Profilare electrochimica cu ajutorul electrodului placat cu nanoparticule de cupru

pentru identificarea carnii de strut si evaluarea calitatii carnii

1.Introducere
Autoritatea legislativa a stabilit faptul ca produsele din carne trebuie sa fie cu
acuratete incadrate in specia din care fac parte. Inlocuirea totala si confiscarea
produselor din carne a fost o problema larg raspandita in restaurante si magazine
de retail. Incadrarea onesta a speciilor de carne este relevanta pentru consumatori
din motive variate ce include o posibila pierdere economica datorita substitutiei
frauduloase sau confiscarii, vatamari asupra persoanelor care poseda anumite
alergii sau violarea credintei religioase. Asadar, unelte simple si adecvate pentru
detectarea si identificarea originii animale sunt necesare.
Carnea de strut are proprietati nutritionale caracteristice cum ar fi cantitati mari de
proteine,amino acizi si continut de fier, slaba in calorii,grasimi si colesterol, ceea ce
o fac o alegere preferentiala a consumatorilor de produse sanatoase. Pretul mare de
vanzare si mic al aprovizionarii a facut-o de asemenea o tinta favorabila pentru
falsificarea si inlocuirea cu tipuri mai ieftine de carne. Asadar, in termenii unui pret
cinstit si ai sigurantei alimentului, este obligatoriu sa putem diferentia carnea de
strut de alte tipuri de carne.
Metode variate de indentificare a originii carnii au fost stabilite , inclusiv metode
bazate pe biologie moleculara,ELISA,analiza senzoriala,analiza electroforetica si
metode cromatografice. O revizuire amanuntita a fost data de Ballin, Vogensen, and
Karlsson (2009) , dar prea putine informatii au fost valabile pentru carnea de strut.
In timp ce toate schemele analitice au propriile avantaje si dezavantaje, HPLC este o
metoda cu o mare sensibilitate si reproductibilitate ce este ptrivita pentru analizele
de rutina. Dezavantajele majore ale metodelor HPLC puplicate include cerintele
pentru extractiile plictisitoare si timpul de analiza lung,ce limiteaza semnificativ
raspandirea folosirii acestei metode. Un avantaj major a detectiei EC este abilitatea
de a detecta direct peptidele si aminoacizii care se expun putin sau nu au
proprietati cromogene sau iluminescente.In plus, sub conditii potrivite
cromatografice si folosirea simultana a electrodului placate cu nanoparticule de
cupru, o detectie corecta este realizata fara tratamentul in prealabil al probei. O
metoda rapida HPLC-EC electrochimica pentru diferentierea diferitelor tipuri de
carne a fost stabilita in 2007, dar factorii problematici ai identitatii peakurilor
speciilor, efectul diferitelor portiuni din carne ,temperatura de depozitare si timpul
din cromatograma, au ramas sa fie elucidate. Scopul acestui studio a fost de a
utiliza metoda cromatografica EC pentru diferentierea eficienta a carnii de strut de
pui,purc si vita si a identifica componentele specific fiecarei specii , care le
diferentiaza. In plus, modelele cromatografice ale diferitelor parti din carnea de stru
au fost mai apoi investigate ca o baza pentru delimitarea claselor de
carne.Temperatura diferita de depozitare si perioadele au fost de asemenea
investigate pentru evaluarea degradarii carnii.
2.Materiale si metode
2.1 Prepararea extractului de carne
Patru specii de carne au fost incluse in acest studiu.Pentru a asigura prospetimea
tesuturilor,carne bruta de bovine,porcine si pui a fost cumparata de la supermarket
din orasul Taichung din Taiwan. Carnea de strut a fost cumparata proaspata de la un
abator asociat cu Asociatia Domestica pentru Struti din Taiwan. Bucati din toata
carnea proaspata au fost procesate imediat, daca nu se specifica altfel, toata carnea
nefolosita a fost depozitata in congelator la -20 C. 50 g de carne slaba a fost taiata
in bucati mici si tocata 5 g au fost omogenizate in 10mL de faza mobila(40mM
tampon fosfat,ph 7.8) cu un bio-omogenizator(M133). Un extract crud a fost obtinut
prin filtrare cu tifon apoi centrifugat la 10.000rpm timp de 15 min la 25C.
Supernatantul rezultat a fost filtrat ulterior prin filtre cu siringa de 0.45 0.22 microm
si un alicot de 20 microL din filtratul final a fost injectat in analizatorul HPLC-EC.
2.2 Analiza HPLC-EC

Pentru scopul acestui studiu,conditiile au fost modificate datorita unui raport

anterior de diferentiere a speciilor de carne. Pe scurt, un sistem HPLC a fost
conectat la un analizator electrochimic CHI 721B si detectat printr-un device de
analiza cu injectie ce foloseste un sistem cu trei electrozi compus din : un electrod
de lucru(Cu-SPE,electrod screen printed placat cu nanoparticule de cupru),un
electrod de referinta Ag/AGCl si un electrod de control auxiliar de platina. Separarile
cromatografice au fost facute folosind o colana bazata pe siliconn (Zorbax Eclipse
AAA, 5 lm, 150 4.6 mm, Agilent technology Inc., Santa Clara, CA, USA),si fosfat de
sodium 10mM,pH 7.8 ca faza mobile. Conditiile analitice au fost:potential de
detectie -0.05V, timp de rulare 500s,volum injectat 20microL. Toate experimentele
au fost facute in triplicat pentru bucati de carne obtinute de la vanzatori diferiti.
Timpul de retentie si aria peakurilor importante au fost inregistrate cu un profil
cromatografic pentru speciile de comparat. Un peak major a fost definit ca un peak
care are aria ce depaseste 10% din totalul ariilor celorlalte peakuri din intreaga
cromaograma.
2.3 Evaluarea diferitelor clase/parti din carnea de strut
Prin conventie,carnea de strut a fost clasificata convenabil in trei
clase( premium,high si fair). Bazata pe gustul,textura si raritatea muschiului.Fiecare
clasa contine 3-8 parti ale carnii (total 16 parti) reprezentand muschi din diferite
locuri ale strutului. Demonstratia anatomica a fiecarei parti si clasa de care apartine
este evidentiata in tabelul1. Profilul cromatografic pentru fiecare parte de carne a
fost analizat si indicat mai sus si profilul cromatografic ce include timpul de retentie,
numarul peakurilor majore si aria a fost inregistrat pentru comparatie.
2.4 Evaluarea degradarii carnii
Schimbarile cromatografice odata cu timpul au fost folosite in indicarea degradarii
carnii. Vita,porcul ,puiul si carnea de strut au fost fie pastrate la temperatura
camerei (25C mai mult de 72h) fie in frigider(4C mai mult de 9 zile) si analizate la
fiecare 12h si la fiecare 3 zile, respectiv pentru fiecare procedeu. Fiecare tip de
carne a fost taiat in trei parti echivalente, impachetate in pungi de plastic pentru a
preveni pierderea apei prin evaporare. Schimbarile cromatografice a fiecarui tip de
carne in timpul de retentie,numarul peakurilor majore si arie au fost evaluate pentru
a accesa timpul si temperatura de stocare ce dau schimbari dinamice ale profilului.
2.5 Analiza statistica
Programul statistic pentru stiinte sociale (SPSS) pentru Windows a fost utilizat
pentru analiza statistca. Carnea de stru a fost clasificata in trei clase: premium ,high
si fair. Pentru comparatia sensurilor ariilor a doua peakuri de-a lungul acestor trei
clase ,a fost aplicata analiza variabilitatii(ANOVA) urmata de testul Tukey pentru
comparatie pe perechi. Pentru a determina care rata a ariei a doua peakuri poate fi
folosita pentru clasificarea carnii de strut ,a fost initiata analiza primirii curbelor
caracteristice (ROC). Folosind o lista cu specificitati si sensibilitati pentru valorile
ulterior inlaturate,curba ROC a fost construita si aplicata pentru determinarea valorii
ce trebuie inlaturata. Aria de sub curba ROC a fost de asemenea folosita pentru
compararea diferitelor metode de determinare; cu cat aria este mai mare cu atat
testul este mai bun.Sub presupunerea non-parametrica,eroare standard a ariei de
sub curba a fost calculata si a fost obtinuta valoarea p. O valoare p mai mica de
0.05 indica faptul ca aria de sub curba este statistic diferita de 0.5.
2.6 Metode LC-MS
Lc/Ms au fost performate pentru a identifica structura peakurile specifice fiecarei
specii. Acetonitrilul si acidul formic au fost procurate de la Merck(Germania). Apa a
fost purificata cu un sistem de deionizare. Gazele folosite inclusiv nitrogenul fara
oxigen si heliul au fost cumparate de la LH Ltd. Taiwan. Separarile HPLC au fost
efectuate folosind Agilent 1100 RP-HPLC sistem cu o pompa binara. Aceeasi coloana
Agilent a fost folosita pentru separarea cu o rata de curgere de 0.7mL/min si un
volum de injectie de 5microL. Faza mobila consta in apa ce contine 0.1%acid formic
(A)si acetonitril(B).Gradul de dilutie a fost adoptat incepand cu 90% A,tinut timp de
6 min; ajungand la 10% A la 8 min; si o intoarcere la 90% A la 10 min si tinut timp
de 5 min.
Experimentele MS si apoi MSn au fost conduse folosind LTQ un spectrometru de
masa cu o capcana liniara de ioni echipat cu o sursa ESI sub modul ioni
pozitivi.Pentru analiza dependenta de date MSn,prima scanare a fost facuta in
modul de scanare total de la m/z 84 la 1000. Urmatoarea scanare a fost setata ca
scanare data-dependenta de ioni pentru cele mai abundente peakuri peste
intensitatea prestabilita la 10^3.
3.Rezultate si discutii
3.1 Diferentierea carnii de strut si LC-MSn la diferite peakuri ale speciilor
Patru tipuri diferite de carne pot fi diferentiate prin profilele cromatografice
caracteristice ce constau doar in patru peakuri majore in mai putin de 5 min.( fig1 si
tab2). Un peak specific aviar la 3.5 min(212s) a fost identificat pentru diferentierea
speciilor de mamifere. Carnea de strut poate fi diferentiata in continuare de cea de
porc si vita cu ajutorul peakului 2(cca 180s). Carnea de vita si de porc impart acelasi
peak major inainte de 5 min, dar pot fi citite diferential prin diferite ratii alea
peakurilor 1/peak2 si peak2/peak3,la fel ca un peak aditional la minutul 10 pentru
porc. Simplitatea profilelor celor patru varfuri este un mare avantaj si o
imbunatatire pentru cromatograma bazata pe UV pentru identificarea speciilor si un
salvator de timp pentru metodele bazate pe biologie moleculara.Succesul metodei
EC poate fi atribuit combinarii sensibilitatii si selectivitatii optime ale aminoacizilor
si /sau a peptidelor mici bazata pe mecanismul Cu-SPE. Acest electrod este
modificat la suprafata cu nanoparticule de Cu ce il fac o unealta sensibila pentru
detectarea aminoacizilor la grade diferite de specificitate in acelasi timp, insensibil
pentru proteine mari. Acest caracter special permite acestui electrod sa detecteze
selectiv aminoacizii si peptidele din matrici bogate in proteine, ceea ce il face o
unealta potrivita pentru scopul acestui studiu.
Identificarea componentelor specifice fiecarei specii este o implicare importanta in
diferentierea de rutina ce poate fi developata in markeri speifici pentru alte metode
analitice cu acelasi scop. Rezultatele LC-MS sugereaza ca peakul specific aviar la
212 a fost al aserinei( beta-alanil-N-metilhistidina) in timp ce peakul carnii de strut
de la 180s a fost al carnozinei(beta-alanil-L-histidina). Fig2. Prima poza din fig2 arata
aparitia peakului de carnozina la min 2.38. Spectrometru de masa a aratat
molecula protonata de carnozina (M+H)+ la m/z 227 care larezultatele scanarii cu
ioni apar la m/z 210 respectivm/z 209 corespunzand pierderii de NH3 si apa. Mai
tarziu fragmentarea MS3 derivata din MS2 produce ioni la m/z 192(pierderea de
apa) si 164 (pierderea de CH2O2). Cantitatea de carnozina existenta a fost destul de
mica in carnea de strut,in comparatie cu alte probe. Figura din mijloc arata peakul
de anserina la min 2.39, ce ofera (M+H)+ lam/z 241. Destule fragmente de ioni la
m/z 224 (pierdere de NH3),197(pierdere de CO2)si 170(pierderea C3H5NO) au fost
observate in spectrul MS2. Spectrul MS3 a aratat fragmente de ioni la m/z 126 si
109. Poate fi observata de asemenea faptul ca cantitatea de aserina existenta in pui
si probe de carne de strut este mult mai mare ca cea din carne de vita sau porc.
Ambele carnozina si aserina sunt derivate din histidina dipeptide a beta alaninei ce
sunt bogate in muschii scheletici si tesuturile din creier ale vertebratelor. Aceste
doua substante pot functiona pentru a reduce febra musculara si imbunatatesc
capacitatea de invatare datorita efectului anti-oxidativ si capacitatea de tamponare
in prezenta gruparii inidazol. Nivele crescute de carnozina si anserina au fost
sugerate in carnea de porc si pui , respectiv rata molara carnozina/anserina a fost
descoperita ca si caracteristica pentru speciile animale fapt ce poate fi folosit
pentru a diferentia carnea de vita,porc,miel de cea de pui si curcan. Rezultatele
curente completeaza utilizarea acestor dipeptide in diferentierea speciilor
(mamifere vs non-mamifere) si a imbunatatit identificarea carnii de strut combinat
cu metoda EC developata folosind Cu-SPE. Pe de alta parte, rezultatele LC/MSn
sugereaza ca peakul 1 si peakul 4 apartin lizinei si glutaminei in baza fragmentarii
caracteristice in comparatie cu standardele acestor doi aminoacizi si mentinuti de
rata peakului si timpul realtiv de retentie. Ultima figura arata aparitia peakului
pentru lizina la min 2.38 si al glutaminei la 2,56 min, ce au ponderi similare ale
peakului cu cele alea peakului 1 si 4 din cele 4 tipuri de carne. Fig1. SpectrulMS al
acestor aminoacizi izobarici a aratat molecula protonata la m/z 147, fragmentand
ioni identici la m/z 130 in spectrul MS2 si m/z 84 in spectrul MS3. Atat lizina cat si
glutamina sunt componenti de aminoacizi obisnuiti in carne si numara mai mult de
10-15% din totalul aminoacizilor din aceste 4 tipuri de carne, aparitia lor ca peakuri
principale in cromatograma EC indica selectivitatea specifica a CU-SPE pentru
acestia. Metoda curenta elaborata EC a demonstrat cateva imbunatatiri
semnificative in timp si costuri in comparatie cu studiile anterioare datorita faptului
ca pregatirea laborioasa a probelor siderivatizarea nu a fost necesara. Rezultatele
au sustinut mecanismul de detectie al CuSPE si a evidentiat faptul ca diferentele
speciilor in componentele muschiului sunt niste tinte potrivite pentru scopuri de
diferentiere si o metoda cromatografica de succes poate fi definita dupa
selectivitatea acesteia mai degraba decat dupa sensibilitate. Metoda curenta LC-EC
are o sensibilitate adecvata dar o selectivitate diferita pentru peptide/aminoacizi
astfel incat diferentierea poate fi obtinuta doar pin patru peakuri , observate prin
prezenta sau absenta carnozinei si anserinei cat si prin cantitatea de lizina si
glutamina. Detectia falsificarii a devenit posibiladatorita prezentei carnozinei care
este bogata in vita,porc , relativ abundenta in carnea de pui si slab prezenta in cea
de strut. Rezultatele LC-MS de asemenea au suferat ca guanidinoacetatul a fost
extrem de slab prezent in carnea de strut in comparatie cu celelalte tipuri de carne,
evidentiandu-l ca alt marker posibil in diferentierea speciilor.
3.2 Evaluarea claselor de carne de strut
Cu profile cromatografice repetabile si consistente , pondereaariei peakurilor a fost
analizata in continuare pentru aplicatii posibile. Analiza statistica indica faptul ca in
timp ce numarul peakurilor si timpurile nu difera in toate partile testate, ponderea
ariilor peakurilor difera semnificativ in diferite parti ale carnii de strut, sugerand
faptul ca rata peakurilor poate fi folosita pentru diferentierea calitatii carniii pe
grade. Analiza Anova indica faptul ca raportul ariei peak1/peak3 (lizina/anserina) in
grupul ,,Fair a fost semnificativ diferit fata de celelalte grupuri. Tabel 3 . Mai mult
decat atat, grupul ,,High are un semnificant raport al ariilor peakurilor 3/4
(anserina/glutamina) comparativ cu celelalte doua grupuri. Curba de analiza ROC a
aratat ca atunci cand raportul de arii peak1/peak3 este mai mare de 10.04, carnea
din clasa Fair poate fi diferentiata de celelalte doua clase, cu o sensibilitate de 83%
si specificitate de 92%. Ulterior carnea Premium poate fi diferentiata de cea High
folosind raportul peak3/peak4 < 0.51 cu o sensibilitate de 95% si specificitate de
100%. AUC a acestor doua curbe ROC sunt ambele statistic semnificative (p<0.05).
Abilitatea de a categoriza mai mult de 15 parti din carnea de strut in trei clase cu o
buna sensibilitate si specificitate a fost o descpoerirre intereanta, deoarece clasele
de carne /preturi sunt clasificate nu doar dupa valoarea nutritionala ,dar si dupa
raritate,textura si alti parametrii senzoriali. Pentru a minimaliza neclaritatile
generate de partile din carne, bucatile de carne au fost preluate de profesionisti
unde au fost proaspat disecate , clasificate si impachetate la vid pentru a fi conform
standarelor. 15 struti maturi au fost comparati in analiza statistica. O explicatie
posibilia pentru similaritatea in rapoartele peakurilor vazute pentru fiecare clasa de
carne in parte poate fi asocierea cu apropierea anatomica / distributia carnii in
carcasa. Partile carnii Premium sunt asociate mai mult cu origine femor sau gastro
Tabel 1. Clasa Fair contine parti de carne multiplu transata distanta de aria
piciorului. Utilizarea rapoartelor fata de aria absoluta a peakului adauga siguranta
analizei ca variatii cantitative de la raspunsurile electroduui si conditiile analitice
pot fi cu succes minimalizate. In oricde caz, trebuie tinut minte ca aceasta
clasificare a carnii este un sistem divers ce implica criterii multiple care nu pot fi
explicate doar cu ajutorul anatomiei si care pot fi diferite in functie de regiune si
tara. Un larg interval de valori cu privire la caracteristicile chimice generale ale
calitatii carnii s-a observat intre muschi si picioare.Proteinele si grasimea
intramusculara au fost de asemenea gasite ca fiind ridicate in categoria Premium
decat in cea High in timp ce colagenul a fost invers. Chhiar daca aceasta metoda
este diferita folosind acesti parametrii, rezultatele coincid cu cea mai comuna
metoda de diferentiere a claselor. In orice caz, cand este aplicat trebuie observat
faptul ca rata concentratiei absolute aminoacizi/peptide trebuie folosita pentru
scopul catalogarii.
3.3 Temperatura si timpul de depozitare in degradarea carnii de strut
Un factor important in validarea metodei a fost gradul de prospetime a probei in
care degradarea proteinei din muschi poate afecta marimea si aria peakurilor
detectate. Cromatogramele carnii de strut,pui si porc incubate la 25 C sau 4C mai
mult de 9 zile nu au aratat nicio schimbare calitativa in profilul in care acelasi
numar de peakuri majore si acelasi timp de retentie au fost retinute. Singura
exceptie a fost un peak aditional produs la 24 h in grupul de la 25C de vita fig3. In
contrast, schimbari cantitative in aria peakului au fost notate si asociate cu
temperatura si timpul.Asadar , este posibil sa se urmareasca schimbarea dinamica a
cromatogramei si sa se foloseasca acest lucru pentru a accesa gradul de scadere a
peakului odata cu degradarea carnii la diferite conditii de mediu. De exemplu, prin
folosirea peakului 1 ca marker si timpul la care un peak similar este observat,
raportul ariei scadere/degradare a fost de trei ori mai rapid la 25C decat la 4C la pui
(60-72h vs9 zile) si porc( 48-60h vs 6-8 zile) si de noua ori mai rapid la carnea de
strut( 24h vs 9 zile) si vita(48h vs 9 zile). Proteoliza postmortem dicteaza profilele
cromatografice ce analizeaza componentele proteice . Cateva sisteme proteolitice
endogene inclusiv sistmul calpain-calpastatin, mediteaza asupra degradarii
proteinelor miofibrilare si citoscheletale. In orice caz, raportul spune ca majoritatea
proteolizelor au loc intre 3-15 zile de la deces. Acest fapt si cel ca nicio noua peptida
mica nu este detectata in profil, indica faptul ca odata cu timpul,prospetimea are
efecte limitate asupra profilului cromatografic. Metoda totusi inca isi permite
detectia schimbarilor dinamice a proceselor proteolitice asa cum este aratat in aria
peakului ce scade gradual ce se schimba odata cu perioada monitorizarii.
In concluzie , o metoda HPLC-EC cu o selectivitate specifica si o sensibilitate
pentru peptidele din muschi a fost elaborata pentru a diferentia eficient carnea de
strut de carnea de porc,vita si pui, si pentru a evalua diferitele clase si
prospetimea carnii de strut.Cele patru tipuri de carne pot fi diferentiate in 5 min cu
profile cromatografice caracteristice ce constau doar in 4 peakuri majore, prevazute
ca fiind lizina,carnozina,anserina si glutamina. LC/MS/MS rezultatele sugereaza ca
falsificarea carnii de strut poate fi identificata prin prezenta continutului ridiccat de
carnozina, care este bogat la pui ,vita si porc si scazut la strut. Analiza statistica
(curba ROC) demonstreaza ca rapoartele peakurilor in carnea de strut in profilul EC
poate fi folosit in evaluarea carnii de strut pe clase (nivele de pret) cu sensibilitate si
specificitate mare.
Mai mult decat atat, schimbarea dinamica a profilelor EC asociata cu temperatura si
timpul de depozitare au fost promitatoare in aplicarea evaluarii prospetimii carnii.
Metoda HPLC-EC pare a fi superioara detectiei UV datortita simplitatii profilelor si
excluderea derivatizarii sau procedurii compleze de extractie, ceea ce o face o
metoda adecvata pentru diferentierea carnii de strut de celelalte tipuri de carne.