I.

I.COMPLEXUL
COMPLEXUL MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE
şi prezentarea antigenului limfocitelor T

As.Univ.Dr.As.SAMAȘCA GABRIEL
Catedra de IMUNOLOGIE
UMF CLUJ, mai 2013

http://www.youtube.co
http://chimerasthebooks.blogspot.com/2011_10_01_archive.html m/watch?v=lrYlZJiuf18
 DESCOPERIREA MHC

MHC (Major Histocompatibility Complex)

• łesutul transplantat de la un Incompatibilitate de

organism la alt organism genetic Ńesut
diferit este rejectat
• Gravitatea rejectului de grefă depinde
de diferenŃele dintre donator şi
Jean Dausset
primitor
Antigene majore de - premiul Nobel
• Incompatibiltatea dintre diferite histocompatibilitate pentru Medicină
Ńesuturi variază, în sensul că, gazda în 1980 -
elimină grefa uneori rapid (violent) Antigene minore de
sau alteori mai lent histocompatibilitate

http://pathmicro.med.sc.edu/ghaffar/mhc2000.htm
 ANTIGENE DE HISTOCOMPATIBILITATE ↔ MHC

Transplantare CROMOZOMUL 6 ReacŃia imună

1974

OLA
H-2
SLA - PLA
Cromozomul 17

RT1
RbH1 DLA
 GENELE MHC/
MHC/HLA

● MHC clasa I: HLA-A, HLA-B, HLA-C.

● MHC clasa II: HLA D: DP, DQ, DR.

● MHC clasa III conține gene care codifică factorul de
necroză tumorală, limfotoxina, și două componente ale
sistemului complement (C2 și C4).
- antigenele de clasa III nu participă la rejetul de grefă.
http://www.oculist.net/downaton502/prof/eb
ook/duanes/pages/v4/v4c034.html
 LOCALIZAREA GENELOR MHC

MHC – COMPLEX DE GENE CARE CONTROLEAZĂ HISTOCOMPATIBILITATEA MAJORĂ!

 MHC clasa I și II EXTREM DE POLIMORFIC

“gene”
“loci”

“alele”

-pentru fiecare genă există alele multiple.

-se datorează numărului mare de alele (polialelism) pentru fiecare din genele HLA
 TRANSMITEREA CODOMINANTĂ A MHC I/II

DQ1 C2
C7
Haplotipul matern DR4
DP3

DP1 DQ2 DR4 B7 C2 A30 A11

A30

DP3 DQ1 DR13 B8 C7 A11

Haplotipul patern
DP1
DR13
B8 B7
DQ2

- din fiecare haplotip se exprimă câte o alelă pentru fiecare locus

- fiecare alela de pe fiecare cromozom are o expresie pe
membrana celulară
 STRUCTURA MOLECULELOR HLA

HLA clasa I HLA clasa II

STRUCTURA MOLECULELOR HLA

ProprietăŃi generale

1.ŞanŃuri despicate de legare a

peptidelor extracelulare
- polimorfismul rezidurilor de
aminoacizi
2.LanŃurile α sunt legate prin
punŃi disulfidice asemănătoare
imunglobulinelor
- situsuri de legare a CD4, CD8
3.Domenii transmembranare şi
intracitoplasmatice
 STRUCTURA MOLECULELOR HLA CLASA I

-un lanŃ greu, polimorf, glicozilat, codificat de MHC -

lanŃul α (43-45kDa)
α2 α1
- un lanŃ uşor, nonpolimorf (constant), codificat de o
genă de pe cromozomul 15 - β2 microglobulina
α3 β2m (12kDa), care are doar rolul de stabilizare a
moleculei.

Extracelular • Extracelular, lanŃul α are trei bucle care formează

trei domenii: domeniile α1, α2 şi α3, menŃinute
Intracitoplasmatic
prin punŃi S-S, deci prezintă o structură similară cu
cea a imunoglobulinelor.

Ancorarea celulară
 STRUCTURA TRIDIMENSIONALĂ
TRIDIMENSIONALĂ HLA CLASA I

Buclele formează un şanŃ între α1 şi α2 (ca o nişă), în care sunt legaŃi

diverşii epitopi din antigenul care vor fi prezentaŃi receptorilor specifici de pe
membrana limfocitelor T.
LanŃul α

Peptide

LanŃul β

ŞanŃuri Structura

- 6 la 16 reziduri de aminoacizi în lungime -

 STRUCTURA MOLECULELOR HLA CLASA II

- un lanŃ α, care are extracelular două

β1 α1 domenii (α1, α2) şi este complet diferit de
lanŃul omonim al moleculelor HLA de clasa I
(34kDa);
β2 α2 - un lanŃ β, tot cu două domenii (β1, β2)
extracelulare (28kDa).

Extracelular
● Fiecare lanŃ prezintă trei regiuni distincte:
extracelulară (expusă mai sus),
Intracitoplasmatic
transmembranară şi intracitoplasmatică.

Ancorarea celulară
 STRUCTURA TRIDIMENSIONALĂ HLA CLASA II

Peptide

LanŃul α

LanŃul β
Structura

Şantul este format din amândouă

lanŃurile α şi b. Nişa este mai lungă
decât cea a MHC-I
ŞanŃuri
- până la 30 reziduri de aminoacizi in lungime sau chiar mai mult -
 reziduri peptide

SPECIFICITATEA DE LEGARE
- REZIDURI POLIMORFICE -

Aşa-numitele buzunare interacŃionează

cu reziduri complementare ale peptidelor
legate, rezultând reziduuri de ancorare.
Alte reziduri MHC polimorfice şi unele
reziduri de peptidă nu sunt implicate în
obligatoriu în legarea moleculelor MHC,
dar formează structuri recunoscute de
celulele T.
 POLIMORFISMUL MHC – DISTRIBUłIA GEOGRAFICĂ

Exemple pentru frecvenŃele antigenelor HLA-A, B în trei grupuri populaŃionale

ANTIGEN E A AA ANTIGEN E A AA

A1 27 1 7 B7 17 11 17
A2 46 43 27 B8 16 1 6
A3 23 1 14 B13 6 4 1
A11 12 17 1 B35 18 14 12
A23 5 1 20 B39 4 6 4
A24 17 59 6 B42 1 1 15
A26 7 19 7 B44 22 13 14
A28 8 1 17 B51 13 16 3
A30 5 1 28 B52 3 21 2
A31 6 15 4 B53 2 0 13
A33 3 13 9 B54 0 14 0

E = descendență europeană; A = descendență asiatică ;

AA = descendență africană
 POLIMORFISMUL MHC – ASOCIERI PATOLOGICE

HLA PatienŃi Lot Martor

Spondilita ankilozantă B27 90 % 9%
Diabetul zaharat tip 1 DR3 52 % 23 %
DR4 74 % 24 %
DR3 or DR4 93 % 43 %
Scleroza multiplă DR2 86 % 33 %
Artrita reumatoidă DR4 81 % 24 %
Narcolepsia DR2 >95 % 33 %
 ANTIGENE HLA
DETECTATE
DETECTATE PRIN TESTE SEROLOGIC
SEROLOGICE
E

• HLA clasa I • HLA clasa II

HLA-A HLA-J HLA-DRA HLA-DRB8 HLA-DMA
HLA-B HLA-K HLA-DRB1 HLA-DRB9 HLA-DMB
HLA-C HLA-L HLA-DRB2 HLA-DQA1 HLA-DPA1
HLA-E HLA-N HLA-DRB3 HLA-DQB1 HLA-DPB1
HLA-F HLA-S HLA-DRB4 HLA-DQA2 HLA-DPA2
HLA-G HLA-X HLA-DRB5 HLA-DQB2 HLA-DPA3
HLA-H HLA-Z HLA-DRB6 HLA-DOA HLA-DPB2
HLA-DRB7 HLA-DOB

POLIMORFISM DIVERSITATE
 ALELE HLA
DETECTATE PRIN TESTE DE BIOLOGIE MOLECULARĂ

Exemplu: HLA-B*15170102
HLA-B Locusul genei
* alela a fost tipizată utilizând teste de biologie moleculară
15 Grupul de alele
17 Subgrupul de alele
01 Numărul de variante de alele
02 Numărul de mutaŃii

Nomenclatura HLA este făcută de WHO Nomenclature Committee:

Publications by Marsh et al.:
HLA Nomenclature Reports HLA Nomenclature Updates
- Tissue Antigens 2002, 60: 407-464 Tissue Antigens 2004, 63: 619
- Human Immunology 2002, 63: 1213-1268 Human Immunology 2004, 65: 767
- European Journal of Immunogenetics 2002, 29: 463-515 European Journal of Immunogenetics 2004, 31: 99
 POLIMORFISMUL MHC clasa I și II

În populaŃia umană au fost identificate peste 1300 de alele MHC clasa I:

699
fisme
Clasa I
umărul de
polimorfis
Numărul

1318 alele
(998 în Octombrie 2003)
396 (657 în Julie 2000)

198

8 2 15
A B C E F G

Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html September 2005

 POLIMORFISMUL MHC clasa I și II

În populaŃia umană au fost identificate peste 700 de alele MHC clasa II

494
Clasa II
morfisme
umărul de

733 alele
Numărul
polimor

(668 în Octombrie 2003)

(492 în Julie 2000)

119
66
28 23
3 4 7 9 9

A B1 A1 B1 A1 B1 A B A B
DR DQ DP DM DO

Data from www.anthonynolan.org.uk/HIG/index.html September 2005

 LEGAREA PEPTIDELOR LA MOLECULELE MHC

MHC clasa I MHC clasa II

Peptide

Buzunar de legare
a peptidei

Cell Membrane
AGENłI PATOGENI
CELULE PREZENTATOARE DE ANTIGEN
 CELULE PREZENTATOARE DE ANTIGEN

MHC Clasa I

Any nucleated cell

MHC Clasa I

MHC Clasa II

Macrofage Celule B Celule dendritice

● Moleculele MHC sunt exprimate de celulele prezentatoare de antigen (APC) și au rolul prezentării
peptidelor derivate din proteinele antigenice.
 UN MODEL AL RECUNOAŞTERII
RECUNOAŞTERII PEPTIDICE

http://www.nephronpower.com/2010_06_01_archive.html

- peptidele se leagă la moleculele MHC prin zone de ancorare, care asigură legarea în
cavitatea (buzunarul) moleculelor MHC.
- receptorul TCR al fiecărei celule T recunoaște anumite resturi de aminoacizi ale peptidului
dar și anumite resturi de aminoacizi (polimorfice) ale moleculei MHC.
CARACTERISTICI ALE INTERACłIUNII DINTRE PEPTIDE ŞI MHC
PROCESAREA ANTIGENELOR INTRACELULARE
PROCESAREA ANTIGENELOR HLA CLASA I

Proteine intracelulare
ANTIGENELE PREZENTATE DE MHC CLASA I
SUNT RECUNOSCUTE DE CELULELE T

Kills

MHC I

Virus-
Cytotoxic infected cell
T cell

Apoptotic cell

LTC recunosc antigenele prezentate de

MHC I şi le omoară

http://www.youtube.com/watch?v=Jg_21iSYwBc&feature=related
PROCESAREA ANTIGENELOR EXTRACELULARE
PROCESAREA ANTIGENELOR HLA CLASA II

Proteine extracelulare
 ANTIGENELE SUNT RECUNOSCUTE DE CELULELE T

Activates
Activates

MHC
MHC II
II
TH2 B cell
TH1
Macrophage

Dead intracellular
bacteria
Anti-toxin antibodies

LTH1 recunosc antigenele LTH2 recunosc antigenele

prezentate de MHC II şi prezentate de MHC II şi
activează macrofagele activează LB

http://www.youtube.com/watch?v=M48qu5c7Cfg&feature=related
LIMFOCITELE T
 De ce este necesar polimorfismul MHC?

• Necesar pentru a face față diversității structurale a

agenților patogeni.
• Manifestat prin abilitatea de a prezenta o gamă
largă de peptide antigenice derivate din agenții
patogeni.
• Rezultă din expresia “alelelor” multiple ale
moleculelor MHC codificate în cadrul “locusurilor”
multiple ale regiunii MHC de pe cromozomul 6.
• Protejează împotriva epidemiilor letale
– Supraviețuire crescută a populației datorită http://twistedbacteria.blogspot.com/
diversității alelelor.

= susceptibili
 POLIMORFISMUL MHC

Exemplu: Dacă MHC X a fost singurul tip de moleculă MHC

MHC
XX

Agentul patogen
se sustrage
MHC X

SupravieŃuirea PopulaŃia ameninŃată cu dispariŃia

individuală
ameninŃată
 POLIMORFISMUL MHC

Exemplu: În cazul în care fiecare individ prezintă

două molecule MHC, MHC X şi Y

MHC
XX
Agentul patogen
se sustrage
MHC X

MHC
dar are
secvenŃe care YY
se leagă de
MHC Y
MHC
XY

Impactul asupra PopulaŃia supravieŃuieşte

individului depinde de
genotip
 POLIMORFISMUL MHC

Exemplu: În cazul în care fiecare individ prezintă

două molecule MHC, MHC X şi Y ...... şi patogeni mutanŃi

MHC
XX
Agentul patogen
se sustrage
MHC X dar are
secvenŃe care se MHC
leagă de MHC Y
YY

…. Dar dezvoltă
mutaŃii pentru a se
sustrage MHC Y MHC
XY

SupravieŃuirea individuală PopulaŃia ameninŃată cu dispariŃia

ameninŃată
Sfârşit
partea I
II.IMUNITATEA DE TRANSPLANTARE
TRANSPLANTARE
(răspunsul imun faŃă de grefă)
As.Univ.Dr.As.SAMAȘCA GABRIEL
Catedra de IMUNOLOGIE
UMF CLUJ, mai 2012

http://www.bidmc.org/Research/Departments/Medicine/Divisions/TransplantImmunology.aspx
Oameni din SUA care trăiesc cu grefe de organe funcţionale
 TERMINOLOGIA ÎN TRANSPLANTARE

● Transplantare = prelevarea unui organ (Ńesut,

celule) de la un donator şi implantarea lui la alt
individ, denumit primitor, cu restabilirea
continuităŃii vasculare.
(1).Dacă organul transplantat este plasat în locul
de unde a fost îndepărtat organul bolnav,
http://celioscopy.blogspot.com/
transplantul se numeşte ortotopic,
(2).iar dacă este plasat în altă regiune anatomică
faŃă de locul de unde a fost îndepărtat cel bolnav,
este denumit transplant heterotopic (de exemplu
transplantarea rinichiului sănătos în fosa iliacă,
nu în loja renală).

http://en.wikipedia.org/wiki/Transplantable_organs_and_tissues
 BARIERE GENETICE ALE TRANSPLANTĂRII

Autogrefa Izogrefa
Molecule MHC alogenice dintr-o parte (singrefa)
- molecule responsabile de a corpului între indivizi
rejetarea rapidă a grefei în alta. identici din
- grefe de piele punct de vedere
(acceptate de genetic.
regulă) - gemeni identici
(acceptate
permanent)

•Molecule care sunt recunoscute

ca fiind străine pe alogrefe sunt
numite aloantigene.
Alogrefa
(homogrefa)
Xenogrefa
între indivizi
(heterogrefa)
diferiți ai
între membri ai
aceleiași specii.
unor specii diferite.
- de la un om la altul - sunt totdeauna
(rejetul apare dacă rejetate.
•Limfocitele şi anticorpii
donatorul și
primitorului care reacŃionează
primitorul nu sunt
cu aloantigenele străine sunt
compatibili).
descrise ca fiind aloreactive.
MEMORIA IMUNOLOGICĂ
IMUNOLOGICĂ

Recunoaşterea aloantigenilor
 MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

Faza de recunoaştere - mecanisme moleculare

MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

Faza recunoaştere - mecanisme celulare

 MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

Faza recunoaştere - mecanisme celulare

vascularizaŃie!!!
MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

lipsa vascularizaŃie!!!

HLA INCOMPATIBILE!!!

ZONE PRIVILEGIATE!!!
 MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

Faza efectoare

• LT CD8

– Recunoaşterea moleculelor
MHC de clasă I exprimate pe
toate celulele donatorului

– Efecte citotoxice directe

• LT CD4

– Recunoaşterea moleculelor
MHC de clasă II pe celulele
dendritice (CD), macrofage
(alorecunoaştere indirectă)

http://www.nature.com/nm/journal/v8/n3/fig_tab/nm0302-220_F1.html
 MECANISME IMPLICATE ÎN REJETARE

Faza efectoare
IL-2, IFN-g, CD4+
TNF
Th1 CD8+
“sărutul morŃii”
Clasa II
Clasa I
Macrofage

• LT CD8 Celulele grefei

– Efecte citotoxice directe

• LT CD4
– eliberarea de TNF+IFNγ+IL2
induce activare macrofagică
şi distrucŃie nespecifică
ADCC
Aloanticorpii fixaŃi pe celulele grefonului se leagă
de celulule NK, monocite/macrofage
- atacă doar celulele lipsite de MHC de clasa I.
 CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

1) Rejetul hiperacut:
- apare la câteva ore după transplant
- la un individ cu anticorpi preformați, fie datorită incompatibilității de grup sanguin, fie datorită
sensibilizării anterioare, prin transfuzii de sânge sau alte transplante

2) Rejetul acut:
- apare după 10-30 de zile de la transplantare
- este mediat mai ales de LT

3) Rejetul cronic sau tardiv:

- apare după luni sau ani

http://www.discoverymedicine.com/Jeffrey-L-
Platt/files/2010/08/discovery_medicine_platt_no51_figure_1.jpg
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0952791500001394
 CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejetul hiperacut

- anticorpii preformaŃi din organismul primitorului, reacŃionează cu endoteliul vascular,

activează complementului şi declanşează tromboza intravasculară rapidă şi necroza peretelui vasului.
CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet hiperacut al unei grefe renale

CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet hiperacut al unei grefe renale

- un prejudiciu endotelial
- trombi de trombocite şi trombină
- infiltrarea neutrofilelor în glomerul.
 CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular

- limfocitele T CD8+ reacŃionează cu aloantigenii de pe celulele endoteliale producând distrugeri ale

celulelor parenchimale;
- anticorpi aloreactivi formaŃi după transplantarea grefei pot contribui, de asemenea, la un
prejudiciu vascular.
CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular al unei grefe renale

- edem
- inflamaŃie

http://www.wikidoc.org/index.php/Transplant_rejection
 CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet acut vascular al unei grefe renale

B. Rejectul acut al unei grefe renale cu celule inflamatorii în Ńesutul conjunctiv din jurul tubilor şi
între celulele epiteliale de la nivelul tubilor. C. respingerea acută mediată de anticorpi, cu reacŃie
inflamatorie distructivă a stratului endotelial al unei artere. D. respingerea acută mediată de
anticorpi, cu depunerea complementului C4d în vase.
 CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet cronic

- arterioscleroza grefei, prejudiciul al peretele vasului duce la proliferarea celulelor musculare

netede intime şi ocluzia lumenului. Această leziune poate fi cauzată de o reacŃie DTH (delayed-type
hypersensitivity) cronică la aloantigenii din peretele vasului.
CLASIFICAREA CLINICA A REACTIILOR DE REJETARE
REJETARE ŞI PREVENIREA LOR

Rejet cronic

Respingere cronică în alogrefa de rinichi, cu

arterioscleroza grefei. Lumenul vascular se
înlocuieşte cu o acumulare de celule musculare
netede şi Ńesut conjunctiv, în intima vaselor.
 PREVENłIA ÎN REJECTUL DE ALOGRAFĂ

A. Selectarea primitorului
1. Compatibilitate AB0 (nu identitate). Respectarea identităŃii AB0 doar pentru a se evita aglomerarea bolnavilor care aşteaptă şi au
grupa 0.
2. Compatibilitate, cât mai apropiată posibil, în special HLA de clasa II
3. Cross-match negativ al serului primitorului faŃă de limfocitele T ale donatorului
4. Alte criterii:
- vârstă, sex
- grefe anterioare
- transfuzii anterioare
- infecŃii severe
- coagulopatii
- alte boli
B. Selectarea donatorului

Donatori post mortem
1. FuncŃie bună a organului ce va fi grefat
2. Lipsa infecŃiilor septice sau transmisibile (HIV, HBV, HCV)
3. Lipsa tumorilor maligne (cu excepŃia celor cerebrale)
4. Lipsa bolilor de sistem (diabet, hipertensiune, leucemie etc.)
5. Lipsa anomaliilor anatomice ale organului
12. Timpul de ischemie la cald scurt

Donatori în viaŃă
1. Organul pereche să aibă funcŃie bună
2. Starea de sănătate perfectă
3. Starea psihologică adecvată
4. Lipsa bolilor transmisibile
5. Lipsa anomaliilor vasculare
6. Restul criteriilor specificate anterior la cadavre

monitorizarea primitorului se realizează prin urmărirea atentă a evoluŃiei clinice

şi mai ales prin biopsii
TRATAMENTUL ÎN REJECTUL DE ALOGRAFĂ

Suprimarea reactivităŃii imune a donatorului

● Medicamentele imunosupresoare inhibă sau

distrug limfocitele T
-ciclosporina şi FK506 (tacrolimus), inhibitori de
calcineurină, inhibă transcrierea unor gene din
celulele T, cum ar fi IL-2.
- rapamicina (sirolimus), inhibă proliferarea
celulelor T
● AgenŃii antiinflamatori, sunt frecvent
utilizaŃi pentru a reduce reacŃia inflamatorie la
alogrefele de organe.
- corticosteroizi
● Anticorpi, care reacŃionează cu structurile de
pe suprafaŃa celulelor T, diminuează sau inhibă
celulele T şi sunt utilizaŃi pentru tratarea
episoadelor acute de respingere
-OKT3
● AntimetaboliŃi, toxine metabolice, distrug
celulele proliferante T sunt utilizate în
combinaŃie cu alte medicamente
- mycophenolate mofetil
● BlocanŃi de căi costimulatoare reduc
rejetului acut.
- CTLA4
TRATAMENTUL ÎN REJECTUL DE ALOGRAFĂ

Suprimarea reactivităŃii imune a donatorului

 TRATAMENTUL ÎN REJECTUL DE ALOGRAFĂ

Efecte secundare ale medicamentelor imunsupresoare

• Toxicitate (nefrotoxicitate)

• Scăderea rezistenŃei la infecŃii

• Risc crescut pentru malignităŃi

– boala limfoproliferativă post-transplant (PTLD)

(asociată cu virusul Epstein-Barr)

 METODE
METODE DE REDUCERE IMUNOGENITĂłII ALLOGREFEI

Minimalizarea diferenŃelor aloantigenice dintre donator şi primitor

Persoanele care exprimă un antigen ABO sunt tolerante la acel antigenul, dar
persoanele care nu exprimă antigenul produc anticorpi naturali care recunosc antigenul.
 Jesica SANTILLAN (26 decembrie 1985 - 22 februarie 2003) a fost un cetăŃean mexican care
a murit după o operaŃie de transplant de organe, în care ea a primit inima şi plămâni de la un pacient
a cărui tip de sânge nu s-a potrivit cu al ei. Medicii de la Duke University Medical Center nu au reuşit
a verifica compatibilitatea înainte de începerea intervenŃiei chirurgicale. Dr. James Jaggers, a declarat,
“Sper că noi, şi alŃii, poate vom învăŃa din această greşeală tragică.” După moartea lui Jesica, familia
SANTILLAN a fost abordată de către spital pentru a stabili dacă organele ei ar putea fi donate pentru a
fi utilizate la transplantul altor pacienŃi. La sfatul avocaŃilor lor, familia a refuzat.

Jesica a avut grupa de sânge O, iar donatorul grupa de sânge A

 METODE
METODE DE REDUCERE IMUNOGENITĂłII ALOGREFEI

Minimalizarea diferenŃelor aloantigenice dintre donator şi primitor

• Tipizarea HLA a pacientului şi donatorului

– Tipizarea serologică a limfocitelor

– Tipizarea ADN prin metode de tip PCR

• Screening-ul serului pacientului pentru anticorpi HLA-
specifici
• Crossmatch–ul între serul pacientului şi celulele
donatorului

http://www.stanford.edu/dept/HPS/transplant/html/hla.html
 ANTIGENE DE TRANSPLANTARE

Pacientul: HLA-A1,A2;B7,B35;DR1,DR4

Tipul HLA Numărul antigenelor

incompatibile

Donator 1 A1,A2;B7,B35;DR1,DR4 0

Donator 2 A1,A2;B35,-;DR1,- 0

Donator 3 A1,A2;B35,-;DR4,DR17 1

Donator 4 A2,A11;B8,B35;DR1,DR5 3

Donator 5 A2,A25;B7,B37;DR7,DR15 4

Donator 6 A3,A26;B8,B38;DR4,DR17 6

Criteriile actuale de compatibilitate HLA se bazează pe numărarea antigenelor

incompatibile de clasă I A, B și de clasă II DR ale donatorului.
 METODE
METODE DE REDUCERE IMUNOGENITĂłII ALLOGREFEI

Minimalizarea diferenŃelor aloantigenice dintre donator şi primitor

 METODE
METODE DE REDUCERE IMUNOGENITĂłII ALOGREFEI

Minimalizarea diferenŃelor aloantigenice dintre donator şi primitor

1/500 milioane

http://uwmedicine.washington.edu/Patient-
Care/`
 TOLERANłA LA TRANSPLANT

• Visul oricărui medic implicat în îngrijirea bolnavilor

transplantați.

• Multe modele experimentale de transplant au

prezentat supraviețuirea permanentă a grefei datorită
inducerii toleranței imunologice.

• Mecanismele inducerii toleranței la transplant:

anergie, supresie, deleție.

• Unele transplante incompatibile continuă să

funcționeze și după încetarea imunosupresiei.

Mecanismul prin care celulele T mature care recunosc

antigenii proprii din Ńesuturile periferice sunt redate ca
incapabile de a răspunde la aceste antigene.
 XENOTRANSPLANTUL
ÎN CLINICĂ

• Donatori potențiali: porcul, babuinul.

http://www.actasurologicas.info/v32/n01/ENG/3201OR14.htm
• Problema majoră nr. 1: anticorpii preformați
împotriva xenoantigenelor (rejet hiperacut).

• Problema majoră nr. 2 ??: Infecția cu virusuri

endogene de la xenogrefe

http://www.ndt-educational.org/cozzislide2007txt.asp
 TRANSPLANTUL DE MĂDUVĂ
MĂDUVĂ HEMATOGENĂ

http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer
• Procesul prin care hematopoieza normală este /StemCells/AllPages/Print
restabilită prin perfuzia i.v. de celule stem
pluripotente.

INDICAłII
• Tratamente cu doze mari (chimioterapie, raze X)
• Acestea distrug și hematopoieza pacientului
• Salvare cu perfuzie de celule stem

Un termen mai bun: http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:A

Nd9GcQ6BCgH3VxoeAk6NGC5SXS
Transplantul de celule stem Gljuo6TEBIwrHkmFS3d7evjOp9Ptt
 TRANSPLANTUL DE MĂDUVĂ
MĂDUVĂ HEMATOGENĂ

Boli genetice tratabile prin Boli maligne tratabile prin transplant medular
transplant medular
SCID Transplant alogenic/singenic Transplant autolog
Sdr. Wiskott-Aldrich Cancer de sân Leucemii
Anemia Fanconi Anemie aplastică Leucemie acută mieloidă
Sdr. Kostmann Leucemii Leucemie acută limfoidă
Boala granulomatoasă cronică Leucemie acută mieloidă Mielom multiplu
Osteopetroza Leucemie acută limfoidă Limfom non-Hodgkin
Ataxia telangiectazia Leucemie cronică Limfom Hodgkin
mieloidă
Sdr. Diamond-Blackfan Mielodisplazie Tumori solide
Candidiaza cutaneo-mucoasă Mielom multiplu Sân
Sdr. Chediak-Higashi Limfom non-Hodgkin Ovarian
Hipoplazia cartilagiu-păr Limfom Hodgkin Testicular
Mucopolizaharidoze Neuroblastom
Boala Gaucher
Thalasemia majoră
 TRANSPLANTUL DE MĂDUVĂ
MĂDUVĂ HEMATOGENĂ

Colectarea de celule progenitoare se poate

face prin afereza măduvei hematogene.

Afereza – procedura în timpul căreia sângele este prelevat de la pacient, trecut printr-un
aparat special care separă celulele alegându-le pe cele necesare transplantului, restul celulelor fiind
înapoiate pacientului.
 TRANSPLANTUL DE MĂDUVĂ
MĂDUVĂ HEMATOGENĂ

Probleme legate de transplantul medular

• Infecție

• Recăderea bolii

• Eșecul grefării (reacție gazdă contra grefă)

http://psychcentral.com/news/2010/06/0
http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/ 1/immune-disorders-tied-to-mental-
StemCells/AllPages/Print illness/14171.html
 BOALA GREFĂ
GREFĂ CONTRA GAZDĂ

GVHD, celulele transplantate atacă celulele gazdă

GVHD acută
• În primele 3 luni după
transplant
• Piele, tractul gastro-
intestinal,
hepatosplenomegalie.

GVHD cronică
• După 3 luni
• Piele, ficat, tract gastro-
intestinal
• Similitudini cu bolile
țesutului conjunctiv (de
exemplu sclerodermia).
 BOALA GREFĂ
GREFĂ CONTRA GAZDĂ

GVHD, celulele transplantate atacă celulele gazdă

Reacții tisulare în GVHD

Gra Piele Ficat Tract

dul gastrointestin
al
1 Rash Bilirubina >500 ml
maculopapular pe serică 2-3 diaree/zi
<25% din suprafața mg/dl
corpului
2 Rash Bilirubina >1000 ml
maculopapular pe serică 3-6 diaree/zi
<25-50% din mg/dl
suprafața corpului

GVHD acută – grad 4 la nivelul pielii

3 Eritrodermie Bilirubina >1500 ml
(formare de bule)
generalizată serică 6-15 diaree/zi
mg/dl

4 Eritrodermie Bilirubina Durere

generalizată cu serică 15 abdominală
formare de bule și mg/dl severă cu sau
descuamare fără ileus
 BOALA GREFĂ
GREFĂ CONTRA GAZDĂ

GVHD, celulele transplantate atacă celulele gazdă

• Profilaxie

– Grad înalt de compatibilitate HLA donator-primitor

– Toți pacienții care suportă transplant medular

allogenic necesită profilaxia GVHD.

– Ciclosporină, Metotrexat, Tacrolimus, steroizi,

depleție de LT

• Tratament

– În ciuda profilaxiei, mulți pacienți dezvoltă GVHD

– Tratament de primă intenție cu steroizi

– Alte tratamente: imunoglobulină antitimocitară,

anticorpi monoclonali
 ASPECTE ETICE

Stephanie Fae Beauclair (14 octombrie

1984 - 15 noiembrie 1984), cunoscută sub
numele de baby Fae, a fost un copil american
născut în 1984, cu sindromul hipoplastic cardiac
stâng. Ea a devenit obiectul primei proceduri de
xenotransplant, primind o inimă de babuin.
Procedura, efectuată de către Leonard L. Bailey
de la Loma Linda University Medical Center,
iniŃial a părut să fie de succes, dar Fae a murit
21 zile mai târziu de o infecŃie a rinichilor.
Procedura a fost supus la o largă dezbatere
privind aspectele etice şi juridice.
 Sfârşit
partea II
III.TEHNICI DE HISTOCOMPATIBILITATE
ÎN LABORATOARELE HLA

As.Univ.Dr.As.SAMAȘCA GABRIEL
Catedra de IMUNOLOGIE
UMF CLUJ, mai 2012
 TIPURI DE GREFE

http://health.rush.edu/HealthInfo http://t1.gstatic.com/images
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/im rmation/graphics/images/en/140 ?q=tbn:ANd9GcTUn5MPQ
ages/ency/fullsize/19083.jpg 76.jpg 8dtMop1Cprz5_h_eelc1sJF
Cq7pQ8zRyXOjuRMMlbbq

http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcS
lRbvtZDmDCmdQn6ftLzdDzDxb4bCxKm9nE http://t1.gstatic.com/images?q=tbn:A http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd
uBCbV9ow3h0NhIVhg Nd9GcRZ0gukuLRZ_4eSbOseKXvswg 9GcTkzWNrJxUPEuWeesZliR3VsskNS33
lXrjA3as1I9X2j6sNhc15tt_Zs _7HsiJYA-GfyQbTM9uR_-
 GREFELE DE PIELE, OS ŞI CORNEE

● Grefele de piele, os şi cornee - grefe “homostatice”, care joacă rolul unic de suport
organic pentru celulele primitorului, care vin şi colonizează breşa tisulară în timp ce
celulele grefate sunt respinse.
 GREFA DE RINICHI

● Grefa de rinichi:
1. determinarea Ag. eritrocitare în sistemul ABO, Rh.
2. determinarea Ag. HLA clasa I şi a II-a
3.Compatibilitatea directă (Cross-match) între serul primitorului şi limfocitele
donatorului
4. Sreening periodic al serurilor de primitori pentru Ac. citotoxici.
● Rolul compatibilitatii pentru locusurule A şi B este controversat datorită numărului
mare de alele care îngreunează găsirea unor persoane HLA identice, compatibilitatea
pentru locusul B fiind mai importantă decât pentru locusul A.
- Ag. HLA C fiind foarte puŃin imunogene nu influenŃează soarta grefei.
● Rolul cel mai important pare sa fie al locusului DR, incompatibilitatea DR = stimulul
major care declansează răspunsul imun în grefa renală; rolul compatibilităŃii DR creşte
la a doua, a treia grefare.
 GREFA CARDIACĂ ŞI GREFA DE FICAT

● Grefa cardiacă:
Se respectă în general compatibilitatea ABO şi cross match negativ, din cauza lipsei
unui organ artificial de înlocuire şi a urgenŃei de găsire a unui donator.
● Grefa de ficat:
Practic în situaŃii neurgenŃă se respectă compatibilitatea ABO şi cross match negativ,
fiind posibil ca în urgente grefa să fie făcută fără compatibilitate ABO şi HLA.
 GREFA DE MĂDUVĂ

Donorii şi primitorii sunt testaŃi pentru antigenele HLA-A, -B, -C, -DP, -DQ şi -
DR. Scopul este potrivirea perfectă pentru cele 6 antigene între primitor şi donor.
Tipizarea ADN este realizată din probe atât de la donor cât şi de la primitor pentru o cât
mai bună compatibilitate pentru clasa a II-a.
Deşi identitatea HLA rămâne cea mai bună alegere pentru transplantul de
măduvă, se folosesc donori fără legătură directă, din “Programul NaŃional al Donorilor de
Măduva osoasă” (National Bone Marrow Donor Program).

http://t0.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcSms
RloBVs_oxcAAEUl2lJKOnd_DuWbP6EUKu8wV
http://www.x-ald.nl/treatment-options/hsct/
tNEgjTMDMK7
 DETECłIA ANTIGENELOR HLA

ReacŃii serologice (ReacŃia de microlimfototoxicitate)

Celulele CD8 + T de la donatorul X să reacŃioneze cu moleculele MHC de clasa I de la donatorul Y.

Celule CD4 + T de la donatorul X să reacŃioneze cu moleculele MHC de clasa II de la donatorul Y.
 DETECłIA
DETECłIA ANTIGENELOR HLA

ReacŃii serologice (ReacŃia de microlimfototoxicitate)

Pentru tipizarea HLA – ABC (clasa I) Ag. se

studiază pe limfocite T totale izolate din: sânge periferic
recoltat pe anticoagulant (heparina / ACD) sau ganglioni
limfatici
1.Cenrifugare în gradient de densitate – pe
limfocite totale, apoi incubarea lor cu o baterie de
antiseruri-HLA, pentru formarea complexului Antigen-
Anticorp, în prezenŃa complementului, care
permeabilizează membrana celulară a limfocitelor, astfel
încât un clorant (eozina /albastru tripan) poate pătrunde
în celule şi le colorează. În cazul unei reacŃii pozitive
serurile anti-HLA reacŃionează cu antigenele limfocitare
corespunzătoare şi apare reacŃia de culoare. ReacŃia
negativă – celulele care nu reacŃionează cu anti-serurile nu
înglobează colorant.
= CITIRE la microscop inversat ÎN CONTRAST DE FAZĂ
- celulele vii mai deschise la culoare şi mai luminoase
(reacŃie negativă)
- celulele moarte mai închise la culoare şi de dimensiuni
mai mari (reacŃie pozitivă)
2.Cu Bile magnetice – pe limfocite T şi apoi
colorare cu Acridin-orange şi Ethidiumbromid
= CITIRE ÎN DUBLĂ FLUORESCENłĂ
 DETECłIA ANTIGENELOR HLA

ReacŃii serologice (ReacŃia de microlimfototoxicitate)

Pentru tipizarea HLA – DR, DQ (clasa II ) Ag.
se studiază doar pe limfocite B izolate din sângele
periferic sau fragmente de splină
1.Cu anticorpi monoclonali : - OKMI pentru
liza monocitelor OCH pentru liza celulelor CD11+ recoltat
pe ACD - OKT3 pentru liza celulelor CD3+
2.Cu Bile magnetice – invelite cu anticorpi
monoclonali specifici pentru epitopul lanŃului beta
monomorf al antigenelor HLA clasa II. Prin incubarea
sângelui recoltat pe anticoagulant cu bilele, limfocitele
purtătoare de antigene HLA clasa a II-a formează rozete,
pot fi apoi separate cu ajutorul unui separator magnetic şi
apoi spălate. Limfocitele izolate pot fi folosite pentru
tehnica de microlimfocitotoxicitate = după adăugarea
limfocitelor pe placă, Ag. se vor liza în prezenta Ac.
corespunzători şi ai complementului. Colorarea se face cu
acridin orange şi ethidium bromid).
CITIRE ÎN DUBLĂ FLUORESCENłĂ: celulele vii sunt colorate
în verde - celulele moarte (lizate) sunt colorate în rosu
INTERPRETAREA REZULTATELOR: 0-10 % = scor 0,
10-30 % = scor 2, 30-60 % = scor 4, 60-80 % = scor 6,
80-100 % = scor 8
 DETECłIA
DETECłIA ANTICORPILOR HLA

CDC şi ELISA

• Reaction scheme Biotest AbScreen/AbIdent

Colored product
PNP Substrate
  P   Anti-human IgG AB, enzyme labeled
Anti-HLA antibody from patient sample
HLA class I/II antigens (coated)
Class I: from Thrombocyte pool
Class II: from B-Lymphocytes

Microtiter plate (MTP)

http://www.youtube.com/watch?v=GsJHYeQy5SU&feature=related
DETECłIA
DETECłIA ANTICORPILOR HLA

CDC şi ELISA
CDC SAU ELISA?
ELISA?
 FORMA DE PREZENTARE

• CDC ELISA

• Biotest Lymphoscreen • Screening

• Lymphoscreen ABC 60 [REF] 823 300 Biotest AbScreen HLA class I [REF]823 400
Screening and identification of antibodies Screening for antibodies against HLA class I
against HLA class I antigens antigens

• Lymphoscreen DR 30x2 [REF] 823 350 Biotest AbScreen HLA class II [REF]823 410
Screening and identification of antibodies Screening for antibodies against HLA class II
against HLA class II antigens antigens

• Identification
Biotest AbIdent HLA class I [REF]823 420
Identification of antibodies against HLA class I
antigens
Biotest AbIdent HLA class II [REF]823 430
Identification of antibodies against HLA class II
antigens

92
 ALELELOR HLA
DETECłIA ALELELOR

ReacŃii bazate pe DNA - prin biologie moleculară

PCR-SSP = sequence specific primers

(alele specific amplification).
Foloseşte secvenŃele specifice de primeri
care Ńintesc o secvenŃă particulară de ADN.
Procedura cunoscută ca PCR-SSP se
bazează pe aplicarea de specificităŃi înalte în
momentul amplificării, mai degrabă decât în
momentul hibridizării. Pentru ca SSP au
anumite Ńinte specifice, prezenŃa materialului
amplificat indică prezenŃa alelelor
corespunzătoare.
PCR--SSP
PCR
 PCR--SSP
PCR

SSP execution exemplified by the ABDR combitray

Negative control

HLA-A

HLA-B

PCR Cocktail
HLA-DR
 PCR--SSP
PCR

For each typing a mastermix has to be

prepared out of the following components

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O

7 µl Taq Polymerase
(5u/µl)

Mix well, then 10 µl of the mastermix are added to the

negative control (black label).
After that add 110 µl DNA (approx. 100 ± 50 ng/µl)
 PCR--SSP
PCR

Für jede Typisierung muß zunächst ein

Mastermix aus den folgenden Komponenten
erstellt werden:

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O

Pipette 10 µl of this mastermix in each

well. To avoid contaminations with
Gut mischen, anschließend werden 10 µl des Ansatzes zur
primers, pipette the mastermix on the
Negativkontrolle hinzu pipettiert (schwarze Markierung).
side of the well as indicated.
Danach Zugabe von 110 µl DNA (approx. 100 ± 50 ng/µl)
 PCR--SSP
PCR

440 µl PCR Cocktail

Seal the PCR tray using the
enclosed foil.
550 µl H2O
 PCR--SSP
PCR

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O

Take care of sealing the tray

tight.
 PCR--SSP
PCR

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O

Transfer the tray into the thermocycler

and start the PCR.
 PCR--SSP
PCR

• Prepare a 2% agarose
gel by boiling 5 g
agarose in 250 ml of 1 x
1 2 TBE in a microwave
oven or on a heating
440 µl PCR Cocktail plate
1. When the solution is
clear, cool it down below
60°C stirring
2. Add 4 µl ethidium
bromide
3 4 3. Subsequently pour the
agarose solution –
devoid of bubbles - into
a prepared and sealed
gel tray.
4. Place the combs (10µl
pockets) and keep it at
room temperature for at
least 10 minutes.
 PCR--SSP
PCR

1 1. After the agarose has

2
solidified the gel is
inserted into the gel
chamber. The combs are
removed and the gel is
covered with 1 x TBE.
2. Pipette the entire PCR
mixtures (10 µl) into the
gel pockets.
3 4
3. The electrophoresis
takes place in 15 to 25
minutes at 8V/cm.
4. The gel is placed on an
UV transilluminator and
photographed for
documentation and
interpretation.
 PCR--SSP
PCR

•Sample
application
point
440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O
Primer
band

Control
band
Primermix-
specific
band
 PCR--SSP
PCR

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O

Click onto the corresponding bands on the screen and press "typing"
 PCR--SSP
PCR

440 µl PCR Cocktail

550 µl H2O
Sfârşit
We love
learning about
MHC.

We will have an exam