CAPITOLUL XV

GENUL MYCOBACTERIUM

Genul Mycobacterium ce aparţine familiei Mycobacteriaceae şi

ordinului Actinomicetales cuprinde un grup de peste 71 de specii, care
pot fi strict patogene, oportuniste sau exclusiv saprofite pentru om.
Numele genului Mycobacterium vine din limba greacă, de la Myces =
ciupercǎ şi mucegai bacterion = bastonaş. Termenul a fost propus de
Lehmann şi Newman în 1896.
Mycobacteriile prezintǎ următoarele caractere:
a) sunt bacili scurţi, drepţi sau uşor încurbaţi,
b) sunt strict aerobi,
c) sunt imobili,
d) nu formeazǎ spori sau capsulǎ;
e) nu se colorează în coloraţia Gram clasică,
f) sunt acid-alcoolo-rezistenţi (AAR);
g) se multiplicǎ lent, având un timp de generaţie (T.G.) lung. T.G.
în condiţii optime de multiplicare este de 18-24 de ore pentru
M. Tuberculosis comparativ cu 15-30 minute pentru flora
bacterianǎ comunǎ. Ca urmare, pe mediile de cultură solide
creşterea este de asemenea lentă: 2-8 săptămâni.
Mycobacteriile saprofite au un T.G. de mai scurt decât M.
tuberculosis.
h) sunt distruşi de radiaţiile ultraviolete.

Mycobacterium tuberculosis sau bacilului Koch (bK)

descoperit pe 24 martie 1882, de cǎtre Robert Koch, reprezintǎ agentul
etiologic al tuberculozei - boalǎ infecto-contagioasǎ cu evoluţie cronicǎ,
vindecabilǎ sub tratament şi largǎ rǎspândire în populaţie.
M. tuberculosis împreunǎ cu Mycobacterium bovis (agentul
etiologic al tuberculozei bovine, afecţiune mult mai rară în prezent, cu
transmitere pe cale digestivă) şi Mycobacterium africanum (întâlnit în
Africa Centrală şi de Vest) formeazǎ Complexul M. tuberculosis.
Speciile acestui complex şi Mycobacterium leprae (agentul etiologic al
leprei - care nu este cultivabil pe mediile de cultură) reprezintǎ singurele
specii din genul Mycobacterium care sunt strict patogene pentru om. În
rest, cele mai multe specii ale acestui gen sunt saprofite sau condiţionat
patogene pentru om (oportuniste), unele fiind capabile sǎ determine
ocazional îmbolnǎvire, în special la persoanele cu imunodeficienţe
(importanţa lor a crescut în condiţiile multiplicării cazurilor de infecţie
HIV-SIDA). Aceste micobacterii atipice cunoscute şi ca non-
tuberculoase au importanţǎ deoarece pot interfera procesul imun din
tuberculozǎ, nu pot fi diferenţiate cu uşurinţǎ la examenul microscopic şi
pot determina, în special la pacienţii imunodeprimaţi, boli asemǎnǎtoare
clinic, radiologic şi histopatologic cu tuberculoza, numite
micobacterioze. Deosebit de tuberculozǎ unde transmiterea este
aerianǎ, iar sursa este bolnavul cu TBC cu localizare de regulǎ
pulmonarǎ, micobacteriozele sunt afecţiuni care nu prezintǎ contagiune
interumanǎ. Deoarece sensibilitatea la chimioterapice este diferitǎ faţǎ
de B. Koch, identificarea speciei de micobacterie netuberculoasǎ ajutǎ la
ghidarea tratamentului în funcţie de antibiogramǎ. Clasificarea
micobacteriilor atipice se face în funcţie de viteza creşterii bacililor pe
mediile de culturǎ, morfologia macro şi microscopicǎ a coloniilor şi
comportamentul acestora la luminǎ sau întuneric, precum şi dupǎ
particularitǎţi metabolice esenţiale recunoscute prin reacţii biochimice
ale bacililor izolaţi prin culturǎ.

Tabel XV. 1. Clasificarea micobacteriilor izolate la om:

Micobacterii cu creştere lentǎ:

A. Specii strict patogene:

Complexul M. Tuberculosis
M. tuberculosis
M. bovis
M. africanum
B. Micobacterii netuberculoase condiţionat patogene:
Grup fotocromogene - cu pigmentare la luminǎ:
M. kansasii
M. marinum
M. simiae
M. asiaticum
Grup scotocromogene, cu pigmentare la luminǎ şi
întuneric:
M. scrofulaceum
 M. szulgai
Grup nefotocromogene
Complexul M. Avium - M. Intracellulare
M. ulcerans
M. malmoense
M. xenopi
C. Micobacterii netuberculoase nepatogene:
M. gordonae
M. gastri
Complex M. Terrae
M. shimoidei

Micobacterii netuberculoase cu creştere rapidǎ:

a.Micobacterii netuberculoase condiţionat patogene:
-grup I noncromogene:
M. fortuitum
M. chelonei
b. Micobacterii netuberculoase nepatogene:
1. grup II termofile:
M. smegmatis
M. phlei
M. thermoresistibile
2. grup III scotocromogene:
M.flavescens
3. grup IV altele:
M. vaccae
M. aurum
M. rhodesiae
 Morfologie şi caractere de cultură:
Genul Mycobacterium include bacili strict aerobi, cu
dimensiuni reduse, de 3-10  lungime / 0,3- 0,6  grosime, frecvent
dispuşi în „corzi şerpuite” sau în grǎmezi caracteristic pentru B. Koch
sau M. Bovis, sau dispuşi izolat la M. atipice.
Structura celularǎ a micobacteriilor:
Protoplastul (interiorul celulei micobacteriene) e reprezentat de
citoplasmǎ în care se identificǎ granule dense (polifosfaţi) sau granule
translucide (cu lipide) şi corpul nuclear bine definit dar fǎrǎ membranǎ
nuclearǎ. Prin inginerie geneticǎ s-au descris „sonde DNA” cu ajutorul
cǎrora se poate face identificare de specie sau se pot evidenţia cantitǎţi
infime de ADN micobacterian în produsele patologice prin tehnica
reacţiei de polimerizare în lanţ (PCR).
Peretele celular este separat de citoplasmǎ prin membrana
citoplasmaticǎ. Structura peretelui celular realizează o veritabilă barieră
hidrofobă la penetrarea intracelulară a coloranţilor hidrosolubili şi
conferă micobacteriilor atât acid-alcoolo-rezistenţă cât şi o rezistenţă
crescută la desicare, facilitând supravieţuirea. Structura complexă, cu
conţinut foarte bogat în lipide (20-45 % din greutatea uscată), este
responsabilă pentru permeabilitatea foarte scăzută a peretelui celular şi,
în consecinţă, pentru ineficienţa majorităţii antibioticelor asupra acestui
microorganism.

Fig.XV.1. M.tuberculosis - www.flickr.com/photos

 Structura în trei straturi a peretelui celular al micobacteriilor:
- mureinǎ: un peptidoglican format din lanţuri lungi de polizaharid
solidarizate de tetrapeptide,
- un strat format din arabino-galactan + acizi micolici + sulfolipide +
cord factor,
- micozide: peptidoglicolipide şi fenolglicolipide.
Lipidele din peretele celular sunt direct implicate în proprietǎţile ce
caracterizeazǎ micobacteriile (virulenţǎ, interacţiunea cu gazda infectatǎ,
rǎspunsul la tratament):
- arabinoglicani şi peptidoglicani subiacenţi (mureinǎ) - conferǎ
celulei forma şi rigiditatea;
- grosimea stratului de micozidele este implicată în relaţia
microorganism - gazdă şi facilitează supravieţuirea M. tuberculosis în
interiorul macrofagelor; micozidele sunt identificabile la microscopul
electronic, sunt specifice speciilor sau chiar tulpinilor de micobacterie,
determinǎ morfologia coloniilor, sunt determinanţi antigenici;
- acizii micolici - acizi graşi cu lanţuri lungi, sunt responsabili de
formarea granuloamelor.
- fosfolipide - responsabile de necroza cazeoasă;
- cord-factorul, format din dimicolat de trehaloză, prezent de
asemenea la tulpinile virulente - inhibă migrarea leucocitelor, determină
leziuni granulomatoase şi serveşte ca adjuvant antigenic. Este implicat
în dispunerea în corzi a M. Tuberculosis (BK).
Proteinele, numite tuberculoproteine, sunt responsabile de
instalarea hipersensibilităţii de tip întârziat ce apare odată cu
primoinfecţia TBC (vezi fenomenul Koch). Extractul proteic purificat
(PPD – purified protein derived) derivat din tuberculoproteina brută este
etalonat în diferite concentraţii în scopul evidenţierii infecţiei
tuberculoase, prin testare IDR la PPD.

Tuberculoza pulmonară
Tuberculoza este o afecţiune infecto-contagioasă, cu tendinţă la
cronizare, evoluţie în pusee acute, separate de perioade de remisiune.
Poate afecta orice organ, dar cea mai frecventă localizare este cea
pulmonară (90% din cazuri).
Riscul unei persoane sănătoase de a se infecta cu bK depinde de
numărul şi gradul de contagiozitate al surselor cu care vine în contact şi
de durata şi proximitatea contactului cu acestea. Tuberculoza care
apare consecutiv infecţiei la o persoanǎ neinfectatǎ anterior este
denumită tuberculoză primară. Nu orice infecţie (care presupune
declanşarea răspunsului imun) evoluează spre îmbolnăvire; doar 10%
dintre infectaţi se îmbolnăvesc în decusul întregii vieţi, în primii doi ani
postinfecţie riscul fiind mai ridicat (5%). Apariţia tuberculozei la persoane
deja infectate, fie consecutiv unei reinfecţii, fie a reactivării endogene a
focarelor de diseminare postprimară, unde au persistat bacili tuberculoşi
în stare dormantă, este numită tuberculoză secundară. Dacă
tuberculoza primară apare în special la copii sau adulţii tineri,
tuberculoza secundară este caracteristică adulţilor.
Sursa de infecţie este reprezentată de omul bolnav, eliminator de
bacili. Transmiterea este interumană, se face pe cale aeriană, prin
intermediul picăturilor Pflugge care conţin bacilii tuberculoşi eliminaţi de
omul bolnav prin tuse, strănut, vorbit. Bacilii inhalaţi care reuşesc să
ajungă în teritoriile pulmonare periferice şi inferioare, determină o reacţie
inflamatorie de tip exudativ, alveolită, numită şancru de inoculare.
Macrofagele fagocitează bacilii dar nu pot distruge bacilii în totalitate,
neavând un echipament enzimatic adecvat. Virulenţa bacteriană este în
mare măsură legată de capacitatea de a supravieţui şi a se multiplica in
mediul intracelular al fagocitelor mononucleare. Bacilii care se multiplică
intracelular, diseminează pe cale limfo-hematogenă, apare adenopatia
satelită şi rezultă complexul primar. Diseminarea pe cale limfatică şi
sanguină este o caracteristică a tuberculozei primare, fiind generalizată
în tot organismul. După 4-12 săptămâni, subiectul dezvoltă
hipersensibilitate de tip întârziat mediată celular (tipul IV în clasificarea
Gell şi Coombs) dar şi cu creşterea activităţii bactericide contra bK şi
prin distrugerea macrofagelor parazitate şi tolerante faţă de bK, prin
limfocite T citotoxice. Din acest motiv doar un numǎr foarte mic de bacili
ajung în circulaţie şi de aici rǎmân ca dormanţi în locuri prefereniale din
organism, puternic oxigenate. In majoritatea cazurilor această
primoinfecţie TBC este subclinică (95% din cazuri) şi trece neobservată
putând fi diagnosticată retroactiv printr-o reacţie pozitivă a testării
tuberculinice.
Evoluţia poate fi spre:
1. vindecare, cu fibroză sau calcificare,
2. extensie, din aproape în aproape,
3. diseminare pe cale limfatică sau sanguină (t.b.c. miliară).
În anumite condiţii sau morbidităţi predispozante ca: diabetul
zaharat, boala ulceroasă, hepatita cronică, stressul, imunosupresia,
iradierea, tratament cu corticosteroizi, bacilii tuberculoşi dormanţi, din
leziunile de diseminare postprimară, îşi pot relua multiplicarea.
Reactivarea endogenă debutează, de obicei, de la nivelul vârfului
pulmonar, cu extindere în sens apico-caudal apărând boala, adică
tuberculoza pulmonară secundară, care se caracterizează prin evoluţia
către necroză de cazeificare, cu diseminare loco - regională şi fără
tendinţă de vindecare spontană, dar cu vindecare prin fibroză sub un
tratament corect. În lipsa tratamentului specific, boala este fatală la 50%
din indivizi.
Diagnosticul se susţine pe baza examenului bacteriologic (bK
prezent în cultură), examen radiologic pulmonar (leziuni polimorfe
infiltrative, nodulare, cazeoase-ulcerate sau cavitare cu localizare
predilectă la nivelul lobilor superiori), examen clinic (tuse prelungită
peste 3 săptămâni cu sau fără hemoptizie, sindrom subfebril prelungit,
semne de impregnare bacilară), argumente epidemiologice (contact cu
un bolnav contagios), teste imunologice pozitive (IDR la PPD,
Quantiferon TB) sau examen histopatologic cu prezenţa de granuloame
giganto-epiteloide cu necroză prezentă.

Tuberculoza extrapulmonară.
Tuberculoza poate avea şi localizare extrapulmonară, fie
intratoracică, fie extratoracică. Cea mai frecventă formă de localizare
extrapulmonară intratoracică este pleurezia, iar extratoracică este
tuberculoza ganglionară.
Alte forme de tuberculoză sunt: tuberculoza osteo-articulară,
uro-genitală, TB gastro-intestinală, peritonita şi ascita TB, meningo-
encefalita, pericardita TB, TB cutanată. Diagnosticul de tuberculoză
extrapulmonară este responsabilitatea specialistul de organ fiind susţinut
de examenul histopatologic sau prin instrumente specifice fiecărei
localizări. Frecvent, tuberculoza extrapulmonară se asociază cu infecţia
H.I.V., SIDA. În stadiile finale ale bolii SIDA, sunt frecvente şi
îmbolnăvirile cu micobacterii nontuberculoase cu localizare
preponderent extrapulmonară.

Imunitate şi hipersensibilitate. Fenomenul Koch.

Robert Koch, în 1891, aduce dovezi experimentale despre
modificările care apar într-un organism gazdă ca urmare a unei infecţii
cu micobacterii, punând bazele înţelegerii răspunsului imun în
tuberculoză. El a observat că răspunsul organismului este diferit la o
prima inoculare subcutanată cu bacili vii şi virulenţi comparativ cu o a
doua inoculare a unei doze similare, la acelaşi cobai, efectuată la o
distanţă de câteva săptămâni (teren deja infectat). Astfel, după prima
injectare subcutanată de bacili tuberculoşi, reacţia inflamatorie imediată
dispare după primele 48 de ore, iar ulterior, după 10-14 zile, la locul
puncţiei, se va forma un nodul, care creşte dimensional, se ulcerează,
determină formarea unui şancru, cu adenopatie regională şi necroză
cazeoasă centrală. În câteva luni animalul moare prezentând semne
evidente de boalǎ, autopsia relevând modificări specifice diseminate la
nivel ganglionar retroperitoneal şi mediastinal, ficat, plămâni, rinichi,
splină, seroase. Nu acelaşi lucru se întâmplă dacă la acelaşi animal,
după 3-4 săptămâni de la prima administrare de bacili, se efectuează o
a doua inoculare subcutanată la celălalt picior. Local apare o induraţie
de culoare închisă care se necroză la 72 de ore şi în câteva zile se
vindecă. Poate apare febra ca manifestare generală dar adenopatia sau
leziunile diseminate în alte organe determinate de bacilii inoculaţi a doua
oară sunt absente. Deşi animalul moare, leziunile sunt determinate de
bacilii inoculaţi iniţial.
Se demonstrează astfel că prima infecţie determină modificări
semnificative în răspunsul gazdei faţă de o nouă infecţie prin apariţia:
4. hipersensibilităţii la bacilii inoculaţi (reacţie rapidă şi brutală locală
cu necroză la 48-72 ore),
5. rezistenţă tradusă prin capacitatea de a localiza, limita sau exclude
o nouă îmbolnăvire: lipsa afectării ganglionului satelit, lipsa
diseminării limfohematogene, vindecare spontană, rapidă şi
completă a leziunilor celei de a doua inoculări.

Principiul acesti fenomen a guvernat logica vaccinării cu bacili de

tip bovin vii dar cu virulenţă atenuată din BCG (Bacili Calmette Guerin).

DIAGNOSTICUL ÎN TUBERCULOZĂ
Examenul bacteriologic

Importanţǎ:
 asigurǎ diagnosticul etiologic de certitudine al tuberculozei,
 identificǎ rapid sursele (examen microscopic) şi previne
rǎspândirea infecţiei şi a bolii,
 susţine diagnosticul de activitate al bolii,
 reprezintǎ criteriu de stabilire a tratamentului, de apreciere a
evoluţiei bolii şi de vindecare a leziunilor bacilare,
  urmǎreşte chimiosensibilitatea germenilor cu identificarea
tulpinilor cu rezistenţǎ multiplǎ (MDR, XDR),
 stǎ la baza unor indicatori epidiometrici de urmǎrire a
endemiei tuberculoase în teritoriu (ex: rata de confirmare
bacteriologicǎ a cazurilor pulmonare).

Produse patologice care pot fi supuse prelucrǎrii pentru examen

bacteriologic pentru micobacterium tuberculosis (indicaţia depinde de
localizarea unde se suspicioneazǎ tuberculoza):

 sputǎ expectoratǎ spontan

 sputǎ indusǎ prin soluţie
salina hipertonǎ (NaCl 4-
10%)
 „spǎlǎturǎ bronşicǎ”, lichid
de aspirat bronşic sau lavaj
bronşiolo-alveolar
 lichid pleural, cefalo-
rahidian, pericardic, ascitic
sau sinovial
 urinǎ, lichid spermatic sau
sânge menstrual,
 aspirate din colecţii Douglas, Fig. XV.2
piosalpinx, abcese
osifluente, www.scienceline.ro/.../5/
 prelevate de ţesut pulmonar,
bronşic, ganglionar, pleural, TUBERCULOZA.jpg
peritoneal

De subliniat că recoltarea produselor patologice, transportul către

laborator în cel mai scurt timp posibil, tratarea specifică a fiecărui
eşantion (decontaminare chimică, centrifugare, neutralizare) sunt etape
esenţiale în creşterea ratei de succes a examenului bacteriologic.

Examenul bacteriologic în tuberculozǎ presupune:

1. examen microscopic direct – coloraţia Ziehl-Neelsen
2. examenul prin culturǎ – însǎmânţarea pe medii solide şi lichide
3. identificarea speciilor de micobacterii
 4. determinarea chimiosensibilitǎţii germenilor tuberculoşi
(antibiograma)
5. metode de biologie molecularǎ de detecţie a micobacteriilor.

 Examen microscopic direct - coloraţia Ziehl-Neelsen

Examenul microscopic şi implicit tehnica coloraţiei Ziehl – Neelsen

se bazeazǎ pe acido-alcoolo-rezistenţă, proprietate care este specifică
micobacteriilor dar şi altor germeni (ex.Corynebacterium, Aspergillus,
Nocardia, Rhodoccocus sau Gordona).
Examen microscopic pune în evidenţǎ bacili acid-alcoolo-rezistenţi
(BAAR) în produsele patologice intens bacilifere (forme cavitare sau
cazeos-ulcerate de tuberculoza pulmonarǎ). Astfel marele avantaj al
metodei este acela de a pune în evidenţǎ formele intens contagioase,
permiţând identificarea surselor şi declanşǎrii deciziilor cu vizǎ
epidemiologicǎ. Este rapid, ieftin, uşor de efectuat. Specificitatea
examenului microscopic direct este de 99,8%, iar sensibilitatea raportatǎ
la examenul clinic este de 53% (rezultatul negativ se coreleazǎ cu un
produs sǎrac în bacili, sub 10.000 germeni/ml).
Dezavantajele testului, reprezentate de lipsa de informaţii privind
specia de micobacterie (BK, M. Bovis sau M. atipice), viabilitatea
acestora sau sensibilitatea la medicaţia specificǎ, impun confirmarea
sistematicǎ prin culturǎ.
Coloraţia clasică Ziehl – Neelsen:
- frotiurile sunt fixate şi colorate 10 minute la cald cu 3-4 ml de
fuxinǎ bazicǎ fenicată 0,3%, lama încǎlzindu-se deasupra flacǎrii pânǎ
la emisia intensǎ de vapori, dar fǎrǎ fierberea colorantului,
- sunt apoi spǎlate şi tratate 3 minute cu o soluţie slabă de acid –
alcool (HCl 3%), care decolorează toţi constituenţii produsului patologic,
cu excepţia micobacteriilor. Rezistenţa la acţiunea acizilor se datorează
în principal conţinutului ridicat în lipide a peretelui celular. Această
proprietate tinctorială constă în fixarea solidă a anumitor coloranţi pe
corpii bacilari, fixare care rezistă selectiv acţiunii decolorante a acizilor şi
alcoolului.
- se spală şi recolorează fondul cu albastru de metilen 0,3% timp
de 30 secunde, obţinându-se frotiuri pe care micobacteriile apar ca
bastonaşe roşii drepte sau uşor încurbate, deseori cu structurǎ
granularǎ, izolate sau grupate în perechi sau grǎmezi, care se
detaşeazǎ pe fondul albastru.
 Ocazional s-au mai descris forme foarte mici cocoidale sau
gigante, sau forme L - structuri sferice cu perete celular deficitar, forme
morfologice care apar în condiţii particulare de dezvoltare şi care par a fi
capabile de a reveni la forma bacilară standard. Importanţa lor nu este
cunoscută total făcându-se supoziţii asupra existenţei unui ciclu vital şi o
posibilă relaţie de supravieţuire îndelungată a micobacteriilor în condiţii
defavorabile, cu reluarea multiplicării după un timp îndelungat.
Examinarea frotiurilor se face cu microscop optic folosindu-se
obiectiv cu imersie, cu putere mǎritoare de 1000x. Obişnuit se
examinează minim 100 de câmpuri şi pânǎ la 300 câmpuri la cazurile
dubioase. Rezultatele pozitive se exprimǎ semicantitativ deoarece
exprimă unitar densitatea BAAR pe frotiu, indiferent de metoda folosită,
permiţând comparaţii la acelaşi bolnav la momente diferite de evoluţie,
între bolnavi sau între laboratoare, astfel:

Tabel XV.2. Interpretarea examenului microscopic pentru

Mycobacterium:
Ziehl-Neelsen (1000x) Rezultat Fluorescenţă
(semicantitativ)
0 BAAR negativ 0
1-2/300 câmpuri Dubios 1-2/30 câmpuri
1-9/100 câmpuri Se specificǎ nr. exact 1-9/10 câmpuri
1-9/10 câmpuri 1+(+) 1-9/1 câmp
1-10/1 câmp 2+(++) 10-90/1 câmp
>10/1 câmp 3+(+++) >90/1 câmp
 Fig. XV. 3. www.srp.ro/images/tuberculoza3.jpg
Alte coloraţii speciale se pot efectua cu fluorocromi: auramină,
rhodamină, bacilii apǎrând galben strǎlucitor pe fond întunecat.
Examinarea se face cu ajutorul unui microscop cu fluorescenţă şi
necesită o durată semnificativ mai mică, dar necesită reconfirmare prin
examinare cu MO a cazurilor pozitive. Metoda nu este folosită în mod
curent în laboratoarele din reţeaua de tuberculoză.

2. Examenul prin culturǎ –

Însǎmânţarea pe medii solide şi lichide
Cultura reprezintă metoda de bază pentru identificarea directă a
micobacteriilor, confirmând suspiciunea de tuberculoză activ - evolutivă.
Are drept avantaje sensibilitatea crescută, cu un „prag” de 10-100
bacili/ml de produs pentru un rezultat pozitiv, dovedirea viabilitătii
germenilor, posibilitatea identificării speciei dar şi a testării
chimiosensibilităţii germenilor. Cultura pozitivǎ creşte numǎrul de cazuri
de TB confirmatǎ bacteriologic cu 30-50% faţǎ de examenul
microscopic. Dezavantajele sunt reprezentate de timpul lung de obţinere
a rezultatelor (3-8 săptămâni), tehnica laborioasă şi exigentă,
necesitatea pregătirii speciale a produselor patologice, ce provin din
zone normal colonizate sau cu risc de contaminare la recoltare (ex.
sputǎ). Pregǎtirea se face prin omogenizare-decontaminare prin agenţi
chimici (NaOH), cu riscul pierderii de unităţi viabile. Însămânţarea
produselor patologice pentru evidenţierea micobacteriilor necesită medii
speciale, mediul de elecţie fiind Lowenstein-Jensen, cu amidon,
glicerină, ou, verde malahit şi eventual antibiotice: penicilină, acid
nalidixic (mediu solid selectiv). Se însǎmânţeazǎ 3 tuburi pentru fiecare
produs cu 4 picǎturi din sediment care trebuie sǎ inunde suprafaţa
mediului şi se incubeazǎ în poziţie înclinatǎ (25-30 grade). Culturile se
incubează 2 luni în termostat la 370 C. Este de dorit sǎ se facǎ
inocularea simultană şi a unui mediu lichid (Middlebrook 7H9) pentru
sisteme de detecţie rapidă precum MBBacT sau BACTEC, ceea ce ar
conduce la obţinerea unui rezultat mai rapid (7-21 de zile).
Prima citire a tuburilor se face după 24-48 ore pentru a exclude
contaminarea (care impune repetarea recoltării), iar ulterior examinarea
se face la fiecare 7 zile până la 8 săptămâni. O cultură microbiană
crescută în primele 7 zile exclude infecţia cu M. Tuberculosis şi va fi
evaluată pentru micobacterie atipică.
Pe mediul Lowenstein, mycobacteriile prezintă două tipuri de
creştere:
6. creştere eugonică (M. Tuberculosis), sub forma unor colonii mari,
cu suprafaţă rugoasă (R), conopidiforme, de culoare crem gălbui-
palide, colonii ce se dezvoltă în 3 până la 8 săptămâni, în medie
după 3 săptămâni.
7. creştere disgonică, (M. Bovis), colonii mici, S, care apar după 4-8
săptămâni.
8. unele mycobacteriile atipice au o creştere mai rapidă, după 3-5
zile, pot fi colorate, altele, cu creştere lentă necesită teste
fenotipice, de identificare a speciei pentru a le diferenţia de M.
Tuberculosis.

Rezultatele se notează astfel: absenţa coloniilor la 60 zile negativ,

sub 30 de colonii pe tub se notează numărul exact de colonii, 30-100
colonii: 1+, peste 100 colonii / tub: 2+ (++), colonii confluente
nenumărabile 3+ (+++). Pentru fiecare din tuburile examinate rezultatele
se înregistrează în registrul de laborator.
BACTEC/MBBacT
Reprezintă metode rapide de cultură a micobacteriilor care
remediază, în mare măsură, dezavantajul rezultatului tardiv al culturii
clasice. Au la bază proprietatea eliberării de CO2 în cursul
metabolismului micobacterian. Acesta este detectat fie prin sistem
radiometric (BACTEC 460TB) ce foloseşte un mediu lichid conţinând
acid palmitic marcat cu 14C (micobacteriile catabolizează acidul palmitic
marcat şi eliberează 14CO2 care este cuantificat automat); fie este
detectat prin sistem colorimetric. În sistemul colorimetric tuburile de
mediu lichid au fixate în partea declivă un detector colorimetric a cărui
culoare variază de la verde închis la galben pe măsura acumulării CO2.
Schimbarea culorii este semnalată optic şi sonor de către aparat
(MB/Bact, MGIT 960). Cultura astfel obţinută trebuie reconfirmată prin
frotiu. Rezultatul se obţine cu peste 10 zile mai repede comparativ cu
metoda clasică, în 20-25% din cazuri semnalul pozitiv poate apare în 5-7
zile.

3. Metodele de identificarea a speciilor de micobacterii sunt :

-viteza de creştere a micobacteriilor (rapidǎ, lentǎ),
-morfologia macroscopică a coloniilor (eugonice, disgonice),
-pigmentaţia coloniilor (culoare, fotocromogene, scotocromogene),
-morfologia microscopică (în benzi, în grǎmezi),
-testul niacinei pozitiv pentru M. tuberculosis, negativ pentru M.
bovis sau atipici,
-testul catalazei negativ pentru M. tuberculosis, negativ pentru M.
bovis şi pozitiv pentru M. Atipice.
În activitatea curentă a laboratoarelor specializate obiectivul
rămâne diferenţierea M. tuberculosis de restul micobacteriilor non-bk.

4. Determinarea chimiosensibilitǎţii germenilor tuberculoşi

(antibiograma)
M. tuberculosis este sensibil in vitro la toate medicamentele
antiuberculoase. Regimurile incorecte de terapie, abandonurile
terapeutice, puseele active repetate conduc, deseori, la selecţia de
mutanţi rezistenţi care sunt prezenţi în proporţii extrem de mici în orice
tulpină sensibilă.
Chimiorezistenţa poate să apară la unul sau mai multe
chimioterapice (MDR - reprezintă chimiorezistenţa la cel puţin isoniazidă
şi rifampicină, XDR - chimiorezistenţă multiplă ), poate să fie primară
apărută la pacienţii care nu au primit niciodată tratament antituberculos
şi s-au infectat cu bacili chimiorezistenţi sau secundară (dobânditǎ) -
cea indusă de chimioterapie.
Spectrul de sensibilitate / rezistenţă al tulpinilor micobacteriene
poate fi determinat cu ajutorul antibiogramei. Principiul antibiogramei
(indiferent de metoda de testare folosită) constă în compararea creşterii
bacteriene de pe tuburile test (conţinând medicamente), cu cea de pe
tuburile martor, după însămânţarea unui eşantion reprezentativ din
populaţia bacilară de testat. Antibiograma directǎ foloseşte ca inocul
produs patologic pozitiv la microscopie, dupǎ decontaminare iar cea
indirectǎ se preparǎ din culturǎ. Cea de a doua are avantajul unui
inocul bine dimensionat dar întârzie rezultatul cu cel puţin 3-4
sǎptǎmâni. Metodele standardizate acceptate sunt reprezentate de
metoda proporţiilor (mǎsoarǎ proporţia de bacili rezistenţi din total, la o
concentraţie datǎ de medicament), metoda concentraţiilor absolute (ia
în considerare cea mai micǎ concentraţie de medicament care inhibǎ
creşterea), metoda raportului rezistenţei (comparǎ CMI pentru fiecare
tulpinǎ şi medicament cu CMI a tulpinii H37Rv).

5. Metode de biologie molecularǎ de detecţie a micobacteriilor

Diagnosticul pozitiv al tuberculozei se stabileşte pe baza criteriilor

bacteriologice („gold standardul” este reprezentat de examenul
microscopic direct corelat cu izolarea în culturi a unei tulpini de M.
tuberculosis) sau histopatologice (foliculul Koester).
Obstacolele ridicate de întârzierea rezultatului culturii BK au
condus la standardizarea unor noi tehnici diagnostice care utilizează
amplificarea genică:
-PCR-Polymerase Chain Reaction
-metoda sondelor ADN
-„Finger printing”-Restriction Fragment Lenght Polymorphism
Aceste metode evidenţiază prezenţa ADN-ului micobacterian
specific de gen sau tip, asigură identificarea speciilor, antibiograma prin
identificarea unor factori genetici de rezistenţă. Specificitatea este înaltă
şi diagnosticul foarte rapid, dar metodele sunt scumpe şi aparatura se
găseşte doar în laboratopare de înaltă performanţă.

Testarea hipersensibilităţii la tuberculină

Testul tuberculinic este metoda cea mai larg utizilată pentru a
stabili existenţa şi amploarea reacţiei de hipersensibilitate la antigenele
tuberculinice. Citirea reacţiei se face la 72 de ore, măsurându-se
diametrul transversal al zonei de induraţie roşie-violacee ce circumscrie
urma înţepăturii intradermice. O testare pozitivă (egală sau > 10mm)
semnifică prezenţa infecţiei cu Mycobacterium, care corespunde
histopatologic cu infiltraţie dermică perivasculară cu limfocite şi
macrofage - substrat al răspunsului de tip hipersensibilitate cutanată la
antigenul injectat. Testul nu dă nici un indiciu despre activitatea bolii. În
ţara noastră se utilizează tehnica injectării intradermice (metoda
Mantoux) a 0,1 ml soluţie (de concentraţie 2 U sau 10 U per 0,1 ml sol.
PPD IC-65). Din păcate, metoda nu are specificitate şi sensibilitate
crescută pentru infecţia cu Micobacterium tuberculosis varianta hominis
(bK), fiind frecvent întâlnite reacţiile de sensibilitate încrucişate după
vaccinare BCG sau infecţii cu micobacterii saprofite (atipice). Mai mult
testul poate fi negativ la o persoană deja infectată dacă a fost efectuat în
perioada antealergică, în caz de imunodepresii secundare
medicamentoase sau în boli grave, în deficite imune congenitale sau
câştigate, sau chiar în forme diseminate, extensive de tuberculoză.
Astfel rezultatul IDR la PPD trebuie corect interpretat în contextul
celorlalte informaţii disponibile, pentru a rămâne o sursă esenţială de
informaţii pentru diagnostic sau cu caracter epidemiologic.
Aceste limite au fost reduse prin teste noi precum QuantiFeron -
TB Gold or T Spot-TB care oferă un răspuns rapid calitativ de tip
DA/NU pentru screening-ul purtătorilor de Mycobacterium tuberculosis.
QTF este un test care măsoară producţia γ-interferon, de către un
subgrup distinct de limfocite T efectoare cu memorie, ca urmare a
contactului cu antigenele peptidelor mycobacteriene. Aceste proteine,
ESAT-6, CFP-10 şi TB7.7 lipsesc din toţi germenii conţinuţi în vaccinul
BCG şi din majoritatea mycobacteriilor non-tuberculoase cu excepţia M.
Kansasii, M. Szulgai şi M. Marinum. Detecţia şi cuantificarea γ-
interferonului prin tehnica ELISA stau la baza acestor teste.
Ambele teste sunt promiţǎtoare prin abilitatea lor de a discrimina
infecţia tuberculoasǎ recentǎ de sensibilizarea produsǎ secundar
vaccinǎrii BCG şi par sǎ aibe o sensibilitate mai ridicatǎ în detectarea
tuberculozei active.
În concluzie, testarea PPD sau quantiferon TB Gold sunt metode
indirecte de diagnostic ale infecţiei latente cu micobacterii. In cazul
utilizării concomitente a celor două teste, valoarea predictivă negativă
pentru infecţia cu M. Tuberculosis este >95% în cazul în care ambele
sunt negative. Astfel, combinaţia dintre cele două rezultate negative
aproape exclude diagnosticul atât de infecţie TB latentă, cât şi de TB
activă la indivizii imunocompetenţi.

Tratament. Terapia în tuberculoză respectă următoarele principii:

iniţiere imediat după confirmarea diagnosticului, terapie standardizată cu
respectarea dozelor şi ritmului de administrare, durata lungă de minim 6
luni în regim bifazic cu asocierea de 4 antibiotice în faza de atac şi
minim 2 în faza de continuare, monitorizare sub directa observare.
Antibioticele antituberculoase se clasifică în :
9. esenţiale (de linia I-a): Izoniazidă (HIN), Rifampicină (R),
Etambutol (E), Pirazinamidă (Z), Streptomicină (S).
 10. de rezervă (de linia a II-a): amikacina, kanamicina,
etionamidă, cicloserină, ciprofloxacină, protionamida.
Există scheme standardizate de tratament, potrivit recomandărilor
Organizaţiei Mondiale a Sănătăţii şi prevederilor Programului Naţional de
Control al Tuberculozei.
Prevenirea tuberculozei se face prin vaccinarea BCG, în prima
săptămână de viaţă şi chimioprofilaxia cu izoniazidă care se adresează
contacţilor cu vârste sub 18 ani din focarele de tuberculoză.

MYCOBACTERIUM LEPRAE
Numit şi bacil Hansen, după cel care l-a descoperit, în 1873. În
prezent, cazurile cele mai numeroase de lepră sunt în Asia. Bacilul este
necultivabil pe medii artificiale. Transmiterea bolii se face prin secreţii
nazale şi necesită contact îndelungat cu secretorii de bacili. Incubaţia
este de 2-10 ani. Formele clinice:
Lepra tuberculoidă – la persoanele cu imunitate celulară
indemnă. Leziunile sunt cutanate, sub formă de macule apigmentare,
nedureroase, de 1-10 cm diametru. Apar şi leziuni neurologice prin
infiltrat perineuronal, cu parestezii, anestezie.
Lepra lepromatoasă – la persoanele cu deficit al imunităţii
celulare. Leziunile sunt de tip granulomatos difuz, extensiv, cu afectarea
nasului, urechilor, pomeţilor (facies leonin). Bolnavii mai prezintă
tulburări neurologice (nevrite, anestezie) şi manifestări sistemice:
anemie, limfadenopatii.
Diagnostic – microscopie, diagnostic serologic.
Tratament: Sulfonamide – DAPSONA şi Rifampicină sau
clofazimin în cazurile rezistente. Tratamentul suprimă multipicarea
microorganismelor şi opreşte evoluţia bolii, dar nu vindecă leziunile deja
instalate.