NUCLEOTIDE SI ACIZI NUCLEICI

Teme abordate
1. Baze azotate, nucleozide, nucleotide – caracteristici structurale, funcţii biologice
2. Acizi nucleici: tipuri, roluri biologice
3. Nucleoproteine
4. Metode de analiza a acizilor nucleici

Baze azotate, nucleozide, nucleotide

Izolate iniţial de către anatomistul F. Miescher (1868) din puroiul extirpat chirurgical,
nucleinele, denumite ulterior nucleoproteine, sunt heteroproteine alcătuite dintr-o
componentă proteică bazică şi o grupă prostetică cu conţinut ridicat de acid fosforic, denumită
acid nucleic. În funcţie de acidul conţinut, se deosebesc ribonucleoproteine, ce conţin ARN
(acid ribonucleic) şi dezoxiribonucleoproteine ce conţin ADN (acid dezoxiribonucleic).
Importanţa deosebită a acizilor nucleici din nucleoproteine constă în rolul fundamental
de înmagazinare a informaţiei genetice şi de transcrierea acesteia în secvenţa de aminoacizi
din structura proteinelor.
Acizii nucleici sunt polinucleotide. Prin hidroliză acidă, bazică sau enzimatică, acizii
nucleici se degradează punând în libertate următoarele componente comune sau diferite:
a) baze azotate purinice sau pirimidinice;
b) pentoze: D-riboză sau D–dezoxiriboză;
c) resturi de acid fosforic.
Baze azotate
Bazele azotate din acizii nucleici derivă de la heterociclurile de bază ale purinei (baze
purinice) şi pirimidinei (baze pirimidinice).

N N N

N N N
H
PURINA PIRIMIDINA
Au caracter bazic. Au proprietatea de a absorbi în UV la λ═260 nm (cea mai mare
absorbţie o au bazele purinice), pe baza intensităţii absorbţiei putând identifica şi doza
spectrofotometric bazele azotate şi compuşii ce le conţin.
Bazele purinice sunt adenina şi guanina (denumirea acesteia derivând de la cuvântul
guano ═ excrementele unor păsări), care se găsesc şi în ADN şi în ARN.
Bazele pirimidinice sunt citozina, uracilul şi timina. Citozina se găseşte şi în ADN şi
în ARN, uracilul în ARN, iar timina în ADN şi bază minoră în unele tipuri de ARN (tARN)
NH2 O

N N HN N
H2N
N N N N
H H
ADENINA GUANINA
NH2 O
O
HN
N HN CH3

O N
O N O N
H
H H

CITOZINA URACIL TIMINA

1
 Baze minore. În afară de aceste baze azotate, considerate baze majore, în acizii
nucleici se găsesc în proporţie redusă aproximativ 30 de baze minore, între care:
pseudouracil, 5-metil-citozină, 5-hidroxi-uracil, 7-metil-guanină etc.
O NH2 O

HN OH N CH3 HN NH

O N O N O N
H H
5-HIDROXIURACIL 5-METILCITOZINA PSEUDOURACIL

Nucleozide
Nucleozidele sunt N-glicozide ale bazelor azotate cu o pentoză: D-riboza sau
D-deoxiriboza, în forma β. Nucleozidele din acizii nucleici sunt: adenozina, guanozina,
citidina, uridina în ARN, respectiv deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina şi
deoxitimidina (timidina) în ADN.
NH2 NH2
NH2

N N N N
N N
CH3 N N
N N N N
HO-H2C HOOC-CH-CH2-CH2-S-CH2
O HO-H2C + O
O NH2
H H
H H H
H H H
H H H H OH OH
OH OH OH H S-ADENOZIL METIONNINA
ADENOZINA DEOXIADENOZINA
Structura unor nucleozide
Nucleozide libere. Pe lângă nucleozidele ce intră în structura acizilor nucleici, unele
ribonucleozide se găsesc şi sub formă liberă, de exemplu S-adenozil metionina, important
donor de grupe metil pentru procesele de metilare ce se desfăşoară în organism.
Nucleotide
Nucleotidele se formează prin legarea unui rest fosfat la grupa –OH din poziţia 3’ sau 5’ a
pentozei. Datorită resturilor fosforice, nucleotidele au caracter acid.
Nucleotidele din ARN sunt: acid adenilic (acid adenozin 5’-monofosforic, AMP), acid
guanilic (acid guanozin 5’-monofosforic, GMP), acid citidilic (acid citidin 5’-monofosforic,
CMP), acid uridilic (acid uridin 5’-monofosforic, UMP).
Nucleotidele din ADN sunt: acid deoxiadenilic (acid deoxiadenozin 5’-monofosforic,
dAMP), acid deoxiguanilic (acid deoxiguanozin 5’-monofosforic, dGMP), acid
deoxicitidilic (acid deoxicitidin 5’-monofosforic, dCMP), acidul timidilic (acid timidin 5’-
monofosforic, dTMP).
NH2
NH2 NH2
NH2
N N
N N N N O O O N N
N N
-
N N N N
O-P-O-P-O-P-O-H2C N N
H2O3PO-H2C - - O O CH2 O
H2O3PO-H2C O- O O H H
O O H H
H H
H H H
H H
H O OH O P O OH
H H H H -
P O -
O O
OH OH OH H AM Pc
O
AMP dAMP ATP

Structura unor nucleotide

Mononucleotidele îndeplinesc şi alte roluri biologice pe lângă acela de a fi componente
structurale ale acizilor nucleici existând ca nucleotide libere în celule.
a. Nucleotide ciclice. Prin legarea resturilor fosforice la două grupe –OH în poziţiile 3’ şi
’
5 şi deshidratarea acestora cu ciclizare rezultă nucleotide ciclice libere. Cele mai importante
sunt: acidul 3’, 5’- adenozin-monofosforic ciclic (3’, 5’ – AMPc) şi acidul 3’,5’ – guanozin-
monofosforic ciclic (3’, 5’ – GMPc), importanţi mesageri secunzi ai hormonilor.
2
 b. Intră în structura unor coenzime (coenzima A, FAD, NAD+),
c. Funcţionează ca şi intermediari în metabolismul nucleotidelor purinice (IMP-
acidul inozilic, ce conţine ca bază azotată hipoxantina),
d. Participă la procese importante, de exemplu cele ce funcţionează ca donori de grupe –
SO3H în procesele biochimice de sulfatare: de exemplu acidul 3’-fosfoadenozin-5’–
fosfosulfuric (PAPS).
e. Nucleozid polifosfaţii sunt nucleotide rezultate prin ataşarea a două resturi fosfat
(nucleozid difosfaţi), respectiv trei resturi fosfat (nucleozid trifosfaţi) la grupa –OH din
poziţia 5’ a pentozei.
Nucleozid polifosfaţii există liberi îndeplinind în celule funcţii biologice diferite:
a) intermediari metabolici: inozin difosfat (IDP), inozin trifosfat (ITP);
b) compuşi bogaţi în energie (compuşi macroergici): adenozin trifosfat (ATP), guanozin
trifosfat (GTP), uridin trifosfat (UTP), citidin trifosfat (CTP);
Prin legarea mononucleotidelor rezultă oligonucleotide (care conţin mai puţin de 50
mononucleotide) sau polinucleotide.
Acizii nucleici
Acizii nucleici sunt polinucleotide în care mononucleotidele sunt unite prin legături
fosfodiesterice între grupa –OH din poziţia 3’ a unei pentoze şi grupa –OH din 5’ a pentozei
din mononucleotidul următor. Legăturile 3’-5’-3’-5’- … înlănţuie nucleotidele într-o secvenţă
liniară reprezentând “coloana vertebrală” a acizilor nucleici.
Au caracter acid şi sunt legaţi de proteine bazice şi, rareori, neutre.
Acizii nucleici se diferenţiază prin:
• lungimea lanţului;
• pentoza conţinută;
• natura bazelor azotate şi ordinea în care acestea se succed (Tabel 1).
Tabel 1 Diferenţe între ADN şi ARN
ADN ARN
Baze azotate A, G, T, C A, G, U, C
Pentoza Deoxiriboza Riboza
Catena Dublu catenar Monocatenar cu regiuni dublu catenare
rezultate prin plierea în ac de păr sau sub
formă de trifoi
Baze complementare G C G C
A T A U
Localizare Nucleu (majoritar) ARN ribozomal (ARNr) – ribozomi
ARN de transfer (ARNt) – citoplasmă
ARN mesager (ARNm) – citoplasmă
Orientare 5’–3’ 5’–3’
Scriere convenţională 5’pdB1pdB2pdB33’ 5’pB1pB2pB33’
dB1dB2dB3 B1B2B3
Hidroliză bazică Nu Da

Structura acizilor nucleici

Odată cu cercetările lui O.Avery, C.Mc Leod şi M.Mc Carthy (1943), care au demonstrat
că ADN pur extras din pneumococii virulenţi determină transformarea suşei nevirulente în
pneumococi virulenţi, s-a stabilit că ADN este molecula eredităţii, informaţia genetică fiind
înscrisă în secvenţa variabilă a nucleotidelor din acizii nucleici. Dezvoltarea caracterelor
morfologice şi funcţionale ale unei celule se realizează după programul înscris în ADN.
Acizii nucleici prezintă o structură primară asemănătoare (vezi figura).

3
 Acidul dezoxiribonucleic este o biomacromoleculă rezultată prin condensarea
deoxiribonucleotidelor. Folosind metoda difracţiei razelor X, R.Franklin şi M.Wilkins au
arătat că ADN produce un model de difracţie ce caracterizează o elice.
Prin analiza cromatografică a ADN izolat de la mai multe specii, Chargraff a stabilit o
relaţie cantitativă între bazele azotate, concentraţiile nucleotidelor cu adenină şi timină,
precum şi cele ale nucleotidelor cu guanină şi citozină, fiind egale:
G = A 1
=
C T
Pe baza datelor existente, J. Watson şi F.Crick, în 1953, au postulat structura
tridimensională a ADN, modelul ADN dublu helix. Descoperirea structurii tridimensionale a
ADN a fost un eveniment de răsunet în cercetarea ştiinţifică care a deschis drumul dezvoltării
cercetărilor de biochimie, biologie celulară, genetică.

Structura secundara a ADN – modelul ADN dublu helix

4
 Caracteristicile modelului structurii tridimensionale a ADN:
• Molecula de ADN are două lanţuri care se înfăşoară în direcţii opuse, antiparalel, în
jurul unui ax imaginar. Modelul poate fi comparat cu o “scară în spirală” în care unităţile de
deoxiriboză şi fosfat sunt îndreptate spre exterior şi reprezintă “balustradele”, iar bazele
azotate spre interior, constituind “ treptele”, perpendiculare pe axul imaginar (vezi figura);
• ADN are unităţi cu dimensiuni identice: diametrul helixului – 20Ǻ; distanţa între
bazele adiacente - 3,4 Ǻ; pasul elicei (unitatea de structură helicală) se repetă după aprox.10
resturi de nucleotide;
• bazele din cele două catene se unesc prin legături de hidrogen după o anumită regulă
de complementaritate;
Modelul propus de Watson şi Crick furnizează elemente pentru explicarea capacităţii
ADN de a funcţiona ca moleculă ce stochează şi transmite informaţia înscrisă în secvenţa de
baze, prin autoreplicarea semiconservativă a ADN sintetizându-se două catene ce păstrează
caracteristicile ADN parental.
ADN este o moleculă flexibilă, fiind posibilă rotaţia în jurul scheletului format din
pentozele unite prin fosfat. Fluctuaţiile termice pot determina îndoirea, întinderea şi
desperecherea (melting) catenelor ceea ce permite apariţia unor structuri diferite de cea
propusă de Watson şi Crick, care mai este cunoscută şi sub numele de forma ADN-B.
Aceasta este forma cea mai stabilă comparativ cu celelalte variante structurale descrise,
formele ADN-A şi ADN-Z (Tabel).

Tabel Caracteristicile formelor structurale ale ADN

Caracteristica ADN A ADN B ADN Z
Sensul elicei Spre dreapta Spre dreapta Spre dreapta
Diametrul elicei 26 Ǻ 20 Ǻ 18 Ǻ
Perechi de baze /spiră 11 10,5 12
Lungimea fiecărei baze 2,6 Ǻ 3,4 Ǻ 3,7 Ǻ
Rotaţia bazelor 20o 6o 7o
Legătura glicozidică Anti Anti Anti - pirimidine
(conformaţie) Syn - purine
Se presupune că forma Z intervine în reglarea expresiei unor gene sau în recombinarea
genetică, în timp ce existenţa formei A în celule nu este confirmată.
În structura ADN există anumite secvenţe simetrice caracterizate prin ordinea inversă a
nucleotidelor (inverted repeats) pe cele două catene complementare (palindroame) sau pe
aceeaşi catenă (secvenţe în oglindă).

Secvenţe particulare din ADN (după Nelson D.L. şi Cox M.M., 2000)

5
 Dimensiunea moleculei de ADN se exprimă ca număr de perechi de baze conţinute (de
exemplu, cromozomul de la E.coli are 4,72 x 103 kpb).
Catenele ADN pot fi liniare sau circulare (bacterii, bacteriofagi).
Cromozomii singulari de la procariote sunt de fapt molecule de ADN circular,
conţinând puţine proteine. Cromozomii eucariotelor sunt reprezentaţi de molecule liniare de
ADN care înconjoară un miez proteic format din patru tipuri diferite de histone: H1, H2A,
H3, H4, asociate într-un octamer formând nucleozomi.

Replicarea ADN determină pregătirea celulelor pentru diviziune.

Între două diviziuni, celulele parcurg un ciclu celular constituit din două faze: interfaza
(cu perioadele G1, S, G2) şi mitoza, diviziunea celulară. Multe celule intră într-o perioadă,
G0, în care ies din G1, devin celule liniştite care desfăşoară activitate specifică. În cancer,
celulele se divid haotic, ciclul celular fiind perturbat.

6
 Transformările neezimatice ale nucleotidelor. Mutaţii. Bazele azotate din nucleotide şi
polinucleotide pot suferi diverse alterări structurale neezimatice:
• Dezaminarea bazelor azotate, în special a citozinei. Resturile de uracil rezultate din
dezaminarea acesteia sunt reparate prin excizie;
• Hidroliza legăturii N-glicozidice din nucleotidele purinice şi, mai rar din cele pirimidinice,
mai ales pentru ADN;
• Formarea dimerilor de timină sub acţiunea radiaţiilor UV şi fragmentarea bazelor purinice
sub acţiunea radiaţiilor ionizante (aproximativ 10% din mutaţiile ADN);
• Dezaminarea provocată de diverse noxe industriale (nitriţi, nitraţi, nitrozamine, bisulfiţi);
• Alchilarea guaninei (cu dimetilnitrozamină);
• Degradarea ADN sub acţiunea speciilor reactive ale oxigenului (radical superoxid,
hidroxil, peroxid de hidrogen) este reprezentată de oxidări ale bazelor purinice, ruperea
catenelor ADN (apare în stresul oxidativ, depăşirea capacităţii organismului de a se opune
acţiunii acestor specii prin sistemele antioxidante enzimatice şi neenzimatice de care dispune).
Deşi se produc cu viteze reduse, acestea au efecte nedorite asupra materialului genetic al
celulei conducând la apariţia mutaţiilor. Celulele sunt dotate cu diferite sisteme de a repara
eventualele mutaţii. Perpetuarea acestor alterări este responsabilă de dezvoltarea unor celule
anormale (în diferitele forme de cancer), de viteza cu care organismul îmbătrâneşte.
Acizii ribonucleici sunt biomacromolecule rezultate prin condensarea ribonucleotidelor şi
reprezintă materialul genetic al unor virusuri mici (ribovirusuri: gripal, virusul
mozaicului tutunului, HIV, hepatita C), în celelalte organisme intervin în transmiterea
informaţiei genetice.

Utilizarea informatiei genetice

Acizii ribonucleici au un conţinut în baze azotate ce nu respectă relaţia lui Chargraff, sunt,
în general, monocatenari. La unele tipuri de ARN catena se poate plia faţă de ea însăşi,
prezentând regiuni dublu catenare ce expulzează în exterior zonele monocatenare sub forma
unui ac de păr sau frunze de trifoi.

7
 Cantitatea de ARN variază de la o celulă la alta şi chiar în aceeaşi celulă, în funcţie de
intensitatea proceselor de biosinteză proteică la un anumit moment.
Tipuri de ARN. După rolul îndeplinit în procesul de biosinteză proteică, se deosebesc
mai multe tipuri de ARN.
ARNt (de transfer, solubil, ARNs) reprezintă 5–15% din ARN total. Sunt molecule mici,
de aproximativ 90 nucleotide, care leagă specific fiecare din cei 20 de aminoacizi
proteinogeni şi îi transportă la locul sintezei proteice.
Indiferent de tipul de ARNt, capetele 5’ şi 3’ sunt identice. La capătul 3’ se leagă
aminoacizii. ARNt poate fi reprezentat asemănător unei frunze de trifoi.
La capătul buclei inferioare se găseşte secvenţa anticodon, braţul DHU (care conţine în
cantitate mare dihidrouracil) este implicat în legarea aminoacil-ARNt-sintetazei, iar prin
braţul TΨC (care are cantitate mare de timină, pseudouracil) se realizează legarea
complexului aminoacil-ARNt la ribozomi.
ARNm (mesager, informaţional, ARNi) reprezintă 2-4% din ARN celular.
Sunt molecule monocatenare, liniare, de lungime variabilă ce se sintetizează în nucleu pe
matriţă ADN (prin transcriere), apoi iese în citoplasmă unde va fi matriţa pentru sinteza unui
polipeptid cu o secvenţă specifică de aminoacizi (prin translaţie). Este heterogen ca mărime în
funcţie de lungimea polipeptidului pe care îl codifică. Are o viaţă foarte scurtă, la bacterii de
2-3 minute, iar la eucariote de câteva ore, fiind degradat de ribonucleaze.
La procariote, ARNm conţine informaţia pentru sinteza unei singure proteine sau a mai
multor polipeptide (frecvent trei lanţuri) implicate în acelaşi proces metabolic.

Structura tridimensională a ARNt

ARNr (ARN ribozomal) este reprezentat de molecule flexibile, heterogene ca formă şi
mărime, ce se clasifică în funcţie de constanta de sedimentare. Sunt conţinuţi în ribozomi,
particule ribonucleoproteice descrise de G.E. Palade, cu constante de sedimentare diferite:
70S la procariote, 80S la eucariote.
Ribozomii se pot disocia în două subunităţi de dimensiuni diferite:
- la procariote: subunitatea mare 50S, subunitatea mică 30S;
- la eucariote: subunitatea mare 60S, subunitatea mică 40S.
Subunităţile conţin ARNr diferiţi: 18S în subunitatea mică, 28S, 5S, 8S în subunitatea
mare de la eucariote.
Ribozomii constituie sediul biosintezei proteice. H. Noller şi colab. au dovedit prin studii
recente participarea ARNr cu rol de catalizator în sinteza legăturilor peptidice, reacţia
catalizată de peptidil transferază necesitând prezenţa unor subunităţi ribozomale lipsite de

8
proteine, denumite ribozime. Acest tip de ARN satisface câteva caracteristici ale enzimelor:
are substrat specific, măreşte viteza reacţiei enzimatice şi iese nemodificat din reacţie.
Recent a fost caracterizat un ARN nuclear de dimensiuni reduse (snARN) care se
găseşte mai ales în nucleul celulelor eucariote. Formează complexe stabile cu proteine
specifice, denumite ribonucleoproteine nucleare mici. Au dimensiunea 10S, reprezintă între
1-10% din ribozomi şi au rol în prelucrarea ARN mesager matur exportat în citoplasma
celulelor eucariote.
Importanţa medicală a analogilor de sinteză ai bazelor azotate, nucleozidelor,
nucleotidelor
Unele medicamente, datorită asemănării structurale cu bazele azotate sau nucleozidele, îşi
bazează acţiunea pe influenţarea procesului di sinteză a acizilor nucleici.
Se cunosc baze de sinteză folosite ca medicamente antitiroidiene (tiouracil, 5-metil-
tiouracil) sau ca antimetaboliţi în tratamentul unor neoplasme de sân, colon (5-fluor-uracil),
leucemiei (6-mercapto-purina, 6-tio-guanina), gutei (alopurinol, analog structural al
hipoxantinei, intermediar în metabolizarea bazelor purinice)
O SH OH

HN N CH3 N N N N
H2N
N N N N N N
H H H
7
N METILGUANINA 6-MERCAPTOPURINA ALLOPURINOL

Unele nucleozide de sinteză au acţiune antivirală sau antitumorală (azidotimidina

(zidovudina), arabinozil citozina etc, fiind folosite în tratamentul infecţiei cu HIV, al unor
forme de cancer.
Datorită caracterului acid al acizilor nucleici, aceştia interacţionează in vivo cu proteine
cu caracter bazic formând nucleoproteine. Interacţiunea se realizează prin legături ionice
între grupele fosfat din acizii nucleici şi grupele –NH3+ ale aminoacizilor bazici din structura
proteinelor. Proteinele din structura nucleoproteidelor se numesc protamine şi histone.
Protaminele se caracterizează prin următoarele:
a) sunt proteine cu masă moleculară mică ( Mr 5 kD);
b) conţin 35–55% arginină, ceea ce le conferă caracter bazic;
c) nu conţin aminoacizi aromatici şi cu sulf;
d) sunt legate de ADN din nucleu, raportul ADN/proteină fiind specific pentru diferite specii;
e) sunt rezistente la acţiunea pepsinei, deoarece aceasta necesită aminoacizi aromatici pentru
a-şi exercita atacul.
Histonele sunt prezente la toate animalele, absente la bacterii şi au următoarele
caracteristici:
a) masa moleculară cuprinsă între 8,4–22 kD;
b) caracter bazic, datorat unui conţinut crescut de lisină şi arginină;
c) sunt solubile în acizi, nedializabile şi hidrolizează sub acţiunea pepsinei;
d) se găsesc în raport fix cu ADN nuclear (un mol histonă la un segment de ADN de 25
perechi de baze azotate);
Metode de analiză a acizilor nucleici. Pentru detectarea unei secvenţe de ADN sau ARN
specifice se pot aplica fi diferite metode.
Southern blot se foloseşte pentru detectarea secvenţei ADN, având următoarele etape:
• Extragere ADN şi scindarea în fragmente mici cu endonucleaze de restricţie, enzime
ce realizează o scindare specifică acţionând asupra anumitor secvenţe de baze azotate;
• Separarea fragmentelor de ADN prin electroforeză în gel de agaroză;
• Transferul fragmentelor separate pe o membrană (de nylon sau nitroceluloză);
• Expunerea la UV sau la temperatură pentru ataşarea de membrană;
• Hibridizarea fragmentelor cu o probă ADN ce recunoaşte secvenţa de interes, probă
marcată radioactiv sau cu un trasor fluorescent sau cromofor pentru a putea fi identificată;

9
 • Vizualizarea rezultatului detectării probei – prin autoradiografie.

Northern blot – se foloseşte pentru studiul expresiei genice prin detectarea ARN. Sunt
parcurse mai multe etape:
• Extragerea ARN total din proba de analizat
• Separarea ARN prin electroforeză în gel de agaroză
• Transferul fragmentelor separate pe o membrană de nylon
• Expunerea la UV sau la temperatură pentru ataşarea de membrană
• Hibridizare cu o probă ARN, ADN sau un oligonucleotid ce recunoaşte ARN de
interes marcată radioactiv sau cu un compus caracterizat de chemiluminescenţă
• Vizualizarea probei legate – autoradiografie.

Polymerase Chain Reaction (PCR) – reacţia de polimerizare în lanţ- se foloseşte pentru

amplificarea unor fragmente specifice din ADN, fiind utilă pentru diagnostic molecular.
Presupune repetarea unor cicluri de încălzire-răcire de 20 - 40 ori .
În general, etapele parcurse sunt următoarele:
1. Iniţierea reacţiei prin încălzire la 94-96o
2. Denaturarea lanţului ADN prin încălzire la 94-96o un timp scurt, variabil, între 20-40”
3. Răcire la 50-65oC şi ataşarea primerilor (nucleotide ce recunosc specific prin
complementaritate secvenţa ce urmează a fi amplificată)
4. Elongare cu Taq polimerază, o polimerază rezistentă la temperatură – 72oC
5. Repetare ciclurilor 1-4
6. Elongare finală – încălzire la 70-74oC, după ultimul ciclu PCR
7. Răcire la 4-15oC
Eficienţa polimerizării este evaluată prin electroforeză în gel de agaroză.

10