Imunohistochimia

IMUNOFLUORESCENȚA
REACȚIA DE PRECIPITARE
REACȚIA DE AGLUTINARE
ANTICORPI MONOCLONALI
CITOMETRIA ÎN FLUX
RIA – radio immuno assay
RIST – radioimmunosorbent test
RAST – radioallergosorbent test
ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
ELISA indirectă
ABO
RH
Chemiluminiscență

1. Teorii selective si instructive de formare a efectorilor sistemului imun

2. Imunogenicitate si antigenicitate. Factori care depind de Ag

3.Imuogenicitate si antigenicitate. Factori dependent de SI al gazdei si de conditiile

de administrare

4.Epitopi, haptene, carrier, adjuvanti. Valenta antigenului. Antigene specific de

tesut, grup, specie.

5. Reactivitatea incrucisata. Experimentele Landsteiner, Antigene heterofile.

Aplicatii practice. Variatia antigenica – tipuri, mecanisme, relevanta pentru
vaccinare.

6. Epitopi recunoscuti de limfocitele B versus epitope recunoscuti de limfocitele T.

7. Bariere anatmice si fiziologice impotriva infectiilor.

8. Macropinocitoza, Endocitoza, Fagocitoza

9. Neutrofile, monocite, macrophage, eozinofile.

10. Mastocite, bazofile

11. Mecanisme oxigen dependente de ucidere intracelulara

12.Strategiile SI nespecific de recunoastere a non-selfului

13.Anticorpi: structura, organizare primra, secundara, tertiara si cuaternara

14.Domeniile moleculelor de imunoglobulin

15.Izotip, alotip, idiotip

16.Regiunea balama. lantul J. Component secretorie

17. Clasele de imunoglobuline si activittile lor biologice

18.Receptori Fc

19.Superfamilia imunoglobulinelor

20.Factori care influenteaza legatura Ag-Ac

21. Reactia de precipitare (tehnici de precipitare in solutie si in gel)

22. Anticorpi monoclonali: productie si utilizare clinica

23. Reactia de aglutinare. Testul Coombs

24.Tehnici de faza solida: RIA, RIST, RAST, ELISA

25.Imunofluorescenta. Imunohistochimie

26.Grupe sanguine ABO si Rh

27.Mecanisme genetice care duc la formarea lanturilor usoare de imunoglobuline

28.Mecanisme genetice care conduc la formarea lanturilor grele de imunoglobuline

29.Factori care contribuie la generarea diversitatii imunoglobulinelor

30. Comutarea de clasa; Secretia de anticorpi; Maturatia de afinitate

31.MHC de clasa I:structura moleculelor, distributia celulara si functii

32.MHC de clasa II: structura moleculelor, distributie celulara si functii

33.Harta genica a MHC; Dezechilibrul de inlantuire; Polimorfismul MHC; MHC si

susceptibilitatea la boala

34. Antigene endogene: calea citosolica

35. Antigene exogene: calea endocitica. Interactiunea MHC II – peptid

36.Prezentarea antigenelor bacteriene non-peptidice

37.Celule prezentatoare de antigen

38.Complexul TCR

39.Organizarea si rearanjarea genelor TCR

40.Generarea diversitatii TCR

41.Molecule co-receptor ale limfocitelor B si T

42.Legaturi implicate in formarea legaturilor Ag-Ac. Reversibilitatea legaturii Ag-
Ac. Receptor pt Ag. Afinitate, aviditate. Afinitatea Ig si TCR

43.Organe limfoide primare

44.Organe limfoide secundare

45.Maturizarea limfocitelor T in Timus si proesele de selectie

46.Semnalele co-stimulatorii si expansiunea clonala versus anergie. Diferenta intre

diversele tipuri de cellule prezenttoare de Ag

47.Calea de semnalizare intracelulara declansata de legarea TCR

48.Superantigene. Antigene T independente

49.Distributia si functia celulelor T γδ. Limfocitele B1 (CD5+)

50.Maturizarea celulelor B in maduva osoasa si procesele de selectie

51.Activarea celulelor B de catre Ag T dependente

52. Calea de semnalizare intracelulara declansata de legarea BCR=sub51

Calea de semnalizare intracelulara declansata de legarea TCR

53.Situsuri in vivo in care au loc inductia si dezvoltarea raspunsurilor imune

umorale

54.Maturatia de afinitate, comutarea de clasa si generarea de plasmocite si cellule

cu memorie in centrii germinali

55.Citokine: structura, proprietati generale si functii

56.Receptori pentru cytokine: structura, familii

57.Transmiterea semnalului mediate de receptorii pentru citokine

58.Antagonisti ai citokinelor. Cross-reglarea citokinelor

59.Secretia de cytokine de catre limfocitele Th1/Th2/Th17

60.Boli in relatie cu citokinele. Terapii bazate pe citokine

61.Diferentierea celulelor T

62.Celule efectorii in raspunsurile mediate celular (CTL, NK, macrofage, TDH)

63.Diferente intre CTL si precursorii CTL

64.Mecanisme de liza ale celulelor tinta

65.Limfocite cu memorie

66.Limfocite reglatoare
67.Celule NK, NKT: importanta, categorii de receptori

68.Calea clasica de activare a complementului

69.Calea alternativa de activare a complementului

70.Calea lectinelor de activare a complementului

71.Reglarea sistemului complement

72.Consecinte biologice ale activarii complementului

73. Receptori pentru complement

74.Inflamatia mediata de complement

75.Mecanisme microbiene de evaziune a atacului sistemului complement.

Deficientele sistemului complement

76.Molecule de adeziune

77.Inflamatia acuta locala

78.Inflamatia acut sistemica. Inflamatia cronica

79.Mediatorii inflamatiei

80.Traficul limocitar

81.Definiti notiunile de infectie, boala, eliminare, colonizare, comensalizare,

persistenta

82.Imunitatea fata de bacterii extracelulare

83.Mecanisme de evaziune ale bacteriilor extracelulare

84.imunitatea fata de bacterii intracelulare

85.Mecanisme de evaziune ale bacteriilor intracelulare

86.Imunitatea anti-virala

87.Mecanisme de evaziune ale virusurilor

88.Imunitatea anti-parazitara

89.Mecanisme de evaziune ale parazitilor

90.Imunitatea anti-fungica si mecanisme de evaziune ale fungilor

91.Hipersensibilitatea I

92.Hipersensibilitatea II
 93.Hipersensibilitatea III

94.Hipersensibilitatea IV (DTH); Granulomul

95.Citometria de flux

ANTICORPI MONOCLONALI

- Antigenele cu care organismul intră în contact prezintă epitopi diferiți → se

formează o multitudine de clone limfocitare
- Pentru producerea de anticorpi monoclonali s-au folosit hibridoamele – fuziunea unei
celule producătoare de anticorpi cu o celulă mielomatoasă
- Celulele hibrid conțin nuclei de la ambele celule parentale
o Prin pierderea unor cromosomi și prin proliferare ulterioară rezultă clone de
celule care conțin un singur nucleu
- Pentru fuzionarea celulelor se folosește polietilenglicolul
- Celulele mielomatoase au la dispoziție 2 căi pentru sinteza ADN
o Calea principală
o Calea secundară sau de salvare
Utilizează enzima HGPRT – hipoxantin guanin phospho ribosil
trasnsferaza
- Celulele mielomatoase utilizate la formarea hibridoamelor îndeplinesc 2 condiții:
o Nu secretă anticorpi
o Nu prezintă HGPRT – nu pot utiliza calea secundară de sinteză a ADN-ului
- Selectarea celulelor HGPRT-negative se face prin incubarea celulelor cu 8-azaguanină
(8-AzG)
o Această substanță determină moarte celulelor care prezintă HGPRT
o Celulele fără HGPRT nu încorporează 8-AzG și supraviețuiesc
- Producția anticorpilor monoclonali:
o Imunizarea animalelor de laborator cu antigenul ales
o După stimularea repetată cu Ag și obținerea RI animalul este sacrificat și i
se extrage splina
o Splenocitele sunt introduse în cultură – acestea conțin un procent ridicat de
 limfocite cu specificitatea dorită
o Celulele mielomatoase HGPRT-negative sunt fuzionate cu plasmocitele din
splină
Se formează un amestec de celule mielomatoase nefuzionate, celule
hibrid și plasmocite nefuzionate
Celulele de interes sunt celulele hibrid
o Plasmocitele normale nefuzionate mor spontan în câteva zile
o Celulele mielomatoase și celulele hibrid suprafiețuiesc în cultură
Doar celulele hibrid prezintă ambele căi de sinteză a ADN-ului
Celulele mielomatoase nefuzionate prezintă doar calea principală de
sinteză a ADN-ului
o Celulele mielomatoase nefuzionate sunt ucise cu ajutorul mediului de cultură
HAT (hipoxantină, aminopterină, timidină)
Aminopterină blochează calea principală de sinteză a ADN-ului
Doar celulele hibrid supraviețuiesc prin folosirea căii de salvare
- După obținerea celulelor hibrid se fac diluții care vor duce la plasarea în fiecare
godeu al unei plăci de cultură a unei singure celule
o Anticorpii produși vor fi identici din punct de vedere al isotipului, al allotipului
și al idiotipului
- Celulele hibrid proliferează și secretă anticorpi în supernatant
o Se recoltează supernatantul și se testează specificitatea anticorpilor printr-un
test ELISA
- Capacitatea secretorie a celulelor hibrid scade în timp
- Cei mai mulți anticorpi monoclonali sunt produși cu ajutorul hibridoamelor murine
o Anticorpii murini sunt recunoscuți ca molecule non-self și sunt îndepărtați
o În unele situații anticorpii monoclonali murini pot fi preluați de celulele
tumoare, procesați, prezentați în cupa MHC I Ly T citotoxice și să devină o
țintă a atacului Ly T citotoxice
- Producerea anticorpilor monoclonali umani se face prin introducerea ADN-ului în
celule – proces numit transfecție
o Secvența de ADN introdusă poate fi modificată prin procesul de mutageneză
o Prin aceste procese de inginerizare se pot construi gene în care o porțiune, ce
provine de la o specie, codează pentru regiunea variabilă a imunoglobulinelor
și o altă porțiune, de la o altă specie, codează pentru fragmentul constant,
Fc Se obțin anticorpi monoclonali recombinați în care regiunea variabilă
aparține anticorpului murin, iar porțiunea constantă aparține
imunoglobulinei umane = anticorp monoclonal chimeric – anticorpi
umanizați
- Anticorpii bispecifici sau heteroconjugați reprezintă alt tip de molecule hibrid
o Acești anticorpi sunt folosiți în terapia anti-tumorală – anticorpul se leagă
printr-un paratop la celula malignă și prin celalalt la o celulă efector a
sistemului imun

REACȚIA DE PRECIPITARE

Precipitarea în soluție

- Reacția de precipitare se produce atunci când anticorpii reacționează cu antigene

solubile, iar rezultatul este un complex antigen-anticorp care își pierde solubilitatea și
precipită
- Formarea unui complex Ag-Ac solubil are loc în doar câteva minute
- Pentru formarea precipitatului este nevoie de formarea unei rețele tridimensionale
o Pentru formarea precipitatului Ag trebuie să fie cel puțin bivalent
o Este necesar un raport optim între cantitatea de Ag și Ac
Se folosesc tuburi cu o cantitate constantă de Ac
Se adaugă cantități progresiv crescătoare de Ag
Se centrifughează
Se observă că pe măsură ce se adaugă tot mai mult Ag, cantitatea de
precipitat crește, până la aringerea unui optim
Adăugarea în continuare de Ag va determina scăderea cantității de
precipitat
- Cantitatea maximă de precipitat este obținută atunci când între Ag și Ac există un
raport ideal – zonă de echivalență
- Exces de anticorpi – prozonă; Exces de antigen – postzonă
o În aceste cazuri se formează complexe mici și solubile
- Exces de antigen
o Se formează o cantitate minimă de precipitat
o În supernatant sunt prezente cantități importante de complexe Ag-Ac
- Exces de anticorpi
o Număr mare de paratopi în raport cu numărul de epitopi
o Anticorpii se leagă mai degrabă monovalent
- Turbidimetria – decelează turbiditatea unei soluții prin măsurarea absorbției luminii
și a scăderii intensității acesteia la trecerea prin soluția respectivă
o Absorbția fasciculului luminos se realizează proporțional cu mărimea,
concentrația și forma moleculelor prezente în soluție
- Nefelometria – metodă de cuantificare a proteinelor dintr-o soluție în care se adaugă
anticorpi față de o substanță ce urmează să fie testată și care determină
formarea de complexe imune solubile
o Această tehnică se bazează pe măsurarea nivelului de împrăștiere a unui
fascicul de lumină monocromatică la trecerea prin soluție
o Lumina este înregistrată cu un senzor situat la un anumit unghi față de
fasciculul emis
o Nefelometria este realizată în exces de anticorp și nu în zona de echivalență
o Se pot măsura IgG, IgA, IgM, factori ai sistemului complement (C3, C4, factor
B), proteina C reactivă

Precipitarea în gel

- Dubla imunodifuzie (Ouchtherlony)

o Gelul de agar este turnat într-o placă Petri
o Se realizează un godeu pentru antigen și un godeu pentru anticorp
o Ag și Ac vor difuza din godeurile în care au fost amplasate → gradiente de
concentrație
Cea mai mare concentrație este lângă godeu
o Pe măsură ce moleculele celor 2 reactanți se întâlnesc se vor forma complexe
Ag-Ac
o La o anumită distanță dintre godeuri, raportul Ag-Ac va fi optim – zona de
echivalență
Se formează o linie de precipitare
o Această tehnică poate fi semicantitativă sau calitativă
o Metoda este utilizată pentru evaluarea prezenței autoanticorpilor anti-fibră
musculară, anti-RNP, anti-SS-A, anti-SS-B, anti-SCL-70
o Foarte util pentru prezenta unui anumit antigen sau anticorp
- Imunodifuzia radială simplă (Mancini)
o Reprezintă o variantă cantitativă a testului Ouchtherlony
o Gelul de agar conține anticorpi
o În godeurile realizate în agar se plasează concentrații diferite de Ag
o Plăcile sunt lăsate la incubat 24h – antigenul difuzează contrifug în gel
Concentrația Ag scade progresiv pe măsură ce se depărtează de
godeu
La un moment dat concentrația Ag ajunge într-un raport optim cu
concentrația Ac – zona de echivalență
• Se formează un inel de precipitare
• Diametrul inelului de precipitare este un indicator al
concentrației Ag-nului – se compară cu un set de standarde
o Această metodă este folosită pentru cuantificarea imunoglobulinelor, a
compușilor sistemului complement sau a altor proteine serice
o Imunodifuzia radială simplă furnizează rezultate greșite:
În macroglobulinemia Waldenstrom – gammopatie monoclonală
malignă caractarizată prin hipergamaglobulinemie M
 • Concentrația IgM determină prin această metodă va avea
valori foarte mari – IgM monomeric difuziează mai rapid decât
IgM pentameric
În cazul unor concentrații mari de factor reumatoid (Ig M anti IgG)
• IgM reacțioează cu IgG și formează complexe IgM-IgG –
migrează mai încet

REACȚIA DE AGLUTINARE

- Anticorpii reacționează cu antigene particulare, insolubile și determină formarea

unui complex tridimensional stabil, vizibil sub forma unui agregat
- Ac care pot conduce la o reacție de aglutinare sunt denumiți aglutinine
- Etapele procesului de aglutinare
o Etapa de sensibilizare – vizează particule antigenice
Este un proces reversibil și implică legarea unui paratop la un epitop de
pe suprafața Ag-nului multivalent
Reacția de sensibilizare poate fi detectată dacă unul dintre reactivi
este marcat
o Etapa de formare a agregatului
Apare legarea încrucișată dintre epitopii rămși liberi și paratopii
corespunzători ai anticorpilor → complex tridimensional
- Reacția de aglutinare poate fi influențată de o serie de factori:
o Isotipul anticorpilor
IgM sunt mult mai eficienți
Rigiditate a regiunii balama
o Sarcina electrică
Sarcina electrică negativă de pe suprafața hematiilor este cauzată de
prezența acidului sialic
• Cand aceste particule sunt suspendate în soluție salină apare un
potențial electric numit zeta – împiedică aglutinarea
IgG nu pot realiza aglutinarea hematiilor
IgM pot realiza aglutinarea hematiilor
o Numărul de epitopi ai antigenului
o Concentrația celor 2 reactivi
În general, aglutinarea se produce mai rapid atunci când concentrațiile
de antigen și anticorp sunt crescute
Efectul maxim este obținut atunci când există o proporție echilibrată
între componentele reacției – zona de echivalență
Titrul anticorpilor = concentrația cea mai mică de Ac la care reacția
se mai poate produce
o Factori de mediu – temperatură, amestecare, perioada de incubare
- Aglutinarea poate fi amplificată prin modificarea unor factori variați:
o Adăugarea de soluții saline cu putere ionică scăzută
o Scăderea sarcinii electrice – adăugarea de albumină
o Creșterea vâscozității
o Creșterea contactului dintre Ag și Ac prin agitare sau centrifugare
o Temperatură corespunzătoare
o pH corespunzător
- Complexele Ag-Ac formate, în special cele la care participă IgM, au capacitatea de a
activa sistemul complement
- Aglutinarea directă
o Interacțiunea dintre antigene și anticorpi conduce la apariția unui agregat în
mod direct
o Explicațiile apariției aglutinării directe:
Existența unui număr mare de epitopi accesibili
Participarea în reacție a unor anticorpi multivalenți
o Aglutinare directă se produce în cazul determinării grupelor sanguine în
sistemul AB0
o Aglutinarea directă este o metodă semicantitativă
- Aglutinarea indirectă
o Legarea anticorpilor la antigene nu determină aglutinare
o Concentrația epitopilor este scăzută
o Anticorpii specifici sunt cel mai adesea de clasă G
o Această situație se întâlnește în cazul grupului sanguin Rh
o Anticorpii anti-Rh ce apar în urma imunizării aparțin isotipului G
Nu se determină legări încrucișate și agregarea eritrocitelor
o Este nevoie de o etapă suplimentară în care hematiile care au fixat anticorpii
anti-Rh sunt incubate cu anticorpi IgM anti IgG → aglutinarea eritrocitelor
- Testul anti-imunoglobulinic – testul Coombs
o Exemplu de aglutinare mediată de anticorpi
o Metoda este folosită pentru decelarea de anticorpi cum sunt cei de tipul IgG
Ac de clasă G sunt numiți anticorpi incompleți
o Se adaugă un al doilea Ac, anti-imunoglobulina umană care să lege
porțiunile Fc ale anticorpilor IgG legați deja la Ag de pe suprafața hematiilor
o Aceste complexe sunt responsabile pentru agregarea eritrocitelor
o Intensitatea reacției de hemaglutinare este proporțională cu cantitatea de
anticorpi care tapetează eritrocitele
o Există 2 variante ale testului Coombs
Testul direct (DAT – direct immunoglobulin test)
• Anti-imunoglobulinele sunt adăugate la particule care sunt
suspectate că ar avea anticorpi legați la suprafața lor
• Ex: dacă un nou născut este suspect de boală hemolitică
produsă de anticorpi materni anti-Rh, adăugarea de anti-
imunoglobuline față de IgG materne s-ar lega la acestea și ar
conduce la aglutinare
Testul indirect
• Se urmărește detectarea prezenței în ser a anticorpilor
specifici pentru anumite antigene de pe suprafața unei celule
sau particule
• Anticorpii adăugați nu conduc la aglutinare
• Dacă se adaugă ulterior anti-imunoglobuline se obține
aglutinarea
• Aplicație – detecția anticorpilor IgG anti-Rh din sângele
femeilor Rh-negative

TESTE DE FAZĂ SOLIDĂ

 RIA – radio immuno assay
- RIA – radio immuno assay
o Acest test poate măsura concentrații de până la 0,001 µg/ml
o Principiul metodei:
Competiția pentru o cantitate constantă de molecule de anticorp
specific între un ligand marcat radioactiv (concentrație cunoscută) și
unul nemarcat (concentrație care trebuie determinată)
Cantitatea de antigen marcat este calculată astfel încât să poată satura
întreaga cantitate de Ac
o În RIA, semnalul este măsurat exclusiv la nivelul suprafeței solide
Ag-nul este incubat la nivelul unei suprafețe solide – o cantitate oare
care va fi adsorbită la nivelul acesteia
• Moleculele nelegate vor fi îndepărtate prin spălare
Situsurile rămase neocupate vor fi blocate prin incubarea cu o proteină
irelevantă
În etapa următoare se adaugă anticorpul test
Moleculele de anticorp în exces sunt înlăturate prin spălare
Cele legate sunt detectate cu ajutorul unui ligand radiomarcat
RIST – radioimmunosorbent test

- RIST – radioimmunosorbent test

o Principiu:
Competiția dintre un ligand marcat și unul nemarcat
o Detecția și cuantificarea cantității totale de anticorpi de clasă E
o Suprafața solidă este tapetată cu Ac anti IgE
Într-o primă etapă va fi tratată cu cantități cunoscute, progresiv
crescânde de IgE radiomarcat – determinarea capacității maxime de
legare
În etapa următoare este utilizată o cantitate de aproximativ 70-80 de
IgE radiomarcat din acest maxim, amestecată cu o cantitate
necunoscută de IgE nemarcat
Cu cât radioactivitatea măsurată este mai mică, cantitatea de IgE din
proba de investigat este mai mare
RAST – radioallergosorbent test
o Metoda RIST poate cuantifica IgE dar nu poate evidenția specificitatea
anticorpilor de clasă E, deci a Ag-nului responsabil pentru manifestările bolii
respective
o RAST reprezintă o metodă de sceening alergenic și de identificare a profilului
alergenilor
o Se leagă o cantitate mare de antigen la un disc de celuloză
Un număr mare de epitopi disponibili pentru legarea la un număr foarte
mic de molecule de IgE din serul pacientului
o Detecția IgE se face cu ajutorul unor anticorpi anti-IgE radiomarcați
ELISA – enzyme linked immunosorbent assay
o Tehnnica se încadrează în categoria solid phase assay - fracțiile de anticorp
legat și, respectiv, liber sunt separate în mod fizic prin etapele de spălare, iar
antigenul care trebuie detectat și măsurat este fizic atașat la o suprafață
solidă
Suprafețele solide sunt reprezentate de materiale plastice speciale care
oferă situsuri de legare pentru moleculele țintă
Antigenele glucidice nu pot fi atașate la astfel de suprafețe în mod
direct – sunt cuplate la proteine purtător ca poli-L-lizină sau tiramină
o Tehnica este similară RIA cu deosebirea că măsurarea semnalului se face pe
baza unei reacții colorimetrice produsă de o enzimă care degradează un
substrat
o Enzimele utilizate:
Peroxidaza din hrean – HRP – horseradish peroxidase
β-galactozidaza
Fosfataza alcalină
o Semnalul obținut este proporțional cu numărul moleculelor de cromogen
degradate și, indirect, cu stabilitatea și activitatea enzimei respective
o Substanțele cromogene pot fi alese în așa fel încât să determine amplificarea
semnalului de culoare
Ex: primul substrat produce un produs care la rândul lui va acționa ca
o co-enzimă pentru o a doua enzimă ce va degrada mai departe un
substrat specific
Sistem larg răspândit – biotină (cuplată cu Ac) și avidină (cuplată
cu enzima)
ELISA indirectă
Este preferată deoarece are sensibilitate crescută
Ag sunt atașate la suprafața solidă
• Pentru a împiedica legarea nespecifică a Ac la plastic prin
intermediul fragmentelor Fc, situsurile rămase neocupate la
nivelul suprafeței solide sunt blocate de către niște proteine
irelevante al căror exces este îndepărtat prin spălare
Se adaugă anticorpi primari – provin din serul pacientului
• După incubare, Ag fixate vor fi legate de către Ac specifici, iar
Ac nelegați vor fi îndepărtați prin spălare
Complexele Ag-Ac formate sunt puse în evidență prin adăugarea de
Ac secundari specifici pentur un anumit isotip
• Ac secundari sunt cuplați cu enzima
• Excesul de reactivi nelegați se îndepărtează prin spălare
În ultima etapă se adaugă substratul cromogen – acesta este degradat de
către enzima cu care este cuplat Ac secundar → reacție de culoare
• Intesitatea culorii este proporțională cu numărul de molecule
de substrat degradate, iar acesta este proporțional cu numărul
de molecule de enzimă, deci cu numărul de molecule de Ac
secundar
• Numărul de molecule de Ac secundar depinde de numărul de
molecule de anticorp primar care au legat cantitatea cunoscută
de antigen fixat la suprafața solidă
Prin măsurarea intensității reacției de culoare se obțin informații
cantitative
Se utilizează 96 de godeuri și o anumită dimensiune – se folosesc
spectofotometre speciale – cititoare ELISA
o ELISA sandwich
Se utilizează suprafețe solide tapetate cu Ac dedicați Ag vizat
Identificarea și măsurarea cantității unor Ag solubile din diverse
fluide
Lichidul în care se găsesc Ag de interes este incubat în godeurile plăcii
tapetate cu Ac
 Moleculele de Ag rămase nelegate sunt îndepărtate prin spălare
Cele capturate în complexele Ag Ac sunt detectate cu ajutorul unor
Ac secundari
• Acești Ac secundari sunt marcați cu
enzima Excesul de Ac secundari este îndepărtat
prin spălare Se adaugă cromogenul
Intensitatea reacției de culoare este proporțională cu concentrația
Ag
o ELISA competitivă
Prima etapă constă în incubarea în soluție a probei ce conține Ag de
interes cu Ac → formarea de complexe imune solubile
• Cantitate mare de Ag → legarea unei cantități mari de
molecule de Ac – vor fi disponibile mai puține molecule de Ac
liber
Această soluție este introdusă în godeurile unei plăci ELISA tapetate
cu Ag
• Ac liberi se leagă la Ag imobilizate în placă
• Complexele Ag-Ac sunt îndepărtate prin spălare
Legarea Ac la Ag fixate este evidențiată prin adăugarea de Ac
secundari conjugați cu enzimă și apoi substrat
Intensitatea culorii este invers proporțională cu cantitatea de Ag din
proba investigată
Chemiluminiscență
o Se bazează pe măsurarea luminii ce rezultă din anumite reacții
chimice Mai eficientă și mai sensibilă coparativ cu ELISA
o Substratul cromogenic este înlocuit cu un substrat caracterizat prin capacitatea
de a emite lumină în prezența unei enzime
o Principiu:
Interacțiunea dintre Ag de interes și Ac cuplați cu enzima
Developarea reacției utilizează un substrat chemiluminiscent, care în
prezența enzimei legată la Ac generează luminiscență continuă, cu
o intensitate constantă, și proporțională cu cantitatea de enzimă,
deci, indirect, cu cantitatea de Ag
o Această metodă poate fi automatizată – o astfel de platformă bazată pe
chemiluminiscență este denumită Immulite
Conjugatele formate din Ac și fosfataza alcalină sunt atașate la niște
bile speciale, care vor fi incubate cu proba ce conțin Ag de interes
Se îndepărtează excesul de reactanți și se adaugă substratul
luminogenic
După 10 min de incubare, unitatea de testat este poziționată în fața
tubului fotomultiplicator (PMT)
• Se măsoară lumina generată de reacția lumigonetică
În reacția luminogenică, substratul este defosforilat într-un anion
instabil intermediar de către conjugatul de fosfatază alcalină fixat pe
suportul bilelor
• Cantitatea de lumină emisă este direct proporțională cu
cantitatea de fosfatază alcalină legată
o Chemiluminiscența are cel mai înalt grad de sensibilitate
 Imunohistochimia

Imunohistochimia

- Tehnica imunohistochimică este dedicată identificării antigenelor proteice de la nivel

celular sau tisular
- Principiu:
o Abilitatea anticorpilor de a interacționa specific cu epitopi sau antigene
o Țesuturile folosite în această metodă sunt fixate și apoi incluse în parafină
- Fixatorii sunt utilizați pentru a proteja țesuturile de autoliză și pentru a împiedica
dezvoltarea bacteriilor și a mucegaiurilor
o Cei mai populari fixatori conțin formalină, o sare neutră și un tampon pentru
pH
- În tehnicile imunohistochimice pot fi utilizați anticorpi monoclonali sau policlonali
o Folosirea anticorpilor monolclonali prezintă avantaje
- Anticorpii pot fi clasificați în primari și secundari
o Anticorpii primari sunt destinați cuplării cu antigenele de interes – cel mai
frecvent sunt neconjugați
o Anticorpii secundari au ca specificitate epitopi de la nivelul anticorpilor primari
– sunt conjugați cu biotină, diferite enzime sau cu agenți fluorescenți
- Metode de colorare
o Metoda directă – anticorpul primar este marcat cu enzimă
Aplicarea substratului cromogen evidențiază formarea complexelor
specifice Ag-Ac
o Metoda indirectă în 2 pași
Se folosește un anticorp primar neconjugat pentru reacția antigen-
specifică
Al doilea anticorp, secundar, conjugat cu enzimă recunoaște și
interacționează cu anticorpul primar
Această tehnică este mai sensibilă
o Metoda indirectă în 3 pași
Același principiu ca la tehnica precedentă
Se adaugă un al treilea Ac cu specificitate pentru anticorpul secundar
Ac secundar și terțiar sunt marcați cu aceiași enzimă
Adiția celui de al treilea Ac are rolul de a amplifica semnalul de culoare

IMUNOFLUORESCENȚA

- Substanțele fluorescente sau fluorocromii au capacitatea ca, odată stimulate cu o

lumină caracterizată de o anumită lungime de undă, să emită lumină cu o altă
lungime de undă
- Anticorpii pot fi cuplați cu astfel de substanțe la nivelul fragmentului Fc fără ca
specificitatea să fie alterată
- Cei mai utilizați fluorocromi sunt:
o Fluoresceina (FITC – isothiocianat de fluoresceină)
Excitarea cu o lumină albastră conduce la emisia de lumină verde
o Phycoerithrina (PE)
Absoarbe lumina de 30 de ori mai eficient decât FITC și emite la o
lungime de undă de 578 nm (galben)
- Utilizăți imunofluorescență:
o Identificarea de populații celulare pe baza unor molecule cheie de suprafață
 o Identificarea unor anticorpi fixați în diverse țesuturi
o Identificarea componentelor sistemului complement care s-au legat la celule
o Identificarea unor hormoni sau citokine sau a unor specii bacteriene
- Imunofluorescența directă
o Anticorpii primari sunt cuplați cu fluorocromi
o Acești anticorpi sunt aplicați direct peste produsul ce urmează a fi analizat
o Legarea specifică a Ac numai la Ag țintă este vizualizată cu ajutorul unui
microscop cu fluorescență
o Se pot folosi Ac de la alte specii sau de la om
o Ex: se folosesc Ac recoltați de la pacienții cu diverse autoimunități
Ac sunt fluorocromați și utilizați pentru marcare
Se identifică prezența și distribuția autoantigenelor
o Avantaje
Se pot folosi mai mulți fluorocromi simultan
Se identifică mai multe molecule simultan
o În funcție de distribuția celulară a moleculelor vizate culorile generate de
excitația substanțelor fluorescente pot fi percepute în mod distinct
o Cuplarea anticorpilor cu biotină apoi incubarea cu un complex
avidină/fluorocrom
- Imunofluorescența indirectă
o Prezintă o serie de avantaje
Anticorpul primar nu mai este cel marcat – nu mai suntem constrânși
să folosim Ac, monoclonali, fluorocromați
Ac secundari sunt de obicei policlonali – un singur reactiv marcat
poate fi folosit pentru o multitudine de Ac primari
Crește sensibilitatea – o moleculă de Ac primar va fi legată de mai
multe molecule de Ac secundari marcați
o Prin această tehnică se permite distincția între diferite isotipuri ale Ac primari
o Această metodă poate fi aplicată pentru testarea capacității de fixare a
complementului la nivelul unui anumit țesut
În prima etapă se utilizează Ac primari cu specificitate pentru un Ag
tisular și produși ai complementului
În a doua etapă Ac fluorocromați anti-complement
o În cazul autoimunităților
Proba de țesut recoltată de la pacient va fi incubată chiar cu serul
pacientului
• Dacă serul conține Ac, aceștia se vor lega la autoantigenele
prezente în țesut
A doua etapă presupune incubarea cu un Ac fluorocromat anti-anticorp
uman penru vizualizarea reacției

CITOMETRIA ÎN FLUX

- Utilizări:
o Identificarea și/sau sortarea celulelor pe baza markerilor de suprafață
o Analiza conținutului ADN și a ciclului celular
o Evaluarea funcționalității unor celule
o Studiul bacteriilor și al unor plante
o Monitorizarea post-transplant
- Principiu:
o Particulele antrenate de un flux de lichid trec individual prin dreptul unui
fascicul laser concentrat pe o suprafață foarte mică
o Fiecare particulă este analizată ca un eveniment distinct
o Se pot analiza până la 100000 de particule/secundă
o Pot fi analizați 20 de parametri distincți pentru fiecare dintre aceste particule
- Componente flow citometru
o Sursa de lumină monocromatică
o Componente necesare pentru focalizarea luminii
o Sistem pneumatic – responsabil pentru mobilizarea cu o viteză constantă a
particulelor
o O celulă de flux
o Ansamblu de detectare și convertoare de semnal
o Sistem de colectare, procesare și stocare a datelor
- Majoritatea flow citometrelor noi folosesc ca sursă de lumină laserele
o Sensibilitatea unui flow citometru depinde de o astfel de sursă coerentă de
lumină
o Sursa de lumină trebuie să fie focalizată la nivelul unei suprafețe foarte
înguste
o Fasciculul trebuie să aibă o anumită formă – cel mai des folosită este cea
eliptică
- Într-un flux de lichid, celulele sunt plasate în centrul acestuia, înconjurate într-o teacă
de lichid
o Pe acest principiu au fost construite celulele de flux
O astfel de celulă prezintă un ac care introduce particulele în interiorul
unui flux de lichid generând un flux coaxial
Lichidul se deplasează de la o zonă cu diametru mare, către o zonă cu
diametru semnificativ mai mic → viteza este amplificată
Viteza de deplasare este maximă în centrul curentului
- Cele mai multe instrumente utilizează fotomultiplicatoare (PMT) atât pentru detecția
împrăștierii luminii cât și pentru detecția semnalelor fluorescente (câte un PMT
pentru fiecare lungime de undă)
- Pulsul pe care îl generează o particulă extitată de fasciulul laser depinde de:
o Forma fasciculului
o Intensitatea luminii
o Dimensiunea, viteza și încărcarea cu fluorocromi a particulei
- Investigația fiecărei celule care trece prin dreptul fasciculului laser se numește
imunofenotipare
- Lumina înregistrată de către un senzor situat de partea opusă sursei de lumină –
Forward Scatter – oferă informații legate de mărimea particulei
- Lumina înregistrată de un senzor situat la un unghi de 90o față de fasciculul laser
oferă informații legate de granularitatea sau structura nucleară
- Prin combinarea acestor 2 parametri, mărime și granularitate, fiecare particulă va
putea fi proiectată sub forma unui punct în cadrul unui grafic denumit dot plot
o Pe baza acestor caracteristici, un amestec de celule va putea fi separat în
populații distincte, vizibile sub forma unor grupuri compacte de puncte
- Identificarea fenotipului celular – a ansamblului de molecule care caracterizează o
anumită celulă – implică incubarea acesteia cu Ac monoclonali specifici Ag celulei
respective, cuplați cu substanțe fluorescente, apoi analizarea sa prin flow-citometru
 o Când o astfel de celulă trece prin dreptul fasciculului laser, exitarea
fluorocromilor duce la emiterea de lumină cu o lungime de undă superioară
celei absorbite, dar la un nivel de energie inferior
o Cantitatea de energie este proporțională cu cantitatea de substanță
fluorescentă prezentă la nivelul celulei respective
o Lumina emisă de un anumit fluorocrom poate trece de oglinzile dicroice sau
poate fi reflectată de către acestea
- Compensație spectrală – procentul de semnal înregistrat de către un detector pentru o
anumită fluorescență este scăzut din procentul de semnal înregistrat de celălalt
detector
- Analiza fluorescențelor emise se poate realiza monoparametric sau biparametric
- Analiza monoparametrică generează histograme – semnalul fluorescent este
reprezentat sub forma unor vârfuri proiectate pe axa x, cu atât mai departe de origine, cu
cât intensitatea semnalului este mai mare
o Primu vârf care apare pe aceste histograme este generat de autofluorescența
celulelor
o Orice semnal real, înregistrat ca urmare a excitării fluorocromilor, este
reprezentat de un vârf situat la dreapta vârfului autofluorescenței
- Analiza bi-parametrică a fluorescențelor compară intensitatea semnalului generat de
2 fluorocromi
o Evenimentele înregistrate sunt reprezentate sub forma unui dot-plot
o Graficul este împărțit în 4
cadrane Dublu-negative –
stânga jos Dublu pozitive –
dreapta sus
Simplu pozitive pentru fiecare fluorocrom

Sortarea particulelor

- Separarea fizică a unor celule de interes, pe baza unor parametri stabiliți de către
investigator
- Una din variante constă în sortarea electrostatică
- Principiu:
o Identificarea celulei de interes pe baza semnalului măsurat
o Plasarea la nivelul celulei a unei sarcine electrice
o La ieșire din analizator, celulele încărcate electric vor trebui să treacă
printr- un câmp electric care le oblică se direcționeze către un anumit pol

APLICAȚII ALE CITOMETRIEI ÎN

FLUX

Imunofenotiparea

- Cea mai frecvent utilizată aplicație

- Reprezintă identificarea, cu ajutorul Ac monoclonali fluorocromați, a expresiei unor
diferite molecule, la nivelul membranei celulare și/sau în interiorul acesteia
- Moleculele constante pe care se bazează această caracterizare alcătuiesc un ansamblu
foarte complex – pentru simplitate au fost introduse într-un sistem denumit CD
(cluster of differentiation)
- Pot fi identificate celulele aparținând unei anumite populații sau subpopulații, poate
fi precizat stadiul de dezvoltare al celulelor sau statusul de activare
- Utilizări:
 o Identificarea populațiilor de Ly T CD4+ și CD8+
o Evidențierea tropismului virusului HIV pentru Ly Th
o Monitorizarea statusului pacienților cu SIDA
o Evaluarea pacienților pre- și post-transplant
o Monitorizarea medicației imunosupresive
o Stabilirea diagnosticului în imunodeficiențele congenitale
o Monitorizarea imunoterapiei și a reconstituirii imune
o Detectarea bolii imune reziduale ca măsură a eficienței unei terapii în
afecțiunie maligne hematologice
o Tiparea HLA

Analiza conținutul ADN

- Celulele normale conțin 2 cromosomi fiind considerate diploide sau euploide – au

conținut normal de ADN
- Cu excepția ovulelor și a spermatozoizilor, toate celulele care nu sunt diploide sunt
considerate aneuploide și reprezintă un indicator al malignității
- Analiza ploidiei poate fi utilizată pentru aprecierea cantității de ADN ce
caracterizează o anumită tumoră și pentru monitorizarea eficienței chimioterapiei
- Fluorocromul de elecție este iodura de propidiu – are capacitatea de a pătrunde în
nucleii celulelor și de a se lega la ADN
o Cantitatea de acid nucleic este cuantificată prin măsurarea intensității
fluorescenței înregistrată de către senzorul FL2
o Intensitatea fluorescenței este direct proporțională cu cantitatea de ADN din
celule
- Indexul ADN este utilizat pentru determinarea ploidiei unei malignități și
reprezintă un raport între fluorescența ADN a celulelor tumorale și fluorescența
ADN a celulelor normale
- Indexul ADN al unei celule diploide este 1
o Un index mai mic sau mai mare decât 1 reprezintă un indicator pentru prezența
celulelor aneuploide
- Cu cât celulele proliferează mai intens, cu atât cantitatea de ADN va fi mai mare
o O cantitate mare de ADN este direct proporțională cu agresivitatea tumorii

Investigarea unor molecule solubile

- CBA – cytometric bead array – utilizează un set de bile cu dimensiuni distincte, cu

fluorescențe discrete care sunt acoperite cu Ac destinați unor substanțe solubile,
cum ar fi citokinele
- Bilele oferă o suprafață de captură pentru proteina vizată
- După ce proteina a fost fixată la suprafața bilelor, ea va putea fi detectată cu ajutorul
unui al doilea strat de anticorpi

Medicina reproducerii
- Identificarea și analiza celulelor spermatice trebuie să utilizeze fluorocromi care se
pot lega de ADN fără să ii inducă alterări
- O altă abordare utilizează Ac cu specificitate față de antigenele H-Y

Cross-match

- Acest test are ca scop identificarea în serul primitorului a eventualilor anticorpi capabili
să recunoască antigene ale donatorului
- Această metodă este de 100 de ori mai sensibilă decât metoda clasică
- Ly izolate de la donator sunt incubate cu serul primitorului și apoi cu Ac
fluorocromați anti-anticorpi umani
- Dacă în serul primitorului există Ac față de molecule prezente pe suprafața Ly
donatorului, atunci aceștia se vor lega și prezența lor va putea fi identificată prin
analiza flow-citometrică a celulelor
- Pe baza unor markeri caracteristici, această procedură oferă avantajul de a putea
identifica simultan dacă Ly care fixează Ac primitorului sunt Ly T sau B

Biologia celulară

- Evaluarea producției de radicali liberi ai oxigenului de către o singură celulă –

reprezintă o metodă eficientă de investigare a funcției de fagocitoză a neutrofilului
- Citometria în flux oferă posibilitatea investigării pH-ului intracelular, a concentrației
thiolului, a unor proteine

Analiza proliferării celulare

- Identificarea celulelor proliferante se bazează pe capacitatea lor de a sintetiza ADN și

de a încorpora la nivelul acestuia analogi de nucleozide marcate ce vor putea fi
vizualizate
- Fiecare divizune celulară împarte cantitatea de CFSE conținută de o celulă între cele
două celule fiice
- În timpul ficărei runde de divizune, intensitatea relativă a colorantului se reduce cu
jumătate
- Aplicații - analiza proliferării specifice și nespecifice a Ly T

Analiza morții celulare prin apoptoză

- Un eveniment precoce al apoptozei este reprezentat de translocarea fosfatidil-serinei

(PS), din interiorul celulei la exteriorul membranei
- PS poate fi evidențiată prin legarea de către Annexina V cuplată cu o substanță
fluorescentă

Analiza citotoxicității celulare

- Teste funcționale, bazate pe evaluarea și măsurarea eliberării de Cr din țintele

ucise de efectori

Microbiologie

- Controlul eficienței metodelor de transfecție genică

 Botanică

- Investigarea ciclului celular sau a cromosomilor celulelor vegetale

Farmacologie
ABO
RH