Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

Cap. 1.2.2. Replicarea plasmidelor i mecanismele de reglaj

Indiferent dac confer bacteriei gazd caractere eseniale sau neeseniale, toate plasmidele au n structura lor o regiune important pentru replicarea i meninerea stabil a plasmidului respectiv n populaia bacterian. n prezent, se consider c aceast regiune ar conine: - secvene de origine a replicrii plasmidiale, denumite convenional oriV (fa de oriC originea replicrii cromozomului bacterian); o secven oriV trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii: - regiunea ADN minimal, cu activitate n cis, ce poate susine replicarea plasmidial - regiunea ADN n care cele 2 catene se despart pentru a iniia procesul de replicare - nucleotidul/nucleotidele la care ncepe sinteza catenei leading - multe plasmide codific o protein implicat n iniierea replicrii plasmidiale, denumita proteina de tip Rep - gene implicate n controlul replicrii plasmidiale A. Replicarea plasmidelor lineare (ADN d.c. linear) n ceea ce privete replicarea plasmidelor lineare, aceasta se desfoar prin mecanisme diferite, funcie de tipul de telomere (H.Hinnebusch et al 1993): a) replicarea plasmidelor cu telomere hairpin Datorit capetelor legate covalent, ADN polimeraza poate trece peste ele continund replicarea printr-un intermediar replicativ concatemeric (modelul Bateman 1975). Asemenea plasmide ar putea reprezenta un caz special de plasmide circulare monocatenare, n care jumtate din cerc este complementar cu cealalt jumtate. b) replicarea plasmidelor cu telomere invertroni se replic printr-un mecanism de replicare ADN primat de proteine (Fig.1.12.), n cazul de fa proteina TP (Telomeric Protein). n cazul unor asemenea plasmide, telomerele reprezint originea replicrii i sunt recunoscute de proteine de iniiere care desfac dublul helix ADN.
TP A
3T

T 3 A TP

A A

HO3
A 3 T

T A

Plasmidele cu telomere invertroni sunt replicate de o ADN polimeraz ce seamn mai mult cu ADN polimeraza de la eucariote, dect cu ADN polimerazele de la procariote. Ultima nucleotid de la capul 5 al fiecarei din cele 2 catene (nucleotida la care este ataat covalent proteina TP), este o adenin (A). Separat de molecula plasmidial, se formeaz complexe din alt monomer TP i alt molecul de adenin. Cei 2 monomeri TP (unul ataat la o adenin, iar cellalt ataat la adenina din telomera plasmidial) se atrag i are loc procesul de dimerizare (vezi fig.), iar ntre A i primul nucleotid (T) de pe catena complementar se formeaz legturi de hidrogen. Tototdat, acest al doilea A ofer capul 3 liber pentru primarea polimerizrii.

Fig.1.12. Replicarea plasmidelor cu telomere invertroni.

B. Replicarea plasmidelor circulare. Au fost descrise 3 mecanisme generale de replicare a plasmidelor circulare (dupa Espinosa M. et al 1995) : A. Mecanismul THETA Acest mecanism prezint asemnri foarte mari cu procesul de replicare a cromozomului bacterian. Ca i n cazul cromozomului bacterian, acest mecanism poart numele de theta datorit faptului c intermediarii de replicare sunt molecule cu forma literei greceti theta. Mecanismul theta de replicare se ntlnete cu precdere la plasmidele de la bacteriile Gramnegative, dar i la unele plasmide de la Gram-pozitive (streptococ, enterococ, unii lactococi). Replicarea acestor plasmide necesit o protein iniiator, codificat plasmidial i denumit proteina Rep. Procesul pornete de la o regiune denumita oriV, ce are organizare similar cu oriC din cromozomul bacterian. Intreg procesul de replicare de tip theta depinde de mai multe clase de proteine, din care ns doar proteinele de tip Rep sunt codificate plasmidial, celelalte sunt codificate cromozomal i sunt aceleai proteine ce intervin i n replicarea cromozomului bacterian. O excepie o reprezint plasmidul Col E1,

HO
A

Cap. 1-2-2 Plasmide bacteriene:replicare i reglaj

care se replic printr-un mecanism de tip theta, dar nu necesit prezena unei proteine iniiator de tip Rep. La plasmidele ce se replic prin mecanism theta, regiunea oriV cuprinde : - 4-5 secvene ADN n repetiie direct i denumite iteroni, la care se ataeaz proteina Rep (iteronii exist i n cazul celorlalte dou mecanisme de replicare plasmidial) - o regiune bogat n A/T, unde este iniiat desfacerea dublului helix - cutii dnaA, la care se ataeaz proteina DnaA Proteinele Rep sunt proteine de tip leucine-zipper cu un domeniu HTH ( -helix-turn- -helix) i se ataeaz la ADN ntr-o manier situs-specific, i anume la secvenele iteroni. Ataarea se realizeaz astfel nct moleculele Rep sunt aliniate pe aceeai fa a moleculei ADN. Procesul de replicare a plasmidelor prin mecanism theta se desfoar n urmtoarele etape (Fig.1.13.): a) n prima etap are loc ataarea proteinelor cutii Rep la secvenele iteroni; acest lucru Rep determin o curbare a moleculei ADN n cutii regiune atasarea DnaA DnaA AT aceast zon, fapt ce faciliteaz etapa DnaA urmtoare; atasarea b) ataarea proteinelor DnaA la cutiile dnaA; la Rep rndul ei, aceast etap o faciliteaz pe urmtoarea; c) ataarea complexului proteic DnaB-DnaC la regiunea din oriV bogat n A/T; DnaB este o helicaz i desface dublul helix n aceast zon; d) are loc sinteza unui ARN primer de ctre o DnaB ARN polimeraz codificat de o gen cromozomal; e) ncepe procesul de polimerizare desfurat, la majoritatea plasmidelor din aceast bucla theta unidirectionala clas, de ctre ADN polimeraza III (excepie face plasmidul Col E1, care este replicat Fig.1.13. Replicarea plasmidelor circulare prin mecanism THETA. prin mecanism theta, dar de ctre ADN polimeraza I); f) sinteza celor 2 catene (leading i lagging) este cuplat i se desfoar cvasi-simultan; g) sinteza se desfoar n majoritatatea cazurilor unidirecional, spre deosebire de replicarea cromozomului bacterian care la marea majoritate a speciilor bacteriene se desfoar bidirecional. Dintre cele mai cunoscute plasmide ce se replic prin mecanism theta, amintim pSC101, P1, RK2, RP4, R6K, R1, ColE2, ColE3. B. Mecanismul STRAND-DISPLACEMENT (SD) Denumirea provine din termenul strand-displacement i se refer la faptul c n timpul procesului de replicare are loc dislocarea uneia din cele 2 catene ADN. Acest mecanism se ntlnete mai ales la plasmidele promiscue din grupul de incompatibilitate IncQ (de exemplu, RSF1010). La aceste plasmide regiunea oriV este alcatuit din : - 3 secvene ADN de tip iteroni - 1 regiune bogat n G/C (174 bp) - 1 regiune bogat n A/T (31 bp) Procesul de replicare ADN de tip strand-displacement nu depinde de proteine ale celulei gazd (codificate cromozomal, cum ar fi DnaA, DnaB, DnaC), ci de trei proteine codificate plasmidial: RepA este o helicaz ce intr n dublul helix ADN n regiunea bogat n A/T i faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma buclei D (forma literei D); RepB este o primaz care sintetizeaz un primer ARN necesar iniierii polimerizrii ADN; RepC este o protein iniiator care se ataeaz la secvenele iteroni din oriV. Replicarea pornete de la dou origini (ssiA i ssiB) simetrice i adiacente, ce funcioneaz n forma monocatenar i sunt situate pe cele 2 catene. Procesul de replicare ncepe cnd aceste 2 origini sunt expuse monocatenar. Procesul de replicare SD se desfoar n urmtoarele etape (Fig.1.14.) :

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

I I I ssiB I I ssiA RepC I RepA (helicaza) RepB (primaza)

1. monomeri ai proteinei RepC se ataeaz la secvene iteroni din oriV; 2. proteina RepA (helicaza) se ataeaz la regiunea din oriV bogat n A/T, determinnd desfacerea dublului helix; 3. proteina RepB (primaza) se ataeaz la bucla A/T i sintetizeaz un primer ARN; 4. ncepe procesul de polimerizare ADN; 5. helicaza RepA faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma unei bucle D.

Fig.1.14. Replicarea plasmidelor circulare prin mecanism stranddisplacement.

Produsele intermediare ale unui proces de replicare SD sunt : 1. o molecul ADN circular d.c. 2. o molecul ADN circular m.c. pe aceasta va fi iniiat un nou proces de replicare care va conduce la formarea catenei complementare, i deci, a formei dublucatenare a plasmidului. n cazul unui asemenea mecanism de replicare, sinteza celor dou catene noi ale moleculei de ADN nu este cuplat i simultan. C. Mecanismul ROLLING-CIRCLE (RC) Denumirea provine din faptul c n timpul procesului, molecula de ADN are forma unui cerc rotativ. Acest mecanism de replicare este ntlnit la plasmide prezente n multe bacterii Gram-pozitive, de exemplu plasmidul pT181 (de la Staphylococcus), pUB110 i pC194 (de la Bacillus subtilis). Ca i n cazul mecanismului SD, replicarea de tip RC depinde de o protein iniiator codificat plasmidial (propteina Rep) i de o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian. Plasmidele ce se replic prin mecanism RC au dou secvene ori, situate distanat una dso de alta: 3OH dso (double-stranded origin), de la dimer helicaza Rep ssb sso care este iniiat replicarea primei ADN pol III catene noi (catena leading); dso are 2 regiuni: atac - regiunea bind, la care are loc ataarea proteinei iniiator Rep 3OH - regiunea nick, n care proteina Rep produce ruptura monocatenar initial sso (single-stranded origin), de la care este iniiat sinteza celei de-a doua catene noi (catena lagging) n procesul de replicare RC se parcurg urmtoarele etape (Fig.1.15) : 1. proteina Rep se ataeaz la regiunea bind a secvenei dso; 2. proteina Rep taie o legtur fosfodiesteric (producnd o ruptur monocatenar) i rmne ataat la capul 5 printr-o legtur Tyrfosfodiesteric; capul 3 va servi ca primer pentru sinteza catenei leading; 3. n procesul de sintez a catenei leading intervin o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian: helicaza, proteine de tip Ssb, ADN polimeraza III;

ADN mc sso RNAP

primer

ADN pol I Rep inactiv ADN dc

Fig.1.15. Replicarea plasmidelor circulare prin mecanism rollingcircle.

Cap. 1-2-2 Plasmide bacteriene:replicare i reglaj

4. replicarea catenei leading continu mai mult de o rund complet, depind regiunea dso; 5. pentru terminarea replicrii catenei leading, are loc o reacie de transfer de caten: prin monomerul liber, proteina Rep atac regiunea dso a catenei vechi (vezi fig.), taie o legatur fosfodiesteric i reface alta, rezultnd: - o molecul circular d.c. care a eliberat i un dimer de Rep inactiv - o molecul circular m.c. pe care, de la sso, este sintetizat un primer i apoi o caten noua Deci, i n cazul acestui mecanism sinteza celor dou catene ADN noi nu este cuplat. Intr-un asemenea proces proteina Rep are un rol mai complex dect ntr-o replicare de tip SD: - se ataeaz la dso, avnd rol n iniierea replicrii; - taie o legtur fosfodiesteric, producnd nick-ul iniial; - la terminarea sintezei primei catene noi, Rep taie i reface legturi fosfodiesterice. Datorit activitatii sale catalitice, proteina Rep de la plasmidele ce se replic printr-un mecanism RC este similar cu topoizomerazele din clasa I. In general, plasmidele ce se replic printr-un mecanism RC au o alctuire modular, cel mai important modul fiind LIC (Leading strand Initiation and Control region) care este format din dso, gena rep i elemente de control al replicrii plasmidei. Pe baza structurii LIC au fost definite 4 familii de plasmide ce se replic prin mecanism RC, familii ce au drept reprezentani urmtoarele plasmide: pT181, pC194, pMV158 i pSN2. Alte module importante n aceste plasmide sunt: 1-2 module sso, 1 secven mob, 1 gen de antibiorezisten. Mecanisme de control al replicrii ADN plasmidial Plasmidele din familia ColE1 Replicarea acestor plasmide se desfoar unidirecional i este realizat de ADN polimeraza I i nu de ADN pol III (principala replicaz a cromosomului bacterian). Procesul de replicare ncepe cu sinteza unui ARN primer (denumit ARN II), ce este transcris ncepnd de la un situs localizat la 555 pb n amonte fa de oriV (Fig. 1.16.). Iniial, acest transcript este separat de ADN, ca n cazul unei transcrieri obinuite. Pe msur ce ARN polimeraza se apropie de oriV, transcriptul ncepe s ramn hibridizat cu matria ADN. Cauza probabil a acestui eveniment l constituie faptul c molecula ARN II contine 6 resturi de guanin consecutive situate la circa 265 nucleotide n amonte fa de oriV; aceste 6 G interacioneaz probabil cu 6 resturi de citozin consecutive din catena matri ADN, ce se gsesc la cca 20 nucleotide n amonte fa de oriV. Apoi hibridul este tiat de RNaza H, iar capul 3 al ARN va fi elongat de ADN pol I. O modalitate de control negativ al replicrii plasmidelor din familia Col E1 se realizeaz prin formarea unui al doilea ARN (denumit ARN I), care are funcie de ARN antisens, conine 108 nucleotide i este transcris de la poziia -445 fa de oriV, dar n direcie opus, de pe cealalt caten ADN. Prin legarea lui ARN I (antisens) de ARN II (primer) este alterat conformaia secundar a acestuia din urm, astfel nct ARN primer nu mai poate hibridiza cu oriV. Acest ARN antisens este transcris constitutiv, dar este instabil, iar legarea lui la ARN II este mediat de o protein numit Rop (codificat de gena rop). Aplicarea unui inhibitor al sintezei proteice n celulele bacteriene (de exemplu, cloramfenicolul) blocheaz sinteza proteinei Rop, rezultatul fiind o crestere a frecvenei de iniiere a replicrii plasmidelor Col E1. Acest lucru se bazeaz pe faptul c n citoplasma bacterian exist suficiente molecule de ADN pol I (cca 300), chiar dac este blocat proteosinteza. Pe acest mecanism se bazeaz i amplificarea plasmidial in vitro (creterea numrului de copii plasmidiale n condiii experimentale), ce este realizat de obicei pentru vectorii plasmidiali ce conin regiunea oriV din plasmidul ColE1. Plasmida pSC101 Prima citare a lui pSC101 n literatura de specialitate a fost n 1973 - Cohen care a folosit-o ca vector n experimente de clonare. Ulterior ns, aceast plasmid a fost identificat ca plasmid natural la tulpini de Salmonella i Escherichia coli. Ea prezint un numr mediu de copii (6-7) per echivalent cromosomal i are o gen de rezisten la tetraciclin. ntreaga plasmid (9263 pb) a fost complet secveniat. Prin analize de deleii s-a constatat c regiunea replicativ a acestei plasmide reprezint un fragment de 2.2 kpb ce este cuprins ntre situsurile a dou enzime de restricie - Hinc II i RsaI. Aceast regiune replicativ are 3 zone majore: (1) regiunea par - foarte important pentru stabilitate i afecteaz i numrul de copii; (2) regiunea ori - de la care pornete replicarea unidirecional i care conine majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate; 4

Genetica microorganismelor i inginerie genetic microbian Note de curs i tehnici de laborator

(3) gena repA - care este o gen specific plasmidial i codific o protein de replicare.

Fig. 1.16. Mecanismul de control al replicrii plasmidului Col EI.

Plasmidul pSC101, mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide (F, R6K), aparine unei clase de repliconi a cror replicare nu este realizat de ADN polimeraza I. Aceti repliconi codific o protein autoreglat (RepA) esenial pentru replicare i posed copii repetate direct ale unei secvene ce este specific pentru fiecare plasmid i la care se ataeaz proteina RepA. Proteina RepA este alctuit din 316 aminoacizi (37kdal) i funcioneaz ca dimer. Promotorul genei repA contine o secven parial omoloag cu repetrile directe. Astfel, RepA are specificitate de ataare i la propriul promotor, autoreglndu-i propria exprimare. n procesul prin care aceast protein controleaz replicarea plasmidei, RepA se ataeaz la cele 3 secvene RS din regiunea oriV, participnd la iniierea replicrii. Eficiena de legare a lui RepA la cele 3 secvene RS pare s moduleze numrul de copii plasmidiale. Meninerea stabil a plasmidului pSC101 n celula bacterian presupune intervenia mai multor clase de proteine: DnaA (esenial i n iniierea replicrii cromosomului bacterian), IHF (Integration Host Factor, protein histone-like implicat n reglarea unei serii de procese celulare), DnaB, DnaC, DnaG (primaza), precum i diverse componente proteice ale holoenzimei ADN polimeraza III.

Cap. 1-2-2 Plasmide bacteriene:replicare i reglaj

Regiunea oriV din plasmidul pSC101 conine situsuri multiple de legare pentru proteine eseniale n replicarea plasmidial. O zon de aproximativ 200 pb este crucial n formarea complexului de iniiere a replicrii plasmidiale. Principalele situsuri sunt: - un situs de ataare a proteinei DnaA (omolog cu situsurile pentru DnaA din oriC) - 2 secvene repetate formate din cte 13 pb (13-mer), omoloage cu secvenele din oriC i care funcioneaz ca situsuri de intrare pentru complexul DnaB-DnaC - o regiune bogat n A/T - ntre regiunea A i regiunea T se gasete situsul pentru IHF - un cluster de 3 secvene repetate direct RS1 (24 pb), RS2 (18 pb), RS3 (24 pb) la care se atasaza proteina RepA - ARN polimeraza se ataeaza la un promotor localizat n i ntre aceste 3 secvene RS (promotorul pentru ARN-Y) Procesul de transcriere genetic n regiunea ori este implicat n iniierea replicrii i constituie un fenomen extrem de frecvent n lumea bacterian, att pentru replicarea cromosomului, ct i a unor plasmide. n cazul plasmidului pSC101, printr-un asemenea proces de transcriere n regiunea de origine a replicrii, este sintetizat o molecul de ARN (denumit ARN-Y) care ncepe din mijlocul lui RS2. Acest proces nu se afl sub controlul proteinei RepA, iar rolul moleculei ARN-Y pare s fie acela de a facilita deschiderea dublului helix ADN n regiunea ori. Legarea simultan a proteinelor Rep A, IHF, Dna A, DnaB-Dna C este favorizat de curbarea ADN determinat de legarea IHF (curbeaza dublul helix ADN cu150o la situsul de atasare), i determin formarea REPLISOMULUI. Regiunea par nu este esenial pentru replicare (plasmidele par- se replic), dar este esenial pentru stabilitatea plasmidelor n celula bacterian, probabil prin situsul pentru giraza. Reglarea numrului de copii plasmidiale la pSC101 i, probabil, i la alte plasmide i sisteme similare, nu este produsul unui singur mecanism de reglare, ci este o rezultant a unui set de interaciuni moleculare (ADN-proteine, ADN-ADN, proteine-proteine), fiecare dintre ele contribuind la replicarea, stabilitatea i partiia eficient a plasmidului.