IZOLAREA I

CONFIRMAREA
ENTEROBACTERIILOR


Enterobacteriile sunt bacterii nepatogene,
slab patogene sau patogene care au ca biotop
intestinul animalelor i a omului.
Acesta reprezint un biotop complex, cu
multiple variaii n funcie de substratul
nutritiv oferit, ceea ce determin o variaie i
o selecie continu a enterobacteriilor care-l
populeaz.
Din acest motiv multe specii se subdivid n
biotipuri, tipuri fagice, bacteriocinotipuri,
antibioticotipuri, etc.

Enterobacteriile pot s piard foarte uor unele
caliti sau pot ctiga altele noi, ceea ce induce
migrarea din unele subuniti taxonomice n
altele, deci largi posibiliti de recombinare.
METODA ORIZONTAL PENTRU
DETECIA I ENUMERAREA
ENTEROBACTERIACEAE
SR ISO 21 528-1/2008


Partea 1 Detecia i enumerarea prin tehnica
MPN cu prembogire.

Partea 2 Metoda de enumerarea a coloniilor.

METODA ORIZONTAL PENTRU
DETECIA I ENUMERAREA
ENTEROBACTERIACEAE
SR ISO 21 528-1/2008
Partea 1 Detecia i enumerarea prin
tehnica MPN cu prembogire
Domeniu de aplicare:
-Produsele alimentare destinate
consumului uman;
-Furaje pentru animale;
-Probe de mediu din zona de producia
i de manevrare a alimentelor.

DEFINIII
Enterobacteriaceae microorganisme care
formeaz colonii caracteristice pe agar cu
cristal violet, rou fenol, bil, glucoz
(VRBG), fermenteaz glucoza i prezint
reacie oxidaz negativ.
detectarea Enterobacteriaceae
determinarea prezenei sau absenei acestor
bacterii dintr-o cantitate specificat de produs
enumerarea Enterobacteriaceae metoda
de a determina numrul cel mai probabil pe
mililitru sau gram de produs.

MOD DE LUCRU
1. Prembogire pe mediu neselectiv
Se nsmneaz apa peptonat tamponat APT cu proba
de analizat i se incubeaz la 37C (sau 30C) timp de
18h +/- 2h;
2. mbogire n mediu selectiv lichid
Pe bulionul EE (cu verde briliant, bil, glucoz) se
inoculeaz cantiti cunoscute din cultura obinut la
prembogire, dup o schem prestabilit i se
incubeaz la 37C (sau 35C, 30C) timp de 24h +/- 2h;
3. Izolare i selectare pentru confirmare
Din bulionul EE se inoculeaz mediul selectiv VRBG i se
incubeaz la 37C (sau 35C, 30C) timp de 24h +/- 2h,
se verific prezena coloniilor presupuse dup
caracteristicile lor.







4. Confirmare
Coloniile prezumtive de Enterobacteriaceae sunt
rensmnate pe mediu neselectiv i confirmate cu
ajutorul analizelor de fermentare a glucozei i
prezena oxidazei.

ENUMERARE PRIN TEHNICA MPN
Mod de lucru
1. Prembogire pe mediu neselectiv
Se adaug x g prob pentru analiz n 9 x ml
APT, se omogenizeaz.
Se prepar una sau mai multe diluii 1 la 10, n
funcie de nivelul de contaminare estimat, n APT.
Se transfer cote pri -10ml- din diluia
iniial n trei eprubete. Apoi se adaug
3x1 ml din diluia iniial la 9 ml APT i
3x1 ml din fiecare diluie ulterioar la 9
ml APT.
Aceste eprubete se incubeaz la 37C
(sau 30C) timp de 18h +/- 2h;
2. mbogire n mediu selectiv lichid
Se inoculeaz eprubetele cu bulionul EE cu
cultur, din fiecarea eprubet obinut
dup mbogire, cel puin 3x3 eprubete
i se incubeaz la 37C (sau 30C) timp
de 18h +/- 2h;

3. Izolare i selectare pentru confirmare
Se insmneaz mediul selectiv VRBG cu
ajutorul unei anse cu fiecare din diluiile dup
mbogire cu bulion EE. Se incubeaz la 37C
(sau 30C) timp de 24h +/- 2h, se verific.
4. Confirmare
Coloniile prezumtive de Enterobacteriaceae sunt
rensmnate pe mediu neselectiv i
confirmate cu ajutorul analizelor de
fermentare a glucozei i prezena oxidazei.
Calculul
Numrul cel mai probabil de Enterobacteriaceae pe
mililitru sau gram de prob analizat se calculeaz
din numrul de eprubete pozitive confirmate,
utiliznd tabelul MPN.
METODA ORIZONTAL PENTRU
DETECIA I ENUMERAREA
ENTEROBACTERIACEAE
SR ISO 21 528-1/2008
Partea 2 Metoda de enumerarea a coloniilor
Mod de lucru
Se prepar o singur serie de diluii zecimale din
proba pentru analiz dac produsul este lichid
sau din suspensia iniial pentru produse solide.
Se transfer cte 1 ml din prima diluie (10-1), n
dou plci Petri sterile. Se transfer cte 1 ml
din urmtoarea diluie (10-2), n alte dou plci
Petri sterile. Se repet modul de lucru pentru
urmtoarele diluii.
Se toarn n fiecare plac Petri aprox. 10 ml
mediuVRBG care a fost preparat i rcit la
44C.
Timpul scurs ntre depunerea inoculului i
turnarea mediului nu trebuie s depeasc
15 minute.
Se omogenizeaz inoculum cu mediul de
cultur prin micri orizontale dirijate in cel
puin 3 direcii. Se las la solidificat.
Dup solidificare se mai toarn un strat de
VRBG de 12-15 ml pentru a se crea condiii
de semianaerobioz i a limita dezvoltarea
coloniilor la suprafaa mediului, uurnd
astfel citirea.
Dup solidificarea celui de al doilea strat, se
inverseaz plcile i se pun la incubat.
Se vor incuba la 37
o
C , timp de 24 ore +/- 2h.
ENUMERAREA COLONIILOR
Sunt considerate caracteristice coloniile care roz
spre rou sau purpuriu, cu sau fr halouri
precipintante.
Se aleg plcile care au mai puin de 150 colonii
caracteristice, se numr aceste colonii din toate
plcile cu cretere microbian, apoi se aleg la
ntmplare 5 colonii i se rensmneaz,
testeaz pentru confirmare biochimice.
ATENIE!
Dac mai mult de jumtate din plac este
invadat cu colonii se va renuna a se face
citirea, nu se va lua n calcul placa
respectiv.
Dac exist plci cu mai puin de plac
invadat, se numr coloniile de pe 1/2
clar, n care coloniile se individualizeaz.
Unele Enterobacteriaceae pot cauza decolorarea
coloniilor sau a mediului, n acest caz se vor alege
colonii albicioase pentru confirmare.
RENSMNAREA COLONIILOR SELECTATE
Se depune fiecare colonie pe cte un sector de agar
nutritiv, se incubeaz la 37C timp de 24h +/- 2h.
ANALIZE BIOCHIMICE Confirmarea
Reacia oxidazei
Cu ajutorul unei anse sau a unei baghete de sticl, se
preleveaz o colonie izolat sau o poriune din zona
nsmnat i se depune pe hrtie de filtru umectat
cu reactiv pentru oxidaz.
ATENIE !
Nu se utilizeaz ans de nichel/crom.
CITIREA REACIEI
Reacia oxidaz pozitiv
Producerea unei coloraii negre in timp de
aprox. 10 sec.
Reacia oxidaz negativ
Hrtia de filtru -i pstreaz culoarea.
Se selecteaz coloniile care au dat testul
oxidazei negativ i se supun testului de
fermentaie.




TESTUL DE FERMENTAIE
Se identific coloniile care au avut reacia
oxidazei negativ i se transfer fiecare
colonie n cte un tub cu agar cu glucoz.
Se incubeaz la 37C timp de 24h +/- 2h.
Reacia pozitiv fermentarea glucozei
Dac apare culoare galben a mediului din tot
coninutul eprubetei
Reacia negativ nefermentarea glucozei
Culoarea mediului agar glucoz este
nemodificat.
REZULTAT
Coloniile cu rezultat negativ la reacia
oxidazei i pozitive la testul fermentrii
glucozei sunt considerate
ENTEROBACTERI ACEAE.