A1 - 4 Lupulescu PDF

Investete n oameni!
Proiect cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operational Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013
Formare profesionala si
organizationala a angajatilor din
Laboratoarele de Imunologie prin
implementarea tehnologiilor de
varf si a managementului calitatii
IMUNOLAB
POSDRU/ 81/ 3.2/ S/ 59497

Activitatea A1.4.:
Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si
laborantilor in laboratorul de imunologie
Noiembrie Decembrie 2011
Investete n oameni!
Diagnosticul molecular
Emilia Lupulescu
INCDMI CANTACUZINO
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Diagnosticul microbiologic traditional

Teste de diagnostic microbiologic traditional:
- microscopie,
- cultura microbiene,
- antigenemia i serologie.
Dezavantaje:
- sensibilitate slab, cu cretere lent sau organisme slab viabile,
- interpretare complexa (imunosupresie, terapie antimicrobian, reacii
ncruciate.
Avantaje:
- cultura microbian aduce date epidemiologice valoroase, patogeni noi, atipici,
necaracterizai, microorganisme intacte disponibile pentru studii
suplimentare.
- Prin urmare, este clar c rolul a testelor tradiionale continu
sa fie unul important.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
PCR - Polymerase Chain Reaction

(reactia de polimerizare in lant)
singur sau asociat cu alte tehnici poate fi o etap n:

-tipizarea molecular a bacteriilor/virusurilor
-secvenierea ADN
-tehnologia ADN recombinant (clonare)
PCR poate fi utilizat pentru:
-Detectarea genelor de rezisten la antibiotice
-Detectarea genelor care codific factori de virulen
-Detectarea i caracterizarea elementelor genetice mobile
(integroni, transpozoni, plasmide)
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Istoric
In 1985 a aprut primul articol in care se folosea tehnica PCR pentru
descrierea genei beta-globinei responsabila de anemia cu hematii in
secera;
In 1993 Kary Mullis, descoperitorul tehnicii PCR a luat premiul Nobel;
Din 1985 pana in prezent au fost perfecionate specificaiile tehnice ale
reaciei (aparatul pentru amplificare, reactivii si metode de vizualizare a
rezultatelor) si s-au diversificat aplicaiile, PCR devenind o tehnica
fundamentala in biologia moleculara;
Real Time PCR reprezint o aplicaie a PCR prin care rezultatul
experimental se poate vizualiza si cuantifica in timpul reaciei;
Reprezint o performanta tehnica din punct de vederea al aparaturii si
reactivilor in anumite aplicaii experimentale.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Receptia probelor biologice
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Receptia probelor biologice in laborator
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
RT-PCR
(Reverse transcription polymerase chain reaction)
Tehnic de laborator utilizat n biologia molecular pentru
amplificarea unui anumit fragment de ARN, purificat manual sau
automat
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Purificarea acidului nucleic
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Purificarea acidului nucleic
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
(1) Revers transcrierea - RT (transcrierea invers)

RT este efectuat de ctre enzima reverstranscriptaz ADN polimeraz
ARN dependenta care transcrie ARN monocatenar n ADN monocatenar;
Revers transcriptazele sunt izolate din virusuri:

M-MLV revers-transcriptaz (din Moloney Murine Leukemia Virus);
AMV revers-transcriptaz (din Avian Myeloblastosis Virus)
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
(1) Revers transcrierea (transcrierea invers)

reactia primei catene
reverstranscrierea
purificarea ARN
denaturarea termo-chimica a structurilor secundare/tertiare ale ARN
ARN denaturat
Revers-transctrierea + degradare ARN
cDNA
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
(2) Polymerase chain reaction (PCR) standard

reactia celei de-a doua catene
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
PCR Principiul metodei:

Denaturarea- separarea ADN
dublucatenar la temperaturi 9094C
Hibridizarea
amorselor(primerilor) 4575C
Extensia (polimerizarea) in
functie de temperatura optima a
ADN polimerazei 6878C
90-94C
5-30
68-78C
45-75C
1-30
Ciclu de amplificae termica a ADN x 25-30 cicli = o reactie PCR

Activitatea A1.4.:
30

Investete n oameni!
Amplificare exponenial a reaciei PCR
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Endpoint Electroforez in gel de

agaroz
Multiplex PCR
Teoretic in timpul unei reacii

PCR, dup 35 de cicluri de
amplificare se poate ajunge la
34 miliarde de copii; practic
nu se atinge niciodat aceasta
valoare datorita in principal
echilibrului de hibridizare;
Dar, dintr-o copie de matria
ADN in mediul de reacie,
cnd metoda este bine
standardizata se obine
suficient amplicon pentru
vizualizarea lui prin tehnica
electroforezei orizontale,
marcat cu bromur de etidiu.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Multiplex PCR
- Mai multe perechi de primeri sunt folosii in reacia PCR
- Scopul este de a amplifica mai multe segmente ale ADN matri
simultan, ctignd timp si reducnd costurile
-Ca regula generala, pana la 8 perechi de primeri pot fi folosii
simultan in PCR standard
-Toi primerii din reacie trebuie sa aib aproximativ aceeai
temperatura de hibridizare
-Produii de amplificare trebuie sa fie de mrime asemntoare dar
suficient de diferita pentru a fi distinctibili in gelul de electroforeza
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Real Time PCR (kinetic PCR)

Real Time PCR este folosia in laboratoare pentru a
detecta/cuantifica abundenta unei anumite secvente
de ARN sau ADN din probe clinice
-Foloseste thermocyclere capabile sa detecteze fluorescenta derivat din
amplificarea specific a secventelor de acid nucleic si concomitent msoar
concentratia lor
-Permite vizualizarea curbelor de amplificare si msoar cantitatea de ADN
amplificat in timpul reactiei PCR cu ajutorul unui colorant fluorescent a crui
excitare/emisie este nregistrat de un modul optic
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Real-Time PCR consideratii tehnice

1. Modul de nclzire - bloc Peltier (BioRad, Stratagene, AB etc.)
- nclzire cu aer (Roche etc.);
2. Modul optic:
- modulul de excitare
- laser (AB, BioRad etc.)
- lampa tungsten (Stratagene etc.)
- dioda emitoare de lumin
- modul de citire si amplificare a emisiei:
- din toate godeurile in acelai timp camera CCD/ amplificare
electronica (AB, BioRad);
- din fiecare godeu cu carusel cu fibra optica/ amplificarea
specifica a undelor (PMT) (Stratagene, BioRad, Roche);
3. Chimia reaciei Real Time PCR coloranii fluoresceni si modul de folosire a
lor;
Activitatea A1.4.:
4. Interpretarea rezultatelor soft bioinformatic;
Investete n oameni!
Real-Time termocycler
Emission
Filter Wheel
Hot
Top
Excitation
Filter Wheel
Thermal
system
TungstenHalogen Lamp
Fiber
Optic
Cable
and
Scanning
Arm
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Chimia reaciei Real Time PCR

Quartz-tungsten halogen lamp excitation range (350-830nm)
TET
TET HEX
HEX TAM
TAM
Alx350
Alx350
350nm
FAM
FAM
TxRd
TxRd
JOE
ROX
Cy3 ROX
JOECy3
Cy5
Cy5
700nm
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Chimia reaciei Real Time PCR

molecule reporter
Decizia asupra tipului de reacie folosit in Real Time PCR depinde de:
- Real Time PCR termocycler;
- disponibilitatea financiar;
- disponibilitatea de livrare a reactivilor;
- metoda utilizat
- exigente de sensibilitate;
- exigente de specificitate.
In toate metodele PCR punctul de dificultate tehnica este alegerea
secvenei primerilor.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Reporter fluorescenti : nespecifici si specifici

Reporteri nespecifici:
SYBR Green
avantaje:
- metoda este uoar, sensibila,
- nu folosete sonde marcate;
- dezavantaje:
- se leag la toate secvenele ADN dublucatenar
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Double Stranded
DNA Binding Dyes
ADN + reporter sybergreen liber

(fluorescenta slaba, in amestecul de
reacie)
Reporterul sybergreen se leag de

ADN dublu catenar
(fluorescent 1,000x)
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Molecule reporter specifice

1. Sonde interne ampliconului marcate cu fluorofor:
TaqMan:
DNA polimeraza folosit are si activitate 5'-nucleazic PCR care hidrolizeaz sonda interna;
Sonda are un fluorofor (5) si un quencher (3); fluorescenta se activeaza in momentul hidorlizrii
sondei;
Dificultatea experimentala consta in alegerea temperaturii de hibridizare a celor trei primeri;
Sensibilitatea este data de echilibrul de hibridizare a primerilor;
Beacon:
Fluorescenta sondei este inactiva datorit unei bucle hair-pin care menine fluorescenta sondei
inactiva;
Sonda beacon emite fluorescenta in momentul hibridizrii;
Dificultatea experimentala consta in alegerea temperaturii de hibridizare a celor trei primeri;
Amorse marcate fluorescent : metoda Plexor

Se marcheaz fluorescent amorsa 5 iar la hibridizarea catenei complemetare se scade
fluorescenta cu un quencher;
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Donor dye
(Reporter)
Metode cu reporter specific:

TaqMan Probes
Acceptor dye
(Quencher)
Unbound probe free in solution
Light
Energy transfer
Energy
Dissipation
Taq
Probe and primer bind target, Fluor quenched
Light
Light Emission
Taq
Taq extends and hydrolyzes probe,

fluor free to emit fluorescence -->
indicate accumulation of amplicons
Activitatea A1.4.:

Investete n oameni!
Molecular Beacons
Loop
Probe sequence
Light
Stem
Reporter dye
Quencher
Probe in preferred
closed structure
Grd. St. Quenching
DNA template
Light
Light Emission
Probe competes for

and hybridizes to
Activitatea A1.4.:
DNA template
Investete n oameni!
Particulariti tehnice
Selecia ampliconilor
In general, lungimea ampliconului trebuie sa fie < 400 pb
60-120 pb pentru TaqMan
200-400 pb pentru SYBR
Selecia amorselor
Lungimea ideala este de 15-30 pb;
Tm (Melting Temperature) ~ 55-60C; primerii Taqman trebuie sa aib o
Tm de cel puin 60C.
Diferena Tm a celor doi primeri (forward si reverse) trebuie sa fie <2 C;
Coninutul GC ideal este de 40-60% GC pentru a preveni autohibridizarea
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Sequencing
Algorithm of influenza
diagnostic
NIC
sampling
Molecular
detection
Real Time PCR
A+B
Isolatian
MDCK
H1+H3
pH1N1
SARI
diagnostic
HI charact. &
phenotypic
antiviral
sensitivity
RSV
Para 1,3
OC43/229E
hMPV
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
The structure of influenza A

viruses
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
ME
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
ME
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Hemaglutinina
Glicoprotein membranar antigenic
16 subtipuri
Structur homotrimeric
Polipeptid (HA0) clivat de proteazele gazdei
n dou subuniti (HA1 i HA2)

Legarea i ptrunderea virionilor n celulele
gazd
HA se leag la structuri glucidice ce prezint
terminal resturi de acid sialic, legat 2,3 sau
2,6 la un rest de galactoz
Legarea precis la aceste lanuri determin
specificitatea de specie: 2,3 (aviar), 2,6
(uman)
Subtipurile suine prezint specificitate dual
Mutaiile punctiforme n RBS determin
modificarea specificitii de receptor
(J. Stevens et. Al., 2004)

Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Neuraminidaza
Glicoprotein integrat n membrana viral
Proteina antigenica minor
Structur tetrameric cu aspect de ciuperc
Nou subtipuri
Familia sialidazelor
Inhibitorii de neuraminidaz blocheaz
situsului activ prin imitarea structurii acidului
sialic
Apariia rezistenei asociat cu substituiile
aminoacidice la nivelul: V116, I117, E119,
Q136, K150, D151, D199, I223, H275Y,
N295
(Rusell R.J et. Al., 2006)
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
H2N2
H2N2
Pandemiile de grip
H1N1
H1N1
H3N8
1895 1905
1889
Russian
influenza
H2N2
1915
Pandemic
H3N2
1925
1900
Old Hong
Kong influenza
H3N8
1955
1918
Spanish
influenza
H1N1
1965
1957
Asian
influenza
H2N2
1975
1985
2010
2005
2015
2009
Pandemic
influenza
H1N1
H9* 1999
H5 1997 2003
H7 1980
Reproduced and adapted (2009) with permission of Dr Masato Tashiro, Director, Center for Influenza Virus Research,
National Institute of Infectious Diseases (NIID), Japan.
1995
1968
Hong Kong
influenza
H3N2
Recorded new avian influenzas
1955
H1N1
1965
1975
1985
1996
1995
2002
2005
Activitatea A1.4.:

Noiembrie
Decembrie
Animated slide:
Press
space bar2011
Investete n oameni!
Real-time RT PCR influenza virus - tipare

5
CN
CN
2010-10
2010-10
2009-11
2009-11
2010-07
2010-07
2009-14
2009-14
2010-09
2010-09
2009-17
2009-17
CP- type A
CP- type B
10
11
12
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Mix reactie real time RT-PCR

Mix (25 uL/r) A / B
Mix A (25 uL/r)
Mix B (25 uL/r)
1 proba (ul)
9 probe
9 probe
SuperScript III RT/Platinum Taq Mix
0.5
4.5
4.5
2x Reaction Mix
12.5
112.5
112.5
Inf.A For (40 uM), B For (40 uM)
0.5
4.5
4.5
Inf.A Rev (40 uM), B Rev (40 uM)
0.5
4.5
4.5
Inf. A Sonda, B sonda (10 uM)
0.5
4.5
4.5
ROX (dil. 1:10) Reference dye
0.5
4.5
4.5
Apa free
45
45
Vol.
20
180
180
Adauga 5 ul ARN
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Consolidated Report RT-PCR A and B Influenza virus detection

MX3005kp, Quantitative PCR, 09-26-2011, 13Hr 19Min.mxp
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Plate Sample Values - RT-PCR A and B Influenza virus detection

Type A
Type B
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Amplification Plots RT-PCR A and B Influenza virus detection

Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Consolidated Report H5 influenza virus detection

Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Avantaje Real-time PCR fat de RT-PCR clasic
Rapiditate mai mare datorit numrului redus de cicluri de amplificare

si ndeprtarea procedurii de detecie post-PCR;
Monitorizeaz acumularea ampliconilor n timpul reaciei, datorit
marcrii primerilor sau sondelor cu fluorofori
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Dezavantaje fat de RT-PCR clasic

Cand se folosesc reporteri nespecifici (SYBR green) exista dificultati de
monitorizare a specificitii ampliconilor fr deschiderea sistemului
(analiza electroforetica);
Cost relativ crescut;
Setarea reaciei dificil si costisitoare;
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Aplicaii
Principala aplicaie e in diagnosticul rapid de nalt specificitate si sensibilitate,
pentru numr mare de probe exemplu: in epidemii, studii clinice, studii
populaionale;
Identificarea mutaiilor punctiforme (ale unui singure nucleotide);
In general, Real Time PCR se recomanda pentru aplicaii de identificare si
cuantificare a unui segment si vizualizare a lui;
In general, Real Time PCR e un test de identificare rapid si exact a unui
segment AND/ARN, nu este recomandata pentru folosirea ampliconilor in
aplicaii post PCR.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Factori care pot influenta calitatea rezultatelor
Erori personale in realizarea testelor, in interpretarea rezultatelor,

nregistrarea si raportarea rezultatelor
Pot aprea erori randomice ex. erori in papetari
Erori legate de reactivi, controale pozitive/negative utilizate in testari
Pot aprea erori sistematice ex. variatii in temperatura de
incubare, schimbarea lotului de reactivi etc.
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Secvenierea ADN
Izolarea ARN/ADN (extracie sau lizat termic)
Amplificarea intei ADN prin PCR
Analiza ampliconului
Purificarea produilor PCR
Cycle sequencing (dideoxy-termination sequencing reactions
using a single primer)
Purificarea produilor de secveniere
Determinarea secvenei de nucleotide
Activitatea A1.4.:
Analiza datelor

Investete n oameni!
Analiz i asamblare:
Sequencer v5 i Gap4
Aliniere: BioEdit i
MEGA5
Filogenie: MEGA5
Analiza Secvente
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Aliniere secvene HA sezon 2009/2010
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Filogenie Influenza B
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Divergena genetic a HA
(2009-2011)
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
GenBank submision
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/submission.html
genomes@ncbi.nlm.nih.gov
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Mulumesc pentru ajutorul realizrii prezentrii colegilor:

Dr. Chim. Monica Strau, CS I, Laboratorul Epidemiologie Molecular
INCDMI Cantacuzino
Alina Ivanciuc si George Necula, Laboratorul de Infecii Virale Respiratorii,
INCDMI Cantacuzino
Activitatea A1.4.:
Investete n oameni!
Va multumesc pentru atentie!
Activitatea A1.4.:

A1 - 4 Lupulescu PDF

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

A1 - 4 Lupulescu PDF

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Investete n oameni!

POSDRU/ 81/ 3.2/ S/ 59497

Diagnosticul microbiologic traditional

PCR - Polymerase Chain Reaction

singur sau asociat cu alte tehnici poate fi o etap n:

Receptia probelor biologice

Receptia probelor biologice in laborator

Purificarea acidului nucleic

Purificarea acidului nucleic

(1) Revers transcrierea - RT (transcrierea invers)

Revers transcriptazele sunt izolate din virusuri:

(1) Revers transcrierea (transcrierea invers)

denaturarea termo-chimica a structurilor secundare/tertiare ale ARN

(2) Polymerase chain reaction (PCR) standard

PCR Principiul metodei:

Ciclu de amplificae termica a ADN x 25-30 cicli = o reactie PCR

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

Amplificare exponenial a reaciei PCR

Endpoint Electroforez in gel de

Teoretic in timpul unei reacii

Real Time PCR (kinetic PCR)

Real-Time PCR consideratii tehnice

Chimia reaciei Real Time PCR

Chimia reaciei Real Time PCR

Reporter fluorescenti : nespecifici si specifici

ADN + reporter sybergreen liber

Reporterul sybergreen se leag de

Molecule reporter specifice

Amorse marcate fluorescent : metoda Plexor

Metode cu reporter specific:

Unbound probe free in solution

Probe and primer bind target, Fluor quenched

Taq extends and hydrolyzes probe,

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

Grd. St. Quenching

Probe competes for

Real Time PCR

The structure of influenza A

n dou subuniti (HA1 i HA2)

(J. Stevens et. Al., 2004)

Recorded new avian influenzas

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

Real-time RT PCR influenza virus - tipare

Mix reactie real time RT-PCR

Mix A (25 uL/r)

Mix B (25 uL/r)

SuperScript III RT/Platinum Taq Mix

Inf.A For (40 uM), B For (40 uM)

Inf.A Rev (40 uM), B Rev (40 uM)

Inf. A Sonda, B sonda (10 uM)

ROX (dil. 1:10) Reference dye

Consolidated Report RT-PCR A and B Influenza virus detection

Plate Sample Values - RT-PCR A and B Influenza virus detection

Amplification Plots RT-PCR A and B Influenza virus detection

Consolidated Report H5 influenza virus detection

Avantaje Real-time PCR fat de RT-PCR clasic

Rapiditate mai mare datorit numrului redus de cicluri de amplificare

Dezavantaje fat de RT-PCR clasic

Factori care pot influenta calitatea rezultatelor

Erori personale in realizarea testelor, in interpretarea rezultatelor,

Competente ale asistentilor medicali, tehnicienilor si

Aliniere secvene HA sezon 2009/2010

Mulumesc pentru ajutorul realizrii prezentrii colegilor: