Sunteți pe pagina 1din 518

Editori

Mihaela Alua ş

Simion Simon

Metode experimentale avansate pentru studiul şi analiza bio-nano-sistemelor

Editori

Mihaela Aluaş

Simion Simon

METODE EXPERIMENTALE AVANSATE PENTRU STUDIUL ŞI ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR

Casa Cărţii de Ştiinţă Cluj-Napoca, 2012

AVANSATE PENTRU STUDIUL Ş I ANALIZA BIO - NANO - SISTEMELOR Casa C ă r ţ

Coperta: Patricia Puşcaş

Editură acreditată CNCSIS (24)

© Universitatea „Babeş-Bolyai”, 2012

Material editat în cadrul proiectului „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, ID 36154

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României Metode experimentale avansate pentru studiul şi analiza bio-nano- sistemelor / ed.: Mihaela Aluaş, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Cărţii de Ştiinţă, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5

I. Aluaş, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.)

53

Prefaţă

În calitate de director al proiectului cu titlul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, cod contract” POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc să mulţumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza şi pro- fesionalismul lor la realizarea acestui volum şi, implicit, la dezvoltarea pro- gramului doctoral.

Mulţumirile mele se îndreaptă de asemenea către echipa de management a proiectului, în următoarea componenţă:

Prof. dr. Simion Simon, coordonator ştiinţific program doctoral

Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator ştiinţific relaţii internaţionale

Cristina Dominic, asistent manager

Andra Ghira, responsabil logistic şi asistent manager

Jr. Alexandru Braşoveanu, consilier juridic

Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar

Ing. Carmen Ciplea, expert IT

Ec. István Püsök, expert contabil

Am convingerea că informaţia cuprinsă în această lucrare va sprijini gene- raţiile prezente şi viitoare de conducători de doctorat în activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor în lumea minu- nată a ştiinţei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercetător o vocaţie.

Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013.

C.S.III. dr. Mihaela ALUAŞ

Cuvânt înainte

Institutul de Cercetări Interdisciplinare a fost înfiinţat prin Hotărârea Sena- tului Universităţii Babeş-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare şi transfer tehnologic, având ca obiectiv de activitate atât realizarea de studii şi cercetări interdisciplinare în domeniile biologie moleculară, biomateriale şi sisteme biologice, materiale avansate şi mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural şi artificial, cât şi transferul rezultatelor obţinute către beneficiari locali, naţionali sau internaţionali. Institutul beneficiază de o clădire proprie, cu o suprafaţă desfăşurată de peste 3000 mp, modernizată la nivelul standardelor internaţionale din punct de vedere al dotărilor conexe şi având laboratoare de cercetare structurate în acord cu nevoile cercetărilor interdisci- plinare menţionate. Între timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis să-şi dedice energia şi cunoştinţele cercetărilor la interfaţa Bio-Nano- Sistemelor, a devenit Institutul de Cercetări Interdisciplinare în Bio-Nano- Ştiinţe (ICI-BNS). În cadrul acestuia îşi desfăşoară activitatea în prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conducători de doctorat), 25 alte cadre didactice şi cercetători şi peste 40 de doctoranzi cu frecvenţă. Aceştia aparţin domeniilor Fizică, Chimie, Biologie, Informatică, Ştiinţa mediului şi Psihologie. Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinarăa oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercetători valoroşi, cu experienţă deosebită în tehnicile experimentale frecvent utilizate în cercetările interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-Ştiinţelor. Marea majoritate a experţilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoc- torale în prestigioase laboratoare din lume unde au dobândit o bogată experi- enţă în utilizarea echipamentelor de înaltă performanţă de care dispune Insti- tutul nostru. Studenţii doctoranzi, dar şi specialişti din domenii ca: fizică, chimie, biologie, geologie sau ştiinţa mediului interesaţi în studii experimentale interdisciplinare vor găsi în materialele incluse în prezentul volum date teoretice dar mai ales prac- tice, despre tehnici experimentale avansate prezentate într-o formă accesibilă, cu exemple semnificative, menite a facilita înţelegerea fenomenelor studiate şi a con- tribui la creşterea aportului fiecărui cercetător la dezvoltarea domeniului în care îşi va desfăşura activitatea ştiinţifică.

Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS

CUPRINS

I.

ANALIZE GENETICE

13

Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea de proteine Asist. univ. dr. Iulia Lupan

13

Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare Asist. univ. dr. Iulia Lupan

36

II.

CULTURI CELULARE

64

Culturi celulare Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac

64

Culturi celulare – partea a II-a Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac

82

III.

MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN

101

Microspectroscopia Raman Conf. dr. Monica Maria Baia

101

Microspectroscopia Raman – partea a II-a Conf. dr. Monica Maria Baia

121

IV.

SPECTROMETRUL IR

134

Spectroscopia de absorbţie în infraroşu Lect. dr. Nicolae Leopold

134

Tendinţe moderne în spectroscopia de absorbţie IR Lect. dr. Nicolae Leopold

147

V.

SPECTROFLUORIMETRUL

160

Spectrofluorimetria Conf. dr. Dana Maniu

160

Spectrofluorimetria - aplicaţii Conf. dr. Dana Maniu

172

VI.

SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ MAGNETICĂ NUCLEARĂ

191

Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş

191

Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) – Implemen-

tarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaţii pe sisteme moleculare organi-

ce în faza solidă C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş

216

Rezonanţa magnetică nucleară pe sisteme lichide Lect. dr. Mihai Vasilescu

246

VII.

MĂSURĂTORI TERMICE

266

Analiză termică diferenţială. Analiză calorimetrică diferenţială Conf. dr. Raluca Ciceo-Lucăcel

266

Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termică diferenţială si analiză calori- metrică diferenţială. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC Conf. dr. Raluca Ciceo-Lucăcel

275

VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X

286

Difracţie de raze X pe pulberi C.S.I. dr. Gheorghe Borodi

286

Determinarea structurii cristaline prin difracţie de raze X C.S.I. dr. Gheorghe Borodi

305

IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ ŞI DE TRANSMISIE

327

Microscopia electronică şef lucrări dr. Lucian Barbu-Tudoran

327

Microscopia electronică - partea a II-a şef lucrări dr. Lucian Barbu-Tudoran

347

X. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ

365

Microscopia de forţă atomică Conf. dr. Ioan Burda

365

Microscopia de forţă atomică – partea a II-a Conf. dr. Ioan Burda

378

XI.

SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X ŞI

ULTRAVIOLETE

394

Spectroscopia fotoelectronică C.S.III. dr. Maria Teodora Radu

394

Studiul prin spectroscopie fotoelectronică de raze X a suprafeţelor diferitelor tipuri de materiale C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga

424

XII.

SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ ELECTRONICĂ DE SPIN

437

Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin C.S. dr. Milica Todea

437

Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin – partea a II- a C.S. dr. Milica Todea

452

XIII.

METODE ELECTROCHIMICE

467

Elaborarea, testarea şi verificarea protocoalelor de practică experimentală pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean

467

Electrochimia unei substanţe cu potenţial biologic activ. Studiu de caz Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean

490

XIV.

SISTEME DE ANALIZĂ A SUPRAFEŢEI SPECIFICE ŞI

A DIMENSIUNII PARTICULELOR

509

Sisteme de analiză a suprafeţei specifice şi a dimensiunii particulelor Lect. dr. ing. Réka Barabás

509

I. ANALIZE GENETICE

Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea de proteine

Asist. univ. dr. Iulia Lupan

Cuprins

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot

13

2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii interdisciplinare

31

3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară

33

4. Bibliografie

34

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem procariot

ADN în sine are doar 2 funcţii importante şi anume păstrarea informa- ţiei genetice şi furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Păstrarea in- clude transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaţie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN şi împărţirea egală a celor două copii în timpul diviziunii celulare. A doua funcţie este legată de desci- frarea informaţiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaţiei între ADN şi proteine este ARN, care este sintetizat în procesul de transcriere a ADN de către o enzimă numită ARN polimerază. ARNm rezultat serveşte ca matriţă în procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc în ribozomi. Practic ARN este cărăuşul informaţiei din nucleu în citoplasmă unde are loc sinteza proteinelor. Dogma centrală a biologiei presupune transmiterea unidirecţională a informaţiei de la ADN la proteine prin in- termediul ARN (Figura 1). Informaţia genetică nu poate fi transmisă invers, de la proteine la ADN. Informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la ADN în cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exis- tă cazuri de transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine.

Figura 1. Dogma central ă a biologiei. Clonarea genelor const ă în izolarea unei gene

Figura 1. Dogma centrală a biologiei.

Clonarea genelor constă în izolarea unei gene dintr-un genom şi introducerea ei în alte celule gazdă pentru multiplicare şi în unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obţine mili- oane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonării constă din următoarele etape:

amplificarea genei de interes

introducerea genei de interes într-un vector de clonare

introducerea moleculelor recombi- nate în celule gazdă

selecţia celulelor transformate (pur- tătoare ale moleculei recombinate)

verificarea moleculelor recombinate

Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment de ADN care se transcrie într-o moleculă de ARN. Moleculele de ARN re- zultate în urma transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii:

ARN funcţional

ARN informaţional

ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte anumite funcţii în celulă (în cea mai mare parte participă la procesul de traducere) şi ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă: ARN ribosomal (ARNr) şi ARN de transport (ARNt). ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un polipeptid şi serveşte ca matriţă în procesul de traducere (sinteză a proteine- lor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonării codifică un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este obligatoriu o genă, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mărime. Din această cauză în continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile. Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un genom este necesară extragerea acestuia. Există 2 modalităţi de a obţine fragmentul dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tăierea fragmentului din genom este mai dificilă deoarece necesită prezenţa unor situsuri (secvenţe specifice) la capetele fragmentului, care necesită apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numărul moleculelor deci şi cantitatea de ADN este mică. A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des

utilizată. În acest scop se utilizează tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Această tehnică poate fi considerată un adevărat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă deoarece necesi- tă cantităţi foarte mici de ADN matriţă. O condiţie obligatorie pentru o am- plificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă, în special la capetele aces- teia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci se vor analiza cel puţin secven- ţe ADN omoloage de la alte specii sau secvenţa de aminoacizi a proteinei dacă este vorba despre o genă. Principiul tehnicii PCR este o imitaţie a pro- cesului de replicare a ADN care are loc în celule. Dacă în celule pentru re- plicare se foloseşte o întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formând molecula dublu catenară după înlăturarea agentului de denaturare. Reacţia de amplificare este una ciclică, fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:

denaturarea ADN

alinierea amorselor

sinteza catenei complementare de către ADN polimerază

După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează, iar după 35-40 de cicluri se obţin milioane de copii ale fragmentului ţintă pornind de la o singură copie. Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizează temperaturi înalte de 94-98ºC. Denaturarea din primul ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare după primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec. Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite şi oligonucleotide, sunt secvenţe scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complemen- tare cu extremităţile secvenţei ţintă şi formează cu acestea porţiuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenţele complementare, temperatura este coborâtă la 40-60ºC timp de câteva zeci de secunde. Această etapă este numită de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se sta- bileşte la câteva grade (2-5ºC) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculează în dependenţă de lungimea amorsei şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de calcul, cea mai sim- plă formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:

Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)
Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)

Unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze azotate. Numărul de G şi C se înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece între acestea există 3 legături de hidrogen, în consecinţă moleculele bogate în G şi C au o temperatură mai mare de topire. Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:

numărul de nucleotide este de 15-35

temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 şi

70ºC

conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%

la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoare- ce oferă o stabilitate mai mare

amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă, în caz contrar amorsa poate forma secvenţe interne dublu ca- tenare care au aspect de stem sau buclă

cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu tre- buie sa fie complementare între ele, altfel se vor forma porţi- uni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica porţiunile scurte rămase monocatenare.

De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi amorsa ADN, polimeraza poate iniţia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia 5'3' (Fi- gura 2). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea fragmentului am- plificat, dar şi ca punct start pentru ADN polimerază, care nu poate porni sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'. Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolată de la bacteria Escherichia coli, care are activitatea optimă de sinteză la 37°C. Cel mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era inactivarea termică în timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de reacţie trebuiau schimbate de la o temperatură la alta şi după fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimerază. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluţionară în acest sens, pe larg utilizată şi astăzi este Taq polimeraza. Această enzimă este o ADN polimerază, izolată de la o bacterie termofilă Thermococcus aquaticus (de unde şi denumirea ei), care sintetizează polimerizarea nucleotidelor trifosfat într-un lanţ polinucleotidic în direcţia 5′→3. Taq polimeraza are activitatea optimă la 72°C şi nu se denaturează la temperaturi ridicate de peste 90°C foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de activi- tate este nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de

aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongării necesare sinte- zei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide – 2minute.

Etapa iniţială de denaturare 5' 3' ADN genomic cu fragmentul ţintă 3' 5' 5' 3'
Etapa iniţială
de denaturare
5'
3'
ADN genomic cu
fragmentul ţintă
3'
5'
5'
3'
Alinierea amorse-
lor la capetele
fragmentului ţintă
3
5'
5'
3
Ciclu I
'
3'
5'
5'
3'
Etapa de elongare sau
sinteză a catenei
complementare de
către ADN polimerază
3'
5'
5'
3'
Sfârşitul
primului ciclu
3'
5'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
3'
3'
5'
5'
3'
5'
3'
3'
3'
5'

Ciclu

II

5' 3' 3' 5' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
3'
3'
5'

Taq polimeraza polimeraza

amorsă ă

amorsă ce indică direcţia de sinteză

5' 3' 5' 5' 3' 3' 5' 3' 5' 5' 3' 3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
3'
5'
5'
3'
3'

Ciclu III

Figura 2. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă. Acest tip este asemănător PCR obişnuit, doar că foloseşte o matriţă de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de această sinteză este transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN polimerază ARN-dependentă. Taq polimeraza este o ADN polimerază deoarece sinteti- zează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează o matriţă ADN pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la virusurile care au material genetic ARN şi în momentul intrării în celulă necesită sinteza unei copii a materialului său genetic. RT-PCR se utilizează pentru obţinerea co- piilor de gene eucariote care nu conţin introni şi analiza exprimării de gene. În ambele cazuri se porneşte de la ARNm (ARN informaţional care codifică proteine).

Enzime de restricţie Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN. Restrictazele re- cunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri specifice de recunoaş- tere, se fixează de acestea şi taie legăturile fosfoesterice între nucleotide. Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că funcţia lor este de apărare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). În mo-

mentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de restricţie digeră aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restric- ţie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricţie, în general, nu taie ADN metilat. Până acum au fost descrise 4000 de enzime de restricţie de la câteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3 clase: I, II şi III. Această clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat şi de secvenţa de recunoaştere. Enzimele cele mai utilizate în tehnicile mo- leculare sunt cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom şi utilizează ioni de Mg 2+ ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele catene în direcţia 5′→3este identică. Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea bacte- riei de la care a fost izolată. Astfel, HindIII este izolată de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13.

A

EcoRI
EcoRI
EcoRI

B

SmaI
SmaI
SmaI

5

GAATTC

3

5

GGGCCC

3

CTTAAG

CCCGGG

3

3 ′ 5 ′ 3 ′ 5 ′

5

3

3 ′ 5 ′ 3 ′ 5 ′

5

G CTTAA
G
CTTAA

5

3

AATTC G
AATTC
G

3

GGG CCC
GGG
CCC

5

3

CCC GGG
CCC
GGG

3

5

5

Figura 3. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi SmaI (B) şi capetele libere după tăiere. Locurile de tăiere sunt indicate cu săgeţi.

Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2 feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI şi EcoRI generează capete coezive după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează capete drepte sau netede (Figura 3). Cu ajutorul unor programe speciale se pot alcătui hărţi de restricţie ca- re reprezintă situsurile de recunoaştere pentru diferite restrictaze într-o secvenţă (Figura 4).

BamHI (533)

H infI (75) EcoRI (605) EcoRV (58) HinfI (616) BamHI (773) H infI (32) H
H infI (75)
EcoRI (605)
EcoRV (58)
HinfI (616)
BamHI (773)
H infI (32)
H infI (461)
EcoRI (633)
NcoI (777)
HinfI (942

YLR377C

1047 b

Figura 4. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre în paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricţie.

Ligarea fragmentelor de ADN Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea nu pot fi legate prin creare de noduri sau nu există nici un lipici special. Pentru lega- rea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită ADN ligază. Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între gruparea hidroxil a unui nucleotid (capătul 3) şi gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (capătul 5) (Figura 5). Funcţia ligazei în celule vii este legarea fragmentelor în timpul replicării, recombinării şi după repararea ADN. Cea mai des uti- lizată este ADN ligaza T4 izolată de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizează ATP ca şi cofactor.

T4. ADN ligaza T4 utilizeaz ă ATP ca ş i cofactor. Figura 5. Reprezentarea schematic ă

Figura 5. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a două fragmente ADN care au capete netede.

Vectori de clonare Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN transportatoare ale fragmentului de ADN străin în celulele gazdă. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi vectori artificiali. Aceşti vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul clonării. Cele mai pe larg uti- lizate sunt plasmidele. Un plasmid este o moleculă dublu catenară de ADN, care este circulară, închisă şi capabilă de replicare autonomă în celule

gazdă. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izola- te de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nişte secvenţe speci-

fice necesare replicării, clonării, selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pen- tru replicarea autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa ori, care este originea de replicare. Nicio moleculă de ADN nu poate fi replicată fără o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate începe replicarea şi care este recunoscută de anumite proteine care iniţiază replicarea.

O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este Situsul Mul-

tiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). În această

regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu ajutorul enzimelor de restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi fragmentul ADN sunt tăiate cu aceleaşi enzime de restricţie şi legate împreună cu ajutorul ligazei. SMC conţine secvenţele de recunoaştere pentru mai multe enzime de restricţie care nu se conţin în altă regiune a vectorului.

O altă componentă foarte importantă a plasmidelor sunt markerii de

selecţie care sunt de obicei nişte gene, a căror produs (enzimă) fac posibilă selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt mai numeroa- se. Cei mai frecvenţi markeri utilizaţi sunt genele ce conferă rezistenţă la antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă rezistenţă. Spre exem- plu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină. Plasmidele care conţin gena pentru această enzimă vor proteja celulele bacteriene de efectul anti- bioticului. Astfel dacă un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conţine atât celule cu, cât şi fără plasmid, se însămânţează pe un mediu cu ampicilină, vor supravieţui doar celulele care conţin plasmidul. Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu plasmid re- combinat adică cu insert de cele cu plasmid fără insert. Insert se referă la fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul multiplu de clonare se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intactă, produsul ei este o proteină activă. Dacă în SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificată şi produsul ei este inactiv. Spre exemplu dacă SMC se află în gena lacZcare codifică subunitatea α a enzimei β-galactozidază, atunci produsul acestei gene împreună cu subunităţile codificate din genomul celulei gazdă bacteriene vor forma o enzimă activă capabilă să metabolize- ze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adăugat în mediu şi este incolor. Dacă β-galactozidaza este activă atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul format în urma reacţiei va avea o culoare albastră. În acest fel coloniile re-

zultate după transformare care conţin vectorul fără insert vor fi albastre, iar cele ce conţin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă activă capabilă de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie utilizează o enzimă toxică pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncţională şi vor supraveţui. Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva mii de pb şi în care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb până la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristică importantă pentru plasmide este numă- rul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un număr mai mare de copii per celulă. Acest fapt permite obţinerea unei cantităţi mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de bacterii (din 3-5 ml de cul- tură se pot obţine câteva μg de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numărul copiilor per celulă este mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o cantitate mai mare de ADN este necesară o cantitate mai mare de cultură. Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofe- ră în plus posibilitatea exprimării genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus faţă de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc şi în genom şi fac parte dintr-o genă: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START şi STOP care delimitează cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se află în amonte de genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixează la nivelul promotorului şi iniţiază transcrierea. Numai în prezenţa promotorului ex- primarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secvenţă care se transcrie dar care nu se traduce şi care este recunoscută de ribosomi. Ribosomii se leagă la acest situs şi se deplasează de-a lungul ARNm până întâlnesc primul codon START de unde începe traducerea. Codonul START la procariote este în cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus în situsul multiplu de clonare, în caz contrar acesta se poate introdu- ce în fragmentul ţintă cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus şi el de obicei în situsul de clonare. În unele cazuri acesta este prezent după re- giuni care codifică anumite aşa-zise etichete. Etichetele facilitează purifica- rea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) şi proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte integrantă a proteinelor la

capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă secvenţa ce codifică eticheta este prezentă după sau înainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate faţă de anumite răşini cromatogra- fice.

A Cla I (25) Eco RI (4360) HindIII (30) Sca I (3847) Eco RV (188)
A
Cla I (25)
Eco RI (4360)
HindIII (30)
Sca I (3847)
Eco RV (188)
Pvu I (3737)
Bam HI (376)
AP r
Sph I (567)
Pst I (3612)
Sal I (652
TC r
pBR322
4361 bp
ORI

Bst Z17I (2247)

B LacZ Eco RI Sac I (6 bla(AmR) Kpn I (6 Xba I (6 pTZ57R
B
LacZ
Eco RI
Sac I (6
bla(AmR)
Kpn I (6
Xba I (6
pTZ57R
Bam HI
2886 bp
MCS
Apa I (
Sal I (6
Pst I (6
Hin dI
T7 p

Ori

T7 terminator His tag C XhoI (159) Not I (167) HindIII (174) f1 origin Sal
T7 terminator
His tag
C
XhoI (159)
Not I (167)
HindIII (174)
f1 origin
Sal I (180)
Sac I (191)
MCS
Eco RI (193)
bla (Ap)
Bam HI (19
Nde I (239
T7 prom
pET-21a
Bgl II (34
5443 bp
lacI
ColE1 pBR322 origin

Figura 6. Hărţile unor vectori plasmidici. A – harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezistenţă la antibiotice: Ap r conferă rezistenţă la ampicilină, iar TC r rezistenţă la tetraciclină, situsul multiplu de clonare îl poate constitui oricare dintre cele două gene de rezistenţă, în dependenţă de gena selecta- tă pentru inserare, rezistenţa la antibioticul respectiv se va pierde . B – harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezistenţă la ampicilină, iar situsul multi- plu de clonare se află în gena lacZ' care oferă selecţia alb-albastră a clonelor pozitive. C – harta vector de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care conferă rezistenţă la ampicilină, situsul multiplu de clonare care conţine un codon START şi un codon STOP după eticheta de 6 histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se numeşte transformare dacă sunt utilizate celule bacteriene sau transfecţie dacă sunt celule eucariote. În continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea având cea mai mare aplicabilitate şi simplitate în scopul obţinerii clonelor şi proteinelor recombinate. Există două tipuri de trans- formare a celulelor bacteriene pe larg utilizate în laboratoarele de biologie moleculară:

transformarea chimică

transformare sub influenţa câmpului electric.

Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei competenţe de

transformare, deoarece E. coli nu are proprietăţi de transformare naturală. Această competenţă în cazul transformării chimice este indusă cu CaCl 2 . În acest scop se realizează o cultură de E. coli şi prin tratarea celule- lor cu clorură de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bac- teriene (Figura 7 A). Celulele sunt şocate termic foarte scurt, timp de ma- xim 2 minute, la 42°C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate în celulele bacteriene. Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât transformarea chimică. Prepararea celulelor competente presupune doar creşterea lor pâ- nă în faza logaritmică (D=600nm = 0,6-0,8) şi înlăturarea prin spălări repe- tate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea câmpul electric între doi electrozi. Amestecul de celule competente şi plasmide recombinate vor

fi depuse într-o cuvă specială de electroporare, ai cărei pereţi laterali sunt

electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de câteva msec (Figura 7 B). După transformare celulele şocate sunt preluate în mediu de cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice. Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte din- tre ele fiind netransformate, adică fără plasmid. Eficienţa de transformare a celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile rezultate. Numărul de colo-

nii va corespunde numărului de celulele transformate deoarece fiecare co-

lonie ia naştere dintr-o singură celulă. Numărul obţinut de la transformarea

a 1 ng de ADN plasmidic se raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoa-

rea la 1000). O eficienţă bună de transformare este 10 6 , ceea ce înseamnă ca

la transformarea unui μg de plasmid s-ar obţine 1 milion de colonii, o va- loare foarte mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie

sau de câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în amestecul de ligare numărul de molecule recombinate este mic şi din aceas- tă cauză este recomandată o eficienţă cât mai mare a celulelor competente. Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă avantaje şi dezavantaje legate de eficienţa de transformare şi de costuri. Transformarea chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar mai ieftină deoa- rece nu necesită aparatură şi cuve costisitoare.

A

B

2 min 42ºC
2 min
42ºC
ă aparatur ă ş i cuve costisitoare. A B 2 min 42ºC Îns ă mân ţ

Însămânţarea celule- lor transformate pe mediu selectiv

Celule transformate

de E.coli

pe mediu selectiv Celule transformate de E.coli Celule de E.coli CaCl 2 1800 V Sp ă

Celule de

E.coli

CaCl 2

Celule transformate de E.coli Celule de E.coli CaCl 2 1800 V Sp ă larea celulelor bacteriene
1800 V
1800 V
transformate de E.coli Celule de E.coli CaCl 2 1800 V Sp ă larea celulelor bacteriene 5

Spălarea celulelor

bacteriene

5 msec

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A – transformarea chimică cu CaCl 2 ; B – electroporarea celulelor bacteriene.

Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină într-un câmp electric. Migrarea moleculelor se realizează printr-o matrice specifică. Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplică cel mai des electroforeza proteinelor în condiţii denatu- rante în gel de poliacrilamidă (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacril- amida se poate utiliza ca matrice şi pentru electroforeza acizilor nucleici care oferă o rezoluţie foarte bună a separării fragmentelor de ADN, mai ales în cazul fragmentelor mici. Această matrice este folosită mai rar în la- boratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioasă. Primul loc în utilizarea vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de agaroză. Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă, ea este utilizată cu succes deoarece este mai simplă. Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită grupărilor fosfat. Această sarcină face posibilă migrarea moleculelor de ADN şi ARN

într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel sepa- rarea moleculelor va fi în dependenţă de masa lor moleculară. Pentru estima- rea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelaşi gel, dar în godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunos- cute. Acest amestec de molecule se numeşte marker molecular ADN. Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile de agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon specific. Con- centraţia agarozei în gel poate fi între 1 şi 3% în dependenţă de scopul ur- mărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare, cu atât mărimea porilor va fi mai mică. La concentraţii mai mici de agaroză, porii vor fi mai mari şi migrarea moleculelor mai rapidă. În concluzie concentraţii mai mici se folo- sesc pentru fragmente mari (câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru fragmente mici. Gelurile de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate, ofe- rind separarea moleculelor între 0,1 şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt pla- sate între cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de migrare. Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folo- site tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA). Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesară utili- zarea unui colorant. Cel mai des folosită în acest scop este bromura de etidiu, care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine fluorescentă şi are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate din molecula dublu catenară de ADN. Lungimea de undă a luminii ultravio- lete la care este expus gelul trebuie să fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.

A

trebuie s ă fie cuprins ă între 260 ş i 300 nm. A B Figura 8.

B

trebuie s ă fie cuprins ă între 260 ş i 300 nm. A B Figura 8.

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză. A – imaginea gelului la expunerea în UV; B – fotografia aceluiaşi gel.

Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi pu- rificarea ADN. Vizualizarea ne oferă informaţii despre integritatea ADN

(ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, es- timarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie. ADN poate fi purificat din gel de agaroză după migrare prin excizarea fragmen- tului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificări.

Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-18 ore de la transformare când apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariţia coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a clonării, deoarece aces- tea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi colonii cu plasmid fără insert. Chiar dacă se foloseşte un sistem alb-albastru de selecţie a coloniilor pozitive, acestea necesită totuşi o dovadă în plus a prezenţei plasmidului recombinat. În acest scop se va efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incu- ba peste noapte cu agitare la 37°C. Ziua următoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajuto- rul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin digestie enzimatică şi apoi prin secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus în vector sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această digestie va confirma prezenţa insertului în plasmid şi aproximativ mărimea acestu- ia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa fragmentului clonat. Secvenţializarea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a clonării. Această verificare este necesară deoarece ADN polimeraza utilizată pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sinteză. Pentru a evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN polimerază care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza ş. a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigură de obicei randamente de sinte- ză mai mari. În unele cazuri se utilizează un amestec de 2 polimeraze (3 părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu polimerază) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescută. În cadrul Centrului de Biologie Moleculară există 2 secvenţiatoare:

Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu de- tecţie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizează principiul Sanger de secvenţiere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secvenţiere. Matriţa ADN ce urmează a fi secvenţiată este denaturată, apoi la unul din capetele sale are loc ataşarea

unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei comple- mentare. Amestecul PCR conţine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar şi di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conţin gruparea OH în poziţia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă continua- rea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se foloseşte o singură amorsă) de diferite mărimi. Numărul de cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc în toate punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt sepa- rate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capi- lar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de câţiva micro- litri vor fi separaţi în gelul din capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în dependenţă de mărimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. În ultima parte a capilarului există o fereastră transparentă prin care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescenţa emisă va fi captată şi prezentată sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electrofo- regramele sunt apoi analizate şi comparate cu secvenţa existentă în bazele de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenţializate variază între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matriţe dificile (cu secvenţe repetitive) este necesară utilzarea unor kituri speciale.

repetitive) este necesar ă utilzarea unor kituri speciale. Figura 9. Electroforegrama unei secven ţ e ob

Figura 9. Electroforegrama unei secvenţe obţinută cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.

Exprimarea genelor în sistem procariot Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multipli- carea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea în scopul multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei şi la care se urmăreşte cunoaşterea secvenţei. În acest scop amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenţializate.

Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine recombi- nate. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă, care însă câ- teodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi de ce cele mai dese ori străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul exprimării genei şi obţinerii de proteină recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru ex- primare. Gena codificatoare poate fi clonată direct în vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conţin neapărat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START şi unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte impor- tant în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire, adică împărţirea exac- tă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigură de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conţine promotorul de la fagul T7, situsul de recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul mul- tiplu de clonare şi codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Dacă se optea- ză pentru prezenţa unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificării, atunci din genă se va înlătura codonul STOP. Dacă aceas- tă etichetă nu este necesară, atunci în genă se va păstra codonul STOP şi tradu- cerea se va opri înainte de etichetă. Promotorul T7 nu este recunoscut de către ARN polimeraza de la E. coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bac- teriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli care conţin gena pentru ARN polimerază de la fagul T7. Această genă se află sub controlul promotorului lac UV5 şi a operatorului lac (Figura 10).

lac UV5 ş i a operatorului lac (Figura 10). Figura 10. Inhibi ţ ia exprim ă

Figura 10. Inhibiţia exprimării genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 şi a genei ţintă în celule- le gazdă de E. coli în lipsa inductorului.

Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină numită represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau analogi ai lacto- zei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi împiedică transcrierea genei pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimerază. În absenţa T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei ţintă din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se află atât în genomul bacteriei gazdă cât şi în plasmidul de exprimare. Agentul care induce expri- marea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de represorul lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel pro- motorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va tran- scrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaşte pro- motorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic şi care poate asigura o producţie de proteină care va alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene.

Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice. Pentru o purificare cât mai bună din amestecul total de proteine este nece- sară purificarea în cel puţin 2 etape prin metode cromatografice diferite. Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură purificarea protei- nelor într-o singură etapă, ceea ce reduce timpul necesar şi asigură randa- mente de purificare mai mari (Figura 11). Dacă eticheta deranjează în anali- za ulterioară a proteinei, atunci se poate recurge la înlăturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. În acest scop pentru clonare şi exprimare se va alege un plasmid care conţine situsul pentru peptidază, cum este spre exemplu situsul pentru trombină în cazul plasmidului pET28.

A

B

C

pentru trombin ă în cazul plasmidului pET28. A B C Figura 11. Reprezentarea schematic ă a

Figura 11. Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie de afinitate. A – încărcarea amestecului total de proteine pe coloana cu răşină; B – spălarea coloanei cu tampon şi fixarea proteinei ţintă de răşină; C – eluarea proteinei ţintă de pe coloană.

2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recom- binate în studii interdisciplinare

Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică indispensabilă în la- boratoarele de biologie moleculară. Una dintre aplicaţiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei în scopul obţinerii de proteine recombinate. Clonarea ge- nelor şi exprimarea lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă de proteine. În cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele în care aceasta se exprimă în mod firesc natural prezintă mai multe dificul- tăţi:

cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesară o can- titate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul purifi- cărilor în câteva etape pot fi sub 100 mg de proteină;

obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem să le cultivăm în condiţii de laborator;

obţinerea materialului pentru purificare implică probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obţinerea de proteine din celule umane ar fi imposibilă;

purificarea se face în mai multe etape care necesită timp, con- sumabile şi are randamente mai mici. Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic sunt eli- minate în cazul exprimării genelor în celule gazdă. Un mare avantaj al aces- tei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care pot dezvălui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea proteinei. Prin in- termediul tehnicilor de mutageneză pot fi introduse mai multe tipuri de mutaţii:

mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;

deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi înlă- turate;

inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena codificatoare şi respectiv în proteina recombinată;

fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu capătul C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;

proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate

cu anumite molecule care sunt introduse în proteine în procesul lor de sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi facilitează detecţia lor.

Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este tehnica la care se apelează cel mai des, deoarece este mai rapidă şi mai puţin costisi- toare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi cuaternară. Exprima- rea genelor şi sinteza proteinelor în celulele procariote asigură doar struc- tura primară exactă a polipeptidului sintetizat. În unele cazuri proteinele adoptă structura secundară independent după sinteză, în alte cazuri este nevoie de condiţii speciale şi alte proteine care contribuie la adoptarea con- formaţiei proteinei active. Unele proteine atât de la eucariote cât şi de la procariote sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o struc- tură secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplas- mă formează corpi de incluziune. Există cazuri când acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune oferă posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii denaturante. Proteinele denaturate purificate în acest mod pot fi utilizate pentru imuni- zarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai important as- pect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a proteinei şi nu structu- ra ei secundară sau terţiară. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezisă pe baza apartenenţei genei sau pe baza anali- zei structurii primare. O altă problemă care poate apărea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazdă. Un alt dezavantaj (deşi în unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificărilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacterie- ne. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări con- formaţionale dar şi modificări post-traducere cum ar fi fosforilări, glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară, atunci se va recurge la clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea ei în celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-traducere este un avantaj atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte să se cu- noască rolul grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest fel protei- na recombinată nu va fi modificată şi se va putea deduce rolul acestor gru- pări în activitatea proteinei.

3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Mo- leculară

Denumire echipament

Caracteristici

Instalaţie de preluare şi prelu- crare a imaginilor Ced Limited, Marea Britanie

Achiziţia şi interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamidă sau geluri de agaroză

Instalaţie de apă ultrapură, Elga-Lab Water, Marea Brita- nie

Purificarea apei până la o rezistivitate de 18,2 MΩ/cm (apa MilliQ)

Centrifugă cu răcire Sigma 3K18 (4 rotoare), Sigma, Ger- mania

Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg, răcire de la temperatura camerei la 0°C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml şi rotor

4x250ml

Centrifugă de masă Sigma 1-13, Sigma, Germania

Fără răcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg)

“Thermocycler”, Eppendorf, Germania

Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml, 0,5ml şi placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatură în tub

“Thermocycler”, Corbett Research, Australia

Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de 0,2ml şi plăci ELISA cu 96 de godeuri; gradient de tempe- ratură

Electroporator Eppendorf, Germania

Transformarea celulelor electrocompetente – bacterii şi drojdii

Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301, CamSpec, Marea Britanie

Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm

Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu termostatare, Jasco, Japonia

Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm, cu termostatare, pentru cinetică enzimatică

Patru instalaţii electroforeză proteine, Consort, Belgia

Electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă, max. 32 probe

Şase instalaţii electroforeza acizi nucleici, Consort, Belgia

Electroforeza orizontală în gel de agaroză, max. 48 probe

pH-metru P901 (două bucăţi), Consort, Belgia

Masurarea pH-ului, electrod combinat prevăzut cu senzor de temperatură

Congelator temperaturi foarte scăzute, 70 litri, Sanyo, Japonia

Congelare probe biologice la -82ºC

Congelator temperaturi foarte scăzute, 100 litri, Snijders Scientific, Olanda

Congelare probe biologice la -82ºC

Două balanţe analitice, Scaltec, Germania

Domeniul de măsurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfaţă pentru calculator şi imprimantă

<