Determinarea activitii fosfatazei alcaline

Fosfataza alcalin este o globulin reprezentat de dou grupe mari de enzime

ce catalizeaz hidroliza esterilor fosforici la pH alcalin i particip la transportul
fosforului.
Se gsete n sistemul osos n osteoblati (nu i n osteoclati), mucoasa intestinal
(intervine n absorbia glucidelor), corticala renal, glanda mamar (lactaie), ficat,
placent, leucocite, dar localizarea preferenial este cea hepatic.
Fosfataza alcalin seric este reprezentat de izoenzime de origine hepatic,
osoas, intestinal iar la gravide i de izoenzima placentar.

Determinarea FAL prin metoda spectrofotometric

Principiul metodei
Enzima n mediu bazic catalizeaz hidroliza monofosfailor. n urma reaciei
rezult p-nitrofenol i fosfat anorganic. Ionii de Mg++ cresc activitatea enzimei.
Activitatea enzimatic este direct proporional cu cantitatea de p-nitrofenol
eliberat, respectiv cu intensitatea coloraiei obinute.

fosfataza alcalin
fosfat de p-nitrofenil + H2O p nitrofenol + fosfat
Mg++
Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticl
termostat
spectrofotometru
cuve 1 cm
vase cu soluie dezinfectant
ap distilat
tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv R1:
Tampon dietilamin, pH = 9,8 1 mol/l
Clorur de magneziu 0,6 mmol/l
Reactiv R2:
Fosfat de p-nitrofenil (soluie) 10 mmol/l
 Proba
Ser nehemolizat
Plasm heparinizat

Tehnica de lucru
Se amestec reactivul R2 n cantitatea corespunztoare de tampon R1 (substrat
tamponat).
Se pipeteaz ntr-o eprubet 1 ml de amestec de reactivi R1 i R2 i 20 l de prob
de analizat.
Se agit coninutul eprubetei i se incubeaz timp de 1 minut la 37C (25, 30C).
Se msoar variaia absorbanei la lungimea de und de 405 410 nm fa de ap
distilat, n cuve de 1 cm, timp de trei minute.
Se calculeaz variaia absorbanei pe minut (A/min).

Calcul

Cp U/l = (A/min) 3000 = 405 nm

unde:
Cp = concentraia probei
A/min = variaia absorbanei pe minut

Observaii
Dac variaia absorbanei pe minut depete 0,25, proba se va dilua cu soluie de
NaCl n proporie de 1:10, se va repeta determinarea i rezultatul se va nmuli cu 10.

Valori normale

femei 55 170 UI/l

brbai 70 175 UI/l
copii n perioada creterii < 700 UI/l

Variaii fiziologice

Creterea nivelului seric al izoenzimei de origine osoas are loc n perioadele de

cretere (pn la 15 17 ani), copiii i mai ales adolescenii prezentnd valori duble sau
chiar triple fa de aduli (datorit formrii i remanierii esutului osos n cadrul
procesului de cretere al osului n lungime).

Variaii patologice
FAL este unica enzim care se determin uzual pentru diagnosticul afeciunilor
osoase.
Valori crescute:
rahitism;
hiperparatiroidism;
 boala Paget;
tumori osteogene nsoite de reacie osteoblastic;
metastaze osoase;
osteoporoza (modificri nesemnificative);
perioada de vindecare a fracturilor;
boala oaselor de marmur;
osteomieloscleroz;
colestaz de orice cauz (FAL crescut denot staza biliar):
icter obstructiv;
hepatit toxic;
metastaze hepatice neoplazice;
ciroz biliar;
tratament cu epileptice, clorpromazin, estrogeni;
insuficien renal;
cancer renal.

Valori sczute:
hipofosfatazie congenital (rahitismul rezistent la tratamentul
cu vitamina D);
hipotiroidie;
intoxicaii cu plumb;
deficit sever de vitamina C.

Determinarea activitii amilazei

Amilazele sunt -1,4 glicozidaze, enzime care catalizez reaciile de hidroliz a

legturilor glicozidice din amidon, glicogen i poliglucidele derivate ale acestora,
conducnd la produi cu greutate molecular mai mic (dextrine, maltoz i cantiti mici
de glucoz).
n cavitatea bucal sunt transformate enzimatic exclusiv glucidele, prin prezena
-amilazei salivare (ptialina) ce hidrolizeaz amidonul i glicogenul.
Pancreasul secret o -amilaz mai puternic dect cea salivar care diger i
amidonul crud, pe care l transform n maltoz, maltotrioz i dextrine ca i amilaza
salivar. n sucul pancreatic exist 6 izoenzime ale amilazei care pot fi separate
electroforetic sau cromatografic.

Determinarea -amilazei prin metoda Wohlgemuth

Principiul metodei
Amilaza are proprietatea de a hidroliza amidonul pn la stadiul de dextrine,
trecnd prin fragmente polizaharidice cu greuti din ce n ce mai mici, care pierd
nsuirea de a se colora cu iodul.
 Se apreciaz cantitatea minim de ser (urin, saliv diluat 1/10) necesar
hidrolizei a 2 ml de soluie de amidon 0,1% n timp de 30 de minute la 37C, din care se
efectueaz diluii succesive. Se stabilete diluia serului care mai conine suficient
enzim ce hidrolizeaz amidonul n condiiile date pn la dextrine.

Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticl
termostat
vase cu soluie dezinfectant
ap distilat
tifon
reactivi

Reactivi
Soluie NaCl 0,9%
Soluie iod 0,1 N
Soluie amidon 0,1%

Proba
Ser (urin, saliv)

Tehnica de lucru
Se pregtesc 10 eprubete curate.
Se pipeteaz n prima eprubet 2 ml de ser, iar n urmtoarele 9 eprubete cte 1 ml
de soluie NaCl 0,9%.
Din prima eprubet se ia 1 ml, se trece n a doua eprubet i se agit coninutul
acesteia.
Din a doua eprubet se ia 1 ml, se trece n a treia eprubet i se agit coninutul
acesteia.
Se procedeaz astfel pn la ultima eprubet, din care se ia 1 ml i se arunc,
realizndu-se astfel o serie de diluii succesive ale serului iniial (1/2, 1/4, 1/8,
1/16....1/512).
Se adaug n toate eprubetele cte 2 ml de soluie de amidon, se agit i se
introduc la termostat la 37C timp de 30 de minute. Apoi, n eprubetele rcite sub jet de
ap, se adaug n fiecare cte 3 picturi de soluie de iod 0,1N.
Eprubetele se agit i se observ culoarea format.
Tabelul IX

Nr.
eprubet 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Diluia
serului 1/1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/252 1/512
Activitatea
amilazic 2 4 8 16 32 64 128 256 512 1024
(uW)

Culoarea din eprubet reflect gradul de hidroliz al amidonului, astfel nct:

eprubetele colorate n albastru conin amidon nehidrolizat;
eprubetele colorate n violet conin amilodextrine;
eprubetele colorate brun-rocat au hidroliz incomplet (eritrodextrine);
eprubetele colorate slab glbui conin amidon hidrolizat (flavodextrine).
eprubetele incolore conin amidon complet hidrolizat (acrodextrine i
maltodextrine)

Activitatea amilazei determinate astfel se exprim n uniti Wohlgemuth (UW).

1 UW reprezint cantitatea minim de enzim capabil s degradeze 1 mg de
amidon n timp de 30 minute la 37C.
1 UD (unitate diastazic) reprezint cantitatea de enzim capabil s hidrolizeze
0,2 ml amidon 1 n condiiile descrise.

1 UW = 2n UD

unde:
n = numrul ultimei eprubete n care nu apare culoarea albastr (n care amidonul
a fost hidrolizat).

Calcul

Se calculeaz cantitatea de amidon (mg) hidrolizat de amilaza coninut ntr-un ml

de ser. Rezultatul exprimat n uniti Wohlgemuth (UW) se obine nmulind gradul
diluiei ultimei eprubete n care nu apare culoarea albastr cu 2.

UW = V0 c / 100 d 103
unde:
V0 = volumul de soluie de amidon;
c = concentraia soluiei de amidon;
d = diluia ultimei eprubete n care nu apare culoarea albastr.
Ex. Presupunnd c n eprubeta a asea apare culoarea albastr, nseamn c
amidonul a fost hidrolizat pn n eprubeta a cincea creia i corespunde diluia 1/16 fa
de serul iniial.
Dac 1/16 ml ser hidrolizeaz o soluie de 2 ml amidon 0,1% (coninnd 2 mg
amidon) pentru 1 ml de ser va corespunde o cantitate de amidon:
 (1 2) : 1/16 = 2 16 = 32 UW

Observaii
Aceast metod este semicantitativ, orientativ.
Reacii fals pozitive dau codeina, morfina, indometacinul.

Valori normale

ser: 16 32 UW
urin: 8 64 UW

Variaii patologice

Valori crescute ale amilazei n ser:

creteri marcante (de 5 10 ori fa de normal):
pancreatite acute (prin leziuni ale acinilor pancreatici);
insuficien renal (amilaza are eliminare renal);
creteri moderate:
pancreatite cronice acutizate;
carcinom de cap de pancreas;
obstrucii intestinale;
contuzii abdominale cu lezarea pancreasului;
ulcer perforat;
colici biliare;
afeciuni ale glandelor salivare:
parotidit;
calcul salivar;
hipertiroidism;
creteri pasagere:
administrare morfin;
intoxicaii acute cu alcool.
Exist o afeciune cu caracter familial (defect genetic) numit macroamilazemie n
care apar molecule anormal de mari ale enzimei ce nu pot fi excretate de rinichi.

Valori crescute ale amilazei n urin:

ulcer perforat;
colici biliare.

Valori sczute ale amilazei n ser:

ciroze;
carcinom hepatic;
hepatite;
alcoolism.

Determinarea activitii catalazei

 Catalaza este o enzim din clasa oxidoreductazelor, care catalizeaz
descompunerea apei oxigenate cu eliberare de oxigen molecular, protejnd astfel celula
de aciunea nociv a peroxidului de hidrogen format n timpul metabolismului sau
datorit radiaiilor ionizante.

catalaza
H2O2 + H2O2 2 H2O + O2

Catalaza sanguin se gsete aproape exclusiv n eritrocite, activitatea ei crescnd

sau scznd n raport cu variaiile corespunztoare ale numrului de eritrocite. Din acest
motiv se efectueaz i numrarea eritrocitelor o dat cu recoltarea sngelui pentru
determinarea catalazei.

Dozarea activitii catalazei serice

Principiul metodei
Determinarea activitii catalazei se face printr-o metod indirect: catalaza dintr-
un microlitru de snge e pus s acioneze asupra unei cantiti (n exces) de ap
oxigenat la temperatura camerei, un anumit timp.
Excesul de ap oxigenat rmas netransformat se titreaz n mediu acid cu
permanganat de potasiu.
Activitatea enzimei se determin prin cantitatea de ap oxigenat descompus de
catalaz n 30 de minute la 37C.

2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 K2SO4 + 2MnSO4 + 5O2 + 8H2O

Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticl
termostat
vase cu soluie dezinfectant
ap distilat
tifon
reactivi

Reactivi
Soluie ap oxigenat 1% (3,3 ml perhidrol se aduc la 100 ml cu ap)
Soluie acid sulfuric 20%
Soluie permanganat de potasiu 0,1N
Alcool amilic

Proba
 Snge diluat 1/1000

Tehnica de lucru
Se recolteaz din pulpa degetului cu ajutorul unei micropipete 0,1 ml snge
care se introduc ntr-un balon cotat de 100 ml care conine 10 ml de ap distilat.
Se amestec pentru a produce hemoliza i se completeaz apoi cu ap distilat
pn la semn, obinnd astfel o diluie a sngelui de 1/1000.
n dou flacoane Erlenmeyer, martor i prob se pipeteaz cte 10 ml de ap
distilat i cte 1 ml de snge diluat 1/1000.
Martorul se fierbe timp de 3 5 minute pentru a distruge activitatea catalazei,
apoi se rcete n jet de ap rece.
Se pipeteaz n ambele flacoane cte 2 ml de ap oxigenat, se agit i se introduc
la termostat timp de 30 de minute la 37C.
Se adaug apoi n cele dou flacoane cte 5 ml de acid sulfuric 20% i cte 2 3
picturi de alcool amilic.
Se titreaz cele dou flacoane, martor i prob, cu permanganat de potasiu N/10
pn la culoare roz pal stabil.

Calcul

Se calculeaz titrul permanganatului de potasiu n raport cu apa oxigenat:

T KMnO4/ H2O2 = N KMnO4 Eg H2O2 10-3

T KMnO4/ H2O2 = 0,1 17 / 1000 = 0,0017 g/ml = 1,7 mg/ml

a = (Vm Vp) T KMnO4/ H2O2

unde:
a = mg ap oxigenat descompus de catalaza din 1 ml snge diluat 1/1000
Vm = volumul de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea cantitii totale de
ap oxigenat din martor n mililitri
Vp = volumul de permanganat de potasiu 0,1 N folosit la titrarea cantitii totale de
ap oxigenat din prob (cu enzima activ) n mililitri
T KMnO4/ H2O2 = titrul permanganatului de potasiu n raport cu apa oxigenat

ntruct activitatea enzimei se exprim prin numrul catalazic, care reprezint

cantitatea n miligrame de ap oxigenat descompus de catalaza dintr-un microlitru de
snge, rezultatul obinut este chiar numrul catalazic.

Valori diagnostice are numai indicele catalazic.

Indicele catalazic = nr. catalazic / nr. eritrocite

Valori normale
 12 14

Variaii patologice

Valori sczute se ntlnesc n:

cancer;
anemie;
caexie;
unele afeciuni hepatice (80%).

EXPLORAREA BIOCHIMIC
A METABOLISMULUI MINERAL

1 Dozarea calciului

Din punct de vedere fizic i fiziologic plasma sanguin conine trei fraciuni
distincte de calciu:
calciu ionizat = ioni liberi de Ca2+ form activ, difuzabil, care reprezint
aproximativ 50% din calciul total (2,5 mEq/l);
calciu neionizat = ioni de calciu complexai cu acizii organici sub form de citrat
de calciu, fosfat de calciu, bicarbonat de calciu form difuzabil, care reprezint 5% din
calciul total (0,2 mEq/l) i prin care calciul i exercit funciile specifice;
calciu legat de proteinele plasmatice (80% albuminai solubili, 20% de globuline)
form nedifuzabil, care reprezint 43 47% din totalul calciului seric (2,3 mEq/l).

Determinarea calciului prin metoda colorimetric

Principiul metodei
n mediu neutru, n prezena arsenazei III, Ca2+ formeaz un compus colorat.
Intensitatea culorii este direct proporional cu concentraia ionilor de Ca2+.

Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticl
pipete semiautomate
conuri
termostat
spectrofotometru
 cuve 1 cm
vase cu soluie dezinfectant
ap distilat
tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv R1:
Arsenaza III 200 mol/l
MES, pH = 6,5 100 mmol/l
Standard:
Calciu standard 10 mg/dl (2,5 mmol/l)

Reactivii sunt gata de ntrebuinare i stabili la temperatura camerei pn la data

nscris pe etichet.

Proba
Ser
Plasm heparinizat
Urin diluat cu ap distilat n proporie de 1:3 i cu pH ajustat la valoarea de 3
4 cu HCl 0,1N

Tehnica de lucru
Se pregtesc trei eprubete: martor, standard, prob.
Se pipeteaz n eprubete conform tabelului XI.
Dup agitare i incubare timp de 1 minut la 25C (30, 37C) se msoar extinciile
probei (Ep) i standardului (Es) fa de martor la lungimea de und de 650 nm, n cuve de
1 cm.

Tabelul XI

Reactivi Martor Standard Proba

Reactiv R1 1 ml 1 ml 1 ml
Ap distilat 10 l
Standard 10 l
Prob 10 l

Calcul

C p = Ep / Es C s

unde:
Cp = concentraia probei
Ep = extincia probei
Es = extincia standardului
Cs = concentraia standardului (10 mg/dl)
 Pn la concentraia de 16 mg/dl intensitatea coloraiei este direct proporional
cu concentraia ionilor de Ca.

Valori normale

n ser, plasm: calciu total = 8,8 10,8 mg/dl

calciu ionic = 4,2 5,2 mg/dl

n urin: calciu = 100 200 mg / 24 ore

Variaii patologice
Valori crescute ale calciului (hipercalcemii):
creterea resorbiei osoase
hiperparatiroidism
tumori (80% din cazuri)
hiperplazie paratiroidian (20% din cazuri)
metastaze osoase
hipersecreia substanelor de natur hormonal:
prostaglandine
parathormon-like
factor de activare
procese osteolitice active tumorale (osteoclaste n mielom, limfoame)
procese osteolitice active infecioase (osteomielit)
hipertiroidie (acromegalie)
imobilizri prelungite
tratament tiazidic
creterea absorbiei intestinale
intoxicaie cu vitamina D
boli granulomatoase (prin hiperproducia metabolitului activ al vitaminei D)
sarcoidoz
berilioz
hipercalcemia idiopatic a copilului
hipercalcemie n deshidratri cu hemocencentraie
Hipercalcemia sever > 15 mg/dl este o urgen metabolic care se asociaz cu
disfuncii nervoase, cardiovasculare i renale.
Valori fals crescute se obin prin staz prelungit la recoltarea sngelui.

Valori sczute ale calciului (hipocalcemii):

nlturarea chirurgical a paratiroidelor/tiroidei (asociat cu descreterea
fosfailor)
hipoparatiroidism idiopatic prin mecanism autoimun, asociat cu hipotiroidie,
insuficien renal .a
pseudohipoparatiroidism (lipsa de rspuns la parathormon)
 hipomagneziemie < 0,8 mg/dl care determin scderea sintezei i aciunii
periferice a PTH
tulburarea metabolismului vitaminei D: scderea aportului alimentar, rahitism
vitamina D rezistent
malabsorbie pentru calciu, fosfor, vitamina D
gastrectomie
pancreatite cronice
afeciuni intestinale
afeciuni hepatice
hipoalbuminemie (scade fraciunea legat de proteine, fraciunea ionizat
rmnnd normal)
dezechilibru P/Ca (hiperfosfatemia prin consum crescut de lapte de vac)
graviditate
lactaie
tratament cu furosemid, antiepileptice, steroizi

Manifestri clinice
Hipocalcemia cu diminuarea fraciunii ionizabile duce la creterea excitabilitii
neuromusculare asociat cu tetanie.
Rahitismul apare la copii n cazul deficitului marcat de calciu i presupune
calcifierea defectuoas a oaselor.
Osteomalacia presupune o decalcifiere osoas a adultului i vrstnicului (este o
boal rar).
Osteoporoza este considerat n prezent o boal, caracterizat prin reducerea
densitii minerale osoase, asociat cu compromiterea structurii osoase trabeculare, ceea
ce predispune osul la fractur n urma unui traumatism de mic intensitate sau chiar n
lipsa acestuia. Osteoporoza apare normal peste vrsta de 65 de ani, mai ales la femei o
dat cu instalarea menopauzei.
Nefrolitiaza calcic poate s apar printr-o dereglare metabolic a organismului,
consecutiv unor excese alimentare n calciu sau n cadrul unor boli hormonale
(hiperparatiroidie).

2 Dozarea magneziului

Organismul uman conine aproximativ 21 33 g magneziu, din care cea mai mare
parte se afl sub form de sruri complexe n oase, unde este asociat cu calciul i fosforul.
Restul magneziului are localizare predominant intracelular i se comport similar
cu potasiul.

Dozarea magneziului n ser prin metoda colorimetric

Principiul metodei
 Ionii de magneziu formeaz cu albastru de xilidin n mediu bazic un complex
colorat. Intensitatea culorii obinute este direct proporional cu concentraia ionilor de
magneziu.

Materiale necesare
eprubete
stativ pentru eprubete
pipete de sticl
pipete semiautomate
conuri
termostat
spectrofotometru
cuve 1 cm
vase cu soluie dezinfectant
ap distilat
tifon
reactivi

Reactivi
Reactiv R1:
Tampon tris, pH = 11,3 250 mmol/l
Albastru de xilidin 1 mmol/l
Standard de magneziu: 0,824 mmol/l (2 mg/dl)
Reactivii sunt gata de ntrebuinare i stabili la temperatura camerei.

Proba
Ser
Plasm heparinizat
Urin diluat cu ap distilat n proporie de 1:10 i cu pH ajustat la valoarea de 3
4 cu HCl 0,1N

Tehnica de lucru
Se pregtesc trei eprubete: martor, standard, prob.
Se pipeteaz n eprubete conform tabelului urmtor:

Tabelul XV

Reactivi Martor Standard Proba

Reactiv R1 1 ml 1 ml 1 ml
Apa distilat 10 l
Standard 10 l
Prob 10 l

Dup agitare i incubare timp de 1 minut la 25C (30, 37C) se msoar extinciile
probei (Ep) i standardului (Es) fa de martor la lungimea de und de 520 nm, n cuve de
1 cm.
 Calcul

Cp = Ep / Es Cs
mg Mg/100 ml ser = Ep / Es Cs

unde:
Cp = concentraia probei
Ep = extincia probei
Es = extincia standardului
Cs = concentraia standardului (2 mg/dl)

Pentru urin rezultatul se nmulete cu factorul de diluie.

Pn la concentraia de 5 mg/dl intensitatea coloraiei este direct proporional cu
concentraia ionilor de magneziu.

Valori normale

n ser:
aduli 1,6 2,5 mg/100 ml ser (1,6 2,4 mEq/l.ser)
copii (pn la 10 ani) 1,6 2,4 mg/100 ml ser (1,3 2,0 mEq/l ser)

n snge intergral: 3,7 4,7 mg/100 ml

n urin: 50 150 mg/ 24 ore

Variaii patologice

Valori sczute ale magneziului seric (hipomagneziemie) apar n:

unele sindroame tetanice (deficitul de magneziu ionizat, nu total, poate
induce o tetanie nsoit de convulsii, dar diferit de cea hipocalcemic);
rahitism infantil;
nefroz lipoidic;
com diabetic;
insuficien hepatic (ciroze);
hipoparatiroidism;
hiperaldosteronism;
mixedem;
alcoolism;
malabsorbie;
vrsturi incoercibile;
diarei accentuate;
pancreatit acut;
tratament cu diuretice;
plasmocitom;
sarcin;
 idiopatic.

Valori crescute ale magneziului seric (hipermagneziemie) apar n:

oligurie, anurie;
insuficien renal acut i cronic;
hipertiroidie;
tratament oral de substituie cu magneziu, laxative i antiacide;
insuficiene renale severe;
stri uremice;
ciroze grave;
acidoz;
tulburri de filtrare glomerular;
avitaminoza D.

Excesul de magneziu administrat parenteral poate duce la paralizie, care se

nltur prin adminstrarea de calciu i potasiu.