N.A. ŞUŢAN, A.

POPESCU

METODE PENTRU CULTURA IN VITRO

A CĂPŞUNULUI ORNAMENTAL

Editura Universității din Pitești

2011
 N.A. ŞUŢAN, A. POPESCU

METHODS FOR IN VITRO CULTURE

OF ORNAMENTAL STRAWBERRY

University of Pitești Publishing House

2011

2
 CUPRINS
Introducere……………………………………………………………… 7
Genul Fragaria, genul Potentilla şi hibrizii intergenerici
Fragaria × Potentilla…………………………………………………… 10
Genul Fragaria…………………………………………………………. 10
Distribuţia geografică………………………………………………….. 10
Taxonomie…………………………………………………………….... 13
Etimologie şi simbolistică……………………………………………... 14
Proprietăţile organoleptice ale fructelor de căpşun………………… 15
Genul Potentilla………………………………………………………… 18
Aria de răspândire……………………………………………………... 18
Taxonomie……………………………………………………………… 18
Etimologie şi simbolistică……………………………………………... 19
Compatibilitatea de hibridare între speciile genurilor Fragaria
şi Potentilla……………………………………………………………... 20
Aplicaţii ale hibridărilor intergenerice Fragaria × Potentilla……….. 20
Obţinerea de forme haploide de Fragaria…………………………… 22
Obţinerea de hibrizi intergenerici Fragaria × Potentilla…………... 24
Înmulţirea comercială a căpşunului………………………………….. 29
Înmulţirea prin metode convenţionale……………………………….. 30
Înmulţirea prin filamente şi stoloni…………………………………… 30
Înmulţirea prin seminţe………………………………………………... 31
Înmulţirea prin metode neconvenţionale…………………………….. 33
Micropropagarea in vitro………………………………………………. 33
Modul de formare a lăstarilor…………………………………………. 35
Cultura de meristeme pentru eliberarea de virusuri……………….. 36
Conservarea germoplasmei………………………………………….. 37
Recuperarea embrionilor……………………………………………… 38
Regenerarea plantelor prin organogeneză şi embriogeneză
somatică………………………………………………………………… 38
Organogeneza…………………………………………………………. 40
Embriogeneza somatică………………………………………………. 41
Variaţia somaclonală………………………………………………….. 43
Mecanismele variaţiei somaclonale………………………………….. 44
Modificările cariotipului………………………………………………... 44
Amplificarea şi diminuarea genică…………………………………… 45
Metilarea ADN…………………………………………………………. 46
Mutaţiile punctiforme…………………………………………………... 48
Activarea elementelor genetice transpozabile……………………… 48
Mutaţii ale ADN extranuclear…………………………………………. 49
Variaţia epigenetică……………………………………………………. 50
Metode de evidenţiere a variaţiei somaclonale…………………….. 51
Evidenţierea variabilităţii genetice cu ajutorul markerilor
moleculari………………………………………………………………. 51
3
Markeri proteici………………………………………………………… 51
Markeri ADN……………………………………………………………. 53
Materialele şi metodele utilizate în experimente de multiplicare
in vitro a hibrizilor intergenerici Fragaria × Potentilla……………… 58
Materialul biologic……………………………………………………… 58
Mediile de cultură utilizate…………………………………………….. 61
Mediile de bază utilizate………………………………………………. 61
Regulatorii de creştere utilizaţi……………………………………….. 61
Materialul biologic utilizat în experienţele de analiză genetică…… 64
Primerii utilizaţi în amplificarea ADN………………………………… 64
Experimente realizate pentru determinarea capacităţii
de micropropagare a hibrizilor Fragaria × Potentilla………………. 67
Iniţierea culturii in vitro………………………………………………… 67
Experimente realizate pentru determinarea capacităţii
de micropropagare prin lăstărire axilară…………………………….. 67
de micropropagare prin organogeneză directă şi indirectă……….. 67
Experimente realizate pentru studiul stabilităţii genetice
a plantelor înmulţite clonal in vitro…………………………………… 68
Selecţia primerilor utilizaţi în studiul stabilităţii genetice…………… 68
Extracţia de ADN în vederea executării analizelor RAPD………… 68
Amplificarea RAPD……………………………………………………. 68
Electroforeza în gel de agaroză……………………………………… 69
Preluarea imaginilor…………………………………………………… 69
Analiza imaginilor……………………………………………………… 69
Metode statistice de calcul şi interpretare a rezultatelor………….. 69
Capacitatea de micropropagare prin lăstărire axilară a unor hibrizi
intergenerici Fragaria × Potentilla……………………………………. 70
Capacitatea de regenerare de lăstari din apexuri caulinare………. 70
Capacitatea de multiplicare in vitro………………………………….. 71
Influenţa genotipului asupra ratei de multiplicare in vitro………….. 71
Influenţa mediului de bază asupra ratei de multiplicare in vitro…... 72
Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor de creştere
asupra ratei de multiplicare in vitro…………………………………... 76
Capacitatea de regenerare de lăstari prin organogeneză indirectă
utilizând medii de cultură agarizate………………………………….. 79
Capacitatea de calusogeneză a explantelor de frunză şi peţiol
cultivate pe medii de cultură agarizate………………………………. 79
Influenţa genotipului asupra capacităţii de calusogeneză
a explantelor de frunză şi peţiol cultivate pe medii de cultură
agarizate………………………………………………………………... 81
Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor de creştere
asupra capacităţii de calusogeneză a explantelor de frunză
şi peţiol cultivate pe medii de cultură agarizate…………………….. 82

4
Potenţialul regenerativ al calusurilor menţinute pe medii
de cultură agarizate……………………………………………………. 84
Influenţa genotipului asupra frecvenţei de regenerare
de neoplantule din calusuri menţinute pe medii de cultură
agarizate………………………………………………………………... 84
Influenţa mediului de bază asupra frecvenţei de regenerare
de neoplantule din calusuri menţinute pe medii de cultură
agarizate………………………………………………………………... 86
Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor de creştere
asupra frecvenţei de regenerare de neoplantule din calusuri
menţinute pe medii de cultură agarizate…………………………….. 87
Influenţa tipului de explant asupra frecvenţei de regenerare
de neoplantule din calusuri menţinute pe medii de cultură
agarizate………………………………………………………………... 91
Capacitatea de regenerare de lăstari prin organogeneză directă
utilizând medii de cultură agarizate………………………………….. 94
Influenţa genotipului asupra frecvenţei de regenerare de lăstari
prin organogeneză directă……………………………………………. 94
Influenţa interacţiunii dintre mediul de bază şi combinaţia
şi concentraţia regulatorilor de creştere asupra frecvenţei
de regenerare de lăstari prin organogeneză directă……………….. 95
Influenţa tipului de explant asupra frecvenţei de regenerare
de lăstari prin organogeneză directă………………………………… 98
Particularităţile lăstarilor regeneraţi prin organogeneză directă….. 99
Capacitatea de înrădăcinare in vitro a unor hibrizii intergenerici
Fragaria × Potentilla…………………………………………………… 100
Influenţa genotipului asupra capacităţii de înrădăcinare in vitro….. 100
Capacitatea de înrădăcinare a microlăstarilor regeneraţi
pe medii de cultură cu compoziţie diferită…………………………... 104
Capacitatea de aclimatizare a plantelor înrădăcinate in vitro…….. 106
Stabilitatea genetică a plantelor multiplicate clonal in vitro,
evidenţiată prin analiză RAPD………………………........................ 108
Protocol de lucru pentru micropropagarea prin lăstărire axilară
a hibrizilor intergenerici ‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’………………… 115
Bibliografie……………………………………………………………… 119

5
6
 Introducere
Privind retrospectiv, toate beneficiile oferite de către plante
umanităţii au reprezentat fundamentul activităţilor de ameliorare
a plantelor, iniţiate cu aproximativ 10.000 de ani în urmă (Heslop-
Harrison, 2005) şi culminând astăzi cu aplicarea şi exploatarea
intensivă a biotehnologiei în scopul creşterii cantităţii de material
săditor şi îmbunătăţirii calităţii acestuia. În plus, izolarea, clonarea
şi secvenţierea ADN genomic, în scopul identificării genelor
şi a rolului acestora sau pentru determinarea şi evaluarea
polimorfismului genetic, au devenit activităţi de rutină, mai uşor
accesibile şi mai puţin costisitoare.
Căpşunul se numără printre puţinele specii caracterizate de o rată
înaltă de înlocuire a soiurilor şi sortimentelor, strâns dependentă
de cerinţele consumatorilor, activitatea extensivă de ameliorare
oferind posibilitatea cultivării căpşunului din zonele temperate până
în regiunile subtropicale şi zonele de taiga din emisfera boreală.
În general, speciile aparţinând genului Fragaria au o distribuţie
geografică largă, în special în emisfera boreală.
Obiectivele majore urmărite prin desfăşurarea programelor
de ameliorare a căpşunului cultivat sunt bazate, în general,
pe identificarea fenotipurilor superioare, urmată de hibridarea
acestora şi selecţia descendenţilor ce pot fi omologaţi ca soiuri noi
sau ce vor fi utilizaţi ca genitori în generaţia următoare. Cercetările
îndelungate, efectuate până în prezent asupra heritabilităţii
caracterelor speciilor genului Fragaria au permis identificarea
a numeroase surse potenţiale de gene pentru: adaptabilitate ridicată
la variaţiile condiţiilor de mediu, vigoare, rezistenţa la o gamă variată
de agenţi patogeni şi dăunători, rezistenţa la ger, toleranţa la secetă
şi salinitate ridicată, fructificarea prelungită sau coacerea timpurie
a fructelor. Totuşi, ca urmare a unei diversităţi genetice limitată,
observată între soiurile de Fragaria × ananassa (Graham şi colab.,
1996), se presupune că obţinerea unor combinaţii favorabile
de caractere ce pot fi întrunite de soiurile şi varietăţile noi de căpşun,
va fi posibilă numai prin creşterea numărului genitorilor aparţinând
germoplasmei exotice (Hancock şi colab., 2002) sau genurilor
înrudite.
Dacă mult timp, hibridarea intergenerică a fost considerată
inutilizabilă în cazul speciilor cu grad diferit de ploidie (Evans, 1984),
progresele înregistrate în ultimii ani, în ceeea ce priveşte
7
manipulările formelor poliploide şi perfecţionarea tehnicilor
de hibridare şi recuperare a embrionilor zigotici rezultaţi din
hibridările îndepărtate au determinat o reconsiderare aproape
radicală a utilităţii practice a acestei metode pentru ameliorarea
genetică a căpşunului cultivat.
Hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla cunoscuţi sub
denumirea de căpşun ornamental, se îmbină armonios cu exigenţele
prezentului şi au o valoare comercială crescând din ce în ce mai mult.
Cele mai cunoscute genotipuri de căpşun ornamental, cum sunt ‘Pink
Panda’, ‘Serenata’, ‘Lipstick’, ‘Red Ruby’, ‘Rosalyne’, ‘Rosseberry’,
se remarcă prin florile de culoare roz–roşie, concomitent cu
producerea de fructe comestibile. Mai mult, hibridarea speciilor
ornamentale se află în mod constant, în căutare de noi tehnologii,
care ar putea oferi un ajutor substanţial în ceea ce priveşte
reducerea costurilor de producţie, creşterea calităţii produsului
rezultat, precum şi diversificarea sortimentelor sau varietăţilor. În
acest fel, creşterea productivităţii varietăţii nou obţinute este realizată
prin îmbunătăţirea caracterelor dorite, precum creşterea greutăţii
fructelor, culoarea şi aroma acestora, perioada prelungită de înflorire
şi fructificare. Astfel, micropropagarea reprezintă, un sistem general
acceptat pentru înmulţirea pe scară largă a soiurilor de căpşun, în
condiţiile utilizării cu maximă atenţie a unor proceduri bine stabilite.
Este un fapt incontestabil că specia Fragaria × ananassa a fost
una dintre speciile de pionierat ale aplicării pe scară largă a tehnicilor
de cultură in vitro (Jungnickel, 1988; Popescu, 1998). Cultura de
meristeme, utilizată ca metodă de micropropagare are deja o istorie
de trei decenii la căpşun. În ceea ce priveşte inducerea formării de
lăstari adventivi, de la prima încercare de inducere a formării de
calus din meristeme şi regenerare de plante (Nishi şi Oosawa, 1973),
gama tipurilor de explante testate s-a lărgit considerabil, incluzând
frunza, peţiolul, rădăcina, embrionii imaturi, cotiledoanele, anterele,
receptaculul, petalele, etc. Protocoluri eficiente pentru regenerarea
de lăstari adventivi din calusul cultivat in vitro au fost însă puse la
punct doar în ultimele două decenii. Rezultatele experimentale au
arătat că, în general, capacitatea de formare de calus şi răspunsul
regenerativ sunt influenţate de tipul de explant, sursa de explante,
tipul şi concentraţia regulatorilor de creştere, condiţiile de cultură
şi genotip. Foarte adesea, condiţiile standardizate pentru un soi nu
sunt optime pentru altele.

8
 Aceasta ilustrează probabil interacţiunea dintre nivelele
de fitohormoni endogeni şi exogeni în determinarea răspunsului
regenerativ. Întrucât a devenit evidentă existenţa unei puternice
interacţiuni între explante, regulatorii de creştere şi condiţiile
de cultură, aceste variabile trebuie să fie luate în consideraţie
simultan la elaborarea unui sistem de regenerare pentru un soi
comercial de căpşun.
Înmulţirea convenţională a hibrizilor intergenerici Fragaria ×
Potentilla nu permite obţinerea, într-un timp scurt, a unui număr mare
de stoloni garantaţi din punct de vedere al autenticităţii şi al valorii
biologice, astfel încât, micropropagarea in vitro, urmată de
înrădăcinarea optimă şi aclimatizarea în condiţii de seră, reprezintă
principala opţiune. Deşi tehnicile de cultură in vitro au monopolizat
micropropagarea pe scară largă şi sunt utilizate cu succes în
programele de ameliorare a numeroase specii de plante, variaţia
somaclonală, raportată frecvent ca o consecinţă a procesului
de multiplicare in vitro, poate avea repercusiuni economice de
proporţii. Prin urmare, determinarea stabilităţii genetice a plantelor
micropropagate (implicit a uniformităţii fenotipice), utilizând tehnici
corespunzătoare de analiză genetică, trebuie să reprezinte etapa
finală a procesului de micropropagare. Identificarea variantelor
somaclonale regenerate prin cultura in vitro de explante
meristematice şi somatice este posibilă prin utilizarea markerilor PCR
aleşi arbitrar, aşa cum sunt markerii RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA).
Astfel, elaborarea unui protocol optim, care să permită
obţinerea unei eficienţe ridicate de micropropagare a hibrizilor
intergenerici prin stimularea lăstăririi axilare şi prin stimularea
regenerării de lăstari direct din explante somatice sau via calus,
concomitent cu menţinerea uniformităţii genetice a plantelor
micropropagate in vitro, este imperios necesară.

9
 1. GENUL FRAGARIA, GENUL POTENTILLA ŞI HIBRIZII
INTERGENERICI FRAGARIA × POTENTILLA

1.1. GENUL FRAGARIA

Genul Fragaria, aparţinând familiei Rosaceae, subfamilia

Rosoideae, cuprinde 34 specii şi subspecii sălbatice (Staudt, 1989;
Hancock, 1999; Staudt, 2008), precum şi specia cultivată, Fragaria ×
ananassa, care este rezultatul unei hibridări accidentale între două
specii octoploide Fragaria chiloensis şi Fragaria virginiana (Hancock,
1999; Hokanson şi Maas, 2001; Folta şi Davis, 2006; Rousseau-
Gueutein, 2009). Numărul de bază de cromozomi x=7, caracteristic
tuturor speciilor genului Fragaria se regăseşte în şase nivele
de ploidie, majoritatea speciilor fiind însă diplode (Tabel 1). Deşi mai
mult de o treime din aceste specii produc fructe comestibile, numai
cinci au fost cultivate de-a lungul timpului: Fragaria vesca
(domesticită în Europa la începutul secolului al XVI-lea), Fragaria
viridis (cultivată în Anglia şi Franţa în Evul Mediu), Fragaria
moschata introdusă în cultură, începând din secolul al XVI-lea,
în Germania, nord-estul Franţei şi Rusia), Fragaria chiloensis
(cultivată de populaţiile de pe coasta chiliană a Pacificului)
şi Fragaria × ananassa (căpşunul modern), cu deosebită importanţă
punct de vedere comercial, reflectată în cvasi-dominanţa în cultură
a soiurilor octoploide de căpşun.

1.1.1. Distribuţia geografică

Genul Fragaria posedă o mare capacitate de adaptare

la condiţiile naturale, reflectată în egală măsură de răspândirea
naturală şi de cea cultivată. Astfel, aria de răspândire (Tabel 1) este
cuprinsă, atât pentru flora spontană, cât şi pentru cea cultivată, între
150 şi 550 latitudine nordică şi sudică, din zona subtropicală până
aproape de graniţa pământurilor îngheţate (Hancock, 1999). Fragaria
vesca (2n=14) este larg raspândită în zonele temperate din emisfera
boreală; celelalte specii diploide sunt restrânse la Eurasia, tetraploizii
sunt limitaţi la Eurasia, iar specia hexaploidă Fragaria moschata
Duch., (sin. Fragaria elatior Ehrh., unica specie hexaploidă a genului)
se regăseşte în Europa şi unele zone din Siberia (Staudt, 1989).

10
Tabel 1. Speciile genului Fragaria, nivelul de ploidie şi distribuţia lor
geografică (după Hancock, 1999).

Specia Nivelul Distribuţia geografică

de ploidie
F. bucharica Losinsk. 2n=2x=14 Tadjikistan, Afganistan, India, Pakistan;
F. chinensis 2n=2x=14 Fără informaţii disponibile;
F. daltoniana J.Gay 2n=2x=14 Sikkim Himalayas;
F. himalayensis 2n=2x=14 Himalaya;
F. iinumae Makino 2n=2x=14 Hokkaido şi Honshu, Japonia;
F. mandschurica 2n=2x=14 Rusia, Mongolia, NE Chinei, Coreea;
Staudt
F. nilgerrensis 2n=2x=14 Regiunile montane temperate de pe
Schlect. Ex J.Gay cuprinsul Indiei, Himalayei, Vietnamului,
SV şi Centrul Chinei;
F. nipponica Makino 2n=2x=14 Honshu şi Yakushima, Japonia, Asia
Centrală din Bokhara până în Himalaya;
F nubicola (Hook. F) 2n=2x=14 Gansu, Sichuan şi Yunnan, China;
Lindl. ex. Lacaita
F. pentaphylla 2n=2x=14 Pe tot cuprinsul zonei temperate de Nord;
Losinsk.
F. vesca L. 2n=2x=14 Eurasia şi America;
F. viridis Weston 2n=2x=14 Euro-Siberia, la est de Munţii Altai;
F. yezoensis 2n=2x=14 Yezo, Japonia;
F. × bifera Duchesne 2n=2x=14 Regiunile populate de F. viridis
şi F. vesca;
F. gracilis A. Losinsk. 2n=2x=14 Provinciile din Nordul Chinei;
F. moupinensis Cardot 2n=4x=28 Gansu, Sichuan şi Yunnan, China;
F. orientalis Losinsk. 2n=4x=28 Rusia şi China;
(sin. = F. corymbosa
Losinsk.)
F. tibetica Staudt şi 2n=4x=28 Centrul şi estul Himalayei, SE Tibetului,
Dickore Yunnan şi Sichuan, China;
F. × bringhurstii 2n=5x=35 California;
Staudt
F. moschata Weston 2n=6x=42 Centrul şi Estul Europei;
F. chiloensis (L.) Miller 2n=8x=56 Coasta de Vest a Canadei şi SUA,
Insulele Hawaii, Ecuador, Bolivia, Peru,
Argentina şi Chile;
F. virginiana Miller 2n=8x=56 Pe tot cuprinsul Americii de Nord;
F. × ananassa Duch. 2n=8x=56 Pe toate continentele, în cultură;
F. iturupensis Staudt 2n=8x=56 Iturup, Japonia
F. x vescana Bauer 2n=10x=70 Europa (Bauer, 1993)
F. iturupensis 2n=10x=70 Munţii Atsunupuri (Hummer şi colab.,
2009);

11
 În acest context, trebuie precizat că, majoritatea speciilor
ce aparţin genului Fragaria au o largă răspândire în Asia, motiv
pentru care aceast continent a fost postulat ca arealul de origine
a genului (Staudt, 1999). Recent, Hummer şi colab. (2009) au
evidenţiat exista unor genotipuri decaploide ce aparţin speciei
Fragaria iturupensis (Fig. 1), originare din Munţii Atsunupuri.
Se consideră că nivelul decaploid este fie consecinţa formării
gameţilor nereduşi, frecvent întâlniţi în cadrul genului Fragaria,
fie determinarea numărului de 56 cromozomi la specia Fragaria
iturupensis (Staudt, 1973) a fost eronată.


Figura 1. Evidenţierea cromozomilor metafazici (2n=10x=70) într-o celulă
meristematică radiculară, la Fragaria iturupensis; scala de măsură - 5 µm
(după Hummer şi colab., 2009).

Fragaria × ananassa (2n=8x=56), specia căreia îi aparţine

marea majoritate a soiurilor cultivate (peste 99%) în toate regiunile
Globului, este la origine un hibrid natural între Fragaria chiloensis
(originară din America de Sud) şi Fragaria virginiana (originară din
America de Nord).

12
 Spre deosebire de Fragaria x ananassa, specia Fragaria x
vescana (2n=10x=70), căreia îi aparţin aproape 10 soiuri (cele mai
cunoscute fiind Sara, Annelie, Rebecka, Florika şi Spadeka) este la
origine un hibrid între Fragaria x ananassa şi F. vesca obţinut prin
încrucişare controlată (Bauer, 1983, Trajkovski, 1998).
Alte specii hibride de Fragaria sunt cele rezultate spontan prin
încrucişarea speciilor F. chiloensis şi F. vesca (Bringhurst, 1963),
cunoscută sub denumirea Fragaria x bringhurstii Staudt, respectiv
prin încrucişarea speciilor F. vesca şi F. viridis, cunoscută sub
denumirea Fragaria x bifera Duch.
Dacă speciile sălbatice de Fragaria diferă din punct de vedere
al latitudinii până la care se întinde arealul lor de răspândire, specia
cultivată Fragaria x ananassa prezintă a adaptabilitate extrem de
largă, ceea ce explică prezenţa ei din regiunile subtropicale până
în cele nordice şi sudice, dincolo de graniţele zonei temperate. Un
exemplu relevant este cel al ţărilor scandinave (Norvegia, Suedia şi
Finlanda).
În ceea ce priveşte altitudinea, aceasta nu este un factor
evident limitativ, plantele de Fragaria aparţinând diferitelor specii fiind
găsite de la nivelul mării până la altitudinea de aproape 2000 m.
De altfel, şi soiurile de Fragaria x ananassa pot fi cultivate până la o
altitudine foarte ridicată (de exemplu, în Elveţia căpşunii se găsesc în
culturi până la 1500 m).

1.1.2. Taxonomie

Taxonomia genului Fragaria a fost intens studiată de Losina-

Losinskaja (1926) şi concretizată în realizarea unei monografii
cuprinzătoare a acestui gen. Ulterior, taxonomia genului a fost
revizuită repetat (Staudt, 1962; Staudt, 1989; Staudt, 1999; Staudt şi
Dickoré, 2001; Staudt şi colab., 2003; Staudt, 2008). Cu privire
la taxonomia genului, Mabberley (2002) a generat numeroase
controverse, propunând schimbarea încadrării taxonomice a speciilor
genului Fragaria. Pe baza similarităţii genetice şi într-o anumită
măsură fenotipice a unora dintre speciile de Potentilla şi respectiv
Fragaria, Mabberley a propus modificarea denumirilor unor specii
aparţinând genului Fragaria, după cum urmează: Potentilla ×
ananassa (Duchesne ex Rozier) Mabb., P. chiloensis (L.) Mabb.,
P. daltoniana (J. Gay) Mabb., P. iinumae (Mak.) Mabb.,
13
P. nilgerrensis (J. Gay) Mabb., P. nubicola (Hook. F) Mabb.,
P. pentaphylla (Losinsk.) Mabb., P. yakusimensis (Masum.) Mabb.
[Fragaria nipponica Mak.] şi P. silvanus Mabb. [Fragaria tibetica
Staudt şi Dickoré]. De asemenea, denumirea Potentilla × rosea este
atribuită hibridului Potentilla palustris (L.) Scop. × Potentilla ×
ananassa (Duch. ex Rozier) Mabb.
Eriksson şi colab. (1998) studiind relaţiile filogenetice dintre
genurile Fragaria şi Potentilla, le-au găsit incompatibile. În Flora
Ilustrată a României, genurile Fragaria şi Potentilla, sunt încadrate
individual în subfam. Rosoideae, fam. Rosaceae, ord. Rosales
(Ciocârlan, 2009).
De altfel, prin unirea celor două genuri, Mabberley (2002)
a ignorat problemele fundamentale de compatibilitate între
clasificarea tradiţională, după Linnaeus (1753) şi clasificarea
filogenetică cladistică (Brummit, 1997, 2002; Welzen, 1998; Diggs
şi Lipscomb, 2002), precum şi dificultatea evaluării unui taxon
ca mono-, para-, sau polifiletic, chiar şi în cadrul unui grup bine
analizat din punct de vedere morfologic şi molecular (Kadereit
şi colab., 1997).
După cum afirmau Hammer şi Pistrick, în anul 2003,
introducerea modificărilor nomenclaturale, având ca argument
recunoaşterea taxonilor monofiletici, ar trebui evitate pentru
menţinerea stabilităţii, în comunicarea globală despre resursele
genetice ale plantelor. Codul Internaţional pentru Nomenclatura
Botanică (Greuter şi colab., 2000) oferă, prin regulile sale,
posibilitatea de a menţine o stabilitate nomenclaturală, în ciuda
diverselor dificultăţi. În studiul resurselor genetice ale plantelor,
necesitatea existenţei unei nomenclaturi stabile a taxonilor, ca un
fundament solid pentru comunicarea globală, este evidentă.
Astfel, de multă vreme, este bine cunoscut faptul că genurile
Fragaria şi Potentilla sunt foarte apropiate, ca o consecinţă
a similarităţii morfologiei florale şi vegetative, dar nici Bentham
(1865), nici Wolf (1908), nici Kalkman (1968), nici Gerstberger (1994)
sau Leslie (1995) nu au contestat independenţa genului Fragaria
(Hammer şi Pistrick, 2003).
De altfel, Knobloch afirma încă din anul 1972 că trebuie să se
respingă ideea conform căreia, dacă este posibilă hibridarea între
specii aparţinând unor genuri diferite, atunci genurile trebuiesc unite.

14
 1.1.3. Etimologie şi simbolistică

Linnaeus a ales termenul latinesc “fraga”, derivat din denumirea

genului, pentru desemnarea căpşunului. Poetul roman Virgil
(70-19 î.H.) a scris “humi nascentia fraga” în cea de-a treia sa elegie.
Căpşunul nu a fost regăsit în operele de artă din Egipt sau Grecia
Antică, probabil, datorită distribuţiei nordice a speciilor, De asemenea
nu este amintit nici în Biblie. Cele mai numeroase consemnări
şi reprezentări ale căpşunului au fost realizate începând din prima
perioadă a secolului al XIII-lea. Călugării din vestul Europei pictau
fructele rotunde de căpşun sălbatic în manuscrisele lor iluministe.
Cu mult înainte de aducerea "căpşunului cu fruct mare din Chile"
în Europa, cu mult înainte ca specialiştii să-şi îndrepte atenţia către
fragul de pădure cu un ochi taxonomic, călugării l-au privit îndelung
şi l-au găsit minunat, pentru a-l dărui ca ofrandă. Ca simbol, nu este
singurul cu largă răspândire, dar pornind de la descoperirea
sa timpurie, i-au fost atribuite succesiv mai multe simboluri. Datorită
poziţiei plecate a fructului, a fost considerat simbol al onestităţii,
gândirii nobile şi modestiei, "cu toate că este trădat de parfum
şi culoarea fructului". Mai mult, legenda povesteşte că, din cauza
culorii de un roşu aprins şi a formei de inimă, căpşunele erau
simbolul zeiţei iubirii, Venus.
Pornind de la diversitatea simbolistică, prin prisma diversităţii
varietăţilor şi soiurilor, acest fruct mitic este caracterizat de o bogăţie
culturală şi economico-socială impresionantă.

1.1.4. Proprietăţile organoleptice ale fructelor de căpşun

Importanţa genului Fragaria este evidentă, în primul rând,

prin prisma soiurilor de căpşun cu potenţial ridicat de producţie şi
calitate superioară a fructelor, conţinutului de vitamina C şi alte
substanţe utile pentru alimentaţia omului. De altfel, căpşunile
se numără, alături de cireşe, printre primele fructe care ajung la
maturitate în timpul anului, respectiv în lunile mai-iunie.
Procentual, căpşunele în stare proaspată conţin: 87-91% apă,
4,5 – 9,7% glucide (glucoză, fructoză), 0,72 – 1,19% acizi organici,
0,1 – 0,5% pectine, 0,94 – 1,74% proteine, precum şi săruri minerale
(potasiu, fier, fosfor, mangan, calciu) şi vitamine (vitamina C,
vitamina B şi vitamina K, acid pantotenic, vitamina E).

15
 În tratamentul insomniilor, se recomandă consumul de căpşune
proaspete datorită conţinutului ridicat de vitamina B şi de mangan,
care reglează activitatea sistemului nervos. În tratamentul anemiilor
căpşunele sunt deopotrivă indicate prin prisma conţinutului lor în fier
şi cupru, iar datorită vitaminei K ajută la buna funcţionare a ficatului.
Sistemul imunitar este stimulat de prezenţa acidului pantotenic,
un acid indispensabil formării anticorpilor. Efectul remineralizant
al căpşunelor derivă din conţinutul mare în magneziu, calciu şi fosfor,
dar şi provitamina A, fiind recomandate în alimentaţia bolnavilor
de TBC sau în tratamentul osteoporozei. Sărurile alcaline îi vindecă
pe suferinzii de gută. Conţinutul de acid salicilic îi conferă proprietăţi
calmante, antiinflamatoare, analgezice, antibiotice, cicatrizante
şi tonice. La seria de însuşiri care asigură succesul fructelor
de căpşun s-a adăugat conţinutul ridicat în acid elagic (Maas
şi Galletta, 1991; Maas şi colab., 1991), compus cu activitate
antimutagenică şi anticarcinogenică recunoscută.
Calităţile nutritive şi organoleptice ale fructelor, pretabilitatea
la prelucrări casnice, precum şi impresionanta adaptabilitate
ecologică, dată de înaltul potenţial de variabilitate genetică,
au determinat o extindere de mari proporţii a suprafeţelor cultivate
cu căpşun pe plan mondial, concomitent cu creşterea productivităţii.
Circa 25% din producţia mondială de căpşuni este înregistrată
în SUA (Tabel 2), urmată de Spania, Turcia, Mexic, Egipt, Japonia,
Republica Coreea, Polonia, Italia, Germania şi Rusia.

16
 Tabel 2. Producţia de căpşune înregistrată în principalele 25 de ţări cultivatoare, în perioada 2000 - 2008
(http://faostat.fao.org/site/567/default.aspx)
Nr. Producţia de căpşuni 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008
crt. (exprimată în tone) în:
1. Statele Unite ale Americii 862 828 748 885 854 845 977 945 1 004 163 1 053 242 1 090 436 1 133 703 1 148 530
2. Spania 344 865 314 079 279 441 264 237 334.892 320 853 330 485 263 900 263 900
3. Turcia 130 000 117 000 145 000 150 000 155.000 200 000 211 127 250 316 261 078
4. Mexic 141 130 130 688 142 245 150 261 177.230 162 627 191 843 176 396 207 485
5. Republica Coreea 180 501 202 966 209 938 205 427 202.500 201 995 205 307 203 227 203 227
6. Polonia 171 314 242 118 153 083 131 332 185.583 184 627 193 666 174 578 200 723
7. Egipt 70 612 68 137 60 017 79 771 104.971 100 000 128 349 174 414 200 254
8. Japonia 205 300 208 600 210 500 202 900 198.200 196 200 190 700 193 000 193 000
9. Italia 195 661 181 000 150 901 154 861 167.727 146 769 143 315 160 558 155 583
10. Germania 104 276 110 130 105 297 95 278 119.384 146 500 173 230 158 658 150 854
11. Rusia 160 000 175 000 194 500 198 500 207.000 221 000 227 000 230 400 145 000
12. Maroc 105 000 90 000 70 000 90 500 106.100 118 600 112 000 100 000 130 000
13. Marea Britanie 37 300 36 600 41 400 47 100 52.500 68 600 73 900 87 200 87 200
14. Ucraina 32 072 34 518 36 600 32 900 36.400 46 200 47 800 40 700 52 900
15. Belarus 13 000 17 700 26 500 20 800 26.500 35 200 47 800 41 800 50 400
16. Columbia 19 142 22 934 23 362 26 591 23.228 17 913 32 884 40 710 43 920
17. Franţa 57 819 52 737 49 693 45 483 53.457 51 491 51 192 46 900 43 541
18. Olanda 34 000 34 000 35 000 36 000 37.000 39 000 39 200 43 000 41 000
19. Chile 21 000 22 500 24 000 25 000 25.200 28 000 33 000 40 000 40 000
20. Belgia 46 000 41 300 40 000 41 000 44.000 42 000 40 500 40 000 40 000
21. Iran 25 361 21 844 32 000 27 000 33.722 38 494 38 500 38 500 38 500
22. Serbia -- -- -- -- -- -- 35 457 33 129 37 924
23. Australia 14 772 15 556 20 088 22 834 20.219 23 737 27 336 28 559 28 559
24. România 11 700 18 400 16 850 14 900 14.533 18 158 21 612 16 496 21 233
25. Canada 23 810 23 740 25 068 24 521 24.619 22 299 24 982 23 902 20 366
 Producţia de căpşuni, în continuă ascensiune în Spania,
Republica Coreea şi SUA, în ultimele două decenii, a înregistrat
un declin în Japonia, Italia şi Polonia, după o creştere impresionantă
în anii ’70 şi 80’ ai secolului trecut (Hummer şi Hancock, 2009).
În România, producţia de căpşuni pentru anii 2009 - 2010 a
fost estimată la aproximativ 12.000 - 15.000 tone (lider în producţia
de căpşuni este judeţul Satu-Mare), după ce în 2008 a fost
înregistrată o producţie de 21.233 tone, ceea ce a situat ţara
noastra pe locul 24 între ţările cultivatoare de căpşun din lume
(Tabel 2).

17
 1.2. GENUL POTENTILLA

Vigoarea sporită, habitusul redus, toleranţa la condiţii

nefavorabile de mediu, propagarea pe cale vegetativă, rezistenţa
sporită la boli şi dăunători, precum şi perioada lungă de înflorire
reprezintă principalele raţionamente ale utilizării pe scară largă
a speciilor aparţinând genului Potentilla, în arhitectura peisageră
(Davidson, 1995).

1.2.1. Aria de răspândire

Genul Potentilla, comparativ cu genul Fragaria, este mult mai

bogat taxonomic, însumând peste 500 de specii de plante ierboase
perene sau rar anuale, precum şi câţiva arbuşti (Davidson, 1995),
originare din America de Nord, zonele muntoase ale Europei şi ale
Asiei de Nord. Ca şi la genul Fragaria, altitudinea nu împiedică
dezvoltarea plantelor în cele mai diverse zone de pe glob, fiind
întâlnite în regiunile joase, de câmpie şi până în zonele subalpine din
Siberia şi Groenlanda, sau în regiunilor muntoase de la tropice şi din
America de Sud. Cea mai mare diversitate de specii este
caracteristică nordului Eurasiei (Tomczyk şi Latté, 2009), în timp ce
vestul şi nord-vestul Mongoliei reprezintă centrul de origine al
evoluţiei genului Potentilla, în Asia (Soják, 2006). În plus, în literatura
ştiinţifică şi populară, sunt menţionate peste 160 de soiuri, dintre care
multe sunt hibrizi între diferite specii.
Speciile genului Potentilla formează o serie poliploidă paralelă
cu aceea a genului Fragaria (numărul de bază de cromozomi este
acelaşi, respectiv x=7), ce include specii diploide (2n=2x=14),
prezente în special în Asia (Elkington şi Woodel, 1963), tetraploide
(2n=4x=28), hexaploide (2n=6x=42) şi octoploide (2n=8x=56).

1.2.2. Taxonomie

Genul Potentilla (L.), cunoscut şi sub denumirea Dasiphora

(Raf.) sau Penthaphylloides (Duch.), este încadrat în tribul
Potentilleae, subfamilia Rosoideae, familia Rosaceae, ordinul
Rosales, subclasa Rosidae, clasa Magnoliopsida (Dicotyledoneae),
subîncrengătura Angiospermatophytina, încrengătura Spermatophyta
(Chaoluan şi colab., 2003; Tomczyk şi Latté, 2009).
18
 Încadrarea sistematică a genului Potentilla, renumit pentru
complexitatea sa taxonomică, a generat numeroase controverse
(Kalkman, 1968; Eriksson şi colab., 1998; Kamelin, 2001). Poziţia
taxonomică incertă a unui număr relativ mic de specii, este atribuită,
parţial, existenţei hibridării intra- şi interspecifice (Sánchez Agudo
şi colab., 1998; Guillén şi colab., 2005) sau hibridării intergenerice
(Mabberley, 2002). În urma studiilor efectuate prin analiza
comparativă a secvenţelor de ADN cloroplastic, au fost sugerate
o serie de modificări taxonomice în rândul speciilor genului Potentilla.
Astfel, Potentilla fruticosa, un arbust de grădină, a fost atribuit unui
gen diferit, devenind Dasiphora fruticosa. Unii taxonomişti au sugerat
încadrarea speciilor Potentilla palustris şi Potentilla salesowianum
în genul Comarum. De asemenea, a fost propusă încadrarea speciei
Potentilla tridentata în genul Sibbaldiopsis, ca Sibbaldiopsis
tridentata, iar a speciei Potentilla arguta în genul Drymocallis,
ca Drymocallis arguta (Eriksson şi colab., 2003). În prezent, aceste
modificări sunt acceptate de Sistemul de Informaţii pentru Integrare
Taxonomică (ITIS - Integrated Taxonomic Information System)
(http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt).

1.2.3. Etimologie şi simbolistică

Denumite popular “cinci-degete”, speciile genului Potentilla

sunt plante medicinale învăluite de mister şi magie, ceea ce se
regăseşte într-o armonie perfectă cu farmecul denumirii lor, afirma
Larry Mitich, în anul 1995. Acestea au fost creditate cu puteri
supranaturale şi au reprezentat ingrediente esenţiale în divinizarea
dragostei.
Genul Potentilla, cu o valoare economică, în general, redusă,
cuprinde specii cu veritabile virtuţi terapeutice, cu o îndelungată
utilizare în medicina tradiţională. Reputaţia speciei P. anserina,
ca având proprietăţi astringente, a determinat numele genului,
care este diminutiv al latinescului potent (puternic).
Extractele obţinute în special din organele aeriene, dar şi din
rizomi de la diverse specii de Potentilla, sunt utilizate în tratarea
inflamaţiilor şi cicatrizarea rapidă a rănilor, a diverselor forme
de cancer, a infecţiilor bacteriene sau virale, a diabetului zaharat,
a tulburărilor gastrointestinale, sau ca hepatoprotectoare şi anti-
oxidante.

19
 Majoritatea efectelor farmacologice sunt atribuite, în principal,
cantităţii crescute de taninuri şi într-o măsură mai mică conţinutului
de triterpenoide, prezente în toate organele plantelor. Utilizarea
pulberilor, tincturilor sau a extractelor obţinute din diferite organe
poate fi considerată sigură, studii relativ recente evidenţiind
eficienţa acestora, precum şi absenţa unor eventuale efecte toxice
(Tomczyk şi colab., 2008; Shushunov şi colab., 2009).

1.3. COMPATIBILITATEA DE HIBRIDARE ÎNTRE SPECIILE

GENURILOR FRAGARIA ŞI POTENTILLA

În natură, barierele externe (separarea fizică a populaţiilor

în timp şi spaţiu, adaptarea populaţiilor la nişe ecologice specifice
sau combinaţii de bariere care produc discontinuitate între populaţii),
consolidate de barierele interne (pre-zigotice, post-zigotice, precum
şi viabilitatea scăzută sau sterilitatea hibrizilor), pot preveni fluxul
de gene între taxoni înrudiţi (Hadley şi Openshaw, 1980).
Galletta şi Maas (1990) au apreciat că schimbul de gene între
genurile Fragaria şi Potentilla este limitat de dimorfismul sexual
al unora dintre specii, şi de incompatibilitatea parţială sau totală
de încrucişare, atât în cazul hibridărilor heteroploide, cât şi în cazul
celor homoploide. Mai mult, hibridarea intergenerică este complicată
şi de nivelele variate de ploidie ale speciilor şi de originea hibridă
a unora dintre acestea. Cu referire la hibridarea intergenerică
Fragaria şi Potentilla, Marta şi colab. (2004) au observat probleme
de incompatibilitate manifestate prin absenţa fructelor sau fructe
cu un număr limitat de seminţe, unele neviabile, ceea ce a împiedicat
studiul relaţiilor de compatibilitate între speciile genitoare.

1.3.1. Aplicaţii ale hibridărilor intergenerice Fragaria ×

Potentilla

Anii ‘20 ai secolului trecut au fost marcaţi de apariţia în

Germania, la Dresden-Pillnitz, a primelor soiuri de căpşun create ca
rezultat al lucrărilor de ameliorare a căpşunului cultivat; de atunci,
scopurile selecţiei, precum şi metodologia, s-au schimbat continuu,
în funcţie de cerinţele pieţei, ale industriei de prelucrare a fructelor şi
ale consumatorilor.

20
 În literatura internaţională sunt semnalate frecvent rezultatele
programelor de ameliorare a căpşunului culivat, precum şi tendinţele
în evoluţia sortimentului. Activitatea de ameliorare s-a intensificat în
ultimii 50 de ani, relevant fiind, în acest sens, numărul mare
de soiuri noi omologate în cele peste 35 de ţări, în care se
desfăşoară programe de ameliorare varietală.
Mult timp, variabilitatea existentă în cadrul fondului
de germoplasmă cultivat a furnizat aproape integral baza genetică
pentru ameliorarea căpşunului, dar în prezent este general
recunoscut faptul că, speciile sălbatice înrudite, aparţinând genului
Fragaria, precum şi altor genuri din familia Rosaceae, reprezintă
o sursă bogată de caractere valoroase şi că, adesea, nivelul variaţiei
genetice pentru un caracter dat este mai ridicat în germoplasma
“exotică” (Paterson şi colab., 1991; Zamir, 2001; Holland, 2004;
Dirlewanger şi colab., 2004; Ulrich şi colab., 2007; Coman și
Popescu, 2009). În plus, pe lângă caracterele agronomice valoroase,
speciile sălbatice manifestă multe proprietăţi importante pentru
supravieţuirea în mediul lor natural. Întrucât aceste proprietăţi
contrastează frecvent cu productivitatea, amelioratorii ezită asupra
utilizării hibridărilor intergenerice, existând teama că separarea
caracterelor nedorite de însuşirile valoroase va fi foarte dificilă. În
acest context trebuie menţionat că, hibridarea somatică asimetrică şi
dihibridarea reprezintă tehnologii importante pentru transferul
diverselor caractere de rezistenţă la factori de stres, de la speciile
sălbatice la cele cultivate (Popescu, 1998; Rákosy-Tican, 1998).
Totuşi, în ultimii ani, ponderea strategiilor de ameliorare
genetică a soiurilor cultivate de căpşun, implicând hibridarea
intergenerică, a fost în evidentă creştere în programele de ameliorare
a genotipurilor de căpşun. Astfel, dată fiind compatibilitatea sexuală
între unele dintre speciile genurilor Fragaria şi Potentilla, pe
parcursul ultimelor patru decenii amelioratorii de căpşun au făcut
numeroase încercări de obţinere de hibrizi intergenerici Fragaria ×
Potentilla, care să poată fi utilizaţi ca genitori pentru crearea de soiuri
comerciale de căpşun mai bine adaptate la diverse condiţii de mediu,
cu rezistenţă sporită la boli şi dăunători, cu productivitate ridicată,
cu tije fructifere rezistente la frângere sau care să combine valoarea
decorativă a florilor cu producerea de fructe comestibile sau care
să fie utilizaţi în obţinerea haploizilor, care să faciliteze generarea
genotipurilor homozigote.

21
 1.3.1.1. Obţinerea de forme haploide de Fragaria

Rezultatele hibridărilor intergenerice realizate până în prezent

au demonstrat că această metodă poate avea aplicabilitate
potenţială largă pentru transferul unor caracteristici importante
ale plantei (vigoarea de creştere, habitusul inflorescenţei, rezistenţa
la agenţi patogeni, etc.) de la speciile de Potentilla, la soiurile
cultivate de căpşun. Totuşi, întrucât incorporarea unui caracter definit
pe calea hibridării intergenerice implică reîncrucişări repetate
şi selecţia într-un număr foarte mare de generaţii segregante,
aplicaţia practică cea mai atrăgătoare pentru amelioratori, a fost
aceea a utilizării speciilor de Potentilla pentru obţinerea de forme
haploide de căpşun (Jelenkovic şi colab., 1984). Având în vedere
gradul ridicat de heterozigoţie al căpşunului cultivat, şi în consecinţă,
segregarea caracterelor la descendenţi, obţinerea de haploizi prin
hibridări îndepărtate, urmate de poliploidizare, reprezintă o metodă
oportună de a dobândi genotipuri homozigote. Utilizarea unor astfel
de genotipuri oferă avantajul unei segregări anticipabile în generaţiile
următoare şi poate constitui un fundament important în procesul
de ameliorare a căpşunului.
Odată cu disponibilitatea metodelor de cultură in vitro, a crescut
interesul pentru obţinerea de haploizi, în scopul ameliorării plantelor
de cultură. Prin cultura de antere, haploizii pot fi obţinuţi în câteva
săptămâni, iar prin dublarea numărului lor de cromozomi, se obţin
diploizi homozigoţi, într-o singură generaţie. Polenul produs de astfel
de plante diploide homozigote oferă avantajul că este rezultatul unei
segregări meiotice normale (Collins şi Sadasivaiah, 1972) şi că nu
a pierdut unele caractere dorite, ca urmare a segregării, iar prezenţa
unui singur set de cromozomi la haploizi facilitează izolarea
mutantelor.
Exceptând cultura in vitro de antere, hibridările intergenerice
Fragaria x Potentilla reprezintă o altă cale de obţinere de haploizi,
prin inducerea formării de embrioni haploizi, din ovule nefecundate,
în urma polenizării cu Potentilla (Niemirowicz-Szczytt, 1984). Sayegh
şi Hennerty (1989) au obţinut haploizi din embrioni recuperaţi după
polenizarea căpşunului cu Potentilla fruticosa. Astfel de indivizi pot fi
folosiţi pentru manipularea nivelului de ploidie în cadrul genului
Fragaria (Niemirowicz-Szczytt, 1990).

22
 Barrientos şi Bringhurst (1973, 1974) au fost primii care au
raportat obţinerea unui tetrahaploid (haplo-octoploid) aparţinând
soiului ‘Tioga’, ca rezultat al hibridării cu Potentilla anserina.
Mai mult, Hughes şi Janick (1974) au subliniat faptul că,
nici unul dintre descendenţii rezultaţi în urma hibridării dintre Fragaria
× ananassa (genitorul matern) şi Potentilla anserina (genitorul patern)
nu a fost hibrid intergeneric, aceştia fiind în majoritate polihaploizi
de căpşun (2n=28). Numărul tetrahaploizilor obţinuţi a fost foarte mic
(numai câteva plante) şi aceştia nu au putut fi folosiţi pentru
investigaţii ulterioare, fie datorită degenerării (Hughes şi Janick,
1974), fie datorită infertilităţii (Barrientos şi Bringhurst, 1973, 1974).
De asemenea, un procent ridicat de polihaploizi a fost raportat şi din
hibridările cu Potentilla fruticosa (2n=14), deşi cea mai parte
a descendenţilor care au supravieţuit au fost hibrizi intergenerici.
Jelenkovic şi colab. (1984) şi ulterior, Niemirowicz-Szczytt (1987)
au demonstrat că hibridările intergenerice Fragaria × Potentilla oferă
o cale cu şanse mari de reuşită, pentru inducerea şi selecţia
de genotipuri haploide de căpşun, a căror valoare potenţială pentru
programele moderne de ameliorare varietală este unanim
recunoscută.
Obţinerea de plante tetrahaploide, dar şi cu diferite alte nivele
de ploidie, în urma hibridării Fragaria × Potentilla, a permis
formularea ipotezei că embrionii acestor plante s-au format printr-un
proces de apomixie. Pentru că, iniţial, s-a sugerat că apomixia nu are
un rol important în reproducerea căpşunului (Berezenko, 1979),
varietăţile de căpşun ‘Freja’, ‘Sonja’, ‘Mieze Schindler’ şi ‘Reine des
Précoce’, reprezentând genitorii materni, au fost polenizate cu polen
de la patru genitori paterni, reprezentaţi de speciile Fragaria ×
ananassa, varietatea ‘Redgauntlet’, Potentilla geoides, Potentilla
rupestris şi Potentilla fruticosa, constatându-se că au loc procesele
de aposporie, diplosporie şi poliembrionie falsă, ca forme
de apomixie (Niemirowicz-Szczytt, 1984b). Numeroasele cazuri de
poliembrionie falsă, prin care s-au format embrionii gemeni
şi numărul mare de tetrahaploizi obţinuţi, au sugerat dezvoltarea
partenogenetică a embrionilor, în conexiune cu dezvoltarea
pseudogamă a semințelor. Rezultatele acestor studii au fost în
concordanţă cu opinia lui Berezenko (1979), că apomixia reprezintă
un proces nesemnificativ în reproducerea căpşunului, însă procesele
de poliembrionie falsă influenţează nivelul de ploidie, în special
al tetrahaploizilor.
23
 Implementarea unor astfel de tehnici de obţinere de haploizi,
prin hibridări intergenerice Fragaria × Potentilla, necesită o sursă
de haploizi sigură şi heterogenă din punct de vedere genetic
(Jelenkovic şi colab., 1984). Totodată, genotipurile utilizate ca
genitori matern şi patern, trebuie să aibă capacitatea de a produce
haploizi, frecvenţa haploizilor fiind strâns dependentă de genotip
(Peloquin şi colab., 1966; Chase, 1969).
În plus, factorii letali, care sunt comuni pentru multe genotipuri
octoploide cultivate, pot împiedica dezvoltarea embrionilor haploizi.
De asemenea, polenizarea târzie, după îndepărtarea anterelor din
floare, influenţează tipul descendenţilor, în sensul scăderii frecvenţei
haploizilor. Apariţia haploizilor poate fi influenţată şi de anumite
deficienţe nedeterminate în tehnologia de extracţie, depozitare
şi germinare a seminţelor conţinând embrioni haploizi, acestea fiind
eliminate selectiv în diferite stadii ale manipulării (Jelenkovic şi colab.,
1984).

1.3.1.2. Obţinerea de hibrizi intergenerici Fragaria ×

Potentilla

Dacă la începutul secolului al XX-lea, mai ales ca rezultat

al pasiunii cultivatorilor amatori şi nu datorită lucrărilor sistematice
de ameliorare, în cele câteva ţări cultivatoare (Franţa, Anglia, Olanda,
Elveţia, Germania, SUA, Japonia) existau câteva zeci de soiuri
de căpşun, în prezent, lista soiurilor selecţionate sau create
de-a lungul istoriei de două secole şi jumătate a căpşunului cultivat
este impresionantă şi este completată armonios de varietăţile
de căpşun ornamental.
Hibridările intergenerice între diverse specii de Fragaria
şi de Potentilla, au fost realizate în scopul ameliorării căpşunului
cultivat Fragaria × ananassa, prin introgresia genelor de la specii
de Potentilla (Jones, 1955), dar succesul multor astfel de încercări
a fost limitat de producţia, în număr mare, de hibrizi sterili. Potentilla
fruticosa, un arbust cu tulpina lemnoasă, care poate atinge o înălţime
de 1-2 metri, a fost considerată o posibilă sursă de gene pentru
ameliorarea morfologiei naturale a căpşunului. Deşi considerate,
la un moment dat, promiţătoare, rezultatele nu au confirmat
aşteptările, hibrizii obţinuţi fiind nu numai cu valoare biologică de
ansamblu scăzută, dar şi sterili în majoritatea cazurilor.
24
 Hibridările intergenerice, în cadrul familiei Rosaceae, raportate
încă de la începutul secolului trecut, au condus la iniţierea unor
programe ample de ameliorare a căpşunului cultivat, prin introgresia
de gene de la specii de Potentilla. Wolf (1908) a obţinut hibrizi între
Duchesnea indica (8x) şi Potentilla reptans L. (2x), Mangelsdorf
şi East (1927) au raportat primul succes al unei hibridări inter-
generice Fragaria vesca (2x) × Potentilla nepalensis (6x), obţinând
doi descendenţi cu viabilitate scăzută, precum şi hibrizi între Fragaria
vesca (2x) şi Duchesnea indica (8x), care nu au ajuns la maturitate.
Hibridarea intergenerică Fragaria × Potentilla a fost în amănunt
studiată de către Darrow (1927) şi Ichijima (1926), iar mai târziu
de Ellis (1958 a, b).
Jones (1955) a obţinut 639 de descendenţi din hibridarea
speciilor Fragaria vesca (2x) şi Potentilla spp. (2x), dar niciunul nu a
supravieţuit. Ellis (1962) a raportat producerea de hibrizi cu diferite
nivele de ploidie, prin hibridare intergenerică Fragaria × Potentilla,
majoritatea neviabili, sau sterili (în cazul celor viabili).
În urma hibridării dintre Fragaria moschata (6x) şi Potentilla
fruticosa L. (2x), Asker (1970) a obţinut un număr mic de hibrizi,
în timp ce MacFarlane Smith şi Jones (1985) au obţinut doar nouă
plante dintr-un număr mare de seminţe, dintre care patru (cu un
număr previzibil de cromozomi, 4x) erau viguroase, dar sterile,
iar celelalte cinci au murit înainte de înflorire. În contrast, Barrientos
şi Bringhurst (1973) au raportat hibrizi 10x fertili, produşi prin
hibridarea între Fragaria chiloensis (8x) şi Potentilla glandulosa
(Lindl.) Rydb. (2x). În încercările nereuşite, cauza insuccesului în
producerea de hibrizi intergenerici fertili nu a fost studiată.
În 1984, Niemirowicz-Szczytt a relansat studiul hibridării inter-
generice, utilizând specii cu diverse grade de ploidie din genurile
Fragaria şi Potentilla (Tabel 3). Justificarea alegerii formelor femele
ca aparţinând genului Fragaria, a constat în evitarea castrării florilor,
precum şi în posibilitatea efectuării polenizărilor repetate într-o
perioadă relativ scurtă de înflorire. Polenul provenit de la genitorii
paterni, precum Potentilla geoides şi Potentilla glandulosa, a stimulat
formarea unui număr mare de seminţe cu o capacitate ridicată
de germinaţie, dar nu a avut un efect favorabil asupra viabilităţii
lăstarilor.
Sayegh şi Hennerty (1993) au efectuat polenizări între Potentilla
fruticosa (2x) şi 11 soiuri de Fragaria × ananassa (2n=8x=56),
urmate de recuperarea embrionilor.
25
Tabelul 3. Lista speciilor aparţinând genului Potentilla, utilizate în
hibridări cu specii ale genului Fragaria şi numărul lor de cromozomi
(după Niemirowicz-Szcytt, 1987).

Potentilla spp. Numărul de cromozomi (2n)

Potentilla adsharica Somm. şi Lev.
ex Keller
Potentilla ambigens Greene
Potentilla andicola Benth.
Potentilla argentea L.
Potentilla arguta Pursh.
Potentilla aurea L.
Potentilla chrysantha Trev.
Potentilla clusiana Jacq.
Potentilla fragiformis Wild
Potentilla fruticosa L.
Potentilla geoides Bleb.
Potentilla glandulosa Lind.
Potentilla hippiana Lehm.
Potentilla nepalensis Hook.
Potentilla nitida L.
Potentilla norvegica L.
Potentilla pupureoides
Potentilla rupestris L.
Potentilla thuringiaca Bernh. ex
Link.
2n=6x=42, 2n=8x=56
2n=2x-2=82
(Goswami şi Matfield, 1975)
2n=6x=42
2n=2x=14, 2n=4x=28, 2n=5x=35,
2n=6x=42, 2n=8x=56, 2n=9x=63
2n=2x=14
2n=2x=14, 2n=4x=28, 2n=5x=35,
2n=6x=42, 2n=8x=56, 2n=10x=70
2n=4x=28, 2n=6x=42, 2n=8x=56
2n=6x=42
2n=6x=42, 2n=8x=56
2n=2x=14, 2n=4x=28, 2n=6x=42
2n=2x=14
2n=2x=14
2n=6x=42, 2n=10x=70, 2n=11x=77,
2n=12x=84, 2n=14x=98
2n=2x=14, 2n=6x=42
2n=2x=14, 2n=6x=42
2n=6x=42, 2n=8x=56, 2n=10x=70
Fără informaţii disponibile
2n=2x=14
2n=6x=42
(Nicolè şi colab., 2007)

Deoarece pe parcursul secolului trecut s-a raportat adesea

că formarea descendenţei, în urma polenizărilor intraspecifice sau
interspecifice la căpşun, este consecinţa unor procese apomictice
(Manglesdorf şi East, 1927; East, 1930; Aalders, 1964; Sukhareva,
1970), iar haploidia era considerată o formă particulară de apomixie
la Fragaria vesca (Islam, 1961), în anul 1995, Baturin şi Sukhareva,
au utilizat hibridarea intergenerică pentru a determina potenţialul
apomictic la Fragaria × ananassa.

26
Fig. 2. Fragaria vesca (sus) şi Fragaria chiloensis (jos) – genitori materni
ai unora dintre soiurile de căpşun ornamental.

27
Fig. 3. Fragaria x ananassa (sus) - genitor matern al majorităţii soiurilor
de căpşun ornamental; Potentilla palustris (jos) – genitor patern
al tuturor soiurilor de căpşun ornamental.

28
Fig. 4. Variaţia culorii florilor la soiurile de căpşun ornamental este dependentă
de specia de Fragaria utilizată ca genitor matern (sus: soiul “Pink Panda”;
jos: soiul “Lipstick”)

29
 Folosind diferite specii de Potentilla ca genitori paterni,
au constatat că descendenţa hibridă este eliminată, rămânând doar
descendenţii rezultaţi prin procese apomictice. Autorii sugerează
că prin reproducere apomictică sunt eliminate majoritatea bolilor,
simptomele de îmbătrânire, şi modificările clonale acumulate
de genitorul matern ca urmare a propagării vegetative intensive
şi de lungă durată. Descendenţa are acelaşi număr de cromozomi
ca şi genitorul matern, fenotipul este asemănător, cu unele variaţii
individuale ale caracterelor cantitative şi calitative, datorită auto-
segregării.
Variabilitatea descendenţei depinde de forma de reproducere
apomictică şi poate constitui baza pentru selecţia unor fenotipuri
comerciale, mai productive şi mai bine adaptate la condiţiile
de mediu (Baturin şi colab., 1995; Sukhareva şi colab., 2000).
În cazul hibridărilor intergenerice Fragaria vesca × Potentilla
fruticosa, incompatibilitatea existentă după fecundaţie, manifestată
fie prin absenţa germinării seminţelor, fie printr-o viabilitate scăzută
a lăstarilor, a fost depăşită prin dezvoltarea unui sistem eficient
de cultură in vitro pentru recuperarea embrionilor hibrizi. Plantele
hibride nu au fost obţinute direct prin recuperarea embrionilor,
ci prin regenerare din calus derivat din cotiledoane, constatându-se
că regenerarea lăstarilor se produce, mai frecvent, la capătul
proximal al cotiledonului. Tehnica permite multiplicarea rapidă a unor
embrioni, în unele cazuri fiind obţinuţi mai mult de 100 de lăstari per
embrion, demonstrându-se utilitatea acestei tehnici în producerea
de hibrizi intergenerici (Silva şi Jones, 1996).
Primul dintre hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla
cu valoare ornamentală a fost obţinut în anul 1989 în Anglia de către
J. Ellis, patentat în SUA sub denumirea ‘Frel’ (Patent PP07598) şi
cunoscut în prezent sub denumirea ‘Pink Panda’ (Fig. 4), iar cel de al
doilea în anul 1993, patentat sub denumirea ‘Serenata’ (Patent
PP08801).
În ultimul deceniu, gama hibrizilor intergenerici Fragaria ×
Potentilla a crescut considerabil, la ‘Pink Panda’ (‘Frel’) şi ‘Serenata’
adăugându-se numeroase soiuri sau selecţii ornamentale de
Fragaria (‘Lipstick’, ‘Red Ruby’, ‘Rosalyne’, ‘Rosseberry’, ‘Tarpan’,
‘Tristan’, ‘Roman’, ‘Pikan’, ‘Merlan’, ‘Florian’ şi ‘Pretty in Pink’), care
combină valoarea decorativă dată de frumuseţea florilor şi perioada
prelungită de înflorire (mai-octombrie) cu producerea de fructe
comestibile.
30
 Totodată, sunt în curs de desfăşurare o serie de proiecte
în care se urmăreşte ameliorarea genotipurilor de căpşun ornamental,
în special, în sensul creşterii productivităţii. Speciile de Fragaria
folosite până în prezent ca genitori materni în hibridările cu Potentilla
palustris (Fig. 3) au fost F. vesca, F. chiloensis şi F. x ananassa
(Fig. 2-3).
Mai recent au fost obţinute primele varietăţi de căpşun
ornamental de tip day-neutral, cum sunt ‘Roseberry’ şi ‘Rosalyne’
(Khanizadeh şi colab., 2002).
Varietatea ‘Rosalyne’ (SJ09620-76), obţinută prin hibridarea
dintre ‘Fern’, ca genitor matern, şi SJ9616-1 × ‘Pink Panda’,
ca genitor patern, înfloreşte pe parcursul întregului sezon estival,
produce fructe de mărime mică până la medie şi este caracterizată
de rezistenţă la Mycosphaerella fragariae şi Diplocarpon earliana.
Varietatea ‘Roseberry’ este obţinută prin hibridarea dintre
genitorul matern SJ8518-11 (Raritan × K74-12) şi genitorul patern
SJ9616-1 × ‘Pink Panda’. Această varietate este caracterizată
de capacitatea de a forma flori şi fructe pe stoloni, chiar înainte
ca aceştia să înrădăcineze şi, de asemenea, manifestă rezistenţă
la Diplocarpon earliana şi Mycosphaerella fragariae.
Pentru stabilirea unui fundament în obţinerea de noi soiuri
de căpşun ornamental, ce combină producerea de fructe comestibile
cu frumuseţea florilor roz sau roşii, precum şi cu număr dublu
de petale, Yu-Hua şi colaboratorii (2005) au efectuat hibridări între
genotipul ‘Pink Panda’ şi soiurile de căpşun ‘Tudla’, ‘Kunouwase’
şi ‘Kinuama’. Raportul flori roşii / flori albe în descendenţă a fost 1:2,
culoarea roşie a florilor prezentând diferite nivele de intensitate.
Genotipurile de căpşun ornamental cu cea mai largă răspândire
sunt: ‘Pink Panda’, ‘Lipstick’ (Fragaria ‘Stickbolwi’), ‘Red Ruby’
(Fragaria ananassa ‘Franor’ - Patent PP12169, USA) şi ‘Serenata’,
care împreună cu genotipurile mai nou omologate, precum
‘Rosalyne’, ‘Rosseberry’ (Khanizadeh şi colab., 2002), ‘Tarpan’,
‘Tristan’, ‘Roman’, ‘Pikan’, ‘Merlan’, ‘Rosana’, ‘Pink Panther’, ‘Viva
Rosa’, ‘Wild Fire’, ‘Florian’ şi ‘Pretty in Pink’, câştigă atenţia
amelioratorilor, în cadrul programelor susţinute de perfecţionare a
calităţilor fructelor genotipurilor de căpşun ornamental (Kuznetsova
şi colab., 2009) sau de ameliorare a principalelor caracteristici
ornamentale, precum înflorirea timpurie, habitusul compact şi flori
atractive, precum şi capacitatea de reproducere prin seminţe
(Bentvelsen şi Bouw, 2006).
31
 2. ÎNMULŢIREA COMERCIALĂ A CĂPŞUNULUI

Dintre principalele metode de înmulţire comercială a căpşunului,

respectiv propagarea convenţională prin stoloni, în câmp,
şi micropropagarea, în laborator, cea de-a doua este considerată cea
mai eficientă în obţinerea de plante sănătoase, dar există numeroase
controverse în ceea ce priveşte randamentul plantelor micro-
propagate şi calitatea fructelor (Damiano, 1980; Cameron şi colab.,
1989). Multiplicarea in vitro a căpşunului prin tehnica culturii
de meristeme este o aplicaţie de rutină în toate statele mari
cultivatoare de căpşun (Jungnickel, 1988; Rosati, 1993), în condiţiile
în care sănătatea materialului săditor (liber de virusuri) reprezintă
o cerinţă esenţială, iar ritmul de replantare sau de înlocuire a soiurilor
implică disponibilitatea unui număr de plante de ordinul sutelor
de mii sau milioanelor. Unii autori au menţionat că plantele
micropropagate au avut o productivitate mai ridicată, au format un
număr mai mare de filamente şi stoloni, lungimea peţiolului şi
numărul inflorescenţelor au fost amplificate (Swartz şi colab., 1981;
Thuesen, 1984; Theiler-Hedtrich şi Woltenberger, 1987; Cameron
şi colab., 1989; Dijkstra, 1994; López-Aranda şi colab., 1994;
Zebrowska şi colab., 2003; Litwińczuk, 2004; Mohan şi colab., 2005)
şi au manifestat rezistenţă sporită la temperaturi scăzute din timpul
iernii (Dalman şi Malata, 1997; Palonen şi Lindén, 2001), dar aceste
efecte se diminuează sau dispar în generaţiile succesive cultivate în
câmp (Szczygiel şi colab., 2002).
În programele moderne de ameliorare a plantelor, tehnicile
de cultură in vitro reprezintă căile cele mai importante de introducere
a unor caractere noi în plantele selecţionate, de multiplicare
a selecţiilor de elită şi de obţinere a varietăţilor valoroase într-un timp
scurt (Popescu, 1998; Taji şi colab., 2002).
Capacitatea de reproducere vegetativă şi productivitatea
potenţială a plantelor sunt puternic influenţate de condiţiile de mediu,
printre care se regăsesc mărimea vasului şi perioada mai scurtă
de înrădăcinare, acestea fiind corelate pozitiv cu o productivitate mai
ridicată. Utilizate împreună cu metodele clasice de înmulţire, tehnicile
in vitro de proliferare şi regenerare de lăstari pot accelera
dezvoltarea programelor de ameliorare; pe de altă parte, abilitatea
de regenerare de lăstari este crucială pentru aplicarea cu succes
a metodelor de cultură in vitro (Isac și colab., 1994; Cao şi
Hammerschlag, 2000).
32
 2.1. ÎNMULŢIREA PRIN METODE CONVENŢIONALE

Majoritatea speciilor genului Fragaria, inclusiv căpşunul cultivat,

sunt caracterizate de capacitatea de reproducere, atât pe cale
sexuală, prin seminţe, cât şi pe cale vegetativă, prin filamente
şi stoloni. Distribuţia energiei în cadrul celor două căi de reproducere
prezintă importanţă deosebită, datorită frecvenţelor diferite ale noilor
combinaţii genetice care rezultă din cele două forme de reproducere.
Mai mult, căpşunul prezintă capacitatea de a adopta o strategie
reproductivă diferită, în funcţie de densitatea populaţiei, înmulţirea
prin seminţe fiind o alternativă eficientă, în populaţiile cu densitate
mare (Abrahamson, 1975).
Reproducerea prin intermediul lăstarilor oferă descendenţei
oportunitatea valorificării resurselor mediului, în habitatele cu condiţii
severe, stolonii dezvoltând clone care exploatează selectiv mediul
(Silander, 1985). Lovett Doust (1981) a apreciat că morfologia
clonală poate fi de tip “guerilla” şi “phalanx”. Morfologia “guerilla” este
caracteristică plantelor clonale cu răspândire vastă prin intermediul
stolonilor, aşa cum sunt speciile genului Fragaria, iar morfologia
“phalanx” descrie plantele clonale ce ramân grupate în pâlcuri.
Creşterea clonală prin ramificaţii laterale, care devin capabile
de supravieţuirea independentă, poate influenţa în mod favorabil
creşterea diversităţii genetice a unei populaţii (Cook, 1983; Handel,
1985).

2.1.1. Înmulţirea prin filamente şi stoloni

Înmulţirea convenţională a speciilor genului Fragaria este

realizată, în general, asexual, prin formarea stolonilor de către planta
mamă (genet), care poate susţine câteva plante noi, cunoscute
şi sub denumirea de rameţi, sau sexual, prin seminţe. Înmulţirea
căpşunului prin seminţe este o practică mai puţin comună, ca urmare
a nivelului ridicat de heterozigoţie, ce caracterizează căpşunul
cultivat.
Înmulţirea prin filamente şi stoloni este o metodă frecventă
de înmulţire vegetativă a căpşunului, cu aplicabilitate largă în pro-
ducţie. În funcţie de cantitatea de stoloni ce trebuie obţinută, aceştia
pot proveni din plantaţii-mamă (stoloniere) sau din plantaţii
de producţie.

33
 Înfiinţarea stolonierelor se realizează numai cu material săditor
autentic, liber de virusuri, obţinut, de obicei, prin culturi in vitro.
Necesitatea plantaţiilor mamă rezidă din faptul că, plantele destinate
producţiei de fructe nu pot asigura stoloni viguroşi şi în cantitate
suficientă, ele fiind slăbite în urma procesului de fructificare.
Când se recurge la înfiinţarea plantaţiilor-mamă, prin lucrările
de întreţinere, se asigură stimularea formării stolonilor şi se suprimă
de timpuriu inflorescenţele, evitându-se astfel competiţia dintre fructe
şi stoloni. Mai mult, stolonii recoltaţi din plantaţiile de producţie pot
fi purtători ai diferiţilor agenţi patogeni, care slăbesc potenţialul
de fructificare.
Formarea lăstarilor este puternic influenţată de factorii de mediu,
cei mai importanţi fiind lungimea zilei şi temperatura (Smeets
şi Kronenberg, 1955; Smeets, 1980; Sønsteby, 1997; Black şi colab.,
2005; Zhang şi colab., 2005), fertilizarea, mobilizarea şi umiditatea
solului (Tworkoski şi colab., 2001) şi vârsta plantelor-mamă.
Aportul exogen de citokinine şi gibereline stimulează formarea
stolonilor la căpşun (Braun şi Kender, 1985), în timp ce asimilarea
deficitară a carbonului conduce la formarea unui număr mare
de stoloni, dar cu lungime mică. Mohan şi colab. (2005) au semnalat
faptul că plantele obţinute prin cultura de ţesuturi produc un număr
mai mare de filamente într-un timp relativ scurt.
Lungimea filamentelor şi numărul rameţilor formaţi de plantele
de căpşun sunt caracteristici importante pentru productivitatea
pepinierelor (Bish şi colab., 1997). Deşi s-a raportat că producţia
de lăstari, prin filamente, contribuie în proporţie de 90%
la multiplicarea căpşunului în Olanda, soiul ‘Elsanta’ a fost identificat
ca fiind susceptibil la mai multe boli fungige (Dijkstra, 1993). Astăzi,
tehnicile de cultură in vitro de celule şi ţesuturi au monopolizat
multiplicarea în scop comercial a plantelor de căpşun.

2.1.2. Înmulţirea prin seminţe

Multiplicarea prin seminţe este o metodă convenabilă pentru

obţinerea unui număr mare de plante, cu o cheltuială minimă,
dar atingerea maturităţii plantelor implică o perioadă mai lungă
de timp comparativ cu propagarea pe cale vegetativă. Mai mult,
descendenţa obţinută din germinarea seminţelor este caracterizată
de variaţie genetică.

34
 În 1976 a fost iniţiat un program de ameliorare a căpşunului
cultivat, al cărui scop a fost obţinerea de soiuri ce pot fi propagate
prin seminţe. A fost investigată în primul rând specia diploidă
Fragaria vesca L. (2n=14), dar variaţia genetică la nivelul mărimii
fructelor, precum şi al altor caracteristici importante, a redus drastic
optimismul amelioratorilor în ceea ce priveşte perspectivele unor
astfel de soiuri. La specia octoploidă, Fragaria × ananassa, variaţia
genetică a fost mai redusă, demonstrându-se că este posibil un nivel
suficient de uniformitate la liniile parentale consangvinizate, în timp
ce hibrizii F1 manifestă un nivel ridicat de uniformitate (Bentvelsen şi
colab., 1997).
Majoritatea soiurilor de căpşun se caracterizează printr-un grad
foarte ridicat de heterozigoţie, fapt care determină o largă
variabilitate a descendenţilor. În mod inevitabil, sistemele de
ameliorare a genotipurilor de căpşun sunt puternic dependente de
limitările asociate cu gradul ridicat de heterozigoţie, şi prin urmare cu
heritabilitatea complexă a numeroase caractere importante. Gradul
înalt de homozigoţie al unor soiuri diploide vechi, precum ‘Baron
Solemacher’, ‘Rügen’, ‘Alexandria’ sau introducerea altora noi, cum
sunt ‘Finija’ şi ‘Mari’, aparţinând speciei Fragaria vesca, care oferă
posibilitatea propagării uşoare prin seminţe, explică menţinerea lor în
cultură, alături de soiurile aparţinând speciei Fragaria × ananassa.
Deşi, propagarea prin seminţe permite conservarea naturală
a resurselor genetice, reprezentând pentru unele varietăţi o metodă
sigură şi eficientă, înmulţirea prin seminţe, în scop comercial,
se foloseşte rar în vederea obţinerii de noi soiuri sau la soiurile
remontante, care formează un număr redus de stoloni sau
nu formează deloc. Seminţele sunt mici (un gram conţinând
840-1200 seminţe), cu putere de răsărire slabă şi o capacitate
germinativă de 2-3 ani.
Achenele se recoltează în special din partea bazală sau
mediană a fructelor mature (Hanke, 1993), iar după spălare se pun
la uscat la umbră, pentru câteva zile, şi apoi se păstrează în condiţii
optime. Cerinţele pentru germinarea seminţelor variază larg în cadrul
genului Fragaria (în funcţie de specie, locaţie, condiţiile de păstrare
anterioare şi condiţiile de mediu pentru germinare).
În condiţiile culturii in vitro capacitatea germinativă a achenelor
este mai ridicată în comparaţie cu condiţiile de ceaţă, în seră (Raizi,
2004). Dacă se recurge la germinarea in vitro a seminţelor, în scopul
obţinerii unui material vegetativ steril (El Hamdouni şi colab., 1999),
35
păstrarea la rece a achenelor pentru un interval de timp cât mai scurt
(Adam şi Wilson, 1967) poate creşte potenţialul germinativ (Hanke,
1993; Yamakawa şi Noguchi, 1994; Kretschmer şi Krüger-Steden,
1997). Dintre condiţiile de mediu care influenţează capacitatea
germinativă, nivelul crescut de umiditate, (Iyer şi colab., 1975),
expunerea la lumină, în special lumină roşie (Hanke, 1993;
Kretschmer şi Krüger-Steden, 1997), pretratamentul osmotic
(Guttridge şi Bright, 1978), temeperatura de 30˚C în timpul zilei
şi respectiv 20˚C pe parcursul nopţii (Chellappa, 1959), tratamentul
cu apă oxigenată (Nakamura, 1972), acid giberelic (Thompson, 1969;
Nakamura, 1972), acid nitric, acid clorhidric, acid azotic sau acid
sulfuric (Yamakawa şi Noguchi, 1994; El Hamdouni şi colab., 2001)
sunt menţionate ca favorizând viteza şi rata de germinare a
achenelor. În schimb, salinitatea ridicată a mediilor de cultură in vitro
diminuează potenţialul germinativ al achenelor (Iapichino şi D'Anna,
2003; Dziadczyk şi colab., 2005).

2.2. ÎNMULŢIREA PRIN METODE NECONVENŢIONALE

Tehnicile de cultură in vitro au depăşit barierele timpului,

trecând mai bine de un secol de la cercetările vizionare ale lui
Haberlandt (1902), care a experimentat, pentru prima dată, cultura
de celule şi ţesuturi in vitro. După descoperirea fitohormonilor
(a auxinelor în anii ‘30 şi a citochininelor în anii ‘50 ai secolului trecut),
a regulatorilor sintetici de creştere şi diferenţiere celulară şi după
formularea compoziţiilor unor medii nutritive cu aplicabilitate amplă,
tehnicile de cultură in vitro au acaparat în mod arbitrar şi exclusiv
propagarea în masă şi ameliorarea multor speciilor de plante.

2.2.1. Micropropagarea in vitro

Multiplicarea la scara comercială a unui număr mare de specii

de plante prin tehnici de cultură in vitro reprezintă una dintre
aplicaţiile de succes major ale acestei tehnologii, practicată
în numeroase laboratoare şi apreciată pe piaţa globală ca o industrie
extrem de profitabilă. Beneficiile pe termen lung ale acestei
biotehnologii derivă din creşterea durabilităţii, profitabilităţii
şi competitivităţii la nivel internaţional, dar mai ales din posibilitatea
multiplicării clonale a plantelor.
36
 Totipotenţa manifestată de meristemele apicale reprezintă
piatra de temelie a micropropagării comerciale a plantelor de cultură,
în general, şi a căpşunului, implicit. Fundamentarea tehnicilor
culturilor de meristeme a fost realizată de Morel (1960), dar imediat
după iniţierea tehnicilor de micropropagare in vitro la căpşun (Boxus,
1974), marile companii producătoare de material săditor din Europa
au devenit interesate de această tehnică, ce contribuie semnificativ
la diminuarea daunelor cauzate de ciupercile din sol. Pe de altă
parte, exceptând cultura de meristeme utilizată pentru regenerarea
de lăstari axilari, există şi alternativa micropropagării căpşunului
pornind de la explante somatice. Indiferent de metoda utilizată,
etapele tehnologiei de micropropagare a căpşunului sunt: iniţierea
culturii in vitro, multiplicare, înrădăcinare şi aclimatizare, urmate
de coltrolul genetic şi fitosanitar al plantelor.
Procedurile de lucru şi mediile de cultură pentru
micropropagarea genotipurilor de Fragaria au fost îmbunătăţite
continuu (Vine, 1968; Adams, 1972; Boxus, 1974, 1977; Lee şi de
Fossard, 1975, 1977; De Assis şi Hildebrandt, 1977; James şi
Newton, 1977; Navatel, 1979; Lee şi Park, 1980; Niemirowicz-
Szczytt şi Malepszy, 1980; Waithaka şi colab., 1980; Coman şi
Neculae, 1981; Oosawa şi colab., 1981; Scott şi Zanzi, 1981; Cossio
şi Menin, 1982; Eun şi colab., 1982; Hunter şi colab., 1984;
Marcotrigiano şi colab., 1984; Scott şi colab., 1985; Simpson şi Bell,
1989; Merkle, 1993; Lopez-Aranda şi colab., 1994; Nehra şi colab.,
1994; Tarenghi şi colab., 1995; Bhatt şi Dhar, 2000; Kaur şi colab.,
2005, Lucyszyn şi colab., 2006; Mehrotra şi colab., 2007).
Pe lângă avantajele esenţiale pe care le oferă sub raportul
calităţii materialului şi a rapidităţii înmulţirii acestuia (Cameron şi
Hancock, 1986), micropropagarea in vitro este impusă şi de o serie
de caracteristici particulare ale unora dintre genotipurile de căpşun.
Astfel, Scott şi colab. (1985) au subliniat importanţa deosebită
a acestui sistem pentru înmulţirea soiului indiferent la lungimea zilei
‘Tribute’, a cărui incapacitate de a emite filamente şi a forma stoloni
determină imposibilitatea propagării sale prin utilizarea sistemului
clasic. Întrucât această caracteristică este proprie majorităţii
genotipurilor “day-neutral”, introducerea în cultură a soiurilor
aparţinând acestui grup, cu valoare comercială deosebită sub
raportul duratei sezonului de fructificare şi al producţiei, este strâns
dependentă de micropropagarea in vitro.

37
 2.2.1.1. Modul de formare a lăstarilor

Întrucât întotdeauna formarea de lăstari sau plantule este

însoţită de formarea de muguri axilari, problema cea mai importantă
legată de micropropagarea căpşunului este aceea a modului prin
care mugurii axilari pot fi scoşi de sub influenţa dominanţei apicale,
pentru inducerea lăstăririi axilare fără teama pentru formarea
lăstarilor adventivi sau din calus. Cea mai sigură cale este aceea
a disecţiei lăstarilor formaţi axenic, pentru individualizarea mugurilor
axilari şi pentru a permite din nou formarea de lăstari din aceştia,
pe medii lipsite de fitohormoni. Tehnica menţionată mai sus poate
fi realizată cu mare uşurinţă prin folosirea acidului giberelic (GA3),
şi are ca rezultat formarea de plantule juvenile intermediare între
plantele “rozetă” şi stoloni, din care microbutaşi de un nod, cu o
singură frunză şi un singur meristem axilar, pot fi obţinuţi pentru
iniţierea de noi culturi.
Auxinele şi citochininele sunt de asemenea implicate în
dominanţa apicală. Lee şi Park (1980) au arătat că în timp ce pe
mediile lipsite de fitohormoni se formează lăstari individuali, pe cele
conţinând 0,02 mg/l 6-benziladenină (BAP), este indusă formarea de
lăstari multipli. Este general recunoscut faptul că, regulatorii de
creştere trebuie să fie folosiţi în concentraţii cât mai reduse posibil,
fără pierderea efectului morfogenetic dorit (James şi Newton, 1977).
În plus, efectul nu este dependent numai de natura hormonilor
aplicaţi, dar şi de genotip. Adams (1972) a demonstrat că chiar şi o
concentraţie de 0,1 mg/l BAP a fost suficientă pentru inducerea
formării adventive de lăstari.
Controlul atent al plantelor multiplicate in vitro este absolut
necesar, întrucât, aşa cum subliniau Marcotrigiano şi colab. (1987),
unele soiuri de căpşun pot exista sau apar, ca himere periclinale,
având originea în mutaţii spontane produse într-un singur strat
histologic al meristemului apical. Aceste soiuri rămân stabile
histologic în cazul propagării prin stoloni, însă în cazul multiplicării
in vitro, formarea de lăstari adventivi poate conduce la apariţia
de plante non-himerice, cu caracteristici modificate.

38
 2.2.1.2. Cultura de meristeme pentru eliberarea de virusuri

Chiar dacă există abateri de la prezumpţia originală, aceea

a succesului exclusiv al culturii de meristeme apicale de căpşun
în eliberarea de virusuri (o serie de cercetări au arătat că această
metodă este utilă şi pentru evitarea răspândirii unor boli fungice
periculoase cum ar fi Phytophthora cactorum, Phytophthora fragariae
sau Verticillium sp.), metoda propusă de Miller şi Belkengren
(1962, 1963), şi ulterior de Vine (1968) şi Boxus (1976), este
generalizată pentru eradicarea virusurilor în materialul biologic
înmulţit pe scară comercială pentru înfiinţarea plantaţiilor de căpşun.
În mod frecvent, termoterapia este asociată cu cultura in vitro
de meristeme (Lines şi colab., 2006), dar se consideră totuşi că,
“toate virusurile cunoscute în prezent, cu excepţia unuia, pot fi
eliminate din soiurile de căpşun prin utilizarea culturii de ţesuturi fără
tratament termic, cu condiţia ca vârfurile excizate să aibă aproximativ
0,1 mm diametru şi sub 1,0 mm lungime (McGrew, 1965). Boxus
şi colab. (1983) au sugerat chiar folosirea unor explante
meristematice de 0,2-0,4 mm. De altfel, Hunter şi colab. (1984)
au raportat că meristeme de 0,25 mm pot fi cultivate in vitro
cu acelaşi succes ca şi cele de 0,5 sau 1,0 mm. Deşi rezultatele unui
număr impresionant de experimente au demonstrat că aproximativ
o jumătate din virusurile prezente în speciile horticole cu propagare
vegetativă pot fi eliminate prin termoterapie, se apreciază
că în ultimele decenii aceasta a fost înlocuită aproape în totalitate
de cultura de meristeme.
La căpşun, eficienţa procesului de regenerare şi de multiplicare
in vitro a materialului sănătos, consecinţă a perfecţionării mediilor
şi a metodelor de cultivare, constituie de altfel atuuri majore ale
succesului eradicării virusurilor în soiurile introduse în cultura
comercială. Kondakova şi Schuster (1991) au raportat sporirea ratei
de eliminare a virusurilor prin adăugarea în mediul folosit pentru
cultura meristemelor a 2,4-dioxohexahidro-1,3,5-triazinei. Încă din
anul 1973, Nishi şi Oosawa au raportat că regenerarea de plante
din calus derivat din cultura de antere este o metodă eficientă pentru
eliberarea de virusuri a soiurilor de căpşun.
Ulterior, utilitatea acestei metode a fost confirmată prin
rezultatele obţinute de Uematsu (1980), Gavrilova (1985), Qin şi
colab. (1988), Wang şi colab. (1990), însă chiar în condiţiile în care
eficienţa de ansamblu sau pentru un anumit virus, este egală sau
39
superioară celei obţinute prin utilizarea culturii de meristeme,
regenerarea de plante eradicate de virusuri din calus de antere
prezintă marele dezavantaj al apariţiei potenţiale a variaţiei
somaclonale. De altfel, aceasta a fost raportată la căpşun
de Uematsu (1980), Oosawa şi Takayanagi (1982), Yoshino şi colab.
(1985), Simon şi colab. (1987), Sayegh şi Hennerty, 1989, Morishita
şi Yamakawa (1990).

2.2.2. Conservarea germoplasmei

Principiul iniţierii micropropagării la momentul şi în cantitatea

dorită din linii individuale sau plante mamă indexate, care sunt
cultivate neîntrerupt pe medii libere de fitohormoni, stă la baza
conservării in vitro a colecţiilor de căpşun. Materialul biologic poate
fi păstrat aproximativ un an fără transfer, în condiţii de iluminare
şi temperatură uşor reduse, în mod similar colecţiilor obişnuite
de microorganisme. În cazul în care temperatura este redusă la +2°C,
fiecare etapă de dezvoltare poate fi întreruptă, iar plantele pot fi
păstrate fără afectarea capacităţii lor de dezvoltare ulterioară.
Acest tip de stocare, în camere cu condiţii de temperatură
scăzută şi întuneric (sau iluminare redusă), poate fi extins la
perioade de câţiva ani. Trebuie menţionat faptul că, în comparaţie cu
stolonii (a căror păstrare se realizează la - 2°C), materialul biologic
conservat in vitro trebuie să fie protejat de temperatura de îngheţ.
Reed (1991) a raportat că 96 de soiuri şi specii diferite de Fragaria
au fost păstrate cu succes şi fără pierderi determinate de contaminări,
timp de 24 luni în întuneric, la temperatura de 4°C, utilizând sistemul
de stocare a lăstarilor multiplicaţi in vitro în pungi de plastic închise
ermetic.
Un procedeu pentru păstrarea de lungă durată a germoplasmei
de căpşun a fost de asemenea pus la punct (Kartha şi colab., 1980).
Acest procedeu standardizat implică crioprezervarea meristemelor în
azot lichid, la temperatura de -196°C, ulterior precultivării pe mediu
suplimentat cu 5% dimetilsulfoxid (DMSO), rata de răcire a
materialului biologic fiind de 0,84°C/minut. Interesul ştiinţific care se
acordă conservării in vitro şi importanţa practică deosebită a acestei
aplicaţii este reflectat de proiectul cu durata de 100 ani iniţiat în
Oregon, SUA (Sherman, 1987) pentru studiul efectelor păstrării pe
perioadă îndelungată a meristemelor de căpşun.

40
 2.2.3. Recuperarea embrionilor

Adesea, embrionii formaţi în urma hibridărilor interspecifice,

dar mai ales intergenerice (de exemplu, Fragaria × Potentilla), sunt
avortaţi sau au capacitate de germinare extrem de redusă. Utilizarea
tehnicii in vitro de recuperare a embrionilor din astfel de hibridări,
permite obţinerea unor descendenţe numeroase de hibrizi
interspecifici şi intergenerici, facilitând aşadar folosirea în programele
de ameliorare a căpşunului, a unor specii sălbatice de Fragaria, sau
a genurilor înrudite. De asemenea, în cazul hibridărilor intergenerice
care au ca rezultat apariţia de haploizi ginogenetici, recuperarea
de embrioni permite obţinerea acestora în număr sporit.
Sayegh şi Hennerty (1989) au raportat că prin cultivarea in vitro
pe mediu MS modificat (Wang şi colab., 1984), suplimentat
cu 1,0 mg/l GA3 ori 1,5 mg/l AIB, 0,4 mg/l BAP şi 500 mg/l hidrolizat
de cazeină, după 21-28 zile de la polenizare, a embrionilor formaţi
în urma hibridării Fragaria × ananassa × Potentilla fruticosa, a avut
ca rezultat regenerarea unui număr mare de plante viabile.

2.2.4. Regenerarea plantelor prin organogeneză şi

embriogeneză somatică

Regenerarea eficientă de novo de plante din culturile de celule

şi ţesuturi somatice este recunoscută ca o condiţie esenţială pentru
aplicarea majorităţii tehnicilor in vitro de manipulare a genomului
(Nehra şi colab., 1990; Sullivan, 1991; Hammerschlag, 1992; Jain şi
Pehu, 1992; Popescu și colab., 1997; Popescu, 1998). Deşi
micropropagarea căpşunului în scopul înmulţirii rapide şi la scară
industrială a genotipurilor cu valoare comercială ridicată, precum şi al
eliberării de virusuri (prin asocierea culturii in vitro de meristeme cu
termoterapia), reprezintă de aproape patru decenii o lucrare de rutină,
elaborarea unor metode eficiente pentru regenerarea de plante din
cultura de celule (inclusiv protoplaşti), ţesuturi şi organe, a întâmpinat
numeroase dificultăţi.
În ultimii ani, numeroasele investigaţii având ca scop precizarea
influenţei factorilor genetici, fiziologici, biochimici şi fizici asupra
formării de calus şi a capacităţii de regenerare de plante prin
organogeneză şi embriogeneză somatică, au permis progrese
considerabile în controlul procesului regenerativ.

41
 Este în prezent general acceptat faptul că, regenerarea in vitro
de plante prin organogeneză şi respectiv embriogeneză somatică,
reprezintă procese distinct diferite (Litz şi Gray, 1992).
Întrucât embriogeneza somatică şi organogeneza reflectă
evenimente diferite în dezvoltare, s-a sugerat că este probabil ca,
aceste două procese să se excludă în mod reciproc, aşa încât
celulele pot parcurge o singură cale. Câteva caracteristici evidente
în dezvoltare, permit o distincţie clară între procesul formării
de lăstari adventivi (organogeneza) şi cel al formării de embrioni
somatici (embriogeneza somatică):
a) embriogeneza somatică implică activarea anumitor celule
şi dobândirea de către acestea a capacităţii de a diferenţia structuri
bipolare, analoge embrionilor zigotici, prezentând un meristem
caulinar şi unul radicular, prin parcurgerea de la celula iniţială
(embriogenă) a aceleeaşi secvenţe de stadii definite (globular,
cordiform, torpilă, cotiledonar).
b) organogeneza are ca rezultat formarea fie de meristeme
caulinare, evoluând în muguri şi ulterior în lăstari, fie de meristeme
radiculare, iar cele două direcţii de evoluţie se exclud reciproc fără
excepţie.
c) embrionii somatici îndeplinesc criteriul de bază al structurilor
bipolare, prezentând un sistem vascular închis; lăstarii sau rădăcinile
adventive sunt structuri unipolare, care aderă la ţesutul din care s-au
format, şi prin urmare ţesutul vascular este continuu între acestea.
d) în cotiledoanele embrionilor somatici apar proteine specifice,
care nu se regăsesc în frunzele lăstarilor adventivi (Litz şi Gray,
1992).
Frecvent, structuri având formă globulară sau cordiformă au fost
descrise ca fiind embrioni somatici, deşi acestea nu au avut
capacitatea de a regenera plante întregi. Aceste structuri anormale în
dezvoltare, denumite "neomorfe", pot crea ambiguitate în delimitarea
organogenezei de embriogeneza somatică. Spre exemplu, embrioni
somatici se pot dezvolta incomplet, astfel încât cotiledoanele,
meristemul caulinar, sau chiar întregul hipocotil pot să lipsească.
Este prin urmare posibil ca structuri formate în culturi embriogene,
care sunt similare primordiilor de rădăcini, să fie interpretate ca
rezultat al procesului de organogeneză. Ontogenia acestor structuri
poate fi însă determinată prin observarea modelului general de
evoluţie al culturii respective şi, în ultimă instanţă, poate fi verificată
prin analiza histologică.
42
 2.2.4.1. Organogeneza

A devenit un fapt incontestabil, că organogeneza este procesul

regenerativ cel mai uşor de indus la speciile aparţinând genului
Fragaria.
Meristemele care generează formarea de lăstari adventivi
se dezvoltă cel mai frecvent la periferia calusului sau a explantului,
deşi în procesul organogenetic pot fi implicate celule din oricare strat
histogenic sau celular. Până recent, s-a considerat că acestea
au origine multicelulară, formându-se din aglomerări de celule
cu volum mic, izodiametrice, cu citoplasmă densă, nuclei proeminenţi
şi diviziune accelerată.
Studiile implicând producerea in vitro de lăstari din discuri foliare
prelevate de la himere periclinale, au evidenţiat însă originea
unicelulară a lăstarilor organogenetici, deşi originea multicelulară
este în egală măsură posibilă. Formarea de muguri adventivi dintr-o
singură celulă somatică, este de altfel principiul de bază al
procedeelor de separare a himerelor (frecvente la numeroase specii
fructifere) în genotipuri pure (Litz şi Gray, 1992).
Organogeneza indirectă. Inducerea formării de muguri
adventivi în cultura de calus este modalitatea cea mai frecvent
utilizată pentru regenerarea de plante din ţesuturi somatice
la speciile de Fragaria. Deşi iniţial s-a apreciat că numai explantele
meristematice pot fi folosite pentru inducerea de calus cu capacitate
organogenetică (Nishi şi Oosawa, 1973; Lee şi de Fossard, 1975),
numeroase rezultate experimentale (Nehra şi colab., 1989, 1990;
Miller şi Chandler, 1990; Nehra şi colab., 1992a; Rugini şi Orlando,
1992; Popescu și colab., 1997), au evidenţiat faptul că regenerarea
de plante poate fi obţinută cu frecvenţă variabilă (în general mai
redusă) şi din calus derivat din ţesuturi mature, cu un înalt grad de
diferenţiere. Limitările în utilizarea explantelor prelevate din ţesuturi
mature (de exemplu, ţesut foliar) sunt în general asociate cu
dificultăţile ridicate de dezinfecţia şi decontaminarea acestora, şi în
mod frecvent cu producerea şi eliminarea în mediul de cultură a
fenolilor şi a altor compuşi toxici. Cercetări recente au indicat că 8-
hidroxi-qinolil-sulfatul, compus cu acţiune antimicotică şi bactericidă,
utilizat în concentraţie de 0,1%, permite decontaminarea eficientă a
ţesuturilor donatoare de explante şi, totodată, împiedică brunificarea
acestora şi a mediului de cultură, prin neutralizarea compuşilor
fenolici şi inhibarea oxidării lor (Laimer da Camara Machado, 1991).
43
 Totuşi, este general recunoscut faptul că explantele
meristematice (sau imature) oferă posibilităţi mai mari pentru
inducerea regenerării de plante cu frecvenţă înaltă.
Din multitudinea de tipuri de explante utilizate pentru
regenerarea (via calus) de plante de Fragaria, explantele de frunze
imature recoltate de la plante micropropagate in vitro constituie
materialul preferat. La baza acestei preferinţe stă însă nu atât faptul
că frunzele sunt singura sursă permanentă şi consistentă de
explante, cât capacitatea relativ ridicată de regenerare, în condiţii
optime de cultură.
Analizele histologice au permis evidenţierea localizării
structurilor celulare generatoare de muguri adventivi, fie la suprafaţa
calusului, fie în interiorul acestuia, sub forma de insule de celule
cu diviziune rapidă în mase de celule parenchimatice (Broertjes
şi Keen, 1980). Predominanţa unui model, pare a fi asociată cu tipul
de calus (compact, nodular friabil), tipul de explant şi, într-o măsură
importantă, cu condiţiile de cultură. Cu mare probabilitate, locul
de formare a centrelor meristematice este influenţat de prezenţa sau
absenţa pretratamentului la întuneric. O serie de studii indică
de asemenea că, aceste două modele de geneză a mugurilor
adventivi sunt asincrone, şi cel mai adesea durata de formare
a centrelor de diferenţiere este mai scurtă pentru cele localizate
la periferia calusurilor (Hammerschlag, 1992).
Organogeneza directă. Regenerarea de lăstari prin
organogeneză directă, pare să aibă un model unic întrucât, indiferent
de tipul de explant utilizat, originea acestora este asociată cu zonele
de rănire şi cu ţesuturile superficiale. În cazul explantelor de frunză
(discuri, benzi), formarea lăstarilor este aproape în exclusivitate
asociată cu locul de secţionare a nervurilor, sugerând rolul important
al aportului de hormoni endogeni.

2.2.4.2. Embriogeneza somatică

Deşi embriogeneza somatică se află în plan secundar

ca metodă de regenerare de plante la speciile de Fragaria, aceasta
deţine un real potenţial în ansamblul tehnicilor de manipulare in vitro
a genomului. Deşi iniţial s-a considerat că embrionii somatici au
origine unicelulară, Williams şi Maheswaran (1986) au sugerat că
aceştia se pot forma fie din celule unice, fie din grupuri de celule.

44
 Dovada originii unicelulare ar fi prezenţa la embrionii somatici
a unui suspensor, în timp ce originea multicelulară ar putea fi indicată
prin fuziunea bazei embrionului somatic cu o arie extinsă de ţesut
parental.
Rezultatele experimentale obţinute până în prezent par să
demonstreze puternica dependenţă a potenţialului embriogenic de
genotip şi de starea fiziologică a explantului (Foucault, 1987).
Totodată, este evidentă condiţionarea strictă a embriogenezei
somatice de auxine. De altfel, Litz şi Gray (1992) au oferit o imagine
sintetică a rolului hormonilor în balanţa procesului de formare
de embrioni somatici din cultura de calus.
Dacă prezenţa în mediul de cultură a unor auxine (ANA, AIA,
AIB) reprezintă o condiţie de bază, citochininele nu constituie
un factor critic pentru inducerea embriogenezei indirecte. Mai mult,
se apreciază că dacă în perioada de inducţie citochininele sunt
necesare, după declanşarea procesului de embriogeneză, prezenţa
lor (chiar în concentraţii reduse) nu favorizează, sau chiar inhibă
formarea embrionilor somatici.
Calusul embriogen este în mod caracteristic înalt friabil şi este
conţinut într-o matrice lichidă. Planurile iniţiale de diviziune celulară
sunt adesea înalt neregulate, dar în general prima diviziune şi a doua
urmează acelaşi model, fiind transverse spre oblice. Prin urmare,
modelul de diviziune al celulelor somatice embriogene se distinge
de cel al celulelor zigotice, la care a doua diviziune este
perpendiculară pe prima. Regiunile de diferenţiere, formate din celule
proembrionice, devin adesea delimitate de calusul înconjurător prin
formarea de pereţi celulari groşi. Structurile globulare asociate
calusului devin evidente după 12-15 zile. Subcultivarea acestora
pe medii lipsite de auxină are ca urmare diferenţierea organelor
embrionare: cotiledoane şi primordiile de rădăcină şi lăstar.
Menţinerea maselor globulare pe mediu conţinând auxină, determină
inhibarea formării organelor embrionare, expansiunea acestora şi
ulterior producerea de embrioni secundari având origine în celulele
stratului epidermal.

45
 3. VARIAŢIA SOMACLONALĂ

“Este firesc să afirm că fenomenul variaţiei somaclonale

a generat controverse încă de la început“, spunea Larkin în 1998,
iar polemica a fost concentrată pe demonstrarea existenţei sau
absenţei variaţiei genetice la plantele regenerate prin cultura
de celule şi ţesuturi in vitro, existând raţionamente conform cărora,
diferenţele genetice reclamate sunt consecinţa desfăşurării
inadecvate a experimentului sau a prezenţei polenului străin.
Controversele asupra acestui fenomen s-au manifestat şi sub
aspectul denumirii corespunzătoare, care s-a modificat de la
termenul “fenovariante” (Sibi, 1976) la “variaţie caliclonală” (Skirvin şi
Janick, 1976), “variaţie protoclonală” (Shepard, 1981), “variaţie
somaclonală” (Larkin şi Scowcroft, 1981), sau “variaţie
gametoclonală” (Evans şi colab., 1984), şi au continuat sub raportul
utilităţii sale practice.
În ultimii ani, cultura in vitro de celule şi ţesuturi vegetale
şi biologia moleculară au fost antrenate într-un sinergism dinamic
(Cloutier şi Landry, 1994). În timp ce cultura de celule şi ţesuturi
somatice şi gametice a furnizat sisteme model pentru studiile
de biologie moleculară, tehnicile de biologie moleculară au fost
aplicate în numeroase cazuri pentru a da răspuns unor întrebări
referitoare la limitele culturilor in vitro de ţesuturi. Prin urmare,
markerii proteici şi ADN sunt recomandaţi şi frecvent utilizaţi
în prezent pentru studiul variaţiei somaclonale, şi în primul rând
pentru determinarea originii acesteia (Williams şi colab., 1990; Nehra
şi colab., 1991a, 1991b; Paterson şi colab., 1991; Palombi şi colab.,
2003; Gaafar şi Saker, 2006; Mohamed, 2007).
Controlul atent al plantelor multiplicate in vitro este absolut
necesar, întrucât, aşa cum subliniau Marcotrigiano şi colab. (1987),
unele soiuri de căpşun pot exista, sau apar, ca himere periclinale,
având originea în mutaţii spontane produse într-un singur strat
histologic al meristemului apical. Aceste soiuri rămân stabile
histologic în cazul propagării prin stoloni, însă în cazul multiplicării
in vitro, formarea de lăstari adventivi poate conduce la apariţia
de plante non-himerice, cu caracteristici modificate.

46
 3.1. MECANISMELE VARIAŢIEI SOMACLONALE

Deşi dezbaterile asupra mecanismelor ce conduc la apariţia

variaţiei somaclonale continuă cu aceeaşi intensitate, printre cele
mai cunoscute se numără modificările cariotipului, amplificarea
şi diminuarea genică, activarea elementelor genetice transpozabile,
metilarea ADN, mutaţiile punctiforme, mutaţiile ADN extranuclear
şi variaţia epigenetică (Kaeppler şi colab., 2000). Indiscutabil, este
dificil de conceput o singură bază fundamentală pentru astfel
de consecinţe genetice atât de disparate. Phillips şi colab. (1994)
au sugerat că în condiţiile unei traume este resetată expresia
genomului, fiind reprogramat anormal sau incontestabil restructurat,
iar celulele afectate se regăsesc în incapacitatea de a urma aceeaşi
secvenţă ordonată, aşa cum se întâmplă în condiţii naturale. Aceste
restructurări genomice pot conduce la o gamă largă de expresii
fenotipice şi genetice modificate, în noile plante regenerate,
precum variegarea frunzelor, cloroza frunzelor, nanismul plantelor
regenerate, absenţa filamentelor sau sterilitate (Swartz şi colab.,
1981; Sansavini, 1989; Sansavini şi colab., 1990; Nehra şi colab.,
1992b; Faedi şi colab., 1993), modificarea culorii fructelor (Popescu
şi colab., 1997), rezistenţă scăzută la boli şi dăunători (Simon
şi colab., 1987; Battistini şi Rosati, 1991; Toyoda şi colab., 1991),
precum şi modificarea nivelului de ploidie (Simon şi colab., 1987)
sau a cantităţii de ADN (Brandizzi şi colab., 2001).

3.1.1. Modificările cariotipului

Celulele cultivate in vitro şi somaclonele regenerate sunt

expuse frecvent modificărilor de cariotip, consecinţă atât a variaţiilor
numerice ale cromozomilor, cât şi a rearanjamentelor cromozomiale,
precum translocaţiile, inversiile, deleţiile sau duplicaţiile (Ahloowalia,
1983; D’ Amato, 1985; Lee şi Phillips, 1988; Fourré şi colab., 1997).
La un nivel înalt, variaţia somaclonală este în cea mai mare
măsură consecinţa recombinărilor genetice, dar şi a
rearanjamentelor cromozomiale, importantă fiind nu atât crearea
variaţiei, cât descoperirea ei. Se consideră că, restructurările
cromozomiale se produc preferenţial în anumite segmente sau
“puncte fierbinţi” ale cromozomilor, caracterizate de heterocromatină
(Lee şi Phillips, 1988; Benzion şi Phillips, 1988), iar frecvenţa ridicată
47
a acestora este o consecinţă a replicării întârziate a hetero-
cromatinei, corelată cu o nouă juxtapunere a genelor, precum şi a
dezechilibrului nucleotidelor, pe fondul compoziţiei mediului de
cultură (Peschke şi Phillips, 1992).
De asemenea, rearanjamentele cromozomiale criptice pot fi
considerate unul dintre mecanismele majore implicate în generarea
variaţiei somaclonale. Modificările criptice pot conduce fie la deleţia
genelor, fie la modificarea expresiei acestora (prin deleţia unei copii
sau prin conversia genei în timpul procesului de reparare) sau la
anularea funcţionalităţii genelor dominante, permiţând genelor
recesive să modifice fenotipul. Deleţiile pot influenţa funcţionarea
genelor plasate în locusul de rupere a cromozomilor, precum şi
funcţionarea genelor învecinate, a căror transcripţie trebuie să fie
coordonat regulată. Dacă transpoziţia afectează loci diferiţi, atunci
poate fi modificată funcţionarea genelor îndepărtate datorită efectului
de poziţie.
Grupul factorilor implicaţi în alterarea cariotipului somaclonelor
include, pe lângă rearanjamente cromozomiale, aneuploidiile şi
euploidiile. Aneuploidia poate fi cauzată de non-disjuncţia
cromozomilor, fusuri de diviziune aberante, inactivarea unor
kinetocori şi prezenţa de cromozomi retardatari, deleţii urmate
de formarea cromozomilor dicentrici sau acentrici. În plus, speciile
cu un nivel înalt de ploidie manifestă un potenţial superior
de exprimare a variabilităţii genetice, comparativ cu speciile cu un
număr somatic mai mic de cromozomi. În cazul plantelor obţinute
prin cultura in vitro de celule şi ţesuturi, poliploidia este, în general,
rezultatul endopoliploidizării sau fuziunii nucleare (Bayliss, 1980).

3.1.2. Amplificarea şi diminuarea genică

Amplificarea genică pe parcursul etapelor de cultură in vitro

a fost amplu documentată la numeroase specii vegetale. Întrucât
principiul creşterii şi descreşterii cantităţii produsului unei gene prin
amplificarea sau diminuarea genică este binecunoscut, acest
mecanism a constituit suportul unor experimente ce au vizat selecţia
de variante somaclonale cu rezistenţă sau toleranţă la concentraţii
ridicate de săruri, ierbicide, pesticide etc.
Se apreciază că crossing-over-ul somatic şi schimbul între
cromatide surori determină asimetria unor secvenţe omologe.

48
 Analizele moleculare au arătat că genomurile eucariote conţin
un număr de secvenţe diferite de ADN repetitiv, distribuite fie
în tandem, fie dispersate în întregul genom.
Adesea, acestea sunt flancate de scurte secvenţe tandem sau
invers repetate, oferind astfel posibilitatea asocierilor asimetrice
a secvenţelor omologe. Când sunt urmate de un schimb, rezultă
duplicarea şi aceasta odată realizată, amplificarea poate continua.
Nuti Ronchi (1991) apreciază că modificările ADN prin
diminuare sau amplificare genică, reprezintă evenimentele cele mai
interesante raportate la plantele regenerate din culturi de celule
şi ţesuturi in vitro.

3.1.3. Metilarea ADN

Rezultatele a numeroase studii au indicat că metilarea unor

secvenţe specifice de ADN este implicată în apariţia de mutaţii
în genomul celulelor cultivate in vitro. Philips şi colab. (1994)
au sugerat că metilarea poate fi implicată în controlul transmiterii
de la celulă la celulă a modelelor de activitate genică. Creşterea
metilării se corelează, de obicei, cu pierderea activităţii genice,
iar descreşterea cu activitatea genică. Mai mult, se apreciază
că activarea elementelor genetice transpozabile este corelată
în numeroase cazuri cu metilarea redusă.
Pentru numeroase specii vegetale au fost raportate observaţii
indicând creşterea şi descreşterea în ansamblu a metilării,
subliniindu-se că aceste modificări au persistat în generaţii
consecutive de consangvinizare. Se pare că nu există o corelaţie
între modificările de metilare şi fenotipurile anormale observate
(Peschke şi Phillips, 1992). Totuşi, acestea par să fie corelate
cu rearanjamentele genomice detectate prin probe de ADN. Deşi
ca rezultat al culturilor de celule şi ţesuturi in vitro au fost observate
atât creşterea, cât şi descreşterea metilării, se pare că tendinţa este
spre reducerea metilării, ca evenimentul cel mai comun.
O modalitate obişnuită pentru studiul efectelor de metilare este
aceea a utilizării 5-azacitidinei sau a altor analogi ai citozinei care au
capacitatea de a inhiba metilarea citozinei sau de a induce rapid
metilarea genomică în celulele vegetale (Brown şi colab., 1989;
Brown, 1991).

49
 Această metodă impune anumite precauţii, deoarece aceşti
analogi par să cauzeze activarea elementelor genetice transpozabile,
astfel încât nu se poate determina cu certitudine dacă rezultatul
observat se datorează inducerii hipometilării, sau altor cauze. În
acest sens, este relevant faptul că pe lângă reducerea metilării,
5-azacitidina poate cauza mutaţii punctiforme, recombinări mitotice şi
ruperi de cromozomi (Phillips şi colab., 1994).
Modificările de metilare, ca de altfel şi modificările la nivelul unei
singure baze şi rearanjamentele cromozomiale, pot fi analizate prin
utilizarea analizei lungimii fragmentelor de restricţie (RFLP). Deşi
este posibilă detectarea modificării unei singure baze prin utilizarea
RFLPs, numai patru până la şase baze sunt examinate pentru
fiecare combinaţie enzimă/probă. Este, prin urmare, uşor de detectat
polimorfismul produs prin cultura de celule şi ţesuturi vegetale, dar
este mult mai dificil de înţeles semnificaţia acestuia (Peschke şi
Phillips, 1992), mai ales dacă luăm în consideraţie faptul că
polimorfismul de orice fel poate fi observat în fenotipul plantei
(normal sau anormal).
În contextul variaţiei somaclonale, o problemă deosebită este
aceea a explicării apariţiei variaţiei genetice pentru caractere
cantitative (frecvent fiind afectate mai mult de un caracter în cadrul
aceluiaşi experiment), ştiut fiind faptul că, acestea sunt controlate
de gene numeroase. S-a apreciat că asemenea modificări ale
caracterelor cantitative sunt greu de imaginat prin mutaţiile clasice
ale genelor structurale sau de reglare, sugerând că efectul poate
fi mai degrabă explicat printr-un efect mai global asupra genomului.
Întrucât metilarea ADN este în anumite cazuri corelată cu
activitatea cromozomilor, se consideră că aceasta alterează structura
cromatinei şi indirect afectează expresia unui număr mare de gene,
făcând prin urmare plauzibilă modificarea caracterelor cantitative în
condiţiile trecerii prin cultura de celule şi ţesuturi in vitro. De altfel, s-a
demonstrat că metilarea ADN poate afecta regiuni cu mărimea de
40-50 kb sau chiar mai mult. În cadrul genului Fragaria, alterarea
procesului de metilare a ADN a fost semnalată la plantele regenerate
din meristeme crioprezervate de căpşun (Hao şi colab., 2002).

50
 3.1.4. Mutaţiile punctiforme

Acest tip de variaţie a fost cel mai puţin semnalat printre

somaclone. În 1994, Phillips şi colab., au propus o conexiune
cu “repeat - induced point mutation” (RIP) la Neurospora. Conform
ipotezei RIP secvenţele C-metilate sunt predispuse la dezaminare
(pentru a forma timină), ceea ce conduce la mutaţii punctiforme.
Tranziţia iniţială C→T poate fi inadecvat reparată cu o citozină
nemetilată sau poate să conducă la o mutaţie punctiformă G→A,
iar această nouă adenină metilată poate reţine sau poate pierde
metilarea în replicările ulterioare.
De altfel, a fost dovedită ulterior (Graham şi Larkin, 1995)
creşterea activităţii genelor promotoare în celulele vegetale cu
adenină metilată şi în plus, supresia activităţii genelor ca urmare a
metilării citozinei. Deci, metilarea iniţială a citozinei poate avea
consecinţe multiple în replicările ulterioare ale ADN, inclusiv mutaţii
punctiforme şi alterarea activităţii promotorilor.

3.1.5. Activarea elementelor genetice transpozabile

Elementele genetice transpozabile sunt secvenţe de ADN

având capacitatea de a se deplasa dintr-o poziţie în alta
a genomului, independent de gradul de omologie al acestora.
Se afirmă că transpoziţia poate avea sau nu efecte detectabile,
însă inserţia unui element genetic transpozabil într-o secvenţă
de codificare determină cu mare probabilitate inactivarea genei
respective. Totodată, s-a sugerat că excizia imprecisă a elementelor
transpozabile poate genera rearanjamente (deleţii, inversii) ale
secvenţelor cromozomiale adiacente. Astfel, în virtutea mobilităţii lor,
elementele transpozabile pot inactiva gene structurale, pot altera
reglarea genică sau reactiva gene silenţioase şi pot genera duplicaţii
şi rearanjamente cromozomiale.
Se apreciază că transpoziţia poate să afecteze atât celulele
somatice, cât şi celulele germinale. Prin urmare, elementele genetice
transpozabile sunt recunoscute în prezent, ca o forţă majoră în
modelarea structurii genomului şi totodată sunt considerate ca fiind
responsabile pentru o parte considerabilă a evenimentelor
mutaţionale (Cullis, 1992).

51
 Elementele genetice transpozabile pot avea un rol deosebit
în generarea variaţiei somaclonale, în condiţiile culturii in vitro
de ţesuturi şi celule, mediul de cultură putând favoriza transpoziţia
elementelor genetice. Primele observaţii asupra relaţiei dintre
activarea elementelor transpozabile şi apariţia variaţiei somaclonale
au fost făcute de Ahloowalia şi Sherington (1985), ulterior, Kaeppler
şi colab. (1998) sugerând că elementele genetice transpozabile sunt
responsabile pentru o mică parte din variaţia genetică indusă prin
cultura in vitro de celule şi ţesuturi vegetale.
De asemenea, s-a sugerat existenţa “punctelor fierbinţi”
(“hot spots”) în genomul nuclear al plantelor, astfel încât, în condiţiile
culturii in vitro de celule şi ţesuturi, se produce activarea elementelor
genetice transpozabile, care transpozează în jurul acestor “puncte
fierbinţi”, conducând la modificări genetice. Probabil că, aceste
“puncte fierbinţi” sunt predispuse la recombinare somatică, cauzând
variaţie genetică.

3.1.6. Mutaţii ale ADN extranuclear

Genomul mitocondrial prezintă o rată mai mare a mutaţiilor

comparativ cu genomul cloroplastic, care este considerat ca fiind mai
stabil şi mai înalt conservat comparativ cu cel mitocondrial sau
genomul nuclear. Unul dintre exemplele clasice în care variaţia
somaclonală este asociată culturii in vitro de ţesuturi este sterilitatea
masculină controlată citoplasmatic (Cytoplasmically Controlled Male
Sterility - CMS).
Având în vedere că numărul organitelor celulare este mult mai
mare într-un lăstar în creştere decât într-o celulă matură, la nivelul
ADN extracelular mutaţiile se pot produce cu o probabilitate mai
mare. Kawata şi colab. (1995), au semnalat că prelungirea duratei
culturilor in vitro de celule şi ţesuturi pot conduce la deleţia unor părţi
ale genomului cloroplastic la orez, pierderi asociate cu modificări
ale morfologiei plastidelor.

52
 3.1.7. Variaţia epigenetică

În unele cazuri, modificările asociate culturii in vitro de celule

şi ţesuturi se datorează variaţiei epigenetice, consecinţă a amplificării
ADN, metilării ADN sau activării elementelor genetice transpozabile.
Astfel de variaţii sunt temporare, nu sunt ereditare şi adesea dispar,
fie după transferul plantelor din mediul de cultură in vitro, fie după
câteva generaţii de descendenţi obţinuţi prin metode convenţionale
de înmulţire (Kaeppler şi colab., 2000). Phillips şi colab. (1994)
au accentuat faptul că mecanismul stres – răspuns este probabil
generatorul variaţiei somaclonale şi că variaţiile neereditare şi
instabile se datorează activării elementelor genetice transpozabile.
Cele două tipuri de variaţie, genetică şi epigenetică, se
deosebesc în mod esenţial printr-o serie de particularităţi:
1) numai variaţia somaclonală este transmisă în descendenţă
prin meioză;
2) numai variaţia epigenetică este reversibilă pe parcursul
ciclului de viaţă;
3) variaţia somaclonală apare numai la plantele generate
din meristemele adventive, în timp ce variaţiile epigenetice afectează
în egală măsură plantele formate de novo şi pe cele formate din
meristeme apicale sau axilare pre-existente;
4) contrar variaţiei somaclonale, variaţia epigenetică poate
fi anticipată (este previzibilă), întrucât aceleaşi condiţii de cultură vor
determina în mod obişnuit acelaşi tip de variaţie epigenetică;
5) variaţia epigenetică este un răspuns fiziologic la inductori
specifici, şi prin urmare este unidirecţională, înscriindu-se pe o curbă
doză-răspuns;
6) direcţia variaţiei somaclonale este în întregime randomizată
sub raportul valorii sale funcţionale sau adaptative, aşa încât
un caracter afectat de variaţia somaclonală se poate modifica
în direcţii opuse în plantele regenerate (De Klerk, 1990).

53
 3.2. METODE DE EVIDENŢIERE A VARIAŢIEI
SOMACLONALE

Una din dificultăţile majore asociate cu variaţia somaclonală,

este aceea a testării rapide şi facile a materialului biologic în scopul
detectării diferenţelor genetice faţă de genotipurile de origine (martor).
Metoda cea mai uşoară de selecţie se bazează pe analiza fenotipică
a regeneranţilor. Un prim dezavantaj al acestei abordări este
determinat de faptul că un fenotip normal (aparent) nu constituie
o garanţie că nu au apărut modificări ascunse (criptice). În al doilea
rând, numeroase rezultate experimentale au demonstrat că multe
dintre modificări sunt heterozigote şi recesive, şi în consecinţă
apariţia lor nu poate fi detectată decât după analiza descendenţilor
rezultaţi din autopolenizarea regeneranţilor. Cel de-al treilea
deazavantaj este asociat cu durata lungă de timp necesară pentru
constatarea apariţiei modificărilor fenotipice (Brown şi colab., 1993).
Analiza cariologică a plantelor regenerate din protoplaşti,
ţesuturi somatice sau organe vegetale cultivate in vitro, poate
conduce adesea la relevarea unor modificări cromozomiale
semnificative, cum ar fi alterarea nivelului de ploidie sau
rearanjamente structurale (Karp şi Bright, 1985). Totuşi, modificările
cromozomiale nu pot pune în evidenţă alterări ale genelor individuale.
Procedee cum ar fi analizele izoenzimatice pun la dispoziţie
o metodă relativ convenabilă pentru examinarea modificărilor
biochimice, dar acestea sunt în mod obişnuit limitate de numărul
markerilor disponibili. De asemenea, utilizarea sistemelor
izoenzimatice prezintă dezavantajul de a fi subiectul alterărilor
determinate de condiţiile de mediu şi de stadiul de dezvoltare.

3.2.1. Evidenţierea variabilităţii genetice cu ajutorul

markerilor moleculari

3.2.1.1. Markeri proteici

Se apreciază că utilizarea markerilor moleculari a permis

depăşirea unora, sau a tuturor problemelor asociate cu markerii
morfologici (utilizaţi extensiv în ameliorarea plantelor). Izoenzimele
(markeri proteici) sunt forme ale unei singure enzime, constând

54
în multimeri ai două sau mai multe subunităţi polipeptidice codificate
de gene diferite.
Modificările la nivelul secvenţelor de aminoacizi alterează
punctele izoelectrice ale polipeptidelor şi permit separarea lor prin
electroforeză şi în consecinţă, utilizarea lor ca markeri genetici
(Lassner şi Orton, 1983; Cloutier şi Landry, 1994). Folosirea
variantelor proteice produse de alele diferite ale aceluiaşi locus
(aloenzime) ca markeri genetici prezintă un mare avantaj, comparativ
cu markerii morfologici, rezultând din co-dominanţa lor generală
(combinată cu rare interacţiuni epistatice), care le face foarte
adecvate pentru elucidarea mecanismului variaţiei la nivelul locilor
individuali. Totuşi, markerii proteici sunt supuşi alterărilor determinate
de influenţa condiţiilor de mediu şi de stadiul de dezvoltare (Brown
şi colab., 1993), şi sunt limitaţi la regiunile de codificare a proteinelor
solubile (Cloutier şi Landry, 1994). O confirmare a limitelor asociate
cu utilizarea markerilor proteici pentru detectarea variaţiei
somaclonale, a fost adusă pentru specia F. × ananassa de către
Nehra şi colab. (1991), care au raportat că aneuploidia şi poliploidia,
puse în evidenţă prin analiza conţinutului de ADN nuclear, nu este
reflectată în spectrele izoenzimatice. De exemplu, analiza profilelor
de bandare ale izoenzimelor leucin aminopeptidaza (LAP), fosfo-
glucomutaza (PGM), esteraza (EST) şi fosfogluco-izomeraza (PGI),
nu a permis distincţia între variantele morfologice şi plantele standard
(martor), deşi analizele fotocitometrice au indicat natura aneuploidă
a variantelor de căpşun regenerate din calus, având modificată
forma frunzelor. Totuşi, utilizarea izoenzimelor ca markeri proteici
este relativ frecventă pentru identificarea soiurilor, inclusiv a celor
multiplicate prin cultura in vitro de meristeme. F. × ananassa face
de altfel parte din grupul speciilor pentru care această aplicaţie a fost
recomandată (Bringhurst şi colab., 1981; Arulsekar şi Bringhurst,
1981, 1983; Bell şi Simpson, 1994).
Damiano şi colab. (1995) au raportat evidenţierea unor diferenţe,
atât între soiuri, cât şi în interiorul aceluiaşi soi, între ratele de
creştere ale calusurilor şi suspensiilor de celule derivate din explante
de peţiol aparţinând plantelor regenerate din ţesuturi somatice la 5
soiuri de căpşun, diferenţe exprimate şi în spectrele izoenzimatice
ale fosfatazei acide, peroxidazei şi glutamat-dehidrogenazei. Nehra
şi colab. (1991) au subliniat faptul că, o condiţie esenţială pentru
identificarea varietală sau a modificărilor genetice cu ajutorul
markerilor proteici o constituie alegerea izoenzimelor.
55
 3.2.1.2. Markeri ADN

De-a lungul timpului, utilitatea markerilor PCR aleşi arbitrar,

aşa cum sunt markerii AFLP (amplified fragment lenght
polymorphism), RAPD (random amplified polymorphic DNA) şi ISSR
(intersimple sequence repeats), în detectarea variaţiei genetice în
cadrul genului Fragaria, a fost evidenţiată de numeroase studii
(Gidoni şi colab., 1994; Graham şi colab., 1996; Degani şi colab.,
2001; Tyrka şi colab., 2002; Arnau şi colab., 2002; Kuras şi colab.,
2004; Debnath şi colab., 2008). Deşi utilizarea markerilor moleculari
aleşi arbitrar pentru aprecierea diversităţii şi indentificarea soiurilor
de căpşun este asociată cu dificultăţi de reproducere şi interpretare
a produşilor PCR, evaluarea asistată de markerii RAPD a fost
utilizată cu succes în acest sens (Korbin şi colab., 2002; Kuras şi
colab., 2004; Milella şi colab., 2006) şi a servit cel puţin o dată la
identificarea varietăţilor patentate (Congiu şi colab., 2000).
În plus, markerii moleculari cu grad înalt de reproductibilitate
pentru genul Fragaria, precum microsateliţii (Gene – specific intron
lenght polymorphisms), markerii CAPS (clevead-amplified polymorfic
sequence), au găsit o largă aplicabilitate în alcătuirea hărţilor linkage
(Deng şi Davis, 2001; Sargent şi colab., 2006; Sargent şi colab.,
2007), precum şi în studiile de taxonomie sau identificare a soiurilor
de căpşun (Kunihisa şi colab., 2003, 2005; Hadonou şi colab., 2004;
Davis şi colab., 2006; Gil-Ariza şi colab., 2006; Govan şi colab.,
2008).
Este general acceptat faptul că, markerii moleculari reprezintă
instrumente noi şi eficiente pentru detectarea variaţiei genetice cu
o mai mare precizie şi probabil cu eforturi mai reduse în comparaţie
cu analizele fenotipice şi cariologice (Paterson şi colab., 1991).
Rezultatele a numeroase experimente au demonstrat că identificarea
variantelor somaclonale regenerate din calus derivat dintr-o gamă
largă de explante (inclusiv cele foliare), este posibilă prin utilizarea
markerilor proteici (izoenzime). Se apreciază însă că mutaţiile pot
să apară şi în secvenţe ADN care nu se exprimă ca proteine, cum ar
fi regiunile de spaţiere, intronii, sau alte secvenţe ADN care nu sunt
transcrise sau translate. Pentru detectarea acestui tip de variaţie sunt
utilizaţi markerii RFLP şi mai recent markerii PCR şi RAPD.
Datele acumulate până în prezent indică faptul că frecvenţa
variaţiei somaclonale este relativ înaltă şi poate să apară la un nivel

56
similar cu variaţia obţinută prin tratamentele cu agenţi mutageni, deşi
tipurile de variaţie pot fi diferite calitativ.
Se apreciază că valori de 30-40% plante regenerate prezentând
cel puţin un caracter modificat, şi de până la 3% pentru variaţia unui
caracter specific, sunt obişnuite (Warren, 1992).
Capacitatea de analiză a genomului şi a variabilităţii genetice
utilizând cantităţi foarte reduse de material vegetal s-a îmbunătăţit
considerabil. Odată cu perfecţionarea tehnicilor moleculare, a devenit
posibilă descifrarea mecanismelor de bază care guvernează cultura
in vitro. Se cunoaşte de mai mult de un deceniu că markerii ADN
permit detectarea substituirii unei singure baze din ADN genomic
total (Myers şi colab., 1985). O determinare precisă a modificărilor
într-o secvenţă particulară de genă, rezultat al condiţiilor de cultură
in vitro, poate fi obţinută prin analiza polimorfismului lungimii
fragmentelor de restricţie (RFLP).
Markerii RFLP (Restriction Fragments Length Polymorphism)
prezintă câteva avantaje importante faţă de markerii genetici
convenţionali. Numărul potenţial de markeri este virtual nelimitat,
întrucât digestia ADN de către o enzimă de restricţie va genera,
în medie, cel puţin 106 fragmente, şi în prezent sunt utilizate peste
100 de astfel de enzime (Cullis, 1992).
Endonucleazele de restricţie recunosc şi clivează moleculele
ADN la nivelul unor secvenţe specifice, ceea ce le face ideale pentru
detectarea variaţiei genetice. Spre exemplu, enzima de restricţie
Eco RV recunoaşte secvenţa ADN “GATATC” pe care o clivează
în mijloc. Dacă doi regeneranţi diferă fie şi numai printr-o singură
nucleotidă din secvenţa recunoscută, endonucleaza de restricţie va
tăia ADN-ul unuia, dar nu şi al celuilalt. Aceasta va genera fragmente
ADN de lungimi diferite, fapt din care derivă denumirea tehnicii.
Aceste fragmente pot fi separate prin electroforeză şi vizualizate
prin hibridizarea cu o probă marcată. Această probă poate fi ADN
genomic, ADNc caracterizat sau ales la întâmplare, sau chiar un
fragment oligonucleotidic sintetic. Această metodă prezintă totuşi
două limitări. Prima este o consecinţă a perioadei lungi de timp
necesară pentru realizarea analizei RFLP (în mod obişnuit 5-6 zile).
Cea de-a doua derivă din faptul că, rezultatul unei astfel de analize
este limitat numai la o singură secvenţă de genă utilizată ca probă.
Întrucât nu a fost încă identificată nicio secvenţă particulară ca fiind
direct responsabilă pentru variaţia somaclonală (sau protoclonală),

57
relevanţa acestei tehnici este redusă considerabil (Brown şi colab.,
1993).
Întrucât se consideră că modificările de metilare a ADN pot
fi responsabile pentru apariţia variaţiei genetice, markerii RFLP pot fi
utilizaţi ca indicatori fideli ai acestor evenimente, având în vedere
sensibilitatea diferită a endonucleazelor de restricţie faţă de starea
de metilare a secvenţelor ADN. Astfel, o serie de studii la nivel
molecular au indicat în mod concludent că endonucleazele de
restricţie diferă în capacitatea lor de digestie a secvenţelor de
recunoaştere, în funcţie de starea de metilare a nucleotidelor care le
compun (Brown, 1989).
Markerii PCR (Polymerase Chain Reaction) reprezintă unul
dintre progresele tehnice majore în biologia moleculară, în ultimii ani.
Pe lângă utilizarea sa în izolarea de gene particulare, tehnica PCR
poate fi uşor aplicată pentru determinarea nivelului de variaţie
în materialul vegetal în toate stadiile de cultură şi creştere, de la
protoplaşti la plantele regenerate. Procedeul elaborat recent de
Brown şi colab. (1993) permite aplicarea acestei tehnici în orice
moment al culturii in vitro de celule şi ţesuturi somatice sau gametice
(chiar şi la nivelul protoplaştilor individuali) sau al procesului
regenerativ, oferind posibilitatea determinării originii variaţiei
somaclonale şi a detectării facile şi cu mare fidelitate a variaţiei
genotipice. ADN polimeraza catalizează alungirea moleculelor ADN.
În prezenţa unei matrice ADN şi corespunzător primerilor ADN, ADN-
polimeraza poate cataliza sinteza de catene complementare.
Ciclurile repetate de denaturare, renaturare şi alungire (extensie)
conduc la amplificarea exponenţială a uneia sau a câtorva secvenţe
specifice de ADN care pot fi determinate electroforetic. Benzile ADN
amplificate care rezultă, sunt specifice matricei originale de ADN şi
pot fi utilizate ca markeri genetici. Iniţal, secvenţele informaţionale ale
capetelor ţintei erau o condiţe prealabilă pentru construirea celor doi
primeri care amplifică ţinta ADN cunoscută.
Markerii RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNAs)
reprezintă o variantă a markerilor PCR, în care pentru conducerea
reacţiei de amplificare este utilizat un singur primer pentru o
secvenţă nucleotidică arbitrară. Utilitatea deosebită a markerilor
genetici bazaţi pe polimorfismul fragmentelor de ADN amplificate
cu primeri arbitrari a fost semnalată de Williams şi colab. (1990).
De asemenea, a fost raportată utilizarea markerilor RAPD şi pentru

58
cartarea genetică a genotipurilor de Fragaria vesca (Davis şi Yu,
1997) şi Fragaria x ananassa (Hancock şi colab., 1994).
Fragmentele ADN generate prin amplificarea cu primeri arbitrari
pot conţine adesea secvenţe ADN repetitive. Întrucât nu este
necesară secvenţa informaţională a ADN ţintă, markerii RAPD pot
fi produşi rapid, iar cantitatea de extract crud de ADN necesară
pentru reacţia de amplificare, este minimă. Aceiaşi primeri pot fi
utilizaţi pentru toate speciile, dar locii detectaţi vor fi diferiţi (Cloutier
şi Landry, 1994; Garcia şi colab., 2002, Milella şi colab., 2006).
Markerii RAPD pot fi produşi mai simplu şi mai rapid (din punct
de vedere tehnic) decât markerii RFLP, însă primii sunt markeri
dominanţi, unde distincţia între genotipurile dominante homozigote
şi heterozigote este greu de făcut în practică. Prin urmare,
se apreciază că markerii RAPD sunt într-un fel mai puţin informativi
dacât markerii RFLP. Sensibilitatea la condiţiile de reacţie şi fondul
genetic limitează de asemenea într-o măsură importantă potenţialul
markerilor RAPD în aplicaţiile de rutină.
Tipurile de markeri ADN sunt într-un proces continuu de
îmbunătăţire. Recent, un nou tip de markeri (derivaţi ai markerilor
RAPD) au fost propuşi pentru analizele vizând detectarea variaţiei
genotipice, în scopul reducerii instabilităţii inerente asociate cu
markerii RAPD.
Markerii SCAR (Sequence Characterized Amplified Region)
sunt produşi prin amplificare PCR condusă de o pereche de primeri
având lungimea de 20 până la 25 de nucleotide, care sunt produşi
prin secvenţierea produşilor de amplificare RAPD.
Un marker SCAR detectează un singur locus, este adesea
un marker codominant, stabil în multe linii, şi poate conţine ADN
repetitiv. Lungimea primer-ului, precum şi condiţiile de amplificare
mult mai stricte, îi face mult mai puţin sensibili la condiţiile de reacţie,
comparativ cu markerii RAPD, şi prin urmare mai reproductibili.
Markerii STS (Sequence Tagged Site), care sunt secvenţe
scurte, unice, amplificate de asemenea prin PCR, diferă uşor de
markerii SCAR. Primerii sunt rezultaţi din secvenţa de informaţie a
capetelor unei clone genomice sau ADNc, care a produs un RFLP.
Un avantaj important al markerilor STS, este acela că se elimină
necesitatea păstrării clonelor. Prin definiţie, este puţin probabil ca
markerii STS să conţină ADN repetitiv. Se apreciază că atât STS, cât
şi RAPD, sunt markeri de mare fidelitate, care pot fi utilizaţi aşadar

59
cu mare succes pentru detectarea variaţiei genetice şi în egală
măsură pentru estimarea frecvenţei variaţiilor somaclonale la plante.
Markerii SSR (Simple Sequence Repeat) constituie repetiţii
în tandem ale unor secvenţe di-, tri- sau tetranucleotidice. Prezintă
numeroase avantaje datorită faptului că sunt foarte polimorfici, sunt
codominanţi, permiţând identificarea tuturor alelelor. În cazul speciilor
cu genom mare, principalul dezavantaj al acestor markeri microsatelit
constă în faptul că, identificarea microsateliţilor şi sinteza primerilor
se face destul de greu şi cel mai adesea nu se poate face asocierea
cu anumite caracteristici. Utilitatea markerilor SSR în identificarea
varietăţilor de Fragaria sau în detectarea variaţiei somaclonale a fost
semnalată de Arnau și colab. (2002), Nourse (2002), Lewers şi colab.
(2005), Dangl şi colab. (2007).

60
 4. MATERIALELE ŞI METODELE UTILIZATE
ÎN EXPERIMENTE DE MULTIPLICARE IN VITRO
A HIBRIZILOR INTERGENERICI FRAGARIA × POTENTILLA

4.1. MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic a fost reprezentat de două genotipuri de

căpşun ornamental, respectiv ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’, provenite
din Colecţia Naţională de Specii şi Soiuri de Fragaria, de la Institutul
de Cercetare-Dezvoltare pentru Pomicultură, Piteşti-Mărăcineni.
Hibridul intergeneric ‘Pink Panda’, omologat în anul 1989
de către J. Ellis sub denumirea ‘Frel’ (Patent PP07598) este un
genotip ornamental de Fragaria, caracterizat de o înflorire continuă,
cu flori de culoare roz.
Origine. Acest genotip ornamental de Fragaria obţinut în cadrul
programului de ameliorare al căpşunului cultivat desfăşurat la Buks,
Anglia, prin hibridarea intergenerică dintre Fragaria × ananassa
şi Potentilla palustris, a fost desemnat ca aparţinând genului Fragaria.
Caracterizarea morfologică. Conform patentului, căpşunul
ornamental ‘Pink Panda’ este o plantă ierboasă, perenă, cu o talie
medie de 10-20 cm înălţime şi 15-20 cm lăţime.
Frunzele compuse trifoliolate, lung peţiolate (lungimea medie
a peţiolului variază între 5,0-7,0 cm), prezintă foliole obovate, uşor
pubescente, cu marginile serate, apexul obtuz şi baza cuneată,
cu o lungime medie de 2,5-5,0 cm şi o lăţime medie de 2,0-4,0 cm.
Inflorescenţa este o cimă paucifloră, erectă în timpul înfloritului
şi caducă la maturitatea fructelor. Sistemul reproductiv ginodioic,
prezintă atât flori femeieşti, cât şi hermafrodite (Şuţan şi colab.,
2008), cu corola formată din şase petale, de formă orbiculară şi
dimensiuni variabile între 2,5 şi 3,5 cm (Fig. 4). Perioada de înflorire
este cuprinsă între luna aprilie şi mijlocul lunii noiembrie, în strânsă
corelaţie cu condiţiile de mediu.
Fructificarea se realizează mai mult sau mai puţin continuu pe
parcursul perioadei de înflorire, cu o productivitate mai ridicată în
condiţiile unor temperaturi mai ridicate. Fructul fals de formă rotundă,
cu dimensiuni de aproximativ 2,0 cm în diametru şi 2,0 cm în lungime,
se formează prin dezvoltarea receptaculului floral care se îngroaşă şi
se înroşeşte.

61
 Căpşunele în număr de 20-30 per plantă, la început de culoare
albă, la maturitate devin roşii, foarte dulci şi gustoase, cu achene
(nucule) de culoare verde închis, destul de proeminente, dispuse
la suprafaţa fructelor, în alveole mici.
Hibridul intergeneric ‘Serenata’ este un genotip de căpşun
ornamental, patentat în 1993, de către J. Ellis (Patent PP08801).
A fost obţinut în cadrul unui program de ameliorare a căpşunului
cultivat (desfăşurat în Buckinghamshire, Anglia), ale cărui principale
obiective au fost crearea unei varietăţi de căpşun cu flori de culoare
roz intens, precum şi cu abilitatea de a forma fructe de mărime şi cu
aromă acceptabile.
Origine. Acest genotip de căpşun ornamental a fost rezultatul
unei hibridări între un genotip obţinut prin ameliorare şi desemnat
82/12-10, reprezentând genitorul matern, şi un genotip desemnat
82/13-27 (mai exact, varietatea de căpşun ornamental ‘Pink Panda’),
reprezentând genitorul patern.
Caracterizarea morfologică. Conform patentului, varietatea de
căpşun ornamental ‘Serenata’ este o plantă ierboasă, perenă, care
are la maturitate o talie de aproximativ 10,0-11,0 cm înălţime şi un
diametru de 18,0-24,0 cm, dar împreună cu rameţii, poate atinge
o lungime de peste 120-130 cm. Filamentele formate în număr mare,
înrădăcinează rapid, iar descendenţa este viguroasă în condiţii
optime de mediu.
Frunzele compuse trifoliolate, sunt de culoare verde închis,
lucioase (datorită cuticulei groase) şi cu dimensiuni de aproximativ
10,0 cm lungime şi 15,0 cm lăţime, Foliolele (aproximativ 8,0 cm
lungime şi 7,0 cm lăţime) transversal concave în prima fază
a creşterii, la maturitate devin rotunde, cu marginea uşor serată.
Peţiolul frunzei, hirsut la suprafaţă, poate atinge o lungime medie
de 7,0-8,0 cm, iar stipelele de culoare cafenie, au o lungime de circa
1,0-2,0 cm.
Caracterizată de o înflorire continuă şi adundentă, din luna
aprilie până în lunile noiembrie sau decembrie (în iernile mai blânde),
această varietate de căpşun ornamental se remarcă prin florile cu
petale de culoare roz-intens, grupate în inflorescenţe cimoase.
Floarea hermafrodită, cu un diametru de aproximativ 2,5 cm, are
caliciul format din şase sepale individualizate, iar corola din şase
petale, sub formă de cupă la deschidere şi apoi de formă rotundă;
este susţinută de un pedicel flexibil, de culoare verde, cu o
pigmentaţie antocianică şi pubescent la maturitate.
62
 Aceeaşi pigmentaţie antocianică se observă şi la baza
pedunculului inflorescenţei. Staminele numeroase şi pistilul, având
o culoare galben, contrastează pregnant cu corola de culoare roz
intens (Fig. 6).
Similar căpşunului ornamental ‘Pink Panda’, înflorirea se
realizează eşalonat din luna aprilie până în luna noiembrie, aceasta
fiind o caracteristică moştenită de la genitorul patern Potentilla
palustris, întâlnită printre speciile genului Fragaria, numai la Fragaria
vesca var. semperflorens (Şuţan şi Popescu, 2006).

Figura 5. Aspecte morfologice ale frunzelor şi florilor

la genotipul de căpşun ornamental ‘Pink Panda’.

Figura 6. Aspecte morfologice ale frunzelor şi florilor

la genotipul de căpşun ornamental ‘Serenata’.
63
 4.2. MEDIILE DE CULTURĂ UTILIZATE

4.2.1. Mediile de bază utilizate

1. Pentru iniţierea culturii in vitro de apexuri caulinare a fost

utilizat mediul de bază Lee-Fossard (1977) modificat, clorura
de calciu (CaCl2) fiind adăugată în mediu într-o concentraţie de 330.0
mg/l. Solidificarea mediului a fost realizată cu 7.0 g/l agar-agar.
2. Pentru multiplicarea microlăstarilor regeneraţi din
apexurile caulinare, s-au utilizat mediile de bază Murashige-Skoog
(1962) şi Lee-Fossard (1977), modificate în mod similar etapei
anterioare. Într-o primă etapă de verificare a capacităţii de micro-
propagare a genotipurilor de căpşun ornamental ‘Pink Panda’
şi ‘Serenata’ a fost testat şi mediul de bază Knop (1965).
3. Pentru iniţierea culturii in vitro utilizând explante de
frunză şi peţiol au fost utilizate aceleaşi medii de bază MS şi LF,
modificate aşa cum am prezentat anterior. În toate experimentele
organizate, mediile de cultură lipsite regulatori de creştere au
reprezentat varianta experimentală martor.

4.2.2. Regulatorii de creştere utilizaţi

Variantele experimentale au fost organizate în funcţie

de combinaţia şi concentraţia regulatorilor de creştere introduşi
în mediile de cultură, precum şi în funcţie de obiectiv, după cum
urmează:
1. Pentru iniţierea culturii in vitro utilizând apexuri caulinare
mediul de bază LF a fost suplimentat cu 3.2 mg/l Kin şi 2.7 mg/l AIA.
2. Pentru multiplicarea lăstarilor regeneraţi din apexuri
caulinare mediile de bază MS şi LF au fost suplimentate fiecare
cu AIA, AIB, BAP, GA3 şi Kin, în şase variante experimentale, care
sunt prezentate în Tabelul 4.
3. Pentru inducerea formării de calus şi regenerarea
de lăstari din explante somatice fragmentele de frunze
şi segmentele de peţiol au fost cultivate pe mediile de bază MS şi LF,
fiecare fiind suplimentat cu diverse combinaţii şi concentraţii ale
2,4-D, AIB şi BAP (Tabel 5).

64
Tabelul 4. Combinaţiile şi concentraţiile regulatorilor de creştere
utilizaţi în compoziţia chimică a mediilor de cultură pentru
multiplicarea lăstarilor regeneraţi din apexuri caulinare.

Regulatorii de creștere utilizați

Codificarea Mediul şi concentrația acestora în mediul
variantelor de de cultură (mg/l)
experimentale bază
BAP AIB AIA GA3 Kin
MM1 MS, LF 0.5 0.1 - 0.1 -
MM2 MS, LF 1.0 0.2 - 0.1 -
MM3 MS, LF 0.5 - 0.5 0.1 -
MM4 MS, LF 1.0 - 1.0 0.1 -
MM5 MS, LF 2.0 - 1.0 - -
MM6 MS, LF 1.0 - - 2.0 0.5

Tabelul 5. Combinaţiile şi concentraţiile regulatorilor de creştere

utilizaţi în compoziţia chimică a mediilor de cultură pentru stimularea
proliferării celulare şi regenerării de lăstari prin organogeneză
indirectă.
Regulatorii de creştere utilizați
Codificarea şi concentrația acestora în mediul
Mediul
variantelor de cultură (mg/l)
de bază
experimentale
2,4 - D AIB BAP
CIM 1 MS, LF 0.5 - 3.0
CIM 2 MS, LF 1.0 - 3.0
CIM 3 MS, LF 1.0 - 5.0
CIM 4 MS, LF - 0.5 3.0
CIM 5 MS, LF - 1.0 3.0
CIM 6 MS, LF - 1.0 5.0

4. Pentru regenerarea de lăstari din explante somatice prin

organogeneză directă fitohormonii 2,4-D sau AIA, împreună cu TDZ,
au fost utilizaţi pentru suplimentarea mediului de bază MS, în şase
combinaţii diferite, prezentate în Tabelul 6.
5. Înrădăcinarea in vitro a lăstarilor obţinuţi a fost stimulată
prin suplimentarea mediului de bază solidificat, conţinând ½ n
macroelemente MS, ½ n microelemente LF şi vitamine MS, cu
diferite concentraţii ale auxinelor AIB şi AIA, împreună cu 0.1 mg/l
GA3 (Tabel 7).
65
Tabelul 6. Combinaţiile şi concentraţiile regulatorilor de creştere
utilizaţi în compoziţia chimică a mediilor de cultură în scopul
regenerării de lăstari prin organogeneză directă.

Regulatorii de creştere utilizați

Codificarea şi concentrația acestora în mediul
Mediul de cultură (mg/l)
variantelor
de bază
experimentale
2,4 - D AIB TDZ
DO 1 MS 0.5 - 0.5
DO 2 MS 1.0 - 1.0
DO 3 MS 1.0 - 1.5
DO 4 MS - 0.5 0.5
DO 5 MS - 1.0 1.0
DO 6 MS - 1.0 1.5

Tabelul 7. Compoziţia mediului de cultură utilizat pentru

înrădăcinarea in vitro a lăstarilor micropropagaţi prin lăstărire axilară.

Hormonii de creştere
Codificarea şi concentraţia acestora
variantelor Mediul de bază în mediul de cultură (mg/l)
experimentale
AIB AIA GA3
Macroelemente MS ½ n,
RM1 Microelemente LF ½ n, 0.25 - 0.1
Vitamine MS n
Macroelemente MS ½ n,
RM2 Microelemente LF ½ n, 0.5 - 0.1
Vitamine MS n
Macroelemente MS ½ n,
RM3 Microelemente LF ½ n, - 0.5 0.1
Vitamine MS n

66
 4.3. MATERIALUL BIOLOGIC UTILIZAT ÎN EXPERIENŢELE
DE ANALIZĂ GENETICĂ

Plantele donoare, de la care au fost prelevate apexurile

caulinare cu care au fost iniţiate culturile in vitro, împreună
cu microlăstarii obţinuţi după o serie de subculturi succesive pe medii
de multiplicare, precum şi somaclonele regenerate din explantele
de frunză şi peţiol, au servit ca material biologic pentru studierea
stabilităţii genetice în cultura in vitro a genotipurilor de căpşun
ornamental ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’. Particularităţile de metodică
prin care au fost obţinuti microlăstarii şi somaclonele, compoziţia
mediilor de cultură, precum şi vârsta culturilor in vitro sunt prezentate
în Tabelul 9. Fiecărei somaclone, i-a fost atribuit un cod, care se va
regăsi în imaginile produşilor de amplificare.

4.3.1. Primerii utilizaţi în amplificarea ADN

Secvenţele de ADN au fost amplificate utilizând 48 de primeri,

aleşi aleatoriu. Toţi primerii testaţi iniţial, au avut aceeaşi provenienţă
(Mycrosinth) şi au fost decanucleotidici, secvenţele lor 5’-3’ fiind
prezentate în Tabelul 8.

4.4. EXPERIMENTE REALIZATE PENTRU DETERMINAREA

CAPACITĂŢII DE MICROPROPAGARE A HIBRIZILOR
FRAGARIA × POTENTILLA

4.4.1. Iniţierea culturii in vitro

În faza de iniţiere a culturii, au fost folosite apexuri caulinare

cu 2-3 primordii foliare şi cu dimensiuni cuprinse între 0.1 şi 0.3 mm,
care au fost inoculate pe mediu de cultură solidificat în plan înclinat.
Asepsizarea materialului biologic s-a realizat în două etape, prima
etapă constând în imersia filamentelor în alcool etilic 94° timp de 1-2
minute, iar în a doua etapă, în hipoclorit de calciu 6%, timp de 14
minute, urmate de 3 clătiri cu apă distilată sterilă.

67
Tabelul 8. Primerii utilizaţi în amplificarea ADN.

Nr. Primer Secvenţa (5’ – 3’) Nr. Primer Secvenţa (5’ – 3’)

1 OPA01 CAGGCCCTTC 25 OPB05 TGCGCCCTTC

2 OPA02 TGCCGAGCTG 26 OPB06 TGCTCTGCCC
3 OPA03 AGTCAGCCAC 27 OPB07 CGTGACGCAG
4 OPA04 AATCGGGCTG 28 OPB08 GTCCACACGG
5 OPA05 AGGGGTCTTG 29 OPB09 TGGGGGACTC
6 OPA06 GGTCCCTGAC 30 OPB10 CTGCTGGGAC
7 OPA07 GAAACGGGTG 31 OPB11 GTAGACCCGT
8 OPA08 GTGACGTAGG 32 OPB12 CCTTGACGCA
9 OPA09 GGGTAACGCC 33 OPB13 TTCCCCCGCT
10 OPA10 GTGATCGCAG 34 OPB14 TCCGCTCTGG
11 OPA11 CAATCGCCGT 35 OPB15 GGAGGGTGTG
12 OPA12 TCGGCGATAG 36 OPB16 TTTGCCCGGA
13 OPA13 CAGCACCCAC 37 OPB17 AGGGAACGAG
14 OPA14 TCTGTGCTGG 38 OPB18 CCACAGCAGT
15 OPA15 TTCCGAACCC 39 OPB19 ACCCCCGAAG
16 OPA16 AGCCAGCGAA 40 OPB20 GGACCCTTAC
17 OPA17 GACCGCTTGT 41 OPC01 TTCGAGCCAG
18 OPA18 AGGTGACCGT 42 OPC02 GTGAGGCGTC
19 OPA19 CAAACGTCGG 43 OPC03 GGGGGTCTTT
20 OPA20 GTTGCGATCC 44 OPC04 CCGCATCTAC
21 OPB01 GTTTCGCTCC 45 OPC05 GATGACCGCC
22 OPB02 TGATCCCTGG 46 OPC06 GAACGGACTC
23 OPB03 CATCCCCCTG 47 OPC07 GTCCCGACGA
24 OPB04 GGACTGGAGT 48 OPC08 TGGACCGGTG

68
Tabelul 9. Plantele control, microplantulele şi somaclonele
investigate în scopul evidenţierii stabilităţii genetice.
Microlăstari

somaclone
Genotip

Metoda de Vârsta
Mediul de cultură micropropagare/ culturii
şi

tipul de explant in vitro

S1 Colecţia de germoplasmă
MS (mediu agarizat):
- 1.0mg/l BAP, Lăstărire axilară /apex
S2 120 de zile
- 1.0 mg/l AIA, caulinar
- 0.1 mg/l GA3
LF (mediu agarizat):
- 1.0mg/l BAP, Lăstărire axilară / apex
S3 120 de zile
- 1.0 mg/l AIA, caulinar
Serenata

- 0.1 mg/l GA3

LF (mediu agarizat):
Organogeneză indirectă /
S4 - 0.5 mg/l AIB, 90 de zile
fragmente de frunză
- 3.0 mg/l BAP
LF (mediu agarizat):
Organogeneză indirectă /
S5 - 0.5 mg/l AIB, 90 de zile
fragmente de peţiol
- 3.0 mg/l BAP
MS (mediu agarizat):
Organogeneză indirectă /
S6 - 1.0 mg/l AIB, 90 de zile
fragmente de frunză
- 3.0 mg/l BAP
PP1 Colecţia de germoplasmă
MS (mediu agarizat):
- 1.0 mg/l BAP, Lăstărire axilară / apex
Pink Panda

PP2 90 de zile
- 1.0 mg/l AIA, caulinar
- 0.1 mg/l GA3
LF (mediu agarizat):
- 1.0mg/l BAP, Lăstărire axilară / apex
PP3 90 de zile
- 1.0 mg/l AIA, caulinar
- 0.1 mg/l GA3

69
 4.4.2. Experimente realizate pentru determinarea capacităţii
de micropropagare prin lăstărire axilară

Microlăstarii obţinuţi după faza de iniţiere a culturii in vitro au fost

divizaţi şi transferaţi pe mediile de multiplicare, în şase variante
experimentale determinate de combinaţia şi concentraţia hormonilor
de creştere (Tabel 4).

4.4.3. Experimente realizate pentru determinarea capacităţii

de micropropagare prin organogeneză directă şi indirectă

În cadrul experimentelor de inducere a calusogenezei şi

regenerării de lăstari via calus la genotipurile de căpşun ornamental
‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’, cultura de calus a fost iniţiată atât din
segmente de peţiol (0.3-0.5 cm lungime), cât şi din fragmente de
frunză (0.3-0.5 cm diametru), recoltate de la plantule regenerate in
vitro. În acest sens, microlăstarii regeneraţi din explante meristematice
au fost transferaţi pe mediul de bază LF suplimentat cu 0.5 mg/l BAP,
0.5 mg/l AIB şi 0.2 mg/l GA3. Acest pretratament a fost realizat pentru
ca microplantulele să asimileze o cantitate mai mare de fitohormoni,
să crească (permiţând astfel recoltarea unor explante somatice de
dimensiuni mai mari) şi pentru ca explantele să aibă un potenţial
ridicat de regenerare de lăstari (Sorvari şi colab., 1993).

4.5. EXPERIMENTE REALIZATE PENTRU STUDIUL

STABILITĂŢII GENETICE A PLANTELOR ÎNMULŢITE
CLONAL IN VITRO

4.5.1. Selecţia primerilor utilizaţi în studiul stabilităţii

genetice

Generarea polimorfismului, claritatea, luminozitatea şi numărul

mare de benzi al produşilor de amplificare au reprezentat criteriile de
selecţie a celor 10 primeri decanucleotidici utilizaţi pentru
determinarea stabilităţii genetice a plantulelor regenerate in vitro
(Tabel 10).

4.5.2. Extracţia de ADN în vederea executării analizelor

RAPD
70
 Pentru toate somaclonele, extracţia de ADN genomic s-a realizat
utilizând DNEasy Plant Mini Kit (metoda Qiagen) urmărind protocolul
recomandat de producători.

4.5.3. Amplificarea RAPD

Reacţia de amplificare s-a desfăşurat într-un aparat TC-512
Gradient Thermocycler (Bibby Scientific Ltd), programat 2 minute la
95ºC pentru denaturarea preliminară a ADN, urmată de 45 de cicluri
cu următorul profil de temperatură: 30 secunde la 92ºC - denaturare;
25 secunde la 36ºC - fixarea primerilor; 74 secunde la 72ºC -
extensie; 7 minute la 72ºC - extensia finală.

Tabelul 10. Primerii utilizaţi pentru amplificarea ADN

Nr. Primer Secvenţa (5’-3’)

1 OPA02 TGCCGAGCTG
2 OPA07 GAAACGGGTG
3 OPA20 GTTGCGATCC
4 OPB05 TGCGCCCTT
5 OPB10 CTGCTGGGAC
6 OPB17 AGGGAACGA
7 OPC05 GATGACCGCC
8 OPC06 GAACGGACTC
9 OPC08 TGGACCGGTG
10 OPC010 TGTCTGGGT

4.5.4. Electroforeza în gel de agaroză

Migrarea gelurilor s-a realizat în cuva de electroforeză orizontală,

în tamponul Tris-borat 0,5 x (TBE). Produşii PCR au fost coloraţi cu
bromură de etidiu (10,0 mg/ml), adăugată în gel.

4.5.5. Preluarea imaginilor

71
 Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat în lumină UV,
iar fotografiile gelurilor au fost realizate cu aparatul Gene Flash
Syngene Bio Imaging.

4.5.6. Analiza imaginilor

Benzile au fost detectate cu ajutorului programului LabImage,

care stabileşte şi mărimea fragmentelor de ADN amplificate prin
compararea acestora cu un ADN standard (Ladder ADN 100 pb),
constând din 14 de fragmente cuprinse între 100 şi 3000 pb.
De asemenea, a fost calculată distanţa genetică dintre
genotipurile ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’, utilizând indicele de similaritate
Jaccard (programul FreeTree, metoda Unweighted Pair Group Method
based on Arithmetic mean (UPGMA).

4.6. METODE STATISTICE DE CALCUL ŞI INTERPRETARE

A REZULTATELOR

Utilizând programul de analiză statistică SPSS for Windows

(Statistical Package for the Social Science), versiunea 16.0 (2007), s-
a aplicat modelul ONE-WAY ANOVA în cazul comparaţiilor între trei
sau mai multe variante. Semnificaţia diferenţelor dintre efectele
factorilor experimentali sau a interacţiunii dintre aceştia, pentru care F
calculat a avut valori semnificative la un nivel de confidenţă de 95%, a
fost notată cu litere mici. Pentru şiruri multidimensionale de
date, a căror dependenţă statistică este de natură probabilistică s-
a calculat coeficientul corelaţiei simple şi s-a determinat regresia
datelor.

5. CAPACITATEA DE MICROPROPAGARE PRIN LĂSTĂRIRE

AXILARĂ A UNOR HIBRIZI INTERGENERICI

72
 FRAGARIA × POTENTILLA

5.1. CAPACITATEA DE REGENERARE DE LĂSTARI DIN

APEXURI CAULINARE

Pornind de la premisa că plantele regenerate prin lăstărire

axilară sunt caracterizate, în general, de o mai mare uniformitate
genetică şi că rata de multiplicare poate fi menţinută la un nivel ridicat
pe parcursul mai multor subculturi, regenerarea de lăstari din apexuri
caulinare, urmată de multiplicarea acestora poate constitui o primă
opţiune în demararea procesului de micropropagare.
Pentru hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla investigaţi,
frecvenţa de regenerare de lăstari din apexurile caulinare a fost
de 100%, iar apariţia primilor lăstari a fost notată la aproximativ
16 zile după iniţierea culturii. În figura 7 sunt prezentaţi microlăstari de
căpşun ornamental regeneraţi din apexuri caulinare prelevate
de la filamente, recoltate de la plante mature din câmp.

‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Figura 7. Plantule regenerate din apexuri caulinare.

Frecvenţa maximă de regenerare de lăstari obţinută în urma

acestor experimente reprezintă un argument important în
implementarea tehnicilor de cultură in vitro la hibrizii intergenerici ‘Pink
Panda’ şi ‘Serenata’. De altfel, utilizate pentru prima dată de către
Boxus, în anul 1974, tehnicile de cultură in vitro de celule şi ţesuturi,
73
reprezintă astăzi procedee extrem de valoroase, aplicate frecvent în
programele de ameliorare a speciilor aparţinând genului Fragaria sau
de multiplicare a selecţiilor de elită (Taji şi colab., 2002). Totuşi, în
obţinerea unui rezultat favorabil prin utilizarea tehnicilor de multiplicare
in vitro, abilitatea de regenerare de lăstari a genotipului studiat este
crucială (Cao şi Hammerschlag, 2000).
La căpşun, în general, meristemele din vârfurile filamentelor au
un potenţial ridicat de regenerare de lăstari, ceea ce le conferă
statutul de cele mai utilizate tipuri de explante utilizate în
micropropagare (Sowik şi colab., 2001)
În prezent, culturile de meristeme apicale reprezintă cea mai
extinsă utilizare a tehnicilor in vitro, atât în scopul micropropagării, cât
şi în cel al obţinerii plantelor libere de virusuri. Capacitatea
de creştere nelimitată in vitro a meristemelor apicale nu se limitează
numai la alungirea rapidă a lăstarului preformat, ci funcţie de balanţa
hormonală a mediului de cultură, se poate realiza neogeneza de
lăstari suplimentari, capacitatea regenerativă a acestor culturi fiind
practic nelimitată (Corneanu şi Corneanu, 2007). În plus, se apreciază
că meristemele de căpşun pot fi subcultivate aparent fără limită pe
mediile lipsite de regulatori de creştere, fără ca viabilitatea sau alte
caracteristici specifice soiurilor să fie alterate.

5.2. CAPACITATEA DE MULTIPLICARE IN VITRO

5.2.1. Influenţa genotipului asupra ratei de multiplicare

in vitro

Din multitudinea de factori implicaţi în procesul regenerativ,

genotipul se situează în prim plan, hibridul intergeneric ‘Serenata’
menţinând avantajul genotipului cu capacitate superioară de
multiplicare in vitro, pe parcursul tuturor celor patru subculturi.
Din datele prezentate în figura 8, se observă că determinarea
numărului mediu de lăstari regeneraţi după cele patru subculturi
succesive a evidenţiat un potenţial de regenerare de 1.96 ori mai
mare al genotipului ‘Serenata’ (pentru care a fost determinat un număr
mediu de 14.69 lăstari formaţi per explant iniţial), comparativ cu ‘Pink
Panda’ (pentru care a fost calculat un număr mediu de 7.49 lăstari
formaţi per explant iniţial).
Ca urmare a problemelor asociate cu stabilitatea genetică
a plantelor multiplicate clonal prin proliferarea mugurilor axilari
74
în subculturi succesive (Rosati, 1993), în cadrul cercetărilor iniţiate de
noi s-a limitat transferul lăstarilor pe medii proaspete de multiplicare,
nedepăşindu-se 4 subculturi.

25

a
20
Numărul mediu de lăstari/explant

a
b
15 b
b

c
10
cd cd cd
d
5

0
‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Subcultura 1 Subcultura 2 Subcultura 3 Subcultura 4 Media

Figura 8. Influenţa genotipului asupra ratei de multiplicare in vitro,

la genotipurile ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’ (barele reprezintă abaterea
standard; a, b, c, d: interpretarea semnificaţiei diferenţelor, cu ajutorul
testului Duncan, p<0,05).

Rezultatele obţinute sunt în conformitate cu datele din literatura

de specialitate, influenţa genotipului asupra capacităţii de multiplicare
in vitro a căpşunului fiind raportată adesea (Simpson şi Bell, 1989;
Landi şi Mezzetti, 2006; Kikas şi colab., 2006; Debnath şi Teixeira da
Silva, 2007).
Corespondenţa dintre genotip şi capacitatea de multiplicare
in vitro a urmat aceeaşi reprezentare după transferul succesiv al
lăstarilor pe medii de multiplicare proaspete, hibridul intergeneric
‘Serenata’ menţinând avantajul genotipului cu o capacitate superioară
de proliferare in vitro (Şuţan şi colab., 2008).

5.2.2. Influenţa mediului de bază asupra ratei de

multiplicare in vitro
75
 Rezultatele înregistrate în experimentele de regenerare de lăstari
la hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla, reflectă cu claritate rolul
important pe care compoziţia mediului de cultură îl deţine în
ansamblul factorilor care determină exprimarea potenţialului
regenerativ, o dovadă concludentă în acest sens fiind efectul diferit al
aceloraşi combinaţii de hormoni în medii de bază cu compoziţie
sensibil diferită în săruri.
Indiferent de combinaţia regulatorilor de creştere, compoziţia
mediului de bază Knop a influenţat negativ capacitatea de regenerare
in vitro a hibrizilor intergenerici Fragaria × Potentilla. Rata de
multiplicare redusă (2-5 lăstari formaţi per explant iniţial la genotipul
‘Pink Panda’, respectiv 4-8 lăstari per explant iniţial la genotipul
‘Serenata’) a fost asociată, în fiecare subcultură, cu o vigoare redusă
a lăstarilor şi cu uscarea prematură a unui procent semnificativ de
lăstari în cazul genotipului ‘Pink Panda’ (Fig. 9), care nu au putut face
obiectul studiilor ulterioare, privind capacitatea de înrădăcinare in vitro
şi de aclimatizare la condiţiile din seră.

‘Pink Panda’ ‘Serenata’

Figura 9. Influenţa mediului de bază Knop asupra ratei de multiplicare

in vitro la hibrizii intergenerici ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’ (a doua subcultură).
În mod similar, rata de multiplicare a fost scăzută în cazul
variantelor martor, absenţa regulatorilor de creştere din mediile
de cultură reflectându-se în incapacitatea regenerativă a unui număr
76
mare de explante, începând cu cel de-al doilea transfer al lăstarilor pe
medii nutritive proaspete. Pornind de la aceste constatări, în
studiile de determinare a capacităţii de multiplicare a lăstarilor
regeneraţi din apexuri caulinare, au fost utilizate exclusiv mediile
de bază MS şi LF.
În figura 10 sunt prezentate rezultatele de sinteză privind
influenţa mediului de bază asupra numărului de lăstari obţinuţi,
relevantă în acest sens fiind diferenţa de 2.1 lăstari formaţi per explant
iniţial calculată între variantele experimentale definite de mediul MS,
respectiv LF, la genotipul ‘Serenata’. Diferenţa de numai 1.11 lăstari
formaţi per explant iniţial determinată între cele două medii de bază, la
genotipul ‘Pink Panda’, dezvăluie influenţa decisivă a interacţiunii
genotip × mediu de bază asupra multiplicării.
Totuşi, în absenţa unor diferenţe semnificative ale valorilor ratei
de multiplicare, care ar fi putut fi atribuite influenţei mediului de bază,
vigoarea mai ridicată a lăstarilor multiplicaţi pe variantele
experimentale caracterizate de mediul nutritiv MS, indică faptul că
mediul de bază MS are o compoziţie minerală favorabilă
micropropagării prin lăstărire axilară, a genotipurilor de căpşun
ornamental ‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’.
Aceste constatări sunt de altfel susţinute şi faptul că, la ambele
genotipuri, cele mai înalte valori ale ratei de multiplicare au fost induse
pe mediul de bază MS. Se remarcă astfel că, deşi cei doi hibrizi
intergenerici au origine diferită, interacţiunea cu mediul de bază a fost
similară.
Pe de altă parte, se apreciază că mediul LF oferă condiţii
de dezvoltare optimizate în comparaţie cu mediul MS, întrucât prin
omiterea glicinei, piridoxinei-HCl şi acidului nicotinic, dar prin
creşterea de 4 ori a nivelului de tiamină-HCl, se întrunesc cerinţele
specifice ale culturilor heterotrofice.
Totuşi, odată cu formarea dintr-un meristem a unui lăstar cu
frunze verzi, acesta devine independent de factorii de creştere
exogeni, exceptând cazul în care formarea pigmenţilor din plastide
este dereglată de compoziţia minerală neadecvată şi/sau de acţiunea
fitohormonilor.

77
 25
a
ab
20 bc
cd
Numărul mediu de lăstari/explant

cd
cd cd cd cd
15 de

ef fg
10 ef fg
fg fg
fg fg
g fg
5

0
MS LF MS LF

‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Subcultura 1 Subcultura 2 Subcultura 3 Subcultura 4 Media

Figura 10. Influenţa mediului de bază asupra ratei de multiplicare in vitro,

la genotipurile ‘Pink Panda’ şi ‘Serenata’ (barele reprezintă abaterea
standard; a, b, c, d, e, f, g: interpretarea semnificaţiei diferenţelor, cu ajutorul
testului Duncan, p<0.05).

Diferenţele de compoziţie dintre mediile de bază utilizate pentru

cultura in vitro a speciilor de Fragaria (Murashige şi Skoog, 1962;
Linsmaier şi Skoog, 1965; Gamborg, 1968; Boxus, 1977; Lee
şi Fossard, 1977) par minore la prima vedere, dar acestea pot avea
efect considerabil asupra evoluţiei explantelor. Jungnickel (1988)
sesiza că, spre exemplu, raportul K/Ca este 6.68 în mediile MS sau
LS, dar numai 1.02 în mediul Boxus. În plus, raportul N/P este
40 în mediile MS sau LS, dar numai 5.94 în mediul propus de Boxus.
În culturile mixotrofe, raportul N/P între 65 şi 70 a fost găsit ca fiind
echilibrat, ceea ce înseamnă că un raport mai mare determină
tendinţa spre limitarea dependentă de fosfat a creşterii, în timp ce un
raport considerabil mai redus poate cauza limitarea creşterii culturilor
dependentă de azot, dacă nu cumva un alt factor limitativ este implicat.
Conţinutul ridicat de fosfat din macroelementele Knop (aflate
la baza mediului Boxus) este rezonabilă în culturile autotrofice de
plante, ca sursă de protoni pentru utilizarea nitratului, dar folosirea
zahărului exogen este de asemenea o sursă de protoni, şi prin urmare,
în condiţii mixotrofice, mediul Boxus devine supraîncărcat cu fosfat.

78
 S-a sesizat totodată faptul că, în cursul autoclavării o parte din
fierul din chelaţii de fier este substituit de alţi cationi prezenţi în mediul
de cultură, şi este bine cunoscută favorizarea co-precipitării fierului de
către concentraţiile ridicate de calciu şi fosfat.
Concentraţiile de microelemente sunt de asemenea discutabile.
Lee şi Fossard (1975) au arătat că omiterea calciului, sodiului, borului,
cuprului, cobaltului sau iodului nu determină reducerea numărului
mediu de frunze în culturile nodale, dar s-ar fi impus ca să fie luată în
consideraţie şi valoarea analitică a chimicalelor (Jungnickel, 1988).
Căpşunul este sensibil la excesul de clor sau bor, concentraţia
acestora trebuind să fie prin urmare strict respectată. S-a arătat
de asemenea că, adăugarea KNO3 la mediul Boxus a avut ca efect o
rată crescută de creştere.
Totuşi, NH4NO3 a determinat reducerea creşterii la o
concentraţie de 3.0 mM sau mai mare. Aceste rezultate sunt
considerate ca fiind surprinzătoare, întrucât s-a demonstrat că
genotipurile de căpşun sunt capabile să utilizeze în egală măsură ionii
nitrat şi amoniu, exceptând cazul în care capacitatea metabolică
a acestora a fost afectată de factori exogeni. Întrucât asimilarea
amoniului este acompaniată de eliberarea de protoni, care sunt
necesari pentru utilizarea azotului, azotatul de amoniu poate fi un
agent fiziologic neutru foarte eficient, iar sărurile de amoniu ale acizilor
organici sunt componente chimice şi fiziologice tampon. Mediile
nutritive în care nitratul este unica sursă de azot, ar trebui să
aibă o valoare iniţială a pH-ului cât mai redusă posibil, dar explantele
sunt incapabile să folosească N furnizat ca (NH4)2SO4.
Tarenghi şi colab. (1995) au evidenţiat faptul că, efectul de
ansamblu al mediilor de cultură pentru micropropagarea genotipurilor
de căpşun poate fi considerabil îmbunătăţit prin adăugarea de
inhibitori ai biosintezei de poliamine sau ai poliaminelor.

5.2.3. Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor

de creştere asupra ratei de multiplicare in vitro

Divizarea şi transferul lăstarilor pe medii de cultură proaspete,

păstrând corespondenţa variantelor experimentale, a evidenţiat
interacţiunea favorabilă dintre genotipurile de căpşun ornamental
studiate cu formule specifice ale hormonilor de creştere, după cum
este evidenţiat în figura 11.
79
 Suplimentarea mediului de cultură cu BAP, într-o concentraţie de
0.5 mg/l, în combinaţie cu 0.1 mg/l AIB şi 0.1 mg/l GA3 a condus la
rezultate favorabile la genotipul ‘Serenata’, multiplicarea realizându-se
cu o rată egală cu 15.93 lăstari formaţi per explant iniţial, per
subcultură. Aceeaşi combinaţie a hormonilor de creştere, dar în
concentraţii mai mari, respectiv 1.0 mg/l BAP, în combinaţie cu 0.2
mg/l AIB şi 0.1 mg/l GA3, a condus la cea mai înaltă rată de
multiplicare la genotipul ‘Pink Panda’, egală cu 5.88 lăstari formaţi per
explant iniţial, per subcultură.
Deşi numărul mediu de lăstari formaţi per explant iniţial a fost
ridicat şi în varianta experimentală conţinând 2.0 mg/l BAP + 0.5 mg/l
Kin + 2.0 mg/l GA3, această balanţă hormonală nu este indicată
datorită vitrificării lăstarilor. De asemenea, balanţa hormonală 1.0 mg/l
BAP + 1.0 mg/l AIA + 0.1 mg/l GA3, caracterizată de o concentraţie
mai mare de auxină, a indus formarea de calus, aspect ce nu o
recomandă pentru lucrările de multiplicare clonală in vitro.

30

a
25
Numărul mediu de lăstari / explant

abc
a ab abcd
20 a
ab abcd
a a
ab

a a ab
abcd a ab
abc
15 a abc
abc abc
abc abc
abc
ab d abcd abcd
bc
bc bc cde
bcde bcd abcd
10 c bc bcde
cde cd cd bcd
c cd
bcd d bcd cd c
cd cd
de d cd
d cde
5 dd
d
e

‘Serenata’ ‘Pink Panda’ ‘Serenata’ ‘Pink Panda’ ‘Serenata’ ‘Pink Panda’ ‘Serenata’ ‘Pink Panda’ ‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Subcultura 1 Subcultura 2 Subcultura 3 Subcultura 4 Media

MM 1 MM 2 MM 3 MM 4 MM 5 MM 6

Figura 11. Influenţa combinaţiei şi concentraţiei hormonilor de creştere

asupra ratei de multiplicare in vitro, la genotipurile ‘Pink Panda’ şi
‘Serenata’ (barele reprezintă abaterea standard; a, b, c, d, e: interpretarea
semnificaţiei diferenţelor, cu ajutorul testului Duncan, p<0,05).
Dacă luăm în consideraţie faptul că, diferenţele dintre variantele
experimentale cu concentraţii mai mici şi cele cu concentraţii mai mari
80
de auxine nu sunt semnificative pentru p<0,05 (conform testului
Duncan), putem afirma că rezultatele obţinute de noi sunt similare
celor raportate de alţi cercetători, care au sugerat pentru
micropropagarea căpşunului următoarele combinaţii ale regulatorilor
de creştere: 1.0 mg/l BAP + 1.0 mg/l AIA + 0.05 mg/l GA3; 0.5 mg/l
BAP + 0.1 mg/l AIB + 0.1 mg/l GA3 (Boxus, 1999; Litwińczuk, 2004);
0.5 mg/l BAP + 0.1 mg/l AIB (Bozena, 2001) şi 0.2 mg/l BAP + 0.01
mg/l AIB + 0.1 mg/l GA3 (Li şi colab., 2009).
Analizând influenţa balanţei hormonale asupra capacităţii de
multiplicare, se constată că începând cu a doua subcultură a crescut
rata de multiplicare pentru varianta experimentală MM6, creşterea
fiind semnificativă la genotipul ‘Serenata’. Deci, adiţia a 1.0 mg/l BAP
şi a 0.5 mg/l Kin, dintre citochinine, şi a 2.0 mg/l GA3, dintre auxine,
a avut un efect semnificativ asupra ratei de micropropagare,
conducând la un număr mediu de 17.65 lăstari per explant iniţial
la genotipul ‘Serenata’, respectiv 7.87 regeneranţi per explant iniţial la
genotipul ‘Pink Panda’, după a doua subcultură. Şi după a patra
subcultură valorile ratei de multiplicare calculată pentru această
variantă experimentală s-au menţinut ridicate, la genotipul ‘Serenata’
înregistrându-se cel mai mare număr de lăstari formaţi per explant,
respectiv 16.22. În acest context, trebuie menţionat faptul că,
citochinina kinetină a fost utilizată cu eficienţă ridicată la căpşun, în
special pentru inducerea de calus şi regenerarea de plante prin
organogeneză indirectă (Sayegh, 1989; Kaushal şi colab., 2006;
Popescu și colab., 1997) sau în inducerea embriogenezei somatice la
Fragaria × ananassa (Husaini şi colab., 2008).
De asemenea, efectul cumulativ favorabil al Kin şi BAP asupra
proliferării lăstarilor in vitro, a fost raportat şi la alte specii de plante,
precum Psidum guajava (Loh şi Rao,1989), Citrus aurantifolia
(Al-Bahrany, 2002), Capsicum frutescens (Sanatombi şi Sharma,
2007) sau Vitex agnus-castus (Balaraju şi colab., 2008) etc. Pe de
altă parte, având în vedere concentraţia mare a acidului giberelic (GA3)
în această variantă experimentală, se impune precizarea că o serie de
rezultate experimentale au arătat că, în general, giberelinele sporesc
dominanţa apicală.

6. CAPACITATEA DE REGENERARE DE LĂSTARI

PRIN ORGANOGENEZĂ INDIRECTĂ UTILIZÂND MEDII
81
 DE CULTURĂ AGARIZATE

6.1. CAPACITATEA DE CALUSOGENEZĂ A EXPLANTELOR

DE FRUNZĂ ŞI PEŢIOL CULTIVATE PE MEDII DE
CULTURĂ AGARIZATE

Pentru a preveni efectul negativ al unui stadiu de dezvoltare

“ante” sau “post” celui dovedit a fi optim, plantulele (originare din
apexuri caulinare), utilizate ca sursă de explante, au fost supuse
pretratamentului propus de Sorvari şi colab. (1993), care a vizat
sporirea nivelului de hormoni endogeni, anterior momentului recoltării
de explante somatice. În acest context, este important de semnalat că,
în studiile preliminare pe care le-am realizat cu scopul inducerii
organogenezei la hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla,
în absenţa pretratamentului de ameliorare a stării fiziologice a
plantulelor utilizate ca sursă de explante, procesele de calusogeneză
şi morfogeneză au eşuat, semnalându-se necroza explantelor după 7-
10 zile de la iniţierea culturii.
De asemenea, absenţa hormonilor de creştere din mediile
de cultură, în varianta martor, a fost semnificativă, în numai 14 zile
fiind observate primele procese necrotice, care au fost iniţiate în zona
de rănire a fragmentelor de frunză şi a segmentelor de peţiol, după
următoarele 20 de zile, necroza explantelor somatice fiind totală.
Jungnickel (1988) a subliniat că explantele de căpşun, altele decât
meristemele, nu regenerează lăstari sau plantule pe medii lipsite de
fitohormoni. De asemenea, faptul că necroza s-a instalat iniţial în zona
de rănire a explantelor somatice, sugerează şi influenţa negativă a
stresului oxidativ, cauzat de rănirea ţesuturilor (Yahraus şi colab.,
2005).
Stresul oxidativ (Gille şi Siegler, 1995; Bartosz, 1997) definit
ca dezechilibrul raportului celular dintre substanţele oxidante şi
antioxidante în favoarea celor oxidante, se poate manifesta printr-un
conţinut ridicat în săruri (McKersie şi Leshem, 1994), deficitul
elementelor minerale (Elstner, 1991), stresul hidric (Navari-Izzo şi
colab., 1996), prin excesul ionilor de metal (Caro şi Puntarulo, 1996)
sau printr-o posibilă supraexpunere la acţiunea auxinelor (Droog,
1997), conducând treptat la deteriorarea constituenţilor celulari şi
moartea celulelor.
În celelalte variante experimentale, adaosul regulatorilor de
creştere în diferite combinaţii şi concentraţii în mediile de cultură a
82
indus proliferarea celulară, evidenţiată iniţial, prin deformarea
explantelor somatice, aspect ilustrat în figura 12.

1,0 mm 1,0 mm
A B

Figura 12. Iniţierea proliferării celulare în explantele de frunză (A)

şi de peţiol (B) inoculate pe medii de cultură agarizate.

Formarea calusului a fost observată după trei săptămâni de la

inocularea explantelor somatice pe mediile de cultură, iar calusurile
formate au fost menţinute pe aceleaşi medii nutritive (fără divizarea şi
subcultivarea acestora), până la formarea lăstarilor. Probabil ca o
consecinţă a prezenţei în cantităţi sporite a hormonilor de creştere în
zonele de rănire (Khal, 1983), stimulând astfel proliferarea celulară,
calusogeneza a fost iniţiată în special în zona de rănire a explantelor,
şi uneori dispersat pe suprafaţa acestora.
Un calus friabil, morfogen a fost bine dezvoltat după aproximativ
40- 45 zile de la inocularea in vitro a explantelor somatice. Ţesutul
calusal compact a crescut la suprafaţa mediului nutritiv formând
o masă amorfă de celule parenchimatice cu pereţi subţiri, fără
o anumită structură anatomică. Masa de calus a avut diferite culori:
galbenă-verde, verde, brună sau a prezentat o pigmentaţie roz-roşie,
caracteristică secreţiei de antociani, indusă mai intens în calusul
derivat din explante somatice la genotipul ‘Serenata’, comparativ cu
‘Pink Panda’. De asemenea, un anumit procent de explante au
necrozat, pierderea treptată a capacităţii de diviziune a celulelor,
conducând la necroza acestuia.

83
 6.1.1. Influenţa genotipului asupra capacităţii de
calusogeneză a explantelor de frunză şi peţiol cultivate
pe medii de cultură agarizate

Pe baza datelor de ansamblu obţinute în experimentele de

determinare a potenţialului de calusare, a fost calculat un procent
mediu de 59,83% de explante somatice (fragmente de frunză şi
segmente de peţiol) care au format calus, pentru genotipul ‘Serenata’
şi de numai 40,5% pentru genotipul ‘Pink Panda’ (Fig. 13), diferenţa
fiind semnificativă pentru p<0,05, conform testului T-independent.
Acest rezultat reprezintă o confirmare a potenţialului diferit de
micropropagare al celor două genotipuri, semnalat în subcapitolele
anterioare.
Deşi, recalcitranţa in vitro a genotipului ‘Pink Panda’
s-a menţinut în experimentele de inducere a formării de calus,
s-a observat însă că, o dată declanşat procesul de calusogeneză,
proliferarea celulară s-a desfăşurat mai intens, calusurile formate fiind
mai mari, comparativ cu cele obţinute prin inocularea explantelor
somatice pe aceleaşi medii de cultură, la genotipul ‘Serenata’.

‘Pink
Panda’;
40,5

Figura 13. Influenţa genotipului

asupra frecvenţei calusogenezei
indusă pe mediu de cultură ‘Serenata’
agarizat ; 59,83

De altfel, creşterea şi regenerarea in vitro sunt procese complexe,

influenţate de o gamă largă de factori genetici şi de mediu, fiecare
genotip fiind caracterizat de exigenţe definitorii, în ceea ce priveşte
substanţele şi condiţiile care favorizează diferenţierea celulară (Sen şi
colab., 2002; Husaini şi Abdin, 2007).

84
 6.1.2. Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor
de creştere asupra capacităţii de calusogeneză a
explantelor de frunză şi peţiol cultivate pe medii de cultură
agarizate

Analiza rezultatelor experimentale a evidenţiat influenţa

favorabilă a mediului de cultură suplimentat cu 2,4-D şi BAP într-un
raport egal cu 0,16 (varianta CIM1) asupra calusogenezei la genotipul
‘Serenata’, corespunzător acestei balanţe hormonale determinându-
se formarea de calus la 94% dintre explantele de frunză, acelaşi
procent mediu fiind calculat şi în cazul segmentelor de peţiol (Fig. 14).

120
Numărul explantelor careau format calus/numărul

a a
100 ab abc abc
abc
abcd
80 abcde
abcde abcde
abcde abcde abcde abcde
60 abcde
total de explante (%)

abcde
bcde
bcde
40 bcde bcde
cde
de
20 e
e
0
Segmente de pețiol Fragmente de Segmente de pețiol Fragmente de
frunză frunză

“Serenataˮ “Pink Pandaˮ

CIM 1 CIM 2 CIM 3 CIM 4 CIM 5 CIM 6

Figura 14. Influenţa combinaţiei şi concentraţiei hormonilor de creştere

asupra capacităţii de calusogeneză a explantelor de frunză şi peţiol cultivate
pe medii de cultură agarizate (barele reprezintă abaterea standard; a, b, c, d,
e: interpretarea semnificaţiei diferenţelor, cu ajutorul testului Duncan,
p<0,05).

Pe de altă parte, AIB s-a dovedit a fi o auxină cu eficienţă ridicată

în inducerea procesului proliferativ şi formarea de calus din explante
somatice la genotipul ‘Pink Panda’. Astfel, 82% dintre segmentele de
peţiol şi, respectiv, 46% dintre fragmentele de frunză plasate pe
mediile de cultură suplimentate cu 0.5 mg/l AIB + 3.0 mg/l BAP

85
(varianta CIM4) au format calus. Comparativ, la ‘Serenata’, rezultate
favorabile au fost înregistrate la o concentraţie de 1.0 mg/l AIB,
adăugat în mediul de cultură împreună cu 3.0 mg/l BAP (varianta
CIM5). In această variantă au format calus 80% dintre explantele de
frunză şi 54% dintre segmentele de peţiol.
De asemenea, la ‘Serenata’ a fost remarcată formarea calusului
verde, secundar din calusul brunificat, derivat din fragmente de frunză,
exclusiv pe variantele de mediu conţinând 2,4-D (Fig. 15). În acest
context, trebuie consemnată şi constatarea făcută de Kang
şi colab. (1994) şi Popescu şi colab. (1997), aceea că 2,4-D pare să
fie regulatorul de creştere esenţial pentru inducerea formării de calus
verde din calusul brunificat, derivat din explante de peţiol.

c. br.

c. v.

1,0 mm
‘Serenata’

Figura 15. Formarea de calus verde din calus brunificat obţinut prin cultura
explantelor de frunză pe varianta de mediu CIM2, definită de balanţa
hormonală 1.0 mg/l 2,4-D + 3.0 mg/l BAP (c. v. - calus verde; c. br. - calus
brunificat).

6.2. POTENŢIALUL REGENERATIV AL CALUSULUI

86
 MENŢINUT PE MEDIU DE CULTURĂ AGARIZAT

6.2.1. Influenţa genotipului asupra frecvenţei de regenerare

de neoplantule din calusuri menţinute pe medii de cultură
agarizate

Numărul calusurilor care au regenerat lăstari, precum şi numărul

plantulelor neoformate a fost determinat după cinci luni de cultură in
vitro, când a fost remarcată îmbătrânirea calusului, iar frecvenţa de
regenerare de lăstari nu a mai înregistrat nicio modificare.
Influenţa genotipului s-a dovedit a fi extrem de importantă în
procesul de organogeneză indirectă la hibrizii intergenerici Fragaria ×
Potentilla, reflectând încă o dată potenţialul superior de regenerare in
vitro al hibridului intergeneric ‘Serenata’.
Comparativ cu inducerea şi proliferarea calusului, caulogeneza
s-a desfăşurat cu o frecvenţă relativ scăzută la genotipul ‘Serenata’,
procentul mediu al explantelor care au condus la regenerarea
de muguri şi lăstari adventivi fiind de 11,33%. Mai mult, la genotipul
‘Pink Panda’, frecvenţa de regenerare de lăstari a fost nulă, indiferent
de tipul de explant şi de formula mediului de cultură. De altfel,
la genotipul ‘Serenata’, regenerarea de lăstari a fost obţinută doar
în cazul explantelor care au format calus într-o proporţie semnificativ
ridicată. Astfel, cea mai înaltă frecvenţă de regenerare (36%), a fost
calculată pentru calusul derivat din fragmente de frunză plasate
pe varianta de mediu CIM4 şi doar 10% din segmentele de peţiol care
au format calus în aceleaşi condiţii, au condus la formarea
de lăstari (Tabel 11).
Păstrarea calusului pe acelaşi mediu nutritiv, fără transferul
periodic al acestuia pe mediu proaspăt poate reprezenta explicaţia
pentru frecvenţa scăzută de regenerare de lăstari înregistrată
la genotipul ‘Serenata’, precum şi pentru incapacitatea formării
de neoplantule a calusului derivat din explante somatice la genotipul
‘Pink Panda’ (Şuţan şi colab., 2010).
Mai mult, pornind de la premisa că procesul de organogeneză
este specific coordonat de anumite gene implicate în menţinerea
potenţialului regenerativ al calusului (Koorneef, 1993; Phillips, 2004),
este posibil ca în cazul acestor genotipuri să se fi produs inactivarea
acestora pe fondul unor condiţii de cultură in vitro inadecvate.

87
 Controlul genetic al potenţialului regenerativ a fost evidenţiat
şi de o serie de experimente în care capacitatea de regenerare a fost
transmisă în descendenţă prin hibridare (Niemirowicz-Szczytt, 1987).

Tabel 11. Frecvenţa de regenerare de lăstari din calusul derivat din

explantele de frunză şi peţiol la genotipul de căpşun ornamental
‘Serenata’.
Numărul
Frecvenţa
Mediul Formula neoplantulelor
de regenerare de
Hibridul intergeneric

regenerate
de hormonilor lăstari (%)
bază de creştere
‘Serenata’

Fragmente Segmente Fragmente Segmente

de frunză de peţiol de frunză de peţiol
0.5 mg/l AIB
36.0 10.0 6.8 3.4
LF + 3.0 mg/l
± 2.3 a ± 1.1 a ± 0.9 a ± 0,32c
BAP (CIM4)
1.0 mg/l AIB
22.0 9.6
MS + 3.0 mg/l -
± 1.6 b ± 0.06 b
BAP (CIM5)
* Fiecare valoare reprezintă media ± ES. În fiecare coloană, diferenţele dintre oricare două variante
urmate de cel puţin o literă comună sunt nesemnificative pentru p<0,05, conform testului Duncan.

Aceste rezultate sunt în concordanţă cu cele obţinute în

numeroase experimente în care s-a reuşit regenerarea de plante de
Fragaria într-o manieră reproductibilă şi în care, capacitatea de a
genera calus cu potenţial organogenic a variat în limite foarte largi la
diferitele genotipuri studiate. Astfel, Foucault şi Letouze (1987)
au subliniat faptul că, în condiţiile cultivării pe aceleaşi variante de
mediu, explantele prelevate de la specia Fragaria vesca au răspuns
printr-o frecvenţă de regenerare de plante prin organogeneză,
superioară genotipurilor de Fragaria × ananassa.
Rolul major al genotipului în exprimarea capacităţii regenerative
a calusurilor derivate din ţesuturi somatice a fost în mod clar evidenţiat
de rezultatele obţinute de Liu şi Sanford (1988) în experimentele
realizate cu explante de frunză la soiurile ‘Allstar’ şi ‘Honeoye’ de
Fragaria × ananassa. Astfel, dacă la primul genotip formarea de
lăstari a fost înregistrată în toate variantele experimentale cu o
frecvenţă variind între 43% şi 84%, la cel de al doilea, regenerarea a
fost observată doar într-una din cele patru variante folosite.

88
 Utilizând acelaşi tip de explant, Nehra şi colab. (1990) au
înregistrat o largă variaţie a capacităţii de regenerare la 8 genotipuri
de căpşun, în varianta optimă de mediu, procentul de calusuri care au
format lăstari variind între 4.2% (soiul ‘Honeoye’) şi 79% (soiul
‘Redcoat’).
Influenţa majoră a genotipului asupra capacităţii de regenerare a
fost confirmată şi de Kang şi colab. (1994), întrucât formarea de lăstari
prin organogeneză din calus derivat din peţiol a putut fi indusă relativ
uşor la soiul ‘Nyoho’, dar a eşuat în cazul soiului ‘Suhong’.
Variaţia potenţialului de organogeneză, determinată de genotip,
a fost sesizată de asemenea de Finstad şi Martin (1995), Popescu
(1998), iar mai recent de Landi şi Mezzetti (2006), condiţiile cerute
pentru regenerarea de lăstari din explante foliare fiind foarte diferite
pentru soiurile de căpşun testate din punct de vedere al capacităţii de
regenerare din ţesuturi somatice.

6.2.2. Influenţa mediului de bază asupra frecvenţei de

regenerare de neoplantule din calusuri menţinute pe
medii de cultură agarizate

Dacă în etapa de formare a calusului nu au fost semnalate

diferenţe semnificative ce ar fi putut fi atribuite mediilor de bază MS şi
LF, capacitatea regenerativă a calusurilor derivate din explantele
somatice a fost totuşi influenţată de compoziţia mediului de bază.
Astfel, s-a remarcat că în timp ce frecvenţa de regenerare de lăstari a
fost mai ridicată atunci când explantele de frunză au fost cultivate pe
mediul LF, numărul neoplantulelor regenerate a fost mai mare pe
mediul MS. În plus, o confirmare a eficienţei sporite a mediului de
bază LF în inducerea regenerării de lăstari este şi faptul că primii
lăstari adventivi au regenerat din explantele foliare inoculate pe
variantele experimentale CIM5-LF şi CIM6-LF, după 60 de zile,
respectiv 68 de zile de la iniţierea culturilor in vitro.
De altfel, deşi mediul propus de Murashige şi de Skog (1962)
este folosit în prezent pe scară largă pentru cultura in vitro de celule şi
ţesuturi somatice de căpşun, în frecvente cazuri, unele genotipuri au
exprimat capacitatea de regenerare la un nivel superior în condiţiile
cultivării pe medii cu compoziţie minerală sensibil diferită. Astfel,
utilizând mediul recomandat de Lee şi de Fossard (1975), pentru
regenerarea de plante din segmente de peduncul şi stolon, Lis (1993)

89
a obţinut în varianta optimă (0.2 mg/l ANA şi 0.8 mg/l BAP) procente
de regenerare apropiate de nivelul maxim la soiurile ‘Surprise de
Halles’ (100%), ‘Redgauntlet’ (96%) şi ‘Senga Sengana’ (84%). O
dovadă în acest sens o poate constitui şi procentul ridicat de
regenerare de plante din ţesut foliar (79%), precum şi frecvenţa înaltă
de lăstari formaţi per disc foliar (6,4), raportate de Liu şi Sanford (1988)
la soiul ‘Allstar’ în condiţiile cultivării pe mediul Linsmaier
- Skoog (1965), suplimentat cu AIB (0.5 mg/l) şi BAP (2.5 mg/l).
Sorvari şi colab. (1993) au raportat de asemenea înregistrarea de
procente foarte ridicate de regenerare de plante de căpşun
(25-56.3%) din discuri foliare cultivate pe mediul G (Uosukainen,
1991). Dependenţa de compoziţia mediului de bază a nivelului
de exprimare a capacităţii de organogeneză a genotipurilor de căpşun
a fost sesizată şi de Kondakova şi colab. (1983). În cazul cultivării pe
mediul de bază MS s-au constatat uneori cerinţe diferenţiate ale
diferitelor genotipuri sau chiar tipuri de explante, pentru concentraţia
în săruri. Prin urmare, în unele experimente, folosirea de medii cu
nivelul de săruri redus la 1/2, 1/3, sau chiar 1/4, a condus la rezultate
superioare.
A devenit totodată evident faptul că, în multe cazuri, mediile
de cultură cele mai eficiente pentru regenerarea de plante din ţesuturi
somatice sunt în fapt combinaţii ale macroelementelor,
microelementelor şi vitaminelor recomandate pentru diferitele medii cu
largă utilizare. Este semnificativ faptul că protocolul propus de Nehra
şi colab. (1990) pentru regenerarea de plante de Fragaria prin
organogeneză directă este o combinaţie de macroelemente şi
microelemente MS, cu vitamine Gamborg (B5).

6.2.3. Influenţa combinaţiei şi concentraţiei regulatorilor

de creştere asupra frecvenţei de regenerare de neoplantule
din calusuri menţinute pe medii de cultură agarizate

Pentru fiecare genotip şi pentru fiecare etapă de micropropagare

se impune definirea unor formule adecvate ale hormonilor de creştere
ce pot fi adăugate mediilor de cultură agarizate. O dovadă
concludentă în acest sens, este aceea că auxina 2,4-D într-o
concentraţie de 0.5 mg/l a fost eficientă în promovarea şi susţinerea
procesului de calusare la genotipul ‘Serenata’, dar regenerarea de
lăstari a fost stimulată de AIB într-o concentraţie de 0.5 mg/l, frecvenţa

90
de regenerare a lăstarilor adventivi fiind de 36%. În cazul genotipului
‘Pink Panda’, auxina AIB s-a dovedit a fi mai eficientă în stimularea
proliferării celulare, dar nu a susţinut procesele regenerative.
Rezultate similare au fost raportate şi de Rugini şi Orlando
(1992), auxina AIB conducând la exprimarea la un nivel ridicat
a capacităţii regenerative a explantelor de ţesut somatic cultivate
in vitro. Astfel, utilizată în concentraţie de 2.5 µM (în combinaţie cu
10.0 µM BAP), această auxină a dat rezultate mai bune decât 2,4-D
folosit în concentraţii de 1.0-5.0 µM.
Eficienţa ridicată a AIB a fost evidenţiată şi de Sorvari şi colab.
(1993), atât sub aspectul procentelor de explante care au exprimat
capacitatea de regenerare, cât şi sub aspectul numărului de lăstari
formaţi per explant, în cazul folosirii sale în concentraţie de 0.1 mg/l,
în combinaţie cu 3.0 mg/l BAP. Prin urmare, este posibil ca tipul de
auxină prezentă în mediul de cultură să influenţeze în mod
determinant capacitatea de exprimare a potenţialului de organo-
geneză al ţesuturilor somatice cultivate in vitro.
Prin prisma influenţei pe care o are asupra modelului
de regenerare, importanţa tipului de auxină este şi mai mare, aceasta
condiţionând esenţial diferitele aplicaţii practice. Deşi pentru
inducerea regenerării de lăstari este aproape generalizată
recomandarea de reducere a concentraţiei de 2,4-D în mediul
de cultură, procesul de organogeneză poate avea loc, cu intensitate
considerabil mai redusă, şi în condiţiile prezenţei auxinei la un nivel
ridicat. Totodată, reţine atenţia faptul că mediul de cultură cel mai
eficient pentru inducerea formării de calus embriogenic
(embriogeneza somatică fiind un proces rar la Fragaria) din embrioni
imaturi de căpşun, a fost cel conţinând o concentraţie foarte ridicată
(5.0 mg/l) de 2,4-D (Wang şi colab., 1984).
Rezultatele unor experimente au arătat că ANA, în concentraţii
cuprinse între 0.2 şi 1.0 mg/l, poate fi de asemenea utilizat cu succes
pentru inducerea formării de calus şi regenerarea de plante de căpşun
prin organogeneză (Nehra şi colab., 1990, 1992; Takahashi şi colab.,
1992). Mai mult, întrucât este o auxină mai slabă în
comparaţie cu 2,4-D, folosirea ANA poate reprezenta o alternativă la
reducerea concentraţiei de 2,4-D în mediile pentru regenerare. Nehra
şi colab. (1990) au raportat de altfel îmbunătăţirea procentului de
regenerare de lăstari din explante foliare de căpşun (50%) prin
transferul calusurilor verzi, obţinute pe mediu cu 2,4-D şi BAP,
pe mediu suplimentat cu 1.0 µM ANA şi 10.0 µM BAP.
91
 Astfel, pentru lucrările de regenerare de plante din ţesuturi
transformate, AIB reprezintă cea mai bună opţiune, întrucât oferă
posibilitatea formării de lăstari prin organogeneză directă (Nehra şi
colab., 1990; Sorvari şi colab., 1993).
Acidul 3-indolil-acetic este auxina cel mai rar folosită pentru
regenerarea de plante de Fragaria din ţesuturi somatice. Cercetările
lui Finstad şi Martin (1995) au arătat însă că în concentraţii de 2.0-8.0
µM, aceasta poate avea o eficienţă foarte ridicată, atât în combinaţiile
cu BAP (15.0 µM), dar mai ales cu TDZ (5.0-15.0 µM), procentele de
explante regenerative atingând 44%-89%.
N6-benziladenina (cunoscută şi sub denumirea 6-benzilamino-
purina), în special, şi kinetina, citochinine recunoscute pentru
capacitatea lor de a induce formarea de muguri adventivi şi ulterior
de lăstari, sunt cel mai frecvent folosite pentru regenerarea de plante
de Fragaria din cultura in vitro de ţesuturi somatice. Analiza
rezultatelor experimentelor realizate cu genotipuri de căpşun indică
faptul că regenerarea de lăstari este puternic dependentă de
concentraţia de citochinină în mediul de cultură, dar mai ales
de raportul citochinină/auxină. Gama concentraţiilor de BAP care
asigură desfăşurarea organogenezei este relativ largă (0.5-5.0 mg/l),
iar eficienţa unei concentraţii date este într-o mare măsură influenţată
de interacţiunile cu nivelul de auxină (Shanqiang şi colab., 1988), tipul
de explant şi, nu în ultimul rând, genotipul.
Aceste interacţiuni sunt singurele care pot explica procentele
de explante regenerative apropiate de nivelul maxim (84-100%),
obţinute de Lis (1993) în cazul folosirii concentraţiei de 0.8 mg/l BAP,
în condiţiile în care în numeroase alte experimente, realizate cu
variate tipuri de explant, capacitatea de regenerare de lăstari s-a
exprimat la un nivel extrem de scăzut la concentraţia de 1,0 mg/l, iar
un nivel acceptabil al organogenezei s-a înregistrat doar în cazul
concentraţiilor de 3.0 mg/l, sau chiar 5.0 mg/l (Nehra şi colab., 1990;
Carli şi colab., 1993; Sorvari şi colab., 1993; Finstad şi Martin, 1995).
Interacţiunea dintre genotip şi tipul de citochinină, pare să fie
confirmată şi de rezultatele obţinute de Foucault şi Letouze (1987),
în sensul că prezenţa în mediul de cultură a kinetinei, în concentraţie
de 1.0 mg/l, nu a permis regenerarea de plante din calus de peţiol
la nici un genotip de Fragaria × ananassa, dar aceasta a fost posibilă
la Fragaria vesca.

92
 În ultimii ani, BAP este frecvent substituită de thidiazuron (TDZ),
compus cu acţiune de tipul citochininelor (Mok şi colab., 1982),
considerat a fi regulatorul de creştere cel mai eficient pentru
promovarea procesului de organogeneză (Huetteman şi Preece,
1993). Rezultatele experimentelor realizate de Finstad şi Martin (1995)
cu soiul ‘Totem’, constituie o confirmare în acest sens, procentul de
explante regenerative fiind de 89% în cazul utilizării unei combinaţii de
2.0 µM AIA şi 15.0 µM TDZ, comparativ cu 33% în cazul
tratamentului cu o combinaţie de 2.0 µM AIA şi 15.0 µM BA. De
asemenea, utilizarea exclusivă a TDZ sau în combinaţie cu 2,4-D
(Passey şi colab., 2003) sau IBA (Yonghua şi colab., 2005) a dovedit
eficienţă crescută în regenerarea lăstarilor din explante de frunze.
Nyman şi Wallin (1992) au subliniat faptul că, TDZ este de asemenea
mai eficient decât BAP în regenerarea de plante din calusurile
derivate din protoplaşti de căpşun.
În prezent, este binecunoscut faptul că unele dintre auxinele
şi citochininele utilizate în cultura in vitro sunt termosensibile şi, prin
urmare, îşi diminuează într-o măsură importantă activitatea atunci
când sunt adăugate în mediu anterior autoclavării. Filtrarea AIA şi AIB,
auxine folosite frecvent pentru inducerea formării de calus din ţesuturi
somatice, şi introducerea acestora în mediul de cultură după
autoclavare, a fost de altfel recomandată de Nehra şi colab. (1990)
pentru aplicaţiile in vitro cu genotipuri de căpşun.
Rolul diferitelor auxine şi citochinine pare însă a fi secvenţial,
întrucât o serie de experimente au demonstrat că procesul de
regenerare, spre exemplu, a continuat normal după excluderea din
mediul de cultură a regulatorilor de creştere de tipul auxinelor. Astfel,
Rugini şi Orlando (1992) au raportat că regenerarea de plante
din soiul de căpşun ‘Gorella’ a fost indusă şi pe mediu fără hormoni, în
cazul calusurilor formate pe mediu conţinând 2.0 mg/l 2,4-D şi
respectiv 1.0 mg/l BAP. Mai mult chiar, în cazul unor genotipuri de
Fragaria, inducerea organogenezei din calusurile obţinute pe medii
suplimentate cu 2,0 mg/l 2,4-D a fost posibilă numai în variantele
experimentale în care concentraţia de auxină a fost redusă la 0.1 mg/l
(Foucault şi Letouze, 1987).
Rezultatele obţinute de Miller şi Chandler (1990) par să confirme
rolul secvenţial al auxinelor, întrucât regenerarea de plante de
căpşun din calusul de cotiledoane excizate de la embrioni maturi a
atins 75% în absenţa acestora, în cazul cultivării pe mediu conţinând
5,0 µM BAP.
93
 Foarte interesante, şi cu implicaţii practice potenţiale deosebite,
sunt rezultatele obţinute de Bois (1992) în experimentele realizate
cu explante de frunză şi peţiol aparţinând unei clone de Fragaria
vesca, care indică posibilitatea cultivării calusului şi regenerării
de plante din acesta, în absenţa oricărui regulator de creştere,
în cazul în care mediul de cultură este suplimentat cu substanţe
derivate din hidroliza diferitelor polizaharide constitutive ale peretelui
celular.

6.2.4. Influenţa tipului de explant asupra frecvenţei de

regenerare de neoplantule din calusuri menţinute pe medii
de cultură agarizate

În experimentele de inducere a regenerării de lăstari adventivi,

calusul produs de fragmentele de frunză a avut o capacitate
organogenică mai ridicată, cu o frecvenţă a regenerării de lăstari
de 36%, comparativ cu un procent de regenerare de 10%, calculat
pentru explantele de peţiol, la genotipul ‘Serenata’ (Tabel 11).
Important de semnalat este faptul că nu a existat o corelaţie
directă între capacitatea de formare a calusului şi potenţialul de
regenerare al acestuia. În acest context, în figura 16 este ilustrată
regenerarea de lăstari din calusul derivat din explante de frunză, la
genotipul ‘Serenata’, acestea prezentând o rată mai scăzută de
calusogeneză.
Potenţialul regenerativ superior manifestat de fragmentele de
frunză, poate fi atribuit mărimii explantelor. În acest context, trebuie
menţionat faptul că Pierik (1998) a raportat că uneori explantele de
dimensiuni mai mari regenerează mai uşor şi au o frecvenţă de
regenerare de lăstari adventivi mai ridicată. Mai mult, se apreciază că
pentru producerea unui calus cu capacitate organogenetică sau
embriogenetică ridicată sunt recomandabile explantele constând din
ţesuturi recoltate din regiuni cu activitate mitotică intensă.
Rugini şi Orlando (1992) au raportat că potenţialul regenerativ al
diferitelor soiuri de Fragaria × ananassa, a variat în limite largi, pentru
fiecare din tipurile de explant utilizate. Astfel, soiurile şi ‘Addie’ au
regenerat lăstari din calusul derivat din explante de frunză, în procent
de 32% şi respectiv 16%, în timp ce la soiurile ‘Dana’ şi ‘Santana’
procesul de organogeneză a eşuat. În mod similar, dintre cele 4

94
genotipuri mai sus menţionate, numai ‘Gea’ a răspuns prin formarea
de lăstari din calusul de rădăcină şi peţiol.
De asemenea, autorii menţionaţi anterior au semnalat că tipul de
explant utilizat pentru regenerarea de plante influenţează în mod
determinant durata de exprimare a capacităţii de organogeneză.
Astfel, potenţialul de regenerare de lăstari al calusurilor derivate din
explante de stipele (recoltate de la soiurile ‘Addie’, ‘Gea’, ‘Dana’
şi ‘Santana’) s-a menţinut nealterat pentru cel puţin 6 subculturi pe
acelaşi mediu, în timp ce calusurile derivate din alte tipuri de explant
(frunză, peţiol, rădăcină) şi-au pierdut capacitatea regenerativă după
doar o singură subcultură.

l.a.

1,0 mm

Figura 16. Regenerarea de lăstari din calusul derivat din explant de frunză,
la genotipul ‘Serenata’ (l.a. – lăstar adventiv).

Predieri şi colab. (1989) au observat efectul evident al sezonului

asupra potenţialului regenerativ al calusului derivat din ovarele
cultivate in vitro, aparţinând unor soiuri de căpşun indiferente la
lungimea zilei. În plus, se apreciază că starea fiziologică a plantelor,
organelor sau ţesuturilor donatoare are un rolul important, aceasta
fiind de altfel explicaţia pentru metodele de pretratament propuse la
numeroase specii, inclusiv la Fragaria × ananassa (Sorvari şi colab.,
1993). Acest pretratament vizează sporirea nivelului de hormoni
endogeni anterior momentului recoltării de explante, favorizând
obţinerea unor frecvenţe ridicate de regenerare de plante prin
95
organogeneză. Astfel, transferul plantelor utilizate ca sursă de
explante pe mediu de bază suplimentat cu (în mg/l) 0.5 AIB, 0.5 BAP
şi 0.2 GA3, cu 4 săptămâni anterior iniţierii culturii de discuri foliare, a
permis creşteri distinct semnificative ale procentului de regenerare de
lăstari.
În varianta optimă de pretratament cu hormoni, procentul de
discuri foliare care au format lăstari a fost de 85.4% la soiul ‘Jonsok’ şi
75% la soiul ‘Hiku’, comparativ cu 20.5% şi respectiv 43.8%
în cazul absenţei pretratamentului.
Deşi literatura de specialitate abundă în informaţii referitoare
la influenţa factorilor de cultură in vitro asupra procesului de
regenerare a lăstarilor prin organogeneza indirectă la diferite soiuri de
căpşun, cel mai frecvent a fost semnalată importanţa alegerii formulei
adecvate a hormonilor de creştere (Shanqiang şi colab., 1988; Nehra
şi colab., 1989; Shaart şi colab., 2002; Zhao şi colab., 2004, Yonghua
şi colab., 2005; Husaini şi Abdin, 2007), originii explantelor (Nishi şi
colab., 1974; Foucault şi Letouze, 1987; Jones şi colab., 1988; Liu şi
Sanford., 1988; Nehra şi colab., 1989, 1990; James şi colab., 1990;
Miller şi Chandler, 1990; Wawrzynczack şi colab., 1990,
Rugini şi Orlando, 1992; Lis, 1990; Lis, 1993; Sorvari şi colab.,
1993; Wallin şi colab., 1993; Svensson şi Johansson, 1994; Graham
şi colab., 1995; Owen şi Miller, 1996; Popescu, 1997, 1998; Passey şi
colab 2003; Litwińczuk, 2004; Singh şi Pandey, 2004; Zhao şi colab.,
2004; Debnath, 2005, 2006; Hanhineva şi colab., 2005; Qin şi colab.,
2005a, 2005b; Yonghua şi colab., 2005; Folta şi colab., 2006; Landi şi
Mezzetti, 2006; Popescu și colab., 1997), toţi aceşti factori fiind înalt
dependenţi de genotip (Liu şi Sanford, 1988; Nehra şi colab., 1989;
Sorvari şi colab., 1993; Barcélo şi colab., 1998; Popescu, 1998;
Passey şi colab., 2003). De asemenea, a fost raportată importanţa
utilizării unui mediu de bază propice regenerării de lăstari (Popescu,
1998; Yang şi colab., 1995).
Mai mult, a devenit evidentă existenţa unei puternice interacţiuni
între tipul de explant, regulatorii de creştere şi condiţiile de cultură,
aceste variabile trebuind să fie luate în consideraţie simultan la
elaborarea unui sistem de regenerare, condiţiile standardizate pentru
un genotip de căpşun nefiind optime pentru altele.

96
 7. CAPACITATEA DE REGENERARE DE LĂSTARI
PRIN ORGANOGENEZĂ DIRECTĂ UTILIZÂND MEDII
DE CULTURĂ AGARIZATE

În încercările de a învinge recalcitranţa genotipului ‘Pink Panda’

la organogeneză, precum şi de a obţine o frecvenţă a regenerării de
lăstari mai ridicată la hibrizii intergenerici luaţi în studiu, am optat
pentru suplimentarea mediilor de cultură agarizate cu thidiazuron
(TDZ), în combinaţie cu AIB sau 2,4-D. Înlocuirea BAP cu TDZ a
condus la obţinerea unor rezultate surprinzătoare, regenerarea de
lăstari fiind obţinută în numai 14 zile direct din ţesuturile somatice, fără
formarea calusului, la ambele genotipuri de căpşun ornamental
investigate. Această reactivitate a genotipurilor de căpşun ornamental
investigate este atribuită, fără îndoială thidiazuronului, care poate
induce o diversitate de răspunsuri morfogenice, de la proliferarea
celulară la formarea de lăstari adventivi sau embrioni somatici.
Frecvenţa de regenerare de lăstari prin organogeneză directă din
explante somatice a fost calculată la sfârşitul celor două săptămâni de
incubaţie la întuneric. În acest context, este important de menţionat că,
pentru prima dată de la iniţierea experimentelor care au vizat
micropropagarea prin organogeneză a hibrizilor intergenerici Fragaria
× Potentilla, a fost profilată acţiunea inhibitoare a fotoperiodismului de
16 ore lumină/8 ore întuneric, având în vedere că transferul culturilor
la lumină a întrerupt orice proces regenerativ la nivelul explantelor
somatice, la ambii hibrizi intergenerici.

7.1. INFLUENŢA GENOTIPULUI ASUPRA FRECVENŢEI DE

REGENERARE DE LĂSTARI PRIN ORGANOGENEZĂ
DIRECTĂ

Influenţa genotipului s-a manifestat şi de această dată, procentul

mediu de lăstari regeneraţi calculat pentru genotipul ‘Serenata’ fiind
de 7.75% şi de numai 5.22% lăstari regeneraţi, corespunzător
genotipului ‘Pink Panda’ (Fig. 17). Deşi genotipul ‘Serenata’ şi-a
menţinut avantajul genotipului cu potenţial superior de regenerare in
vitro, frecvenţa de regenerare de lăstari prin organogeneză directă a
fost extrem de redusă, având în vedere chiar şi rezultatele înregistrate
în cazul organogenezei indirecte.

97
 De altfel, TDZ este recunoscut ca un regulator de creştere
extrem de eficient în inducerea proceselor proliferative, însă modul de
acţiune al regulatorilor de creştere, implicit al thidiazuronului este înalt
dependent de factori genetici specifici (Passey şi colab., 2003).
Capacitatea regenerativă a explantelor somatice este puternic
influenţată de genotip şi de compoziţia mediului de cultură, după cum
au afirmat Landi şi Mezzetti (2006), diferitele varietăţi de căpşun
manifestând o largă variabilitate în ceea ce priveşte diferenţierea
capacităţii de regenerare de lăstari din ţesuturi somatice.
Semnificative în acest sens, sunt rezultatele raportate relativ
recent (2006) de autorii mai sus amintiţi la nouă soiuri de căpşun
octoploid, la care frecvenţa de regenerare de lăstari din explante de
frunză inoculate pe medii de cultură suplimentate cu TDZ, a variat
între 4.7 şi 71.4%.

Figura 17. Influenţa genotipului ‘Serenata’;

5,22
asupra frecvenţei de regenerare
de lăstari prin organogeneză Pink Panda
directă 7,75

7.2. INFLUENŢA INTERACŢIUNII DINTRE MEDIUL DE BAZĂ

ŞI COMBINAŢIA ŞI CONCENTRAŢIA REGULATORILOR
DE CREŞTERE ASUPRA FRECVENŢEI DE REGENERARE
DE LĂSTARI PRIN ORGANOGENEZĂ DIRECTĂ

Analizând datele prezentate în figura 18, privind influenţa

interacţiunii dintre mediul de bază şi formula hormonilor de creştere
asupra capacităţii de regenerare de lăstari prin organogeneză directă,
se observă că suplimentarea mediului de bază cu concentraţii
moderate şi mari de TDZ a influenţat pozitiv frecvenţa de regenerare

98
directă de lăstari din explante de peţiol, cultivate pe mediul de bază
Lee - Fossard.
Diferenţe semnificative între valorile acestei caracteristici au fost
determinate de mediul de bază, pentru genotipul ‘Pink Panda’
dovedindu-se adecvată combinaţia de regulatori de creştere
(respectiv balanţa hormonală) 1.0 mg/l AIB + 1.0 mg/l TDZ (varianta
experimentală DO5), adăugată mediului de bază MS, pentru care a
fost calculată o frecvenţă de regenerare de 12.26%. Comparativ,
mediul de bază LF, suplimentat cu aceeaşi combinaţie a regulatorilor
de creştere, a condus la o frecvenţă de regenerare de lăstari de
numai 6%.

25
a
regenerative/numărul total de explante

20
Numărul explantelor

15
b b
b
c c c
10 d
c
de cd
e e e e e f ef f ef
5 f

g g g
0
MS LF MS LF
“Serenata” “Pink Panda”

DO1 DO2 DO3 DO4 DO5 DO6

Figura 18. Influenţa interacţiunii dintre mediul de bază şi combinaţia

şi concentraţia regulatorilor de creştere asupra frecvenţei de regenerare
de lăstari prin organogeneză directă (barele reprezintă abaterea standard; a,
b, c, d, e, f, g: interpretarea semnificaţiei diferenţelor, conform testului
Duncan, pentru p< 0,05).

În cazul genotipului ‘Serenata’, cele mai înalte frecvenţe de

regenerare de lăstari au fost corespunzătoare mediului de bază MS,
în care, în mod similar, raportul regulatorilor de creştere auxină/TDZ a
fost 1. Adăugarea în mediul de bază MS a 1,0 mg/l 2,4-D a influenţat
semnificativ frecvenţa de regenerare de lăstari, valoarea acesteia
99
înregistrând o creştere de 8.4%, comparativ cu mediul MS suplimentat
cu 1,0 mg/l AIB.
Deci, deşi suplimentarea mediilor de bază MS şi LF cu 1.0 mg/l
2,4-D a condus la valori semnificativ mai mari ale frecvenţei
de regenerare de lăstari prin organogeneză directă, comparativ cu
variantele experimentale caracterizate de prezenţa auxinei AIB,
similar cu inducerea calusogenezei din explante de peţiol,
reactivitatea genotipului ‘Pink Panda’ la cultura in vitro a fost
intensificată de adaosul de AIB, într-o concentraţie de 1.0 mg/l,
în mediul de bază MS.
Rezultatele obţinute în urma acestor experimente confirmă
aşadar necesitatea abordării diferenţiate a mediilor de cultură, în
special a balanţei regulatorilor de creştere, funcţie de exigenţele
specifice genotipului supus micropropagării.
Rezultatele experimentelor realizate de Finstad şi Martin (1995)
cu soiul ‘Totem’, constituie o confirmare în acest sens, procentul de
explante regenerative fiind de 89% în cazul utilizării unei combinaţii de
2.0 µM AIA şi 15.0 µM TDZ, comparativ cu 33% în cazul tratamentului
cu o combinaţie de 2.0 µM AIA şi 15.0 µM BA. De asemenea,
utilizarea exclusivă a TDZ sau în combinaţie cu 2,4-D (Passey şi
colab., 2003) sau AIB (Yonghua şi colab., 2005) a dovedit eficienţă
crescută în regenerarea lăstarilor din explante de frunze.
Este important de semnalat şi faptul că, perioada de timp
în care s-a declanşat procesul de organogeneză, a fost considerabil
mai scurtă comparativ cu intervalul necesar regenerării de lăstari din
calusurile derivate din explante somatice. În plus, în cazul
organogenezei directe, probabil ca o consecinţă directă a capacităţii
recunoscute de multiplicare a thidiazuronului, a fost dificil să facem
disticţia între lăstarii regeneraţi individual din explante de peţiol şi cei
formaţi ulterior, prin multiplicarea lăstarilor iniţiali.
Justificative în acest sens sunt rezultatele unor studii care
au sugerat că TDZ este un modulator al nivelului auxinelor endogene,
dovedindu-se experimental că acest regulator de creştere stimulează
sinteza de novo a auxinelor, crescând concentraţia acidului indolil
acetic (AIA) şi a precursorului său triptofanul (Murthy şi colab., 1995).
Ca o consecinţă a stimulării creşterii conţinutului endogen
de auxine şi citochinine, se consideră că TDZ determină regenerarea
rapidă de lăstari, fie prin organogeneză indirectă (Malik şi Saxene,
1992), fie prin embriogeneză somatică (Zhou şi colab., 1994), fie prin
organogeneză directă (Popescu, 1998).
100
 7.3. INFLUENŢA TIPULUI DE EXPLANT ASUPRA REGENERĂRII
DE LĂSTARI PRIN ORGANOGENEZĂ DIRECTĂ

În experienţele care au vizat stimularea regenerării de lăstari prin

organogeneză, dintre cele două tipuri de explante somatice testate
doar explantele de peţiol au manifestat potenţialul de regenerare de
lăstari, fără formare de calus (Fig. 19). În acest sens, este important
de semnalat că Foucault (1990) a raportat că, în cazul folosirii TDZ,
procentele de explante foliare regenerative au fost similare sau chiar
inferioare celor induse de BAP.
Punctele de iniţiere a organogenezei au fost întotdeauna la
extremităţile segmentelor de peţiol, probabil ca o consecinţă a
acumulării hormonilor endogeni la nivelul secţiunilor cu reacţii de
cicatrizare, precum şi ca urmare a posibilităţii de preluare a nutrienţilor
din mediu, necesari pentru susţinerea procesului de regenerare, prin
zonele de rănire.

l.a.

seg. p.

l.a.

1,0 mm

seg. p. 1,0 mm
‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Figura 19. Regenerarea de lăstari prin organogeneză directă, din explantele

de peţiol, inoculate pe mediul de bază MS, suplimentat cu 1.0 mg/l AIB + 1.0
mg/l TDZ (l.a. – lăstar adventiv; seg. p. – segment de peţiol).

În acest context, trebuie menţionat faptul că dintre diferitele tipuri

de explantele somatice, fragmentele de frunză au fost mai adesea
luate în studiu (Liu şi Sanford, 1988; Nehra şi colab, 1989; Isac şi
Popescu, 1994; Sorvari şi colab., 1993) şi în marea majoritate a
cazurilor au condus la cea mai înaltă frecvenţă de regenerare de
lăstari adventivi (Passey şi colab., 2003).
101
 7.4. PARTICULARITĂŢILE LĂSTARILOR REGENERAŢI PRIN
ORGANOGENEZĂ DIRECTĂ

Prin transferul lăstarilor obţinuţi prin organogeneză directă,

pe medii de cultură suplimentate cu diferite balanţe hormonale
(Tabel 6) s-a constatat că genotipul ‘Serenata’, şi-a menţinut
potenţialul superior de multiplicare in vitro, în timp ce plantulele de
‘Pink Panda’ obţinute prin transferul lăstarilor (obţinuţi din explante de
peţiol, prin organogeneză directă) pe medii de multiplicare, au
prezentat o vigoare extrem de redusă (Fig. 20), asociată frecvent cu
fenomenul de vitrificare, ceea ce a condus la uscarea unui procent
important de lăstari, în subculturi succesive.
În plus, s-a constatat prezenţa caracterelor juvenile, în special a
frunzelor unifoliolate, a căror frecvenţă a fost mult mai mare
la genotipul ‘Serenata’, comparativ cu ‘Pink Panda’ (Fig. 17), probabil
ca o consecinţă directă a efectului cumulat dintre conţinutul endogen
de regulatori de creştere, în special TDZ, şi al capacităţii regenerative
ridicate a genotipului ‘Serenata’.
Observaţiile noastre sunt în concordanţă cu cele făcute de
Foucault (1990), în sensul că, într-un procent important lăstarii
regeneraţi pe mediile de cultură suplimentate cu TDZ sunt anormali,
prezentând fenomenul de vitrificare, fasciere şi creştere de tip “dwarf”.

f.u.

‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Figura 20. Multiplicarea lăstarilor regeneraţi din explante de peţiol prin

organogeneză directă; f.u. - frunză unifoliolată.

102
 8. CAPACITATEA DE ÎNRĂDĂCINARE IN VITRO
A UNOR HIBRIZI INTERGENERICI FRAGARIA × POTENTILLA

Pornind de la ipoteza că mediul de cultură utilizat pentru

multiplicarea lăstarilor derivaţi din meristeme poate să influenţeze
semnificativ procesul de rizogeneză in vitro, experienţele care au vizat
determinarea capacităţii de înrădăcinare a vitroplantelor, au fost
organizate în funcţie de mediul de multiplicare. Astfel, rata de
înrădăcinare a lăstarilor (raportul procentual dintre numărul lăstarilor
înrădăcinaţi şi numărul total de lăstari transferaţi pe mediu de
înrădăcinare), numărul şi lungimea rădăcinilor formate au fost
determinate diferenţiat, fiecărei variante de mediu de multiplicare
corespunzându-i cele trei variante de mediu de înrădăcinare.

8.1. INFLUENŢA GENOTIPULUI ASUPRA CAPACITĂŢII DE

ÎNRĂDĂCINARE IN VITRO

Dacă în procesele de stimulare a lăstăririi axilare şi a organo-

genezei, varietatea de căpşun ornamental ‘Serenata’ s-a remarcat
printr-o capacitate superioară de regenerare şi proliferare a lăstarilor,
la genotipul ‘Pink Panda’ a fost evidenţiată o capacitate sporită
de înrădăcinare in vitro a lăstarilor.
Astfel, în timp ce la hibridul intergeneric ‘Pink Panda’
înrădăcinarea lăstarilor a început după 10 zile de la iniţierea culturii şi
a continuat cu o rată medie de 81.43%, la genotipul ‘Serenata’,
procesul de rizogeneză a fost iniţiat după 16 zile de la inocularea
lăstarilor, iar rata medie de înrădăcinare a plantulelor a fost redusă
semnificativ, fiind de numai 36.17%. Potenţialul rizogenic superior al
hibridului intergeneric ‘Pink Panda’ a fost evidenţiat şi prin rezultatele
calculate pentru celelalte două caracteristici analizate, determinându-
se un număr mediu de 3.97 rădăcini per lăstar, cu o lungime medie de
8.96 mm, comparativ cu un număr mediu de 2.67 rădăcini formate per
lăstar, cu o lungime medie de 3.54 mm, în cazul genotipului ‘Serenata’.
În figura 21 sunt prezentaţi coeficienţii de corelaţie, dreptele
de tendinţă şi ecuaţiile acestor drepte între rata de înrădăcinare,
numărul mediu al rădăcinilor şi lungimea medie a acestora, în cazul
genotipului ‘Pink Panda’.

103
 Analizând datele prezentate în figura 21 se constată că rata
de înrădăcinare este corelată pozitiv cu numărul mediu de rădăcini
per lăstar, coeficientul de corelaţie Pearson având valoarea r = 0.702,
precum şi cu lungimea medie a rădăcinilor, coeficientul de corelaţie
având valoarea r = 0.744. De asemenea, a fost determinată
o corelaţie pozitivă între numărul mediu de rădăcini per lăstar şi
lungimea medie a rădăcinilor, valoarea coeficientului de corelaţie
Pearson fiind de 0.592. Corelaţiile sunt distinct semnificative pentru un
prag de semnificaţie de p<0,01.
În figura 22 sunt prezentaţi coeficienţii de corelaţie, dreptele
de tendinţă şi ecuaţiile acestor drepte între rata de înrădăcinare,
numărul mediu al rădăcinilor şi lungimea medie a acestora, în cazul
genotipului ‘Serenata’. Analizând datele prezentate în figura 22,
se observă că o corelaţie pozitivă, distinct semnificativă pentru pragul
de semnificaţie p<0,01, a fost stabilită doar între rata de înrădăcinare
a lăstarilor şi lungimea medie a rădăcinilor, valoarea coeficientului de
corelaţie simplă Pearson fiind de 0.782. Între lungimea medie
a rădăcinilor şi numărul mediu de rădăcini formate per lăstar,
deşi nesemnificativă, corelaţia a fost negativă, valoarea coeficientului
de corelaţie simplă Pearson fiind de – 0.140. De asemenea, valoarea
coeficientului de corelaţie r = 0.441 determinată între numărul mediu
de rădăcini formate per lăstar şi rata de înrădăcinare a fost
nesemnificativă pentru pragul de semnificaţie p<0,01.
Rezultatele obţinute sugerează că genotipul reprezintă un factor
cu o influenţă majoră asupra nivelului de exprimare a capacităţii de
înrădăcinare a microplantulelor, variabilitatea reacţiei între diferitele
genotipuri testate pentru capacitatea de înrădăcinare in vitro fiind
raportată şi de alţi cercetători (Horn, 1992; Al-Khalifah şi colab., 2005;
Mankessi şi colab., 2010).

104
 20
Lungimea medie a rădăcinilor (mm) 18
y = 0,1165x - 0,4242
16
r = 0,744**
14
12
10
8
6
4
2
0
0 20 40 60 80 100 120
Rata de înrădăcinare (%)

7 y = 0,0127x + 3,0793
Numărul mediu de rădăcini/lăstar

6 r = 0,702**
5

0
0 20 40 60 80 100 120

Rata de înrădăcinare (%)

20
y = -0,102x + 9,3656
Lungimea medie a rădăcinilor (mm)

18
16 r = 0,592**
14
12
10
8
6
4
2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Numărul mediu de rădăcini/lăstar

Figura 21. Corelaţia între lungimea medie a rădăcinilor şi rata de

înrădăcinare (sus), între numărul mediu de rădăcini per lăstar şi rata de
înrădăcinare (mijloc) şi între numărul mediu de rădăcini per lăstar şi
lungimea medie a rădăcinilor (jos), la genotipul ‘Pink Panda’. (** Corelaţia
este semnificativă pentru pragul de semnificaţie p<0,01).
105
 12 y = 0,0827x + 0,5575
Lungimea medie a rădăcinilor (mm) r = 0,782**
10

0
0 20 40 60 80 100 120
Rata de înrădăcinare (%)

7
y = -0,0086x + 2,9878
6 r = 0,441
Numărul mediu de rădăcini/explant

0
0 20 40 60 80 100 120
Rata de înrădăcinare (%)

12 y = -0,187x + 4,0495
r = - 0,140
10
Lungimea medie a rădăcinilor (mm)

0
0 1 2 3 4 5 6 7
Numărul mediu de rădăcini/lăstar

Figura 22. Corelaţia între lungimea medie a rădăcinilor şi rata de

înrădăcinare (sus), între numărul mediu de rădăcini per lăstar şi rata de
înrădăcinare (mijloc) şi între numărul mediu de rădăcini per lăstar şi
lungimea medie a rădăcinilor (jos) la genotipul ‘Serenata’. (** Corelaţia este
semnificativă pentru pragul de semnificaţie p<0,01).
106
 8.2. CAPACITATEA DE ÎNRĂDĂCINARE A MICROLĂSTARILOR
REGENERAŢI PE MEDII DE CULTURĂ CU COMPOZIŢIE
DIFERITĂ

Efectul cumulat al conţinutului endogen de fitohormoni

şi compoziţia mediului de cultură este semnificativ în procesul de
stimulare a rizogenezei. De altfel, Bouza şi colab. (2004) au afirmat că
diferenţele de răspuns rizogenetic manifestate între explantele
regenerate pe medii de multiplicare cu compoziţie diferită sub aspectul
balanţei hormonale, ar putea fi explicate prin conţinutul endogen de
fitohormoni asimilaţi în etapa anterioară de proliferare in vitro.
Au fost constate două căi de interacţiune: pe de o parte, mediul
de bază LF suplimentat cu concentraţii reduse ale hormonilor
de creştere × mediu de înrădăcinare suplimentat cu 0.25 mg/l AIB
+ 0.1 mg/l GA3 şi pe de altă parte mediul de bază MS suplimentat
cu concentraţii mai mari ale hormonilor de creştere × mediu
de înrădăcinare suplimentat cu 0.5 mg/l AIB sau AIA + 0.1 mg/l GA3,
care au potenţat capacitatea de înrădăcinare in vitro a plantelor.
La genotipul ‘Pink Panda’, analiza de ansamblu a rezultatelor
a evidenţiat o corelaţie pozitivă între compoziţia minerală a mediului
de bază MS folosit pentru multiplicarea explantelor şi capacitatea
lăstarilor de înrădăcinare, rata de înrădăcinare înregistrând valori
în intervalul 53.2-100%. Comparativ, lăstarii multiplicaţi pe mediul
de bază LF au prezentat valori ale ratei de înrădăcinare cuprinse între
40% şi 100% (Fig. 23).
Analiza datelor prezentate în figura 24, cu privire la influenţa
mediului de cultură asupra ratei de înrădăcinare la genotipul
‘Serenata’, evidenţiază faptul că, asemănător rezultatelor prezentate
anterior, mediul LF folosit pentru multiplicarea lăstarilor, indiferent
de combinaţia şi concentraţia hormonilor de creştere, a avut
o influenţă pozitivă asupra capacităţii de înrădăcinare a lăstarilor
inoculaţi pe varianta RM1, confirmându-se astfel, interacţiunea
favorabilă dintre compoziţia mediului de bază LF şi concentraţia
redusă a AIB. O abatere de la această constatare a fost observată
în cazul plantulelor regenerate pe varianta de mediu MM3 şi MM4,
pentru care creşterea concentraţiei AIB de la 0.25 la 0.5 mg/l
a determinat o rată de înrădăcinare de 80%, respectiv 86.6%.

107
 120
a abc a abc a a a a a a a abc ab abc
b abc abc ab abc ab
100 bcd bcd bcd bc bc abc
bcd bcd
bcd cd bcd bcd cd
80 cd
d d

60
lăstari (%)
Numărul lăstarilor înrădăcina

40

20

0
MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6 MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6

LF MS

“Pink Pandaˮ

RM1 RM2 RM3

Figura 23. Rata de înrădăcinare a microlăstarilor la genotipul ‘Pink Panda’

(barele reprezintă abaterea standard; a, b, c, d: interpretarea semnificaţiei
diferenţelor, cu ajutorul testului Duncan, p<0,05).

120
a abcd
abc
100 bc
abcd abcd abcd abcd
abcd abcd
80 abcd
abcd abcd
abcd abcd abcd abcd

60 abcd abcd
bcd
Numărul lăstarilor înrădăcina
de lăstari (%)

bcd bcdbcd
40 cd
bcdbcd bcd bcd bcd bcd
cd
20
d d d d d
0
MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6 MM1 MM2 MM3 MM4 MM5 MM6

LF MS

‘Serenata’
RM1 RM2 RM3

Figura 24. Rata de înrădăcinare a microlăstarilor la genotipul ‘Serenata’

(barele reprezintă abaterea standard; a, b, c, d: interpretarea semnificaţiei
diferenţelor cu ajutorul testului Duncan, p<0,05).

108
 Rezultate similare au fost obţinute de Kaur şi colab. (2005) care
au raportat inducerea unei rate maxime de înrădăcinare in vitro la
Fragaria × ananassa soiul ‘Chandler’, prin cultivarea lăstarilor
pe mediu MS ¼ suplimentat cu 1.0 mg/l AIB.
Deşi, utilizarea mediului la putere maximă conduce la o
înrădăcinare optimă a lăstarilor, transferul lăstarilor pe medii de
înrădăcinare cu concentraţie redusă a macroelementelor şi
microelementelor este o practică comună pentru plantele ornamentale
şi pomii fructiferi (Mancousin, 1988; George, 1996). Efectul favorabil al
soluţiilor diluate asupra înrădăcinării in vitro poate fi explicat prin
reducerea concentraţiei de azot (Driver şi Suttle, 1987).

109
 9. CAPACITATEA DE ACLIMATIZARE A MICROLĂSTARILOR
ÎNRĂDĂCINAŢI IN VITRO

După transferul ex vitro, plantulele pot fi uşor afectate de

modificările bruşte ale condiţiilor de mediu, necesitând o perioadă de
aclimatizare pentru corectarea aberaţiilor.
În acest sens, rădăcinile microlăstarilor au fost spălate delicat,
prin scufundare în apă de robinet pentru îndepărtarea urmelor
de agar de pe sistemul radicular şi, apoi, transplantate în perlit, în
condiţii de seră (Fig. 25). Pentru reducerea treptată a umidităţii şi
pentru adaptarea la condiţiile de mediu, rafturile au fost acoperite cu
folie de polietilenă şi descoperite gradual.
În faza de aclimatizare, cele două genotipuri au manifestat
capacitate diferită de adaptare, la genotipul ‘Pink Panda’, procentul
plantulelor care au supravieţuit fiind de 86.8%, comparativ cu 92.4%,
în cazul genotipului ‘Serenata’.
După aclimatizare, plantele au fost transferate în ghivece şi,
ulterior, în câmp.

Figura 25. Aclimatizarea lăstarilor înrădăcinaţi, în substrat de perlit, în seră.

110
 10. STABILITATEA GENETICĂ A PLANTELOR MULTIPLICATE
CLONAL IN VITRO, EVIDENŢIATĂ PRIN ANALIZA RAPD

În cazul genotipului ‘Serenata’, primerii RAPD selectaţi au

generat un număr total de 59 benzi, care au fost monomorfice pentru
toate plantele analizate, incluzând şi planta martor. Numărul de benzi
per primer a variat între 3 (OPC05) şi 10 (OPC08), cu o valoare medie
de 5.9 benzi per primer. În ceea ce priveşte mărimea fragmentelor
ADN amplificate, aceasta a variat între 2665 pb şi 287 pb.
Pentru genotipul ‘Pink Panda’, primerii selectaţi au generat un
număr total de 54 benzi, de asemenea monomorfice, iar numărul
benzilor per primer a variat între 2 (OPB17) şi 8 (OPA20 şi OPC08),
cu o valoare medie de 5.4 benzi per primer. Mărimea fragmentelor
ADN amplificate a variat în acelaşi interval ca în cazul genotipului
‘Serenata’.
Analiza gelurilor din experienţele organizate pentru determinarea
stabilităţii genetice a plantelor multiplicate prin subculturi succesive, a
evidenţiat modele de benzi identice între planta martor şi lăstarii
regeneraţi după a patra subcultură, procentul de monomorfism per
genotip fiind de 100%. Numărul cel mai mare de benzi au fost obţinute
cu primerii OPA08, repectiv 10 benzi, OPA20 şi OPB05 (Fig. 26),
respectiv 8 benzi, ceilalţi primeri nefiind atât de eficienţi în generarea
produşilor PCR succesivi.
Deşi puţine studii s-au concentrat asupra influenţei sursei
de explante şi a gradului de diferenţiere a acestora asupra variaţiei
somaclonale, îndeosebi pentru că, în mod preferenţial, sunt utilizate
doar sistemele de cultură care permit o frecvenţă înaltă de regenerare,
este general recunoscut faptul că, meristemele cultivate în stadiul
prealabil diferenţierii, produc variaţie genetică redusă sau aceasta
este absentă, comparativ cu cele aflate în stadiul de diferenţiere.
Stabilitatea genetică a somaclonelor regenerate din explante
meristematice, evitând formarea de calus (în special la genotipurile
stabile de căpşun) a fost semnalată de Reed şi Hummer (2001).
Cu cât sunt mai mari gradul de abatere de la creşterea organizată
şi perioada de timp acordată acestui stadiu, cu atât şansele apariţiei
variaţiei genetice sunt mai mari (Karp, 1995).
În experimentele organizate de noi pentru multiplicarea clonală a
hibrizilor intergenerici Fragaria × Potentilla, deşi s-a remarcat
formarea calusului la baza explantelor transferate repetat pe varianta
de mediu MM4, toate profilele RAPD, corespunzătoare genotipurilor
111
‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’, obţinute după patru subculturi in vitro,
au fost monomorfice şi analoage celor corespunzătoare plantelor
mamă, indicând identitatea sau similaritatea lor.
Stabilitatea genetică evidenţiată la cele două genotipuri de
căpşun ornamental poate fi atribuită şi limitării transferului lăstarilor
regeneraţi pe medii de cultură proaspete la numai 4 subculturi. Efectul
negativ al numărului mare de subculturi asupra stabilităţii genetice a
genotipului a fost confirmat de cercetări relativ recente (Kinet şi
Parmentier, 1989; Kinet şi colab., 1990; Jemmali şi colab., 1992;
Jemmali şi colab., 1994; Jemmali şi colab., 1995; Boxus şi colab.,
2000). În prezent, se apreciază că un număr de 3 până la 5 subculturi
reprezintă modul cel mai indicat de a combina o rată înaltă de
multiplicare a soiurilor de căpşun cu stabilitatea genetică (Rosati,
1993).

S1 S2 S3 PP1 PP2 PP3 L S1 S2 S3 PP1 PP2 PP3 L

3000 bp 3000 bp

1000 bp 1000 bp

500 bp 500 bp

OPA20 OPB05

Figura 26. Profilul RAPD al genotipurilor ‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’ (plantele

martor şi microlăstarii obţinuţi după a patra subcultură) cu primerii OPA20 şi
OPB05; L= marker ADN, 100 pb.

Având în vedere că, marea majoritate a variaţiei genetice indusă

prin cultura de celule şi ţesuturi in vitro se produce în faza de calus a
procesului (Skirvin şi Janick, 1976; Kumar şi colab., 1999), formarea
calusului fiind un proces analog răspunsului plantelor la rănire,

112
cunoscut ca activator al elementelor genetice transpozabile
(McClintock, 1984), iar la căpşun, apariţia variaţiei somaclonale
a fost frecvent semnalată în cultura de calus derivată din explante
foliare şi de peţiol (Simon şi colab., 1987; Popescu şi colab., 1997;
Kaushal şi colab., 2004; Kaushal şi colab., 2006; Palombi şi colab.,
2003) şi a fost propagată cu succes la plantele regenerate din acest
calus, s-a impus identificarea, la nivel molecular a stabilităţii genetice
a neoplantulelor regenerate din explante somatice, inoculate pe medii
de cultură agarizate.
Aceiaşi 10 primeri, capabili să detecteze polimorfismul genetic la
genotipurile de căpşun ornamental investigate, au fost utilizaţi pentru
amplificarea probelor de ADN extras din planta martor şi din
microlăstarii regeneraţi via calus. Amintim în acest context că, în
experimentele organizate cu scopul inducerii regenerării de lăstari din
explante de frunză şi peţiol inoculate pe medii de cultură agarizate, nu
au permis obţinerea de lăstari via calus, la genotipul de căpşun
ornamental ‘Pink Panda’.
In figurile 27 şi 28 sunt prezentate profilele RAPD obţinute pentru
genotipul ‘Serenata’, respectiv planta control, neoplantulele
regenerate prin organogeneză indirectă, precum şi cele regenerate
după cel din urmă transfer pe medii de cultură agarizate.
Corespondenţa dintre pofilele RAPD denotă stabilitatea genetică
a neoplantulelor regenerate din explante somatice via calus.

S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 L S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 L

3000 bp
3000 bp

1000 bp
1000 bp
500 bp
500 bp

OPA02 OPA20

Figura 27. Profilul RAPD al genotipului ‘Serenata’ (planta martor,

microlăstari originari din meristeme şi somaclone) cu primerii OPA02
şi OPA20; L= marker ADN, 100 pb.
113
 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 L S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7

3000 bp

1000 bp

500 bp

OPC05 OPC08

Figura 28. Profilul RAPD al genotipului ‘Serenata’ (planta martor şi

somaclonele derivate din meristeme şi explante somatice) cu primerii
OPC05 şi OPC06; L= marker ADN, 100 pb.

Având în vedere că în generarea variaţiei somaclonale a fost

frecvent semnalată influenţa genotipului, pornind de la stabilitatea
genetică a plantulelor regenerate prin lăstărire axilară şi, în special
a celor neoformate din explante de frunză şi peţiol, putem considera,
pentru început, că genotipul de căpşun ornamental ‘Serenata’ este
stabil în condiţiile culturii in vitro.
Deşi o serie de factori interni şi externi pot fi identificaţi ca
potenţiali perturbatori ai stabilităţii genetice a plantelor
micropropagate, ca dealtfel însăşi cultura de ţesuturi, care reprezintă
un sistem mutagenic prin experienţa traumatică a izolării celulare
(Jain, 2001), continuând cu regenerarea de lăstari în condiţii diferite,
comparativ cu procesele naturale, în experimentele desfăşurate
de noi, somaclonele obţinute prin diferite metode de regenerare
in vitro, nu au fost diferite genetic de plantele mamă, care au
reprezentat sursa de meristeme cu care au fost iniţiate culturile.
De altfel, prin completarea mediilor de bază cu concentraţii relativ

114
scăzute ale regulatorilor de creştere, am încercat să evităm apariţia
variantelor somaclonale.
În plus, determinarea condiţiilor de cultură care să permită
regenerarea de lăstari în absenţa divizării şi transferului calusurilor pe
medii de cultură proaspete poate reprezenta un atu în limitarea
aportului exogen de regulatori de creştere, a căror acţiune mutagenă,
ca urmare a efectului lor asupra diviziunii celulare, incluzând creşterea
dezorganizată, este recunoscută ca având o influenţă însemnată în
producerea modificărilor cariotipului în culturile de celule (Bordallo şi
colab., 2004). Dintre hormonii de creştere, auxina 2,4-D este
considerată principalul responsabil pentru cea mai mare parte a
variaţiei genetice (Kaeppler şi colab., 2000).
La căpşun, variante pitice sau cu funze deformate şi variegate
au fost raportate la plantele regenerate din explante foliare cultivate
in vitro, în condiţiile creşterii concentraţiei de citochinină, respectiv
BAP, de Nehra şi colab. (1992), iar mai recent de Sowik şi colab.
(2004). Biswas şi colab. (2009) au raportat că o concentraţie ridicată
de BAP în mediul de cultură induce cu succes variaţia somaclonală
la plantele de căpşun regenerate in vitro.
De asemenea, frecvenţa ridicată de regenerare de lăstari via
calus, la hibrizii intergenerici Fragaria × Potentilla, într-o perioadă
de timp relativ scurtă, a permis obţinerea de somaclone cu structură
genetică identică cu cea a plantelor martor, corelaţia dintre
îmbătrânirea culturii şi acumularea variaţiei genetice fiind raportată
frecvent la diferite specii de plante, inclusiv la căpşun. În acest sens,
sunt relevante rezultatele recente raportate de Sowik şi colab. (2004)
la soiul ‘Elsanta’, creşterea frecvenţei variaţiei somaclonale fiind
obţinută şi prin prelungirea perioadei de cultură. Damiano şi colab.
(1997) au izolat o somaclonă de căpşun rezistentă la Colletotrichum
acutatum, eficienţa procesului de selecţie fiind dependentă de vârsta
culturii.
Brar şi Jain (1998) consideră că frecvenţa mai mare a variaţiei
somaclonale corelată cu durata mai mare a culturii in vitro este mai
degrabă consecinţa acumulării secvenţiale a mutaţiilor în timp, decât o
creştere a ratei mutaţiilor în culturile bătrâne.
Chiar dacă sunt respectate condiţiile de bază privind
desfăşurarea procesului de micropropagare în scopul păstrării
fidelităţii clonale a plantelor neoformate, analiza genetică a plantelor
micropropagate se impune şi ca urmare a variaţiei genetice

115
preexistentă în celulele explantului (Evans şi colab., 1984; Karp şi
Bright, 1985; Larkin şi Scowcroft, 1981; Scowcroft şi Larkin, 1988).
Variaţia pre-existentă se datorează faptului că explantele
nu sunt în mod normal unicelulare, fiind un amestec de ţesuturi sau
celule cu nivele diferite de ploidie sau cu diverse variaţii determinate
de mutaţii (Skirvin şi colab., 1994). Având în vedere că regenerarea
plantelor prin cultura de ţesuturi începe, adesea, de la o singură
celulă, aceste diferenţe se exprimă în plantele regenerate. Se poate
spune că celulele vegetale dispun de resurse genetice pentru
producerea variaţiei somaclonale. Procesul îndelungat desfăşurat în
sensul ameliorării plantelor de cultură a exploatat deja această
variaţie genetică într-o proporţie considerabilă, sau poate a optimizat
genotipul, astfel încât putem presupune că variaţia somaclonală va fi
în mod frecvent nefavorabilă la speciile înalt selecţionate (Larkin,
1998).
Nu în ultimul rând, în generarea variaţiei somaclonale a fost
frecvent semnalată influenţa genotipului. Deşi distincţia între efectul
genotipului şi răspunsul diferit la cultura in vitro (incluzând mediul de
cultură, explantul, condiţiile de cultură şi interacţiunea acestora) este
dificilă, este incontestabil faptul că, genotipul influenţează variaţia
somaclonală, oricare ar fi modul de regenerare (Bebeli şi colab., 1988;
Popescu şi colab., 1997; Hammerschlag şi colab., 2006).
O astfel de situaţie a fost raportată şi la Fragaria × ananassa
(Swartz şi colab., 1981), evaluarea variantelor apărute printre plantele
regenerate din cultura de meristeme arătând că soiul ‘Earliglow’ a
produs un număr cel puţin dublu de variante afectând tufa, frunza sau
fructul, comparativ cu subclonele soiurilor ‘Guardian’ sau ‘Redchief’.
Variaţia somaclonală a fost intens studiată la căpşun şi de Sansavini
şi colab. (1989), cele mai întâlnite modificări fiind variegarea şi cloroza
frunzelor, dar şi piticismul plantelor regenerate, iar frecvenţa variaţiei
somaclonale a variat între 0.048 şi 0.461%, în funcţie de genotip.
Lee şi Phillips (1988) au afirmat că replicarea întârziată a
heterocromatinei, caracteristică unor genotipuri, poate intensifica
procesul de rupere al cromozomilor în timpul culturii in vitro.
Genotipurile purtătoare de elemente genetice transpozabile sunt mult
mai instabile în cultura in vitro, comparativ cu cele lipsite de
transpozoni (Peschke şi Phillips, 1991), dar nu toate mutaţiile unor
astfel de genotipuri sunt urmarea activării transpozonilor (William şi
colab., 1991).

116
 Dar dacă contribuţia preexistenţei unor astfel de modificări
genetice la variaţia somaclonală este dificil de dovedit (Cullis, 1992),
şi de altfel nu se impune ca o necesitate, nenumărate dovezi
experimentale sugerează că majoritatea modificărilor genetice care
conduc la variaţie somaclonală, apar pe parcursul fazelor de cultură.
În cazul în care într-adevăr unele modificări genetice preexistă în
genotipurile supuse regenerării, sau acestea sunt mai predispuse la
alterări ale materialului genetic, nivelul variaţiei observate va fi desigur
amplificat (De Klerk, 1990; Hashmi şi colab., 1997).
Deşi instabilitatea genetică şi fiziologică a culturilor de calus
reprezintă un impediment major pentru utilizarea acestora în scopul
multiplicării clonale şi al conservării germoplasmei, există specii
la care culturile de calus sunt foarte stabile, fără modificări genetice pe
perioade lungi de timp, putând fi utilizate în scopul micropropagării
(Corneanu şi Corneanu, 2007).
Pornind de la această afirmaţie, la sfârşitul acestui subcapitol,
considerăm necesar să accentuăm stabilitatea genetică a plantulelor
regenerate prin lăstărire axilară şi, în special a celor neoformate din
explante de frunză şi peţiol, astfel încât putem considera, pentru
început, că genotipurile de căpşun ornamental ‘Serenata’ şi ‘Pink
Panda’ sunt stabile în condiţiile culturii in vitro.

117
11. PROTOCOL DE LUCRU PENTRU MICROPROPAGAREA PRIN
LĂSTĂRIRE AXILARĂ A HIBRIZILOR INTERGENERICI
‘SERENATA’ ŞI ‘PINK PANDA’

Cercetările privind aplicabilitatea tehnicilor de culturi de ţesuturi

pentru micropropagarea in vitro a genotipurilor de căpşun ornamental
‘Serenata’ şi ‘Pink Panda’ au evidenţiat aspecte definitorii ale
condiţiilor de cultură sub aspectul elaborării unui protocol eficient şi
rapid de regenerare şi multiplicare in vitro a oricărui soi, sau a
selecţiilor de elită.
Tehnicile de micropropagare se disting de toate celelalte metode
convenţionale de multiplicare prin condiţiile aseptice imperios
necesare în obţinerea unui rezultat favorabil. De asemenea, o atenţie
deosebită trebuie acordată selecţiei materialului biologic, sub aspectul
stării fitosanitare şi autenticităţii lui.
Tipul şi mărimea explantelor. Pentru iniţierea culturii in vitro se
utilizează apexuri caulinare cu 2-3 primordii foliare, cu dimensiuni
cuprinse între 0.1 şi 0.3 mm, excizate din vârful filamentelor recoltate
de la plante mature din câmp.
În vederea iniţierii culturii in vitro este recomandată prelevarea
explantelor în lunile de vegetaţie activă a căpşunului, respectiv între
lunile Martie şi Octombrie, pentru a evita influenţa negativă a
fitohormonilor implicaţi în procesul de dormanţă.
Metoda de asepsizare a explantelor. După îndepărtarea
primelor frunze cu ajutorul unei lame scalpel, filamentele se spală
în apă de robinet pentru îndepărtarea urmelor de substrat.
Asepsizarea materialului biologic se realizează în două etape,
prima etapă constând în imersia filamentelor în alcool etilic 94° timp
de 1-2 minute, iar în a doua etapă, în hipoclorit de calciu 6% timp
de 14 minute, urmate de 3 clătiri cu apă distilată sterilă. Prelevarea
apexurilor caulinare după asepsizare se realizează la o lupă
binoculară simplă şi în atmosferă sterilă asigurată de hota cu flux
laminar de aer steril, pentru a evita contaminările secundare.
Cel mai adecvat mediul de cultură pentru stimularea
lăstăririi axilare. Pentru ambele genotipuri de căpşun ornamental
mediul de bază MS suplimentat cu 1.0 mg/l BAP, 0.2 mg/l AIB
şi 0.1 mg/l GA3 a condus la valori ridicate ale ratei de multiplicare,
asociate cu o vigoare ridicată a lăstarilor regeneraţi (Fig. 29). Astfel,
la genotipul ‘Serenata’, rata medie de multiplicare calculată la sfârşitul
celor patru subculturi succesive a indicat obţinerea unui număr mediu
118
de 16,3 lăstari formaţi per explant iniţial, cu un maxim de 18.85 lăstari
formaţi per explant iniţial după cea de-a doua subcultură. La genotipul
‘Pink Panda’, prin utilizarea aceluiaşi mediu de cultură a
fost obţinut un număr maxim de 10.9 lăstari formaţi per explant iniţial
după prima subcultură, respectiv un număr mediu de 7.43 lăstari
formaţi per explant iniţial după cele patru subculturi.

‘Serenata’ ‘Pink Panda’

Figura 29. Lăstari regeneraţi pe mediul de bază MS suplimentat cu 1.0 mg/l

BAP, 0.2 mg/l AIB şi 0.1 mg/l GA3.

Deoarece s-a constatat că în sezonul rece capacitatea de

multiplicare a lăstarilor este mai scăzută, menţionăm că lăstărirea
axilară poate fi înalt stimulată şi în afara perioadei de vegetaţie activă,
prin utilizarea unui mediu de cultură adecvat. Astfel, în lunile de
toamnă şi iarnă, mediul de cultură LF s-a dovedit a fi adecvat pentru
micropropagarea genotipurilor de căpşun ornamental ‘Serenata’ şi
‘Pink Panda’, iar o concentraţie mai mare de citochinină a influenţat
pozitiv procesele de regenerare sub aspectul creşterii numărului de
lăstari formaţi per explant iniţial. Prin urmare, în condiţiile menţionate,
pe baza rezultatelor noastre, recomandăm utilizarea mediului de bază
LF suplimentat cu 2.0 mg/l BAP şi 1.0 mg/l AIA.

119
 Regimul de vitrocultură. Culturile in vitro se menţin în camera
de creştere (Fig. 30), la temperatura de 22-24°C, în condiţiile unui
fotoperiodism de 16 ore lumină/8 ore întuneric şi la o intensitate a
luminii de aproximativ 40 µmol m-2 s-1. Culturile de explante
meristematice trebuiesc supuse în prealabil unui pretratament la
întuneric, cu durata de 2 săptămâni, menţinând neschimbaţi ceilalţi
factori fizici din camera de creştere.

Figura 30. Incubarea vitroculturilor în camera de creştere.

0,5 cm 0,5 cm

Figura 31. Microlăstari transferaţi pe medii de multiplicare proaspete.

120
 Parametrii de multiplicare. Multiplicarea se efectuează prin
divizarea buchetelor şi transferul lăstarilor pe medii de multiplicare
proaspete. Anterior transferului lăstarilor, foliolele frunzelor se
îndepărtează (Fig. 31). Durata fiecărei subculturi pe mediu de
multiplicare este de 4-5 săptămâni.
Particularităţile lăstarilor multiplicaţi. Partea bazală a
peţiolului lăstarilor prezintă o pigmentaţie de culoare roz-roşie,
caracteristică secreţiei de antociani, uneori absentă la genotipul ‘Pink
Panda’ şi mult mai pronunţată la genotipul ‘Serenata’.
Cel mai eficient mediu de cultură pentru înrădăcinarea
in vitro a lăstarilor. Mediul de bază recomandat pentru înrădăcinarea
microlăstarilor este reprezentat de macroelemente MS ½ n,
microelemente LF ½ n şi vitamine MS, cu adaos de auxine, fie AIB, fie
AIA, în diferite concentraţii.
La genotipul ‘Serenata’, mediul de bază suplimentat cu 0.25 mg/l
AIB + 0.1 mg/l GA3 a condus la înrădăcinarea a 80% dintre lăstarii
regeneraţi pe mediul de bază MS suplimentat cu 1.0 mg/l BAP, 0.2
mg/l AIB şi 0.1 mg/l GA3.
Deşi, la genotipul ‘Pink Panda’ o rată maximă de înrădăcinare de
100% a fost indusă atât de AIB introdus în mediul de cultură într-o
concentraţie de 0.25 mg/l, cât şi de AIA într-o concentraţie de 0.5 mg/l,
eficienţa maximă a primei auxine (AIB), la numai jumătate din
concentraţia celei de-a doua, o face recomandabilă pentru stimularea
înrădăcinării in vitro a microlăstarilor. Mediul de bază suplimentat cu
0.25 mg/l AIB + 0.1 mg/l GA3 a stimulat dezvoltarea unui număr mediu
de 6.04 rădăcini per explant, lungime medie a rădăcinilor fiind de
12.13 mm.
Aclimatizarea şi adaptarea plantulelor. În vederea aclimatizării,
rădăcinile plantulelor se spală delicat, prin scufundare în apă de
robinet pentru îndepărtarea urmelor de agar de pe sistemul radicular
şi, apoi, se transplantează în perlit, în condiţii de seră. Adaptarea la
condiţiile de mediu ex vivo impune reducerea treptată a umidităţii
atmosferice, motiv pentru care paturile cu perlit în care au fost
transplantate plantulele (multiplicate şi înrădăcinate in vitro) se
acoperă cu folie de polietilenă şi se descoperă gradual.

121
BIBLIOGRAFIE
1. Aalders, L.E. (1964): Production of maternal type plants through crosses to
apomictic species. Nature, 204:101-102.
2. Abrahamson, W.G. (1975): Reproductive strategies in dewberries. Ecology,
56:721-726.
3. Adam, J., Wilson, D. (1967): Factors affecting the germination of strawberry
seed. Annual Report-Long Ashton Research Station., p. 90-95.
4. Adams, A.N. (1972): An improved medium for strawberry meristem culture.
The Journal of Horticultural Science, 47:263-264.
5. Ahloowalia, B., Sherington, J. (1985): Transmission of somaclonal variation in
wheat. Euphytica, 34:525-537.
6. Al-Khalifah, N.S., Hadi, S., Khan, F. (2005): Influence of sucrose
concentration on in vitro growth of five rose (Rosa hybrida L.) cultivars. Plant
Tissue Culture, 15(1):43-49.
7. Arnau, G., Lallemand, J., Bourgoin, M. (2002): Fast and reliable strawberry
cultivar identification using inter simple sequence repeat (ISSR) amplification.
Euphytica, 129:69-79.
8. Arulsekar, S., Bringhurst, R.S. (1981): Inheritance of PGI and LAP isozymes
in octoploid cultivated strawberries. Journal of the American Society for
Horticultural Science, 106:679-683.
9. Arulsekar, S., Bringhurst, R.S. (1983): Strawberry. In: Isozymes in Plant
Genetics and Breeding. Part B. Tanksley, S.D. & Orton, T.J. (Eds.), Elsevier
Sci. Publ., Amsterdam, p. 391-400.
10. Asker, S. (1970): An intergeneric Fragaria × Potentilla hybrid. Hereditas,
64:135-139.
11. Balaraju, K., Agastian, P., Preetamraj P., Arokiyaraj, S., Ignacimuthu, S.
(2008): Micropropagation of Vitex agnus-castus (Verbenaceae) – a valuable
medicinal plant. In Vitro Cellular and Developmental Biology – Plant,
44(5):436-441.
12. Barrientos, F., Bringhurst, R.S. (1973): A haploid of an octoploid strawberry
cultivar. Horticultural Science, 8:44.
13. Barrientos, F., Bringhurst, R.S. (1974): Interspecific Fragaria and intergeneric
Fragaria × Potentilla amphiploids in strawberry breeding. Proceedings XIX
International Horticultural Congress, Warsaw, p. 362.
14. Battistini , C., Rosati, P. (1991): In vitro evaluation of somaclonal strawberry
(Fragaria × ananassa ‘Brighton’) variants for susceptibility to Phytophtora
cactorum. In: Dale, A., Luby, J.J. (Eds.). Strawberry into the 21 Century,
Timber Press, Portland, Oregon, USA, p. 121-123.
15. Baturin, S.O., Sukhareva, N.B. (1995): Induced apomixis as a mode
of improvement of varieties of cultivated strawberry. In: Genetical Basis of
Agricultural Plants, Moscow, p. 141-149.
16. Baturin, S.O., Sukhareva, N.B., Maletskii, S.I. (1995): Application
of apomixis for studying inheritance of everbearing habit in garden strawberry
(Fragaria × ananassa Duch.). Russian Journal of Genetics, 31(10):1207-1212.
17. Bayliss, M.V. (1980): Chromosomal variation in plant tissues in culture.
International Review of Cytology, Supplement, 11A:113-114.

122
18. Bebeli, P.J., Karp, A., Kaltsikes, P.J. (1988): Plant regeneration from cultured
immature embryos of sister lines of rye and triticale differing in their content of
heterochromatin I. Morphogenetic response. Theoretical and Applied Genetics,
75:929-936.
19. Bell, J.A., Simpson, D.W. (1994): The use of isoenzyme polymorphisms as an
aid for cultivar identification in strawberry. In: Progress in Temperate Fruit
Breeding. Schmidt, H. & Kellerhals, M. (Eds.), Kluwer Acad. Publ.,
p. 321-325.
20. Bentham, G. (1865): Handbook of the British Flora. 2nd ed., vol. 2,
pp. 1076.
21. Bentvelsen, G., Bouw, E., Veldhuyzen van Zanten, J.E. (1997): Breeding
strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) from seed. Acta Horticulturae,
439:149-154.
22. Bentvelsen, G., Bouw, B. (2006): Breeding ornamental strawberries. Acta
Horticulturae, 708: 455-458.
23. Benzion, B., Phillips, R.L. (1988): Cytogenetic stability of maize tissue cultures;
a cell line pedigree analysis. Genome, 30:318-325.
24. Berezenko, N.P. (1979): Abnormal phenomena in the development
of ovules, female gametophyte and embryo in Fragaria grandiflora.
Ukrayinskyi Botanichnyi Zhurnal, 36:16-20.
25. Bhatt, I.D., Dhar, U. (2000): Micropropagation of Indian wild strawberry. Plant
Cell, Tissue and Organ Culture, 60:83-88.
26. Bish, E.B., Cantliffe, D.J., Hockmuth, C.J., Chandler, C.K. (1997):
Development of containerized transplants for Florida’s winter production
system. Acta Horticulturae, 439:461-468.
27. Biswas, M.K., Dutt, M., Roy, U.K., Islam, R., Hossain, M. (2009): Development
and evaluation of in vitro somaclonal variation in strawberry for improved
horticultural traits. Scientia Horticulturae, 122(3):409-416.
28. Black, B.L., Swartz, J.H., Deitzer, G.F., Butler, B., Chandler C.K. (2005): The
effects of conditioning strawberry plug plants under altered red/far-red light
environments. HortScience: 40(5):1263-1267.
29. Blidar, C.F. (2004): Evolutia protocormilor de Cymbidium hybridum cultivati
in vitro pe medii lichide, pe punti din hârtie de filtru, în functie de sezonul
de inoculare. În: Lucrarile celui de al XII-lea Simpozion National de Culturi de
Tesuturi si Celule Vegetale “Fitopatologia celulei vegetale în regim
de vitrocultura”, Cachita-Cosma, D., Ardelean, A., Fati, V. (Edit.), Editura Daya,
Satu-Mare, pp: 213-227.
30. Bois, F. (1992): The influence of some cell-derived precursors on
organogenesis and differentiation of wild strawberry (Fragaria vesca) callus
culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 28:91-96.
31. Bordallo, P.N., Silva, D.H., Maria J., Cruz, C.D., Fontes, E.P. (2004):
Somaclonal variation on in vitro callus culture potato cultivars. Horticultura
Brasileira, 22:300-304.
32. Bouza, L., Jacques, M., Sotta, B., Miginiac, E., (2004): Relations between
auxin and citokinin contents and in vitro rooting of tree Peony (Paeonia
suffruticosa Andr.). Plant Growth Regulation, 15(1):69-73.
33. Boxus, P.H. (1974): The production of strawberry plants by in vitro
micropropagation. The Journal of Horticultural Science, 49:209-210.

123
34. Boxus, P. (1976): Rapid production of virus-free strawberry by in vitro culture.
Acta Horticulturae, 66:35-38.
35. Boxus, P. (1989): Review of in vitro strawberry mass production. Acta
Horticulturae, 265:309-320.
36. Boxus, P. (1999): Micropropagation of strawberry via axillary shoot
proliferation. In: Plant Cell Culture Protocols. Methods in Molecular Biology.
Part III. Plant Propagation In Vitro, vol 111, Hall, R. D. (Ed.) Humana Press
Inc., Totowa N.J., p. 103-114.
37. Boxus, P., Damiano, C., Brasseur, E. (1983): Strawberry. In: Handbook of
Plant Cell Culture. Ammirato, P. V., Evans, D. A., Sharp, W. P., Yamada, Y.
(Eds.), Vol. 3. Macmillan, New York, p. 453-486.
38. Boxus, P., Jemmali, A., Terzi, J.M., Arezki, O. (2000): Drift in genetic stability
in micropropagation: The case of strawberry. Acta Horticulturae, 530:155-161.
39. Bozena, B. (2001): Morphological and physiological characteristics
of micropropagated strawberry plants rooted in vitro or ex vitro. Scientia
Horticulturae, 89:195-206.
40. Brandizzi, F., Forni, C., Frattarelli, A., Damiano, C. (2001): Comparative
analysis of DNA nuclear content by flow cytometry on strawberry plants
propagated via runners and regenerated from meristem and callus culture.
Plant Biosystems, 135:169-174.
41. Brar, D.S., Jain, S.M. (1998): Somaclonal variation: mechanism and
applications in crop improvement. In: Somaclonal Variation and Induced
Mutations in Crop Improvement, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p.
15-37.
42. Braun, J.W., Kender, W.J. (1985): Correlative bud inhibition and growth habit
of the strawberry as influenced by application of gibberellic acid, cytokinin, and
chilling during short day length. Journal of the American Society for
Horticultural Science, 110:28-34.
43. Bringhurst, R.S., Arulsekar, S., Hancock, J.F., Voth, V. (1981): Electrophoretic
characterization of strawberry cultivars. Journal of the American Society for
Horticultural Science, 106:684-687.
44. Broertjes, C., Keen, A. (1980): Adventitious shoots: do they develop from one
cell? Euphytica, 29:73-87.
45. Brown, P.T.H. (1989): DNA methylation in plants and its role in tissue culture.
Genome, 31:717-729.
46. Brown, D.C.W., Thorp, T.A. (1995): Crop improvement through tissue culture.
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11:409-415.
47. Brown, P.T.H., Yoneyama, K., Lorz, H. (1989): An investigation into the role of
5-azacytidine in tissue culture. Theoretical and Applied Genetics,
78:321-328.
48. Brown, P.T.H., Gobel, E., Lorz, H. (1991): RFLP analysis of Zea mays callus
culture and their regenerated plants. Theoretical and Applied Genetics,
81:227-232.
49. Brown, P.T.H., Lange, D.F., Kranz, E., Lorz, H. (1993): Analysis of single
protoplast and regenerated plants by PCR and RAPD technology. Molecular
and General Genetics, 237:311-317.
50. Brummit, R.K. (1997): Taxonomy versus cladonomy, a fundamental
controversy in biological systematics. Taxon, 46:723-734.

124
51. Brummit, R.K. (2002): How to chop a tree. Taxon, 51:31-41.
52. Cameron, J.S., Hancock, J.F. (1986): Enhanced vigor in vegetative progeny of
micropropagated strawberry plants. HortScience, 21:1225-1226.
53. Cameron, J.S., Hancock, J.F., Flore, J.A. (1989): The influence of
micropropagation of yield components, dry matter partitioning and gas
exchange characteristics of strawberry. Scientia Horticulturae, 38:61-67.
54. Cao, X., Hammerschlag, F.A. (2000): Improved shoot organogenesis from leaf
explants of highbush blueberry. Horticultural Science, 35:945-947.
55. Carli, A., Pellicano, D., Mezzeti, B., Rosati, P. (1993): Phytophthora cactorum
resistance evaluation of petal and receptacle regenerants in the susceptible
strawberry cv. ‘Pajaro’ with an ion leakage method. Acta Horticulturae,
348:422-426.
56. Caro, A., Puntarulo, D. (1996): Effect of in vitro ion supplementation on oxigen
radical production by soybean roots. Biochimica et Biophysica Acta,
1291:245-251.
57. Chalupa, V. (2002): In vitro propagation of mature trees of Sorbus aucuparia L.
and field performance of micropropagated trees. Journal of Forest Science,
48:529-535.
58. Chaoluan, L., Ikeda, H., Ohba, H. (2003): Potentilla Linnaeus, Sp. Pl., 1: 495,
1753. In: Gobin, S. (Ed). A checklist of Potentilla fruticosa. The shrubby Flora
of China, 9:291-327.
59. Chase, S.S. (1969): Monoploids and monoploids derivatives of maize (Zea
mays L.). Botanical Review, 35:117-167.
60. Chellappa, T. (1959): The physiology of strawberry seed germination.
Dissertation Abstracts, 20:859-860.
61. Ciocârlan, V. (2009): Flora Ilustrată a României: Pteridophyta et
Spermatophyta. Editura Ceres, Bucureşti.
62. Cloutier, S., Landry, B.S. (1994): Molecular markers applied to plant-tissue
culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology, 30(1):32-39.
63. Collins, G.B., Sadasivaiah, R.S. (1972): Meiotic analysis of haploid and
doubled haploid forms of Nicotiana otophora and Nicotiana tabacum.
Chromosoma, 38:387-404.
64. Coman, T., Neculae, L. (1981): Micropropagarea industrială a soiurilor
de perspectivă la căpşun. In: Culturile de Ţesuturi – Instrument de Cercetare
în Biologia Vegetală, Teoretică şi Practică, Cluj-Napoca, p. 189-200.
65. Coman, M., Popescu, A. (2009): Interspecific hybridization for the introduction
of fruit flavor from wild Fragaria into commercial strawberry. Acta
Horticulturae 842: 511-514.
66. Congiu, L., Chicca, M., Cella, R., Rossi, R. , Bernacchia, G. (2000):
The use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers to identify
strawberry varieties: A forensic application. Molecular Ecology, 9:229–232
67. Cook, R.E. (1983): Clonal plant populations. American Scientist,
71:244-253.
68. Corneanu G, Corneanu M. (2007): Biotehnologii Moderne. În: Enciclopedie de
Biologie. Mohan, G., Ardelean, A. (Coord.), Editura All Educational, Bucureşti,
p. 764-850.

125
69. Cossio, F., Menin, G. (1982): Micropropagazione della fragola: confronto tra
substrati contenenti differenti miscele di macroelementi. Atti Incontro Fragola,
Soc. Ortofrut. Italiana, Cesena, p. 54-57.
70. Cullis, C.A. (1992): The molecular biology of plant cell and cultures. In: Plant
Biotechnology. Comprehensive Biotechnology, Fowler, M.W., Warren, G.S. &
Moo-Young, M. (Eds.), Pergamon Press, p. 19-30.
71. Dalman, P., Malata, V. (1997): The effect of cultivation practices on the over-
wintering and yield of strawberry. Acta Horticulturae, 439:881-886.
72. D’Amato, F. (1985): Cytogenetics of plant cell and tissue cultures and their
regenerates. CRC Critical Review in Plant Science, 3: 73-112.
73. Damiano, C. (1980): Strawberry micropropagation. Proceeding of the
conference on nursery production of fruit plants through tissue cuture:
Application and feasibility, p. 93-101.
74. Damiano, C., Ascarelli, A., Frattarelli, A., Lauri, P. (1995): Adventitious
regeneration and genetic variability in strawberry. Acta Horticulturae, 392:
107-114.
75. Damiano, C., Monticelli, S., Frattarelli, A., Nicolini S., Corazza, L. (1997):
Somaclonal variability and in vitro regeneration of strawberry. Horticultural
Biotechnology: In Vitro Culture and Breeding, p. 87-93.
76. Dangl, S.G., Lee W.E., Sim, T.S., Golino, A.D. (2007): A new system for
strawberry cultivar identification developed at Foundation Plant Services
(FPS), University of California, Davis, using Simple Sequence Repeat (SSR)
primers. Proceedings of the 2007 North American Strawberry Symposium and
the North American Strawberry Growers, p. 118-121.
77. Darrow, G.M. (1927): Sterility and fertility in strawberry. Journal
of Agricultural Resources, 34:393-411.
78. Davidson, C.G. (1995): Potentilla fruticosa taxonomy and international
registration. Acta Horticulturae, 413:157-162.
79. Davis, T.M., Yu, H. (1997): A linkage map of the diploid strawberry Fragaria
vesca. Journal of Heredity, 88:215-221.
80. Davis, T.M., DiMeglio, L.M., Yang, R.H., Styan, S.M.N., Lewers, K.S. (2006):
Assessment of SSR transfer from the cultivated strawberry to diploid
strawberry species: Functionality, linkage group assignment and use
in diversity analysis. Journal of the American Society for Horticultural Science,
131:506–512.
81. De Assis, M., Hildebrandt, A.G. (1977): In vitro growth of apical meristems
of strawberries. In Vitro, 13:145-149.
82. Debnath, S.C. (2003): Micropropagation of small fruits. Micropropagation
of Woody Trees and Fruits, Jain, S. M., Ishii, K. (Eds), Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, p. 465-506.
83. Debnath, S.C. (2005): Strawberry sepal: another explant for thidiazuron-
induced adventitious shoot regeneration. In Vitro Cellular and Developmental
Biology – Plant, 41:671-676.
84. Debnath, S.C. (2006): Zeatin overcomes thidiazuron-induced inhibition
of shoot elongation and promotes rooting in strawberry culture in vitro. Journal
of Horticultural Science and Biotechnology, 81:349-354.

126
85. Debnath, S.C., Teixeira da Silva, J.A. (2007): Strawberry culture in vitro:
Applications in genetic transformation and biotechnology. Fruit, Vegetable and
Cereal Science and Biotechnology, 1(1):1-12.
86. Debnath, S.C., Khanizadeh, S., Jamieson, A.R., Kempler, C. (2008): Inter
simple sequence repeat (ISSR) markers to assess genetic diversity and
relatedness within strawberry genotypes. Canadian Journal of Plant Science,
88:313–322.
87. Degani, C., Rowland, L.J., Saunders, J.A., Hokanson, S.C., Ogden, E.L.,
Golan-Goldhirsh, A., Galletta, G.J. (2001): A comparison of genetic
relationship measures in strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) based on
AFLPs, RAPDs, and pedigree data. Euphytica, 117:1–12.
88. De Klerk, G.J. (1990): How to measure somaclonal variation.
Acta Botanica Neerlandica, 39:129–144.
89. Deng, C., Davis, T.M. (2001): Molecular identification of the yellow fruit color
(c) locus in diploid strawberry: A candidate gene approach. Theoretical and
Applied Genetics, 103:316–322.
90. Diggs, G.M., Lipscomb, B.L. (2002): What is a writer of a flora to do?
Evolutionary taxonomy or phylogenetic systematics? Sida, 20:647-674.
91. Dijkstra, J. (1993): Development of alternative methods for healthy
propagation of strawberry using cuttings. Acta Horticulturae, 447:289-293.
92. Dijkstra, J. (1994): Early cuttings essential for good trayplant. Fruitteelt Den
Haag, 84(13):18-19.
93. Dirlewanger, E., Graziano, E., Joobeur, T., Garriga-Calderé, F., Cosson, P.,
Howad, W., Arús, P. (2004): Comparative mapping and marker-assisted
selection in Rosaceae fruit crops. Proceedings of the National Academy
of Science, USA, 101(26):9891–9896.
94. Driver, J.A., Suttle, G.R. (1987): Nursery handling of propagules. In: Cell and
Tissue Culture in Forestry. Bonga, J.M. & Durzan, D.J. (Eds.), Dordrecht,
Netherlands, p. 320-335.
95. Droog, F. (1997): Plant glutathione S-tranferases, a tale of Theta and Tau.
Journal of Plant Growth Regulation, 16:95-107.
96. Dziadczyk, P., Dyrda, D.E., Hortynski, J.A. (2005): NaCl influence on the
in vitro germination of Fragaria × ananassa (Duch.) and F. vesca (L.) seeds.
Small Fruits Review, 4(1):11-19.
97. East, M.E. (1930): The production of homozygotes through induced
parthenogenesis. Science, 72:148-149.
98. El Hamdouni, E.M., Lamarti, A., Badoc, A. (1999): La régénération in vitro
du fraisier (Fragaria × ananassa Duch.). I – Les différentes phases
de la micropropagation. II – Les possibilités par la culture in vitro. Bulletin
de la Société de Pharmacie, Bordeaux, 138(1-4):19-48, 49-74.
99. El Hamdouni, E.M., Lamarti, A., Badoc, A. (2000): Micropropagation des
cultivars ‘Chandler’ et ‘Tudla’ de fraisier (Fragaria x ananassa Duch). Bulletin
de la Société de Pharmacie de Bordeaux, 139:91-104.
100. El Hamdouni, E.M., Lamarti, A., Badoc, A. (2001). In vitro germination of the
achenes of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) cvs. ‘Chandler’ and
‘Tudla’. Bulletin de la Société de Pharmacie, Bordeaux, 140:31-42.
101. Elkington, T.T., Woodel, S.R.J. (1963): Potentilla fruticosa L. (Dasiphora
fruticosa (L.) Rydb.). Journal of Ecology, 51:769-781.

127
102. Ellis, J.R. (1958a): Cytogenetic studies in the genera Fragaria and Potentilla.
PhD Thesis, University College, London, p. 1-263.
103. Ellis, J.R. (1958b): Intergeneric hybridization between Fragaria and Potentilla.
International Gen. Congress Abs. vol. II, p. 74.
104. Ellis, J.R. (1962): Fragaria-Potentilla intergeneric hybridization and evolution
in Fragaria. Proceedings of the Linnean Society of London, 173:99-106.
105. Ellis, J.R. (1989): Frel. US Plant Patent. http://patft.uspto.gov/netacgi/nph-
Parser?Sect1=PTO1&Sect2=HITOFF&d=PALL&p=1&u=%2Fnetahtml%2FPT
O%2Fsrchnum.htm&r=1&f=G&l=50&s1=PP07,598.PN.&OS=PN/PP07,598&R
S=PN/PP07.598
106. Elstner, E.F. (1991): Oxygen radicals – biochemical basis for their efficacy.
Klinische Wochenschrift, 69:949-956.
107. Eriksson, T., Donoghue, M.J., Hibbs, M.S. (1998): Phylogenetic analysis
of Potentilla using DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed
spacer (ITS), and implications for the clasification of Rosoideae (Rosaceae).
Plant Systematics and Evolution, 211:155-179.
108. Eriksson, T., Hibbs, M.S., Yoder, A.D., Delwiche, C.F., Donoghue, M.J. (2003):
The Phylogeny of Rosoideae. International Journal of Plant Science,
164(2):197–211.
109. Evans, D.A., Sharp, W.R., Medina-Filho, H.P. (1984): Somaclonal
and gametoclonal variation. American Journal of Botany, 6:759-774.
110. Faedi, W., Mourgues, F., Rosati, C. (2002): Strawberry breeding
and varieties: situation and perspectives. Acta Horticulturae, 567:51-59.
111. Faedi, W., Quarta, R., Persano, S., Apoloni, F.M., Damiano, C. (1993):
Somaclonal variation in plants regenerated by anther culture of cv. ‘Pajaro’.
Acta Horticulturae, 348:427-429.
112. Finstad, K., Martin, R.R. (1995): Transformation of strawberry for virus
resistance. Acta Horticulturae, 385: 86-90.
113. Folta, K.M., Davis, T.M. (2006): Strawberry genes and genomics. Critical
Reviews in Plant Science, 25:1-17.
114. Folta, K.M., Howard, L., Dhingra, A., Stewart, P.J., Chandler, C.K. (2006):
Characterization of LF9, an octoploid strawberry genotype selected for rapid
regeneration and transformation. Planta, 224:1058-1067.
115. Foucault, C. (1990): In vitro: néoformation sur cals dans le cas du Fraisier
(Fragaria × ananassa Duchesne). Étude du comportement au champ
de plantes régénérés. Thèse Doctorale, Univ. Angers, France.
116. Foucault, C., Letouze, R. (1987): In vitro regeneration de plantes
de Frasier a partir de fragmentes de petiole et de bourgeons floraux. Biologia
Plantarum, 29:409-414.
117. Fourré, J.L., Berger, P., Niquet, L., André, P. (1997): Somatic embryogenesis
and somaclonal variation in Norway spruce: morphogenetic, cytogenetic and
molecular approaches. Theoretical and Applied Genetics, 94:159–169.
118. Gaafar, R.M., Saker, M.M. (2006). Monitoring of cultivars identity and genetic
stability in strawberry varieties grown in Egipt. World Journal of Agricultural
Sciencies, 2(1):29-36.
119. Galletta, G. J., Maas, J. L. (1990): Strawberry genetics. HortScience, 25:871–
879.

128
120. Gamborg, O.L., Miller, R.A., Ojima, K. (1968): Nutrient requirements
of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research,
50:151-158.
121. Gamborg, O.L., Wetter, L.R. (1975): Plant Tissue Culture Methods. National
Research Council of Canada, Saskatoon, p. 1-19.
122. Garcia, M.G., Ontivero, M., Diaz Ricci, J.C., Castagnaro, A. (2002):
Morphological traits and high resolution RAPD markers for the identification of
the main strawberry varieties cultivated in Argentina. Plant
Breeding, 121(1):76-80.
123. Gavrilova, L.I. (1985): Anther culture as a method of propagating strawberries.
In: Problema Vegetativnaya Razmnozheniya v Sadovodstve State Publishers,
Moskow, p. 128-132.
124. George, E.F. (1996): Plant propagation by tissue culture: in practice, Part II.
nd
2 edition. Exegetics Limited Press, London.
125. Gerstberger, P. (1994): Fragaria. Gustav Hegl, Illustrierte Flora von
Mitteleuropa, In: Weber, H.E. (Hrsg.), Bd.IV, Teil 2A, 3 Aufl., Blackwell, Berlin:
597-619.
126. Gidoni, D., Rom, M., Kunik, T., Zur, M., Izsak, E., Izhar, S., Firon, N. (1994):
Strawberry-cultivar identification using Randomly Amplified Polymorphic DNA
(RAPD) markers. Plant Breeding, 113:339–342.
127. Gil-Ariza, D.J., Amaya, I., Botella, M.A., Muoz Blanco, J., Caballero, J.L.,
López-Aranda, J.M., Valpuesta, V., Sánchez-Sevilla, J.F. (2006): EST-derived
polymorphic microsatellites from cultivated strawberry (Fragaria × ananassa)
are useful for diversity studies and varietal identification among Fragaria
species. Molecular Ecology Notes, 6:1195–1197.
128. Goswami, D., Matfield, B. (1975): Cytogenetics studies in the genus Potentilla.
New Phytologist, 75(1):135-146.
129. Govan, C.L., Simpson, D.W., Johnson, A.W., Tobutt, K.R., Sargent, D.J.
(2008): A reliable multiplexed microsatellite set for genotyping Fragaria and its
use in a survey of 60 F. × ananassa cultivars. Molecular Breeding, 22:649–
661.
130. Graham, M.W., Larkin, P.J. (1995): Adenine methylation at dam sites
increases transient gene expression in plant cells. Transgenic Research,
4:324-331.
131. Graham, J., McNichol, R.J., McNichol, J.W. (1996): A comparison
of methods for the estimation of genetic diversity in strawberry cultivars.
Theoretical and Applied Genetics, 93:402–406.
132. Greuter, W., McNeill, J., Barrie, F.R., Burdet, H.M., Demoulin, V., Filgueiras,
T.S., Nicolson, D.H., Silva, P.C., Skog, J.E., Trehane, P., Turland, N.J.,
Hawksworth, D.L., (2000): International Code of Botanical Nomenclature
(Saint Louis Code) adopted by the Sixteenth International Botanical Congress
St. Louis, Missouri, July – August, 1999. Konigstein: Koeltz Scientific Books.
133. Guillén, A., Rico, E., Castroviejo, S. (2005): Reproductive biology of the
Iberian species of Potentilla L. (Rosaceae). Anales del Jardin Botánico de
Madrid, 62(1):9-21.
134. Guttridge, C.G., Bright, S. (1978): Accelerating and synchronizing germination
of strawberry seed by osmotic pretreatments. Euphytica, 27(3):843-
848.

129
135. Haberlandt, G. (1902): Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen.
Sitzungsberichte der Akademie der Wissenschaften in Wien, Mathematisch-
Naturwissenschaftliche Klasse, 3:69-92.
136. Hadley, H.H., Openshaw, S.J. (1980): Interspecific and intergeneric
hybridization. In: Ferh, W. R. & Hadley, H. H. (Eds.), Hybridization of Crop
Plants. American Society of Agronomy, Inc., Crop Science. Society of America,
USA, p. 133-159.
137. Hadonou, A.M., Sargent, D.J., Wilson, F., James, C.M., Simpson, D.W. (2004):
Development of microsatellite markers in Fragaria, their use in
genetic diversity analysis and their potential for genetic linkage mapping.
Genome, 47:429–438.
138. Hammer, K., Pistrick, K. (2003): New versus old scientific names
in strawberries (Fragaria L.). Genetic Resources and Crop Evolution,
50:789-791.
139. Hammerschlag, F.A. (1992): Somaclonal variation. In: Hammerschlag,
F.A. & Litz, R.E. (Eds.). Biotechnology of Perennial Fruit Crops. Wallingford:
CAB International, p. 35-55.
140. Hammershlag, F., Garces, S., Koch-Dean, M., Ray, S., Lewers, K., Maas, J.,
Smith, B.J. (2006): In vitro responce of strawberry cultivars and regenerants to
Colletotrichum acutatum. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 84(3): 255-
261.
141. Hampl, V., Pavlicek, A., Flegr, J. (2001): Construction of bootstrap analysis of
DNA fingerprinting-based polygenetic trees with a freeware program Free
Tree: Application of trichomonad parasites. International Journal of Systematic
and Evolutionary Microbiology, 51:731-735.
142. Hancock, J.F. (1999): Strawberries. Crop Production Science in Horticulture
Series, No. 11. CABI Publishing, Wallingford, UK.
143. Hancock, J.F., Callow, P.A., Shaw, D.V. (1994): Randomly amplified
polymorphic DNAs in the cultivated strawberry, Fragaria × ananassa. Journal
of the American Society of Horticultural Science, 119(4):862-864.
144. Hancock, J.F., Luby, J.J., Dale, A., Callow, P.W., Serҫe, S., El-Shiek, A.
(2002): Utilizing wild Fragaria virginiana in strawberry cultivar development:
Inheritance of photoperiod sensitivity, fruit size, gender, female fertility and
disease resistance. Euphytica, 126(2):177-184.
145. Handel, S.N. (1985): The intrusion of clonal growth patterns on plant breeding
systems. American Naturalist, 125:367-384.
146. Hanhineva, K., Kokko, H., Kärenlampi, S. (2005): Shoot regeneration from leaf
explants of five strawberry (Fragaria × ananassa) cultivars in temporary
imersion bioreactor system. In Vitro Cellular and Developmental Biology -
Plant, 41:826-831.
147. Hanke, V. (1993): Untersuchungen zur Keimung von Achänen bei Erdbeere.
Erwerbsobstbau, 35(4):105-109.
148. Hansen, K.J., Elven, R., Brochmann, C. (2000): Molecules and morphology in
concert: test of some hypotheses in arctic Potentilla (Rosaceae). American
Journal of Botany, 87:1466-1479.
149. Hashmi, G., Huettel, R., Meyer, R., Krusberg, L., Hammershlag, F. (1997):
RAPD analysis of somaclonal variants derived from embryo callus culture of
peach. Plant Cell Reports, 16:624-627.
130
150. Hao, Y.J., Deng, X.X. (2002): Analysis of ploidy and the patterns of amplified
fragment length polymorphism and methylation sensitive amplified
polymorphism in strawberry plants recovered from cryopreservation.
Cryoletters, 23:37-46.
151. Heslop-Harrison, J.S. (2005): Introduction. In: Biotechnology of Fruit and Nut
Crops Litz, R.E. (Ed.), Biotechnology in Agriculture Series; no. 29. CABI
Publishing, p. XIX – XXIV.
152. Hokanson, S.C., Maas, J.L. (2001): Strawberry biotechnology, In: Plant
Breeding Reviews. John Wiley and Sons Inc., New York, p. 139-180.
153. Holland, J.B. (2004): Incorporation of exotic germplasm. Encyclopedia
of Plant and Crop Science, p. 222-224.
154. Horn, W.A.H. (1992): Micropropagation of rose (Rosa L). In: Bajaj, Y.P.S.
(Ed.). Biotechnology in Agriculture and Forestry. Vol. 20, High-tech
and Micropropagation IV. Springer, Germany, p. 320-342.
155. Huetteman, C.A., Preece, J.E. (1993): Thidiazuron: a potent cytokinin for
woody plant tissue culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 33:105-119.
156. Hughes, H.G., Janick, J. (1974): Production of tetrahaploids in the cultivated
strawberry. HortScience, 9:442-444.
157. Hummer, K., Hancock, J.F. (2009): Strawberry genomics: botanical history,
cultivation, traditional breeding, and new technologies. Genetics and
genomics of Rosaceae. In: Plant Genetics/Genomics, vol.6., Folta, K.M. and
Gardiner, S.E. (Eds), Springer Science and Business Media, LLC, New York,
p. 413-435.
158. Hummer, E.K., Nathewet, P., Yanagi, T. (2009): Decaploidy in Fragaria
iturupensis (Rosaceae). American Journal of Botany, 96:713-716.
159. Hunter, S.A., Hennerty, M.J., Foxe, M.J. (1984): Micropropagation
of strawberry: The influence of four auxin and three cytokinin compounds.
In: Plant Tissue Culture and its Agricultural Applications, University
of Nottingham, Abstract no. 61.
160. Husaini, A. M., Abdin, M. Z. (2007): Interactive effect of light, temperature and
TDZ on the regeneration potential of leaf discs of Fragaria × ananassa Duch.
In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 43(6):576-584.
161. Husaini, A.M., Aquil, S., Bhat, M., Qadri, T., Kamaluddin Abdin, M.Z. (2008): A
high-efficient direct somatic embryogenesis system for strawberry (Fragaria ×
ananassa Duch.) cultivar ‘Chandler’. Journal of Crop Science and
Biotechnology, 11(2):107-110.
162. Iapichino, G., D'Anna, F. (2003): Genotype variation in Fragaria × ananassa
Duch. seed germination under in vitro salinity stress. Acta Horticulturae,
609:109-111.
163. Ichijima, K., (1926): Cytological and genetic studies on Fragaria. Genetics.
11:590-604.
164. Isac, V., Popescu, A., Coman M. (1994): Studies on plant regeneration from
tissue-derived callus in Fragaria x ananassa Duch. In: Progress in Temperate
Fruit Breeding. Developments in Plant Breeding, Vol. 1, Kluwer Publ.,
Dordrecht.
165. Islam, A.S. (1961): The haploid strawberry, Fragaria vesca L. and the
significance of haploidy in phylogeny and plant breeding. Scientist (Pakistan),
4:1-17.

131
166. Iyer, C.P., Subramanyam, M.D., Singh, R. (1975): Improving seed germination
with mist. Current Science, 44 (24):895-896.
167. Jain, S.M. (2001): Tissue culture-derived variation in crop improvement.
Euphytica, 118:153-166.
168. Jain, S.M., Pehu, E. (1992): The prospects of tissue culture and genetic
engineering for strawberry improvement. Acta Agriculturae Scandinavica,
Section B, Soil and Plant Science, 42(3):133-139.
169. James, D.J., Newton, B. (1977): Auxin:cytokinin interactions in the in vitro
micropropagation of strawberry plants. Acta Horticulturae, 78:321-331.
170. Jelenkovic, G., Wilson, M.L., Harding, P.J. (1984): An evaluation of
intergeneric hybridization of Fragaria spp. × Potentilla spp. as a means
of haploid production. Euphytica, 33:143-152.
171. Jemmali, A., Boxus, P., Kinet, J.M. (1992): Are strawberry plantlets arising
from adventitious stipule buds also true to type? Acta Horticulturae, 319:171-
176.
172. Jemmali, A., Boxus, P., Dekegel, D., Van Heule, G. (1994): Occurrence
of spontaneous shoot regeneration on leaf stipules in relation to
hyperflowering response in micropropagated strawberry plantlets. In Vitro
Cellular and Developmental Biology-Plant, 30:192-195.
173. Jemmali A., Boxus Ph., Kevers C., Gaspar Th., 1995. Carry-over
of morphological and biochemical characteristics associated with
hyperflowering of micropropagated strawberries. Journal of Plant Physiology,
147:435–440.
174. Jones, J.K. (1955): Cytogenetic studies in the genera Fragaria and Potentilla.
PhD Thesis, University of Manchester, UK.
175. Jones, O.P., Walker, B.J., Beech, M.G. (1988): The production of strawberry
plants from callus culture. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 12:235-241.
176. Jungnickel, F. (1988): Strawberry (Fragaria spp. and hybrids). In: Bajaj, Y.P.S.
(Ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, Vol. 6, Springer-Verlag,
Berlin, p. 38-103.
177. Kadereit, J.W., Schwarzbach, A.E., Jork, K.B. (1997): The phylogeny
of Papaver s.I. (Papaveraceae): polyphyly or monophyly? Plant Systematics
and Evolution, 204:75-98.
178. Kaeppler, S.M., Phillips, R.L. (1993): Tissue culture-induced DNA methylation
variation in maize. The Proceedings of the National Academy of
Science Online, USA, 90:8773-8776.
179. Kaeppler, S.M., Phillips, R.L., Olhoft, P. (1998): Molecular basis
of heritable tissue culture-induced variation in plants. In: Jain et al. (Eds).
Somaclonal Variation and Induced Mutations in Crop Improvement. Current
Plant science and Biotechnology in Agriculture, Vol. 32, Kluwer Academic
Publishers, Dordrecht, Netherlands, p. 465-484.
180. Kaeppler, S., Kaeppler, H., Rhee, Y. (2000): Epigenetic aspects of somaclonal
variation in plants. Plant Molecular Biology, 43:179-188.
181. Kalkman, C. (1968): Potentilla, Duchesnea and Fragaria in Malaesia
(Rosaceae). Blumea, 16:325-354.
182. Kamelin, R.V. (2001): Potentilla L. Flora Europae Orientalis. In: Tzvelev, N.N.
(Eds)., Mir i Semia, Sankt-Petersburg, 10:394-452 [In Russian].

132
183. Kang, K.Y., Ha, S.H., Jeong, H.B., Jeong, J.S., Lee, S.S. (1994): Study on the
tissue culture of strawberry (Fragaria × ananassa). 2. Organ differentiation
and virus free stock production from petiole tissue culture. RDA Journal of
Agricultural Science and Biotechnology, 36(2):193-198.
184. Karp, A. (1995): Somaclonal variation as a tool for crop improvement.
Euphytica, 85:295-302.
185. Karp, A., Bright, S.W.J. (1985): On the causes and origins of somaclonal
variation. Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 2,
p. 199-234.
186. Kaur, R., Gautam, H., Sharma, D.G. (2005): A low cost strategy for
micropropagation of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) cv. ‘Chandler’.
Acta Horticulturae, 696:129-133.
187. Kaushal, K., Nath, A.K., Kaundal, P., Sharma, D.R. (2004): Studies on
somaclonal variation in strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) cultivars. Acta
Horticulturae, 662:269–275.
188. Kaushal, K., Nath A.K., Sharma, D.R. (2006): Establishment of callus culture
and plant regeneration in strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) cv.
‘Chandler’. Indian Journal of Plant Physiology, 11(2):136-144.
189. Kawata, M., Ohmiya, A., Shimamoto, Y., Oono, K., Takaiwa, F. (1995):
Structural changes in the plastid DNA of rice (Oryza sativa L.) during tissue
culture. Theoretical and Applied Genetics, 90:364-371.
190. Kahl, G. (1983): Wound repair and tumor induction in higher plants.
In: Akazawa, T., Imasei, H. (Eds). The New Frontiers in Plants Biochemistry,
Japan Scientific Society Press. Tokyo and Martinus Nijhoff/Dr. W. Junk Publ.,
The Hague, p. 193-216.
191. Khanizadeh, S., Cousineau, J., Deschênes, M., Levasseur, A., Carisse, O.
(2002): Roseberry and Rosalyne: two new hardy, day-neutral, red flowering
strawberry cultivars. Acta Horticulturae, 567 (1):173-174.
192. Khanizadeh, S., DeEll, J. (2005): Our strawberries – Les fraisier de chez nous,
Agriculture and Agri-Food, Horticultural Research and Development Centre,
Quebec, Canada.
193. Kartha, K.K., Leung, N.L., Pahl, K. (1980): Cryopreservation of strawberry
meristems and mass propagation of plantlets. Journal of the American Society
for Horticultural Science, 105(4):481-484.
194. Kikas, A., Libek, A., Vasar, V. (2006): Influence of micropropagation on the
production of strawberry runners plants, yield and quality. Acta Horticulturae,
708:241-244.
195. Kinet, J. M., Parmentier, A. (1989): The flowering behaviour
of micropropagated strawberry plants cv. ‘Gorella’: the influence of the number
of subcultures on the multiplication medium. Acta Horticulturae, 265:327-334.
196. Kinet, J.M., Parmentier, A., Boxus, P. (1990): Hyperflowering: an abnormal
reproductive behaviour in micropropagated strawberry plants. Archives
Internationale de Physiologie, de Biochimie et de Biophysique, 98(6):49.
197. Knobloch, I.W. (1972): Intergeneric hybridization in flowering plants. Taxon,
21(I):97-103.
198. Knop, W. (1965): Quantitative Untersuchungen Über den Ernährungens
prozess der Pflanze. Landwisrtsch, Versuch-St, 7:93-107.

133
199. Kondakova, V., Schuster, G. (1991): Elimination of strawberry mottle virus and
strawberry crinckle virus from isolated apices of three strawberry varieties by
the addition of 2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (5-azadihydro uracil) to the
nutrient medium. Journal of Phytopathology, 132:84-86.
200. Korbin, M., Kuras, A., Zurawicz, E. (2002): Fruit plant germplasm
characterization using molecular markers generated in RAPD and ISSR-PCR.
Cellular and Molecular Biology Letters, 7:785–794.
201. Koorneef, M., Bade, J., Hanhart, C., Horsman, K., Schell, J., Soppe, W.,
Verkerk, R., Zabel, P. (1993): Characterization and mapping of a gene
controlling shoot regeneration in tomato. Plant Journal, 3(1):121-129.
202. Kretschmerm M., Krüger-Stedenm, E. (1997): Uber die Keimfähigkeit von
Erdbeersaatgut. Gemuese, 33(7):417-418.
203. Kumar M.K., Barker R.E., Reed B.M., (1999): Morphological and molecular
analysis of genetic stability in micropropagated Fragaria x ananassa cv.
‘Pocahontas’. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 35: 254-
258.
204. Kunihisa, M., Fukino, N., Matsumoto, S. (2003): Development of cleavage
amplified polymorphic sequence (CAPS) markers for identification of
strawberry cultivars. Euphytica, 134:209–215.
205. Kunihisa, M., Fukino, N., Matsumoto, S. (2005): CAPS markers improved by
cluster-specific amplification for identification of octoploid strawberry (Fragaria
× ananassa Duch.) cultivars, and their disomic inheritance. Theoretical and
Applied Genetics, 110:1410–1418.
206. Kuras, A., Korbin, M., Zurawicz, E. (2004);: Comparison of suitability
of RAPD and ISSR techniques for determination of strawberry (Fragaria ×
ananassa Duch.) relationship. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 79:189–
193.
207. Kuznetsova, L., Grout, B., Baturin, S.O., Zilke, R. (2009): Improving double-
usage (ornamental and fruiting) strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) in
Western Siberia. International Conference on FoodOmics, Abstract Book,
University of Bologna, Cesena, Italy.
208. Laimer da Câmara Machado, M., da Câmara Machado, A., Hanzer, V.,
Kalthoff, B., Weiss, H., Mattanovich, D., Regner, F. and Katinger, H. (1991): A
new, efficient method for the initiation and establishment of tissue cultures of
apple from adult material. Plant, Cell, Tissue and Organ Culture,
27:155-160.
209. Landi, L., Mezzetti, B. (2006): TDZ, auxin and genotype effects on leaf
organogenesis in Fragaria. Plant Cell Reports, 25:281-288.
210. Larkin, P.J. (1998): Introduction. In: Somaclonal Variation and Induced
Mutations in Crop Improvement, Mohan Jain, S., Brar, D.S., Ahloowalia,
B.S.(Eds.). Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, p. 3-13.
211. Larkin, P.J., Scowcroft, W.R. (1981): Somaclonal variation - a novel source of
variability from cell cultures for plant improvement. Theoretical and Applied
Genetics, 60:197-241.
212. Lassner, M.W., Orton, T.J. (1983): Detection of somatic variation. In:
Isozymes in Plant Genetics and Breeding. Tanksley, S.D. and Orton, T.J.
(Eds.), Elsevier Science and Technology Publishers, Amsterdam, p. 207-216.

134
213. Lee, E.C.M., de Fossard, R.A. (1975): Regeneration of strawberry plants from
tissue cultures. In: Proceedings of International Plant Propagation Society,
25:277-285.
214. Lee, E.C.M., de Fossard, R.A. (1977): Some factors affecting multiple bud
formation of strawberry (Fragaria × ananassa Duchesne) in vitro. Acta
Horticulturae, 78:187-196.
215. Lee, J.B., Park, M.O. (1980): Organ formation on axillary buds of strawberry in
in vitro culture. Journal of the Korean Society for Horticultural Science, 21:13-
17.
216. Lee, M., Phillips, R.L. (1988): The chromosomal basis of somaclonal variation.
Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 39:413-437.
217. Leslie, A.C. (1995): Fragaria L. The European Garden Flora. In: Cullen, J. et
al. (Eds), Vol. 4, Cambridge University Press, p. 397-398.
218. Lewers, K.S., Styan, S.M.N., Hokanson, S.C. (2005): Strawberry Gene-Bank-
derived and genomic simple sequence repeat (SSR) markers and their utility
with strawberry, blackberry, and red and black raspberry. Journal of the
American Society for Horticultural Science, 130(1):102-115.
219. Li, H., Zhang, Z., Huang, F., Chang, L., Ma, Y. (2009) : MicroRNA expression
profiles in conventional and micropropagated strawberry (Fragaria × ananassa
Duch.) plants. Plant Cell Reports, 28:891-902.
220. Linnaeus, C. (1753): Species plantarum. Holmiae, vol. 2, p. 1200.
221. Linsmaier, E.M., Skoog, F. (1965): Organic growth factor requirements
of tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, 18:100-127.
222. Lis, E.K. (1990): In vitro clonal propagation of strawberry from immature
achenes. Acta Horticulturae, 280:147-149.
223. Lis, E.K. (1993): Strawberry plant regeneration by organogenesis from
peduncle and stolon segments. Acta Horticulturae, 348:435-438.
224. Litz, R.E., Gray, D.J. (1992): Organogenesis and embryogenesis. In:
Biotechnology of Perennial Fruit Crops. Hammerschlag, F.A. & Litz, R.E.
(Eds.), CAB International, p. 3-34.
225. Litwińczuk, W. (2004): Field performance of ‘Senga Sengana’ strawberry
plants (Fragaria × ananassa Duch.) obtained by runners and in vitro through
axillary and adventitious shoots. Electronic Journal of Polish Agricultural
Universities, Horticulture 7. Available online:
http://www.ejpau.media.pl/series/volume7/issue/horticulture/art-03 .html.
226. Liu, Z.R., Sanford, J.C. (1988): Plant regeneration by organogenesis from
strawberry leaf and runner culture. HortScience, 23:1056-1059.
227. Loh, C.S., Rao, A.N. (1989): Clonal propagation of guava (Psidium guajava L.)
from seedling and grafted plants and adventitious shoot formation in vitro.
Scientia Horticulturae, 39:31-39.
228. Losina-Losinskaja, A.S. (1926): Revision critique du genre Fragaria
(in Russian). Bulletin du Jardin Botanique, 2547-88.
229. López-Aranda, J.M., Pliego-Alfaro, F., Lopez-Navidad, I., Barceló-Muňoz, M.
(1994): Micropropagation of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.). Effect of
mineral salt, benzyladenine levels and number of subcultures on the in
vitro and field behavior of the obtained microplants and the fruiting capacity of
their progeny. The Journal of Horticultural Science, 69:625-637.

135
230. Lorz, H. (1984): Variability in tissue culture derived plants. In: Genetic
Manipulation: Impact on Man and Society. Arber, W. (Ed.), Cambridge
University Press, Cambridge, p. 103-114.
231. Lovett Doust, L. (1981): Population dinamics and local specialization in a
clonal perennial (Ranunculus repens) 1. The dynamics of ramets in
contrasting habitats. Journal of Ecology, 69:743-755.
232. Mabberley, D.J. (2002): Potentilla and Fragaria (Rosaceae) reunited. Telopea,
9:793-801.
233. MacFarlane Smith, W.H., Jones, J.K. (1985): Intergeneric crosses with
Fragaria × Potentilla. I. Crosses between Fragaria moschata and Potentilla
fruticosa. Euphytica, 34:725-735.
234. Malik, K. A., Saxene, P. K. (1992): Thidiazuron induces high frequency shoot
regeneration in intact seedlings of pea, chickpea and lentil. Australian Journal
of Plant Physiology, 19:731–740.
235. Mancousin, C. (1988): Adventitious rhizogenesis control: new developments.
Acta Horticulturae, 230:97-104.
236. Mangelsdorf, J.A., East, E.M. (1927): Studies on the genetics of Fragaria.
Genetics, 12:307-339.
237. Mankessi, F., Saya, R.A., Toto, M., Monteuuis, O. (2010): Propagation
of Eucalyptus urophylla x Eucalyptus grandis clones by rooted cuttings:
influence of genotype and cutting type on rooting ability. Propagation
of Ornamental Plants, 10(1):42-49.
238. Marcotrigiano, M., Morgan, P.A., Swartz, H.J., Ruth, J. (1987): Histogenic
instability in tissue culture-proliferated strawberry plants. Journal of American
Society for Horticultural Science, 112:583-587.
239. Marcotrigiano, M., Swartz, H.J., Gray, S.E., Tokarcik, D., Popenoe, J. (1984):
The effect of benzylaminopurine on the in vitro multiplication rate and
subsequent field performance of tissue-culture propagated strawberry plants.
Advances in Strawberry Production,3:23-25.
240. Marta, A.E., Camadro, E.L., Diaz-Ricci, J.C., Castagnaro, A.P. (2004):
Breeding barriers between the cultivated strawberry, Fragaria × ananassa,
and related wild germplasm. Euphytica, 136:139-150.
241. McClintock, B. (1984): The significance of the responses of the genome
to challenge. Science, 226:792-801.
242. McGrew, J.R. (1965): Eradication of latent C virus in Suwannee variety
of strawberry by heat plus excised runner tip culture. Phytopathology,
55:480-481.
243. McKersie, B.D., Leshem, Y.Y. (1994): Stress and Stress Coping in Cultivated
Plants. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht.
244. Milella, L., Saluzzi, D., Lapelosa, M., Bertino, G., Spada, P., Greco, I., Martelli,
G. (2006): Relationships between an Italian strawberry ecotype and its
ancestor using RAPD markers. Genetic Resources and Crop Evolution,
53:1715–1720.
245. Miller, A.R., Chandler, C.K. (1990): Plant regeneration from excised
cotyledons of mature strawberry achenes. HortScience, 25(5):569-571.
246. Miller, P.W., Belkengren, R.O. (1962): Obtaining virus-free strawberries by
excising and culturing of apical meristem of plants infected with the yellow -

136
 edge, crinkle, and vein banding viruses and certain other virus complexes.
Phytopathology, 52:743-744.
247. Miller, P.W., Belkengren, R.O. (1963): Elimination of yellow edge, crinkle and
vein banding viruses and certain other virus complexes from strawberry by
excision and culturing of apical meristems. Plant Disease Reports,
47:298-300.
248. Mitich, L.M. (1995): Cinquefoils (Potentilla spp.): The five finger weeds. Weed
Technology, 9(4):857-861.
249. Mohamed, A.E. (2007). Somaclonal variation in micropropagated strawberry
detected at the molecular level. International Journal of Agriculture and
Biology, 9(5):721-725.
250. Mohan, R., Chui, E.A., Biasi, L.A., Soccol, C.R. (2005): Alternative in vitro
propagation: use of sugarcane bagasse as a low cost support material during
rooting stage of strawberry cv. ‘Dover’. Brazilian Archives of Biology and
Technology, 48:37-42.
251. Mok, M.C., Mok, D.W.S., Armstrong, D.J., Shudo, K., Isogai, Y., Okamoto, T.
(1982): Cytokinin activity of N-phenil-N’-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea (thidiazuron).
Phytochemistry, 21(7):1509-1511.
252. Morel, G.M. (1960): Producing virus-free cymbidiums. American Orchid
Society Bulletin, 29:495-497.
253. Morishita, M., Yamakawa, O. (1990): Variance of the plants regenerated from
callus in anther culture of strawberry. Journal of the Japanese Society for
Horticultural Science, 59:420-421.
254. Murashige, T., Skoog, F. (1962): A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologya Plantarum,
15(3):473-497.
255. Murthy, B. N. S., Murch, S. J., Saxena, P. K. (1995): TDZ-induced somatic
embryogenesis in geranium (Pelargonium × hortorum Bailey cv. Ringorose)
cotyledonary cultures. Plant Cell Report, 15:423–426.
256. Myers, R.M., Lumelsky, N., Lerman, L.S., Maniatis, T. (1985): Detection
of single base substitutions in total genomic DNA. Nature, 313:495-497.
257. Nakamura, S. (1972): Germination of strawberry seed. Journal of the
Japanese Society for Horticultural Science, 41 (4):367-375.
258. Navari-Izzo, J., Quartacci, M.F., Sgherri, C.L.M. (1996): Superoxide
generation in relation to dehydratation and rehydratation. Biochemical Society
Transactions, 24: 447-451.
259. Nehra, N.S., Chibbar, R.N., Kartha, K.K., Datla, R.S.S., Crosby, W.L.,
Stushnoff, C. (1990): Genetic transformation of strawberry by Agrobacterium
tumefaciens using a leaf disk regeneration system. Plant Cell Reports, 9:293-
298.
260. Nehra, N.S., Kartha, K.K., Stushnoff, C. (1991a): Nuclear DNA content and
isoenzyme variation in relation to morphogenic potential of strawberry
(Fragaria × ananassa) callus cultures. Canadian Journal of Botany,
69:239-244.
261. Nehra, N.S., Kartha, K.K., Stushnoff, C. (1991b): Isozymes as markers for
identification of tissue culture and greenhouse-grown strawberry cultivars.
Canadian Journal of Plant Science, 71:1195-1201.

137
262. Nehra, N.S., Kartha, K.K., Stushnoff, C. (1992a): Plant Biotechnology and
Strawberry Improvement. Advances in Strawberry Research, 11:1-11.
263. Nehra, N.S., Kartha, K.K., Stushnoff, C., Giles, K.L. (1992b): The influence
of hormone concentrations and callus age on somaclonal variation in callus
culture regenerants of strawberry. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
29:257-268.
264. Nehra, N.S., Kartha, K.K., Stushnoff, C., Giles, K.L. (1994): Effect of in vitro
propagation methods on field performance of two strawberry cultivars.
Euphytica, 76:107-115.
265. Nehra, N.S., Stushnoff, C., Kartha, K.K. (1988): Regeneration of plants from
imature, leaf-derived callus of strawberry. HortScience, 23, 756.
266. Nehra, N.S., Stushnoff, C., Kartha, K.K. (1989): Direct shoot regeneration
from strawberry leaf disks. Journal of the American Society for Horticultural
Science, 114(6):1014-1018.
267. Nehra, N.S., Stushnoff, C., Kartha, K.K. (1990): Regeneration of plants from
immature leaf-derived callus of strawberry (Fragaria × ananassa). Plant
Science, 66:119-126.
268. Nicolè, F., Tellier, F., Vivat, I., Till-Bottraud, A. (2007): Conservation unit
status inferred for plants by combining interspecific crosses and AFLP,
Conservative Genetics, 8:1273–1285.
269. Niemirowicz-Szczytt, K. (1984)a: The result of intergeneric pollination
of Fragaria × ananassa Duch. and Fragaria virginiana Duch. by Potentilla
species. Acta Societatis Botanicorum Polonie, 53:443-454.
270. Niemirowicz-Szczytt, K. (1984)b: Morphological and cytological evaluation
of progeny obtained from Fragaria × ananassa Duch. with Potentilla spp. Acta
Societatis Botanicorum Polonie, 53:455-468.
271. Niemirowicz-Szczytt, K. (1987): Strawberry (Fragaria × ananassa Duch.)
haploids and their generative progeny: Induction and characteristics.
Agricultural University Press, Warsaw, 3-84.
272. Niemirowicz-Szczyt, K. (1990): Somaclonal variation in strawberry.
In: Bajaj YPS (Ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry, vol. 11.
Somaclonal variation in crop improvement I. Springer, Berlin, Heidelberg, New
York, Tokyo, p. 511-528.
273. Niemirowicz-Szczytt, K., Malepszy, S. (1980): Micropropagation from the
meristems and young leaves of Fragaria. Bulletin of the Polish Academy
of Sciences - Chemistry, Biology Science, 28:335-340.
274. Nishi, S., Oosawa, K. (1973): Mass production method of virus-free strawberry
plants through meristem callus. Japan Agricultural Research Quarterly, 7:189-
194.
275. Nishi, S., Oosawa, K., Toyoda, T. (1974): Studies on the anther culture
of vegetable crops. I. Differentiation of young seedlings of some vegetable
crops from calli formed by anther culture. Bulletin of the Vegetable and
Ornamental Crops Research Station, Series A, 1: 1-40.
276. Nourse, S.M., Fickus, E.W., Cregan, P.B., Hokanson, S.C. (2002):
Development of simple sequence repeat (SSR) molecular markers
in strawberry, In: Hokanson, S.C. & Jamienson, A.R. (Eds.). Strawberry
Research to 2001. ASHS Press, Alexandria, p. 48-53.

138
277. Nuti Ronchi, V. (1991): Cytogenetics of plant cell cultures. In: Plant Tissue
Cultures. Applications and Limitations. Bhojwani, S. S. (Ed.), Elsevier,
Amsterdam, p. 276-308.
278. Nyman, M., Wallin, A. (1992): Improved culture technique for strawberry
(Fragaria x ananassa Duch.) protoplasts and the determination of DNA
content in protoplast-derived plants. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
30:127-133.
279. Oosawa, K., Kuriyama, T., Sugahara, Y. (1981): Clonal multiplication
of vegetatively propagated crops through tissue culture. I. Effective balance of
auxin and cytokinin in the medium and suitable explant part for mass
production of plantlets in strawberry, garlic, scallion, welsh onion, yam and
taro. Bulletin of the Vegetable and Ornamental Crops Research Station,
Series A, 9:1-46.
280. Oosawa, K., Takayanagi, K. (1982): High yielding variants in strawberry
derived from anther culture. In: Proceedings of 5th International Congress of
Plant Tissue and Cell Culture, Peking, p. 765-766.
281. Palombi, M.A., Monticelli, S., Festa, S., Damiano, C. (2003): In vitro
adventitious regeneration affects the genetic stability of strawberry plants
(Fragaria × ananassa Duch.). Acta Horticulturae, 616:459-462.
282. Palonen, P., Lindén, L. (2001): Winter hardiness of micropropagated and
conventionally propagated strawberry plants. Journal of Horticultural Science
and Biotechnology, 76:685-690.
283. Passey, A.J., Barrett, K.J., James, D.J. (2003): Adventitious shoot
regeneration from seven commercial strawberry cultivars (Fragaria ×
ananassa Duch.) using a range of explant types. Plant Cell Reports,
21:397-401.
284. Paterson, A.H., Tanksley, S.D., Sorrells, M.E. (1991): DNA markers
in plant improvement. Advances in Agronomy, 46:39–90.
285. Peloquin, S.J., Hougas, R.W., Cabert, A.C. (1966): Haploidy as a new
approach to the cytogenetics and breeding of Solanum tuberosum. In:
Riley, R.& K. R. Lewis (Eds.). Chromosome manipulation and plant genetics.
Plenum Press, New York, p. 21-27.
286. Peschke, V.M., Phillips, R.L., Gegenbach, B.G. (1992): Genetic and molecular
analysis of tissue culture-derived Ac elements. Theoretical and Applied
Genetics, 82:121-129.
287. Peschke, V.M., Phillips, R.L. (1991): Activation of the maize transposable
element Suppressor-mutator (Spm) in tissue culture. Theoretical and Applied
Genetics, 81:90-97.
288. Peschke, V.M., Phillips, R.L. (1992): Genetic implications of somaclonal
variation in plants. Advances in Genetics, 30:41-75.
289. Phillips, G.C. (2004): In vitro morphogenesis in plants - recent advances.
In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant, 40:342-345.
290. Phillips, R.L., Kaeppler, S.M., Olhoft, P. (1994): Genetic instability of plant
tissue cultures: break-down of normal controls. Proceedings of the National
Academy for Science, USA, 91:5222-5226.
291. Pierik, R.L.M. (1998): In vitro culture of higher plants as a tool in the
propagation of horticultural crops. Acta Horticulturae, 226:25-40.

139
292. Popescu, A. (1992): Ameliorarea genetică a căpşunului (Fragaria × ananassa)
prin tehnicile de cultură in vitro. Buletin Ştiinţific ICPP, 27:1-9.
293. Popescu, A. (1998): Cercetări privind manipularea genetică a unor specii de
Fragaria prin cultura in vitro. Teză de Doctorat, Universitatea din Bucureşti.
294. Popescu A. (2002): Biotehnologii Aplicate pentru Producerea Materialului
Săditor la Speciile Pomicole. In: Catalog de Soiuri şi Material Săditor Pomicol.
Coordonator: Branişte N., Editura Ceres, Bucureşti.
295. Popescu, A., Isac, V.S., Coman, M.S., Radulescu, M.S. (1997): Somaclonal
variation in plants regenerated by organogenesis from callus culture of
strawberry (Fragaria × ananassa). Acta Horticulturae, 439:89-96.
296. Popescu A., Şuţan N. A., Corneanu G., Isac V. (2008): Influence
of genotype on micropropagation of two intergeneric hybrids Fragaria ×
Potentilla, Analele Universităţii din Craiova, Agricultură, Montanologie
Cadastru, XXXVIII/B:379-384.
297. Pospíšilova, J., Tichá, I., Kadleček, P., Haisel, D., Plzáková, Š. (1999):
Acclimatization of micropropagated plants to ex vitro conditions. Biologia
Plantarum, 42 (4):481-497.
298. Predieri, S., Fasolo Fabbri Malavasi, F., Ancherani, M. (1989): Regeneration
of plants from strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) unpollinated ovaries
and petals. Acta Horticulturae, 265:335-338.
299. Qin, L., Deng, S., Li, Q. (1988): Studies on the anther culture for the
production of virus-free strawberry plants. Acta Horticulturae Sinica,
15:175-179.
300. Qin, Y., Zhang, S., Asghar, S., Zhang, L.X., Qin, Q., Chen, K., Xu, C. (2005a):
Regeneration mechanism of Toyonoka strawberry under different color plastic
films. Plant Science, 168:1425-1431.
301. Qin, Y., Zhang, S., Zhang, L.X., zhu, D., Asghar, S. (2005b): Response
of strawbbery cv. ‘Toyonoka’ in vitro to silver nitrate (AgNO3). HortScience,
40:747-751.
302. Rákosy-Tican, L. (1998): Utilizarea tehnicilor de electrofuziune în hibridarea
somatică a plantelor. Presa Universitară Clujeană.
303. Reed, B.M. (1991): Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage
of strawberry germplasm. Plant Cell Reports, 10:431-434.
304. Reed, B.M., Hummer, K.E. (2002): Genetic Stability of Strawberries
in Culture, In: Hokanson, S.C. & Jamieson, A.R. (Eds.). Strawberry Research
to 2001. ASHS Press, Alexandria, VA. Proceedings of the 5th North American
Strawberry Conference, p. 98-101.
305. Rosati, P. (1993): Recent trends in strawberry production and research:
an overview. Acta Horticulturae, 348:23-35.
306. Rousseau-Gueutin, M., Gaston, M., Aïnouche, A., Aïnouche, M.L., Olbricht, K.,
Staudt, G., Richard, L., Denoyes-Rothan, B. (2009): Tracking the evolutionary
history of polyploidy in Fragaria L. (strawberry): New insights from
phylogenetic analyses of low-copy nuclear genes. Molecular Phylogenetics
and Evolution, 51:515-530.
307. Rugini, E., Orlando, R. (1992): High efficiency shoot regeneration from
calluses of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) stipules of in vitro cultures.
Journal of Horticultural Science, 67:577-582.

140
308. Sanatombi, K., Sharma, G.J. (2007): Micropropagation of Capsicum
frutescens L. using axillary shoot explants. Scientia Horticulturae, 113(1): 96-
99.
309. Sansavini, S. (1989): Frequency and permanence of somaclonal variations
in micropropagated strawberry. In: Culture In Vitro e Micropropagazione
in Ortoflorofrutticoltura, Cesena, p. 24.
310. Sansavini, S., Rosati, P., Gaggioli, D., Toshi, M.F. (1990): Inheritance
and stability of somaclonal variation in micropropagated strawberry. Acta
Horticulturae, 280:375-384.
311. Sánchez Agudo, J.A., Rico, E., Sánchez, J. (1998): Palynological study
of Potentilla subg. Potentilla (Rosaceae) in the Western Mediterranean. Grana,
37:276-284.
312. Sargent, D.J., Clarke, J., Simpson, D.W., Tobutt, K.R., Arús, P., Monfort, A.,
Vilanova, S., Denoyes-Rothan, B., Rousseau, M., Folta, K.M., Bassil, N.V.,
Battey, N.H. (2006): An enhanced microsatellite map of diploid Fragaria.
Theoretical and Applied Genetics, 112:1349–1359.
313. Sargent, D.J., Rys, A., Nier, S., Simpson, D.W., Tobutt, K.R. (2007): The
development and mapping of functional markers in Fragaria and their
transferability and potential for mapping in other genera. Theoretical and
Applied Genetics, 114:373–384.
314. Sayegh, A.J., Hennerty, M.J. (1989): Androgenesis and embryo rescue for
strawberry haploid production. Acta Horticulturae, 265:129-135.
315. Sayegh, A.J., Hennerty, M.J. (1993): Intergeneric hybrids of Fragaria and
Potentilla. Acta Horticulturae, 348:151-154.
316. Scowcroft, W.R., Larkin, P.J. (1988): Somaclonal variation.
In: Applications of Plant Cell and Tissue Culture, Bock, G. and Marsh, J. (Eds).
Chichester: Ciba Foundation Symposium, 137, p. 21-35.
317. Sen, J., Kalia, S., Guha-Mukherjee, S. (2002): Level of endogenous free
amino acids during various stages of culture of Vigna mungo (L.). Hepper -
somatic embryogenesis, organogenesis and plant regeneration. Current
Science, 82(4):429-433.
318. Shanqiang, K., Shurong, H., Renhuang, H., Xianwei, W., Skirvin, R.M. (1988):
The effect of growth regulators on adventitious shoot formation from
strawberry leaves. Journal of Wuhan Botanical Research, 6(2):133-138.
319. Shepard, J.F. (1981): Protoplasts as sources of disease resistance
in plants. Annual Review of Phytopathology, 19:145-166.
320. Sherman, H. (1987): Strawberry clones frozen in time. Agricultural Research,
35:4.
321. Shushunov, S., Balashov, L., Kravtsova, A., Krasnogorsky, I., Latté, K.P.,
Vasiliev, A. (2009): Determination of acute toxicity of the aqueous extract of
Potentilla erecta (Tormentil) rhizomes in rats and mice. Journal of
Medicinal Food, 12(5):1173-1176.
322. Sibi, M. (1976): La notion de programme génétique chez les végétaux
supérieurs. II. Aspect expérimental; obtention de variants (par culture de
tissus in vitro sur Lactuca sativa L., apparition) de vigeur chez les croisements.
Annals de l’amélioration des Plantes, 26:523-547.

141
323. Silander, J.A. Jr. (1985): Microevolution in clonal plants. In: Jackson, J.B.C.,
Buss, L.W., Cook, R.E. (Eds.). Population biology and evolution of clonal
organisms. Yale University Press, New Haven, CT, p. 107–152.
324. Silva, T., Jones, J.K. (1996): In vitro production and propagation of Fragaria
vesca × Potentilla fruticosa hybrids. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
46(1):51-58.
325. Simon, I., Racz, E., Zatyko, J.M. (1987): Preliminary notes on somaclonal
variations of strawberry. Fruit Science Reports, 14:151-154.
326. Simpson, D.W., Bell, J.A. (1989): The response of different genotypes of
Fragaria × ananassa and their seedling progenies to in vitro micropropagation
and the effects of varying the concentration of 6-
benzylaminopurine in the proliferation medium. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, 17:225-234.
327. Singh, A.K., Pandey, S.N. (2004). Genotypic variation among strawberry
cultivars for shoot organogenesis. Acta Horticulturae, 662:277-280.
328. Skirvin, R.M., Janick, J. (1976): Tissue culture – induced variation
in scented Pelargonium spp. Journal of the American Society for Horticultural
Science, 101:281-290.
329. Skirvin, R. M., McPheeters, K.D., Noton, M. (1994): Sources and frequency of
somaclonal variation. HortScience, 29:1232-1237.
330. Smeets, L. (1980): Effect of temperature and daylenght on flower initiation and
runner formation in two everbearing strawberry cultivars. Scientia
Horticulturae, 12(1):19-26.
331. Smeets, L., Kronenberg, H.G. (1955): Runner formation on strawberry plants
in autumn and winter. Euphytica, 4(1):53-57.
332. Soják, J. (2006): Potentilla gobica (Rosaceae), a remarkable new species
from SW Mongolia. Willdenowia, 36:867-869.
333. Sorvari, S., Ulvinen, S., Hietaranta, T., Hiirsalmi, H. (1993): Preculture
medium promotes direct shoot regeneration from micropropagated strawberry
leaf disks. HortScience, 28:55-57.
334. Sowik I., Bieleniu A., Michalczuk L. (2001). In vitro testing of strawberry
resistance to Verticillium dahliae and Phytophtora cactorum. Scientia
Horticulturae, 88:31-40.
335. Sowik, I., Wawrzyńczak, D., Michalczuk, L. (2004): Selection of somaclonal
variants of strawberry with increased tolerance to verticillium wilt. Scientific
Works, 23(2):164-173.
336. Sønsteby, A. (1997): Short-day period and temperature interactions
on growth and flowering of strawberry. Acta Horticulturae, 439: 609-616
337. Sukhareva, N.B. (1976): Apomixis in strawberry. Proc. Biol. Inst. Sib. Sec.
Acad. Sc. USSR, 30:152-164.
338. Sukhareva, N.B. (1970): Elements of apomixis in strawberry. In: Khokhlov, S.
S. (Ed.), Apomixis and breeding, Nauka Publishers Moscow, p. 120-123.
339. Sukhareva, N.B., Baturin, S.O., Trajkovski, K. (2002): Induction of apomixis in
Fragaria x vescana. Acta Horticulturae, 567:231-234.
340. Staudt, G., (1962): Taxonomic studies in the genus Fragaria. Canadian
Journal of Botany, 40:869-886.
341. Staudt, G. (1973): Fragaria iturupensis: A new species of strawberry from East
Asia. Willdenowia, 7:101–104 (în limba germană).

142
342. Staudt, G. (1989): The species Fragaria, their taxonomy and geographical
distribution. Acta Horticulturae, 256:23-33.
343. Staudt, G. (1999): Systematics and geographical distribution of the American
strawberry species: Taxonomic studies in the genus Fragaria (Rosaceae:
Potentilleae). University of California Publications, Botany 81, XII, pp.162
344. Staudt, G. (2008): Strawberry biogeography, genetics and systematics. In: VI
International Symposium, 3-7 March 2008, Huelva.
345. Staudt, G., Dickoré, W.B. (2001): Notes on Asiatic Fragaria species: Fragaria
pentaphylla Losinsk. and Fragaria tibetica spec. vov. Botanische Jahrbücher
für Systematik Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie, 123:341-354.
346. Staudt, G., DiMeglio, L.M., Davis, T.M., Gerstberger, P. (2003): Fragaria ×
bifera Duch.: Origin and taxonomy. Botanische Jahrbücher für Systematik,
Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie, 125:53-72.
347. Staudt, G. 2008. Strawberry biogeography, genetics and systematics.
In: Book of abstracts for the VI International Strawberry Symposium, 35 March
2008, International Society for Horticultural Science. Huelva, Spain.
348. Sullivan, J.A. (1991): Improvement of strawberry using tissue culture
techniques. In: The Strawberry into the 21st Century. Dale, A., Luby, J.J.
(Eds.), Timber Press, Portland, Oregon, p. 84-90.
349. Svensson, M., Johansson, L.B. (1994): Anther culture of Fragaria × ananassa:
Environmental factors and medium components affecting microspore
divisions and callus production. Journal for Horticultural Science, 69(3):417-
426.
350. Swartz, H.J., Galletta, G.J., Zimmerman, R.H. (1981): Field performance and
phenotypic stability of tissue culture-propagated strawberry. Journal of the
American Society for Horticultural Science, 106:667-673.
351. Szczygiel, A., Pierzga, K., Borkowska, B. (2002): Performance
of micropropagated strawberry plantlets after planting in the field.
Acta Hoticulturae, 567:317-320.
352. Şuţan N.A., Popescu A. (2006): The phenotypical and cytogenetical
characterization of some ornamental varieties of Fragaria with unknown origin,
Contribuţii Botanice, XLI, (2):129-134.
353. Şuţan N. A., Popescu A., Isac V., Corneanu G. (2008): Studies on
micropropagation efficiency in ornamental strawberry varieties (Fragaria ×
Potentilla), Lucrări Ştiinţifice, USAMV “Ion Ionescu de la Brad”, Seria
Horticultură, LI (51):749-754.
354. Şuţan N.A., Popescu A., Coman M. (2008): Studies on the reproductive
behavior of some ornamental strawberry varieties (Fragaria x Potentilla),
Lucrări Ştiinţifice, USAMV “Ion Ionescu de la Brad”, Seria Horticultură,
LI(51):755-760.
355. Şuţan N.A., Popescu A., Gheorghe R., Popescu C.F., Isac V. (2009):
Molecular markers for genetic stability of intergeneric hybrids Fragaria x
Potentilla derived from tissue culture. Analele Universităţii din Oradea,
Fascicula Biologie, XVI(2):146-149.
356. Şuţan N. A., Popescu A., Isac V. (2009): The effect of culture medium
composition on in vitro rooting of two intergeneric hybrids Fragaria × Potentilla.
Analele Universităţii din Oradea, Fascicula Biologie, XVI(2): 150-154.

143
357. Şuţan N.A., Popescu A., Isac V. (2010): The influence of the season and
culture medium on micropropagation of two intergeneric Fragaria × Potentilla
varieties. Analele Universităţii din Oradea, Fascicula Biologie, XVII(1):190-195.
358. Şuţan N. A., Popescu A., Isac V. (2010): In vitro culture medium and explant
type effect on callogenesis and shoot regeneration in two genotypes of
ornamental strawberry. Romanian Biotechnological Letters, 15(2)
Supplement:12-18.
359. Taji, T., Ohsumi, C., Iuchi, S., Seki, M., Kasuga, M., Kobayashi, M.,
Yamaguchi-Shinozaki, K., Shinozaki, K. (2002): Important roles
of drought- and cold-inducible genes for galactinol synthase in stress
tolerance in Arabidopsis thaliana. Plant Journal, 29:417–426.
360. Takahashi, H., Takai, T., Matsumoto, T. (1992a): Resistant plants
to Alternaria alternata strawberry pathotype selected from calliclones
of strawberry cultivar Morioka-16 and their characteristics. Journal of the
Japanese Society for Horticultural Science, 61(2):323-329.
361. Takahashi, H., Takai, T., Matsumoto, T. (1992b): Gene analysis of
mutants resistant to Alternaria alternata strawberry pathotype selected from
calliclones of strawberry cultivar ‘Morioka’. Journal of the Japanese Society for
Horticultural Science, 61(2):347-351.
362. Tarenghi, E., Carré, M., Martin-Tanguy, J. (1995): Effects of inhibitors of
polyamine biosynthesis and of polyamines on strawberry microcutting
growth and development. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 42:47-55.
363. Theiler-Hedtrich, R., Woltenberger, H. (1987): Comparison of plant and yield
characteristics of in vitro and normal propagated strawberry plants. Acta
Horticulturae, 212:445-448.
364. Thompson, P.A. (1969): The use of chilling and chemical treatments
to promote rapid germination of strawberry achenes. Journal of Horticultural
Science, 44(2):210-210.
365. Thuesen, A. (1984): Yiled of fruit from meristem propagated strawberry plants.
Tidsskrift for Planteavl, 88:75-80.
366. Tomczyk, M., Latté, K.P. (2009): Potentilla – A review of its phytochemical and
pharmacological profile. Journal of Ethnopharmacology, 122:184-204.
367. Tomczyk, M., Leszczyńska, K., Jakoniuk, P. (2008): Antimicrobial activity
of Potentilla species. Fitoterapia, 79(7-8):592-594.
368. Toyoda, H., Horikoshi, K., Yamano, Y., Ouchi, S. (1991): Selection
of Fusarium wilt disease resistance from regenerants derived from callus
strawberry. Plant Cell Reports, 10:167-170.
369. Tyrka, M., Dziadczyk, P., Hortynski, J.A. (2002): Simplified AFLP procedure
as a tool for identification of strawberry cultivars and advanced breeding lines.
Euphytica, 125:273–280.
370. Tworkoski, T.J., Benassi, T.E., Takeda, F. (2001): The effect of nitrogen
on stolon and ramet growth in four genotypes in Fragaria chiloensis L.
Scientia Horticulturae, 88(2):97-106.
371. Uematsu, Y. (1980): Frequency of variants appearing on breeding a lot
of virus-free strawberry plants by means of anther culture method. Bulletin
of the Shikoku National Agricultural Experiment Station, 25:7-10.

144
372. Ulrich, D., Komes, D., Olbricht, K., Hoberg, E. (2007): Diversity of aroma
patterns in wild and cultivated Fragaria accessions. Genetic Resources and
Crop Evolution, 54(6):1185-1196.
373. Uosukainen, M. (1991): G-basic medium. In: Plant In Vitro Culture - Report
of the 1991 activities. Riordain, F.O. (Ed.). COST 87, Commission of the
European Communities. Biotechnology Research for Innovation, Development
and Growth in Europe, Brussels, p. 34.
374. Vine, S.J. (1968): Improved culture of apical tissues for production of virus
free strawberries. The Journal of Horticultural Science, 43:293-297.
375. Waithaka, K., Hildebrandt, A.C., Dana, M.N. (1980): Hormonal control
of strawberry axillary bud development in vitro. The Journal of the American
Society for Horticulture Science, 105(3):428-430.
376. Wallin, A., Skjoldebrand, H., Nyman, M. (1993): Protoplasts as tools in
Fragaria breeding. Acta Horticulturae, 348:414-420.
377. Wang, D., Wergin, W.P., Zimmerman, R.H. (1984): Somatic embryogenesis
and plant regeneration from immature embryos of strawberry. HortScience,
19(1):71-72.
378. Wang, G., Liu, F., Xue, G., Zhu, Q., Yang, Z., Wang, H. (1990): Research on
identification of strawberry viruses in China and techniques of obtaining virus-
free strawberries. Scientia Agricultura Sinica, 23:43-49.
379. Warren, G.S. (1992): Cell culture and recombinant DNA technology
in plant pathology. In: Plant Biotechnology. Fowler, M.W., Warren, G.S. and
Moo-Young, M. (Eds.), Pergamon Press, p. 283-291.
380. Wawrzynczak, D., Sowik, I., Michalczuk, L. (1990): Shoot regeneration from in
vitro leaf explants of five strawberry genotypes (Fragaria × ananassa Duch.).
Journal of Fruit and Ornamental Plant Resources, 2:63–71.
381. Welzen, P.C. (1998): Phylogenetic versus Linnaean taxonomy,
the continuing story. Taxon, 47:413-423.
382. Williams, E.G., Maheswaran, G. (1986): Somatic embryogenesis: Factors
influencing coordinated behaviour of cells as an embryogenic group.
Annales of Botany, 57:443-462.
383. Williams, J.G.K, Kubelik, A.R., Livark, K., Rafalski, A., Tingey, S.V. (1990):
DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic
markers. Nucleic Acids Research, 18:6531-6535.
384. William, M.E., Hepburn, A.G., Widholm, J.M. (1991): Somaclonal variation in a
maize inbred line is not associated with changes in the number or location of
Ac-homologous sequences. Theoretical and Applied Genetics, 81:272-276.
385. Wolf, Th. (1908): Monographie der Gattung Potentilla. Bibliotheca Botanica,
71:7-714.
386. Yamakawa, O., Noguchi, Y. (1994): Effect of storage conditions and seed
production time on seed germination in strawberry. Bulletin of the National
Research Institute of Vegetables, Ornamental Plants and Tea, Ser. A:
Vegetables, Ornamental Plants, 9:41-49.
387. Yang, C.S., Kozai, T., Jcong, B.R. (1995): Ionic composition and strength of
culture medium affect photoautotrophic growth, transpiration and net
photosynthetic rates of strawberry plantlets in vitro. Acta Horticulturae,
393:727-734.

145
388. Yonghua, Q., Shanglong, Z., Asghar, S., Lingxiao, Z., Qiaoping, Q., Kunsong,
C., Xu Changjie, X. (2005): Regeneration mechanism of ‘Toyonoka’
strawberry under different color plastic films. Plant Science, 168:1425-1431.
389. Yoshino, A., Yamamoto, F., Jitsukawa, S., Yuasa, M. (1985): Characteristics
of a ‘Hokowase’ strawberry variant derived from anther culture callus. Bulletin
of Chiba-Ken Foundation, Japan, 7:1-7.
390. Yu-Hua, Y., Han-Ping, D., Jia-Jun, L. (2005): Study on red-flowered
strawberry (Fragaria × Potentilla) and its breeding. Chinese Electronical
Publishing Service, 36(5):612-614.
391. Zamir, D. (2001): Improving plant breeding with exotic genetic libraries. Nature
Reviews Genetics, 2:983-989.
392. Zebrowska, J.I., Czernas, J., Gawronski, J., Hortynski, J.A. (2003): Suitability
of strawberry (Fragaria × ananassa Duch.) microplants to the field cultivation.
Food, Agriculture and Environment, 1:190-193.
393. Zhang, X., Himelrick, D.G., Woods, M.L., Ebel, R.C. (2005): Effect
of temperature, photoperiod and pretreatment growing condition on floral
induction in springbearing strawberry. Small Fruits Review, 1(2):113-123.
394. Zhao, Y., Liu, Q.Z., Davis, R.E. (2004): Transgene expression
in strawberry driven by a heterologous phloem-specific promoter. Plant Cell
Reports, 23:224-230.
395. Zhou, J., Ma, H., Guo, F., Luo, X. (1994): Effect of thidiazuron on somatic
embryogenesis of Cayratia japonica. Plant Cell, Tissue and Organ Culture,
36:73–79.
396. Zhukova, P. G., Petrovsky, V. V. (1980): Chromosome numbers and
taxonomy of some species of the Anyui mountains. Botanicheskii Zhurnal
SSSR, 65:651–659 (in Russian).
397. http://www.abz-strawberry.nl/product.php?product_id=35&language=en
(accesat 12 aprilie 2010).
398. http://www.freepatentsonline.com/PP07598.html (accesat 4 mai 2010).
399. http://www.freepatentsonline.com/PP08801.html (accesat 4 mai 2010).
400. http://www.itis.gov/servlet/SingleRpt/SingleRpt (accesat 8 iunie 2010).

146