LP14.Bacteriologie.Virusologie.

Parazitologie

Identificarea Enterobacteriaceaelor.
Hemocultura în diagnosticul infecţiei.
Diagnosticul de laborator al febrelor enterice

I. Identificarea Enterobacteriaceaelor
Ia.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli

Genul Escherichia cuprinde în bună parte germeni comensali. Specia reprezentantivă este
Escherichia coli. Deşi, majoritatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiţionat
patogene, există şi tulpini patogene (patotipuri: E. coli enteroagregativ, E. coli
enterohemoragic, E. coli enteroinvaziv, E. coli enteropatogen, E. coli enterotoxigen, E. coli
aderent difuz). Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.

Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă

Recoltarea şi transportul se efectuează cu respectarea regulilor impuse pentru aceste operaţii.

Se recoltază materii fecale, lichid de vărsătură etc.
Examinarea macroscopică este urmată de examen de laborator. În cazul infecţiei produsă de
E. coli enterohemoragic (EHEC), materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de
mucoasă epitelială. De obicei se face frotiu. Examinarea se face între lamă şi lamelă şi se pot
observa hematii şi PMN.
Cultura. Cultivată pe MacConkey cu D-sorbitol, tulpina EHEC nu fermentează sorbitolul sau
îl fermentează tardiv. Coloniile suspecte, sunt de tip „S”, 1-3 mm, necolorate (coloniile
sorbitol pozitive au o culoare roz).
Identificarea se face pe baza:
- caracterelor morfotinctoriale: bacili gram-negativi;
- caracterelor de cultură: colonii de tip „S”, cu caracterele menţionate mai sus;
- caracterelor biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), lactoză-pozitivi,
nu fermentează (sau fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt
urează-pozitivi, mobili (există şi tulpini imobile) etc.;
- caracterelor antigenice: prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri
monovalente anti O157 şi anti H7).
Antibiograma este recomandată pentru supravegherea apariţiei fenomenului de rezistenţă la
antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.

Ib.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Klebsiella

Bacteriile din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradează glucoza
cu producere de gaz şi fermentează lactoza. Specia tip este Klebsiella pneumoniae (bacili
Gram negativi, capsulaţi). Este un microb condiţionat patogen. Poate produce infecţii ale
tractului respirator superior, infecţii urinare etc., inclusiv infecţii nosocomiale.
Pentru diagnostic, se ia ca exemplu cazul de pneumoniei produse de Klebsiella pneumoniae.
Diagnosticul integral include elemente clinice, paraclinice şi de laborator; diagnosticul
bacteriologic permite stabilirea etiologiei şi tratamentului corespunzător.
Recoltarea şi transportul preparatului patologic se face cu respectarea regulilor cunoscute.
Se recoltează spută.
Examenul macroscopic poate evidenţia aspectul mucoid, de culoare roşu închis, "în jeleu de
coacăze" al sputei.
Examenul microscopic al p.p. permite observarea prezenţei macrofagelor alveolare,

1
LP14.Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

celulelor inflamatorii (PMN) şi a bacililor Gram negativi, de dimensiuni relativ mari, cu

capsulă (halou, vizibil).
Cultura. P.p. se cultivă pe medii de cultură obişnuite (18-24 ore, 35-37°C) şi se examinează
coloniile izolate, pentru identificare. Se recomandă utilizarea mediilor slab selective
(MacConkey), deoarece Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este
parţial inhibată pe cele moderat selective. K pneumoniae formează colonii lactoză-pozitive,
mari, de tip „M”, cu aspect de "curgere" pe suprafaţa mediului de cultură (tendinţă de
confluare).
Identificarea microorganismului se face pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, dimensiuni mari, capsulaţi, dispuşi în lanţuri
scurte, perechi sau izolaţi;
• de cultură: colonii lactozo-pozitive, de tip „M”, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4
mm la 48 ore), bombate, cremoase, în "picătură de miere", care dau aspectul de "curgere" pe
suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare;
• biochimice: glucoza pozitiv (cu producere de gaz), lactoză pozitiv, nu produce H 2S,
imobil, urează pozitiv, indol negativ, se dezvoltă folosind citratul ca unică sursă de C;
• antigenice: se utilizează seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de
Klebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (în laboratoare de referinţă);
• testarea sensibilităţii la bacteriofagi.
Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice.

Ic.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Proteus

Genul Proteus face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde trei specii cu importanţă
medicală: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris şi Proteus penneri. Germenii din genul
Proteus sunt ubicuitar răspândiţi în natură, putându-se întâlni în sol, ape reziduale, ape de
suprafaţă, în materiile organice în putrefacţie, în intestinul omului, în alimente şi în produse
patologice. Sunt bacili Gram-negativi, aerobi sau facultativ anaerobi, nu fermentează lactoza,
produc urează, sunt ciliaţi peritrichi sau lofotrichi şi foarte mobili. Sunt polimorfi: au forme
variate, de la bastonaşe scurte până la forme lungi, filamentoase. Nu prezintă capsulă şi nici
spori. Sunt germeni condiţionat patogeni.
Pot produce infecţii ale tractului urinar (ITU), dar chiar şi alte infecţii (tegumentare, genitale,
infecţii nosocomiale etc.).

Recoltarea şi transportul p.p. se realizează cu respectarea regulilor impuse. Produsul

patologic este urina, care poate fi tulbure, purulentă. Transportul trebuie realizat în maxim 30
minute, iar dacă nu e posibil, p.p. trebuie transportat "la rece" (+ 4°C).
Examenul microscopic al produsului patologic include realizarea preparatului proaspăt între
lamă şi lamelă, din sedimentul urinar. Acest tip de examinare este foarte important, uşor de
realizat, ieftin şi permite observarea unor elemente utile, care orientează diagnosticul şi
stabilirea numărului de leucocite/câmp. De asemenea, mobilitatea poate fi evaluată.
Cultura. Bacteriile din genul Proteus se cultivă pe medii de cultură simple, nu sunt
pretenţioase nutritiv. Pe geloza simplă şi pe geloză-sânge cresc avand o caracteristica unică
în familia Enterobacteriaceae de a invada mediul, fenomen numit ,,fenomen de căţărare’’,
,,fenomen de invazie’’. Din locul inocularii, valuri succesive de cultură migrează concentric
până la marginea mediului sau până la întâlnirea cu valul migrator al altei colonii. Pentru ca
rezultatul să fie pozitiv, numărul de bacterii/ml de urină trebuie să fie >100.000.
Identificarea microorganismului se va realiza pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale: bacili gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme
filamentoase de peste 30 μm);

2
LP14.Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

• de cultură:
- fenomenul de invazie (dacă însămânţăm o tulpină la periferia unei plăci Petri cu
mediu simplu, cultura se "dezvoltă în valuri concentrice", pe toată suprafaţa mediului). Pe
anumite medii selective (cu săruri biliare), invazia este inhibată şi se obţin colonii izolate, de
tip „S”, lactoză negative;
- fenomenul "liniei de demarcaţie" (dacă pe o placă cu mediu solid cultivăm 2 tulpini
diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadând până în apropierea liniei de
întâlnire, unde se va crea o "linie de demarcaţie" între cele 2 tulpini);
- fenomenul de "căţărare";
• biochimice: sunt microorganisme lactozo-negative (alte caractere biochimice se pot
studia pe mediile multi test, TSI, MTU etc.), glucoză-pozitive (cu formare de acid şi gaze),
produc H2S, mobile, urează pozitive, fenilalanină pozitive, se pot dezvolta folosind citratul ca
unică sursă de carbon. Specia Proteus vulgaris este singura care produce indol;
• antigenice. Speciile de Proteus prezintă:- antigen somatic O, cu specificitate de grup
şi antigen flagelar H, cu specificitate de tip.
Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice. Sunt, în
general, destul de rezistente la dezinfectanţi şi antiseptice obişnuite. Sunt destul de răspîndite
în mediul spitalicesc şi au rezstenţă destul de mare la antibiotice.

Id.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Shigella

Genul Shigella face parte din familia Enterobacteriaceae şi reuneşte 4 subgrupe: A. Shigella
dysenteriae (13 serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) şi D. S.
sonnei (1 serotip cu 2 faze, R şi S). Sunt bacterii strict adaptate omului, întotdeauna patogene.
Sunt întâlnite în intestinul şi materiile fecale ale bolnavului, convalescentului şi purtătorului
aparent sănătos. Sunt bacili Gram-negativi, neciliaţi, necapsulaţi, nesporulaţi. Sunt bacili
Gram-negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi sau facultativ anaerobi, glucoză
pozitivi (fără producere de gaz), oxidază negativi, lactoză negativi.
Omul reprezintă rezervorul de Shigella. Bacteriile sunt eliminate în mediul extern prin
materiile fecale, contaminând apa, alimentele, solul. Transmiterea este directă fecal-orală.
Poarta de intrare este tractul digestiv, prin consum de apa şi alimente contaminate. Speciile
mai frecvent întâlnite sunt S. dysenteriae şi S. flexneri, fiind şi cele mai virulente. Controlul
infecţiei se face prin igiena personală şi comunitară.
Produc infecţii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate să apară după ingestia a numai
10-100 bacterii. Shigella spp. pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios. Shigelele
produc exotoxine care acţionează ca enterotoxine (toxina Shiga în cazul infecţiei cu Shigella
dysenteriae, cu efect neurotoxic, citotoxic, enterotoxic).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) şi trebuie stabilit rapid.
Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale) se efectuează cu respectarea regulilor
cunoscute.
Examenul macroscopic al materiilor fecale poate indica prezenţa unor cantităţi mici de
mucus, puroi, sânge. Transportul trebuie să fie realizat rapid (se recomandă însămânţarea la
patul bolnavului; altfel, trebuie să fie folosit un mediu de transport, Cary-Blair). Recoltarea se
poate face şi cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoid.
Examenul microscopic al p.p. este foarte important. El poate oferi un răspuns concret, rapid şi
util. Se examinează preparatul între lamă şi lamelă, iniţial cu obiectivul 40x. Dacă se
evidenţiează numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dacă se
remarcă un procent de peste 75% PMN, alături de hematii, acest aspect este sugestiv pentru
dizenteria bacteriană.

3
LP14.Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Cultura. Prima izolare se face pe medii slab sau moderat selective şi medii diferenţiale
(ADCL, Istrate-Meitert). Dacă apar colonii lactoză negative, coloniile transparente, lactozo-
negative sunt însămânţate pe medii (TSI, MIU, MILF, Simmons-citrat, uree), pentru
identificare biochimică prezumptivă.
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
 morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, unele tulpini posedă capsulă;
 de cultură: produc colonii de tip „S”, lactoză negative, 1-2 mm, transparente;
 biochimice: sunt glucoză pozitivi, fără producere de gaz, lactoză negativi, nu
produc H2S, imobili, urează negativi, indol negativi (excepţie S. flexneri), oxidază negatvi,
citrat negativi, lizină negativi;
 antigenice: se utilizează seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri
imune specifice de tip (reacţii de aglutinare pe lamă, conform schemelor de lucru).
Antigenele mai importante sunt: antigenul somatic O, care stă la baza împărţirii în 4 grupe
antigenice; Grupul A: S. Dysenteria; Grupul B: S. Flexneri; Grupul C: S. Boydii; Grupul D:
S. sonnei şi antigenul K;
 testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizată în scop
epidemiologic.
Antibiograma este recomandată. Se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată atât
în special în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente, cât şi pentru stabilirea
tratamentului antimicrobian corespunzător.

Ie.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Salmonella

Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde o singura specie,
Salmonella enterica. Aceasta specie cuprinde peste 2300 serotipuri diferenţiate pe baza
antigenelor somatice O şi flagelare H. Principalul habitat al salmonelelor este tractul
intestinal al omului şi animalelor. Aceste doua surse vor determina poluarea solului, apelor
reziduale, apelor de suprafaţă în care pot supravieţui de la câteva luni la câţiva ani, în condiţii
de temperatură şi pH favorabile.
Genul Salmonella include bacili gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, mobili cu cili
peritrichi, necapsulaţi, nesporulaţi, nu fermentează lactoza, produc H2S, utilizează citratul ca
unică sursă de carbon. Pot produce salmoneloze minore (TIA) şi salmoneloze majore (febra
tifoidă). În cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. În
cazul afecţiunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic şi serologic.

Diagnosticul de laborator în infecţiile cu localizare digestivă

Recoltarea şi transportul p.p. se efectuează cu respectarea regulilor cunoscute. Preparatul
patologic este reprezentat de materii fecale.
Examenul microscopic al p.p. se face între lamă şi lamelă şi se remarcă prezenţa
granulocitelor.
Cultura. Salmonella spp. se cultivă pe următoarele medii de cultură: un mediu lichid de
îmbogăţire (bulion selenit) şi două medii selectivo-diferenţiale (MacConkey şi ADCL). După
18-24 ore la 35-37°C, pe mediile solide pot apărea colonii bacteriene suspecte (lactozo-
negative) din care se obţine cultura pură. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit se repică pe
medii solide. Pe mediile selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-negative de tip „S”.
Producerea de H2S, evidenţiată prin apariţia unei pete de culoare neagră în centrul coloniilor,
face ca acestea să se numească ,, în ochi de pisică’’. Pe mediul Wilson-Blair formează colonii
opace, rugoase, cu margini neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru
Salmonella sunt mediile cu selenit, azid de sodiu şi bulionMuller-Kauffmann.
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
4
LP14.Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

 morfotinctoriale: sunt bacili gram-negativi;

 de cultură: pe medii selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-negative de tip
„S”, necolorate (pe mediu MacConkey). Producerea de H2S, evidenţiată prin aparţia unei pete
de culoare neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească ,, în ochi de pisică’’
(pe mediu ADCL). Pe mediul Wilson-Blair formează colonii opace, rugoase, cu margini
neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru Salmonella sunt mediile
selenit azid de sodiu şi bulionMuller-Kauffmann;
 biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt germeni lactoză-
negativi, produc H2S, indol negativi, lizină pozitivi şi utilizează citratul ca unică sursă de
carbon;
 antigenice: reacţii de aglutinare pe lamă prin utilizarea serurilor imune cu Ac anti-O şi
ulterior Ac anti-H, cu respectarea protocolului de lucru. Salmonella prezintă trei tipuri
importante de antigene: antigenul somatic O, este rezistent la căldură şi alcool, prezintă
specificitate de grup; antigenele de suprafaţă (înveliş, antigenul Vi este un antigen specific de
suprafaţă întlânit doar la trei serovaruri Salmonella: typhy, paratyphy C; antigenele flagelare
H, sunt proteine labile termic situate la nivelul cililor. Fenomenul de variaţie de fază se
întâlneşte la multe tipuri de salmonele, astfel putând să-şi schimbe tipul de specificitate al
flagelilor cu un altul.
Patogenitatea salmonelelor este datorată factorilor de virulenţă, adezinele şi toxinele
enterotoxinele termo-stabilă (ST), termo-labilă (LT), verotoxina (toxina Shiga-like),
citotoxina implicată în invazia şi distrucţia celulară, antigenul Vi cu rol de adezină, fimbrii.
 sensibilitate la bacteriofagi.
Antibiograma este recomandată în cazul pacienţilor foarte în vârstă sau în cazul copiilor
foarte mici, prematuri, cu alte boli adăugate şi pentru supravegherea apariţiei fenomenului de
rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice. Sunt sensibile la cloramfenicol, streptomiocină,
tetraciclină, ampicilină, dar au apărut şi tulpini plurirezistente.

II. Hemocultura în diagnosticul infecţiei

Hemocultura este izolarea şi cultivarea germenilor din sânge. De obicei se face din sânge
venos, mai rar arterial, excepţional cu sânge şi pulpă din măduva osoasă. Indicaţiile unei
hemoculturi: septicemie (prezenţa persistentă a germenilor în sânge, existenţa unui focar
septic unde germenii se multiplică şi de unde ajung periodic în sânge, manifestări generale
grave: febră, frison, fenomene nervoase, erupţii cutanate), la nou-născuţi, persoane
imunocompromise, în stări febrile la bolnavii cu valvulopatii şi intervenţii pe aparatul
cardiovascular, la bolnavi ce prezintă un sindrom febril prelungit, în bacteriemie (prezenţa
trecătoare de germeni în sânge fără expresie clinică sau cel mult asociată de febră şi frison),
în stări febrile din infecţii sistemice specifice (febra tifoidă, meningococcemia sistemică
acută).
Recoltare în recipiente speciale pentru hemocultură. Momentul recoltării de sânge trebuie
ales cât mai devreme în cursul bolii şi în momentul când sângele poate fi mai bogat infectat
(ascensiune termică, frison). În general se recomandă ca recolta în stările febrile să se facă
imediat înaintea frisonului.
Se recomandă recoltarea sângelui din 2 locuri diferite. Volum recoltat: 10 ml (1-3 ml la
copii). Recoltarea pentru hemocultură, presupune lipsa tratamentului cu antibiotice, altfel
există riscul ca germenii să nu crească.
Tehnica de recoltare: se procedează la antiseptizarea tegumentului cu iod (betadine), apoi cu
alcool 70%. Se aşteaptă uscarea zonei antiseptizate dacă acest interval nu poate fi respectat,
probele trebuie păstrate la 4ºC imediat după recoltare. Recoltarea sângelui se face cu ac şi

5
LP14.Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

seringă şi se transferă în flacoane. Se inoculează fiecare flacon fără a depăşi semnul de pe

etichetă.
Transport: se folosesc flacoane pentru sistemul automat (BactAlert). Se impune
decontaminarea dopurilor la flacoanele de hemocultură cu alcool 70%. Se inoculează fiecare
flacon fără a depăşi semnul de pe etichetă. Transportul trebuie făcut imediat. Nu se
refrigerează.
În laborator se introduc în analizorul BactAlert care semnalează rapid prezenţa bacteriilor în
hemoculturi prin detecţia producerii de CO2 de către acestea.

III. Diagnosticul de laborator al febrelor enterice

Diagnosticul de laborator în febrele enterale (febra tifoidă)
Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea şi identificarea bacteriei S. typhi din p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele prezentate anterior.
În prima săptămână de boală, p.p. este reprezentat de sânge; ulterior pot fi recoltate materii
fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. Dacă p.p. este reprezentat de materii
fecale, se respectă procedura indicată mai sus (există şi unele particularităţi). Coloniile de S.
typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL. S. typhi nu produce gaz din
glucoză, H2S fiind produs în cantitate mică. Nu foloseşte citratul ca unică sursă de carbon.
Pentru identificarea AgO este necesară o inactivare prealabilă (termică). Prezenţa AgVi poate
crea probleme în identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utilă. Testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice este indicată în toate infecţiile produse de S. typhi.
Diagnosticul serologic se realizează cu respectarea principiile generale. Tehnica actuală
poartă numele de analiză serică cantitativă (aglutinare în tuburi), în cadrul căreia se utilizează
serii de tuburi (câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Pentru a evidenţia Ac anti-O
(TO - S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphiB) şi anti-H (d - S. typhi, a-S.
paratyphi A, b -S. paratyphi B) se folosesc 6 serii de tuburi. Se pregătesc diluţiile, se
incubează pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei,
iar pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei şi apoi se
procedează la citirea reacţia. Un titru de 1/250 în cazul Ac anti-O şi unul de 1/2.500 în cazul
Ac anti-H sunt sugestive. Creşterea de 4 ori a titrului, la 2 determinări succesive confirmă
diagnosticul.
În cazul convalescenţilor şi purtătorilor este recomandată reacţia de aglutinare în tuburi
pentru identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi (titru mai mare de 1/40).