LP8. Bacteriologie.Virusologie.

Parazitologie

Identificarea stafilococilor. Examenul bacteriologic al puroiului.

I.Identificarea stafilococilor

 Familia Staphylococcaceae
 Genul Staphylococcus

Se disting 2 grupuri (varietăţi):

Stafilococi coagulazo-pozitivi (SCP), foarte virulenţi (S. aureus, S. intermedius).
Stafilococi coagulazo-negativi (SCN), potenţial-patogeni (aproximativ 30 specii: S. epidermidis,
S. saprophyticus, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis). Habitat: 20-70% din populaţie sunt
purtători: S. aureus - cavitatea nazală, intestine; S. epidermidis – tegument; S. saprophyticus -
mucoasa uro-genitală, tegument.

Staphylococcus aureus
a.Caractere morfo-tinctoriale: coci Gram+, în frotiu se aranjează în grămezi neregulate
(ciorchine), în perechi sau izolat. Sunt imobili, nesporogeni, necapsulaţi (uneori microcapsule).

Fig.1 Coloraţia Gram: coci Gram pozitivi în perechi, tetrade şi grămezi/ciorchine (MOx100)

b.Caractere de cultură: facultativ anaerobi, nepretenţioşi la cultivare, cresc pe medii uzuale, pH-
7,0–7,5. Cultura apare peste 24 h de incubare la 37°C.
Medii selective cu caracter diferenţial-diagnostic: geloză salină (3 % NaCl) cu gălbenuş de ou
(GGO); mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol); geloză-sânge.
1
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Colonii S, 2-3 mm, opace, bombate, pigmentate (galben-auriu, galben-citrin, alb), pe geloză-
sânge cauzează hemoliză. Pe GGO coloniile sunt înconjurate cu un halou opac (acţiunea
lecitinazei). Pe mediul Chapman coloniile sunt înconjurate de un halou galben (fermentarea
manitolului).

Fig.2.Colonii de Staphylococcus aureus pe mediul geloză-sânge. Coloniile sunt înconjurate de o zonă clară de
hemoliză

c.Caractere biochimice: catalazo-pozitivi, fermentează glucoza şi manitolul.

Testul catalazei: se urmăreşte producerea de catalază de către bacterii.

Testul se efectueaza prin descarcarea unei colonii dintr-o cultura de stafilococi intr-o picatura de
peroxid de hidrogen). Interpretare:

-test pozitiv: eliberarea de oxigen (efervescenţă prin degajarea unor bule de gaz), în prezenţa apei
oxigenate (transformă peroxidul de hidrogen în oxigen şi apă).

-test negativ: lipsa efervescenţei.

Fig.3. Testul catalazei

2
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Testul fermentării manitolului

Fig.4. Testul fermentării manitolului pe mediul Chapman: negativ (roşu) la stânga şi pozitiv (viraj în galben) la
dreapta

1.Factori de patogenitate
Factori structurali
Peptidoglicanul induce secreţia citokinelor de către celulele limfocitare, responsabile de starea
de şoc.
Acizii lipoteichoici induc o stare de hipersensibilitate tardivă.
Proteina A asigură fixarea Fc al IgG, împiedică opsonizarea şi fagocitoza.
Microcapsula are rol antifagocitar.
Adezine, proteine care asigură fixarea S. aureus pe diverse molecule plasmatice ale gazdei,
ulterior adeziunea la ţesuturi:
-proteine fixatoare de fibronectină şi laminină. Fibronectina este prezentă pe suprafeţe epiteliale
şi endoteliale, precum şi în cheaguri sanguine.
-“Clumping factor”, proteina fixatoare de fibrinogen. Asigură aderarea la cheaguri şi ţesuturi
lezate, protejează stafilococii de fagocitoză.
-proteina fixatoare de colagen. Tulpinile ce posedă astfel de adezine cauzează osteomielite şi
artrite septice.
Toxine
-α-toxina (alfa-hemolizina): deteriorează membranele celulelor gazdei (trombocite, monocite,
hematii) prin integrare şi formarea porilor;
-ß-toxina (sfingomielinaza): prezentă la tulpinile izolate de la bovine cu mastită;

3
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

-γ şi δ-toxine: efect leuco - şi hemolitic;

-leucocidina, efect litic faţă de leucocite şi macrofage, factor important în procese
dermonecrotice;
-exfoliatine (epidermolizine) A şi B: manifestă tropism cutanat.
Mecanism: se fixează de unele proteine cutanate (profilagrină şi filagrină), inducând
desprinderea intra-epidermică dintre stratum granulosum şi stratum spinosum, cu formarea
leziunilor buloase (pemphigus neonatorum, impetigo bulos, dermatită exfoliantă/sindromul pielii
opărite).
Coagulaze
Coagulaza liberă - proteină extracelulară care se leagă de protrombina gazdei cu formarea unui
complex. Astfel activată, trombina determină conversia fibrinogenului în fibrină şi coagularea
plasmei. Reprezintă cauza tromboflebitelor septice şi protejează cocii de fagocitoză.

Fig.5.Testul coagularii plasmei libere:rezultat pozitiv Fig.6.Testul coagularii plasmei libere: rezultat negativ

Coagulaza legată (Clumping factor) este un determinant superficial al S. aureus fixator de

fibrinogen. Provoacă fenomenul de aglutinare a stafilococilor în prezenţa fibrinogenului.

Fig.7. Testul coagulazei legate

Stafilokinaza (fibrinolizina) - activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi lizogeni).

Complexul stafilokinază-plasminogen manifestă activitate proteolitică, cauzând dizolvarea
trombilor (responsabilă de localizări septice secundare).
Enzime de patogenitate: hialuronidaza facilitează diseminarea bacteriilor; alte enzime: proteaze,
lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze. Rol în diseminarea infecţiei şi producerea
leziunilor.

4
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Se disting multiple serotipuri de S. aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit clasificarea în
lizotipuri (fago-variante).
2.Epidemiologia infecţiilor stafilococice
Sursa de infecţie: omul bolnav sau purtători sănătoşi de germeni. Rareori - bovinele bolnave de
mastită. Contact direct sau diseminare manuportată. Contact indirect (alimente, praf,
îmbrăcăminte).
Factori favorizanţi: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plăgi,
3.Formele clinice ale infecţiilor cu S. aureus
-infecţii cutanate şi subcutanate: foliculite, furuncule, cărbuncule, abcese, hidrosadenite, mastită,
panariţiu, infecţie de plagă (frecvent de origine nosocomială);
-exfoliatina determină epidermoliza buloasă (dermatita exfoliativă, sindromul pielii opărite,
sindromul Lyel) la copii, pemphigus neonatorum la nou-născuţi (boala Ritter) şi impetigo bulos
la mature;
-infecţii ale mucoaselor: mastoidite, sinuzite, otite, angine;
-infecţii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonită, meningită;
-infecţii osoase: osteomielită, spondilodiscită, infecţie de proteză;
-infecţii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite.
S. aureus poate coloniza corpuri străine (catetere, proteze, etc). După implantare ele sunt
acoperite cu proteine matriciale ale organismului (fibronectină, fibrinogen, laminină).
Stafilococii prin adezinele sale se leagă specific de aceste proteine matriciale, se multiplică şi
secretă exopolizaharide, constituind un biofilm. El protejează bacteriile de AB, anticorpi, celule
imunitare şi constituie un focar de diseminare a infecţiei.
Septicemii şi endocardite. Cauzate şi întreţinute de un focar infecţios primar (infecţie cutanată,
pneumonie) complicat de tromboflebită. În mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere
intravasculare, proteze valvulare cardiace, articulare, stimulatoare cardiace).
Risc major de metastaze septice (endocard, oase, articulaţii).
Sindromul şocului toxic stafilococic: febră, hipotensiune arterială, erupţie scarlatiniformă în
special pe palme şi plante, urmată de descuamare, stare de şoc, leziuni viscerale (cerebrale,
renale, hepatice, musculare). Mortalitate 3-5%.
Descris în 1978 în SUA la femei care utilizau tampoane periodice şi sufereau de vaginită cu S.
aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni stafilococice.
Intoxicaţii alimentare (doza toxică - 1μg la 100 g aliment). Incubaţie scurtă (1-6 ore). Vome,
diaree, deshidratare, absenţa febrei

5
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Enterita fulminantă - gravitate extremă şi mortalitate înaltă. Consecinţa unei antibioterapii,

urmare a multiplicării tulpinii de stafilococ producător de enterotoxină în intestin.
4.Infecţii cauzate de SCN
S. epidermidis produce un polizaharid de adeziune (glicocalix), care-i permite fixarea pe
implante din polimeri sintetici, metalici, din ceramică (formarea unui biofilm).
S. epidermidis determină infecţii asociate cu un corp străin (proteze, catetere, sonde de intubare,
stimulatori cardiaci) frecvent de origine nosocomială (endocardite, endoftalmii, peritonite la
pacienţi cu dializă peritoneală, bacteriemii, infecţie de plagă).
S. saprophyticus este responsabil de 10-20% din infecţiile acute ale tractului urinar, în special
cistită la femei tinere. La bărbaţi rareori - uretrită.
S. lugdunensis - infecţii de plagă, endocardite.
Imunitatea antistafilococică este mixtă: celulară şi umorală.
5.Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Staphylococcus
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, etapele fiind următoarele:
a.Recoltarea şi transportul produsului patologic:
-se face cât mai repede, la debutul bolii, înainte ca pacientului să primească
antibiotice/chimioterapice, corect, asepsie;
-se recoltează: secreţii purulente (în abcese, celulite, infecţii ale plăgilor şi arsurilor), lichide (prin
puncţie sinusală, articulară, pleurală); exsudat nazal sau exsudat faringian, sânge, LCR, spută,
urină, secreţie vaginală, lichid de vărsătură, materii fecale.

b.Diagnostic direct:
Examinarea microscopică a p.p. (Gram, RIF) cu realizarea a minim 2 frotiuri pe care le colorăm
cu A.M. şi Gram: se examinează la microscop şi se notează prezenţa celulelor (unele fiind
modificate), prezenţa celulelor inflamatorii (leucocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitivi, cu
diametrul de 0,5-1,5 μ, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate, intra
sau extraleucocitar.
c.Cultivarea pe medii de cultură a p.p. se face pentru a obţine colonii izolate (cultură pură),
necesară în etapele următoare. Se folosesc medii de cultură obişnuite. Coloniile sunt de tip S, de
1-3 mm, pigmentate (auriu). Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolerând o
concentraţie de NaCl (mediul Chapman, pentru p.p. contaminate).
d.Identificarea microorganismului se va realiza pe baza:
Caracterelor morfo-tinctoriale: coci gram-pozitivi, 0,5-1,5 μ, dispuşi în lanţuri scurte, perechi,
izolaţi sau în grămezi neregulate.
Caracterelor de cultură: colonii de tip Sv pigmentate auriu.
Caracterelor biochimice: fermentează zaharuri cu producere de acid (S. aureus este manito-
pozitiv); sunt catalazo-pozitivi.

6
LP8. Bacteriologie.Virusologie.Parazitologie

Caracterelor antigenice.
Caracterelor de patogenitate: se recomandă îndeosebi efectuarea testul coagulazei.
Sensibilităţii la bacteriofagi (în centrele de referinţă).
Altor caractere (în centre de referinţă: studiul acizilor graşi celulari, hibridarea moleculară,
ribotipie, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea prin biologie moleculară
a rezistenţei la antibiotice etc.).
OBS!Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
e.Diagnostic indirect (serologic)
Se examinează seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru>2
UI/ml) - în caz de infecţii profunde sau cronice sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) - ȋn caz de
endocardite sau focare inaccesibile.
II. Examenul bacteriologic al puroiului
Puroiul este un exsudat fibrinos, uneori sangvinolent, care conţine leucocite (predominant
polimorfonucleare neutrofile ȋn inflamaţile acute sau mononucleare ȋn inflamaţiile cronice
specifice), resturi celulare şi microorganismele determinante.
1.Examenul macroscopic este posibil doar pentru probele de puroi prelevate ȋn seringă sau
recipiente. Se urmăreşte mirosul, culoarea, consistenţa, omogenitatea sau prezenţa granulelor.
Culoarea puroiului variază de la galben la roşu brun. Aspectul roşu se datorează sângelui sau
hemoglobinei. Puroiul din plăgile şi arsurile infectate cu bacil pioceanic este albastru-verzui.
Puroiul verzui sugerează o infecţie pneumococică.
Consistenţa: puroiul cremos, bine legat, este sugestiv pentru infecţii stafilococice; puroiul fluid
este sugestiv pentru infecţii streptococice; puroiul cazeos este sugestiv pentru infecţia
tuberculoasă. Puroiul poate ajunge ȋn laborator coagulat ȋn infecţiile stafilococice sau ȋn cazul
probelor hemoragice.
2.Examenul microscopic
Pentru probele de puroi uzuale, imediat după primirea probei, se efectuează cu ansa un frotiu
subţire şi uniform. Se colorează Gram şi se examinează la microscopul optic. La cererea
clinicianului sau ȋn funcţie de aspectul puroiului, se efectuează şi un frotiu colorat Ziehl-Neelsen,
sau un preparat umed ȋntre lamă şi lamelă montat ȋn soluţie salină izotonă.
3.Cultivarea probelor
Mediile de cultură ȋnsămânţate, condiţiile şi durata de incubare sunt ȋn funcţie de conjunctura
clinico-epidemiologică, rezultatele microscopiei, localizarea şi caracterele leziunilor supurative
examinate.