FACULTATEA DE MEDICINĂ

Biologie Celulară și Moleculară – Curs_10

Disciplină: Biologie Celulară și Moleculară

An de studiu: 1
Cadru didactic: Ancuța Zazgyva, MD, PhD
Data: 10.01.2024
„Acolo unde apare o celulă, trebuie să existe o celulă anterioară,așa
cum animalele pot apărea numai din animale și plantele din plante.”

Rudolf Virchow
(1858)
§ Singura modalitate de a forma o celulă nouă este de a duplica o celulă deja
existentă

§ Continuitatea vieții se bazează pe diviziunea celulelor

 Rolurile cheie ale diviziunii celulare

§ în organismele unicelulare – diviziunea unei celule reproduce întregul organism,

crescând astfel populația
§ în organismele multicelulare
• pe parcusul dezvoltării – permite organismelor multicelulare să se dezvolte
pornind de la o singură celulă (ovulul fertilizat)
• în organimele complet dezvoltate – permite reînnoirea, repararea sau înlocuirea
celulelor, după necesități
- pentru a menține homeostazia celulară normală
- pentru a repara și regenera celulele/țesuturile deteriorate (de ex. vindecarea
plăgilor)
 Majoritatea diviziunilor celulare duc la formarea de celule fiice genetic identice
pot continua să se
Sarcina fundamentală a unei celule ce se divide: dividă trecând prin
Ø trecerea informației genetice către noua generație cicluri celulare
de celule suplimentare

Pentru a produce două celule fiice genetic identice

§ ADN-ul fiecărui cromozom trebuie mai întâi
replicat cu fidelitate (1)
§ cromozomii replicați trebuie apoi distribuiți cu
acuratețe în cele două celule fiice (2)
§ majoritatea celulelor își dublează și celelalte
organite și macromolecule (în caz contrar, celulele
fiice s-ar micșora cu fiecare diviziune)

Diviziunea celulară este o parte integrală a ciclului celular

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
 Ciclul celular
viața unei celule din momentul în care este generată prin diviziune unei celule
progenitoare până când celula se divide ea însăși = ciclul celular

Faza mitotică (M) alternează cu interfaza în ciclul celular

§ interfaza are trei sub-faze:

• faza G1 (“first gap”)
• faza S (“synthesis”)
• faza G2 (“second gap”)

§ faza mitotică (M) include

• mitoza (meioza) și
• citokineza (diviziunea citoplasmei)
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

Cele patru faze G1, S, G2 și M

alcătuiesc „ceasul” clasic al ciclului
celular
 Numărul de cicluri celulare

G1- S- G2- M
§ fazele ciclului celular (G1- M)) se repetă pe durata vieții celulei

interphase interphase interphase

§ numărul de cicluri celulare (capacitatea de proliferare) – variază la diferite tipuri de celule

(pe baza naturii acestora)
§ celulele normale sunt capabile doar de un număr finit de cicluri celulare (diviziuni celulare)
chiar și în condiții optime de cultură, după care
Ø intră într-o stare de repaus permanent al creșterii (senescență replicativă) -
- scurtarea telomerilor (la capetele cromozomilor umani)
 Durata ciclului celular

§ variază mult la diferite tipuri de celule

§ depinde de condițiile externe (de ex. nutrienți, oxigen)

Molecular Biology of the Cell, fourth Edition

 Durata fazelor ciclului celular

§ Într-o celulă umană tipică ce se multiplică în cultură celulară – durata totală a ciclului
celular ~ 24 de ore

Faza M – aprox. 1 oră

Faza G1 – de regulă cea mai

lungă și cea mai variabilă ca
lungime dintre cele patru faze

https://www.brainkart.com/article/Cell-Cycle_33013/
 Interfaza
Interfaza (fazele G1, S și G2) – reprezintă aproximativ 90% din ciclul celular
§ celulele continuă în general să-și transcrie genele, sintetizează proteine și cresc ca și masă
§ vizualizată la microscop, aceasta apare, în mod amăgitor, ca o fază lipsită de interes semnalele indică celulelor să
se dividă, să se oprească
Faza G1 (8-10 ore) pentru a-și repara ADN-ul, să
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition înceapă apoptoza sau să
celula crește și își îndeplinește funcțiile de bază intre în G0
se ia o decizie (punct de restricție)
• de a intra în faza S (de ex. factori mitogeni) sau
• de a opri progresia spre faza S și a intra într-o stare
de repaus (G0)
Faza S (6-8 ore)
replicarea ADN – celula produce o copie identică a fiecăruia
dintre cromozomii săi, sinteza de histone Fazele G (Gap) – celula își
duplicarea centriolilor în citoplasmă monitorizează starea internă și
mediul extern: se asigură că există
condiții corespunzătoare pentru a
G0 Faza G2 (4-6 ore) trece către următoarea fază
creșterea celulară continuă – sinteza de proteine și organite
mitocondriile se divid
cromozomii înainte și după faza S
se sintetizează tubulină și se formează microtubuli

G1 este o fază lungă – se ia o decizie importantă - la punctul de restricție de la finalul fazei G1, este
determinată soarta celulei:
• continuarea ciclului celular și diviziune sau
• intrarea în faza G0
Majoritatea celulelor dintr-un organism
adult îți petrec cel mai mult timp în faza G0
https://en.wikipedia.org/wiki/Cell_cycle
Faza G0
Faza G0 (G zero) – o stare specială de repaus (în sensul de lipsă a
diviziunii)
- celulele își îndeplinesc funcțiile lor specifice
Motive pentru a ieși din ciclul celular:
• lipsa nutrienților
• lipsa factorilor de creștere sau inhibiție datorită densității celulare
• program genetic (de ex. diferențiere)
Ieșire tranzitorie: celulele rămân în această stare G0 posibil până la
câțiva ani – de ex. celule gliale, hepatocite
Ø până când primesc semnalele corespunzătoare – factori de creștere
sau alte semnale extracelulare, de regulă induse prin leziune sau
turnover celular normal – pentru a re-intra în G1
Ieșire permanentă: celulele rămân în G0 până la moartea lor sau a
organismului (diferențiere terminală – de ex. neuroni maturi, celulele
musculare scheletice)
 Faza S: replicarea ADN

Introducere
§ materialul genetic al ADN trebuie replicat cu o acuratețe extraordinară de fiecare dată când o
celulă se divide – pentru a se asigura faptul că informația codificată în aceasta este transmisă
fără modificare la celulele fiice

§ există aproximativ 3 bilioane de perechi de baze de ADN în genomul uman, fiecare necesitând
copiere cu acuratețe la diviziunea oricăreia dintre cele cîteva trilioane de celule ale organismului

§ trebuie să aibă loc înainte ca celula să poată forma două celule fiice genetic identice

§ există foarte rar eșecuri ale procesului de replicare ADN, ducând la modificări permanente ale
ADN-ului = mutație poate distruge un organism dacă apare într-o poziție vitală a secvenței
ADN
 Celulele germinale și celulele somatice îndeplinesc funcții fundamental diferite
§ celulele dintr-un organism cu reproducere sexuată sunt de două tipuri:

• celule germinale – transmit informația genetică

de la părinte la urmaș
• celule somatice – formează corpul
organismului, sunt necesare pentru
supraviețuirea liniei de celule germinale

§ celule germinale – trebuie protejate de ratele înalte de mutații (stabilitatea celulelor germinale)
Ø pentru a menține specia
§ celule somatice – trebuie protejate de modificarea genetică (stabilitatea celulelor somatice)
Ø pentru a menține corespunzător structura organismului
Ø o acumulare de modificări în secvențele ADN ale celulelor somatice cancer

De reținut! – fidelitatea remarcabilă cu care sunt replicate și menținute

secvențele de ADN ale celulelor

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 Bazele replicării ADN (sinteza ADN)
Mecanismele de bază ale replicării ADN sunt similare la toate organismele

Replicarea ADN = copierea secvenței de nucleotide a unei catene ADN într-o secvență ADN complementară

§ cele două catene ale ADN din dublul helix se

despiralizează
§ fiecare catenă din dublul helix funcționează ca șablon
pentru sinteza unei catene noi
§ acest proces generează două molecule ADN fiice dublu-
catenare, fiecare fiind identică cu cea inițială
§ secvența de baze a catenelor noi este complementară cu
cea a catenelor șablon
§ ADN-ul nou este produs de enzime denumite ADN
polimeraze care lucrează împreună cu o varietate de alte
enzime și proteine pentru a se asigura că replicarea ADN
este efectuată cu precizie
Replicarea ADN este un proces „semiconservativ”

§ în fiecare rundă de replicare ADN, fiecare dintre cele două

catene este utilizată ca șablon pentru formarea unei catene noi,
complementare

§ fiecare dublu helix de ADN „fiică” este compusă dintr-o catenă

conservată și una nou sintetizată - „semiconservativ”

§ prin urmare, catenele originale rămân intacte de-a lungul mai

multor generații de celule

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 Sinteza ADN începe în originile de replicare
§ replicarea catenelor ADN începe la nivelul unor secvențe specifice – origini de replicare (bogate în perechi de
baze A-T) – recunoscute de proteine inițiatoare se leagă la și descompun punțile de hidrogen dintre baze

§ pe măsură ce ADN-ul este desfăcut, se formează o așa-numită

„bulă” de replicare (replication bubble) cu
replication bubble § două structuri în formă de „Y” numite furci de replicare

sunt atrase un grup de proteine ce efectuează replicarea ADN:

„aparat de replicare” – un complex format din mai multe
enzime în care fiecare proteină are o funcție specifică

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 Sinteza ADN are loc la nivelul furcilor de replicare
§ Se formează două furci de replicare la nivelul fiecărei origini de replicare

§ la fiecare furcă, un aparat de replicare

(replication machine) se deplasează de-a lungul
ADN-ului

§ desface cele două catene ale dublului helix

§ utilizează fiecare catenă ca șablon pentru a

forma o catenă fiică nouă
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
Există mai multe origini de replicare în cromozomii eucariotelor

§ cromozomul mic și inelar la bacterii are o singură

origine de replicare
§ cromozomii eucariotelor, care sunt mult mai
mari, prezintă multe origini de replicare
• în genomul uman există în medie 220 de
origini per cromozom
§ începerea replicării ADN în mai multe poziții în
același timp scurtează semnificativ timpul
necesar celulei pentru a-și copia genomul în
totalitate
 Replicarea ADN este bidirecțională

§ cele două furci de replicare se deplasează dinspre

originea de replicare, în direcții opuse
§ acestea desfac ca un fermoar dublul helix de ADN și
realizarea replicarea sa pe măsură ce avansează

1, 2, 3 – reprezintă aceeași porțiune a unei molecule de

ADN așa cum poate să apară în momente diferite pe
parcursul replicării
- linii portocalii – cele două catene ADN „părinte”
- linii roșii – catenele ADN nou sintetizate

§ furcile se deplasează foarte rapid

~1000 perechi de nucleotide pe secundă în bacterii
~ 100 perechi de nucleotide pe secundă la om

O imagine de microscopie elecronică ce prezintă

replicarea ADN într-un embrion de muscă. Particulele
vizibile de-alungul ADN-ului sunt nucleozomii
(courtesy of Victoria Foe.)

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 ADN polimeraza
§ este „miezul” aparatului de replicare

§ catalizează adăugarea de nucleotide la capătul 3ʹ al

catenei ADN în creștere
§ folosind o catenă ADN părinte drept șablon

§ reacția de polimerizare implică formarea unei legături

fosfodiester între gruparea OH de la capătul 3ʹ al
lanțului în creștere de ADN și gruparea fosfat 5ʹ al
nucleotidei adăugate

§ nucleotidele libere (substrat) se găsesc sub formă de

dezoxiribonucleotid-trifosfați (dNTPs)

§ energia necesară pentru polimerizare este furnizată de

hidroliza a două dintre legăturile de fosfat ale dNTP
ADN polimeraza sintetizează o catenă nouă de ADN în direcția 5ʹ–către–3ʹ

§ în fiecare etapă, nucleotida potrivită pentru

adăugare este selectată prin formarea de
perechi de baze cu următoarea nucleotidă
din catena șablon:
§ A cu T, T cu A,
§ C cu G și G cu C

§ fiecare este adăugat la capătul 3ʹ al catenei

noi în creștere

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 Caracteristici cheie ale ADN polimerazelor

§ o familie de enzime: celula eucariotă conține cinci ADN polimeraze - α, β, γ, δ și ε;

polimeraza γ se găsește în mitocondriile celulei
§ necesită întotdeauna un șablon
§ poate adăuga nucleotide doar la capătul 3' al unei catene de ADN
§ nu poate porni formarea unui lanț de ADN de sine stătătoe, ci necesită un lanț pre-existent sau o secțiune
scurtă de nucleotide denumită un primer

§ verifică greșelile (proofreading) – își verifică munca, îndepărtând marea majoritate a nucleotidelor
„greșite” care au fost adăugate accidental la catenă

Arthur Kornberg, 1956

a izolat prima ADN plimerază (I)
 Primeri și primaza
§ ADN plimerazele pot adăuga nucleotide exclusiv la capătul 3' al unei catene existente de ADN
Deci cum adaugă ADN polimeraza prima nucleotidă la nivelul unei noi furci de replicare?

este necesară o enzimă diferită -

Primază – formează un fragment scurt de ARN – folosind catena ADN drept șablon

Primer – fragment scurt de ARN (aprox. 10 nucleotide lungime)

- este complementar ca baze cu catena ADN șablon
- oferă un capăt 3ʹ cu baze complementare ca punct de pornire pentru ADN
polimerază
astfel servește ca primer pentru sinteza ADN
Primaza - o ARN polimerază:
o enzimă ce sintetizează ARN folosind ADN ca șablon Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

§ odată ce primerul ARN este la locul său, ADN plimeraza o „extinde” – adaugă
nucleotide una câte una pentru a forma o catenă nouă de ADN care este
complementară catenei folosite ca șablon
 Catena avansată și catena întârziată
§ ADN polimeraza poate forma ADN în direcția 5' către 3'
§ cele două catene din dublul helix ADN sunt antiparalele –
acestea sunt orientate în direcții opuse

acest lucru reprezintă o problemă pe parcursul replicării

Soluția: cele două catene noi, care sunt și antiparalele cu

șabloanele lor, trebuie formate în mod diferit
Catena avansată (leading) – catena nouă, care este orientată 5‘
către 3' spre furca de replicare, este formată în mod continuu
(ADN polimeraza se deplasează în aceeași direcție ca și furca de
replicare)
Catena întârziată (lagging) – cealaltă catenă nouă, care este
Fragmentele scurte de ADN rezultate –
orientată 5' către 3‘ dinspre furca de replicare, este formată din
fragmente Okazaki – sunt mai apoi reunite
fragmente (în mod discontinuu – ADN polimeraza se
pentru a forma o catenă nouă continuă
depplasează în sens invers față de furca de replicare)
Descoperite de Reiji Okasaki în 1968
Catena avansată – un primer
Catena întârziată – câte un primer nou pentru fiecare fragment
 Sinteza unui fragment ADN continuu pe catena întârziată
sunt necesare trei enzime suplimentare

§ primeri ARN sunt formați la intervale de aprox. 200 nucleotide pe catena

întârziată, și
§ fiecare primer ARN ~ 10 nucleotide lungime

§ Nucleaze – recunosc o catenă ARN dintr-un helix ARN/ ADN și o degradează

§ astfel se crează un gol

§ Polimeraza de reparare (o ADN polimerază) – înlocuiește ARN cu ADN

§ ADN ligaza – conectează fragmentele finale, catalizând formarea unei

legături fosfodiester între gruparea -OH de la capătul 3ʹ al unui fragment cu
gruparea fosfat de la capătul 5ʹ al următorului fragment

§ această reacție de etanșare a tăieturii necesită un aport de energie sub

formă de ATP

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

Proteinele de la nivelul unei furci de replicare cooperează pentru a forma un aparat de
replicare
Replicarea ADN necesită cooperarea unui număr mare de proteine ce acționează coordonat
pentru a desface dublul helix și a sintetiza ADN nou
§ ADN helicaza – desface helixul ADN la nivelul furcii de
replicare
§ Proteine de legare a ADN-ului monocatenar – se prind
de ADN-ul monocatenar expus de helicază,
împiedicând tranzitoriu catenele să reformeze perechi
de baze și menținându-le astfel într-o formă alungită

§ Clemă glisantă (sliding clamp) – o proteină inelară –

menține pe loc moleculele de ADN polimerază când
acestea sintetizează ADN-ul

§ Topoizomeraza acționează în regiunea aflată înainte de

furca de replicare pentru a preveni supraspiralizarea
ADN-ului desfăcut
§ formează mici goluri temporare în helix pentru a
elibera tensiunea, apoi sigilează aceste spărturi pentru
a evita deteriorarea permanentă
Essential cell biology (4th ed.) 2013
 ADN polimeraza este capabilă de auto-corectare
§ ADN polimeraza face câte o greșeală la aprox. fiecare 1 di 107 baze și
adaugă o dezoxiribonucleotidă incorectă la lanțul în formare
§ necorectate, aceste greșeli ar putea duce lao acumulare de mutații

ADN polimeraza are două calități speciale care îmbunătățesc

semnificativ acuratețea replicării ADN:
§ monitorizează atent cuplarea bazelor – doar dacă perechea este
corectă se va produce catalizarea reacției de adăugare a
nucleotidelor
are loc în același
§ când face o greșeală rară și adaugă nucleotida greșită, poate timp cu sinteza de
corecta eroarea (proofreading): ADN
Ø activitate de exonuclează 3` către 5` - îndepărtează
nucleotida incorectă și o înlocuiește cu cea corectă
Ø sinteza ADN continuă după aceasta
Polimerizarea și verificarea greșelilor (proofreading) sunt efectuate de
domenii catalitice diferite de pe aceeași moleculă de plimerază
Essential cell biology (4th ed.) 2013
Problema replicării capătului

§ catena întârziată a furcii de replicare este sintetizată sub

forma de fragmente discontinue de ADN – fiecare dintre
ele începe cu propriul primer ARN

§ problemă: atunci când furca de replicare ajunge la

capătul unui cromozom linear, nu există pozibilitatea de
a porni replicarea ultimului fragment deoarece primerul
ar ajunge dincolo de capătul cromozomului

§ ADN-ul situat imediat la capătul cromozomilor

eucariotelor este omis din copiere la fiecare rundă de
replicare, ducând la formarea unei proeminențe pe o
catenă
§ după multiple runde de divziune celulară, cromozomii se
vor scurta continuu pe măsură ce acest proces este
repetat
 Telomeri

§ capetele cromozomilor la eucariote prezintă „capace”

specializate de ADN, denumite telomeri
§ constă din câteva sute sau mii de repetiții ale aceleiași
secvențe scurte de ADN (5'-TTAGGG-3' la om)
§ unități repetitive – secvențe care nu codifică

§ secvențele repetitive care formează telomerii sunt

pierdute lent pe parcursul ciclurilor de diviziune

§ protejează regiunile interne ale cromozomilor – cele care

conțin genele (cel puțin, pentru o anumită perioadă)

https://www.istockphoto.com
Telomeraza efectuează replicarea capetelor cromozomilor la eucariote
Telomerază – o ribonucleoproteină (RNP) formată din două subunități esențiale:
§ ARN telomeraza – conține o secvență complementară cu unitatea repetitivă
telomerică – oferă șablonul pentru sinteza de ADN repetitiv al telomerilor
§ enzima revers-transcriptaza terlomerazei – o ADN polimerază ARN-
dependentă, care formează ADN folosind ARN ca șablon

telomeraza – folosind șablonul ARN (care face parte din moleculă) adaugă
copii multiple ale aceleiași secvențe scurte de ADN la catena șablon

aceast șablon extins permite finalizarea replicării catenei întârziate prin

replicare ADN convențională
Semnificație clinică
Telomeraza

§ telomeraza nu este de obicei activă în majoritatea celulelor somatice

§ însă este activă în celulele germinale (celulele care formează spermatozoizi și ovule) și în unele celule
stem aulte

Ø celulele germinale – duc la formarea unui nou organism la care „ceasul” telomeric este resetat
Ø celule stem adulte – tipuri de celule care trebuie să parcurgă diviziuni multiple

§ multe celule canceroase au telomeri scurtați, iar telomeraza devine activă în aceste celule

§ Dacă telomeraza ar putea fi inhibată de medicamente ca parte a terapiei împotriva cancerului,

diviziunea în exces a celulelor canceroase ar putea fi oprită
 Telomeri. Telomerază
§ scurtarea telomerilor a fost conectată cu îmbătrânirea celulelor
§ pierderea progresivă a telomerilor ar putea explica de ce celulele au un număr limitat de diviziuni posibile

Diviziunile celulare sunt

limitate de obicei la un
număr de 50 de diviziuni

Teleomeraza permite
celulelor să își extindă
numărul de diviziuni
posibile peste 50
 Corectura ADN-ului și repararea ADN-ului

§ există mecanisme de corectare a erorilor pe parcursul replicării ADN și de reparare a deteriorărilor ADN
pe durata vieții celulei

§ Corectură – corectează erorile produse pe parcursul replicării ADN

§ Repararea nepotrivirilor (mismatch repair) – are loc imediat după replicarea ADN
§ pentru a îndepărta și înlocui bazele cuplate incorect (nepotrivite) – cele care nu au fost
reparate pe parcursul corecturii)
• mai întâi, un complex de proteine recunoaște și se leagă la baza nepotrivită
• un al doilea complex taie ADN-ul în apropiere de nepotrivire, iar mai multe
enzime decupează nucleotida incorectă și o parte a ADN-ului din jur
• o ADN polimerază înlocuiește apoi secțiunea lipsă folosind nucleotidele corecte,
iar o ADN ligază etanșează locul
§ Căi de reparare a deteriorărilor ADN – detectează și corectează deteriorările pe parcursul ciclului celular

ADN-ul este deteriotat tot timpul de către factori externi (de ex. lumina UV, substanțe chimice, radiații X)
dar și de către reacții chimice spontane ce au loc fără factori din mediul extern

Reversie directă: unele reacții chimice ce deteriorează ADN-ul pot fi „anulate” de către enzime ale celulei

Reparare prin excizie: deteriorare la nivelul unei sau a câtorva baze ale ADN
a. reparare prin excizie de baze – este îndepărtată doar baza deteriorată
b. reparare prin excizie de nucleotide – este îndepărtat un petic de nucleotide

Repararea rupturii dublu-catenare: când un întreg cromozom este despicat în două părți
a. unirea capetelor – cele două capete rupte ale cromozomului sunt pur și simplu „lipite” una la alta
- versiune „mai dezordonată” – implică pierdere sau adăugare de câteva nucleotide la locația întreruptă

a. recombinarea omologilor – cei doi cromozomi omologi se reunesc, iar regiunea nedeteriorată a
omologului servește ca șablon pentru a înlocui regiunea afectată a omologului său
- versiune „mai curată” de reparare – de regulă nu cauzează mutații
Semnificație clinică
Corectura și repararea ADN în bolile umane
În multe cazuri, mutații ale genelor ce codifică proteinele de corectură și de reparare sunt
asociate cu versiuni ereditare de cancer - de exemplu:

Cancer colorectal ereditar non-polipozic (cunoscută și ca sindrom Lynch)

§ cauzată de mutații în genele ce codifică anumite proteine de reparare a nepotrivirilor bazelor
§ mutațiile se acumulează mult mai rapid decât în celulele unei persoane neafectate
§ acest lucru poate duce la dezvoltarea de tumori la nivelul colonului

Xeroderma pigmentosum
§ cauzată de mutații ce afectează calea de reparare prin excizia de nucleotide
§ unele forme de deteriorare a ADN induce de radiații UV nu pot fi reparate
§ sensibilitate extremă la lumina UV
§ aprox. 50% dintre cei afectați vor dezvolta cancer cutanat până la vârsta de 10 ani dacă nu
folosesc protecție solară adecvată
 Reacția de polimerizare în lanț (PCR) „replicarea ADN în eprubetă”
§ tehnică ce permite obținerea de multiple copii (de ordinul milioanelor) ale unei regiuni ADN specifice, in vitro
§ primer ADN – dezvoltați în mod specific pentru regiunea de interes a ADN-ului – doi primeri sunt utilizați în
fiecare reacție PCR - aceștia sunt specifici pentru porțiunile situate de o parte și alta a regiunii de copiat (țintă)
§ o ADN polimerază termostabilă – polimeraza Taq (după denumirea bacteriei din care a fost izolată - Thermus
aquaticus)

Fiecare ciclu PCR include 3 etape:

(1) ADN-ul dublu-catenar este încălzit pentru scurt timp pentru a separa cele două catene (denaturare)
(2) ADN-ul este expus la primerii specifici – apoi proba este răcită pentru a permite primerilor să fie hibridizați
la secvențele complementare din catenele ADN (anelare)
(3) Acest amestec este incubat cu ADN polimeraza și cele patru dNTP pentru a putea fi sintetizat ADN, pornind
de la cei doi primeri (extensie)
Multiple cicluri de amplificare in vitro generează bilioane de copii ale secvenței de nucleotide dorite

Utilizare:
• cercetare
• diagnostic
• medicină
legală
§ runde repetate de separare a catenelor, hibridizare și sinteză petru a amplifica ADN
Ciclul celular la eucariote

§ celula își dublează masa, își duplifică genomul și

organitele, și le împarte în cele două celule fiice

§ aceste evenimente trebuie să aibă loc cu mare

precizie și în ordinea corectă

§ în plus, întregul proces trebuie să recunoască

momentul în care este necesară oprirea

G0 § celulele și-au stabilit procese de control sofisticate

pentru a asigura faptul că ciclul celular continuă cu
precizia necesară și pentru a preveni ieșirea de sub
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition control a ciclului celular, care ar putea duce la
cancer
 Sistemul de control al ciclului celular – un sistem de control molecular

§ funcționează similar unui timer ce declanșează evenimentele ciclului celular în ordinea

setată

§ se bazează pe o serie conectată de comutatori moleculari, fiecare dintre aceștia fiind

responsabil de inițierea unui eveniment specific al ciclului celular

§ toate celulele eucariote par să utilizeze mecanisme de control similare pentru a efectua
și regla evenimentele ciclului celular

§ este foarte adaptabil și se poate modifica pentru a se potrivi tipurilor specifice de celule
și pentru a răspunde unor semnale intracelulare sau extracelulare specifice
 Capacitate de diviziune diferită

§ momentul și ratele diviziunii celulare în diferite părți ale unui organism sunt deosebit de
importante pentru creșterea, dezvoltarea și întreținerea celulelor

Frecvența diviziunilor celulare variază de la un tip de celulă la altul

o unele celule umane se divid frecvent pe parcursul vieții (celule cutanate, celulele
mucoasei intestinale, celulele din măduva osoasă)
o alte celule umane au capacitatea de a se divide însă nu o utilizează continuu
(hepatocite, celule endoteliale, fibroblaști)
o celulele nervoase și musculare mature nu par a se divide deloc după maturizare
(celule diferențiate terminal)

§ aceste diferențe rezultă din reglări efectuate la nivel molecular

Celulele canceroase reușesc să scape de sub controlul normal al ciclului celular

 Puncte de control ale ciclului celular
Puncte de control – etape ale ciclului celular la eucariote în care celula examinează semnalele interne și externe și
„decide” dacă continuă sau nu cu diviziunea
Cele mai importante trei:
§ Punct de control G1 – la tranziția dintre fazele G1/S
§ punct de decizie principal – se verifică: mărimea celulei, nutrienții,
factorii de creștere, eventuale deteriorări ale ADN-ului
§ fără „indicații de continuare” – celula poate părăsi ciclul celular (către
G0)
§ odată trecut – celula este angajată în ciclul celular

§ Punct de control G2 – trecerea între fazele G2/M

§ întrebare: este ADN-ul în stare perfectă înainte de a începe mitoza?
§ se verifică: deteriorarea ADN, finalizarea replicării ADN
§ erori sau deteriorări – celula se va opri în G2 pentru reparații
§ dacă deteriorările sunt iremediabile – celula poate trece spre apoptoză

§ Punct de control al fusului de diviziune – trecerea de la metafază

la anafază
§ se verifică: dacă cromatidele sunt corect atașate
la microtubulii fusului de diviziune
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
§ dacă un cromozom nu este la locul său – celula va opri mitoza,
se permite „prinderea” de către fus a cromozomului scăpat
 Puncte de control ale ciclului celular

reguli de funcționare:

§ înainte de a traversa un punct de control, celula trebuie să se asigure că există

condiții adecvate pentru ca fazele S și M să poată fi executate cu succes

§ informațiile despre finalizarea evenimentelor ciclului celular, precum și

semnalele din mediu, pot determina sistemul de control să oprească ciclul la
aceste puncte de tranziție
 Cum funcționează de fapt punctele de cotrol?

§ o serie de semnale interne (cum ar fi deteriorarea ADN) și externe (cum ar

fi semnale moleculare) declanșează căi de semnalizare în interiorul celulei
care activează sau dezactivează
un set de proteine principale ce trec celula prin etapele ciclului celular

Ø reglatori ai ciclului celular

 Cicline și kinaze dependente de cicline (CDKs)
§ componente centrale ale sistemului de control al ciclului celular
Cicline – grup de proteine înrudite
§ denumite inițial pe baza faptului că trec printr-un ciclu de sinteză și degradare în
fiecare ciclu celular nivelurile diferitelor cicline variază semnificativ pe parcursul
ciclului celular
§ patru tipuri principale la om: G1 cicline, G1/S cicline, S cicline și M cicline
§ modificările ciclice ale nivelului de cicline duc la asamblarea și activarea ciclică a
complexelor de ciclină–Cdk în etape specifice ale ciclului celular

Kinaze dependente de cicline (Cdks) – o familie de protein-kinaze

§ activitatea lor crește sau scade pe măsură ce celula parcurge ciclul celular Când ciclina formează un
ducând la modificări ciclice în fosforilarea proteinelor intracelulare complex cu Cdk, protein-
ceea ce inițiază sau reglează evenimentele principale ale ciclului celular kinaza este activată pentru a
declanșa evenimente
§ nivelurile proteinelor Cdk sunt constante specifice ale ciclului celular. În
§ se modifică activitatea lor - controlată de nivelul de proteine cicline lipsa ciclinei, Cdk este inactivă

Ciclinele și Cdks – conservate pe parcursul evoluției, se găsesc la

multe specii diferite, de la fungi la om
 Acumularea de cicline ajută la reglarea activității Cdks

Essential cell biology (4th ed.)., 2013

§ modificările concentrației de cicline sunt corelate cu activitatea de

protein-kinază a Cdk
 Baza activării Cdk
§ în absența ciclinei, situsul activ al
proteinei Cdk este parțial mascat
printr-o buclă proteică (A)

§ legarea ciclinei duce la deplasarea buclei

de la nivelul situsului activ, ceea ce
conduce la activarea parțială a enzimei
Cdk (B)
§ de asemenea, este necesară fosforilarea
Cdk la nivelul unui situs specific pentru a
obține activarea completă

§ CDK necesită și reglare negativă prin

fosforilare în alte situsuri

o Important! Proteina ciclină nu doar își activează proteina partener Cdk ci o și direcționează către proteine
țintă specifice. Drept urmare, fiecare complex ciclină–Cdk fosforilează un set diferit de proteine substrat
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
 Complexele ciclină–Cdk ale sistemului de control al ciclului celular

Concentrațiile celor
trei tipuri principale de
cicline oscilează pe
parcursul ciclului
celular, în timp ce
concentrațiile Cdk (nu
sunt prezentate) nu se
modifică

§ G1/S-ciclina crește – se formează complexe G1/S-Cdk – declanșează progresia prin punctul de tranziție de start
§ S- ciclina crește – se formează complexe S-Cdk (la începutul fazei S) – declanșează replicarea ADN, evenimente
precoce ale mitozei
§ M-ciclina crește – se formează complexe M-Cdk pe parcursul G2 – declanșează intrarea în mitoză (trecere G2/M)
§ APC/C – o proteina de reglare separată, inițiază tranziția metafază-spre-anafază
Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
 Factor de promovare a maturării (maturation-promoting factor - MPF)
§ un factor din citoplama celulelor ce se divid, capabil de a controla intrarea celulei în mitoză
§ Cdk (Cdk1) se leagă la partenerul său M ciclină (ciclina B)

§ M ciclina se acumulează pe măsură ce celula se apropie de

tranziția G2/M se leagă la Cdk deja prezente în celulă și
formează complexe care declanșa faza M a cliclului celular

§ complexele MPF active adaugă marcaje fosfat la o serie de

proteine, de ex.
• în învelișul nuclear, ducând la degradare
(un eveniment cheie al fazei M timpurii)
• ținte ce promovează condensarea cromozomilor
https://www.khanacademy.org/

o Odată inițiată mitoza, este esențial ca Cdk1 să fie dezactivată. Acest lucru este realizat prin distrugerea
M-ciclinei (ciclina B) în proteazom
 Activitatea Cdk poate fi împiedicată prin fosforilare de inhibiție și
proteine inhibitorii ale Cdk (CKI)

§ fosforilarea unor aminoacizi specifici în situsul activ al Cdk de către o

protein-kinază numită Wee1 inhibă activitatea Cdk complexul activ
ciclină-CDK este oprit
§ defosforilarea acestor situsuri de către o fosfatază denumită Cdc25
crește activitatea Cdk

§ proteine inhibitorii ale Cdk (CKIs) – inactivează complexele ciclină–Cdk

de ex. CKI p27, p16, p21
• legarea CKI stimulează o rearanjare amplă a structurii situsului ativ
al Cdk, inactivând Cdk
• celulele utilizează CKI în principal pentru a ajuta la controlarea
activității G1/S- și S-Cdk-uri la începutul ciclului celular

Molecular Biology of the Cell, sixth Edition

 Complexul de promovare a anafazei/ciclozom (APC/C)
§ progresia prin tranziția metafază-spre-anafază este declanșată nu de către fosforilarea de proteine, ci de către
distrugerea de proteine, ducând la etapele finale ale diviziunii celulare

Complexul de promovare a anafazei, sau ciclozomul (APC/C)

§ reglator-cheie al tranziției de la metafază la anafază
§ un membru al familiei de enzime ubiquitin ligaze
§ poliubiquitilează (adaugă multiple copii de ubiquitină la) proteine țintă specifice, ducând la distrugerea
acestora în proteazomi:

Ø M ciclina – distrusă începând cu anafaza – scoate celula din

mitoză, permițând celulelor fiice noi să intre în G1
Essential cell biology (4th ed.)., 2013

Ø Securina – pornește un lanț de evenimnente => distrugerea cohezinei,

proteina care menține împreună cromatidele surori => separarea
acestora în anafază și deplasarea spre capetele opuse ale celulei

https://www.khanacademy.org
Semnale externe
Factori de creștere (mitogeni)
§ proteine eliberate de anumite celule care stimulează diviziunea altor celule
§ acționează la nivelul receptorilor de pe suprafața celulei
§ pornesc căi de semnalizare celulară ce stimulează sinteza de G1 cicline, G1/S cicline și alte
proteine implicate în sinteza de ADN și duplicarea cromozomilor
§ frecvent induc ieșirea celulei din repausul ciclului celular, sau din anumite stări non-proliferative

De ex. factorul de creștere derivat din trombocite (PDGF) Factorii de creștere induc ieșirea din G0
stimulează diviziunea fibroblaștilor umani în culturi celulare
Semnale externe Proteina retinoblastom (Rb)
§ o proteină de supresie tumorală
§ un reglator negativ important: blochează progresia de la
faza G1 la faza S
§ a fost identificată inițial în studii ale unei tumori oculare
rare la copii denumită retinoblastom, în care proteina Rb
lipsește sau este defectă
§ abundentă în nucleii tuturor celulelor la vertebrate – se
leagă la reglatori specifici ai transcripției și împiedică
pornirea de către aceștia a transcripției genelor necesar
pentru proliferarea celulei

§ Mitogenii declanșează activarea G1-Cdks și G1/S-Cdks

§ aceste complexe fosforilează proteina Rb, modificându-i

conformația – eliberarea reglatorilor de transcripție legați

§ reglatorii de transcripție devin liberi să activeze genele

necesare pentru proliferarea celulară Molecular Biology of the Cell, sixth Edition
Semnale externe
Dependența de ancorare
celulele normale trebuie să fie atașate la un substrat pentru a se divide

Inhibiție dependentă de densitate

§ celulele dintr-un vas de cultură celulară sau de la marginea
unei plăgi se divid până ajung să se atingă
§ când intră în contac cu celulele vecine, acestea se opresc
din divizine:
contactul duce la producerea a două CKIs: p16 și p27

acestea inhibă G1 Cdks și împiedică sinteza ADN

Celulele canceroase nu prezintă nici inhibiție dependentă de densitate și nici dependență de ancorare
Semnale interne p53
„gardianul genomului”
Deterioarea ADN poate opri
temporar progresia prin G1
§ o proteină de supresie tumorală

§ sistemul de control al ciclului celular folosește o serie de mecanisme

diferite pentru a opri progresia prin ciclul celular în cazul în care ADN-ul
este deteriorat, unul fiind la nivelul trecerii G1-S:

§ deteriorarea ADN în G1 duce la creșterea concentrației și activității p53

§ p53 este un reglator al transcripției – activează transcripția unei gene ce p21
codifică p21 – o proteină inhibitorie a Cdk
§ proteina p21 se leagă la G1/S-Cdk și S-Cdk – stopează ciclul celular în G1

§ oferă celulei timpul necesar pentru a repara ADN-ul deteriorat înainte

de replicarea sa
https://en.wikipedia.org/wiki/P53
§ dacă deteriorarea ADN este ireparabilă, p53 poate induce sinuciderea
celulei (apoptoza)
Semnificație clinică
§ Dacă p53 lipsește sau este defectă, replicarea nerestricționată a ADN-ului deteriorat duce la o
rată ridicată de mutații și la producerea de celule care tind să devină canceroase

§ Mutațiile genei p53 sunt prezente în aprox. 50% din cancere la om

Pierderea controlului ciclului celular în celulele canceroase

§ Celulele canceroase nu răspund la semnalele care reglează în mod normal ciclul celular. Acestea:
ü nu necesită factori de creștere pentru a crește și a se divide
ü își fabrică propriul factor de creștere
ü pot transmite semnalul unui factor de creștere fără ca acesta să fie prezent în mod real
ü pot prezenta un sistem de control anormal al ciclului celular