Universitatea de Științele Vieții „Regele Mihai I al României”

din Timișoara
Facultatea de Inginerie și Tehnologii Aplicate
Specializarea: Management Forestier
Disciplina: Sisteme neconvenționale de obținere și multiplicare a materialului
săditor

Micropropagarea la Taxus

Prof. coordonator: Masterand:

Prof.univ.dr. Danci Marcel Udrescu Constantin Ion

TIMISOARA 2023

1
 CUPRINS:

1. Introducere....................................................................................................................3

2. Protocol experimental...................................................................................................4

2.1. Pregătirea explantului................................................................................................4

2.1.1. Condiții de creștere a plantelor-mamă.......................................................4

2.1.2. Dezinfectarea materialului vegetal.............................................................4

2.2. Media de cultură........................................................................................................4

2.3. Regenerarea și întreținerea fotografiilor....................................................................4

2.3.1. Formarea și propagarea mugurilor.............................................................4

2.3.2. Alungirea mugurilor..................................................................................5

2.4. Înrădăcinarea………………………….....................................................................6

Bibliografie.......................................................................................................................8

2
 Micropropagarea la Taxus

1. INTRODUCERE
Tisele sunt arborii toleranți la umbră cu creștere lentă, care au fost folosiți de-a lungul
mileniilor deoarece din lemnul lor durabil și elastic, în special pentru arme precum arcurile lungi.
Acest lucru a dus la o penurie extremă a acestui material și o selecție negativă dramatică pentru
fenotipuri brațe, această specie de copac și-a revenit din nou. Mai târziu, otrăvirea accidentală a
valorilor animalele domestice, cum ar fi caii, au cauzat o curățare suplimentară a copacilor (de
exemplu, lângă drumuri).
Un interes tot mai mare pentru țesut a apărut din nou cu investigații privind principiul
toxic 50 cu ani în urmă. Paclitaxelul otrăvitor mitotic a fost un inhibitor eficient al rapidității
crescând celule canceroase și a fost concentrat în principal în scoarța copacilor. Aproximativ
șapte tone de scoarță de țesut sunt necesare pentru a obține un kilogram de paclitaxel.
Pe baza acestui lucru și a unor calcule similare, a devenit evident că aprovizionarea cu
instalații materialul din țesut ar putea fi un factor limitativ în viitor (Croom, 1995). Prin urmare,
au fost dezvoltate și îmbunătățite metode de propagare a tăierii vegetative în diferite țări
(Schneck, 1996; Ewald și colab., 2002). Metode de micropropagare de multiplicat materialele
selectate au fost dezvoltate în același timp, însă numărul publicat rezultatele privind materialul
vegetal adult sunt limitate (Taxus mairei - Chee, 1995; Chang și colab., 1998, 2001; Taxus
baccata - Majada și colab., 2000). Embriogeneza somatică a Taxus, în mare parte din explante
foarte tinere, cum ar fi embrioni zigotici imaturi, a fost, de asemenea raportat (Wann & Goldner,
1994), dar regenerarea plantelor a fost adesea dificilă în ceea ce privește formarea embrionilor și
dezvoltarea sincronă (Taxus brevifolia - Ewald și colab., 1995 și Taxus chinensis - Qiu și colab.,
1998). De asemenea, embriogeneza somatică nu a fost satisfăcător în ceea ce privește procentul
de explante germinate (Taxus brevifolia - Chee, 1996). Testarea acestor metode in vitro descrise
anterior bazată pe organogeneză, deseori a dus la eșec în laboratorul autorului în timp ce
investigarea micropropagării materialului de tisa pentru adulți. Cultură tisulară
insuficientăcapacitatea materialului vegetal utilizat, precum și alți factori ar fi putut fi
responsabili pentru rezultatele negative. Prin urmare, pe baza experiențelor de micropropagare a
conifere, a fost elaborată o metodă detaliată pentru a multiplica clonele selectate de tisa.

3
 PROTOCOL EXPERIMENTAL
2.1. Pregătirea explantului
2.1.1. Condiții de creștere a plantelor-mamă
Butașii copacilor donatori selectați adulți recoltați în septembrie au fost înrădăcinați
folosind pasta de înrădăcinare conținând 2 g l – 1 acid indol-3-butiric (IBA) sub ceață de înaltă
presiune într-o seră . Aceste plante înrădăcinate au fost utilizate ca plante donatoare pentru
stabilire culturi de țesuturi. Mugurii închisi sau vârfurile de lăstari au fost recoltate ca explante
după pretratare cu un fungicid (0,2% Euparen by Bayer, 50% diclorfluanidă) timp de 24 de ore.
2.1.2. Dezinfectarea materialului vegetal
Suprafața explanților a fost menținută uscată pentru a permite o dezinfecție eficientă. Prin
urmare, nu s-a efectuat nicio spălare înainte de dezinfecție și plantele nu au fost udate cu o zi
înainte de utilizare. Dezinfectarea a fost efectuată prin spălarea explantelor în mercuric soluție de
clorură (0,25%) cu o picătură de detergent (de ex. TWEEN 80) timp de 10-15 min. Ulterior,
explantele au fost clătite de trei ori cu apă sterilă și plasate pe mediu nutritiv în baloane
Erlenmeyer de 100 ml.
2.2. Media de cultură
Mediile nutritive utilizate pentru micropropagare sunt enumerate în Tabelul 1.
Concentrația a componentelor de bază (diluare sau creștere) din mediul nutritiv al plantelor bine
cunoscut este prezentate acolo, în timp ce regulatorii de creștere, care au fost adăugați, sunt
menționați în text separat. În diferite experimente Woody Plant Medium (WPM, conform Lloyd
& McCown, 1981) a fost găsit pentru a sprijini creșterea și vitalitatea Taxus cele mai bune
explante. Prin urmare, medii nutritive pentru propagare, precum și pentru alungire s-a bazat pe
acest mediu bazal. Mediul bazal pentru înrădăcinare a fost un LS modificat mediu (L9, bazat pe
LS conform Linsmaier & Skoog, 1965).
2.3. Regenerarea și întreținerea fotografiilor

2.3.1. Formarea și propagarea mugurilor

Testarea citokininelor foarte eficiente, cum ar fi 6-benzilaminopurina (BAP), pentru a

stimula dezvoltarea mugurilor și a lăstarilor în combinație cu medii nutritive suplimentate cu
cărbunele activ, așa cum a fost raportat în literatura de specialitate, a dus la o necroză rapidă a
material. Testele diferitelor medii de bază au arătat că Woody Plant Medium (W) era cel mai
eficient pentru creșterea și vitalitatea explanților. Experiențe cu alte persoane s-au aplicat și

4
conifere privind utilizarea citokininelor (zada, molid norvegian) tisa. S-a folosit mediu pentru
plante lemnoase cu 1,5 mg l-1 zeatină (mediu numit Wz) inducerea mugurilor. Uneori, zeatina a
fost înlocuită cu 2iP (N6- ( 2-izopentenil) adenină - 2,84 mg l – 1). Explanele au fost ținute în
condiții de lumină roșie continuă (30 μE m – 2s – 1, 650 nm vârf de emisie) la o temperatură de
23 ° C. Deși Wz mediu a condus la o alungire redusă a lăstarilor, a fost forțată formarea
mugurilor axilari (Figura 1B). Dacă concentrația mediului de bază a fost dublată (Wdouble) și
utilizată cu zeatină în concentrații identice cu Wz (Wzdouble) o îmbunătățire remarcabilă a
filmării s-a atins alungirea, numărul mugurilor laterali și lungimea acului. Cu toate acestea, a
utilizarea continuă a Wzdouble a redus rata de propagare. O fază de calus - comparabilă la
propagarea accidentală a mugurilor în alte conifere (de exemplu molid norvegian) - a fost
neobservat. Rezultatul acestor experimente a fost utilizat mediul nutritiv Wz pentru propagarea
continuă a grupelor de muguri axilari datorită eficienței sale. Au fost atinse rate de propagare de
1,2-1,8 pe lună. Adăugarea a 200 mg l – 1 spermidina a stimulat aceste rezultate pozitive.
Folosind exclusiv un mediu pentru a obține propagarea precum și alungirea, de ex. așa cum a fost
elaborat pentru plop în laboratorul nostru, nu a fost posibil. Concluzia a fost stabilirea și
menținerea unei propagări cultură și să transfere mugurii pe un mediu de alungire pentru a obține
lăstari înrădăcinați. Probleme în timpul propagării care au derivat din apariția bacteriilor
endofitice au fost rezolvată prin adăugarea de 500 mg l – 1 ticarcilină.

2.3.2. Alungirea mugurilor

Alungirea mugurilor laterali. Teste privind propagarea în serie a purtătorilor de muguri
segmente de tulpină prin disecție de lăstari alungitori comparabili cu sistemul utilizat pentru
larice, a eșuat deoarece nu a fost posibilă forțarea dezvoltării mugurilor axilari în segmente stem.
Pe de altă parte, alungirea vârfurilor de tragere în acest experiment a fost cel mai bine realizat
folosind un mediu nutritiv concentrat W dublu (Wdouble) și o combinație de zeatină și kinetină
(0,66 + 0,64 mg l – 1) cu adaos de PVP și arginină (100 mg l – 1 fiecare). Alungirea mugurilor
laterali nu a fost stimulată pe acest mediu, dar a fost stimulat cel mai mult când a fost inclusă o
subcultură lipsită de fitohormoni printr-o subcultură cu concentrație scăzută de tidiazuron (TDZ,
0,01 mg l – 1).
Trageți alungirea. Cea mai bună alungire a lăstarilor, în general, a fost realizată folosind
mediu W (Wdouble) suplimentat cu 0,01 mg l – 1 TDZ în combinație cu 200 mg l – 1
spermidină. În acest fel a fost posibil să se stimuleze alungirea mugurilor din clustere de muguri
axilari derivate din mediul de propagare (Figura 1C). Această combinație a dus, de asemenea, la

5
cea mai bună dezvoltare a acelor pe lăstari (lungimea acului). Pornire cu lăstari lungi de 15 mm,
lăstari înrădăcinați (35-45 mm) s-au dezvoltat după două subculturi (8 săptămâni). Observarea
aranjamentului acului ca măsură pentru dezvoltarea normală a lăstarilor, a devenit evident că
concentrații mai mari de TDZ au inhibat dezvoltarea acului și alungirea lăstarului. Experimentele
de înrădăcinare au dus la concluzia că înrădăcinarea a fost îmbunătățită atunci când numai
mediul nutritiv utilizat direct înainte de înrădăcinare conținea spermidină. Prin urmare, trageți
alungirea după stimularea dezvoltării mugurilor a fost început pe un mediu fără fitohormoni
(prima subcultură, 4 săptămâni) și a continuat cu un mediu care conține TDZ suplimentat cu
spermidină (a doua subcultură, 4 săptămâni) imediat înainte de inducerea rădăcinii.

2.4. Înrădăcinarea

Toate etapele de inducție și dezvoltare a rădăcinilor au fost efectuate la 15-17 ° C și 16-h

perioada de lumină (radiația luminii albe 30 μE m – 2s – 1). A existat o influență remarcabilă din
mediul nutritiv utilizat înainte de înrădăcinare pe procentul de înrădăcinare ulterior. Mediile care
conțin zeatină utilizate înainte de înrădăcinare au scăzut succesul înrădăcinării. Spermidina în
combinație cu TDZ (0,01 mg l – 1) a crescut și procentul de înrădăcinare vitalitatea lăstarilor. În
comparație cu alte conifere (zada, molid norvegian), înrădăcinarea Procesul în țesut a necesitat o
perioadă lungă de până la 7 luni. Înrădăcinarea - inducerea auxinei. Au fost induse lăstari
rădăcinați (aproximativ 30-40 mm în lungime) pentru formarea rădăcinilor pe mediul nutritiv L9
conținând 2 mg l – 1 IBA timp de 2 săptămâni. IBA sa dovedit a fi cea mai bună auxină în
comparație cu NAA (acid naftalen acetic). partea de bază (2 mm) a lăstarilor a fost tăiată înainte
de a fi plasate pe mediu de inducție. Înrădăcinare - inducerea Agrobacterium rhizogenes. Lăstări
pregătite în mod identic în ceea ce privește inducerea auxinei au fost așezate astfel încât bazele
lăstarilor să fie în contact, pentru 24 h cu o soluție de diverse tulpini Agrobacterium rhizogenes
(OD = 0,6 la 600 nm - mediu nutritiv 20E; Werner și colab. 1975) suplimentat cu 19,6 mg l – 1
Marburg) și A.r. ZALF (furnizat cu amabilitate de Dr. P. Lentsch / ZALF Müncheberg).

Formarea și supraviețuirea rădăcinilor a fost cel mai bine folosind tulpina A.r. Marburg în
comparație cu Tratamentul IBA. Formarea calusului, precum și decăderea bazelor de tragere au
fost reduse în timpul procesul de lungă durată al dezvoltării rădăcinilor după utilizarea
Agrobacterium rhizogenes și mai ales al A.r. Tulpina Marburg. Această variantă a tulpinii
Agrobacterium a fost, de asemenea, cel mai bun referitor la comportamentul general al lăstarilor

6
în timpul înrădăcinării. Prin urmare, merită testate mai multe tulpini diferite de Agrobacterium
rhizogenes pentru inducerea rădăcinii, deoarece acești inductori naturali sunt capabili să susțină
întregul proces de dezvoltare a rădăcinilor în unele cazuri mult mai bine în comparație cu o
inducere a auxinei.

7
 Bibliografie:

S. Mohan Jain, H. Haggman, 2007 - Protocols for Micropropagation of Woody Trees and
Fruits, Published by Springer, Olanda