Analiza Cromozomilor Umani

Citogenetica
 Citogenetica – aria geneticii care studiaza cromozomii si
comportamentul lor in timpul diviziunii celulare.

 Citogenetica conventionala – analizeaza numarul si

stuctura tuturor celor 46 cromozomi bandati (kariotip).

 Citogenetica moleculara – analiza unor anumiti cromozomi,

sau a unor loci specifici ai cromozomilor (folosind sonde
ADN marcate fluorescent = markeri)

 KARIOTIP – Un profil vizual organizat al cromozomilor

unui individ sau a unei specii, aranjati dupa numar,
marime, forma si alte particularitati ale cromozomilor
(structura benzilor)
 Metode citogenetice
Kariotipul / kariotiparea
Analiza cromatinei sexuale
(LP-ul precedent)
FISH (LP ulterior)
 Metode de kariotipare
 DIRECTE (NU necesita cultivarea celulelor
studiate in vitro): maduva osoasa, tesuturi
tumorale – au o rata mare de diviziune

 INDIRECTE (necesita cultivarea celulelor in

vitro pentru 48h pana la 3 saptamani,
depinzand de tipul celular: amniocite,
limfocite
 Metoda directa

 Analiza tesuturilor cu un index mitotic mare (maduva

osoasa, ganglionii limfatici, tumori maligne, lichid de ascita
sau lichid pleural, celule ale vilozitatilor choriale, studiul
cromozomilor meiotici in spermatocite, etc)
 Etape:
- Punctie-biopsie (maduva osoasa din stern sau calcaneu
la copii), cu extragerea a aproximativ 1ml maduva intr-o
seringa heparinizata in prealabil (previne coagularea)
- transferul materialului obtinut intr-un tub steril care
contine nutrientii necesari supravietuirii celulelor
- blocarea diviziunii celulare (in Metafaza) cu colchicina
- Procesarea probei si citirea ei folosind microscopul optic
(rezultatele in aproximativ 3-12 h)
 Metoda indirecta
 Foloseste culturi celulare in vitro, pentru a induce celulele
catre stadiul lor blastic (cu nr mare de celule in mitoza)
prin folosirea, pe langa nutrienti, a unor substante precum
phytohemaglutinina (PHA) (induce mitoza)

 Tipurile de celule ce pot fi studiate astfel:

- limfocite din sangele periferic (venos sau capilar)
- fibrocite si fibroblasti din tesutul embrionic tegumentar
- celule epiteliale fetale (amniocite)
- celule trofoblastice
- maduva osoasa (aplazica)
 AMNIOCENTEZA
(diagnostic prenatal)
Amniocenteza
METAFAZA
Tehnici de evidentiere a cromozomilor umani
din limfocite (etape):
-mostra de sange (recipient heparinizat)

-insamantarea si cresterea culturilor celulare (pe medii bogate in nutrienti, cu

adaos de PHA si ser fetal, d.ex. de vitel) 48-72h;37 grade Celsius

-blocarea diviziunii celulare in Metafaza (colchicine)

-tratare rapida cu solutie hipotona (KCl 0.075M)

-Celulele “umflate” sunt fixate (metanol : acid acetic glacial = 3:1),

3:1) pe o
lamela de microscop si apoi uscate

- Lamelele sunt colorate dupa tratament pentru a induce un pattern de

bandare kariotip
Cromozomii metafazici Kariotipuri si grupe cromozomiale

Tipuri de cromozomi in
functie de forma

Nota: Specia
umana NU
dispune de
cromozomi
telocentrici!
Cromozomii umani sunt mai “bogati” sau mai “saraci” in gene
Relatia dintre gene si cromozomi
Evenimente implicand diviziunea celulara si cromozomii
Structura cromozomului
M
E
T
A
F
A
Z
A
BANDAREA CROMOZOMIALA

Scop: pemite identificarea:

- corecta a cromozomilor omologi (M/F)
- anomaliilor structurale discrete (dar mai mari de 3-5 Mb)

Benzile cromozomiale – caracteritici morfologice:

- ocupa aceeasi pozitie si au aceleasi dimensiuni si forma
la cromozomii omologi (cu cateva exceptii normale)
- reprezinta un polimorfism (variatie) respectand legile
mendeliene ale ereditatii
- Sunt numerotati cu cifre arabe de la centromer catre
telomer (pentru fiecare brat)
 CLASIFICAREA INTERNATIONALA A
CROMOZOMILOR UMANI
Dupa lungime (intre 1.5-10 µ)
Dupa pozitia centromerului (vezi mai jos)
Dupa prezenta sau absenta constrictiilor
secundare si a satelitilor

Nota: Specia
umana NU
dispune de
cromozomi
telocentrici!
Tipuri de cromozomi (clasificare
dupa pozitia centromerului)

Cromozomi metacentrici (q≈p)

Cromozomi submetacentrici (p=1/3L)
Cromozomi acrocentrici (p=1/10L)
 GRUPURILE DE CROMOZOMI DIN KARIOTIP
 Group A (mari) = perechile 1, 2, 3 de cromozomi
 perechile 1 si 3 - metacentrici
 perechea 2 – submetacentrici

 Group B (mari, submetacentrici) = perechile 4 si 5

 Group C (medii) = perechile 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 + cromozomul X (metacentric)

 perechea 6- metacentrici
 perechile 7, 8, 9, 10, 11,12 – submetacentrici

 Group D (medii, acrocentrici, cu sateliti) = perechile 13, 14, 15

 Group E (mici) = perechile 16, 17, 18

 perechea 16 - metacentrici
 perechile 17, 18 – submetacentrici

 Group F (mici, metacentrici) = perechile 19, 20

 Group G (mici, acrocentrici, cu sateliti) = perechile 21, 22 + cromozomul Y (acrocentric,

insa FARA sateliti)
Numerotarea benzilor
cromozomiale

Care este cromozomul?

 Metode de bandare
cromozomiala
- Bandarea G (Giemsa)
- Bandarea Q (Quinacrina)
- Bandarea R (Reverse)
- Bandarea C (Centromer)
- Bandarea T (Telomer)
Tipuri de bandari cromozomiale:
1. Benzile G (Giemsa) sunt obtinute prin:
- tratament cu tripsina (proteoliza)
- bandare Giemsa
- evidentiaza regiunile bogate in A and T
- sunt constituite din heterocromatina facultativa
- se suprapun cu benzile Q

In citogenetica, studiul cromozomilor si a anomaliilor lor structurale, fiecare

pereche cromozomiala are un pattern de benzi G care este unic.

2. Benzile Q sunt obtinute prin:

- tratament cu Quinacrina (fluorescenta)
- evidentiaza regiunile bogate in A and T
- sunt constituite din heterocromatina facultativa
 Bandarile G si Q

BENZILE INTUNECATE (BENZILE G SAU Q)

Se coloreaza intens cu cromofori care se leaga preferential de regiunile bogate in AT, cum ar fi Giemsa si Quinacrina
Pot fi comparativ mai bogate in AT
Insensibile la ADNaza (sugereaza inactivarea)
Se condenseaza devreme in timpul ciclului celular dar se replica tarziu
Sarace in gene. Genele pot fi mari deoarece deseori exonii sunt des separati de foarte lungi introni

BENZILE DESCHISE (CORESPUND BENZILOR R)

Se coloreaza slab cu Giemsa si Quinacrina
Pot fi comparativ mai bogate in GC
Sensibile la ADNaza (sugereaza o inalta activitate)
Se condenseaza tarziu in timpul ciclului celular dar se replica devreme
Bogate in gene. Genele sunt comparativ mai mici datorita aglomerarii exonilor.
3. Benzile R (Reverse) sunt obtinute prin:
- denaturarea si renaturarea termica
- colorare Giemsa
- sunt complementare (reverse) benzilor G si Q
- evidentiaza regiuni bogate in G si C

4. Benzile C (centromerice / cu heterocromatina

CONSTITUTIVA) sunt obtinute prin:
- denaturarea termica si tratamentul cu NaOH
- colorare Giemsa
- they evidentiaza centromerele, constrictiile secundare,
regiunea distala (1/3) a Yq
Bandarea C
Bandarea G versus bandarea R

Cromozomul 1 : bandare G, diagrama si bandarea R

5. Bandarea T este utilizata sa coloreze regiunile telomerice.
-Telomerele sunt alcatuite din secvente scurte, repetitive, in
tandem (cap-la-cap) TTAGGG
-Bandarea telomerica (sau terminala) a fost prima data raportata de
Dutrillaux, care a utilizat doua tipuri de denaturare termica controlata, urmata
de colorarea ori cu Giemsa ori cu acridin-orange (fluorescent).
-Benzile T reprezinta aparent un subset al benzilor R, deoarece sunt
mai mici decat benzile R corespondente (in care se incadreaza) si sunt
localizate strict telomeric (Gustashaw, 1991).

Functiile telomerelor:
- mentin stabilitatea cromozomiala
- asigura replicarea completa a cromozomilor
- pierderea telomerelor  deletii terminale  induc translocatii
- fiecare generatie celulara se scurteaza discret la nivelul
telomerelor  “imbatranirea celulara”
 Grupa A (mari)

perechile 1 si 3 – metacentrici
perechea 2 – submetacentrici
Grupa B (mari, submetacentrici)
 Grupa C (medii)

7,8,9,10,11,12
6 - metacentrici
submetacentrici
Grupa D (medii, acrocentrici, cu
sateliti)
 Grupa E (mici)

submetacentrici

metacentrici
Grupa F (mici)

metacentrici
Grupa G (mici, acrocentrici)

cu sateliti
 Heterosomii (cromozomii sexuali)
Y apartine grupei G (este cel mai
mic cromozom, acrocentric, dar
FARA sateliti)

X apartine grupei C (ca marime, metacentric)

METAFAZE vizualizate
la microscopul optic
Bandare G 46,XY
Bandare G 46,XX
Bandarea NOR (regiunile organizatorilor
nucleolari)
–Implica colorarea cu argint (solutie de nitrat de argint)
–Benzile NOR sunt localizate pe bratul scurt(p) al satelitilor
cromozomilor acrocentrici (perechile 13, 14, 15, 20 si 21), langa
constrictiile secundare.
–Colorarea NOR pune in evidenta satelitii.
–Benzile NOR contin gene pentru sinteza ARNr
Indicatii pentru Analiza Cromozomiala
(Kariotipare)
 La copii cu multiple anomalii congenitale
 Retardul mintal (d.ex. Sindromul X fragil la barbati)
 Cupluri cu probleme de reproducere
 Intersexualitate / sex genetic incert XX sau XY
 Tulburari de dezvoltare pubertara
 Hemopatii maligne d.ex. Cromozomul Philadelphia t(9;22)
 Sindroame asociate cu instabilitate cromozomiala (sindrom
Bloom, anemia Fanconi, etc)
 Urmarirea efectelor mutagene ale expunerii profesionale la
diferite substante sau expunerea accidentala la radiatii
ionizante (Cernobil, Fukushima)
 Diagnostic prenatal cand suspectam o boala genetica