BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC 1. Scopul lucrrii Const n nsuirea utilizrii microscopului optic, cu finalitate n vizualizarea i msurarea diametrelor unor celule sanguine. 2. Principiul lucrrii Microscopul este un instrument optic care mrete diametrul aparent al obiectelor, formnd imagini virtuale. Dimensiunea minim ce poate fi distins printr-un microscop este dat de lungimea de und a radiaiei folosite, datorit fenomenului de difracie. n Fig. 2.1 este reprezentat o scal relativ a organismelor biologice i intervalele de msur ale ctorva dintre instrumentele de investigaie.

Fig. 2.1. Scala relativ a organismelor biologice i intervalele de msur ale ctorva dintre instrumentele de investigaie

Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile (la microscopul electronic, lentilele sunt nite cmpuri electrice i magnetice care deviaz fasciculele de electroni) grupate n obiectiv i ocular, prin care mersul razelor este cel reprezentat n Fig. 2.2.

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

Fig. 2. 2 Mersul razelor de lumin prin microscop

Pentru a distinge ntre performanele unor microscoape se compar caracteristicile acestora: 1. Puterea - raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede un obiect prin instumentul optic ( ) i dimensiunea liniar a obiectului pe direcia perpendicular pe axa optic.
2

P=

tg 2 AB

(2.1)

2. Grosismentul sau mrirea unghiular - raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede un obiect prin instumentul optic ( ) i tangenta unghiului sub care se vede un obiect cnd este
2

privit cu ochiul liber aezat la distana optim de citire microscopului (G obiectivului (G ).

ob microscop

= 25 cm

( ). Grosismentul
1 oc

) este egal cu produsul dintre grosismentul ocularului (G ) i cel al

Gmicroscop =

tg 2 tg 1

(2.2)

Gmicroscop = Gob Goc

Relaia dintre puterea i grosismentul microscopului este: G =

P e = 4 4 f1 f 2

(2.3)

unde e este dinstana dintre focarul imagine al lentilei obiectiv i focarul obiect al lentilei ocular, iar f1 i f2 reprezint distanele focale ale obiectivului i ocularului, respectiv (Fig. 2. 2). 3. Puterea separatoare () - inversul distanei separatoare (d ) care reprezint cea mai mic distan la care se pot gsi imaginile a dou puncte care nu apar confundate:

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

1 d

(2.4)

Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de cellalt prin microscop este
d= 1.22 2n sin u

(2.5)

unde reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este indicele de refracie al mediului strbtut de radiaie dintre obiect i obiectiv, u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai ndeprtate de ax care mai ptrund n obiectiv. Pentru a micora aceast distan, adic pentru a mbunti performanele microsopului exist mai multe metode:

- folosirea unei radiaii cu lungime de unda ct mai mic (de exemplu, pentru radiaie
ultraviolet s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0.15 m)

- folosirea unor medii ntre obiect i obiectiv cu indicele de refracie n ct mai mare (microscop
cu imersie)

- folosirea obiectivelor cu deschidere ct mai mare, astfel nct sin u s fie ct mai mare, dar
aceste obiective ridic probleme de construcie datorit aberaiilor de sfericitate. n funcie de ceea ce se studiaz, se pot folosi diferite microscoape (Tabelul 2.1). Microscopul optic folosete unde electromagnetice din domeniul vizibil. Lumina este transmis de-a lungul axului optic al instrumentului, prin preparat, n aceste condiii obinndu-se un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele, pentru a putea fi vzute, se disting pe fondul luminos fie prin opacitate, fie prin culoarea lor. Pentru a se face msurtori se folosesc nite lamele de sticl pe care sunt gradate foarte fin nite scale, numite micrometre care sunt piese auxiliare microscopului. Acestea au dimensiuni cunoscute sau uor de determinat i imaginea lor se poate suprapune peste imaginea obiectului de cercetat. Micrometrele sunt de dou feluri: oculare (sunt aezate n ocularul microscopului i imaginea lor este permanent n cmpul vizual al experimentatorului) i obiective (acestea se aeaz pe platina microsopului n locul preparatului i sunt folosite pentru calibrarea microscopului).

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

Tipul microscopului Microscopul optic

Principiul de funcionare

Sursa de radiaie Radiaie e.m. n vizibil

Mediul dintre prob i obiectiv Aer sau lichid

Natura lentilelor sticl

Focalizare

Ajustarea mririi

Folosete radiaie n vizibil. Imaginile sunt bidimensionale. Se pot observa i celule vii. mprtierea luminii de ctre obiectele microscopice, acestea apar ca nite puncte luminoase pe un cmp ntunecat Transformarea diferenelor de faz aprute ca urmare a detaliilor preparatului n diferene de amplitudine; se pot vizualiza obiecte transparente fr a fi colorate n prealabil Folosete fluorescena proprie a probei; se poate pune n eviden starea fiziologic a unor microorganisme Pune n eviden activitatea optic a unor preparate Folosete fascicule de electroni. Imaginile sunt tridimensionale. Are mrire mare i rezoluie bun. Se zrete conturul specimenului, imaginea este alb-negru. Nu se pot observa specimene vii.

mecanic

Interschimbarea obiectivelor

Ultramicroscopul

Radiaie e.m. n vizibil

Aer sau lichid

Sticl

Mecanic

Interschimbarea obiectivelor

Microscopul cu contrast de faz

Radiaie e.m. n vizibil

Aer sau lichid

Sticl

Mecanic

Interschimbarea obiectivelor

Microscopul cu fluorescen

Radiaie n vizibil, UV

Aer sau lichid

sticl

Mecanic

Interschimbarea obiectivelor

Microscopul polarizant

Radiaie e.m. n vizibil Fascicul de electroni

Aer sau lichid fr proprieti optic active Vid

Sticl

Mecanic

Interschimbarea obiectivelor

Microscopul electronic

Cmpuri magnetice sau lentile electrostatice

Electric; de ex. schimbarea valorii curentului electric prin solenoidul lentilelor obiectiv -

Electric

Microscopul de for atomic

Msoar forele exercitate ntre un ac plasat pe o consol uoar i elastic (cantilever) i prob. Instrumentul scaneaz cu acul proba, iar un aparat de detecie msoar deflexia vertical a cantileverului, indicnd nlimea local a probei. Rezoluia este de 10 pm, i se pot vizualiza probe n aer sau imersate n lichid.

Nu folosete radiaie e.m., nici fascicule de electroni, limitarea fiind dat nu de difracie ci de dimensiune a probei

Aer sau lichid

Tabelul 2.1 Tipuri de microscoape

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

Descrierea microscopului optic Prile componente ale microscopului optic ( Fig. 2. 3) sunt urmtoarele:

1) Piciorul microscopului, constituit dintr-o plac metalic grea care are rolul de a susine fix
microscopul, pe care se afl platina microscopului. Pe aceasta se aeaz frotiul (lamel de sticl pe care se afl preparatul) ce urmeaz a fi studiat. Platina prezint un orificiu central care permite trecerea razelor luminoase i niste orificii laterale n care sunt prini cavalerii cu ajutorul crora frotiul este fixat pe platin. Proba poate fi deplasat pe dou direcii perpendiculare cu ajutorul unor uruburi, deplasarea fiind msurat pe dou scale ataate msuei.

Fig. 2.3 Microscopul optic

2) Tubul microscopului pe care sunt prini ocularul i obiectivul; lui i se poate imprima o
micare ampl, vizibil cu ochiul liber cu ajutorul macrovizei i o micare fin cu ajutorul microvizei. Ocularele de diverse puteri se monteaz la captul superior al tubului. Microscopul poate fi mono sau binocular. n general, ocularele sunt construite din dou lentile i anume aa numita lentil de cmp i lentila ocular propriu-zis. Ele sunt aezate ntr-un tub care se introduce n partea superioar a tubului microscopului. Ocularele sunt de dou tipuri : Huyghens (Fig. 2.4 a)) i Ramsden (Fig. 2.4 b)). Ambele sunt formate din lentile plan-convexe, dar difer prin aezarea acestora, precum i prin mrimea lor.

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

a)

b)

Fig. 2.4 a) Ocularul Huyghens; b) Ocularul Ramsden

Astfel, la ocularul Huyghens lentilele sunt aezate cu convexitatea n jos, ctre obiectiv i lentila ocular este mic n timp ce lentila de cmp este mare. Lentila inferioar face parte din sistemul obiectiv, avnd rolul de a de a clarifica imaginea i de a o forma n planul diafragmei, care limiteaz cmpul optic. Lentila superioar a acestui tip de ocular este, de fapt, o lup care mrete imaginea format n lentila de cmp i d imaginea final (care este virtual i mrit) la 25 cm de ochi. La ocularul Ramsden, numit i ocular ortoscopic, cele dou lentile plan-convexe sunt egale ca mrime i sunt aezate cu convexitatea fa n fa. Imaginea dat de obiectiv se formeaz chiar n planul diafragmei. Acest tip de ocular se folosete pentru determinarea puterii de mrire a microscopului sau pentru cazul n care se fac desene microscopice, deoarece d un cmp de dimensiuni mari. La microscoapele moderne ocularele moderne au mai multe lentile. Obiectivul, care conine un set de lentile centrate, se monteaz n revolverul de la captul inferior al tubului. Revolverul are locauri pentru mai multe obiective i permite schimbarea lor prin rotire. Lentilele obiectivului au asemenea convergene nct s poat fi corectate aberaiile de sfericitate. Lentila inferioar a obiectivului este plan convex avnd faa plan spre obiectiv. Cu ct distana focal a obiectivului este mai mic cu att puterea de mrire este mai mare. Un obiectiv cu putere separatoare mare determin o putere separatoare mare a microscopului. Obiectivele cu putere mare au o vedere de ansamblu foarte bun, n timp ce obiectivele cu putere mai mic sunt mai luminoase. Exist dou tipuri de obiective: uscate i cu imersie. Obiectivele uscate primesc fasciculul de lumin ce trece prin preparat direct prin aer, astfel c o parte din

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

razele trimise de obiect ctre lentila obiectivului se pierd prin fenomenul de reflexie total. Pierderea razelor de lumin datorit acestui fenomen se poate nltura dac ntre preparat i obiectiv se pune o pictur dintr-un lichid (de exemplu ulei de cedru) cu indice de refracie apropiat de cel al sticlei din care este fcut lentila frontal a obiectivului. Se obine astfel un obiectiv cu imersie.

3) Dispozitivul de iluminare este format din: - oglind care are rolul de a dirija razele de la sursa de lumin spre axul optic al microscopului;
prezint o suprafa plan i una concav i este fixat pe un suport, n aa fel nct se poate roti n jurul a dou axe perpendiculare

Fig. 2. 5 Mersul razelor de lumin prin microscop

- condensorul format din 2 sau 3 lentile care concentreaz lumina reflectat de oglind asupra
obiectului; fasciculul paralel de lumin care cade pe condensor este transformat ntr-unul convergent; pentru a obine o imagine clar condensorul se poate deplasa pe vertical pn cnd obiectul se gasete n focarul fasciculului convergent care iese din condensor; razele de lumin, nainte de intrarea n condensor, trec printr-un suport de filtre i o diafragm (apertura cu rol de a controla diametrul bazei "conului" luminos); exist filtre de diferite culori care pot modifica spectrul luminii transmise. n practic, diametrul aperturii poate fi redus uor pentru obinerea unui compromis ntre rezoluie i contrast. Reglarea diametrului aperturii nu trebuie

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

fcut pentru a controla intensitatea luminoas deoarece acest procedeu nu face dect s produc imagini cu contrast mare, dar cu rezoluie sczut.

4) Piesele auxiliare ale microscopului sunt: - micrometrul ocular care este un disc de sticl cu diametrul egal cu diametrul interior al
tubului ocularului pe care sunt trasate niste diviziuni; acest micrometru se aeaz n ocular chiar n planul imaginii date de obiectiv, motiv pentru care el se vede ntotdeauna clar n microscop; n dreptul diviziunilor lui se pot aduce cu ajutorul msuei mobile obiectele ce urmeaz a fi msurate. Micrometrele oculare sunt de mai multe tipuri, n funcie de ceea ce se urmrete a fi msurat (Fig. 2. 6)

Fig. 2.6 Tipuri de micrometre oculare

- micrometrul obiectiv care este o lam de sticl pe care sunt trasate pe o lungime de 1mm, cu
un vrf foarte fin de diamant, 100 de diviziuni. Acest micrometru este folosit pentru calibrarea microscopului. El se aeaz n locul preparatului, urmnd s se fac suprapunerea scalei micrometrului ocular cu scala micrometrului obiectiv, pentru determinarea dimensiunii unei gradaii a micrometrului ocular (Fig. 2.7).

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

Fig. 2.7 Micrometrul ocular i micrometrul obiectiv

- camera clar care este un dispozitiv ce se poate adapta ocularului microscopului i permite
suprapunerea n ochiul observatorului a imaginii unui obiect vzut direct n mrime natural peste imaginea obiectului vzut prin microscop.

- camera de numrare sau hematocitometrul (Fig. 2.8) care este un dispozitiv auxiliar
microscopului cu ajutorul cruia se poate determina numrul de celule dintr-un volum oarecare.

Fig. 2. 8 Camera de numrare

3. Mod de lucru Materiale necesare: microscop optic

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC

- oculare, obiective de diferite puteri - micrometre oculare i obiective - obiecte de msurat

Lucrarea experimental presupune urmtoarele etape:

1) Calibrarea microscopului care se face n cazul n care valoarea diviziunilor micrometrului

ocular nu este cunoscut.

2) Msurarea dimensiunilor obiectelor de studiu.

Pentru calibrarea microscopului se procedeaz n felul urmtor:

- n locul preparatului se pune un micrometru obiectiv cu dimensiuni cunoscute; - cu ajutorul msuei mobile i rotirii ocularului se aduc alturi cele dou scale ce apar n
cmpul aparatului;

- se observ cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt necesare s acopere ntreaga scal a
micrometrului ocular i se determina valoarea dimensiunilor micrometrului ocular.

Fig. 2. 9 a) i b) Calibrarea microscopului; c) Msurarea diametrului unei celule

Odat microscopul calibrat, se poate trece la msurarea diametrelor celulelor sanguine, urmnd paii:

- se aeaz obiectul pe platina microscopului i se fixeaz cu cavalerii; - privind din lateral microscopul, se coboar tubul acestuia folosind macroviza pn cnd
obiectivul de mare putere aproape atinge preparatul;

- se rotete revolverul astfel nct s ajung deasupra probei obiectivul de mic putere;

BIOFIZICA LUCRRI PRACTICE

- apoi, privind prin microscop se clarific imaginea cu ajutorul microvizei;

se rotete din nou revolverul pentru alegerea obiectivului de mare putere i se clarific din nou imaginea, folosind microviza;

- privind n aparat se deplaseaz condensorul cu diafragma complet deschis pn cnd

marginile luminoase coincid cu marginile imaginii obiectivului;

- se manevreaz diafragma condensorului pn cnd marginile cmpului apar nete; - n acest moment apertura condensorului este egal cu cea a obiectivului; - se introduce n ocularul folosit micrometrul ocular; - prin micarea msuei mobile i prin rotirea ocularului, lungimile ce trebuie msurate sunt
aduse n dreptul diviziunilor micrometrului ocular, a cror valoare este deja cunoscut;

- se vor msura diametrele eritrocitelor, fcndu-se apoi calculul erorilor; - valoarea diametrului mediu obinut va fi comparat cu valoarea teoretic acceptat a acestuia
i se va stabili dac diferena dintre cele dou valori este semnificativ; pornind de la aceast diferen se poate atribui hematiilor calificativul de normocitoz, microcitoz sau macrocitoz; comparnd variana calculat pe eantioanele studiate cu valoarea teoretic a acesteia din literatura de specialitate, se va atribui populaiei de hematii studiate calificativul de izocitoz sau anizocitoz;

- pentru dou eantioane de cte 15 hematii fiecare se vor compara mediile calculate stabilinduse dac diferena este semnificativ.

STUDIUL MICROSCOPULUI OPTIC