Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Cinetica reaciilor enzimatice

Coordonator :Profesor Universitar Doctor Rodica Srbu

Indrumtor:Asistent Universitar Doctorand Iuliana Stoicescu
Student :Laura Diana Sandu

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Generaliti despre enzime

Reaciile din organismele vii sunt catalizate de enzime (sau fermeni), care sunt substane
macromoleculare, proteine, cu masa molecular cuprins ntre 104 i 107. Reaciile enzimatice pot
fi: reacii de oxidare, reducere, transfer de grupe sau atomi, reacii de hidroliz, etc.
O protein este rezultatul unei aranjri, dup un anumit cod, a resturilor de amino-acizi.
Pe suportul proteic sunt fixate grupe prostetice, cu rol de centri activi, grupe de natur aminoacid, ce au rol determinant n aciunea catalitic a enzimei i care nu pot fi separate prin simpl
dializ [1].
n reaciile catalizate enzimatic, moleculele reactanilor sunt denumite substrat. Enzima
se combin cu substratul care apoi se descompune n produi de reacie cu eliberarea
catalizatorului enzimatic.
Cinetica reaciilor catalizate enzimatic este complex.
Ea decurge printr-un numr de etape elementare, fiecare implicnd interaciuni complexe
ntre mai multe grupri funcionale ale enzimei i moleculele de substrat.
Enzimele pot prezenta, [1]:
- Specificitate absolut de exemplu ureaz catalizeaz numai cataliza ureei;
- Specificitate de grup de exemplu enzimele proteolitice catalizeaz hidroliza
peptidelor;
- Specificitate stereospecific cnd sunt catalizate numai anumite forme ale
moleculelor reactante de exemplu enzimele proteolitice catalizeaz numai hidroliza
peptidelor formate din aminoacizi n configuraia L (levogir)
Caracteristicile unei ezime sunt cele specifice unui catalizator i anume, [3]:
- n urma unei reacii enzimatice, enzima nu sufer o modificare chimic net;
- Orice enzim prezint o anumit specificitate, ea se leag de substrat prin centri activi
n funcie de afinitatea sa fa de acea poziie a substratului.
- Enzima crete viteza anumitor reacii chimice numai dac acele reacii sunt posibile
termodinamic;
- n cazul unui echilibru, enzima crete numai viteza de atingere a echilibrului, dar ea
catalizeaz att reacia direct ct i reacia invers;
- O enzim micoreaz energia de activare fr a modifica bilanul energetic al reaciei
globale.
n catalizele enzimatice, n absena unor mici cantiti din anumite substane numite
Cofactori, anumite enzime sunt inactive. Ionii metalici: Fe2+, Zn2+, Cu2+, Co2+ sunt cunoscui
drept cofactori, [1,2]. Dac cofactorul este o molecul organic ea este denumit coenzim.

Ecuaii de vitez n cataliza enzimatic

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Aa cum am artat mai sus enzimele prezint o mare specificitate. Activitatea lor n
condiii optime se exprim fie prin viteza de reacie, fie prin numrul TO. Eficiena mare a
enzimei implic folosirea acesteia n cantiti foarte mici comparativ cu cantitile de substrat.
Astfel, n tratrile cinetice, se poate aplica aproximaia staionaritii enunat de Briggs
Haldane n 1925, [4,5].
Conform postulatului strii staionare n afara unei foarte scurte faze iniiale (de ordinul a
cteva secunde), necesar amestecrii enzimei cu substratul, concentraia complexului enzim
substrat rmne constant pn ce substratul rmne aproape n ntregime epuizat.
Cel mai simplu sistem enzimatic funcioneaz dup schema [3]:

Tratarea cinetic conduce la viteza iniial a formrii produsului de reacie v0, dat de
ecuaia:

( ddt[ P] )

v0 =

t =0

=k 2 [ ES]

(9.2)

Complexul enzim substrat [ES] poate fi determinat din ecuaia de vitez pentru
procesul su de apariie:
d [ES ]
=k 1 [ E ][ S ] k 1 [ ES ] k 2 [ES ]
dt

(9.3)

n accepia lui Michaelis Menten [4.6], echilibrul din prima etap a procesului global
din ecuaia (9,3) se poate produce numai dac k1>>k2. Din constanta de disociere a complexului
ks, se poate obine [E][S]. Ecuaia (9,3) de formare a complexului enzim substrat devine:
d [ES ]
=( k 1 k sk 1 k 2 ) [ ES]
dt

(9.4)

Ipoteza lui Michaelis Menten nu mai corespunde totdeauna cu realitatea. Dar n

literatura de specialitate este regsit denumirea de complex Michaelis dat complexului substrat
enzim. n accepiunea postulatului strii staionare ns, trebuie respectat condiia:
d [ES ]
=0
dt

(9.5)

Introducnd ecuaia de bilan pentru enzim se obine:

[ Etot ]=[ E ] +[ES ]

2013 grupa 4 Semestrul II

(9.6)

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Unde: [E] este concentraia enzimei libere [ES] concentraia enzimei legat n complex,
iar [Etot] este concentraia total a enzimei.
Viteza de apariie a complexului substrat-enzim este:
d [ES ]
=k 1 [ E ][ S ] k 1 [ ES ] k 2 [ ES ] =0
dt

(9.7)

Concentraia complexului substrat-enzim este:

[ ES ] =

k 1 [ S ] [Etot ]
k 1 +k 2 +k 1 [S]

(9.8)

Ecuaia cinetic a reaciei red viteza sub forma:

( ddt[ P ] )

v0 =

t =o

k s [ S ] [ E tot ] k s [ S ] [E tot ]
=
k1+ k 2
k M +[S]
+[S ]
k1

(9.9)

unde kM se numete constanta lui Michaelis:

k M=
-

k 1 +k 2
k1

(9.10)

Dac [S] >> kM, atunci n ecuaia vitezei se poate neglija kM i ecuaia devine:
v 0 =(

d [ P]
) =k [ E ]
dt t =0 2 tot

(9.11)

n aceste condiii [Etot] = [ES]max iar viteza de reacie iniial la valoarea maxim vmax:
v max =k 2 [ E tot ]

(9.12)

v max
este un indice al reactivitii compusului enzim
[E tot ]
substrat. Viteza de reacie se poate scrie acum i sub forma:
'
Conform ecuaiei (9.12) k 2=

v 0 =(

v [ S]
v
d [ P]
) = max = max
dt t =0 [ S ] + k M k M
+1
[S ]

Aceasta este o ecuaie de baz n cinetica enzimatic.

- Dac se considera [S]=kM rezult:
2013 grupa 4 Semestrul II

(9.13)

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

v 0 =(

v
d [ P]
) = max
dt t =0
2

(9.14)

Constanta kM - constanta lui Michaelis are semnificaia constantei de disociere a

complexului enzim-substrat, fiind o msur a stabilitii complexului:
k M=

k 1 +k 2
k
=k s + 2
k1
k1

(9.15)

Cu ct kM are o valoare mai mica (i deci i kM) cu att afinitatea enzimei pentru substrat
este mai mare.

Ecuaia de vitez n cinetica enzimatic n prezena unui

inhibator
Reaciile enzimatice pot fi inhibate de anumite substane, n principal prin dou
mecanisme: competitiv i necompetitiv. n cazul inhibiiei competitive, inhibitorul se combin cu
enzime la centrul activ la care acioneaz substratul, blocndu-l prin urmtoarea reacie ce
decurge n paralel cu ecuaia (9.1a):

(9.16)
Viteza iniial de reacie, n aceste condiii, devine:
v 0,max

v 0, I =
0

1+

[I ]
k
1+ 0
[S]
k1

(9.17)

Valorificarea ecuaiei (9.17) prin reciproca sa reprezentat grafic n sistemul

1
v0

I0

1
funcie de
(pentru o concentraie constant de inhibitor), permite calcularea constantei de
[S ]
echilibru K I
Dixon a realizat ns valorificarea ecuaiei (9.17) prin reprezentarea grafic n sistemul
funcie de pentru o concentraie constant a substratului S, [7,8]. Inhibitorul necompetitiv se
2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

combin cu enzima n alt parte dect centrul activ, rmas liber pentru substrat, dar complexul
trimolecular care se formeaza ESI este nereactiv.
Sistemul de reacie n acest caz este:

(9.18)

Tratearea cinetic conduce la viteza iniial sub forma:

V 0, I =
nc

v 0,max , I
k 2 [Etot ]
=
k
k
[I ]
1+ M
1+ M 1+ 0
[S ]
[S]
k1

nc

)(

.19)

Din care rezult ca viteza iniial maxim depinde de concentraia inhibitorului necompetitiv.
Reciproca ecuaiei (9.19) permite valorificarea propus de Lineweaver Burk, [8,9]:
1
v 0, I

=
nc

1
v 0, max , I

+
nc

k1
v 0, max, I [S ]

(9.20)

nc

1
1
n funcie de
,[8,9].
v 0, I
[S ]
Din panta dreptei se poate obine k1, iar din ordonata la origine se obine v0max.
Ecuaia (9.20) d o reprezentare liniar a lui

nc

Unele reacii enzimatice prezint o cretere a vitezei iniiale cu creterea concentraiei

substratului, dar dup ce atinge valoarea maxim ncepe s scad datorit fenomenului de
autoinhibiie, care este o inhibiie necompetitiv prin strat.

Influena diverilor factori asupra reaciilor catalizate enzimatic

Experiena arat c reaciile catalizate enzimatic sunt influenate de o serie de factori ce
nu in de structurile enzimei sau ale substratului. Dintre acetia cei mai importani sunt: pH-ul i
temperatura de reacie.
2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Cnd pH-ul mediului se modific, viteza reaciei catalizate enzimatic trece printr-un
maxim, fig. 9.1 numit pH optim. Orice enzim prezint o activitate optim la un
anumit pH relativ mic n jurul celui optim, pentru care forma activ a enzimei nu este
distrus:
(9.21)

Fig. 9.1 Variaia vitezei de reacie cu

pH-ul mediului n cataliza enzimatic

La un pH dat cantitile relatice din cele trei forme, depind de valorile constantelor de disociere
ka ale formei acide EH2 i kb ale formei neutre EH. Se regsesc dou soluii:
- La un pk mare domeniul de pH este larg, iar enzima acioneaz n forma sa neutr
EH;
- La un pk mic domeniul de pH este foarte ngust.

Fiecare dintre cele trei forme pot interaciona cu substratul formnd un complex enzim-substrat
conform schemei:

Euler, Josephson i Myrrback, [10], au propus o schem n care forma EH este singura form
activ i este implicat n echilibrul de formare a complexului enzim-substrat:

Din schem rezult c se poate intercepta curba experimental ce prezint un maximum.

n soluii acide, echilibrul este deplasat spre stnga, enzima existnd n principal ca EH2 i
complex EH2S. ntruct forma reactiv este EHS, viteza va fi mai mic. n soluii bazice vor
2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

predomina formele E i ES, iar viteza va fi din nou mic. La un pH intermediar, pH-ul optim,
concentraia EHS i viteza vor avea valoarea maxim. n majoritatea cazurilor valoarea maxim
a pH-ului este n apropiere de domeniul neutru pH=7. Schema de reacie conduce la ecuaia
vitezei:
+
H

+
H

+
H

k 'a
1+

+[S ]

k
1+ a

k
k 2 [ E tot ] [S]
v0 H=

(9.23)

Pentru valori mai mici ale lui [S] se pot determina constantele de disociere ka i kb, iar n
condiiile unei concentraii mari de substrat, cnd enzima este saturat, se determin ka i kb.
Aceste valori sugereaz natura grupelor din complex i din enzima liber, dnd informaii despre
grupele active.
Un alt factor care influeneaz cataliza enzimatic este temperatura.
Experiena arat c viteza de reacie trece printr-un maxim cnd temperatura crete, aceasta se
numete temperatura optim. La temperaturi n jur de 35oC sau mai mari, de obicei enzima sufer
o dezactivare rapid n timpul determinrilor cinetice. Procesul inactivrii enzimei se datoreaz
denaturrii proteinei. Denaturarea se produce de cele mai multe ori ireversibil, astfel constanta de
vitez crete mai puin sau chiar scade.
Influena temperaturii asupra vitezei de reacie este de natur complex. La temperaturi joase (la
care dezactivarea nu are loc) poate fi studiat acest efect al temperaturii asupra catalizelor
enzimatice.
Ecuaia lui Arrhenius se poate aplica i n acest caz pe domenii restrnse de temperatur. Din
ecuaia:

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

v =k 2 [ Etot ]

(9.24)

EIRT
Unde k2 depinde de T, dup ecuaia lui Arrhenius ( k 2= Ae
) , cnd se lucreaz la
concentraie constant de enzim.
Reprezentarea v = f(1/T) este o dreapt, ceea ce se verific n multe cazuri. La concentraii mici
de substrat:

v=

k2
[ E ] [S]
k M tot

(9.25)

Ecuaia (9.25) nu d o dependen simpl a vitezei de temperatur. Sunt dou cazuri limit:
1. Cnd k2 >> k-1 viteza va avea ecuaia v=k1[Etot][S]; reprezentarea v = f(1/T) este o dreapt
i energia de activare calculat din pant va corespunde lui k1;
k1 k s
2. Cnd k-1 >> k2 viteza va avea ecuaia v =
[ E ] [S ] , iar energia de activare
k 1 tot
obinut din panta dreptei v = f(1/T) va fi:
Ea =E1+ E2E1

(9.26)

Unde cele trei energii de activare corespund celor trei procese elementare, iar Ea este
energia global de activare.

Sisteme farmaceutice obinute prin reacii n cataliza enzimatic

Obinerea prin biosintez a penicilinelor G i V

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Penicilina G (benzil-penicilina) folosit n practica terapeutic sub form de sare

de Na sau K, i penicilina V (fenoximetil-penicilin) folosit sub form de acid liber sau
sare Na i K, sunt antibiotice de biosintez larg utilizate, [11].
Benzoil-penicilina (penicilina G), este o substan alb, cristalin, cu punct de
topire 800C, solubil n ap i solveni organici, avnd trei atomi de carbon asimetrici (C3,
C5, C7) i este optic activ, 20
=+2410. Este activ bacteriostatic i bactericid fa de
D
bacilii i cocii gram pozitivi.
Fenoximetil-penicilina (penicilina V) este o substan alb, insolubil n apm
solubil n solveni cu punct de topire ntre 1180C i 1200C i are activitatea optic,
=+1930.
20
D
Tehnologia de obinere este comun tuturor atibioticilor de biosintez i cuprinde
urmtoarele faze:
o Pregtirea mediilor de cultur i sterilizarea lor;
o Fermentaia biochimic;
o Filtrarea soluiilor native;
o Separarea i purificarea penicilinelor.
Fiecare faz din procesul de fabricaie necesit studii cinetice, termotehnice, de
bilan de materiale i de control a parametrilor de compoziie (temperatura, pH-ul
mediului, etc.) pentru proiectarea i realizarea lor n ideea obinerii unor procese cu
randamentul dorit.
n exemplificarea ce ne intereseaz, fermentaia biochimic pentru procesul de
biosintez enzimatic se realizeaz cu participarea unor specii de microorganisme din
clasa Penicillium i Aspergillus i anume tulpina P. Crysogenum Q 176.
Compoziia mediului de cultur are un rol hotrtor pentru procesul de biosintez,
ntruct microorganismele au nevoie pentru dezvoltarea lor de surse de hidrani de carbon
(glucoz i lactoz), surse de azot, substane minerale ( CaCO3, NH4NO3, Na2SO4,
MgSO4, KH2PO4, ZnSO4) i precursori.
Precursorii sunt substane care dirijeaz procesul de biosintez ctre o anume
penicilin, constituind catena lateral a penicilinei respective. Pentru penicilina G se
utilizeaz ca precursori fenilacetamida sau acidul fenilacetic, iar pentru penicilina V se
utilizeaz acidul feoxiacetic.
pH-ul mediului influeneaz viteza reaciilor enzimatice, permeabilitatea
membranelor celulare i gradul de ionizare a srurilor.
Valoarea optim a pH-ului este cuprins ntre 6,4 7.
Biosinteza unor molecule aa de complexe, cum sunt penicilinele, necesit un flux
de energie din exterior, procesul fiind endoterm, biosinteza propriu-zis nu se poate
realiza dect dac se desfoar simultan i procese de oxidare a hidranilor de carbon,
care constituie principala surs de energie.
Cum viteza de utilizare a hidranilor de carbon respect ordinea: glucoz > acid
lactic > lactoz, nseamn c n faza de cretere a masei celulare se consum glucoz, iar
n perioada de formare a penicilinei se consum lactoz.
n concluzie, mediul de cultur trebuie s asigure necesarul de glucoz i lactoz
pentru desfurarea normal a biosintezei.
2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Cinetic, viteza procesului de biosintez enzimatic a penicilinei este descris de

ecuaia Michaelis Menten:
dC
v C
v = p = max s
(9.27)
d k M + C s
Unde : v este viteza de acumulare a penicilinei vmax este viteza maxim de formare
a penicilinei, kM - constanta Michaelis Menten, Cs concentraia substratului i de
ecuaia Monod, [11]:
= max

Cs
k s +C s

(9.28)

Unde este viteza specific de cretere a masei celulare, max este viteza maxim
de cretere a masei celulare iar ks, reprezint constanta de saturaie Monod.
Din tratarea cinetic a proceselor privind viteza de formare a penicilinelor sau de
acumulare a masei celulare, funcie de concentraia substratului se pot deosebi trei
categorii:
1. Concentraia substratului limitativ este foarte mare comparativ cu constantele
ks i kM, ceea ce face ca viteza procesului s fie maxim
v =v max i =max

(9.29)

2. Concentraia substanei este apropiat ca valoare de constantele sistemului (ks

= Cs i ks = Cs) i avem:
1
1
v = v max i = max
2
2

(9.30)

3. Concentraia substratului este foarte mic (Cs << ks i Cs << kM) iar viteza
procesului este proporional cu concentraia de substrat.
Necesarul de azot pentru formarea grupelor aminice i biosinteza aminoacizilor
este asigurat prin srurile de amoniu, aminoacizii i peptidele din extractul de porumb.
Substanele minerale sunt i ele vitale n procesul de cretere a masei celulare, ele
influeneaz permeabilitatea membranei celulare, echilibrul ionic i activeaz sistemele
enzimatice.
Un alt factor de care trebuie s se in cont este faptul ca biosinteza penicilinei
este un proces aerob. Alimentarea cu oxigen trebuie s se fac cu o vitez controlat,
astfel nct s se asigure condiiile pentru atingerea vitezei maxime de cretere a masei
celulare. Se constat practic c viteza de dizolvare a oxigenului crete cu ajutorul
2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

agitatorului mecanic care disperseaz bulele de aer i intensific transferul n mas al

oxigenului, dar aceasta nu poate depi anumite limite deoarece ajunge la deteriorarea
mecanic a biomasei.

Temperatura este un parametru care intervine mult n aceast biosintez. La

pregtirea mediilor de cultur, care se face n instalaii prevzute cu serpentine de
nclzire-rcire, se asigur la nceput o temperatur de 50 600C, apoi se adaug
extractul de porumb, substanele minerale i hidraii de carbon (glucoza i lactoza).
Adesea glucoza i lactoza se dizolv n ap i se sterilizeaz separat pentru evitarea
bazelor Schiff, care sunt nedorite.
Mediul de cultur astfel pregtit se sterilizeaz prin nclzirea n coloan la
1241260C care se menine 10 12 minute i apoi se rcete la 60 650C. La aceast
ultim temperatur amestecul este trimis n fermentatorul intermediar i cel de regim.
Relaia timp temperatur se poate regsi n figura 9.2. Din figur rezult c degradarea
mediului de cultur este favorizat mult de factorul timp iar sterilizarea de factorul
temperatur. Asta nseamn c soluia optim se obine cnd se conduce procesul de
sterilizare la temperaturi mai ridicate i la timpi mai scuri. Procesele de inactivare a
penicilinelor G i V au necesitat i ele studii cinetice. Urmrind acest proces de inactivare
n mediul acid C.Oniscu [11], constat c valorile constantelor de vitez la inactivarea
penicilinelor G i V difer foarte mult. Valorile energiilor de activare sunt ns foarte
apropiate.
Din

figura 9.3 reiese variaia log k cu 1/T la hidroliza penicilinelor G i V (linii continui i
respectiv ntrerupte).

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Se confirm astfel c reducerea vitezei de inactivare n mediul acid al penicilinei

V n comparaie cu penicilina G este determinat de scderea factorului preexponenial
din ecuaia lui Arrhenius i nu de valoarea energiei de activare.
n mediu bazic, la pH = 910, Oniscu arat c viteza de inactivare a penicilinei V
este de 2,2 mai mare dect a penicilinei G. Aceste aspecte sunt importante la separarea
celor dou peniciline din soluiile apoase obinute la fermentaie
Alte exemple de procese enzimatice sunt:
- Sinteza unor antibiotice cu aciune citostatic cum sunt Rubomycina i Mitomicina C
Rubomyicina (Daunomicina, Daunorubicin, Rubidomycina) este un antibiotic produs
de microorganismul Streptomyces peucetius, varianta carneus, pe un mediu de cultur
ce conine glucoz 4%, proteine 5%, NaCl 0,2%, KH2PO4 0,1%, CaCO3 0,1% i
adaosuri de MgSO4, Zn, Cu printr-o tehnologie asemntoare tuturor antibioticelor,
[11]. Se folosete sub form de clorhidrat n boala Hodgkin, n leucemii acute i n
sarcoame. Mitomicina C se obine prin cultivarea microorganismului Streptomyces
caespitosus pe un mediu nutritiv ce conine hidrai de carbon, surse de azot organic i
anorganic i microelemente. Fermentaia se realizeaz n condiii obinuite, iar
separarea produsului ce se gsete n soluie, se face prin filtre i prin extracie.
Deoarece mitomicina C este degradat foarte repede, n biomasa obinut dup
fermentaie se inactiveaz enzima prin tratare cu 0,1% lauroil de sodiu, cu asigurarea
condiiilor optime de filtrare. Separarea mitomicinei C se face din filtrat cu acetat de
butil, iar din extract se realizeaz prin acidulare cu H2SO4 4-5%. Urmeaz apoi
purificarea i separarea sub form de baz pentru utilizarea n practica terapeutic.
Acest medicament se utilizeaz n terapia diferitelor forme de cancer, avnd
proprieti alchilante.
- Obinerea Vitaminei B2 (Riboflavina, Lactoflavina, 6-7- dimetil-9-D ribidilizobioxazina) prin biosintez enzimatic pe tulpini de Ermothecium Ashbji ntr-un
mediu ce conine proteine i hidrai de carbon, [11]. Separarea din soluia apoas
obinut la fermentaia enzimatic ce se face prin reducerea chimic sau biochimic la
dihidroriboflavin, care este insolubil n ap. Ea apoi se filtreaz, se usuc i se
reoxideaz cu aer i ap oxigenat.

2013 grupa 4 Semestrul II

Univerditatea Ovidius din Constanta Facultatea de Farmacie

Vitamina B2(1), este un derivat de izoaloxazin, labil la lumin att n mediu bazic
cnd se formeaz lumiflavin ,(2) ct i acid cnd se formeaz lumicrom, (3).
Riboflavina are proprietatea de a se reduce reversibil formnd un leucoderivat. Vitamina
B2 este o component a coenzimei flavoproteinelor existente n toate celulele. Ea are un
rol foarte important n procesele enzimatice din organism, funcia sa biologic de
catalizator bazndu-se pe transferul de hidrogen ntre sistemele enzimatice donoracceptor, conform schemei:

2013 grupa 4 Semestrul II