MICROBIOLOGIE SUBIECTE EXAMEN- rezolvate

1.Celule eucariote i procariote, caracteristici comparative

Din punct de vedere al nucleului, la celula eucariota, acesta prezinta membrana, are mai multi cromozomi, prezinta aparat mitotic si este tipic, prezentand nucleol. Nucleul celulei procariote nu prezinta membrana, are un singur cromozom circular, nu este tipic, ci apare ca nucleoid si ii lipseste aparatul mitotic. Citoplasma la celula eucariota prezinta reticul endoplasmatic, mitocondrii, lizozomi, ribozomi 80S. La nivelul mb citoplasmatice regasim steroli. Citoplasma celulei procariote prezinta ribozomi 70S, insa acesteia ii lipsesc mitocondriile, lizozomii si reticulul endoplasmic. Membrana citoplasmatica nu prezinta steroli, exceptie facand Mycoplasma. Peretele cellular la eucariote este absent sau format din chitina sau celuloza,lipsind la acest nivel glicopeptidele. La procariote, peretele cellular are o structura complexa prezentand glicopeptide, proteine, lipide, etc. Diviziunea la celula eucariota se face prin mitoza, iar la celula procariota se face prin diviziune directa(binara). Celula eucariota nu prezinta capsula, insa regasim capsula adesea la celula procariota.

2. Clasificai bacteriile dup form i dispunere exemple

n raport cu forma lor deosebim 4 categorii de bacterii: rotunde (cocii), alungite (bacili), ncurbate (spirili, spirochete, vibrioni) i filamentoase (actinomycetele). cocii sunt bacterii rotunde (genul Staphylococcus), ovalare (genul Streptococcus), lanceolate (specia Streptococcus pneumoniae), reniforme (genul Neisseria) cu de 0,8 - 1; bacilii sunt bacterii cu form alungit de bastona cu dimensiuni ntre 1,5 - 10. La bacili este important examinarea extremitilor, aspectul acestora avnd rol n identificarea lor. Astfel, bacilii pot prezenta capetele rotunjite (familia Enterobacteriaceae), tiate drept (Bacillus anthracis - bacilul crbunos), mciucate (Corynebacterium diphteriae - bacilul difteric), n form de suveic (Fusobacterium); cocobacilii sunt bacterii uor alungite, fiind forme intermediare ntre coci i bacili (Yersinia pestis, Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae); vibrionii sunt bacterii ncurbate n form de virgul (Vibrio cholerae); spirilii sunt bacterii spiralate avnd 1-2 spire rigide (Spirillum volutans); spirochetele sunt bacterii spiralate cu corpul flexibil avnd 12-20 de spire (Treponema pallidum), foarte multe spire strnse (Leptospira) sau 2-3 spire (Borrelia): actinomicetele sunt bacterii foarte asemntoare fungilor i formeaz filamente sau hife lungi i ramificate care se rup, rezultnd forme bacilare (Actinomyces). Aezare Bacteriile sunt organisme unicelulare care se multiplic prin diviziune binar. La unele specii, dup diviziune urmeaz separarea complet a celulelor fiice, rezultnd bacterii izolate. La alte specii, dup diviziune, celulele fiice rmn legate ntre ele, grupndu-se n mod caracteristic datorit unei substane vscoase dispus fie pericelular, fie localizat n anumite regiuni determinnd diferite tipuri de aezare a celulelor. Aezarea bacteriilor permite uneori recunoaterea genului, sau chiar a speciei, prin examinarea la microscopul optic a preparatelor colorate efectuate din culturi, sau direct din produsul recoltat de la pacient.

Cocii se aaz: n grmezi sau asemntor unei ciorchini de struguri ca, de exemplu, germenii din genul Staphylococcus; n tetrade la genul Micrococcus; n baloturi de cte 8 coci orientai n cele 3 direcii ale spaiului la genul Sarcina; n lanuri la genul Streptococcus; n diplo, ca dou flcri de lumnare care se unesc prin bazele lor, la specia Streptococcus pneumoniae; n diplo, ca dou boabe de cafea care se privesc fa n fa prin concavitile lor ca, de pild, la Neisseria gonorrhoeae (gonococ) i Neisseria meningitidis (meningococ); izolai, care nu sunt de interes medical. Bacilii se aaz: cel mai adesea izolai i n poziii ntmpltoare unul fa de cellalt ca, de exemplu, majoritatea bacililor gram-negativi; grupai cte doi (diplobacili) sau n lanuri scurte ca, de exemplu, genul Klebsiella; dispui n lanuri ca bacilii din genul Bacillus (bacilul crbunos); dispui n mod caracteristic sub forma unor majuscule sau litere chinezeti cum sunt bacilii difterici (Corynebacterium diphteriae); n palisad, ca scndurile unui gard (bacilii difterimorfi).

3.Enumerati componentele constante si facultative ale celulei bacteriene Nucleu bacterian este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o struct primitiva in comparative
cu nucleul celulelor eucariote si reprezinta 2% din greutatea uscata a bacteriei.

Citoplasma system coloidal, alcatuit din 80% apa , in care se gaseste o cantiate mare de molecule organice, ioni anorgnici, enzyme, ARN, vacuole si incluzii. Mezozomii struc membranare care se form prin invaginarea membrane citoplasmatice sub forma de buzunar sau in deget de manusa, prezente la bacteriile gram + si ocazional la cele gram -. Peretele cellular comp celulara obligatorie care inconjoara mb citoplasmatica; struct rigida,specifica bacteriilor. Capsula invelis compact, intim legat de celula bacteriana, cu o latime de cel putin 0.2um. Cili sau flagelii bacterieni apendici filamentosi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea in citoplasma bacteriana; servesc ca organe de locomotie. Pili bacterieni apendici filamentosi,rigizi,mai scurti decat flagelii, in numar mare si cu dispozitie in general peritricha; in general la bacteriile gram -. Sporii forme primitive de diferentiere celulara, cu rezistenta crescuta la factorii de mediu si care apar endocelular in conditii nefavorabile de viata.

4. Structura peretelui la bacteriile Gram pozitive i Gram negative

Component celular obligatorie care nconjoar membrana citoplasmatic, peretele celular este o structur rigid, specific bacteriilor. El este format dintr-un strat bazal, asemntor la toate bacteriile i un strat al structurilor superficiale, foarte difereniat, n funcie de care bacteriile manifest caractere tinctoriale diferite: bacterii gram - pozitive, gram- negative i acido-alcoolorezistente. Structura stratului bazal. Peptidoglicanul sau mureina este structura chimic responsabil de rigiditatea peretelui celular i care asigur forma i rezistena mecanic a bacteriei. Prezent la toate bacteriile, el const dintr-un schelet, format din molecule lungi paralele polizaharidice de N-acetil-glucozamin i acid N-acetil-muramic. Moleculele de acid N-acetil-muramic din lanurile vecine sunt legate ntre ele prin puni polipeptidice, transversale, a cror structur difer la bacteriile gram- pozitive de cele gram-negative i chiar de la specie la specie. Astfel, de fiecare molecul de acid N-acetil-muramic se leag un tetrapeptid ce conine D i L aminoacizi. De exemplu, tetrapeptidul la Staphylococcus aureus este format din L-alanin - D-glutamin - L-lizin - D-alanin, iar la bacteriile

gram negative conine acid diaminopimelic. La bacteriile gram - pozitive dou tetrapeptide de pe 2 lanuri paralele nvecinate sunt legate printr-un pentapeptid. La bacteriile gram - negative, tetrapeptidele se leag ntre ele printr-o simpl legtur peptidic. Menionm c acidul diaminopimelic i acidul N-acetil-muramic sunt componente care nu au fost gsite n natur dect la bacterii. Structura stratului structurilor speciale. Deosebim 3 tipuri de structuri speciale: gram-pozitiv, gram-negativ i acido-alcoolorezistent. La bacteriile gram - pozitive, peptidoglicanul reprezint 50-90% din greutatea uscat a peretelui celular, are o grosime de 15-30 nm i conine pn la 200 de lanuri paralele de murein. Stratul structurilor speciale este redus i alctuit din polimeri hidrosolubili care sunt acizii theicoici: acidul ribitoltheicoic i gliceroltheicoic. Acetia pot ptrunde pn la membrana citoplasmatic legndu-se covalent de aceast - acizii theicoici de membran sau numai pn la perete - acizi theicoici de perete. Ei reprezint antigenele de supafa ale bacteriilor gram-pozitive. Peretele celular al bacteriilor gram-pozitive este sensibil la aciunea lizozimului care rupe legturile dintre acidul N-acetil muramic i N-acetilglucozamin i a penicilinei care nhib sinteza peptidoglicanului. La bacteriile gram-negative, peptidoglicanul are o grosime de 4-5nm, reprezentnd numai 10% din greutatea uscat a bacteriei. Stratul superficial este ns mult mai complex dect la bacteriile gram pozitive fiind alctuit dintr-o membran extern, lipoproteine i lipopolizaharidul de perete. Membrana extern este format dintr-un strat dublu fosfolipoproteic ce cuprinde o cantitate foarte mare de molecule proteice. Aceste proteine, bine definite la majoritatea speciilor bacteriene, sunt denumite Omp (outer membrane proteins) sau Momp ( major outer membrane proteins). Membrana extern se leag de protoplast prin intermediul unei lipoproteine i a proteinei OmpA din membrana extern. Proteinele nespecifice ale membranei externe cu funcie de porine, cum sunt trimerii OmpF i OmpC, delimiteaz nite canale umplute cu ap prin intermediul crora pot difuza n spaiul periplasmic substane hidrosolubile. Proteinele specifice au funcii de transport pentru anumite substane, unele dintre ele fiind i receptori pentru bacteriofagi. Proteinele de suprafa pot avea la unele bacterii rol n patogenitate, ca de exemplu cele 7 proteine de suprafa al shigellelor care le asigur invazivitatea. Deasupra membranei externe a bacililor gram-negativi se afl lipopolizaharidul de perete (LPZ) sau endotoxina bacililor gram-negativi. LPZ este o toxin termolabil, care se elibereaz n mediul nconjurtor de ctre bacteriile gram-negative numai dup liza lor i foarte reactiv n organismul gazd. Astfel, lipidul A produce febr, activeaz mecanismele aprrii antiinfecioase i n exces produce ocul endotoxic cu evoluie grav, chiar fatal. Spaiul periplasmic. Sistemul structural dublu al peretelui celular la bacteriile gram-negative creeaz un compartiment ce se ntinde de la membrana celular pn la membrana extern, numit spaiu periplasmic. El conine peptidoglicanul i un gel care favorizeaz nutriia bacteriei prin coninutul n enzime degradative ca, de pild, fosfataze, nucleaze, proteaze etc. Tot aici sunt prezente enzimele de inactivare ale unor antibiotice cum sunt beta-lactamazele i cefalosporinazele.

5. Rolul peretelui bacterian

Funciile peretelui celular: asigur forma, rezistena mecanic i osmotic a bacteriei; asigur protecia membranei citoplasmatice fa de presiunea intern a celulei bacteriene, care este foarte mare: 5-6 atm la E. coli, 20-30 atm. la S. aureus; regleaz traficul molecular de perete n ambele sensuri, deci schimbul de substane dintre bacterie i mediul nconjurtor, fiind permeabil pentru molecule cu o GM mai mic de 10.000 daltoni i cu un diametru mai mic de 1nm;

 stocheaz unele enzime n spaiul periplasmic la bacteriile gram-negative ce vor fi eliberate dup necesiti, spre deosebire de bacteriile gram-pozitive care i elimin enzimele direct n mediul extern; prezint receptori pentru bacteriofagi; este sediul antigenelor de suprafa, fiind deci implicat n rspunsul imun al macroorganismului; este sediul unor factori de patogenitate; are rol n diviziunea bacterian i n procesul de sporulare.

6. Coloraia Gram, timpi interpretare exemple

Pt aceasta reactive avem nevoie de solutie de violet de gentian 1%,solutie Lugol, solutie alcool-acetona ( sol decoloranta), solutie fucsina bazica 1%,in dilutie 1/10 Se dilueaza intr-un recipient fucsina. Apoi acoperim frotiul cu violet de metil sau cristal violet pentru 1-3 minute, apoi indepartam colorantul. Se acopera frotiul cu sol Lugol(mordant) pentru 1-3 minute. Se indeparteaza Lugolul si se acopera frotiul cu amestec alcool- acetone pt un timp foarte scurt 7-8 secunde. Se spala insistent cu apa de la robinet sau apa distilata. Se va acoperii frotiul cu fucsina diluata 1/10 pt 1 minut. Spalam din nou cu apa distilata si asezam frotiul in stativ pt uscare sau grabim uscarea prin tamponare cu sugativa sau hartie de filtru. Mecanismul Gram are la baza component biochimica diferita a peretelui cellular la bacteriile gram + fata de cele gram -. La bacteriile gram - peretele cellular prezinta continut crescut de lipide si permite pierderea violetului de gentiana si recolorarea ulterioara cu fucsina. La bacteriile gram + peretele cellular are alta component : predomina acidul muramic. In timpul tratarii cu alcool acetona se deshidrateaza, permeabilitatea se reduce si violetul de gentiana nu mai poate fi extras din cellule. Bacterii gram + -> coci : genul Staphylococcus spp, genul Streptococcus spp, Entetococcus; -> bacilli : Listeria,Bacillus, Clostridium. Bacterii gram - -> coci: Neisseria meningitides, Neisseria gonorrhoese, Moraxella; -> bacilli: E. coli, Salmonella, Proteus, Haemophillus spp.

7. Coloraia Ziehl-Neelsen, timpi interpretare exemple

Este o coloratie utila in identificarea prezentei de bacilli acid-alcoolo rezistenti(BAAR) solubilizand peretele bacterian prin cresterea temperaturii, facilitand penetrarea colorantului. Avem nevoie de fucsina fenicata Zheil 1%, amestec decolorant acid-alcool si albastru de metiln 1%. Procedeu : punem frotiul uscat si fixat pe un support situate desupra tavitei de colorare.Acoperim complet lama cu fucsina bazica nediluata. Trecem becul de gaz aprins pe sub lama acoperita cu fucsina, pana incepe emiterea de vapori.In cazul in care lama nu mai este acoperita complet cu fucsina, adaugam colorant. Timpul de lucru este de 10 minute, perioada in care repetam de 3 ori operatia de incalzire a lamei pana la emiterea de vapori. Spalam insistent cu apa distilata. Adaugam amestecul decolorant acid-alcool pt 2-3 minute. Spalam din nou cu apa distilata. Recoloram cu albastru de metilen pt 1 minut. Spalam cu apa distilata. Asezam frotiul in stativ pt uscare sau grabil uscarea prin tamponare cu sugativa sau hartie de filtru. Bacili acid-alcoolo rezistenti apar rosii pe fond albastru,ceilalti germeni si elem tisulare aparand colorate in albastru. Colorabilitatea depinde de varsta culturii, mediul de izolare, prezenta in produsul patologica medicamentelor tuberculostatice. Bacterii acid-alcoolo rezistente: Nocardia, Actinomyces.

8. Structura i rolul membranei citoplasmatice

Este o membran fin (6,5-7nm), elastic, lipsit de rezisten mecanic ce mrginete la exterior citoplasma bacteriilor i o separ de peretele celular. Pe seciune apare trilaminat, fiind alctuit din dou straturi fosfolipidice dispuse cu prile hidrofobe fa n fa. Printre moleculele fosfolipidice se gsesc molecule proteice, situate fie la nivelul unuia dintre cele dou straturi fosfolipidice, fie le traverseaz fiind expuse la ambele fee ale membranei. Aceast structur dinamic, fluid, temporar i reversibil n funcie de factorii de mediu este o structur n mozaic, modelul ei fiind descris n 1972 de Singer i Nicholson. Funciile membranei citoplasmatice:

 este o membran cu permeabilitate selectiv, ndeplinind funcia de barier osmotic ce regleaz schimburile celulei bacteriene, n ambele sensuri cu mediul nconjurtor. Permeabilitatea selectiv a membranei citoplasmatice permite realizarea n interiorul celulei, pentru unele substane, concentraii de 105 ori mai mari dect n afara celulei, secret numeroase enzime hidrolitice ce se elibereaz n mediul nconjurtor unde scindeaz substratul nutritiv n uniti absorbabile, unele proteine legate de membrana citoplasmatic joac rolul de chemoreceptori, ndeplinete rolul mitocondriilor de la celulele eucariote, fiind sediul enzimelor lanului respirator i al fosforilrii oxidative, deci centrul energogenezei celulare, este sediul sintezei acizilor grai, a fosfolipidelor, este implicat n sinteza peretelui celular, al polizaharidelor capsulare, participnd activ la creterea i diviziunea celulei bacteriene, la formarea sporului bacterian, constituie o posibil int pentru aciunea unor chimioterapice ca, de pild, polimixinele.

9.Ribozomii, structur i rol

Ribozomii sunt structuri sferice cu diametru de aproximativ 180nm i constanta de sedimentare de 70S. n absena ionilor de Mg2+ se desfac n dou subuniti cu constanta de sedimentare de 50S i 30 S. Din punct de vedere chimic sunt alctuii din 65-70% ARN i 30-35% proteine. O parte din ribozomi se asociaz formnd polizomi (mai ales n timpul sintezelor proteice), alii sunt liberi, iar o a treia categorie se ataeaz mezozomilor sau membranei citoplasmatice. Ribozomii reprezint sediul sintezelor proteice din celul.

10.Mezozomi Incluzii Vacuole (n structura celulei bacteriene)

Vacuolele sunt formatiun sferice care contin diferite substante in solutie apoasa. Au o membrana lipoproteica numita tonoplast. Au fost descrise in special la bacteriile acvatice. Incluziile citoplasmatice, descrise la unele specii bacteriene, sunt formaiuni structurale inerte, temporare, de diferite dimensiuni, variind n funcie de specia bacterian i condiiile de mediu. Compoziia lor chimic este diferit, ele putnd fi de glicogen sau amidon (la unii bacilii aerobi sporulai), lipide (la genul Bacillus), polimetafosfai (sau incluziile de volutin descrise mai nti la Spirillum volutans i apoi de Babe i Ernst la bacilii difterici) etc. Incluziile sunt structuri legate de activitatea metabolic a celulei bacteriene i reprezint un material de rezerv care poate fi folosit ca surs de energie. Mezozomii sunt structuri membranare care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice sub form de buzunar sau n deget de mnu, prezente la bacteriile gram - pozitive i ocazional la cele gram - negative. Ei nu formeaz n citoplasm caviti inerte, ci deschise spre spaiul periplasmic (spaiul dintre membrana citoplasmatic i peretele celular) i sunt n contact direct cu materialul nuclear. Dup morfologia lor, mezozomii sunt lamelari, veziculari i tubulari, iar dispoziia lor n celula bacterian poate fi septal, periferic i nuclear. Funciile mezozomilor: particip la replicarea cromozomului bacterian i diviziunea celular, particip la reaciile de fosforilare oxidativ i oxidoreducere, dar n msur mai mic dect membrana celular, sediul unor enzime hidrolitice care ndeplinesc rolul enzimelor lizozomale de la celulele eucariote, sinteza i secreia unor exoenzime, ca de exemplu penicilinaza sau cefalosporinaza, sinteza peretelui celular i formarea sporului bacterian.

11.Masa nuclear bacterian structur, caracteristici

Nucleul bacterian Este un nucleoid sau echivalent nuclear, cu o structur primitiv n comparaie cu nucleul celulelor eucariote i reprezint 2% din greutatea uscat a bacteriei. Nucleoidul este format dintr-o molecul circular de ADN, organizat sub forma unui cromozom haploid care este n contact direct cu citoplasma datorit lipsei membrane nucleare. Molecula de ADN dublu spiralat este la rndul ei

suprahelicat n jurul unui miez de ARN, dispoziie necesar funcionalitii materialului nuclear. n mod obinuit, nucleoidul este situat n centrul celulei bacteriene i poate fi legat de membrana citoplasmatic prin intermediul mezozomilor. Funcia nucleului bacterian const n depozitarea informaiei genetice necesar autoreplicrii, organizrii structurale i funcionale a celulei bacteriene, deci a caracterelor ce definesc specia. n afar de ADN cromozomial, la unele bacterii sunt prezente molecule circulare mici, extracromozomiale de ADN care se numesc plasmide i care se replic independent de cromozomul bacterian. Vom reveni asupra lor n capitolul de genetic bacterian.

12. Cum este nscris informaia genetic n genomul celulei bacteriene

Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de determinani genetici: 1. genele eseniale, localizate n structura cromozomului bacterian i 2. genele accesorii extracromozomale prezente n structura: - plasmidelor i - elementelor genetice transpozabile. Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independent de cromozom (replicon), dar depinznd de factori codificai de nucleul bacterian. Conin informaie genetic neesenial pentru viaa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de -a lungul generaiilor. Dimensiunea plasmidelor variaz ntre 1kb i circa 200 kb. Majoritatea sunt alctuite din molecule de ADN circular, dar exist i plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar exist i plasmide de ADN monocatenar (se consider c plasmidele de ADN monocatenar reprezint de fapt o situaie intermediar n cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. laStaphylococcus aureus). Unele plasmide (numite i epizomi) pot exista alternativ n stare autonom (libere n citoplasm) sau integrate n cromozomul celulei gazd (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persist indefinit numai n stare autonom (de exemplu plasmida R, Col, F etc). Clasificarea plasmidelor n raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica n: 1. plasmide care codific rezistena la ageni antibacterieni: - factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpin de Shigella dysenteriae); - plasmidele de rezisten la UV etc. 2. plasmide care codific sinteza unor ageni antimicrobieni: - factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotic) etc. 3. plasmide de patogenitate care codific sinteza de: - hemolizine; - factori de colonizare; - enterotoxine sau alte exotoxine etc. 4. plasmide care codific enzime ale unor ci metabolice particulare: - n anumite condiii, unele bacterii pot utiliza ca surs de C diferite substane cu potenial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieuirea i dezvoltarea n aceste condiii se numesc plasmide degradative; 5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celul care deine respectivul plasmid (F) la alta, putnd fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F; 6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate. Elemente genetice transpozabile O anumit secven specific de ADN constituie un element genetic transpozabil dac i menine integritatea fizic, structural i genetic, funcional n cursul translocaiei de la o poziie la alta n acelai genom, replicon (intramolecular) sau n genomuri diferite (intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziie poate avea loc la nivelul oricrui replicon, la ntmplare, dar exist i situaii n care un transpozon are anumite zone specifice unde se va insera (zone calde).

Pe baza complexitii lor, elementele care ndeplinesc aceast condiie se pot grupa n trei categorii: - secvene de inserie (IS); - transpozoni (Tn); - bacteriofagi. Secvenele de inserie nu conin nici o gen i nu au nici o alt funcie (cunoscut) n afar de cea de inserie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. Dup inseria lor pot aprea modificri n expresia unor gene sau modificri n rata incidenei deleiilor n regiunile adiacente situsului lor de inserie. Transpozonii difer de secvenele de inserie prin complexitate i prin faptul c poart gene care confer bacteriilor funcii noi, detectabile, de exemplu: - rezistena la antibiotice; - capacitatea de sintez a unor enzime; - producerea de enterotoxine; - sinteza antigenelor bacteriene de suprafa (de exemplu K 88 la E. coli); - sinteza unor factori de colonizare intestinal etc. Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezult prin prescurtarea mutator, pentru c a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb i o structur linear. Dup infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inser n cromozom la ntmplare i ul terior n diferite poziii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci cnd structura genetic Mu va prsi genomul bacterian va prelua o parte din structura genetic bacterian (circa 100-150 pb).

13.Enumerai i descriei succint etapele biosintezei proteice

Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi este necesar ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei proteine. Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controleaz sinteza unui polipeptid poart numele de cistron. ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza mai multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast situaia particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i metabolismului intens care are loc n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur molecul de ARNm policistronic. De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este controlat de ARN polimeraza ADN-dependent. Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi exist una sau mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice fiecrui tip de aminoacid care controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului. ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop.

Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare.

14.Capsula bacterian structur, rol, localizare

Capsula este un nveli compact, intim legat de celula bacterian, cu o lime de cel puin 0,2m. Este vizibil pe preparatele uzuale sau n coloraiile negative sub forma unui halou clar ce nconjoar bacteria. Din punct de vedere chimic, capsula tuturor bacteriilor de interes medical este de natur polizaharidic (Streptococcus pneuomoniae, Klebsiella etc.) cu excepia capsulei bacilului crbunos care este polipeptidic. Capsula are rol n rezistena bacteriilor fa de fagocitoz, fiind astfel un factor de virulen. Variantele necapsulate ale acelorai specii sunt nepatogene. De exemplu, Streptococcus pneumonie, de tip S, capsulat, produce la oarecele alb de laborator o septicemie mortal, pe cnd varinata necapsulat nu este patogen. Capsula este o structur cu proprieti antigenice specifice (antigenele K) care permit diferenierea unor serotipuri n cadrul speciei. Bacteriile nu sintetizeaz material capsular in vitro pe mediile uzuale, coloniile rezultate fiind rugoase, de tip R =rough. Pe medii speciale, ns, bacteriile pot crete capsulate, coloniile fiind mucoase, de tip S =smooth. Structura descris mai sus este capsula clasic a bacteriilor, la care ne referim atunci cnd vorbim de bacterii capsulate. La unele bacterii s-au mai evideniat i alte structuri de nveli, cum sunt: -Microcapsula este o structur discret cu o grosime sub 0,2m care nu se evideniaz la microscopul optic, ci numai prin metode imunologice sau electronomicroscopice (Neisseria gonorrhoeae). Ea constituie un factor de virulen. -Stratul mucos, glicocalixul este un strat amorf i vscos ce nvelete bacteria. El este format din lanuri lungi de polizaharide, cum sunt levanii i dextranii, cu rol major n adezivitatea bacteriilor de suprafee. Astfel, de pild, Streptococcus mutans produce cantiti mari de dextran i levan prin intermediul crora se ataeaz de suprafaa diniilor contribuind la formarea cariilor i a plcii dentare. Un alt exemplu este Pseudomonas aeruginosa, care secret un strat mucos dens care i crete rezistena la antibiotice. Funciile capsulei: este un factor de aderen i colonizare a bacteriile pe suprafee; protejeaz bacteriile de diferii ageni antibacterieni din mediu cum sunt: bacteriofagii, colicinele, complementul, lizozimul sau alte enzime bacteriolitice; protejeaz bacteriile de aciunea fagocitelor, fiind deci un factor de virulen; reprezint sediul antigenelor capsulare, importante n identificarea acestor bacterii.

15.Flagelii bacterieni structur, rol, localizare

Cilii sau flagelii bacterieni Sunt apendici filamentoi ai speciilor bacteriene mobile, cu originea n citoplasma bacterian, i servesc ca organe de locomoie. Ei sunt prezeni mai ales la bacili (Enterobacteriaceae) dar i la unii coci (enterococ). Cilii sunt structuri helicoidale, cu dimensiunea n general mai mare dect cea a celulei bacteriene creia i aparin (2-15/2-20 nm) i se evideniaz microscopic prin coloraii speciale. Dispoziia i numrul cililor sunt caracteristice speciei. S-au descris bacterii atriche (fr cili), monotriche - cu un cil polar (Vibro cholerae), lofotriche - cu un smoc de cili situat la unul din polii bacteriei - (Pseudomonas fluorescens), amfitriche - cu cilii situai la ambii poli ai bacteriei (la genul Spirillum) i peritriche - cu cilii dispui pe ntreaga suprafa a bacteriei (Salmonella, E. Coli, Proteus etc.). Structura cililor este tubular, ei fiind formai dintr-o protein contractil, flagelina, sub form polimerizat. Cilul se ataeaz de bacterie printr-un corpuscul bazal i un crlig de articulaie aflate n citoplasma bacteriei. Corpusculul bazal se inser prin crligul de articulaie de membrana citoplasmatic i peretele celular.

Mobilitatea i direcia micrii cililor pot fi influenate de concentraia unor substane din mediu (chimiotactism pozitiv sau negativ) i de temperatur. Ei sunt sediul antigenelor flagelare (H), importante n identificarea bacteriilor. Cilii bacterieni nu se observ dect pe preparate colorate special. n practica de rutin nu se evideniaz flagelii, ci mobilitatea bacteriilor, fie prin examinarea lor pe un preparat nativ ntre lam i lamel n care se urmresc micrile bacteriilor, fie prin nsmnarea tulpinii pe un mediu semisolid prin neparea n profunzime a mediului. Dac bacteria crete nu numai pe traseul nsmnrii i difuzeaz n mediu, ea este mobil.

16.Fimbriile bacteriene (pili bacterieni)

Numeroase specii bacteriene gram-negative au pe suprafaa lor lor nite apendici filamentoi, rigizi, mai scuri dect flagelii, n numr mare (100-500/celul) i cu dispoziie n general peritrich. Ei se evideniaz numai prin microscopie electronic. Din punct de vedere chimic sunt polimeri proteici de pilin, dispui helicoidal ntr-o structur tubular. Natura proteic a pililor le confer proprieti antigenice. Din punct de vedere funcional, pilii se mpart n: sex pili - codificai de formaiunile genetice extracromozomiale (plasmide) i care prezint o importan deosebit n transferul de material genetic ntre bacterii. Sunt prezeni mai ales la bacteriile gram-negative (Enterobacteriaceae, Pseudomonas), pili comuni sau pili de aderen (fimbrii), n numr mare, codificai cromozomial, i care servesc bacteriilor la fixarea ferm de mediul de cultur sau de celulele pe care se afl. Ei constituie, deci, un factor important de virulen (de exemplu la gonococ). n afar de aderen, pilii comuni mai au i proprieti antifagocitare. Ambele categorii de pili prezint antigene specifice piliare i pot fi receptori pentru bacteriofagi.

17.Sporii bacterieni structur, rol, localizare

Unele bacterii se transform n spori, care sunt forme primitive de difereniere celular, cu rezisten crescut la factorii de mediu i care apar endocelular n condiii nefavorabile de via. Sporogeneza se ntlnete numai la 3 genuri de bacterii gram-pozitive, Clostridium i Bacillus care sunt bacili i Sporosarcina care sunt coci. Sporii nu sunt forme de nmulire ale bacteriilor. Dintr-o bacterie vegetativ se formeaz un singur spor, care n condiii favorabile de via va da natere unei singure celule bacteriene. Forma sporului poate fi rotund sau oval. Diametrul sporilor este mai mic la bacilii sporulai aerobi, nedepind diametrul bacteriei (genul Bacillus), pe cnd la genul anaerob Clostridium, sporul are un diamentrul mai mare dect bacteria, producnd deformarea acesteia. Acest caracter al sporului se numete caracter clostridial i este important n identificarea bacililor gram-pozitiv anaerobi. Poziia sporului bacterian constituie un caracter taxonomic. Poate fi central, ca la bacilul crbunos (Bacillus anthracis), subterminal, ca la B.cereus, sau terminal, ca bacilul tetanic (Cl.tetani). Structura sporului variaz de la specie la specie, dar organizarea general se aseamn. De la interior spre exterior, sporul este format din: core sau protoplastul sporal, format din materialul nuclear inconjurat de membrana citoplasmatic. Aici este depozitat DNA i o substan care are rol n rezistena sporului la cldur dipicolinatul de Ca, care nu s-a mai evideniat nicieri n natur, cortexul intern sau peretele sporal format din peptidoglican i care este peretele celular primordial, membrana extern sau cortexul sporal, care este stratul cel mai gros al sporului i care conine i el un peptidoglican, cu o structur particular, foarte sensibil la lizozim. Autoliza acestui strat este momentul cheie n transformarea sporului n forma vegetativ, tunica proteic este format din proteine chitinoase cu numeroase legturi disulfitice. Ea este impermeabil, fiind responsabil de rezistena sporilor la unele dezinfectante, exosporiumul este prezent numai la unii spori i conine lipoproteine i zaharide. n coloraiile obinuite sporul apare ca o zon incolor n corpul bacterian. El se evideniaz ns prin

coloraii speciale, la cald, care permeabilizeaz nveliurile sporale pentru colorani (coloraia Mller). Pe preparatele native ntre lam i lamel efectuate din culturi, sporii apar ca nite formaiuni rotunde, refringente. Ultrastructura i compoziia chimic a sporilor asigur acestora o mare rezisten la agenii fizici i chimici, ceea ce face ca ei s fie considerai forme de rezistena ale bacteriilor. De importan deosebit pentru medicin este rezistena sporilor la cldur, de care trebuie s se in cont la sterilizare.

18.Nutriia principalelor bacterii studiate: tipuri de nutritive

Nutritia bacteriana reprezinta totalitatea proceselor prin care bacteriile si procura din mediul nconjurator substantele necesare supravietuirii, cresterii si nmultirii , iar respiratia bacteriana modalitatea de a-si produce energia necesara activitatii metabolice. Sursa de energie. n functie de sursa de energie pe care o folosesc, bacteriile se mpart n: fotosintetizante, care utilizeaza energia luminoasa pentru sinteza compusilor proprii chimiosintetizante, care si procura energia prin reactii de oxido-reducere a unor substante. Bacteriile care oxideaza substantele anorganice se numesc lithotrofe, iar cele care oxideaza substante organice chemoorganotrofe. Sursa de carbon. Dupa sursa de carbon, bacteriile se clasifica n: autotrofe, care sintetizeaza compusi organici pornind de la substante anorganice, sursa de carbon fiind CO2, mixotrofe, care folosesc ca sursa de carbon att substante organice ct si CO2, heterotrofe, care utilizeaza ca sursa de carbon numai substante organice. Sursa de azot a bacteriilor de interes medical o constituie n general aminoacizii, dar unele bacterii utilizeaza si sarurile de amoniu (Escherichia coli, Salmonella etc.). Necesarul de oxigen pentru dezvoltarea bacteriilor este variabil. Oxidarea se defineste ca o pierdere de electroni sau de ioni de hidrogen. Substanta care se va oxida este donorul, iar cea care se reduce, acceptorul de hidrogen. Deci, n urma oxidarii va rezulta o substanta oxidata, o substanta redusa si o anumita cantitate de energie libera. Substanta energogenetica de baza este la multe bacterii glucoza, monozaharid ce poate fi metabolizat pe mai multe cai n functie de performantele oxidative ale bacteriilor. La bacterii deosebim n functie de acceptorul final de hidrogen, 3 tipuri de oxidatie: respiratia, n care acceptorul final de hidrogen este oxigenul atmosferic, fermentatia, n care acceptorul final de hidrogen este o substanta organica, si respiratia anaeroba, n care acceptorul final de hidrogen este oxigenul prezent ntr-o sare anorganica (nitrat sau sulfat) care se va reduce.

19.Clasificarea bacteriilor n funcie de tipul respirator

Din punct de vedere practic, bacteriile se mpart, dupa necesarul de oxigen, n: bacterii strict aerobe, care se dezvolta numai n prezenta oxigenului atmosferic, folosind exclusiv respiratia aeroba si deci oxigenul ca acceptor final de hidrogen. Astfel de bacterii sunt, de exemplu, Pseudomonas aeruginosa, Corynebacterium diphteriae, Mycobacterium tuberculosis etc. bacterii strict anaerobe, care nu se dezvolta dect n absenta oxigenului, prezenta lui fiind foarte toxica culturii chiar la o presiune de numai 10-5 atm. Aceste bacterii folosesc ca reactie energogenetica exclusiv fermentatia, n conditii anaerobe, deci oxidatia de substrat. Daca fermentatia se produce n prezenta oxigenului, se formeaza radicali de superoxid (O2-) foarte toxici. Bacteriile strict anaerobe, spre deosebire de cele aerobe, sunt lipsite de superoxiddismutaza care transforma radicalul superoxid n apa oxigenata si catalaza care descompune apa oxigenata. Exemple de bacterii strict anaerobe sunt cele din genul Clostridium, Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium etc. bacterii facultativ anaerobe, care se pot dezvolta att n prezenta ct si n absenta oxigenului atmosferic. Ele utilizeaza ca reactii energogenetice respiratia aeroba, fermentatia iar unele chiar si respiratia anaeroba. Majoritatea speciilor de interes medical sunt facultativ anaerobe (de pilda, enterobacteriile). bacterii anaerobe aerotolerante folosesc numai fermentatia n prezenta aerului atmosferic, fara participarea oxigenului la reactiile energogenetice. Ele tolereaza oxigenul n mediu fie pentru ca au n

echipamentul enzimatic superoxiddismutaza si catalaza, fie ca enzimele exista n mediul de cultura. Astfel, bacteriile din genul Streptococcus sunt lipsite de catalaza, dar pot fi cultivate n conditii de aerobioza pe medii cu snge, care suplineste catalaza. bacterii microaerofile folosesc respiratia si fermentatia, dar necesita o concentratie mai mare de bioxid de carbon dect cea din atmosfera pentru reactii de carboxilare. Astfel, unele specii, ca cele din genurile Neisseria, Brucella, Campylobacter, necesita concentratii de bioxid de carbon de 6-10%.

20.Definii factorii de cretere bacterieni; exemple

Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n: 1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN); 2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor; 3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime. Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon. Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur. Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2).

21. Clasificai bacteriile n funcie de temperatura optim de dezvoltare; exemple

Temperarura optima de dezvoltare a bacteriilor este cea a habitatului lor natural. n functie de aceasta temperatura, bacteriile se mpart n psihrofile, care se nmultesc optim la 20C dar si sub aceasta temperatura, mezofile, cu temperatura optima cuprinsa ntre 20-40C si termofile, care se nmultesc optim la peste 45C. Bacteriile mezofile sunt cele patogene deoarece se nmultesc la temperatura organismului, fiind denumite si bacterii homeoterme. Limitele de temperatura n care aceste bacterii pot sa creasca sunt nsa mai mari si variaza de la specie la specie. Astfel, gonococul si meningococul nu suporta variatii mai mari de 1-2C fata de temperatura optima, spre deosebire de enterobacterii, care cresc n limite foarte largi. Microorganismele sunt sensibile la temperaturile ridicate, aplicatia practica a acestui aspect fiind sterilizarea. Temperaturile moderat scazute, ca, de pilda, cea de +4C din frigidere, nu distrug bacteriile, dar opresc n general nmultirea lor prelungindu-le viabilitatea. Din acest motiv, majoritatea produselor biologice sau patologice destinate examenului bacteriologic se pastreaza n aceste conditii. Totusi, exista tulpini microbiene care se nmultesc si la temperatura frigiderului ca, de exemplu, tulpinile criogene de Pseudomonas aeruginosa, ce se nmultesc la 0C si tulpini din familia Enterobacteriaceae (E.coli) care se n nmultesc la +5C. Acest aspect trebuie luat n calcul de catre medicul bacteriolog, mai ales acolo unde implicatia etiologica a unui germene ntr-o infectie se bazeaza pe criteriul numeric.

22.Definii noiunea de cultivare a bacteriilor; enumerai pe ce substraturi se Realizeaz

Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele caractere n vederea identificrii. Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare definete

operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur bacterian.

23.Definii noiunea de cretere i multiplicare bacterian

Cresterea si inmultirea bacteriilor este rezultatul nutritiei si al metabolismului bacterian. Bacteriile se divid n marea lor majoritate prin diviziune binara, cu exceptia chlamydiilor, care au un ciclu de dezvoltare unic n lumea bacteriana. Diviziunea este precedata de cresterea n volum a celulei bacteriene, dedublarea materialului nuclear si a componentelor citoplasmatice, ceea ce duce la un dezacord ntre masa si volumul celulei bacteriene. Cnd acest dezacord atinge un punct critic se produce diviziunea celulei parentale n doua celule fiice, identice cu celula din care au provenit. La bacili diviziunea se face ntotdeauna dupa un plan perpendicular pe lungimea bacteriilor, n timp ce la coci planurile de diviziune sunt variate. Celulele fiice se pot separa imediat dupa diviziune sau pot ramne legate una de cealalta, rezultnd o asezare caracteristica, utila n recunoasterea bacteriilor ca, de exemplu, a celor din genul Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria etc. Diviziunea bacteriilor gram pozitive are loc prin formarea unui sept ntre cele doua celule fiice, pe cnd bacteriile gram negative se divid prin strangulare directa.

24.Definii noiunea de mediu selectiv, electiv i de mbogire; exemple

Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric). Daca un mediu de imbogatire se solidifica, rezulta un mediu selectiv care are avantajul obtinerii microbilor sub forma de colonii izolate. Datorita acestor medii, izolarea si identificarea bacteriilor este astazi mult simplificata. Mediile selective, care se bazeaza pe particularitatile metabolice ale unor specii microbiene sau mai ales pe rezistenta naturala a acestora la antibiotic, sunt utilizate in mod current in lab bacteriologice, deoarece permit practice, izolarea dintr-un amestec de microbe, a orcarui microb in cultura pura.. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent) . Mediul de mbogire este mediu lichid care permite inmultirea preferential a unui microb dintr-un amestec. Astfel sunt mediile cu continut mare de clorura de sodium(1-10%) in care se pot dezvolta numai bacteria halofile, ca de ex stafilococul (mediu Chapman lichid) si enterococul. Unele medii de imbogatire au ca factor elective anumite substante ca selenitul acid de sodium,care permite dezv salmonelelor din materiile fecale. Alte medii se bazeaza pe prop unor germeni de a se dezvolta la un pH mai acid sau mai alcalin decat majoritatea speciilor bacteriene de interes medical. Astfel vibrionul holeric se dezvolta la un pH alcalin(9) iar brucelele la un pH acid (6).

25.Definii noiunea de mediu diferenial; exemple

Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree).

26.Ce este o colonie bacterian ? Cum se pot obine colonii bacteriene izolate ?
Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic,

inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate.

27.Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene

Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin 1.Faza de lag Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. 2.Faza de multiplicare logaritmic (exponenial) Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore. 3.Faza staionar Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul. Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile. 4.Faza de declin Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele bacterii pot persista 2-3 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte intens.

28.Aspectele culturilor bacteriene pe medii solide; corelaii ntre acestea i patogenitate; exemple
Introducerea mediilor de cultura solide a nsemnat un progres urias n tehnicile de diagnostic, deoarece permite dezvoltarea distincta a microbilor, sub forma de colonii izolate. O colonie bacteriana este o micropopulatie ce rezulta din nmultirea unui singur microb pe un mediu, vizibila n general cu ochiul liber. Cel mai simplu mediu solid este geloza simpla, ce se obtine prin adaugarea la bulion a unei substanta gelificabile, care de regula este geloza, un polizaharid obtinut din alga marina agar-agar. La aceast mediu simplu se pot adauga diferite ingrediente (snge de oaie, ser, ascita, extract de drojdie etc.) pentru a putea cultiva bacteriile pretentioase. Caracterele culturale sunt foarte importante n identificarea microbilor. Ele se apreciaza fie cu ochiul liber, fie cu ajutorul unei lupe. Elementele ce se descriu, n general, sunt dimensiunea, forma, pigmentul, consistenta, aderenta la mediu, activitatea hemolitica si unele modificari pe care microorganismele le produc n mediul respectiv.

Coloniile cu aspect neted, cu marginile regulate si care se suspenda omogen n ser fiziologic se numesc colonii de tip S (smooth), pe cnd coloniile aceleiasi specii, cu suprafata rugoasa, relief si margini neregulate si care aglutineaza sponatan n ser fiziologic - colonii de tip R (rough). n general, cu unele exceptii, coloniile S apartin tupinilor virulente, pe cnd cele R sunt nevirulente. Cultivarea microbilor pe medii solide permite, de asemenea, numaratoarea de germeni ntr-un anumit produs. Acest aspect este deosebit de important deoarece n multe infectii criteriul de implicare etiologic este numarul bacteriilor n produsul de examinat (infectii urinare).

29. Aspectele culturilor bacteriene pe medii lichide; corelaii ntre acestea i patogenitate; exemple
Mediile lichide se folosesc cel mai adesea pentru nmultirea unor microbi care se gasesc n numar mic ntr-un anumit produs. Cel mai simplu mediu folosit n laboratorul de bacteriologie este bulionul care se prepara din decoct de carne de vaca, peptona si clorura de sodiu. Cultivarea unui produs pe medii lichide are dezavantajul ca nu permite nsa obtinerea unei culturi pure. Caracterele culturale ale microbilor pe medii lichide difera. Astfel, bacteriile apartinnd familiei Enterobacteriaceae tulbura uniform mediul, altele, ca de pilda bacteriile strict aerobe (Pseudomonas, Nocardia) formeaza pelicule la suprafata mediului. Altele formeaza agregate care se dezvolta sub forma de grunji ce se depun pe peretele eprubetei sau la fundul mediului (Streptococcus). Unele bacterii secreta n mediu pigmenti difuzibili ca de exemplu bacilul piocianic (Ps.aeruginosa).

30.Sisteme de culturi continue; definiii i exemple

Cnd se urmareste obtinerea unei mase mari microbiene sau a unor produsi bacterieni pentru cercetare, preparare de vaccinuri, diversele industrii (farmaceutica, alimentara etc.), cultivarea bacteriilor se face n sisteme deschise, n care mediul de cultura este permanent nlocuit cu mediu proaspat, ndepartndu-se n acelasi timp masa nou formata de bacterii. Bacteriile vor fi mereu n faza logaritmica, curba de nmultire avnd un aspect liniar. n acest fel se obtin culturile continuew, pentru realizarea carora este necesar un chimiostat sau un turbidistat.

31.Definii noiunile de asepsie i antisepsie; exemple de antiseptice; aplicaii

Antisepsia consta n aplicarea unor substante bactericide sau bacteriostatice n scopul de a omor sau inhiba dezvoltarea florei patogene la nivelul tegumentelor, mucoaselor, plagilor. Asepsia cuprinde toate masurile care mpiedica contaminarea cu agenti infectiosi a unei plagi. Cinetica reactiei bactericide prin agenti fizici si chimici decurge ca o reactie de ordinul nti, ceea ce nseamna ca bacteriile supuse oricirei actiuni bactericide nu vor muri toate n acelasi timp. Criteriul fundamental de apreciere a actiunii bactericide a unei noxe este pierderea capacitatii microorganismului de a se nmulti atunci cnd este nsamntat ntr-un mediu favorabil. Testele de viabilitate sunt foarte importante n prepararea vaccinurilor, de pilda, a caror sterilizare se face prin metode blnde pentru a nu modifica imunogenitatea microbilor. Astfel, exista posibitatea supravietuirii unui numar mic de bacterii care dupa ncetarea noxei se vor nmulti din nou. Antisepticele sunt substante cu actiune bacteriostatica, uneori bactericida, putnd fi aplicate pe tegumente sau ca spalaturi ale unor mucoase (vaginala, uretrala, otica etc.). Aceeasi substanta poate fi antiseptic sau dezinfectant n functie de concentratie. Alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptic.

32. Definii noiunile de sterilizare i dezinfecie; exemple de dezinfectante; aplicaii

Prin termenul de sterilizare, care este un termen absolut, se nteleg procedeele fizice si chimice care elimina toti germenii viabili (bacterii, spori, fungi, virusuri, paraziti) de pe un obiect. Se desemneaza ca steril un obiect care a fost supus unui procedeu de sterilizare si protejat n mod corespunzator pentru a preveni contaminarea sa. Se folosesc, n principiu, 4 metode de sterilizare: sterilizarea prin caldura; filtrarea prin filtre bacteriologice care retin bacteriile din lichidele ce nu pot fi supuse temperaturilor ridicate;

 iradierea cu raze UV sau raze ionizante; sterilizarea chimica, metoda evitata n general deoarece doar ctiva dezinfectanti, foarte toxici si iritanti (ca de exemplu, formaldehida, oxidul de etilen etc.) folositi n conditii riguros controlate, sunt capabili sa omoare toate formele de viata inclusiv sporii, fara a deteriora obiectele de sterilizat. Trebuie specificat, nsa, ca sterilizarea nu este identica cu distrugerea fizica a bacteriei, cu toate ca cele doua notiuni se folosesc des una n locul celeilalte. Acest aspect este foarte important, deoarece solutiile perfuzabile, care sunt sterile dar contin bacterii omorte, a caror produsi de degradare au efecte pirogene, dau reactii toxice a caror gravitate merge pna la socul endotoxinic. Deci, apa si lichidele care vor servi la prepararea solutiilor injectabile sau perfuzabile trebuie sa fie nu numai sterile, dar sa aiba un grad pronuntat de puritate. Dezinfectia se refera n general la distrugerea tintita a potentialului infectios n scopul de a mpiedica raspndirea microbilor dintr-un anumit focar de infectie, rezultatul nefiind ntotdeauna omorrea tuturor formelor microbiene, mai ales a endosporilor. Dezinfectantele sunt substante puternic bactericide, cel mai des toxice pentru organismul uman. Dezinfectia se aplica acolo unde sterilizarea nu se poate efectua: mobilier, asternuturi de pat, bazine de not, ncaperi etc. Metodele de dezinfectie sunt: dezinfectia prin caldura umeda si consta in fierbere si pasteurizare dezinfectia chimica. Principalele clase de substante dezinfectantate sunt: a) halogenii si compusii halogenati (Cl2, NaOCl2, I2, iodoform, CH3, cloramine); b) compusi oxidanti (apa oxigenata H2O2 solutie 3%, peroxidul de sodiu, Na2O2 folosit si la mastile de gaz pentru retinerea CO2, KMnO4, solutie 102-105) c) compusii borului acid boric, H3BO3, solutie 3% si tetraboratul disodic, solutie 5 % mai bine tolerat de mucoase); d) compusii organo-metalici (fenosept, solutie 2103 argint coloidal, AgNO3, solutie 102-105 ) e) alcoolii si derivatii (alcoolul etilic,C2H5OH,1 g/2m3 aer la umidatate maxima 20-30% si esteri) f) aldehide (formaldehida CH2, solutie 40% si polimarizata: paraformaldehida HO-(CH2-O)n-H, cu n=10-50 si trioximetilen, trimerul ciclic, conditionat in comprimate a 1,1 g); g) fenoli si derivati (tricrezolul amestec de orto, meta si paracrezol, rezorcina, in unguente si eugenolul, in stomatologie si esteri) i) detergent.

33.Antiseptice i dezinfectante. Mecanisme de aciune

Substanele antiseptice i dezinfectante se pot clasifica n funcie de mecanismul de aciune, dup cum urmeaz: a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea concentraiei corespunztoare. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele *srurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide+, gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii *acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea

antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc+, detergenii *anionici (spunuri, perlan etc), cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz).

34.Sterilizarea prin cldur umed; metode, presiune, temperatur, aplicaii

Caldura umeda este mai eficienta dect caldura uscata, distrugnd bacteriile la o temperatura mai scazuta si timp mai scurt. Formele vegetative a majoritatii bacteriilor, fungilor si virusurilor animale sunt omorte de caldura umeda n 10 minute la temperaturi cuprinse ntre 50C (Neisseria gonorrhoeae) si 65C (Staphylococcus aureus). O susceptibilitate deosebita fata de caldura o prezinta Treponema pallidum, care este distrusa n 10 minute la 43C. Rezistenta maxima la caldura umeda o are, nsa, Bacillus stearothermophylus, a carui forma vegetativa se poate multiplica la 80C. O parte din virusurile animale au o rezistenta crescuta fata de caldura umeda, ca, de pilda, virusul poliomielitic care este inactivat la 60C dupa 30 de minute, si virusul hepatitei B care daca se afla n ser rezista 10 ore la 60C. Multi bacteriofagi au o rezistenta mai mare la caldura umeda dect bacteria gazda, aceasta fiind distrusa la 60C n 15-30 minute iar bacteriofagul la temperaturi cuprinse ntre 65-80C. Formele sporulate ale actinomicetelor, ciupercilor si a fungilor sunt mai rezistente dect formele vegetative, dar nu att de rezistente ca si sporii bacterieni. Rezistenta sporilor bacterieni variaza la diferitele specii, dar chiar si ntre tulpinile aceleiasi specii. Astfel, majoritatea sporilor de Cl.tetani sunt distrusi prin fierbere la 100C n 10 minute, dar s-au semnalat tulpini a caror spori rezista la fierbere 1-3 ore, fiind cei mai rezistenti patogeni ce pot infecta o plaga. Rezistenta lor determina standardele minime pentru sterilizarea chirurgicala: 10 minute la 121C sau 30 de minute la 115C fara a socoti timpul de ncalzire. Unii spori de Cl.botulinum rezista la fierbere la un pH=7 pna la 8 ore iar la autoclavare 10-40 de minute la 115C. Omorrea microorganismelor prin caldura umeda se produce prin coagularea proteinelor structurale si inactivarea enzimelor, cu participarea apei. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi prin expunere la caldura umeda la 121C timp de 30 de minute. fierberea este de fapt o metoda de dezinfectie deoarece ea nu distruge toate formele sporulate. Se efectueaza la 100C timp de 1/2 de ora si se aplica siringilor si instrumentelor de mica chirurgie atunci cnd nu este posibila alta metoda. Fierberea se mai foloseste n epidemii la sterilizarea apei. pasteurizarea a fost introdusa de Pasteur pentru conservarea vinului, fiind utilizata si acum pentru sterilizarea unor alimente lichide care nu suporta temperaturi prea ridicate (lapte, bere, sucuri de fructe). Metoda consta n ncalzirea lichidului la 62C pentru 30 de minute (pasterurizare joasa), 71C 15 minute (pasteurizare medie), 80-85C 3-5 minute (pasteurizare nalta) sau introducerea unor vapori filanti la o temperatura de 130 -150C sub presiune pentru cteva secunde (ultrapasteurizare). Pasteurizarea este o metoda eficienta deoarece bacteriile patogene care se pot dezvolta n lapte (Mycobacterium tuberculosis, Salmonella, Streptococcus si Brucella) nu sunt bacterii sporulate, numarul lor reducndu-se dupa pasteurizare cu 97-99%. Coxiella burnetii nu este distrusa prin pasteurizare joasa. tyndalizarea consta n ncalzirea produsului de sterilizat 3 zile la rnd, n baie de apa la 56-100C cte o ora. Temperatura se alege n functie de produsul de sterilizat. Metoda se aplica lichidelor care nu suporta temperaturile ridicate, ca de exemplu: vaccinuri, medii de cultura ce contin zaharuri n

concentratie mare, proteine, gelatina etc. Formele vegetative sunt distruse n prima zi, iar sporii se transforma n forme vegetative ce vor fi distruse zilele urmatoare. Reamintim, nsa, ca sporii bacteriilor termofile nu se distrug prin aceasta metoda. autoclavarea este metoda folosita pentru instrumentarul de chirurgie iar n laboratoarele de microbiologie pentru sterilizarea mediilor de cultura si a materialului infectios. Sterilizarea are loc ntr-o atmosfera saturata de vapori de apa la 121C, la o presiune de 1 atm, timp de 20-30 de minute, n aparate speciale numite autoclave sau la 134C, la o presiune de 2 atm. 10-15 minute.

35.Autoclavarea principiu, parametrii tehnici, utilizri

Cea mai eficienta metoda de sterilizare si se bazeaza pe mecanismul de coagulare, degradare a proteinelor. Autoclavarea: esentiala pentru orice tip de laborator de microbiologie, pentru unitati sanitare, stomatologie, farmacologie, in sistem public sau privat. Vaporii de apa realizeaza la 0,5 atm o temperatura de 115C (sterilizarea mediilor de cultura lichide sau solide, cu zaharuri in compozitie, termosensibile). Timp de omorare a microorganismelor: 25 min. La 1 atm se realizeaza o temperatura de 121C (sterilizare solutii apoase: ser fiziologic, apa distilata, medii de cultura). Timp de omorare a microorganismelor: 15 min. La 2 atm se realizeaza o temperatura de 134 C, la care se obtine distrugerea bacteriilor in forme vegetative si sporulate, virusurilor, fungilor, parazitilor. La acesti parametri se sterilizeaza deseurile infectioase rezultate din activitatea zilnica in laboratorul de microbiologie.Timpul de omorare al microorganismelor: 3 min (20-30 min pentru prioni). Tipuri de autoclave: -autoclave cu perete simplu -autoclave cu manta de abur -autoclave cu pre- si post- vacuum Important: evitarea formarii pungilor de aer. Prezenta aerului, compromite sterilizarea: vaporii de apa, mai usori, incalzesc partea superioara a incintei, iar aerul, mai greu, ramane in partea inferioara cu temperaturi insuficiente pentru sterilizare. * sistemul de vacuum favorizeaza uscarea finala a materialelor sterilizate, * sistem de racire: previne fierberea violenta a lichidelor si grabeste scaderea presiunii la sfarsitul sterilizarii, * prin autoclavare se sterilizeaza: solutii, substante, medii de cultura solide, lichide; instrumentar medical (metalic, cauciuc, bumbac, textile etc), sticlarie, materiale contaminate din laborator- deseuri infectioase.

36. Sterilizarea prin cldur uscat; metode, presiune, temperatur, aplicaii

Caldura uscata omoara microorganismele prin oxidarea distructiva a componentelor celulare. Cei mai rezistenti spori sunt distrusi de caldura uscata la 160C, timp de 60 de minute. Caldura uscata de 100 C distruge n 60 de minute bacteriile care sunt omorte prin calduraa umedaa la 60C n 30 de minute. Sporii fungilor sunt distrusi n 60 de minute la 115C, iar cei bacterieni la temperaturi cuprinse ntre 120-160C. n laboratorul de microbiologie se utilizeaza urmatoarele tehnici de sterilizare: ncalzirea la rosu n flacara a obiectelor se aplica anselor bacteriologice n laboratorul de microbiologie; flambarea (trecerea prin flacara pentru cteva secunde) se aplica gtului baloanelor, eprubetelor dupa deschiderea si nainte de nchiderea lor, pipetelor nainte de utilizare pentru a preveni contaminarea cu germenii din aer. Se mai sterilizeaza prin flambare instrumente de mica chirurgie, dupa ce se stropesc cu alcool, dar temperatura produsa nu este suficient de nalta pentru a asigura o sterilizare optima; sterilizarea la pupinel. Pupinelul sau cuptorul cu aer cald este o cutie metalica cu pereti dubli ntre care se gaseste un strat de azbest care mpiedica pierderile de caldura, o sursa de caldura care este energia electrica si un termoregulator. n interior pupinelul este prevazut cu rafturi pentru obiectele de sterlizat. Temperatura de sterilizarea la pupinel este de 180C timp de o ora. La pupinel se sterilizeaza ntreaga sticlarie de laborator, instrumentarul de stomatologie, seringi fara armatura metalica, pudre, uleiuri etc. Pupinelul nu trebuie sa fie suprancarcat, pentru ca aerul sa poata circula nestingherit printre obiectele de sterilizat. sterilizarea cu raze infrarosii este folosita pentru sterilizarea seringilor faraa armaturaa metalicaa la o temperatura de 180C. Sterilizarea se poate efectua si la 200C n vid, aplicndu-se instrumentelor chirurgicale.

37. Congelarea i liofilizarea bacteriilor definiie, efecte asupra viabilitii germenilor, aplicaii
Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc. n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG).

38.Bacteriofagii definiie, structur, tipuri de interaciune fag-bacterie (enumerare)

Bacteriofagii sunt parazii intracelulari obligatorii ale celulelor bacteriene. Toate bacteriile pot fi infectate de ctre bacteriofagi. In majoritatea cazurilor, un fag anume infecteaz doar celulele unui singur gen, unei anumite specii sau a unei tulpini -specificitatea fagului. Aceast specificitate de infecie este determinat de prezena receptorilor pentru acest fag la suprafaa bacteriei-gazd.Se cunosc 6 grupe morfologice de bacteriofagi, cei mai bine studiai fiind bacteriofagii T ai bacilului coli. Morfologie. Bacteriofagii sunt formai dintr-un cap hexagonal, un gt i o prelungire numit picior

(coad). Capul este alctuit dintr-un nveli proteic caracteristic virusurilor (capsida) i adpostete ADN. Coada este un cilindru rigid nvelit ntr-un manon proteic asemntor miozinei i se termin cu o plac hexagonal ce conine o enzim de tipul lizozimului. De placa bazal se aprind 6 fibre cu rol n fixarea bacteriofagului pe suprafaa bacteriei. Ataarea bacteriofagului pe suprafaa peretelui bacterian este determinat de existena unor receptori de perete, specifici. Aceast specificitate este de tip enzimatic i st la baza lizotipiei 2. Dup ataare are loc contracia manonului proteic i bacteriofagul i injecteaz numai ADN n celula bacterian. Interaciunea dintre bacteriofag i celula-gazd Bacteriofagii exist n stare de virioni extracelulari, iar la infectarea unei bacterii ei pot duce la doua tipuri de infecii: Infecie litic: determinat de fagii viruleni. La finele ciclului de multiplicare bacteria infectat este lizat elibernd fagii nou-formati. Infectie nelitica sau lizogen: determinat defagii temperai (moderai). Ei infecteaz bacteriile fr a le distruge.

39.Interaciunea fag-bacterie: ciclul litic (etape, evideniere)

Dup ptrunderea genomului fagic n celula bacterian, acesta va determina sinteza de noi bacteriofagi identici cu cel de la care a provenit ADN. ADN se replic prin replicare semiconservativ iar ribozomii bacterieni vor sintetiza proteinele capsidale i ale cozii. Dup asamblarea noilor virusuri ele vor prsi celula bacterian care se lizeaz. Acesta este ciclul litic al bacteriofagilor, iar ei se numesc fagi viruleni.

40.Interaciunea fag-bacterie: ciclul lizogen, proprietile bacteriilor lizogene

Dar nu ntotdeauna relaiile bacteriofag-bacterie evolueaz n acest fel. Uneori genomul bacteriofagului se va integra n cromozomul bacterian ncadrndu-se i funcional n acesta. n aceast situaie el nu se mai replic dect n acelai timp cu cromozomul bacterian, deci n timpul diviziunii bacteriene i se numete profag. Acest ciclu este ciclul lizogen iar bacteriofagii se numesc fagi temperai. Lizogenia are urmtoarele consecine pentru bacteria n cauz: bacteria lizogenizat este imun la infecia cu acelai bacteriofag, dar nu pentru ali bacteriofagi profagul codific el nsui unele caractere pe care le dobndete astfel bacteria lizogen. Un exemplu clasic n acest sens este toxigeneza la bacilul difteric care este codificat de un profag ce se afl n cromozomul bacterian. Tulpinile de bacili difterici care nu sunt lizogenizate de acest profag, nu sunt capabile s secrete toxina i sunt, deci nepatogene, transducia, mecanism de transfer genetic de la o bacterie la alta, mediat de bacteriofagi Proprietati bacteria lizogene:1. inductia ciclului litic - inductia se poate declansa spontan la un nr de cellule sau poate fi provocata la majoritatea celulelor. 2. Imunitate contra suprainfectiei bacteriile lizogene sunt immune la fagul virulent omolg profagului gazduit. 3. Conversie fagica- poate fi provocata de expresia unor gene ale fagului sau de inavtivarea unor gene cromozomiale la integrarea profagului.

41. ADN bacterian; localizare, structur, rol

ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide. Unitatea structural este format dintr-o baz azotat purinic (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinic (timina, T; citozina, C), o pentoz (dezoxiriboza) i acid fosforic. Legturi fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboz cu carbonul 3 al moleculei adiacente, formnd o caten lung polinucleotidic. Prin analiza compoziiei n baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat c exist o anumit compoziie care difer la diversele specii. Compoziia de nucleotide a ADN-ului este surprinztor de variabil. Suma procentual a citozinei i guaninei variaz la bacterii de la 22% pn la 74%, n timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrns (28 - 58%). La om variaz ntre 39-40% n funcie de tipul de esut (timus 39%; ficat

39,4%). Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor n general i a omului n particular. Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i microorganisme au fost folosite drept fundament n vederea stabilirii relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice (lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat n medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n locuri mai protejate. Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este diferit n funcie de specie, dar se pstreaz constant n cadrul unei anumite specii. Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport difer la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris, 51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus morgani i67% la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori, compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1) La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular. ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei genetice.

42.Replicarea ADN bacterian; mechanism

Structura dublu spiralat a ADN permite replicarea lui identic, semiconservativ. Spirala se deschide ca un fermuar la locul iniial al replicrii sub aciunea unei ADN-giraze. Pe fiecare spiral se va sintetiza o spiral nou, complementar, cu participarea ADN - polimerazei (I, II, III) din direcia captului 5' terminal spre captul 3' terminal. Legaturile de H nu sunt singurele forte stabilizatoare ale moleculei de ADN. Bazele sunt hidrofobe, se stivuiesc si tind sa se separe de mediul apos. Rasucirea helixului aduce bazele mai aproape si apa este exclusa mai eficient. Structura dublu catenara este stabilizata prin interactiunile hidrofobe dintre bazele celor 2 catene. Desi bazele sunt hidrofobe si foarte putin solubile in apa, acizii nucleici sunt destul de solubili, datorita hidrofiliei axei glucid-fosfat si in special, datorita concentratiei mari de grupari fosfat incarcate negativ.Acestea pot avea efect invers, de respingere electrica a celor doua catene, dar prezenta sarurilor in mediu, creeaza un nor de ioni pozitivi care anuleaza respingerea. Replicarea cromosomului bacterian este un proces strict reglat si are loc intr-o etapa bine definita a ciclului celular. Replicarea ADN bacterian este de tip semiconservativ: fiecare din cele doua molecule fiice contine o catena sintetizata de novo si o catena complementara, conservata din molecula parentala (fig. 27). Pentru ca replicarea ADN sa aiba loc, cele doua catene ale moleculei parentale trebuie sa se separe fizic, cel putin pe o secventa scurta, pentru a permite ADN-polimerazei si proteinelor asociate sa citeasca fiecare catena individuala cu rol de matrita. Reasocierea catenelor separate este blocata prin legarea SSB(single stranded DNA-binding protein).

43.Plasmidele; definire, tipuri, roluri n celula bacterian

Plasmidele sunt formaiuni genetice autonome, extracromozomiale, libere n citoplasm, reprezentate de molecule circulare de ADN care se replic independent de cromozom. Denumirea de plasmide le-a

fost dat de Lederberg n 1952, iar importana lor practic a fost sesizat n 1963 de Watanabe, o dat cu descoperirea posibilitii transmiterii prin plasmide a rezistenei la antibiotice ntre bacterii . Bacteriile conin foarte frecvent plasmide, descriindu-se peste 1.000 de tipuri diferite. Lungimea acestor molecule variaz ntre 1-150 mm i greutatea molecular ntre 2-3 milioane (3x103 pn la 450x103 perechi de baze). Plasmidele mici se gsesc de obicei ntr-o celul bacterian n 10-40 de copii, pe cnd cele mari n numr mai redus de 1-3 copii. n aceeai celul nu pot coexista mai multe plasmide nrudite (cu mecanism comun de control al replicrii), ele fiind incompatibile, spre deosebire de cele nenrudite (cu mecanism distinct de reglare al replicrii), care sunt compatibile. Compatibilitatea exprim competiia plasmidelor pentru un anumit situs de legare n celula bacterian. Plasmidele pot fi: conjugative, care se pot transfera singure la alte bacterii, ca de exemplu plasmidele de rezisten la antibiotice R, neconjugative, care nu pot prsi ele nsi bacteria de origine, ci numai prin intermediul unui alt plasmid conjugativ sau a unui bacteriofag (de exemplu plasmidul care codific secreia de beta-lactamaz la S.aureus) episomi, care se pot integra prin recombinare n cromozomul bacterian, pierzndu-i astfel autonomia de replicare. Un exemplu de episom este factorul de sex F (plasmidul F sau factorul de fertilitate). Determinanii genetici eseniali ai plasmidelor codific informaiile legate de replicarea lor autonom, iar cei accesorii caractere fenotipice neeseniale supravieuirii celulei bacteriene n condiii naturale: gene de transfer (tra), de rezisten la antibiotice (factorul R), de secreie a colicinelor (factorul col), de secreie a unor toxine, de metabolizarea unor substraturi, de rezisten la unii ioni i compui organometalici etc. Unele plasmide nu au un efect observabil asupra fenotipului bacteriei i se numesc plasmide criptice. Pentru medicin important este cunoaterea plasmidelor de virulen i a celor care confer bacteriilor rezistena la antibiotice. Plasmidele de virulen poart determinanii genetici ai unor factori de virulen la bacterii, ca de exemplu secreia de enterotoxina (termolabil i termostabil) i factorul de colonizare la Escherichia coli, hemolizina la Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis i E.coli, exfoliantina la S. aureus, gena de invazivitate la Shigella etc.

44.Factorul F i factorul R; definiie, roluri

Plasmidele R -de rezisten la chimioterapice (Factorul R) sunt molecule circulare de ADN care constau n esen din dou regiuni genetice distincte: genele care codific rezistena la antibiotice R, care pot fi unice sau multiple i genele care confer plasmidului capacitatea de a se transfera FTR. Rezistena la peste 90% din tulpinile de spital este de natur plasmidic. Existena acestor plasmide se explic prin aglomerarea mai multor gene de rezisten R, pe acelai plasmid, prin fenomenul transpoziiei repetate de material genetic. Plasmide de rezisten au fost evideniate la genurile Escherichia, Salmonella, Shigella, Proteus, Providencia, Klebsiella, Serratia din familia Enterobacteriaceae, la genurile Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Yersinia, Pasteurella, Campylobacter, Haemophilus, Neisseria, Bacteroides, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Clostridium, i Corynebacterium. Plasmidele prezente la bacilii gram-negativi sunt mai mari dect cele evideniate la bacteriile gram-pozitive. Plasmidul F se mai numete i plasmid de sex, sau factor de fertilitate i conine, pe lng ali determinani genetici, genele de transfer tra. Plasmidul F se poate transmite altor celule bacteriene prin conjugare. El se poate integra n cromozomul bacterian putnd media transferul de gene cromozomiale de la o celul bacterian donor la cea receptor. n funcie de prezena factorului F, bacteriile se mpart n: bacterii F- lipsite de factorul F, denumite celule femele i care sunt receptoare de material genetic, bacterii F+, masculine, care au factorul F+, autonom, ca plasmid n citoplasm i care sunt celule

donoare, bacterii Hfr care au factorul F+ integrat n cromozom, de asemenea masculine, bacterii F care au factorul F+ ca plasmid autonom, dup ce acesta a fost integrat n cromozom i l-a prsit rupnd un fragment ADN din cromozom. i aceste celule dunt donoare, deci masculine.

45.Definii noiunile de genom, genotip i fenotip; variabilitatea genetic i Fenotipic

Genomul reprezint suma genelor unui organism. Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip n interaciune cu mediul ambiant se numete fenotip. Variabilitatea genetic este proprietatea fiinelor vii de a-i schimba, (sub influena mediului i a ereditii, a factorilor externi i interni), nsuirile lor morfologice, fiziologice, biochimice, ecologice, de a se deosebi unele de altele.

46.Mutaiile la bacterii; definiie, tipuri de mutaii, clasificare

Modificrile spontane ale genomului se numesc mutaii i constau din modificarea secvenei de nucleotide dintr-o gen. Ele pot fi punctiforme, inversii, inserii, deleii i mutaii secundare. Mutaiile punctiforme afecteaz un singur nucleotid n cadrul unei gene i sunt reversibile. Consecinele unei astfel de mutaii pot fi: nlocuirea unui codon cu altul, ceea ce se va traduce prin nlocuirea unui aminoacid cu altul din structura unui polipeptid. Aceast mutaie se numete mutaie cu sens greit, apariia unui codon nonsens. Mutaia nonsens mpiedic sinteza n continuare a unui polipeptid, iar dac ea se produce la nceputul genei ce codific un polpeptid - mutaie polar, acesta nu se va mai putea sintetiza deloc. Inseria i deleia nseamn adugarea, respectiv pierderea a dou pn la sute sau chiar mii de nucleotide, procesul fiind ireversibil. Acest tip de mutaie duce la modificarea important a secvenei de aminoacizi, fiind denumit mutaie cu schimbare de proiect. Mutaiile secundare sunt mutaiile reverse, care restabilesc o secven nucleotidic ce s-a modificat, iar mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a unei gene care a suferit o mutaie, fr restaurarea codonilor iniiali. Acest fenomen se explic prin sinteza unui ARNt care tie s citeasc un codon nonsens. Frecvena pe unitatea de timp cu care se produc mutaiile este diferit i se numete rat de mutaie. Mutaia spontan variaz de la gen la gen ntre 10 -6 i 10 -10. Mutaiile duc la apariia unor indivizi cu caractere noi, cum sunt rezistena la chimioterapice, structur antigenic modificat, pierderea unor receptori specifici pentru bacteriofagi, pierderea capacitii de sintez a unui metabolit etc. Din punct de vedere medical intereseaz n mod deosebit mutaia spre chemorezisten care se poate produce dintr-o dat, adic one-step, sau n mai multe etape, multistep. Prin mutaie one-step bacteria devine rezistent brusc peste noapte la un antibiotic, pe cnd prin mecanism multistep se produc mutaii multiple, succesive, pn ia natere o mutant rezistent la concentraii ridicate de antibiotic. Astfel prima mutant va fi puin mai rezistent dect tulpinile slbatice din care provine, mutanta a doua mai rezistent dect mutanta 1 .a.m.d. Dat fiind c mutaiile naturale sunt rare, este necesar un mijloc care s selecteze mutanta pentru ca aceasta s se transforme ntr-o populaie bacterian cu proprieti noi. Rata mutaiei poate fi crescut n mod considerabil prin ageni mutageni, ca, de pild, raze X, UV, derivai acridinici, ageni alchilani etc.

47.Transformarea la bacterii; definiie, mechanism

Reprezint transferul de material genetic de la o celul donor la una receptor sub forma de ADN pur, eliberat fie prin liza celulei donor, fie prin extracie chimic. Acest proces a fost observat pentru prima oar la pneumococi de Griffith n 1928. ADN-ul pneumococilor viruleni, capabili s sintetizeze capsula, s-a transferat la mutante R, nevirulente, acestea din urm dobndind capacitatea de a sintetiza

capsula. Transformarea s-a pus n eviden ulterior la numeroase genuri cum sunt, de pild, Streptococcus, Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella etc. i se petrece nu numai ntre tulpiile aceleiai specii, ci i ntre specii diferite. Transformarea genetic este posibil numai dac bacteria receptoare se afl n stare de competen, stare care-i permite nglobarea de ADN strin. Competena este o stare fiziologic temporar a bacteriei, care variaz n funcie de specie i de faza de multiplicare n care se afl bacteria. Dup unii autori, celulele competente au pe suprafaa lor un antigen special numit factor de competen. n timpul strii de competen se modific structura peretelui celular, care devine mai poros, ncrcat electropozitiv, favoriznd legarea ADN-lui strin. Transformarea depinde n egal msur i de unele proprieti ale ADN transformant, cum sunt structura dublu catenar i o dimensiune minim a moleculei de 1 x 106 daltoni. Cu toate c transformarea s-a descoperit experimental i se practic astzi pe scar foarte larg n tehnicile de inginerie genetic, ea se petrece n mod natural n mediile n care triesc mpreun multe specii bacteriene i unde procesul de liz a celulelor bacteriene este frecvent, ca de exemplu n colon . Aici se pun n libertate cantiti mari de ADN care, dac ntlnete celule bacteriene n stare de competen, va ptrunde i se va recombina cu genomul acestora, conferindu-le caractere noi. Majoritatea bacteriilor nu sunt n mod natural capabile de transformare dar experimental s-au dezvoltat metode de inducere artificial a strii de competen foarte utile ingineriei genetice.

48.Transducia; definiie, mecanism, tipuri de transducie

Transducia reprezint un transfer de gene cromozomiale de la o celul bacterian la alta, mediat de bacteriofagi. Unii bacteriofagi sunt capabili s transfere orice gen bacterian (transducie generalizat) iar alii numai anumite gene (transducia specializat). Transducia generalizat este mediat de fagii viruleni, litici, care dup ptrunderea n celula bacterian se multiplic i determin liza celulei gazd. n timpul lizei celulei bacteriene cromozomul acesteia se fragmenteaz. Se poate ntmpla, ocazional, ca un fragment cu o dimensiune apropiat de cea a genomului fagic s se integreze n capisda bacteriofagului, n locul genomului fagic. Astfel de fagi sunt defectivi i nu se vor mai putea replica, dar pot ptrunde n alte celule bacteriene injectndu-le ADN-ul, ce provine de fapt din genomul celulei donoare. ADN-ul se va integra n cromozomul celulei receptoare prin recombinare, conferindu-i acesteia caractere noi, ca, de exemplu, rezistena la chimioterapice, proprieti ce in de patogenitatea bacteriei etc. Transducia specializat este mediat de fagii temperai. Dup ptrunderea n celula bacterian a ADN-lui bacteriofagului temperat, acesta sufer iniial un proces de circularizare dup care se inser n cromozom prin recombinare sub forma de profag. Inseria n cromozom se face pe baza homologiei dintre 10 perechi de baz ale ADN fagic i bacterian. Profagul devine parte integrant a cromozomului bacterian, se va replica o dat cu acesta i nu independent, deoarece este supus unui proces de represie din partea genomului gazd. Bacteriile care au integrate n cromozomul lor un profag sunt n stare de lizogenie. n anumite condiii, ns, are loc un proces de derepresie i genomul bacteriofagic prsete cromozomul bacterian devenind din nou autonom. Cnd prsete cromozomul bacterian poate detaa din acesta un fragment de ADN care va rmne legat de genomul bacteriofagic. Acest bacteriofag nu se va putea nmuli, fiind defectiv, dar va putea intra n alt celul integrndu-se n cromozomul acesteia tot sub forma de profag. Fragmentul provenit de la prima celul bacterian poate s codifice diferite caractere (rezistena la antibiotice, secreia unor enzime, toxine etc.), ce se vor manifesta fenotipic la noua bacterie gazd. Cel mai bine studiat exemplu de transducie specializat este cea mediat de fagul lambda i gena bacterian ce codific degradarea galactozei (lambda-gal). Transducia specializat nu trebuie s se confunde cu conversia lizogen. In acest caz caracterul nou al celulei bacteriene este codificat chiar de genomul bacteriofagului temperat. Fenomenul a fost descris pentru prima oar, aa cum am mai artat, la Corynebacterium diphteriae, toxigeneza fiind tributar prezenei unui fag temperat n cromozomul bacterian.

49.Conjugarea bacterian
Conjugarea este transferul de material genetic de la o bacterie donoare la una receptoare printr-un proces de mperechere, ce se realizeaz prin contactul direct dintre cele dou celule. Prin conjugare se pot transmite plasmide, precum i gene cromozomiale (prin intermediul factorului F+). Conjugarea la bacilii gram negativi. Factorul F+ poate fi situat, aa cum s-a mai artat, ntr-un plasmid, favoriznd transferul acestuia sau n cromozomul bacterian, fcnd posibil transferul unor gene cromozomiale de la o bacterie la alta. Celulele bacteriene care au factorul F+ integrat n cromozom se numesc Hfr (high freqency of recombination ), deoarece ele pot transfera material genetic cromozomial cu o frecven mare, ceea ce duce la recombinarea unor gene din cromozomul bacteriei donoare cu material genetic al cromozomului celulei receptoare. Prin intermediul factorului F+ inserat n cromozom se poate transfera o copie ntreag a cromozomului celulei donoare la cea receptoare. Transferul integral dureaz n jur de 100 minute. Procesul de mperechere este un mijloc ideal de localizare a genelor pe cromozomul celulei donoare. Ca celul donoare se alege o tulpin Hfr. Aceasta va fi cultivat cu celule F-. Prin agitare puternic a mediului se intrerupe procesul de mperechere la anumite intervale de timp, i se caut recombinani printre celulele receptoare. Cu ct ntreruperea recombinrii se produce mai repede cu att gena studiat se afl mai aproape de vrful moleculei de ADN transferat. Transferul prin conjugare a plasmidelor este condiionat de prezena n plasmid a genelor de transfer tra, care sunt responsabile de sinteza sex-pilului i de transferul plasmidului. Conjugarea ncepe prin sinteza sex-pilului care va adera de receptori specifici prezeni pe peretele celular al bacteriei receptoare. Dup formarea legturii dintre celula donor i cea receptor are loc replicarea de transfer a plasmidului. O caten parental de ADN va rmne n celula donor, iar a doua va trece n celula receptoare, pe tiparul lor sintetizndu-se catene complementare. Din punct de vedere medical importante sunt plasmidele conjugative de rezisten - plasmidele R. Dintre proprietile plasmidelor de rezisten ale bacililor-gram negativi, 3 sunt de interes medical deosebit : frecvena transferrii: frecvena transferului multor plasmide slbatice pe receptori adecvai este relativ sczut 10-4/ cel., i se datoreaz faptului c plasmidele tulpinilor slbatice sunt reprimate, adic produc un represor care inhib activitatea propriei gene de transfer. Dac se incubeaz donorii i receptorii mpreun mai multe ore, numrul de celule recombinante cresc; spectrul de gazde: plasmidele transferabile R circul ntre specii diferite. Acest transfer are loc i n laborator i n macroorganism. S-a descris astfel transferul de plasmide de la bacilul coli nepatogen la salmonele sau shigelle. Nu s-a observat ns transferul plasmidelor de la bacterii gram-negative la cele gram-pozitive; determinanii de rezisten R: caracteristici pentru plasmidele conjugative sunt determinanii de rezisten multipli. S-au evideniat astfel la tulpinile izolate din spital plasmide ce au factori de rezisten fa de toate chimioterapicele uzuale (ampicilina, cefalosporine, streptomicina, tetraciclina, cloramfenicol, kanamycina, gentamicina, sulfonamide). Conjugarea la bacterii gram-pozitive S-au descris procese de mperechere i la bacteriile gram-pozitive ca, de pild, la genurile Streptococcus, Streptomyces, Clostridium, procesul bazndu-se pe performana celulei receptoare. Celula receptoare produce un peptid cu mol. mic (GM=1000 daltoni) care determin sinteza unor substane proteice de agregare de ctre celula donoare cu afinitate pentru unele substane adezive de pe suprafaa receptorului. Se produce astfel o legtur strns ntre receptor i donor cu formarea unei puni intercelulare care permite transferul de material genetic. Prin analogie cu substanele atrgtoare la insecte peptidul ce induce substana de agregare a fost desemnat ca sexpheromon.

50.Substane antibiotice; definiie, utilizri n clinic i laborator

Antibioticele i chimioterapicele antimicrobiene reprezint un grup de substane medicamentoase

capabile s distrug sau s inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic n bolile infecioase. Au o aciune selectiv asupra celulelor microorganismelor, exercitnd aciuni minime asupra celulelor organismului gazd. Aceste substane pot fi: - antibacteriene, - antivirale, - antifungice, - antiparazitare. n mod clasic, n aceast grup de medicamente au fost incluse i antineoplazicele (ex. dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Exist i antibiotice folosite ca: inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini), imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizat de Tolypocladium inflatum), hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus), insecticide, ierbicide etc.

51.Antibiotice bactericide i bacteriostatice; definiii, exemple

Un chimioterapic bacteriostatic, care opreste doar nmultirea bacteriilor, nu le va putea elimina din tesuturi fara interventia factorilor rezistentei naturale si dobndite. n lipsa mecanismelor acestora nici chimioterapicele bactericide nu sunt eficient deoarece ntr-o populatie bacteriana exista ntotdeauna cteva tulpini cu rezistenta fenotipica, asa-numitele tulpini persistente (persister) care apar n culturile in vitro cu o frecventa de 1/106 -1/108. Dupa ntreruperea chimioterapiei, aceste tulpini se vor nmulti si vor produce recidive. mpartirea chimioterapicelor n bacteriostatice si bactericide este artificiala, deoarece actiunea statica sau/si cida este conditionata si de concentratia chimioterapicului, timpul de actiune si specia bacteriana asupra careia actioneaza.

52.Clasificarea substanelor antimicrobiene dup mecanismul de aciune; exemple

a). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid i sunt reprezentai de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc; b). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea funciei membranei celulare; au efect bactericid i sunt reprezentai de polimixine (polimixin B, colistin), gramicidin, tirocidin, imidazoli, nistatin, amfotericin B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice); c). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc; d). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc.

53.Clasificarea antibioticelor dup structura chimic; clase principale, exemple

1. Antibioticele betalactaminice a). Penicilinele - penicilinele naturale (de exemplu penicilina G); -penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina); - aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina); - alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina, epicilina); - peniciline stabile n prezena unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; n aceast categorie ar putea intra i ampicilina, amoxicilina, ticarcilina i piperacilina); - peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina); - alte peniciline i inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilin / ticarcilin, sulbactam + ampicilin, tazobactam + piperacilin);

b). Cefalosporinele - din generaia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina); - din generaia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima); - din generaia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona); - din generaia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma). Cefalosporinele se mai pot clasifica i n: cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc); cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc); cefalosporine care prezint o mai bun stabilitate n prezena beta-lactamazelor (cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc); cefalosporine cu activitate fa de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc). c). Alte antibiotice beta-lactaminice - monobactamii (de exemplu aztreonamul); - penemii (de exemplu ritipenemul); -carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei); - oxacefemii (ex. latamoxef); - carbacefemii (ex. loracarbef). d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). 2. Glicopeptidele (teicoplanina i vancomicina); Vancomicina este utilizat n tratamentul infeciilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administreaz intravenos deoarece nu se absoarbe n tractul gastrointestinal. Printre reaciile adverse amintim reaciile anafilactice, febr, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului. 3. Aminoglicozidele - streptomicina (care este de fapt un oligozaharid); - kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.; 4. Ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc); 5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina); 6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul); 7. Antibioticele care nu se ncadreaz n nici una din grupele de mai sus - cloramfenicolul; - lincosamidele (lincomicina i clindamicina); - acidul fusidic (cu o structur asemntoare steroizilor); - streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin); - oxazolidinonele (linezolid); - mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite n special ca rspuns la apariia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilin etc.

54.Rezistena la aciunea antibioticelor; definiii, tipuri

Se deosebesc doua tipuri de rezistenta a bacteriilor la antibiotice: - rezistenta naturala, care este un caracter de specie, determinat genetic, deci absolut - rezistenta dobndita, care apare la tulpinile unor specii natural sensibile la un anumit antibiotic. Ea este relativa, deoarece desemneaza rezistenta unei tulpini la concentratiile de antibiotic utilizate n terapie. Numarul tulpinilor cu rezistenta dobndita este n continua crestere. Rezistena natural (intrinsec) reprezint rezistena tuturor membrilor unei specii bacteriene fa de un antibiotic i este determinat genetic, de exemplu rezistena bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G. Rezistena dobndit este acea rezisten necaracteristic unei specii bacteriene, dar achiziionat de

anumite subpopulaii din acea specie n circumstane date; de exemplu, antibioticul acioneaz ca un presor selectiv (pacientul are o infecie n care majoritatea populaiei bacteriene este sensibil la agentul antimicrobian, dar exist tulpini care prezint rezisten; n aceste condiii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse n timp ce tulpinile rezistente vor fi selectate; aceast situaie nu poate fi detectat dect utiliznd tehnicile de testare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice i chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetric standardizat). Rezistena dobndit poate fi cromozomial sau extracromozomial. Mecanisme biochimice implicate n rezistena la antibiotice - producerea de ctre bacterie a unei enzime care inactiveaz antibioticul, de exemplu penicilinaza stafilococului auriu (codificat plasmidic) care inactiveaz nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii); - scderea permeabilitii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu formele L); - elaborarea n exces de ctre bacterie a unor enzime complementare, care limiteaz sau anuleaz aciunea antibacterian a antibioticului, exercitat la nivelul enzimei respective; - alterarea intei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale); - amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulndu-se astfel prin diluare aciunea inhibitorie a sulfamidelor etc

55.Antibiograma difuzimetric; principiu, interpretare

Antibiograma este metoda de testare a sensibilitatii/ rezistentei la antibiotice si substante chimioterapice, a unei tulpini bacteriene izolate si identificate, dintr-un prelevat patologic. n examenele bacteriologice de rutina se utilizeaza antibiograma difuzimetrica, n mediu solid, dupa tehnica Kirby-Bauer. Ea consta n nsamntarea tulpinii de cercetat pe suprafata unui mediu solid si aplicarea unor microcomprimate de antibiotice pe suprafata mediului. Dupa o termostatare de 16 ore se apreciaza sensibilitatea germenelui n functie de diametrul zonei de inhibitie care apare n jurul microcomprimatului de antibiotic. Fiecare firma producatoare de microcomprimate livreaza, mpreuna cu acestea, o lista din care rezulta corespondenta diametrului zonei de inhibitie masurat n mm si sensibilitatea la fiecare microcomprimat. Exprimarea rezultatelor se face in acord cu standardul CLSI/ EUCAST, prin incadrarea marimii diametrului de inhibitie a cresterii culturii, in categoriile: sensibil/ S, intermediar/ I, rezistent/ R.

56.Definii noiunea de CMI i CMB; cum se determin i care este utilitatea determinrii CMI i CMB ?
Concentratia minima inhibitorie (CMI) a unui antibiotic pentru o anumita tulpina bacteriana este cea mai mica concentratie care inhiba complet multiplicarea tulpinii respective. Concentratia minima bactericida (CMB) a unui antibiotic pentru o tulpina este concentratia minima care omoara tulpina. Cu ct CMI sau CMB sunt mai mici fata de nivelul seric maxim pe care l poate atinge un antibiotic, cu att acesta este mai activ. Majoritatea antibioticelor se administreza la intervale de timp fixe n functie de perioada de njumatatire a antibioticului. n unele cazuri, timpul de njumatatire este att de scurt nct este necesara administrarea continua a antibioticului prin perfuzie. La administrarea intermitenta a unui antibiotic, concentratia plasmatica depinde de doza, de intervalul administrarii, de absortia si eliminarea antibioticului. Cu ct perioada de resorbtie este mai lunga cu att concentratia va fi mai mica. Prin eliminare se nteleg procesele prin care se inactiveaza principiul activ al unui antibiotic sau se elimina din organism. De obicei eliminarea are loc prin filtrare glomerulara sau prin secretie tubulara. Mai rar, unele antibiotice se pot elimina prin intestin, dupa ce urmeaza un ciclu enterohepatic de retrorezorbtie sau sunt metabolizate n ficat prin reactii de oxidare, reducere, hidroliza sau conjugare. Raportul dintre concentratia sanguina a chimioterapicului si cea din focarul infectios depinde de pe de o parte de diferitele proprietati fizico-chimice ale chimioterapicului iar pe de alta parte de macroorganism. Constanta de disociere (pK), solubilitatea, dimensiunea moleculara a antibioticului si

alti factori cum sunt perfuzarea diferitelor organe si tesuturi, pH-ul plasmei si n focarul infectios etc. influenteaza repartizarea regionala si astfel raportul dintre concentratia plasmatica si cea din focar. Recent s-a introdus o alta varianta de antibiograma pe mediu solid, testul E, care permite stabilirea precisa a CMI. n loc de microcomprimate se aplica pe mediul de cultura nsamntat fsii de hrtie de filtru impregnate cu antibiotic n concentratie crescnda. Astfel, la un capat al fsiei concentratia este minima iar la celalalt capat maxima. Dupa diametrul zonei de inhibitie corespunzatoare fiecarei concentratii se va putea calcula CMI. Cunoscnd CMI pentru antibioticele la care un germene este sensibil, nivelul seric maxim care se poate realiza si capacitatea de difuziune a antibioticului n focarul infectios se va putea alege varianta optima de tratament.

57.Definii noiunile de simbioz, comensalism, parazitism; exemple

Relaii de comensalism, n care un microorganism are nevoie de un altul, fr ca fenomenul s fie valabil i invers. De pild, Haemophilus influenzae are nevoie pentru cretere i multiplicare de factor V pe care l secret Staphylococcus aureus. Aplicaia practic a acestui raport dintre cele dou specii se folosea n trecut pentru izolarea Haemophilus influenzae dintr-un produs patologic n care se bnuia prezena lui prin nsmnarea n striu transversal a unei tulpini de Staphylococcus aureus. Coloniile de Haemophilus se dezvolt doar n jurul culturii de stafilococ. Acest fenomen se numete satelitism. Simbioza const n asocierea a dou specii care se favorizeaz reciproc. Astfel, aciditatea produs de bacilii lactici favorizeaz dezvoltarea levurilor, care consum la rndul lor acidul lactic. scderea aciditii permite dezvoltarea bacililor lactici. Parazitismul const n folosirea unei specii de ctre o alt specie ca habitat. Exist multe forme de parazitism ntre microorganisme, dar din punct de vedere medical importante sunt virusurile care paraziteaz bacterii (bacteriofagii). Prin relaiile care se stabilesc ntre bacteriofagi i celulele parazitate se pot rspndi diverse caractere, dintre care de interes medical sunt cele legate de patogenitatea i rezistena la antibiotice ale bacteriilor. Acest aspect a fost discutat n capitolul de genetic bacterian.

58.Definii patogenitatea i virulena; exemple de factori de patogenitate

Patogenitatea este un proces complex i multi-factorial, care cuprinde totalitatea mecanismelor biochimice prin care microorganismele produc infecii. Este un caracter de specie. Virulena este gradul de patogenitate a unei tulpini n cadrul specie; este un caracter de tulpin. Factorii de patogenitate ai bacteriilor: ataarea i ptrunderea n organismul gazd; invadarea local sau general a organismului; multiplicarea n organismul gazd i secreia unor factori de patogenitate.

59.Flora microbian normal a organismului uman

Organismul uman este populat de foarte multe de specii bacteriene i de un numr mai mic de virusuri, fungi i protozoare. Flora normal a organismului depinde de o serie de factori, cum sunt: vrsta, regimul alimentar, statusul hormonal, starea de sntate, condiiile de igien colectiv i personal. Este foarte dificil definirea exact a speciilor care alctuiesc flora normal, deoarece o serie de specii patogene pot fi i ele prezente temporar pe tegumente i mucoase, fr s produc nbolnviri. De exemplu, pneumococul i meningococul sunt bacterii patogene, fiind cauza unor infecii foarte grave. Totui ele se gsesc la 10% din populaia sntoas. Zonele organismului populate n mod normal cu microorganisme sunt: pielea, tractul respirator superior (vestibul nazal, faringe), tubul digestiv (cavitatea bucal i intestinul gros), tractul urinar (partea anterioar a uretrei) i vaginul. n zonele intens colonizate, ca, de pild, n intestinul gros, numrul de bacterii este de 1 x 1012/ml pe cnd n zonele cu flor mai redus, cum sunt pielea, vaginul, numrul lor nu depete n mod normal 1 x 106/ml. n afar de aceste zone, microorganisme mai pot aprea n numr mic i n mod pasager n restul

tractului respirator, digestiv i n uter, fiind rapid ndeprtate de mijloacele de aprare ale organismului. Sngele, lichidul cefalorahidian, lichidele sinoviale, din seroase, esuturile profunde sunt sterile. Prezena microbilor n aceste zone are ntotdeauna o semnificaie patologic.

60.Definii noiunile de exotoxin, endotoxin, anatoxin i antitoxin; exemple

Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi lizogenizai (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2) Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legrii de receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu i exercit efectele toxice dect dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt secretate n timpul vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei botulinice). Endotoxinele au fost evideniate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de acetia i apoi incluse n peretele bacterian, eliberndu-se n urma distrugerii germenilor. Au structur lipopolizaharidic (LPZ sau LOZ), n constituia lor intrnd acizi grai, un lipid A i lanuri de polizaharide. (Figura nr. 6) Au efecte toxice la nivelul celulelor majoritii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacterian care le elibereaz. Toxicitatea lor este ceva mai redus (n comparaie cu exotoxinele), dar pot aciona la mai multe nivele inducnd apariia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilitii vasculare, hipotensiunii arteriale pn la colaps, sindromului de coagulare intravascular diseminat etc. Sunt implicate ntre altele n apariia ocului endotoxic (se elibereaz o cantitate de endotoxin proporional cu numrul germenilor distrui). Studiile arat c mortalitatea n ocul endotoxic este n relaie destul de direct cu cantitatea de endotoxin / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identific 100 uniti endotoxin / ml de plasm. Antitoxinele Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare specific cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific. De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului). Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai pe cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai curnd posibil. Tratamentul acestor entiti clinice este complex i nu reprezint subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie fcut dup o testare a unei eventuale hipersensibiliti i n cazul c aceasta exist se recurge la desensibilizare i abia ulterior la seroterapie (administrarea de antitoxin). O alternativ ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dac acestea sunt disponibile. Anatoxinele Exotoxinele pot fi detoxifiate ntr-un anumit interval de timp sub aciunea conjugat a temperaturii i formolului. Prin acest procedeu i pierd puterea toxic, dar i menin puterea imunogen i devin anatoxine. Anatoxinele se utilizeaz n profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (n cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum i pentru hiperimunizarea animalelor n scopul obinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc).

61.Inflamaia; definiie, factori care determin procesul inflamator

Inflamatia acuta este rezultatul schimbarilor ce se petrec ntr-un tesut ca raspuns la o agresiune mecanica, chimica sau infectioasa. Ea este un mecanism de aparare antiifectios rapid, care tinde sa localizeze infectia si sa previna diseminarea ei. Manifestarile locale ale inflamatiei sunt eritemul (rubor), caldura (calor), durerea (dolor) si edemul (tumor).

Inflamatia poate evolua spre vindecare cu restitutio ad integrum a tesuturilor sau cu sechele. Deznodamntul unei reactii inflamatorii depinde de extinderea procesului inflamator, de microorganismele implicate, precum si de reactivitatea gazdei. Cele 3 evenimente majore ale inflamatiei sunt: vasodilatatia capilara locala, modificarile structurale microvasculare, acumularea leucocitelor la locul injuriei. Vasodilatatia capilara. Mediatorii plasmatici ai inflamatiei, ca, de pilda, complementul, exista sub forma unor precursori care, asa cum am vazut, devin biologic activi numai dupa activare. Activarea C3 a complementului este o etapa critica a inflamatiei. C3a si C5a rezultate n cursul activarii complemenetului sunt anafilatoxine puternice ce determina degranularea mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici. O parte dintre acestia sunt preformati, asa cum este histamina. Ea are actiune vasodilatatoare asupra capilarelor, crescnd totodata si permeabilitatea acestora. n consecinta, se produce o exudare din capilare spre zona infectata a plasmei cu mediatorii pe care aceasta i contine. Modificarile structurale microvasculare si acumularea de leucocite. Sub actiunea unor mediatori chimici rezultati n timpul activarii complementului si secretati de macrofagele stimulate de toxine bacteriene se modifica endoteliul capilar, care permite adeziunea PMN de acesta. PMN sunt atrase de factorii chemotactici de natura bacteriana, de cei produsi n urma activarii complementului si de cei rezultati din degranularea mastocitelor. Ele vor parasi capilarul prin diapedeza si se vor ndrepta catre focarul inflamator unde vor distruge microbii prin fagocitoza.

62.Definii noiunile de infecie, infecie inaparent, stare de boal i stare de purttor de germeni
Infecia reprezint un tip particular de relaie ntre microorganismele condiionat patogene i patogene pe de o parte i organismul gazd pe de alt parte. Pentru ca s se declaneze un proces infecios i s apar infecia, microorganismele trebuie s ptrund n organismul gazd, s depeasc barierele i mecanismele de aprare, s-l colonizeze, s se multiplice i eventual s intre ntr-un lan de transmitere prin intermediul cruia poate contamina o nou gazd. Infecia inaparent nu se asociaz cu semne sau simptome i ar putea fi decelat numai prin examene de laborator. Spre deosebire de infecia latent, infecia inaparent este limitat n timp i poate contribui la crearea unei stri de imunitate (ex. infecia cu Neisseria meningitidis, infecii cu Haemophilus influenzae etc). Starea de boal (manifest clinic sau fr ca modificrile aprute s fie exteriorizate i constatabile de ctre medicul clinician) se datorete interaciunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazd i este urmat de apariia unor simptome (de ex. temperatur peste 39C, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) i de reacii funcionale din partea gazdei (de ex. stare general modificat, senzaie de febr, frisoane, creterea numrului de respiraii pe minut, creterea numrului de bti cardiace pe minut etc). Infecia nu este urmat obligatoriu de starea de boal, putnd fi inaparent, subclinic sau latent. Starea de purttor de germeni se refer la bolnavul cu o stare infecioas, la persoana aflat n convalescen, nainte de eradicarea infeciei suferite dar i la persoanele aparent sntoase care adpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul putndu-se cantona la acest nivel dup o febr tifoid). Starea de purttor reprezint atingerea unui echilibru relativ ntre cele dou verigi, de multe ori fiind nsoit de eliminarea n mediu a germenilor care au produs infecia i se afl n diferite focare latente (precum n exemplul de mai sus, situaie n care starea de purttor se elimin doar prin extirparea veziculei biliare)

63.Definii noiunea de rspuns imun i precizai principalele sale atribute

Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i anume: activarea limfocitelor, eliberarea a diverse molecule, multiplicarea celulelor specifice, producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la eliminarea acestuia (direct sau indirect). Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T i B de memorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiai antigen. Principala caracteristic a imunitii este specificitatea. O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen. Rspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de ctre celule.

64.Definii rspunsul imun umoral i specificai celulele implicate n realizarea sa

Rspunsul imun umoral Soarta antigenelor, deci i a microorganismelor care ptrund n organism, depinde de calea de ptrundere i de penetrarea barierelor externe ale aprrii antiinfecioase. Dac microorganismul ptrunde direct n snge, va ajunge n splin unde va avea loc i rspunsul imun. Microorganismele care ptrund n tegument ajung pe cale limfatic la primul ganglion limfatic, iar cele care au reuit s traverseze mucoasele (digestiv, respiratorie) vor ajunge n sistemul limfatic ataat mucoaselor (MALT). Indiferent de calea de ptrundere a antigenelor (cu excepia celor timoindependente), ele vor fi preluate prin fagocitoz de macrofage. n macrofage, antigenele vor fi digerate de enzimele lizozomale pn la eliberarea epitopilor secveniali, care sunt ntotdeauna peptide scurte. Epitopii secveniali ajung printr-un mecanism nc necunoscut la suprafaa macrofagului, care l prezint limfocitului Th n asociaie cu complexul major de histocopatibilitate MHC de clasa II. n contact cu un limfocit Th a crui receptor este complementar antigenului prezentat n asociaie cu MHC de clasa II i poart la suprafa antigenul CD4, se produce un semnal care va stimula secreia de Interleukin-1 (IL-1) de ctre macrofag. Aceasta va aciona asupra limfocitului T-helper care va secreta IL-2, care are induce creterea celuelor ce au receptori pentru aceast interleukin, printre care chiar limfocitul Th (activare autocrin). Stimularea limfocitului Th este esenial n rspunsul imun, deoarece Th va stimula n continuare limfocitele B, care vor produce efectorii umorali ai imunitii (anticorpii) i celulele Tc, efectorii imunitii celulare. n timp ce limfocitul Th este stimulat de epitopul secvenial, prelucrat i prezentat de macrofage, al unui antigen, un limfocit B este stimulat la rndul su de epitopul structural, neprelucrat, nativ. Stimularea de ctre epitopul structural este un prim semnal pentru limfocitul B, dar insuficient pentru a produce un rspuns n anticorpi. Aici intervine limfocitul Th care a fost stimulat de epitopul secvenial al aceluiai antigen. Limfocitul Th va secreta dup activare un factor de cretere i un factor de difereniere pentru limfocitele B, care se vor transforma n limfoblati, plasmoblati i n final plasmocii secretori de anticorpi. Deci, ca un antigen microbian s induc un rspuns n anticorpi, el va trebui s fie fagocitat pe de o parte de macrofag care i va evidenia epitopul secvenial (numit carrier n trecut), iar pe de alt parte va fi recunoscut prin epitopul structural de pe suprafaa lui (hapten) direct de limfocitul B care, sub influena citokinelor secretate de limfocitului Th, va deveni celul secretoare de anticorpi. n decursul rspunsului imun o parte din limfocitele Th i B se vor diferenia n limfocite T, respectiv B de memorie care vor iniia la o stimulare ulterioar cu acelai antigen un rspuns secundar mai rapid i eficient.

n afar de antigenele timodependente mai exist i antigene timoindependente. Acestea sunt n general antigene cu epitopi repetitivi (care se repet n mod regulat de-a lungul moleculei ca, de exemplu, polizaharidul pneumococic), ele avnd proprietatea de a stimula direct limfocitele B, fr participarea limfocitelor T. Aceste antigene induc un rspuns n anticorpi discret i fr memorie imunologic

65.Enumerai tipurile de imunitate i descriei-le pe scurt

Imunitatea poate fi motenit (trstur de specie, se transmite ereditar) i dobndit. Imunitatea poate fi dobndit activ, dup contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian). Evenimentul imunologic poate aprea dup o infecie (natural) sau dup administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunitii dobndite activ este faptul c, de regul, protecia este de durat. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul c instalarea rspunsului imun are loc lent, mai ales n cazul RIP. Imunitatea poate fi dobndit i pasiv, prelund anticorpi produi de ctre o alt gazd. Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxin difteric / tetanic / botulinic (artificial) pune la dispoziia gazdei infectate, imediat, o cantitate important de antitoxin, n vederea neutralizrii ct mai rapid a toxinei implicate patogenic. n mod natural, ftul i nou nscutul beneficiaz de protecie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) provenii de la mam. Avantajul imunitii dobndite pasiv este rapiditatea, n timp ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru care este oferit protecia iar pe de alt parte, de riscurile unei hipersensibilizri, atunci cnd sunt utilizai anticorpi provenind de la o alt specie (ex. n cazul administrrii de ser recoltat de la cal hiperimunizat). Exist i posibilitatea dobndirii unei imuniti activ - pasiv, atunci cnd se administreaz concomitent (dar n locuri diferite) ser imun i un vaccin (ex. n suspiciunea infeciei cu Clostridium tetani). Mult timp s-a considerat c cele 2 tipuri de imunitate acioneaz independent, imunitatea nnscut oferind prima linie de aprare mpotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobndit intervenind mai trziu, pentru a elimina infecia. ns, interaciunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evident: imunitatea adaptativ profit de abilitatea imunitii nnscute de a distinge ntre agenii patogeni, microbii benefici i factorii de mediu. Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, n strns colaborare

66.Organele centrale i periferice ale sistemului imun; localizare, funcii

Organele limfoide primare Sunt mduva osoas roie i timusul. n aceste organe limfocitele devin celule imunocompetente, dobndind repertoriul de recunoatere a antigenelor i proprietatea de a deosebi selful de non-self. Acest proces de colarizare se desfoar n absena antigenelor din mediul extern. n timus prolifereaz limfocitele T, din care 10% dobndesc caracterul imunocompetent iar restul de 90% sunt distruse. La psri, limfocitele B migreaz i se difereniaz ntr-un organ numit bursa lui Fabricius. La mamifere, deci i la om, ele rmn n mduva roie i se difereniaz aici, mduva roie fiind i un organ limfoid secundar. Organele limfoide secundare Dup diferenierea lor n organele limfoide primare, limfocitele B i T migreaz pe calea vaselor sanguine i limfatice n organele limfoide secundare, care sunt ganglioni limfatici, splina, amigdalele i esutul limfoid ataat mucoaselor (MALT). Limfocitele imunocompetente care populeaz organele limfoide secundare sunt celule antigen-reactive. Deci spre deosebire de organele limfoide primare, unde instruirea se face n absena antigenului, n organele limfoide secundare prezena acestuia este obligatorie. Ganglionii limfatici au rolul unui filtru pentru antigenele venite pe cale limfatic i care vor fi preluate de celulele prezentatoare de antigen (CPA): macrofage, celulel foliculare dentritice). Sub capsula conjunctiv a ganglionilor se afl sinusul subcapsular, marginat de macrofage. Limfocitele i antigenele ajung din alte regiuni aici prin vasele limfatice aferente. Zona cortical a ganglionului conine limfocitele B organizate n foliculi limfoizi, care prezint centrii

germnativi dac au fost stimulai antigenic. Zona paracortical conine limfocite T care sunt n contact strns cu celulele dendritice (prezentatoare de antigen). Zona medular conine limfocitele T i B, plasmocite, dispuse n cordoane i macrofage aezate de-a lungul traveelor conjunctive. n trecerea limfei de la vasul limfatic aferent spre cel eferent, antigenele sunt fagocitate de macrofagele din zona medular. Fiecare ganglion limfatic are o vascularizaie arterial i venoas proprie. Limfocitele circulante intr n ganglion la nivelul endoteliului specializat al venulelor postcapilare a zonei paracorticale. Limfocitele nu pot prsi ganglionul dect prin vasul limfatic eferent. Pentru a ajunge din nou n circulaia sanguin trebuie s strbat toat circulaia limfatic pna la vena subclavicular. Splina este format din pulpa roie implicat n distrugerea eritrocitelor mbtrnite i pulpa alb care reprezint esutul limfoid al splinei. Acest esut este organizat n jurul arteriolelor centrale, constuituind arii limfoide periarteriolare. Ele cuprind o zon adiacent arteriolei care conine limfocite T, n jurul acestei zone dispunndu-se limfocitele B, organizate fie n foliculi primari nestimulai, fie n foliculi secundari stimulai ce conin centri germinativi. n zona marginal a centrilor germinativi se gsesc macrofage i celule dendritice. Limfocitele intr i prsesc splina prin capilarele aretriolei centrale situate n zona marginal, deoarece splina ne dispune de un drenaj limfatic asemntor ganglionilor limfatici. Sistemul imun al mucoaselor (MALT)1este format din esut limfoid ataat mucoasei gastrointestinale, respiratorii i a tractului uro-genital i este deosebit de important n aprarea antiinfecioas dobndit deoarece este principala barier antiinfecioas fa de microorganismele care ptund n organism pe cale digestiv, respiratorie i urogenital. Mai bine cunoscut este esutul limfoid asociat bronhiilor (BALT2) cu rolul de a capta antigenele venite pe calea aerului i esutul limfoid asociat intestinului (GALT3) care preia antigenele venite pe cale digestiv. BALT este format din foliculi i alte agregate limfocitare dispuse n ntreg sistemul bronic, mai ales la bifurcaia broniilor, bronhiilor i bronhiolelor. Dispune de o reea foarte organizat de capilare, arteriole, venule i vase limfatice eferente ceea ce arat c joac un rol de filtru pentru toate antigenele care ajung aici, fie pe cale respiratorie, fie circulatorie. Antigenele venite pe cale respiratorie sunt preluate de celulele M sau Owen). GALT este alctuit din plcile lui Peyer (aglomerri submucoase de limfocite B i T de-a lungul intestinului care sunt stimulate de antigenele ce ptrund pe cale digestiv) i limfocitele intraepiteliale.

67.Enumerai celulele implicate n rspunsul imun

Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, n diferite msuri, n imunitate. Limfocitele T i B suntelementele centrale alerspunsului imun specific. Celulele NK sunt celule fundamentale (alturi de fagocite) n imunitatea nnscut. Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele i mastocitele acioneaz n diferite momente ale rspunsului imun.

68.Limfocitele T origine, evoluie, tipuri, funcii

Limfocitele T reprezint 69-80% din limfocitele circulante. Ca i limfocitele B, ele recunosc n mod specific un numr imens de antigene ceea ce nseamn c i ele trebuie s dispun de un mecanism care s le garanteze variabilitatea receptorilor. Principiul mecanismului de sintez a receptorilor este asemntor celui prin care se sintetizeaz anticorpii. Se deosebesc i aici fragmentele de genele V,D,J, posibilitatea de variablitate fiind foarte mare. Markerii de surafa a limfocitelor T. La suprafaa limfocitelor T se gsesc markerii care individualizeaz subpopulaiile de limfocite T. Limfocitele T helper (Th) alctuiesc o subpopulaie de limfocite care dup interaciunea cu antigenul stimuleaz limfocitele B n elaborarea unui rspuns imun umoral n anticorpi, limfocitele Tc pentru obinerea unui rspuns celular i activeaz macrofagele. Markerul de suprafa a limfocitului Th este

molecula CD4+. Limfocitele T supresoare (Ts) limiteaz expansiunea clonal a limfocitelor B i T stimulate antigenic participnd la reglarea intensitii rspunsului imun. Limfocitele T citotoxice (Tc) sunt stimulate prin antigene care sunt exprimate la suprafaa celulei gazd ca, de pild, celule virus infectate, celule infectate cu microbi cu habitat intracelular sau celule tumorale pe care sistemul imun nu le mai recunote ca self. Markerul de suprafaa este tot CD8+. Limfocitele TDH1 sunt limfocite care au pe suprafaa lor marker CD4+ fiind responsabile de producerea hipersensibilitii de tip ntrziat (vezi capitolul de hipersensibilitate). Ele secret dup stimulare antigenic limfokine care activeaz macrofagele ce adpostesc bacterii cu habitat facultativ sau obligator intracelular. Limfocitele T cu memorie se formeaz n timpul rspunsului primar, ele avnd o viaa de aproximativ 40 de ani. Memoria lor imunologic ns se intinde pe o perioad de 10-15 ani.

69.Limfocitele B origine, evoluie, tipuri, funcii

Limfocitele B reprezint 2-12% din limfocitele circulante. Ele au pe suprafaa lor markerul CD19 i antigene MHC de clasa II. Cnd limfocitul B este stimulat corespunztor prin limfocitul T-helper sau mai rar de antigene timoindependente, el ncepe s se divid transformndu-se n limfoblati care dau natere la plasmoblati, apoi la plasmocite. Toate celulele provenite dintr-un singur limfocit B aparin unei singure clone celulare, productoare a milioane de anticorpi identici care vor fi eliberai n mediul intern. Pe suprafaa limfocitelor B se gsete BCR care permite celulelor B s recunoasc antigenele specifice. Cele mai multe limfocite B sunt sub control direct al limfocitelor T-helper care stimuleaz activitatea lor i T-supresoare care o deprim. Exist ns i limfocite timoindependente, care nu necesit cooperarea cu limfocitele T reglatoare fiind stimulate direct de antigen. Dup stimulare antigenic, limfocitele se difereniaz, n afar de plasmocite secretoare de anticorpi, i n limfocite B cu memorie, care sunt celule cu via lung, fiind responsabile de un rspuns umoral rapid la o stimulare ulterioar cu acelai antigen.

70.Sistemul mononuclear origine, tipuri de celule, funcii

Monocitele / macrofagele reprezint o linie celular cu funcie important n imunologie, prin intervenia lor n imunitatea natural, n prezentarea antigenic i n reacia imun specific. Principalele funcii ale sistemului MM sunt reprezentate de: recunoaterea structurilor strine (non-self) sau modificate, fagocitarea, prelucrarea i prezentarea acestora (n context MHC), citotoxicitate, citostatism, secreie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-) i reglarea reaciilor n cadrul rspunsului imun. Macrofagele, alturi de celulele dendritice i celulele epiteliale, formeaz sistemul reticulo-histiocitar (SRH). Macrofagele pot fi observate n toate esuturile. Se formeaz n mduva osoas hematogen, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast i cnd devin mature poart numele de monocite. n acest stadiu, moleculele MHC II fie nu exist fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcional redus (devin foarte bine reprezentate dup stimulare). Monocitele circul n snge 6-8 ore, dup care migreaz n esuturi unde iau nume diferite i ndeplinesc funcii diferite: histiocite n esutul conjunctiv; celule gliale (microglii) n esutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer n ficat; macrofage splenice; macrofage peritubulare n rinichi; macrofage ganglionare, n mduva osoas i timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rndul lor, o capacitate fagocitar fa de limfocitele n apoptoz). Monocitele / macrofagele prezintreceptori pentru carbohidrai, receptori pentru M-CSF, receptori

pentru imunoglobuline i complement. n cadrul procesului de recunoatere, fagocitare i prelucrare a structurilor strine sau a structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea gruprilor specifice, necesare stimulrii rspunsului imun.

71.Granulocitele tipuri, rol n imunitate

Neutrofilele Sunt cele mai abundente granulocite din circulaia periferic. Neutrofilele intervin n: imunitatea natural prin fagocitoz i imunitatea specific, datorit receptorilor proprii pentru imunoglobuline i complement, n colaborare cu limfocitele i alte APC. Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecios sunt: complexele Ag-Ac, subcomponenta C5a a sistemului complement, derivaii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4). Dup fagocitare, PMN utilizeaz pentru degradarea structurilor strine diferite enzime precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze). Sunt generai i radicali activi de oxigen. Eozinofilele Eozinofilele reprezint n mod normal ntre 1% i 3-5% din leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor crete n alergii sau n infeciile parazitare. Funcia lor fagocitar, prin receptorii de IgG i IgE i mecanismul ADCC, este relativ limitat. Totui, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conin produi toxici pentru diferii parazii. Pe de alt parte, eozinofilele produc histaminaz i arilsulfataz care inactiveaz histamina i respectiv 0leucotrienele produse de mastocite. Prin aceti factori se reduce rspunsul inflamator i migrarea leucocitelor n focarul infecios. Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor n cadrul imunitii nnscute i adaptative ndreptate mpotriva infeciilor cu parazii. Nu a fost dovedit c eozinofilele ar iniia rspunsul imun fa de parazii. Bazofilele se difereniaz i matureaz n mduva osoas hematogen, apoi circul prin snge. Att bazofilele ct i mastocitele secret citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secret i IL-4. A fost studiat un eventual rol n diferenierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesit IL-4) (12). A fost demonstrat prezena bazofilelor n ganglionii limfatici, n apropierea LT ca i faptul c secreia de IL-4 poate fi declanat de un stimul independent de IgE

72.Sistemul complement definire, elemente componente, roluri i efecte biologice

Complementul este un sistem seric de 25 de proteine enzime care, ca si sistemul coagularii si fibrinolizei, se activeaza n cascada sub actiunea unui trigger8 . Desemnarea componentelor sistemului complement este ngreunata de numerotarea nelogica n ordinea descoperirii lor si nu n ordinea n care se activeaza. Componentele majore sunt notate cu C1-C9. Cnd o componenta se activeaza, ea se descompune n 2 subunitati notate cu literele a si b. De exemplu, factorul C3 se transforma prin activare ntr-un peptid cu GM mica, notat C3a si unul mai mare, notat C3b. Cnd produsii de clivaj se asociaza pentru a forma mpreuna o enzima activa, ca, de pilda, C4b2a, se adauga o bara deasupra componentelor sale. n cazul n care un produs intermediar activat se inactiveaza, va fi precedat de litera i, de pilda iC3b. Rolul biologic al complementului Activarea complementului genereaza o serie de efecte biologice de o importanta deosebita n

rezistenta antiinfectioasa: declansarea inflamatiei. Activarea complementului aduce dupa sine declansarea reactiei inflamatorii prin produsii intermediari rezultati pe parcursul activarii. Astfel, C5a este un puternic factor chemotactic si chemokinetic pentru PMN pe care le va aduce n focarul infectios. C3a si C5a sunt anafilatoxine care vor duce la o degranulare fiziologica a mastocitelor cu eliberarea unor mediatori chimici vasoactivi; citoliza. Celulele pe care s-a fixat complementul si care n mod fiziologic sunt celulele straine organismului (bacteriile, n cazul de fata) sunt lizate sub actiunea complexului de atac al membranei. n cazuri patologice, complementul se poate fixa de celulele proprii organismului producnd distrugerea acestora; opsonizarea. Fagocitele au pe suprafata lor receptori pentru C3b. Astfel, microbii de care s-a fixat C3b vor adera de celulele fagocitare fiind fagocitati mai eficient.

73.Calea clasic de activare a complementului

Activarea complementului pe calea clasica se produce de regula n prezenta complexelor antigen-anticorp, deci n urma unui raspuns imunitar. Astfel, bacteriile cu care organismul a mai venit n contact, patrund n organism si ntlnesc anticorpii corespunzatori cu care vor forma complexe antigen anticorp. Cte o molecula de C1q, C1s si doua molecule de C1r formeaza unitatea de recunoastere care se va lega de complexul antigen-anticorp. Unitatea de recunostere va cliva C2 si C4 n C2a, C2b si C4a, C4b. C4b2a va forma C3 convertaza caii clasice, care va cliva C3 n C3a si C3b, piesa esentiala n reactiile urmatoare.

74.Calea alternativ de activarea a complementului

Calea alternativa. n plasma normala C3 este supus permanent unei activari spontane discrete prin clivarea n C3a si C3b. C3b se combina cu factorul B rezultnd C3bB. Acesta la rndul sau este supus actiunii factorului D care va transforma C3bB n C3bBb si Ba. C3bBb este C3-convertaza caii alternative. Aceasta convertaza, rezultata, deci, n mod fiziologic ar putea cliva cantitati mari de C3 printr-un feedback pozitiv, asemanator unui cerc vicios, daca nu ar exista mecanisme foarte riguroase de reglare ce mpiedica activarea spontana a unor cantitati mari de C3. n prezenta unor polizaharide de pe suprafata bacteriilor, a endotoxinei si a acizilor theicoici, C3bBb rezultat n urma clivarii fiziologice se leaga de suprafata bacteriilor fiind protejat astfel de inactivare. La stabilizarea C3bBb participa si o proteina plasmatica, properdina. Deci, activarea complementului pe calea alternativa este rezultatul stabilizarii C3bBb (a C3-convertazei) ce poate fi determinata, printre altele, de prezenta bacteriilor

75.Inteleukinele origine, tipuri, efecte

Citokinele sunt peptide, asemanatoare hormonilor, cu proprietati imunomodulatoare, produse de celulele care raspund invaziei microbiene. Cele care actioneaza chiar asupra celulelor care le produc sunt denumite autocrine, cele cu efect pe celulele nvecinate paracrine, iar cele cu efect pe celule la distanta endocrine. Exista multe celule producatoare de citokine, dar cele mai importante sunt macrofagele si limfocitele. n cazul invaziei organismului de catre agenti straini (bacterii, toxine), se declanseaza secretia de citokine care contribuie n ansamblu la cresterea rezistentei la infectii. Astfel, citokinele au rol important n declansarea inflamatiei. IL-1este implicata n producerea febrei, cresterea permeabilitatii vasculare, induce explozia respiratorie n macrofage si PMN, moment esential n fagocitoza. IL-6 declanseaza n ficat sinteza proteinelor de faza acuta. IL-8 secretata de macrofage la stimularea acestora de Il-1 si TNFa este un puternic factor chemotactic pentru PMN, contribuind astfel la formarea puroiului n focarul infectios. TNFa favorizeaza agregarea si activarea leucocitelor neutrofile si eliberarea enzimelor proteolitice din celulele mezemchimale, deci sunt producatoare de leziuni tisulare. Unele simptome generale ale infectiei, ca, de exemplu, febra, somnolenta, starea de disconfort, durerea musculara etc., se datoreaza activitatii acestor substante.

76.Cooperri celulare directe, n rspunsul imun 77. Cooperri celulare (indirecte) mediate de citokine, n rspunsul imun 78. Prezentai schematic principalele cooperri celulare ce intervin n rspunsul imun 79.Precizai succesiunea de evenimente din cadrul rspunsului imun umoral, pn la sinteza de anticorpi
Cnd limfocitul B este stimulat corespunztor prin limfocitul T-helper sau mai rar de antigene timoindependente, el ncepe s se divid transformndu-se n limfoblati care dau natere la plasmoblati, apoi la plasmocite. Toate celulele provenite dintr-un singur limfocit B aparin unei singure clone celulare, productoare a milioane de anticorpi identici care vor fi eliberai n mediul intern. Pe suprafaa limfocitelor B se gsete BCR care permite celulelor B s recunoasc antigenele

specifice. Cele mai multe limfocite B sunt sub control direct al limfocitelor T-helper care stimuleaz activitatea lor i T-supresoare care o deprim. Exist ns i limfocite timoindependente, care nu necesit cooperarea cu limfocitele T reglatoare fiind stimulate direct de antigen. Dup stimulare antigenic, limfocitele se difereniaz, n afar de plasmocite secretoare de anticorpi, i n limfocite B cu memorie, care sunt celule cu via lung, fiind responsabile de un rspuns umoral rapid la o stimulare ulterioar cu acelai antigen.

80.Expunei principiile teoriei seleciei clonale n rspunsul imun

Teoria seleciei clonale a fost propus n jurul anului 1950 de ctre McFarlane Burnet. Aceast teorie afirm c la nivelul sistemului imun exist un numr imens de capi de clone de limfocite, fiecare dintre aceti capi de serie corespunznd unei structuri antigenice (unui anume epitop); n cadrul aceleai teorii, Burnet a fcut estimarea c n lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferii. Clona, aa cum se cunoate, este o populaie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule mam. Toate celulele unei anumite clone au la suprafa, molecule identice cu structur imunoglobulinic; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit exist un receptor diferit). Structurile antigenice selecteaz din acest numr imens de limfocite cap de serie pe acelea care au receptori complementari (configuraie spaial etc) i astfel determin proliferarea i diferenierea lor n celule productoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeai specificitate pentru structura antigenic datorit creia au proliferat. Clonele de limfocite care ar putea s produc anticorpi fa de structurile proprii (self) sunt reprimate n timpul vieii intra-uterine i numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. n lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenial fatale.

81.Rspunsul imun primar i secundar; caracteristici principale

Rspunsul imun primar (RIP) naintea primului contact cu un anumit antigen, nu exist anticorpi potrivii fa de acesta. Stimulul antigenic primar selecteaz LB care au receptori pentru respectivul Ag. Dup primul contact cu Ag se dezvolt RIP, cu urmtoarele caracteristici: Latena: reprezint perioada de la contactul cu Ag pn la prezentarea structurilor Ag ctre LB (n conjuncie cu moleculele MHC); variaz n funcie de natura antigenului, calea de administrare i doza administrat; dureaz ntre 2 i 3 zile; Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare (cteva zile), timp n care titrul anticorpilor serici se menine relativ constant; Ulterior are loc scderea progresiv a titrului anticorpilor serici. De regul, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac dup 5-14 zile de la stimulul antigenic primar. Natura anticorpilor: examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM scade); n urmtoarele 2-3 sptmni, n ser predomin anticorpii de tip IgG; n urmtoarele luni, eventualii anticorpi care persist sunt de tip IgG. Rspunsul imun secundar (RIS) Rspunsul imun secundar apare dup al doilea contact cu acelai antigen (sau dup contacte ulterioare). RIS are urmtoarele caracteristici: poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen; latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere logaritmic; anticorpii sunt de tip IgG;

 titrul Ac produi este mult mai nalt; persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile). Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific. Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic: face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii).

82.Vacinuri; ce sunt i n ce scop se utilizeaz ?

Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2. cuprinde fraciuni din microorganisme (subuniti), n vederea stimulrii mecanismelor de rspuns imun, de regul pentru prevenirea apariiei unor infecii. Vaccinarea este definit drept o metod profilactic, care urmrete creterea rezistenei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activ, cu stimularea rspunsului umoral sau celular, dup caz. De fapt, vaccinrile incluse n programele naionale de vaccinare (conform recomandrilor Organizaiei Mondiale a Sntii, OMS) reprezint metodele profilactice cu cel mai bun raport ntre cost i eficien, n comparaie cu orice alt metod cunoscut. Strategiile de vaccinare au n vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective (imunocompetent sau imunodeprimat). Unele vaccinuri se pot administra i n timpul unei izbucniri epidemice (outbreak) sau a unei epidemii, pentru prevenirea apariiei de cazuri noi i scurtarea duratei epidemiei. Exist i posibilitatea administrrii unor vaccinuri n scop curativ, gazda fiind deja infectat n momentul inoculrii (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatit cronic, cu HBV).

83.Clasificarea vaccinurilor; exemple

n funcie de infecia care se dorete a fi prevenit, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale. n funcie de modul de preparare exist: Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluznd, dup caz, corpi vii atenuai sau distrui (inactivai) prin aciunea unor factori fizici (ex. cldur) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conine bacterii vii atenuate, stimuleaz RIC i se administreaz pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conin virusuri vii, atenuate i stimuleaz RIU i rspunsul imun la poarta de intrare. Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetic, au un grad superior de siguran (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular). Vaccinurile care conin anatoxine bacteriene, purificate i adsorbite pe suport mineral (DTP conine anatoxin tetanic i difteric plus corpi de Bordetella pertussis omori, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA). n funcie de numrul componentelor antigenice exist: Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc), Vaccinuri asociate, care conin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc).

84.Descriei schematic structura unei molecule de imunoglobulin

Structura de baz a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde dou lanuri grele identice i dou lanuri uoare identice, legate ntre ele prin puni disulfurice: dou puni ntre cele dou lanuri grele (n cazul IgG1) i o singur punte ntre fiecare lan greu i uor. Aceast schem structural a fost identificat n urma mai multor experimente (reducere i alchilare, aciunea papainei, aciunea pepsinei). Pepsina poate de ex. s degradeze enzimatic o molecul de

imunoglobulin, acionnd la nivelul aminoacidului Leucin din structura lanurilor grele. Duce astfel la apariia unui fragment cu greutate molecular destul de mare format la rndul su din 2 fragmente Fab unite *acest fragment poart numele de F(ab)2+. Fragmentele unei Ig sunt urmtoarele: - Fab: prima jumtate a lanului greu i ntregul lan uor, legate ntre ele printr-o punte disulfuric, obinute sub aciunea papainei, prin scindarea naintea regiunii balama, cu un singur situs de legare; - F(ab) 2: cele dou fragmente Fab i regiunea balama, care rezult dup aciunea pepsinei, constituie un fragment superior celor dou fragmente Fab i conine dou situsuri de legare; - Fc: jumtile terminale ale celor dou lanuri grele unite prin puni disulfurice la nivelul regiunii balama; - pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu CH3 situat dup aminoacidul 333 al lanului greu; - Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, i dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor; - Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL). Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este urmtoarea: Lanurile grele: - VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu aceeai specificitate. - CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 , Cg12 i Cg13 i pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4. Lanurile uoare: - VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk i Vl. - CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl funcionale. Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul antigenic (epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact direct cu epitopul i se numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete idiotip.

85.Tipuri de imunoglobuline 86.IgM i Ig G; structur i rol

Imunoglobulina G IgG reprezint 70% - 80% din imunoglobulinele serice, concentraia ei fiind de 8-16mg/ml. Concentraia normal este atins la vrsta de 5-8 ani. Dimensunea mic a moleculei (GM 15 KD) face posibil ptrunderea ei i n esuturi. IgG se mparte n 4 subclase IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4, care difer ntre ele structural prin secvena aminoacizilor n Fc al lanurilor H i prin numrul i sediul legturilor disulfurice dintre lanurile H i L i dintre lanurile H. Diferenelor structurale le corespund proprieti diferite care sunt ilustrate n tabelul xx. Proprietatea IgG1 i IgG3 de a se lega prin Fab de antigenul bacterian (opsonizare) i prin Fc de receptorii de pe suprafaa PMN i a macrofagelor favorizeaz nglobarea bacteriilor de ctre aceste celule, potennd fagocitoza. n afar de IgG4, toate celelalte subclase de IgG sunt capabile s activeze complementul pe cale clasic dup unirea cu antigenul specific (de exemplu o celul bacterian), ceea ce are ca urmare citoliza dac antigenul este situat la suprafaa unei celule (bacteriene de exemplu). Clasa IgG cuprinde, n afar de anticorpi opsonizani, i anticorpi neutralizani (antitoxine), precipitani (precipitine) i aglutinani (aglutinine). IgG trec prin placent de la mam la ft, asigurnd rezistena antiinfectioas a sugarului n primele luni dup natere. Timpul de njumtire a IgG seric este de 21 de zile, cu excepia IgG3 care este metabolizat dup 7 zile. Imunoglobulina M

IgM se prezint sub forma unei structuri mari (IgM-macroglobulin) pentamerice cu o greutate molecular de 900.000 Da i constant de sedimentare de 19S. Cei 5 monomeri de IgM sunt legai ntre ei printr-un lan J. Datorit greutii moleculare mari, IgM nu trece prin placent. Reprezint 6 -7% din totalul imunoglobulinelor serice, concentraia fiind de 0,5-2mg/ml. Aceast concentraie este atins la vrsta de 1 an. Timpul de njumtire a IgM este de 6 zile. Se cunosc 2 subclase de IgM IgM1 i IgM2, fr a se evidenia ns diferene n activitatea lor biologic. n contextul rspunsului imun, IgM este clasa de anticorpi care apare n rspunsul primar. Prezena anticorpilor IgM fa de un anumit agent infecios indic o infecie acut, recent.Mare parte din anticorpi naturali, ca de exemplu isoaglutininele de grup (anti-A, anti B), sunt IgM. Datorit structurii pentamerice, IgM are 10 situsuri de combinare cu o configuraie care permite legarea preferenial de antigenele corpusculare. Aadar, este deosebit de eficace n legarea microorganismelor, producnd aglutinarea acestora. Prin fixarea complementului se realizeaz concomitent opsonizarea bacteriilor. IgM activeaz complementul pe cale clasic favoriznd deci i bacterioliza.

87.IgA i Ig E; structur i rol

Imunoglobulina A IgA reprezint 17% din totalul imunoglobulinelor. Ea apare n ser ca monomer, cu GM de 160.000 Da i o constant de sedimentare de 7S, ntr-o concentraie de 200 mg/100ml i este format de plasmocitele din ganglionii limfatici i splin. Nu este capabil s fixeze complementul, dar reacioneaz cu antigenele din torentul circulator. Se presupune, de pild, c antigenele din intestin ce au ptruns prin bariera intestinal i au ajuns n snge sunt fixate de IgA i vor fi eliminate prin ficat. Cea mai mare parte a IgA este prezent extravascular sub form de dimer - IgA secretor (S-IgA) - n secreiile epiteliilor (lacrimi. saliv, mucus bronic etc.) i la suprafaa mucoaselor. Cea mai mare parte a S-IgA este produs de plasmocitele esutului limfatic asociat mucoasei intestinale dar i ale celui asociat celorlalte mucoase (respiratorii, nazale etc.). S - IgA este alctuit din 2 molecule de IgA, legate printr-un lan J (join) glicolipidic i o component secretorie polipeptidic (CS). Componenta secretorie se adaug dimerului n celula epitelial i faciliteaz transportul IgA prin epitelii i secreia sa n saliv, lacrimi, lapte i 12 protejeaz S - IgA de aciunea enzimelor digestive. Ca i IgA seric, S - IgA nu poate fixa (activa) complementul pe cale clasic ci numai alternativ, deci nu poate participa la opsonizare. Fixeaz ns bacterii i virusuri prin Fab formnd complexe imune i mpiedic astfel fixarea acestor ageni infecioi de celulele epiteliale ale mucoaseor. Aceast neutralizare este cea mai important funcie antiinfecioas a S-IgA pe mucoase. IgA are dou subclase IgA1 i IgA2. IgA 1 se gsete predominent sub form monomeric deci n ser, iar IgA2 mai ales sub forma de S-IgA. Concentraia normal de S-IgA este atins la vrsta de 10-11 ani, ceea ce explic frecvena infeciilor respiratorii la copii. La una din 700 de persoane se constat un deficit de S-IgA, Dac acest deficit nu este compensat de o activitate crescut de IgM sau dac se adaug i un deficit de IgG, persoanele afectate sunt susceptibile de a face frecvent infecii respiratorii i intestinale. Imunoglobulina E Este o Ig monomer, cu GM 190.000 i costant de sedimentare 9S. Timpul de njumatire este de 2-4 zile. Nu fixeaz complementul. Se gsete n cantiti extrem de mici n serul persoanelor sntoase, dar n concentraii crescute la persoane alergice. IgE sunt anticorpi citofili, care se leag prin Fc de receptorii specifici de pe suprafaa leucocitelor bazofile i a mastocitelor. n contact cu alergenul specific, care le-a indus producerea, are loc degranularea acestor celule cu eliberarea unor mediatori chimici (histamin, serotonin, leucotriene, prostaglandine), responsabili de manifestrile alergice de tip I anafilactic

88.Ce sunt antigenele: definiie, tipuri, exemple

Antigenele sunt substane capabile de a interaciona specific cu receptorii pentru antigen (anticorp,

BCR1, TCR2). Datorit configuraiei de suprafa, antigenele sunt recunoscute de organism ca strine, ca non-self. n unele situaii patologice chiar i unele substane proprii ale organismului pot deveni antigenice, nemaifiind recunoscute de organism ca self. Un agent infecios, indiferent de natura lui, este un mozaic de antigene capabile s produc un rspuns imunitar. Antigenele complete au dou proprieti de baz: imunogenitatea, care este capacitatea unui antigen de a induce un rspuns imunitar (umoral sau/i celular), i antigenicitatea, care este proprietatea antigenelor de a reaciona n mod specific cu efectorii imuni (anticorpi sau limfocite sensibilizate) a cror producere au indus-o. Haptenele sunt antigene incomplete lipsite de imunogenitate, deci de proprietatea de a induce un rspuns imunitar, dar sunt capabile s reacioneze cu anticorpi specifici. Contradicia din definiia de mai sus se explic prin faptul c o hapten devine imunogen legat covalent de o molecul mai mare, numit carrier. Anticorpii care se vor forma vor reaciona la un contact ulterior i cu haptena liber fr ca aceasta s fie asociat cu carrierul. Epitopii. Gruprile unui antigen care sunt recunoscute de organism ca non-self se numesc epitopi. Partea complementar a efectorilor imuni (anticorpi sau receptori de pe suprafaa limfocitelor) se numete paratop. Un antigen poart n general mai muli epitopi diferii fa de care organismul va produce tot atia anticorpi cu paratopi diferii. S-au descris i antigene cu epitopi identici repetitivi. Poziia epitopilor ntr-un antigen este diferit i n funcie de aceast poziie pot fi recunoscui de limfocitele - T sau B. Epitopii care vor fi recunoscui de anticorpi sau limfocitele B sunt proeminene ale unor molecule dispuse la suprafaa antigenului i se numesc epitopi structurali sau epitopi B. Aceti epitopi nu sunt antigenici dect n stare nativ, denaturarea proteinei modificnd aspectul acestor epitopi.

89.Antigenele; factori de care depinde imunogenitatea

Antigenele trebuie s aib o anumit configuraie de suprafa i o structur chimic ce le confer caracterul de non-self, deci de strin de organism. Natura chimic a antigenelor este foarte variat. Cele mai bune antigene sunt proteinele urmate de polizaharide, care sunt antigene i haptene foarte bune, apoi de lipide i acizi nucleici, care sunt cel mai ades haptene. Se adminte c greutatea molecular a unui antigen este n general peste 10.000 D, dar exist i excepii. Glucagonul, spre exemplu, este imunogenic cu toate c are GM de 3.600 D. Intensitatea rspunsului imun fa de un antigen este n funcie de natura chimic, persistena n organism, doza, ritmul, calea, intervalul i calea de administrare. Cunoaterea rspunsului n funcie de aceti factori st la baza elaborrii calendarului de vaccinri. Administrarea antigenelor cuplate cu adjuvani induce un rspuns imunitar mai intens, deoarece crete perioada de remanen a antigenului n organism. Exemple de adjuvani sunt adjunvatul Freund incomplet ce conine ap, ulei mineral i lanolin i adjuvantul Freund complet care conine n plus BCG1. Studiul rspunsului imun fa de antigenele cuplate i necuplate cu adjuvani este foarte important, deoarece antigenele de pe suprafaa bacteriilor nu induc niciodat rspunsuri imune n stare pur, ci cuplate cu corpul bacterian, a crui componente au rol adjuvant, influeneaz rspunsul imun. Din punct de vedere al organismului care produce anticorpii fa de antigene, acestea sunt: - antigene alogenice, care provin de la indivizii aceleiai specii i mpart specia n grupe. Un exemplu de astfel de antigene sunt antigenele eritrocitare care determin grupele sanguine, - antigene singenice, care provin de la acelai organism, - autoantigene, care sunt substane proprii organismului ce au suferit o modificare, nemaifiind recunocute ca self de sistemul imunitar, - antigene xenogenice sunt antigene care provin de la o alt specie. Astfel de antigene, foarte importante n patologia uman, sunt antigenele bacteriene.

90.Reacii antigen-anticorp; mecanism general i forme de evideniere

Reacia antigen-anticorp este o reacie ntre un antigen (Ag) i un anticorp (Ac) i const n legarea gruprii determinante de pe suprafaa antigenului (epitop - o proeminen) cu situsul de combinare de pe suprafaa anticorpului (paratop - o adncitur). (Figura nr. 1) Reacia Ag-Ac are 2 proprieti principale, specificitatea i reversibilitatea. Specificitatea se refer la faptul c un antigen nu este recunoscut dect de anticorpii care au fost produi n urma inoculrii respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc dect antigenul fa de care au aprut. Trebuie menionat c specificitatea nu este absolut, ntruct un Ag cu reactivitate ncruciat, poate reaciona cu un Ac format fa de un alt antigen (reacia ncruciat se explic prin aceea c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datoreaz faptului c legturile necovalente sunt reversibile la cald sau pH acid (<3). Legarea antigenului cu anticorpul este determinat de complementaritatea reciproc dintre conturul suprafeei epitopului i paratopului, care apropie la civa Angstromi gruprile chimice care le alctuiesc, permind stabilirea unor fore intermoleculare ntre epitop i paratop (hidrofobe ntre gruprile nepolare, de atracie electrostatic ntre gruprile ionizate de semn contrar). Iniial are loc cuplarea ntre Ag i Ac rezultnd complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface relativ uor. n continuare, datorit existenei mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se reunesc formnd structuri de dimensiuni mai mari, adevrate reele Ag-Ac, care pot fi evideniate fie direct, fie dup utilizarea unor artificii tehnice

91.Reacii de precipitare n mediu lichid; exemple, utilizri

Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii. Reacii de precipitare n amestec Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar). Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei proteinei C reactive (CRP).

92. Reacii de precipitare n gel; exemple, utilizri

Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi va duce la vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare. Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia unui cerc de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen din prob. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony) Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului, iar distana parcurs de reactant ntr-un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor Ag-Ac studiate. Dubla difuzie Elek Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. n cazul n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin, complexele Ag-Ac vor da natere unor linii de precipitare.

93.Reacii de aglutinare; principiu, tipuri, exemple

n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

94.Reacia de fixare a complementului; principiu, etape, utilizri, exemple

RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasic i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac-antihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea C' i respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber. RFC are loc n 2 etape: o n prima etap se pun n reacie C', serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, C' rmne liber; o n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac anti-hematie); exist 2 posibiliti: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei. n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc.

95. Reacia de seroneutralizare; principiu, tipuri, utilizri, exemple

Reacia ASLO Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO. Pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz).

96.Reacii antigen-anticorp care utilizeaz componente marcate; tipuri de marcare, utilizri

n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe

tipuri de reacii Ag-Ac, i anume: reacii de precipitare reacii de aglutinare reacia de fixare a complementului (RFC) reacii de seroneutralizare. Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face: - izotopic (radio immunoassay, RIA); - enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA); - fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA); - chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc. n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.

97.Hipersensibilitatea definire, tipuri de hipersensibilitate, exemple

n evoluia unor infecii, efectorii imunitari pot contribui, alturi de agentul etiologic, la patogenia bolii prin sensibilizarea la unele antigene microbiene. Rspunsurile imune care apar ntr-o manier improprie sau exagerat corespund termenului de hipersensibilitate. Aceste reacii sunt denumite reacii alergice, iar antigenele implicate, alergeni. Reaciile de hipersensibilizare apar la indivizi sensibilizai n prealabil printr-un contact anterior cu antigenul, deci sunt reacii secundare. P.G. Coombs i R.A. Gell clasific n 1963 reaciile de hipersensibilitate n 4 tipuri, n funcie de viteza de reacie i natura efectorilor imuni implicai: tipul I - reacii mediate de anticorpi IgE (reagine), tipul II - reacii citolotic-citotoxice, mediate de anticorpi formai fa de antigenele de pe 19 suprafaa celulelor, cu participarea complementului, celulelor K i macrofagelor, tipul III - reacii mediate de complexe imune cu participarea complementului, tipul IV - reacii mediate de limfocitele T sensibilizate. Dei tratate separat, reaciile de hipersensibilitate apar n realitate rar complet izolate una de cealalt, deoarece mecanismele lor se intric.

98.Reacii anafilactice mecanism, forme de manifestare

Principalele elemente care particip la aceast reacie sunt: anticorpii citofili IgE, mastocitele, precum i o serie de mediatori foarte activi din punct de vedere biologic. Toate acestea sunt responsabile de simptomele clinice ale alergiei, care pot apare n doar cteva minute (reacie imediat). Alergenele care induc acest tip de hipersensibilitate sunt foate variate ca, de pild, polenul, sporii de mucegai (Aspergillus), praful de cas, prul animalelor, unele alimente (ou, lapte, cpuni, ciocolat etc.), seruri terapeutice, medicamente (penicilina), veninul unor insecte (viespi) etc. Primul pas n desfurarea reaciei de tip I este reprezentat de contactul alergenului cu organismul, cea mai frecvent cale de ptrundere a acestor antigene fiind cea respiratorie. Alergenele se pot afla n forme mai mult sau mai puin pure (polenul), sau cuplate cu particulele de praf inhalate i depozitate pe mucoasa respiratorie. Dup depozitarea n epiteliu, sau penetrarea filmului de mucoas, alergenele sunt preluate de celulele prezentatoare de antigen (CPA). Acestea prezint alergenul limfocitelor Th. Limfocitele Th activate vor secreta interleukinele IL4, IL13 i IL5. IL4 i IL13 vor aciona asupra limfocitului B care sub aciunea acestor interleukine se va transforma n plasmocit care va produce n loc de IgG, IgE. Interleukina 5 va induce eozinofilie. Limfocitele Th activate induc apoi transformarea limfocitelor B n plasmocite productoare de IgE. La pacienii atopici, cu mecanismul de control al produciei de IgE perturbat, este deseori depit producia de anticorpi chiar dup un contact scurt, cu o doz sczut de alergen. Producia de IgE la locul de ptrundere al alergenului sensibilizeaz mai nti celula mastocitar. Excesul de IgE ptrunde

apoi n secreiile mucoase i n circulaie i se leag prin fragmnetul Fc de bazofilele circulante i mastocitele din esuturi. A doua etap a reaciei de tip I este activarea celulelor mastocitare i este declanat de o nou ntlnire cu alergenul. Alergenul se va uni cu IgE fixate pe mastocite i va determina o reacie ncruciat ntre dou molecule de IgE cu interconexiuni ale receptorilor Fc la nivelul membranei iritate a celulei mastocitare. Degranularea apare ca o consecin a influxului de Ca++. Granulele, coninnd mediatori deja sintetizai, migreaz spre suprafaa celulelor mastocitare, fuzioneaz cu membrana extern i i elibereaz constituienii (histamina, serotonina, leucotriene i prostaglandine, factori chemotactici). n urma interaciunii IgE fixate pe mastocit cu alergenul se elibereaz din mastocit acid arahidonic sub aciunea enzimatic a fosfolipazei A2. Acidul arahidonic este metabolizat de lipooxigenaz, sau ciclooxigenaz, producnd noi substane mediatoare. Pe calea lipooxigenazei se produc leukotriene,iar pe cea a ciclooxigenazei, prostaglandine i tromboxan. n a treia faz a reciei de tip I, mediatorii produc variate efecte care dau natere simptomatologiei clinice La nivelul tractului respirator, histamina eliberat determin contracia musculaturii netede a bronhiilor (bronhoconstricia) n decurs de cteva minute. n acelai timp, mediatorii chemotactici eliberai favorizeaz invadarea mucoasei de ctre granulocitele eozinofile i neutrofile, limfocite i trombocite, n decurs de cteva ore. Aceste celule inflamatorii elibereaz ele nsele mediatori, unii dintre ei toxici, de exemplu, aa-numita protein bazic major a eozinofilelor. Aceti mediatori cauzeaz o reacie ntrziat, la 6-10 ore de la contactul cu alergenul, tradus prin: bronhoconstricie, secreie de mucus i edem al mucoasei. Reacia indus de celulele inflamatorii determin o cretere a hiperreactivitii bronice i formeaz baza alergiei sau inflamaia astmatic a mucoasei respiratorii.

99.Hipersensibilitatea de tip III mecanism, boala serului, alte exemple

Leziunile produse de reaciile de tip III sunt iniiate de complexe imune antigen-anticorp care, formate n cantitate mare, sau persistente n circulaie, activeaz complementul i determin leziuni la locul depunerii lor. La persoanele sntoase, complexele antigen-anticorp sunt rapid fagocitate de macrofage dar, n anumite circumstane (de obicei cnd exist un exces de antigen), ele persist i stau la baza a numeroase afeciuni. Antigenele care induc aceast reacie sunt foart variate. Dintre speciile microbiene care pot determina acest tip de hipersensibilitate menionm : Streptococcus pyogenes, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Plasmodium, virusul hepatitei B, virusul Epstein Barr etc. Anticorpii implicai sunt IgG i IgM, deci activatori de complement. Complexele antigen-anticorp ptrund prin epiteliul vascular, se depun pe membrana bazal a vaselor i activeaz complementul. C3a i C5a, care sunt anafilatoxine, vor crete permeabilitate vascular, iar C5a (factor chemotactic) va determina afluxul de PMN. Activarea complementului, eliberarea enzimelor lizomale ale PMN vor produce alterarea membranei bazale. Simptomatologia clinic depinde de sediul reaciei. Reacia de tip Arthus este o reacie local. Arthus a inoculat n mod repetat iepuri cu ser de cal. Dup cca 20 de zile, la locul reinoculrii subcutanate a serului de cal a observat apariia, la interval de 3-8 ore, a unor modificri inflamatorii (congestie, edem, peteii, infiltrat celular), uneori i necroz, persistente 2-3 zile. Este vorba de fapt despre o reacie a complexelor imune, declanat dup inocularea de antigene la nivel tegumentar. Antigenul inoculat reacioneaz cu anticorpi de tip IgG la nivelul pereilor vasculari, cu formare de complexe imune. Acestea determin activarea fraciunii C3a i C5a ale complementului seric, precum i agregarea trombocitar i eliberarea de enzime vasoactive. Aceste enzime determin creterea permeabilitii vasculare i edem local. Granulocitele prsesc vasele, fagociteaz complexele imune i secret enzime lizozomale. Se poate produce, de asemenea, i o degranulare mastocitar cu apariia reaciilor inflamatorii locale.

O reacie local de tip Arthus este plmnul de fermier datorat inhalrii prafului provenit dela fn mucegit. Personalul care paricip la fabricarea brnzei fermentate de mucegaiuri (Penicillium casei) este susceptibili s fac prin acelai mecansim alveolit alergic extrinsec. Cronicizarea implic i reaciile de tip IV. Reacii locale de tip III se produc i prin eliberarea persistent local de antigen de ctre un agent infecios. Astfel, infecia cu o filarie (Wucheriria bancrofti) este relativ benign, dar parazitul mort care se afl n vasele limfatice iniiaz o reacie inflamatoare responsabil de obstrucia vaselor limfatice cu edeme limfatice gigante : elefantiaza. Chimioterapia antiinfecioas poate determina o eliberare masiv de antigene microbiene prin omorrea microbilor, ceea ce va determina reacii mediate de complexe imune grave, ca, de pild, eritemul nodos lepros ce apare la pacienii bolnavi de lepr tratai cu dapson. Boala serului este o reacie de tip III generalizat i apare la pacieni crora li s-au administrat, n scop terapeutic, doze mari de ser imun heterolog (ser antidifteric sau antitetanic preparat pe cai). Dup 7-10 zile de la admnistrarea serului apar n circulaie anticorpi fa de proteinele de cal. Dac proteinele nu au fost nlturate din circulaie pn la apariia anticorpilor, acetia se vor uni cu ele i complexele imune formate se vor depune pe pereii vaselor. Prin activarea complementului se vor leza pereii vaselor la care se adaug leziunile datorate enzimelor lizozomale pe care PMN, frustrate de a nu putea fagocita complexele depuse pe pereii vaselor, le elibereaz aici. n scurt timp pacienii devin febrili, prezint rash urticarian, adenit generalizat, splenomegalie, tumefieri i dureri articulare, leucocitoz cu neutrofilie i eozinofilie, scderea complementului seric. Frecvent apare albuminurie, care traduce leziuni de glomerulonefrit. Infecii cronice cauzate de streptococi hemolitici, stafilococi, virusuri hepatitice (stimulare antigenic persistent) pot duce la continua formare de complexe imune i afectarea consecutiv a organelor vizate. Un exemplu este glomerulonefrita care apare la la 2-3 sptmni de la debutul unei infeciei cu anumite serotipuri de Streptococcus pyogenes sau S. zooepidemicus. Mecanismul patogenic este similar bolii serului.

100.Hipersensibilitatea de tip IV mecanism, evideniere, aplicaii practice

Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie (mai) ntrziat, care apare la 48-72 de ore dup contactul cu antigenul i se datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat de rspuns imun celular. HS de tip IV poate fi considerat ca un martor al mecanismelor protective fa de germenii intracelulari dar i de alte substane chimice care se leag puternic de membrana celular. Totui, corelaia protecie-hipersensibiltate nu e perfect, n sensul c se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit germen s dezvolte infecii progresive cu acel patogen (ex. situaia din infeciile cu M. leprae). Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt importante n patologia uman. - Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om); - Hipersensibilitatea de contact Este o reacie epidermic, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. n experimentele pe animal se plaseaz pe piele diferite antigene, care penetreaz uor n epiderm i se leag solid de celule. Cel mai frecvent se utilizeaz DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de hapten care sensibilizeaz aproape toi contacii, i pe care o putem folosi ca s stimulm imunitatea mediat celular. Un rol important n sensibilizare l joac keratinocitele i celulele Langerhans. Reacia de hipersensibilitate de contact survine dup ce animalul a fost sensibilizat n prealabil. Dup o injecie ulterioar intradermic sau dup aplicarea antigenului pe tegument, urmeaz legarea haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o celul Langerhans care se va activa, matura i i va ncepe migrarea spre zona paracortical a nodulilor limfactici sub aciunea IL-1 i TNF

secretai de keratinocitele agresate. Corespunde unei infiltrri dermice i epidermice, edemului epidermic i eritemului aprut dup 48-72 ore, care va persista cteva zile. Absena reaciei se datoreaz unui deficit imun celular. Sensibilizarea prealabil cu DNCB (ex. la fotografii) poate declana un oc anafilactic la IgE. Primele modificri apar ncepnd cu a 6-a pn la a 8-a or dup contactul cu alergenul; LT activate i cele cu memorie vor ajunge n circulatie i ulterior n zona inflamat, alturi de monocite, unde vor ndeprta complexul hapten-carrier. Ele nconjoar vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloi i infiltreaz epidermul. Infiltratul celular se accentueaz progresiv i ajunge maxim spre a 72-a or. Infiltratul conine celule T CD4+ (n majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage i bazofile. Aceleai keratinocite, dar i macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reaciei inflamatorii. LTs intervin de asemenea n terminarea reaciei de HS (la fel ca i ultravioletele), prin scderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhib direct i celulele Langerhans. n concluzie, fenomenele apar n urmtoarea succesiune: celulele Langherhans activeaz LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g i GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate i activeaz o reacie inflamatorie n care predomin celulele mononucleare. - Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12) Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau care vin n contact cu substanele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate. n laborator, pentru sensibilizare se injecteaz la un animal Ag mpreun cu adjuvantul complet Freund (pregtirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamid permite i utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Aceast faz de sensibilizare ncepe cu 2-3 sptmni nainte de testarea HS. Dup injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migreaz n jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreia de interleukine care recruteaz alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm i atinge un maxim la 48-72 ore dup injecie. Celulele observateiniial sunt LT *predomin T CD4+ (raport CD4/CD8 - 2/1)+, ulterior ncep s se acumuleze macrofagele (atingnd un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare). Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge i epidermul; keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei), circulaia aferent i eferent a celulelor imunocompetente seamn cu cea observat n hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uoar cu bazofile; n timp se poate dezvolta o reacie granulomatoas. La om se practic intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat, un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face dup 72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se identific existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii dermice. Apoi se apreciaz tactil (prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se nregistreaz diametrul maxim al zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca leziunea s se transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas. - Hipersensibilitatea granulomatoas Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd antigenul persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i poate s persiste mai multe sptmni. Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda diferite hipersensibiliti

ntrziate precedente, n general dup o perioad de 3 - 4 sptmni. Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezult celule gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor. Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei grupe principale de afeciuni: 1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din piele de animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc; 2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr, leishmanioz, listerioz, micoze profunde etc); n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide, celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen. n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda. Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim. 3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia HIV, poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).