nsmnrile artificiale la canide

CUPRINS

I.

Introducere

II.

Recoltarea materialului seminal

III.

Examinarea materialului seminal

IV.

Conservarea materialului seminal

V.

Stabilirea momentului optim pentru monta sau insamantare artificiala

VI.

Metode de inseminare artificiala

VII.

Concluzii

VIII.

Bibliografie

I. Introducere

nsmnrile artificiale (IA) la canide nu reprezint un concept nou: prima inseminare

artificial la cea a fost realizat de Spallanzani (1784), rezultatul fiind apariia a 3 pui dup 62
de zile de gestaie. De atunci ns, IA la animalele de rent au cunoscut o dezvoltare mai
rapid, n timp ce cresctorii de cini au nceput s fie tot mai atrai de aceast biotehnologie n
ultimii 20 de ani.
Acest interes se datoreaz ameliorrii rezultatelor obinute, precum i avantajelor conferite
de utilizarea IA. Astfel, IA elimin riscul transmiterii bolilor veneriene la mascul. Un mascul de
valoare poate fi reprodus la distane mari spaiale (se elimin stresul de transport, iar costurile
sunt mai reduse n cazul transportului materialului seminal) i temporale (masculul poate fi
reprodus chiar i dup moartea sa), iar eficiena utilizrii unui ejaculat este crescut fr a
epuiza individul (un ejaculat de calitate superioar poate fi divizat n mai multe doze de
inseminare). IA permit realizarea seleciei i ameliorrii genetice a raselor, depind
incompatibilitile de ordin anatomic (angustie vulvar, diferene mari de talie ntre parteneri,
afeciuni osteo-articulare dureroase care nu permit efectuarea saltului etc.) i psihologic (mascul
neexperimentat, femel dominant).
Reuita IA depinde de mbinarea a trei puncte cruciale: calitatea spermei utilizate, alegerea
momentului optim pentru realizarea inseminrii i alegerea metodei adecvate de nsmnare.
Nu trebuie uitat c nainte de orice demers cei doi parteneri trebuie supui unor examene
clinice i paraclinice (examen ecografic al aparatului genital, examene serologice pentru bolile
veneriene bruceloz, herpesviroz) pentru a confirma starea de sntate reproductiv.
II. Recoltarea materialului seminal
Ideal este s se asigure cteva zile de repaus sexual nainte de recoltarea i evaluarea
spermei. n cazul utilizrii repetate a unui mascul, recoltarea nu trebuie s se fac mai des de o
dat la 2-3 zile.
Materialul seminal la cine poate fi recoltat prin metoda masturbrii, dar pentru cinii care nu
accept aceast metod sau cu impoten de copulaie se poate utiliza i electroejacularea.
Dezavantajele electroejaculrii sunt: necesitatea anestezierii animalului, calitatea redus a
ejaculatului obinut comparativ cu metoda masturbrii, uneori ejacularea realizndu-se retrograd
(spermatozoizii ajung n vezica urinar) sau n furou.
Cea mai simpl metod de recoltare a spermei la cine este cea a masturbrii. Un ejaculat
se obine mult mai uor n prezena unei cele n estru, dar prezena acesteia nu este
obligatorie. Alternativ, se poate utiliza i o cea de aceeai ras sau talie care nu este n estru
i care a fost impregnat n regiunea cozii cu feromoni comerciali (metil-parabenzen) sau
naturali (tampoane de vat recoltate de la femele n estru pot fi stocate n congelator i utilizate
la nevoie). Un operator experimentat poate recolta un mascul i n absena unei femele. Dac
persoana care face recoltarea prefer s utilizeze mnui n timpul procesului, acestea trebuie
s fie latex-free, deoarece cauciucul este spermatotoxic. Optim, femela i masculul sunt adui

n les ntr-o camer linitit, cu podea care nu alunec, iar numrul persoanelor prezente n
sal trebuie redus la strictul necesar (proprietar i operator, eventual un tehnician). Este
imperativ ca orice surse de distracie sau anxietate s fie reduse la minimum. n timp ce
masculul adulmec vulva femelei sau efectueaz saltul, cinele este masturbat rapid timp de
cteva secunde pn ajunge la erecie complet. n acest timp, prepuul este retras napoia
bulbilor bazopenieni nainte ca penisul s i mreasc volumul, n caz contrar ncercarea de
recoltare a materialului seminal putndu-se solda cu un eec din cauza durerii. Cu degetul mare
i indexul se formeaz un inel ce se plaseaz n spatele bulbilor penieni, exercitnd o presiune
ferm pn cnd ejacularea este complet. Cu cealalt mn se in recipientele prenclzite la
37o C n care se va colecta fracionat ejaculatul. La cine, ejaculatul este format din trei
fraciuni:
- fraciunea prespermatic clar pn la uor tulbure, transparent, secreia glandelor uretrale
Littre are rolul de a cura uretra i este eliminat rapid n cteva zeci de secunde (1-3 ml);
fraciunea spermatic bogat n spermatozoizi, de culoare alb-lptos pn la alb-gri (0,1-6
ml);
-fraciunea prostatic limpede, transparent, este ejaculat intermitent n 10-30 de minute (150 ml n funcie de talia cinelui).
Pe parcursul ejaculrii primei fraciuni se pot observa micrile caracteristice de pistonare,
iar cinele poate ncerca s peasc peste mna operatorului pentru a obine poziia de mont
natural crup la crup. n acest caz, operatorul va roti n plan orizontal penisul n erecie la
180o .
Dup ce recoltarea este ncheiat, masculul se ine sub observaie pn la dispariia
ereciei. n urma recoltrii poate apare parafimoza, astfel c masculul nu trebuie niciodat trimis
acas pn cnd penisul nu a revenit complet n prepu. Pentru a preveni parafimoza se
lubrefiaz orificiul prepuial dup recoltare.
III. Examenul materialului seminal (spermograma)
Pe tot parcursul realizrii spermogramei, materialul seminal se pstreaz la 37o C, tiindu-se
c spermatozoizii sunt sensibili la ocul termic. De asemenea, toate materialele utilizate pe
parcursul evalurii (lame, lamele, camere de numrat, vrfuri de pipete) trebuie s fie nclzite
la aceeai temperatur de 37o C.
Macroscopic se examineaz: volumul ejaculatului (direct n tubul de recoltare), culoarea,
mirosul i pH-ul.
Culoarea normal a fraciunii spermatice depinde de concentraia acesteia n spermatozoizi
i n mod normal variaz ntre alb-lptos pn la gri. n absena spermatozoizilor (azoospermie)
aspectul fraciunii spermatice este apos, clar (incolor) uneori uor glbui, iar prezena unui
numr foarte mare de spermatozoizi i confer un aspect alb-lptos, opac. Colorarea n galben
sau galben-verzui a ejaculatului indic contaminarea acestuia cu urin sau prezena unui
exsudat purulent (elemente nocive pentru spermatozoizi). Colorarea n rou sau maro indic
prezena sngelui. Sngele din ejaculat sugereaz fie un traumatism n urma recoltrii, fie un
proces patologic cum ar fi o afeciune a prostatei, balanopostit sau un proces neoplazic.
Sperma normal este inodor; prezen a urinei, a puroiului, a sngelui sau a unor
medicamente n ejaculat modific mirosul acestuia.

pH-ul se apreciaz cu ajutorul pH-metrelor sau cu hrtie indicatoare special. Exist o

corelaie direct ntre calitatea spermei i pH-ul acesteia.
Examenul microscopic al spermei urmrete: viabilitatea, concentraia, mobilitatea i
morfologia spermatozoizilor.
Viabilitatea spermatozoizilor se determin prin tehnici de colorare intravitale (eozinnegrozin, albastru tripan-Giemsa etc.) sau tehnici de colorare fluorescent, urmate de
examinare microscopic simpl sau special (microscop cu lumin polarizat, microscop cu
contrast de faz sau cu lumin fluorescent).
Concentraia spermei reprezint numrul de spermatozoizi pe unitatea de volum (valori
normale la cine 250-1200 x 106 spermatozoizi/ml). Concentraia spermei este un indicator
important al calitii spermei i reprezint punctul de pornire n cadrul tehnologiilor de
conservare a spermei pentru stabilirea gradului de diluie. Determinarea concentraiei se poate
face prin tehnica hemocitometric (adaptat dup tehnica de numrare a globulelor roii),
spectrofotometrie, metoda electronic (Sperm Quality Analyzer-SQA) sau cu ajutorul sistemelor
computerizate de analiz a spermei (CASA) (foarte rapid i precis). S-a observat o corelaie
pozitiv semnificativ ntre talia cinelui, respectiv dimensiunile testiculelor i numrul de
spermatozoizi per ejaculat i o corela ie negativ ntre vrst i numrul de spermatozoizi.

Mobilitatea reprezint un factor determinant n avansarea spermatozoizilor n cile genitale

femele. Mobilitatea spermei se apreciaz subiectiv pe o lam nclzit la 37o C. Mobilitatea
total este estimat prin notarea procentului de celule din prob care sunt mobile. Mobilitatea
normal a spermatozoizilor este micarea nainte liniar. Nu se consider mobilitate util
micrile rotatorii (n manej), micrile pendulante (agonice), micrile de naintare cu vitez
mic sau retropulsia. Examenul se realizeaz n doi timpi: aprecierea micrii n mas a
spermatozoizilor i aprecierea micrii individuale i se apreciaz pe o scal de la 1 la 5. O
mobilitate bun (4/5) permite examinatorului doar s observe forma celulei spermatice pe
msur ce aceasta traverseaz cmpul microscopic. O motilitate foarte bun (5/5) este atunci
cnd structura spermatozoidului abia se poate observa cnd acesta traverseaz rapid cmpul
vizual. Obiectiv, mobilitatea se determin cu ajutorul sistemelor CASA. Acestea permit obinerea
unor rezultate precise, rapide i complexe privind caracteristicile de micare ale
spermatozoizilor.
O mobilitate total de peste 80%, cu peste 70% progresie liniar este considerat normal
pentru cini de ctre majoritatea clinicienilor. Diveri factori (afeciuni ale aparatului genital,
echipamentul de recoltare, substanele utilizate pentru sterilizarea echipamentului de recoltare,
lubrifianii folosii, temperatura echipamentului de recoltare ca i a suprafeei de examinare a
spermei etc.) pot afecta mobilitatea spermei. Mrimea picturii de sperm depus pe lam
pentru examinare poate influena rezultatul examinrii o pictur prea mic limiteaz micrile
spermatozoizilor.
Morfologia spermatozoizilor se apreciaz imediat dup recoltare prin examen microscopic
(100x cu imersie) i colorare (DiffQuick, albastru de metilen, violet de genian, tu de China,
opal-bleu, albastru-tripan-Giemsa, eozin-negrozin, Spermac etc). Ofer posibilitatea de a
pune n eviden spermatozoizii imaturi, cu anomalii (majore sau minore) sau mori. Defectele
majore apar n timpul spermatogenezei i sunt incompatibile cu fertilitatea. Defectele minore

apar n timpul maturrii epididimare, a stresului termic exercitat la nivelul testiculelor (afeciuni
inflamatorii, mediu extern cald) sau a tehnicii defectuoase de colectare i examinare a
materialului seminal. Sunt preferate coloraiile care permit i evidenierea acrozomului. ntr-un
ejaculat normal procentul spermatozoizilor anormali, imaturi sau mori (teratospermie) nu
trebuie s depeasc 20%. n laboratoarele de specialitate se pot realiza i alte teste pentru
evaluarea spermei: testul hipoosmotic, proba redox, analiza structurii cromatinei spermatice,
examene bacteriologice i imunologice.
Pe lng cele de mai sus, trebuie examinat sedimentul de la fraciunile 1 i 3 n vederea
identificrii hematiilor, celulelor inflamatorii sau bacteriilor care pot indica afeciuni
asimptomatice ale sistemului reproductiv masculin. Culturile spermatice sunt adesea greu de
interpretat datorit numeroaselor microorganisme care populeaz uretra i prepuul. Totui, un
numr semnificativ de bacterii indic existena unei infecii. Mai mult, culturile realizate din
fluidul prostatic pot ajuta n identificarea organismelor asociate prostatitelor sau disfunciei
prostatice. Sperma de la masculii care nu au ejaculat recent poate conine mai multe celule
epiteliale i fragmente dect sperma de la un mascul folosit frecvent, dar dac sunt prezente
numeroase fragmente sau spermatozoizi mori trebuie recoltat o a doua prob la 24 48 de
ore.
Evaluarea reproductorului mascul nu trebuie s se bazeze pe o singur spermogram
anormal. n cazul unui rezultat nesatisfctor, masculul trebuie reevaluat dup 2-7 zile de
repaus sexual, iar dac anomaliile se menin, examinarea se va repeta dup 2 luni (durata unui
ciclu spermatogenetic complet la cine).
IV Conservarea materialului seminal
La ora actual, conservarea spermei se realizeaz prin:
-congelare care asigur pstrarea pe termen lung, practic infinit a materialului seminal;
-refrigerare, modalitate de conservare pe termen scurt, mergnd de la cteva ore la 4 7 zile.
Principiul care st la baza conservrii materialului seminal este c reducerea temperaturii
determin o scdere a activitii metabolice a spermatozoizilor permi nd stocarea lor. n cadrul
protocoalelor de conservare a spermei se utilizeaz doar cea de a doua fraciune a ejaculatului.
Se conserv doar sperma de bun calitate: mobilitate total peste 70 80% i maximum 20
30% anomalii.
Sperma refrigerat prezint o rat de fertilitate similar spermei proaspete, tehnica de lucru
este mai puin complicat, iar costurile totale sunt mai mici fa de sperma congelat.
Problemele care pot fi ntlnite n cazul utilizrii sale sunt faptul c ajunge moart sau congelat
la destinaie, fie datorit ambalrii improprii, fie din cauza lipsei de control asupra temperaturii
pe parcursul drumului. n plus, utilizarea spermei refrigerate necesit o bun coordonare i
planificare ntre proprietari i medicul veterinar determinate de durata sa mai scurt de via.
Pentru refrigerare, sperma se centrifugheaz (eliminarea complet a fluidului prostatic) i se
dilueaz. Diluantul protejeaz membranele spermatozoizilor de ocul provocat de modificarea
de temperatur i de transport, asigurnd n acelai timp rezerva energetic i meninerea
constant a pH-ului i presiunii osmotice. Exist mai muli diluani comerciali pentru refrigerarea
spermei, majoritatea necesitnd adugarea glbenuului de ou. nainte de a dilua materialul
seminal, trebuie s ne asigurm c sperma i diluantul se gsesc la aceeai temperatur (de

regul, temperatura camerei). Sperma diluat este rcit i meninut la 4o C 30-60 de minute,
iar apoi poate fi transportat ntr-un termos sau ntr-o lad frigorific. Fiola n care se afl
materialul seminal diluat trebuie izolat de contactul direct cu gheaa pentru a preveni o rcire
accentuat a acesteia. nainte de inseminare, sperma refrigerat se nclzete lent la
temperatura camerei.
Sperma congelat are avantajul stocrii pe termen nelimitat. n plus, permite schimbul
internaional, condiiile de transport i de utilizare a sa fiind bine reglementate. Dezavantajele
utilizrii sale sunt date de rezultatele variabile obinute dup decongelare chiar i n cazul
aceluiai individ, de costul ridicat al echipamentelor utilizate i de necesitatea realizrii
congelrii doar n centrele specializate (pentru ca monta s fie recunoscut). La ora actual
exist mai multe metode de congelare, fiecare cu setul su de substane tampon,
crioprotectoare i protocol de congelare. Unele metode sunt marc nregistrat i necesit
cumprarea unei francize pentru a fi utilizate (Canine Cryobank, CLONE, International Canine
Semen Bank (ICSB), Synbiotics i altele), altele sunt publicate n literatura de specialitate
(diluantul norvegian, diluanii Uppsala-Equex system 1 and 2, diluantul CERREC, diluantul
CERCA).
Etapele principale ale congelrii spermei de cine sunt: centrifugarea, diluarea, echilibrarea
termic, ambalarea, congelarea i decongelarea.
Scopul centrifugrii este de a elimina excesul de fluid prostatic despre care s-a demonstrat
c are un efect negativ asupra mobilitii i viabilitii spermatozoizilor dup congelare i
decongelare i de a standardiza concentraia final a spermei ca numr total de spermatozoizi
i concentraie n glicerol. Regimul cel mai utilizat n protocoalele de procesare a spermei
canine este centrifugarea la 600-700 g timp de 5-10 minute.
Diluarea materialului seminal are dou roluri: protejarea spermatozoizilor de efectele
negative ale temperaturilor joase din timpul congelrii i obinerea unei concentraii spermatice
finale predeterminate. Diluantul trebuie s fie izoton i izoterm cu sperma, s aib acelai pH cu
aceasta, s se prepare uor, s fie economic, s-i menin proprietile un timp ndelungat.
Mediile de diluie trebuie s conin: substane energetice (glucide); substane crioprotectoare
(glicerina, lecitina din glbenuul de ou); substane tampon (citrai, fosfai, tartrai, etc);
substane care s activeze mobilitatea spermatozoizilor n cile genitale femele (mucinaza);
substane care s mpiedice dezvoltarea florei microbiene (antibiotice, sulfamide).
nainte de a fi congelat, sperma diluat este rcit la 4o C i meninut la aceast
temperatur un interval de timp variabil, n funcie de protocolul utilizat (1-4 ore). Acest proces
se numete echilibrare i permite spermatozoizilor s dezvolte o rezisten mai mare fa de
ocul termic asociat congelrii. Dei spermatozoizii de cine sunt considerai relativ rezisteni la
ocul termic, s-a demonstrat c la aceast specie este preferabil o rcire lent. Pregtirea
pentru criocongelare a spermei include i fracionarea i ambalarea spermei, oferind astfel
posibilitatea stocrii spermei sub form de doze de inseminare n elemente uor de identificat:
paiete, comprimate, tuburi. La ora actual, cea mai rspndit form de ambalare a spermei
congelate de cine este reprezentat de paiete, acestea prezentnd cteva avantaje fa de
celelalte metode de ambalare: volum redus (crete capacitatea de stocare), congelare uniform
n interiorul paietei, posibilitatea marcrii cu datele importante pentru identificare (numele
cinelui, codul de identificare al paietei/cinelui, data recoltrii, numele ageniei care a fcut
congelarea etc.)

Congelarea propriu-zis se face folosind un dispozitiv de congelare programabil sau prin

amplasarea paietelor la diferite distane deasupra azotului lichid. Dei congelarea n cutie de
polistiren pe vapori de azot se folosete nc pentru mai multe specii datorit echipamentului
mai ieftin, mai multe studii arat c dispozitivele de congelare asistate de computer
mbuntesc longevitatea i mobilitatea progresiv post-decongelare deoarece permit stabilirea
unei curbe n doi pai, cu o reducere mai rapid a temperaturii pe parcursul primului pas fa de
cea obinut pe cutia de polistiren.
Ultima etap a crioconservrii o constituie plonjarea n azot lichid (-196o C). Sperma
congelat se stocheaz i se transport n tancuri cu azot lichid.
Pentru decongelare paietele se introduc n baie de ap la temperatura i pentru intervalul de
timp recomandat n protocolul de congelare utilizat, deoarece s-a descoperit c exist o
corelaie ntre vitezele de congelare i de decongelare. Decongelarea paietelor de 0,5 ml se
realizeaz n baie de ap la 37o C timp de 30 60 secunde.
V. Stabilirea momentului optim pentru mont sau nsmnarea artificial
Indiferent de tipul de material seminal utilizat (sperm proaspt, refrigerat sau congelat)
i de metoda de inseminare, momentul ales pentru realizarea IA este crucial pentru reuita
demersului i a obinerii fertilitii maxime. Din pcate, nc exist proprietari de cini care cred
c femela trebuie s fie montat/inseminat n anumite zile prestabilite ale ciclului sexual, lucru
care conduce la rezultate negative n numeroase cazuri i la etichetarea eronat drept infertil a
femelei. La ora actual, cea mai frecvent cauz a infertilitii la cea este reprezentat de
monta/inseminarea la momentul nepotrivit. n cazul nsmnrilor artificiale cu sperm
congelat sau refrigerat i transportat, costurile de transport i ale materialului seminal
propriu-zis (dac se utilizeaz o singur inseminare) se reduc la minimum. i n cazul utilizrii
spermei proaspete este util stabilirea momentului ovulaiei care permite un numr minim de
recoltri fr a epuiza masculul i evitarea inseminrilor inutile care ar conduce la creterea
costurilor economice pentru proprietar.
Un alt avantaj al cunoaterii momentului ovulaiei este c putem determina corect data
ftrii; de regul, are loc la 65 zile de la prima zi dup valul de LH. Data probabil a ftrii este
o informa ie preioas att pentru proprietar, ct i pentru medicul veterinar n stabilirea
diagnosticului de gestaie (ncepnd cu a 18-a zi de la valul de LH) i deci al reuitei inseminrii
sau n cazul n care este necesar operaia cezarian (ultimele 3 zile de gestaie).
Stabilirea momentului optim pentru mont implic cunoaterea fiziologiei ciclului sexual al
celei. n general, ceaua este o femel diestric (prezint 2 cicluri sexuale pe an), existnd i
rase monoestrice (ex.: Basenji), dar i femele care prezint 3 cicluri sexuale pe an. Fazele
ciclului sexual la cea sunt: proestru (320 zile), estru (3-21 zile), metestru/diestru (30-90 zile) i
anestru (2-4 luni).
n timpul proestrului femela se afl sub influena estrogenilor, dar nu i a progesteronului.
Prima cretere a concentraiei serice a progesteronului este corelat cu peak-ul LH-ului. Valul
de LH (hormon luteinizant) este fenomenul care va declana ovulaia n 30-48 ore. n mod
particular, ovocitele la cea sunt eliberate ntr-un stadiu prematur (ovocite primare) i nu pot fi
fertilizate imediat. Este nevoie de nc 48 de ore pentru desfurarea celei de a doua diviziuni
meiotice i eliberarea primului globul polar, fenomen n urma cruia rezult ovocitele secundare

mature. Ovocitele rmn viabile 4-5 zile n tractul genital femel, dup care sufer fenomene de
degenerare i nu mai sunt fecundabile.
Perioada fertil este intervalul de timp n care monta/inseminarea pot conduce la gestaie.
Acest interval cuprinde nu numai perioada n care ovocitele sunt fecundabile, ci i cteva zile
precedente, deoarece sperma de cine proaspt poate rmne fertil pn la 7 zile la nivelul
aparatului genital femel. n schimb, sperma refrigerat supravieuiete 24 de ore n tractul
genital femel, iar cea congelat-decongelat doar 12 ore.
Toate aceste date subliniaz nc o dat necesitatea i importana determinrii exacte a
momentului ovulaiei. Aceasta se face pe baza semnelor clinice, a datelor obinute din frotiul
vaginal, vaginoscopie, determinarea concentraiei serice a progesteronului (P4), ecografie
ovarian (tabelul 1). Ideal ar fi s se utilizeze minimum dou dintre aceste metode, iar
examinarea s se realizeze n dinamic (la fiecare 2 zile sau chiar zilnic n funcie de
particularitile ciclului femelei respective, dup debutul cldurilor).
Utilizarea comportamentului femelei ca indicator al ovulaiei are numeroase limite deoarece
aceste lucruri nu sunt ntotdeauna clare. Unele cele prezint un proestru fantom (nu
prezint sau prezint scurgere sangvinolent de intensitate redus etc.) ceea ce face dificil
estimarea datei ovulaiei, pot flutura coada i s fie receptive fa de mascul pe parcursul
proestrului sau pot refuza monta chiar i dup ovulaie. n plus, exist diferene
comportamentale de a o femel la alta.
Concentraia progesteronului plasmatic (P4) ncepe s creasc rapid n timpul valului de LH.
Monitorizarea serial a progesteronului permite deci anticiparea momentului ovulaiei cu 1-2
zile, confirmarea ovulaiei i determinarea perioadei fertile. Progesteronul poate fi msurat cu
precizie prin radioimunoanaliz (RIA), test ELISA sau prin imunochemoluminiscen i este
exprimat n ng/ml sau nmol/l (1 ng/ml = 3,17 nmol/l).
Variaiile hormonale care se produc n cursul diferitelor stadii ale ciclului sexual au
repercusiuni asupra multiplicrii i diferenierii celulelor epiteliului vaginal. Examinarea frotiurilor
vaginale permite identificarea stadiului ciclului sexual, dar nu ofer suficient exactitate n
stabilirea momentului optim pentru mont sau nsmnare artificial. Din acest motiv se
recomand completarea examenului citologic cu alte examene care s rezolve acest neajuns.
Pentru realizarea unui frotiu vaginal, se introduce un tampon de vat printre labiile vulvare n
vagin. Tamponul se orienteaz cranio-dorsal pentru a evita recoltarea celulelor din fosa
clitoridian. Odat tamponul ajuns cranial de orificiul uretral, acesta este rotit lent pentru a
exfolia i recolta celulele. Dup retragerea tamponului din vagin, celulele sunt transferate pe o
lam de microscop curat prin rularea tamponului pe suprafaa acesteia. Astfel se obin celule
intacte n timpul transferului. Din contr, prin micarea nainte-napoi a tamponului pe lam se
produc distorsionri celulare severe i chiar rupturi. Odat celulele transferate, lamele se usuc
la aer, se coloreaz i se examineaz la microscop. Exist mai multe tehnici de colorare a
frotiului vaginal (May-Grnwald Giemsa (MGG) sau Giemsa rapid, Harris-Shorr, Papanicolau,
hematoxilin-eozin, Romanowsky etc.), alegerea unei metode fcndu-se n func ie de scopul
urmrit, de posibilitile de execuie, de rapiditatea realizrii, de cost i de experiena i
preferinele examinatorului. Interpretarea frotiului vaginal const n clasificarea celulelor
ntlnite, evaluarea aspectului i cantitii de mucus, stabilirea indicilor citovaginali i corelarea
tuturor acestor date n vederea stabilirii fazei ciclului sexual.

Vaginoscopia permite examinarea mucoasei vaginale cu ajutorul unui endoscop rigid sau
flexibil sau al unui proctoscop pediatric. Endoscopul trebuie s aib un diametru de maxim 8
15 mm, cel puin 10 20 cm lungime i o surs adecvat de lumin. Procedura este bine
tolerat de femel i nu necesit sedarea acesteia. n timpul examinrii se urmresc culoarea
mucoasei, prezena faldurilor i a secreiilor. Sub influena estrogenilor, faldurile vaginale devin
edemaiate, umede i de culoare roz. Pe msur ce femela avanseaz de la proestru spre estru
aceste falduri ncep s i piard din aspectul edemaiat, devenind cutate (pliuri primare i
secundare). Cnd ceaua este n deplin estru faldurile vaginale prezint cute cu margini bine
definite. La trecerea din estru spre diestru faldurile vaginale se aplatizeaz, iar mucoasa
vaginal capt un aspect vrgat rou cu alb.
Dei se consider c ecografia ovarian la cea este dificil de realizat (datorit
dimensiunilor mici ale ovarelor, nconjurate de bursa ovarian care poate fi gr soas,
mpiedicnd trecerea fasciculului de ultrasunete i a localizrii superficiale), generaiile noi de
ecografe i experiena dobndit de medicii veterinari permit utilizarea acestei tehnici pentru
monitorizarea ovulaiei la cea.
Spre sfritul anestrului, ovarele hipoecogene tind s se mreasc n volum i se pot detecta
foliculi plini cu lichid, de dimensiuni mici 1 2 mm. Situaia se poate menine timp de 30 sau mai
multe zile pn la debutul proestrului cnd numrul i dimensiunile foliculilor cresc. S-au
menionat modificri ale aspectului ecografic n jurul momentului ovulaiei. Foliculii sunt destul
de evideni cu 5 zile nainte de ovulaie, moment la care diametrul foliculilor mari crete i atinge
dimensiunile maxime cu aprox. 1 zi nainte de valul de LH. La acest moment diametrul intern al
foliculilor mari poate ajunge la 8 9 mm i frecvent apare o modificare a conturului care nu mai
este sferic. Foliculii tind s depeasc marginile stromei ovariane. Mai muli sau chiar toi
foliculii anecogeni ovarieni sunt nlocuii la momentul ovulaiei de structuri hipoecogene sau
ecogene i tind s dispar. Aceast modificare, care este evident timp de 1 2 zile, poate fi
detectat ca fenomen acut dac ovarele sunt examinate ecografic zilnic. Nu se tie dac
aceast modificare de aspect implic o modificare a ecogenitii fluidului folicular, colapsul
folicular, hemoragie n folicul sau proliferarea timpurie rapid a esutului luteal n antrumul
folicular. Totui, acest aspect ecografic este tranzitoriu deoarece corpul galben se caviteaz
rapid i din nou apare plin cu lichid i cu un centru anecogen dup 24 48 de ore. Faza luteal
ovarian poate varia foarte mult ca aspect deoarece ecogenitatea corpului galben poate s nu
difere prea mult fa de stroma ovarian.
Pot exista diferene ntre foliculii ovarieni ca extindere a ecogenitii foliculare la momentul
ovulaiei i ca mrime i hipoecogenitate a corpului galben la cteva zile dup ovulaie. Dei
corpii galbeni au pereii mai groi dect foliculii preovulatori, ei sunt greu de interpretat, iar
pentru un operator neexperimentat nu este posibil printr-o singur examinare s determine dac
ovulaia a avut loc pn la cteva zile dup aceasta cnd pereii luteali se ngroa progresiv.
Interesant, numrul de foliculi ce sunt vizibili prin ultrasunete nu se coreleaz corect cu numrul
de ovocite ce ovuleaz. Aceasta se datoreaz faptului c 20 30% din foliculii canini conin mai
mult de o ovocit; cel mai mare numr nregistrat ntr-un folicul este de 17 ovocite. Deci, cel
puin n teorie, o generaie de cei poate fi produsul unei singure ovulaii.

VI. Metode de inseminare

n literatura de specialitate, n funcie de locul de depunere a spermei sunt descrise dou
tehnici de inseminare: intravaginal i intrauterin (cu acces intrauterine transcervical sau
chirurgical). Alegerea metodei de inseminare depinde de tipul de sperm utilizat:
- Pentru sperma proaspt inseminare intravaginal
-Pentru sperma refrigerat se prefer inseminarea intrauterin, dar se poate utiliza i cea
vaginal
-Pentru sperma congelat inseminare intrauterin .
Inseminarea intravaginal necesit echipament i pregtire minime, este relativ noninvaziv, cu risc redus pentru cea. IA vaginal se poate realiza cu ajutorul unui cateter simplu
de plastic (de genul celui folosit pentru bovine, dar tiat la o lungime adecvat) sau cu
dispozitive speciale (cateterul Osiris prezint la vrf un balon gonflabil care va bloca refluxul
spermei). Cu femela n poziie patrupodal, pipeta de inseminare este introdus pe la comisura
superioar a vulvei, iniial n poziie aproape vertical, apoi prin micri uoare de rotaie se
orienteaz orizontal i se avanseaz ct mai mult posibil (pn la pliul dorso-median al
vaginului pseudocervixul). Dac se simte rezisten, pipeta se retrage 1 2 cm, apoi se
reintroduce la un unghi uor diferit. Vaginul celei este lung i o pipet de inseminare poate fi
introdus pn la o adncime de peste 20 cm la femelele de talie mare. Se aspir sperma n
sering, iar seringa se ataeaz direct sau prin intermediul unui tub scurt de cauciuc la pipeta
de inseminare. Prin refularea coninutului pipetei n vagin se realizeaz practic inseminarea. n
timpul inseminrii i 10 15 minute dup aceasta, ceaua se menine cu trenul posterior ridicat
astfel nct coloana vertebral este sub un unghi de 45 60o i se maseaz clitorisul
(stimuleaz contraciile vaginale antiperistaltice) pentru a facilita pasajul spermatozoizilor spre
uter. Dup ce membrele posterioare sunt eliberate, ceaua nu trebuie lsat s se aeze sau
s sar timp de nc 10 15 minute.
nsmnarea transcervical este o tehnic de depozitare a spermei n uter prin
cateterizarea cervixului. Acest lucru se poate realiza fie cu ajutorul cateterului norvegian, fie
endoscopic. Ambele tehnici se pot realiza chiar i fr sedarea femelei. Este important ca
volumul inseminat s fie destul de mic pentru a se evita refluxul spermei n vagin (1 ml la rasele
de talie mic, 2ml la rasele de talie medie, 3-4ml pentru rasele de talie mare).
Tehnica norvegian utilizeaz un echipament format din: sond metalic, un tub de plastic
folosit pentru ghidaj i o sering. Operatorul introduce ghidul tubular prin vagin pn la
extremitatea posterioar a pseudocervixului. Prin tubul de ghidaj se introduce sonda metalic
sau un cateter rigid de plastic care se dirijeaz prin palpaie transabdominal prin canalul
cervical. naintarea transcervical este facilitat de tracionarea transabdominal a cervixului n
sens cranial i alinierea canalului cervical cu sonda. Plasarea sondei n apropierea deschiderii
cervixului este perceput de operator ca o senzaie de crepitaie asemntoare palprii unui
cartilaj. Pentru reuita metodei se impune mult exerciiu i o bun manualitate. Insuccesul
cateterizrii transcervicale este cotat de autorii scandinavi la 2 3,5%, cu menionarea
neaplicabilitii metodei la celele de talie mare, obeze sau cu temperament nervos.
Tehnica endoscopic necesit utilizarea unui endoscop rigid care se introduce n vagin
pentru a vizualiza cervixul. Cateterizarea cervixului se realizeaz cu un cateter rigid din

polipropilen. Dei tehnica propriu-zis este mai facil, utilizarea sa implic utilizarea unui
echipament scump. Un aspect important al procedurii este riscul de traume sau infecie. Este
greu de crezut c un cateter urinar din plastic ar putea perfora peretele vaginal sau uterin n
timpul estrului n afara cazului n care nu exist o situaie patologic. Totui, zona paracervical
poate fi traumatizat de endoscop dac se utilizeaz o for inadecvat; dac avansarea
endoscopului determin un disconfort evident celei, atunci procedura trebuie oprit. n timpul
proestrului i estrului se izoleaz n mod curent bacterii din uter i vagin care, aparent, nu
creeaz probleme, probabil datorit unei rezistene crescute fa de infecii a organismului n
aceast perioad. Prin urmare, este rezonabil s credem c avansarea unui cateter din vagin n
uter n acest moment nu va determina probleme. Totui, trebuie s avem grij s nu introducem
noi infecii prin utilizarea unui echipament incorect sterilizat sau din mediu printr-o tehnic
defectuoas. Echipamentul trebuie curat i dezinfectat conform recomandrilor
productorului.
Inseminarea intrauterin chirurgical este utilizat n cazul obstruciilor vaginului sau
cervixului care nu permit cateterizarea acestuia prin metodele mai sus menionate. Inseminarea
prin laparotomie este cea mai folosit metod. Tehnica este simpl i rapid. Dup o pregtire
de rutin a abdomenului posterior se efectueaz incizia pielii i a peretelui abdominal, se
exteriorizeaz uterul, iar sperma este injectat folosind o sering cu ac de 20 G sau un cateter
intravenos. Procedura se realizeaz cu instrumentar steril, astfel c riscul introducerii bacteriilor
din vaginul nesteril este eliminat. Tehnica chirurgical permite accesul la uter, astfel c
depozitarea materialului seminal se face corect; n schimb, necesit anestezie general, cu
riscurile asociate acesteia i unei intervenii chirugicale. Un alt dezavantaj l reprezint numrul
limitat de inseminri care se pot realiza pe aceast cale. De asemenea, metoda este
costisitoare i cronofag. n ceea ce privete doza de inseminare, prerile sunt mprite, dar n
general se consider c trebuie s se asigure 150-200 milioane spermatozoizi normali cu
motilitate progresiv.

VII.

Concluzii

La ora actual se pot obine rezultate bune i foarte bune prin IA la c ea. Succesul depinde de
modul n care medicul veterinar reuete s mbine toi factorii implicai n acest proces, inclusiv
modul n care se programeaz i coordoneaz acestea (momentul solicitrii spermei
refrigerate/congelate etc.).

VIII. Bibliografie

* Revista Veterinaria nr 6 aprilie-iunie 2012

* www.zoopedia.ro