Rezultatele Proiectului Genesis

Evolutie Genetic: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.
O cltorie biomolecular n jurul Carpailor din Antichitate pn n Evul Mediu
Raport tiinific
Sumar 2012-2016
CUPRINS
1. Sumar raportri tiinifice pe perioada de desfurare a proiectului

2. Raport tiinific an 2016 (12 luni)
a. Antropologie fizic 2012/2016
b. Antropologie molecular:
i. Tumulul de la Mireasa i necropola medieval de la Capidava (Epoca
Bronzului, perioada medieval), rezultate finale - 2016
ii. Tartru dentar (perioada medieval) - 2016
iii. Diagnostic molecular malaria (perioada premodern) - 2016
c. Bioarheologie: identificarea unor resturi arheologice vegetale (cereale) - 2016
d. Analize conexe - 2016

1. Sumar raportri tiinifice pe perioada de desfurare a proiectului
n cadrul acestui proiect, desfurat n perioada 2012-2016, am reuit, pornind de la o

echip nucleu reunind istorici, arheologi, biologi i fizicieni afiliai la Institutul de Arheologie
Vasile Prvan al Academiei Romne, Centrul de Studii Transilvane al Academiei Romne,
Institutul de Biologie Bucureti al Academiei Romne, Institutul de Cercetri Interdisciplinare n
Bio-Nano-tiine al Universitii Babe-Bolyai din Cluj-Napoca i la Facultile de Istorie i
Biologie ale Universitii Alexandru Ioan Cuza din Iai, n premier naional, constituirea unei
reele interdisciplinare funcionale capabil s demareze, susin i valorifice studii complexe
avnd ca obiect materialul arheologic. Aceast reea, a fost extins pe parcursul proiectului
pentru a include ali actori naionali i internaionali relevani i interesai de abordarea
interdisciplinar n arheologie. Astfel, echipa funcional include acum i cercettori ai Muzeului
de Istorie Naional i Arheologie Constana, colaborri susinute cu Universitatea din Florena
(Laboratorul de Paleogenetic).
Proiectul susine activitatea de cercetare a patru studeni doctoranzi, care vor susine
tezele doctorale la finalul anului 2017.
Geografic, probele analizate n cadrul proiectului acoper zone din Transilvania,
Moldova, Muntenia i Dobrogea, iar din punct de vedere cronologic au fost analizate probe
neolitice, din Epoca Bronzului, perioada clasic, perioada medieval i perioada premodern.
Probele dominante analizate sunt probe osteoarheologice umane, dar au mai fost analizate i
probe arheozoologice, material de inventar (ceramic, lemn, metal) i alte materiale
bioarheologice (resturi vegetale).
Activitatea grupului constituit n cadrul acestui proiect va continua i se va diversifica
dup ncheierea acestuia.
n perioada de desfurare a proiectului au fost raportate 24 de articole publicate sau
acceptate spre publicare, 61 de participri la conferine internaionale cu prezentri orale sau
postere (conform datelor ncrcate n platforma de raportare).
n cadrul proiectului au fost organizate trei workshop-uri (2013, 2014 i 2015) la Cluj-
Napoca n vederea popularizrii rezultatelor proiectului n mediul academic i o conferin de
ncheiere a proiectului la Iai, n 2016.
a. Antropologie fizic 2012/2016
Principalele obiective de lucru ale laboratorului de antropologie fizic au fost: 1. realizarea

unui protocol de lucru unitar care s cuprind o selecie de metode din cele existente n literatura
internaional, precum i metodologia de aplicare a acestor metode i de nregistrare a datelor; 2.
analiza extins a unor serii de eantioane osteologice; 3. publicarea rezultatelor prin articole
tiinifice i participri la conferine.
1. Protocolul de lucru
S-a realizat un protocol de lucru ce cuprinde 37 de pagini. Metodele selectate sunt folosite la
nivel internaional i permit realizarea unor comparaii ntre rezultate. Acestea urmresc
stabilirea unor atribute standard cum sunt sexul i vrsta la deces, dar i a msurtorilor metrice
i identificarea unor patologii dentare i osoase. Aceste date ofer informaii cu privire la
demografia populaiilor arheologice, stilul de via, dieta i patologiile la care erau expui
indivizii n diferite perioade istorice. Se observ de asemenea prezena traumelor i fracturilor,
cu scopul identificrii comportamentului violent dar i a interveniilor post-mortem asupra
defunctului.
Studiul macroscopic al materialului osteologic include urmtoarele observaii:
Starea de reprezentare i inventarul oaselor
Determinarea sexului i estimarea vrstei la deces
Inventarul dentiiei i patologia dentar
Identificarea osteoartritei
Identificarea inflamrii sub-periostale
Identificarea patologiilor metabolice (anemie, scorbut, rahitism)
Identificarea unor leziuni patologice indicatoare pentru boli specifice (sifilis, tuberculoz,
osteomielit, sinuzit etc.)
Realizarea msurtorilor metrice
Metodele folosite pentru realizarea observaiilor de mai sus au fost selectate n funcie de
dou principii aplicabilitate (metodele s nu dea erori cnd sunt aplicate pe populaii de pe
teritoriul Romniei) i comparabilitate (rezultatele s poat fi comparate cu date internaionale).
Metode folosite:
1. Pentru determinarea sexului
a. Prin observarea caracterelor craniene Acsadi, Nemeskeri, 1970.
b. Prin observarea caracterelor regiunii subpubice Phenice, 1969; Buikstra,
Ubelaker, 1994.
2. Pentru estimarea vrstei la deces
a. Morfologia capetelor costo-condrale Ican i colab., 1984.
b. Morfologia simfizei pubiene Todd, 1920, 1921.
c. Morfologia suprafeei auriculare Lovejoy i colab., 1985.
d. Sinostoza suturilor craniene Meindl, Lovejoy, 1985.
e. Uzura dentar Brothwell, 1981.
f. Erupia dentar Ubelaker, 1989.
g. Lungimea oaselor pentru rmie fetale Fazekas, Ksa, 1978.
h. Lungimea oaselor Stloukal, Hankov, 1978.
i. Sinostoza epifizelor Coqueugniot, Weaver, 2007.
3. Analiza dentiiei
a. Hipoplazia dentar Hassett 2014.
4. Artroza articulaiilor Steckel i colab., 2011.
5. Nodulii lui Schmorl stnda 2008.
6. Remodelarea leziunilor Mensforth i colab., 1978.
7. Hiperostoza porotic Stuart-Macadam, 1985.
8. Fracturi i traume Lovell, 1997.
9. Modificri osoase (deranjarea secundar) Outram, 1998; Villa, Mahieu, 1991; Outram
i colab., 2005.
2. Analiza materialului osteologic

S-a analizat un numr de aproximativ 800 de schelete provenind din 26 de necropole diferite.
Cronologia acestora variaz, din perioada Neolitic pn n secolul al 19-lea.
Tabel 1. Probe osteologice studiate
Nume sit Jude Datare Numr de Publicaie
cronologic schelte
1 Alba Alba Multipl (Ep. 10
Gmba Bronzului,
Avari, etc.)
2 Boldeti- Prahova sec. 4-5 18 C
Grdite
3 Clineti Prahova Medieval 171
4 Capidava Constana Multipl (Ep. 127 C
Bronzului, Ep.
Medieval)
5 Cristian Sibiu Neolitic 5 A
6 Ernei Mure Sec. 2-4 1 C
7 Fntnele Bistria- Sec. 6-7 10
Nsud
8 Feleac Cluj Medieval 25
9 Galaii Bistria Sec. 6-7 13
Bistriei
10 Gheorgheni Harghita Medieval 28 A, C
11 Gherseni Buzu Sec. 4-5 4 A
12 Histria Constana Multipl 9 A
13 Hunedoara Hunedoara Sec. 1 BCE- 2 39 C
CE
14 Joseni Harghita Medieval 11
15 Mlieti Prahova Sec. 2-3 1 C
16 Miceti Alba Ep. Bronzului 3 A
17 Mireasa 1 Constana Ep. Bronzului 12 A, C
18 Mireasa 2 Constana Medieval 150 C
19 Ndlac 1 Arad Sec. 6-7 2 A
20 Ndlac 2 Arad Sec. 2-4 24
21 Autostrad Arad Sec. 2-4 17 A
22 Suplacu de Slaj Neolitic 1 A, C
Barcu
23 Toboliu Bihor Ep. Modern 8 A
24 Turda Hunedoara Neolitic 2 A
25 Turda Cluj Sec. 6-7 2
26 Vlaha Cluj Sec. 6-7 110 C
TOTAL 803
*C conferin; A articol tiinific.
Distribuia loturilor osteologice pe perioade

cronologice
600
500
400
300
200
100
0
Neolitic Ep. Ep. Fierului Per. Ep. Ep. Ep.
Bronzului Roman Migraiilor Medieval Modern
Nr. necropole Nr. indivizi
Figura 1. *Ep. Migraiilor cuprinde i populaii din Barbaricum din timpul perioadei romane.
Interpretarea rezultatelor s-a axat pe trei direcii: necropole cu un numr mare de indivizi,
grupurile populaionale extinse i cazurile excepionale.
2.1.Necropole cu un numr mare de indivizi (peste 100 de indivizi)

n acest grup intr materialul osteologic de la Capidava (perioada medieval, N=125), Clineti
(perioada medieval, N=171), Mireasa (perioada medieval, N=150) i Vlaha (epoca migraiilor,
N=110). Datorit numrului mare de indivizi existent n fiecare necropol, rezultatele obinute
sunt mult mai reprezentative la nivel populaional.
2.2.Grupuri populaionale extinse

n majoritatea cazurilor, necropolele nu sunt investigate arheologic integral, astfel c numrul
de indivizi este de multe ori redus. Cu toate acestea, unele loturi osteologice fac parte din acelai
grup populaional cu o rspndire geografic mai larg sau sunt datate n aceeai perioad
cronologic. Acest lucru ne permite att realizarea unor comparaii ntre sub-grupuri ct i o
analiz populaional, care, ca i n cazurile necropolelor descrise mai sus, este mai
reprezentativ. Dintre loturile analizate, se observ urmtoarele grupuri, reprezentate n special
de grupuri etnice: cultura Iamnaia, Sarmai, Gepizi i perioada medieval.
Lotul osteologic de la Mireasa, judeul Constana, reprezint un complex funerar tumular cu
15 morminte, datate n Epoca timpurie a Bronzului, care conin 12 indivizi. Lotul osteologic este
compus din 4 subaduli, 2 adolesceni i 6 aduli (5 brbai i un adult pentru care sexul nu a
putut fi determinat). Din punctul de vedere al strii de sntate, att la nivel osos ct i dentar
grupul populaional nu prezint leziuni patologice extinse. Distribuia hiperostozei porotice la
40% dintre indivizi coroborat cu lipsa defectelor de dezvoltare dentare sugereaz c acest grup
a fost afectat moderat de stres fiziologic i deficiene nutriionale. De asemenea, lipsa cariilor
este indicatoare pentru o diet srac n carbohidrai. Acest lucru poate fi corelat cu valoarea
izotopului stabil 13C, -19,7, care ne indic o diet compus din plante C3. Nu n ultimul
rnd, s-a observat lipsa indivizilor de sex masculin n acest ansamblu funerar. Compoziia
demografic a lotului osteologic de la Mireasa a fost comparat cu alte 17 situri contemporane.
Din 168 de indivizi, femeile reprezint doar 12,5% (n=21). n concluzie, studiul nostru (Radu i
colab., Bioarchaeological characterization of the human remains from the Early Bronze Age
barrow from Mireasa, Romania) ofer o perspectiv bioarheologic asupra acestui grup
populaional, insistndu-se asupra strii de sntate (prin identificarea leziunilor patologice),
dietei (prin identificarea indicatorilor de stres nutriional) i interpretrii bioculturale a unor date
biologice.
Dou necropole identificate pe tronsoanele n lucru ale autostrzii Arad-Timioara au fost
ncadrate pe baza culturii materiale populaiei sarmatice i datate n secolele 2-4 CE. n total au
fost analizai 45 de indivizi. Prima necropol (punct: autostrada Arad-Timioara, tronson Arad-
Seceani, km 23+170 - 23 +690 (siturile B0_7-B0_8), responsabil Dr. Vitalie Brc) cuprinde 17
morminte. Conservarea precar a materialului osteologic a limitat analiza, care s-a axat n special
pe dentiie. Lotul cuprinde 14 copii i 3 aduli. Cea de-a doua necropol (responsabil Dr. Adrian
Ursuiu) cuprinde 24 de indivizi, dintre care 8 sunt femei, 6 brbai, 6 aduli pentru care sexul nu
a putut fi determinat, i 4 subaduli.
Populaia gepidic este reprezentat de materialul osteologic provenit de la Galaii Bistriei,
Fntnele, Vlaha i Ndlac 1. n total au fost analizai 136 de indivizi. Datele obinute vor fi
prelucrate n vederea realizrii primei sinteze bioarheologice pentru aceast populaie. Mai mult,
pentru necropolele cu morminte n iruri paralele este caracteristic fenomenul deranjrii
secundare, cel mai probabil cu scopul jefuirii mormintelor (Opreanu, 2003). Astfel, n analiza
acestor loturi s-a acordat o atenie special morfologiei i distribuiei traumelor pe schelet.
Modul n care osul se rupe este influenat de nivelul de scheletizare a osului. Cu ct a trecut mai
mult timp de la moartea defunctului, cu att osul este mai demineralizat. Studiul nostru a pornit
de la ipoteza c deranjarea mormintelor se realizeaz la puin timp dup nmormntare, probabil
chiar de membri ai comunitii de care acetia aparin. Prin aplicarea protocolului de lucru
elaborat special pentru a studia aceast problem, am reuit s identificm modele diferite n
modul n care oasele sunt afectate i, mai exact, perioade diferite n care deranjarea secundar are
loc (n cazul unor indivizi oasele erau mai scheletizate la momentul producerii traumelor dect la
alii). n continuare, acest protocol va fi aplicat pe nc o serie de loturi osteologice, urmnd ca
rezultatele s fie coroborate cu datele osteologice i arheologice.
Perioada medieval este larg reprezentat n cadrul materialului osteologic analizat, n
special prin cele 3 mari necropole descrise mai sus. n total, au fost analizai 510 indivizi.
Rspndirea necropolelor este la nivelul ntregului actual teritoriu al Romniei. Numrul mare de
indivizi ne permite s investigm frecvena i distribuia unor boli cum sunt tuberculoza, sifilisul
sau infecii respiratorii, dar i a traumelor n medii diferite (urban i rural). n cazul necropolei de
la Clineti, s-a observat o frecven ridicat a fracturilor de col femural, dar i a infeciilor de
tipul sifilisului i tuberculozei. n cazul necropolei de la Capidava exist dou situaii
excepionale: o groap comun, respectiv o distribuie larg a unui tip de traum cranian.
Groapa comun cuprinde minimum 10 indivizi (femei, aduli i copii). Studiul acestora vizeaz
comparaia cu ceilali indivizi din necropol pentru identificarea unor factori care s motiveze
modul n care au fost nmormntai. Analizele moleculare sunt n curs de desfurare. Ct
privete trauma cranian, aceasta a fost identificat la 9 indivizi sub forma unei lovituri circulare
vindecate, realizat antemortem cu un obiect contondent, avnd un diametru aproximativ ntre 10
i 22 de cm. Din cei nou indivizi, patru prezint o singur lovitur, iar 5 au traume multiple
(ntre 2 i 8/individ) (vezi tabel 2).
Tabel 2. Distribuia traumelor craniene circulare la indivizii din necropola de la Capidava.
Vrst
Nr. Mormnt Sex Frontal Parietal Occipital Nr. traume
la deces
C50 M 24-35 1
C7 M3 F 44-50 x3 3
C96P M 18-20 x2 2
C105P M 24-34 x7 8
C87P F 27-34 x2 2
C100P M 35-44 x2 x2 4
C91P M 25-51.5 1
C106P M 39-44 1
C86P M 34.7-44 1
2.3.Cazuri excepionale
2.3.1. Ernei
n anul 2004, n cadrul unor spturi de salvare a fost identificat un complex arheologic datat
iniial n Epoca Migraiilor. Complexul conine patru niveluri, dintre care trei doar cu obiecte iar
unul, cel mai de la suprafa, cu un schelet (Lzrescu, Crian, 2010). Dei scheletul a fost
analizat antropologic anterior n cadrul altui laborator, analiza noastr a identificat dou traume
la nivelul vertebrei C4, realizate perimortem i indicatoare pentru decapitarea individului. Un
fragment osos a fost datat cu radiocarbon, iar ncadrarea cronologic este diferit de cea iniial,
relativ, i anume 75-235 Cal AD. Astfel cercetarea acestui complex include date osteologice,
paleopatologice, moleculare, biochimice i arheologice. Cazul a fost prezentat n cadrul CHNT
20. Conference on Cultural Heritage and New Technologies (2-4 noiembrie 2015, Viena,
Austria). Publicarea rezultatelor este n curs. Se intenioneaz publicarea acestora n Journal of
Archaeological Science.
2.3.2. Suplacu de Barcu

n anul 2012 a fost identificat un schelet n cadrul aezrii neolitice de la Suplacu de Barcu
Coru, cercetat de Dr. Florin Gogltan i Dr. Gruia Fazeca. Datarea scheletului a oferit o
dat Cal BC 4830-4710. n urma analizei am identificat o serie de caracteristici patologice rar
ntlnite. Diagnosticul diferenial al leziunilor sugereaz c ar putea fi vorba de un caz de Diabet
de tip II. Dat fiind faptul c la momentul actual nu exist cazuri publicate de diabet la populaii
arheologice, argumentarea diagnosticului este ngreunat. Rezultatele primare au fost publicare
n Acta Musei Porolissensis XXXV, 2013. Se intenioneaz publicarea extins a rezultatelor n
International Journal of Paleopathology.
2.3.3. Mlieti
Un schelet de copil cu o vrst la deces ntre 0 i 2 luni a fost descoperit n anul 2014 n
cadrul termelor romane spate la Mlieti, jud. Prahova de Dr. Ovidiu entea. Cu toate c
scheletul este prost pstrat, s-a putut observa prezena unei patologii la nivelul tuturor
fragmentelor osoase recuperate. Mai mult, analizele de izotopi stabili au artat valori foarte
sczute pentru 15N, 7,9. Acest lucru este interesant deoarece sugarii prin ingerarea laptelui
matern practic urc n lanul trofic i astfel prezint valori mai ridicate pentru 15N. Valoarea
nregistrat n cazul acestui copil sugereaz n primul rnd c dieta sa nu se baza pe laptele
matern i c aceasta e caracterizat de un aport sczut de proteine. Aceste informaii se coreleaz
cu datele paleopatologice. Leziunile identificate pe scheletul copilului sunt caracterizate de os
patologic nou format. Pentru diagnosticul diferenial este revelatorie prezena leziunilor pe
mandibul i clavicul, acestea fiind patognomonice pentru hiperostoza cortical infantil. n
cazurile clinice, sugarii care se prezint cu leziuni pe mandibul adesea refuz alptarea, ceea ce
se potrivete cu valorile izotopilor stabili. Cazul a fost prezentat n cadrul 3 rd International
Congress. Biomedical Sciences in Archaeology (6-9 noiembrie 2014, Bordeaux, Frana).
Publicarea este n curs. Se intenioneaz publicarea rezultatelor n Archaeological and
Anthropological Sciences.
3. Publicarea rezultatelor
3.1.Participri la conferine
n total, s-a participat la 13 conferine, dintre care 6 n strintate. Acest lucru a permis att
discutarea unor cazuri cu experi din strintate, dar i creterea vizibilitii grupului de lucru la
nivel internaional. Cretera vizibilitii grupului s-a realizat i la nivel naional, lucru evideniat
de numrul mare de instituii cu care colaborm:
Institutul de Arheologie i Istoria Artei, Academia Romn, Cluj-Napoca
Muzeul Naional de Istorie a Transilvaniei, Cluj-Napoca
Muzeul Naional de Istorie a Romniei, Bucureti
Muzeul Judeean de Istorie i Arheologie, Ploieti
Muzeul rii Criurilor, Oradea
Muzeul Judeean, Satu-Mare
Muzeul Naional al Unirii, Alba-Iulia
Muzeul de Istorie Naional i Arheologie, Constana
Muzeul Naional Brukenthal, Sibiu
Muzeul Tarisznys Mrton, Gheorgheni
3.2. Articole tiinifice

S-au publicat 13 articole tiinifice. Publicarea rezultatelor s-a fcut n unele din cele mai
importante reviste din ar pentru domeniul arheologiei: Ephemeris Napocensis, Materiale i
Cercetri Arheologice, Brukenthal Acta Musei, Analele Banatului, Pontica, Terra Sebus, Acta
Musei Porolissensis, Annales Universitatis Apulensis. Series Historica, Journal of Ancient
History and Archaeology. Alte patru articole au fost publicate n volume aferente unor conferine
(Archaeopress Publishing, Oxford, United Kingdom; JATEPress Kiado, Szeged, Ungaria),
respectiv capitole n dou volume editate.
Dat fiind lipsa acut de informaie bioarheologic n cercetarea din Romnia, am ncercat s
publicm ct mai mult din materialul analizat, crescnd astfel nivelul de date existente pentru
diferite perioade cronologice sau populaii. Mai mult dect att, cu o excepie, toate publicaiile
sunt n limba englez. Acest lucru se adaug la utilizarea unor metode aplicate n cercetarea
internaional, rezultnd un grad ridicat de accesibilitate a informaiilor existente n mediul
academic internaional cu privire la aplicaii bioarheologice pentru teritoriul Romniei.
4. Direcii viitoare
n perioada urmtoare se va continua publicarea rezultatelor obinute. Se vizeaz dou
direcii: publicarea cazurilor descrise la punctul 2.3., respectiv publicarea unor lucrri de sintez.
Astfel, cercetarea celor trei cazuri de la punctul 2.3. este multidisciplinar, incluznd date
obinute din analiz macroscopic, microscopic, molecular sau biochimic. Gradul de
complexitate al studiului i al interpretrii datelor argumenteaz pentru publicarea rezultatelor n
reviste internaionale. n al doilea rnd, se dorete publicarea datelor pentru cele trei necropole
medievale (Capidava, Mireasa i Clineti) mpreun cu datele arheologice.
Acsdi, Gy., Nemeskri, J. (1970). History of human life span and mortality. Akadmiai Kiad,
Budapest.
Brothwell, D. R. (1981). Digging up bones: The excavation, treatment, and study of human
skeletal remains. Cornell University Press, Ithaca, N.Y.
Buikstra, J. E., Ubelaker, D. H. (eds.) (1994). Standards For Data Collection from Human
Skeletal Remains. Arkansas Archaeological Survey Research Series No. 44.
Coqueugniot, H., Weaver, T. D. (2007). Infracranial Maturation in the Skeletal Collection from
Coimbra, Portugal: New Aging Standards for Epiphyseal Union. American Journal of
Physical Anthropology 134: 424-437.
Fazekas, I. Gy., Ksa, F. (1978). Forensic Fetal Osteology. Akadmiai Kiad, Budapest.
Hassett, B. R. (2014). Missing defects? A Comparison of Microscopic and Macroscopic
Approaches to Identifying Linear Enamel Hypoplasia. American Journal of Physical
Anthropology 153: 463-472.
Ican, M. Y., Loth, S.R., Wright, R.K. (1984). Metamorphosis at the Sternal Rib End: A New
Method to Estimate Age at Death in White Males. American Journal of Physical
Lovejoy C. O., Meindl, R. S., Pryzbeck T. R., Mensforth R. P. (1985). Chronological
Metamorphosis of the Auricular Surface of the Ilium: A New Method for the
Determination of Adult Skeletal Age at Death. American Journal of Physical
Lovell, N. C. (1997). Trauma Analysis in Paleopathology. Yearbook of Physical Anthropology
40: 139-170.
Meindl, R. S., Lovejoy, C. O. (1985). Ectocranial Suture Closure: A Revised Method for the
Determination of Skeletal Age at Death Based on the Lateral-Anterior Sutures. American
Journal of Physical Anthropology 68: 57-66.
Mensforth, R. P., Lovejoy, C.O., Lallo, J.W., Armelagos, G. J. (1978). The Role of
Constitutional Factors, Diet, and Infectious Disease in the Etiology of Porotic
Hyperostosis and Periosteal Reactions in Prehistoric Infants and Children. Medical
Outram, A. K. (1998). The Identification and Palaeoeconomic Context of Prehistoric Bone
Marrow and Grease Exploitation. PhD Thesis. Department of Archaeology, University of
Durham.
Outram, A. K., Knusel, C. J., Knight, S., Harding, A. F. (2005). Understanding complex
fragmented assemblages of human and animal remains: a fully integrated approach.
Journal of Archaeological Science 32, 1699-1710.
Phenice, T. W. (1969). A newly developed visual method of sexing the os pubis. American
Journal of Physical Anthropology 30 (2), 297-301.
Steckel, R. H., Larsen, C. S., Sciulli, P. W., Walker, P. L. (2011). Data Collection Codebook for
the Global History of Health Project. (http://gloval.sbs.ohio-
state.edu/new_docs/Codebook-01-24-11-em.pdf)
Stloukal, M., Hankov, H. (1978). Die Lnge der Lngsknochen altslawischer Bewlkerungen -
Unter besonderer Bercksichtigung von Wachstumsfragen (The length of long bones in
ancient Slavonic populations - With particular consideration to the question of growth).
Homo, 29, p. 53-69.
Stuart-Macadam, P. (1985). Porotic Hyperostosis: Representative of a Childhood Condition.
American Journal of Physical Anthropology 66, 391-398.
Todd, T. W. (1920). Age Changes in the Pubic Bone. I. The Male White Pubis. American
Journal of Physical Anthropology 3: 285-334.
Todd, T. W. (1921). Age Changes in the Pubic Bone. II. The Pubis of the Male Negro-White
Hybrid. III. The Pubis of the White Female. IV. The Pubis of the Female Negro-White
Hybrid. American Journal of Physical Anthropology 4: 1-70.
Ubelaker, D. H. (1989). Human skeletal remains: excavation, analysis, interpretation.
Taraxacum, Washington.
stndag, H. (2008). Schmorls Nodes in a Post-Medieval Skeletal Sample from
Klostermarienberg, Austria. International Journal of Osteoarchaeology 19, 695-710.
Villa, P., Mahieu, E. (1991). Breakage patterns of human long bones. Journal of Human
Evolution 21, 27-48.
Traum circular vindecat. Capidava.
Traum realizat perimortem. Capidava.

EDX pentru vertebra secionat aparinnd individului de la Ernei.
Trauma la nivelul vertebrei aparinnd individului de la Ernei.

Schem a reelei de colaborri i a procesului de lucru ideal n bioarheologie determinat
pe parcursul desfurrii proiectului.
b. Antropologie molecular:
i. Tumulul de la Mireasa i necropola medieval de la Capidava
(Epoca Bronzului, perioada medieval), rezultate finale - 2016
1. Rezumat
Efectuarea analizelor de genetica populaiilor i statistic comparativ (PCA, Pairwise
population differentiation values (FST), Hierarchical agglomerative clustering) pe
baza rezultatelor moleculare privind populaia medieval de la Capidava obinute n anul
anterior (inclusiv datele NGS, obinute n Laboratorul de Antropologie Molecular din
Florena), n vederea evalurii relaiilor genetice dintre populaii ce dateaz din aceeai
perioad istoric.
Obinerea informaiei genetice de la nivelul regiunii de control a genomului mitocondrial
pentru un grup de 9 indivizi ce dateaz din Epoca Bronzului, descoperii n tumulul T-38
de la Mireasa (sit localizat n apropierea Capidavei). Aceste date permit evaluarea
variaiei genetice a populaiilor umane n timp, n spaiul din sud-estul Romniei
furniznd explicaii suplimentare cu privire la modul de formare a diversitii genetice
actuale. Epoca Bronzului este o perioad istoric dinamic, de mare interes pentru lumea
bioarheologiei (dar nu numai), iar contextul istoric i arheologic al populaiei analizate
ridic ipoteze interesante, dei recuperarea secvenelor autentice de ADN din probe att
de vechi reprezint o provocare din punct de vedere metodologic.
Procesarea unui numr de 11 probe de provenien arheologic n timpul stagiului de
cercetare efectuat n Laboratorul de Antropologie Molecular (Florena: 1.10.2016 -
25.11 2016). Acestea includ 6 probe ce au fost descoperite n timpul spturii arheologice
de la Capidava, campania 2015, care sunt de mare interes, avnd n vedere c indivizii au
fost descoperii ntr-o groap comun i prezint diferite tipuri de traume, un tipar diferit
fa de cel reflectat de indivizii deja analizai. Alte 2 probe provin de la 2 indivizii din
populaia de la Mireasa ce au fost deja analizai n laboratorul de ADN vechi din cadrul
Institutului de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine (Cluj-Napoca). Re-analiza
lor este necesar pentru a confirma autenticitatea rezultatelor. Restul indivizilor dateaz
din sec. XI-XII AD. i prezint un interes deosebit prin prisma contextului istoric i
arheologic.
Rezultatele obinute au fost diseminate prin participarea i susinerea cte unei prezentri
orale la dou conferine internaionale.
2. Stadiul actual al cunoaterii in domeniu

Peisajul genetic al populaiei moderne este rezultatul interaciunilor complexe dintre fonduri
locale cu dimensiuni i distribuie spaial variabil i cele din exterior care se datoreaz, n
principal, micrilor populaionale. Indicii cruciale pentru desluirea modului n care acestea au
dus la diversitatea genetic n populaia contemporan se pot obine prin completarea axei
temporale i spaiale cu ct mai multe informaii stocate n ADN-ul specimenelor de provenien
arheologic, o dovad direct a trecutului istoric.
Epoca Bronzului (3000-1000 .e.n.) este o perioad istoric dinamic, caracterizat de
evenimente demografice majore, precum i de schimbri culturale i sociale care au avut o
influen semnificativ asupra fondului genetic european contemporan. De-a lungul timpului a
fost intens dezbtut de ctre arheologi dac schimbrile remarcate pe parcursul Epocii Bronzului
au fost determinate de migraia populaiilor umane sau de difuzia ideilor ntre grupuri adiacente.
Studii recente de ADN vechi aduc primele indicii ce privesc legtura dintre schimbrile
culturale, mobilitate i tipare lingvistice (Allentoft i colab., 2015; Haak i colab., 2015;
Mathieson i colab., 2015). Acestea pun n lumin faptul c dispersia major a tehnologiilor i a
materialului genetic se datoreaz expansiunii umane atribuite culturii Yamnaya, care n Epoca
Bronzului Timpuriu se regsea n stepa Pontico-Caspic. Pe lng ruta de migraie estic, nspre
centrul Asiei, dovezile genetice indic un vestic, nspre centrul i nordul Europei, unde ia
natere cultura Corded Ware, ca rezultat al amestecului cu populaia local neolitic (Allentoft
i colab., 2015). Aceste micri populaionale sunt n coresponden cu ipoteza legat de
expansiunea limbii Indo-Europene (Haak i colab., 2015). Cu toate acestea, relaiile observate
rmn de demonstrat pentru fiecare caz n parte, iar prin analiza molecular a probelor din alte
regiuni geografice sau intervale istorice mai recente se pot aduce informaii suplimentare care s
contribuie la conturarea tiparului ce a determinat diversitatea genetic actual n Europa.
Dac prin intermediul datelor genetice asociate Epocii Brozului este conturat o imagine
global, dar cu rezoluie nu foarte bun, situaia pentru Evul Mediu este diferit. Cercetrile
paleogenetice ce reflect aceast perioad istoric sunt restrnse la cteva zone geografice
dispersate pe teritoriul European printre care Italia, Ungaria, Norvegia, Polonia (Alt i colab.,
2015; Vai i colab., 2015; Krzewiska i colab., 2015; Juras i colab., 2014). Pn n prezent,
sud-estul Europei este reprezentat doar prin analiza molecular a unor populaii proto-bulgare
(Nesheva i colab., 2015).
Datele genetice revelate de cele dou grupuri analizate aduc dovezi noi, dintr-o regiune
geografic care nu este reprezentat n literatura de specialitate. n acelai timp, pe baza lor se
poate verifica dac relaiile observate pn n prezent se confirm i n aceste cazuri particulare
sau dac ele reprezint excepii. Studiile de genetica populaiilor istorice din sud-estul Europei
sunt de o importan deosebit, mai ales din pricina faptului c n acest areal, n diferite perioade
istorice, au existat indivizi provenind din amestecuri populaionale i cu variate origini etnice,
fiind greu de distins doar pe baza nregistrrilor arheologice.
3. Activiti i metode de cercetare

Acizii nucleici din probele istorice sunt adesea slab conservai i n diverse stadii de
degradare, n funcie de vechime i de condiiile de mediu, astfel nct recuperarea acestora n
cantiti suficiente pentru analizele ulterioare este un punct crucial. Optimizarea protocolui de
extracie a ADN-ului vechi a fost realizat prin modificarea compoziiei tamponului de legare
(binding buffer), creterea volumului su n raport cu cel al tamponului de extracie i
scurtarea timpului pentru digestia pulberii osoase (Dabney i colab., 2013). Acest lucru a permis
analizarea variaiei genetice de la nivelul celor dou regiuni hipervariabile ale genomului
mitocondrial pentru populaia de Epoca Bronzului de la Mireasa (Dobrogea). Secvenele de
interes au fost obinute prin amplificarea a 8 fragmente scurte (150 pb), clonarea i
secvenializarea lor (Gabriel i colab., 2001). Polimorfismul genetic a fost determinat prin
alinierea secvenelor n BioEdit i ncadrat n haplogroup cu ajutorul aplicaiei online
HaploGrep2 (Weissensteiner i colab., 2016; van Oven M., 2015).
Procesarea probelor n laboratorul din Florena a presupus extracia moleculelor de ADN
vechi, urmat de construirea bibliotecilor de ADN, etap pe care o presupune protocolul de
secvenializare pentru platforma Illumina (MiSeq) (Kircher i colab., 2010). Selectarea
fragmentelor de interes (genomul mitocondrial uman) din amestecul ADN existent n bibliotecile
obinute s-a realizat prin capturare (target capture) (Maricic i colab., 2010), acestea fiind apoi
amplificate prin PCR pentru a obine cantitatea necesar pentru secvenializare. Rezulatele
secvenializrii vor fi obinute la nceputul anului 2017.
Secvenele de ADN vechi asociate celor dou populaii (Mireasa, Capidava) au fost
comparate cu cte un set de peste 300, respectiv 500 de secvene mitocondriale aparinnd unor
populaii euro-asiatice ce dateaz din aceleai intervale istorice (Epoca Bronzului, respectiv Evul
Mediu), colectate din literatur. n cazul populaiei de la Mireasa a fost efectuat analiza PCA,
folosind XLSTAT, pe baza frecvenelor haplogrupurilor mitocondriale identificate n 19
populaii (Fig. 2). Variaia genetic a populaiei de la Capidava a fost comparat cu cea
identificat n alte 14 populaii medievale, analiza PCA fiind efectuat cu ajutorul funciei
prcomp pentru date categorice, implementat n R 3.3.2 (R Core Team, 2014). Rezultatul a fost
vizualizat ntr-un spaiu bi-dimensional pe baza primelor dou componente principale (PC) (Fig.
3). Pe lng PCA, n cazul acestei populaii, a fost realizat i clustering-ul ierarhic, utiliznd
algoritmul Ward i metoda euclidean de msurare a distanei (Ward type algorithm and
Euclidean measurement method) (Ward, 1963). Pentru clustering au fost utilizate toate
componenetele principale (PC), iar rezultatul a fost vizualizat ca dendrogram prin intermediul R
3.3.2. Semnificaia clusterului a fost evaluat printr-un bootstrap de 10000, folosind funcia
pvclust n R 3.3.2, iar semnificaia fiecrui cluster este dat de valoarea AU (approximately
unbiased), exprimat ca procent (Fig. 4).
Comparaia ntre cele 15 populaii medievale a fost realizat, folosind Arlequin versiunea
3.5.2.2 (Excoffier i colab., 2010). Valorile de difereniere populaional (FST) au fost calculate
pe baza secvenelor HVR-I (poziiile nucleoditice 1605016383), considernd modelul de
substituie Tamura & Nei (Tamura i Nei., 1993) cu o valoare gamma de 0,26. Variaiile
semnificative ale valorilor FST au fost testate prin 10000 de permutri ntre cele 15 populaii
medievale incluse n analiz, iar matricea valorilor FST ce a rezultat a fost vizualizat cu ajutorul
R 3.3.2 (Fig. 5).
4. Rezultate
Tumulul de Epoca Bronzului de la Miresa se remarc printr-un context arheologic deosebit,
cu unele trsturi caracteristice culturii Yamnaya. Cei 9 indivizi analizai din acest populaie
sunt ncadrai pe baza polimorfismului genetic din regiunea de control n 5 haplogrupuri
distincte, 4 din ele europene, iar unul (D) asiatic. Interesant este faptul c linia matern asiatic
este asociat individului care prezint un ritual de nmormntare mai aparte (mormnt cu brne
de lemn), spre deosebire de ceilali membrii ai comunitii (Fig. 1). Prin comparaia frecvenelor
haplogrupurilor mitocondriale determinate n populaia analizat cu cele ale altor 18 populaii
euroasiatice din acelai interval istoric, Mireasa este plasat n proximitatea a dou grupuri
asociate culturii Yamnaya din stepa Pontico-Caspic. Dei geografic Mireasa este localizat mai
aproape de grupul Yamnaya_eEU, distana genetic este mai mare dect n cazul Mireasa-
Yamnaya_Samara/Kalmykia, aa cum rezult din analiza PCA (Fig. 2).
n cazul a 3 indivizi din cei 6 din necropola medieval de la Capidava care au fost re-
analizai prin NGS n laboratorul din Florena la finele anului 2015 am obinut rezultate pentru
ntreg genomul mitocondrial. n regiunea de control, fragment pentru care am obinut date prin
ambele tipuri de analiz, am observat acelai tipar genetic pentru fiecare dintre cei trei indivizi,
fapt ce confirm autenticitatea rezultatelor iniiale, obinute n laboratorul de ADN vechi din
Cluj-Napoca. n acelai timp, mutaiile identificate la nivelul ntregului genom mitocondrial
rafineaz ncadrarea n haplogrup, dar fr a schimba interpretrile preliminare.
Analiza molecular a celor 11 indivizi din necropola de secol X AD. de la Capidava,
datare confirmat prin analize de radiocarbon, dezvluie existena unei diversiti genetice
ridicate n aceast populaie avnd n vedere prezena a 9 haplotipuri mitocondriale. Majoritatea
liniilor materne sunt europene cu o singur excepie, N9 care este specific sudului Asiei. n
plus, variaia genetic n populaia analizat este mai apropiat de cea existent n populaia
Bizantin n comparaie cu cea reflectat n alte populaii de aceeai perioad din diverse areale
ale Europei, fapt ce reiese din analiza PCA (Fig. 3). Existena unei relaii genetice strnse ntre
aceste grupuri populaionale nu este att de surprinztoare dac este luat n calcul i contextul
istoric i cel arheologic al populaiei analizate. Contextul istoric ce privete Dobrogea secolelor
X-XI AD. este unul controversat, datorit faptului c aceast regiune este centrul conflictelor
dintre Imperiul Bizantin, Rusia Kievean i Bulgari. Inelul cu pentagram descoperit la unul din
indivizii de la Capidava este considerat ca fiind reprezentativ pentru cultura bizantin a secolelor
X-XI AD. Dei simbolul pentagramei i are originile n civilizaiile strvechi, acesta este ntlnit
i n simbolistica cretin, unde semnific cele cinci rni ale mntuitorului. De asemenea,
simbolul pentagramei este asociat cu micarea religioas, cunoscut sub numele de bogomilism,
ce apare n Bulgaria n secolul X AD (Pinter i colab., 2011). Interesant este legtura nu foarte
strns a populaiei de la Capidava cu cea proto-bulgar, cel mai probail nefiind surprins
datorit numrului mic de probe analizate n ambele cazuri.
Populaiile medievale i Vikingii din nordul Europei sunt grupate mpreun, n direcia
primelor dou componente PC1 i PC2 (variaie 33,9%). Populaiile medievale din sudul Europei
sunt, de asemenea, apropiat grupate, cea mai ndeprtat populaie de-a lungul componentei PC1
fiind cea a Cumanilor din Ungaria. Clusteringul ierarhic reflect o diagram similar cu cea a
PCA-ului, cu excepia faptului c populaia medieval din Polonia este grupat cu cea Bizantin
i cu cea de la Capidava, explicaia fiind faptul c n aceast analiz a fost luat n calcul
interaciunea dintre toate componentele principale (PC) (Fig. 4). Din calculul distanei genetice
ntre cele 15 populaii medievale reiese faptul c cea de la Capidava n raport cu restul, este
semnificativ diferit (p<0,05) doar fa de populaia medieval din Italia.
Pe lng determinarea compoziiei genetice pe baza liniilor materne n cele dou populaii
antice de pe teritoriul actual al Romniei i caracterizarea relaiilor lor cu alte populaii ce
dateaz din aceleai intervale istorice este necesar o comparaie i cu populaia modern, iar
ulterior rezultatele i interpretrile vor putea fi valorificate sub forma unui articol cotat ISI.
5. Diseminarea rezultatelor
1. Lista de comunicri la conferine i a lucrrilor publicate
Rusu. I., Methods for mitochondrial DNA typing in ancient human populations,
International Symposium Young Researchers in BioSciences, Cluj-Napoca, July 25-31,
2016.
Rusu, I., Radu, C., Dobrinescu, C., Bodolic, V., Kelemen, B., The story told by Mireasa
(Constana) Bronze Age barrow interdisciplinary approach, 22 nd Annual Meeting of the
EAA, Vilnius, 31st August 4th September, 2016
2. Stagii internaionale de cercetare

01.10.16 25.11.16: Stagiu internaional de cercetare n Laboratorul de Antropologie
Molecular, din cadrul departamentului de Biologie al Universitii din Florena (Italia),
sub ndrumarea prof. David Carameli
6. Ilustraii
Fig. 1 Distribuia mormintelor n tumulul T-38 Mireasa, caracteristicile arheologice i

haplogrupurile mitocondriale pentru indivizii analizai.
Fig. 2 Rezultatele analizelor genetice ale populaiei de Epoca Bronzului de la Mireasa; A: PCA
efectuat pe baza frecvenei haplogrupurilor mitocondriale a 19 populaii de EB; B: Frecvena
haplogrupurilor mitocondriale n populaia de la Mireasa.
Fig. 3 Analiza PCA efectuat pe baza frecvenei haplogrupurilor mitocondriale a 15 populaii
medievale.
Fig 4. Clustering ierarhic al variaiilor genetice n cele 15 populaii medievale.

Fig. 5 Matricea valorilor de difereniere populaional (FST) ntre 15 populaii medievale.
ii. Tartru dentar (perioada medieval) - 2016
Tartrul, asociat rmielor arheologice, reprezint de fapt placa bacterian calcifiat,

avnd capacitatea de a conserva pe perioade ndelungate microorganisme prezente la un moment
dat n cavitatea bucal a unui individ. Pe lng comunitatea microbian n sine, pot fi nglobate
n tartru celule de origine animal sau vegetal care au constituit la un moment dat sursa de hran
a acestuia.
Pentru domeniul arheologiei i antropologiei, analiza tartrului dentar poate oferi o serie
de informaii legate de modul de via al indivizilor, dieta i starea de sntate. Totodat diferite
comuniti microbiene caracteristice microbiomului oral cuprind n structura lor pe lng speciile
comune i semnturi unice, putnd fi astfel urmrite n spaiu i timp n populaiile umane.
Microorganismele orale se transmit orizontal ntre membrii familiei, devenind poteniale surse n
determinarea structurii populaionale i a rspndirii potenialelor boli.
Probe
C58_2, C111, C132 din necropola medieval timpurie de la Capidava, jud.
Constana (sec X).
M14 din necropola premodern de la Clineti, jud. Prahova (sec XVI-XIX).
Fig 1. Probe de tartru (marcate prin sgei): A. C58_2, B. C111, C132, D. M14.
A.
C. B.
D.
Tabel 1. Rezultatele analizei antopologice pentru indivizii C58_2, C111, C132 i M14.
Rezultatele analizei antrolpogice ofer detalii legate de severitatea afeciunilor dentare
ale indivizilor. Numrul dinilor cariai este mic, iar scorurile atribuite tartrului dentar,
peridontitei i hipoplaziei relev schimbri patologice uoare i moderate (Buikstra i
Ubelaker., 1994).
Prob Vrst Sex Analiza antropologic
Dini permaneni Carii dentare Tartru dentar Periodontit Hipoplazie
Mandibul Maxilar Mandibul Maxilar Mandibul Maxilar
C58_2 24-34 M 30 0 3 2 3 2 1 1
C111 20-34 F 27 1 3 2 1 3 2 1
C132 26-34 M 24 1 2 3 2 2 1 1
M14 26-34 20 2 3 3 2 2 1 1
SEM
A.
B.
C.
Fig 2. Imaginile de microscopie electronic de baleiaj. A. Celule filamentoase de

fungi/bacterii din proba de tartru a individului C58_2. B. Potenial fibr vegetal din
proba de tartru a individului C58_2. C. Potenial celul bacterian din prob de tartru a
individului C111.
Analiza molecular
Extracie ADN
Protocolul de extracie utilizat pentru recuperarea moleculelor de ADN din probele de

tartru este o adptare a celui propus de Dabney i colab., 2013. Cantitatea de ADN vechi extras
din tartru este mare, (Warinner, Speller, and Collins 2015), la fel ca i riscul de contaminare.
Bacteriile i fungii sunt organisme ubiquitare, speciile moderne venind n contact cu probele
arheologice nc din solul n care se pstreaz. Analizele moleculare au fost efectuate ntr-un
laborator conceput pentru studiul ADN-ului vechi (localizat la Institutul de Cercetri n Bio-
Nano-tiine din Cluj-Napoca).
qPCR
Pentru cuantificarea moleculelor de fungi, bacterii i plante au fost folosite amorsele

BITS i B58S3, V6_926F i V6_1046R, respectiv Z1aF i 19bR menionate n Tabelul 2. Pentru
curba standard s-a folosit un plasmid pJET1.2 coninnd fragmentul de interes care a fost
secvenializat n prealabil. Amplificrile au avut loc n Rotor-Gene Q (QIAGEN, Hilden,
Germany) utiliznd SensiFAST TM SYBR No-ROX Kit (Bioline). Reaciile s-au desfurat ntr-
un volum final de 20 l, coninnd SensiFAST SYBR No-ROX Mix 1, 0,5 mM din fiecare
amors, 1,5 l ADN i 6,5 l H2O. A fost utilizat un program de PCR n trei pai: 95-3 (95-
10, 56-15, 72-15) 40. Au fost utilizate triplicate pentru fiecare prob ct i controale
negative.
Tabel 2. Amorsele utilizate n reciile de amplificare

Gena
Nume amors Seceven amors (5'-3') intit
V1F AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 16S rRNA

V1 120R TTACTCACCCGTICGCCRCT 16S rRNA
V6 926F AAACTYAAAKGAATTGACGGG 16S rRNA
V6 1046R CGACARCCATGCASCACCT 16S rRNA
A49325 CGA AAT CGG TAG ACG CTA CG trnL
B49466 CCA TTG AGT CTC TGC ACC TAT C trnL
Z1aF ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC rbcL
19bR CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG rbcL
BITS ACC TGC GGA RGG ATC A SSU
B58S3 GAG ATC CRT TGY TRA AAG TT SSU
Fig 3. Rezulatate qPCR pentru indivizii C58_2, C111, C132. Cuantificarea absolut a
numrurlui de copii de gene pentru 16S ribozomal pentru estimarea numrului de celule
bacteriene, a numrului de copii de gene pentru subunitatea mare a RuBisCO pentru
estimarea numrului de celule de plante i a numrului de copii de gene pentru SSU
pentru estimarea numrului de celule fungice. Valorile au fost raportate la 1 mg de prob.
PCR
Pentru fiecare set de amorse, amplificarea s-a realizat ntr-un volum final de 25 l,
amestecurile coninnd urmtoarele componente: 1 MangoTaq Colored Reaction Buffer
(Bioline), 2,5 mM MgCl2 (Bioline), 0,2 mM dNTP (Bioline), 0,5 mM din fiecare amors
(Macrogen Sequencing Service, Korea), 1,25 U MangoTaq (Bioline) i 2 l ADN. Pentru fiecare
set de amorse a fost introdus un control negativ.Pentru amplificare au fost folosite urmtoarele
variaii termice pe parcursul a 35 de cicluri: 95C pentru 5 min, 95C pentru 30 sec, 56C pentru
30 sec i 72C pentru 30 sec, 72C pentru 5min, 4C. Reacia de amplificare a generat
fragmente de ADN de dimensiuni ateptate care au fost clonate i ulterior trimise la secvenat
(Macrogen Sequencing Service, Korea). Au fost analizate cte 16 clone pentru fiecare din
markerii moleculari utilizai.
Fig 4. Abundena relativ a genurilor dominante de bacterii din probele de tartru analizate. Au
fost identificate 22 de genuri de bacterii frecvent corelate n literatur cu microbiomul uman oral.
Cea mai mare variabilitate a fost ntlnit n cadrul pobei C 58_2 de la Capidava, iar cea mai
sczut n cadrul probei de la Clineti. O serie de genuri precum: Actinomyces, Streptococcus,
Eubacterium au fost asociai cu periodontita, putnd fi astfel explicate scorurile artibuite n urma
analizei antropologice.
Fig 5. Heatmap realizat pe baza indicelui de similaritate Bray-Curtis obinut pe baza

abundenei relative a celor 22 de genuri identificate. Se observ o similaritate mai mare ntre
comunitile microbiene orale asociate indivizilor C58_2 i C132 spre deosebire de indivizii
C111i M14.
Fig 5. Comparaie ntre comunitile bacteriene orale identificate n cadrul necropolei de la
Capidava, respectiv Clineti i 3 necropole medievale localizate n vestul Europei (Yorkshire,
York, Northamptoshire). Filumuri comune comunitilor bacteriene orale ca: Actinobacteria,
Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Firmicutes, Synergistetes, Euryarchaeota, Chloroflexi,
Proteobacteria, Bacteroidetes au fost semnalate n toate necropolele menionate mai sus (Adler
i colab., 2013). Filumurile prezente sunt comparabile cu cele ntlnite la populaia modern,
fiind cantitativ mai puin reprezentate cele potenial cariogene (Proteobacteria, Acidobacteria)
care ncep sa predomine n microbiomul oral uman dup revoluia industrial.
Fig 6. Comparaie ntre comunitile fungice identificate n cadrul probelor de tartru asociate
indivizilor necropolei de la Capidava, respectiv Clineti. Pentru Capidava, au fost amplificate
cu success fragmente doar pentru individul C58_2, dei un numr similar de celule fungice
disponibile reaciei de amplificare au fost semnalate i pentru ceilali indivizi ai necropolei n
urma qPCR-ului. Spre deosebire de speciile de bacterii, fungii identificai au provenit n
exclusivitate din sol, fiind specii implicate n descompunerea resturilor de natur celulozic
prezente n sol: Spizellomyces punctatus, Genistelloides hibernus, Clavochytridium
emersonii, Beauveria bassiana. Prezena exclusiv a speciilor din sol poate fi explicat, fie prin
numrul mic de secvene analizate, fie prin lipsa patogenilor de natur fungic n microbioamele
orale studiate.
Fig 7. Comparaie ntre speciile de plante identificate n probele de tartru ale indivizilor de la
Capidava. Pentru individul C132 specia Poa bulbosa, ubicvitar n flora actual a Dobrogei, este
cel mai probabil contaminant, nefiind nici o specie comestibil. Pe de alt parte, Agriophyllum
squarrosum este o specie care nu se gsete n flora actual a Drobogei. Specia este caracteristic
dunelor de nisip din centrul Asiei, fiind cunoscut sub denumirea de orez de nisip. Seminele se
consum avnd valori nutriionale ridicate 23 % proteine, 9 % lipide, 45 % carbohidrai.
Prezena ei ca surs de hran pentru necropola medieval timpurie de la Capidava, fiind
pluzibil. Cannabis sativa este o specie cu o utilizare vast de-a lungul timpului, fibrele sau
seminele fiind ntrebuinate n scop recreaional sau medicinal.
iii. Diagnostic molecular malaria (perioada premodern) - 2016
Proteine pentru teste de malarie
Protocolul de extracie a proteinei totale din pulp dentar se bazeaz o variant

modificat a unui protocol descris de Tran i colab. (2011).
Pulberea obinut prin burghierea pulpei dentare a fost decalcifiat peste noapte ntr-o
soluie de 0,5 M EDTA, pH 8, cu agitare permanent. Probele au fost apoi sonicate pentru a
facilita desprinderea proteinelor de hidroxilapatit. Dup sonicare, probele au fost centrifugate
timp de 20 min la 12000 g. Supernatantul a fost filtrat folosind filtre Centricon 30K conform
instruciunilor de utilizare. Filtrul Centricon a fost splat de 3 ori cu TBS (50 mMTrisHcl, 150
mM NaCl, pH 8), i o dat cu ap ultrapur. 50-100 l soluie proteic recuperat din filtru
Centricon s-au diluat pn la un volum final de 500 l. Pentru precipitarea proteinelor din
aceast soluie s-a folosit TCA (acid tricloracetic) n concentraie final de 20%. Pelletul obinut
dup precipitare a fost splat cu aceton i resuspendat n 100 l TBS. Concentraia proteinelor
obinute a fost determinat prin msurarea spectrofotometric a absorbanei de 280 nm.
Proteinele obinute au fost folosite pentru diagnosticul rapid al malariei cu ajutorul
testelor SeeNow Malaria Casette (CampMedica).
Au fost aplicate aceste teste pentru 23 de indivizi din necropola pre-modern de la

Mireasa, jud. Constana. Pentru fiecare individ au fost fcute minim 3 repetiii ale testului rapid.
Mormintele din care provin probele folosite au fost alese aleatoriu, de pe toat suprafaa
necropolei. Poziiile acestor sunt marcate pe planul general.
Plan general T38.
Pentru 10 (M40, M47, M54, M62, M69, M72, M88, M95, M96, M144) din cei 23 de
indivizi au fost obinute teste pozitive pentru Plasmodium falciparum. Pentru restul de 13
indivizi (M43, M44, M49, M56, M71, M77, M92, M97, M112, M118, M131, M134, M152) au
fost obinute rezultate negative la toate repetrile testelor rapide.
Exemplu: Mireasa M88, pozitiv
Din cei 23 de indivizi studiai 6 sunt pre-aduli (M44 -, M62 +, M77 -, M118 -, M134 - i
M144 +), restul de 17 sunt aduli (M40 +, M43 -, M47 +, M49 -, M54 +, M56 -, M69 +, M71 -,
M72 +, M88 +, M92 -, M95 +, M96 +, M97 -, M112 -, M131 -, M152 -). Nu se observ un
pattern al rezultatelor pozitive care s fie corelat cu vrsta la momentul morii.
ADN - Confirmarea diagnosticului
Pentru confirmarea diagnosticului stabilit cu ajutorul testelor rapide ne-am propus

amplificarea unui fragment de 196pb din gena AMA1 (Apical Membrane Antigen 1) specific
genului Plasmodium. Aceast abordare a mai fost folosit cu succes i este descris de Hawass i
colab. (2010) i Lalremruata i colab. (2013).
ADN a fost obinut din pulpa dentar folosind protocolul descris de Dabney i colab.
(2013) pentru 12 indivizi din necropola Mireasa pentru care au fost fcute i teste de diagnostic
rapid: M40, M42, M44, M47, M49, M54, M69, M71, M77, M88, M112, M118.
Am obinut amplificarea unor fragmente de dimensiuni ateptate pentru 4 din acetii
indivizi (M40, M43, M47 i M69). Produii de PCR obinui au fost clonai i secvenializai
(Macrogen). Secvenele obinute indic o contaminare cu microorganisme din sol.
Hemozoin
Hemozoina este produs de organismele din genul Plasmodium pentru a evita efectele
toxice ale hemului provenit din digestia hemoglobinei. Natura insolubil a acestui compus i
proprietile sale specifice sugereaz c acest marker ar putea fi folosit i pentru diagnosticul
malariei n context arheologic. Depunerile de hemozoin din cavitatea mduvei osoase ale
oaselor lungi poate fi un criteriu suplimentar de diagnostic al malariei n cazul rmielor umane
scheletizate.
Am folosit microscopia electronic SEM pentru a detecta i vizualiza cristalele de
hemozoin din interiorul cavitii mduvei osoase pentru indivizii M40 i M43. Compoziia
cristalelor a fost studiat prin EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy).
M40- Cristal de hemozoin, SEM (stnga), harta Fe n EDX (dreapta).
Avnd n vedere faptul c hemozoina conine exclusiv hem, elementul distinctiv care
permite identificarea cristalelor de hemozoin este fierul. Se poate observa n imaginile obinute
c distribuia fierului corespunde poziiei cristalului.
Dabney, J., Knapp, M., Glocke, I., Gansauge, M.-T., Weihmann, A., Nickel, B., Valdiosera, C.,
Garcia, N., Paabo, S., Arsuaga, J.L., Meyer, M. (2013). Complete mitochondrial genome
sequence of a Middle Pleistocene cave bear reconstructed from ultrashort DNA
fragments. Proceedings of the National Academy of Sciences, 110(39), 1575815763.
doi:10.1073/pnas.1314445110
Hawass, Z., Gad, Y., Ismail, S., Khairat, R., Fathalla, D., Hasan, N., Ahmed, A., Elleithy, H.,
Ball, M., Gaballah, F., Wasef, S., Fatewen, M., Amer, H., Gostner, P., Selim, A., Zink ,
A., Pusch, C. M. (2010). Ancestry and Pathology in King Tutankhamuns Family. JAMA,
303(7), 638647.
Lalremruata, A., Ball, M., Bianucci, R., Welte, B., Nerlich, A. G., Kun, J. F. J., & Pusch, C. M.
(2013). Molecular Identification of Falciparum Malaria and Human Tuberculosis Co-
Infections in Mummies from the Fayum Depression (Lower Egypt). PLoS ONE, 8(4), 9
12. doi:10.1371/journal.pone.0060307
Bioarheologie: identificarea unor resturi arheologice vegetale (cereale)
Resturi vegetale (cereale) carbonizate
Resturile vegetale descoperite n siturile arheologice prezint o importan crescut

pentru comunitatea arheologic oferind informaii legate de sursele de hran i tipul de
agricultur practicat. De cele mai multe ori, resturile vegetale sufer un proces de combustie,
fiind n mare parte carbonizate. Fiind carbonizate, nu pot servi ca o bun surs de ADN,
ncercrile de identificare a speciilor bazndu-se de cele mai multe ori pe criterii morfologice i
nu moleculare. Pentru ca resturile vegetale s i pstreze forma, temperatura de combustie
trebuie s fie relativ joas. Arderea impiedic procesul de degradare stopnd accesul
microorganismelor la sursa de substan organic
Probe
Resturi vegetale carbonizate asociate unei amfore de tip Carthage LR II pastrat
fragmentar n situl arheologic de la Capidava.
Fig 1. Planul general al cetii Capidava. Localizarea amforei de tip Carthage LR II cu resturi
vegetale carbonizate n sectorul C12, marcat cu rou.
Fig 2. Amfor de tip tip Carthage LR II, utilizat cu precdere pentru transportul vinului, ns o
ntrebuinare multipl nu poate fi exclus.
Fig 3. Resturi vegetale carbonizate.

A. B.
Fig 4. Resturi vegetale carbonizate. Cariopsele analizate au fost mprite n dou categorii,
redate prin imaginile A. i B. pe baza caracteristicilor morfologice. Cu 1 au fost notate cariopsele
asemntoare celei din imaginea B., iar cu 2 cele asemntoare celei din imaginea A.
Analiza molecular
Extracie ADN
Pentru extracia de ADN s-au utilizat cte 6 cariopse din fiecare categorie mai sus
menionat i kitul Animal and Fungi DNA Preparation Kit (Jena Bioscience), n conformitate
cu indicaiile productorului.
PCR
Utiliznd amorsele Uni-MinibarF1 i Uni-MinibarR1 au fost identificate trei genuri de
bacterii: Rothia, Olsenella i Lachnobacterium. Genurile menionate nu sunt frecvente n sol, dar
sunt asociate cu procese fermentative, putnd determina procesul de combustie care s determine
carbonizarea resturilor de cereale analizate.
Tabel 1. Amorse utilizate n reacia de amplificare

Gena
Nume amors Seceven amors (5'-3') intit
Uni-MinibarF1 TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC COI

Uni-MinibarR1 GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC COI
Z1aF ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC rbcL
19bR CTTCTTCAGGTGGAACTCCAG rbcL
Fig 5. Secvene obinute pentru cariopsele notate cu 2, utiliznd amorsele Z1aF i 19bR.
Utiliznd secvenele obinute pentru interogarea bazelor de date de nucleotide din cadrul
serviciului BLAST-NCBI s-a obinut ncadrarea lor n tribul Triticeae.
c. Analize conexe
Procese diagenetice
termen utilizat iniial n geologie
W. von Gmbel, Geologie von Bayern, 2 vol., 1884-1894.
J. Walther, Eileitung in die Geologic als historische Wissenschaft, 1893-1894.
preluat n paleontologie, antropologie i arheologie
Doar ntr-o singur baz de date (http://www.sciencedirect.com) peste 1200 de lucrri
ce analizeaz probe arheologice, aprute n ultimii 10 ani
Atacul microbial
Scderea cantitii de collagen
Creterea gradului de cristalinitate
Pierderea de mas i creterea porozitii
Absorbia srurilor (UO2 2+, Sr2+)
Procesele diagenetice i condiii de mediu

Condiiile climatice
Hidrologia
Compoziia geochimic Ca10(PO4)6(OH)2
Determinarea compoziiei chimice
Analiza compoziiei mineralogice
Investigarea transformrilor structurale
Fig. 1. Localizarea siturilor din care au fost prelevate i analizate fizic probe
osteoarheologice umane.
Tab. 1 Detalii despre probele osteoarheologice umane investigate prin metode fizice
Fig. 2 Rezultatele analizei elementale de suprafa pentru probele

osteoarheologice umane de la Vorniceni (S22)
osteoarheologice umane de la Isaiia (M8, M13, M15, M18) i Vorniceni (M1S)

osteoarheologice umane de la Capidava (M1, M3, M4)
Analizele fizice i chimice pot avea ca subiect att resturile organice, ct i inventarul
material. n cazul resturilor organice se pot stabili conexiuni cauzale ntre compoziia fizico-
chimic i analiza biologic/antropologic (conservare, cause ale degradrii, momentul de debut
al proceselor degradative: - perimortem, postmortem, n depozit etc.)
Pentru inventarul material (ceramic/ metal) pot fi investigate procesele de construcie,
sursele de material, gradul de conservare etc.
Fig. 5. Spectru obinut prin ATR-FTIR, reflectnd compoziia mineral a probelor analizate
(raport carbonai/fosfai) detalii despre starea tafonomic a osului, probe cu slab consevare a
componentei organice/proteice.
Fig. 6. Spectru obinut prin ATR-FTIR, reflectnd compoziia mineral a probelor

analizate (raport carbonai/fosfai) detalii despre starea tafonomic a osului (Capidava,
sec. 10, se observ prezena unui peak pentru amida I, indicator al bunei conservri a
fraciunii organice/proteice).
Fig. 7. Spectru obinut prin ATR-FTIR, reflectnd compoziia mineral a probelor analizate
(raport carbonai/fosfai) detalii despre starea tafonomic a osului, probe cu slab consevare a
componentei organice/proteice.
Fig. 8. Micrografii ale suprafeelor osoase necontaminate, care nu reflect aciune

microbian/fungic.
Fig. 9. Micrografii ale suprafeelor osoase contaminate, care reflect aciune
microbian/fungic.
Fig. 10. Micrografii ale suprafeelor ceramice, care reflect aciune microbian/fungic.
Procese diagenetice i reconstituiri istorice

Fraciunea minerala a fragmentelor osteologice conine pe lnga Ca, P, K, Na, Mg, C, O, H i o
serie de elemente urma ( F, Cu, Zn, Mn, I, Co, Mo, Se)
Reconstituirea paleodietei (d13C, d15N, d Sr87/Sr86)
Determinarea mobilitaii comunitailor umane (d87Sr/86Sr)

Analize de paleoclima (d18O, d13C)
Fig. 11. Limitele analizelor izotopice.
Fig. 12. nlocuirea nomenclaturii bazat pe ncadrri culturale, n nomenclatur zonal bazat pe
similariti la nivel fizic/chimic a materialului arheologic.
EvolutieGenetic:Dovezinoinstudiulunorstructuriinterconectate.Ocltoriebiomolecularnjurul
CarpailordinAntichitatepnnEvulMediu
Raporttiinific
Etapa2015

Cuprins
Rezumat
Raportareatemelordecercetarelaobiectiveleprevzutenetapa2015
o NecropolaCapidava
o Microbiota asociat resturilor umane arheologice consecine pentru depozitarea pe termen
lung
o Diagnosticulmalarieinpopulaiiistoriceabordareinterdisciplinar
o Alteinvestigaiideantropologiefizic
Concluzii
Rezumat
n condiiile njumtirii bugetului prevzut, pentru al doilea an succesiv, a fost decis
restrngereacercetrilordinacestanifocalizareaasupratemeloriloturilorcucelmaimarepotenial
pentru publicare. Temele selectate sunt: finalizarea analizelor de antropologie fizic i molecular
pentru necropola de la Capidava, jud. Constana; investigarea prin metode clasice i moleculare a
microbiotei asociate resturilor osteoarheologice: decelarea speciilor microbiene proprii individului de
cele din sol, investigarea contaminrilor microbiene n depozite i consecinele acestei contaminri
pentru depozitarea pe termen lung; utilizarea unei abordri interdisciplinare pentru diagnosticul
infecieicuPlasmodiumsp.npopulaiiistoricedinregiunicurisccrescutdemalarie.Aufostcontinuate
investigaiile de antropologie fizic finalizate cu raport, pentru diferite loturi, n vederea identificrii
unor cazuri cu potenial pentru aprofundarea cercetrilor. Au fost continuate documentrile n teren,
coleciimuzealeibiblioteci.
Temeleselectateconstituie,deasemenea,subiecteleunortezededoctorat.
A fost organizat la ClujNapoca, n perioada 2228 noiembrie 2015, workshopul
InterdisciplinaritateanarheologiecuinvitaidelaInstitutuldeArheologieVasilePrvanalAcademiei
Romne,MuzeuldeIstorieNaionaliArheologieConstana,MuzeulBrukenthalSibiuiUniversitatea
LucianBlagaSibiu.ncadrulacestuievenimentaufostprezentatelaboratoareledeantropologiefizici
molecular,aufostorganizatecursuriintroductivepracticedeantropologiefizicimoleculariaufost
organizatemeserotundenvedereaidentificriianoioportunitidecolaborareiformaredeechipe
interdisciplinare.

Raportareatemelordecercetarelaobiectiveleprevzute

Activitiprevzutepentruetapa2015:

1. Documentareischimburitiinifice/7.Studiidearhiv
Au fost efectuate vizite de documentare la diverse biblioteci i n colecii ale unor institute
internaionale de profil (istorie/arheologie). Dintre acestea amintim documentarea la Topkapi Seray,
Istanbul, Turcia, Biblioteca Secret a Vaticanului, Vatican, Biblioteca Naional a Austriei, Austria
coleciademanuscrisemedievalialtele.
2. Investigaiipaleoosteologice
Afostcontinuatanalizaunornoiloturiosteologicedupcumurmeaz:Clineti(jud.Prahova)n=188;
Capidavan=116(npregtirepentrupublicare);Ernein=1(cazspecial,npregtirepentrupublicare);
Ndlacn=19;Turdan=1;Trgorn=4;CriptafranciscanClujNapoca=nr.minimdeindivizi130.
3. ADNvechisecvenializareigenotipare
naceastetapaufostobinute,prelucrateiinterpretatenvedereapublicriipeste1000desecvene
ADN(720desecveneADNmitocondrialcaracteriznd15indivizidinnecropolaCapidavaicazulErnei;
300desecvenefolositepentrudeterminareaspeciilordebacteriiifungidinresturiosteologiceumane
de provenien arheologic, tartru i sol, n vederea caracterizrii microbiotei asociate acestui tip de
material i impactul asupra tafonomiei i depozitrii pe termen lung; 200 de secvenializri n scopul
identificriiprezeneivectoruluimalarieiPlasmodiumsp.).
4. Analizeizotopistabiliaicarbonului(C)iazotului(N)pentrucaracterizareadietei
Prinsondaj,aufostdatatecuradiocarboniaufostefectuateanalizedeizotopistabiliaiCiNpeprobe
aparinndtuturorloturilorinvestigatemolecularnaceastetap.
5. Analizecomplementare(SEM,spectroscopieIR)
Au fost efectuate analize de microscopie electronic pentru detecia fungilor din microbiota asociat
osului i pentru detecia cristalelor de hemozoin formate prin degradarea hemoglobinei de ctre
vectorul malariei. Tehnici de spectroscopie IR au fost utilizate pentru evaluarea tafonomiei oaselor
studiate.
6. Spturiarheologiceiprocesareainventaruluimaterial
Membrii echipelor partenere n proiect au participat pe antiere arheologice la Stoina, Bzdna i
Capidava.LaCapidava,datoritcondiiilorfortuitecreatederestaurareacetiiafostspatnecropola
medievaliaufostdescoperiteaproape200decomplexeconinndresturiumanearheologice.
NecropolaCapidava
Pentruprobeleumanearheologiceproveninddinaceastnecropol(campaniile2010,2013i
2014)aufostsecvenializateprinabordareclasic(extracieADN,amplificaresegmenteint,clonarei
secvenializare: 11 probe). n acest an a fost reluat secvenializarea prin tehnici de ultim generaie
(NextGenerationSequencingNGS)pentru6indivizicuscopuldeaverificadateleobinuteipregtirea
lorpentrupublicare.
Materialul genetic stocat n specimenele arheologice reprezint o dovad genetic direct

pentru un anumit moment din trecut i permite observarea evoluiei genetice n timp real, spre
deosebire de ADNul modern prin intermediul cruia se pot efectua doar inferene asupra
evenimenteloristorice,pebazatipareloractualededistribuieafrecvenelorgenice.Faptulcacesttip
de informaie poate fi accesat a deschis calea spre noi direcii de cercetare, iar metodele utilizate
pentruprocesareaprobeloraufostconstantmbuntite.Necesitateaoptimizriimetodelordeanaliz
utilizatenstudiiledepaleogeneticsedatoreazunorcaracteristicipecaremoleculeledeADNvechile
posed:nivelulslabdeconservareifragmentareasecvenelornucleotidicedincauzadegradriipost
mortem a acizilor nucleici (Pbo et al., 2004; Willerslev i Cooper, 2005). O alt provocare pentru
aceast arie de cercetare este recuperarea i procesarea moleculelor autentice, deoarece n probele
arheologice exist un amestec de ADN endogen i ADN ce provine din mediul nconjurtor. n plus,
contaminarea probelor cu ADN modern n timpul manipulrii poate afecta autenticitatea rezultatelor,
motivpentrucarenlaboratoareledeADNvechiselucreazncondiiidesterilitate,dupprotocoale
stricte(Pillietal.,2013;Poinar,2003;YangiWatt,2005).
Tehnica PCR sau reacia n lan a polimerazei permite generarea unui numr considerabil de
copii ale unui fragment de ADN. Dezvoltarea acesteia a avut consecine remarcabile n domeniul
bioarheologieimoleculare,deoarecepermiteanalizamarkerilorgeneticidinprobececoninunnumr
micdemoleculedeADN,cumsuntcelearheologice.Lascurttimpdupimplementareaacesteitehnici
nstudiiledeADNvechinumrulloracrescutapreciabil,iarfocusulfiindtotmaidiversificat.Origineai
evoluia speciilor, relaiile filogenetice, dinamica populaiilor sau rspndirea unor specii patogene n
rndul populaiilor antice sunt doar cteva dintre aspectele cheie vizate n domeniu (Hervella et al.,
2015; Nesheva et al., 2015; Noonan et al., 2005; Papagrigorakis et al., 2006). Aceast strategie de
amplificare a fragmentelor nucleotidice de interes este nc cea mai frecvent utilizat att pentru
secvenializarea clasic de tip Sanger, ct i pentru abordrile de tip NGS, dei situaia sar putea
schimbanviitorulapropiat(KnappiHofreiter,2010).
Dezvoltarea tehnologiilor de secvenializare, cunoscute sub numele de NGS, a avut un impact
revoluionar asupra majoritii ariilor de cercetare ale biologiei moleculare, dar nu toate au avut de
ctigat la fel de mult precum studiile de ADN vechi. Dac prin metoda clasic, cele mai accesibile
informaiierau,ngeneral,celedelanivelulunorsegmentealegenomuluimitocondrial,prinNGSsepot
obine date de la nivelul ntregului genom mitocondrial, dar i de la cel nuclear. n civa ani de la
inventareaNGSnumruldatelordesecvenedeADNvechiaucrescutexponenial,punndnlumintot
maimulteinformaiilegatedeorigineaievoluiaspeciilor.Astfel,afostposibilanalizageneticaunor
resturiosoaseextremdevechicarereprezintveriginevoluiaomuluicaspecieicareoferrspunsuri
pentruunuldincelemaiintrigantesubiectepentrucomunitateatiinific(Fuetal.,2015;Meyeretal.,
2014; Sawyer et al., 2015). Numrul tot mai mare de probe analizate n cadrul anumitor studii este
corelat i cu scderea dramatic a costurilorpentru secvenializare (Allentoftet al., 2015; Haak et al.,
2015). Cu toate acestea, costurile necesare pentru pregtirea probelor de ADN vechi pentru
secvenializaresuntncridicate,nefiindaccesibilepentrutoatelaboratoarelespecializatendomeniu.
Exist maimulteinstrumentedesecvenializaredisponibile,celemai comunepentruanalizaADNului
vechifiindRoche(454)GSFLXTitaniumiIllumina(Solexa)GenomeAnalyzerIie(Millaretal.,2008).Cu
ajutorul ambelor instrumente se realizeaz o secvenializare de tipul massively parallel sequencing,
diferena dintre cele dou fiind dat de lungimea fragmentelor ADN citite i de cantitatea de date
generatprintrosingurrulare(KnappiHofreiter,2010).Alegereaplatformeidesecvenializareeste
influenat,nprincipal,decalitateaADNuluifolositidescopulurmrit.
Studiudecaz:geneticapopulaiilormedievaledinsudestulRomniei
n scopul investigrii din punct de vedere genetic a populaiilor umane vechi ce au ocupat n
perioadamedievalteritoriuldinsudestulRomniei,Dobrogeadeazi,sauanalizatmaintirmiele
osoase descoperite n necropola de la Capidava. Aceast necropol dateaz din secolul al Xlea AD,
conform contextului arheologic, o perioad n care micrile populaionale n regiune au fost intense
(Pinteretal.,2011).Datelegeneticesuplimenteazinformaiaobinutdinsurseletradiionale(izvoare
istorice,arheologice)carepotfiadeseacontroversateipunnluminaspectelegatedeaportulgenetic
naceastzoniposibilaoriginebiogeograficapopulaiilor.Rezultatelemolecularepentruindiviziide
laCapidavaaufostobinuteprindouabordridistincte,efectuatenlaboratoarediferite.Mainti,sa
obinut tiparul genetic reflectat de analiza regiunii de control a genomului mitocondrial prin metoda
clasicdeanalizaADNuluivechi.Astfelaufostanalizaiunnumrtotalde11indivizinLaboratorulde
Bioarheologie molecular din cadrul ICIBNS, ClujNapoca. Dintre acetia, 6 indivizi au fost selectai
pentru a fi analizai n Laboratorul de Antropologie molecular i paleogenetic din Florena. Aceste
probeaufostprocesatepentruaobineinformaiageneticdelanivelulntreguluigenommitocondrial
prin secvenializare NGS i confirmarea autenticitii rezultatelor obinute anterior n Romnia. n
continuarevorfidescriseaspectelemetodologice,cuprecizareaavantajelorialimitrilor,urmriten
celedoumodurideabordare.

1. Metodaclasicdeanaliz
SursapentruextraciaADNuluiafostreprezentatdepiesedentare,bineconservate,frcarii
sau fisuri. Pentru decontaminare, dinii au fost, mai nti, splai cu soluie de clor 10%, apoi cu ap
steril,iarulteriorntreagasuprafaadinilorafostiradiatUV,timpde40deminute.ExtraciaADN
ului sa desfurat ntro ncpere steril, separat de cea n care se realizeaz amplificarea prin PCR.
Protocolul de extracie utilizat a fost descris de Yang i colaboratorii si n 1998, fiind adaptat la
condiiile din laboratorul nostru (Yang et al. 1998). Fiecare prob a fost reprezentat de 50 mg de
pulberedentarcareafostincubatla55oCtimpde60deoren1mldetampondeextracie(0,5M
EDTApH8.0;0,5%SDS;2mg/mlProteinazK),iarulteriorincubatla37oCtimpde4ore.IzolareaADN
ului sa efectuat cu ajutorul kitului QIAquick PCR purification kit (Qiagen), conform specificaiilor
productorului. La fiecare extracie au fost incluse controale negative pentru monitorizarea unei
eventuale contaminri a reactivilor. De asemenea, au fost considerate alte metode de precauie,
frecventutilizatencercetriledeADNvechi:sterilizareaUVaincintelordelucru,accesulcercettorilor
doarcuechipamentadecvat(combinezon,masc,mnuideunicfolosin)(Gilbertetal.2005;Pbo
etal.2004;YangiWatt,2005).
StrategiadeamplificareasecvenelorADNdeinteresafostbazatpeutilizareaunorseturide
amorse proiectate pentru amplificarea unor fragmente nucleotidice scurte, care tind s fie mai
numeroasechiarinprobelearheologicedegradate(Gabrieletal.,2001;Pboetal.,2004).nacest
mod, exist mai multe anse de a produce copii suficiente de secvene autentice. Pentru fiecare
specimen, secvenele din regiunea hipervariabil I (HVRI) i regiunea hipervariabil II (HVRII) ale
genomului mitocondrial au fost determinate prin amplificarea a 8 segmente care se suprapun pe
ntreaga regiune hipervariabil. Dimensiunea acestor segmente este cuprins ntre 126 de perechi de
baze i 170 de perechi de baze (Gabriel et al., 2001). Monitorizarea unei posibile contaminri a
reactivilor folosii sa realizat prin adugarea controalelor negative de PCR. La finalul reaciilor de
amplificare sa verificat faptul c au fost amplificate fragmentele de interes prin intermediul
electroforezei n gel de agaroz. Aceast metod analitic presupune separarea moleculelor de acizi
nucleici care migreaz n cmp electric n funcie de dimensiunea pe care o au. Astfel, cunoscnd
dimensiuneaampliconului,nurmamigrriisalentrungeldeagarozcoloratcubromurdeetidiu,se
poatevizualizalaUVprezenaADNuluidemrimeaateptat.SegmenteledeADNdeinteresobinute
ngelaufostpurificate,nvedereaclonriilor.
Pentrufiecareampliconsauefectuatunminimde6clone,rezultndunnumrtotalde48de
clonepentruunsingurindivid.Etapadeclonarepresupuneinserareaampliconilornvectoriplasmidiali
de clonare, transformarea unei tulpini de E. coli, purificarea plasmidelor i verificarea prezenei
insertului prin digestia cu enzime de restricie. Dei acest proces este unul de durat, el este
indispensabil pentru c permite efectuarea distinciei ntre mutaiile reale i cele datorate degradrii
postmortem a ADNului, precum i identificarea prezenei unui amestec de ADN n urma alinierii
secvenelor. Secvenializarea tradiional, de tip Sanger, a clonelor a fost efectuat prin intermediul
serviciilordisponibilencadrulMacrogen.
2. NGS
Cancazulprimeimetodedeanaliz,izolareaADNsarealizatdindinicarereprezintceamai
bunsurspentrurecuperareamaterialuluigeneticdinspecimenelearheologice,datoritproprietilor
morfologice (Adler et al., 2011; Higgins i Austin, 2013). Extracia ADN a fost realizat conform
protocoluluidescrisdeDabneyetal.,2013.Spredeosebiredemetodeledeextraciepublicateanterior
(Rohland i Hofreiter, 2007), acest protocol se remarc prin: modificri n compoziia tamponului de
legare ADN (binding buffer), creterea volumului acestui tampon fa de cel de extracie i utilizarea
coloanelordesilicacuplatecuunrezervorcarespermitncrcareaunorvolumemari.Aceasttehnic
de extracie n combinaie cu pregtirea bibliotecilor de ADN permite recuperarea eficient a
moleculelor de ADN vechi scurte de pn la 30 de perechi de baze (Dabney et al., 2013). n cazul
amplificriiPCRdirecteaprodusuluideextracieinformaiaconinutnsecvenelenucleotidicescurte
este pierdut, deoarece doar fragmentele suficient de lungi permit ataarea complementar a
amorselorlasecvenadeinteresiimplicitreplicareaacesteia.
Protocolul de secvenializare pentru platforma Illumina (MiSeq) presupune convertirea
secvenelorceurmeazafideterminatenbibliotecideADNcarepermitamplificareaiimobilizarealor
pentru secvenializare (Kircher et al., 2010). Bibliotecile de ADN pot fi construite fie din molecule
monocatenare,fiedinmoleculedublucatenare.Datfiindfaptulcmetodeledepreparareabibliotecilor
monocatenaredeADNvechisuntlimitatedecosturileridicateidetimpulndelungatnecesarpentru
obinerea lor, sa optat pentru cealalt variant care permite recuperarea eficient a materialului
genetic endogen (Bennett et al., 2014). Primul pas pentru crearea bibliotecilor este fragmentarea
segmentelor mari de acizi nucleici, dar din moment ce ADNul coninut n probele arheologice are
dimensiuni mici, datorit degradrii postmortem, aceast etap nu mai este necesar. Astfel,
construirea bibliotecilor ADN a fost realizat prin ligarea unor adaptori universali trunchiai la ambele
capete ale segmentelor bicatenare extrase (Meyer i Kircher, 2010). Adaptorii conin situsuri de
recunoatere i ataare ale amorselor (priming sites) utilizate pentru amplificare i secvenializare. n
scopul ligrii eficiente ale acestor segmente nucleotidice scurte sau efectuat modificri la nivelul
capetelorfragmentelordeADNmatri.Maintiacestecapeteaufostndreptateprintroreacieblunt
end, iar apoi la unul din capete a fost extins prin adaugarea unei cozi poliA care permite ataarea
complementaraadaptorilorceconincapete3poliT.nacestfelseasigurfaptulclafiecaredincele
dou capete se vor lega adaptori diferii. Dup cele 2 reacii (bluntend, adaptor ligation) produii
obinuiaufostpurificaicuajutorulcoloanelorcusilicaMinElute(Qiagen).Lafiecarepasdepurificareo
cantitatedeADNmatriestepierdut,alterndrandamentuldeconstruireabibliotecilor.Dinaceast
cauzesterecomandatcanumrulacestorpurificrisfiectmaimic(MariciciPaabo,2009).Dupo
reacie de completare a secvenelor adaptorilor, sau adugat secvene nucleotidice scurte, numite
etichete (index) cu ajutorul unor amorse cu coad (tailedprimers). Etichetele sunt secvene specifice
fiecrei biblioteci provenite dintro singur surs i permit identificarea acesteia dup ce mai multe
probe(deregul2,3)suntmpreunatepentrucapturisecvenializaremultiplex.Profilulbibliotecilor
ADN a fost verificat prin electroforez capilar, iar numrul de molecule a fost cuantificat prin PCR
cantitativ.
Selectareafragmentelordeinteres(genomulmitocondrialuman)dinamesteculADNexistentn
bibliotecile obinute sa realizat prin capturare (target capture) (Maricic et al., 2010). Acest proces
presupune hibridarea secvenelor ADN pe baz de complementaritate cu secvenele prob care sunt
imobilizate pe sfere magnetice. Fragmentele de ADN irelevante (care nu sau legat de sfere) au fost
nlturateprinsplare,iarapoifragmenteleintaufosteluate.Pentruobinereaunuinumrdecopii
suficient de mare pentru secvenializare, bibliotecile de ADN ce conin doar fragmente aparinnd
genomuluimitocondrialumanaufostamplificateprinPCR.
nconcluzie,caracteristicilemoleculelordeADNvechiimpunadaptareametodeloritehnicilor
utilizate n studiile de ADN modern. Protocoalele de lucru sunt constant optimizate astfel nct s se
acceseze ct mai mult din informaia genetic pstrat n rmiele arheologice, iar costurile pentru
procesarea probelor s fie ct mai reduse. Progresul tehnologic n domeniu este unul uluitor, fiind
disponibiletotmaimultemetodedeanalizaADNuluivechi,iaralegereauneiaserealizeaznfuncie
descopulstudiului,caracteristicilematerialuluiarheologic,dotriledinlaboratorifonduriledisponibile.
Analiza molecular a celor 11 indivizi din aceast necropol demonstreaz existena unei
diversiti genetice mari n cadrul acestei populaii. Variaia genetic la nivelul celor dou regiuni
hipervariabilealegenomuluimitocondrialpentrumajoritateaindivizilor analizaicorespundeunor linii
materne esteuropene, cu o singur excepie care este specific sudului Asiei. Aceste rezultate indic
existenauneioriginibiogeograficediferitepentruindiviziidincomunitateamedievalanalizat.nplus,
rezultatele obinute confirm ipoteza arheologilor cu privire la existena unor relaii de rudenie ntre
dougrupuridectedoiindivizinmormntaincomplexularheologicCapidava.

Microbiotaasociatresturilorumanearheologiceconsecinepentrudepozitareapetermenlung
Pentru evidenierea efectului biodegradativ al fungilor asupra resurselor arheologice au fost

utilizate probe de os din trei situri arheologice din Transilvania: Feleac (secolele XIIXVI AD), Tarian
(secolul al XIXlea AD) i Turda (mileniul al Vlea BC). Oasele au fost selectate datorit prezenei pe
suprafaaloraunorzonepigmentate.Pentruadifereniaposibilelespeciivechidecelecontaminante
dinmediuaufostrulatenparalelprobedesolcorespunztoarefiecruiindividanalizat.
TehnicaFTIR

SpectruFTIRpentruprobedeosdeprovenienarheologic

Cu ajutorul tehnicii fizice FTIR (Fourier Transformant Infrared Spectroscopy) poate fi evaluat
rapid gradul de remodelare pe care l sufer osul n cadrul procesului de degradare. Raportul dintre
apatit i colagen se schimb dea lungul timpului putnd fi urmrite modificrile de structur.
Principalii factori prin care se evalueaz gradul de conservare sunt IRSF (Infrared Splitting Factor) i
raportulcarbonat/fosfat(C/Pratio).PentruprobelemodernevalorileindiceluiIRSFsuntcuprinsentre
2,5i3,25,descriindcristalinitateamatriceimineraleaosului.Pentruprobelearheologice,careprezint
alterridestructur,valorileindiceluisuntmaimaride3,4(SuroveliStiner,2001).ncazulraportului
C/Pseiauncalculvalorilepeakurilorla1035cm1pentrufosfat,respectiv1415cm1pentrucarbonat
(Beasleyetal.,2014).
Valorile obinute pentru probele analizate sunt n concordan cu vechimea atribuit de
arheologi.Scoruriletafonomiceatribuitencadrulanalizeiantropologicesuntidentice,utilizareaanalizei
FTIRfiinddecinecesar.
TehnicaSEM(microscopieelectronicadebaleiaj)
Cuajutorulmicroscopieicebaleiajafostevideniatprezenaspeciei
StachybotryschartarumpesuprafaaosuluidelaFeleac.
qPCR
1.00E+10
Concentratie(numardecopii/reactie)
1.00E+09
1.00E+08
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Tarian Turdas Feleac
os 4.15E+03 5.14E+03 8.07E+06
sol 3.34E+09 9.28E+02 2.63E+06
Abundenaabsolutaspeciilordefungipentrufiecaredinprobeledesolios
analizatedinsiturilearheologicedelaTarian,Turda,respectivFeleac.
Pentru cuantificarea moleculelor de fungi prezente n probele de os i sol analizate au fost

folosite amorsele FR1 (5AICCATTCAATCGGTAIT3) i FF390 (5CGATAACGAACGAGACCT3) (Pervost
Bouretal.,2011)careintescunfragmentde390pbdingenapentruARNr18S.Pentrucurbastandard
sa folosit un plasmid pJET1.2 coninnd fragmentul de interes care a fost secvenializat n prealabil.
Amplificrile auavutlocnRotorGeneQ(QIAGEN,Hilden,Germany)utilizndSensiFASTTM SYBRNo
ROX Kit (Bioline) reaciile desfurnduse ntrun volum final de 20 l, coninnd 10 l of SensiFAST
SYBRNoROXMix1x,1ldinfiecareamors(500nM),1,5ldeADNi6,5lH2O.Afostutilizatun
programPCRntreipai,dupcumurmeaz:95oC3(95oC10,56oC15,72oC15)40.Aufost
utilizateduplicatepentrufiecareprob,precumicontroalenegative.
Pentru probele de sol de la Tarian i Feleac sau obinut valori similare cu datele de qPCR
prezentenliteratur,spredeosebiredeceadelaTurdaundevalorilesuntmici.Abundenadespecii
estemaimarepentruprobeledeoscomparativcuceledesolncazulsiturilordelaFeleaciTurda,
oaseleoferindsubstraturimaibogatennutrienidectsol.Diversitateainumrulde speciidefungi
dinsolscadecuadncimea,probeledesolasociateindiviziloranalizaiproveninddela40cmadncime.
Analizaprobelorprinmetodaindependentdecultivare
ADNulafostextrasdin200mgprobdeossausoldirectutilizndPowerSoilDNAIsolationKit
(MOBIOLaboratories,Inc.)conformspecificaiilorproductorului.
Pentru analiza molecular a fost aleas regiunea spacerului intern transcris (ITS). Amorsele
utilizate n reacia de amplificare au fost ITS1 (5TCCGTAGGTGAACCTGCGG3) i ITS2 (5
GCTGCGTTCTTCATCGATGC3)pentruregiuneaITS1,respectivITS3(5GCATCGATGAAGAACGCAGC3)i
ITS4(5TCCTCCGCTTATTGATATGC3)pentruregiuneaITS2(Whiteetal.,1990).Oaltregiuneintita
fostgenapentruARNr18S,iaramorselefolositeaufostFR1(5AICCATTCAATCGGTAIT3)iFF390(5
CGATAACGAACGAGACCT3)(PervostBouretal.,2011).
Pentrufiecaresetdeamorse,amplificareasarealizatntrunvolumfinalde25l,amestecurile
coninndurmtoarelecomponente:5lde5MangoTaqColoredReactionBuffer(Bioline),1,25lde
MgCl250mM(Bioline),0,5ldNTP10mM(Bioline),1,25ldinfiecareamors(MacrogenSequencing
Service,Korea),0,25ldeMangoTaq(Bioline)5U/li2ldeADN.Pentrufiecaresetdeamorseafost
introdusuncontrolnegativ,carenuconineADN.Pentruamplificareaufostfolositeurmtoarelevariaii
termicepeparcursula35decicluri:95oCpentru30sec,56oCpentru30seci72oCpentru30sec.
ReaciadeamplificareageneratfragmentedeADNdedimensiuniateptatecareaufostclonate
iulteriortrimiselasecvenializat(MacrogenSequencingService,Korea).Aufostanalizatecte8clone
pentrufiecaredinmarkeriimoleculariutilizai.
Speciimicrobienenos,respectivsol,probeFeleacu,Cluj.
n cazul probelor de la Feleac au fost identificate secvene aparinnd speciilor din genul
Stachybotrys,attnsolctipesuprafaaosului.Diversitateadespeciiestesczutpentruacestsit.
Toatespeciileidentificatesuntcomunensolfiinddefaptlargrspnditenmediu.Seremarcprezena
uneisecveneamplificatedinoscaresealiniaznbazelededatecuospecienecultivatasociatpielii
umane. Fragmentul este totui mare aprox. 300 pb neputnd fi corelat cu o posibil specie veche.
Problemacontaminriintimpulprocesuluideinvestigareestedeluatncalcul(transferulacesteispecii
delaceicareaumanipulateprobele:arheologi,biologi).
Speciimicrobienenos,respectivsol,probeTarian,Oradea.
n cazul probelor de sol, respectiv os de la Tarian, se observ o diversitate mult mai mare de
specii. Sau obinut secvene aparinnd ctorva specii ncadrate n regnul plante fiind evident efectul
prezeneiapeinprocesuldebiodegradare.
Speciimicrobienenos,respectivsol,probeTurda,Hunedoara.

Stachibotryseprezentntoateprobele,probabilcontaminaredindepozit.
Analizaprobelorprinmetodabazatpecultivare
Pentru a detecta speciile active asociate suprafeei sa utilizat metoda de analiz bazat pe
cultivare. Suprafaa curat a osului a fost pulverizat mecanic, peste 100 mg de pudr de os fiind
adugai500lapultrapur.300laufostinoculaipeplciSabouraudagarconinnd:40g/lglucoz,
10g/lpepton,15g/lagar,50g/mlcloramfenicollapH5,6.Plcileaufostincubate7zilela25oC.

Speciimicrobienecaracterizateprintehnicadecultivarepemediu.

SpeciidingenurileRhodotorula,Stachybotrys,Epicocum,careaparconstantnprobelestudiate
suntasociatenunelecazuricupatologii.
Specii bacteriene aparinnd microbiotei orale identificate n probe de tartru de provenien

arheologic
Actynomices,StreptococcusiMT7

Diagnosticulmalarieinpopulaiiistoriceabordareinterdisciplinar
ExtraciedeproteintotalpentruefectuareadetesterapidededetecieainfecieicuPlasmodium
sp.
Activitate de documentareinformare n vederea cunoaterii stadiului actual al cercetrilor i
elaborrii unui protocol de lucru necesar pentru obinerea i analiza proteinelor din surse
arheologice.
Activitipractice
o Planificareaexperimentelor(adaptareaprotocoalelordinbibliografiaconsultatlabaza
materialdisponibil)
o Pentruaevitacontaminareaprobelorcuproteineexogenetoateprobelefolosite(esut
osossaudentar)aufostcurateprinsplareiiradiereculuminUV.Cuajutorulunei
freze dentare din aceste probe sa obinut o pulbere care a fost folosit n toate
metodeleexperimentaleulterioare.
o Testareaprotocoalelordelucru
Aufostelaborate3protocoaledelucrupentrutestare:doudineleaufostdescrisedeSchmidt
Schultz&Schultz(2004),respectivTranetal.(2011).Altreileafoloseteunkitdeextracieaproteinelor
disponibilcomercial(ProteoJET,Fermentas).
o EvaluareacantitativaeficieneicelortreimetodeprinmetodaBradford.
o Seleciaipregtireaprobelorprovenitedela11indivizidinnecropoleleMireasa,jud.
Constana(9)iCapidava,jud.Constaa(2).
o Utilizareaproteinelorobinuteprinextraciedinpulpadentarpentrudeteciamalariei
folosindtestedediagnosticrapidBinaxNOWMalaria.Rezultate:5pozitiv(Mireasa4,
Capidava1),6negativ(Mireasa5,Capidava1).

ConfirmareadiagnosticuluipozitivprinamplificareaADN
o Seleciaamorselorfolositepentruconfirmareadiagnosticuluipozitiv:
Nume Secvena Sursa
OngagnaYhombi,S.Y.,Corstjens,P.,Geva,E.,Abrams,
Plf3D7F GAAACTGTGGATAATGTAAATG W.R.,Barber,C.a,Malamud,D.,&Mharakurwa,S.
(2013).ImprovedassaytodetectPlasmodium
falciparumusinganuninterrupted,seminestedPCR
Plf3D7R ATTTATCCTATTGCTTAAAGGT andquantitativelateralflowanalysis.MalariaJournal,
12(1),74.
Pfcrt76D1F TGTGCTCATGTGTTTAAACTT Schwab,U.,Alloueche,A,&Doherty,J.F.(2005).

MultidrugresistantmalariafromSouthAfrica.Clinical
InfectiousDiseases:AnOfficialPublicationofthe
Pfcrt76D2R CAAAACTATAGTTACCAATTTTG InfectiousDiseasesSocietyofAmerica,40(3),493.
Smith,P.H.,Mwangi,J.M.,Afrane,Y.A,Yan,G.,
PlspSSUF TCTAGGGGAACTATTTTAGCTT Obbard,D.J.,RanfordCartwright,L.C.,&Little,T.J.
(2011).AlternativesplicingoftheAnophelesgambiae
DscamgeneindiversePlasmodiumfalciparum
PlspSSUR CACAGTAAATGCTTTAACTGTT infections.MalariaJournal,10(1),156.

o ExtraciaADNdinpulpadentarprovenitdela2indivizidinnecropolaMireasapentru
careamobinutrezultatepozitivelatestuldediagnosticrapidBinaxNOWMalaria.
o OptimizareaprotocoluluidePCRpentruamorseledescrisemaisus.
o Analiza secvenelor obinute prin amplificare folosind amorsele Plf3D7 i PlspSSU a
demonstrat o amplificare nespecific. Secvenele obinute se aliniaz parial cu mai
multesecvene,proveninddeladiversespecii,dinbazadedateNCBIGene.
o Designulunoramorsealternativefolositepentruconfirmareadiagnosticuluipozitiv:
Nume Secvena Sursa
MinibarF TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC Meusnier,I.etal.(2008).AuniversalDNA
MinibarR GAAAATCATAATGAAGGCATGAGC minibarcodeforbiodiversityanalysis.BMC
Genomics,9,214.
PlasmodiumCOIF CAGAATTAGCATAYCCWAGAAT Proprii
PlasmodiumCOIR CTTAATGGTGGATATAAAGTCC
PlasmodiumCytBF TACATTTACATGGTAGCACAAAT Proprii
PlasmodiumCytBR ACGATAGCATTATCAGGATGTGA

o Analiza secvenelor obinute prin amplificare folosind amorsele universale Minibar
pentru un fragment de 130 bp din gena COI arat c speciile predominante n ADN
extrasdinosprovinedelaspeciidebacteriiifungicomunensol.
o ImplementareaunuinouprotocoldeextracieADNpebazametodeidescrisedeDabney
et al (2013) Complete mitochondrial genome sequence of a Middle Pleistocene cave
bearreconstructedfromultrashortDNAfragments.ProceedingsftheNationalAcademy
ofSciences,110(39),1675815763.
o ExtraciaADNdinpulpadentarfolosindprotocolulmenionatanterioradatrezultate
bunensensulcreteriicantitiideADNobinute.

Confirmareadiagnosticuluipozitivprindeteciacristalelordehemozoin

Activitatededocumentarecuscopul:
o Elaborrii unor protocoale de lucru pentru confirmarea diagnosticului de malarie
obinutprinfolosireatestelordediagnosticrapidBinaxNOWMalaria.
o Familiarizriicumetodededetecieicaracterizareahemozoinei(produsdedegradare
produsdeparaziiidingenulPlasmodiumcaurmareadegradriihemoglobinei).

Activitipractice:
o Testarea unor tehnici de izolare i detecie a hemozoinei pe baza proprietilor fizico
chimicealeacesteia:
Microscopieoptic
TEM(Microscopieelectronicdetransmisie)
XRD(DifraciederazeX)
FTIR(SpectroscopieninfraroucutransformatFourier)
o Folosirea microscopiei electronice de transmisie pentru detecia hemozoinei, pentru 3

indivizi.

ImagineTEM.CristaledehemozoinrecoltatedelaindividulM47,Mireasa,Constana

Alteinvestigaiideantropologiefizic

Afostcontinuatanalizaunornoiloturiosteologicedupcumurmeaz:Clineti(jud.Prahova)
n=188;Capidavan=116(npregtirepentrupublicare);Ernein=1(cazspecial,npregtirepentru
publicare); Ndlac n = 19; Turda n = 1; Trgor n = 4; Cripta franciscan ClujNapoca = nr. minim de
indivizi130.
Altelucrrincursdeapariie

Carte
AdrianIoni,BeatriceKelemen,AlexandruSimon,PrinulNegrualriiRomneti:unvoievoddelaCurtea
deArgeivremurilesale(=Minerva,III,14)(ClujNapoca:AcademiaRomn,CentruldeStudiiTransilvane,
ClujNapoca,2015),216p.[EditurCNATDCU(NatA1A2)/CNCS(B)]

Articol
Beatrice Kelemen, Adrian Ioni, AlexandruSimon, DelaBisericaArgeIlaBisericaArgeII: vremea rii
RomnetiiaBisericiiSfntulNicolaeDomnesc,AnuarulInstitutuluideIstorieA.D.Xenopol(Iai),LII(2015),pp.
158.[ERIH(Nat)/BDI(CEEOL)/CNCS(B)]
Concluzii
Pebazacelorraportatemaisusputemconcluzionacaufostndepliniteactivitileasumatepentruaceastetapa
proiectuluinproporiede100%.
Raport tiinific 2014 GENESIS PCCA_1153_2011 (contract 229/2013)
Raport tiinific privind rezultatele obinute n cadrul proiectului PCCA_1153b (contract

229/2013)
Evolutie Genetica: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.

O calatorie biomoleculara n jurul Carpatilor din Antichitate pna n Evul Mediu
n perioada ianuarie-decembrie 2014

Cuprins:
1. Rezumat
2. Sinteza rezultatelor obinute n perioada ianuarie decembrie 2014
3. Anexe I Rezultatele principalelor direcii de cercetare n anul 2014
a. Studiul I
Utilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei de ADN din
oase arheologice
b. Studiul II
Diagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni, Romnia
c. Studiul III
Diversitatea genetic reflectat de analiza regiunii de control mitocondriale la o
populaie de secol X din Capidava (Constana, Romnia)
d. Studiul IV
Optimizarea diagnosticului molecular al sexului la probe arheologice umane
e. Studiul V
Diagnosticul interdisciplinar al unui caz de diabet din perioada neolitic
f. Studiul VI
Mormntul 10 din Biserica Sf. Nicolae Domnesc de la Curtea de Arge
g. Studiul VII
Copilul de la Mlieti (MMPP)
4. Anexe II Rapoarte de antropologie fizic pentru loturile procesate n anul 2014

Raport arheozoologic Miercurea Sibiului 2014
Raport antropologic - Capidava 2014
Raport antropologic Cristian 2014
Raport antropologic - Mlieti 2014
Raport antropologic - Miceti 2014
Raport antropologic - Toboliu 2014
Raport antropologic - Turda 2014
5. Lista publicaiilor i participrilor la conferine tiinifice n anul 2014

REZUMAT
n etapa II a proiectului PCCA-1153b contract 229/2013 (perioada 1 ianuarie - 31 decembrie

2014) au continuat cercetrile demarate n anul 2013.
Grupurile de antropologie fizic (P1 i P2) continu analiza loturilor recepionate n anul 2013 i
a celor recepionate n anul 2014. Analizele antropometrice constituie analize preliminare care
evideniaz cazurile speciale ce vor primi prioritate n ceea ce privete analizele moleculare. n
Anexele II ale acestui raport tiinific sunt date ca exemplu cele mai relevante necropole studiate din
punct de vedere al antropologiei fizice n cadrul etapei II a proiectului i pentru care a fost redactat
un raport pentru echipa de arheologi.
Cele mai relevante rezultate moleculare obinute n cadrul acestei e tape au fost evideniate n
cadrul studiilor I-VII ce formeaz Anexa I. Dintre acestea, amintim: 1. optimizarea unei metode de
atribuire mai sigur a vrstei la momentul decesului folosind tehnica FTIR (Fourier Transfor
Infrared Spectroscopy), confirmarea prin analize genetice a unui diagnostic de tuberculoz (studiu
pentru care la finalul etapei I nu existau dect rezultate preliminare), identificarea primelor
haplogrupuri mitocondriale de Epoca Bronzului i medievale din diverse necropole de pe teritoriul
Romniei (Capidava, Mireasa - Constana; M10 din Curtea de Arge; copilul nou-nscut din
Mlieti). Majoritatea haplogrupurilor mitocondriale caracterizate pentru populaiile istorice pn n
acest moment sunt forme genetice rare, sau relativ rare n populaia modern ceea ce ridic noi
ntrebri despre contribuia acestora la alctuirea structurii genetice a populaiei moderne.
Tot n aceast etap a continuat efortul de datare radiometric i de analizare a izotopilor stabili
de C i N, cu rezultate n curs de interpretare.
n cadrul proiectului, ncepnd cu finalul acestei etape au fost demarate patru doctorate (3
biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria tematic vizat de proiect.
SINTEZA REZULTATELOR OBINUTE N PERIOADA IANUARIE DECEMBRIE 2014
Obiectivele etapei II sunt:

1. Documentare i schimburi tiinifice
(vezi lista de participri la conferine i deplasrile de documentare)
2. Investigaii paleo-osteologice
(vezi Anexele II)
3. ADN vechi secvenializare i genotipare
(vezi Studiile I-VII)
4. Analize izotopi stabili ai carbonului (C) i azotului (N), pentru caracterizarea dietei
(2014 - datri radiometrice i analiza izotopilor stabili de C i N n cadrul
studiilor II, III, VII)
5. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)
(vezi studiile I, II, V)
6. Sapaturi arheologice i procesarea inventarului material
(vezi deplasrile pe antiere arheologice)
7. Studii de arhiva
(studiul VI)
Obligaiile asumate de partenerii proiectului prin semnarea Actului Aditional nr. 2 din 2014
pentru acest etap sunt:
1. Depunerea raportului anual aferent etapei II

2. Depunerea raportului tiinific aferent etapei II
3. Depunerea raportului financiar aferent etapei II
4. Participarea la conferine tiinifice 28
n plus fa de indicii asumai au fost publicate 8 articole n reviste indexate n baze de date
internaionale, acceptat spre publicare 1 articol n reviste indexate n baze de date internaionale,
publicat 1 articol n revist n curs de indexare n bazele de date (primul numr n anul 2014) i
publicat 1 articol (proceedings) n volumul unei conferine internaionale (Arheovest, decembrie
2014, Timioara).
A fost organizat, la Cluj-Napoca, n data de 7-8 noiembrie 2014, Workshopul Abordarea
biocultural i tiinele biomedicale care a oferit studenilor arheologi i biologi oportunitatea de
a observa procedurile practice aplicate n laboratoare de antropologie fizic i molecular, de a
demara un schimb de idei ntre oameni formai n discipline umanist e i reale i a identifica
posibiliti de colaborare.
ncepnd cu lunile octombrie 2014, respectiv noiembrie 2014 au demarat 4 doctorate (3
biologie, 1 arheologie) cu subiecte din aria acoperit de proiect.
Studiul I.
Utilitatea spectroscopiei FT-IR n determinarea randamentului extraciei de
ADN din oase arheologice
Populaia analizat n acest studiu aparine unei necropole de lng satul Mireasa din
comuna Silitea, judeul Constana i aparine Epocii Bronzului, defuncii fiind ngropai n
poziie fetal (chircit), pe o parte (Figura 1). Pentru a afla vrsta exact a acestora, unul dintre
indivizi a fost testat prin radiometrie.
Datarea cu 14C arat c proba testat aparinea unui individ care a murit ntre anii 2580 i
2490 .e.n, perioad ce coincide cu epoca timpurie a bronzului pe teritoriul Romniei.
n acest studiu, notarea indivizilor este

urmtoarea:
M2 A M7 G
M3 B M11a H
M4 C M11b J
M5a D M115A K
M5b E M160 -L
M6 F
Fig.1. Fotografiile celor 11 morminte din necropola Mireasa care au fost atribuite Epocii
Bronzului. Toate scheletele sunt aezate n poziie chircit.
Dup analiza markerilor de sex i vrst (creast nucal, proces mastoid, margine
supraorbital, glabel, i eminen mental, precum i a markerilor de pe oasele coxale, dar i
lungimea unor oase lungi) observabili la scheletele indivizilor necropolei Mireasa, Epoca
Bronzului, a fost fcut o aproximare a vrstei acestora la momentul morii, precum i o atribuire
ct mai exact a sexului (Tabel 1). Astfel, majoritatea rmielor aparin unor brbai, excepie
fcnd (M5a D), de sex feminine. Indivizii studiai au vrste variate, de la nou-nscut, copii,
tineri i aduli. n cazul M5b (E), unde e vorba de osemintele unui infans, nu au putut fi
caracterizai markerii amintii mai sus din cauza slabei reprezentri i conservri a oaselor (Tabel
1).
Tab.1. Valorile aproximative ale vrstei indivizilor din necropola Mireasa, sexul lor, valoarea
medie a strii de reprezentare (scorul 3 nsemnnd c peste 75% din os este disponibil, 2
aproximativ 50%, 1 sub 25% i scorul 0 pentru oasele lips ) i procentul de oase disponibile
calculat pe baza strii de reprezentare.
Stare de
Numr Procentul de oase
Cod individ Sex Vrst reprezentare
mormnt salvate din individ
(medie)
M2 A M 20-23 ani 1.296875 32%
M3 B M 26-70 ani 0.65625 16%
M4 C M 15-25 ani 2.265625 57%
M5a D F 11-15 ani 0.953125 24%
M5b E ? bebelu ? ?
M6 F M 17-19 ani 0.28125 7%
M7 G M 33-42 ani 1.15625 29%
M11A H M 21-53 ani 1.65625 41%
M11B J M 7-12 ani 0.546875 14%
M115A K M 20+ ani 1.328125 33%
M160 L M 26-39 ani 2.4375 61%
Dup cum se observ din tabelul 1, valoarea medie a strii de reprezentare a scheletelor
este n mare parte sub 50%, ceea ce reduce mult acurateea determinrii vrstei i sexului, multe
dintre poriunile cu rol de marker de diagnostic lipsind. Pentru o confirmare absolut a sexului se
pot face analize moleculare, ns vrsta morii este deocamdat o informaie ce nu poate fi
verificat i confirmat prin metode de biologie molecular. Analizele spectroscopice, ns,
manifest un potenial puternic n creterea acurateii determinrii vrstei.
Spectroscopia FTIR i rolul ei n analiza oaselor arheologice

Indicii FTIR folosii pentru evaluarea diagenezei osoase
IRSF
Istoric, primul indice FTIR folosit pentru evaluarea cristalinitii hidroxiapatitei a fost
funcia de despicare (splitting function), un raport arie/arie caracteristic despicrii degenerative
a peak-ului de la 600 cm-1 propriu ndoirii antisimetrice a fosfatului odat cu sporirea ordinii
atomilor (Termine i Posner, 1966). Uneori numit index de cristalinitate CI, alteori factor de
despicare n infrarou IRSF (Infrared splitting factor), raportul dintre suma absorbanelor
valorilor celor dou peak-uri ale despicturii i valoarea corespunztoare vii dintre ele
(A595+A605)/A588 codific informaii referitoare la gradul de diagenez al unui os. Cu ct faza
organic a osului este degradat chimic sau microbiologic, reeaua mineral din jurul ei sufer i
ea disoluii, mai ales ale cristalitelor mai mici i mai instabile din punct de vedere termodinamic,
care se vor recristaliza pe suprafaa cristalelor deja existente, mai mari i mai stabile, conform
condiiilor fizico-chimice discutate mai sus. Nielsen-Marsh i Hedges (2000) afirmau c cele
dou procese, disoluia i recristalizarea pot participa mpreun la creterea valorii IRSF. Astfel,
cristalinitatea crete, i chiar dac la nivel macroscopic nu se observ diferene, reorganizarea
microscopic poate fi urmrit cu ajutorul acestui parametru (Rogers i colab., 2010). O corelare
direct ntre IRSF i mrimea medie a cristalitelor a fost artat de Truman i colab. (2004),
mpreun cu o modificare n forma cristalitelor odat cu maturarea, de la o form planar nspre
una acicular: 163 x 28 x 5 nm (Berna i colab., 2004).
Mai multe colective au calculat IRSF pentru os modern n comparaie cu oasele
arheologice pe care le studiau la acel moment, artnd o cretere clar a valorii indicelui odat cu
degradarea osului: 2.7 peste 3 (Mller i colab., 2011); sub 2.8 ntre 2.7 i 3.4 (Trueman i
colab., 2004); 3.4 ntre 3.5 i 3.8 pentru un loc de nmormntare i ntre 3.1 i 4.6 pentru un
altul (Lebon i colab., 2010); 2.6 3 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000) i Berna i colab., (2004)
au evideniat o gam i mai larg de valori: ntre 2.6 i 3 pentru oase in vivo, pn la 3.4 pentru
oase puin afectate la suprafaa solului, pn la 4.1 pentru oase fosile i un IRSF de 7 a fost
determinat pentru fosile puternic alterate (Figura 2). Pentru comparaie, IRSF pentru
hidroxiapatita sintetic este 5.4. O explicaie pentru care cristalinitatea ntr-un os poate fi mai
mare dect ntr-o hidroxiapatit standard va fi dat imediat.
Fig.2. Valori ale IRSF i gradul de recristalizare pentru diferite tipuri de apatite. Apatita
carbonatat exogen este mineralul ce se formeaz cel mai des prin reacia ntre fosfatul eliberat din
degradarea materiei organice i carbonatul de calciu prezent n sedimente. (din Berna i colab.,
2004)
Cnd structura chimic original a apatitei geologice este alterat, ntregul complex va fi
mai destins (mai lax), mai solubil i deci mai puin cristalin, asemenea alterri se ntmpl cnd
CO3 nlocuiete parial PO4 sau OH, sau cnd Ca este substituit de ali atomi, ca Na sau Mg.
Figura 3 arat spectre ale unor tipuri distincte de diagenez, graficul negru corespunznd unui os
depozitat n mediu carbonatat (vezi peak-ul masiv al carbonatului, de la 1415 cm-1): se observ
slaba despicare a peak-ului la 595 605 cm-1, susinnd explicaia de mai sus. Situaia opus
pentru hidroxiapatit este atunci cnd OH este nlocuit de un atom de flor. Floroapatita
[Ca10(PO4)6(F)2] este chiar mai strns mpachetat fr gruparea hidroxil, conferind mineralului
insolubilitate, cristalinitate i rezisten la pH mic, cu un IRSF de pn la 7. n os, hidroxiapatita
carbonatat leag florul, devenind francolit [Ca10(PO4,CO3)6(F)2], un mineral cu un peak
specific de absorbie n infrarou, la 1096 cm -1, uor de recunoscut pe spectru prin umrul de
francolit de lng peak-ul principal al fosfatului. Graficul rou din Figura 3 este un exemplu de
spectru al unui os care a absorbit flor, avnd distinctivul umr de francolit i un IRSF mai mare,
dup cum despicarea de la 600 cm -1 sugereaz.
Fig.3. Exemple de spectre de absorbie FTIR ale unor oase cu tipuri de diagenez diferite (discuie
n text) (imagine proprie)
ntr-un sit arheologic s-a observat c oasele indivizilor nmormntai n zona cu sol mai
umed a sitului prezentau semne de francolit (King i colab., 2011), ceea ce se explic prin
afinitatea mare a florului pentru ap (Greenwood i Earnshaw, 1998). Fosilele foarte vechi, ca
cele de dinozauri, au IRSF de aproape 7 i un coninut crescut de flor, altfel nu ar fi putut
supravieui n timp (Berna i colab., 2004).
Totui, nici un IRSF mic i nici un timp de depoziie scurt nu se pot corela cu o
conservare bun a organicului, cci toi ceilali factori descrii mai sus depesc contribuia
vrstei cronologice (Weiner i Bar-Yosef, 1990). Hagelberg i colab. (1991) ofer un exemplu n
acest sens: o groap comun din perioada Rzboiului Civil nu a avut randament la obinerea de
ADN pentru analize genetice, ns un cimitir saxon mai vechi dect precedentul a dus la rezultate
ADN interpretabile. Nici Salamon i colab. (2005) nu au reuit s gseasc o corelare ntre
randamentul amplificrii ADN i vrsta probei, ns Allentoft i colab. (2012) subliniaz c dac
toate celelalte variabile ar fi constante, conservarea ar fi o funcie de timp, aa cum ne ateptm,
conform datelor de chimie fizic pur.
C/P
Coninutul de carbonat, msoar raportul absorbiilor peak-urilor CO3/PO4 de la 1415 i
1035 cm-1 respectiv. Wright i Schwartz (1996) au stabilit o bun corelare ntre raportul C/P i
procentul de mas (wt%) al CO32- msurat prin eliminarea de CO2 la disoluie acid.
C/P este un parametru disputat, mai ales n domeniul etichetrii izotopice, orice carbonat
exogen din esutul osos examinat ducnd la rezultate greite legate de vrsta geologic, migraii,
diet, clim (King i colab., 2011).
n ceea ce privete diageneza, raportul C/P arat doar raportul cantitativ ntre anioni. El
poate crete n timp, dac concentraia carbonatului n mediu este mare, astfel nclinnd balana
echilibrului termodinamic mpotriva tendinei naturale a hidroxiapatitei de a elimina carbonatul.
Asemenea cazuri vor prezenta pe spectru un peak specific calcitului la 712 cm -1 (Figura 5), dac
calcitul reprezint minim 3% din mineralul osului (3% fiind limita de detecie) (Nielsen-Marsh i
Hedges, 2000; Mller i colab., 2011). O valoare C/P mic indic pierderea CO 3 prin disoluie
i/sau absorbia de PO4 n structura cristalin; deci o valoare medie, de os modern, a indicelui
C/P ntr-un os antic indic nspre ambele procese: (a) o depunere de calcit (CaCO3) n i pe os i
adsorbie pe suprafaa cristalelor de apatit, i (b) o cretere local a perfeciunii cristalitelor prin
fixarea PO4 (Nielsen-Marsh i Hedges, 2000).
Lebon i colab. (2010) au argumentat problema valorii fluctuante a raportului C/P pentru
probe arheologice prin existena mai multor procese ce contribuie la valoarea lui final, indicele
variind ntre 0.15 i 0.35, pe cnd probele moderne au o deviaie standard mult mai mic, cu o
valoare medie a C/P de 0.28.
Indicele C/P ridic nite probleme din cauza vibraiilor organice C-H crora li se
suprapune frecvena de absorbie cu cea a gruprii CO 3, ducnd la o supraestimare a carbonatului
odat cu coninutul de matrice organic (Truman i colab., 2004). n Figura 5, spectrul probei
carbonatate are i un peak nalt la Amida I (Amida I este legtura C=O din lanul polipeptidic),
sprijinind aceast observaie.
CC
Coninutul de colagen CC este indicele ce msoar conservarea proteic a matricei
osoase, calculat ca raportul valorilor de absorbie ale amidei I i fosfatului (A1640/A1035). Valori
de 0.2 corespund la 15 wt% material organic n os, i un CC de 0.8 la 30 wt% (Truman i
colab., 2004). Cu ct semntura proteic este mai puternic, cu att fraciunea organic a
supravieuit mai bine trecerii timpului ntr-un anumit os.
Nielsen-Marsh i Hedges (2000) au artat o corelare ntre CC i IRSF explicat prin
strnsa legtur dintre matricea mineral i cea organic, pierderea materialului organic ducnd
la disoluia mineralului, corelare neobinut i de Lebon i colab. (2010), probabil din cauz c
lotul investigat de acetia avea i ali factori care au influenat valorile indicilor, ca prezena
florului.
Deplasarea peak-ului 1PO4

Un alt indice, propus de Lebon i colab. (2010), este deplasarea unei benzi de absorbie a
fosfatului de la 960 cm-1 nspre 963 cm-1, deplasare corelat liniar cu pierderea carbonatului i
creterea perfeciunii reelei cristaline, odat cu excluderea ionilor strini. Acest indice pare s
fie mai sensibil la pierderea carbonatului i modificri ale tensiunii n reeaua mineral dect
IRSF, care se refer mai ales la mrimea cristalelor. Unele probe au avut acest peak deplasat i
peste 963 cm-1, dar numai acompaniat de un coninut crescut de flor, care confer floroapatitei
mai mult ordine atomic dect are hidroxiapatita.
Apatitele dopate cu ioni ca Ba2+, Mn2+, Sr2+ au acest peak deplasat sub 960 cm-1, artnd
c acest indice ar putea fi folosit pentru detectarea substituiilor ionice n reeaua mineral de-a
lungul diagenezei (Thomas i colab., 2007).
Concluzii
Procesul de diagenez afecteaz ambele componente ale esutul osos, fraciunea mineral
trecnd prin disoluii i recristalizri succesive, n timp ce partea organic sufer degradare
chimic i digestie microbian. Procesele de diagenez ale celor dou componente osoase sunt
interdependente, ele protejndu-se una pe cealalt.
ADN nu poate fi observat a priori n oasele antice, deci estimarea lui se face pe baza altor
componente, mai accesibile (mineral i proteic).
Din spectrele FTIR se pot obine date privind mrimea cristalitelor din os
[(565+605)/588], raportul carbonat/fosfat (1415/1035), coninutul de colagen (1640/1035), dar i
alte informaii, ca prezena fluoroapatitei sau a calcitului.
Prin interpretarea informaiilor oferite de spectroscopia FTIR privind diferite oase,
molecularistul poate alege osul cel mai potrivit pentru a extrage ADN i a avea un randament ct
mai bun n procesele ulterioare (PCR, Q-PCR, secveniere).
Corelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extras

Pentru fiecare prob de extracie de ADN din fiecare individ au fost calculai indicii
IRSF, C/P, CC. Datele indic o corelare clar ntre valoarea concentraiei de ADN extras (citit
prin spectrometrie UV) i cei 3 indici. Raportul C/P i coninutul de colagen CC sunt direct
proporionale cu cantitatea de ADN extras, iar indicele IRSF este n relaie invers (Figura 4.F
individul M6-F). Corelarea nu este la fel de evident la toi indivizii, dar proporionalitatea
invers a IRSF rmne valabil n mai multe cazuri (Figura 4.B individul M3-B). De precizat
este faptul c gradul de corelare ntre date se menine doar cnd se analizeaz cte un individ pe
rnd, astfel c la combinarea datelor ntre indivizii B i F graficul nu mai are aceeai simetrie
(Figura 5). IRSF i menine invers proporionalitatea fa de C/P i CC, ns relaia acestora cu
concentraia de ADN extras din probe nu se pstreaz la compararea inter-individual, fapt ce se
explic prin condiiile diferite n care au fost depozitate oasele. Chiar dac toi indivizii studiai
aici provin din aceeai necropol i condiiile climatice de-a lungul secolelor au fost aceleai
pentru toate scheletele, este posibil ca proprietile solului i hidrologia local s fie diferite chiar
i la distane de civa metri.
F B
CONC CONC
IRSF IRSF
C/P C/P
CC CC
F2 F56 F8 F10 F11 B2 B3 B6 B8 B11
Fig.4. Corelarea direct proporional a indicilor C/P i CC i invers proporional a IRSF cu

concentraia de ADN extras. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probe
din oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.
CONC
IRSF
C/P
CC
F11 F8 F2 F10 B3 B11 F56 B2 B8 B6
Fig.5. Corelarea indicilor cu concentraia de ADN dispare atunci cnd se compar indivizi
diferii. Indicii FTIR i pstreaz relaia de simetrie, dar valorile concentraiei de ADN nu
coincid cu modelul individual. F = individul M6, B = individul M3. Pe axa absciselor sunt probe
din oase diferite. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.
Corelarea indicilor FTIR cu vrsta

Metoda pantei graficului CC-ADN
Ipoteza de la care s-a pornit n studiul de fa este c supravieuirea ADN n oase este
proporional cu cea a colagenului. Deci indicele CC ar trebui s fie decisiv n luarea deciziei de
a aprofunda studiul unui anumit os prin extracia de ADN. Figura 6 aduce mpreun toate
valorile indicelui CC i concentraiile de ADN extras. Liniile punctate sunt trendline-uri pentru
cte un individ i respect codul de culori de la legend. La cele mai multe probe, trendline-ul
arat o proporionalitate direct ntre valoarea CC i concentraia ADN, dar exist i indivizi
pentru care dreapta este nclinat invers sau este orizontal. Oricum, i la indivizii cu
proporionalitate direct se observ diferite grade de corelare, liniile din grafic fiind nclinate la
unghiuri foarte variate. Aadar, valoarea CC nu pare s prezic nicicum concentraia de ADN din
probe.
C
D
CC
F
G
K
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
Concentraie ADN extras L
Fig.6. Slaba corelare dintre valoarea CC i concentraia de ADN obinut pentru toate probele
studiate. Fiecare individ este reprezentat cu un alt simbol, iar axele de trend corespund codului de
culori. Se observ o variaie a unghiului dintre trendline i axa ox.
S-a observat o legtur ntre nclinarea axei dintre CC i concentraiile de ADN extras
per individ i vrsta acestuia. Ecuaiile axelor de trend sunt notate n tabelul 2, ordonate cresctor
dup panta lor. Astfel, axele cele mai orizontale sunt ale datelor de la indivizii M3-B i M160-
L, de 26-70, respectiv 26-39 ani. La individul L, ns, graficul a fost trasat din doar dou puncte,
deci e probabil ca unghiul trendline-ului s fie mai mare n realitate. Aadar vrsta lui de maxim
39 de ani nu ar mai contrazice teoria propus aici. n ordinea cresctoare a unghiurilor trendline-
urilor urmeaz indivizii M7-G i M11a-H care au vrstele cuprinse ntre 33-42 respectiv 21-53
ani. Urmtoarele drepte sunt ale indivizilor M115A-K i M2-A, aproximai ca avnd 20+ i 20-
23 de ani. Urcnd nspre vertical, urmeaz dreptele indivizilor M4-C i M6-F, de 15-25 respectiv
17-19 ani. Dreapta cu cea mai mare pant din aceast serie de drepte este cea a individului M5b-
E, infans. Exist i dou axe puternic deviate, unde relaia dintre CC i concentraia de ADN este
invers, dar acestea aparin tot unor copii i unghiul de nclinaie e n continuare dependent de
vrsta lor: M5a-D avnd vrsta de 11-15 ani i M11b-J de 7-12 ani. Aadar, fie individual infans,
fie cei doi copii prezint erori de la modelul urmat n acest grafic. Oricum, este important de
subliniat aceast legtur n cazul fiecrui individ, ntre unghiul de nclinaie al axei dintre
valorile CC i concentraie, legtur ce poate reda informaii privind vrsta individului.
Tab.2. Ecuaiile dreptelor de trendline ale funciilor dintre valorea CC i concentraia ADN pentru
fiecare individ studiat, i vrsta atribuit indivizilor prin metode antropologice i antropometrice.
Datele sunt ordonate cresctor dup valoarea pantei dreptei.
Individ Ecuaia dreptei Vrsta
B y = -0.0075x + 10.43 26-70
L y = 0.0427x + 5.2831 26-39
G y = 0.0819x + 4.5159 33-42
H y = 0.0944x + 9.2929 21-53
K y = 0.1191x + 10.716 20+
A y = 0.3105x - 0.4069 20-23
C y = 0.3502x + 9.7025 15-25
F y = 0.3749x + 3.514 17-19
E y = 0.9444x + 14.056 bebe
D y = -0.9112x + 54.206 11-15
J y = -0.1399x + 21.16 7-12
La indivizii tineri coninutul de colagen este mult mai mare raportat la cantitatea de
ADN, n comparaie cu cazurile de oseminte adulte, unde valoarea CC crete mai lent cu
creterea concentraiei de ADN. Probabil explicaia const n strnsa relaie dintre fraciunile
mineral i organic ale osului. Cu ct un individ este mai avansat n vrst, oasele i sunt mai
mineralizate, iar la momentul morii acest element pare s aib un efect de protejare a ADN. La
indivizii foarte tineri, coninutul de colagen raportat la cel de hidroxiapatit este mai mare, de
unde i valori superioare ale indicelui CC, dar cantitatea de ADN ce supravieuiete trecerii
timpului este redus, posibil din cauza lipsei proteciei minerale.
Dintr-o reprezentare grafic a intervalelor de vrst determinate prin standarde
antropologice i a valorii pantei axelor obinute din graficul CC-concentraie ADN, se obine
figura 11. Cu negru sunt reprezentate intervalele de vrst conform analizei antropologice, cu
maximul la 70 de ani, iar cu albastru sunt valorile pantelor axei de trend pentru fiecare individ,
ordonate descresctor. ntre indivizii K-B, valorile pantelor scad aproximativ liniar, aa c s-a
considerat c diferena de vrst ntre ei este una cu variaii mici. La fel este cazul i ntre
indivizii F-C-A, ns diferena de vrst dintre individul F (17-19 ani) i infans E este brusc.
Pentru a completa acest grafic pn la o liniaritate pe tot intervalul este necesar investigarea
unui numr mai mare de indivizi tineri. Exist posibilitatea ca n zona de sub 18 ani relaia
vrst-pant s nu mai fie liniar, ci exponenial, ns asta nu se poate clarifica deocamdat.
Poate din acest motiv indivizii J i D (7 12, respectiv 11 15 ani) prezint deviaii att de
puternice de la grafic. Considernd, aadar, o relaie de liniaritate, s-au trasat (cu albastru) drepte
paralele cu dreapta de variaie a pantei, drepte care ndeplinesc condiia de a trece prin toate
intervalele de vrst determinate clasic. Pe baza acestui grafic s-au dedus vrstele cele mai
probabile ale indivizilor dintre 17 i 90 de ani. Valorile deduse se regsesc n tabelul din figura 7.
Vrsta estimat
Individ prin metoda
descris
F 17-19
C 19-21
A 21-23
K 30-35
H 32-36
G 33-37
L 34-39
B 36-40
Fig.7. A. Metoda de deducie a vrstei indivizilor pe baza pantei funciei CC-concentraie ADN. Cu
negru sunt reprezentate intervalele de vrst deduse prin metode antropologice. Cu albastru sunt
valorile pantelor funciilor corespunztoare fiecrui individ. Prin trasarea unor drepte paralele cu
valorile pantelor astfel nct acestea s se intersecteze la fiecare individ cu intervalul dedus anterior,
se pot obine intervale mult mai restrnse ale vrstei indivizilor B.
Excepii ale valorilor indicilor FTIR la oasele de copii

n cutarea corelrii dintre indicii FTIR i concentraia de ADN extras din diferite tipuri
de oase, n cazul coastelor i a oaselor craniului s-a observat o anomalie. Figura 8 arat indicii
C/P i CC n relaie cu concentraia de ADN din coastele diferiilor indivizi. Punctul unde apare
o cretere a valorilor indicilor corespunde osemintelor unui individ nou nscut.
5
(coaste)
4
2 C/P
1 CC
0
K9 E45 F56 D56 G67 A8
Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)
Fig.8. Indicii C/P i CC n relaie cu concentraia de ADN extras din coastele diferiilor indivizi.
Individul E, la care apare o aberaie n grafic, este un nou nscut.
Figura 9 conine valorile indicilor FTIR pentru probe preluate din oasele craniului ale
indivizilor investigai. Se poate observa creterea valorilor C/P i CC i scderea lui IRSF fa de
restul probelor n dou cazuri. Individul E (M5b) este acelai nou nscut evideniat n graficul
anterior, iar individul D (M5a) este un copil de 11-15 ani. Restul indivizilor reprezentai n aceste
dou grafice au vrste mai mari (Tabel 3).
(craniu)
IRSF
C/P
CC
2
23
23
K3
F2
A3
B3
A2
B2
34
34
G
H
E1
12
12
C
D
Concentraii cresctoare de ADN (ng/ul)
Fig.9. Indicii FTIR n relaie cu concentraia de ADN extras din oasele craniilor. Probele aparinnd
indivizilor D (M5a) i E (M5b) prezint aberaii fa de trendline.
Tab.3. Vrstele indivizilor reprezentai n figurile 12 i 13. Cu rou sunt ncadrate probele care
prezint anomalii de la grafic. Cu verde e evideniat proba care n oasele craniului prezint
diferene de la linia general dar n coast nu.
Proba Concentraia Vrsta Proba Concentraia Vrsta
ADN (ng/ul) individului ADN (ng/ul) individului
K9 4.8 20+ K3 0.4 20+
E45 11.8 nou nscut E123 1.6 nou nscut
F56 38.6 17--19 H23 2 21--53
D56 40.3 11--15 F2 2.6 17--19
G67 55.7 33--42 C1234 3.7 15--25
A8 71.1 20--23 D1234 5.1 11--15
A3 31.2 20--23
B3 33 26--70
G3 46.7 33--42
A2 52.4 20--23
G2 53.8 33--42
B2 78.2 26--70
Oasele craniului au prezentat o cretere a valorilor C/P i CC la indivizi sub 15 ani, efect
observat la oasele costale doar la indivizi sub 11 ani. Prin diferena de osificare ntre anumite
oase ale corpului i prin compararea cu date de osteologie juvenil se poate determina vrsta
unui individ la momentul morii. Rezultatele acumulate aici sunt insuficiente pentru formarea
unui etalon complet, dar indic spre o metod alternativ de determinare a vrstei la oasele
arheologice, acolo unde rmiele umane sunt incomplete, lipsind markeri eseniali ai
determinrii vrstei. Desigur, pentru o analiz comprehensiv, sunt necesare mult mai multe
probe dect am avut noi la dispoziie i indivizi aflai n etape ale vieii mai apropiate ntre ele,
pentru a forma o linie continu. Probele ar trebui alese astfel nct s se urmreasc toate oasele
corpului, mai puin prile de articulaii care deja sunt folosite n analiza antropologic la
determinarea vrstei, unde analiza ar fi redundant.
S-au mai fcut ncercri de corelare a vrstei cu proprieti ale spectrelor FTIR a oaselor
i s-a artat c odat cu naintarea n vrst are loc o intensificare a mineralizrii n esuturile
osoase animale (Alvarez-Lloret i colab., 2006).
Valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN, n funcie de tipul de os

Pentru a diferenia oasele cu cea mai mare ans de izolare a ADN, s-au calculat valorile
medii ale indicilor FTIR i ale concentraiilor de produs extras (Tabel 4). Cea mai mare cantitate
de material genetic a fost extras din probele de os spongios din corpurile vertebrale (50-60
ng/l), urmat de coaste (~45-50 ng/l) i de osul spongios al oaselor scurte i al epifizelor
testate (~40-46 ng/l). Urmeaz osul compact al diafizelor, cu valori ale concentraiei de
aproximativ 30-34 ng/l i osul craniului, cu ~28-33 ng/l. Valoarea mai mic a mediilor s-a
calculat folosind toate datele disponibile, iar cea mai mare ( Media ) s-a obinut eliminnd
valorile extreme ale unui individ, unde probabil diferena a rezultat dintr-o eroare de manipulare
n etapa de extracie.
Indicele CC se refer la coninutul de material organic dintr-un os. Valorile minime
(~0.11) s-au gsit la oasele nchise (diafize i craniu) acolo unde i cantitile de ADN extras au
fost cele mai mici, iar oasele spongioase i coastele au valori mai mari ale CC (0.15-0.18).
Explicaia ar fi faptul c n oasele spongioase exist contaminare cu material organic microbian.
n ciuda msurilor luate pentru a distruge urmele de ADN exogen, e foarte probabil ca n spaiile
din interiorul esutului spongios curarea s nu fi fost destul de eficient. Probele din oasele
compacte ale diafizelor i din osul craniului au fost preluate din adncime, deoarece grosimea
esutului a permis, astfel reducnd substanial ansa ca acolo s se fi dezvoltat bacterii.
Raportul C/P se distribuie, de asemenea, n aceleai dou direcii: valorile mici (0.17)
corespund oaselor cu CC i concentraie de ADN mai mici, iar cele mari (0.21-0.25) celeilalte
categorii. Valoarea mare a carbonatrii oaselor spongioase se poate datora carbonatului din sol,
care, dizolvat n ap, a putut ptrunde mai uor n spaiile din esutul spongios dect n oasele
compacte, recristaliznd pe suprafaa apatitei.
Indicele IRSF are valori de 3.3-3.6 pentru oasele compacte i 3.1-3.2 pentru oasele
spongioase, ceea ce nseamn c mrimea cristalitelor de hidroxiapatit din oasele compacte este
superioar celei din oasele spongioase, unde, conform deduciei de mai sus, o mare cantitate de
carbonat s-a ncorporat n reeaua mineral. Carbonatul, avnd structura diferit de a fosfatului,
reduce cristalinitatea prin dezordonarea structurii, nepermind cristalului s creasc natural, deci
pstrnd o valoare mai mic a indicelui IRSF.
Valorile medii ale indicilor FTIR se potrivesc cu modelul descris n subcapitolul
Corelarea indicilor FTIR cu concentraia de ADN extras, concentraia mai mare de ADN
corespunznd probelor cu CC i C/P mai mari i IRSF mai mic, i invers. Aadar, cele mai
potrivite oase pentru extracia de ADN sunt cele compacte, groase i nedeschise, astfel, se reduce
contaminarea cu bacterii i cu alte substane chimice inhibitoare din sol. Din aceste considerente,
n continuare se vor aprofunda i compara caracteristicile tipurilor de os cranian i a unor diafize.
Tab.4. Valori medii ale concentraiilor de ADN extras i ale indicilor FTIR pe grupe de oase.
Conc ADN (ng/ul) CC C/P IRSF
Media Media Media Media Media
50.707 59.063 0.158 0.214 3.243

Vertebre - S
44.812 50.528 0.184 0.231 3.199

Coaste
40.4 46.114 0.187 0.254 3.109

Spongios
29.469 34.363 0.114 0.177 3.37

Diafize - C
28.223 33.171 0.115 0.176 3.623

Cranii
Oasele craniului
n cadrul osului craniului se disting straturile de os spongios i compact. S-au comparat
valorile indicilor FTIR i concentraia de ADN extras pentru cele dou tipuri de esut cranian la
civa indivizi, unde starea de reprezentare a permis acest lucru. La oasele indivizilor foarte
tineri, osul craniului este prea subire pentru a putea prelua cele dou tipuri de probe ntr-un mod
precis. Concentraia de ADN obinut din probele de os cranian compact i spongios se coreleaz
pozitiv cu valorile C/P i CC i negativ cu valoarea indicelui IRSF, corespunznd observaiilor
fcute mai sus (Figura 10). n grafic, datele sunt reprezentate relativ i nu ca valori absolute,
pentru a arta relaia ntre probele aparinnd aceluiai individ. Datele exacte sunt prezentate n
tabelul 5. Rndurile gri deschis reprezint oase compacte, iar cele gri nchis sunt oase
spongioase. Valorile foarte mici ale concentraiei ADN de la individul K le-am atribuit unei
greeli de manipulare n etapa de extracie, de aceea le-am eliminat de la calcularea valorilor
medii (mai sus), dar am considerat c pierderea a fost proporional la toate probele, deci n
discuia comparrii datelor intra-individual, rezultatele se pot lua n considerare.
(craniu)
Conc
IRSF
C/P
CC
A.C A.S B.C B.S K.C K.S G.C G.S
Fig.10. Corelarea direct ntre concentraia de ADN extras i indicii CC i C/P i corelarea lor
invers cu IRSF, la indivizii A, B, K. Individul G prezint o neconcordan cu restul rezultatelor
observate. A = individul M2, B = individul M3, K = individul M115A, G = individul M7, C = os
compact, S = os spongios. Indicii nu sunt reprezentai n valori absolute.
Tab.5. Valorile concentraiei ADN extras din poriunea compact (gri deschis), respectiv
spongioas (gri nchis) a oaselor craniene de la indivizii A, B, G i K, i valorile indicilor FTIR
corespunztori.
Individ Conc (ng/l) IRSF C/P CC
A 52.4 3.803 0.139 0.045

31.2 4.034 0.1 0.038
78.2 3.63 0.159 0.136
B
33 3.876 0.138 0.104
53.8 3.791 0.129 0.048
G
46.7 3.791 0.136 0.056
1.6 3.323 0.174 0.145
K
0.4 3.633 0.156 0.068
Dintre indivizii studiai, unul singur (M7-G) nu se supune modelului: n acest caz, indicii
FTIR au avut valorile IRSF i C/P aproape identice pentru osul spongios versus cel compact, iar
CC a fost invers proporional cu concentraia de ADN extras. Probabil c osul compact a suferit
o fosfatizare concomitent cu o decarbonatare, ceea ce a dus la scderea indicilor CC i C/P i la
creterea IRSF. Mormntul M7 are ntr-adevr o deosebire major fa de celelalte din
necropol, i anume prezena unor brne de lemn i a ocrului. Este posibil ca materialul organic
vegetal suplimentar s fi fost legat preferenial de carbonatul din vecintatea scheletului i astfel
exteriorul craniului s fie mai puin carbonatat dect stratul spongios profund.
n figura 11 sunt reprezentate spectre ale diferenei dintre spectrul osului compact i cel al
osului spongios pentru fiecare din indivizii testai. Spectrele explic datele prezentate n figura
10. Se observ diferena mare ntre valorile indicelui CC la individul K, prin nlimea peak-ului
amidei I n spectru i egalitatea indicilor la individul G, unde spectrul de diferen nu are un vrf
. n ceea ce privete indicele C/P, diferena se manifest la nivelul peak-ului fosfatului: pentru
indivizii A, B i K valoarea diferenei absorbiei ntre compact i spongios este o valoare
negativ, pe cnd la individul G osul compact are un coninut de fosfat mai mare dect cel
spongios. i pentru IRSF (cu detaliu n medalion) diferena se poate arta de pe spectru: la
individul A zona de diferen a spectrelor corespunztoare peak-ului despicat arat ca litera W,
i n contrast, la individul G spectrul este invers, ca un M.
Fig.11. Diferena dintre spectrele de absorbie ale osului compact i spongios pentru indivizii A, B,
K i G. Se observ diferenele de la nivelul amidei I, al carbonatului i fosfatului i din zona de
calcul a indicelui de cristalinitate IRSF, care se vede n detaliu n medalion.
Diafize
S-a comparat randamentul extraciei de ADN din osul compact a unor diafize degradate
diferit, aparinnd aceluiai individ. n cazul individului M7-G, indicii i concentraia de ADN
sunt n relaie identic cu a cazurilor prezentate mai sus i n concordan cu atribuirea vizual a
caracterului de degradare (Figura 12A). i pentru diafizele individului M3-B, concentraia ADN
extras a coincis cu degradarea macroscopica a osului (Figura 12B, Tabel 6), ns valorile
indicilor nu au corespuns: IRSF i CC au fost aproape identice pentru cele dou oase, iar C/P fost
inversat (Tabel 6). Totui, faptul c aici indicii FTIR nu aduc mult ajutor n alegerea osului mai
potrivit pentru extracie, este normal s alegem osul mai puin degradat dac urmrim purificarea
de ADN.
A
CONC
IRSF
C/P
CC
G9 G14
Fig.12. A. Corelarea dintre concentraia ADN extras din dou diafize ale individului M7-G (proba
G9 mai slab conservat dect proba G14) i indicii FTIR pentru oasele respective. B. Fotografie a
probelor din individul M3-B, unde proba B8 este vizibil mai bine conservat dect proba B11.
Tab.6. Valorile concentraiei ADN extras din probele de os compact lung pentru indivizii B i G i
ale indicilor FTIR n oase cu grade de degradare vizibil diferite. Pe rndurile gri deschis sunt
probele mai slab conservate i pe rndurile gri nchis sunt probele mai bine conservate.
Concentraie(ng/ul) IRSF C/P CC
B11 35 3.554 0.165 0.082
B8 111.8 3.505 0.144 0.084
G9 54.9 3.421 0.152 0.093
G14 77.3 3.189 0.189 0.146
Extracia de ADN vechi

ADN-ul extras din probe arheologice este puternic degradat. Dup cum se vede n Figura
13, majoritatea materialului extras are lungimi sub 50 pb. Primele dou probe sunt extrase din
oasele craniului, compact i spongios. Toate celelalte probe (din corp vertebral, coast, dou
diafize compacte i o epifiz spongioas) prezint urme majore de contaminare cu ADN modern,
n partea de sus a gelului. ADN modern nu este la fel de degradat, deci nu migreaz la fel de
repede n gelul de agaroz. Contaminarea este cel mai probabil de origine microbian, n probele
extrase din os spongios fiind mult mai evident. Blankul de extracie nu conine ADN.
Fig.13. Gel de agaroz 2% cu ADN vechi extras din probe de os. Banda inferioar a
markerului are 50 pb.
Determinarea inhibitorilor PCR co-extrai cu ADN antic
Este un fapt bine cunoscut n literatur c ADN extras din probe antice conine inhibitori
ai PCR, ceea ce constituie o mare problem. Chiar i la adugarea unui l de extras ADN ntr -un
PCR cu ADN modern, reacia este inhibat (Kalmar i colab., 2000). S-a ncercat deducerea
substanelor ce rmn n extrasul de ADN i inhib reaciile ulterioare, pentru a putea dezvolta o
metod eficient i direcionat de purificare. Prin compararea spectrelor de absorbie FTIR (de
fapt de Transmisie) ale probelor de ADN extras cu ale substanelor folosite n etapa de extracie
ADN (sursa: chemicalbook.com), s-au exclus fenolul i cloroformul dintre potenialii inhibitori
(Figura 14). n intervalul 3000 1700 cm-1, fenolul are cteva peakuri care n probele noastre nu
apar, iar cloroformul are un peak puternic la 800 750 cm-1, peak ce nu se observ n probe.
Fig.14. Evidenierea diferenelor dintre spectrele de absorbie n IR ale fenolului (gri deschis) i
cloroformului (gri nchis) n comparaie cu spectrul specific al ADN antic extras (jos). Cu rou sunt
marcate peak-urile care infirm prezena acestor substane n produsul extras.
Substanele folosite n soluia de decalcifiere au fost de asemenea verificate prin

compararea spectrelor individuale (chemicalbook.com) cu spectrul probelor obinutue prin
extracie. SDS-ul iese din calcul din cauza peak-ului puternic de la 3000 2700 cm-1 i TRIS-ul
datorit peakului ngust de la 1040 cm -1. n schimb, EDTA pare s corespund spectrului de
absorbie al probelor investigate, avnd un peak puternic la 1600 cm-1, i mai multe mici ntre
1400 1000 cm-1, la fel ca probele de ADN extras (Figura 15).
Fig.15. Comparaie a spectrelor SDS (gri pal), EDTA (gri) i TRIS (gri nchis) cu al ADN-ului
antic extras (jos). Marcate cu rou sunt peak-urile care dovedesc absena SDS i TRIS n produsul
de extracie. Cu verde e evideniat EDTA, cu un spectru asemntor cu al probei.
Aadar, se pare c substana care rmne n probele de ADN i inhib amplificarea prin
PCR ar putea fi EDTA, un cunoscut inhibitor al polimerazei, ce acioneaz prin chelatarea ionilor
de magneziu, necesari enzimei pentru funcionare.
Pe lng culoarea maronie a probelor obinute, s-a observat c extractul de ADN are
fluorescen albastr n UV (Figura 16). Pe lng aceste dou observaii, Pbo spunea c
probele de ADN antic extras au un miros plcut, dulciu (2014). Aceste indicii conduc nspre
existena n probe a produilor Maillard.
Fig.16. Gel de agaroz n UV, pe care s-a migrat ADN antic. Se observ fluorescena albastr.
Produii Maillard copurificai cu ADN antic pot fi de origine endogen (din condensarea
colagenului cu zaharuri) sau pot proveni din sol. Principala component organic a solului sunt
acizii humici (Figura 17), molecule organice complexe de origine abiogen, ce se formeaz de-a
lungul timpului, prin reacie Maillard ntre molecule de resturi organice rmase n sol. n plus,
acizii humici sunt cunoscui ca fiind inhibitori ai polimerazei n PCR. Figura 18 arat spectre de
absorbie n IR ale unor acizi humici. Primele 2 casete conin imagini preluate din literatur,
caseta C conine spectrele IR ale acizilor humici conform chemicalbook.com, iar caseta D
conine spectrul de absorbie al probei G9 de ADN extras din os. Complexitatea i variaia
structurii chimice a acestor molecule duce la diferene n spectru n funcie de proprietile
solului din care provin. n plus, n probele studiate aici, acizii humici sunt n amestec cu ADN,
care contribuie i el cu mici diferene la proprietile spectrale, iar posibilitatea ca i EDTA s fi
fost copurificat nu trebuie omis.
Fig.17. Formula chimic general a acizilor humici.
Fig.18. Spectre de absorbie n IR ale unor acizi humici. A dup Rodriguez i colab., 2009; B
dup Fong i colab., 2006; C chemicalbook.com; D proba G9 de ADN extras din os.
nlturarea produilor inhibitori din extractul de ADN

S-a ncercat purificarea ADN-ului extras cu kitul SureClean Plus de la Bioline, dar fr
a folosi co-precipitantul roz, care ar fi putut da semnale spectrale care s interfereze cu
interpretarea datelor, i la UV i n IR. Diferena dintre spectrele de absorbie n IR ale probelor
nainte i dup purificare se poate observa n figura 19, unde spectrul de sus, negru, arat
transmitana probei D1 nainte de purificare, spectrul rou dup purificare, iar spectrul albastru
este diferena celor 2 spectre, fiind o vizualizare a cantitilor i tipurilor de contaminani
nlturai. Colorarea maronie a probelor a fost redus sau nlturat prin folosirea kitului, iar
spectrele confirm nlturarea unei pri din contaminani.
Fig.19. Spectrele de absorbie n IR ale probei D1, nainte i dup purificarea cu kitul SureClean
Plus de la Bioline (spectrul negru, respectiv rou) i diferena dintre acestea (spectrul albastru). Se
observ c peak-ul puternic de la 1600 cm-1 i peak-urile mai mici dintre 1400 1100 cm-1 dispar.
Valorile concentraiei de ADN citite prin spectrometrie UV nainte i dup etapa de

purificare ar trebui s fie corelate liniar, aa cum este n cazul probelor aparinnd indivizilor D
i G (Figura 20.1), dar nu ntotdeauna relaia se pstreaz (Figura 20.2). La indivizii A i B nu
exist o corelare ntre concentraiile ADN citite la spectrofotometru pentru fiecare prob. Se
poate ca din cauza faptului c nu s-a folosit co-precipitantul roz, ADN s fi fost aruncat din
anumite probe, astfel explicnd necorelarea. Cantitatea de ADN n aceste probe este prea mic
pentru a se forma un pellet vizibil, crescnd posibilitatea aruncrii materialului genetic. O alt
explicaie ar putea fi legat de degradarea ADN, fragmentele sub 100 pb fiind eliminate de kit.
Deci, dac o anumit prob coninea un raport mai mare de fragmente sub 100 pb, concentraia
de ADN dup purificare trebuie s fi sczut mai mult dect la o prob cu puine fragmente mici.
Concentraia ADN dup
Concentraia ADN dup

G
purificarea produilor
purificarea produilor
D B
0 50 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0 00Concentraia
00 00 00 00ADN nainte
00 00 00 00de
00 00 00 Concentraia ADN nainte de
purificarea purificarea
Fig 20.1. Corelarea liniar a concentraiilor de ADN nainte i dup purificarea cu kitul SureClean
Plus de la Bioline. 2. Probe pentru care corelarea liniar nu s-a pstrat.
Efectele etapei de purificare asupra randamentului PCR

Nu s-a reuit creterea randamentului PCR prin purificarea cu kitul SureClean Plus de la
Bioline. Urmeaz s se ncerce i alte metode de purificare a ADN, cum ar fi precipitarea cu
izopropanol (Hnni i colab., 1955), sau introducerea n procesul de extracie a PTB (N-
phenacylthiazolium bromide), substan ce inverseaz reaciile Maillard.
Nici creterea concentraiei de MgCl 2 pn la 2.5 mM, i nici reducerea concentraiei
amorselor pn la 0.5 pmoli/l nu au avut efect pozitiv asupra reaciei de amplificare. Folosirea
adjuvanilor, ca BSA i 2x Polymate Additive TM (Bioline) nu au reuit s contracareze efectul
inhibitor al compuilor copurificai. S-au ncercat diferite diluii ale ADN, dar rezultatul a fost
ntotdeauna negativ. Pe toate gelurile s-au vzut dimeri de amorse, la ~50pb.
Totui, faptul c probele au fost curate eficient de compuii Maillard prin metoda
adoptat (dup cum demonstreaz rezultatele prezentate n lucrarea de fa) se contrazice cu
nereuita tuturor ncercrilor de a mbunti randamentul PCR. Se poate ca ntr-adevr ADN s
fie att de puternic degradat, nct reacia nu are matri de lungimea potrivit de la care s
porneasc, avnd n vedere faptul c populaia studiat aici are 4500 de ani vechime (conform
datrii radiometrice). Prin comparaie, la un individ ce dateaz din secolele IV V d.Cr (Rusu-
Bolinde i colab., 2014), deci cu o vechime de aproape o treime din cea a populaiei de la
Mireasa, s-au putut efectua amplificri ale fragmentelor HVR1 A, B, C, i D, folosind aditivii
BSA sau Polymate, cu 2.5 mM MgCl2 i o diluie a ADN matri de 1:30. Produsul de extracie
de la acest individ nu a fost purificat, dar tot a dat rezultate, n ciuda colorrii maronii. Aadar, se
pare c timpul petrecut de oseminte n sol are o influen asupra randamentului experimentelor
ulterioare, mai ales cnd diferenele de perioade sunt att de mari. Pentru indivizi datai la
intervale de timp apropiate, factorii de mediu sunt decisivi n procesul de diagenez, dar aici
diferena de vrst i spune cuvntul.
CONCLUZII
O comparaie ntre valorile indicilor FTIR la indivizi diferii nu se poate face n mod
relevant, fiecare dintre ei suferind un grad de diagenez diferit, n funcie de condiiile din
imediata vecintate. Se pot compara doar oase ale aceluiai individ pentru a alege varianta
optim pentru o extracie ulterioar.
n general, se recomand extragerea de ADN din oase lungi sau ale craniului, din zone
groase de os compact, care nu au fost deschise, deci au anse mult mai mici de contaminare, i n
niciun caz din oase spongioase, care dei par s conin mai mult ADN, acesta e n mare parte de
origine exogen, bacterian cel mai probabil.
O legtur impresionant s-a observat ntre valorile indicilor FTIR i vrsta indivizilor la
moarte. Astfel de tehnici pot veni cu mult n ajutorul metodelor clasice de atribuire a vrstei.
S-au identificat compuii colorai din extrasul de ADN, puternici inhibitori ai PCR, ca
fiind acizi humici, probabil n amestec cu EDTA.
Prin purificri suplimentare ale ADN se poate reduce cantitatea de substane coextrase
nedorite care inhib PCR, dar apare i riscul reducerii cantitii de material genetic din probe.
La populaia de la Mireasa, datnd din epoca Bronzului, nu s-a reuit amplificarea nici
unui fragment de ADN mitocondrial, motivul cel mai probabil fiind vechimea oaselor.
Studiul II.
Diagnosticul molecular al tuberculozei la o populaie gotic din Gherseni,
Romnia
Din necropola de la Gherseni, judeul Buzu, au fost deshumai doi indivizi, notai M3 i
M4, despre care s-a presupus c au fost afectai de boala lui Pott (tuberculoz osoas). Pentru c
au trit n aceeai perioad, o boal infecioas ar putea uor s explice distribuia acelorai
simptome ntr-o comunitate restrns. Dat fiind lipsa dovezilor patognomotice, scopul acestei
lucrri experimentale a fost confirmarea sau infirmarea prin metode moleculare a prezenei
tuberculozei. Lumea tiinific este preocupat de secvenarea ADN-vechi provenit din
organisme patogene deoarece astfel se poate identifica rata mutaiilor n situsuri implicate n
patogenitate. Dat fiind dezvoltarea n ultimele decenii a tulpinilor MDR i XDR de M.
tuberculosis, este important identificarea mecanismului de achiziie a rezistenei la antibiotice.
Dei experimentul n discuie nu va putea rspunde la aceast ntrebare, el i propune s
confirme existena tuberculozei n acea populaie antic i astfel va pune bazele unui studiu mai
aprofundat.
Analiza antropologic
Analiza antropologic s-a realizat pe baza unor standarde de antropologie fizic pentru
exist grile de atribuire a scorurilor pentru fiecare marker osteologic (Brickley i McKinley,
2004). Vrsta este determinat folosind suturile craniene, uzura suprafe ei auriculare i a simfizei
pubiene. Pentru stabilirea sexului se iau n calcul: markerii cranieni: glabela, protuberana nucal
i mental, linia supraorbital, procesul mastoid; markerii pelvieni: arcul ventral, concavitatea
subpubiana, aspectul ramurii ischiopubiene i al sulcusului. Se pot semnala i unele patologii
care afecteaz osul, dar toate caracterele determinate prin antropologie fizic sunt probabilistice.
n afar de vrst, celelalte ipoteze pot fi confirmate prin metode moleculare.
Pstrarea condiiilor de sterilitate

Pentru a se evita contaminarea probelor cu ADN-modern sunt urmate reguli stricte de
procedur n laboratoare. Etapele de burghiere a osului, extracie de ADN -vechi i amplificare
prin PCR i electroforez, sunt separate fizic, realizndu-se n laboratoare diferite. Toate
laboratoarele de ADN-vechi se afl la un etaj al institutului unde nu exist laboratoare n care s
se lucreze cu ADN-modern. Cele trei laboratoare de ADN-vechi sunt dotate cu filtre cu UV i
lmpi de UV. Filtrele funcioneaz non-stop iar lmpile de UV sunt pornite pe timpul nopii dar
i n timpul zilei atunci cnd se ncheie munca la un individ i se trece la altul. Se lucreaz n
hote cu presiune pozitiv i lmpi cu UV. Personalul este echipat cu combinezo ane, mti cu
filtru, mnui. Exist un circuit al personalului, astfel c nu se intr n laboratorul de extracie
dup ce s-a lucrat n cel de PCR.
Analiza FT-IR (Fourier transform infrared spectroscopy)

Probele pentru analiza FT-IR au fost prelevate din vertebre i coaste, zone preponderent
afectate de tuberculoz. n plus, s-au testat probe din oasele lungi (ex. radius) ca i control
negativ. 0,8 mg pudr de os s-au amestecat cu 150 mg KBr i s-au mojarat folosindu-se mojar i
pistil din agat. Proba se comprim cu ajutorul unei prese hidraulice pn la presiunea de 175
kg/cm2 pn cnd se formeaz o pastil translucid. n urma spectroscopiei se obine un spectru
ntre numerele de und 400 - 4000 cm-1. Pentru fiecare prob s-a fcut blank-ul cu o prob
compus doar din Kbr iar baseline-ul a fost corectat. Dup prelucrarea fiecrei probe s-au cutat
semnalele specifice date de acizii micolici. Oasele pentru extracia ADN au fost selectate pe
seama spectrului FT-IR. Pentru fiecare prob s-a calculat indicele de cristalinitate (infrared
splitting factor) ca raportul dintre absorbanele (A) la numerele de und (A565+A605)/A588.
Aceast valoare este important pentru c se afl n corelaie cu dimensiunea cristalelor de
hidroxiapatit. S-a calculat i raportu l dintre carbonat/fosfat (A1415/A1035) care ne spune ct
anume din carbonat s-a pierdut, probabil n urma dizolvrii n sol. Cantitatea de colagen pstrat
n oase se poate deduce pe seama raportului A1660-A1645/A1035. Aceast valoare este
proporional cu cantitatea de ADN-endogen pstrat. Toate aceste valori se folosesc atunci cnd
se alege o prob de os pentru extracia ADN.
Protocolul de extracia al ADN-vechi

Decontaminarea
Probele alese pentru extracia ADN-vechi au fost tratate pentru a ndeprta contaminarea
cu ADN modern de la suprafata oaselor. Oasele au fost splate cu ap UV/UP, uscate i iradiate
pe fiecare parte cu UV pentru 20 min. Suprafaa osului a fost ndeprtat cu o frez dentar
steril i osul a fost iradat pentru nc 10 min.
Decalcifierea i ndeprtarea colagenului de tipul I
Osul decontaminat a fost transformat n pulbere cu ajutorul unei freze dentare sterile i a
unui micromotor rulat la vitez mic pentru a se evita degradarea ADN-vechi prin nclzire. 200
mg pudr de os au fost incubate peste noapte la 56oC cu 1mL soluie de decalcifiere (0.5 M
EDTA pH 8.08.5; 0.5% SDS; 50 mM Tris HCl pH 8.0; 1 mg/ml proteinaza K).
Extracia cu fenol-cloroform
1. Probele incubate peste noapte au fost centrifugate 5 min la 6.000 rpm.
2. S-a transferat supernatantul ntr-un tub Eppendorf nou i s -a adugat un volum egal de fenol-
cloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat.
3. Probele au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
4. S-a preluat faza apoas, fr s se ating faza organic, i s-a transferat ntr-un tub nou. S-a
adugat un volum egal de fenol-cloroform-alcool izoamilic (25:24:1) i s-a agitat. Probele au fost
centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
5. S-a transferat faza apoas ntr-un tub nou i s-a adugat un volum egal de cloroform, apoi
tuburile s-au agitat. Tuburile au fost centrifugate 15 min la 6.000 rpm.
6. Faza apoas s-a transferat ntr-un tub nou. S-au adugat 1/10 volume de CH3-COONa 3M, pH
5.2 i 2,5 volume de etanol absolut.
7. Probele au fost inute la -80oC pentru 10 min (o alternativ: 30 min la -3oC).
8. Tuburile se centrifugheaz 15 min la 12.400 rpm.
9. Supernatantul s-a ndeprtat cu pipeta, iar pellet-ul s-a splat cu 1 mL etanol 80% i a fost
centrifugat 15 min la 12.400 rpm. S-a repetat pn cnd s-a format un pellet stabil*.
*
Deoarece ADN-vechi este foarte contaminat cu substane din sol, e posibil s fie necesari mai mult de trei
pai de splare.
10. Pellet-ul a fost uscat la 37oC pentru a se ndeprta orice urm de etanol.
11. ADN a fost resuspendat n 50 L ap PCR Grade sau tampon TE.
Cuantificarea ADN-vechi extras
Cantitatea de ADN din fiecare prob a fost cuantificat prin dou metode: electroforez
n gel de agaroz i spectrofotometrie.
Electroforez n gel de agaroz

Deoarece ADN-vechi este foarte degradat i se gsete aprope n totalitate n fragmente
de 50-200 pb, s-a preparat un gel cu concentraia de 2% agaroz. 100 mL tampon TAE se
amestec cu 2 g agaroz ntr-un pahar Erlenmeyer. S-a topit agaroza folosindu-se un cuptor cu
microunde. S-a lsat s se rceasc amestecul i s-au adugat 5 L bromur de etidiu (10mg/mL)
pentru a se ajunge la concentraia final de 0,5 g/mL. ADN-vechi s-a ncrcat n godeuri. Se
migreaz cu 5-10 V/cm (distana dintre electrozi). ADN s-a vizualizat prin iradierea gelului cu
UV ntr-un transiluminator (Barbas et al., 2001).
Spectrofotometrie
Acizii nucleici absorb radiaia luminoas cu lungimea de und de 260 nm, proteinele
absorb la 280 nm iar fenolul la 230 nm. Pentru aceast analiz este necesar proba de ADN ce se
dorete cuantificat, o prob martor (apa sau tamponul TE n care s -a resuspendat ADN) i un
spectrofotometru (NanoDrop Spectrophotometer). Suprafaa optic superioar i inferioar s -a
splat cu ap UV/UP. S-a deschis software-ul aparatului i s-a selectat modulul - acizi nucleici.
Mai nti se citete o prob de ap. Apoi se citete proba martor prin adugarea a 1 -2 L pe
suprafaa optic i selectarea butonului - Blank. Apoi s-au adugat cte 1-2 L din probele de
ADN i s -a selectat opiunea - Measure. Dup fiecare msurtoare suprafeele optice au fost
splate cu ap UV/UP. Pentru o cuv cu latura de 1 cm, o soluie pur de ADN dublu-catenar cu
concentraia de 50 ng/L are densitatea optic (OD 260) egal cu 1. Pe baza acestei corelaii,
aparatul afieaz concentraia de ADN existent n probe. Valoarea optim pentru raportul
260/280 este cuprins ntre 1.8 - 2. O valoare mai mic este interpretat ca o contaminare cu
proteine, iar una mai mare indic prezena ARN sau a ADN mono -catenar (Barbas et al., 2001).
PCR (Reacia n lan a polimerazei)

Pentru confirmarea tuberculozei s-a dorit amplificarea unor secvene de ~100 pb din
locii: pncA, oxyR, IS1081 i D1. Amorsele au fost concepute de Taylor i colab. (2005) cnd au
investigat cazul de la Tarrant Hinton. Acetia au descris i condiiile de reacie (Tabelul 1 ).
Tabelul 1. Condiiile de reacie descrise de Taylor i colab. (2005)

Pentru fiecare set de amorse s-a realizat un control pozitiv folosind ADN-genomic de la
M. tuberculosis primit de la Institutul Cantacuzino, Romnia. Reaciile pentru ADN modern i
vechi s-au realizat n laboratoare diferite (aflate la etaje diferite) ale institutului pentru a se evita
contaminarea i obinerea de rezultate fals-pozitive.
Pentru c randamentul reaciilor pe ADN-vechi este sczut, pentru fiecare set de amorse
s-au realizat dou reacii succesive, la al doilea PCR folosindu -se 1 L din produsul primului.
Am adaptat reaciile crescnd temperatura de aliniere la pncA i IS1018 cu 2oC. Aceasta ne-a
ajutat c cretem specificitatea reaciilor. Am folosit BSA (albumin seric bovin), PEG
(polietilen glicol) i DMSO (dimetil-sulfoxid) ca i aditivi pentru a crete randamentul reaciei.
Pentru fiecare PCR s-au realizat 30 de cicluri.
Purificarea ADN din gelul de agaroz

Produii PCR s-au migrat n gelul de agaroz urmnd metoda descris mai sus. Etapa de
purificare a ampliconilor din gel s-a realizat cu ajutorul kitului Agarose Gel extraction Kit, Jena
Bioscience.
Clonarea produilor PCR

Aceast etap s-a realizat folosind kitul CloneJET PCR Cloning Kit, Thermo
Scientific. Am folosit protocolul de clonare cu capete boante (Blunt-End Cloning Protocol).
Prima dat s-au digerat capetelor adezive prin realizarea mixului: 2X tampon de reacie - 2 L,
H2O - 1.5 L i DNA Blunting Enzyme - 0.5 L. Amestecul s-a vortexat, centrifugat apoi s-a
incubat la 70oC pentru 5 min. Probele s-au rcit pe ghea. Reacia de ligare s -a realizat prin
adugarea la amestec a 0,5 l pJET1.2/blunt Cloning Vector (50 ng/l) i 0,5 l T4 DNA -ligase.
Tuburile s-au vortexat, centrifugat i incubat la temperatura camerei pentru 30-60 min. Pentru
clonare s-a realizat urmtorul amestec: KCM 5X - 20 L, H2O - 70 L, Produs de ligare - 10
L. Celulele competente s-au scos de la -80oC i s -au dezgheat pe ghea. 100 L suspensie de
celule competente s-au adugat la amestecul descris mai sus. Tuburile s-au pstrat pe ghea
pentru 20 min, apoi la temperatura camerei pentru nc 10 min. S-a adugat peste amestec 1 mL
mediu LB lichid. Tuburile s-au inut la 37 oC pentru 20 min. 200 L amestec s-a folosit pentru
inocularea plcilor cu agar. Acestea s-au incubat la 37oC pentru ~16 ore.
* Prepararea mediului LB (Lysogeny broth) - lichid: 25 g LB - 1000 mL H2O
- solid: 15 g agar la 1000mL H2O
- antibiotic - Ampicillin (100mg/mL) se adaug pentru un volum final de 100 g/mL.
* Prepararea KCM 5X: 2M KCl - 2.5 mL, 1M MgCl2 - 2.5 mL, 1M CaCl2 - 1.5 mL, H2O
- 3.5mL.
Pentru preculturi se toarn 5 mL mediu LB lichid cu Ampicilin n tuburi de 15 mL
pentru preculturi. Acestea se inoculeaz cu o colonie de pe placa Petri. Preculturile se incubeaz
la 37oC, cu agitare 200 rotaii/minut, pentru ~16 ore.
Purificarea de plasmide
Aceast etap s-a realizat utiliznd kitul Fast-n-Easy Plasmid Mini Prep Kit, Jena
Bioscience. ADN s-a eluat n 50 L tampon de eluie.
Secvenializarea ADN
Procedura de secvenializare a plasmidelor s -a realizat de ctre Macrogen Company,
Netherlands. Pentru reaciile de secvenializare s-au folosit amorsele specifice ale plasmidului
pJET 1.2.
Analizele bioinformatice
Produii PCR s-au identificat n interiorul secvenelor vectorilor prin cutarea amorselor
folosite la PCR utiliznd software-ul BioEdit 7.2.5. Fiecare secven s-a identificat prin
comparare cu cele existente n GenBank (NCBI) folosind instrumentul BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool) cu opiunea blastn.
n cazul genei pncA, atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosindu -se parametrul
Highly similar sequences, am schimbat parametrii algoritmului astfel: Program selection:
Somewhat similar sequences; Expect threshold: 15; Word size: 7; Match/Mismatch Scores: 2,-3;
Gap Costs: existence 2, extension 2 i s-a deselectat Low complexity regions filter. Secvenele
obinute s-au aliniat cu toate secvenele omoloage din genul Mycobacterium din baza de date
Gene folosindu-se algoritmul Muscle n Mega 5. Ca i secven outgroup s-a folosit secvena
omoloag a genei pncA de la Corynebacterium glutamicum ATCC 13032. Alinierea a fost
exportat n formatul MEGA, necesar pentru construirea de arbori filogenetici. Am rulat n Mega
5 opiunea Models - Find Best DNA/Protein Models (ML) i am stabilit c trebuie folosit
modelul evolutiv Tamura 3 cu distribuie discret Gamma.
Istoria evolutiv a secvenelor a fost calculat prin metoda Maximum Likelihood
(Tamura, 1992). Arborele final este cel cu cea mai mare valoare log likelihood (-684.5563).
Procentul arborilor n care secvenele au fost asociate n acelai cluster este afiat n dreptul
ramurilor (valoarea Bootstrap). Lungimea ramurilor este proporional cu numrul de
substituii/situs. Toate poziiile cu gap-uri au fost eliminate astfel c n setul final au fost luate n
considerare 73 de poziii. Au fost analizate n total 45 de secvene nucleotidice (Tamura i colab.,
2011).
Analiza antropologic
Din necropola de la Gherseni au fost deshumate resturile osteologice a trei indivizi. Pe
baza standardelor de antropologie fizic s-au dedus urmtoarele aspecte:
Individul M3 (M - mormnt)
a. Reprezentarea. Din craniu s-a pstrat doar calota cranian. Vertebrele cervicale,
toracale i lombare, precum i coastele, s-au pstrat n proporie de 1/3. Sternul nu este
prezent. Dintre oasele lungi se pstrez partea proximal a humerusului de pe partea
stng, partea distal a celui de pe dreapta, regiunea medial i proximal a radiusului de
pe dreapta. Omoplatul drept este mai bine reprezentat dect cel stng. Clavicula de pe
partea dreapt este ntreag.
b. Conservarea. n general suprafaa oaselor arat bine, iar conservarea a primit scor
maxim.
c. Sexul. Patru din cei 5 markeri osteologici cranieni lipsesc (glabela, creasta nucal,
marginea supraorbital, mentonul). Mastoida a fost notat cu scorul 2 (1-feminin; 5-
masculin), valoare corelat cu genul feminin. Niciunul din markerii pelvieni nu este
reprezentat.
d. Vrsta. Markerii osteologici lipsesc. Aspectul general spune c individul a ajuns la
maturitate.
e. Patologia. Se observ o artroz puternic pe partea proximal a humerusului stng.
Artroza a afectat i vertebrele cervicale i toracale, ducnd la distrugerea plato ului
superior i inferior. Dou din vertebrele toracale sunt unite - corpurile vertebrale lipsesc
dar procesele spinoase se pstreaz (Figura 1). Procesele spinoase sudate, o vertebr
cervical i dou coaste (stnga i dreapt) au fost supuse analizelor fizice i moleculare.
Figura 1. A. Epifiza proximal a humerusului stng afectat de artroz; B. Apofizele spinoase a dou
vertebre toracale sudate ntre ele; C. Platouri vertebrale afectate de artroz; D. Faa anterioar a unei
vertebre cervicale afectat de artroz.
Individul M4
a. Reprezentarea. Pentru c scheletul este aproape complet vom meniona doar oasele
care lipsesc: oasele minii (dreapta i stnga), vertebrele cervicale C1, C3, C5 i toracale
T1, T12, ischiumul i pubisul, femurul stng, patelele, talusul i calcaneul (dreapta i
stnga), oasele labei piciorului (dreapta).
b. Conservarea. n general conservarea este foarte bun.
c. Sexul. Scorurile acordate markerilor osteologici sunt prezentai n Tabelul 2. Se
presupune c individul avea genul feminin dar acest aspect urmeaz a fi clarificat prin
tehnici moleculare.
Tabel 2. Scorurile acordate individului M4 markerilor osteologici asociai genului.

CRANIU Scor (1=; 5=) PELVIS Scor (1=; 9=)
Creasta nucal 3 Concavitatea subpubian 4
Mastoida 3 Unghiul subpubic -
Marginea supraorbital 3 Ramura ischio-pubian 2
Glabela 3 Arcul ventral 6
Mentonul 4 Arcul compozit 7
Incizura sciatic 7
Sulcusul preauricular 9
d. Vrsta. Vrsta individului s-a estimat pe baza markerilor din Tabelul 3 ca fiind
cuprins ntre 38-58 ani.
Tabel 3. Estimarea vrstei individului M4 pe baza markerilor osteologici.
Marker osteologic Vrsta estimat
Capetele sternale 43-58
Simfiza pubian 38
Suprafaa auricular 45-47
Sinostoza suturilor 45-56
Uzura dentar 40-45
e. Patologia. Se observ sudarea urmtoarelor perechi de vertebre: C6 i C7, T7 i T8,

T10 i T11. Platoul inferior al vertebrei lombare L5 este complet distrus, la fel i platoul
superios la S1. n aceste regiuni esutul compact lipsete iar cel spongios este expus
(Figura 2). Aceste modificri s-a presupus c ar fi cauzate de boala lui Pott (tuberculoz
localizat n oase).
Figura 2. Probe din care s-a extras ADN pentru confirmarea diagnosticului de tuberculoz. A. Vertebra
L5 cu platoul inferior distrus n comparaie cu (B) o vertebr sntoas; C. Vertebre toracale sudate
versus dou vertebre dispuse anatomic.
Individul M5
a. Reprezentarea. Din individul M5 se pstreaz n mic msur calota cranian,
vertebrele toracale, lombare i coastele. Manubriul este ntreg dar din corpul sternal s -a
conservat doar jumtatea superioar. Omoplatul drept este ntreg, la fel ca i humerusul ,
radiusul i ulna de pe partea dreapt. Clavicula stng este prezent n ntregime.
b. Conservarea. Oasele sunt conservate foarte bine, avnd scor maxim.
c. Sexul. Se pstreaz un singur marker osteologic asociat sexului, creasta nucal, creia i
s-a acordat scorul maxim masculin.
d. Vrsta. Estimarea vrstei la 33-42 ani s-a realizat doar pe baza capetelor sternale ale
coastelor, fiind singurul marker existent.
e. Patologia. Individului M5 nu i s-a asociat nicio patologie.
Analiza FT-IR
Datorit deformrilor osoase ale indivizilor M3 i M4 s-a presupus c ambii ar fi putut
suferi de tuberculoz. Acesta este un diagnostic realist deoarece o boal infecioas ar fi o bun
explicaie pentru aceeai simptomatologie existent n aceeai perioad i ntr -o singur
necropol. S-au prelevat probe pentru FT-IR din aceti doi indivizi, att din oase afectate de
boal ct din cele care preau neafectate. n spectrul obinut s -au identificat peak-uri asociate
acizilor micolici (Figurile 3, 4), precum: absorbana gruprii metilen la 2955 cm-1, a gruprii
metil la 2860 cm-1i deformarea lanurilor alifatice cu caten lung la 722 cm -1 (Coates, 2000;
Mark i colab., 2009; Rafidinarivo i colab., 2009). Aceste rezultate ns, nu au valoare de
diagnostic. Mark i colab. (2009) au testat probele lor pentru confirmarea tuberculozei i prin
MALDI-TOF-MS. Minnikin i colab. (2011a, 2011b) i Gernaey i colab. (2001) s -au folosit de
tehnica HPLC pentru stabilirea patologiei. Datele obinute de noi la FT-IR s-au folosit n
selectarea oaselor din care s-a extras ADN, pe baza raionamentului c dac exist acizi micolici
n acestea, probabil se gsete i ADN-vechi provenit de la MTBC.
Figura 3. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M3, presupus a fi infectat cu MTBC.
Figura 4. Spectrul FT-IR al unui individ sntos versus M4, presupus a fi infectat cu MTBC.
Spectrul FT-IR se utilizeaz i pentru stabilirea indicelui de cristalinitate (CI) a

hidroxiapatitei. Acesta se calculeaz ca raportul (A 595+A605)/A588 dintre suma absorbanelor
fosfatului (atunci cnd legturile covalente P-O sunt ndoite antisimetric, iar aceasta rezult ntr-
o degenerare a semnalului de la numerele de und 600 cm -1, la 595 cm-1i 605 cm-1), i valoarea
minim dintre ele (Termine i Posner, 1966). Aceast valoare se coreleaz cu gradul de
diagenez suferit de esutul osos astfel c, cu ct acest raport este mai ma re, cu att este mai mare
dimensiunea cristalelor. Comparaiile ntre oasele actuale i cele antice au artat c CI n cazul
primelor nu depete valoarea de 2,7 pe cnd cele vechi au n general peste 3. Oasele fosilizate
pot avea valori de pn la 4,1 sau chiar 7 n cazul dinozaurilor (Berna i colab., 2004). Totui, n
cazul indivizilor afectai de tuberculoz, acest raport este diminuat fa de valoarea ateptat
(Nagy i colab., 2008). Valoarea CI a individului M3 este de 3.04 iar a lui M4 de 2.65.
Un alt parametru calculat este raportul carbonat/fosfat (C/P) care indic ce cantitate de
fosfat s-a pierdut din HA i a fost nlocuit de carbonat. n cazul oaselor infectate cu MTBC s-a
observat o modificare a acestui parametru. Aceast raport are media n jurul valorii de 0,23 la
indivizii sntoi, dar n infeciile cu tuberculoz valoarea medie este mult crescut datorit
calcifierii oaselor. Nagy i colab. (2008) au calculat o medie de 0.47 a raportului C/P pentru
indivizi afectai de tuberculoz, iar media calculat de noi pentru indivizii de la Gherseni este de
0.50 (M3) i respectiv 0.53 (M4).
Coninutul de colagen (C/C) este un alt indice care se poate calcula din spectrul FT-IR.
Acesta reprezint cantitatea de colagen pstrat n matricea osoas. Se calculeaz ca raportul
dintre absorbanele amidei I i PO 4 (A1640/A1035). O valoare de 0,2 corespunde la 15 wt%
(procente de mas) iau una de 0,8 la 30 wt% materie organic n os (Lebon i colab., 2010). Noi
am presupus c exist o relaie proporional ntre cantitate de colagen din os i cea de ADN-
vechi. Indivizii M3 i M4 au avut valoarea C/C de 0,3 respectiv 0,5, acestea sugernd c exist
posibilitatea izolrii ADN-vechi endogen.
Extracia de ADN-vechi
Dup extracia cu fenol-cloroform conform protocolului descris, ADN a fost precipitat cu
etanol s-a observat depunerea unui precipitat brun-negricios. Acesta s-a resuspendat n 50 L
i
ap PCR Grade, iar 8 L au fost migrai n gel de agaroz 1,5% (Figura 5).
Figura 5. Electroforegrama obinut n urma migrrii ADN-vechi extras din individul M4; 1.
ADN extras dintr-o coast; 2. ADN extras din vertebre sudate; 3. control negativ de extracie.
Deoarece s-au obinut rezultate similare la extracii succesive din acelai individ, M4, dar
i din M3, s-a ataat doar Figura 9. Se poate observa n gelul de agaroz un smear de ADN
datorat degradrii n diagenez, astfel c majoritatea fragmentelor au o dimensiune mai mic de
50 pb. Mai mult, s-a observat n lumin UV o fluorescen albastr. Numeroase surse au raportat
acest aspect i s-a artat c fluorescena este datorat produilor Maillard. Acetia se formeaz n
timpul diagenezei, prin cross-linkarea colagenului de tipul I cu acizii humici infiltrai din sol n
oase. Acetia migreaz mpreun cu ADN n gelul de agaroz iar n PCR au un efect puternic
inhibitor. Kalmr i colab. (2000) i Hnni i colab. (1995) au ncercat ndeprtarea acestor
compui n timpul extraciei prin nlocuirea eta nolului cu izopropanol i au observat o diminuare
a semnalului fluorescent, dar inhibiia PCR poate fi evitat i prin diluarea ADN de 10 - 100x
(Herrmann i Hummel, 1994).
Rezultatele amplificrilor prin PCR

Hnni i colab. (1995) au testat inhibiia produilor Maillard prin realizarea unui PCR
unde au adugat 1L ADN-vechi la mixul de reacie, iar ca ADN matri au pus ADN-modern.
Ei au observat c acel 1 L a fost suficient pentru a inhiba reacia, chiar dac ADN- matri era
intact. Pentru a stabili la ce diluii activitatea polimerazei este restabilit, am diluat ADN-vechi
extras din dou vertebre sudate ale individului M3 de 25x, 50x, 75x, 100x. Iniial, la migrarea
ADN-vechi n gelul de agaroz s-a observat o puternic fluorescen albastr. Rezul tatul acestui
PCR se poate observa n Figura 6. Astfel, atunci cnd o prob de ADN-vechi extras avea o
fluorescen albastr puternic, s-a stabilit ca la PCR s se folosea o diluie a acestuia de 50x.
Figura 6. Amplificarea fragmentului de 117 pb din gena pncA cu amorsele F2-R2; se observ c diluia
de 50x este suficient pentru ca inhibiia datorat produilor Maillard s fie depit; se observ c diluia
de 75x i 100x este prea mare, motiv pentru care ADN -matri lipsete.
Gena pncA (pirazinamidaza/nicotinamidaza)

Dup mai multe testri s-a constatat c 3 L de ADN-vechi sunt suficieni pentru o
amplificare PCR ntr-un volum final de 25 L. S-au realizat dou amplificri succesive cu
amorsele F2-R2 (vezi Tabelul 2). n prima reacie s-a adugat BSA la un volum final de 1
mg/mL. Acest aditiv nu las ca ADN matri s adere la pereii tubului n care are loc reacia,
aspect important mai ales atunci cnd concentraia acestuia este sczut, i scade efectul inhibitor
al acizilor humici (Pbo i cola b., 1988; Farell i Alexandre, 2012; Simonovi i colab., 2012).
Alinierea amorselor s-a fcut la 60oC n prima reacie i la 62 oC n cea de-a doua, pentru a se
crete specificitatea. n a dou reacie s-a folosit ca i matri 1 L din produsul reaciei
precedente. Electroforegrama pentru amplificarea pncA F2-R2 folosindu-se ADN extras din M4
poate fi observat n Figura 7.
Figura 7. Produii PCR amplificai cu amorsele pncA F2-R2 i cu ADN matri extras din individul M4;
s-a obinut amplificare specific doar din oase afectate de tuberculoz (coast i vertebr); a fost testat i
ADN extras din radius, dar nu s-a obinut amplificare; controalele de extracie i de PCR sunt curate,
dovedind lipsa contaminrii cu ADN modern; benzile cu dimensiune mai mic de 50 pb s-au constatat a fi
dimeri de amorse.
Rezultate similare au fost obinute i pentru M4. Produii au fost purificai din gelul de
agaroz folosindu-se kitul Agarose Gel extraction Kit - Jena Bioscience, apoi au fost clonai cu
ajutorul kitului CloneJET PCR Cloning Kit - Thermo Scientific.
Pseudogena oxyR
n reacia de amplificare a fragmentului de 110 pb din pseudogena oxyR s-au folosit 2 L
de ADN matri. Concentraia final n mixul de reacie a MgCl 2 a fost crescut de la 1,5 mM la
2mM deoarece iniial nu s-a obinut nicio amplificare. Ca i n cazul pncA s-a adugat ca i
aditiv BSA (1 mg/mL) n reacia iniial. n a doua reacie s -a folosit 1 L din produsul primului
PCR. Rezultatele pot fi observate n Figurile 8 i 9 .
Figura 8. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M3; se observ c cea mai
bun amplificare a rezultat din ADN provenit din vertebra afectat diluat de 50x; exist amplificare i n
controlul de extracie, dar controlul de PCR este curat, ca urmare se exclude posibilitatea contaminrii cu
ADN-modern.
Figura 9. Electroforegrama produilor de PCR oxyR F3-R1 pentru individul M4; v - vertebr; s-a obinut
amplificare specific pentru probe din coast, vertebre, dar i n controlul de PCR. Deoarece nu exist
amplificare n controlul de extracie, se consider c nu a existat contaminare cu ADN -modern, dar
probabil a intervenit o eroare de manipulare.
Produii PCR au fost purificai din gel cu kitul de la Jen a Bioscience. Pn acum au fost
clonai secvenializai doar cei de la individul M3, cei de la individul M4 urmnd a fi clonai
i
ulterior.
Deleia TbD1
S-a ncercat amplificarea unui fragment care flancheaz deleia D1, folosindu-se
amorsele F-R2. Deoarece la concentraia de 2 mM MgCl 2 nu s-a obinut nicio amplificare, s-a
crescut concentraia la 2,5 mM. S -au folosit 2 L ADN matri, iar n cazul ADN extras din
vertebr s-a folosit o diluie de 50x. Ca i n cazurile anterioare, n prima amplificar e s-a folosit
BSA (1 mg/mL) (Figura 10).
Figura 10. Electroforegrama ampliconilor D1f F-R2 pentru individul M3; c - coast, v - vertebr, r -
radius; se observ c s-au obinut trei ampliconi de marimi diferite; fiecare band a fost purificat din gel,
urmnd a fi clonat; controalele de extracie i de PCR sunt curate, de aceea se elimin posibilitatea
contaminrii cu ADN-modern.
Prezena deleiei TbD1 face diferena ntre cele dou tipuri de tulpini M. tuberculosis:
ancestrale i moderne. De fapt, ambele tipuri exist astzi, aa cum arat un studiu realizat n
India, ar responsabil pentru 21% din cazurile globale de tuberculoz. Stavrum i colab. (2009)
au testat 65 de izolai de M. tuberculosis i au realizat c 26,2% aveau regiunea TbD1 intact.
Pn acum, am reuit obinerea unor produi PCR folosind amorse care flancheaz deleia, dar
testm i un set de amorse interne. Pn acum am obinut o amplificare specific n blankul de
extracie. Presupunem c n probe nu avem amplificare datorit produilor Maillard. Urmeaz s
optimizm reacia prin diluii succesive i utilizarea aditivilor. Dei avem un rezultat pozitiv n
controlul negativ de extracie nu credem c poate fi vorba de o contaminare cu ADN modern de
M. tuberculosis din controlul pozitiv deoarece acesta a fost testat anterior i este TbD1 +.
Analiza bioinformatic
Toate plasmidele secvenializate au fost prelucrate cu software-ul BioEdit 7.2.5.
Ampliconii PCR identificai au fost comparai cu cei din GenBank (NCBI) folosindu -se opiunea
blastn. Atunci cnd nu s-a obinut niciun rezultat folosind setrile automate ale blastn, ele au fost
modificate conform descrierii de la materiale i metode. n continuare vor fi descrise analizele
bioinformatice pentru fiecare amplicon PCR n parte.
Gena pncA
Fragmentele pncA obinute de la secvenializare au fost cu 10 nucleotide mai scurte dect
fragmentul ateptat. Parametrii blastn au fost modificai, aa cum s-a descris la Materiale i
metode, astfel nct s se conformeze unui ADN-vechi foarte degradat ca urmare a diagenezei.
Primele 22 de rezultate blastn pot fi observate n Figura 11.
Figura 11. Rezultatele obinute la blastn prin compararea secvenelor pncA F2 -R2 cu secvenele din
GenBank.
Dei primele rezultate nu aparin grupului MTBC ele pot fi excluse deoarece alinierile au
acoperire mic. Singurele rezultate cu acoperire de 100% aparin speciei M. tuberculosis, i au o
identitate de 68-70% cu fragmentul omolog modern pncA.
Ulterior, pentru a susine ncadrarea secvenelor de ADN-vechi la grupul MTBC, am
descrcat toate secventele genei pncA ale genului Mycobacterium depuse n baza de date Gene.
Am descrcat att secvenele speciilor patogene ct i a celor ambientale. Am aliniat secvenele
obinute de noi, din oase, extracii sau indivizi diferii cu cele existente n bazele de date. Pentru
aliniere am folosit algoritmul ClustalW n Mega 5 (Figura 12).
Se pot observa din aliniere, trei deleii care se pstreaz n dreptul situsurilor 29-31, 53-57
i 95-96. Acele deleii nu puteau aprea n diferite zone din corp i mai ales la indivii diferii ca
urmare a diagenezei pentru c acesta este un proces randomic. Dar ele ar putea fi explicate de
apariia buclelor n moleculele monocatenare de ADN. Aa cum se poate observa n Figura 9,
ADN-vechi extras de noi este deja foarte degradat i fragmentat. Forma cea mai stabil a ADN
este aceea de dublu-helix supra-rsucit, dar n momentul fragmentrii orice supra-rsucire este
nlturat. Astfel, ADN este mult mai uor de denaturat (Cox i colab., 201 0). Mai mult, se tie
c extracia cu fenol - cloroform - alcool izoamilic este una agresiv (Ausubel i colab., 1995) iar
fenolul oxidat cauzeaz degradarea i ruperea catenelor de ADN. De aceea am presupus c n
timpul extraciei s-ar putea forma monocatene de ADN, care ar putea adopta structuri secundare
(Liang i colab., 2006).
Toate PCR s-au realizat cu Taq-polimeraza, iar o serie de articole au analizat activitatea
acesteia n momentul n care ntlnete o bucl n molecula de ADN-matri (Viguera i colab.,
2001; Canceill i Ehrlich, 1996; Levinson i Gutman, 1987 ). S-a artat c polimeraza poate ignora
nucleotidele implicate n formarea buclei astfel c n molecula rezultat va exista o deleie
aproximativ egal cu dimensiunea buclei (Figura 13).
Figura 13. Reprezentarea schematic a modelului prin care Taq-polimeraza induce la locul de formare a
unei bucle apariia unei deleii n molecula de ADN (dup Viguera i colab., 2001)
Pentru a observa dac fragmentul de 117 pb formeaz structuri secundare de tipul

buclelor am folosit aplicaia DNA Folding Form a The Mfold Web Server. S-a setat concentraia
MgCl2 folosit n PCR. Rezultatul modelrii 2D poate fi observat n Figura 14. Se poate observa
c cele trei bucle evideniate (A, B i C) se suprapun peste cele trei deleii n alinierea multipl
din Mega 5.
Figura 14. Modelarea 2D a fragmentul de 117 pb al genei pncA de la M. tuberculosis folosind aplicaia
DNA Folding Form a The Mfold Web Server.
Datorit divergenei observate n alinierea multipl ntre secvenele de ADN -vechi i cele
moderne, ncadrarea secvenelor de ADN-vechi n MTBC are nevoie de dovezi suplimentare.
Astfel s-a formulat ipoteza c dac ntru-un arbore filogenetic secvenele noastre s -ar grupa cu
cele ale MTBC i nu cu secvenele provenite de la specii ambientale, atunci cel mai probabil
divergena este cauzat de degradarea din timpul diagenezei i nu este datorat apartenenei lor la
o specie diferit.
Pentru a se afla modelul evolutiv care ar putea explica cel mai bine datele observate, am
rulat n Mega 5 opionea Find Best DNA/Protein Models (ML). S-a folosit n construcia
arborelui prima opiune raportat: Tamura 92 (Tamura 3 - parameter cu distribuie discret
Gamma) cu cel mai mic scor BIC (Bayesian Information Criterion).Un scor BIC mic implic
existena unui numr sczut de variabile explicative necesare pentru justificarea datelor obinute
(Baxevanis i Ouellette, 2001).
Figura 12. Alinierea multipl a secvenelor pncA obinute de noi i a celor din baza de date Gene ale genului Mycobacterium.
Arborele a fost realizat prin metoda Maximum Likelihood. Referitor la modul n care
urmau s fie tratate cele trei deleii, am ales opiunea Complete deletion - Gap/Missing Data
Treatement. Alegerea este justificat prin faptul c am pornit de la ipoteza conform creia
deleiile sunt produsul activitii Taq-polimerazei, i nu al evoluiei sau al diagenezei.
Pentru c modificrile n secvena nucleotidic (exceptnd deleiile) sunt produsul
degradrii post-mortem a ADN, am considerat c n construcia arbo relui secvenele nucleotidice
ar trebui tratate ca secvene non-codificatoare. Dac n schimb, am fi selectat opiunea automat -
Protein coding - doar primele dou poziii din codon ar fi fost analizate pentru a se evita
influena celui de-al treilea nucleotid, care poate varia fr a influena secvena proteic. Aadar,
nici n acest caz diferenele nu sunt produsul mutagenezei i al seleciai naturale, ci al diagenezei.
Mai mult, poriunea de 117 pb a genei pncA codific n lanul polipeptidic o regiune de
39 de aminoacizi nalt conservat. Lanul polipeptidic formeaz un buzunar care susine un ion
de Fe2+ prin intermediul a apte aminoazici: H51, H57, H71, D49, D8, C138, K96. Patru dintre
acetia sunt codificai de poriunea amplificat de noi: D49, H51 , H57, H71 (Petrella i colab.,
2011). n Figura 15 se observ structura 3D a proteinei prelucrat n Rastop 2.2 astfel nct s fie
evideniat buzunarul i aminoacizii implicai n susinerea fierului.
Figura 15. Structura 3D a pirazinamidazei de la Mycobacterium tuberculosis prelucrat n Rastop 2.2; se

observ buzunarul catalitic i cei patru aminoacizi implicai n susinerea Fe 2+.
Histidina din poziia 57 este substituit de acidul aspartic la M. bovis ca urmare a unei
mutaii punctiforme, aceast specie devenind astfel rezistent la tratamentul cu pirazinamid.
Deoarece existena acestor patru poziii este esenial pentru funcia enzimei, este puin probabil
ca modificrile observate n alinierea multipl s fi survenit n timpul evoluiei.
Pentru ca relaia dintre secvenele obinute de noi i secvenele moderne s fie stabilit cu
o mai mare certitudine am construit un arbore filogenetic prin metoda Maximum Likelihood.
Aceasta poate reconstitui relaiile filogenetice dintre taxonii analizai i ofer suport statistic
(Bootstrap sau Jack-knife) (Harrison i Langdale, 2006). Arborele rezultat pe baza alinierii din
Figura 12 poate fi observat n Figura 16.
Figura 16. Arborele filogenetic realizat prin Maximul Likelihood: Bootstrap 100, modelul evolutiv
Tamura 3 cu distribuie discret Gamma, poziiile cu gap-uri s-a eliminat din analiz.
Pentru ca arborele realizat s fie relevant s-au ters din alinierea multipl o parte din
secvenele amorselor, pstrndu-se secvena minim unic de nucleotide de la captul 3', adic 6
nucleotide. Pentru a fi siguri c topologia arborelui nu este nfluenat de secvena conservat a
amorselor, am pstrat de la captul 3' doar 5 nucleotide. S-a fcut aceast alterare bazandu-ne pe
raionamentul c acele nucleotide sunt necesare pentru legarea amorselor de catena matri i
pentru activitatea Taq-polimerazei. Dup cum se poate observa n Figura 16, secvenele obinute
de noi sunt evideniate prin romburi, culorile diferite reprezentnd indivizi diferii, iar ele
formeaz un cluster care se pstreaz n toi arborii generai (Bootstrap 100). Apoi, acest cluster
este legat de un alt grup ce cuprinde secvenele pncA ale tuturor speciilor din MTBC, scorul
Bootstrap fiind tot 43. Speciile ambientale i care cauzeaz boli similare tuberculozei la animale,
formeaz un grup separat, n care majoritatea valorilor Bootstrap sunt reduse, deci cu o stabilitate
mai sczut. Ca i secven outgroup am ales fragmentul omolog pncA de la Corynebacterium
glutamicum ATCC 13032. Pentru a echilibra diferenele observate n lungimea ramurilor am
ncercat s utilizm un cluster de secvene outgroup, format din mai multe fragmente pncA ale
genului Corynebacterium. Rezultatele nu au fost satisfctoare, obinndu-se un arbore cu valori
Bootstrap sczute. Acest aspect nu este surprinztor deoarece nu ne putem atepta ca rata
evolutiv s fie aceeai n dou grupuri taxonomice diferite, chiar dac genurile sunt nrudite
(Luo i colab., 2010). Aadar, gruparea secvenelor de ADN-vechi cu MTBC este susinut
statistic i putem concluziona c divergena observat se datoreaz diagenezei i nu unei
amplificri PCR nespecifice.
Pseudosena oxyR
La bacterii, oxyR codific principala protein reglatoare a rspunsului la stresul oxidativ,
dar surprinztor, la speciile din MTBC aceasta a fost inactivat. La Escherichia coli i
Salmonella typhimurium proteina este un factor de transcriere cu rol n activarea transcrierii
proteinelor implicate n rspunsul la stresul oxidativ, dar la speciile din MTBC secvena oxyR
omoloag conine numeroase deleii i inserii frame shift mutations (Figura 17).
Figura 17. Organizarea genetic a regiunii oxyR-ahpC la M. tuberculosis comparativ cu M. leprae;

segmentele n dungi - zone unde au avut loc deleii masive; triunghiurile - mutaii care au schimbat cadrul
direct de citire; romburile - inserii; ptratul - muatie n codonul start (dup Pagn-Ramos i colab.,
2006).
Una dintre genele aflate sub controlul OxyR este ahpC, care codific alchilhidroperoxid -
reductaza, implicat n metabolizarea peroxidului de hidrogen i a acidului azotic (Springer i
colab., 2001). S-a observat c la speciile care nu mai au gena oxyR funcional, nivelul expresiei
ahpC este foarte sczut, dar nefiind complet inactivat, se presupune c ea ar avea un rol
funcional. Deoarece oxyR nu se mai extrim n MTBC, i deci nu mai este supus seleciei
naturale, ea a putut acumula mutaii i astfel, pe baza polimorfismului din poziia 285 a
pseudogenei se poate face diferena dintre M. tuberculosis i M. bovis (Sreetvansan i colab.,
1996). Noi am amplificat o poriune adiacent acestui SNP, cu amorsele F3-R1 prezentate n
Tabelul 1, cu scopul de a obine un amplicon pe baza cruia s stabilim specia din MTBC care a
cauzat boala.
Dup ce am purificat i clonat produii de PCR, acetia au fost secvenalizai. Secvenele
obinute au fost comparate cu toate celelalte secvene din baza de date GenBank (NCBI) i s-a
obinut o similaritate de 99-100% cu secvena omoloag modern (Figura 18).
`
Figura 18. Alinierea multipl a secvenelor oxyR de ADN-vechi i a fragmentului omolog de la M.
tuberculosis CCDC5180 realizat n Mega 5.1 cu ClustalW.
Secvenele au fost obinute pn acum doar de la individul M3 i aa cum se observ n

Figura 8, controlul negativ de PCR este curat, de aceea, dei similaritatea cu ADN-modern e
surprinztoare, contaminarea este puin probabil. Aceasta demonstreaz prezena lui M.
tuberculosis n oasele cu remodelri asociate tuberculozei. Fragmentele obinute din M4, i
observate n Figura 9, urmeaz a fi clonate i secvenalizate.
CONCLUZII
Rezultatele analizei antropologice au indicat posibilitatea ca indivizii M3 i M4 din

necropola de la Gherseni s fi fost afectai de boala lui Pott. Am ncercat confirmarea acestui
diagnostic utiliznd tehnici fizice (FT-IR) i de biologie molecular. Astfel, n spectrele FT-IR
au fost identificate peak-uri asociate acizilor micolici dar s-au determau fost identificate i
modificri ale indicilor de cristalinitate i a rapoartelor C/P specifice tuberculozei.
Am reuit amplificarea prin PCR a secvenelor pncA din ambii indivizi i secvenalizarea
acestora, iar analizele bioinformatice ne-au ajutat s ncadrm secvenele n MTBC, chiar dac
ADN-vechi a suferit schimbri datorate diagenezei.
Mai mult, au fost obinute secvene ale pseudogenei oxyR cu similaritate de 99-100% cu
secvenele omoloage moderne. Deoarece controlul negativ de PCR este curat, posibilitatea
contaminrii cu ADN modern este nlturat.
n continuare se dorete obinerea secvenelor TbD1 externe i interne.
Studiul III.
Diversitatea genetic reflectat de analiza regiunii de control mitocondriale la
o populaie de secol X din Capidava (Constana, Romnia)
Antropologia fizic
naintea efecturii analizelor moleculare, s-a realizat o analiz osteologic a scheletelor

provenite din necropola de la Capidava pentru a evalua starea de reprezentare i conservare a
oaselor, pentru a identifica sexul indivizilor si pentru a estima vrsta la care acetia au decedat.
Pentru determinarea acestor caracteristici s-au utilizat protocoalele descrise n Standards for data
collection from human skeletal remains (Buikstra i Ubelaker, 1994).
Sexul indivizilor a fost atribuit pe baza trsturilor morfologice de la nivelul craniului
(marginea supraorbital, glabela, mental) i de la nivelul pelvisului (concavitatea subpubic,
arcul ventral, incizura sciatic, sulcusul preauricular). Pentru fiecare din aceste trsturi s-a
atribuit un anumit scor, conform protocolului standard, care reflect gradul de siguran cu care a
fost identificat sexul. n cazul indivizilor subaduli, sexul nu a putut fi determinat pe baza
analizelor de antropologie fizic, deoarece, fiind nc n curs de dezvoltare la momentul morii,
resturile osoase nu prezint trsturile specifice unui anumit sex.
Pentru estimarea vrstei la momentul morii au fost examinai mai muli markeri
osteologici printre care sinostoza suturilor craniene, simfiza pubic, suprafaa auricular a
iliumului i capetele sternale ale coastelor. Pentru stabilirea vrstei subadulilor s-a folosit un set
diferit de criterii. Acestea au inclus caracterizarea stadiului de dezvoltare al danturii precum i
msurtori ale oaselor realizate cu ublerul electronic, fie cu placa osteometric.
n plus, a fost examinat gradul de artroz al articulaiilor pentru a aprecia dac individual
folosea frecvent anumite pri ale corpului n activitile sale fizice, fapt ce poate reflecta stilul
de via. Informaiile legate de nutriie care ilustreaz condiia social pot fi deduse prin
evaluarea strii de afectare a dentiiei, o alt caracteristic analizat. n acelai timp a fost
urmrit eventuala apariie a unor stri patologice speciale cum ar fi tuberculoza sau sifilisul,
precum i prezena traumelor care indic starea de sntate a indivizilor i uneori posibila cauza
a morii.
Prevenia contaminrii i autentificarea rezultatelor
Pe lng degradarea molecular, studiile de ADN se confrunt cu o alt dificultate

major. Din moment ce ADN-ul modern uman i microbial este ubicuitar, riscul contaminrii cu
ADN exogen apare n fiecare etap a procesrii probelor de ADN vechi. Astfel, pentru a evita
contaminarea n laborator au fost urmate reguli i protocoale stricte (Yang i Watt, 2005).
Extracia ADN-ului i amplificarea PCR au fost realizate n laboratoare separate fizic,
destinate doar pentru lucrul cu probe de ADN vechi. n aceste ncperi au fost montate filtre de
aer dotate cu lmpi UV care au fost utilizate naintea nceperii fiecrui proces pentru meninerea
unui mediu de lucru steril. Toat aparatura, suprafeele de lucru, precum i ustensilele din
laborator au fost curate n mod regulat cu Cl, ap ultra-pur i etanol 70%, iar apoi iradiate cu
UV. Tot personalul care a intrat n laborator a purtat combinezon, masc, nclminte de
protecie i mnui de unic folosin pentru a minimize, pe ct posibil, riscul de contaminare.
Din acelai motiv, persoanele care au lucrat ntr-o anumit zi cu probe moderne nu au avut acces
n ziua respectiv n laboratoarele de ADN vechi.
Totodat, fiecare intrare n laborator a fost realizat conform unui program bine-organizat
i a fost manipulat o prob de la un singur individ o dat. Pentru fiecare extracie au fost co-
extrase sistematic blank-uri de control, iar pentru fiecare amplificare enzimatic au fost rulate
controale negative de PCR pentru a monitoriza o posibil contaminare a substanelor folosite. De
asemenea, pentru a detecta contaminarea cu ADN modern provenit de la personalul care are
acces n aceste laboratoare, rezultatele obinute au fost comparate cu o baz de date ce conine
secvenele genetice de interes ale cercettorilor din instituie (Sampietro et al. 2006).
Din cauza faptului c, n ciuda respectrii tuturor acestor msuri de precauie, exist ansa
de contaminare n laborator, se recomand replicarea independent a analizelor ntr-un laborator
separat de ADN vechi (Gilbert et al. 2005; Pbo et al. 2004; Willerslev and Cooper 2005). n
acest context, pentru fiecare schelet analizat n acest studiu, au fost trimise cel puin cte un dinte
ntreg, fr carii sau fisuri la un laborator de ADN vechi din Spania cu scopul de a autentifica
rezultatele obinute.
Pregtirea probelor i extracia ADN
Extracia ADN-ului din probele osteologice a fost realizat prin dou metode diferite,
ambele frecvent utilizate n astfel de studii. Una dintre ele este extracia cu fenol-cloroform
(Hervella et al. 2012), iar cealalt metod implic utilizarea unor coloane cu silica (Anderung et
al., 2008; Yang et al., 1998). Extracia ADN a folosit ca i surs att oase ct i dini, n cazurile
n care acestea au fost gsite intacte. Au fost alese ca probe pentru acest proces cele mai bine
conservate oase, mai exact diafiza humerusului pentru 4 dintre indivizi: M1, M3, M4, M5.
Extracia din dini a fost efectuat pentru 3 dintre indivizi: M4, M5, M8.
Pentru eliminarea contaminanilor din sol, , a fost curat mai nti suprafaa
osului/dintelui cu Cl 10% i ap ultra-pur. Apoi, ntreaga suprafa a osului, respectiv a dintelui
a fost iradiat UV n UVIlink crosslinker (Uvitec Cambridge) pentru a reduce riscul de
contaminare cu ADN exogen. Din acelai motiv, n cazul probelor reprezentate de piese osoase
au fost nlturai 1 -2 mm din partea extern a osului, cu micromotorul dentar. Ulterior, cu
ajutorul acestui instrument a fost obinut pulberea osoas n cantitatea necesar extraciei. n
cazul utilizrii dinilor, a fost deschis camera pulpar i recoltat sub form de pulbere tot
coninutul. Burghierea electric a fost realizat la vitez mic pentru prevenirea distrugerii ADN-
ului datorit nclzirii excesive (Adler et al., 2011). O singur prob provenind de la un anumit
individ plus un control de extracie au fost prelucrate n acelai timp (nu au fost prelucrate
concomitant probe de la indivizi diferii).
Pentru extracia cu fenol-cloroformau fost utilizate 20 mg de esut osos sub form de
pulbere. Acesta a fost incubat peste noapte la 56 oC n soluie de decalcifiere ce conine: 0.5 M
EDTA pH 8.0-8.5, 0.5% SDS, 50mM TrisHCl pH 8.0 i 1 mg/ml Proteinaz K (Ginther et al.,
1992; Hagelberg i Clegg, 1991). Soluia a fost apoi centrifugat, iar ADN-ul a fost extras din
supernatant, urmrind protocolul de extracie cu fenol-cloroform (Hervella et al., 2012). Au fost
efectuate dou extracii succesive cu un volum egal de 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl
Alcohol (Calbiochem), urmate de adiia cloroformul la faza apoas pentru a nltura urmele de
fenol. Ulterior, ADN-ul a fost precipitat folosind dou volume de etanol absolut (1 ml etanol
absolut la 500 ml supernatant) i 1/10 volume de acetat de sodiu 3 M. Prin centrifugare, a fost
obinut un pellet de ADN care a fost splat de 2 ori cu 1 ml de etanol 80%, apoi acesta a fost
uscat la 56oC timp de 10 minute i resuspendat ntr-un mililitru de ap PCR Grade. ADN-ul a
fost purificat i concentrat prin trecerea soluiei prin centricoane de tipul Amicon Ultra - 0.5 mL
30K Centrifugal Filters (Merck Millipore) (obinandu-se 50-70ul soluie final). ADN-ul eluat a
fost stocat n alicote de 20 l la o temperatur de -20oC pentru o scurt perioad de timp, astfel
nct s nu se degradeze pn la efectuarea amplificrii.
Probele reprezentate de dini au fost supuse extraciei printr-o metod simpl i eficient,
ce nu implic folosirea solvenilor organici. Metoda presupune purificarea i concentrarea ADN-
ului din probe osteologice antice prin intermediul unor coloane cu silica (QIAquicky, QIAGEN)
(Anderung et al., 2008; Yang et al., 1998). Aceasta a fost adaptat la condiiile i aparatura
disponibil n laborator. Digestia pulberii obinute din dini a fost realizat prin adugarea a 100
l Proteinaz K (20 mg/ml) i a unui tampon de extracie alctuit din 0,5 M EDTA pH 8 i 5%
SDS. Amestecul a fost pstrat la 55oC peste noapte, iar apoi la 37oC timp de 24 de ore. Dup ce
amestecul a fost centrifugat, supernatantul a fost preluat i mprit n alicote de 250 l, n tuburi
de 2 ml. Peste acestea au fost adugate 5 volume de PB Buffer (1250 l) i amestecat. Ulterior,
cte 750 l din soluie au fost ncrcate succesiv pe coloan i centrifugate 1 minut la 12400 g.
La terminarea amestecului, ADN-ul legat de particulele de silica a fost splat prin adugarea a
750 l PE Buffer, iar apoi a fost eluat n 100 l Elution Buffer.
Amplificarea PCR i electroforeza
Strategia de amplificare a secvenelor ADN de interes a fost bazat pe utilizarea unor

seturi de amorse proiectate pentru amplificarea unor fragmente nucleotidice scurte, care tind s
fie mai numeroase chiar i n probele arheologice degradate (Gabriel et al. 2001; Pbo et al.
2004). n acest mod, exist mai multe anse de a produce copii suficiente de secvene autentice.
Pentru fiecare specimen, secvenele din regiunea hipervariabil I (HVR-I) i regiunea
hipervariabil II (HVR-II) ale genomului mitocondrial au fost determinate prin amplificarea a 8
segmente care se suprapun pe ntreaga regiune hipervariabil. Dimensiunea acestor segmente
este cuprins ntre 126 de perechi de baze i 170 de perechi de baze (Gabriel et al. 2001)
(Tabelul 1).
Tabelul 1. Design-ul amorselor pentru amplificarea HVR-I i HVR-II (Gabriel et al. 2001)
Intervalul
Dimensiunea
Fragm. secvenei Temp. de
ampliconului Secvena amorsei
amplificat informative aliniere
(pb)
ADN
F: 5-CCC AAA GCT AAG ATT CTA AT-3

HVR-I A 170 16009-16138 50
R: 5-TAC TAC AGG TGG TCA AGT AT-3
F: 5-CAC CAT GAA TAT TGT ACG GT-3

HVR-I B 126 16132-16217 50
R: 5-TGT GTG ATA GTT GAG GGT TG-3
F: 5-CCC CAT GCT TAC AAG CAA GT-3

HVR-I C 133 16210-16302 46
R: 5-TGG CTT TAT GTA CTA TGT AC-3
F: 5-CAC TAG GAT ACC AAC AAA CC-3
HVR-I D 143 162886390 48
R: 5-GAG GAT GGT GGT CAA GGG AC-3
F: 5-GGG AGC TCT CCA TGC ATT TGG TA-3

HVR-II A 126 R: 5-AAA TAA TAG GAT GAG GCA GGA ATC- 57135 54
3
F: 5-GCA CCC TAT GTC GCA GTA TCT GTC-3
HVR-II B 132 133219 46
R: 5-TAT TAT TAT GTC CTA CAA GCA-3
F: 5-CTA TTA TTT ATC GCA CCT-3
HVR-II C 142 169273 46
R: 5-ATT TTT TGT TAT GAT GTC T-3
F: 5-TGC TTG TAG GAC ATA ATA AT-3
HVR-II D 158 240357 47
R: 5-GTG TTA GGG TTC TTT GTT TT-3
Au fost utilizate mai multe tipuri de ADN polimeraz, disponibile comercial, printre care
MangoTaqTM (Bioline), MyTaqTM (Bioline), PlatinumTaq (Invitrogen). Fiecare reacie PCR a
fost optimizat prin variaia concentraiilor substanelor folosite pentru amplificare, n funcie de
calitatea i cantitatea de ADN extras. n majoritatea cazurilor, ADN polimeraza MangoTaq TM
(Bioline) s-a dovedit a fi cea mai eficient pentru amplificarea secvenelor degradate de
ADNvechi. S-au obinut rezultate constante atunci cnd urmtorul design de PCR a fost folosit
pentru o reacie de 25 l: 5 l tampon de reacie colorat MangoTaq, 2.5 mM MgCl 2, 0.2 mM
fiecare dNTP, 0.5 M fiecare amors, 1.25 uniti de MangoTaq TMpolimeraz i, de obicei, 2 l
de ADN matri. Pentru a depi dificultile ntmpinate la amplificare, datorit prezenei
urmelor de fenol i ai inhibitorilor PCR n ADN-ul extras conform protocolului cu fenol-
cloroform, acesta a fost, de regul, diluat de cel puin 5 ori naintea folosirii pentru amplificare.
Programul de PCR standard folosit a presupus: denaturarea iniial 95 oC 5 min, urmat de 35 de
cicluri: 95oC 30 sec, 46-50oC (n funcie de amorse), 72oC 30 sec i elongarea final 72oC timp
de 5 min. Monitorizarea unei posibile contaminri a reactivilor folosii s-a realizat prin adugarea
controalelor negative de PCR.
La finalul PCR-urilor s-a verificat faptul c au fost amplificate fragmentele de interes prin
intemediul electroforezei n gel de agaroz. Aceast metod analitic presupune separarea
moleculelor de acizi nucleici care migreaz n cmp electric n funcie de dimensiunea pe care o
au. Astfel, cunoscnd dimensiunea ampliconului, n urma migrrii sale ntr-un gel de agaroz
colorat cu bromur de etidiu, se poate vizualiza la UV prezena ADN-ului de mrimea ateptat.
Un exemplu n acest sens se regasete n figura 4 care ilustreaz amplificarea segmentelor HVR-I
A i HVR-I B de la individual M4, vizualizat in gel de agaroza (Fig. 1).
Fig. 1. Electroforeza n gel de agaroz
Segmentele de ADN de interes obinute n gel au fost purificate, n vedea clonrii lor. n
acest scop s-au utilizat kit-uri speciale pentru purificare din gel (FavorPrep GEL Purification
Kit, Favorgen Biotech Corp) i s-a respectat protocolul disponibil n kit. n situaiile n care s-a
remarcat prezena amplificrii n controlul de extracie, acesta a fost de asemenea purificat pentru
a identifica sursa de contaminare. Totodat, atunci cnd au aprut amplificri n controlul negativ
de PCR, probele nu au fost purificate. n schimb a fost repetat acel pas, utiliznd alicote noi de
reactivi ne-contaminai.
Clonare i secvenializare
nainte de secvenializare, produii PCR purificai au fost clonai (CloneJet PCR Cloning
Kit, Thermo Scientific), ceea ce permite, ulterior, realizarea distinciei dintre mutaiile autentice
specifice fiecrui individ i greelile induse de alterarea post-mortem a integritii moleculelor de
ADN. Avnd n vedere faptul c produii PCR au avut capete coezive 3-dA generate de Mango
Taq polimeraza s-a urmarit protocolul de clonare din kit, specific pentru ndeprtarea acestor
capete (Sticky-End Cloning Protocol), nainte de ligare. Bacteriile competente DH5 alpha, una
din cele mai frecvent utilizate tulpini de E coli. n clonarea de rutin, au fost transformate cu
produii de ligare, iar apoi depuse pe plci de cultur. Doar clonele recombinate care conin
insertul au crescut pe plci, datorit proprietii vectorului pJET1.2/blunt de a exprima o enzim
de restricie letal dac se recircularizeaz dup transformare. Cte 6 colonii izolate de pe fiecare
plac au fost folosite pentru preculturi.
Dup ce bacteriile au crescut timp de aproximativ 15 ore la 37 oC cu agitare, ADN-ul
plasmidic a fost purificat conform instuciunilor din kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo
Scientific). Cantitatea i puritatea ADN-ului plasmidic obinut au fost determinate
spectofotometric. Totodat, pentru a certifica prezena insertului de dimensiunea ateptat, a fost
realizat digestia probelor cu enzima de restricie Bgl II (Thermo Scientific) conform
recomandrilor i au fost vizualizate pe gel de agaroz.
Un minim de 5 clone care au coninut insertul au fost secvenializate (Macrogen, Korea),
folosind amorsa standard pJET1.2 R. Secvenele care au rezultat au fost aliniate cu ajutorul
programului BioEdit i comparate cu secvena ADNmt de referin (revised Cambridge
Reference Sequence; Andrews et al. 1999). De asemenea, rezultatele obinute au fost comprate
att cu secvenele provenite de la personalul implicat n acest studiu, pentru a elimina
posibilitatea contaminrii, ct i cu secvenele regsite n bazele de date.
Rezultate i discuii
Antropologie fizic
Analizele de antropologie fizic efectuate pe cele 9 schelete recuperate din necropola de

la Capidava au pus n eviden faptul c 3 dintre ele aparin unor femei (M1, M3, M8), unul este
al unui individ de sex masculin (M4), iar restul aparin unor indivizi subaduli (M2, M5, M6,
M9, M10) al cror sex nu a putut fi determinat prin metode de antropologie fizic. n cazul
adulilor a fost remarcat prezena a mai mult de 75% din schelet ceea ce semnific o
reprezentare foarte bun. n acelai timp, aceste schelete sunt foarte bine conservate, fiind
alterat mai puin de 25% din suprafaa osoas sub aciunea solului. Nu se poate spune acelai
lucru despre gradul de reprezentare i conservare a scheletelor indivizilor subaduli. n afara
resturilor osoase ale individului M10 care sunt reprezentate i conservate moderat, celelalte
schelete sunt slab pstrate.
Pe baza markerilor osteologici analizai, a fost estimat vrsta la momentul morii pentru
individual M1, de sex feminin, ntre 38-48 de ani. Nu au fost identificate patologii speciale, dar a
fost observat existena unei fracturi oblice vindecate la nivelul humerusului stng, n zona
diafizei proximale. Celei de-a doua femei (M3) i s-a atribuit o vrsta cuprins ntre 43-56 de ani,
iar pentru cea de-a treia femeie (M8) s-a stabilit vrsta n intervalul 20-24 de ani. n cazul
individului M8 s-a identificat o traum la nivel cranian, parietal stng. Cel mai probabil aceasta
este datorat unei lovituri antemortem cu un obiect contondent. De asemenea, a fost remarcat
existena unei fracturi oblice la nivelul unei coaste de pe partea stng, vindecat, fr urme de
infecie. Vrsta pentru individul M4 a fost aproximat n intervalul 33-43 de ani i s-a constatat
c dantura sa a fost pstrat intact, ntr-o stare foarte bun, fr carii sau abcese, fapt ce reflect
o stare de sntate relativ bun. Scheletele M2 i M5 aparin unor indivizi tineri, preaduli cu
vrsta cuprins ntre 9-12 ani. Cu toate c resturile osoase ale indivizilor M6, M9 i M10 sunt
puternic alterate, a putut fi determinat vrsta lor pe baza erupiei dentare i a lungimii oaselor.
Astfel, M6 este cel mai tnr individ, avnd 38-40 sptmni prenatal, M8 0-2 luni postnatal, iar
M9 2,6-4 ani.
Analiza molecular
Dintre cei 9 indivizi ale cror rmie osoase au fost recuperate din situl arheologic
Capidava au fost analizai prin metode moleculare doar 5 dintre acetia. Au fost analizai mai
nti adulii (M1, M3, M4, M8), deoarece piesele osoase sunt bine pstrate, fapt ce permite
extragerea ADN-ului. Prezena dinilor intaci, fr carii sau fisuri, care pot fi folosii pentru
extracia ADN reprezint un motiv suplimentar pentru alegerea fcut. Spre deosebire de aduli,
scheletele indivizilor tineri sunt slab conservate, iar dinii permaneni au rdcinile deschise,
fiind n curs de dezvoltare, fapt ce ridic dificulti n analiza secvenelor de ADN provenite din
astfel de probe, datorit riscului crescut de contaminare cu ADN exogen. Totui, a fost efectuat
analiza de genetic molecular pentru subadultul M5 care prezint un interes deosebit, deoarece
a fost gsit n vecintatea mormintelor M3 i M4, iar o astfel de analiz poate reliefa o eventual
relaie de rudenie ntre aceti indivizi.
Rezultate obinute prin extracia ADN cu fenol-cloroform (M1, M3, M4, M5)
Extracia ADN a fost realizat prin dou modaliti distincte, una bazat pe fenol-
cloroform, iar cealalt prin intermediul coloanelor cu silica. Pentru extracia cu fenol-cloroform
s-a prelevat pulbere ososas de la indivizii M1, M3, M4 i M5. Cantitatea i calitatea ADN-ului,
astfel obinut au permis doar amplificarea celor 4 segmente din regiunea hipervariabil I (HVR-
I) a genomului mitocondrial. Avnd n vedere faptul c s-a remarcat prezena urmelor de fenol n
ADN-ul extras, precum i a anumitor inhibitori de PCR cum ar fi acizii humici, fiecare
amplificare enzimatic a fost optimizat i s-au testat diferite concentraii de ADN matri n
amestecul de PCR. Din aceast cauz, ADN-ul rezultat n urma unei extracii unice nu a fost
suficient pentru obinerea rezultatelor pentru cel de-al doilea segment hipervariabil din regiunea
de control.
Primul dintre indivizii analizai este M3. Pentru 3 din 4 fragmente clonate i
secvenializate, blank-urile de extracie au fost curate, adic nu au rezultat amplificri,
fragmentul HVR-I D fiind singurul care a prezentat amplificare n blank, cel mai probabil
datorit unei erori de manipulare. Secvenele obinute au fost comparate cu secvena de referin
(rCRS) pentru a identifica mutaiile specifice acestui individ. A fost evideniat o tranziie C-T n
poziia 16069 n toate clonele analizate. Pe lng aceasta au fost idendificate nc 2 polimorfisme
n poziiile 16111T i 16126C. Interesant este faptul c n secvenele n care s-a regsit una dintre
aceste mutaii (de exemplu 16111T) nu a fost prezent cealalt (16126C), fapt ce indic cel mai
probabil existena a dou surse de ADN. De asemenea, s-a constat prezena unor mutaii
punctiforme, caracteristice moleculelor vechi de ADN care sunt supuse degradrii post-mortem.
Acestea sunt mult mai frecvente n acele secvene care conin substituia 16111 C-T, ceea ce
sugereaz c acestea provin de la individul M1. Aceast idee este susinut i prin faptul c
mutaia 16111T apare pentru prima dat n setul de analize efectuate n laboratorul nostru. Cu
toate acestea, rezultatele pentru M1 trebuie autentificate prin replicarea analizelor i investigarea
mutaiilor din HVR-II care s confirme ncadrarea ntr-un anumit haplogrup.
n secvenele obinute de la individul M1 nu s-au semnalat diferene fa de rCRS, ceea
ce implic ncadrarea acestuia n haplogrupul european H2a2. Pentru certificarea acestei
ncadrri se vor analiza i secvenele pentru HVR-II, precum i un segment nucleotidic care s
includ poziia 7028, poziie definitorie pentru ncadrarea n haplogrupul H (Dissing et al.,
2007).
n cazul indivilor M4 i M5 s-au obinut dou seturi de rezultate, primul n urma analizei
ADN-ului extras cu fenol-cloroform. Dei au fost obinui produi de amplificare pentru HVR -I,
rezultatele de la secvenializarea clonelor sunt inconclusive. Unul dintre factorii care a contribuit
la acest aspect este cel mai probabil conservarea slab a ADN-ului n rmiele osoase. Este
bine cunoscut faptul c gradul de pstrare al moleculelor de ADN este influenat de factorii de
mediu i s-a observat c acesta poate varia chiar n rndul specimenelor excavate din acelai
complex arheologic (Burger et al. 1999). Din acest motiv analizele au fost repetate, folosind
dinii biradiculari (premolari) ca surs de ADN.
Rezultate obinute pentru extracia ADN cu coloane silica (M4, M5, M8)
Iniial, s-a ncercat extracia ADN -ului prin aceast metod din os, dar metoda s-a
dovedit a fi ineficient, iar ca urmare, s-au utilizat dinii foarte bine conservai ca surs de ADN.
n acest mod, s-a reuit recuperarea unei cantiti suficiente de ADN pentru amplificarea tuturor
celor opt segmente care cuprind cele dou regiuni hipervariabile ale genomului mitocondrial.
Totodat, prin folosirea coloanelor cu silica la extracia ADN s-au eliminat dificultile
ntmpinate la amplificarea enzimatic din cauza prezenei urmelor unor solveni organici. n
plus, nu au rezultat amplificri n probele de control folosite la extracie, fapt ce indic absena
unei contaminri cu ADN exogen sau chiar cu ADN din prob n timpul manipulrii lor. De
asemenea, toate controalele negative de PCR au fost curate. Secvenele nucleotidice pentru
fiecare segment amplificat au nucleotide ncorporate greit (Fig. 2) ceea ce sugereaz c acestea
provin de la specimene antice care au fost supuse degradrii post-mortem.Toate aceste aspecte
cresc gradul de siguran ce reflect autenticitatea rezultatelor.
Fig. 2. Alinierea clonelor secvenializate pentru segmentul HVR-I D, individul M4
Pentru fiecare dintre cei trei indivizi, M4, M5 i M8 s-au analizat cte ase clone. n
secvenele pentru HVR-I provenite de la individul M4 s-au identificat 4 mutaii ce apar n toate
clonele analizate, dup cum urmeaz: 16126C, 16278T, 16299G, 16362C. Pe baza acestor
mutaii, individul M4 poate fi ncadrat n haplogrupul R0a2i cu o probabilitate de 80.2 %
conform aplicaiei on-line de atribuire a haplogrupului, cunoscut sub numele de Haplogrep
(http://haplogrep.uibk.ac.at/about.html). Dintre acestea, 16278T este substituia definitorie pentru
ncadrarea n haplogrup, iar 16299G este considerat o mutaie local privat. n regiunea HVR-
II s-au identificat 6 puncte de divergen comparativ cu rCRS: 39T, 58C, 60.1T, 64T, 263G i
315.1C. Aceste puncte de diagnostic confirm ncadrarea secvenelor de ADN mitocondrial ale
individului M4 n haplogrupul R0a2i. Dintre mutaiile regsite n semntura genetic a lui M4,
16126C este singura care a fost identificat n probele de ADN modern analizate n laborator, dar
ea a aprut ntotdeauna n conjuncie cu 16069T i conduc spre clasificarea ntr-un haplogrup
distinct, i anume J. Acest fapt confer un plus de ncredere rezultatelor obinute.
Datele de secvenializare ale individului M8 conin motivele nucleotidice
caracteristice haplogrupului U3a. Pe intervalul investigat (15989-16410, 34-377) din regiunea de
control s-au evideniat 7 mutaii, dup cum urmeaz: 16343G, 16390A, 39T, 73G, 150T, 263G i
315.1C. Primele 6 dintre acestea fac posibil ncadrarea cu o siguran de 100% n haplogrupul
U3a, iar inseria din poziia 315 este considerat un hot-spot mutaional
(http://haplogrep.uibk.ac.at/about.html). Acest tipar gentic a fost comparat cu o baz de date ce
conine informaia genetic mitocondrial a tuturor cercettorilor implicai n acest studiu,
precum i cu probele moderne analizate n laborator i nu s-au descoperit similariti, fapt ce
sporete ncrederea n rezultatele obinute.
Succesiunea nucleotidic care include HVR-I i HVR-II de la individul M1
conine variaiile specifice (16261T, 263G) haplogrupului H7a1. Gradul de confiden al acestei
ncadrri este 58,7% conform HaploGrep, din pricina faptului c restul mutaiilor care l definesc
se afl n afara regiunii examinate. Drept consecin, pentru confirmarea acestei ipoteze se vor
analiza SNPs definitorii cuprinse n regiunea codificatoare a genomului mitocondrial.
Modificarea din poziia 16261 a fost ntlnit ntr-o singur prob de ADN modern, dar asociat
cu alte cteva mutaii care contribuie la un diagnostic diferit al haplogrupului, ceea ce exclude o
posibil contaminare a probei M5.
Informaiile oferite de aceste rezultate preliminare subliniaz c indivizii analizai
poart semnturi genetice distincte. Fiind clasificai n haplogrupuri diferite, pe baza variaiei n
cadrul secvenelor nucleotidice, este sugerat absena unor relaii de rudenie pe linie matern
ntre indivizii analizai. Totui, alte legturi de tip familial, cum ar fi cel de so-soie, nu pot fi
excluse. Aceste aspecte au o importana deosebit pentru nelegerea organizrii sociale a
populaiei medievale de la Capidava. Contextul arheologic i distribuia mormintelor n situl
arheologic reflect ipoteza existenei a dou grupuri sociale distincte. Unul dintre ele cuprinde
indivizii M3i M4, singurii care au avut inventar funerar. Descoperirea mormntului subadultului
M5 n vecintatea acestor aduli, conduce spre ideea existenei unui ansamblu de tip familial.
Datele moleculare actuale aduc informaii suplimentare n acest sens, prin eliminarea ipotezei
prezenei unor legturi maternale ntre aceti indivizi.
Compararea datelor cu ADN-ul populaiilor moderne
Clasificarea variaiei ADN-ului uman mitocondrial n grupuri genealogice care au un

ancestor matern comun este utilizat n studiile de genetica populaiilor pentru urmrirea
migraiilor populaionale majore din trecutul istoric. Aceste informaii sunt deduse prin
compararea distanelor genetice observate cu cele din rndul populaiilor moderne, precum i cu
cele ilustrate n alte studii de ADN vechi.
Haplogrupul mitocondrial U3a din care face parte individul M8 reprezint o ramur a
haplogrupului major U i se deosebete de U3b prin prezena unei mutaii specifice (16390A)
ntlnit n regiunea HVR-I (Achilli et al., 2005). Prezena acestui haplogrup a fost detectat n
Fig. 3. Distribuia haplogupului mitocondrial U3 n Europa, Orientul Apropiat i Nordul

Africii (http://www.eupedia.com/europe/maps_mtdna_haplogroups.shtml#U3)
numeroase populaii actuale din Europa i vestul Asiei, cele mai ridicate frevene fiind ntlnite
n rile din preajma Mrii Negre (Bulgaria, Georgia) i Caucaz (iranieni, armeni, avari, turci),
dup cum se poate observa i n imaginea de mai jos (Fig. 3).
De asemenea, frecvene mari ale acestui haplogrup s-au distins n populaii actuale de
romi, ai cror strmoi au migrat prin teritoriul Armeniei i al Imperiul Bizantin n ruta lor spre
Europa (Malyarchuk et al., 2006). Mai mult, o frecven sporit a acestui haplogrup mitocondrial
a fost remarcat pe teritoriul Romniei, mai exact n cadrul unor indivizi de etnie romn din
Ploieti (Bosch et al., 2006). Studiul relaiilor genetice pe linie matern ce privesc legturile
dintre populaiile evreieti subliniaz, de asemenea, existena grupului genealogic U3a n rndul
acestora (Behar et al., 2008). Datele arheologice legate de populaia medieval de la Capidava,
sugereaz c probabilitatea ca aceast populaie s aib vreo conexiune cu cele evreieti este
extrem de mic, din moment ce indivizii au fost nmormntai dup un ritual cretin.Considernd
contribuia haplogrupului U3a la fondul genetic actual se poate deduce faptul c acesta a avut un
rol n istoria populaiilor strvechi, marcnd numeroase valuri de migraie din diferite perioade.
Zona Caucazian, situat ntre Levant i Europa, poate fi considerat una dintre potenialele rute
de colonizare a Europei de ctre omul modern (Schnberg et al., 2011). De asemenea, este foarte
posibil ca dispersia major din regiunea Caucaz nspre Europa de-a lungul bazinului Dunrii s
se fi realizat n timpul exapnsiunii neolitice, dei diversitatea genetic curent este influenat i
de amestecul ulterior al populaiilor (Quintana-Murci et al., 2004).
Analiza haplotipurilor mitocondriale umane din cadrul populaiilor moderne ilustreaz
frecvene ridicate pentru haplogrupul vest Eurasiatic, R0a, n numeroase din regiunile geografice
n care s-a remarcat o frecven crescut a haplogrupului U3a. Acest fapt este evideniat n cele
dou imagini (Fig. 3., Fig. 4) care surprind distribuia acestor haplogrupuri.
Fig. 4. Distribuia haplogupului mitocondrial R0 (HV) n Europa, Orientul Apropiat

i Nordulhttp://www.eupedia.com/europe/maps_mtdna_haplogroups.shtml#HV
Prezena haplogrupului R0a, cunoscut anterior drept HV, este ntlnit cel mai adesea n
structura genetic a populaiilor din Turcia, Iran, Yemen i Bulgaria
(http://www.eupedia.com/europe/european_mtdna_haplogroups_frequency.shtml).
Prezena celor mai ridicate frecvene ale acestui grup mitocondrial n peninsula arab se
poate datora faptului c n aceast regiune a avut loc o diversificare intern a sa, ca urmare a
expansiunii demografice de dup ultima glaciaiune (ern et al., 2011). n acelai timp, s-a
observat o frecven de 48% a haplogrupului R0a n cadrul aromnilor de pe teritoriul romnesc
i una de 34% pentru romnii din Constana, zona geografic n care se regsete situl arheologic
Capidava (Bosch et al., 2006). Cele dou hri ale distribuiei frecvenelor celor dou tipuri de
varieti mitocondriale oglindesc prezena unor hotspot-uri n partea sudic a Belarusului i n
sud-vestul Ucraninei. O explicaie plauzibil pentru acest aspect ar fi expansiunea nordic a
populaiilor culturii Cucuteni din regiunea pontic , n neoliticul trziu, ca urmare a invadrii
teritoriului lor de ctre indo-europeni (Nikitin et al., 2011).
Compararea datelor cu alte studii de ADN vechi
n ceea ce privete studiile de ADN vechi, literatura de specialitate despre evoluia

ADNmt este puternic dominat de probe foarte vechi care dateaz din Paleolitic, Neolitic, Epoca
Bronzului, Epoca fierului.
Acelai tipar genetic ca i n cazul individului M8 a fost semnalat prin analiza resturilor
osoase ale unui individ descoperit ntr-o peter din regiunea Levantului, un important coridor de
comunicare, migraie i comer (Salamon et al., 2010). Datarea cu carbon a osemintelor plaseaz
mormintele din aceste peteri n Epoca Bronzului (mileniul 5-4 naintea erei noastre). Un alt
haplotip identic a fost pus n eviden n cazului unui schelet din Epoca Fierului, aflat ntr-o
aezare stveche din Danemarca (Melchior et al., 2008). O frecven ridicat a liniei materne U3
a fost constatat n cadrul unei populaii Bizantine din situl arheologic Sagalassos din sudul
Anatoliei, ce dateaz din secolele 11-13 AD (Ottoni et al., 2011). Rezultatele discutate n acest
studiu subliniaz afinitatea genetic a populaiei din Sagalassos cu cea a populaiilor Balcanice, o
consecin a interaciunilor frecvente dintre ele n trecutul istoric. Mai mult, sunt prezentate dou
ipoteze pentru originea liniei mitocondriale U3. Una dintre ele identific U3 ca fiind o
component levantic, fapt explicat prin schimburile comerciale intense stabilite ntre populaii,
din cele mai vechi timpuri, dar aceasta nu exclude posibilatatea unei origini caucaziene.
Studiile de ADN vechi care s fac referire la modul n care haplogrupul R0a2i a
contribuit la diversitatea genetic a populaiei actuale sunt aproape inexistente. n literatura
actual exist un singur studiu care atribuie haplogrupul R0 unui individ descoperit n petera
Paglicci din sudul Italiei i care datez de acum 24000 de ani (Caramelli et al., 2003).
Din contextul istoric i arheologic al populaiei de secol 10-11 AD de la Capidava pot fi
deduse mai multe ipoteze pentru apartena acestora la un anumit grup populaional. Printre
acestea se numr: bulgari, turci (bizantini), avari, armeni, cumani, pecenegi, slavi. Prin
corelarea datelor moleculare cu cele istorice i arheologice se poate restrnge intervalul acestora.
Astfel, cel mai probabil indivizii analizai provin dintr-un fond bulgresc sau turanic, avnd
originea n zona Caucazului. Rezultatele genetice actuale nu exclud posibilitatea ca cei doi
indivizi s provin din acelai fond etnic. Informaii suplimentare care s ofere o imagine mai
comprehensiv asupra situaiei din regiunea Dobrogei n secolul X, pot fi ilustrate prin analiza
diversitii genetice a mai multor indivizi din necropolele din aceast zon. De asemenea, tiparul
de migraie i modul n care micrile demografice au lsat amprente n fondul genetic actual
poate fi completat prin integrarea datelor moleculare cu cele obinute prin analize de izotopi
stabili, mai exact stroniu.
Concluzii
Studiile de ADN vechi au poteialul de a oferi indicii despre modul n care evenimentele
din trecutul istoric au modelat fondul genetic actual, precum i despre legturile genetice inter i
intra populaionale. Datele de ADN vechi disponibile la ora actual sunt infinitezimal de mici,
datorit eforturilor, costurilor i dificultilor pe care o analiz de acest tip le presupune. Astfel,
cele mai multe informaii pot fi deduse logic din datele de ADN modern, corelate cu cele istorice
i arheologice.
Rezultatele moleculare din acest studiu pun n lumin informaii legate de originea
populaiei medievale excavate din situl arheologic de la Capidava, precum i despre relaiile de
rudenie dintre indivizi. Aadar, aceast populaie i are originea cel mai probabil n zona
Caucazului i face parte dintr-o populaie turanic sau bulgar. Totodat, datele moleculare
indic faptul c cei trei indivizi, M4, M5 i M8 nu mprtesc o relaie de rudenie apropiat pe
linie matern, dei alte relaii de tip familial nu pot fi excluse. Estimarea diversitii genetice a
acestei populaii este limitat de prezena n numr mare a indivizor subaduli, n cazul crora
ADN-ul este slab conservat.
O imagine mai cuprinztoare asupra trecutului istoric al acestei populaii poate fi
conturat prin integrarea datelor moleculare cu cele obinute prin analiza izotopilor stabili
(stroniu) i datarea cu carbon radioactiv.
Studiul IV.
Optimizarea diagnosticului molecular al sexului la probe arheologice umane
Scopul prii experimentale a lucrrii de fa este acela de a testa patru amorse nou concepute
pentru a amplifica fragmente din genele pentru amelogenin prezente pe cromozomul X,
respectiv Y, n vederea determinrii sexului, pe baza ADN-ului extras din dini sau oase
aparinnd indivizilor de diverse vrste, descoperii n diverse situri arheologice, fiind datai n
secole diferite. Totodat se urmrete standardizarea unui protocol, n vederea obinerii de
rezultate constante, indiferent de particularitile fiecrui individ analizat. Mai muli pai sunt
urmrii n obinerea datelor.
1. Extracia ADN-ului
Oasele sau dinii sunt utilizai n extracia ADN-ului. Cum problema contaminrii este foarte
serioas i poate influena ntr-o msur covritoare datele obinute, sunt luate msuri pentru a
diminua cantitatea de ageni contaminani care vin n contact cu fiecare prob analizat. Au fost
puse la punct dou protocoale de extracie: unul pe baz de fenol-cloroform (Harvella et al.,
2012, Hagelberg and Clegg, 1991, Ginther et al., 1992) i un altul care utilizeaz coloane cu
membran de siliciu (Yang et al., 1998, Anderung et al., 2008). Trsturile ADN-ului vechi
legate de cantitatea redus a acestuia, calitatea sczut i prezena inhibitorilor sunt luate n
calcul atunci cnd este elaborat un protocol de extracie.
a) Curarea probelor
Fiecare prob utilizat pentru extracie este mai nti splat cu ap ultrapur. Urmeaz apoi
splarea suprafeelor oaselor cu clor, respectiv imersarea dinilor n clor pentru 10-15min. Din
nou, se utilizeaz ap ultrapur pentru ndeprtarea clorului. Probele sunt ulterior lsate la UV
timp 10-15min pe fiecare parte.
b) Decalcifierea i ndeprtarea substanelor organice

Probele astfel curate sunt introduse n hot, unde cu ajutorul unui micromotor i al frezelor
dentare se obine 0,2g de pulbere din osul compact, dupa ce suprafaa acestora a fost ndeprtat,
respectiv din pulpa dentar n cazul dinilor, preferai n extracia realizat cu ajutorul coloanelor
cu membran de siliciu. Peste pulbere se adug soluia de decalcifiere. Pentru extracia cu fenol
soluia conine: 0,5M ETDA (ethylene diaminetetra-actic acid), cu rol n chelatarea ionilor de
calciu, 0,5% SDS (sodium dodecyl sulfate), 50mM TrisHCl i 1 mg/ml proteinaz K, pentru
digestia proteinelor. pH-ul soluiei se aduce la 8. Peste fiecare 0,2g pulbere os/dinte se adaug
1ml din soluia de decalcifiere, lsndu-se peste noapte la 56C. n ceea ce privete extracia cu
ajutorul coloanelor cu membran de siliciu, soluia de decalcifiere are o compoziie uor diferit:
0,5M EDTA, 5%SDS i 20mg/ml proteinaz K, aducndu-se pH-ul la 8. Se adaug 1 ml de
soluie peste pulberea de dinte. Se las peste noapte la 55C, iar apoi 24h la 37C. Pentru a
verifica gradul de contaminare cu ADN modern n timpul extraciei soluia de decalcifiere se
aplic i ntr-un tub gol, care nu conine pulbere de os sau dinte, utilizat ca i control negativ de
extracie. Dup acest pas, controlul negativ de extracie va suferi acelai tratament ca probele
propriu-zise.
c) Extracia cu fenol-cloroform
Extracia propriu-zis a ADN-ului se realizeaz ntr-o ncpere separat fizic de cea n care s-
a realizat extracia materialului osos/dentar sau de cea destinat PCR-ului, dotat cu o hot cu
presiune pozitiv. Principiul extraciei cu fenol-cloroform este acela al extraciei lichid-lichid
bazat pe separarea moleculelor pe baza gradului lor de solubilitate n medii lichide nemiscibile.
ADN-ul se gsete n fiecare etap n stratul apos, superior.
Probele coninnd pulberea de os sau dinte sunt centrifugate, prelundu-se supernatantul care
se amestec cu un volum egal de fenol-cloroform (fenol:cloroform:alcool izoamilic 24:25:1,
v/v), prelundu-se n urma unei centrifugri supernatantul. Procedeul se repet. Dup cea de-a
doua centrifugare, supernatantul se amestec cu cloroform, cu rolul de a ndeprta fenolul n
exces legat de ADN. Se preia din nou supernatantul, urmnd precipitarea ADN-ului cu etanol
absolut. Urmeaz dou splri cu etanol 80%, dup care probele sunt uscate, apoi rehidratate i
trecute prin centricon (Amicon Ultra- MILLIPORE), cu rol n concentrarea i purificarea
acestora.
Protocoale de extracie a fost testate pe o serie de indivizi aparinnd unor necropole
localizate n diferite zone geografice din Romnia, avnd vechimi diferite. Localizarea
geografic diferit presupune condiii tafonomice diferite, aciunea degradant a factorilor de
mediu diferind n funcie de amplasare. Extracia cu fenol-cloroform a fost testat pe 7 indivizi
dup cum urmeaz:
Localizarea sitului Surs de Sex atribuit dup

Individ Datare
arheologic cruia aparine ADN analiza antropologic
I1 Suplacu de Barcu Mil IV . Hr. brbat
I2 Coconi humerus
I3 Gheorghieni - vertebr posibil femeie
I4 Mireasa Secol X d.Hr molar brbat
I5 Capidava Secol X d. Hr molar brbat
I6 Capidava Secol X d. Hr molar femeie
Secol IV-V d.
I7 Histria craniu brbat
Hr
d) Extracia cu coloane cu membran de siliciu QIAquick PCR Purification Kit Protocol

(QIAGEN)
Metoda de extracie care implic utilizarea coloanelor se bazeaz pe proprietatea particulelor
de siliciu de a reine ADN-ul (Hss and Pbo, 1993). Membranele permit reinerea fragmentelor
cu dimensiuni cuprinse ntre 100pb i 10kb, excluznd nucleotidele, proteinele i srurile.
Fragmentele de ADN vechi au n general cteva sute de perechi de baze, fiind preponderent
scurte, fragmentele de dimensiuni mari, provenind de fapt de la organisme care vin n contact,
postmortem, cu dinii sau oasele analizate. Metoda este mult mai specific pentru ADN,
sczndu-se cantitatea de produi coextrai, avnd de cele mai multe ori efect inhibitor asupra
PCR-ului. Eliminarea compuilor organici din procesul de extracie, n special al fenolului, care
interfereaz n special cu determinarea spectofotometric exact a cantitii de ADN extras i
mai apoi n reacia de PCR, cresc ulterior ansa de a obine amplificarea fragmentelor de interes.
Protocolul de extracie utiliznd coloane cu membran de siliciu a fost aplicat asupra a trei
indivizi caracterizai n tabelul de mai jos.
Localizarea sitului Surs de Sex atribuit dup
Individ Datare
arheologic cruia aparine ADN analiza antropologic
I8 Curtea de Arge Secol XIV d.Hr molar brbat
I9 Capidava Secol X d.Hr molar femeie
I10 Capidava Secol X d.Hr molar brbat
e) Determinarea spectrofotometric a concentraiei de ADN din probe cu ajutorul

Spectrophotometer Nano Drop ND 1000
Spectrofotometrul permite cuantificarea cantitii de ADN la absorbana de 260nm.
Nanodropul, spre deosebire de un spectrofotometru normal, necesit un volum redus de prob
pentru a stabili concentraia acesteia. Utiliznd 1l din compusul de analizat, pe baza peak-ul de
absorbie se stabilete concentraia de acid nucleic din prob. Amplitudinea vrfului de aborbie
este proporinal cu cantitatea de acid nucleic analizat.
f) Electroforeza acizilor nucleici n gel de agaroz

Pentru a verifica dac exist ADN n probe, dup extracie, a fost realizat migrarea lor, sub
aciunea curentului electric n gel de agaroz. Moleculele migreaz cu viteze diferite n funcie
de mrimea lor, cele mai mici migrnd mai uor printre porii gelului spre deosebire de cele mai
mari.
2. Amplificarea fragmentelor de interes
Amplificarea prin PCR a fragmentelor caracteristice cromozomilor X i Y n vederea
determinrii sexului poate fi problematic atunci cnd este folosit ca matri ADN-ul vechi. Au
fost testate o serie de amorse, corelate cu diverse polimeraze ncercndu-se i adugarea unor
aditivi n vederea mbuntirii productivitii i specificitii reaciei.
a) Amorse
Amplificarea genelor pentru amelogenin corespunztoare cromozomul X i Y a avut loc
printr-un PCR multiplex. Aceeai amors forward (M4) a fost conceput pentru amplificarea
AMELX ct i pentru amplificarea AMELY. Amorsele reverse (M5 pentru AMELX, M6 pentru
AMELY) sunt specifice fiecrui cromozom (Faerman et al., 1995). Fragmentele intite sunt de
330pb pentru cromozomul X, respectiv 218pb pentru Y. Amorsa M7 a fost conceput ulterior ca
alternativ la M5 (Faerman and Bar-Gal, 1998) pentru a duce la amplificarea unui segment mai
scurt, de 270pb pe cromozomul X.
Nume amors Secven Tm(C)
Cromozom X
M4(F) 5-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3 60
M5(R) 5-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3 62
M7(R) 5-GTGACTATCTTAGAATCAGGAG-3 62
Cromozom Y
M4(F) 5-CAGCTTCCCAGTTTAAGCTCT-3 60
M6(R) 5-GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3 62
Pornind de la ideea intirii unor fragmente ct mai scurte, dorite n cazul studiului ADN-ului
vechi, patru noi amorse forward (NP_1, NP_2, NP_3, NP_4) au fost concepute ca substitute ale
lui M4. Dimensiunile fragmentelor amplificate sunt: utiliznd NP_1 243pb pentru cromozomul
X i 131pb pentru cromozomul Y, utiliznd NP_2 204pb pentru X i 92pb pentru Y, utiliznd
NP_3 181pb pentru X i 69pb pentru Y i utiliznd NP_4 212pb pentru X i 100pb pentru Y. M5
i M6 sunt folosite n continuare ca amorse reverse.
Nume amors Secven Tm(C)
Cromozom X
NP_1(F) 5-CCTCCTAAATATGGCYGTAAG-3 60
NP_2(F) 5-CRTCTCAGGRAGGYTCCATC-3 60
NP_3(F) 5-AGGGCAAAAAGTMAACTCTGAC-3 62
NP_4(F) 5-CATGAACCACTRCTCAGGRAG-3 62
M5(R) 5-TCTCCTATACCACTTAGTCACT-3 62
Cromozom Y
NP_1(F) 5-CCTCCTAAATATGGCYGTAAG-3 60
NP_2(F) 5-CRTCTCAGGRAGGYTCCATC-3 60
NP_3(F) 5-AGGGCAAAAAGTMAACTCTGAC-3 62
NP_4(F) 5-CATGAACCACTRCTCAGGRAG-3 62
M6(R) 5-GCCCAAAGTTAGTAATTTTACCT-3 62
b) Polimeraze
O serie de polimeraze au fost testate n ncercarea de a amplifica segmentele intite constant.
Probele de ADN obinute utiliznd kitul de extracie cu coloane cu membran de siliciu au dat
frecvent i constant amplificare atunci cnd a fost utilizat MangoTaqTM DNA Polymerase
(BIOLINE). n cazul ADN-ului obinut prin extracia cu fenol-cloroform niciuna din
polimerazele testate nu au dat constant rezultate. Au fost ncercate: MangoTaq TM DNA
Polymerase (BIOLINE), GoTaq DNA Polymerase (Promega), IMMOLASE DNA
Polymerase (BIOLINE) i MyFiTM DNA Polymerase (BIOLINE).
c) Aditivi
2x PolyMate Additive (BIOLINE) poate fi utilizat alturi de oricare polimeraz termostabil
avnd rolul de a crete specificitatea i productivitatea PCR-ului. Este indicat de folosit n cazul
probelor dificile, cu un coninut ridicat de GC sau cu secvene repetitive.
Cantitile utilizate pentru multiplicarea fragmentelor de interes, utiliznd MangoTaq TM ca
polimeraz sunt menionate n tabelul urmtor.
Componente Volume (l)

H2O 10.5
Buffer (5X) 5
MgCl2(50mM) 1.25
dNTP(10mM) 0.5
NP_1/2/3/4(F)(10M) 1.5
M5(R) )(10M) 1.5
M6(F) )(10M) 1.5
MangoTaq(5U/10l) 0.25
ADN(40ng/react) 3 Volum final 25l
Pentru celelalte n care sunt utilizate celelalte polimeraze difer doar tamponul cu care vine
nsoit enzima. n cazul n care este utilizat ca i aditiv 2x PolyMate Additive, acesta nlocuiete
cantitatea de ap adugat n mod normal.
Condiiile termice i numrul de cicluri necesare amplificrii segmentelor dorite sunt

urmtoarele:
Pasul din PCR Temperatura Timp Numar de cicluri

Denaturarea iniial 95C 30 s 1
Denaturarea 95C 30 s
Alinierea amorselor 58C 30 s 35/40
Extensia catenelor 72C 30s
Extensia final 72C 5 min 1
4C 1
3. Electroforeza produilor PCR n gel de agaroz (1.5-2%)

4. Purificarea produilor PCR din gel de agaroz cu FavorPrep Gel/PCR Purification Kit
(FAVORGEN)
5. Autentificarea rezultatelor
Autentificarea rezultatelor presupune discriminarea fragmentelor amplificate de pe matria de
ADN vechi, respectiv cele amplificate de pe moleculele de ADN moderne, contaminante. Pentru
acesta, fragmentele obinute prin PCR, avnd dimensiunile ateptate au fost clonate utiliznd
protocolul Sticky-end cloning protocol (Thermo Scientific). Pentru transformare au fost folosite
celule de E. coli, tulpina DH5, rezistent la amplicilin.
Plasmidele au fost purificate utiliznd kitul GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas). Dup
verificarea prezenei fragmentelor de interes, plasmidele au fost secvenializate (Macrogen,
Coreea). Pentru ca secvenele obinute s fie atribuite amplificrii de pe matria de ADN vechi
este urmrit prezena substituiilor aprute post-mortem n interiorul secvenelor analizate.
Prezena substituiilor n clonele aceluiai fragment atest faptul c acesta a fost amplificat
pornind de la ADN-ul vechi extras din osul sau dintele analizat.
Rezultate i discuii
Utiliznd amorsele propuse de Faerman, nu s-a reuit amplificarea cu succes n niciuna
din probele de ADN vechi testate (Figura 1.). Fragmentele intite, de 330pb pentru cromozomul
X, respectiv 218pb pentru Y sunt prea mari. n general, fragmentele din probele de ADN vechi
au lungimi medii de 150pb, fragmente ceva mai lungi, de 500-600pb putnd fi amplificate n
cazul indivizilor bine conservai i avnd ca int ADN-ul mitocondrial (Pbo et al., 1989).
Figura 1. Gel de agaroz coninnd produi PCR din probe extrase cu fenol-cloroform din individul I7 descoperit la
Histria. Au fost utilizate amorsele propuse de Faerman. Godeuri: 1-marker 100pb, 2- amplificare ADN extras din os
scurt, 3- amplificare ADN extras diafiza unui os lung, 4- amplificare ADN extras din epifiza unui os lung, 5-
amplificare control negativ de extracie, 6- control negativ PCR.Reacia de amplificare a fost realizat
utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase.Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru fiercare din probele
2-5 a fost nregistrat spectrofotometric (2: conc ADN- 1089.9, 260/280-1.47, 260/230- 0.53; 3: conc ADN- 550.9,
260/280-1.42, 260/230-0.8; 4: conc ADN-855.3, 260/280-1.47, 260/230-0.44, 5(control negativ de extracie): conc
ADN-34.5, 260/280-13.03, 260/230-0.05) Valorile foarte mari ale concentraiei de ADN se datoreaz prezenei altor
compui care manifest absorban la 260mn ca n cazul acizilor humici prezeni n sol. Valorile sczute ale
indicelui 260/280 (1.5) fa de valoarea la care ADN-ul este considerat pur (1.8) indic prezena proteinelor,
fenolului i a altor compui organici fenolici. Indicele 260/230 este i el sub valorile care indic puritatea (2-2.2)
marcnd prezena fenolului i a acizilor humici. Pe lng lungimea fragmentelor intite, prea mare, pentru studiul
ADN-ului vechi, prezena fenolului i al altor substane organice co-extrase determin insuccesul reaciei de
amplificare.
Amorsele nou concepute au fost testate iniial pe probe de ADN modern pentru a se
stabili dac dimensiunea fragmentelor obinute este cea ateptat (Figura 2.). Amplificarea a avut
loc cu succes fiind obinute fragmentele dorite. Segmentele intite sunt mai scurte cu cel puin
90pb faa de amorsele testate anterior, motiv pentru care sunt mult mai potrivite pentru studiul
ADN-ului vechi.
Figura 2. Gel de agaroz care ilustreaz modalitatea de funcinare a amorselor nou concepute cnd ADN -ul modern
este folosit ca matri. Godeuri: 1. marker 100pb, 2. fragment de 243pb obinut prin amplificarea de ADN feminin
(cromozom X), 3. fragmente de 243pb i 131pb obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv
Y), 4. fragment de 204pb obinut prin amplificarea de ADN feminin (cromozom X), 5. fragmente de 204pb i 92pb
obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv Y), 6.fragment de 181pb obinut prin
amplificarea de ADN feminin (cromozom X), 7. fragmente de 181pb i 69pb obinut prin amplificarea de ADN
masculin (cromozom X, respectiv Y), 8. fragment de 212pb obinut prin amplificarea de ADN feminin (cromozom
X), 9. fragmente de 2124pb i 100pb obinut prin amplificarea de ADN masculin (cromozom X, respectiv Y), 10
control negativ de PCR. Reacia de amplificare a fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase.
Dintre toate probele obinute prin extracie cu fenol-cloroform, singura amplificare

reuit n vederea determinrii sexului a fost posibil n cazul individului I3 (Figura 3.).
Rezultatele vin s confirme atribuirea sexului realizat prin analiza antropologic, remarcndu-se
n urma amplificrii doar banda caracteristic cromozomului X.
Figura 3. Gel de agaroz n care de gsesc produii PCR obinui prin analiza ADN-ului extras din individul I3.
Godeuri: 1. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_1, 2. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_2, 3.
amplificarea probei utiliznd amorsa NP_3, 4. amplificarea probei utiliznd amorsa NP_4, 5. marker 100pb, 6.
amplificarea controlului de extracie utiliznd amorsa NP_1, 7. amplificarea controlului de extracie utiliznd
amorsa NP_2, 8. amplificarea controlului de extracie utiliznd amorsa NP_3, 9. amplificarea controlului de
extracie utiliznd amorsa NP_4, 10. Control negativ de PCR. Reacia de amplificare a fost realizat
utilizndMyFiTM DNA Polymerase. Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru prob i controlul de
extracie au fost nregistrate spectrofotometric (prob: conc ADN- 401.5, 260/280-1.52, 260/230- 0.6; control de
extracie: conc ADN- 0.4, 260/280- 0.62, 260/230-0.09).
O problem important a utilizrii noilor amorse este legat de faptul c tind s formeze dimeri
atunci cnd ADN-ul folosit ca matri este n cantitate redus (Figura 4.). Dimerii formai ajung
s aib dimensiuni comparabile cu cele ale fragmentelor scurte de 69 sau 92pb amplificabile de
pe cromozomul Y. Astfel de segmente s-au obinut n ncercarea de determinare a sexului pentru
individul I4, amplificarea dovedindu-se un eec atunci cnd au fost analizate secvenele (Figura
5.).
Figura 4. Gel de agaroz care ilustreaz presupuii produi de PCR n cazul amplificrii ADN-ului extras din
individul I4. Godeuri: 1. marker 50pb, 2. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_1,3. amplificare ADN din
controlul de extrecie utiliznd amorsa NP_1, 4. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_2, 5. amplificare
ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_2, 6. amplificare ADN din prob utiliznd amorsa NP_3, 7.
amplificare ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_3, 8. Amplificare ADN din prob utiliznd amorsa
NP_4, 9. amplificare ADN din controlul de extracie utiliznd amorsa NP_4, 10. Control negativ de PCR. Reacia de
amplificare a fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase asociat cu aditivul PolyMate.Cantitatea de
ADN extras i puritatea acestuia a fost nregistrat spectrofotometric (prob: conc ADN- 8.8, 260/280-1.6, 260/230-
0.54; control de extracie: conc ADN- -0.7, 260/280- -0.91, 260/230- -0.9). Valorile indicelui 260/280, respectiv a
celui 260/230 sunt comparabile cu valorile obinute n extraciile anterior menionate, semnalnd prezena
inhibitorilor PCR. Totodat concentraia de ADN nregistrat este mult mai sczut. Absena amplificrii
segmentului specific cromozomului X, folosit ca i control pozitiv n PCR-ul multiplex de determinare a sexului
poate fi un indiciu c reacia de amplificare nu a funcionat. Totui este plauzibil i varianta ca doar segmentul
specific cromozomului Y s fie amplificat avnd n vedere faptul c fragmentul intit este mai mic.
Figuara 5. Analiza secvenelor presupuse ca fiind fragmentele obinute utiliznd amorsa NP_3 caracteristice
cromozomului Y pentru individul I4. Lungimea segmentelor se apropie de lungimea ateptat de 69pb, dar ele sunt
de fapt dimeri ai amorselor folosite NP_3, M6 i M5.
Pentru a se evita situaia analizrii dimerilor n locul segmentelor scurte potrivite de altfel
studiului ADN-ului vechi, pentru investigarea cromozomului Y se va folosi n continuare amorsa
NP_1 care permite amplificarea segmentului cel mai lung de 131pb. Deoarece NP_1 ar conduce
la amplificarea unui fragment de 243pb pe cromozomul X, sistemul multiplex de PCR nu va mai
fi folosit. Amplificrile vor fi realizate n tuburi separate, pentru cromozomul X folosindu-se ca
amors forward NP_3, ateptndu-se s fie amplificat un fragment de 181pb.
n ceea ce privete extracia cu coloane cu mebran de siliciu, s-a reuit amplificarea
fragmentelor de interes n toate probele analizate (Figura 6.).
Figura 6. Gel de agaroz care conine produii de PCR n cazul amplificrii ADN-ului extras cu coloane cu
membran de siliciu din individul I8. Godeuri: 1. amplificare specific cromozomului Y din prob, 2. marker
100pb,3. amplificare specific cromozomului Y din control de extracie, 4. control negativ PCR, 5. amplificare
specific cromozomului X din prob, 6. marker 100pb, 7. amplificare specific cromozomului X din prob, 8.
amplificare specific cromozomului X din controlul de extracie, 9. Contol negativ PCR.Reacia de amplificare a
fost realizat utilizndMangoTaqTM DNA Polymerase. Cantitatea de ADN extras i puritatea acestuia pentru prob
respectiv controlul de extracie a fost nregistrat spectrofotometric (prob: conc ADN- 18.2, 260/280-1.75,
260/230- 2; control de extracie: conc ADN- 2.2, 260/280- -1.13, 260/230- -1.3). Valoriile indicilor 260/280 i
260/230 sunt mai apropiate de valorile care definesc puritatea. Nu este astfel deloc surprinztor faptul c ADN -ul
extras cu ajutorul coloanelor cu membran de siliciu este o matri mai bun n reacia de PCR.
Autentificarea rezultatelor presupune validarea secvenelor obinute ca fiind amplificate

de pe matria de ADN vechi extras i nu de pe alte molecule de ADN contaminante, care vin n
contact cu probele. n cazul individului I8 a fost clonat i secvenializat fragmentul caracteristic
cromozomului Y. Deoarece controalele de extracie, respectiv de PCR, nu au generat amplificri,
iar personalul laboratorului n care s-a realizat analiza molecular este n totalitate de sex
feminin, contaminarea cu ADN modern n timpul analizei moleculare desfurate n laborator
poate fi exclus. Din analiza secvenelor clonelor fragmentului analizat se poate remarca
prezena unei substituii CT la captul 5 al fragmentului analizat, caracteristic moleculelor
de ADN vechi (Figura 7.). Fragmentul analizat este scurt, prezena altor substituii caracteristice
fiind limitat de dimensiunea lui. O serie de alte teste moleculare viznd ADN-ul mitocondrial
sau nuclear au foat realizate asupra aceluiai individ, n cazul tuturor reaciilor realizate
controalele de PCR i extracie fiind neamplificabile. Corelnd lipsa de amplificare din
controalele negative de extracie i PCR, cu prezena substituiei CT i rezultatele obinute n
cazul celorlate, fragmentul obinut pentru cromozomul Y poate fi considerat ca fiind amplificat
de pe matria de ADN vechi prezent n prob.
Figura 7. Alinierea secvenelor fragmentelor caracteristice cromozomului Y obinute n cazul individului I8.
Concluzii
Utilizarea amorselor propuse de Faerman n determinarea molecular a sexului nu a
condus la amplificarea segmentelor dorite, cel mai probabil, dimensiunea segmentelor intite
fiind prea mare pentru studiul ADN-ului vechi. Amorsele nou propuse care vizeaz segmente
mai scurte au condus n unele probe la amplificri caracteristice.
n ceea ce privete standardizarea unui protocol n vederea determinrii constante a
sexului utiliznd amorsele noi, acesta nu a putut fi nc pus la punct. Inconstana cu care are loc
amplificarea fragmentelor de inters se datoreaz unei serii de factori legate n primul rnd de
calitile ADN-ului extras i de cantitatea de elemente co-extrase cu efect inhibitor asupra
reaciei de amplificare.
Cu siguran metoda de extracie a ADN-ului influeneaz gradul de reuit al
amplificrii ulterioare. n cazul extraciei cu fenol, o serie de substane (fenol, acizi humici) sunt
co-extrase avnd ulterior efecte negative asupra PCR-ului. Extracia cu coloane cu membran de
siliciu ofer un ADN ca matri cu mai puini contaminani. Sursa de extracie este i ea
important dinii oferind rezultate constant mai bune dect oasele analizate.
n ceea ce privete strict eficiena amoselor sintetizate, acestea au rezultatele scontate la
amplificare n cazul n care matria de ADN este n cantitate suficient. n condiiile n care
ADN-ul vechi este degradat, amorsele tind s formeze dimeri, de dimensiuni confundabile cu ale
fragmentelor ateptate, motiv pentru care nu pot fi utilizate n PCR multiplex aa cum au fost
concepute. Amplificarea ntr-o singur reacie a fragmentelor caracteristice att cromozomului X
cat i cromozomului Y reprezint o metod rapid i eficient de atribuire a sexului. Necesitatea
utilizrii separate a amorselor nou concepute, pentru a evita dimerii este un neajuns al acestora.
O constant tinde s se observe totui n ceea ce privete extracia ADN-ului cu ajutorul
coloanelor cu membran de siliciu. n toate cazurile, amplificarea a avut succes, ADN-ul extras
fiind mai pur dect cel extras cu fenol. Amorsele ns au fost testate separat, n reacii diferite,
specifice fiecrui cromozom. n cazul polimerazei, MangoTaqTM DNA Polymerase tinde s ofere
rezultatele dorite n cazul ADN-ului extras cu ajutorul coloanelor cu membran de siliciu.
Pentru standardizarea unui protocol de determinare a sexului va fi necesar analizarea
mai multor probe pentru a se putea trage concluzii mai elocvente. Tendina de constan apare n
cazul extraciei cu coloane cu mebran de siliciu, cu siguran mbuntirea cantitii de ADN
extras fiind soldat cu reuita atribuirii moleculare a sexului n urma PCR-ului multiplex.
Studiul V.
Diagnosticul interdisciplinar al unui caz de diabet din perioada neolitic
Situl arheologic Suplacu de Barcu se afl n judeul Bihor, la limita cu judeul Slaj. n
aceast zon se ntalnesc trei uniti geografice importante: Cmpia de Vest, Dealurile de Vest, i
o parte a Munilor Apuseni (fig. 1.). Complexitatea structurii g eologice determin o mare
varietate de roci utile: marmur, calcar, gresie, granit, tufuri, o mare parte din ele fiind utilizate
de comunitatea de la Suplacu de Barcu pentru producerea de unelte de piatr lefuit (Ignat,
1998).
Fig. 1. Localizarea sitului arheogic Suplacu de Barcu.

(www.maps.google.ro)
Zonele mpdurite erau dominate de fag, pe lng care apar molidul, bradul, gorunul,
carpenul, ulmul i frasinul. Aceste specii au fost folosite de comunitile neolitice ca materiale de
construcii (Ignat, 1998). n ceea ce privete agricultura, se practica cultivarea cerealelor, mai
ales a grului (au fost descoperite rnie, vase de provizii).
Fauna acestei zone era una tipic pentru regiunile deluroase i montane central-europene:
cerbul, cerbul loptar, ursul, mistreul, lupul, vulpea, rsul, i numeroase psri printre care
cocul de munte, corbul i fazanul. Cercetrile arheologice au identificat prezena oaselor de
psri de talie mare cum ar fi barza, cocorul i pelicanul. Deseori sunt prezente rpitoarele
(acvile i vulturi) i n mod permanent galinaceele i anatidele. Pe lng oasele de la speciile
slbatice au fost descoperite i specii domestice: boul, oaia i capra (Ignat, 1998).
Locuinele grupului cultural Suplacu se grupeaz n a ezri permanente i sezoniere.
Aezarea de la Suplacu de Barcu-Coru este una permanent format din locuie de suprafa.
Aezrile sezoniere sunt cele din peteri (la Vadu Criului- Deven, Petera Caprelor) sau din
zonele joase, inundabile (Ignat, 1998).
Modificarea dietei - presiune selectiv asupra genelor implicate n

metabolism
Impactul pe care l-a avut adoptarea agriculturii asupra comunitilor umane a fost major
i a afectat mobilitatea, comportamentul, dieta, dinamica populaiilor etc.
Pe de o parte evoluia tehnologic i surpl usul de hran a dus la o explozie demografic
prin creterea fertilitii i scderea timpului dintre nateri (Wells & Stock, 2007).
n acelai timp, efectul asupra strii de sntate a fost unul negativ. Trecerea de la o diet
divers (carne de vnat, fructe, rdcini, semine etc.) la o diet bazat n cea mai pare parte pe
carbohidrai (amidon din cerealele cultivate, lactoza din produsele lactate ale animalelor
domesticite) duce la o serie de rezultate negative pentru sntate care se reflect n frecven a cu
care se observ deficienele nutritive i cariile dentare la astfel de populaii. n plus, traiul n
aezri permanente sau semi-peremanente alturi de animale domestice crete prevalena
zoonozelor (Pinhasi & Stock, 2011).
Apariia unor modificri ale metabolismului par a fi rezultatul presiunii selective asociate
cu domesticirea animalelor i plantelor. n Neolitic, dup trecerea la agricultur, are loc selecia
legat de persistena lactazei (Burger et al.,2007) i de numrul de copii ale genei pentru amilaz
(Perry et al., 2007).
De aceea, i apariia patologiilor metabolice, cum este diabetul n cazul de fa, poate fi
explicat prin selecia anumitor variante genetice ca rspuns la stresul nutriional asociat cu
trecerea la agricultur.
Materiale i metode
Arheologie
Situl arheologic Suplacu de Barcu Coru a fost excavat ncepnd cu anul 1973 de D.
Ignat, iar n ultimii zece ani de G. Fazeca. Punctul central al spturilor arheologice a fost
aezarea care aparine grupului Suplacu, datat n perioada Neoliticului Mi jlociu. Campania
arheologic din 2012 a utilizat metode geofizice, ceea ce a dus la identificarea a 60 de complexe
arheologice, dintre care 53 au fost investigate. Printre acestea, a fost identificat un schelet
nhumat n poziie chircit. Pe baza stratigrafiei sitului, acest complex a fost datat la aproximativ
5000 . Hr.
Antropologie fizic
Pentru analiza osteologic a fost folosit un protocol bazat pe indicaiile descrise n

Standards For Data Collection from Human Skeletal Remains (Buikstra, Ubelaker 1994) i Data
Collection Codebook (Steckel et al., 2011).
Determinarea sexului s-a fcut pe baza morfologiei craniului i a pelvisului.
Vrsta a fost estimat pe baza morfologiei simfizei pubiene, a suprafeei auriculare a
sacrului i a capetelor sternale ale coastelor.
Modificrile patologie au fost analizate urmrind descrierile fcute de Ortner, 2003,
Aufderhaide i Rodriguez -Martin, 1998, Waldron, 2009 i Pinhasi i Mays, 2008.
Pentru obinerea mai multor detalii privind aspectul unor oase afectate de fenomene
patologice au fost realizate radiografii cu raze X.
ADN vechi- probleme specifice, limite
Exist dificulti ntruct dup moartea organismului mecanismele reparatorii nu mai

funcioneaz i ADN se degradeaz n timp. Acesta se gsete sub forma unor fragmente de
cteva sute de perechi de baze. n plus, apar modificri precum: monocatene i situsuri apurinice
datorate hidrolizei, dezaminarea citozinei i tranziia ei n timin, oxidarea care mpiedic reacia
de PCR i alchilarea ADN (Lamers, Hayter, & Matheson, 2009).
Datorit faptului c ADN vechi se gsete n cantitate mic i degradat sunt necesare
msuri de protecie pentru a evita contaminarea cu ADN modern. Toate experimentele s-au
desfoar n condiii standard de sterilitate, ntr-un laborator dedicat exclusiv acestui scop.
Laboratorul este separat de cel n care se lucreaz cu ADN modern, care se afl la un etaj diferit
n cadrul aceleiai cldiri. Toate probele au fost verificate, att n etapa de extracie ct i n cea
de PCR, prin una sau mai multe probe control.
Selecia genelor, proiectarea amorselor
Exist numeroase studii care i propun s descopere asociaia dintre unele mutaii i
apariia diabetului zaharat. Exist un numr de mutaii care sunt asociate consecvent cu un risc
crescut de apariie a diabetului. Dintre aceste mutaii au fost selectate cele de interes n acest
studiu.
Selecia s -a fcut innd cont de mai multe variabile: vrsta individului la momentul
morii, sexul brbtesc, caracteristicile dietei specifice Neoliticului european. n plus, deoarece
structura genetic a populaiilor neolitice europene este diferit de cea a populaiilor actuale,
trebuie luate n considerare rezultatele studiilor genetice obinute pentru o ct mai mare varietate
de populaii moderne.
Avnd n vedere c vrsta individului a fost estimat la 33-45 de ani, i c individul a trit
cu diabet suficient timp inct s dezvolte complicaiile osoase asociate, vrsta de debut se
ncadreaz n intervalul 20-40 de ani.
Un alt aspect important este dieta. Lund n considerare ceea ce se cunoate despre dieta
tipic a comunitilor neolitice (Richards et al., 2003) dar i faptul ca individul nu prezenta
markeri osoi asociai cu obezitatea, am ales s exclud mutaiile implicate n metabolismul
lipidic i obezitatea central care ar putea duce la apariia diabetului.
Avnd n vedere aceste informaii, analiza genetic a urmrit cteva SNP asociate cu
MODY, rezistena la insulin i diabet ul mitocondrial.
Termenul MODY (Maturity Onset Diabetes of the Young) este folosit pentru a descrie un
grup de forme de diabet non insulino-dependent, heterogen din punct de vedere al cauzelor
genetice. Mutaiile implicate n MODY afecteaz dezvoltarea/diferenierea sau funcionarea
celulelor pancreatice n diferite moduri; acestea se reflect n diferene n ceea ce privete
vrsta de debut, gravitatea hiperglicemiei i riscul apariiei complicaiilor (Ellard & Hattersley,
2008).
Mutaiile care duc la pierderea funciei n genele pentru glucokinaz (GCK) i factorul
nuclear hepatic 1 (HNF1A) sunt cea mai comun cauz a diabetului monogenic i apar la
aproximativ 80% din pacienii diagnosticai cu diabet monogenic n Marea Britanie (Ellard,
Thomas, Edghill, & Owens, 2007). Mutaiile care afecteaz gena HNF4A sunt de asemenea o
cauz pentru MODY (Molven & Njlstad, 2011).
SNP rs1799884 n gena GCK este unul din SNP relativ comune care au fost asociate cu
apariia diabetului de studiul DESIR (Data from the E pidemiological Study on the Insulin
Resistance Syndrome) realizat pe 3877 de indivizi caucazieni. Indivizii homozigoi A:A sau
heterozigoi A:G prezint un risc crescut de a dezvolta diabet de tip 2 (Vaxillaire et al., 2007).
SNP rs2144908 n gena HNF4a a fost asociat cu riscul crescut pentru diabet de tip 2 n
studii realizate pe populaii de evrei a shkenazi (Love-Gregory et al., 2004) i finlandezi (Silander
et al., 2004). De asemenea, este una din mutaiile vizate de studiul DESIR (Vaxillaire et al.,
2007).
SNP rs1169288 n gena HNF1a a fost asociat cu apariia MODY 3 n studii realizate pe
pacieni din Suedia i Finlanda (Giuffrida et al., 2009).
SNP rs3792267 n gena CAPN 10 a fost asociat cu diabetul de mai multe studii realizate
pe populaii europene din Germania, Finlanda, Danemarca, Marea Britanie, Polonia, Cehia i
Frana (Tsuchiya et al., 2006).
O alt mutaie pe care am urmrit-o n acest studiu este i cea mai comun mutaie n
ADN mitocondrial asociat cu diabetul: A3243G n gena care codific ARNt Leu (MTTL1)
(Janssen et al., 2007).
Tabel 1. Sumarul mutaiilor analizate

Gena SNP Element codificat Funcia n celul Asociat cu
GCK rs1799884 Glucokinaza Fosforileaz glucoza la MODY

GA glucoz-6-fosfat
MTTL1 3243 ARNt Leu ARNt pentru sinteza Diabet i surzenie

AG mitocondrial/ proteinelor transmise pe linie
matern
HNF4A rs2144908 Factorul nuclear Factor de transcriere MODY
GA hepatic 4
HNF1A rs1169288 Factorul nuclear Factor de transcriere MODY
TG hepatic 1
CAPN10 rs3792267 Calpain 10 Proteaz activ n Rezisten la insulin
GA pancreas
Tabelul 1 sumarieaz informaiile despre SNP selectate pentru a fi detectate n analiza

cazului de la Suplacu.
Avnd n vedere vechimea rmielor arheologice (6000 de ani) secvenializarea genelor
n ntregime nu este o strategie fezabil. Cel mai probabil, ADN este degradat i fragmentat ,
majoritatea fragmentelor avnd lungimi de cteva sute de perechi de baze. De aceea, am ales s
folosesc amorse care s amplifice fragmente de 100-150 de perechi de baze n jurul mutaiei de
interes. Amorsele au fost proiectate cu ajutorul aplicaiei NCBI primer BLAST tool
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Amorsele folosite se regsesc n tabelul 2.
Tabel. 2 Amorsele folosite pentru amplificarea secvenelor int
Gena SNP Amorse Lungimea produsului

PCR
GCK rs1799884 Forward:CACATCCTAGCCTGCTTCCC 132
Reverse:TGGTCACCATGACAACCACA
Forward: GGTGTGGAGGGGGGATTCT 143
Reverse:TTGCCACCAGTCCCAGTTTTA
MTTL1 A3243G Forward: TTATACCCACACCCACCCAAG 143
Reverse: TACAATGAGGAGTAGGAGGT
HNF4A rs2144908 Forward:CCGTGGGGAACAAGGATGTAA 131
Reverse:AGAGTCAGGAGATCAGGCCC
HNF1A rs1169288 Forward: CCCTGTGGCAGCCGAG 141
Reverse: TTCTCCAGCCAGGAGGTAGG
CAPN10 rs3792267 Forward: ACACCGGATGCCAGAGAGTT 111
Reverse: CATCCTCACCAAGTCAAGGCT
Analiza izotopic
Datarea cu radiocarbon a fost metoda folosit pentru a confirma vechimea estimat a

scheletului de la Suplacu de Barcu.
Analiza izotopilor stabili de carbon i azot din colagenul din oase este folosit n studiile
de bioarheologie pentru reconstrucia dietei/ nutriiei.
Se poate stabili dac sursa primar de proteine din diet era de origine animal, vegetal
sau o combinaie din cele dou. Proporia izotopilor 15N la 14N indic nivelul trofic al unui
organism. Animalele ncorporeaz preferenial 15N din surse alimentare. Aadar, raportul 15N la
14
N crete pe niveluri trofice succesive.
Cantitatea de 13C raportat la 12C este o msur a dependenei alimentare de plante cu
metabolism C3 sau C4. Att planete C3 ct i plantele C4 sunt mai srace in 13C dect sursa lor
de carbon, CO2 atmosferic. Datorit diferenelor din fotosintez, plantele C3 ncorporeaz mai
puin 13C dect plantele C4 (Leatherdale, 2013).
Analiza a fost facut extern, de ctre Beta Analytic Inc (Florida, SUA).
Spectroscopie n infrarou cu transformat Fourier (FT-IR)
Spectroscopia n infrarou cu transformat Fourier este o tehnic prin care se poate obine
un spectru de absorbie pentru un domeniu larg de spectre , simultan. FT-IR este folosit pentru a
identifica i cuantifica gruprile funcionale polare din structura unei probe (White, 1990).
FT-IR este o metod potrivit pentru a evalua variaiile n compoziia chimic a osului.
Msuratorile cantitative ale compoziiei chimice a osului pot oferi informaii despre formarea
osului i pot indica eventuale patologii.
Diabetul zaharat determin apariia unor anomalii musculo -scheletale:
osteopenie/osteoporoz, i dificulti n vindecarea oaselor lezate (Kim et al., 2001). Diabetul
poate afecta formarea si resorbia oaselor prin determinarea multor modificri metabolice ce
afecteaz echilibrul fosfo-calcic i acido-bazic.
ntr-un studiu realizat pe obolani diabetici s -a observat o scdere a coninutului total de
colagen n calusul format dup fracturi fa de grupul control. Cantitatea de colagen a fost
estimat prin msurarea raportului fosfat/carbonat detectat prin FT-IR (Boyar et al., 2003).
Pentru analiza FT-IR s-a folosit pulbere de os obinut mecanic prin frezare. 0,8mg de
pulbere de os au fost amestecate cu 150mg de KBr i presate la presa hidraulic la 175 kg/cm2.
Spectrele FT-IR au fost obinute cu ajutorul aparatului FT/IR JASCO 6000, folosind platforma
software Spectra Manager. S-a construit spectrul de absorbie ntre numere de und 400 i 4000
cm-1, cu 265 de scanri i rezoluie de 4 cm -1. Spectrele obinute au fost normalizate i prelucrate
cu ajutorul softului Essential FTIR (http://www.essentialftir.com/).
Un spectru tipic pentru os este prezentat n figura 2.
Fig.2. Spectru FT-IR tipic pentru os. (dup Kobrina et al.,

2010)
Raportul carbonat la fosfat a fost calculat ca raportul dintre suprafaa de sub maximul
pentru CO32- (850-890 cm-1) i PO 43- (900-1200 cm-1) (Boyar et al., 2003).
Metode moleculare
Extracia ADN
O caracteristic a lucrului cu ADN vechi este necesitatea de a evita contaminrile cu

ADN din surse externe. ADN vechi se gsete degradat i n caniti mici. n cazul unei
contaminri cu ADN extern, n reacia PCR va fi folosit ca matri ADN mai puin degradat. Din
aceast cauz n laboratoarele de ADN vechi trebuie s existe un circuit cu un singur sens:
extracia ADN, PCR, prelucrare post-PCR. Asta nseamn c laboratorul de extracie ADN este
izolat spaial de laboratorul de PCR.
Pentru a evita contaminarea ntre probe succesive, laboratorul este curat nainte de
fiecare utilizare cu o soluie de 5% Clor i iradiat cu UV. Extracia se face ntr -o hot nchis cu
presiune pozitiv i filtre de aer HEPA. Interiorul hotei se cur cu so luia de Clor nainte de
fiecare extracie, i lmpile UV funcioneaz minim 4 ore nainte de introducerea probelor.
Accesul n laborator se face individual; echipamentul standard este format din:
combinezon de unic folosin, acoperitori de nclminte , mnui din latex i masc cu filtru
pentru particule.
Toate tuburile de plastic folosite n procesul de extracie sunt sterilizate prin autoclavare
i iradiere cu UV.
Datorit nhumrii, n probe exist acizi humici din sol. Acetia, dar i calciul din oase,
sunt inhibitori ai reaciei PCR. Decalcifierea oaselor este o etap obligatorie nainte de extracia
propriu-zis.
Cum nu exist un protocol de extracie a ADN vechi care s fie eficient n orice situaie,
fiecare grup de cercetare i stabilete propriul protocol prin adaptarea celor deja existente. Am
folosit dou metode de extracie: una bazat pe un protocol clasic cu fenol -cloroform i cealalt
utiliznd un kit de purificare a produilor de PCR. Sursele de ADN folosit sunt oasele lungi
(femur, humerus) i molarii biradiculari.
Protocolul de extracie cu fenol cloroform a fost elaborat pe baza celor folosite de
Hervella et al., 2012, Ginther et al., 1992 i Hagelberg & Clegg, 1991:
1. Curarea oaselor
Splare cu soluie clor 5% i H 2O UP/UV.
Iradiere cu UV 20 minute
ndeprtarea suprafeei osului.
UV, 10 minute.
Osul sau dintele au fost apoi pulverizate cu ajutorul unei freze dentare, pulberea obinut
fiind folosit n etapele urmtoare.
2. Decalcifierea
Soluie de decalcifiere: EDTA 0,5M, SDS 0,5%,TrisHCl 50mM, proteinaz K
1 mg/ml, pH=9.
Pulberea de os este incubat cu soluia de decalcifiere timp de 24 de ore, la 56 oC.
3. Extracia cu fenol -cloroform.
Centrifugare 5 min, 6.000x g.
1 vol. Supernatant + 1 vol. fenol:cloroform 1:1. Centrifugare 15 min, 6.000x
g.
1 vol. faza organic (superioar) + 1 vol. fenol:cloroform 1:1. Centrifugare 15
min, 6.000x g.
1 vol. faza organic + 1 vol. cloroform. Centrifugare 15 min, 6.000x g.
Precipitare cu etanol: 1 vol. faza organic + 2,5 vol. etanol absolut, 10 min la -
4oC. Centrifugare 15 min, 12.400x g.
Splare cu etanol: Precipitatul + 1 mL etanol 80%. Centrifugare 5 min,
12.400x g.
Uscare la 56oC.
Precipitatul se resuspend n 1 mL H2O PCR-grade.
4. Filtrare prin filtre Centricon 30k. Centrifugare 10 minute, 5.000x g.
Protocolul de extracie cu kit QIAQuick PCR Purification Kit (Quiagen) cu coloane cu

membran de silica (Yang et al., 1998; Anderung et al., 2008):
1. Curarea oaselor se face prin aceeai metod ca n protocolul de extracie cu

fenol-cloroform .
2. Decalcifiere
Soluie de decalcifiere EDTA 0,5M, SDS 5%, proteinaz K 20 mg/mL.
Pulberea de os este incubat cu soluia de decalcifiere timp de 24 de ore, la 55oC apoi
nc 24 de ore la 37 oC.
3. Extracia ADN
Centrifugare 5 min, 2.000x g.
Supernatantul + 5 vol. PB Buffer.
Amestecul se filtreaz printr-o coloan cu silica prin centrifugare 1 minut la
12.400x g. Se arunc filtratul.
4. Splare
Se ncarc 750L PE Buffer n coloan i se centrifugheaz 1 minut la
12.400x g. Se arunc filtratul i se repet pasul de splare.
Se arunc filtratul i se centrifugheaz 1 min la 12.400x g pentru ndeprtarea
complet a etanolului.
5. Eluare.
Se transfer coloana n tub nou de 1,5mL i se adau g 100L Elution Buffer.
Se incubeaz la temperatura camerei timp de 5 miute.
Centrifugare 1 minut la 12.400x g.
Evaluarea randamentului extraciei a fost bazat pe determinarea spectrofotometric a

concentraiei ADN.
PCR
n laboratorul de PCR s-au urmrit aceleai condiii de sterilitate ca i n cel de extracie.

Pentru amplificarea fragmentelor de interes s-au folosit amorsele desrise n tabelul 2.
nainte de utilizarea lor n lab de ADN vechi, amorsele au fost nti testate pe probe
moderne de ADN uman.
Pentru optimizarea PCR cu ADN vechi, am testat o serie de polimeraze: MangoTaq
(Bioline), Kapa2G Robust HotStart (Kapa Biosistems), Kapa2G Robust (Kapa Biosistems),
Kapa HiFi HotStart (Kapa Biosistems), MyTaq (Bioline), PlatinumTaq (Invitrogen). Mango Taq
a dat cele mai bune rezultate, aadar a fost folosit n majoritatea reaciilor.
Protocolul de baz pentru volum final 25L.
Concentraia iniial Volum iniial Concentraia final Program
Buffer 5x 5L 1x
MgCl2 50mM 1L 2mM
dNTP 10mM 0,5L 0,2mM 95oC 5
Forward 10pmoli/L 1,25L 0,5pmoli/L 95oC - 30
Reverse 10pmoli/L 1,25L 0,5pmoli/L Ta - 30
MangoTaq 5U/L 0,25L 1,25 U/reacie 72oC 30
ADN 1L 95oC 5
H2 O 14,75L
Optimizarea protocolului de PCR a fost fcut prin modificri ale concentra iei de MgCl2
(ntre 2 i 2,5mM), numrului de cicluri (ntre 30 i 40), cantitii de ADN (ntre 0,5 i 7 L).
Verificarea existenei ampliconului de dimensiunea ateptat s -a fcut prin electroforez
n gel de agaroz (1,5% agaroz).
n cazul n care exist ampliconul ateptat, banda a fost excizat din gel i ADN purificat
cu ajutorul kitului FavorPrep GEL Purification Kit (Favorgen).
Clonare si secvenializare
nainte de secvenializare este necesar o etap de clonare. Astfel se pot selecta pentru
secvenializare doar plasmidele care conin insertul de dimensiunea dorit; iar dupa obinerea
secvenelor se poate face distincia dintre o mutaie (care apare n toate clonele) i o eroa re
datorat degradrii postmortem (care apare doar n unele clone).
Pentru clonare a fost folosit kitul CloneJET PCR Cloning Kit (Thermo Scientific).
Bacteriile competente folosite au fost E.coli XL1-Blue sau E. coli DH5.
Bacteriile transformate au fost inoculate pe plci cu mediu LB solid i ampicilin 100
mg/L. Au fost folosite 6 colonii/plac care au fost transferate n 4 mL de mediu LB cu 100 mgL
ampicilin i incubate la 37 oC cu agitare continu timp de 16 ore. Plasmidele au fost izolate cu
ajutorul GeneJET Plasmid MiniPrep Kit (Thermo Scientific).
Prezena insertului a fost verificat prin digestie cu enzima Bgl II i electroforez.
Interpretarea secvenelor
Pentru fiecare produs PCR de interes au fost secvenializate 6 clone de ctre Macrogen
Inc (Coreea de Sud).
Analiza secvenelor obinute a fost fcut cu ajutorul softului BioEdit.
Rezultate i discuii
Antropologie fizic
Scheletul aparine unui brbat cu vrsta cuprins ntre 33 i 45 de ani. Scheletul este bine
conservat, cu excepia cutiei craniene. Lipsesc 4 dini datorit proceselor postmortem.
Din 32 de dini permaneni rupi, individul a pierdut 11 n timpul vieii. n ceea ce
privete patologiile dentare, se pot observa 5 abcese i 4 carii. Uzura suprafeei molarilor este
moderat pn la sever (scoruri ntre 4 i 8 conform Data Collection Codebook, (Steckel et al.,
2011)). n plus, caninul maxilar stng prezint o uzur neobinuit pe latura lingual care
sugereaz o utilizare special, non-alimentar. (figura 3) Hipoplazia smalului nu exist sau nu a
putut fi observat din cauza numarului mare de dini pierdui.
Fig.3. Caninul maxilar stng.
n analiza scheletului au fost urmrii i o serie de markeri specifici pentru stresul

profesional, stresul nutriional sau patologii nespecifice.
Fig.4. Distribuia
proceselor degenerative
Au fost observate modificri degenerative n mai multe articulaii (figura 4). n ceea ce
privete membrele superioare, cel drept este mai afectat, procesele degenarative fiind prezente pe
capul humeral i oasele minii. n cazul membrelor inferioare, este afectat centura pelvian:
acetabulul i capul femural.
Toate regiunile coloanei vertebrale prezint osteofite de dimensiuni medii. n plus,
ultimele dou vertebre lombare sunt sudate ntre ele i cu prima vertebr sacral prin formaiuni
osoase specifice pentru DISH (Diffuse Idiopathic Skeletal Hyperostosis). DISH este caracterizat
prin osificarea ligamentelor longitudinale ale coloanei vertebrale ce rezult n fuziunea
vertebrelor afectate (Dupras et al., 2010). Poziia coloanei vertebrale este afectat de aceast
fuziune anormal a vertebrelor. (figura 5)
Pe suprafaa orbitei drepte se observ aspectul poros c aracteristic pentru cribra
orbitalia.(figura 6)
Fig. 5. DISH Fig. 6. Cribra orbitalia
Pe diafizele tibiilor se observ urme de osteoperiosit.

Patru dintre coaste prezint fracturi antemortem remodelate. Starea precar de conservare
a coastelor nu a permis stabilirea poziiei acestora n cadrul cutiei toracice. Dei fracturile sunt
bine aliniate, n procesul de vindecare s-a produs calus osos n zona leziunii.
Cele mai notabile modificri patologice prezente pe acest schelet sunt leziunile litice
bilaterale pe calcanee. Leziunile sunt situate pe tuberozitatea calcaneului, n punctul de inserie al
tendonului lui Ahile. Calcaneul drept este cel mai afectat; leziunea msoar 18,5 x 23.6 mm.
Formarea exostozelor n jurul marginii leziunii sugereaz c piciorul a fost folosit dup
dezvoltarea infeciei. Trsturile morfologice indic faptul c infe cia era activ n mometul
morii individului. Modificrile observate pe calcaneul stng indic o infecie similar, dar ntr -
un stadiu mai puin avansat. Tuberozitatea calaneului stng prezint erodare, cu patru caviti de
dimensiuni mici (figura 7).
Fig. 7. Leziuni pe calcanee

Pentru a evalua gradul de extindere a leziunilor, au fost fcute radiografii pentru aceste
oase. (figura 8.)
Fig. 8. Radiografii cu raze X ale oaselor calcanee.
Diagnosticul diferenial
Individul a suferit o serie de modificri patologice i traume descrise n analiza de mai

sus. Pentru a le determina cauza, mai multe variante de diagnostic au fost luate n considerare:
osteomielita, tuberculoza, bruceloza i diabetul zaharat.
Punctul de plecare n acest diagnostic au fost leziunile de pe calcanee. Acestea ar putea fi
datorate piciorului diabetic, o complicaie comun a diabetului netratat.
Alte simptome asociate cu diabetul sunt capsulita adeziv (limitarea mobilit ii
articulaiei gleno-humerale) i DISH (Dupras et al., 2010).
Asocierea diabetului cu patologiile dentare este de asemenea un motiv n plus pentru
susinerea diagnosticului de diabet. Complicaiille diabetului netratat includ gingivita,
periodontita, cariile, xerostomia i pierderea dinilor (Dupras et al., 2010).
Analiza izotopic
Vrsta scheletului, determinat prin metoda datrii cu radiocarbon este 5890 30 ani.
Raportul 13C/12C n colagenul din oasele scheletului de la Suplacu este -20,7. Pentru
plantele C3, raportul este -27,1, iar pentru plantele C4, -13,1. De aici rezult ca ponderea
plantelor C3 i a celor C4 era echilibrat n dieta acestui individ.
Raportul 15N/14N este +10,1. n lipsa unor rmie scheletice din acelai sit, raportul
acesta poate fi interpretat prin comparaie cu o populaie de vechime asemntoare (Richards et
al., 2003). Raportul 15N/14N este mai mare dect al animalelor ierbivore, ceea ce indic o diet a
acestui individ bogat n proteine animale.
Spectroscopie n infrarou cu transformat Fourier (FT-IR)
Raportul carbonat la fosfat a fost calculat ca raportul dintre suprafaa de sub maximul
pentru CO32- (850-890 cm-1) i PO 43- (900-1200 cm-1).
Am comparat valorile raportului fosfat/carbonat ntre oase neafectate de patologii pentru
Suplacu i 3 indivizi din situl arheologic neoliti c de la Turda. Datele obinute sunt n tabelul 3 i
reprezentate n graficul 1.
10
Tabel 3. Raportul fosfat /
carbonat pentru oase neafectate 9
9.09
8
Proba Fosfat/carbonat
Suplacu 3.8 7
P/C
Turda 1 9.09 6
Turda 2 5.88 5.88
5
Turda 3 5
5
4
3.8
3
Suplacu Turdas 1 Turdas 2 Turdas 3
Grafic 1. Comparaia raportului fosfat/carbonat ntre individul de la Suplacu

i indivii aparent sntoi.
Pentru a evalua variaia ntre diverse zone ale scheletului, am comparat valorile obinute
petru oase neafectate vizibil (femur) i oase cu modificri patologice (vertebra L4, mandi bul).
Datele obinute sunt n tabelul 4 i reprezentate n graficul 1.
Tabel 4. Raportul fosfat / carbonat

pentru diferite zone ale scheletului
Proba Fosfat/carbonat
femur 1 3.7
femur 2 4
femur 3 3.7
L4 1 5.5
L4 2 4.5
L4 3 4.2
mandibula 1 4
mandibula 2 4.5
mandibula 3 3.6
Grafic 2. Comparaia raportului fosfat/carbonat diferite zone ale
scheletului.
Modificarea raportului fosfat/carbonat n scheletul de la Suplacu poate indica o dereglare
a echilibrului fosfo-calcic ce poate fi explicat prin mobilizarea fosfatului din oase. Osteopenia
observat n radiografii este n concordan cu acest rezultat.
O dereglare a metabolismului fosforului se poate explica i prin corelaia cu o insuficien
renal datorat nefropatiei diabetice (Silva et al., 2013).
ADN
Extracia ADN prin metoda cu coloane cu membran de silica s-a dovedit a fi mai
eficient dect cea cu fenol-cloroform, din punct de vedere al concentraiei ADN, dar mai ales
prin lipsa contaminrii cu fenol i a randametului reaciilor PCR.
Amorsele au fost nti testate n reacii PCR cu ADN modern (3 probe i un control
negativ) (figura 9).
Fig. 9. Testarea amorselor cu ADN modern.
Fragmentele de interes au fost amplificate (figura 10) i clonate.

Fig. 10. PCR cu ADN vechi.
Secvenele obiute pentru MTTL1 (n reacii duplicat) i GCK nu indic prezena SNP
vizate. Repetarea secvenializrii pentru GCK a returnat secvene care se aliniaz parial cu
secvena de referin i conin deleii. Celelalte secvene nu au fost infor mative, fie pentru c nu
se aliniau n zona nucleotidului vizat, sau conineau amplificri nespecifice din ADN bacterian
din sol.
Discuii
Modificrile patologice observate pe scheletul individului de la Suplacu de Barcu sunt

asemntoare cu cele pe baza crora a fost diagnosticat cu diabet scheletul de la Dayr al-Barsha,
Egipt.
Rezultatele obinute prin FT-IR indic o afeciune care afecteaz ntreg scheletul
(sistemic).
Absena mutaiilor vizate indic , fie faptul c sunt mutaii mai rare, care au o frecven
mai redus n populaia contemporan , fie faptul c segmentele selectate pentru analiz nu conin
acele SNP care conduc la apariia diabetului la acest individ.
Concluzii
Analiza scheletului cercetat pe parcursul acestei teze a condus autorii spre un diagnostic
prezumptiv de diabet zaharat de tip 2 cu debut la maturitate pe baza analizei antropologice fizice.
Teza are ca obiect ncercarea de confirmare a diagnosticului prin metode de genetic molecular
prin analiza a cinci SNP dintre care unul apartinand genomului mitocondrial i patru genomului
nuclear.
Niciuna din mutaiile ateptate nu a fost revelat, fie datorit absenei sale, fie datorit
faptului c ADN vechi obinut a fost prea alterat pentru a conduce la amplificarea intelor.
Studiul va continua cu validarea rezultatelor obinute i extinderea analizei la alte
segmente int omise pana n acest moment.
Pe lang analiza antropologic fizic, care susine n continuare diagnosticul de diabet de
tip 2 cu debut la maturitate, i analizele FT-IR vin s ntreasc acest diagnostic.
Studiul VI.
Mormntul 10 din Biserica Sf. Nicolae Domnesc de la Curtea de Arge
(CO i P1 Adrian Ioni, Alexandru Simon, Beatrice Kelemen )
Obiectivele studiului preliminar
1. Analizarea regiunii de control a genomului mitocondrial n vederea prediciei

haplogrupului mitocondrial
2. Verificarea prin metode moleculare a sexului individului
3. Verificarea apartenenei individului la haplogrupul Y Ra1a, cel mai vechi haplogrup Y
descoperit la indivizi moderni purtnd numele Basarab
4. Verificarea prin metode moleculare a culorii ochilor (principal), prului (secundar)
pentru individul studiat
Extracia de ADN (realizat dup protocolul Yang et al, 1998) a permis recuperarea a 100
microlitri ADN total cu o concentraie de 18ng/microlitru.
1. Dup amplificarea, clonarea i secvenializarea celor 8 fragmente care reconstruiesc

regiunea de control a genomului mitocondrial, pentru individul M10 de la Biserica Sf. Nicolae
din Curtea de Arge au fost identificate urmtoarele mutaii care l difereniaz de rCRS (revised
Cambridge Reference Sequence):
16093C 16291T 39T 73G 152C? 185A 263G
Analiza de predicie a haplogrupului mitocondrial a fost efectuat folosind platforma Haplogrep

(haplogrep.uibk.ac.at).
Cele mai probabile ncadrri sunt, n acest moment:

Haplogrup M5a1a - 73-185-263
Haplogrup H3v2 - 16093-73-263
Apartenena exact la unul din cele dou haplogrupuri va fi verificat dup o extracie ulterioar
de ADN prin amplificarea, clonarea i secvenializarea mutaiilor de diagnostic din regiunea
codificatoare a genomului mitocondrial.
Conform Eupedia haplogrupul M5a1a are o frecven crescut in populaia modern din
subcontinentul Indian, n timp ce haplogrupul H3v2 are frecven crescut n populaia modern
din Germania (rile German ice).
Secvena obinut pentru acest marker molecular la individul M10 a fost comparat cu singurele
date moleculare omoloage publicate pentru o comunitate cuman din punct de vedere cultural,
dar vestic din punct de vedere molecular (Bogacsi-Szabo et al, 2005). ntre cei 11 indivizi
analizai n cadrul acestui studiu, nu a fost semnalat prezena haplogrupului M5a1a, iar indivizii
majoritari, ncadrai n haplogrupul H, nu au fost ncadrai exact ntru -un subhaplogrup.
Pn la identificarea exact a haplogrupului/haplotipului mitocondrial, orice supoziie privind o
potenial ereditate matern legat de continental Asiatic i eventual migratori din aceast
regiune, nu poate fi verificat.
2. ADN-ul extras a avut o calitate suficient de bun pentru a permite amplificarea unor
fragmente relevante din genele ce codifica amelogenina pe cromozomii X i Y n vederea
atribuirii prin metode moleculare a sexului. Rezultatul acestei amplificri a condus la concluzia
c individul M10 a aparinut sexului brbtesc. Dei inventarul individului i analiza de
antropologie fizic au preconizat aceast concluzie, atribuirea molecular a sexului ndeprteaz
orice fel de dubii n aceast privin.
3. Pornind de la studiul publicat de Martinez-Cruz et al, 2012, i datorit cantitii limitate

de ADN genomic disponibil am verificat apartenena individului la cel mai vechi haplogrup Y
descoperit la purttori moderni ai numelui Basarab (i care, prin studii genealogice, pot s i
urmreasc ascendena n familia istoric a Basarabilor). Acest haplogrup Y, R1a1, este definit de
mutaiile M17 (rs3908 4G3G) i M56 (rs2032622 AT), care n urma investigaiilor nu au
fost descoperite la individual M10 din Curtea de Arge. Astfel, excludem relaia dintre individual
studiat i cei trei indivizi moderni purtnd numele de Basarab (1 din Ungaria, 2 din judeul Ilfov)
ncadrai n acest haplogrup. Analize ulterioare, dup o extracie viitoare de ADN genomic, vor
verifica apartenena lui M10 din Curtea de Arge la celelalte 10 haplogrupuri Y caracterizate
pentru indivizii moderni purtnd numele Basarab.
4. Analiznd 6 mutaii punctiforme folosite n criminalistic i medicin legal pentru

reconstrucia culorii ochilor i prului (Rs12913832 (HERC2), Rs1800407 (OCA2), Rs12896399
(SLC24A4), Rs16891982 (SLC4A2), Rs1393350 (TYR), Rs12203592(IRF4)), se relev faptul
c ndividul M10 din Curtea de Arge a avut cu o probabilitate de 97,3 % ochi nchii la culoare i
cu o probabilitate de 99,0% pr de culoare castaniu nchis, ceea ce sus ine descoperire iniial a
unei uvie nchise la culoare la deschiderea iniial a morm ntului, dar i iconografia asociat
adesea cu indivizi aparinnd familiei Basarabilor.
Concluziile preliminare privind acest individ, bazate pe analiza contextelor arheologic, istoric i
biologic este c:
- Aparine familiei Basarabilor, dar nu acelei ramuri care confer indivizilor moderni
haplogrupul Y R1a1
- Nu este probabil, nici Vlaicu Vod, nici Radu Vod (ambele, nume sub care M10 a fost
identificat anterior)
- Nu se pot trage concluzii privind o potenial ereditate cuman (cultural), asiatic (din
punct de vedere genetic) nici pe linie matern, nici pe linie patern.
Pentru detalierea acestor concluzii sunt necesare analize ulterioare, care sunt limitate n acest
moment, de absena unei cantiti suficiente de ADN genomic.
Studiul VII.
Copilul de la Mlieti (MMPP)
(CO i P1 Norbert Szeredai, Claudia Radu, Ioana Rusu, Beatrice Kelemen, Octavian Popescu)
Pentru analiza molecular a individului MMPP a fost extras ADN genomic din 5 coroane dentare
deciduale (1 incisiv central, 1 incisiv lateral, 2 canini i 1 molar). La momentul decesului acestea erau
incluse n maxilar i mandibul.
Dup curarea prin splri succesive n clor 30%, etanol 96%, ap ultrapur i uscare la UV,
probele nu au fost procesate suplimentar (folosirea frezei dentare, tiere etc.)
Pentru extractia de ADN genomic a fost folosit un protocol modificat dup Yang et al, 1998.
Modificrile au vizat perioada de digestie cu proteinaz K, care a fost crescut de la 24h la 60h.
n urma extraciei a fost obinut o cantitate de 100 microlitri ADN cu o concentraie de 54,80
ng/microlitru (Tabel 1).
Tabel 1. Cantitatea i calitatea ADN-ului genomic extras, n prob i blank
Sample Concentration (ng/l) 260/280
MMPP 54.8 1.47
Blank 1.9 1.17
Amorsele proiectate de Gabriel et al, 2002 au fost utilizate pentru amplificarea regiunilor
hipervariabile I i II din regiunea de control a genomului mitocondrial (Figura 2 a). Un exemplu de
amplificare obinut pentru fragmentul HVRIIA este ilustrat mai jos (Figura 2b).
HVRII A segment
200bp
100bp
MMPP Blank C-
Figura 2. Amorsele Gabriel et al, 2002 i exemplu de rezultat al amplificrii pentru fragmentul
HVRIIA.
Toate cele opt fragmente au fost amplificate cu success (n condiii de maxim monitorizare a
contaminrii: blancurile de extracie i controalele negative de amplificare nu au avut ampliconi), clonate
i secvenializate.
Analiza secvenelor a permis identificarea mutaiilor punctiforme relative la rCRS (revised
Cambridge Reference Sequence), care permit predicia haplogrupului mitocondrial)(Figure 3).
Mutaii reale
greeli, datorate degradrii postmortem a ADN-ului
Figure 3. Example of multiple alignment of HVRII clones versus rCRS
Mutaiile acestui individ, raportate la rCRS sunt:

HVRI 16069, 16193, 16278
HVRII 39, 73, 150, 152, 235
Pe baza acestora, utiliznd platforma Haplogrep (http://haplogrep.uibk.ac.at/), MMPP poate fi
ncadrat cu un grad mare de siguran n haplogrupul mitocondrial J2b1a (Figura 4).
Figura 4. Predicia haplogruului n platform Haplogrep .
J2b1a este un haplogrup mitocondrial relative recent, avnd o vechime de aproximativ 10000 de
ani, este relative rar, i se gsete aproape exclusive n populaia modern european, sau n populaii cu
origine european. Este distribuit mai ale n vestul Europei, de-a lungul coastei nordice a Mrii
Mediterane, n Spania i Portugalia. Frecvene populaionale mai mici au fost raportate n literatur pentru
Irlanda, Maroc, Grecia, Rusia i Moldova. Pala et al (2012) au analizat 27 de indivizi aparinnd acestui
haplogrup i au ajuns la concluzia ca distribuia actual a acestuia a fost puternic modelat de o
recolonizare post glacial a Europei din refugii din Orientul Apropiat.
Patologiile identificate pentru acest individ izolat (potenial thalassemie sau malarie) i distribuia
actual a haplogrupului J2b1a preponderaent n zone cu frecven e crescute ale ambelor patologii, cresc
gradul de interes pentru acest studiu. Prezentm mai jos o hart cu incidena malariei n perioada 1900-
2002 (Figura 5).
Figura 5. Harta incidenei malariei n perioada 1900 -2002 (https://www.koshland-science-

museum.org/sites/all/exhibits/exhib_infectious/malaria_vector_control_05.jsp).
MMPP are n comun, cu un singur individ modern ncadrat n acest haplogrup, mutaia din poziia
235 a genomului mitocondrial (Pala et al , 2012) Numr de Acces GeneBank JQ797936, prob
identificat ca aparinnd unui evreu cu ereditate european). Acest aspect, ne ncurajeaz s atribuim
individului MMPP haplotipul J2b1a2a, extreme de rar, caracterizat pentru doar dou probe moderne de
ctre Pala et al (2012): JQ797936 (numit anterior) i JF93891 (un individ din Portugalia) (Figura 6).
Figura 6. Arbore MP pentru haplogrupul J2 publicat de Pala et al (2012). Sunt marcai cei doi
indivizi similari genetic cu MMPP.
Trei probe vechi, prezentnd haplogrupul J2b1a aparin grupului Schoningen (4100 -3950 BC),
culturii Salzmunde (3400-3100 BC) i culturii Unetice (2200 -1550 BC) i au fost descoperite n
Germania (Brandt et al, 2013). Acestea sunt mai diferite de haplotipul lui MMPP comparative cu cele
dou probe moderne menionate mai sus.
Toate aceste aspecte, indic faptul c individul MMPP a fost un imigrant, probabil dintr-o zon
peri-mediteranean. Momentul imigrrii nu poate fi dedus pe baza datelor existente n acest moment.
Raport de analiz arheozoologic asupra materialului osteologic de la Sibiu (neolitic)
Lajos Kiraly
(text parial)
Materialul arheozoologic analizat aparinnd neoliticului nsumeaz 1562 de resturi

osoase. Dintre acestea, bovinele sunt cele mai reprezentative cu un procentaj de 16,77%
(Tabel 1), dup numrul resturilor de oase identificate (NISP Number of Identifiable
Specimens). Ponderea att de mare a taurinelor, ne arat faptul c acest specie era crescut nu
doar pentru carne, ci i pentru traciune i produse secundare (lapte, piele). Menionm c a
fost identificat i un humerus care ar putea prezenta un caz patologic(diafiza osului are o
curbur mai accentuat).
n categoria cornutelor mici, ovicaprinele sunt reprezentate prin 75 fragmente

osteologice i doar prin 5 fragmente osoase, caprinele. De la capre au fost identificate doar
fragmente de coarne.
n cadrul lotului analizat, suinele ocup locul 3 ca importan alimentar n lotul speciilor
domestice evaluate. Cele mai multe resturi osoase provin de la mandibule i dentiii izolate (
Tabelul 2).
Au fost identificate 31 de fragmente aparinnd cabalinelor, majoritatea resturilor

(Tabelul 2) fiind dentiii izolate (12 fragmente) i metatars (5 fragmente, unele sunt ntregi).
Canidele ocup ultimul loc ca reprezentare n cadrul animalelor domestice evideniate
n lotul analizat , nsumnd un numr de 26 de resturi osoase (Tabelul 1), care aparin la cel
puin a doi indivizi, unul matur i unul tnr/ juvenil.
Dat fiind numrul prea mic de oase identificate, speciile slbatice sunt mai slab
reprezentate dect cele domestice. Dintre speciile slbatice, specia cea mai bine reprezentat
este cerbul (Tabelul 3) care se evideniaz prin 21 fragmente osteologice, dintre care cele mai
multe sunt coarne (19 fragmente), un fragment metatars distal i o falang proximal.
Majoritatea coarnelor de cerb au urme de prelucrare, unele dintre acestea sunt probabil
rebuturi rezultate n urma procesrii.
Au fost analizate 8 fragmente osoase aparinnd speciei Lepus europaeus (iepure)
aparinnd unui singur individ, iar 3 fragmente ( un craniu, un fragment de os coxal i un
femur) au fost atribuite unei specii de roztoare.
Cele mai puine resturi aparin cpriorului, cu un singur fragment de corn, bourul cu
un molar i un fragment de craniu (?), care prezint urme ale unor intervenii antropice i
mistreul de la care au fost identificai 2 canini inferiori..
n ceea e privete psrile i palmidele, acestea nsumeaz 50 de resturi osoase (Tabel

4), din care 7 fragmente provin de la gina domestic, iar alte 43 de la gsc. Raportul dintre
cele dou fiind de 0,44 % (Tabel 1), respectiv 2,75 %. Cu toate c din punct de vedere al
procentajelor specia Anser sp. predomin, aceasta se datoreaz faptului c cele 43 de resturi
osoase provin de la un schelet aproape complet.
Unele fragmente osoase prezint urme de tieturi (filetare) n anumite pri ale osului,
de exemplu: la nivelul articulaiilor tieturile sunt mai evidente fiind probabil rezultatul
aciunii de dezarticulare voit a scheletului; la nivelul apofizelor spinoase ale vertebrelor i la
nivelul diafizelor, tieturile sunt mai fine i sunt probabil rezultatul aciunii de descrnare a
osului. Menionm c pe cteva fragmente osteologice apar i urme de procesare termic
(arsur).
De asemenea, trebuie amintit faptul c n cadrul eantionului arheofaunistic, au fost
gsite i oase moderne; acestea au o culoare deschis i lucioas, cu o structur mult mai fin
dect ar fi trebuit s aib n mod normal, dac lum n considerare timpul petrecut n sol.
Aceste oase nu au fost luate n considerare la calcularea procentajelor.
Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic uman de la Capidava prelevat
n cadrul campaniei din 2014
Claudia Radu, Szeredai Norbert
Protocolul de lucru al Laboratorului de Antropologie Fizic utilizeaz urmtoarele metode:
Pentru determinarea sexului se observ morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,

marginea supraorbital, glabela i mentonul), respectiv a pelvisului (concavitatea
subpubic, unghiul subpubic, ramul ischiopubic, arcul ventral, arcul compozit, incizura
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat conform metodelor
descrise de Buikstra, Ubelaker (1994), Steckel et al. (2011), White, Black, Folkens
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (Ican,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011,
Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la non-aduli se
observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), se msoar
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza epifizelor (Schaefer et al.
2009).
Statura este calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
(1965) i Breitinger (1937).
Patologia este analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998), Roberts, Manchester
(2005) i Waldron (2009). n cadrul analizei preliminare, pentru toate scheletele se
noteaz prezena artrozei articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru
cribra orbitalia i cribra cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i
a aspectelor specifice rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt
observate urmtoarele elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid,
humerusul proximal i distal, radiusul proximal i distal, u lna proximal i distal, oasele
minii, fosa acetabular, femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula
proximal i distal, oasele piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar).
Pentru identificarea leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula,
humerusul, radiusul, ulna, femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra,
Ubelaker (1994).
Cu toate c materialul osteologic a prelevat din 8 morminte, unele dintre acestea au coninut oase
de la mai muli indivizi (4 cazuri) . n aceste situaii, al doilea individ a fost notat cu litera B. n
cazul indivizilor non-aduli, vrsta a fost determinat pe baza erupiei dentare i a lungimii
oaselor. Deoarece n majoritatea cazurilor au existat diferene mari ntre cele dou rezultate, am
optat pentru vrsta determinat pe baza erupiei dentare. Acest lucru e motivat de studiile clinice
i bioarheologice care au scos n eviden faptul c, comparativ cu dezvoltarea dentiiei, creterea
i dezvoltarea scheletului este mult mai afectat de eventualele boli sau carene nutriionale la
care este expus copilul (Lewis 2007). Pentru indivizii sub 17 ani, sexul nu a fost determinat.
Mormntul 11
Cu toate c scheletul este relativ bine reprezentat, starea de conservare a oaselor este slab, n
cele mai multe cazuri compactul fiind distrus din sol. Am determinat vrsta la momentul morii
pe baza erupiei dentare, rezultatul fiind 7 -8 ani. Pe baza lungimii oaselor, vrsta a fost de 5 ani.
Scheletul pstreaz un numr de 29 de dini, dintre care 11 sunt deciduali erupi, 10 sunt
permaneni erupi iar 8 sunt permaneni neerupi. Pe molarul 2 decidual de pe partea dreapt a
maxilarului exist o carie interproximal. Pe dinii de pe corpul mandibular se poate observa
tartru slab. Periodontita este de asemenea moderat pe dinii maxilari. Att pe incisivii maxilari
i mandibulari ct i pe caninii maxilari se pot observa linii hipoplazice moderate. De asemenea,
pe toat dentiia decidual se observ uzur avansat, cu expunerea dentinei. Din 10 oase lungi
prezente, pe niciunul nu s-au observat leziuni periostitice. Nu am identificat porozitate specific
pentru cribra orbitalia i hiperostoza porotic. Dintre aspectele care pot indica prezena
scorbutului sau a rahitismului, acest individ nu a prezentat niciunul. De obicei, la indivizii att de
mici este greu s se observe prezena artrozei articulaiilor. n cazul individului M11, s -au
observat foarte clar schimbri degenerative pe ambii condilii mandibulari, parte a articulaiei
temporo-mandibulare.
Mormntul 12
Scheletul este moderat reprezentat, fiind prezente elemente din calota cranian i oase lungi;
scheletul axial este cel mai slab reprezentat. Conservarea acestora ns este bun. Din pcate nu
s-au pstrat dini, prin urmare vrsta a putut fi determinat doar pe baza lungimii oaselor. Pe baza
acestora din urm putem spune c acest individ a murit la natere, avnd o vrst perinatal (38
de sptmni prenatale). Din 10 oase lungi pstrate, niciunul nu prezint leziuni periostitice. Nu
s-au pstrat orbitele, deci nu am putut determina prezena cribrei orbitalia. Pe elementele calotei
craniene nu exist leziuni specifice pentru hiperostoza porotic. De asemenea, nu s-au identificat
aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau rahitism.
Mormntul 13
Individul M13A
Scheletul de non-adult este moderat reprezentat i conservat. Vrsta aproximat pe baza erupiei
dentare este ntre 18 i 24 de luni; pe baza lungimii oaselor rezultatul este inf erior, ntre 6 i 12
luni. Se pstreaz 10 dini deciduali erupi, 5 deciduali neerupi i 4 permaneni neerupi. Nu s -a
notat prezena tartrului, periostitei i a hipoplaziei smalului. Din 11 oase lungi prezente, pe unul
singur (tibia dreapt) s-au observat leziuni periostitice slabe. Orbitele nu s-au pstrat. Pe
suprafaa endocranian a occipitalului i a parietalelor exist distrugere de os, numit n literatur
hair-on-end lesions (Lewis 2004) (Fig. 1 i 2) . De asemenea, pe suprafaa exterioar a ca lotei
craniene exist porozitate accentuat. Alte aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau
rahitism nu s-au observat.
Individul M13B
Scheletul este foarte slab reprezentat: fragmente de arcuri vertebrale, coaste, poriunea proximal
a radiusului drept, scapula dreapt, fragment din clavicula dreapt. Pe baza lungimii scapulei,
vrsta la momentul morii a fost aproximat ntre 6 i 18 luni. Nu se pstreaz dini.
Mormntul 14
Scheletul este relativ bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a fost determinat
pe baza erupiei dentare ca fiind ntre 6 i 9 luni. Pe baza lungimii oaselor, rezultatul este de 3 -6
luni. Se pstreaz 11 dini deciduali neerupi. Pe acetia nu am observat aspecte patologice. Din
14 oase lungi pstrate, niciunul nu prezint leziuni periostitice. Pe tavanul orbital nu exist
porozitate. S-a observat franjurarea capetelor costo-condrale, ns fr a fi afectat i cortexul
coastelor (Fig. 3). Att deasupra ct i sub spina scapular exist porozitate (Fig. 4). Parietalele i
occipitalul prezint de asemenea leziuni distructive pe suprafaa endocranian, ca i n cazul
individului M13A (Fig. 5).
Mormntul 15
Individul M15A
Scheletul este bine reprezentat, mai puin oasele lungi ale minilor. Pe baza erupiei dentare,
vrsta la momentul morii a fost aproximat ntre 5 -6 ani; lungimea oaselor a dat un rezultat
inferior, ntre 4 i 4.5 ani. Se pstreaz 17 dini deciduali, 3 p ermaneni erupi i 13 permaneni
neerupi. Nu s -a observat prezena tartrului sau a hipoplaziei enamelului. Se observ periodontit
att maxilar ct i mandibular. Uzura dinilor deciduali este accentuat, cu expunerea dentinei.
Din 8 oase lungi, 3 prezint leziuni periostitice: femurul drept, tibia dreapt i tibia stng.
Orbitele nu s-au pstrat. Pe suprafaa calotei craniene nu exist porozitate. Pe dintele axisului
exist un osicul, poziionat chiar n apexul dintelui (Fig. 6). Pe ambele femure, crista aspera este
pronuna t iar n zona anterioar a metafizei proximale se poate observa o faet produs prin
articularea cu fosa acetabular (Fig. 7). Pe femurul drept, pe metafiza distal, exist de asemenea
o cavitate poziionat pe locul de inserie al biceps femoris.
Individul M15B
Scheletul este slab reprezentat (falange, epifize, fibula, coasta). Vrsta la momentul morii
aproximat pe baza lungimii fibulei este ntre 0 i 1.5 luni postpartum.
Mormntul 16
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii aproximat pe baza
erupiei dentare este ntre 3 i 4 ani; pe baza lungimii oaselor rezultatul este ntre 2 i 2.5 ani. Se
psreaz 19 dini deciduali. Nu s-au observat aspecte patologice pe acetia n afar de uzur
puternic pe incisivii centrali. Din 11 oase lungi analizate, pe niciunul nu am identificat leziuni
periostitice. Orbitele nu s-au pstrat. Pe craniu nu se observ porozitate. Capetele sternale ale
coastelor sunt franjurate, cortexul este distrus i afectate de porozitate (Fig. 8). Pe cortexul
corpului costal, se observ os nou depus, cu aspect neregulat i neorganizat. De asemenea i pe
metafiza femoral se poate observa acelai tip de franjurare i prezena porozitii. Lipsesc oasele
piciorului stng. Sutura metopic este deschis, cu prelungire pn la sutura coronar. Am
identificat un fragment de arc vertebral aparinnd unui copil cu o vrst i mai mic.
Mormntul 17
Individul M17
Scheletul bine reprezentat i conservat aparine singurului adult spat n aceast campanie.
Vrsta la momentul morii a fost determinat pe baza morfologiei capetelor sternale, simfizei
pubice i suprafeei auriculare, rezultatul fiind ntre 24 i 34 de ani. Pentru determinarea sexului,
am analizat att elementele craniene ct i cele ale pelvisului. Elementele craniene au o
morfologie masculin, dar cele pelviene sunt mai feminine. Rezultatul este posibil masculin.
Se pstreaz un numr de 32 de dini p ermaneni. Pe molarul 1 maxilar de pe partea stng
exist o carie interproximal i un abces dentar (Fig. 9). Pe mandibul exist tartru puternic.
Periodontita poate fi observat pe maxilar. Hipoplazia smalului este puternic pe toat dentiia,
att maxilar ct i mandibular (Fig. 10 i 11) . Uzura este moderat. Din 32 de elemente de
articulare analizate, 5 prezint modificri degenerative (humerus proximal dreapta, radiu distal
dreapta, oasele minii drepte, vertebrele cervicale, radius distal stnga). La ambele picioare,
falangele 2 i 3 de la al patrulea deget sunt unite. Pe axis exist o faet de articulare a dintelui cu
atlasul (Fig. 12). Din 13 oase lungi analizate pentru periostit, doar femurul de pe partea stng
prezint astfel de leziuni. Pe craniu exist porozitate. Orbitele nu au putut fi analizate. Statura
variaz n funcie de formulele aplicate: pentru formula lui Pearson (1899) pentru femur,
rezultatul este 155.28 cm; pentru formula lui Breitinget (1937) pentru femur, rezultatul este
161,91 cm.
Individul M17B
n timpul spturii, deasupra individului adult M17 s-au gsit, disparate, oase de la un subadult.
Scheletul acestuia este reprezentat doar de 4 coaste, fragmente de vertebre, scapula i humerusul
de pe partea stng i o fibul. Pe baza lungimii oaselor, vrsta acestui individ la momentul
morii este perinatal, 38 -40 de sptmni prenatale.
Mormntul 19
Materialul osteologic notat cu M19 era amestecat. Exist cu siguran cel puin doi indivizi, dar
faptul c acetia au aceeai vrst a ngreunat asocierea oaselor cu fiecare individ. Am fcut acest
lucru pe baza morfologiei i aspectului oaselor.
Individul M19A
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii, determinat att pe baza
erupiei dentare ct i a lungimii oaselor, este perinatal, 38-40 de sptmni prenatale. Se
pstreaz 19 dini deciduali neerupi. Nu s-a identificat nicio patologie dentar. Din 12 oase lungi
prezente, pe niciunul nu exist leziuni periostitice. Tavanul orbital nu prezint schimbri
patologice. Pe craniu (occipital i temporal) i pe scapula stng se observ porozitate slab.
Metafizele oaselor lungi sunt slab franjurate, cu porozitate. De asemenea, diafiza tibiei de pe
partea stng pare a avea o curbur neobinuit. Sutura metopic este deschis i prelungit pn
la sutura coronar.
Individul M19B
Scheletul este reprezentat doar de coaste, diafizele humerale i femurul stng. Pe baza lungimii
oaselor, vrsta la momentul morii este perinatal, 38-40 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz
dini. Cele trei diafize pstrate nu prezin leziuni periostitice sau aspecte patologice indicatoare
pentru scorbut i rahitism.
Alte oase
Printre oasele lui M16, am mai gsit un fragment de proces vertebral de la un copil (probabil
nou-nscut).
Printre oasele lui M17, pe lng oasele lui M17B, mai exist o falang de la un alt copil.
Imagini
Fig. 1. Individul M13A. Hair-on-end lesions pe suprafaa endocranian.
Fig. 2. Individul M13A. Detaliu cu leziunile endocraniene.
Fig. 3. Individul M14. Franjurare capetelor sternale.

Fig. 4. Individul M14. Scapula dreapt cu porozitate sub spina scapular (cu detaliu).
Fig. 5. Individul M14. Leziuni endocraniene (cu detaliu).

Fig. 6. Individul M15A. Axis.
Fig. 7. Individul M15A. Poriunea proximal a

femurului stng. Se observ faeta din zona trochanterului mare.
Fig. 8. Individul M16. Franjurarea capetelor sternale i os nou depus n zona leziunii (cu detaliu).
Fig. 9. Individul M17. Abces dentar (sgeat) pe maxilar n zona primului molar.
Fig. 10. Individul M17. Jumtatea stng a maxilarului. Se observ periodontita avansat
(sgeat) i liniile hipoplazice pe smalul dinilor (detaliu mai jos).
Fig. 11. (detaliu)
Fig. 12. Individul M17. Faet pe poriunea posterioar a dintelui axisului.

Raportul analizei antropologice preliminare pentru materialul osteologic de la Cristian

(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (I can,
2009).
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009). n
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele se noteaz prezena artrozei
articulaiilor, leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra
cranii, nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor sunt observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo -mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proximal i distal, oasele minii, fosa acetabular,
femurul proximal i distal, tibia proximal i distal, fibula proximal i distal, oasele
piciorului i vertebrele (segmentele cervical, toracic i lombar). Pentru identificarea
leziunilor periostitice se observ urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul, ulna,
femurul, tibia i fibula (bilateral).
(1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile se analizeaz dup metodele descrise n Lovell (1997) i Buikstra ,
Ubelaker (1994).
Materialul osteologic aparine unui numr de 6 indivizi. n unele cazuri s-a utilizat silicon dentar
de culoare portocalie pentru lipirea fragmentelor osoase. Statura nu a putut fi calculat pentru
niciun individ.
Mormntul 1
S-a analizat materialul osteologic de la doi indivizi, primii n cutii separate (complexul 019),
numii M1 defunctul 1 i M1 un defunct, acesta din urm fiind numit de noi M1B.
Scheletul individului M1 este slab reprezentat i conservat. Splarea oaselor i dizolvarea

pmntului cu ap a rezultat n numeroase fragmente osoase dar foarte puine dintre acestea au
putut fi reconstitute. Pentru a evita pierderea informaiei, materialul a fost analizat i nainte de
splare, cnd nc era inut n bulgrii de pmnt. Astfel am putut determina sexul individului,
care este masculin (rezultat dat de morfologia elementelor craniene) (Fig.1). De asemenea, am
notat faptul c lng mandibul, spre exemplu, am identificat diafiza unui humerus (Fig. 2). Pe
suprafaa orb itelor i a calotei craniene exist porozitate specific pentru cribra orbitalia i
hiperostoza porotic (Fig. 3 i 4).
S-a pstrat un numr de 25 de dini mpreun cu fragmente din mandibul i maxilar. Tartrul este
slab spre moderat. Pe coroana caninului mandibular se observ un defect al smalului, o linie
hipoplazic extins (2.15 mm n grosime) (Fig. 5). Pe caninii maxilari i pe incisivii mandibulari
nu exist astfel de defecte. Uzura molarilor este slab spre moderat. Pe fragmentele osoase
pstrate nu exist leziuni periostitice.
Individul M1B este i mai slab pstrat, fiind reprezentat de fragmente craniene, din coxal i de
oase lungi (Fig. 6). Pe lng acestea, mai exist 33 de dini, dintre care 9 sunt deciduali, 12 sunt
permanei erupi, iar 12 sunt permaneni neerupi. Tartrul este moderat att maxilar ct i
mandibular. Nu am observat linii hipoplazice pe incisivi i canini. Uzura molarilor deciduali este
puternic. Pe baza erupiei dentare, am determinat vrsta la momentul morii ntre 7 i 8 ani. Pe
fragmentele craniene nu se observ hiperostoza porotic.
Mormntul 2
Oasele umane ce compun materialul osteologic din acest mormnt aparin cel puin la doi
indivizi. Primul individ i cel principal (pe baza gradului de reprezentare a oaselor) es te probabil
un brbat (Fig. 10), cu o vrst la momentul morii ntre 20 i 25 de ani. Scheletul prezint un
grad de reprezentare moderat iar oasele se pstreaz ntr-o stare relativ bun (50-75%). De
asemenea, s-au pstrat 4 dini i fragmente din corpul mandibular i cel maxilar. Se observ
tartru i periodontit slab. Nu s-a putut nota prezena liniilor hipoplazice. Uzura dentar pe
molari este moderat, specific vrstei individului. Din 11 articulaii prezente, niciuna nu
prezint schimbri degenerative (artroza articulaiilor). Din 12 oase lungi prezente, fragmentare
sau ntregi, doar pe unul (tibia dreapt) s-au notat leziuni periostitce. Cu toate c orbitele nu s-au
pstrat pentru a se observa prezena cribrei orbitalia, pe craniu exist porozitate slab, specific
pentru hiperostoza porotic.
De asemenea, pe craniu am mai observat o serie de aspecte. n primul rnd, pe parietalul stng,
aproape de sutura sagital, exist o traum produs cu un obiect contondent i realizat
antemortem (Fig. 7 i 9). Diametrul traumei este de 8.40 mm, cu o adncime de 1.95 mm. Lng
aceast traum se observ i o fractur, lung de 72.2 mm (Fig. 8). Este posibil ca aceasta din
urm s fie o fractur radial cauzat de trauma iniial. Att trauma circular ct i fractura sunt
vindecate, de-a lungul fracturii existng i calus de dimensiuni moderate. n al doilea rnd, calota
cranian este ngroat anormal n unele locuri, ceea ce poate sugera boala lui Paget sau
hiperostoz frontal intern. Totui, aceste aspecte identificate pe calota individului din
mormntul 2 trebuie cercetate n continuare.
Cel de-al doilea individ, denumit de noi M2B, este slab reprezentat (oase lungi de la mn i
picioare, fragment de maxilar, oase de la picior). Scheletul aparine unui adult dar sexul rmne
indeterminat. O singur articulaie se pstreaz, dar aceast nu prezint schimbri degenerative.
Din 5 oase lungi pstrate fragmentar, pe niciunul nu se observ leziuni periostitice. S-au pstrat 2
dini n alveol, parte din corpul m axilarului, ceea ce ne-a permis s spunem cu siguran c acest
maxilar nu aparine individului M2. Nu s-au observat aspecte patologice, cu excepia tartrului
slab. Pe diafiza proximal a femurului drept, posterior, lng tuberozitatea gluteal, exist o
traum care taie locul de inserie al muchilor adductor magnus i gluteus maximus (Fig. 11).
Trauma msoar 15 mm i a fost realizat cu un obiect tios. Cronologia ei este antemortem,
fiind bine vindecat, fr urme de infecie.
Pe lng oasele indivizilor M2 i M2B, exist i oase de animale.
Mormntul 3 (complex 024, un adult i un copil)
Scheletul este reprezentat n special de fragmente de oase lungi, att superioare ct i inferioare.
Dinii lipsesc. Vrsta la momentul morii a fost determinat pe baza morfologiei suprafeei
auriculare, care ne indic o vrst ntre 35 i 39 de ani. Sexul nu a putut fi determinat datorit
lipsei elementelor de diagnostic. Prezena artrozei articulaiilor nu a fost notat pe cele 5 zone de
articulare prezente. Din 9 diafize de oase lungi prezente pentru observaie (unele doar n stare
fragmentar), doar pe femurul drept s-au observat leziuni periostitice slabe. Pe lng oasele
umane mai exist i dou fragmente de oase de animale.
Cel de-al doilea individ din mormntul 3 (M3 copil) este un non-adult. Acesta este reprezentat de
dini, fragmente din craniu i fragmente foarte mici de diafize. n ceea ce privete dinii, acetia
aparin att dentiiei deciduale (5 dini) ct i celei permanente, neerupte (9 dini). Dezvoltarea
dinilor indic o vrst la momentul morii de 2-3 ani. Pe incisivii deciduali maxilari de pe partea
stng se observ un defect al smalului.
Imagini
Fig. 1. Craniul individului din M1 nainte de splare.
Fig. 2. Craniul individului M1 nainte de splare. Lng mandibul se observ diafiza unui
humerus (n seciune).
Fig. 3. Hiperostoz porotic pe craniul individului M1.
Fig. 4. Cribra orbitalia (individul M1).

Fig. 5. Defect al smalului pe caninul mandibular drept al individului M1.
Fig. 6. Craniul individului M1B nainte de splare.
Fig. 7. Individul M2. Parietalul stng. Trauma circular este ncercuit cu rou. Linia roie indic
direcia fracturii (nu o suprapune, aceasta este n stnga linii roii).
Fig. 8. Detaliu cu fractura radial de pe parietalul stng al individului M2.
Fig. 9. Detaliu cu trauma circular identificat pe parietalul stng al individului M2.

Fig. 10. Occipitalul individului M2. Se observ creasta nucal foarte pronunat.
Fig. 11. Suprafaa posterioar a f emurul stng al individului M2B.

Fig. 12. Detaliu cu trauma de pe femurul individului M2B (n stnga liniei roii).
Raport antropologic Mlieti 2014
Szeredai Norbert, Claudia Radu
Materialul osteologic a fost analizat folosindu-se urmtoarele metode:
Pentru estimarea strilor de reprezentare i de conservare s-au aplicat standardele descrise

de Buikstra i Ubelaker (1994) i Steckel et al. (2011).
Pentru determinarea vrstei s-au aplicat metodele specifice pentru non-aduli, i anume
observarea erupiei dentare (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011) i msurarea
lungimii oaselor (Schaefer et al. 2009).
Patologia a fost analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
Buikstra, Ubelaker (1994), Aufderheide, Rodriguez-Martin (1998) i Waldron (2009).
Dentiia i patologia d entar au fost analizate pe baza standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Msurtorile s-au realizat conform standardelor din Buikstra, Ubelaker (1994).
n urma analizei s-a determinat faptul c scheletul aparine unui c opil cu o vrst perinatal (0-2
luni), rezultat dat de observarea erupiei dentare i de lungimea oaselor (femur, illium). Starea de
conservare a scheletului este medie, puin peste 50%. Starea de reprezentare este bun (Fig. 2).
S-au identificat 10 dini deciduali neerupi (Sc1, Dc1, ?i2, ?i1, ?m1, ?m2, Dm2, Sm2, ?m1, ?i11).
Oasele lungi au fost analizate pentru identificarea unor leziuni periostitice, dar la non-aduli
acestea sunt dificil de difereniat de esutul fibros care reflect creterea i dezvoltarea normal a
osului (Lewis 2004, 2007). Totui, n cazul acestui copil, morfologia i distribuia esutului fibros
observat pe majoritatea oaselor sugereaz prezena unei boli infecioas e.
Oasele afectate sunt urmtoarele:

coaste
femur (stnga i dreapta)
humerus (stnga i dreapta)
ulna (stnga i dreapta)
radius
tibia
scapula
illium
clavicula (stnga i dreapta)
temporal (stnga i dreapta)
1
Aici am folosit modelul standard pentru notarea dinilor (White et al. 2012). Astfel, spre exemplu, LM1 reprezint
primul (1) molar (M) permanent (majuscule) mandibular (1) de pe partea stng (S). Rdm2 reprezint al doilea (2)
molar (m) decidual (litere minuscule i d) maxilar (2) de pe partea dreapt (D). Cnd am folosit semnul ?, nu s-a
putut stabili partea de pe care este dintele.
mandibula
frontal (endocranian)
occipital (baza craniului)
orbite
un metatarsian
vertebre
Pe aproape toate oasele prezente se observ os nou format cu aspect periostitic, a crui formare a
fost cauzat probabil de o inflamare subperiostal. Pentru diagnosticul diferenial al acestor
leziuni sunt foarte importante urmtoarele aspecte:
1. vrsta foarte mic (0-2 luni) a copilului;
2. aproape toate oasele scheletului sunt afectate;
3. printre oasele afectate se regsesc i mandibula, scapulele i claviculele;
4. patologia se manifest prin formare de os nou i nu prin distrugere osoas, cu toate c
cele dou procese pot fi ntlnite n cadrul aceleiai boli;
5. esutul patologic este localizat n special pe diafiza oaselor si nu pe metafiza acestora.
Vrsta foarte mic i gradul de afectare a scheletului (aproape toate oasele) ne indic faptul c
procesul infecios a fost iniiat nc din perioada intrauterin. Prin urmare, organismul copilului
s-a mbolnvit prin interaciunea cu organismul mamei, care e foarte probabil s fi suferit de
aceeai boal/condiie patologic. Faptul c toate oasele prezint aceste schimbri ne indic de
asemenea o afeciune sistemic i nu localizat. Modelul dup care este afectat scheletul acestui
copil ne-a fcut s lum n considerare pentru diagnosticul diferenial urmtoarele afeciuni:
scorbut (sau lipsa vitaminei C), anemie genetic (thalassemia major), sifilis endemic, malarie
congenital i hiperostoz cortical infantil.
Pentru argumentarea diagnosticului diferenial n continuare, vom realiza analiza SEM a oaselor.
Fig. 1. Clavicula stng.

Detaliu cu esutul periostitic,
comparativ cu esutul sntos
(stnga sus, de culoare
deschis).
Fig. 2. Starea de reprezentare a scheletului
(cu gri sunt colorate oasele prezente iar cu
alb cele absente).
Raport antropologic Miceti 2014
Materialul osteologic primit pentru analiz const n scheletele a trei indivizi provenind din situl
arheologic de la Miceti. Pentru analiza acestora s -au folosit urmtoarele metode:
Pentru determinarea sexului s-au observat morfologia craniului (creasta nucal, mastoida,
sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora a fost realizat conform metodelor
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli s-au observat capetele sternale (Ican, Loth, Wright
1984), simfiza pubic i suprafaa auricular (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011, Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel
et al. 2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea vrstei la subaduli
s-a observat erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al. 2011), s-a msurat
lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i s-a observat sinostoza epifizelor (Schaefer et
al. 2009).
Statura a fost calculat dup formulele lui Pearson (1899), Trotter, Gleser (1958), Bach
Patologia a fost analizat conform descrierilor din Ortner (2003), Steckel et al. (2011),
cadrul analizei preliminare pentru toate scheletele s-a notat prezena artrozei articulaiilor,
leziunilor periostitice, leziunilor specifice pentru cribra orbitalia i cribra cranii,
nodulilor lui Schmorl, a distrugerii platoului vertebral i a afeciunilor specifice
rahitismului i scorbutului. Pentru artroza articulaiilor au fost observate urmtoarele
elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
leziunilor periostitice au fost observate urmtoarele oase: clavicula, humerusul, radiusul,
ulna, femurul, tibia i fibula (bilateral).
Dentiia i patologia dentar au fost analizate conform standardelor din Buikstra,
Ubelaker (1994) i Steckel et al. (2011).
Traumele i fracturile au fost analizate dup metodele descrise n Lovell (1997) i
Buikstra, Ubelaker (1994).
Oasele sunt puternic afectate din sol att datorit activitii plantelor dar i datorit specif icului
solului, care rmne prins pe oase. O serie de elemente osoase au fost lipite pentru reconstituirea
osului folosindu-se silicon dentar de culoare portocalie. n cadrul analizelor antropologice
precedente s-a folosit pentru reconstituirea oaselor un material pentru lipit transparent. Din
pcate, degradarea post-mortem a scheletelor a limitat ntr-o oarecare msur observarea unor
aspecte patologice.
Scheletul individului nr. 9
Att starea de reprezentare ct i cea de conservare a scheletului sunt medii. Sexul a fost
determinat pe baza morfologiei craniului (mastoid, marginea supraorbital, eminena mental)
iar rezultatul este posibil masculin. Vrsta a fost aproximat pornind de la observarea
morfologiei capetelor sternale, suprafeei auriculare i a uzurii dentare, rezultatul fiind o vrst
cuprins ntre 26 i 45 de ani la momentul morii. Scheletul pstreaz un numr de 15 dini
permaneni din 22 poziii dentare observabile. Nu s-a notat pierderea dinilor antemortem sau
abcese dentare. O carie interproximal exist pe primul molar mandibular stng (SM 1). S-a
observat tartru dentar moderat, att mandibular ct i maxilar, i periodontit slab. Pe caninii
maxilari i mandibulari exist linii hipoplazice. Uzura molarilor este moderat spre sever. Din
15 articulaii observabile, nici una nu prezint schimbri specifice artrozei. Am identificat leziuni
periostitice pe dou oase, tibia i fibula stng, cu manifestare moderat. De asemenea, pe calot
exist porozitate specific pentru hiperostoza porotic. Orbitele nu au putut fi analizate pentru
observarea cribrei orbitalia. Din pcate, doar o singur vertebr s-a mai pstrat astfel c nu am
putut stabili prezena artrozei vertebrale sau a nodulilor lui Schmorl. Nu s-au identificat traume
sau fracturi. Statura nu a putut fi calculat deoarece oasele lungi ale cror msurtori sunt
necesare nu s-au pstrat ntregi. Pe lng oasele umane, mai exist o msea de animal.
Scheletul individului nr. 1
Strile de conservare i reprezentare sunt medii. Pe baza morfologiei elementelor de pe craniu

(creasta nucal, mastoid, marginea supraorbital, eminena mental) i de pe pelvis (arc
compozit, incizura sciatic) s-a stabilit c individul este de sex feminin. Vrsta a fost determinat
pe baza uzurii dentare, morfologiei suprafeei auriculare i maturizrii scheletului (nc se mai
observ linile de sudare a epifizelor), rezultatul fiind o vrst cuprins ntre 25 i 34 de ani. S -au
pstrat 22 de dini i 30 de poziii dentare. Ca i n cazul scheletului nr. 9, nu s-au observat
pierderea antemortem a dinilor sau abcese dentare. Exist o carie dentar, interproximal, pe
primul molar mandibular stng (SM1). Tartrul este puternic pe mandibul dar slab pe maxilar,
diferen care poate fi dat de procesele postmortem. Hipoplazia smalului dentar a fost
observat doar pe caninii mandibulari. Uzura molarilor este moderat. Din 20 de articula ii
analizate, patru (humerus proximal, radius distal, radius proximal i femur distal, toate de pe
partea stng) prezint schimbri patologice specifice pentru artroz, cu manifestare moderat.
Am identificat leziuni periostitice moderate pe dou oase lungi (femur i tibie de pe partea
stng) din 7 observabile. Cribra orbitalia i hiperostoza porotic nu au putut fi observate din
cauza degradrii osoase. Vertebrele sunt de asemenea puternic distruse din sol. S-a observat pe o
singur vertebr lombar prezena unui nodul al lui Schmorl. Nu s-au identificat traume sau
fracturi. Statura a fost calculat pe baza lungimii femurului drept (432 mm) folosindu-se
formulele lui Pearson (1899), Trotter i Gleser (1958) i Bach (1965). Rezultatele sunt 156,86
cm, 16160,80 cm, respectiv 163,41 cm.
Scheletul individului nr. 9 (7)
Ca i n cazul celorlai doi indivizi, strile de reprezentare i conservare sunt medii. Sexul a fost
determinat pe baza morfologiei elementelor craniene (mastoid, eminena mental, creasta
nucal i marginea supraorbital), rezultatul fiind feminin. Vrsta a fost aproximat pe baza
morfologiei capetelor sternale, suprafeei auriculare, sinostozei suturilo r i a uzurii dent are,
rezultatul fiind o vrst cuprins ntre 24 i 45.2 ani. S-au pstrat 28 de dini i 32 poziii dentare.
Individul a pierdut un dinte antemortem i exist 3 carii dentare, una interproximal pe molarul 2
mandibular stnga i dou pe molarul 3 mandibular dreapta (una ocluzal i una interproximal).
Tartrul dentar este mediu att pe mandibul ct i pe maxilar. Pe caninii mandibulari am observat
linii hipoplazice. Uzura molarilor este medie. Din 21 de articulaii analizate, 8 prezint schimbri
artrozice (pe partea stng: fibula proximal, femur distal, acetabul, ulna proximal, radius distal,
humerus distal; pe partea dreapt: acetabulul; i pe vertebrele lombare). n toate cazurile,
schimbrile degenerative sunt moderate. Nu s-au observat leziuni periostitice dar pe craniu exist
porozitate specific pentru hiperostoza porotic. Nu am identificat traume sau fracturi. Statura a
fost calculat pe baza lungimii tibiei fr eminen (357 mm) folosindu-se formulele compuse de
Pearson (1899) i Trotter i Gleser (1958). Rezultatele sunt 157,87 cm, respectiv 165,06 cm. Pe
lng oasele umane mai exist un os de animal. De asemenea n materialul din umplutura
mormntului, am mai identificat 9 fragmente de oase i dini de animal i 3 fragmente de oase
umane (clavicul dreapta medial, humerus dreapta proximal, humerus stng distal). Acestea din
urm nu aparin individului principal din mormntul 9 (7).
Tabel 1. Distribuia datelor osteologice i patologice pentru fiecare schelet.

Nr. Sex Vrst Statur1 Carii HSD2 Artroz3 Cribra Hiperostoz Periostit4
mormnt dentare orbitalia porotic
1 F 25-34 156,86 1 X 4 (20) - - 2 (7)
9 M 26-45 - 1 X 0 (15) - X 2 (6)
9 (7) F 24-45,2 157,87 3 X 8 (21) - X 0 (8)
1
Aici am folosit rezultatele obinute din aplicarea formulelor lui Pearson (1899). Rezultatele sunt
in cm.
2
HSD= hipoplazia smalului dentar.
3
Numerele reprezint articulaiile afectate iar n parantez este dat numrul total al articulaiilor
observabile.
4
Numerele reprezint oasele lungi afectate iar n parantez este dat numrul total al oaselor lungi
observabile.
Discuii
n acest stadiu al cercetrii, datele osteologice i patologice pot fi interpretate la nivel preliminar.
Prezena linilor hipoplazice n cazul tuturor indivizilor este relevant pentru stresul nutritiv
susinut n perioada copilriei cnd smalul dentar se formeaz. Aceste linii reprezint perioade
de stagnare a mineralizrii smalului cauzat de deficiene nutritive severe. Hiperostoza porotic
este un aspect patologic care se manifest n copilrie i i are etiologia n anemia genetic sau
anemia megaloblastic (lipsa vitaminei B12). Statura este de asemenea un indicator pentru
aportul nutritiv din perioada de cretere i dezvoltare a corpului, dar n lipsa unui eantion
reprezentativ nu putem stabili dac staturile acestor indivizi sunt sub media specific pentru
populaia de care aparin. Prin urmare, putem doar s sugerm c este foarte posibil ca n timpul
creterii i dezvoltrii acestor indivizi s fi existat perioade de stres nutritiv dat de malnutriie,
foamete sau boli.
1 F 25-34
9 56 M 26-45
9 (7) F 24-45,2
fig. 1. Distribuia artrozei articulaiilor (cu rou) i leziunilor periostitice (cu gri) pentru M9 (7),
M1 i M9 (de la stnga la dreapta).
Leziunile periostitice sunt indicatoare non-specifice pentru infecie. Distribuia lor limitat poate
sugera ca i etiologie o traum sau o infecie localizat (ulcer al pielii). O distribuie mai extins,
mai multe oase ale scheletului, este un indicator pentru o infecie sistemic. n cazul individului
din mormntul M9, limitarea distribuiei leziunilor pe tibia i fibula stng poate sugera o
inflamare a membranei interosoase. n ambele cazuri (M1 i M9), osul afectat de leziune este
remodelat spre os compact, ceea ce indic vindecarea infeciei.
Modelul de distribuie al artrozei articulaiilor nu este relevant dat fiind lotul mic analizat. Totui,
dac lum n considerare sexul indivizilor, este interesant faptul c individul de sex masculin nu
are nicio articulaie (dintre cele prezente, n=15) a fectat de schimbri degenerative, comparativ
cu cele dou femei care au cte 4, respectiv 9 articulaii afectate de artroz moderat.
Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic de la Toboliu
Claudia Radu

sciatic i sulcusul preauricular). Analiza acestora este realizat confor m metodelor
(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (Ican,
Loth, Wright 1984), simfizei pubice i a suprafeei auriculare (Buikstra, Ubelaker 1994,
Steckel et al. 2011, Meindl et al. 1985), sinostoza suturilor craniene (Buikstra, Ubelaker
1994, Steckel et al. 2011) i uzura dentar (White et al. 2012). Pentru determinarea
vrstei la non-aduli se observ erupia dentar (Buikstra, Ubelaker 1994, Steckel et al.
2011), se msoar lungimea oaselor (Schaefer et al. 2009) i se observ sinostoza
epifizelor (Schaefer et al. 2009).
elemente: articulaia temporo-mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
(1994) i Steckel et al. (2011).
Ubelaker (1994).
Am analizat materialul osteologic din 8 morminte (mormintele 2, 3, 4, 6, 8 i contextele 5, 6 i

7). n fiecare mormnt am identificat doar cte un individ. Oasele au fost splate i, n unele
cazuri reconstituite folosindu-se silicon dentar. Aa cum rezult din descrierea metodelor, pentru
fiecare individ s-au stabilit gradul de reprezentare i conservare, s -au determinat sexul i vrsta,
s-a analizat patologia osoas i dentar i s-au efectuat diferite msurtori.
Mormntul nr. 8
Scheletul este foarte bine pstrat i conservat. Vrsta a fost determinat pe baza morfologiei
capetelor sternale, simfizei pubice i suprafe ei auriculare. Rezultatul este o vrst la momentul
morii ntre 30 i 42 de ani. Sexul a fost determinat pe baza morfologiei elementelor craniene
(creasta nucal, mastoid, margine supraorbital, glabela i eminena mental) i elementelor
pelvisului (ram ischiopubic, arc ventral, arc compozit, incizura sciatic), rezultatul fiind
Masculin. Statura din timpul vieii a fost calculat pe baza lungimii femurului drept (410 mm) i
folosindu-se formula lui Breitinger (1937), rezultatul fiind 161,75 cm.
Se pstreaz 22 de dini. Maxilarul este rupt n zona molarilor, prin urmare am notat prezena a
minim 28 de poziii; pe partea dreapt a maxilarului cu siguran nu a avut erupt molarul 3.
Faptul c mandibula i maxilarul s-au pstrat ntr-o stare bun ne-a permis s observm mai
multe patologii dentare. Individul a pierdut n timpul vieii 4 dini. Exist 3 carii dentare, una
interproximal pe primul molar mandibular de pe partea stnga, una interproximal pe molarul 2
mandibular de pe partea dreapt i una interproximal pe al doilea premolar maxilar de pe partea
dreapt. De asemenea, se pot observa 3 abcese dentare foarte puternice. Tartrul este moderat iar
periodontita este extins. Pe smalul incisivilor i caninilor att maxilari ct i mandibulari se
observ linii hipoplazice pronunate. Uzura molarilor este puternic. i pe incisivi i canini exist
uzur puternic. Pe molarii mandibulari de pe partea stng exist un defect pe suprafaa labial
a acestora, aproximativ la linia de ntlnire dintre smalul coroanei i cementul dentar (radicular).
De asemenea, exist 4 dini (al doilea premolar mandibular de pe partea stng, incisivul lateral
maxilar de pe partea stng, caninul maxilar de pe partea dreapt, i premolarul 1 sau 2 maxilar
de pe partea dreapt) cu o uzur foarte puternic, nu mai exist deloc coroana dentar iar
rdcina este de asemenea distrus. Este posibil ca acest lucru s fie o consecin a faptului c
aceti dini sunt de fapt deciduali; dac acestui individ i lipseau congenital mugurii pentru dinii
permaneni, este posibil s nu -i fi pierdut pe cei deciduali, ceea ce a dus la folosirea lor foarte
ndelungat i prin urmare uzura lor excesiv.
Una din cele mai evidente patologii observabile pe schelet e artroza avansat. Se pstreaz
pentru observaie 39 de elemente de articulaie. Dintre acestea, ase sunt afectate de artroz
puternic, cu deformarea conturului elementului i cu osteofite de mari dimensiuni, 27 sunt
afectate de artroz moderat iar 6 nu prezint schimbri degenerative. Cele mai afectate sunt
articulaia temporo-mandibular, fosa acetabular dreapt i femurul proximal drept, vertebrele
cervicale i cavitatea glenoid de pe partea stng. Vertebrele cervicale nr. 2 i 3 sunt unite,
posibil datorit unei fracturi prin comprimare (compression fracture).
Din 14 oase lungi prezente pentru obsevaie, pe niciunul nu se observ leziuni periostitce. De
asemenea, porozitatea specific pentru cribra orbitalia i hiperostoz porotic nu e prezent. Pe
suprafaa endocranian exist granulaii arahnoide. Pe omoplatul drept se observ parial o
traum circular (diametru de 16.11 mm) produs antemortem. Cu toate c nu exist urme de
infecie, vindecarea traumei nu a acoperit cavitatea produs.
n ceea ce privete markerii musculoscheletali, acetia au fost observai pe mai multe elemente
osoase. Pe ambele ulne, pe olecranon, locul de inseria al muchiului triceps brachii prezint
exostoze (osificri); pe ulna stng, n poriunea distal a diafizei, pe locul de inserie al
membranei interosoase sau a muchiului pronator quadranus se observ de asemenea exostoze
osoase. Pe femure e foarte pronunat locul de inserie al muchiilor plantaris i adductor
magnus; de asemenea, pe femurul stng, ntre trochanterul mare i gtul femural, pe locul de
inserie al obturator externus, exist exostoze osoase de mari dimensiuni (bony spurs). Pe
tuberozitatea calcaneelor se observ exostoze osoase. Pe ambele tibii, epifizele distale, anterior,
exist faete de ngenunchere ( squatting facets). Pe coxalul drept, acetabulul e nconjurat de
exostoze osoase, cu mult os nou format, pe locul de inserie al ligamentelor capsulare. Coxalul
stng nu prezint aceste modificri. Pe manubriu (parte a sternului), pe suprafaa posterioar, se
observ porozitate accentuat cu distrugerea i remodelarea cortexului.
Mormntul nr. 2
Scheletul este slab reprezentat i conservat. Pe baza lungimii oaselor, vrsta a fost stabilit ntre
32 i 34 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz dini. Din 4 oase lungi analizate, niciunul nu
prezint leziuni periostitice. Nu s-au observat aspecte patologice indicatoare pentru scorbut sau
rahitism sau alte boal metabolic.
Mormntul nr. 3
Scheletul este moderat reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a fost determinat pe
baza lungimii oaselor ca fiind ntre 34 i 36 de sptmni prenatale. Nu se pstreaz dini. Din 10
oase lungi, pe niciunul nu se observ leziuni periostitice. Nu exist porozitate specific pentru
hiperostoza porotic. n afar de porozitate slab prezent pe mandibul, nu exist alte aspecte
patologice indicatoare pentru boli metabolice.
Mormntul nr. 4
Scheletul este bine reprezentat i conservat. Vrsta la momentul morii a f ost determinat pe baza
erupiei dentare i a lungimii oaselor. Rezultatul este o vrst ntre 1.5 i 2 ani. Se pstreaz 18
dini deciduali i 4 dini permaneni neerupi. n afar de hipoplazie slab prezent doar pe canii
mandibulari, nu s-au notat alte patologii dentare. Din 12 oase lungi prezente pentru observaie,
pe 6 oase se observ leziuni periostitice avansate (pe femurul, tibia i fibula de pe partea dreapt
i tibia i fibula de pe partea stng). De asemenea, femurele i tibiile sunt curbate medial. Nu se
observ hiperostoz porotic. Pe ulne, proximal, sub tuberozitatea ulnar exist o zon cu os nou
format.
Mormntul nr. 6
Scheletul este slab reprezentat i conservat. Vrsta a fost determinat pe baza lungimii oaselor i
pe baza erupiei dentare, rezultatul fiind, ca i n cazul copilului din mormntul nr. 4, ntre 1.5 si
2 ani. Se pstreaz 15 dini deciduali i 1 dinte permanent neerupt. Nu se observ patologie
dentar. Din 6 oase lungi prezente pentru observaie, pe dou (cele dou tibii) exist leziuni
periostitice slabe. Pe suprafaa ventral a unor coaste se observ porozitate slab. Nu am notat
prezena cribrei orbitalia i a hiperostozei porotice.
Contextul 5
Scheletul este moderat reprezentat i conservat. Pe baza erupiei dentare, vrsta la momentul
morii a fost stabilit ntre 6 i 9 luni. Pe baza lungimii oaselor, vrsta determinat este mai mic,
ntre 1.5 i 3 luni, ceea ce indic o ntrziere a dezvoltrii scheletului postcranian. Acest lucru
este cauzat n general de deficiene nutritive sau de prezena unei boli. Se pstreaz 19 dini
deciduali neerupi. Din 13 oase lungi prezente pentru observaie, doar pe unul (tibia dreapt) s -a
observat periostit slab. Orbitele nu sunt prezente. Pe palatin, mandibul, sfenoid i temporal
exist porozitate slab.
Contextul 6
Scheletul este foarte slab reprezentat i conservat: se pstreaz fragmente de craniu, coaste, oase
de la mn i oase de la picior. Lipsesc elementele osoase sau dentare pe baza crora se poate
determina vrsta; totui putem spune c scheletul aparine un ui subadult.
Contextul 7
Scheletul este bine reprezentat i conservat . Am determinat vrsta pe baza erupiei dentare,
rezultatul fiind ntre 9 i 12 luni. Pe baza lungimii oaselor, ca i n cazul individului din Cxt 5,
vrsta este mai mic, ntre 3 i 6 luni. S-au pstrat 3 dini deciduali erupi, 15 deciduali neerupi
i 2 permaneni neerupi. Pe acetia nu s-a notat prezena vreunei patologii. Din 14 oase lungi
prezente pentru observaie, pe 6 exist leziuni periostitice: humerus, femur i tibie de pe a mbele
pri. Metafiza ambelor oase radius este puin deformat medial, cu franjurare slab. Pe palatin i
mandibul de asemenea se observ porozitate slab. De asemenea, pe craniu se vede foarte bine
activitatea unor insecte.
Raportul analizei antropologice pentru materialul osteologic de la Turda

(2012), Phenice (1969), Bruzek (2002).
Pentru determinarea vrstei la aduli se analizeaz morfologia capetelor sternale (I can,
2009).
elemente: articulaia temporo -mandibular, cavitatea glenoid, humerusul proximal i
distal, radiusul proximal i distal, ulna proxim al i distal, oasele minii, fosa acetabular,
Denti ia i patologia dentar se analizeaz conform standardelor din Buikstra, Ubelaker
(1994) i Steckel et al. (2011).
Ubelaker (1994).
Materialul analizat este puternic afectat de factori tafonomici care au dus la o stare de
reprezentare i conservare foarte slab a scheletelor. Metodele descrise mai sus au fost aplicate
ntr-o mai mic sau mai mare msur n funcie de gradul de reprezentare i conservare al
fiecrui schelet. n unele cazuri s-a utilizat silicon dentar de culoare portocalie pentru lipirea
fragmentelor osoase. Materialul osteologic cuprinde un numr de 5 indivizi. Att reprezentarea
redus a scheletelor ct i numrul lor mic ne mpiedic s interpretm din punct de vedere
biocultural datele osteologice obinute.
Scheletul C2054
Vrsta a fost determinat prin observarea suprafeei auriculare i a uzurii dentare, rezultatul fiind
o vrst cuprins ntre 25 i 35 de ani la momentul morii. Pe baza morfologiei elementelor
pelvisului (concavitatea subpubic, ramul ischiopubic, unghiul subpubic, arcul compozit i
incizura sciatic), sexul scheletului a fost determinat ca fiind posibil masculin. Scheletul
pstreaz un numr de 13 dini. Lipsa mandibulei i a maxilarului ne -a mpiedicat s observm
prezena abceselor sau a periodontitei. Dinii pstrai nu p rezint carii dentare, dar exist tartru
slab. De asemenea, pe incisivi i pe canini nu s-au observat linii hipoplazice. Uzura molarilor
prezeni este puternic. Schimbri degenerative specifice osteoartrozei au fost notate pe dou
zone de articulare (acetabulul drept i falangele de la mna stng) din 12 articulaii prezente
pentru observare. Pe niciun os lung nu au fost observate leziuni periostitice (din 13 oase prezente
pentru observaie ntregi sau fragmentare). Cribra orbitalia i hiperostoza porotic nu au putut fi
notate datorit lipsei oaselor craniului.
Un numr mic de oase au putut fi analizate pentru identificarea markerilor musculoscheletali. Pe

tibia dreapt muchiul tibialis anterior are o inserie pronunat. Pe ambele femure crista aspera
este foarte bine reliefat iar locul de inserie al gluteus maximus este remodelat (Fig. 1).
Humerusul stng prezint o curbur neobinuit n jumtatea proximal a diafizei, ceea ce ar
putea indica un defect de dezvoltare iniiat n perioada de cretere a osului sau probabil o
fractur vindecat cu mult timp n urm (Fig. 2). De asemenea, pe tibia dreapt, pe suprafaa
anterioar a epifizei distale, se observ o faet de ghemuire/ngenunchere (squatting facet)
(Fig.3).
Scheletul C201A
Scheletul aparine unui adult (rezultat dat de observarea general a oaselor). Sexul nu poate fi
determinat. S-au pstrat oase de la mn, tibie, humerus i femur, toate n stare foarte
fragmentar. Acest lucru a limitat puternic observaiile pe care le-am putut realiza. Nu s-a pstrat
nicio articulaie. Dintre diafizele de oase lungi prezente (tibia dreapt, humerus stng, femur
stng), pe cea femoral exist striaii indicatoare pentru o periostit remodelat, non-specific. Pe
lng oasele umane, am mai identificat dou fragmente de oase de animal.
Scheletul C1100B
Pe lng materialul osteologic exist o pung cu ceramic i crmizi. Fragmentele osoase sunt
foarte mici (<1 cm), ceea ce face imposibil identificarea unor aspecte patologice pe acestea. Se
pstreaz de asemenea i 8 dini, dintre care 3 sunt deciduali (1 canin, 2 molari) i 5 permaneni
neerupi (1 incisiv maxilar, 2 canini, 2 molari). Pe baza erupiei dentare, se poate estima vrsta la
momentul morii ca fiind ntre 3 i 4 ani.
Scheletul C144 M2
Se pstreaz doar fragmente foarte mici de os (ca i n cazul scheletului din C1100B) i amprente
de oase pe calupuri de pmnt. Exist de asemenea i 12 dini, dintre care 7 sunt deciduali (3
canini i 4 molari) i 5 sunt permaneni neerupi (2 canini, 1 incisiv maxilar, 2 molari). Pe baza
erupiei dentare, vrsta la momentul morii este aceeai ca i n cazul scheletului din C1100B, i
anume 3-4 ani.
Scheletul C1442
Se pstreaz mai multe fragmente dintre care se disting capetele femurale, fragmente de diafiz,
fragmente craniene i falange de la mn. nainte de a spla oasele, am observat n bulgrii de
pmnt care conineau oasele c acest ea erau deja amestecate, sugernd c nc din trecut
scheletul nu se mai afla n ordine anatomic (Fig. 4). Pe baza observrii scheletului n general,
putem spune c individul este un adult, dar sexul nu poate fi determinat. Nu se pstreaz dini. Pe
fragmentele osoase pstrate nu se observ nicio patologie.
Context Vrsta Sex Observaii

C2054 25-35 ani Pos. M Artroz slab pe dou zone de articulare, markeri
musculoscheletali, squatting facet
C201A Adult IND
C1100B 3-4 ani IND
C144 M2 3-4 ani IND
C1442 Adult IND
Imagini
Fig. 1. Individul C2054. Fragment din diafiza femurului drept.
Fig. 2. Individul C2054. Humerusul stng.

Fig. 3. Individul C2054. Faet de ngenunchere.
Fig. 4. Individul C1442. Imagine cu bulgrul de pmnt n interiorul cruia se observ diafizele
unor oase lungi.
List publicaii 2014
Nr. An
Titlu articol Revista Autori Status
Crt. aparitie
Studia Universitatis - Tatar Andra-Sorina
Bone Diagenesis and FTIR
1 2014 Babes-Bolyai - Ponta Oana Publicat
Indices: a Correlation
Biologia - Kelemen Beatrice Simona
- Chiriac Cecilia
Techniques Used for the
Studia Universitatis - Tatar Andra-Sorina
Diagnostic of Ancient
2 2014 Babes-Bolyai - Radu Claudia Publicat
Tuberculosis in Human
Biologia - Lupan Iulia
Remains
- Kelemen Beatrice Simona
The Evolution of Gender Studia Universitatis
- Mircea Cristina
3 Detection Protocols in 2014 Babes-Bolyai Publicat
Bioarchaeological Studies Biologia
Molecular Diagnosis of
Pathologies in Ancient
Human Remains. A Case
Studia Universitatis - Mihalache Ioana
Study: the
4 2014 Babes-Bolyai - Radu Claudia Publicat
Bioarchaeological Study of
Biologie - Kelemen Beatrice Simona
a Neolithic Skeleton
Displaying Symptoms of
Diabetes
A brief overview of the
Studia Universitatis
mitochondrial DNA as - Rusu Ioana
5 2014 Babes-Bolyai Publicat
molecular marker in - Kelemen Beatrice Simona
Biologia
bioarchaeology
The Evolution and Genetic Studia Universitatis
- Kocsis Eniko
6 Basis of Human 2014 Babes-Bolyai Publicat
Pigmentation Biologia
Anthropological analysis of
a skeletal sample belonging
Journal of Ancient
to the Sarmatian population - Radu Claudia
7 2014 History and Publicat
inhabiting the territory at - Szeredai Norbert
Archaeology
the east of the Pannonian
basin
Analysis of Kinship Using
- Rusu Ioana
Mitochondrial DNA: A
- Radu Claudia
Case Study from a 10th Annuaire Roumain
8 2014 - Oltean Andreea Publicat
Century Medieval d'Anthropologie
- Dobrinescu Catalin
Population in Capidava
(Constana, Romania)
Recent Research at the - Rusu-Bolindet Viorica
Materiale i Cercetri
Basilica Extra Muros in - Badescu Alexandru
9 2014 Arheologice Serie Publicat
Histria at 100 Years Since - Lazarescu Vlad Andrei
Nou
the Initiation of - Dima Mihai
Archaeological Research on - Radu Claudia
the Site - Szeredai Norbert
Anthropological data
regarding three adult Annales Universitatis - Radu Claudia
10 individuals from a middle 2014 Apulensis. Series - Szeredai Norbert Acceptat
bronze age archaeological Historica
context
List participri conferine - 2014
Nr.
Titlu An Tip Publicatie
Crt.
Modern and ancient mitochondrial
Proceedings WiBioSE Conference,
DNA genetic landscape of Prezentare
1 2014 Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
maternal heredity in Eastern Orala
February 02-08, 2014
Europe from Paleolithic onwards
Molecular Diagnosis of a Proceedings WiBioSE Conference,
Prezentare
2 Tuberculosis Case from the Late- 2014 Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
Roman-Period February 02-08, 2014
Testing for type 2 diabetes in an Proceedings WiBioSE Conference,
Prezentare
3 ancient human skeleton using 2014 Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
Orala
molecular methods February 02-08, 2014
MITOCHONDRIAL
HAPLOGROUP DIVERSITY IN
A 10th CENTURY AD Prezentare
MEDIEVAL POPULATION Orala
FROM MIREASA, CONSTAA,
ROMNIA
Mitochondrial haplogroup
diversity in a 10th century ad Prezentare
medieval population from Orala
Capidava, Constanta, Romania
A correlation between physical
analytical methods and the rate of
6 2014 Poster Arandjelovac and Belgrade, Serbia,
DNA extraction from ancient
human remains
Preliminary mitochondrial DNA
analysis of a 10th century Young Natural History Scientists'
7 2014 Poster
medieval population from Meeting
Capidava, Constanta, Romania
Determinig the sex of ancient
human remains using new primers Young Natural History Scientists'
8 2014 Poster
to amplify X and Y amelogenin Meeting
alleles
Neolithic diabetes? Tentative Young Natural History Scientists'
9 2014 Poster
interdisciplinary diagnosis. Meeting
Eye and hair color prediction from Prezentare Young Natural History Scientists'
10 2014
ancient human remains Orala Meeting
How representative is a skeletal
assemblage? A discussion about Prezentare Archaeothanatology: An interdisciplinary
11 2014
paleodemography and the Orala approach to death in Prehistory
treatment of the dead
Applying a biocultural approach
in the reconstruction of the
formation of a funerary Prezentare Homines, Funera, Astra. Time and cause
12 2014
assemblage from a Bronze Age Orala of death from Prehistory to Middle Ages
barrow from Constanta county,
Romania
Mortality and morbidity profiles
for a non-adult sample from the
Prezentare Homines, Funera, Astra. Time and cause
13 early medieval necropolis of 2014
Orala of death from Prehistory to Middle Ages
Mireasa (Constanta county,
Romania)
Reassembling the life of a neonate
Prezentare 3rd International Congress Biomedical
14 found in the balnea of a Roman 2014
Orala Sciences in Archaeology
fort from Romania
APPLYING A BIOCULTURAL
APPROACH IN THE
ANALYSIS OF THE LATE Prezentare Conference on Cultural Heritage and
15 2014
MEDIEVAL/EARLY MODERN Orala New Technologies
POPULATION FROM
GHEORGHENI (ROMANIA)
Subadult funerary treatment in the
Dacian culture. An extended
Prezentare European Association of Archaeologists
16 analysis of the necropolis from 2014
Orala 20th Annual Meeting
Hunedoara-the Castle's Garden
Plateau (Romania)
Exploring Life Quality Levels for
Prezentare
17 a 10th-Century Population from 2014 International Medieval Congress Leeds
Orala
Dobruja, Romania
Social and epidemiological
hypotheses regarding the International Scientific Communication
Prezentare
18 individuals buried in the 4th-th 2014 Session "Archaeology of the First
Orala
centuries necropolis from Millenium AD"
Boldesti-Gradiste, Romania
Identificarea relatiei dintre individ
Prezentare Simpozionul "Zilele Francisc I. Rainer"
19 si sistemul social pentru 2014
Orala 2014. Antropologie si Societate
populatiile arheologice
ANALYSIS OF KINSHIP USING Prezentare Simpozionul "Zilele Francisc I. Rainer"
20 2014
MITOCHONDRIAL DNA: A Orala 2014. Antropologie si Societate
CASE STUDY FROM A 10TH
CENTURY MEDIEVAL
POPULATION IN CAPIDAVA
(CONSTANA, ROMNIA)
A MOLECULAR APPROACH
TO INVESTIGATE
TUBERCULOSIS CASES IN A THE 32ND ANNUAL SCIENTIFIC
21 2014 Poster
GOTHIC POPULATION FROM SESSION OF RSCB
GHERSENI NECROPOLIS,
BUZU COUNTY
Zooarchaeological analysis of an
animal sample from 10th century Prezentare
22 2014 Simpozion Arheovest 2014
Capidava. Inferences regarding Orala
humananimal interaction
Mormantul 1O de la biserica ,,Sf.
Prezentare Al IX-lea simpozion de heraldica,
23 Nicolae" de la Curtea de Arges. 2014
Orala Chisinau, Republica Moldova
Despre geneza Tarii Romanesti
THE SHAFT-HOLE AXE FROM
YUNATSITE (BULGARIA)
AND THE CHRONOLOGY OF
Prezentare Bronze Age Chronology in the
24 THE SHAFT-HOLE AXES OF 2014
Orala Carpathian Basin
P.AnURENI AND BALSA,
TYPES IN THE CARPATHIAN-
BALKAN AREAl
European admixture analysis
International Zoological Congress of
25 inferred by Early Bronze Age 2014 Poster
Grigore Antipa Museum
human bones amtDNA sequencing
Analyses of a Funerary Context
and the Evaluation of DNA
European Association of Archaeologists
26 Recovery from EBA Human 2014 Poster
20th Annual Meeting
Bones by Different Isolation
Methods
Was Sigismund of Luxemburg a
"wiser man" at the end of his Prezentare
27 2014 International Medieval Congress Leeds
reign? Ottoman and Eastern case Orala
studies
The Hungarian Kingdom,
Transylvania, and the Cuman
Prezentare
28 Steppe between the battle of 2014 International Medieval Congress Leeds
Orala
Kalka, 1223 and the Great Tartar
Invasion 1241-1242
Raport tiinific privind rezultatele obinute n cadrul proiectului PCCA_1153b (contract 229/2013)
Evolutie Genetic: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.
O cltorie biomolecular n jurul Carpailor din Antichitate pn n Evul Mediu
n perioada ianuarie-decembrie 2013
Rezumat
n perioada 1 ianuarie 31 decembrie 2013, n cadrul proiectului au fost preluate spre

analiz i demarate investigaiile de antropologie fizic i bioarheologie molecular pentru mai mult
de 600 de schelete i alte resturi biologice (animale, vegetale) din excavaiile arheologice prezentate
n segmentul Situri arheologice i necropole investigate. Au fost definitivate protocoale unitare de
analiz pentru echipele partenerilor 1 i 2, att pentru echipele responsabile cu analizele
antropologice clasice (Anexa 1), ct i cele responsabile de analizele moleculare (extracie ADN vechi,
amplificare prin PCR a secvenelor int, purificare ampliconi i secvenializare), inclusiv protocolul de
autentificare a secvenelor de ADN vechi obinute n cele dou laboratoare responsabile pentru
analiza acizilor nucleici (Anexa 2). Au fost obinute primele rezultate moleculare populaionale
pentru populaiile medievale de secol X din Capidava, Constana i Mireasa, Constana. Au fost
datate cu ajutorul analizelor 13C trei probe recoltate de la trei indivizi: din Curtea de Arge sec. XIV,
Mireasa, Constana (Epoca Bronzului) i Suplacu de Barcu (jud. Bihor) (Neolitic). Pentru aceste trei
probe a fost analizat i fracionarea izotopilor stabili ai carbonului (C). Au fost obinute primele
rezultate n studiile de documentare molecular a unor presupuse patologii (diabet i tuberculoz) i
a comunitilor bacteriene asociate cu resturile umane arheologice i efectele pe care acestea le au
asupra materialului osteologic, cu implicaii n conservarea acestui material. Analizele
complementare ca spectroscopia n infrarou (FT-IR) i difracia de raze X (XRD) au adus primele
rezultate privind efectul unor infecii cu Micobacterium tuberculosis, sau asociate unor afeciuni
metabolice (diabetul) asupra fraciunii minerale a oaselor. Se testeaz utilitatea acestor metode n
diagnosticul acestui tip de patologii. Aceleai metode au fost utilizate pentru determinarea condiiilor
de incinerare pentru indivizi recuperai dintr-o excavaie arheologic datat, pe baza inventarului, n
Epoca Fierului (Hunedoara). Cantitatea i calitatea ADN vechi extras a fost corelat cu indici calculai
pe baza analizelor FT-IR cu scopul de a estima utilitatea acesteia ca metod de selecie a surselor de
material genetic, funcie de gradul de conservare a fraciunii organice din os. Microscopia electronic
de baleiaj a fost utilizat pentru a caracteriza material vegetal (brne de lemn) provenind dintr-o
camer mortuar acoperit de un tumul (Mireasa, Constana, Epoca Bronzului) cu scopul de a estima
gradul de conservare al acestuia i/sau identificarea speciei vegetale.
Rezultatele preliminare obinute au fost valorificate prin prezentri la conferine tiinifice
internaionale (6 prezentri orale n anul 2013 i 1 conferin invitat - invited talk, 6 prezentri orale
i 4 postere acceptate la conferine ce se vor desfura n anul 2014).
Lista publicaiilor ce conin rezultatele pariale obinute n primele 15 luni ale proiectului se
regsete in Anexa 4.
Obiective propuse
Conform actului adiional nr.2/2013 la Contractul de finanare pentru execuie de proiecte de

cercetare nr. 229/2013 (nr ieire UEFISCDI PT83/19.04.2013) partenerii proiectului i-au asumat
urmtoarele obiective pentru perioada 1 ianuarie 31 decembrie 2013:
1. Documentare i schimburi tiinifice

2. Investigaii paleo-osteologice
3. Recuperarea ADN vechi testare i standardizare metod
4. ADN vechi secvenializare i genotipare
5. Analize izotopi stabili ai carbonului (C) i azotului (N), pentru caracterizarea dietei
1
6. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)

7. Spturi arheologice i procesarea inventarului material
8. Studii de arhiv
Rezultatele ateptate convenite n cadrul cererii de finanare depuse iniial, identice cu cele
declarate la debutul finanrii anului n curs i specificate n actul adiional mai sus menionat sunt:
Depunerea raportului anual

Depunerea raportului tiinific
Depunerea raportului financiar
Participarea la conferine tiinifice
n plus fa de aceste rezultate programate, n cadrul proiectului a fost organizat workshop-ul

Interdisciplinaritatea n bioarheologie n data de 29 noiembrie 2013, la sediul Centrului de Biologie
Molecular din cadrul Institutului de Cercetri Interdisciplinare n Bio Nano - tiine al Universitii
Babe-Bolyai din Cluj-Napoca. Deoarece unul din dezideratele acestui proiect, specificat n cererea de
finanare iniial, a fost formarea unei generaii de arheologi capabili s neleag i s utilizeze
tehnici moderne, interdisciplinare de analiz a artefactelor arheologice i a materialului biologic
rezultat din excavaii, grupul int vizat de acest workshop a fost alctuit din studenii, masteranzii i
doctoranzii Facultii de Istorie i Filosofie din cadrul Universitii Babe-Bolyai. Workshop-ul a inclus
prezentri teoretice i exerciii practice n domeniul Antropologiei fizice i Bioarheologiei moleculare.
Lista participanilor la workshop i materialele oferite n mapa workshopului se regsesc ataate
acestui raport n Anexa 3.
Lista publicaiilor ce conin rezultatele preliminare obinute n primele 15 luni ale proiectului se
regsete n Anexa 4.
Situri arheologice i necropole investigate:

n perioada ianuarie decembrie 2013, n cadrul proiectului sunt investigate urmtoarele
necropole:
Echipa P1 Universitatea Babe-Bolyai din Cluj-Napoca

Nr. Nr. de indivizi Inventar
Sit arheologic Perioada Ritual funerar Observaii
Crt. (estimativ) osteologic animal
Suplacu de Barcu nhumare
1 2 7000 BP NU Presupus diabetic
(jud. Bihor) Incinerare
Mireasa
2 11 4500 BP DA nhumare
(jud. Constana)
Cristian Recepionai
3 5 Neolitic ? ?
(jud. Sibiu) Octombrie 2013
Turda Recepionai
4 5 Neolitic ? ?
(jud. Hunedoara) Octombrie 2013
Fntnele
5 zeci Sec. III BC ? Incinerare
(jud. Bistria)
Autostrada Arad-
6 3 Sarmai? NU nhumare
Timioara
Hunedoara nhumare
7 50 Sec. IBC-IAD DA
(jud. Hunedoara) Incinerare
Miercurea Sibiului Recepionai
8 13 Sec. IBC-IAD ? ?
(jud. Sibiu) Octombrie 2013
Boldeti Grditea - Presupus
9 20 Sec. IV-V AD DA nhumare
(jud. Prahova) tuberculos
Mireasa
10 150 Sec. al X-lea AD DA nhumare
(jud. Constana)
2
Capidava
11 10 Sec. al X-lea AD DA nhumare
(jud. Constana)
Coconi
12 12 Sec. XIII-XV AD ? nhumare
(jud. Clrai)
Feleac
13 60 Sec. XIII-XVII AD NU nhumare
(jud. Cluj)
Gheorgheni nhumare
14 100 Sec. XVII-XIX AD NU
(jud. Harghita) (osuar)
DA
Cripta Bisericii
? (resturi animale nhumare
15 Franciscane Sec. XVII-XIX AD
Min. 150 din epoca (osuar)
(jud. Cluj)
roman)
TOTAL 2013 Aprox. 600 7000 BC- sec. XIX AD
Echipa P2 Universitatea Alexandru Ioan Cuza din Iai

Lotul investigat de echipa 2 este reprezentat de 8 schelete.
Nr. Nr. de indivizi Inventar

Sit arheologic Perioada Ritual funerar Observaii
Crt. (estimativ) osteologic animal
Vorniceni Pod
Sec. II-III AD
1 Ibneasa, jud. 2 NU nhumare
Eneolitic
Botoani
Isaiia, Balta Popii,
2 com. Rducneni, 4 Sec. I-II AD NU nhumare
jud. Iai
Popeni Cherchez,
3 com. Ggeti, jud. 1 2800-2005 BC ? nhumare
Vaslui
4 Tarnia 1 ? ? ?
Eneolitic sec. II-III
TOTAL 2013 8
AD
Investigaiile osteoarheologice au implicat recoltarea sau preluarea probelor, nregistrarea

lor n laborator, splarea i efectuarea msurtorilor i observaiilor care au condus la:
- identificarea gradului de reprezentare i conservare a scheletelor;
- atribuirea sexului;
- atribuirea vrstei la momentul decesului;
- identificarea i caracterizarea traumelor i patologiilor;
Exemple ale unor rapoarte predate responsabililor de sptur se regsesc n Anexa 5.
Markerii moleculari investigai n cadrul acestui studiu sunt:

A. Regiunile hipervariabile I i II din regiunea de control a genomului mitocondrial
Alegerea acestora se datoreaz:
1. Faptului c genomul mitocondrial este cantitativ mai bine reprezentat n probele vechi,
ansa s se obin rezultate reproductibile pentru toate loturile investigate fiind mult mai mare.
2. Studiile de genetica populaiilor umane vechi sunt dominate de publicaii care vizeaz
aceti markeri moleculari.
Informaiile privind aceti markeri moleculari ne permit s caracterizm structura genetic a
populaiilor studiate, s reconstituim ereditatea lor pe linie matern, s deducem tipare de migraie
i schimburi intrapopulaionale, s deducem preferine privind tiparele reproductive etc., n loturile
studiate.
Faptul c este folosit n cadrul acestui proiect pentru a analiza i loturi reprezentative pentru
populaia modern ne permite s stabilim conexiuni ntre populaiile vechi i cele moderne, s
3
identificm factorii principali care au contribuit semnificativ la modelarea structurii genetice a

populaiilor n timp (bariere geografice, factori sociali etnia, religia etc.) i s identificm contribuia
populaiilor vechi la alctuirea populaiei moderne.
Investigaii moleculare (aspecte metodologice):
A.a. Lotul modern cuprinde n acest moment mai mult de 200 de persoane i va fi extins
pn la finalul anului 2014.
1. Recoltarea probelor la lotul modern. Recoltarea s-a fcut prin raclaj al mucoasei bucale, cu
ajutorul unor tampoane special create n acest scop (Isohelix DNA Buccal Swabs, Cell Projects Ltd.,
UK) (Figura 1), dup ce participanii la studiu au semnat consimmntul informat i au completat un
chestionar privind ereditatea pe linie matern (Anexa 6).
2. Extracia ADN genomic i amplificarea regiunilor HVRI i HVRII pentru un lot modern,
reprezentativ pentru structura genetic a populaiei contemporane de pe teritoriul Romniei. Acest
lot, mpreun cu secvenele disponibile n bazele de date (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) vor constitui
etalonul cu care vor fi comparate secvenele omoloage pentru populaiile vechi investigate.
Comparaia dintre lotul modern i loturile vechi vor permite urmrirea evoluiei structurii genetice a
populaiilor n timp i spaiu, precum i identificarea factorilor ce au influenat n mod concret
aceast evoluie.
Figura 1. Tampoane pentru raclajul mucoasei bucale (Isohelix DNA Buccal Swabs)
Extracia ADN-ului genomic pentru lotul modern a fost fcut cu ajutorul kit-ului Animal and
Fungi DNA Preparation Kit, PP-208L (Jena Bioscience, Germania), respectnd instruciunile
productorilor.
Secvenele obinute pn n prezent pentru regiunile hipervariabile I i II, amplificate
utiliznd amorsele MPS1A F15989 i MPS4B R377 (Gabriel et al, 2001) au o lungime de aproximativ
1100 pb i permit ncadrarea indivizilor pentru care s-a realizat analiza n haplogrupuri mitocondriale
distincte. n lotul experimental modern supus analizei domin macrohaplogrupurile H i JT, urmate
de o prezen redus a haplogrupurilor U4, U5, HV, K, I, X2 i N1a. Frecvena acestor variante n
populaia analizat n cadrul acestui studiu se ncadreaz n intervalele semnalate n literatur pentru
populaia european.
A.b. Extracia ADN vechi s-a efectuat dup un protocol optimizat care are la baz izolarea
ADN vechi prin tehnica fenol i cloroform, fiind singurul protocol folosit de ctre ambele echipe P1 i
P2 care au drept activitate extracia de ADN vechi din oase umane i animale (Figura 2). Acesta este
descris n Anexa 2.
4
Figura 2. Verificarea cantitii i calitii ADN-ului vechi extras pe gel de agaroz.
n urmtoarea etap a proiectului va fi verificat gradul de certitudine pentru analizele ADN

prin rularea probelor n laboratorul partener (P1, respectiv P2).
B. Ali markeri moleculari folosii n cazuri speciale, alte direcii de cercetare:

B.a. Identificarea i caracterizarea infeciei cu Micobacterium tuberculosis
Figura 3. Amplificare pncA la individul M3 Gherseni

(presupus infecie cu Micobacterium tuberculosis)
Individul testat: Gherseni M3.
ADN a fost amplificat prin tehnica PCR folosind amorsele pncA F2 i pncA R2 (gena pentru
pirazinamidaza / nicotinamidaza). Am folosit 3l ADN genomic. S-au realizat 2 reacii succesive. n
primul amestec de reacie s-a adugat 1mg/ml BSA. n a doua reacie s-a adugat 1l din produsul
primei reacii. S-a folosit polimeraza MangoTaq (Bioline) 1unitate/reacie i MgCl2 2mM. Fragmentul
amplificat are 117 pb.
Program PCR:
95C - 5 min
95C - 30 sec
60C - 30 sec 30X
72C - 15 sec
5
72C - 10 min
4C -
Electroforeza n gel de agaroz 2%, 85V, 1 or.
Ordinea probelor n gel ( I - produs al primei reacii, II - produs al celei de-a doua reacii):
1. (I) ADN genomic extras din coast
2. (II)ADN genomic extras din coast
3. (I) ADN genomic extras din apofize spinoase sudate aparinnd unor vertebre cervicale
4. (II) ADN genomic extras din apofize spinoase sudate aparinnd unor vertebre cervicale
5. Marker 50 pb
6. Control pozitiv
7. (I) ADN genomic extras din radius (diafiz)
8. (II) ADN genomic extras din radius (diafiz)
9. (I) Control negativ de extracie
10. (II) Control negativ de extracie
11. (I) Control negativ de PCR
12. (II) Control negativ de PCR
Figura 4. Amplificare pncA la individul M4 Gherseni

(presupus infecie cu Micobacterium tuberculosis) optimizarea metodei
Individul testat: Gherseni M4 (optimizare metod)

PCR folosind amorsele pncA F2 - pncA R2. Am ncercat 2 amestecuri cu MgCl2 de 1mM i 1,5mM. Am
folosit ADN extras dintr-o coast ce prezenta leziuni tipice tuberculozei. S-au folosit 1l respectiv 1l
diluat de 10X de ADN genomic (s-a realizat anterior un alt PCR cu aceleai amorse, iar banda
corespunztoare controlului pozitiv a fost purificat din gelul de agaroz). S-a folosit polimeraza
MangoTaq Bioline) 1unitate/reacie. Fragmentul amplificat are 117 pb.
Program PCR:
95C - 5 min
95C - 30 sec
62C - 30 sec 30X
72C - 15 sec
72C - 10 min
4C -
Electroforeza n gel de agaroz 2%, 75V, 1 or. Ordinea probelor n gel:
6
1. Marker 50 pb
2. MgCl2 1,5mM, ADN genomic extras din coast, 1l diluat de 10X
3. MgCl2 1,5mM, ADN genomic extras din coast, 1l nediluat
4. MgCl2 1mM, ADN genomic extras din coast, 1l diluat de 10X
5. MgCl2 1mM, ADN genomic extras din coast, 1l nediluat
6. Control negativ de PCR
n figura 5 este prezentat un spectru FT-IR pentru o prob osoas extras dintr-o vertebr
lombar cu corpul vertebral colapsat. Se pot observa vrfurile date de gruprile metil, metilen i de
"long chain deformation". Cumulat, acestea indic prezena unor acizi grai cu caten foarte lung,
posibil acizi micolici.
Figura 5. Utilizarea spectroscopiei IR (FTIR) pentru identificarea probelor cu anumite patologii n

acest caz tuberculoza) se observ semnalul pentru gruprile metil i metilen, absente n probele
fr patologii.
B.b. Diagnosticarea molecular a unui presupus caz de diabet

Au fost proiectate i testate pe ADN modern amorse specifice unor loci asociai n literatura
de specialitate cu patologii asociate diabetului de tip 2.
GCK (Glucokinaza)MODY 2
Forward: CACATCCTAGCCTGCTTCCC
Reverse: TGGTCACCATGACAACCACA
Product length: 132
Figura 6. Teste amorse GCK

(Glucokinaza) probe moderne
HNF1A (hepatocyte nuclear factor 1 homeobox A) MODY3

Forward CCCTGTGGCAGCCGAG
Reverse TTCTCCAGCCAGGAGGTAGG
Product length 141
7
HNF4A MODY1
Forward CCGTGGGGAACAAGGATGTAA
Reverse TAGAGTCAGGAGATCAGGCCC
Product length 131
CAPN10 (Calpain 10) Insulin resistance
Forward ACACCGGATGCCAGAGAGTT
Reverse CATCCTCACCAAGTCAAGGCT
Product length 111
MTTL1 mitochondrially encoded tRNA leucine 1) Maternally Inherited Diabetes and Deafness
Forward TTATACCCACACCCACCCAAG
Reverse GGTACAATGAGGAGTAGGAGGT
Product length 143
HNF4A MTTL1
CAPN10 HNF1A
Figura 7. Teste amorse loci HNF4A, MTTL1, CAPN10, HNF1A probe moderne
C. Investigarea diversitii comunitilor bacteriene din resturi umane arheologice n vederea

caracterizrii atacului microbian i rolului su n degradarea oaselor
Obiective:
1. Determinarea structurii comunitilor de bacterii din sol i oase;

2. Caracterizarea diversitii comunitilor bacteriene i stabilirea rolului unor bacterii n
degradarea osului.
Plan de lucru:
1. Colectarea probelor de os (doar oase intacte al cror interior nu a avut contact cu solul) i de
sol care a avut contact cu osul analizat.
2. Extracia ADN genomic din probele colectate cu ajutorul unui kit specific de extracie i
purificarea de ADN genomic (ADNg) din probele de sol.
8
3. Determinarea concentraiei i puritii ADNg purificat: spectrofotometric, cu ajutorul

electroforezei n gel de agaroz.
4. Amplificarea unui fragment int din gena pentru ARN ribosomal (ARNr) 16S prin tehnica PCR
cu ajutorul unor amorse (oligonucleotide) specifice.
5. Purificarea produilor PCR i determinarea secvenelor prin tehnica de pirosecvenializare.
6. Analiza datelor brute de pirosecvenializare i identificarea taxonilor.
Stadiu actual al studiului:

1. Au fost recoltate mai multe probe de sol i os din care a fost extras ADNg.
2. A fost determinat spectrofotometric concentraia ADNg purificat, concentraiile au avut
valori cuprinse ntre 10 i 20 ng/l.
3. S-au proiectat i comandat amorsele fuzionate ce vor fi utilizate la PCR i apoi pentru
pirosecvenializare.
D. Datarea probelor cu radiocarbon

n vederea publicrii datelor au fost trimise spre analiz i sunt n curs de investigare trei
probe: Vlaicu (Curtea de Arge - datarea 2), Suplacu de Barcu (presupus diabetic) i Mireasa (lotul
Epoca Bronzului).
E. Analize de izotopi stabili C i N

n vederea publicrii datelor a fost stabilit un contact cu laboratorul de analize izotopice al
Universitaii Tuebingen, Germania. Loturile Mireasa (Epoca Bronzului), reprezentate att de lotul
resturilor umane, ct i animale fiind n curs de analiz.
Participri conferine:
2013
Third Arheoinvest Congress, Iunie 2013, Iai, RO
Prezentare oral (Claudia Radu)
Sesiunea internaional a Muzeului de Istorie Naional i Arheologie Constana
Pontica Octombrie 2013, Constana, RO
Prezentare oral (Beatrice Kelemen coautor)
Interethnic Relationships in Transylvania. Militaria Mediaevalia in Central and South
East Europe, Octombrie 2013, Sibiu, RO
Prezentare oral (Claudia Radu, Beatrice Kelemen)
Neoliticul Transilvaniei. Lumea Nou Lumea Zau, Noiembrie 2013, Zalu, RO
Prezentare oral (Ioana Mihalache, Claudia Radu, Beatrice Kelemen)
Conferina Internaional a Departamentului de Tracologie (Institutul de Arheologie
i Muzeu al Academiei Bulgare), 21-24 Sofia, Bulgaria
Prezentri orale (Radu Bjenaru i Vlad Zirra)

Alte conferine la care participarea a fost acceptat

2014
WiBioSe, Februarie 2014, Serbia
Beatrice Kelemen conferin invitat - invited speaker
Cecilia Chiriac, Cristina Mircea, Ioana Mihalache, Ioana Rusu (masterande)
prezentri orale (cu Beatrice Kelemen coordonator ultim autor - pentru
fiecare prezentare oral)
Andra Ttar (masterand) poster (cu Beatrice Kelemen coordonator
ultim autor)
International Medieval Congress, Iulie 2014, Leeds, UK
Prezentare oral (Claudia Radu, Beatrice Kelemen)
9
European Archaeological Association Symposium, Septembrie 2014, Istanbul, TR

Prezentare oral (Claudia Radu, Beatrice Kelemen abstract acceptat)
1st Young Natural History scientists Meeting, 12-14 Februarie 2014, Paris, FR
3 postere - Ioana Mihalache, Cristina Mircea, Ioana Rusu masterande (cu
Beatrice Kelemen coordonator ultim autor)
Organizare workshop:
29 Noiembrie 2013 Interdisciplinaritatea n Bioarheologie Cluj-Napoca la Institutul de Cercetri
Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine, Centrul de Biologie Molecular.
A fost organizat un workshop interdisciplinar, practic, adresat studenilor la Arheologie
(Universitatea Babe-Bolyai din Cluj-Napoca) pentru a le prezenta tehnicile moleculare ce pot fi
folosite pentru caracterizarea inventarului osteoarheologic (vezi Anexa 3).
Deplasrile membrilor echipei proiectului n ar i strintate au vizat documentarea n

instituii cu activitate recunoscut n domeniul de activitate al proiectului, stabilirea de contacte
internaionale, identificarea unor poteniale loturi populaionale cu conexiuni cu populaiile aflate
deja n studiu.
Sumar al obiectivelor i activitilor partenerilor n etapa a II-a a proiectului.
1. Optimizarea protocolului de extracie ADN vechi din os i dinte.

2. Identificarea punctelor n care are loc contaminarea i eliminarea ei.
3. Identificarea calitii materialului extras.
4. Histomorfometrie n vederea restrngerii intervalului de vrst n momentul decesului.
5. Caracterizarea proceselor care contribuie la degradarea osului n sol i n spaiul de depozitare.
6. Caracterizarea regiunilor hipervariabile I i II din regiunea de control a genomului mitocondrial la
probele moderne i vechi.
7. Identificarea i caracterizarea molecular a infeciei cu Micobacterium tuberculosis la schelete cu
patologii atribuite tuberculozei osoase.
8. Metode moleculare de diagnosticare a diabetului (teste schelet neolitic Suplacu de Barcu).
9. Spectrometrie IR (FTIR) pentru caracterizarea fraciunilor minerale i organice n probe de os
normal i patologic n vederea identificrii unor semnturi tipice pentru anumite patologii (diabet,
tuberculoz).
10. Spectrometrie IR (FTIR), difracie de raze X (XRD) pentru identificarea temperaturilor de ardere n
cazul oaselor incinerate.
10
Anexa 1 Analize de Antropologie Fizic

a) Fia
a de preluare a scheletului uman (model)
Fia nr.: Denumire sit: Cod sit (CIMEC):
Isaiia-Balta Popii,, com. Rducneni, jud. Ia
Iai
4 98710.01
M8/2003
Groap
Context funerar Umplutur Amenajare funerar
Form Adncime
Conturul gropii
Oval-alungit 1.10 m
Necropol de inhumaie nu nu
(1.80mx0.80m) Partea inferioar
1.10 m
Orientare
NNV
Privirea spre est
Desen Fotografie
Descrierea scheletului:
1. Cap Craniul deformat datorat practicii bandajrii aplicat la vrsta copilriei
2. Corp
3. Braul drept Situat pe lng corp
4. Braul stng ndoit din cot i cu palma pe abdomen
5. Piciorul drept ntins pe spate
6. Piciorul stng ntins pe spate
Starea de conservare Relative bun
Stratigrafie M8 a fost gsit n caseta E, la marginea sud-vestic

sud a locuinei precucuteniene nr. 8
ncadrare cronologic A doua jumtate a sec. I sec. II d.Hr
Atribuire cultural Perioada sarmatic (roxolani)

Sex feminin; adult; aproximativ 30 de ani; tipul nordoid n amestec cu trsturi protoeuropoide; nlime
nl
de 1.57m.
Inventar funerar:
a. cel puin
pu 12 mrgele din sticl i pasta de sticl n zona picioarelor (glezna dreapt-culoare
dreapt
glbui-aurii;
glbui glezna stng-culoare albstruie)
Alte comentarii Nicolae Ursulescu, Raluca Koglniceanu, Necropola sarmatic de la Isaiia (c. Rducneni, j. Iai). Date
preliminare,, in Cercetri Istorice XXI-XXIII, 2002-2004 (2007), p. 27-58,
58, Complexul Muzeal Naional
Moldova, Iai
Georgeta Miu.
Miu Studiul antropologic al scheletelor din necropola sarmatic de la IsaiiaIsaiia, in Cercetri
Istorice XXI-XXIII,
XXIII, 2002-2004
2002 (2007), 59-71.
Proba pentru analiza ADN a fost recoltat din zona humerusului.
11
b) Protocol investigaii antropologie fizic (Laborator UBB i platforma Arheoinvest) - cuprins
PROTOCOLUL DE LUCRU AL LABORATORULUI DE ANTROPOLOGIE FIZIC
CENTRUL DE BIOLOGIE MOLECULAR

INSTITUTUL DE CERCETRI INTERDISCIPLINARE N BIO-NANO TIINE
UNIVERSITATEA BABE-BOLYAI
Claudia Radu
realizat cu sprijinul
Dr. Andrei Soficaru
Dr. Beatrice Kelemen
Acest document este pentru uz intern n cadrul Centrului de Biologie Molecular al Universitii Babe-Bolyai.
CLUJ-NAPOCA
2013
CUPRINS
1. Starea de reprezentare.............................................................................................4
2. Starea de conservare...............................................................................................5
3. Determinarea sexului
3.1. Determinarea sexului pe craniu....................................................................6
3.2. Determinarea sexului pe coxal.....................................................................7
4. Determinarea vrstei la deces

4.1. Morfologia capetelor sternale.....................................................................11
4.2. Morfologia simfizei pubiene.......................................................................12
4.3. Morfologia suprafeei auriculare.................................................................14
4.4. Sinostoza suturilor craniene........................................................................15
4.5. Uzura dentar..............................................................................................17
4.6. Erupia dentar............................................................................................17
4.7. Lungimea oaselor........................................................................................18
4.8. Sinostoza epifizelor.....................................................................................33
5. Analiza dentiiei
5.1. Inventarul dinilor i a aspectelor patologice..............................................39
5.2. Uzura molarilor............................................................................................40
5.3. Localizarea i morfologia aspectelor patologice.........................................41
6. Patologie
6.1. Artroza articulaiilor....................................................................................41
6.2. Leziuni periostitice.....................................................................................43
6.3. Patologii metabolice
6.3.1. Cribra orbitalia i Hiperostoza porotic.....................................44
6.3.2. Scorbut.........................................................................................44
6.3.3. Rahitism........................................................................................45
6.4. Patologia vertebrelor...................................................................................45
6.5. Entesopatii..................................................................................................45
6.6. Patologie VI................................................................................................64
7. Trsturi non-metrice...........................................................................................64
12
8. Traume i fracturi
8.1. Fracturi........................................................................................................67
8.2. Traume........................................................................................................68
8.3. Activiti medicale......................................................................................68
9. Bibliografie..........................................................................................................69
13
Anexa 2 Protocol optimizat de extracie ADN vechi
Extracia aDNA din oase umane i animale

1. PROTOCOL PCI
1. Tampon pentru decalcifiere i digestie:
Conine: TrisHCl 50mM (pH=8), SDS 10%, EDTA 0,5mM.
5% TrisHCl (stoc 1M); 40% SDS (stoc 50%); 0,1% EDTA (stoc 0,5M); 74,9% H2O
2. Soluii stoc:
1. SoluieTris-HCl 1M (pH=8): - cantitile sunt calculate pentru un volum de 100ml;
- se dizolv 12,11g Tris n 80ml H2O miliQ;
- se corecteaz pH-ul la 8 cu HCl;
- se autoclaveaz.
3. Soluie NaOH 10N (100ml):
- se cntresc 40g NaOH
- se adaug 70ml H2O-miliQ autoclavat i se agit pn la dizolvare;
- se aduce volumul la 100ml;
- nu se autoclaveaz.
4. Soluie SDS 25% (dodecil sulfat de sodiu):
- se introduc 50g SDS n 50ml H2O-miliQ autoclavati se nclzete soluia la 80C pentru dizolvare;
5. Soluie EDTA 0,5M (etilendiaminotetraacetatsare disodic) :
- se cntresc 18,61g EDTA, peste care se adaug 80ml H2O-miliQ;
- se agit puternic i se adaug 1ml soluie NaOH 10N;
- se adaug NaOH pn cnd soluia devine alcalin (pH=8,0), iar EDTA este dizolvat complet.
- se aduce volumul la 100ml cu H2O-miliQ i se autoclaveaz;
1 ml tampon pentru Decalficiere si digestie + 50 ul Proteinaz K 20mg/ml (C final 1mg/ml)
Soluie Acetat de Na 3M (pH 5.2) 50ml
- se cntresc 20,4g Acetat de Na, peste care se adaug 40ml H2O-miliQ
- se adaug Acid Acetic pn cnd soluia devine acid (pH=5,2).
- - se aduce volumul la 50ml cu H2O-miliQ i se autoclaveaz;
Material:
S-au utilizat 200mg pudr de os compact + 1ml tampon pentru decalcifiere i digestie + 50ul
Proteinaz K 20mg/ml (C final 1mg/ml)
Protocol:
Incubare la 56oC peste noapte
Centrifugare 6000xg 5 min (transfer supenatant)
Supernatant + 1 volum PCI (vortex)
Centrifugare 6000xg 15 min (transfer faza superioar)
Faza superioar + 1 volum PCI (vortex)
Faza superioar + 1 volum C (vortex)
Faza superioar + 2,5 volume Etanol Absolut + 1/10 volume Acetat de Na 3M pH 5.2
Incubare 3C 30 min
Centrifugare 12000xg 15 min
Pelet + 1 ml Etanol 80% (se amestec uor)
Pelet + 1 ml Etanol 80% (se amestec uor)
Uscare pelet la temperatura camerei 37C 12 min
Eluie ADN 100ul H2O (incubare peste noapte 3C)
14
Anexa 3 Detalii Workshop Interdisciplinaritatea n Bioarheologie, 29 noiembrie 2013, Cluj
List participani
Nr. crt. Prenume Nume Facultate
1 Horaiu Coci Arheologie, licen II
2 Drago Mitrofan Arheologie, licen II
3 Paul Vdineanu Arheologie, licen II
4 Ion Petru Arheologie, licen II
5 Xenia Pop Zooarheologie, masterat
6 Viceniu Pucau Istoria artei, licen II
7 Lucian Muntean Arheologie i studii clasice I
8 Dan Morariu Arheologie i studii clasice I
9 Alexandru Buda Politehnica, Materiale
10 Mihai Brian Politehnic, Tehnologii n sudur
11 Xenia Puan
12 Raul Cioban Fizic, licen III
15
Materiale de prezentare oferite participanilor
16
Anexa 4 Publicaii n anul 2013
1. Bioarchaeological analysis of human remains from the necropolis of Gherseni. Preliminary

results and discussions.
autori: Claudia Radu, Szeredai Norbert, Vlad-Andrei Lzrescu, Bogdan Ciuperc, Beatrice Kelemen
n Ephemeris Napocensis XXIV - 2014.
2. Bioarchaeological study of a skeleton belonging to the Suplacu Group, dated in the Middle
Neolithic period.
autori: Claudia Radu, Ioana Mihalache, Gruia Fazeca, Florin Gogltan, Beatrice Kelemen
n Acta Musei Porolissensis XXXV - 2013.
17
Anexa 5 Rapoarte analiz antropologie fizic predate responsabililor de excavaie (exemple)
1. Raport: antropologie fizic

Campania: Capidava 2013
n campania 2013, din excavaia de la Capidava au fost colectate pentru analiz antropologic patru
schelete umane cu context arheologic clar i dou seturi de resturi umane subadulte fr context
arheologic (umplutur). n plus, apar resturi umane disparate, din umplutur, care neavnd context,
nu sunt cuprinse n cadrul acestei analize.
Scheletele au fost numerotate M6, M8, M9, M10, respectiv U1 i U2.
Pentru fiecare schelet au fost analizai urmtorii parametri:
- Inventarul osos: 68 variabile, scor 0-3 (0=absen os; 1=reprezentare sub 50% a osului;
2=reprezentare ntre 50-75% a osului; 3=reprezentare peste 75% a osului). Variabilele
reprezint fie un os, fie un segment de os.
- Gradul de conservare a scheletului (tafonomia): 68 variabile, scor 0-3 (0=lipsa osului;
1=conservare slab-75% din suprafaa osului este erodat/alterat sub aciunea solului;
2=conservare moderat-50% din suprafaa osului este erodat/alterat sub aciunea solului;
3=conservare bun-25% sau mai puin din suprafaa osului este erodat/alterat sub
aciunea solului). Variabilele reprezint fie un os, fie un segment de os.
- Descrierea dentiiei: prezene, absene antemortem/postmortem; tartru scor 0-3 (0= fr
tartru; 1=depunere slab de tartru; 2= depunere moderat de tartru; 3=depunere
considerabil de tartru), periodontit, hipoplazie.
- Vrsta:
subaduli
- erupia dinilor, lungimea oaselor lungi, gradul de sutur al epifizelor oaselor lungi
aduli
- erupia dinilor, uzura dinilor permaneni, lungimea oaselor lungi, gradul de sutur al
epifizelor oaselor lungi, analiza capetelor sternale ale coastelor, aspectul simfizei pubiene,
aspectul suprafeei auriculare, sinostoza suturilor craniene.
- Artroza articulaiilor
- Leziuni periostitice
- Patologii
- Traume: fracturi, lovituri
M6 subadult, sex nedeterminat, 38-40 sptmni prenatal, fr traume, fr patologii.
Inventar osos: scor pentru 68 variabile 0,91 (pierderea a mai mult de 50% din schelet). Reprezentare
slab.
Conservare: scor pentru 68 de variabile 0,79 (75% din suprafaa oaselor analizate este
erodat/alterat sub aciunea solului) conservare slab.
Inventar dentiie: exist dini deciduali neerupi (pentru radiologie).
Sex: indeterminabil prin metode de antropologie fizic.
Vrsta: dini deciduali neerupi (40 sptmni prenatal), msurtori osteologice (38 sptmni
prenatal).
Artroza articulaiilor: nu e cazul.
Leziuni periostitice: pe diafiza oaselor lungi (inclusiv coaste i clavicul) apar la suprafaa osului
modificri cu aspect periostitic, dar cel mai probabil, nu au cauze patologice, ci se datoreaz
procesului de cretere/dezvoltare, avnd n vedere c individul este subadult (38-40 sptmni
prenatal).
Patologii: nu exist.
Traume: nu exist.
18
M8 adult, femeie, 20-24 ani, traume: lovitur slab cu obiect contondent, antemortem parietal
stng; fractur oblic coast (stng), vindecat, fr urme de infecie.
Inventar osos: scor pentru 68 variabile 2,85 (este prezent mai mult de 75% din schelet).
Reprezentare foarte bun.
Conservare: scor pentru 68 de variabile 2,91 (sub 25% din suprafaa oaselor analizate este
erodat/alterat sub aciunea solului) conservare foarte bun.
Inventar dentiie: prezeni 31 (nu a erupt M3 maxilar stng pentru radiologie). 3 carii. Tartru
mandibular slab, absent maxilar. Periodontit maxilar slab, absent mandibular. Nu prezint linii
hipoplazice.
Sex: femeie (CRANIU: creast nucal NA, proces mastoid 4, margine supraorbital 3, glabela NA,
Menton 4; PELVIS: concavitatea subpubian 5, unghi subpubian 6, ram ischiopubian 8, arc
ventral 6, arc compozit 8, incizura sciatic 4, sulcus preauricular 2).
Vrsta: Sudarea epifizelor oaselor lungi 16-24 ani, aspectul capetelor sternale ale coastelor 16-19
ani, aspectul simfizei pubiene 25 ani, suprafaa auricular 20-24 ani, sinostoza suturilor craniene
extern 34,7 ani (puin informativ) .
Artroza articulaiilor: osteofite mai mici de 3mm pe: humerus distal stng, radius distal stng, oasele
minii stnga i dreapta, femur proximal stng, tibie proximal stnga i dreapta, tibie distal stnga.
Markeri de activitate, posibil predominant stnga.
Leziuni periostitice: striaii longitudinale accentuate pe femur stng, restul oaselor prezente fr
modificri.
Traume: Lovitur slab cu obiect contondent, antemortem, vindecat, parietal stng, fr infecie.
Diametrul traumei 10,78mm. Fractur oblic, vindecat, fr infecie, treime sternal coast stnga.
Dimensiunea calusului 14,43mm.
Observaii: pat circular roiatic pe craniu n zona medial a suturii lambdoide cu diametrul de
56,49mm (probabil impresia lsat de matrial metalic sau textil); inel roiatic extern concentric cu
pata descris mai sus cu diametrul de 88,53mm (probabil impresia lsat de material metalic sau
textil).
Fig. 1 traum cranian,

parietal stng
19
Fig. 2 traum cranian,

parietal stng - detaliu
Fig. 3 urmele colorate,

concentrice din
apropierea suturii
lambdoide
Fig. 4 fractur oblic

vindecat antemortem
treime sternal a unei
coaste stngi
M9 - subadult, sex nedeterminat, 2,6-4 ani, fr traume, fr patologii.
Inventar osos: scor pentru 68 variabile 1,01 (pierderea a mai mult de 50% din schelet). Reprezentare
slab.
Conservare: scor pentru 68 de variabile 01,06 (75% din suprafaa oaselor analizate este
erodat/alterat sub aciunea solului) conservare slab.
Inventar dentiie: 16 dini deciduali erupi; exist dini deciduali neerupi (pentru radiologie).
Vrsta: erupie dentar (3-4 ani), msurtori osteologice (2,6-3 ani).
Leziuni periostitice: pe oasele prezente nu exist.
Traume: nu exist.
20
M10 - subadult, sex nedeterminat, 0-2 luni postnatal, fr traume, fr patologii.
Inventar osos: scor pentru 68 variabile 1,88 (ntre 50 - 75% din schelet). Reprezentare moderat.
Conservare: scor pentru 68 de variabile 2,04 (ntre 50-75% din suprafaa oaselor analizate este
erodat/alterat sub aciunea solului) conservare moderat.
Inventar dentiie: exist dini deciduali neerupi (pentru radiologie).
Vrsta: erupie dentar (0-2 luni), msurtori osteologice (0-2 luni).
Leziuni periostitice: pe oasele prezente nu exist.
Traume: nu exist.
U1
Oasele lungi nu prezint epifize. Oasele inventariate: 8 coaste, 5 arcuri vertebrale nesudate, 1 corp
vertebral, 6 falange, humerus D incomplet distal, femur S,D, tibie S,D, fibul S,D. Pe baza
msurtorilor efectuate pe oasele lungi atribuim vrsta de 1,5 luni postnatal, fr posibilitatea de
determinare a sexului prin metode de antropologie fizic.
U2
Reprezentare foarte slab, conservare foarte slab, pe baza erupiei dentare i lungimii oaselor lungi
se atribuie vrsta de 0-6 luni postnatal. Nu prezint artroza articulaiilor, leziuni periostititce,
patologii sau traume.
Reprezentarea grupului pe clase de vrst:
CAPIDAVA 2010, 2013

Numar de invidizi pe grupe de varsta
GRUPE
DE
PERIODONTITA
VARSTA
PAT. SPECIALA
HIPOPLAZIE
PERIOSTITA
TRAUME
TARTRU
ABCESE
CRIBRA
CARII
DJD
6-10 1
11-15 1 1 1
21-25 1 1 1 1 1 1
36-40 1 1 1 1 1 1 1
41-45 1 1 1 1
46-50 1 1 1 1 1 1 1 1
TOTAL 4 2 3 3 3 5 3 4 2 0
21
GRUPE DE Sub 0- 6- 11- 16- 21- 26- 31- 36- 41- 46- 51- 56-
VARSTA/SEX 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 60+ TOTAL
MASCULIN 1 1
FEMININ 1 1 1 3
SUBADULT 1 2 1 1 5
INDETERMINAT 0
TOTAL 1 2 1 1 0 1 0 0 1 1 1 0 0 0 9
Observator 1: Claudia Radu ________________________

Observator 2: Ioana Rusu _________________________
Observator 3: Cristina Mircea ______________________
Responsabil proiect PCCA_1153/2011/P1-UBB
Dr. Beatrice Kelemen
2. Raport antropologic pentru materialul osteologic de la Gheorgheni- Biserica Romano-

Catolic
Radu Claudia*, Szeredai Norbert*, Kirly Lajos*, Beatrice Kelemen*
*Centrul de Biologie Molecular, Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nano tiine, Universitatea
Babe-Bolyai Cluj-Napoca
Materialul osteologic a fost sortat n funcie de tipul de os, de parte (stnga, dreapta) sau
poriune (distal, medial, proximal) i de element de diagnostic (ex. procesul mastoid).
inndu-se cont de aceast mprire, oasele au fost numrate pentru a se stabili numrul
minim de indivizi (MNI). S-au folosit urmtoarele elemente osteologice:
Element osteologic MNI

Frontal 9 (12)*
Occipital 6 (9)*
Proces mastoid dreapta 8 (11)*
Proces mastoid stnga 13 (16)*
Mandibul 58
Clavicul dreapta 36
Clavicul stnga 23
Cavitatea glenoid dreapta 19
Cavitatea glenoid stnga 24
Humerus distal dreapta 43
Humerus distal stnga 30
Sacrum 20
Femur dreapta 42
Femur stnga 32
Patella dreapta 20
Patella stnga 14
Tibie dreapta 28
Tibie stnga 23
Talus dreapta 32
22
Talus stnga 33
Calcaneu dreapta 24
Calcaneu stnga 30
Ilium dreapta 21
Ilium stnga 22
Tab. 1.
* pe lng aceste elemente, mai exist trei cranii relativ ntregi, astfel c pentru stabilirea
MNI pentru fiecare element cranian n afar de mandibul, trebuie s se adauge 3 (ex.
pentru frontal MNI=9+3=12)
Aa cum reiese din Tab. 1., cel mai ridicat numr minim de indivizi s-a obinut din numrarea
mandibulelor (N=58). Humerusul drept distal i femurul drept au oferit de asemenea valori
nalte (N=43, respectiv N=42), dar totui semnificativ reduse fa de mandibul. Diferenele
dintre rezultatele obinute pentru toate elementele analizate pot reflecta modul n care
aceste oase au fost prelevate n vechime pentru a fi mutate.
Dintre elementele osteologice prezente, s-a insistat pe analiza iliumului i a mandibulelor. De
asemenea, s-au analizat n detaliu cele trei cranii pstrate relativ ntregi.
Fragmentele de ilium au fost cercetate n vederea stabilirii sexului prin observarea marii
incizuri sciatice. Astfel, s-au obinut urmtoarele date:
Ilium
Dreapta Stnga
Masculin Feminin Indeterminat Subadult Masculin Feminin Indeterminat Subadult
0 5 2 14 4 2 0 16
Total 21 Total 22
Tab. 2. Distribuia populaiei n funcie de sex, determinat pe baza observrii morfologiei
ilium-ului.
Dat fiind c numrul total de indivizi obinut prin numrarea ilium-ului reprezint
aproximativ doar o treime din numrul de indivizi oferit de numrarea mandibulelor, s-a
insistat pe studiul acestora din urm.
Subaduli (N=39) Aduli (N=22)
Sex/Vrst 0-5 6-10 11-16 17-25 25-35 35-45 45+ Adult Total
ani ani ani ani ani ani
Masculin - - - 2 3 - - 3 8
Feminin - - - - 2 1 2 3 8
Adult - - - - - - - 6 6
indeterminat
Subadult 21 16 2 - - - - - 39
Total 21 16 2 2 5 1 2 12 61
Tab. 3. Distribuia pe grupe de vrst i pe sex (informaii obinute din observarea
mandibulelor)
Mandibula ofer posibilitatea stabilirii sexului i vrstei prin analiza eminenei mentale,
respectiv a uzurii dentare. Pentru determinarea sexului s-au folosit protocoalele descrise n
Standards (Buikstra, Ubelaker 1994) i Data Collection Codebook (Steckel et al. 2006). Pentru
stabilirea vrstei s-a folosit schema lui Brothwell pentru uzura dentar (White et al. 2012).
Din pcate, sexul stabilit doar prin observarea eminenei mentale, n lipsa altor elemente de
diagnostic, are o marj de eroare ridicat, rezultatul fiind limitat.
23
Mandibula, de asemenea, permite observarea dentiiei inferioare. S-au analizat urmtoarele

patologii:
dini pierdui antemortem;
carii dentare;
abcese;
tartru;
periodontit;
hipoplazia linear a enamelului dentar.
Distribuia acestora n funcie de sex i pe grupe de vrst arat astfel:

VRST SEX DPPAM* DC* ABCESE TARTRU PERIO* HLE*
0-5 ani M* - - - - - -
F* - - - - - -
IND* - - - - - -
SUB* - - - - - -
6-10 ani M - - - - - -
F - - - - - -
IND - - - - - -
SUB - 3 - - - -
11-16 ani M - - - - - -
F - - - - - -
IND - - - - - -
SUB - - - - - -
17-25 ani M - 1 - 1 - -
F - - - - - -
IND - - - - - -
SUB - - - - - -
25-35 ani M - 1 - 2 - 1
F 1 1 1 1 1 -
IND - - - - - -
SUB - - - - - -
35-45 ani M - - - - - -
F - - - - - -
IND - - - - - -
SUB - - - - - -
45 + M - - - - - -
F 1 1 1 1 1 -
IND - - - - - -
SUB - - - - - -
Adult* M 2 1 1 - 1 -
F 3 - 3 1 - -
IND 5 - 2 - - -
SUB - - - - - -
Total 12 8 8 6 3 1
Tab.4. Distribuia patologiilor dentare pe grupe de vrst. n tabel e trecut numrul de
indivizi, nu numrul de leziuni.
24
*DPPAM- dini permaneni pierdui antemortem.

*DC- dini cariai.
*PERIO- periodontit.
*HLE- hipoplazia linear a enamelului.
*M=masculin; F=feminin; IND=adult, sex indeterminat; SUB=subadult (<17 ani).
*ADULT- indivizi a cror vrst nu a putut fi determinat cu exactitate, dar pe baza trsturilor generale s-a putut stabili c
sunt aduli.
DPPAM DC ABCESE TARTRU PERIO HLE TRAUME C.O/H.P.

ADULT M 2 3 1 3 1 1 0 0
F 5 2 5 3 2 0 2 3
IND 5 0 2 0 0 0 1 0
Subadult 0 3 0 0 0 0 2 0
Total 12 8 8 6 3 1 5 3
Tab. 5. Distribuia patologiilor n funcie de sex i vrst (fr grupe de vrst).
*C.O./H.P. - cribra orbitalia/hiperostoz porotic
n cadrul ansamblului de oase amestecate au fost identificate trei cranii relativ ntregi.
Pentru acestea s-a realizat stabilirea sexului, determinarea vrstei, analiza dentiiei i
identificarea patologiilor i traumelor posibil prezente. Din pcate, n nici unul din cele trei
cazuri nu s-a pstrat mandibula. Pentru determinarea sexului s-au observat creasta (linia)
nucal, procesul mastoid, marginea supraorbital, glabella i eminena mental, iar stabilirea
vrstei s-a fcut pe baza sinostozei suturilor craniene. Pentru determinarea ambelor atribute
biologice s-au utilizat sistemele de observare din Standards (Buikstra, Ubelaker 1994) i Data
Collection Codebook (Steckel et al. 2006).
Astfel, Craniul nr. 1 prezint o stare de conservare i reprezentare bun (peste 75%)
(Fig. 2.). Sexul a fost determinat ca posibil feminin iar vrsta este cuprins ntre 34,7 i 45,5
ani. Maxilarul a mai pstrat doar 8 dini, dintre care unul prezint o carie dentar ocluzal i
un abces. Pe suprafaa calotei craniene se observ leziuni specifice hiperostozei porotice.
Craniul nr. 2 aparine unei femei cu o vrst cuprins ntre 30 i 40 de ani. Dintre cei
6 dini pstrai pe maxilar, nici unul nu prezint patologii. Pe suprafaa palatului orbital sunt
prezente leziuni indicatoare pentru cribra orbitalia iar pe suprafaa calotei craniene exist
leziuni specifice hiperostozei porotice. Pe frontal a fost identificat o traum, realizat cu un
obiect cu vrf rotund, cu o dimensiune de 14,49mm n diametru (Fig. 1.). Leziunea e
poziionat pe mijlocul suprafeei anterioare a frontalului (pe frunte), pe sutura metopic,
care la acest individ este extins pn la sutura coronar i nu este nchis. Dat fiind faptul c
nu exist urme de vindecare, trauma a fost cel mai probabil realizat perimortem.
Craniul nr. 3 aparine unei femei cu o vrst cuprins ntre 39,4 i 51,9 ani. Pe locul
de articulare a mandibulei cu temporalul (articulaia temporo-mandibular) se observ
artroz puternic, bilateral (Fig. 10). Ca i n cazul celorlalte dou cranii, exist leziuni
hiperostozice pe calota cranian. Acest individ prezint o serie de traume. Prima, identificat
pe parietalul stng n zona suturii sagitale, msoar 16,79mm. Forma sa circular sugereaz
c a fost realizat cu un obiect contondent, cu vrf rotund. Calusul format pe marginile
loviturii indic faptul c la momentul morii aceasta era deja vindecat, prin urmare a fost
realizat antemortem. A doua lovitur este o fractur cu nfundare (depressed fracture),
poziionat pe frontal, deasupra glabellei i msoar 10,92mm n diametru (Fig. 4). Lovitura a
fost realizat cu un obiect contondent, cu vrf rotund; compactul (osul cortical) de pe
suprafaa exocranian a fost nfundat spre interior, fr a se rupe. Marginile leziunii prezint
25
urme slabe de vindecare; de asemenea, n jurul loviturii se observ activitate vascular,

asociat cu procesul de vindecare. Prin urmare, momentul realizrii loviturii poate fi plasat
cu puin timp naintea morii. Traumele 3, 4 i 5 se observ pe frontal, medial, lng sutura
coronar i msoar fiecare n jurul a 30mm (Fig. 5). Toate trei au fost realizate cu un obiect
tios. Nici una nu prezint urme de vindecare, prin urmare foarte probabil au fost suferite
perimortem.
n continuare, pe dou mandibule i un frontal au fost de asemenea identificate

traume.
Mandibula nr. 2 aparine unui individ adult trziu, al crui sex nu a putut fi identificat
(Fig. 6). Vrsta sa naintat poate fi dedus din pierderea complet a dentiiei i nchiderea
spaiilor alveolare. n dreapta mentonului se poate observa o fractur prin nfundare
(depressed fracture), cu un diametru de 12,76mm, realizat cu un obiect cu vrf rotund. Nu
se observ activitate de vindecare, prin urmare trauma a fost probabil suferit perimortem.
Mandibula nr. 46 aparine unui subadult cu vrsta de 6 ani (Fig. 7). O traum a fost
identificat n dreapta mentonului; aceasta msoar 14,75mm n lungime i a fost realizat
cu un obiect tios. Nu exist urme de vindecare, ceea ce plaseaz realizarea ei n jurul
momentului morii (perimortem).
Pe un frontal de subadult s-a identificat un fragment de material anorganic (fier,
piatr, ??) prins nc n os, provocnd o fractur prin nfundare (depressed fracture) (Fig. 11).
Endocranian se poate observa perforarea osului i achierea lui. Nu exist urme de
vindecare, prin urmare trauma a fost suferit perimortem.
Materialul osteologic prezint dovezi pentru existena stresului nutriional i

ocupaional n rndul grupului populaional studiat. Prezena artrozei severe pe corpurile
vertebrale (Fig. 9) indic un stres ocupaional, cauzat de activitile realizate de indivizi.
Cribra orbitalia, hiperostoza porotic i hipoplazia linear a enamelului dentar sunt patologii
provocate de deficiene nutritive suferite n timpul creterii i dezvoltrii. Prin urmare, sunt
indicatoare pentru tipul de alimentaie oferit copiilor. Cribra orbitalia i hiperostoza porotic
(Fig. 3 i Fig. 11)sunt rspunsuri osoase pentru anemia megaloblastic, cauzat de lipsa
vitaminei B12. Hipoplazia linear a enamelului dentar (Fig. 8) este reprezentat de leziuni pe
suprafaa smalului dentar; fiecare leziune este cauzat de o perioad de stres nutritiv
puternic.
n ceea ce privete traumele, acestea au fost identificate doar pe subaduli i indivizi
aduli de sex feminin. Poziionarea traumelor, pe craniu, poate sugera violen
interpersonal, de tipul violenei domestice.
Toate aceste date trebuie corelate cu analiza celorlalte schelete din ansamblul
osteologic de la Gheorgheni-Biserica Romano-Catolic. O interpretare populaional poate
oferi concluzii cu privire la stilul de via dus de indivizii ce compun acest grup populaional.
26
IMAGINI
Fig. 1. Craniul nr. 2 (sgeata indic trauma).
Fig. 2. Craniul nr. 1.
Fig. 3. Hiperostoza porotic.
27
Fig. 4. Craniul nr. 3 (vedere anterior lateral).
Fig. 5. Craniul nr. 3. Detaliu traume perimortem.
Fig. 6. Mandibula nr. 2.
Fig. 7. Mandibula nr. 46.
28
Fig. 8. Detaliu. Hipoplazia linear a enamelului dentar.
Fig. 9. Osteofite pe o vertebr toracic.
Fig. 10. Craniul. nr. 3. Artroza articulaiei temporo-mandibulare.
Fig. 11. Cribra orbitalia.
29
Fig. 12. Fragment anorganic pe frontalul unui subadult (vedere exocranian).
30
Anexa 6 - Extras Chestionar ereditate matern aplicat lotului modern
31
RAPORT STIINTIFIC
Programul: Parteneriate in domenii prioritare

Domeniul: 9: Cercetare socio-economica si umanista
Contract nr: 227/2012
Cod proiect: PCCA_1153/2011, proiect tip 1
Titlul proiectului: Genetic Evolution: New Evidences for the Study of Interconnected Structures. A
Biomolecular Journey around the Carpathians from Ancient to Medieval Times
Acronim proiect: GENESIS
Director de proiect: Acad. Prof. Dr. Octavian POPESCU

Semnatura:
Obiective si activitati
Etapa I: 2012, unica
Perioada: 01.10.2012-15.12.2012
Obiectiv: Documentare, teste si selectia probelor
Activitati: I.1. Documentare si schimburi stiintifice
I.2. Investigatii paleo-osteologice preliminare
I.3. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)
I.4. Procesarea inventarului material
I.5. Studii de arhiva
In aceasta prima faza a proiectului, echipa extinsa a acestuia a urmarit:

1. actualizarea informatiilor privind metodologia de lucru: tehnici de analiza, protocoale
de lucru, standardizarea si optimizarea acestora in laboratoarele de analiza antropologica,
laboaratoarele de bioarheologie molecular si laboratoarele de analize fizice complementare. In
cadrul acestui pachet de lucru sunt incluse activitatile I.1. I.4.
2. selectia probelor biologice si materiale pentru teste (in anul 2012) si analize (in anul
2013). In cadrul acestui pachet de lucru sunt incluse activitatile I.1., I.4. si I.5.
I.1. Documentare si schimburi stiintifice:
Deplasari si schimburi stiintifice:
In perioada 11-21 noiembrie 2012, cercetatorii Radu Bajenaru, Adrian Ionita, Alexandru Simon si
Vlad Zirra (echipa CO Academia Romana) s-au deplasat in Bulgaria pentru cercetari de teren la Sofia
(Academia Bulgara de Stiinte, Institutele de Arheologie si Antropologie) si la principalele santiere
arheologice de epoca medievala (secolele VII-XIII) coordonate de Academia Bulgara de Stiinte (la Preslav
si Plika). Deplasarea a avut ca scop dezvoltarea legaturilor existente cu colegii din Bulgaria si conturarea
unui orizont relevant de probe pentru analizele ADN (ADN-ul bulgar de Bulgaria urmand a fi comparat
si cu ADN-ul extras din osemintele identificate ca fiind bulgare, de secol VIII-IX, descoperite la Alba Iulia si
Aiud). Totodata, in cadrul deplasarii au fost explorate posibilitatile prelevarii de probe din osemintele de
epoca bronzului si epoca fierului (perioada La Tne), descoperite la linia Dunarii de Jos. In urma vizitei,
au fost identificati de comun acord cu colegii bulgari, un numar de 30 de indivizi medievali (secolele IX-
XII), pentru analiza ADN. Extragerea ADN-ului va avea loc in urmatoarea etapa a proiectului (2013), cu
implicarea echipei Partenerului 1 din proiectul Genesis (Universitatea Babe-Bolyai, Cluj-Napoca),
specializata pe aceste proceduri stiintifice.
In perioada 23 noiembrie-2 decembrie, cercetatorii Radu Bajenaru, Tudor Salagean si Vlad Zirra
(echipa CO Academia Romana) au efectuat o deplasare in Ungaria la Budapesta, Szeged si Pcs pentru
cercetari de teren si de arhiva (activitatea I.5.) la Arhiva Naionala Maghiara, la Institutul de Arheologie
al Academiei Ungare de Stiinte si la principalele santiere arheologice coordonate de catre acesta (cu
accent pe aria Kunsg-ului dintre Gyula si Szeged). Scopul deplasarii este identificarea surselor pentru
recoltare de material biologic in vederea compunerii unui lot extins (acoperind de preferinta prin
minimum 20 de probe distincte pentru fiecare epoca studiata epoca celtica, romana, huno-avara si
maghiara timpurie de pe teritoriul Ungariei de astazi) pentru posibile probe ADN. De asemenea, prin
aceasta deplasare se urmareste un schimb de bune practici cu colegii maghiari, care au inceput deja
analize de acest tip. In acest context, un rol important il va juca discutarea si eventuala cooperare in jurul
descoperirilor de la Alba Iulia (precum ar fi cea mai veche biserica de zid de rit grec de la nord de Dunare)
realizate de catre Daniela Marcu Istrate, membr a echipei proiectului Genesis (partener CO Academia
Romana).
Documentare bibliografica:
In cadrul acestei activitati a fost desfasurata o intensa activitate de interogare a bazelor de date
bibliografice internationale si identificarea ultimelor descoperiri metodologice de interes pentru
activitatile practice ale acestui proiect. In urma acestui efort, prezentam urmatoarea bibliografie
(selectiva) continand cele mai relevante articole stiintifice in domeniile abordate in cadrul proiectului:
paleodemografie (ADN vechi), antropologie biologica (atribuirea sexului, determinarea varstei la
momentul mortii, estimarea staturii, patologii si traumatisme), reconstructia dietei cu ajutorul izotopilor
stabili, tafonomie (procese de diageneza) etc.
1. Agarwal, S.C., Dumitriu, M., Tomlinson, G.A. and Grynpas, M.D. (2004), Medieval trabecular bone architecture: The
influence of age, sex, and lifestyle. Am. J. Phys. Anthropol., 124: 3344. doi: 10.1002/ajpa.10335
2. Alesan, A., Malgosa, A. and Sim, C. (1999), Looking into the demography of an Iron Age population in the Western
Mediterranean. I. Mortality. Am. J. Phys. Anthropol., 110: 285301. doi: 10.1002/(SICI)1096-
8644(199911)110:3<285::AID-AJPA3>3.0.CO;2-2
3. Alzualde, A., Izagirre, N., Alonso, S., Alonso, A., Albarrn, C., Azkarate, A. and de la Ra, C. (2006), Insights into the
isolation of the Basques: mtDNA lineages from the historical site of Aldaieta (6th7th centuries AD). Am. J. Phys.
Anthropol., 130: 394404. doi: 10.1002/ajpa.20375
4. Belcastro, M. G., Rastelli, E. and Mariotti, V. (2008), Variation of the degree of sacral vertebral body fusion in
adulthood in two European modern skeletal collections. Am. J. Phys. Anthropol., 135: 149160.
doi: 10.1002/ajpa.20716
5. Bernstein, R. M. (2010), The big and small of it: How body size evolves. Am. J. Phys. Anthropol., 143: 4662.
doi: 10.1002/ajpa.21440
6. Bierry, G., Le Minor, J.-M. and Schmittbuhl, M. (2010), Oval in males and triangular in females? A quantitative
evaluation of sexual dimorphism in the human obturator foramen. Am. J. Phys. Anthropol., 141: 626631.
doi: 10.1002/ajpa.21227
7. Black, T. K. (1978), A new method for assessing the sex of fragmentary skeletal remains: Femoral shaft circumference.
Am. J. Phys. Anthropol., 48: 227231. doi: 10.1002/ajpa.1330480217
8. Black, T. K. (1978), A new method for assessing the sex of fragmentary skeletal remains: Femoral shaft circumference.
9. Bolnick, D. A., Bonine, H. M., Mata-Mguez, J., Kemp, B. M., Snow, M. H. and LeBlanc, S. A. (2012), Nondestructive
sampling of human skeletal remains yields ancient nuclear and mitochondrial DNA. Am. J. Phys. Anthropol., 147: 293
300. doi: 10.1002/ajpa.21647
10. Bonneau, N., Bouhallier, J., Simonis, C., Baylac, M., Gagey, O. and Tardieu, C. (2012), Technical note: Shape variability
induced by reassembly of human pelvic bones. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 139147. doi: 10.1002/ajpa.22040
11. Bouwman, A. S., Chilvers, E. R., Brown, K. A. and Brown, T. A. (2006), Brief communication: Identification of the
authentic ancient DNA sequence in a human bone contaminated with modern DNA. Am. J. Phys. Anthropol.,
131: 428431. doi: 10.1002/ajpa.20411
12. Bruzek, J. (2002), A method for visual determination of sex, using the human hip bone. Am. J. Phys. Anthropol.,
117: 157168. doi: 10.1002/ajpa.10012
13. Buzon, M. R. and Judd, M. A. (2008), Investigating health at Kerma: Sacrificial versus nonsacrificial individuals. Am. J.
Phys. Anthropol., 136: 9399. doi: 10.1002/ajpa.20781
14. Calce, S. E. (2012), A new method to estimate adult age-at-death using the acetabulum. Am. J. Phys. Anthropol.,
148: 1123. doi: 10.1002/ajpa.22026
15. Coquerelle, M., Bookstein, F. L., Braga, J., Halazonetis, D. J., Weber, G. W. and Mitteroecker, P. (2011), Sexual
dimorphism of the human mandible and its association with dental development. Am. J. Phys. Anthropol., 145: 192
202. doi: 10.1002/ajpa.21485
16. Cowal, L. S. and Pastor, R. F. (2008), Dimensional variation in the proximal ulna: Evaluation of a metric method for sex
assessment. Am. J. Phys. Anthropol., 135: 469478. doi: 10.1002/ajpa.20771
17. Craig, O. E., Biazzo, M., O'Connell, T. C., Garnsey, P., Martinez-Labarga, C., Lelli, R., Salvadei, L., Tartaglia, G., Nava, A.,
Ren, L., Fiammenghi, A., Rickards, O. and Bondioli, L. (2009), Stable isotopic evidence for diet at the Imperial Roman
coastal site of Velia (1st and 2nd Centuries AD) in Southern Italy. Am. J. Phys. Anthropol., 139: 572583.
doi: 10.1002/ajpa.21021
18. Cucina, A. and Tiesler, V. (2003), Dental caries and antemortem tooth loss in the Northern Peten area, Mexico: A
biocultural perspective on social status differences among the Classic Maya. Am. J. Phys. Anthropol., 122: 110.
doi: 10.1002/ajpa.10267
19. De Mendona, M.C. (2000), Estimation of height from the length of long bones in a Portuguese adult population. Am.
J. Phys. Anthropol., 112: 3948. doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(200005)112:1<39::AID-AJPA5>3.0.CO;2-#
20. Deguilloux, M.-F., Soler, L., Pemonge, M.-H., Scarre, C., Joussaume, R. and Laporte, L. (2011), News from the west:
Ancient DNA from a French megalithic burial chamber. Am. J. Phys. Anthropol., 144: 108118.
doi: 10.1002/ajpa.21376
21. DeWitte, S. N. (2009), The effect of sex on risk of mortality during the Black Death in London, A.D. 13491350. Am. J.
22. DeWitte, S. N. (2009), The effect of sex on risk of mortality during the Black Death in London, A.D. 13491350. Am. J.
23. DeWitte, S. N. (2010), Sex differentials in frailty in medieval England. Am. J. Phys. Anthropol., 143: 285297.
doi: 10.1002/ajpa.21316
24. DeWitte, S. N. (2012), Sex differences in periodontal disease in catastrophic and attritional assemblages from
medieval london. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 405416. doi: 10.1002/ajpa.22138
25. DeWitte, S. N. (2012), Sex differences in periodontal disease in catastrophic and attritional assemblages from
medieval london. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 405416. doi: 10.1002/ajpa.22138
26. Disotell, T. R. (2012), Archaic human genomics. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 2439. doi: 10.1002/ajpa.22159
27. Drusini, A. G., Toso, O. and Ranzato, C. (1997), The coronal pulp cavity index: A biomarker for age determination in
human adults. Am. J. Phys. Anthropol., 103: 353363. doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(199707)103:3<353::AID-
AJPA5>3.0.CO;2-R
28. Eshed, V., Gopher, A., Gage, T. B. and Hershkovitz, I. (2004), Has the transition to agriculture reshaped the
demographic structure of prehistoric populations? New evidence from the Levant. Am. J. Phys. Anthropol., 124: 315
329. doi: 10.1002/ajpa.10332
29. Falys, C. G., Schutkowski, H. and Weston, D. A. (2006), Auricular surface aging: Worse than expected? A test of the
revised method on a documented historic skeletal assemblage. Am. J. Phys. Anthropol., 130: 508513.
doi: 10.1002/ajpa.20382
30. Flander, L. B. (1978), Univariate and multivariate methods for sexing the sacrum. Am. J. Phys. Anthropol., 49: 103
110. doi: 10.1002/ajpa.1330490116
31. France, D. L. (1988), Osteometry at muscle origin and insertion in sex determination. Am. J. Phys. Anthropol., 76: 515
526. doi: 10.1002/ajpa.1330760411
32. Gamba, C., Fernndez, E., Tirado, M., Pastor, F. and Arroyo-Pardo, E. (2011), Brief communication: Ancient nuclear
DNA and kinship analysis: The case of a medieval burial in San Esteban Church in Cuellar (Segovia, Central Spain). Am.
J. Phys. Anthropol., 144: 485491. doi: 10.1002/ajpa.21451
33. Gapert, R., Black, S. and Last, J. (2009), Sex determination from the occipital condyle: Discriminant function analysis in
an Eighteenth and Nineteenth Century British sample. Am. J. Phys. Anthropol., 138: 384394.
doi: 10.1002/ajpa.20946
34. Garvin, H. M. and Ruff, C. B. (2012), Sexual dimorphism in skeletal browridge and chin morphologies determined using
a new quantitative method. Am. J. Phys. Anthropol., 147: 661670. doi: 10.1002/ajpa.22036
35. Geber, J. and Murphy, E. (2012), Scurvy in the Great Irish Famine: Evidence of vitamin C deficiency from a mid-19th
century skeletal population. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 512524. doi: 10.1002/ajpa.22066
36. Gibbon, V. E., Penny, C. B., trkalj, G. and Ruff, P. (2009), Brief communication: Minimally invasive bone sampling
method for DNA analysis. Am. J. Phys. Anthropol., 139: 596599. doi: 10.1002/ajpa.21048
37. Gilmore, C. C. and Grote, M. N. (2012), Estimating age from adult occlusal wear: A modification of the miles method.
38. Haas, C. J., Zink, A., Molar, E., Szeimies, U., Reischl, U., Marcsik, A., Ardagna, Y., Dutour, O., Plfi, G. and Nerlich, A. G.
(2000), Molecular evidence for different stages of tuberculosis in ancient bone samples from Hungary. Am. J. Phys.
Anthropol., 113: 293304. doi: 10.1002/1096-8644(200011)113:3<293::AID-AJPA2>3.0.CO;2-6
39. Harris, E. F. and Lease, L. R. (2005), Mesiodistal tooth crown dimensions of the primary dentition: A worldwide survey.
40. Harris, E. F., Hicks, J. D. and Barcroft, B. D. (2001), Tissue contributions to sex and race: Differences in tooth crown size
of deciduous molars. Am. J. Phys. Anthropol., 115: 223237. doi: 10.1002/ajpa.1077
41. Hassett, B. (2011), Technical note: Estimating sex using cervical canine odontometrics: A test using a known sex
sample. Am. J. Phys. Anthropol., 146: 486489. doi: 10.1002/ajpa.21584
42. Holman, D. J. and Bennett, K. A. (1991), Determination of sex from arm bone measurements. Am. J. Phys. Anthropol.,
84: 421426. doi: 10.1002/ajpa.1330840406
43. Jacobs, K. (1994), Human dento-gnathic metric variation in mesolithic/neolithic Ukraine: Possible evidence of demic
diffusion in the Dnieper Rapids region. Am. J. Phys. Anthropol., 95: 126. doi: 10.1002/ajpa.1330950102
44. Jaouen, K., Balter, V., Herrscher, E., Lamboux, A., Telouk, P. and Albarde, F. (2012), Fe and Cu stable isotopes in
archeological human bones and their relationship to sex. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 334340.
doi: 10.1002/ajpa.22053
45. Jurmain, R., Bartelink, E. J., Leventhal, A., Bellifemine, V., Nechayev, I., Atwood, M. and DiGiuseppe, D. (2009),
Paleoepidemiological patterns of interpersonal aggression in a prehistoric central California population from CA-ALA-
329. Am. J. Phys. Anthropol., 139: 462473. doi: 10.1002/ajpa.21002
46. Kaestle, F. A. and Horsburgh, K. A. (2002), Ancient DNA in anthropology: Methods, applications, and ethics. Am. J.
47. Kaestle, F. A. and Smith, D. G. (2001), Ancient mitochondrial DNA evidence for prehistoric population movement: The
numic expansion. Am. J. Phys. Anthropol., 115: 112. doi: 10.1002/ajpa.1051
48. Kerley, E. R. (1965), The microscopic determination of age in human bone. Am. J. Phys. Anthropol., 23: 149163.
doi: 10.1002/ajpa.1330230215
49. Kim, K., Kim, K.-Y., Jeon, E., Togloom, A., Cho, Y.-O., Lee, M.-S., Lkhagvasuren, G., Choi, J.-H., Tumen, D., Ja Park, A.,
Kim, K.-C., Park, K.-W., Kim, J.-H., Noh, M., Yoo, K.-J. and Lee, K.-H. (2008), Technical note: Improved ancient DNA
purification for PCR using ion-exchange columns. Am. J. Phys. Anthropol., 136: 114121. doi: 10.1002/ajpa.20782
50. Kindschuh, S. C., Dupras, T. L. and Cowgill, L. W. (2010), Determination of sex from the hyoid bone. Am. J. Phys.
51. Klales, A. R., Ousley, S. D. and Vollner, J. M. (2012), A revised method of sexing the human innominate using Phenice's
nonmetric traits and statistical methods. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 104114. doi: 10.1002/ajpa.22102
52. Kolman, C. J. and Tuross, N. (2000), Ancient DNA analysis of human populations. Am. J. Phys. Anthropol., 111: 523.
doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(200001)111:1<5::AID-AJPA2>3.0.CO;2-3
53. Konigsberg, L. W. and Hens, S. M. (1998), Use of ordinal categorical variables in skeletal assessment of sex from the
cranium. Am. J. Phys. Anthropol., 107: 97112. doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(199809)107:1<97::AID-AJPA8>3.0.CO;2-
A
54. Kuch, M., Grcke, D. R., Knyf, M. C., Gilbert, M. T. P., Younghusband, B., Young, T., Marshall, I., Willerslev, E.,
Stoneking, M. and Poinar, H. (2007), A preliminary analysis of the DNA and diet of the extinct Beothuk: A systematic
approach to ancient human DNA. Am. J. Phys. Anthropol., 132: 594604. doi: 10.1002/ajpa.20536
55. Lee, E. J., Makarewicz, C., Renneberg, R., Harder, M., Krause-Kyora, B., Mller, S., Ostritz, S., Fehren-Schmitz, L.,
Schreiber, S., Mller, J., von Wurmb-Schwark, N. and Nebel, A. (2012), Emerging genetic patterns of the european
neolithic: Perspectives from a late neolithic bell beaker burial site in Germany. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 571579.
doi: 10.1002/ajpa.22074
56. Lertrit, P., Poolsuwan, S., Thosarat, R., Sanpachudayan, T., Boonyarit, H., Chinpaisal, C. and Suktitipat, B. (2008),
Genetic history of Southeast Asian populations as revealed by ancient and modern human mitochondrial DNA
analysis. Am. J. Phys. Anthropol., 137: 425440. doi: 10.1002/ajpa.20884
57. Lieverse, A. R., Weber, A. W., Bazaliiskiy, V. I., Goriunova, O. I. and Savel'ev, N. A. (2007), Osteoarthritis in Siberia's Cis-
Baikal: Skeletal indicators of hunter-gatherer adaptation and cultural change. Am. J. Phys. Anthropol., 132: 116.
doi: 10.1002/ajpa.20479
58. Loth, S. R. and Henneberg, M. (2001), Sexually dimorphic mandibular morphology in the first few years of life. Am. J.
59. Lovejoy, C. O., Meindl, R. S., Mensforth, R. P. and Barton, T. J. (1985), Multifactorial determination of skeletal age at
death: A method and blind tests of its accuracy. Am. J. Phys. Anthropol., 68: 114. doi: 10.1002/ajpa.1330680102
60. Maggiano, I. S., Schultz, M., Kierdorf, H., Sosa, T. S., Maggiano, C. M. and Tiesler Blos, V. (2008), Cross-sectional
analysis of long bones, occupational activities and long-distance trade of the Classic Maya from Xcamb
Archaeological and osteological evidence. Am. J. Phys. Anthropol., 136: 470477. doi: 10.1002/ajpa.20830
61. Mays, S. (2012), An investigation of age-related changes at the acetabulum in 18th19th century ad adult skeletons
from Christ Church Spitalfields, London. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 485492. doi: 10.1002/ajpa.22146
62. McCormick, W. F., Stewart, J. H. and Langford, L. A. (1985), Sex determination from chest plate roentgenograms. Am.
63. McIntyre, M. H., Cohn, B. A. and Ellison, P. T. (2006), Sex dimorphism in digital formulae of children. Am. J. Phys.
64. Meindl, R. S. and Lovejoy, C. O. (1985), Ectocranial suture closure: A revised method for the determination of skeletal
age at death based on the lateral-anterior sutures. Am. J. Phys. Anthropol., 68: 5766. doi: 10.1002/ajpa.1330680106
65. Meindl, R. S., Lovejoy, C. O., Mensforth, R. P. and Carlos, L. D. (1985), Accuracy and direction of error in the sexing of
the skeleton: Implications for paleodemography. Am. J. Phys. Anthropol., 68: 7985. doi: 10.1002/ajpa.1330680108
66. Meindl, R. S., Lovejoy, C. O., Mensforth, R. P. and Walker, R. A. (1985), A revised method of age determination using
the os pubis, with a review and tests of accuracy of other current methods of pubic symphyseal aging. Am. J. Phys.
67. Melchior, L., Gilbert, M.T.P., Kivisild, T., Lynnerup, N. and Dissing, J. (2008), Rare mtDNA haplogroups and genetic
differences in rich and poor Danish Iron-Age villages. Am. J. Phys. Anthropol., 135: 206215. doi: 10.1002/ajpa.20721
68. Mensforth, R. P. (1990), Paleodemography of the Carlston Annis (Bt-5) Late Archaic skeletal population. Am. J. Phys.
69. Molnar, P. (2008), Dental wear and oral pathology: Possible evidence and consequences of habitual use of teeth in a
Swedish Neolithic sample. Am. J. Phys. Anthropol., 136: 423431. doi: 10.1002/ajpa.20824
70. Mulhern, D. M. and Jones, E. B. (2005), Test of revised method of age estimation from the auricular surface of the
ilium. Am. J. Phys. Anthropol., 126: 6165. doi: 10.1002/ajpa.10410
71. Mutolo, M. J., Jenny, L. L., Buszek, A. R., Fenton, T. W. and Foran, D. R. (2012), Osteological and molecular
identification of brucellosis in ancient Butrint, Albania. Am. J. Phys. Anthropol., 147: 254263.
doi: 10.1002/ajpa.21643
72. Nagaoka, T. and Hirata, K. (2007), Reconstruction of paleodemographic characteristics from skeletal age at death
distributions: Perspectives from Hitotsubashi, Japan. Am. J. Phys. Anthropol., 134: 301311. doi: 10.1002/ajpa.20670
73. Nagy, D., Tmry, G., Csnyi, B., Bogcsi-Szab, E., Czibula, ., Priskin, K., Bede, O., Bartosiewicz, L., Downes, C. S. and
Rask, I. (2011), Comparison of lactase persistence polymorphism in ancient and present-day Hungarian populations.
74. Nicklisch, N., Maixner, F., Ganslmeier, R., Friederich, S., Dresely, V., Meller, H., Zink, A. and Alt, K. W. (2012), Rib
lesions in skeletons from early neolithic sites in Central Germany: On the trail of tuberculosis at the onset of
agriculture. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 391404. doi: 10.1002/ajpa.22137
75. Nicklisch, N., Maixner, F., Ganslmeier, R., Friederich, S., Dresely, V., Meller, H., Zink, A. and Alt, K. W. (2012), Rib
lesions in skeletons from early neolithic sites in Central Germany: On the trail of tuberculosis at the onset of
agriculture. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 391404. doi: 10.1002/ajpa.22137
76. Norn, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A. and Graw, M. (2005), Lateral angle: A method for sexing using the petrous
bone. Am. J. Phys. Anthropol., 128: 318323. doi: 10.1002/ajpa.20245
77. Novak, M. and laus, M. (2011), Vertebral pathologies in two early modern period (16th19th century) populations
from Croatia. Am. J. Phys. Anthropol., 145: 270281. doi: 10.1002/ajpa.21491
78. Oelze, V. M., Koch, J. K., Kupke, K., Nehlich, O., Zuner, S., Wahl, J., Weise, S. M., Rieckhoff, S. and Richards, M. P.
(2012), Multi-isotopic analysis reveals individual mobility and diet at the early iron age monumental tumulus of
magdalenenberg, germany. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 406421. doi: 10.1002/ajpa.22063
79. Oettl, A. C., Becker, P. J., de Villiers, E. and Steyn, M. (2009), The influence of age, sex, population group, and
dentition on the mandibular angle as measured on a South African sample. Am. J. Phys. Anthropol., 139: 505511.
doi: 10.1002/ajpa.21009
80. Owers, S. K. and Pastor, R. F. (2005), Analysis of quantitative methods for rib seriation using the Spitalfields
documented skeletal collection. Am. J. Phys. Anthropol., 127: 210218. doi: 10.1002/ajpa.20038
81. Pechenkina, E. A., Benfer, R. A. and Zhijun, W. (2002), Diet and health changes at the end of the Chinese neolithic: The
Yangshao/Longshan transition in Shaanxi province. Am. J. Phys. Anthropol., 117: 1536. doi: 10.1002/ajpa.10014
82. Plomp, K. A., Roberts, C. A. and Viarsdttir, U. S. (2012), Vertebral morphology influences the development of
Schmorl's nodes in the lower thoracic vertebrae. Am. J. Phys. Anthropol., 149: 572582. doi: 10.1002/ajpa.22168
83. Pretorius, E., Steyn, M. and Scholtz, Y. (2006), Investigation into the usability of geometric morphometric analysis in
assessment of sexual dimorphism. Am. J. Phys. Anthropol., 129: 6470. doi: 10.1002/ajpa.20251
84. Prowse, T. L., Schwarcz, H. P., Garnsey, P., Knyf, M., Macchiarelli, R. and Bondioli, L. (2007), Isotopic evidence for age-related
immigration to imperial Rome. Am. J. Phys. Anthropol., 132: 510519. doi: 10.1002/ajpa.20541
85. Redfern, R. C. and DeWitte, S. N. (2011), A new approach to the study of Romanization in Britain: A regional
perspective of cultural change in late Iron Age and Roman Dorset using the Siler and GompertzMakeham models of
mortality. Am. J. Phys. Anthropol., 144: 269285. doi: 10.1002/ajpa.21400
86. Redfern, R. C. and DeWitte, S. N. (2011), Status and health in Roman Dorset: The effect of status on risk of mortality in
post-conquest populations. Am. J. Phys. Anthropol., 146: 197208. doi: 10.1002/ajpa.21563
87. Reitsema, L. J. and Vercellotti, G. (2012), Stable isotope evidence for sex- and status-based variations in diet and life
history at medieval Trino Vercellese, Italy. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 589600. doi: 10.1002/ajpa.22085
88. Ricaut, F.-X., Keyser-Tracqui, C., Cammaert, L., Crubzy, E. and Ludes, B. (2004), Genetic analysis and ethnic affinities
from two Scytho-Siberian skeletons. Am. J. Phys. Anthropol., 123: 351360. doi: 10.1002/ajpa.10323
89. Rogan, P. K. and Salvo, J. J. (1990), Study of nucleic acids isolated from ancient remains. Am. J. Phys. Anthropol.,
33: 195214. doi: 10.1002/ajpa.1330330509
90. Rogers, T. L. (2009), Sex determination of adolescent skeletons using the distal humerus. Am. J. Phys. Anthropol.,
140: 143148. doi: 10.1002/ajpa.21060
91. Ruff, C. B., Holt, B. M., Niskanen, M., Sladk, V., Berner, M., Garofalo, E., Garvin, H. M., Hora, M., Maijanen, H.,
Niinimki, S., Salo, K., Schuplerov, E. and Tompkins, D. (2012), Stature and body mass estimation from skeletal
remains in the European Holocene. Am. J. Phys. Anthropol., 148: 601617. doi: 10.1002/ajpa.22087
92. Safont, S., Malgosa, A. and Subir, M. E. (2000), Sex assessment on the basis of long bone circumference. Am. J. Phys.
Anthropol., 113: 317328. doi: 10.1002/1096-8644(200011)113:3<317::AID-AJPA4>3.0.CO;2-J
93. Saunders, S., DeVito, C., Herring, A., Southern, R. and Hoppa, R. (1993), Accuracy tests of tooth formation age
estimations for human skeletal remains. Am. J. Phys. Anthropol., 92: 173188. doi: 10.1002/ajpa.1330920207
94. Scheuer, L. (2002), A blind test of mandibular morphology for sexing mandibles in the first few years of life. Am. J.
95. Schmidt, D., Hummel, S. and Herrmann, B. (2003), Brief communication: Multiplex X/Y-PCR improves sex
identification in aDNA analysis. Am. J. Phys. Anthropol., 121: 337341. doi: 10.1002/ajpa.10172
96. Schwartz, G. T. and Dean, M. C. (2005), Sexual dimorphism in modern human permanent teeth. Am. J. Phys.
97. Shin, D. H., Oh, C. S., Kim, Y.-S. and Hwang, Y.-i. (2012), Ancient-to-modern secular changes in Korean stature. Am. J.
98. Simn, M., Jordana, X., Armentano, N., Santos, C., Daz, N., Solrzano, E., Lpez, J. B., Gonzlez-Ruiz, M. and Malgosa,
A. (2011), The presence of nuclear families in prehistoric collective burials revisited: The bronze age burial of
montanissell cave (Spain) in the light of aDNA. Am. J. Phys. Anthropol., 146: 406413. doi: 10.1002/ajpa.21590
99. Sldek, V., Berner, M., Sosna, D. and Sailer, R. (2007), Human manipulative behavior in the Central European Late
Eneolithic and Early Bronze Age: Humeral bilateral asymmetry. Am. J. Phys. Anthropol., 133: 669681.
doi: 10.1002/ajpa.20551
100. laus, M. (2000), Biocultural analysis of sex differences in mortality profiles and stress levels in the late medieval
population from Nova Raa, Croatia. Am. J. Phys. Anthropol., 111: 193209. doi: 10.1002/(SICI)1096-
8644(200002)111:2<193::AID-AJPA6>3.0.CO;2-0
101. laus, M. (2008), Osteological and dental markers of health in the transition from the Late Antique to the Early
Medieval period in Croatia. Am. J. Phys. Anthropol., 136: 455469. doi: 10.1002/ajpa.20829
102. laus, M., Novak, M., Bedi, . and Strinovi, D. (2012), Bone fractures as indicators of intentional violence in the
eastern adriatic from the antique to the late medieval period (2nd16th century AD). Am. J. Phys. Anthropol.,
149: 2638. doi: 10.1002/ajpa.22083
103. Sparacello, V. and Marchi, D. (2008), Mobility and subsistence economy: A diachronic comparison between two
groups settled in the same geographical area (Liguria, Italy). Am. J. Phys. Anthropol., 136: 485495.
doi: 10.1002/ajpa.20832
104. Sparacello, V.S., Pearson, O.M., Coppa, A. and Marchi, D. (2011), Changes in skeletal robusticity in an iron age
agropastoral group: The samnites from the Alfedena necropolis (Abruzzo, Central Italy). Am. J. Phys. Anthropol.,
144: 119130. doi: 10.1002/ajpa.21377
105. Sterling, R., Miranda, J. J., Gilman, R. H., Cabrera, L., Sterling, C. R., Bern, C. and Checkley, W. (2012), Early
anthropometric indices predict short stature and overweight status in a cohort of peruvians in early adolescence. Am.
106. Stevenson, J. C., Mahoney, E. R., Walker, P. L. and Everson, P. M. (2009), Technical note: Prediction of sex based on
five skull traits using decision analysis (CHAID). Am. J. Phys. Anthropol., 139: 434441. doi: 10.1002/ajpa.21042
107. Stojanowski, C. M. and Schillaci, M. A. (2006), Phenotypic approaches for understanding patterns of intracemetery
biological variation. Am. J. Phys. Anthropol., 131: 4988. doi: 10.1002/ajpa.20517
108. Stojanowski, C. M., Seidemann, R. M. and Doran, G. H. (2002), Differential skeletal preservation at Windover Pond:
Causes and consequences. Am. J. Phys. Anthropol., 119: 1526. doi: 10.1002/ajpa.10101
109. Stone, A. C., Milner, G. R., Pbo, S. and Stoneking, M. (1996), Sex determination of ancient human skeletons using
DNA. Am. J. Phys. Anthropol., 99: 231238. doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(199602)99:2<231::AID-AJPA1>3.0.CO;2-1
110. Stone, A. C., Milner, G. R., Pbo, S. and Stoneking, M. (1996), Sex determination of ancient human skeletons using
DNA. Am. J. Phys. Anthropol., 99: 231238. doi: 10.1002/(SICI)1096-8644(199602)99:2<231::AID-AJPA1>3.0.CO;2-1
111. Sullivan, A. (2004), Reconstructing relationships among mortality, status, and gender at the Medieval Gilbertine Priory
of St. Andrew, Fishergate, York. Am. J. Phys. Anthropol., 124: 330345. doi: 10.1002/ajpa.10271
112. Sullivan, A. (2005), Prevalence and etiology of acquired anemia in Medieval York, England. Am. J. Phys. Anthropol.,
128: 252272. doi: 10.1002/ajpa.20026
113. Sulzmann, C.E., Buckberry, J.L. and Pastor, R.F. (2008), The utility of carpals for sex assessment: A preliminary study.
114. Tague, R. G. (1994), Maternal mortality or prolonged growth: Age at death and pelvic size in three prehistoric
Amerindian populations. Am. J. Phys. Anthropol., 95: 2740. doi: 10.1002/ajpa.1330950103
115. Tague, R. G. (2000), Do big females have big pelves?. Am. J. Phys. Anthropol., 112: 377393. doi: 10.1002/1096-
8644(200007)112:3<377::AID-AJPA8>3.0.CO;2-O
116. Tague, R. G. (2007), Costal process of the first sacral vertebra: Sexual dimorphism and obstetrical adaptation. Am. J.
117. Templeton, A. R. (2005), Haplotype Trees and Modern Human Origins. Am. J. Phys. Anthropol., 128: 3359.
doi: 10.1002/ajpa.20351
118. Thayer, Z. M. and Dobson, S. D. (2010), Sexual dimorphism in chin shape: Implications for adaptive hypotheses. Am. J.
119. Tmry, G., Csnyi, B., Bogcsi-Szab, E., Kalmr, T., Czibula, ., Cssz, A., Priskin, K., Mende, B., Lang, P., Downes, C.
S. and Rask, I. (2007), Comparison of maternal lineage and biogeographic analyses of ancient and modern Hungarian
populations. Am. J. Phys. Anthropol., 134: 354368. doi: 10.1002/ajpa.20677
120. Velasco-Vzquez, J., Gonzlez-Reimers, E., Arnay-De-La-Rosa, M., Barros-Lpez, N., Martn-Rodrguez, E. and
Santolaria-Fernndez, F. (1999), Bone histology of prehistoric inhabitants of the Canary Islands: Comparison between
El Hierro and Gran Canaria. Am. J. Phys. Anthropol., 110: 201213. doi: 10.1002/(SICI)1096-
8644(199910)110:2<201::AID-AJPA6>3.0.CO;2-N
121. Veroni, A., Nikitovic, D. and Schillaci, M. A. (2010), Brief communication: Sexual dimorphism of the juvenile
basicranium. Am. J. Phys. Anthropol., 141: 147151. doi: 10.1002/ajpa.21156
122. Viciano, J., Alemn, I., D'Anastasio, R., Capasso, L. and Botella, M. C. (2011), Odontometric sex discrimination in the
herculaneum sample (79 AD, Naples, Italy), with application to juveniles. Am. J. Phys. Anthropol., 145: 97106.
doi: 10.1002/ajpa.21471
123. Vlak, D., Roksandic, M. and Schillaci, M. A. (2008), Greater sciatic notch as a sex indicator in juveniles. Am. J. Phys.
124. Walker, P. L. (2005), Greater sciatic notch morphology: Sex, age, and population differences. Am. J. Phys. Anthropol.,
127: 385391. doi: 10.1002/ajpa.10422
125. Walker, P. L. (2008), Sexing skulls using discriminant function analysis of visually assessed traits. Am. J. Phys.
126. Walker, R. A. and Lovejoy, C. O. (1985), Radiographic changes in the clavicle and proximal femur and their use in the
determination of skeletal age at death. Am. J. Phys. Anthropol., 68: 6778. doi: 10.1002/ajpa.1330680107
127. Walrath, D. E., Turner, P. and Bruzek, J. (2004), Reliability test of the visual assessment of cranial traits for sex
determination. Am. J. Phys. Anthropol., 125: 132137. doi: 10.1002/ajpa.10373
128. Waters-Rist, A., Bazaliiskii, V. I., Weber, A., Goriunova, O. I. and Katzenberg, M. A. (2010), Activity-induced dental
modification in holocene siberian hunter-fisher-gatherers. Am. J. Phys. Anthropol., 143: 266278.
doi: 10.1002/ajpa.21313
129. Weiss, E. (2003), Understanding muscle markers: Aggregation and construct validity. Am. J. Phys. Anthropol.,
121: 230240. doi: 10.1002/ajpa.10226
130. Weiss, K. M. (1972), On the systematic bias in skeletal sexing. Am. J. Phys. Anthropol., 37: 239249.
doi: 10.1002/ajpa.1330370208
131. Wiechmann, I. and Grupe, G. (2005), Detection of Yersinia pestis DNA in two early medieval skeletal finds from
Aschheim (Upper Bavaria, 6th century A.D.). Am. J. Phys. Anthropol., 126: 4855. doi: 10.1002/ajpa.10276
132. Williams, S. R., Chagnon, N. A. and Spielman, R. S. (2002), Nuclear and mitochondrial genetic variation in the
Yanomam: A test case for ancient DNA studies of prehistoric populations. Am. J. Phys. Anthropol., 117: 246259.
doi: 10.1002/ajpa.10035
133. Wittwer-Backofen, U., Buckberry, J., Czarnetzki, A., Doppler, S., Grupe, G., Hotz, G., Kemkes, A., Larsen, C. S., Prince,
D., Wahl, J., Fabig, A. and Weise, S. (2008), Basics in paleodemography: A comparison of age indicators applied to the
early medieval skeletal sample of Lauchheim. Am. J. Phys. Anthropol., 137: 384396. doi: 10.1002/ajpa.20881
134. Wittwer-Backofen, U., Gampe, J. and Vaupel, J. W. (2004), Tooth cementum annulation for age estimation: Results
from a large known-age validation study. Am. J. Phys. Anthropol., 123: 119129. doi: 10.1002/ajpa.10303
135. Zink, A. R., Grabner, W. and Nerlich, A. G. (2005), Molecular identification of human tuberculosis in recent and historic
bone tissue samples: The role of molecular techniques for the study of historic tuberculosis. Am. J. Phys. Anthropol.,
126: 3247. doi: 10.1002/ajpa.10409
Imbunatatirea continua a tehnicilor de analiza transforma rapid bioarheologia. Un volum

impresionant de noi informatii este publicat in fiecare an, in toate subdomeniile acestei stiinte. Acest
aspect induce nevoia unei constante monitorizari a ultimelor publicatii aparute in revistele de
specialitate, de aici, si nevoia unui obiectiv dedicat documentarii continue.
I.2. Investigatii paleo-osteologice preliminare,
I.3. Analize complementare (SEM, spectroscopie etc.)
si I.4. Procesarea inventarului material
Anticipand analizele propriu-zise ale loturilor de studiu propuse in cadrul acestui proiect, in
aceasta prima faza au fost investigate resturi umane arheologice din cateva regiuni si din diverse
perioade istorice, in vederea standardizarii si optimizarii protocoalelor de lucru (atat intra cat si intre
laboratoare), a identificarii celor mai adecvate tehnici de analiza in vederea caracterizarii diferitelor
tipuri de resturi bioarheologice si anticiparii potentialelor probleme de natura metodologica ce pot
aparea pe parcursul studiului.
Loturile experimentale implicate in aceasta etapa sunt:

1. Necropola I BC I AC din Hunedoara, Gradina Castelului Platou
Este vorba despre o necropola birituala cu indivizi incinerati (adulti) si inhumati (copii si adulti)
reunind aproximativ 40 de subiecti cu varste cuprinse intre nou-nascuti si adulti de varsta mijlocie, acest
sit a permis testarea metodelor fizice complementare in vederea caracterizarii procesului de incinerare
in contextul in care izvoarele istorice nu transmit nici un fel de detalii despre acesta (tipul de rug,
temperaturile de ardere etc.).
Analize ca XRD (X-Ray Diffraction), FT-IR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) si SEM
(Scanning Electron Microscopy) permit evaluarea temperaturii si duratei procesului de incinerare (XRD),
gradul de supravietuire a materiei organice in resturile incinerate (FT-IR), observarea modificarilor
structurale suferite de resturile osoase in timpul procesului de ardere (SEM modificarea observata la
nivelul suprafetelor; FT-IR modificari observate la nivel molecular). In plus, teste de incinerare
efectuate pe oase de porc ofera posibilitatea compararii rezultatelor obtinute prin metodele de analiza
enumerate mai sus, pentru diferite intervale de temperatura, ajutand la extrapolari privind incinerarile
resturilor umane. Prin aceste metode, vom incerca de asemenea sa decelam modificarile de structura
ale oaselor induse de crematie si cele induse de diageneza osului dupa depozitare in sol, apoi stocarea in
depozite arheologice. Estimarea gradului de supravietuire a materiei organize in oasele de analizat, va
contribui la selectia probelor pentru analize ulterioare mai costisitoare cum sunt analizele de ADN si de
izotopi stabili.
Tot in cazul acestei necropole, dominate de resturi osoase apartinand unor copii de varste mici,
s-a testat importanta utilizarii radiografiilor dentare in vederea stabilirii cat mai precise a varstei la
momentul decesului, precum si utilizarea lor in vederea sporirii gradului de siguranta la atribuirea
sexului (proces cunoscut ca fiind dificil in cazul copiilor).
2. Resturi umane arheologice provenite de sub pavimentul Bisericii Ortodoxe din Feleac, Cluj
Acest lot experimental contine exclusiv resturi umane inhumate din intervalul sec 13 secol 18.
Si in acest grup au fost descoperite resturi de copii si adolescenti ceea ce a contribuit la standardizarea
metodelor de inregistrare a datelor de antropologie fizica pentru aceste clase de varsta. Au fost
selectate cele mai relevante caractere non-metrice ce trebuiesc urmarite pentru stabilirea sexului si
varstei la momentul mortii, iar pentru caracterele metrice au fost alcatuite tabele unice ce vor fi utilizate
pe parcursul studiului, atat pentru copii, cat si pentru adulti.
Starea proasta de conservare a resturilor umane din acest sit a reprezentat o provocare pentru
investigatiile prin metode de antropologie fizica, dar prin teste fizice complementare (FT-IR, XRD,
RAMAN) permit caracterizarea proceselor de diageneza in conditii de mediu diferite (comparatii cu
celelalte loturi).
14
Din cadrul acestui lot experimental au fost datate cu C 5 probe, ce vor fi descrise in
continuarea acestui raport. Concomitent cu datarea cu radiocarbon au fost efectuate si masuratori
pentru izotopii stabili de C si N in vederea reconstructiilor dietare pentru indivizii analizati. Rezultatele
preliminare sunt incurajatoare. Datarile rafineaza concluziile privind perioadele in care pavimentul
lacasului mai sus amintit a fost folosit pentru inhumari, iar datele furnizate de analiza izotopilor stabili
sugereaza atat distinctia dintre dieta copiilor si adultilor, dar si cea dintre alimentatia femeilor si
barbatilor si a indivizilor din perioade istorice diferite.
Subiecti suplimentari analizati cu ajutorul unora sau tuturor metodelor descrise mai sus sunt:
- Copii si adulti de secol X din Capidava (extra murros), Constanta
o Analize de antropologie fizica, radiografii dentare, XRD, FT-IR;
- Scheletul izolat al unei femei apartinand intervalului I BD I AD din Miercurea Sibiului
o Analize de antropologie fizica, radiografii ale scheletului postcranian, XRD, FT-IR;
- Resturi umane de sec XIV XV din Coconi, Calarasi
o Analize de antropologie fizica;
- Scheletul din mormantul din interiorul Bisericii Domnesti din Curtea de Arges
o Analize de antropologie fizica (pentru comparatie cu datele anterior publicate),
14
datare cu C, analize de izotopi stabili, analize privind compozitia elementala a
obiectelor de inventar;
Rezultate preliminare:
Documentarea caracterelor morfometrice observate in cadrul analizei antropologice fizice:
- Exemple pentru atribuirea sexului:
o Diversi markeri morfometrici primesc scoruri intre 1-5 pe baza analizei vizuale
efectuate de minim doi observatori.
o Scorurile mici indica sexul feminin, iar scorurile mari pe cel masculin
o Un scor intermediar de 3 nu permite identificarea sexului
Marginea supraorbitala (scor 1)
Glabella (scor 1), creasta occipitala externa (scor 1) si procesul mastoid (scor 2)
Mentonul (scor 1)
Arcul ventral, concavitatea subpubiana, documentarea traumelor

(fractura antemortem de ram ischiopubic drept)
Creasta ramurii ischiopubiene (scor 1)

Marea scobitura sciatica, larga (scor 1)
Radiografii dentare: - contribuie la rafinarea datelor privind varsta la momentul decesului

Analizele SEM/EDX permit investigarea imagistica a suprafetelor si analiza elementala a
acestora. Pot contribui la caracterizarea modificarilor oaselor in timpul procesului de incinerare, pot da
detalii despre structura unor materiale (textile, metale) cu implicatii in caracterizarea structurii acestora
si proceselor lor de prelucrare.
Suprafata unor oase arheologice inhumate (17) si incinerate la diverse temperaturi (7a si 13a
temperaturi mari; 16a si 18 temperaturi sub 600 C).
Quantitative results
Fe 1.2%
C 15.4%
Ca 20.8%
K 0.4%
Weight%
S 0.3%
P 0.6%
Si 5.3%
Al 2.2%
Mg 0.7%
O 53.2%
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
Al C Ca 17_02
Cl Fe K 16a_02
Mg Na
O P S 7a_02
Si
Ti
Zn
Analiza elementala SEM/EDX a unui fragment osos incinerat (permite estimarea semicantitativa
preliminara a raportului Ca/P, si concluzii privind procesul de diageneza osoasa corelata cu incinerarea).
Analiza XRD - permite identificarea substantelor cristaline din fractiunea minerala a osului si
determinarea dimensiunilor cristalitelor care la randul ei permite estimarea temperaturilor de ardere.
Determinarea temperaturilor de ardere prin XRD (7a si 13 a temperaturi ridicate de ardere; 16a, 18
temperaturi scazute de ardere; 17 inhumat)
Datare cu 14C si reconstructia dietei cu ajutorul analizelor de fractionare a izotopilor stabili de C si N

Probele analizate:
Varsta
Varsta
conventi
Proba Locatie Sex biologica C N
onala +/-
(ani)
30 ani
Curtea
Vlaicu de barbat adult 610 -18.90 11.00
Arges
M7 Feleac femeie copil 580 -19.60 9.40
M9 Feleac barbat copil 330 -19.30 8.90
M10 Feleac femeie adult 670 -19.00 10.20

M11 Feleac nedeterminat copil 340 -19.50 9.10
M15 Feleac barbat adult 210 -19.40 11.00
Rezultatele analizelor de izotopi stabili de C si N permit estimarea dietei indivizilor analizati.

Fractionarea izotopilor stabili de C indica ponderea de sursa vegetala cu fotosinteza de tip C3 si C4 in
alimentatie, in timp ce valoarea raportului dintre izotopii stabili de N indica nivelul trofic al individului
pentru care au fost obtinute masuratori.
Area colorata indica pozitia trofica a probelor analizate in acest studiu preliminar
Proba an calculat +/- 30 interval
Vlaicu 1340 1310-1370

M7 1370 1340-1400
M9 1620 1590-1650
M10 1280 1250-1310
M11 1610 1580-1640
M15 1740 1710-1770
Datarea probelor si intervalul probabil in care a survenit decesul
Intervalele temporare obtinute pentru resturile datate sugereaza ca sub pavimentul Bisericii
Ortodoxe din Feleac s-au efectuat inhumari incepand cu sfarsitul secolului XIII pana in secolului XVIII.
Numarul mic de probe analizate, specific unui studiu preliminar nu permite enuntarea unor concluzii mai
amanuntite.
Tipare alimentare pentru probele analizate
Se observa aportul mai scazut de carne la copii (M7, M9, M11) comparativ cu adultii si la femei (
M10) comparativ cu barbatii (M15 si Vlaicu). Indivizii mai vechi din punct de vedere istoric prezinta un
aport crescut de plante cu fotosinteza de tip C4 (mei) comparativ cu adultii mai recenti si copiii.
CONCLUZII:
- Obiectivele si activitatile propuse pentru aceasta etapa au fost realizate in totalitate si
permit continuarea desfasurarii proiectului in parametri asumati la contractare.

Rezultatele Proiectului Genesis

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Rezultatele Proiectului Genesis

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Evolutie Genetic: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.

O cltorie biomolecular n jurul Carpailor din Antichitate pn n Evul Mediu

1. Sumar raportri tiinifice pe perioada de desfurare a proiectului

3. Raport tiinific an 2015 (12 luni)

n cadrul acestui proiect, desfurat n perioada 2012-2016, am reuit, pornind de la o

Principalele obiective de lucru ale laboratorului de antropologie fizic au fost: 1. realizarea

2. Analiza materialului osteologic

Distribuia loturilor osteologice pe perioade

Nr. necropole Nr. indivizi

2.1.Necropole cu un numr mare de indivizi (peste 100 de indivizi)

2.2.Grupuri populaionale extinse

2.3.2. Suplacu de Barcu

3.2. Articole tiinifice

Traum realizat perimortem. Capidava.

Trauma la nivelul vertebrei aparinnd individului de la Ernei.

2. Stadiul actual al cunoaterii in domeniu

3. Activiti i metode de cercetare

2. Stagii internaionale de cercetare

Fig. 1 Distribuia mormintelor n tumulul T-38 Mireasa, caracteristicile arheologice i

Fig 4. Clustering ierarhic al variaiilor genetice n cele 15 populaii medievale.

Tartrul, asociat rmielor arheologice, reprezint de fapt placa bacterian calcifiat,

Fig 2. Imaginile de microscopie electronic de baleiaj. A. Celule filamentoase de

Protocolul de extracie utilizat pentru recuperarea moleculelor de ADN din probele de

Pentru cuantificarea moleculelor de fungi, bacterii i plante au fost folosite amorsele

Tabel 2. Amorsele utilizate n reciile de amplificare

V1F AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 16S rRNA

Fig 5. Heatmap realizat pe baza indicelui de similaritate Bray-Curtis obinut pe baza

Proteine pentru teste de malarie

Protocolul de extracie a proteinei totale din pulp dentar se bazeaz o variant

Au fost aplicate aceste teste pentru 23 de indivizi din necropola pre-modern de la

Plan general T38.

ADN - Confirmarea diagnosticului

Pentru confirmarea diagnosticului stabilit cu ajutorul testelor rapide ne-am propus

M40- Cristal de hemozoin, SEM (stnga), harta Fe n EDX (dreapta).

Resturi vegetale (cereale) carbonizate

Resturile vegetale descoperite n siturile arheologice prezint o importan crescut

Fig 3. Resturi vegetale carbonizate.

Tabel 1. Amorse utilizate n reacia de amplificare

Uni-MinibarF1 TCCACTAATCACAARGATATTGGTAC COI

Procesele diagenetice i condiii de mediu

Fig. 2 Rezultatele analizei elementale de suprafa pentru probele

Fig. 4 Rezultatele analizei elementale de suprafa pentru probele

Fig. 6. Spectru obinut prin ATR-FTIR, reflectnd compoziia mineral a probelor

Fig. 8. Micrografii ale suprafeelor osoase necontaminate, care nu reflect aciune

Procese diagenetice i reconstituiri istorice

Determinarea mobilitaii comunitailor umane (d87Sr/86Sr)

Materialul genetic stocat n specimenele arheologice reprezint o dovad genetic direct

Pentru evidenierea efectului biodegradativ al fungilor asupra resurselor arheologice au fost

sol 3.34E+09 9.28E+02 2.63E+06

Pentru cuantificarea moleculelor de fungi prezente n probele de os i sol analizate au fost

Specii bacteriene aparinnd microbiotei orale identificate n probe de tartru de provenien

Pfcrt76D1F TGTGCTCATGTGTTTAAACTT Schwab,U.,Alloueche,A,&Doherty,J.F.(2005).

o Folosirea microscopiei electronice de transmisie pentru detecia hemozoinei, pentru 3

Raport tiinific privind rezultatele obinute n cadrul proiectului PCCA_1153b (contract

Evolutie Genetica: Dovezi noi n studiul unor structuri interconectate.

n perioada ianuarie-decembrie 2014

4. Anexe II Rapoarte de antropologie fizic pentru loturile procesate n anul 2014

5. Lista publicaiilor i participrilor la conferine tiinifice n anul 2014

n etapa II a proiectului PCCA-1153b contract 229/2013 (perioada 1 ianuarie - 31 decembrie

SINTEZA REZULTATELOR OBINUTE N PERIOADA IANUARIE DECEMBRIE 2014

Obiectivele etapei II sunt:

1. Depunerea raportului anual aferent etapei II

n acest studiu, notarea indivizilor este

Spectroscopia FTIR i rolul ei n analiza oaselor arheologice