Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Caiet de Laborator PDF
Caiet de Laborator PDF
4
Recoltarea sngelui ........................................................................................................... 6
Condiii de recoltare...................................................................................................... 6
Recoltarea sngelui capilar ........................................................................................... 7
Recoltarea sngelui venos............................................................................................. 7
Condiiile de conservare a probelor recoltate ............................................................... 8
Obinerea plasmei i a serului....................................................................................... 9
Prepararea soluiilor procentuale molare, normale .......................................................... 9
Noiunea de pH ............................................................................................................... 14
Ionizarea apei i produsul ionic al apei................................................................... 14
Scara de pH............................................................................................................. 15
Determinarea pH-ului cu ajutorul indicatorilor acido-bazici.................................. 15
Demonstrarea capacitii de tamponare:................................................................. 17
Determinarea colorimetric a pH-ului prin metoda cu soluii tampon ....................... 18
Volumetrie ...................................................................................................................... 19
Principiile analizei volumetrice .............................................................................. 19
Clasificarea metodelor volumetrice ........................................................................ 20
Calcule n analiza volumetric................................................................................ 20
Tehnica titrrii......................................................................................................... 21
Erorile determinrilor volumetrice ......................................................................... 22
Surse de erori .......................................................................................................... 22
Acidimetria volumetric ............................................................................................. 24
Titrri acido-bazice ................................................................................................. 24
Titrarea unui acid tare cu o baz tare...................................................................... 24
Determinarea factorului unei soluii de HCl 0,1N cu ajutorul unei soluii etalon . 25
Dozarea unei soluii de NaOH cu soluia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut........... 26
Dozarea amoniacului prin diferen........................................................................ 27
Titrarea unui acid slab cu o baz tare ..................................................................... 27
Aplicaie: Dozarea acidului lactic cu o soluie titrat de NaOH............................ 28
Titrarea unei baze slabe cu un acid tare.................................................................. 29
Oxidimetria volumetric ............................................................................................. 30
Permanganometrie ...................................................................................................... 31
Stabilirea factorului soluiei de KMnO4 0,1N ........................................................ 31
Determinri permanganometrice n mediu acid...................................................... 32
Dozarea acidului oxalic (micrometod).................................................................. 32
Dozarea apei oxigenate (macrometod) ................................................................. 33
Iodometrie................................................................................................................... 34
Dozarea substanelor reductoare ........................................................................... 35
Stabilirea factorului soluiei de Na2S2O3 0,01 N .................................................... 35
Dozarea substanelor oxidante ................................................................................ 36
Dozarea K3[Fe(CN)6] (macrometod) ................................................................. 36
Dozarea K3[Fe(CN)6] (micrometod)..................................................................... 36
Complexometria volumetric ..................................................................................... 37
Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometric (metoda Budesinsky) ... 40
Volumetria prin reacii de precipitare......................................................................... 41
Dozarea clorurilor prin metoda Volhard................................................................. 42
Identificarea glucidelor ................................................................................................... 43
Reacii de reducere.................................................................................................. 43
Identificarea dizaharidelor ...................................................................................... 50
Identificarea polizaharidelor ................................................................................... 51
1
Identificarea glucidelor ...............................................................................................52
Identificarea aminoacizilor i proteinelor .......................................................................53
Reacii de culoare ....................................................................................................53
Reacii de precipitare ale proteinelor ..........................................................................57
Dozarea aminoacizilor monoamino-monocarboxilici prin metoda Srensen .........60
Identificarea nucleoproteinelor .......................................................................................62
Vitamine ..........................................................................................................................63
Identificarea vitaminelor prin metoda cromatografic................................................63
Dozarea iodometric a acidului ascorbic din urin (metoda Palladin)........................65
Enzime.............................................................................................................................66
Influena concentraiei substratului asupra vitezei de reacie enzimatic ..................68
Determinarea constantei lui Michaelis pentru ureaz .................................................69
Determinarea activitii catalazei sanguine.................................................................72
Determinarea activitii transaminazelor (metoda colorimetric cu 2,4-
dinitrofenilhidrazin)...................................................................................................73
Determinarea activitii fosfatezei alcaline (Metoda Bodansky) ...............................77
Explorarea echilibrului acido-bazic ................................................................................82
Determinarea rapid a rezervei alcaline (bicarbonat actual) ...................................83
Metoda Astrup.........................................................................................................83
Ioni anorganici.................................................................................................................84
Determinarea potasiului seric......................................................................................84
Dozarea flamfotometric a potasiului seric.............................................................86
Dozarea calciului i magneziului ................................................................................87
Dozarea calciului.....................................................................................................87
Determinarea cationului calciu n snge .................................................................87
Dozarea calciului prin metoda permanganometric................................................89
Dozarea calciului prin metoda complexonometric................................................91
Dozarea magneziului prin metoda Mann i Yoe .....................................................93
Dozarea ionului de clor din ser prin metoda Schales ..................................................96
Dozarea ferului seric (metoda Heilmeyer modificat)................................................97
Dozarea fosfatului anorganic din ser prin metoda Briggs ( cu deproteinizare) .........99
Compui organici ..........................................................................................................103
Dozarea azotului total din ser prin metoda Kjeldahl.................................................103
Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului.........................................106
Electroforeza proteinelor serice ................................................................................108
Dozarea azotului neproteic din ser prin metoda Kjeldahl .........................................112
Dozarea ureei din ser prin metoda cu ureaz ............................................................114
Dozarea ureei din ser prin metoda Kowarski ............................................................115
Dozarea acidului uric din ser.....................................................................................119
Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin ..........................................................121
Dozarea bilirubinei din ser prin diazorecia van den Bergh......................................122
Glucoza......................................................................................................................124
Determinarea glicemiei prin metoda Hagedorn-Jensen (titrimetric)..................124
Dozarea glucozei prin metoda enzimatic (glucozoxidaz)..................................128
Teste rapide pentru determinarea glicemiei ..........................................................129
Alte tehnici de determinare a glicemiei n laborator .............................................132
Dozarea beta-lipoproteinelor dup Burstein .............................................................132
Dozarea colesterolului total din ser prin metoda enzimatic ....................................134
Dozarea colesterolului total i liber...........................................................................135
Obinerea, purificarea i identificarea lecitinei (glbenu de ou)..............................138
2
Hemoglobina............................................................................................................. 141
Dozarea hemoglobinei in snge ( metoda Drabkin) ............................................. 141
Dozarea hemoglobinei sub form de oxihemoglobin ......................................... 141
Analiza urinii ................................................................................................................ 142
Examenul fizic al urinei............................................................................................ 143
Examenul chimic al urinei ........................................................................................ 145
Analiza compuilor patologici din urin................................................................... 146
Identificarea proteinelor urinare ........................................................................... 146
Evidenierea puroiului........................................................................................... 149
Identificarea glucidelor urinare............................................................................. 150
Identificarea corpilor cetonici urinari ................................................................... 155
Teste rapide pentru identificarea corpilor cetonici ............................................... 156
Identificarea acizilor biliari................................................................................... 157
Identificarea pigmenilor biliari urinari ................................................................ 157
Identificarea urobilinogenului i stercobilinogenului ........................................... 158
Identificarea sngelui............................................................................................ 159
Teste rapide de diagnostic din urin ......................................................................... 160
Test rapid de sarcin ................................................................................................. 160
Analiza de laborator a urinei..................................................................................... 161
Determinri n urina din 24 de ore............................................................................ 162
Dozarea clorurilor din urin (metoda Mohr) ........................................................ 162
Dozarea acidului uric din urin............................................................................. 163
Dozarea creatininei din urin................................................................................ 163
Determinarea de clearance (coeficientul de epurare) renal....................................... 164
Analiza calculilor urinari .......................................................................................... 165
Identificarea unor componeni prin reacii specifice: ........................................... 165
Analiza salivei............................................................................................................... 166
Identificarea unor componeni ai salivei................................................................... 166
Determinarea pH-ului i a capacitii tampon a salivei ........................................ 168
Analiza sucului gastric.................................................................................................. 169
Determinarea aciditii gastrice ................................................................................ 169
Analiza lichidului cefalorahidian.................................................................................. 172
Examenul fizic .......................................................................................................... 172
Examenul chimic al lichidului cefalorahidian .......................................................... 173
Analiza scaunului.......................................................................................................... 174
Metode fizice de analiz folosite n laborator............................................................... 176
Fotometria................................................................................................................. 176
Spectrofotometru Spekol ...................................................................................... 178
Spectrofotometrul de absorbie atomic ................................................................... 180
Spectrofotometrul de absorbie atomic ............................................................... 180
Flanfotometria........................................................................................................... 181
Fotometrul cu flacr (flamfotometrul) ................................................................ 181
Poteniometria cu electrozi cu electroni ioni - selectivi............................................ 183
Msurarea pH-ului cu electrodul de sticl ............................................................ 183
Valori patologice de laborator care amenin viaa ...................................................... 185
3
Msuri pentru protecia muncii i asigurarea securitii n
laboratoarele de biochimie
1. ntregul personal i studenii, trebuie s cunoasc i s respecte regulile de protecia
muncii i asigurarea securitii, pentru prevenirea accidentelor de munc.
2. Tot personalul care lucreaz n laboratoarele de analize biochimice este obligat s
poarte halate curate.
3. Aparatele electrice (centrifug, termostate, frigidere, spectrofotometru etc.) trebuie
s aib prizele mpmntate i izolare electric perfect. Fixarea lor n priz se face
numai cu mna uscat.
4. nainte de nceperea oricrei lucrri de laborator trebuiesc nsuite tehnic
problemele teoretice.
5. Toate reaciile chimice se execut n conformitate cu condiiile prescrise (cantitatea,
concentraia, vesela, etc.).
6. Masa de lucru se pstreaz ntr-o ordine i curenie exemplar.
7. Nu se execut nici o operaie n vase murdare.
8. Dup ntrebuinare toate vasele de laborator se spal cu ap de robinet i cu ap
distilat.
9. Nu se aglomereaz masa cu vase i aparate inutile, pe mas se pun numai reactivii i
vesela necesar pentru lucrarea respectiv.
10. Sticlele cu reactivi s fie ntotdeauna nchise cu dop. Dac se folosesc diferii
reactivi trebuie avut grij s nu se schimbe dopurile. Excesul luat dintr-un reactiv nu
trebuie turnat napoi n sticl.
11. ncperea unde se prepar acizii minerali, apa de brom, solvenii organici trebuie s
fie prevzut cu ni, exhaustor i ventilaie electric.
12. nainte de folosirea unor substane inflamabile (sulfur de carbon, benzin, eter,
etc.) se sting toate becurile de gaz.
13. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu extinctor, s se fac instructaj periodic de
utilizarea extinctorului i s fie precizat o echip care s intervin n caz de
incendiu.
14. Evaporarea solvenilor inflamabili se va face numai pe bi de nisip sau bi de ap
electrice, sub nie cu tiraj convenabil.
15. Trebuie s se lucreze cu mare precauie cu metalele alcaline, fosfor, brom, clor, acid
azotic, substane toxice i inflamabile.
4
16. Pipetarea produselor biologice se face cu pipete prevzute cu filtru de vat.
17. Pipetarea acizilor concentrai i bazelor se face cu pipet cu volum mai mare dect
volumul de pipetat i prevzute cu filtru de vat.
18. Bromul se msoar numai sub ni, cu pipete cu bul, prevzute cu o par de
cauciuc pentru aspirare. Acidul sulfuric diluat se prepar prin turnarea acidului
sulfuric concentrat n vasul cu ap i nu invers.
19. n timpul nclzirii unei eprubete care conine un lichid captul deschis al eprubetei
nu se ine spre cel care efectueaz operaia i nici spre vecini.
20. Nu se las substane n vase neetichetate.
21. Substanele toxice se in sub cheie i n borcane sau sticle prevzute cu etichete cu
cap de mort.
22. Este strict oprit gustarea reactivilor deoarece majoritatea substanelor chimice
folosite sunt toxice sau caustice.
23. Mirosirea substanelor chimice nu se face prin apropierea nasului direct la gtul
sticlei cu reactivi, ci prin aducerea unui curent de aer care conine vapori ai
substanelor de la gtul sticlei cu ajutorul palmei n apropierea nasului.
24. Cnd se lucreaz cu substane care n cursul operaiei se pot mprtia sau se pot
produce mici explozii, se folosesc ochelari de protecie.
25. Tuburile de oxigen, bioxid de carbon i azot lichid se depoziteaz, n afara
laboratorului. Cnd sunt strict necesare anumitor operaii n laborator ele se
ancoreaz cu lan n locuri anume prevzute.
26. Cromatografia i electroforeza se efectueaz n ncperi izolate de restul
laboratorului i prevzute cu ventilatoare electrice.
27. n legtur cu lucrarea practic efectuat se noteaz toate observaiile precum i
schia instalaiei folosite.
28. Acizii minerali i hidroxizii concentrai, hrtiile i eprubetele sparte nu se arunc n
chiuvete.
29. Dup terminarea activitii, se pun toate vasele la loc, se cur masa i se
controleaz dac aparatura electric a fost scoas din prize i robinetele de ap i
gaz nchise.
30. Fiecare laborator trebuie s fie dotat cu o trus de prim ajutor care s conin
medicamente i material sanitar strict necesar (antinevralgice, cardiotonice,
antibiotice, antiseptice, calmante, fei, tifon etc.).
5
31. Este interzis pstrarea alimentelor n frigidere cu produse biologice,. pentru a evita
pericolul de infectare.
32. Este necesar ca msurile de protecia muncii, asigurarea securitii, prevenirea
toxicitii s fie prelucrate cu fiecare grup de studeni la nceputul activitii anului
universitar i reamintite periodic.
33. n cazul unor accidente se va apela la conductorul lucrrii.
Recoltarea sngelui
Analizele chimice ale constituenilor anorganici i organici sanguini se pot
realiza pe snge venos, capilar i arterial (foarte rar).
Investigaiile comparative pe snge capilar i venos au artat c nu exist
diferene dependente de modul de prelevare pentru urmtoarele substane: sodiu,
potasiu, clor, calciu, fosfor, colesterol, uree, proteine totale. n schimb pentru glucoz s-
au gsit valori mai mici n sngele venos fa de cel arterial, pentru piruvat i lactat
valori mai mari n sngele venos dect n cel capilar iar pentru amoniac valorile din
sngele arterial sunt mai mari dect cele din sngele venos.
Condiii de recoltare
6
Component (concentraie) Eritrocite Plasm Eritrocite
Plasm
Azot neproteic (mg/100 ml) 44,0 25,0 1,80
Creatinin (mg/100 ml) 1,8 1,1 1,60
Azot ureic (mg/100 ml) 14,0 17,0 0,82
Acid uric (mg/100 ml) 2,5 4,6 0,54
Glucoz (mg/100 ml) 74,0 90,0 0,82
Colesterol (mg/100 ml) 139,0 194,0 0,72
Potasiu (mEq/l) 100,0 4,4 22,7
Sodiu (mEq/l) 16,0 140,0 0,11
Clor (mEq/l) 52,0 104,0 0,50
Calciu (mEq/l) 0,5 5,0 0,10
Magneziu (mEq/l) 5,5 2,2 2,5
Fosfor anorganic (mEq/l) 2,5 3,2 0,78
Bicarbonat (mEq/l) 19,0 26,0 0,73
Recoltarea sngelui capilar se face din pulpa degetului, din clci (la nou
nscui) sau din lobul urechii (la pacienii n stare de oc), dup urmtoarea tehnic :
- se spal locul cu eter se usuc, se neap suficient de adnc cu un ac steril;
- se las sngele s curg spontan pn cnd se formeaz o pictur apre-
ciabil din care se recolteaz cu ajutorul unei micropipete cantitatea de snge necesar;
dac sngele nu curge spontan n cantitate suficient, se pot folosi manevre ajuttoare:
frecarea degetului n cazul prelevrii din pulp, a gambei n cazul prelevrii din clci
sau aplicare de alcool 70 n cazul prelevrii din lobul urechii; dup prelevare se pune
pe locul nepturii un tampon steril.
Recoltarea sngelui venos se efectueaz din venele plicii cotului (la adult i copii
mari), din fontanel i venele jugulare (la sugari i copii mici).
7
Recoltarea din venele plicii cotului se face dup urmtoarea tehnic:
- se fixeaz garoul deasupra cotului, se dezinfecteaz tegumentul n locul
puncionrii cu alcool 70 %;
- se puncioneaz vena i se recolteaz sngele prin ac fie direct n eprubet prin
scurgere liber, fie prin aspirare n sering ;
- dup recoltare se ndeprteaz garoul i se tamponeaz locul puncionat cu un
tampon de vata mbibat n alcool.
Se folosesc ace i seringi de unic utilizare s-au ace i vase speciale pentru
recoltarea sngelui, vasele n care se recolteaz trebuie s fie n perfecta stare de
curenie i uscare ntruct urmele de alcool, ap etc. pot produce hemoliza sngelui, iar
diferitele impuriti pot falsifica rezultatele dozrilor.
Poziia corpului i staza venoas influeneaz rezultatele obinute n cazul
determinrii elementelor figurate (eritrocitele, etc.) i a celor cu greutate molecular
mare (proteinele totale, fraciunile proteice individuale, colesterolul din complexul
lipoproteinelor etc.).
De exemplu: valoarea proteinelor totale crete de la 6,63 g/100 ml n poziie de
deccubit la 7,65g/100 ml n ortostatism.
n cazul determinrii substanelor cu greutate molecular mic, poziia corpului
i staza venoas nu afecteaz valoarea rezultatelor excepie, fcnd lactatul, piruvatul i
amoniacul.
8
Obinerea plasmei i a serului
Analizele biochimice se pot efectua pe snge total, plasm sau ser. Plasma
sanguin se obine prin centrifugarea sngelui proaspt recoltat pe un anticoagulant
(fluorur de sodiu, amestec de oxalai de potasiu i amoniu, heparin etc.); supernatantul
este constituit din plasma sanguin, iar sedimentul din elementele figurate.
Serul sanguin se obine prin centrifugarea sau decantarea sngelui recoltat fr
anticoagulant, dup ce a fost lsat s coaguleze la temperatura camerei timp de 30-60
minute.
Serul normal este limpede, de culoare galben pai i se deosebete de plasma
sanguin prin faptul c nu mai conine fibrinogen. n condiii fiziologice, aspectul
serului poate fi :
- opalescent datorit particulelor de grsime provenite dintr-un regim foarte
bogat n lipide, caz n care clarificarea se poate obine prin deproteinizare sau
extracia lipidelor cu amestec alcool-eter (3/1);
- galben-brun datorit substanelor carotenoide provenite din alimentaie excesiv
vegetarian ;
- de la roz la rou intens datorit prezenei hemoglobinei, rezultat al hemolizei
produs prin greeli n tehnica de recoltare a sngelui.
n condiii patologice, serul poate prezenta urmtoarele modificri de culoare :
- opalescent n nefroza lipoidic;
- galben-brun n ictere de diferite etiologii; n contact cu aerul, bilirubina se
poate transforma n biliverdin, sngele devenind verzui.
9
De exemplu 100 g soluie 15% (m/m) H2SO4 conine 15 g H2SO4 i
85 g ap.
- concentraia procentual volumetric - ml solut n 100 ml soluie,
(v/v)
De exemplu 100 ml soluie 4% (v/v) etanol se prepar completnd 4
ml CH3CH2OH pn la 100 ml cu ap. n acest caz facem abstracie de
contracia de volum, fenomen larg ntlnit n prepararea soluiilor
procentuale volumetrice. ntr-o expresie restrns acest fenomen poate
fi scris astfel: v solut + v solvent > v soluie. Pentru soluii diluate el poate fi
neglijat.
- concentraia procentual mixt - grame solut n 100 ml soluie, (m/v)
De exemplu 100 ml soluie 0,8% (m/v) NaCl (ser fiziologic) conine
n acest volum 0,8 g NaCl
b) Concentraia molar (m, M) reprezint numrul de moli de solut aflai ntr-un
litru de soluie.
c) Concentraia molal, mai rar folosit, se definete prin numrul de moli de
solut dizolvai n 1000 g de solvent.
d) Concentraia normal reprezint numrul de echivaleni-gram de solut dintr-
un litru de soluie.
Se numete echivalent cantitatea de substan n greutate care ntr-o reacie
chimic dat poate nlocui sau lega 8 pri n greutate de oxigen sau 1,008 pri n
greutate de hidrogen. Cantitatea de substan n grame, egal numeric cu echivalentul,
se numete echivalent-gram.
Pentru calcularea echivalentului-gram se ine cont de urmtoarele reguli:
echivalentul-gram a unui acid este egal cu raportul dintre masa molecular (M) a
acidului i numrul de ioni H+ angajai n reacie. De exemplu, ntr-o reacie de
neutralizare cu HCl
M HCl
EgHCl = = 36,5 g HCl,
1
+
iar ntr-o reacie n care H3PO4 cedeaz toi cei 3 ioni H :
M H3 PO4 98
E gH3 PO4 = = = 32,7 g H3PO4
3 3
10
echivalentul-gram a unei baze este dat de masa molecular a sa mprit la numrul
-
ionilor HO care particip la reacie. Dac toi ionii HO- particip la reacie
echivalentul-gram al bazei se poate calcula mprind masa molecular a acesteia la
valena metalului. De exemplu:
M NaOH M Ca ( OH ) 2 74
EgNaOH = = 40 g NaOH E gCa ( OH ) 2 = = = 37 g Ca(OH)2
1 2 2
n sensul mai larg al bazelor generalizate, echivalentul gram se calculeaz
cunoscnd numrul de protoni care sunt legai.
pentru sruri, echivalentul-gram este dat de raportul dintre masa molecular i
produsul dintre numrul atomilor de metal din molecula de sare i valena acestui
metal, sau raportul dintre masa molecular i produsul dintre numrul radicalilor acid
i valena acestora. De exemplu:
M Fe2 ( SO4 ) 3 400
E Fe2 ( SO4 ) 3 = = = 66,7 g Fe2(SO4)3
23 6
Ca i n cazul acizilor, bazelor i srurilor, echivalentul-gram a unei substane
oxidante sau reductoare se calculeaz pe baza stoicheometriei redox a reaciei la care
particip aceasta. n reaciile de oxido-reducere atomii i schimb valena. Echivalentul
se definete ca fiind raportul dintre masa molecular a compusului chimic i numrul de
electroni cedai sau primii n reacie de atomul (atomii) care se oxideaz sau se reduc.
De exemplu, n permanganometrie, n mediu acid ionul de mangan din KMnO4,
accept 5 electroni:
7+ 2+
2KMnO4 + 3H2SO4 = 2MnSO4 + K2SO4 + 3H2O + 5[O]
M KMnO4
Prin urmare, E gKMnO4 = = 31,6 g KMnO4
5
- variaia strii de oxidaie a ionului de mangan din KMnO4 n mediu slab alcalin
sau neutru este 3.
7+ 4+
2KMnO4 + H2O = 2KOH + MnO2 + 3[O]
M KMnO4 158
E gKMnO4 = = = 52 ,7 g KMnO4
3 3
- variaia strii de oxidaie a manganului din KMnO4 n mediu puternic alcalin
este 1
+7 +6
2KMnO4 + 2KOH = 2K2MnO4 + H2O + [O]
11
EgKMnO4 = MKMnO4 = 158g KMnO4
1
1. Soluii procentuale
a) Prepararea unei soluii de NaCl 10 % (m/m)
Conform definiiei 100 g soluie NaCl 10 % trebuie s conin 10 g NaCl i 90 g
ap. Se cntresc 10 g NaCl la balana tehnic care se introduc ntr-un pahar Berzelius i
se adaug 90 ml de H2O distilat. Se omogenizeaz amestecul cu ajutorul unei baghete
de sticl.
b) Prepararea unei soluii de CH3COOH 15 % (v/v)
Conform definiiei 100 ml soluie CH3COOH 15 % trebuie s conin 15 ml
CH3COOH glacial i restul H2O distilat. Se msoar ntr-un cilindru gradat 15 ml
CH3COOH glacial i se completeaz volumul cu H2O distilat pn la 100 ml. Se
omogenizeaz amestecul cu ajutorul unei baghete de sticl.
c) Prepararea unei soluii de Na2CO3 5%(m/v)
100 ml soluie Na2CO3 5 % trebuie s conin 5 g Na2CO3 anhidru i H2O
distilat. Se cntresc 5 g Na2CO3 anhidru la balana tehnic, se introduc ntr-un cilindru
gradat i se completeaz cu H2O distilat pn la 100 ml. Se omogenizeaz amestecul
cu ajutorul unei baghete de sticl. n cazul n care se lucreaz cu Na2CO3 . 10 H2O se
vor lua n considerare masele moleculare pentru a se determina cantitatea n grame a
srii hidratate ce corespunde greutii de sare anhidr.
M Na2 CO3 anh . = 106 M Na2 CO3 .10H2 O = 286
Regula amestecurilor
Dintr-o soluie mai concentrat se poate prepara o soluie mai diluat cu ajutorul
regulei amestecurilor. De exemplu, avnd la dispoziie o soluie de NaCl 2 % (m/m) s
se prepare 20 ml soluie NaCl 0,9 %(m/m). Valorile concentraiilor celor dou soluii,
12
avnd concentraia mai mare, respectiv mai mic dect concentraia soluiei de preparat,
se aeaz n colurile de sus ale unui dreptunghi imaginar. Valoarea concentraiei
soluiei de preparat, se aeaz la intersecia celor dou diagonale. Valorile numerelor ce
reprezint concentraiile se scad pe diagonal (numerele mai mici se scad din cele mai
mari). Rezultatele se scriu n colurile de jos ale dreptunghiului. Aceste numere
reprezint pri n greutate din soluiile respective (grame, kilograme, etc.).
2 0
0,9
0,9 pri NaCl 2 % 1,1 pri H2O distilat2 pri NaCl 0,9%(m/m)
Deci, se pot amesteca 0,9 pri NaCl 2 % cu 1,1 pri H2O distilat pentru a
rezulta 2 pri soluie de NaCl 0,9%(m/m). Avnd n vedere c soluia NaCl 0,9%
(m/m) este diluat putem tolera conversia prilor de greutate, n volume. Adic,
20 ml (soluie) NaCl 0,9 %(m/v) ..........x ............y
x = 9 ml NaCl 2 %
y = 11 ml H2O distilat
Aproximaia fcut este util deoarece este mai uoar msurarea volumetric a
soluiilor n loc de cea gravimetric.
2. Soluii molare
13
m 49
v= = = 43,02 ml sol. H2SO4 20 %(m/m)
1,139
n balonul cotat de 1000 ml se introduce o cantitate de H2O distilat, se adaug
43,02 ml soluie H2SO4 20 % i apoi se aduce la cot cu H2O distilat dup rcirea
amestecului la temperatura menionat pe balon (20C). Dup ce se fixeaz dopul
balonului cotat se omogenizeaz soluia prin agitare energic.
3. Soluii normale
Prepararea unei soluii de H2SO4 0,1 N avnd la dispoziie soluie H2SO4 20 %
(m/m) cu densitatea 1,139 g/cm3. Conform definiiei 1000 ml sol. H2SO4 0,1 N conin
0,1 E gH2 SO4 . Deci:
Noiunea de pH
Ionizarea apei i produsul ionic al apei
Dei apa pur este considerat neelectrolit, ea conduce totui curentul electric.
Acest lucru se datoreaz faptului c o parte din moleculele ei sunt ionizate. Ionizarea
apei poate fi scris conform ecuaiei:
Ka=
[H O ][OH ]
3
+
[H 2O]2
La temperatura de 25C apa se afl ionizat n proporie de o molecul la 555
milioane de molecule. De aceea se consider c, prin ionizare, concentraia apei (de la
numitor) rmne practic constant i deci poate fi nmulit cu constanta de aciditate.
14
Ka [H2O]2 = Pi = [H3O+] [OH-]
Constanta Pi este numit produsul ionic al apei sau constanta de autoprotoliz a
apei. Deoarece la temperatura de 25C produsul ionic al apei are valoarea de
10-14 moli2/l2, nseamn c n apa pur la 25C concentraia ionilor de hidroniu, egal cu
cea a ionilor de hidroxid, este 10-7moli/l.
[H3O]+ = [OH-] = 10-7moli/l
Scara de pH
n soluii diluate, acizii tari pot fi considerai practic ionizai complet. Astfel,
ntr-o soluie apoas 0,1N de HCl (0,1 moli/l) concentraia ionilor de hidroniu este
practic egal cu concentraia total a acidului. Este comod s se exprime concentraia
ionilor de hidroniu dintr-o soluie apoas n form logaritmic. Se numete exponent al
concentraiei ionilor de hidroniu sau pH logaritmul zecimal cu semn schimbat al
concentraiei ionilor de hidroniu din soluie (Srensen, 1909):
pH = - lg [H3O+]
Punctul neutru: O soluie apoas este neutr cnd concentraiile ionilor de
hidroniu i ionilor de hidroxid sunt egale, conform ecuaiei:
[H3O+] = [OH-] = 10-7moli/l
Punctul neutru, n soluii apoase, este la pH = 7. O soluie cu pH < 7 este acid; o soluie
cu pH > 7 este bazic.
15
n cazul albastrului de bromtimol, acidul slab AH este galben iar baza conjugat
A- este albastr. Prin schimbarea aciditii soluiei indicatorului i schimb culoarea
fenomen numit viraj, datorit trecerii lui din stare protonat n cea deprotonat sau
invers.
Constanta de aciditate al indicatorului va fi:
-
[A ]
Ka = [H ]
+
[AH]
n forma logaritmic:
[A-]
-
[A ]
lgKa = lg[H ] + lg
+
sau - lg[H ] = -lgKa + lg
+
[AH] [AH]
Adic:
-lg[H+] = pH i -lgKa = pKa, deci:
[A-] ________
[albastru]
pH = pKa + lg sau pH = pKa + lg
[AH] [galben]
Ochiul uman nu poate distinge dect cca. 10% dintr-o culoare n prezena unei alte
culori. Dac [A-] = 10[AH], soluia va fi albastr i pH1 = pKa + 1. Dac 10[A-] = [AH],
soluia va fi galben i pH2 = pKa - 1. Prin urmare:
pH1 - pH2 = pH = 2
Acest interval de pH se numete intervalul de viraj al indicatorului care nseamn
intervalul de pH n care are loc schimbarea culorii indicatorului (de la albastru la galben
n cazul nostru) odat cu schimbarea pH-ului soluiei. Fiecare indicator are un interval
de viraj specific. La valori de pH inferioare intervalului de viraj indicatorul i pstreaz
culoarea, iar peste acest interval la fel. Din culoarea soluiei unui indicator se poate
aprecia pH-ul soluiei.
Indicatorii acido-bazici pot fi simpli, micti i universali. Indicatorii simpli se
caracterizeaz printr-un interval de viraj relativ mic (cca 2 uniti de pH).
Indicatorii simpli se pot folosi pentru tatonarea pH-ului necunoscut. pH-ul
necunoscut se poate estima cu o eroare de un semiinterval de viraj.
Indicatorii universali sunt amestecuri de indicatori simpli ale cror intervale de
viraj sunt parial suprapuse sau, n cazul cel mai bun, unul n continuarea celuilalt.
Indicatorii universali au intervale de viraj mai mari dect ale celor simpli. n comer se
gsesc hrtii indicatoare impregnate cu indicatori universali. Prin compararea culorii
16
obinute cu o scar de culori etalon, se poate determina pH-ul unei soluii cu o precizie
de aproximativ + 0,5 uniti pH.
Sistemele tampon: sunt formate dintr-o sare hidrolizabil i acidul slab sau baza slab
rezultat prin hidroliz. O soluie care i schimb numai puin pH-ul, la adugarea unei
cantiti mici de acid sau baz tare se numete soluie tampon. O caracteristic a unei
soluii tampon este capacitatea de tamponare.
Capacitatea de tamponare a unei soluii este capacitatea ei de a se opune variaiei de pH
la adaosul de acid tare sau baz tare i se exprim prin numrul de echivaleni de acid
sau baz care schimb pH-ul unui litru de soluie cu o unitate. Ea se micoreaz prin
diluare.
17
Modul de lucru:
n dou pahare Berzelius (1, 1a) se pune ap distilat i se adaug cte 2 ml de
indicator. Dac apa este neutr culoarea soluiilor este verde. n alte dou pahare (2, 2a)
de aceiai mrime se prepar soluie tampon cu pH = 7, la care se adaug cte 2 ml
soluie de indicator obinndu-se tot culoarea verde. Se adaug cte 1 ml HCl N/10 n
paharele 1i 2 i se amestec cu bagheta: se observ o puternic variaie a culorii
soluiei din paharul 1 ceea ce indic o mare variaie a pH-ului. n paharele 1a i 2a se
adaug cte 1 ml NaOH N/10, se amestec cu bagheta i se observ la fel o mare
variaie a culorii soluiei din paharul 1a. n paharele 2 i 2a culoarea se schimb foarte
puin, deoarece pH-ul s-a modificat foarte puin.
n dou pahare Berzelius (1, 1a) se prepar soluie tampon cu pH = 7 i se adaug
cte 2 ml indicator. n alte 2 pahare (2, 2a) se prepar soluie tampon cu acelai pH, ns
de zece ori mai diluat, adugnd cte 2 ml indicator i n aceste pahare. Se pipeteaz
cte 1 ml HCl N/10 n paharele 1 i 2, i cte 1 ml NaOH N/10 n paharele 1a i 2a. Se
amestec cu bagheta. n paharele 2 i 2a se observ schimbarea mai pronunat a culorii
indicatorului deoarece, soluiile tampon fiind mai diluate, li s-a micorat capacitatea de
tamponare.
Principiu:
Se adaug soluiei de cercetat un anumit volum dintr-un indicator potrivit i se
compar culoarea pe care o capt soluia, cu culoarea produs de aceiai cantitate de
indicator adugat unei serii de soluii tampon cu pH-uri cunoscute. pH-ul soluiei de
cercetat va fi egal cu pH-ul soluiei de referin cu culoarea identic.
Reactivi: - Sol. de CH3COOH N/10
- Sol. de CH3COONa N/10
- Sol. de KH2PO4 M/15
- Sol. de Na2HPO4 M/15
- Indicator Bogen (amestec de rou metil i albastru de bromtimol)
Modul de lucru:
Se prepar n dou serii de eprubete soluii tampon cu pH diferit conform
tabelelor:
18
Tampon acetat (Walpole)
Volumetrie
Principiile analizei volumetrice
Analiza volumetric se bazeaz pe msurarea de volume, operaie ce se execut
comod cu vase calibrate (cilindrii gradai, baloane cotate, pipete, biurete). Principiul
analizelor volumetrice const n msurarea volumului de reactiv necesar producerii
reaciei cantitative cu substana de determinat ce se afl n soluia de analizat. Operaia
de adaos a soluiei de reactiv se face n pic- turi, din biuret i se numete titrare.
Pot fi urmrite volumetric numai acele reacii care au loc univoc, (fr reacii
secundare i cantitativ) i cu vitez foarte mare. Pentru marcarea sfritului reaciei,
respectiv a punctului de echivalen, se folosesc fenomene ce pot fi puse n eviden
prin observare vizual (schimbri de culoare, apariii de precipitate) sau instrumental
(poteniometru, conductometru, spectrofotometru). Pentru observarea vizual a
19
sfritului titrrii n modul cel mai obinuit se folosesc indicatorii, substane care i
schimb culoarea n punctul de echivalen.
La punctul de echivalen reactanii sunt prezeni n cantiti echivalente, deci n
amestecul de reactivi nu se afl n exces nici substana de dozat i nici reactivul titrat.
Volumul de reactiv adugat pentru atingerea punctului de echivalen se numete volum
de echivalen.
Spre a putea stabili concentraia substanei de analizat este necesar ca soluia de
reactiv folosit la titrare s fie de concentraie cunoscut, s fie suficient de stabil i s
se prepare relativ uor.
Metodele volumetrice se caracterizeaz prin rapiditate, n majoritatea cazurilor o
determinare volumetric se face n cteva minute.
20
Vt
F= unde: Vt - volumul teoretic (a soluiei exact normale)
Vr
Vr - volumul real ( a soluiei preparate)
Factorul soluiilor exact normale este 1,000. Ele folosesc ca soluii etalon i cu
ajutorul lor se determin factorul soluiilor aproximativ normale. Soluiile mai diluate
au un factor subunitar, soluiile mai concentrate au un factor supraunitar. Practic
valoarea factorului trebuie s fie ntre 0,8000-1,2000.
Pe lng factor concentraia exact a soluiilor se poate exprima i cu ajutorul
titrului. Titrul unei soluii reprezint cantitatea de substan exprimat n grame din 1 ml
soluie. De exemplu: pentru o soluie de NaOH care conine 4,653 g pe litru titrul are
valoarea de 0,004653.
Tehnica titrrii
Pregtirea instrumentelor pentru titrare
Biureta se spal cu ap distilat i apoi se cltete cu soluia de titrare de dou
ori. Dup utilizarea mai ndelungat a biuretei este necesar degresarea tubului gradat al
acesteia. Aceasta se poate realiza cu amestec cromic sau cu soluie de detergent.
Se umple biureta cu soluia de titrare peste gradaia 0, apoi se scoate plnia care
a servit pentru introducerea lichidului n biuret i se potrivete la zero nivelul lichidului
lsnd s cad ncet lichidul n exces ntr-un vas colector. Dac robinetul se mic greu
sau biureta picur, se scoate robinetul, se terge de umezeal i se unge cu un strat
subire i uniform de vaselin. Partea inferioar a manonului robinetului se usuc cu
ajutorul hrtiei de filtru i apoi se introduce robinetul uns la locul lui. Bulele de aer
prezente n biuret pot s cauzeze erori la titrare ceea ce impune ndeprtarea lor.
Modul de lucru:
La nceputul titrrii dm drumul soluiei din biuret n picturi repezi agitnd n
continuu coninutul flaconului Erlenmayer, n care se gsesc, exact msurat, volumul
soluiei de titrat plus indicatorul. De obicei se observ o schimbare temporar de culoare
a indicatorului n locul unde cad picturi de reactiv n soluie. Spre sfritul titrrii
concentraia substanei de dozat scade i la contactul picturilor de reactiv cu soluia de
dozat schimbarea temporar a culorii soluiei este mai persistent. n aceast faz viteza
de picurare se reduce treptat n aa fel nct dup adugarea ultimei picturi necesare, s
fie posibil nchiderea rapid a robinetului. Pictura aderat pe vrful biuretei se
21
introduce n vasul de titrare prin atingerea de peretele interior al acestuia i se amestec
cu lichidul de titrat aplecnd vasul n direcia lichidului ce se prelinge pe peretele
vasului. Titrarea se consider terminat cnd ultima pictur produce o schimbare slab
dar sesizabil i stabil a culorii lichidului.
Erorile determinrilor volumetrice
n analizele chimice pot interveni dou tipuri de erori:
- erori sistematice
- erori ntmpltoare
Erorile sistematice au valori constante i sunt ntotdeauna pozitive sau negative.
Erorile ntmpltoare au valori i semne diferite. Ele se pot elimina prin
efectuarea unui mare numr de determinri i prin calcularea mediei aritmetice a
volumelor de echivalen cu valori apropiate. Volumele de echivalen ale cror valori
sunt exagerat de ndeprtate se exclud
Practic se efectueaz titrarea a trei probe paralele efectundu-se media aritmetic
ntre volumele de echivalen identice sau cele cu valoare foarte apropiat. Se accept o
diferen ntre volumele de echivalen mai mic sau egal cu 0,2 ml. S lum un
exemplu. Volumele de echivalen obinute la titrarea a trei probe paralele sunt: V1 = 7
ml; V2 = 7,1 ml; V3 = 7,4 ml. Diferenele V3 - V1 i V3 - V2 sunt mai mari de 0,2 ml,
deci V3 se exclude. Volumul mediu ( v ) luat n calcul va fi n acest caz media aritmetic
dintre V1 i V2 i are valoarea de 7,05 ml. Dac toate probele au valori foarte diferite
rezultatele nu sunt interpretabile iar titrrile trebuie s fie repetate.
Surse de erori
Eroarea de paralax ( eroarea de citire) intervine la citirea incorect a nivelului
soluiei din vasul de msurat. Volumul de soluie ntr-un vas de msurat este egal cu
volumul nominal al vasului n cazul n care punctul inferior al meniscului lichidului este
tangent la cota de pe vas. Pentru citirea corect a poziiei meniscului ochiul
observatorului trebuie s fie pe orizontal ntr-un plan tangent la menisc iar vasul
trebuie s aib o poziie vertical.
22
Vorbim despre eroarea de paralax n minus cnd ochiul observatorului este
deasupra acestei orizontale, respectiv eroare de paralax n plus, cnd ochiul se gsete
sub nivelul orizontului. Pentru evitarea erorii de paralax se folosesc biuretele
Schellbach care sunt prevzute cu o dung albastr pe un fond alb. La nivelul
meniscului dunga albastr se ntrerupe formnd dou vrfuri ascuite care se ating ntr-
un punct. Se citete poziia acestui punct de contact.
Eroarea de scurgere se datoreaz faptului c soluiile apoase umezesc sticla i, la
golirea rapid o parte din lichid ader pe suprafaa biuretei, deci soluia nu se scurge
cantitativ n vasul de titrare. Pentru evitarea acestei erori, viteza de scurgere pe
parcursul titrrii trebuie s fie mic.
Eroarea de picurare
n analiza volumetric, soluiei de analizat i se adaug soluia titrat pn cnd
ultima pictur produce o schimbare sesizabil i stabil a culorii soluiei. n cele mai
multe cazuri acest efect se datoreaz unui exces a soluiei cu care se titreaz. Pentru
reducerea acestui exces, ciocul biuretei trebuie s fie ct mai subire pentru ca picturile
de titrant s fie ct mai mici.
Eroarea de temperatur
Vasele de msurat volume, biurete, baloane cotate, pipete sunt etalonate pentru o
anumit temperatur (200C). Diferena dintre temperatura de etalonare a vasului i
temperatura real a soluiei de msurat determin o diferen de volum, care poart
denumirea de eroare de temperatur. Se poate evita aceast eroare prin respectarea
temperaturii de etalonare. Diferenele mici de 1-20C sunt, n majoritatea cazurilor,
neglijabile.
23
Acidimetria volumetric
Titrri acido-bazice
n titrrile de neutralizare, stabilirea volumului de echivalen sau de
neutralizare se face cu ajutorul indicatorilor acido-bazici care, cum am artat sunt n
form neionizat acizi slabi (AH) sau baze slabe (B). n tabelul de mai jos sunt
exemplificai mai muli indicatori acido-bazici cu precizarea naturii lor de acid sau baz.
Sunt inclui i civa din indicatorii utilizai la determinarea pH-ului (vezi mai sus).
Evident, tria acestor acizi crete ctre cel al crui interval de pH este cel mai mult sub
valoarea 7.
Pentru prepararea soluiilor de indicatori se folosesc ca solveni apa, dar mai ales
alcool apos, cei mai muli n concentraie de 0,1 %.
[H ] = [OH ] = 10
+ 7
ioni g/l pHechiv. = 7
[H ]+
pe parcursul titrrii este egal cu concentraia acidului rmas netitrat.
[
Dup echivalen OH ] este egal cu concentraia bazei introdus n exces. Pentru
24
echivalen. La un exces (eroare) de 1% reactiv pH-ul soluiei variaz brusc. La titrarea
unui acid tare cu o baz tare intervalul de eroare corespunde aproximativ intervalului de
pH 4-10, ceea ce nseamn c se poate folosi orice indicator care are un interval de viraj
ntre pH 4-10. n figura de mai jos apare curba de titrare a unui acid tare cu o baz tare
cu precizarea a doi indicatori ce permit punerea n eviden a punctului de echivalen
(P.E.) al reaciei
25
poate prepara prin cntrirea i dizolvarea n ap a KHCO3, necesar n titrarea de mai
jos.
Pentru determinarea factorului soluiei de HCl 0,1 N preparat anterior se
msoar exact cu ajutorul unei pipete cte 10 ml sol. KHCO3 n 3 pahare Erlenmeyer.
Se adaug cte 3 picturi de metiloranj i se titreaz, cele trei probe paralele, pn la
virajul indicatorului de la galben la portocaliu. CO2 format n urma reaciei se
ndeprteaz prin fierberea probelor 2-3 minute. n cazul n care dup rcirea probelor
culoarea a revenit la galben, se continu titrarea pn la portocaliu.
Din cele 3 volume de echivalen se face media aritmetic i se obine v HCl . La
baza calcului st relaia:
v HCl . FHCl = VKHCO3 . FKHCO3
10 x FKHCO3
de unde FHCl =
v HCl
Dozarea unei soluii de NaOH cu soluia de HCl 0,1 N cu factor cunoscut
n trei flacoane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml sol. NaOH, se adaug cte 3
picturi de metiloranj i se titreaz cu soluie titrat de HCl 0,1 N pn la virajul
indicatorului de la galben la portocaliu. Concentraia procentual mixt a soluiei de
NaOH se exprim n g/100 ml i se calculeaz n felul urmtor:
- se face media aritmetic a celor trei volume de echivalen i se obine v HCl
- conform definiiei concentraiei normale, 1000 ml HCl 1 N conin 1 EgHCl
- din ecuaia reaciei chimice NaOH + HCl = NaCl + H2O rezult c 1 EqHCl
reacioneaz cu 1 EqNaOH deci:
1000 ml HCl 1 N ............. 40 g NaOH
1000 ml HCl 0,1 N............ 4 g NaOH
v HCl FHCl ................... x g NaOH
4 v FHCl
x= - reprezint g NaOH coninute n volumul sol. de
1000
NaOH titrate (10 ml).
CNaOH%(m/v) = 10 x, reprezint concentraia procentual mixt a soluiei de
NaOH.
26
Dozarea amoniacului prin diferen
Principiu:
Metoda direct de dozare a amoniacului cu o soluie titrat de HCl 0,1 N, n
prezen de metiloranj, este n general evitat datorit pierderilor de amoniac prin
desorbie. Este preferat metoda dozrii amoniacului prin diferen. Soluia de amoniac
se trateaz cu un volum de soluie titrat de HCl, ce conine un exces de acid i se
determin excesul de HCl prin titrare cu o soluie titrat de NaOH n prezen de
metiloranj. Reaciile sunt urmtoarele:
NH3 + HCl = NH4Cl; NaOH + HCl = NaCl + H2O.
Reactivi: - Soluie de HCl 0,1N cu factor cunoscut
- Metilorange, soluie alcoolic 0,1%
Modul de lucru:
n trei flacoane Erlenmeyer se introduc cte 10 ml HCl 0,1 N, 5 ml soluie de
NH3, 1-2 picturi de metiloranj i se titreaz excesul de acid cu o soluie titrat de
NaOH 0,1 N pn la virajul indicatorului de la rou la portocaliu.
Calcul:
1000ml HCl 0,1 N ................. 1,7 g NH3
vHCl FHCl - v NaOH FNaOH ...........x
x = g NH3/ 5 ml
vHCl FHCl - v NaOH FNaOH = volumul teoretic de HCl, obinut pe cale
titrimetric, ce conine cantitatea de HCl care a reacionat cu NH3 din
prob; vHCl = 10 ml; v NaOH 0,1 N = media aritmetic a volumelor de
echivalen obinute la titrarea celor 3 probe paralele.
Concentraia soluiei de amoniac se exprim n g/100 ml, adic C NH3 %(m/v) = 20 x
27
CH3 CH COOH + Na+ + HO - CH3 CH COO - + Na+ + H2 O
OH OH
H2O H+ + OH -
OH OH
Din ecuaii reiese c anionii acidului slab, rezultai prin ionizarea complet a
srii, se combin cu H+ rezultai n urma procesului de disociere a H2O . Astfel H + [ ]
[
descrete, iar OH > ] [H ] ceea ce determin reacia alcalin a soluiei. La punctul
+
de echivalen soluia are un pH > 7. n general, soluiile apoase ale srurilor acizilor
slabi cu baze tari sunt alcaline. Se alege acel indicator al crui interval de viraj conine
valoarea pH-ului soluiei srii hidrolizabile. n cazul de fa este folosit indicatorul
fenolftalein, al crui interval de viraj este cuprins ntre 8-10 uniti de pH. Aa cum se
vede n figura de mai jos, n care acidul slab este CH3COOH, folosirea unui indicator cu
28
Concentraia acidului lactic se exprim n procente mixte i se calculeaz n felul
urmtor:
1000 ml NaOH 0,1 N ............... 9 g acid lactic
v FNaOH ............................ x
x = g/10 ml c% (m/v) = 10 x
+
NH4OH + H+ + Cl- NH4 + Cl- + H2O
H2O H+ + OH-
NH+
4 + OH- NH4OH
[ ]
reaciona cu o parte din ionii de amoniu formai. Astfel OH descrete, iar H + > [ ]
[HO ] ceea ce determin reacia acid a soluiei. La punctul de echivalen soluia are
un pH < 7. Prin urmare se alege acel indicator al crui interval de viraj conine pH-ul
soluiei srii rezultate n urma titrrii (NH4Cl). n acest caz se poate folosi metiloranjul
(figura de mai jos).
29
Titrrile acizilor slabi cu baze slabe (i invers), nu produc variaii brute i mari
a pH-ului n jurul punctului de echivalen. De aceea ele sunt rar utilizate n titrimetria
acido-bazic.
Oxidimetria volumetric
Date generale
n oxidimetrie toate reaciile chimice au loc cu transfer de electroni, ele
denumindu-se oxido-reduceri sau reacii redox.
Dup reactivii utilizai oxidimetria se poate mpri n:
a) Permanganometria, care folosete drept component oxidant KMnO4.
b) Iodometrie, n care ca reactiv se folosete I2 sau I-, ca oxidant respectiv reductor,
dup caz.
c) Alte procedee [bromatometrie(KBrO3), cerimetrie (Ce(SO4)2), bicromatometrie
(K2Cr2O7), iodatometrie (KIO3)] utilizeaz compuii precizai ntre paranteze ca
oxidani.
Reaciile redox pot fi utilizate n vederea unor dozri, dac ele ntrunesc anumite
condiii:
- s fie totale n sensul dorit ( adic s fie cantitative),
- s decurg cu vitez mare, pentru ca deteminrile s se efectueze ntr-un timp scurt,
- s se poat observa uor punctul de echivalen, care arat sfritul reaciei chimice.
Grupa metodelor volumetrice bazate pe reacii redox cuprinde procedee de
determinare cantitativ, care se realizeaz prin titrarea substanelor reductoare cu
oxidani i a substanelor oxidante cu reductori.
Majoritatea reaciilor redox sunt reversibile, al cror echilibru dinamic poate fi
deplasat ntr-un sens sau altul n funcie de condiiile de lucru.
Ca n oricare alt metod volumetric i n oxidimetrie (titrimetria redox) se
urmrete atingerea punctului de echivalen care se poate indica vizual sau
instrumental. De exemplu, n permanganometrie, permanganatul de potasiu este o
substan colorat ce poate s funcioneze ca indicator, fiindc un mic exces de reactiv
produce o schimbare de culoare uor sesizabil. n cazul titrrilor iodometrice, la
punctul de echivalen poate s apar un exces de iod molecular sau s dispar acest
exces, ceea ce se poate indica cu ajutorul amidonului tiut fiind c amidonul formeaz
cu I2 un complex violet intens colorat.
30
Permanganometrie
Principii:
Permanganatul de potasiu, KMnO4, este unul dintre oxidanii cei mai folosii,
datorit potenialului de oxidare mare al sistemului MnO4-/Mn2+. Oxidarea se poate
efectua att n mediu acid ct i n mediu neutru sau alcalin. Puterea oxidant a
permanganatului scade mult cu creterea pH-lui soluiei. Reaciile care se petrec n
diferite medii sunt cele artate mai nainte la calcularea echivalenilor-gram ai KMnO4.
Rescrierea simplificat a lor pune n eviden numrul de electroni acceptai de
o molecul de oxidant:
- n mediu acid KMnO4 accept 5 electroni/molecul:
MnO4- + 8H+ + 5e- <=> Mn 2+ + 4H2O;
- n mediu neutru sau aproape neutru se transfer 3 electroni:
MnO4-+ 4H+ + 3e- <=> MnO2 + 2H2O
- n mediu alcalin, accept un singur electron:
MnO4- + e- <=> MnO4 2-
Permanganatul de potasiu cristalin este de culoare violet, aproape neagr.
Lumina, creterea temperaturii, a dilurii, a aciditii sau a alcalinitii soluiei, prezena
corpilor strini mai ales n pulbere, accelereaz descompunerea permanganatului. De
aceea soluiile de KMnO4 se pstreaz n soluie neutr, n sticle brune (la ntuneric) i
la temperatura obinuit.
31
Vacid oxalic Facid oxalic
FKMnO4 =
VKMnO4
32
Aceast reacie nu se produce direct: o pictur de soluie de permanganat nu se
decoloreaz imediat cnd este adugat ntr-o soluie coninnd exces de acid oxalic i
sulfuric. Culoarea roz a soluiei (datorat prezenei ionului MnO4-) persist, disprnd
numai dup un anumit interval de timp deoarece reacia redox corespunztoare are o
cinetic lent pn la formarea catalizatorului (Mn3+). Apoi ionii Mn3+ se reduc la Mn+2,
care este un proces instantaneu. n ultima etap manganul (II) format reacioneaz rapid
cu ionul MnO4- (VII), formndu-se Mn (III) foarte reactiv care oxideaz acidul oxalic,
finalul titrrii fiind determinat de epuizarea (COOH)2 din prob i apariia unui mic
exces de ioni MnO4- care coloreaz persistent soluia de titrat. Secvena de reacii ale
procesului autocatalitic este urmtoarea:
(1) Mn(VII) + (COOH)2 -------> Mn(III) +CO2 (lent)
(2) Mn(III) + (COOH)2 -------> Mn(II) + CO2 (instantaneu)
(3) Mn(II) + Mn(VII) ---------> Mn(III) (rapid).
n stadiul iniial viteza reaciei este controlat de etapa lent (1). De ndat ce
concentraia ionilor Mn(II) devine apreciabil, reducerea permanganatului poate s se
desfoare rapid pe calea procesului (3). Spre finalul titrrii culoarea MnO4- dispare tot
mai greu datorit scderii concentraiei acidului oxalic. Reacia este accelerat n final,
ca i la nceput, prin nclzire la 70-80C .
Modul de lucru:
n trei flacoane Erlenmeyer se msoar cte 10 ml soluie de ap oxigenat de
dozat. Se adaug cte 10 ml H2SO4 20%. Se titreaz cu soluie de KMnO4 0,1N cu
factor, FKMnO4, cunoscut pn cnd soluia rmne colorat n roz slab.
33
Calcul:
1000 ml KMnO4 0,1N sunt echivaleni cu ...................1,7 g ap oxigenat
V KMnO4 F KMnO4 ............................................................ x g ap oxigenat
x g H2O2 10 ml soluie
c% (m/v) = 10x
Iodometrie
Principiu:
Metoda se bazeaz pe sistemul redox:
I2 + 2e- <=> 2I- al crui potenial redox standard biochimic este E0 = 0,62 V (pH = 7)
n soluii de iodur coninnd ionul I3-, reacia redox i valoarea potenialului redox
standard biochimic sunt:
I3- + 2e- <=> 3 I- E0 = 0,54 V (pH=7)
n aceste reacii, iodul molecular este oxidant, iar substanele care au un
potenial redox mai mic dect + 0,54V vor fi oxidate de ctre iod i se vor putea
determina uor. Un exemplu este reacia cu tiosulfat:
I2 + 2S2O32- 2I- +S4O62- (ioni tetrationat)
Substanele care au potenial redox mai mare (substanele oxidante), cum este
ionul Fe3+, pun n libertate iodul molecular conform reaciei:
2Fe3+ + 2I- 2Fe2+ + I2
Calculul de baz al iodometriei este deci urmtorul: din cantitatea de iod eliberat
de un oxidant sau din cantitatea de I2 redus de un reductor se poate calcula cantitatea
oxidantului sau reductorului.
Sfritul reaciei dintre substana de analizat i iod, n prezen de iodur, este
determinat cu ajutorul amidonului, care formeaz un compus colorat intens albastru, de
forma [(C6H10O5)4I]4 KI. Sensibilitatea indicatorului este mare, punndu-se n eviden
circa 1,5 mg iod la litru de soluie, (10-5N) acidulat cu HCl sau H2SO4. Creterea
temperaturii soluiei de titrat sau prezena alcoolului metilic sau etilic micoreaz
sensibilitatea indicatorului.
Tot ca indicator n iodometrie se poate folosi o soluie alcoolic 0,2% de -
naftol-flavon, care cu iodul d un compus colorat tot n albastru. Acest indicator este
ns mult mai sensibil dect amidonul i se poate folosi la titrarea soluiilor mai diluate
34
de iod (10-3n) sau la titrarea iodometric a soluiilor colorate, n lumin ultraviolet
cnd, la un exces de iod, fluorescena albastr a indicatorului dispare. n acelai mod se
folosete i rodamina B, a crei fluorescen roie la lumina ultraviolet dispare n
prezena unui mic exces de iod.
VKMnO4FKMnO4
adic FNa2S2O3 =
VNa2S2O3
35
Dozarea substanelor oxidante
Din soluia de KI oxidanii pun n libertate iod elementar. Cantitatea de iod pus
n libertate este echivalent cu cantitatea substanei oxidante adugate. Iodul elementar
pus n libertate se dozeaz prin titrare cu tiosulfat de sodiu care reduce iodul la ioni de
iodur conform reaciei de mai sus.
36
Modul de lucru:
n 3 baloane Erlenmeyer se msoar cte 2 ml ap bidistilat. Se adaug cu
ajutorul micropipetei cte 0,10 ml fericianur de potasiu. Se adaug cte 1 ml soluie de
KI i 1,5 ml CH3COOH - ZnSO4. Dup 5 minute se titreaz iodul eliberat cu soluie de
tiosulfat de sodiu 0,01N n prezena de 0,2 ml amidon pn la dispariia culorii albastre.
Calcul:
1000 ml Na2S2O3 0,01N ..3,29 g K3[Fe(CN)6]
VFNa2S2O3...........................................x g
x g K3[Fe(CN)6].0,1 ml sol
c%(m/v) = 1000 x
Sistemul I2/I- se gsete n concentraie foarte mic n apa de mare (0,05 mg/l), deoarece
iodul este legat n cea mai mare parte sub form organic. Plantele marine extrag iodura
din apa de mare. Iodura se regsete n cenua acestor plante. Se mai gsete iodur n
cantiti variabile (7-46 g/m3) n apele fosile care nsoesc petrolul i, n concentraii mai
mici, n unele ape minerale.
Iodul apare, n concentraii foarte mici, n toate vieuitoarele i este indispensabil
pentru viaa acestora. La animalele superioare, iodul este concentrat n glanda tiroid
ntr-o protein numit tireoglobulin. Lipsa de iod n apa de but, n special n unele
regiuni muntoase, determin apariia, la populaia acelor regiuni, a unor maladii ale
glandei tiroide (gu).
Complexometria volumetric
37
CH2 COO- 2-
CH2 COOH
N N CH2 C O
CH2 C O
CH2 CH2
O- Na+ + Ca2+ O
O- Na+
Ca + 2 Na+ + 2H+
CH2 CH2 O
CH2 C O
N CH2 C O
N
CH2 COOH
CH2 COO -
K MY =
[ MY ]
[ M ] [Y ]
Valoarea constantei de stabilitate depinde de natura complexului i de o serie de ali
factori, cum ar fi pH-ul soluiei.
Indicatorii folosii n complexometrie sunt indicatorii metalocromici, colorani
organici, care formeaz compleci interni cu cationii metalici, de alt culoare dect
aceea a indicatorului liber.
Indicatorul trebuie s fie ales n aa fel nct stabilitatea complexului format de
el cu ionii de metal s fie mai mic dect stabilitatea complexului format agentul de
complexare cu ionii metalici. n tabelul de mai jos sunt prezentai principalii indicatori
metalocromici, cationii pentru care sunt folosii i logaritmul constantelor de stabilitate
ale lor n mediile precizate.
38
Indicator
Cationi Mediu lg KMY
metalcromic
Eriocrom negru T Cd2+ NaClO4 0,3N 12,74
Co2+ - 20,00
Cu2+ NaClO4 0,3N 21,38
2+
Mg - 7,00
Pb
2+ NaClO4 0,3N 13,19
2+ NaClO4 0,3N 12,31
Zn
Murexid Ca2+ - 2,68
Cu2+ - 3,50
Ni2+ KNO3 0,1N 3,36
Acid sulfosalicilic Al3+ NaClO4 0,2N 10,01
Cu2+ NH4ClO4 0,2N 9,04
3+
Fe 14,05
-
Ftaleincomplexon Ba, Sr, Ca
Xilenoloranj Be2+ NaClO4 3,92
Bi3+ NaNO3 0,2N 75,60
3+
La NaClO4 0,2N 11,67
Pb2+, Zn2+, - -
Hg2+, Sn2+ - -
Acid Ca2+ - -
calconcarbonic
Cromazurol S Al3+ KCl 0,2N 4,32
Cu2+ NaClO4 0,1N 4,10
Fe3+ KCl 0,1N 15,60
Ni2+ - 9,30
, `- Dipiridil Fe2+ KCl 0,1N 3,70
Zn2+ KCl 0,1N 4,35
39
Dozarea aminoacizilor prin metoda complexonometric
(metoda Budesinsky)
Principiu :
Fosfatul cupric, greu solubil n ap, reacioneaz n mediu neutru cu aminoacizii
formnd compleci de tipul chelailor. Un aminoacid monoamino-monocarboxilic
complexeaz ionii Cu2+ n raport de 2:1 formnd un complex solubil n ap. Reacia este
urmtoarea:
COOH COO R
H H
6 HC NH2 +Cu3(PO4)2 3 HC N Cu N CH + 2PO43- + 6H+
R R H H
OOC
Excesul de fosfat cupric nedizolvat se poate separa prin centrifugare sau filtrare.
Prin adugare de HCl la filtrat se elibereaz ionii cuprici din complex conform reaciei:
COO
R COOH
H H
HC N Cu N CH + 2HCl Cu2+ + 2 Cl- + 2 HC NH2
H H
R R
OOC
Ionii cuprici eliberai se dizolv prin titrare cu complexon III n prezena
indicatorului metalocromic piridilazonaftol (PAN). Reacia titrimetric de complexare
este urmtoarea:
2-
CH2 COOH CH2 COO-
N N
CH2 C O
CH2 C O CH2
CH2 O
O- Na+
- + Cu2+ Cu + 2Na+ + H+
O Na + O
CH2 CH2
CH2 C O CH2 C O
N N
CH2 COO-
CH2 COOH
40
Modul de lucru:
n trei flacoane Erlenmeyer se pipeteaz cte 5 ml soluie aminoacid, 5 ml
suspensie agitat de Cu3(PO4)2, se agit bine i apoi se las 5 minute n repaos.
Amestecul se filtreaz i din filtrate se pipeteaz cte 5 ml n trei flacoane Erlenmeyer
curate. Se adaug ctre 1 ml soluie HCl, 3 picturi indicator PAN i se titreaz ionii Cu
2+
eliberai cu o soluie de complexon III 0,01 M pn la virajul indicatorului de la rou
violet la galben-verzui.
Calcul:
Dac se cunoate natura aminoacidului prezent se ia n calcul masa molecular a
lui. Dac este vorba de un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici
rezultatul se exprim n mg N -aminic/100 ml sau mmoli N -aminic/l.
1000 ml sol. complexon III 0,01 M ....................0,01 2 14 g N
v FComplexon III ................................... .............................. x
Principii:
Soluia de reactiv formeaz cu componentul de dozat un precipitat insolubil. Din
volumul reactivului folosit pentru precipitarea complet a componentului de dozat se
calculeaz cantitatea componentului respectiv. Pot fi utilizate numai acele reacii, la
care precipitatul format are compoziie constant, reacia decurge rapid i punctul de
echivalen poate fi indicat. Fiecare metod necesit indicator aparte. Dac n cursul
titrrii se formeaz precipitat alb sau de culoare deschis, putem folosi un indicator care
cu ionul de dozat sau cu excesul reactivului d reacie de culoare sau precipitat colorat.
Dintre metodele bazate pe reacii de precipitare cea mai des utilizat este argentometria,
n care se ntrebuineaz ca reactiv AgNO3. Azotatul de argint (ionii de Ag+ ) formeaz
cu ionii Cl-, Br-, I-, SCN- precipitate practic insolubile.
Prepararea unei soluii de AgNO3 0,01N
Azotatul de argint chimic pur se deshidrateaz la 210-250C. Dup rcire se
cntrete cantitatea necesar (1,6989 g/l) se dizolv i se completeaz cu ap distilat
41
la volumul necesar. Dac nu se msoar exact cantitatea teoretic de AgNO3, soluia va
avea factorul:
Cantitatea msurat
F AgNO3 =
1,6989
42
fierbere, se adaug 2 ml alaun feric 20%. Se titreaz cu o soluie 0,01 N de NH4SCN
agitnd puternic, pn la roz slab, persistent timp de 5 10 secunde.
Calcul:
Rezultatul se va exprima n mM/l. Fiind vorba de o titrare prin diferen,
raionamentul este identic cu cel din cazul determinrii amoniacului.
Identificarea glucidelor
Reacii de reducere
Reaciile de reducere nu sunt specifice doar glucidele reductoare, ele fiind date
i de alte substane neglucidice cu caracter reductor. Caracterul reductor al
monozaharidelor i a unor dizaharide este datorat prezenei n molecula lor a funciunii
carbonilice, care se poate oxida, reducnd la cald i n mediu alcalin cationii metalelor
grele: Cu, Ag, Bi, precum i unele substane organice ca acidul picric, indigoul, etc.
1. Reacia Fehling
Principiu:
Gruparea carbonil din glucidele reductoare reduce la cald Cu2+ pn la Cu+ din
complexul solubil format n mediu alcalin cu sarea Seignette (tartrat dublu de sodiu i
potasiu). Se formeaz Cu2O, pulbere de culoare roie-crmizie, conform reaciilor:
CuSO4 + 2KOH Cu(OH)2 + K2SO4
C6H12O6 + 2 Cu(OH)2 C6H12O7 + Cu2O + 2 H2O
acid gluconic
43
2. Reacia Benedict
Principiu:
Glucidele reductoare reduc la cald n mediu alcalin hidroxidul de cupru de
culoare albastr n oxid de cupru (I) de culoare roie-crmiziu. Reacia Benedict
prezint avantajul c se folosete un singur reactiv, ionul de Cu2+ fiind complexat n
soluie de ctre citratul de sodiu.
Reactivi: - Reactivul Benedict: 173 g citrat de sodiu i 100 g Na2CO3
anhidru se dizolv n 800 ml H2O distilat fierbinte, se filtreaz i
se aduce volumul la 850 ml. Se dizolv separat 17,3 g CuSO4 5
H2O n 100 ml H2O distilat, se adaug sub agitare primei soluii
i se completeaz volumul soluiei finale la 1000 ml.
- Soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.
Mod de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie de glucid i 3 ml reactiv Benedict, se
nclzete pn la fierbere agitnd continuu. Apariia unui precipitat rou-crmiziu
implic existena n soluie a glucidului reductor.
3. Reacia Tollens
Principiu:
Glucidele reductoare reduc la cald Ag+, din azotatul de argint amoniacal, la Ag
metalic care se depune pe pereii eprubetei sub forma unei oglinzi (oglinda de argint),
conform reaciilor:
AgNO3 + NaOH AgOH + NaNO3
AgOH + 2 NH3 [Ag(NH3)2]OH
C6H12O6 + 2 [Ag(NH3)2]OH C6H12O7 + 2 Ag + 4NH3 + H2O
Reactivi: - soluie AgNO3 5% n ap distilat
- soluie NH4OH 20%
- soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 1 ml AgNO3, se adaug pictur cu pictur soluie
de amoniac pn la dizolvarea precipitatului format iniial. Se adaug 1 ml soluie
glucidic i se introduce eprubeta ntr-o baie de ap nclzit la fierbere. n cazul
44
existenei unui glucid reductor n soluia glucidic se formeaz oglinda de argint.
nclzirea eprubetei se poate face i direct la flacr sub agitare blnd.
4. Reacia Nylander
Principiu:
Gruparea carbonil din glucidele reductoare reduce azotatul de bismut n bismut
metalic de culoare neagr.
Reactivi: - Reactivul Nylander: 20 g azotat bazic de bismut, 40 g sare
Seignette i 100g NaOH se dizolv n ap pentru 1000 ml soluie.
- Soluii 2% de glucoz, fructoz, lactoz.
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucidic i 1 ml reactiv Nylander, se
nclzete pn la fierbere agitnd continuu. n prezena unui glucid reductor n soluie
apare un precipitat negru-brun.
5. Reacia Barfoed
Principiu:
Reacia Barfoed permite diferenierea monozaharidelor reductoare, pentru care
reacia este pozitiv, de dizaharidelor reductoare pentru care reacia este negativ.
Principiul reaciei const n reducerea n mediu acid a ionilor de Cu2+ la Cu+ din Cu2O,
care se depune pe fundul eprubetei sub forma unui precipitat rou-crmiziu. De fapt
reacia este potrivit att pentru monozaharide ct i pentru dizaharide reductoare.
Diferena const n vitezele de reacie foarte diferite: mari pentru monozaharide; mici
pentru dizaharidele reductoare.
Reactivi: - Reactivul Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolv n 200 ml
H2O distilat, se filtreaz i se adaug 1,8 ml acid acetic glacial.
- Soluii 2% de glucoz, fructoz
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucidic i 2 ml reactiv Barfoed, se
nclzete pn la fierbere agitnd continuu timp de 1-2 minute. Apariia unui inel de
precipitat rou-crmiziu la suprafaa soluiei i depunerea de precipitat rou-crmiziu
pe fundul eprubetei pune n eviden prezena monozaharidelor.
45
6. Reacia cu acidul picric
Principiu:
Glucidele reductoare reduc una din gruprile nitro ale acidului picric (de
culoare galben) la grupare amino, cu formare de acid picramic (de culoare brun-roie).
Reacii de culoare
Reaciile de culoare sunt specifice monozaharidelor care sub aciunea acizilor
minerali concentrai se deshidrateaz i se transform n furfurol sau n derivai ai lui.
H H
HO - C - C - OH
CHO
H2C CH - CHO
3 H2O O
O O
H H furfurol
pentoz
H H
HO - C - C - OH
HO - H2C - CHO
HO - CH2 - HC CH - CHO
3 H2O O
O O
H H
hidroximetil - furfurol
hexoz
46
Furfurolul i derivaii lui pot reaciona cu fenolii, n urma reaciei rezultnd
compui colorai.
1. Reacia Molisch
Principiu:
n prezena acidului sulfuric concentrat, monozaharidele (pentozele, hexozele) se
transform n furfurol (hidroximetil furfurol) care reacioneaz cu -naftolul n raportul
1:2 formnd produi de condensare de culoare violet. Aceast reacie o dau la cald
toate glucidele deorece, sub aciunea H2SO4 conc. ele hidrolizeaz punnd n libertate
monozaharidele.
OH
H
R CHO +
H
O H2O
OH
OH
R CH
O
OH
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 1 ml soluie glucoz 1%, se adaug 1-2 picturi din
soluia de alfa-naftol i apoi se toarn cu precauie pe peretele nclinat al eprubetei
47
H2SO4 conc. La suprafaa de contact a celor dou straturi de lichide cu densiti diferite
se formeaz un inel violet.
2. Reacia Bial
Principiu:
Reacia Bial servete la identificarea pentozelor, pentru care reacia este
pozitiv, fa de hexoze, ea fiind negativ.
n prezena acizilor minerali tari, pentozele reacioneaz cu orcina (5-metil-
rezorcina) formnd produi de condensare de culoare violet sau albastru-verde n
funcie de natura acidului folosit.
Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcin se dizolv n 200 ml alcool etilic 96%
i se adaug 40 picturi sol. FeCl3 10%
- HCl conc.
- soluie 1% de fructoz, arabinoz, glucoz
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduc 2 ml sol. de pentoz, iar n alt eprubet 2 ml soluie
de glucoz. Se adaug n fiecare eprubet 10 picturi reactiv Bial i cte 2 ml HCl conc.
Se agit coninutul eprubetelor, se astup cu dopuri de vat i se las ntr-o baie de ap
ce fierbe timp de 10 minute. Coninutul eprubetei n care se gsete soluia de pentoz
devine albastru-verzui.
3. Reacia Seliwanoff
Principiu:
Reacia Seliwanoff servete la diferenierea cetozelor de aldoze. Monozaharidele
n prezena HCl conc. reacioneaz cu rezorcina (sau ali polifenoli) formnd produii
de condensare colorai. Reacia este mai rapid i mai intens n prezena cetozelor,
cnd se obin produi colorai n rou dect n prezena aldozelor, cnd se obin produi
colorai n roz deschis.
Reactivi: - reactivul Seliwanoff: 0,15 g rezorcin, 100 ml HCl conc., 200
ml H2O distilat.
- soluie de fructoz, glucoz 2%
Modul de lucru:
ntr-o eprubet se introduce 1 ml soluie fructoz i n alt eprubet 1 ml soluie
de glucoz. Se adaug n ambele eprubete cte 2 ml reactiv Seliwanoff i se nclzesc
48
probele pn la fierbere. Dup rcire, coninutul eprubetei cu fructoz se coloreaz n
rou, iar a celei cu glucoz n roz slab.
Reacia cu fenilhidrazina
Principiu:
Reacia glucidelor reductoare cu fenilhidrazina decurge n dou etape:
- la rece, se formeaz fenilhidrazina
- la cald, n prezena unui exces de reactiv, se formeaz osazona specific
glucidului folosit. Cetonele reacioneaz ca i aldozele. Prin RMN s-a
dovedit c osazonele au o structur chelatic ciclic.
Reactivi: - fenilhidrazin solid
- CH3COONa H2O
- acid acetic glacial
- soluii 10% de glucoz, lactoz, maltoz
Modul de lucru:
Se introduc cte 5 ml soluie de glucoz, lactoz i maltoz n cte o eprubet, se
adaug 0,5 ml acid acetic glacial, puin fenilhidrazin i o cantitate dubl de acetat de
sodiu. Se agit i se introduc eprubetele ntr-o baie de ap la fierbere timp de 1/2 de or.
49
Dup rcire apar cristalele galbene specifice, care se vor examina la microscop, punnd
1-2 picturi din fiecare prob pe o lamel de sticl.
H H
C = O C = N - N H - C 6H5
+ H2N - N H - C 6H5
HC - O H fe n ilh id r a z in HC - O H
H2O
R R
fe n ilh id r a z o n
g lu c id
r e d u c to r
C = N - N H - C 6H5
+ H2N - N H - C 6H5
H -C - O H
N H3
R C 6H5 - N H2
H
C = N - N H - C 6H5
C = O
C = N - N H - C 6H5
+ H2N - N H - C 6H5
C = O fe n ilh id r a z in
H2O
R
C = N - N H - C 6H5
C = N - N H - C 6H5
o s a zo n
Identificarea dizaharidelor
Dizaharidele pot fi reductoare - maltoz, lactoz sau nereductoare - zaharoza.
Dup o prealabil hidroliz a legturii glicozidice i cele nereductoare vor da reaciile
caracteristice de reducere i culoare ale monozaharidelor.
50
Reactivi: - reactiv Benedict
- reactiv Barfoed
- acid clorhidric 10%
- hidroxid de sodiu 10%
- soluii 2% de zaharoz, lactoz, maltoz
Modul de lucru:
Se introduc cte 2 ml soluie maltoz, zaharoz i lactoz n cte o eprubet, se
adaug 2 ml reactiv Benedict i se nclzesc soluiile pn la fierbere. Reacia este
pozitiv n cazul maltozei i a lactozei care sunt dizaharide reductoare. ntr-o alt
eprubet se introduc 2 ml zaharoz, 3 picturi HCl 10% i se aduce soluia la fierbere.
Dup rcire se neutralizeaz cu 3 picturi de NaOH 10%, se adaug apoi 2 ml reactiv
Benedict i se nclzete din nou la fierbere. Reacia va fi pozitiv pentru c n urma
hidrolizei au rezultat dou monozaharide reductoare.
Identificarea polizaharidelor
Principiu:
Polizaharidele cu importan biologic - amidonul, dextrinele, glicogenul -
formeaz cu iodul la rece combinaii colorate diferit:
- amidonul cu iodul - albastru
- dextrinele cu iodul - brun-rou clar
- glicogenul cu iodul - crmiziu opalescent
Aceste combinaii sunt termolabile, la cald culoarea dispare i reapare la rcire
ceea ce sugereaz termodisocierea lor.
Reactivi: - soluie apoas de iod: se amestec 0,2 g I2 cu 1 g KI i 2 ml ap
distilat. Dup dizolvare se completeaz la 100 ml cu ap
distilat.
- soluii 2% de amidon, dextrine, glicogen
Modul de lucru:
Se introduc cte 2 ml soluie amidon, dextrin, glicogen n cte o eprubet. Se
adaug apoi 1-2 picturi soluie de iod i se observ culorile obinute. Se verific
dispariia culorilor prin nclzirea eprubetelor i reapariia lor la rcire.
51
Identificarea glucidelor
1. Reacia cu iod
pozitiv negativ
glucid reductor glucid nereductor
soluie fr glucid
3. Reacia Barfoed
4'.Reacia Benedict
pozitiv negativ maltosazona lactosazona
pentoze hexoze
pozitiv negativ
zaharoza sol.fr glucid
5. Reacia Selivanov
pozitiv negativ
fructoz glucoza
52
Identificarea aminoacizilor i proteinelor
Reacii de culoare
Reaciile de culoare nu sunt specifice moleculei proteice ca un tot, ci sunt date
de prezena n molecula proteic a unor componente structurale, cum ar fi legturile
peptidice n cazul reaciei biuretului sau prezena unor anumii aminoacizi n cazul
celorlalte reacii.
Reacia biuretului
Principiu:
Substanele care conin legturi peptidice (ncepnd cu tripeptidele) reacioneaz
cu Cu2+ n soluie puternic alcalin dnd o coloraie caracteristic violet, purpurie,
datorit formrii unui complex colorat n care ionul Cu2+ este unit prin legturi
coordinative cu heteroatomi ai aminoacizilor angajai n legtura peptidic. Aceast
reacie se folosete i pentru dozarea substanelor proteice prin metod
spectrofometric.
Simboliznd cu Ri respectiv Ri+1 radicali ai aminoacizilor legai prin legtura
peptidic, aceast legtur se poate reprezenta n felul urmtor:
Cel mai simplu compus care d aceast reacie este biuretul, de unde i numele
reaciei. Formula biuretului este:
53
Reacia ninhidrinei
Principiu:
Ninhidrina (tricetohidrindenhidrat) reacioneaz cu aminoacizii n soluie
apoas, neutr sau slab alcalin i la cald, cu formarea unui compus colorat. Coloraia
variaz pentru diverii aminoacizi de la roz, rou la albastru-violet (purpura lui
Ruhemann) i este galben pentru prolin, galben-brun pentru hidroxiprolin. Aceast
reacie este dat nu numai de aminoacizi, ci i de peptide i proteine. Reacia cu
ninhidrin este una din reaciile generale folosite pentru identificarea i dozarea
aminoacizilor n special la metoda cromatografic.
Reactiv: - Sol. de ninhidrin 0,1% cu adaos de piridin.
Mod de lucru:
La 2-3 ml soluie de cercetat se adaug 0,5 ml soluie de ninhidrin, se nclzete
soluia la fierbere cca 30 secunde, apoi se rcete. Se observ formarea unei coloraii
albastru-violet (fiindc se lucreaz cu un amestec de aminoacizi).
Reacia xantoproteic
Principiu:
Aceast reacie este caracteristic aminoacizilor aromatici. Astfel fenilalanina,
tirozina, triptofanul dau o coloraie galben la nclzire cu acidul azotic concentrat.
Reacia este datorat nitrrii nucleului benzenic, respectiv imidazolic. Se poate da ca
exemplu reacia fenilalaninei cu acidul azotic:
54
galben. La fierbere precipitatul se poate dizolva parial sau complet. Dac dup rcire
soluia se alcalinizeaz, culoarea se intensific, se schimb n galben portocaliu.
Apariia petelor galbene pe piele n urma aciunii acidului azotic concentrat se explic
tot prin reacia xantoproteic.
Reacia Adamkiewicz-Hopkins-Cole (reacia triptofanului)
Principiu:
Triptofanul (aminoacid care se gsete n aproape toate proteinele) d cu acidul
glioxilic (OHC-COOH) o coloraie violet. Se folosete ca reactiv acidul acetic glacial,
care conine ca impuritate acid glioxilic.
Reacia este specific nucleului indolic, astfel produii obinui prin
descompunerea triptofanului (indolul i derivaii si) dau i ei reacia pozitiv.
Reactivi: - Acid acetic glacial
- Acid sulfuric concentrat
Mod de lucru:
La 2 ml soluie de cercetat se adaug 2 ml acid acetic glacial, se amestec i se
introduc pe fundul eprubetei 2 ml H2SO4 concentrat. La suprafaa de separaie se
formeaz un inel violet. Reacia se folosete n laboratoarele clinice pentru diferenierea
meningitei tuberculoase de meningitele de alt etiologie, aceast reacie fiind pozitiv
numai din lichidul cefalo-rahidian al pacienilor cu meningit tuberculoas. Meningita
este inflamaia membranelor care nvelesc creierul i mduva spinrii.
55
Reacia Pauli (reacia histidinei i tirozinei)
Principiu:
Tirozina, histidina i proteinele coninnd aceti aminoacizi, formeaz prin
cuplare cu acidul diazobenzensulfonic, un colorant azoic roz care se intensific la rou
prin alcalinizare. Sinteza srii de diazoniu are loc prin reacia:
CH2
Colorant
I
azoic
H - C - NH2
I
- +
COO Na
Mod de lucru:
Se diazoteaz 1 ml soluie de acid sulfanilic adugnd 1 ml soluie de nitrit de
sodiu. Se amestec acidul diazobenzensulfonic obinut cu 1 ml soluie de cercetat i
dup neutralizare cu 3-4 ml soluie de Na2CO3 (sau cteva picturi de NaOH) se obine
o coloraie roie.
56
Reacia Sakaguchi (reacia argininei)
Principiu:
Soluiile care conin substane cu radicalul guanidinic n molecul, dau n mediu
alcalin n prezena alfa-naftolului i a hipocloritului sau hipobromitului de sodiu
combinaii colorate n rou.
Reactivi: - Soluie de hipoclorit de sodiu
- Soluie alfa-naftol: se dizolv 0,1 g alfa-naftol n aprox. 25 ml
alcool etilic i se dilueaz cu ap la 100 ml.
- Soluie de NaOH 10%
Mod de lucru:
Se ia ntr-o eprubet 1 ml soluie proteic diluat i se alcalinizeaz cu 1 ml
soluie NaOH 10%. Se adaug 1 ml soluie alfa-naftol i soluia de hipoclorit de sodiu
pictur cu pictur pn la apariia unei culori viinii. Culoarea dispare la cald.
Principiu:
Proteinele sunt precipitate de acizi minerali (H2SO4, HNO3, HCl) sau organici
(acid tricloracetic, tanic, ferocianic, sulfosalicilic), soluii concentrate de sruri (sulfat
de sodiu, sulfat de amoniu, etc.), alcooli (metanol, etanol, etc.), aceton, ioni de metale
grele (sruri de argint, mercur, cupru, plumb), nclzire. Precipitarea poate fi reversibil
sau ireversibil.
Precipitarea salin
Principiu:
Proteinele sunt macromolecule hidratate n soluie apoas. Dac srurile
metalelor uoare sau de amoniu (sulfat de amoniu, sulfat de sodiu, clorur de sodiu,
sulfat de magneziu) adugate soluiilor proteice ating o anumit concentraie,
deshidrateaz particulele proteice, care precipit. Precipitatul de protein obinut prin
precipitare salin poate fi redizolvat prin micorarea concentraiei srii (prin dializ,
diluare), deci este o precipitare reversibil.
Deoarece proteinele precipit la concentraii diferite de sruri, precipitarea salin
(salting-out) poate fi folosit i pentru fracionarea proteinelor. Astfel globulinele
57
precipit n soluii semisaturate de sulfat de amoniu, iar albuminele numai n soluii
saturate de sulfat de amoniu.
Reactivi: - Sol. de protein (ser sanguin uman, bovin sau cabalin)
- Sol. saturat de (NH4)2SO4
- (NH4)2SO4 solid
- NaCl solid
- MgSO4 solid
- Acid acetic glacial
Mod de lucru:
ntr-o eprubet se toarn 3 ml soluie de protein. Se adaug acelai volum de
soluie saturat de sulfat de amoniu. Astfel obinem o soluie semisaturat de
(NH4)2SO4. Dup cteva minute precipit globulinele. Precipitatul se separ prin
filtrare. Filtratul conine albuminele. Se pune n filtrat sulfat de amoniu solid pn la
saturare (cnd noi cantiti de sare nu se mai solv). n aceast soluie vor precipita
albuminele.
n dou eprubete se toarn cte 3 ml soluie de protein. ntr-una din eprubete se
adaug NaCl, n cealalt MgSO4, pn la saturare. Dup cteva minute n ambele
eprubete precipit globulinele. Precipitatul se filtreaz. Filtratul conine albuminele
deoarece srurile adugate nu precipit albuminele n soluie neutr. Filtratul se
aciduleaz cu cteva picturi de acid acetic glacial. n aceast soluie slab acid
precipit albuminele.
58
Mod de lucru:
n 4 eprubete se toarn cte 1 ml soluie de protein. n fiecare eprubet se
adaug pictur cu pictur soluie din fiecare reactiv. n toate eprubetele se formeaz
precipitate. Acetatul de plumb i sulfatul de cupru nu trebuiesc adugate n exces,
deoarece precipitatul format se solv n exces de reactiv (salting-in).
59
Precipitarea prin nclzire
Principiu:
Proteinele la nclzire coaguleaz. Coagularea este cea mai rapid la punctul
izoelectric. n mediu puternic acid sau bazic proteinele nu coaguleaz la nclzire,
deoarece sarcina electric le confer o mai mare stabilitate n stare dizolvat.
Reactivi: - Sol. de CH3COOH 1%
- Sol. de CH3COOH 10%
- Sol. de NaOH 10%
- NaCl crist.
Mod de lucru:
n 5 eprubete se toarn cte 1-2 ml soluie de protein. Se adaug reactivi
conform tabelului.
60
- + - +
R - CH - COO + H + NaOH R - CH - COO Na + H2O
I I
N = CH2 N = CH2
pH
14
61
Calcul:
ntruct se lucreaz cu un aminoacid oarecare monoamino-monocarboxilic sau
cu un amestec de aminoacizi monoamino-monocarboxilici, nu putem folosi greutatea
molecular la calcul. Din acest considerent rezultatul se exprim n mg % azot alfa-
aminic sau n mmoli N aminic/l. Dac volumul mediu de titrare a probelor se noteaz cu
Vm, calculul este urmtorul:
1 ml NaOH 0,1 N . . . . . . . . . . . .1,4 mg N aminic
Vm FNaOH . . . . . . . . . . . . . . X mg . . . . . . 10 ml prob
Y mg . . . . . .100 ml prob
100
Y = 10 X mg N % = X mmoli N aminic/l.
14
Identificarea nucleoproteinelor
Principiu:
Scheletul structural al acizilor nucleici este construit din baze azotate, pentoze i
acid fosforic. Prin hidroliz acid aceste aceste subuniti se elibereaz i pot fi puse n
eviden
Reactivi: - Sol de H2SO4 5%
- Sol. de NH3 10%
- HNO3 conc.
- Sol. de molibdat de amoniu
- Sol. amoniacal de AgNO3
- Reactiv Bial
- HCl conc.
Modul de lucru:
a) Hidroliza: ntr-un balon cu fund rotund se introduc 5-10 g drojdie de bere, la
care se adaug 40 ml H2SO4 5%. Se astup balonul cu un dop prevzut cu un refrigerent
ascendent i se fierbe 60-90 minute. O parte din hidrolizat se filtreaz i se mparte n 3
eprubete n care se identific prile componente ale acizilor nucleici.
b) Identificarea pentozelor: n prima eprubet se adaug 10 picturi reactiv Bial
i 2 ml HCl conc. Se agit coninutul eprubetei se astup cu un dop de vat i se las pe
o baie de ap ce fierbe timp de 10 minute. Coninutul eprubetei se coloreaz n albastru
verde.
62
c) Identificarea H3PO4: In a doua eprubet se adaug soluie de NH3 pn la
reacia slab alcalin, apoi cteva picturi de HNO3 conc., 1 ml soluie de molibdat de
amoniu. La nclzire se obine un precipitat galben de fosfomolibdat de amoniu.
d) Identificarea nucleobazelor: n a treia eprubet se adaug soluie de NH3 pn
la reacia alcalin, se filtreaz i se adaug cca. 1 ml soluiei amoniacal de AgNO3.
Dup ctva timp se formeaz un precipitat floconos galben-brun de sruri ale bazelor
purinice. Identificarea bazelor purinice din hidrolizat se poate face i cu ajutorul reaciei
murexidului. Murexidul este un colorant provenit din produsul de oxidare cu HNO3
conc. a bazelor purinice i amoniac.
Modul de lucru:
1-2 picturi din soluia de analizat se usuc pe o plac de porelan pe baie de
ap. Cu baghet se adaug o pictur de HNO3 conc. Dup evaporare se atinge cu o
baghet nmuiat n amoniac. Apare o coloraie roie care se schimb spre albastru
violaceu cnd se adaug o pictur de NaOH.
Vitamine
Principiu:
Cromatografia este o metod fizico-chimic de separare a componenilor unui
amestec, care utilizeaz fenomenele ce au loc la interfaa a dou faze. Ea poate fi
folosit n scopuri analitice sau preparative. Pe suprafaa dintre dou faze dintre care
una este staionar (faza solid sau lichid adsorbit pe un material poros) i una
mobil (solvent lichid sau gaz) pot avea loc fenomene de adsorbie, schimb de ioni sau
partiie ntre dou faze lichide nemiscibile.
Faza staionar la cromatografia n strat subire este constituit dintr-un strat de
silicagel sau oxid de aluminiu n stare dispers depus pe o lam de sticl. Developarea
se face cu un solvent apolar (benzen, toluen, petrol) sau un amestec de solveni apolari.
Dac substanele cromatografiate sunt incolore, decelarea petelor (spoturilor)
formate pe placa cromatografic se face cu ajutorul unor reactivi care dau reacii de
culoare cu substanele amintite.
Identificarea componenilor se poate face:
63
- prin decuparea spoturilor i analiza lor ulterioar prin metode chimice sau fizice.
- prin aplicarea simultan pe plac a substanelor etalon, spotul format de o anumit
substan cunoscut se va gsi dup developare la aceeai distan de punctul de start ca
i acela dat de componentul identic din amestec.
- prin determinarea valorii (raportul dintre distana parcurs de spot i de frontul
solventului n acelai interval de timp) Rf este caracteristic pentru fiecare substan n
condiii de lucru standardizate.
Modul de lucru:
a) Pregtirea plcii cromatografice
Se prepar prin agitarea silicagelului n alcool etilic (2 g silicagel, 6 ml alcool) o
suspensie care se toarn pe suprafaa unei plci de sticl. Prin micarea plcii se ntinde
ct mai uniform suspensia i se continu micarea plcii pn cnd prin evaporarea
alcoolului mobilitatea suspensiei scade i suspensia rmne nemicat. Dup uscarea
complet a plcii laturile longitudinale se terg pe o lime de 0,5 cm.
b) Aplicarea amestecului de analizat
La o distan de 1 cm de la unul din capetele plcii, cu ajutorul unei capilare se
aplic soluia de cercetat precum i soluiile etalon din vitamine urmrite. Diametrul
maxim admis al probelor aplicate este cca. 5 mm. Cantitatea minim de vitamin
aplicat este aproximativ 3 g.
c) Developarea
Plcile se introduc ntr-un vas cu toluen cu captul pe care s-au aplicat soluiile,
aezat n solvent. Placa n timpul developrii are o poziie nclinat la 20-30 fa de
orizontal. Solventul migreaz prin capilaritate de-a lungul stratului de adsorbant.
Pentru a mpiedica evaporarea, cromatografia se face ntr-o atmosfer saturat cu
vaporii solventului, adic vasul este ermetic nchis.
d) Localizarea petelor
Dup uscarea plcilor, componentele migrate sunt evideniate cu ajutorul unui
strat subire de H2SO4 98% turnat pe plac cu ajutorul unei pipete n aceeai parte n
care au fost aplicate probele. Poziia plcii trebuie s asigure deplasarea acid sulfuric n
sensul n care s-a fcut developarea. Vitaminele liposolubile n contact cu acid sulfuric
se coloreaz astfel: vitamina A albastru-violet, - carotenul albastru, vitamina D2
galben-portocaliu, vitaminele E, K1, K2, K3 brun.
64
Dozarea iodometric a acidului ascorbic din urin
(metoda Palladin)
Principiu:
Acidul ascorbic este oxidat n mediu acid de I2 la acid dehidroascorbic
O O
C C
HO C O C
O + I2 O + 2HI
HO C O C
HC HC
HO CH HO CH
CH2OH CH2OH
65
Calculul: se efectueaz innd cont de faptul c 1ml soluie KIO3 0,004N
corespunde la 0,352mg acid ascorbic (M. acid ascorbic =176). Rezultatul se raporteaz
la 100g produs analizat sau la cantitatea de urin eliminat in 24 ore.
Valori normale 50-150 mol/zi (10-30mg/zi). Variaiile lor nu sunt concludente
din punct de vedere clinic. De aceea se folosete proba ncrcrii cu acid ascorbic.
Se administreaz intravenos 1000mg acid ascorbic i dup ce se colecteaz urin
timp de 5 ore, adugnd la fiecare fraciune de urin cte 10% acid acetic glacial.
n mod normal se elimin in 5 ore cel puin 400mg acid ascorbic. O eliminare
mai sczut pledeaz pentru hipovitaminoz sau avitaminoz C.
Enzime
Introducere
Enzimele, biocatalizatori proteici, sunt produse de materia vie i prezena lor
este necesar pentru desfurarea reaciilor chimice n toate sistemele biologice.
Enzimele au i nsuiri ale catalizatorilor utilizai n reaciile chimice din lumea nevie.
Ele sunt ns superioare acestor catalizatori n mai multe privine:
a) Asigur reaciilor chimice pe care le catalizeaz viteze cu cteva ordine de
mrime mai mari,
b) Reaciile pe care le catalizeaz au loc n condiii blnde: temperatur sub
50C, presiune atmosferic, pH n jurul valorii 7, for ionic moderat. Comparativ,
catalizatorii chimici acioneaz la temperaturi ridicate, presiuni mari i valori extreme
de pH;
c) Au specificitate foarte mare ceea ce asigur ca n reaciile pe care le
catalizeaz s nu participe dect substraturile pentru care enzimele sunt specifice.
Multe enzime au i nsuiri nentlnite la catalizatorii chimici cum sunt:
a) Activitatea lor poate fi reglat (mrit sau micorat) de anumii efectori;
b) Catalizeaz reacii endergonice imposibile d.p.d.v. termodinamic prin
transferul energiei libere necesare de la reacii exergonice.
Cinetica enzimatic studiaz viteza reaciilor catalizate de enzime n funcie de
concentraia substratului [S], de concentraia enzimei [E] i de influenele unor factori
fizico-chimici cum sunt: temperatura, pH-ul, cofactori, etc. Concepia unanim admis n
enzimologie c formarea din substrat a produsului de reacie implic existena
complexului enzim-substrat (ES), redat prin ecuaia:
66
K1 K3
E + S ES ------> E + P,
K2
a fost statuat n primul rnd innd cont de alura dependenei vitezei reaciilor
catalizate de enzime de concentraia de substrat (Leonor Michaelis i Maud Menten,
1913).
Din punct de vedere al localizrii enzimele se clasific n:
Enzimele secretate cu rol activ n plasm, ca de exemplu:
a) enzimele plasmatice funcionale, produse n special n ficat (ceruloplasmina)
b) enzimele coagulrii, lipoproteinlipaza (LPL), lecitin-colesterol-aciltransferaza
(LCAT).
Nivelul lor plasmatic scade cu lezarea celulelor productoare.
Enzimele secreto-excretate, provenind din glandele exocrine i pancreas. Ele
sunt excretate i acioneaz la nivelul tubului digestiv, de exemplu amilaza, lipaza,
tripsina. Activitile lor cresc n plasm prin lezarea celulelor de origine sau prin
prezena unui obstacol la nivelul cilor excretorii precum i prin creterea
permeabilitii membranei celulelor secretorii;
Enzimele celulare cu loc de aciune n celulele din care provin, a cror activitate
plasmatic crete prin lezarea celulelor de origine. Exemple sunt glutamic-oxalacetic
transaminaza (GOT), glutamic-piruvic transaminaza (GPT), lactat dehidrogenaza
(LDH), fosfataza alcalin i acid, creatin kinaza (CK), etc.
Concentraia majoritiilor enzimelor celulare este constant n timp. Fac
excepie enzimele inductibile/represibile i enzimele plasmatice funcionale intracelular
cum ar fi CK (creatin kinaza), GOT, LDH, GPT, GDH (glutamat dehidrogenaza), GT
(-glutamil-transaminaza), SDH (sorbitoldehidrogenaza), OTC (ornitin transcarba-
milaza) fosfatazele acid i alcalin, ale cror concentraii cresc sau scad n anumite
stri patologice (leziuni de esut).
Din punct de vedere medical, enzimologia contribuie astzi n msur
hotrtoare la cunoaterea cauzelor a numeroase boli, diagnosticul i urmrirea evoluiei
acestora, elaborarea pe baze tiinifice a medicamentelor.
67
Influena concentraiei substratului asupra
vitezei de reacie enzimatic
68
v = vmax
[S ] unde KM, constanta lui Michaelis.
K M + [S ]
Principiu:
n determinarea experimental se va folosi ca substrat ureea i ca enzim ureaza
din boabe de soia. Ureaza catalizeaz urmtoarea reacie:
NH 2 ureaz
O=C + H 2O CO2 + 2NH 3
NH 2
Viteza de reacie este proporional cu cantitatea de amoniac eliberat n unitatea de timp
(1min). Aceasta se determin prin titrare cu o soluie de HCl cu factor cunoscut.
HCl + NH3 ---------> NH4Cl
Cunoscnd concentraiile substratului din probe care se consider constante pe parcursul
fazei de incubaie i calculnd vitezele de reacie, exprimate n moli uree transformai
ntr-un minut, pe baza datelor titrimetrice se face reprezentarea grafic (v, [S]) din care
se poate calcula KM pentru ureaz.
69
Modul de lucru:
Calculul:
1mol HCl........................................1 mol NH3..................1/2moli uree
1000 ml HCl N/20............................................. ........._____1_____moli uree
2.20
(ai-m) ml..............................................................................xi____________
xi = (ai-m)25 moli uree transformai n 25 minute
vi = (ai-m)25/25 = ai-m moli uree/ 1 min.
Reprezentarea grafic
Pe un sistem rectangular de axe de coordonate trasat pe hrtie milimetric se
aplic pe ordonat o scar a valorilor vitezelor de reacie. Pe abscis se trec
concentraiile molare ale ureei din cele ase probe menionate n tabel. Se reprezint
grafic punctele (vi, [S]). Curba hiperbolic se traseaz printre punctele experimentale.
Poriunea dreapt, paralel cu abscisa (corespunztoare saturrii E cu S), se prelungete
pn la intersecia cu ordonata, intersecia corespunznd valorii vmax. La valoarea vmax/2,
se duce o dreapt paralel cu abscisa pn la intersecia cu curba i de la aceast
intersecie se duce o dreapt paralel cu ordonata pn la intersecia cu abscisa. Acest
punct corespunde valorii KM (concentraia de substrat corespunztoare semi-vitezei
maxime). Ea este ntr-o prim aproximaie constanta de disociere a complexului
enzim-substrat (ureaz-uree). Deci, se stabilesc (1) vmax, (2) vmax/2 i (3) KM.
70
71
Interpretarea rezultatelor
Valorile mari ale KM corespund unei legturi slabe ntre E i S iar valorile mici
ale KM corespund unei legturi puternice ntre E i S. Valorile lui KM pentru diverse
enzime sunt cuprinse ntre 10-1- 10-6 moli/litru. n cazul ureazei, KM10-2 moli/litru
ceea ce plaseaz aceast enzim n rndul celor cu afinitate (constant de stabilitate a
complexului E-S) mic fa de substrat.
-2 - 2e 0 x5
O2 O2
72
Calculul:
Volumul mediu de titrare pentru probe (bm) este mai mic dect cel pentru martori
(am) deoarece catalaza descompune o parte din apa oxigenat din probe.
(am-bm)FKMnO4 --------------------------------------------------------------x
Principiu:
Transaminazele catalizeaz reacia de transfer a gruprii amino de la un alfa-
aminoacid la un alfa-cetoacid. Transaminazele cu cea mai mare importan clinic sunt:
glutamic-oxalacetic-transaminaza (GOT, aspartat aminotransferaza-AST) i glutamic-
piruvic-transaminaza (GPT, alanin aminotransferaza-ALT). Acestea catalizeaz
urmtoarele procese reversibile:
glutamat piruvat
oxaloacetat
GOT GPT
(AST) (ALT)
73
GOT este o enzim localizat n proporie de 60% n citoplasm i 40% n
mitocondrii, n special n muchiul scheletic, miocard i ficat. n reacia catalizat de
GOT se folosete ca substrat amestecul aspartat--cetoglutarat din care rezult
oxalacetat i glutamat. Oxalacetatul se decarboxileaz spontan trecnd n piruvat.
Piruvat rezult i din reacia catalizat de GPT avnd ca substrat amestecul
alanina--cetoglutarat Piruvatul rezultat din aceste reacii reacioneaz cu 2,4-dinitro-
fenil-hidrazina n mediu alcalin dnd dinitro-fenil-hidrazona corespunztoare de culoare
roie, care se determin fotometric:
74
- Soluie standard de piruvat de sodiu 2 mM: se dizolv n 100 ml ap
bidistilat 22 mg piruvat de sodiu (1 ml soluie conine 2 moli
piruvat). Se adaug 0,3 ml cloroform pentru conservare.
- Soluie NaOH 0,4N
Modul de lucru:
Att pentru GOT ct i pentru GPT se pregtesc cte trei eprubete: prob (P),
standard (S) i blanc (B).
GOT GPT
P S B P S B
Sol.substrat GOT (ml) 0,5 0,5 0,5 - - -
Sol.substrat GPT (ml) - - - 0,5 0,5 0,5
Se incubeaz 5 minute la 37C
Ser (ml) 0,1 - - 0,1 - -
Sol.standard PIR (ml) - 0,1 - - 0,1 -
Se incubeaz la 37C 60 minute 30 minute
Sol.2,4-dinitrofenilhidrazin (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Ser (ml) - - 0,1 - - 0,1
Sol.NaOH 0,4 N (ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Calcul:
tiind c soluia standard conine 0,2 moli piruvat /0,1 ml se calculeaz
cantitatea de piruvat rezultat din reacia pentru fiecare enzim i se exprim activitatea
enzimatic n moli piruvat format/min./1000 ml ser (n condiiile de lucru) i se
noteaz cu X:
75
comparaie cu datele obinute cu metoda de referin, care exprim activitatea
enzimatic real, msurnd spectrofotometric n UV transformarea NADH + H+ in
NAD+, n prezena enzimelor indicatoare: malat-dehidrogenaza (MDH) n amestec cu
GOT i lactat-dehidrogenaza (LDH) n amestec cu GPT.
Reaciile enzimatice sunt urmtoarele:
GOT
Din tabelul de corecie se citete activitatea enzimatic real (determinat prin metoda
enzimatic) exprimat n Uniti Internaionale (UI = moli/min./l, 25C) care
corespunde valorilor X calculate.
UI UI UI UI
X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT X GOT GPT
2 2 1 26 23 9,5 54 60 23 80 38
4 3 2 28 25 10 56 24 82 39
6 5 2,5 30 27 11 58 25 84 40
8 6 3 32 29 12 60 26 86 42
10 7 4 34 31 13 62 27 88 44
12 9 4,5 36 33 14 64 29 90 46
14 11 5 38 35 15 66 30 92 48
16 13 6 40 37 16 68 31 94 50
18 15 7 42 39 17 70 33 96 52
20 17 7,5 44,46 41,44 18,19 72 34 98 54
22 19 8 48 47 20 74 35 100 56
23 20 8,5 50 51 21 76 36 102 60
24 21 9 52 55 22 78 37
Observaii:
1. Dac activitatea enzimatic depete 60 UI se va repeta determinarea cu incubaie
scurt: 20 de minute pentru GOT si 10 minute pentru GPT. Rezultatele obinute se
vor nmuli cu 3. Este de preferat ca n locul scurtrii timpului de incubaie s se
76
fac diluii ale serului 1:5, 1:10, 1:20 n ap distilat i se reia cu fiecare diluie
tehnica de lucru de la nceput. La calcul se ine seama de diluie.
2. Sticlria utilizat trebuie s fie perfect curat, splat n final cu mult ap distilat,
deoarece urme de detergeni pot inhiba considerabil activitatea enzimatic.
Interpretarea valorilor obinute
Valori normale: GOT: Aduli: 2-20 UI. Copii sub 3 luni: pn la 40 UI
GPT: Aduli: 2-16,5 UI. Copii pn la 5 ani: 0,2-13 UI
Valori patologice: n cazul leziunilor celulare mai uoare crete activitatea GPT,
ea fiind o enzim citoplasmatic, iar n cazul leziunilor mai grave crete i activitatea
GOT (GOT este prezent i n microsomi)
GOT : - creteri marcate ( 10-100 ori ) n: infarct miocardic, hepatit viral acut,
necroza toxic a ficatului
- creteri moderate n: hepatite cronice, icter mecanic, mononucleoza infecioas,
anemii hemolitice, boli ale musculaturii striate
GPT: - creteri marcate ( ~ 100 ori ) n: hepatita viral acut, necroza toxic a ficatului
- creteri moderate n: hepatite cronice, ciroz, mononucleoza infecioas,
hepatita de staz cardiac.
Raportul de Ritis: GOT/GPT ~ 1,2-1,3. n leziunile inflamatorii ale ficatului
acest raport scade datorit creterii mai mari ale activitii GPT. n leziunile necrotice
raportul crete datorit creterii mai marcate a activitii GOT.
77
Fosfatazele alcaline sunt foarte rspndite n corpul animal. Cele mai bogate
surse sunt: epiteliul intestinal, prile n cretere ale oaselor, rinichi, glandele mamare,
leucocite.
Principiu:
Sub aciunea catalitic a fosfatazei alcaline serice glicerolfosfatul de sodiu
este hidrolizat eliberndu-se fosfat monosodic.
CH O P OH + HOH CH OH + NaH2PO4
O
CH2 OH CH2 OH
78
balon cotat de 1000 ml, se adaug cteva picturi de cloroform drept conservant.
Aceast soluie conine 1 mg de fosfor / 1 ml.
Curba de etalonare
Pentru realizarea curbei de etalonare, se dilueaz de 50 de ori soluia etalon,
astfel 1ml soluie conine 20 g fosfor. Se msoar ntr-o serie de eprubete 0,5; 1; 2; 3;
4 i 5 ml din aceast soluie standard. La fiecare prob se adaug cte 2 ml acid
tricloracetic 20% i ap pn la 10 ml. Dup amestecare, din acest amestec se msoar
cte 5 ml ntr-o alta eprubet, dup care se adaug 2 ml molibdat de amoniu 2,5%, 1 ml
hidrochinon i 2 ml sulfit de sodiu. Dup 5 minute se citete exticia i se reprezint
grafic lund pe ordonat extincia la =610 nm n cuv de 1 cm, iar pe abscis cantitatea
de fosfor n g (adic 5, 10, 20, 30, 40, 50 g)
Modul de lucru:
n dou eprubete se msoar cte 5 ml substrat (pH = 9,6). Prima eprubet se
menine timp de 5 minute la 37 C dup care se introduce 1 ml ser i se las astupat
jumtate de or la 37 C.
n eprubeta a doua se msoar 1 ml ser i deoarece acesta constituie martorul, se
introduc 4 ml acid tricloracetic 10% pentru inactivarea enzimei. Dup incubarea de o
jumtate de or, prima eprubet se trateaz cu 4 ml acid tricloacetic 10%. Att proba
ct i martorul se agit energic 1-2 minute i se filtreaz, iar din filtrat se iau cte 5 ml
n dou pahare Erlenmeyer i se dozeaz cantitatea de fosfat anorganic dup cum
urmeaz.
Se adaug n fiecare pahar, n ordine, 1 ml molibdat de amoniu, 1 ml sulfit de
sodiu, 1 ml hidrochinon i 2 ml ap bidistilat. Dup 20 de minute de repaus se citete
extincia probei fa de martor la = 610 nm.
Calcul:
Se face pe baza curbei de etalonare. Rezultatul se exprima n uniti Bodansky
(UB). O unitate Bodansky este activitatea fosfatazic pentru care 1 mg fosfor este
eliberat ntr-o or la 37 C i pH = 9,6 de 100 ml ser din substratul de glicerolfosfat.
Valori normale: Aduli: 2 - 4 U.B. / 100 ml ser
Copii: 2 - 8 U.B. / 100 ml ser
Sugari: 3 10 U.B. / 100 ml ser
Transformarea unitilor Bodansky, n uniti internaionale (mU/ml sau UI/l) se
face nmulind cu factorul de conversie 8,3.
79
Modificrile patologice apar n dou mari categorii de afeciuni: osoase i
hepatobiliare. Astfel crete mult n boli n care exist o activitate crescut a
osteoblastelor: Boala Paget (osteodistrofie deforment), hipoparatiroidismul primar i
secundar, rahitism infantil, osteomalacie, metastaze osoase ale unor tumori maligne,
icter prin obstrucie (dozarea fosfatazei constituind n acest caz un mijloc biochimic de
diagnostic diferenial al icterelor).
O cretere fiziologic se observ n sngele matern aproximativ n trimestrul trei
al sarcinii i atinge maximumul n timpul travaliului. La ft, concentraia seric a
fosfatazei crete, dar este sub valoarea matern i se nsoete de fixarea ionilor Ca2+ i
PO43 . Concentraia mai mare n sngele matern se explic printr-o trecere
transplacentar de la ft la mam.
Scderea fosfatazei alcaline apare n ciroz hepatic, hepatit cronic.
Fosfataza acid are valori normale cuprinse n intervalul 4,5 13,5 UI/l (enzim
total) i 0,05 3,6 UI/l (fraciunea prostatic). Valorile cresc n carcinomul de prostat
(cu metastaze osoase), boala Gaucher, prostatit acut i cronic, necroz hepatic
datorat hepatitelor acute i cornice.
80
Principiu:
Se determin cantitatea minim de amilaz seric necesar pentru a hidroliza
complet 2 mg amidon, n 30 minute la 38C.
Reactivi: - Soluie de NaCl 0,9%
- Soluie de amidon 0,1%
- Soluie de KI3 N/10
Modul de lucru:
Se iau 8 eprubete care se numeroteaz de la 1 la 8. n fiecare se introduce cte un
ml soluie NaCl 0,9%. n prima eprubet se adaug 1 ml ser. Pipeta se spal de 3 ori
prin aspirare n amestecul din prima eprubet i cu aceeai pipet se trece 1 ml din
amestec n a doua eprubet. Din nou se spal pipeta prin aspirare n a doua eprubet i
se trece 1 ml n a treia. Operaia se repet pn la ultima eprubet din care se arunc 1
ml din amestec. n acest mod se obine urmtoarea serie de diluii succesive ale serului:
1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256, adic 1/2n unde n este numrul de ordine al
eprubetei.
Se adaug apoi n fiecare eprubet cte 2 ml soluie amidon. Se agit i se
aeaz n baie de ap la 38C. Dup 30 de minute se scot, se rcesc repede la un curent
de ap, apoi n fiecare se introduc cte 1-2 picturi de soluie de iod. Se agit i se
observ culoarea format. Culoarea galben indic lipsa amidonului, cea roie arat
prezena produilor intermediari de hidroliz (dextrine), iar cea albastr semnaleaz
prezena amidonului nehidrolizat. Se noteaz ultima eprubet n care amidonul a fost
hidrolizat.
Cu aceast metod nu se poate face diferen ntre amilaza salivar i cea
pancreatic. Exist, ns, metode electroforetice pentru a diferenia cele dou izoenzime:
migrarea electroforetic a amilazei salivare este mai rapid dect a celei pancreatice.
Calcul:
Rezultatul se exprim n uniti Wohlgemuth (UW). Unitatea amilazic Wohlgemuth
reprezint cantitatea de enzim necesar pentru a hidroliza un mg amidon n 30 minute
la 38C. Pentru calcul se consider ultima diluie n care nu apare culoarea albastr.
Rezultatul n uniti Wohlgemuth se obine nmulind diluia cu 2. De exemplu, dac
coloraia albastr apare n eprubeta a 5-a nseamn c amidonul a fost hidrolizat pn la
a 4-a eprubet. Calculm diluia acestei eprubete care este 1/16 fa de serul iniial.
Dac: 1/16 ml ser hidrolizeaz 2ml sol. amidon 0,1% atunci, 1 ml ser hidrolizeaz x ml
sol. amidon 0,1% sau x mg amidon.
81
12
x = = 32 UW
1/16
Observaii:
1. Amilaza seric este stabil timp de o sptmn dac serul se ine la frigider sau
congelator.
2. Saliva conine de 1000 ori mai mult amilaz dect serul de aceea este necesar ca
pipetrile s se fac cu atenie evitndu-se scurgerea salivei n pipet.
3. Eprubetele vor fi bine splate cu ap distilat, de asemenea i pipetele, nlturndu-
se urmele de detergent care ar putea influena reacia enzimatic.
82
respiratorie. n funcie de modificrile pH-lui se realizeaz acidoza sau alcaloza
compensat sau decompensat. Cnd pH-ul nu este modificat este vorba de acidoz sau
alcaloz compensat. Cnd pH-ul scade sub 7,35 este vorba de acidoz decompensat,
iar cnd pH-ul crete peste 7,45 se poate vorbi de alcaloz decompensat. Valori ale pH-
ului sngelui sub 6,9 sau peste 7,9 sunt incompatibile cu viaa. Cele mai importante
sisteme tampon care funcioneaz permanent n organism sunt: sistemul bicarbonat/acid
carbonic, sistemul fosfailor (HPO42-/H2PO4-), sistemul proteinelor si sistemul
hemoglobinei (deprotonat/protonat).
Metoda Astrup
Spre deosebire de msurtorile de bicarbonai i de pH efectuate n plasm,
metoda Astrup ine cont i de rolul tamponului de hemoglobin i de intervenia
anhidrazei carbonice din eritrocite. Metoda se bazeaz pe relaia invers proporional
dintre pCO2 i valorile de pH din snge. Este o micrometod n care se utilizeaz un
83
electrod capilar de sticl pentru msurarea pH-ului (dozarea poteniometric a pH-ului
cu electrod de sticl, pag.183). Determinrile se fac din snge capilar. Se msoar trei
valori de pH (n condiii anaerobe, n condiii de pCO2 sczut i pCO2 crescut). Cu
ajutorul acestor trei valori se pot calcula factorii principali ai echilibrului acido-bazic
dintr-o nomogram.
Ioni anorganici
84
- Soluia A: Se dizolv 1,25 g Co(NO3)3 n 2,5 ml H2O. Dup dizolvare se adaug
0,0625 ml CH3COOH glacial.
- Soluia B: Se dizolv 56 g NaNO2 n 9 ml H2O bidistilat, prin nclzire.
Soluia A se amestec cu soluia B. Pentru ndeprtarea vaporilor nitroi se
trece prin soluie un curent de aer timp de 60 minute (tromp de vid). Se las
n repaus 2 ore dup care se filtreaz. Dac culoarea se nchide din nou se
trece din nou un curent de aer.
- Alcool etilic 70
- Soluie fosfat disodic 5%
- H2SO4 20%
- KMnO4 0,01N
- K 10%
- Amidon 1%
- Na2S2O3 0,05N
Modul de lucru:
ntr-o eprubet de centrifug se msoar:
- 1 ml reactiv Konninck (Sol.A + B), apoi 1 ml ser. Se agit i se las n repaos
20 minute. Eprubeta se supune centrifugrii la 2000 rpm timp de 10 minute. Dup
decantarea lichidului supernatant, precipitatul sedimentat se spal cu 5 ml etanol iar
dispersia etanolic se supune din nou centrifugrii i decantrii
Precipitatul rmas se dizolv cu 5 ml fosfat disodic, prin fierbere 5 minute.
Soluia se golete ntr-un flacon Erlenmeyer de 100 ml iar eprubeta se spal n flacon cu
1 ml H2SO4 20%. n tabel apar cantitile de reactivi care se introduc n flaconul
Erlenmeyer cu prob i n unul cu martor.
Prob Martor
Precipitat dizolvat -
H2O bidistilat (ml) - 5
H2SO4 20% (ml) 1 2
KMnO4 0,01N (ml) 20 20
Repaus 20 minute (ml)
K 10% (ml) 3 3
Amidon 1% (ml) 2 2
85
Proba i martorul se titreaz cu Na2S2O3 0,05N pn la dispariia culorii albastre
determinate de prezena I2.
Calcul:
1 ml Na2S2O3 0,05N corespunde la 0,065 5 mg K
mg K% = (v1 - v2) 5 0,065 100; unde v1 = nr. ml Na2S2O3 folosii la titrarea
martorului i v2 = nr. ml Na2S2O3 folosii la titrarea probei
Valori normale: 13-21 mg/100 ml ser; 3,3-5,4 mmol/l
Principiu:
Serul nehemolizat se dilueaz cu ap bidistilat, apoi se pulverizeaz ntr-un
dispozitiv special cu ajutorul unui curent de gaz purttor. Aerosolii formai n urma
pulverizrii se amestec cu unul din amestecurile de gaze: metan-aer, propan-aer sau
acetilen-aer care arde ntr-un arztor special (Brenner), dnd natere la spectre
caracteristice. Liniile spectrale ale potasiului pot fi selecionate cu ajutorul unui filtru.
Lumina flcrii este proiectat cu ajutorul unei oglinzi concave, prin filtrul de selecie,
pe o celul fotoelectric, ceea ce produce un fotocurent, care se poate msura cu ajutorul
86
unui galvanometru. Intensitatea fluxului luminos este proporional cu concentraia
ionilor K+ din ser. Alte detalii privind aceast analiz instrumental sunt cuprinse n
capitolul privind unele aparate de analiz fizic de la sfritul ndrumtorului.
Dozarea calciului
87
form de oxalat i apoi dozarea oxalatului de calciu format cu ajutorul permanganatului
de potasiu i metoda complexonometric. Metodele optice sunt descrise n principiu la
sfritul ndrumtorului. Metodele poteniometrice cu electrod pentru Ca2+ utilizeaz un
milivolmetru cu impedan de intrare mare similar cu pH-metrului care n locul
2+
electrodului de sticl utilizeaz electrodul selectiv pentru ionii de Ca .
Metodele chimice (volumetrice) sau fizice cu excitare (flamfotometrie,
spectroscopie de absorbie atomic) permit determinarea concentraiei totale a calciului.
Singurele metode care pot determina calciul ionizabil (singurul care este biologic activ)
sunt metodele nernstiene, adic cele care folosesc electrozi selectivi.
Toi electrozii selectivi au ca particularitate o parte care este numit n mod
curent membran. Aceast membran confer selectivitatea electrodului. Membranele
sunt de mai multe tipuri: membrane de sticl (pentru msurarea pH-ului), membrane
solide (pentru msurare concentraiei F-, CN-) i membrane lichide (pentru msurarea
Ca2+, Mg2+).
Electrodul membran-lichid pentru Ca2+ este constituit din urmtoarele
componente principale:
- Un fir de argint metalic acoperit cu clorur de argint, scufundat ntr-o soluie de
CaCl2
- Un rezervor central n care se afl CaCl2 i firul de argint
- O membran poroas millipor de PVC care joac rolul unui suport inert,
impregnat cu o soluie organic compus din sarea de calciu a acidului
didecilfosforic dizolvat ntr-un solvent nemiscibil cu apa (de exemplu: di n -
octil fenil fosfat).
Ionul de calciu este comun att soluiei apoase (soluie a crei concentraie vrem
s-o determinm) ct i soluiei organice cu care este impregnat membrana millipor.
n aceast soluie organic se va reine ionul de calciu de ctre un contraion (ion cu
semn opus), n cazul de fa didecil fosfatul, care fiind insolubil n ap nu poate prsi
soluia organic. ntre cele dou soluii (apoas i organic) apare o diferen de
potenial nernstian (respect legea lui Nernst).
Diferena de potenial este msurat cu ajutorul instrumentului, care este gradat
direct n uniti de concentraie a ionilor de Ca2+ (pCa). Concentraia ionilor de calciu,
poate fi apreciata i indirect folosindu-se nomograme. Sunt dou tipuri de nomograme
utilizate n acest scop. Nomograma MacLean-Hastings cu ajutorul creia se poate
88
deduce concentraia calciului ionizat, cunoscnd calciu total din ser sau plasm i
concentraia total a proteinelor din ser sau plasm.
Cea de a doua nomogram utilizabil pentru deducerea concentraiei Ca2+, se
bazeaz pe faptul c ionizarea ionilor de calciu variaz linear n funcie de pH-ul
serului sau plasmei. Acest tip de extrapolare se poate face numai ntre limitele variaiei
pH-ului fiziologic (6,8 - 7,8), pentru c numai n aceast plaj de pH variaia este linear
(vezi figura de mai jos).
89
CaCl2 + (COONH4)2 (COO)2Ca + 2NH4Cl
(COO)2Ca + H2SO4 (COOH)2+ CaSO4
5(COOH)2 + 2KMnO4 + 3H2 SO4 2MnSO4 + K2SO4 + 10CO2 + 8H2O
Reactivi: - soluie de oxalat de amoniu 4% (soluie saturat)
- soluie de hidroxid de amoniu 2%
- soluie de acid sulfuric 1N
- soluie de permanganat de potasiu 0,01 N cu factorul FKMnO4
Modul de lucru:
Se pipeteaz 1 ml ser, 1 ml soluie saturat de oxalat de amoniu i 2 ml de ap
bidistilat ntr-o eprubet de centrifug. Se amestec prin agitare i se las minim 30 de
minute n repaus. Se centrifugheaz timp de 10 minute la 4000 turaii pe minut.
Supernatantul se ndeprteaz printr-o singur rsturnare a eprubetei i peste precipitat
se adaug 4 ml din soluia de hidroxid de amoniu 2%, se agit, apoi se centrifugheaz.
Se ndeprteaz supernatantul cum s-a artat mai sus i se mai face o splare cu soluia
de hidroxid de amoniu, se centrifugheaz i se elimin supernatantul. Peste precipitatul
astfel splat se adaug 2 ml acid sulfuric 1N i se ajut dizolvarea prin nclzire pe o
baie de ap la 60-70C. Se recomand ca temperatura s nu depeasc 70C pentru a
se evita descompunerea acidului oxalic. Se titreaz cu soluia de permanganat de potasiu
la cald pn la apariia unei coloraii roz palid care trebuie s persiste minimum un
minut. n paralel se face i o prob martor. Tot ntr-o eprubet de centrifug, se introduc
2 ml acid sulfuric 1 N, se nclzete pe o baie de ap la 70C i se titreaz cu soluia de
permanganat de potasiu la cald pn la apariia unei coloraii roz palid care trebuie s
persiste minimum un minut.
Calcul:
1 ml soluie KMnO4 0,01 N conine 0,01 miliechivaleni de KMnO4.
Stoichiometric 0,01 miliechivaleni de KMnO4 vor reaciona cu 0,01 miliechivaleni de
Ca ceea ce reprezint 0,2 mg de calciu.
x = (a-b) F KMnO4 0,20 (mg Ca /1ml ser)
x100 = mg Ca /100 ml ser sau
(a-b) F KMnO4 5 (mmol Ca /l)
n care: a = numr de ml soluie KMnO4 0,01 N utilizai la titrarea probei de analizat iar
b = numr de ml soluie KMnO4 0,01 N utilizai la titrarea martorului.
Valori normale: ser 9-11 mg / 100 ml la aduli sau
90
2,2-2,8 mmol / l
7-14 mg / 100 ml la copii sau
1,8-3,5mol / l
Valori sczute: - hipofuncie paratiroidian
- avitaminoz sau hipovitaminoz D
- uremie
La valori de sub 1,7 mmol / l (6,8 mg%) apar fenomene de tetanie.
Principiu:
Ionii de calciu din urin n mediu puternic alcalin se vor titra cu EDTANa2,
adic complexon III (sarea de sodiu a acidului etilendiaminotetraacetic) n prezena
murexidului (purpurat de amoniu) ca indicator. Indicatorul va fixa ionii de calciu
(culoarea soluiei va fi roz) care prin titrare vor fi apoi complexai cu EDTA. Indicatorul
eliberat va colora soluia n violet. Murexidul, indicator metalocromic (pentru calciu i
ali cationi) are gradul de ionizare n funcie de pH-ul mediului. Reaciile prin care ionii
Ca2+ sunt complexai de indicator i de complexon sunt:
Ca2+ + Ind3- CaInd-
roz
Ca2+ + Y4- CaY2-
complexonul
deprotonat
Reacia titrimetric care produce virajul indicatorului este:
91
Reactivi: - soluie complexon III 0,001 N .
- soluie de NaOH 9 N
- soluie indicator murexid 0,1%
Modul de lucru:
Se folosete urin proaspt, fr conservani. Se pregtesc dou pahare
Erlenmeyer de cte 100 ml i se pipeteaz n fiecare urmtoarele:
Exprimarea
Proba Martor
cantitilor
Urin ml 2 -
Ap bidistilat ml 50 52
Soluie de NaOH 9 N ml 0,2 0,2
Indicator murexid pic. 1 1
Culoare roz roz-violaceu
Se titreaz cu EDTA 0,01N pn la violet A ml B ml
92
Valori normale:
- sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore - copii i aduli 0,1 - 0,2 g/24 ore
sau 0,25 - 3,5 mmol/24 ore sau 2,5 - 5,0 mmol/24 ore
Valori crescute apar n boala Recklinghausen, osteoporoze, dup fracturi,
intoxicaii cu vitamina D, hipercalciurie ideopatic.
Valori sczute apar n spasmofilie, tetanie infantil, osteomalacie, rahitism,
hipopara-tiroidism.
93
Reactivi: - Reactivul Mann i Yoe: se dizolv 8 mg colorant n 75 ml
alcool absolut (eventual prin fierbere cu reflux) i dup dizolvare
se aduce la 100 ml cu alcool absolut.
- Soluie tampon (pH 9-10): 20 g tetraborat de sodiu cristalizat cu
10 molecule de ap, se dizolv la cald n 500 ml ap bidistilat,
apoi se completeaz cu ap bidistilat la 1000 ml.
- Soluie standard de Mg2+ 2 mg/ 100ml: se dizolv 203 mg
MgSO4 cristalizat cu 7 molecule de ap n 500 ml ap bidistilat,
se adaug 1 ml cloroform (conservant), apoi se completeaz la
1000 ml cu ap bidistilat
- Soluie acid percloric 0,33 N: se dizolv 2,85 ml HClO4 70% n
100 ml ap distilat
Modul de lucru:
Se pregtesc n trei eprubete urmtoarele mixturi:
Prob Blanc Standard
Soluie tampon (ml) 1,0 1,0 1,0
Ser (ml) 0,02 - -
Standard de Mg2+ (ml) - - 0,02
Ap bidistilat (ml) - 0,02 -
Se amestec bine
Reactiv Mann i Yoe (ml) 1,0 1,0 1,0
94
comparativ cu carena altor elemente (exemplu ferul) i apare ntr-un context complex
n asociere cu alte afeciuni care pot domina tabloul.
95
Dozarea ionului de clor din ser prin
metoda Schales
Principiu:
Modul de lucru:
96
Observaii: n cazul serurilor puternic icterice se efectueaz deproteinizarea.
Dup deproteinizare, culoarea indicatorului la viraj tinde spre albastru, pe cnd la ser
neproteinizat spre violet.
Principiu:
Se trateaz serul sanguin cu acid clorhidric cnd se elibereaz Fe3+ din legtura
sa cu proteinele (transferina). Se precipit proteinele serice cu acid tricloracetic, dup
filtrare Fe3+ din filtrat este redus cu hidrochinon la Fe2+. Ionii de Fe2+ formeaz cu
ortofenantrolina i, mai specific, cu ,-dipiridil, un complex colorat n rou.
Intensitatea coloraiei roii va fi proporional cu concentraia ferului din prob.
97
- Soluie ortofenantrolin clorhidric 1% (se poate utiliza i
ortofenantrolin, iar pentru dizolvare se aciduleaz iniial cu 2-3
picturi de HCl concentrat)
- Soluie semisaturat de CH3COONa. Se dilueaz extemporaneu o
soluie saturat (la temperatura camerei cu ap bidistilat) n proporie
de 1:1
- Soluie standard concentrat de fer 10 mg%: 0,0497 g FeSO4 7H2O, ad
100 ml cu ap bidistilat sau 0,0702 g Fe(NH4)2(SO4)2 6H2O, ad 100
ml cu ap bidistilat. Standardul concentrat se pstreaz la frigider. Se
dilueaz extemporaneu 1 ml la 100 ml cu ap bidistilat obinndu-se
un standard de lucru de 100 g Fe % cu stabilitate limitat la 1-2 luni.
Modul de lucru:
98
Valori crescute: creterea reabsorbiei (absena blocadei mucoasei), depozitarea
excesiv a ferului n organism (hemosideroz, hemocromatoz), tratament cu fer n
exces, etc.
Valori sczute: scderea aportului (diet inadecvat, regim finos-lactat),
scderea absorbiei (rezecii de stomac/intestin, diaree cronic, sindrom de
malabsorbie), aclorhidrie, pierderi mari de snge.
Proteina plasmatic transportoare de fer este transferina (siderofilina) sintetizat n
ficat. Capacitatea total de fixare a ferului (CTFFe) corespunde cantitii totale de
siderofilin i se exprim n g Fe/100 ml plasm. Valorile normale ale CTFFe se
ncadreaz ntre 250-420 g% Fe. n deficitul de transferin sunt sczute att sideremia
ct i, evident, CTFFE. n anemia feripriv sideremia este mult sczut, n timp ce
CTFFe este mult crescut, cauza fiind utilizarea ferului plasmatic pentru producia de
hemoglobin. La rndul ei producia accelerat de hemoglobin poate fi cauzat de
pierderile cronice de snge, sarcini repetate, hemoragii puternice.
n serul sanguin i alte lichide biologice fosforul se gsete sub trei forme:
1. Combinat n proteine (a) sau acizi nucleici (b) ca:
(a) fosfoproteine ( cazeina din lapte, vitelina din glbenuul de ou)
(b) nucleoproteine (mediul intracelular animal, etc.).
2. Sub form acidosolubil, adic neprecitabil cu acid tricloracetic:
a. fosfor anorganic ( acid ortofosforic (H3PO4), H2PO4-, HPO42-,
Me4P2O7), b. nucleotide, c. esteri fosforici ai glucidelor, d. acid fosfogliceric, e. acid
fosfopiruvic, f. acid creatinfosforic, g. acizi trifosforici
3. Fosfolipide: lecitine, cefaline, sfingomieline etc.
Fosfaii anorganici ndeplinesc unele roluri n lichidele i esuturile biologice:
a) Sistemul tampon al fosfailor (H2PO4-/ HPO42-). n organismul uman mediul
intern are bazicitatea uor crescut peste neutralitate, pH = 7,35 -7,45. Meninerea
constant a pH-ului n mediu intern este realizat, alturi de alte sisteme tampon, prin
sistemul tampon al fosfailor. Acest sistem poate fi alctuit din dou sruri: fosfat
monoacid (Na2HPO4 sau K2HPO4) - care constituie componenta bazic a sistemului - i
99
fosfatul diacid (NaH2PO4 sau KH2PO4) care este componenta acid. De fapt,
componentele funcionale n cursul tamponrii sunt anionii acestor sruri: HPO42- i
H2PO4-. La pH-ul normal (7,4), concentraia anionului HPO42- este aproximativ de 5 ori
mai mare dect cea a anionului H2PO4-.
Componenta bazic, HPO42-, tamponeaz aciditatea mediului prin reacia:
HPO42- + H+ ---------> H2PO4-
Componenta acid, H2PO4-, elibereaz protoni care neutralizeaz ionii OH- ai
bazelor:
H2PO4- + OH- ------------> H2O + HPO42-
Dup cum se observ, produii rezultai n ambele cazuri sunt componentele
sistemului tampon.
Sistemul tampon al fosfailor este operant n special n hematii, dar i n celulele
tubulilor renali.
b) n snge exist un raport aproximativ invers proporional ntre ionii fosfat i
calciu. La nivel renal, hormonul paratiroidian crete reabsorbia calciului i inhib
reabsorbia ionilor fosfat (aciune fosfaturic). Efectele la nivelul oaselor i rinichilor,
ale hormonului cresc calcemia, fr o cretere echivalent a concentraiei fosfatului,
mpiedicndu-se astfel atingerea unor concentraii critice la care aceti ioni s formeze
fosfat tricalcic insolubil. De fapt concentraiile serice ale acestor ioni depesc pragul de
solubilitate al fosfatului tricalcic. Totui, coninutul n proteine i ali metabolii din ser
previne precipitarea srii tricalcice.
Principiu:
Se precipit proteinele cu acid tricloracetic i se separ prin filtrare. n filtratul
acidulat fosfatul anorganic, mpreun cu molibdatul de amoniu, formeaz
fosfomolibdatul de amoniu ( un complex de culoare galben):
100
cantitatea de fosfat anorganic din prob, adic culoarea produs de oxizii de molibden
este fotometrabil (se supune legii Lambert-Beer).
Aparatur: - Spectrofotometru Spekol.
Reactivi: - Acid tricloracetic 20%
- Soluie de molibdat de amoniu n mediu acid obinut prin dizolvarea
a 25g molibdat de amoniu n 300ml H2O la care se adaug 75ml
H2SO4 concentrat iar apoi se completeaz la 500ml cu ap.
- Soluie de hidrochinon 1% acidulat cu o pictur de H2SO4
concentrat.
- Soluie sulfit de sodiu 20% care se mprospteaz la fiecare serie de
determinri.
- Soluie standard stoc de fosfat (2 mgP/ml) preparat folosind ca
substan etalon KH2PO4.
- Soluie standard de lucru (20 gP/ml) obinut prin diluarea soluiei
stoc de fosfat.
Curba de calibrare
1 2 3 4
n baloane Erlenmeyer se msoar:
Sol. Standard de lucru de P
(1ml=20gP), ml 0,5 1 3 5
Acid tricloracetic 20%, ml 2 2 2 2
Ap bidistilat, ml 7,5 7 5 3
Din acest amestec se msoar n
baloane Erlenmeyer: 5 5 5 5
Molibdat de amoniu, ml 1 1 1 1
Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1 1 1
Hidrochinon 1%, ml 1 1 1 1
Ap bidistilat, ml 2 2 2 2
Modul de lucru:
Se prepar o prob i un blanc n conformitate cu tabelul de mai jos:
101
Proba Blanc
n baloane Erlenmeyer se msoar:
Ser, ml 2 -
Ap bidistilat, ml 4 5
Acid triloracetic 20%, ml 4 -
Agitare energic i repaus 10 min
Filtrare n eprubete + -
n baloane Erlenmeyer se msoar:
Din filtrat, ml 5 -
Molibdat de amoniu, ml 1 1
Sulfit de sodiu 20%, ml 1 1
Hidrochinon 1%, ml 1 1
Ap bidistilat, ml 2 2
Variaii patologice:
Valori sczute: Hipofosfatemii apar n hiperparatiroidism, rahitism, osteomalacie.
Valori crescute: Hiperfosfatemii apar n hipoparatiroidism, acromegalie,
hipervitaminoz D, tubulopatii renale, insuficiene renale acute
i cronice.
102
Compui organici
Principiu:
Dozarea azotului din materiale biologice se face dup metoda pus la punct de
ctre Kjeldahl n 1883. Componentele organice azotate din ser se transform prin
mineralizare n sruri de amoniu care n aparatul Wagner-Parnas elibereaz amoniac.
Amoniacul este captat ntr-o soluie de H2SO4 n exces iar excesul de H2SO4 se titreaz
cu o soluie de NaOH n prezena indicatorului Groak.
Reactivi: - H2SO4 conc.
- Amestec catalizator CuSO4 . 5 H2O i K2SO4 (1:3), (m:m)
- H2O2 3 %;
- NaOH 30 %;
- H2SO4 N/100;
- NaOH N/100;
- Indicator Groak: la 100 ml sol. alcoolic saturat de rou metil
se adaug 4 ml sol. de albastru de metilen 1 %;
Dozarea decurge n trei faze: mineralizarea, antrenarea cu vapori i titrarea
Mineralizarea pentru distrugerea materiei organice se face cu H2SO4 conc., la
temperatur ridicat i n prezena ionilor de cupru:
2 N + 3 C + 3H2SO4 2 NH3 + 3 CO2 + 3 SO2
Sulfatul de potasiu ridic temperatura de fierbere la 350-4000 C iar ionii de
cupru, din sulfatul de cupru, au rolul de a cataliza reacia. n cazul mineralizrii NH3
reacioneaz cu H2SO4 prezent, transformndu-se n sulfat de amoniu, conform reaciei:
2 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4
naintea antrenrii cu vapori, NH3 se elibereaz din sulfatul de amoniu cu NaOH
concentrat:
(NH4)2SO4 + 2 NaOH Na2SO4 + 2 NH3 + 2 H2O
i se antreneaz cu vapori n aparatul Wagner-Parnas, ntr-un volum cunoscut de H2SO4
N/100. Excesul de H2SO4 N/100 se titreaz cu NaOH N/100 n prezen de indicator
Groak.
103
Aparatur: Aparatul Wagner-Parnas este alctuit din balonul A (generator de
vapori) n care se formeaz vaporii de ap, care prin vasul B (deflegmator) trec n
balonul de antrenare C antrennd de aici amoniacul. Aburii sunt condensai n
refrigerentul descendent D, iar soluia apoas de amoniac se colecteaz n flaconul
Erlenmayer E care conine soluia de H2SO4 N/100.
Modul de lucru:
1) Mineralizarea :
ntr-un balon Kjeldahl de mineralizare se introduc 1 ml H2O distilat, 0,1 ml
ser, 2 ml H2SO4 conc., un vrf de spatul amestec catalizator i 2-3 picturi soluie de
H2O2. Mineralizarea are loc pe flacr mic sub ni. Dup 10 minute balonul Kjeldahl
se rcete la temperatura camerei fiind lsat n repaos sub ni (atenie, eman vapori
corozivi de H2SO4 !).
104
3) Antrenarea NH3 cu vapori de ap.
ntr-un flacon Erlenmeyer (E) de 100 ml se pipeteaz 20 ml H2SO4 N/100, se
adaug 2-3 picturi de indicator Groak i flaconul se aeaz sub refrigerentul D n aa
fel nct captul acestuia s fie introdus n soluie. Coninutul mineralizat al balonului
Kjeldahl se dilueaz cu precauie cu 2 ml H2O distilat i se introduce prin plnia F n
vasul de distilare C. Balonul Kjeldahl se spal de 3 ori cu civa ml de apa distilat iar
aceasta se colecteaz tot n plnia F.
Se adaug prin plnia F 20 ml NaOH 30%. Se nchide robinetul plniei F, se
introduce flacra sub balonul A i apoi se nchide robinetul de siguran G se ateapt
pn cnd vaporii antrenatori ajung la nivelul refrigerentului D, toate robinetele fiind
nchise. Distilarea se face 3 minute, din acest moment, mai precis, dup ce prima
pictur de condens cade pe tubul refrigerentului descendet D. n acest timp amoniacul
trece cantitativ n flaconul E.
Dup terminarea distilrii se coboar flaconul n care s-a colectat condensul i se
las s mai picure cteva picturi. Cu ajutorul unei pisete se spal captul refrigerentului
D n acest flacon. Numai dup aceasta se scoate becul de gaz de sub balonul A. Dup
aceasta se poate trece la splarea aparatului prin procedeul descris mai sus. Coninutul
flaconului Erlenmayer E se supune titrrii.
4) Titrarea
Excesul de H2SO4 N/100 din flaconul Erlenmeyer se titreaz cu NaOH N/100 n
prezena indicatorului Groak.
Calcul :
1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N
a FH2 SO4 b FNaOH ................... x
a = 20 ml H2SO4 N/100
b = volumul de NaOH N/100 consumat la titrare.
105
Dozarea proteinelor totale din ser prin metoda biuretului
Principiu:
Proteinele reacioneaz cu ionii de cupru n soluie alcalin formnd un complex
proteic de culoare violet. Avantajul const n faptul c se folosete un singur reactiv n
care hidroxidul de cupru este meninut n soluie sub form de complex format cu
tartratul dublu de sodiu i potasiu, stabilizat cu iodur de potasiu. Reacia de complexare
cu ionii Cu2+ este dat de compui care conin n molecula lor cel puin dou legturi
peptidice.
Cel mai simplu compus care d aceast reacie este biuretul, compus care ia
natere prin nclzirea ureei.
NH2
NH2 O C
2O t0 CuSO4
C NH
NH2 NH3 NaOH
O C
NH2
biuret
H H O 2-
O
C N N C
HN (- ) Cu (-) NH + 2 Na +
C N N C
O H O
H
106
Modul de lucru:
Proba Blanc
Sol. de lucru ml 5,0 5,0
NaCl 0,9% ml - 0,1
Ser ml 0,1 -
Calcul:
E V E 5,1
c (g/100ml) = 1%
F =
E 1cm V P 2 ,77 0,1
extincie procentual
Valori normale:
6,5 - 8,2 g/100 ml
107
limfom malign cu hipergamaglobulinemie. Apare hiperproteinemie i n unele forme de
leucemie.
Hipoproteinemie relativ apare n cadrul dilurii sngelui circulant prin
administrare de perfuzii sau prin ingerare excesiv de lichide.
Hipoproteinemie absolut apare n deficitul genetic de anticorpi sau albumin,
afeciuni hepatice grave (ciroz cu evoluie spre insuficien hepatic, intoxicaii cu
benzen, CCl4) n care este compromis funcia hepatic de sintez a proteinelor.
Pacienii cu tumori maligne prezint hipoproteinemie datorit catabolismului proteic
accentuat. n inaniie i sindrom de malabsorbie apare caren de proteine datorit
aportului insuficient, sau datorit tulburrii de absorbiei intestinal. Se pot pierde
cantiti nsemnate de proteine n sindromul nefrotic (prin filtrul renal lezat trec
numeroase molecule de protein i se elimin prin urin), sau poate avea loc pierdere
de proteine pe cale intestinal (enterocolit). Hipoproteinemie mai apare n arsuri
extinse, hemoragii, ascit (lichid bogat n proteine aprut n cavitatea abdominal n
cadrul insuficienei hepatice).
Principiu:
Electroforeza se bazeaz pe proprietatea particulelor ncrcate electric de a
migra spre polul pozitiv sau negativ sub aciunea tensiunii electrice. n funcie de pH
proteinele se comport ca anioni i vor migra spre anod (+), sau ca i cationi i vor
migra spre catod (-). n cursul electroforezei componenii amestecului de analizat se vor
separa datorit vitezelor de deplasare diferite. n funcie de mediul n care are loc
migrarea exist dou tipuri de electroforez: electroforeza n faz liber i electroforeza
zonal. n cazul electroforezei n faz liber migrarea are loc n faz lichid.
Electroforeza zonal folosete o faz solid sau un gel de amidon, agar, agaroz etc.
pentru migrare. Electroforeza zonal este tipul cel mai folosit n laborator.
Aparate i materiale: - Surs de curent continuu: redresor (0-500 V, 0-50 mA)
- Camer de electroforez confecionat din material
plastic care conine dou cuve prevzute cu electrozi de
108
platin, i o punte mobil pe care se vor pune lamele cu
probele de analizat. n camera de electroforez nchis cu
un capac se realizeaz echilibrul lichid (tampon)-vapori
de ap.
Modul de lucru:
a.) n camera umed se introduc n cele dou cuve laterale volume egale de soluie
tampon, msurate cu cilindrul gradat. Aceste dou compartimente nu comunic ntre
ele, deoarece numai n felul acesta curentul electric trece numai prin gel.
b.) Se scoate lama de sticl cu gel din cutia de plastic. Se aeaz o band de hrtie de
filtru pe o zon a gelului unde urmeaz s fie depus proba. Dup umectare se
109
ndeprteaz imediat hrtia de filtru i se pune n locul ei o matri pentru probe.
Matria trebuie s adere la gel. Cu o sering cu Hamilton se introduce 1 l de ser n
anul creat de matri i se ateapt 5 minute pentru absorbia serului n gel. Dup 5
minute se ndeprteaz excesul de ser cu o band de hrtie de filtru. Se scoate
matria i se pune lama pe puntea care se afl n mijlocul camerei de electroforez.
La extremitile lamelor se aplic dou hrtii de filtru Whatman mbibate cu soluie
tampon. Aceste hrtii de filtru sunt ndoite la capete astfel nct cu un capt s
acopere aproximativ 1/2 cm din lungimea lamei (gelului), iar cellalt capt s fac
legtura cu soluia tampon din cuvele cu electrozi.
c.) Se nchide etan aparatul, se conecteaz cuvele la redresor i se las probele la
migrat 1 h la 170 V.
d.) Dup migrare se scot lamele din camera de electroforez i se introduc 10 minute n
soluia de fixare, aflat ntr-o cutie Petri.
e.) Colorarea se face prin mbibare timp de 5 minute ntr-o soluie de colorant aflat
ntr-o cutie Petri. Excesul de colorant de pe plcue se ndeprteaz prin splare cu
ap distilat.
f.) Uscarea se poate face la termostat sau la temperatura camerei. Gelul uscat va avea
consistena unui film.
g.) Determinarea cantitativ a fraciunilor proteice se face cu ajutorul unui densitometru
optic. Acesta traseaz automat curba de extincie (reflexie optic), care prezint
attea maxime cte fraciuni sunt. Aparatul calculeaz valorile procentuale ale
fraciunilor proteice. n cazul serului normal, prin electroforeza n gel de agaroz,
rezult urmtoarele 6 fraciuni:
110
1. Hiperalbuminemiile apar n puine stri patologice, mai importante fiind leucozele
limfatice cronice.
2. Hiperglobulinemie global (, , ) se ntlnete n cazul tumorilor maligne, bolilor
infecioase acute sau cronice, afeciunilor hepatice cronice, nefropatiilor cronice.
3. Hiperalfaglobulinemia asociat sau nu cu hiperbetaglobulinemia se ntlnete n
inflamaii acute (reumatism poliarticular acut, boli infecioase acute, infarct
miocardic), sindrom nefrotic (cresc ndeosebi 2 globulinele), tumorile maligne,
poliartrita reumatoid.
4. Hiperbetaglobulinemia izolat se ntlnete n - plasmocitom, hepatite acute
virotice sau toxice, diabet zaharat, sindrom nefrotic, icter obstructiv prelungit.
5. Hiperalfa i hipergamaglobulinemia sunt ntlnite n inflamaiile acute i cronice, n
tumori maligne.
6. Hipergamaglobulinemie izolat se ntlnete n afeciunile cu implicaie
imunologic cum sunt:
- boli infecioase acute sau cronice: hepatit virotic, mononucleoz infecioas;
- limfogranulomatoz benign, tuberculoz, sifilis, stafilococi, streptococi
endocardit bacterian subacut;
- colagenaze: poliartrit reumatoid, lupusul eritematos diseminat, sclerodermie;
- afeciuni hepatice: hepatite cronice, ciroze;
- afeciuni neoplazice de sistem: boala Hodkin, leucemii.
7. Hipogamaglobulinemia se ntlnete n :
- agamaglobulinemie i hipogamaglobulinemie congenital;
- afeciuni digestive: inflamaia mucoasei digestive, neoplasm digestiv;
- sindrom nefrotic;
- insuficien cardiac;
- arsuri ntinse;
- eczeme generalizate.
111
n figur sunt prezentate proteinogramele obinute prin citirea
electroforegramelor la densitometru optic, n cteva cazuri patologice precum i n
cazul normal. a) Normal (vezi tabelul de mai sus), b) Inflamaie acut, c) Inflamaie
cronic, d) Sindrom nefrotic, e) Enteropatie exudativ, f) Ciroz hepatic, g) Mielom
multiplu, h) Hipogamaglobulinemie.
Principiu:
Azotul neproteic reprezint azotul din substanele ce rmn n soluie dup
deproteinizarea serului (uree, acid uric, creatin, creatinin, aminoacizi, amoniac, etc.).
Dintre acestea azotul ureic reprezint mai mult de 50 %. Diferena dintre azotul total
neproteic i azotul ureic se numete azot rezidual.
Dup precipitarea i ndeprtarea proteinelor coninutul de azot neproteic se
determin dup acelai principiu ca i n cazul dozrii azotului total din ser prin metoda
Kjeldahl.
Aparatur: Aparatul Wagner-Parnas.
Reactivi: - Fosfowolframat de sodiu 10 %
- H2SO4 0,58 N
- H2SO4 conc.
112
- Amestec catalizator CuSO4.5H2O i K2SO4 (1:3)
- H2O2 3 %
- NaOH 30 %
- H2SO4 N/100 cu factorul FH2SO4
- NaOH N/100 cu factorul FNaOH
- Indicator Groak
Modul de lucru:
1) Deproteinizarea serului: ntr-un flacon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml
H2O bidistilat, 2 ml soluie de fosfowolframat de sodiu i 2 ml H2SO4 0,58 N. Se
agit energic i dup 10 minute proba se filtreaz.
2) Mineralizarea : ntr-un balon Kjeldahl se introduc 2 ml filtrat, 2 ml H2SO4
conc., 2-3 picturi soluie de H2O2 i un vrf de spatul de amestec catalizator.
Mineralizarea are loc pe flacr mic sub ni. Dup 10 minute balonul Kjeldahl se
rcete la temperatura camerei.
3) Splarea aparatului Wagner-Parnas: se face ca mai sus.
4) Antrenarea NH3 cu vapori de ap : Se efectueaz dup modul descris la
dozarea azotului total, cu excepia faptului c amoniacul pus n libertate se va capta n
10 ml H2SO4 N/100.
5) Titrarea: Excesul de H2SO4 se titreaz cu o soluie de NaOH N/100 n
prezena indicatorului Groak.
Calcul :
1 ml sol. H2SO4 N/100 ................. 0,14 mg N
a FH2 SO4 b FNaOH .................. x
a = 10 ml H2SO4 N/100
b = volumul NaOH N/100 consumat la titrare
Rezultatul se exprim n mg N neprot./100 ml ser.
Avnd n vedere c 50% din azotul neproteic este reprezentat de azotul ureic,
interpretarea ese aceeai cu cea de la uree.
Valori normale : 20 - 40 mg N neprot./ 100 ml ser
Valori crescute: se ntlnesc n afeciuni renale ca insuficiena renal cronic sau
n obstrucii ale cilor urinare. Aceste valori se mai ntlnesc n arsuri, hemoragii
digestive, boala Addison.
113
Dozarea ureei din ser prin metoda cu ureaz
Principiu:
Ureea din ser este hidrolizat sub aciunea unei enzime specifice, ureaza, i se
descompune n amoniac i dioxid de carbon. Amoniacul eliberat este determinat apoi pe
baza reaciei pe care o d cu fenolul i hipocloritul de sodiu n mediu alcalin. (Reacia
Berthelot).
-
ClO + OH + NH 3 O N Cl
-
O N O
Reactivi:
- ureaz tamponat: se dizolv 1 g EDTA n 80 ml ap bidistilat i se
ajusteaz, pH-ul la 6,5 cu NaOH diluat. Se adaug apoi 150 mg ureaz i se
completeaz volumul la 100 ml cu ap bidistilat. Se agit bine i se
psreaz ntr-un vas de plastic.
- soluie etalon de uree: 40 mg uree pur, uscat n prealabil n exicator, se
dizolv n ap bidistilat aducndu-se la 100 ml.
- reactiv fenolic. Se dizolv 25 g fenol chimic pur n 400 ml ap bidistilat.
Separat se dizolv 125 mg nitroprusiat de sodiu n 50 ml ap distilat. Se
amestec cele dou soluii i se aduce volumul la 500 m1.
- reactiv hipoclorit. ntr-un balon de 500 ml se dizolv 12,5 g NaOH n 400
ml apa bidistilat. Se adaug apoi un volum de hipoclorit comercial
coninnd 1,10 g hipoclorit de sodiu (de regul 20 ml soluie). Se aduce
volumul la 500 ml.
Modul de lucru:
Se pipeteaz 0,2 ml suspensie ureaz ntr-o serie de eprubete. Se adaug apoi cu
o pipet cte 0,02 ml ser n probele de analizat, 0,02 ml ap distilat pentru proba oarb
i 0,02 ml soluie de uree 40 mg% pentru proba standard. Se incubeaz eprubetele la
37C pe baia de apa timp de 15 minute. Se scot eprubetele de la incubat i se adaug 1
114
ml reactiv fenolic, se agit uor i se adaug 1 ml reactiv hipoclorit alcalin. Se
incubeaz din nou la 37C timp de 15 minute pentru dezvoltarea culorii. Se scot din
baie eprubetele i se dilueaz prin adugarea a 10 ml ap distilat. Se amestec continuu
eprubetele i se citete extincia la 630 nm fat de proba oarb.
Calcul: uree mg% = (E probei / E standardului ) 40
115
Aparatur : Aparatul Kowarski are forma unui tub n form de "U". Ramura
stng (A) este prevzut n partea superioar cu un robinet (a) i este gradat att
deasupra ct i dedesubtul robinetului. Ramura dreapt (B) nu este gradat i are n
partea inferioar un robinet (b) cu trei ci n form de T. De aici se ramific i tubul de
scurgere (C). Pe robinetul cu trei ci (b) direcia cii verticale a T-ului este evideniat
de obicei ca o umfltur sau adncitur (semn). Prin rsucirea acestui robinet se obin
trei poziii n funcie de poziia umflturii robinetului: 1) semnul n spate : comunic A
cu B. 2) semnul n jos : comunic A cu C. 3) semnul n sus : comunic B cu C. 4)
semnul n fa : comunic A i B cu C
116
Reactivi: - Acid tricloracetic 10 %.
- Soluie Kowarski : 350 g NaCl i 150 g K2SO4 se dizolv la
fierbere n 1000 ml H2O, se rcete i se filtreaz.
- Soluie NaOBr : se prepar proaspt, adugnd sub ni, sub
agitare, 12 picturi de brom la 6 ml NaOH 33 %. Se pstreaz
la ghea cel mult o sptmn.
Modul de lucru:
Deproteinizarea serului: ntr-un flacon Erlenmayer se pipeteaz 2,5 ml ser i 2,5
ml acid tricloracetic 10 %. Se agit i dup 10 minute se filtreaz.
Manipularea aparatului : Se umple aparatul cu soluie Kowarski. Pentru aceasta se
stabilete legtura ntre ramurile A i B, se deschide robinetul "a" i se toarn soluia
Kowarski n aparat prin ramura B pn cnd lichidul depete nivelul robinetului "a"
cu 1-2 ml. Dac rmne aer n aparat, el se ndeprteaz prin tubul de scurgere C
(semnul n jos), apoi se completeaz lichidul pn la nivel. Se nchide robinetul "a", se
ndeprteaz cu o pipet lichidul de deasupra i se usuc cu o fie de hrtie de filtru.
Robinetul "b" se aeaz cu semnul n jos. n ramura A se toarn aproximativ 3,5 ml
filtrat. Se las s ptrund n aparat, prin deschiderea robinetului "a", exact 2,5 ml
filtrat. Excesul de soluie Kowarski se va scurge prin tubul C. Se ndeprteaz cu o
pipet restul filtratului, se spal cu H2O distilat i se usuc din nou cu hrtie de filtru.
Se introduc apoi, prin ramura A, 6 ml soluie de NaOBr. Se las s intre n aparat cca. 5
ml. Degajarea azotului ncepe imediat mpingnd n jos soluia Kowarski care se scurge
prin tubul C. Dup 10 minute se aduce la nivelul ramurei A soluia din ramura B, lsnd
s curg din ramura B lichidul n exces (semnul n sus). Apoi se stabilete comunicarea
ntre ramurile A i B (semnul n spate). n acest fel azotul din aparat va avea aceiai
presiune cu cea a mediului nconjurtor. Se citete volumul azotului degajat (vN2)
precum i temperatura i presiunea atmosferic. Dup dozare aparatul Kowarski se
golete i se spal cu ap distilat pentru a evita blocarea robinetelor.
Calcul:
v N 2 F 100 = mg uree/100 ml ser
117
Se caut n tabelul Kowarski factorul F care corespunde temperaturii i
presiunii barometrice din timpul determinrii. Aceast valoare se introduce n formula
de mai sus.
Baro-
10 C 12 C 14 C 16 C 18 C 20 C 22 C 24 C 25 C
metru
710 1,91 1,90 1,88 1,86 1,84 1,83 1,81 1,80 1,79
720 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87 1,85 1,84 1,82 1,80
725 1,95 1,93 1,92 1,90 1,89 1,87 1,85 1,83 1,82
730 1,97 1,94 1,93 1,91 1,90 1,88 1,87 1,85 1,83
735 1,98 1,96 1,94 1,93 1,91 1,89 1,88 1,86 1,84
740 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92 1,90 1,89 1,87 1,86
745 2,01 1,99 1,98 1,96 1,94 1,92 1,91 1,89 1,87
750 2,02 2,00 1,99 1,97 1,95 1,93 1,92 1,90 1,88
755 2,04 2,02 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,92 1,90
760 2,05 2,03 2,01 2,00 1,98 1,96 1,95 1,93 1,91
765 2,06 2,05 2,03 2,01 1,99 1,97 1,96 1,94 1,92
770 2,08 2,06 2,04 2,02 2,00 1,98 1,97 1,95 1,93
118
Dozarea acidului uric din ser
Principiu:
Acidul uric (catabolitul final al nucleotidelor purinice) reduce n mediu alcalin
reactivul fosfowolframic pn la un produs de culoare albastr. Intensitatea culorii este
proporional cu concentraia acidului uric n proba de analizat.
Reactivi: - Acid tricloracetic 20%
- Reactiv fosfowolframic: ntr-un balon de 1000 ml prevzut cu
refrigerent cu reflux, se introduc 50 g wolframat de sodiu, 40
ml H3PO4 85% (d = 1,71 g/cm3) i 350 ml ap bidistilat. Se
fierbe lent aproximativ 6 ore. Se rcete balonul i coninutul
su se trece cantitativ ntr-un balon cotat de 500 ml. Se aduce
la semn cu ap bidistilat. Dac reactivul este verde se adaug
1-2 picturi de brom i se fierbe cteva minute fr refrigerent
pentru ndeprtarea excesului de brom. Reactivul are culoarea
galben-verde deschis, pstrat n sticl brun, el nu se altereaz.
Reacia este urmtoarea:
12 Na2WO4 + 9 H3PO4 = P(W2O7)6H7 + 8 Na3PO4 + 10 H2O
- Na2CO3 crist 22%
- Soluie stoc de acid uric: se introduc n aproximativ 60 ml ap
bidistilat cald (60C) 100 mg acid uric, 200 mg fosfat disodic,
100 mg fosfat monosodic i se agit pn la dizolvare complet.
Dup rcire se completeaz la 100 ml cu ap bidistilat ntr-un
balon cotat. Soluia stoc, nchis ermetic prin parafinare (dup
adugare de 3-4 picturi de cloroform) se poate pstra 4-5 luni la
temperatura de +4C.
- Soluia standard de acid uric se prepar prin diluarea soluiei
stoc: 1 ml se aduce la 100 cu ap bidistilat.
Modul de lucru:
a) Deproteinizarea serului: ntr-un balon Erlenmeyer se introduc 2 ml ser, 4 ml ap
bidistilat si 2 ml acid tricloracetic 20%. Se agit puternic i dup 10 minute se
filtreaz.
b) Reducerea reactivului fosfowolframic se realizeaz efectund urmtoarele
amestecuri n eprubete care apoi se agit energic:
119
Prob Standard Blanc
Filtrat, ml 2,0 - -
Sol. standard, ml - 2,0 -
Ap distilat, ml - - 2,0
Na2CO3 22%, ml 0,9 0,9 0,9
Reactiv fosfowolframic, ml 0,1 0,1 0,1
120
Dozarea creatininei din ser prin metoda Folin
Principiu:
Creatinina reacioneaz cu acidul picric (galben) n mediu alcalin dnd natere
unui produs a crui coloraie poate fi de la orange la rou aprins. Intensitatea coloraiei
roii este proporional cu concentraia creatininei din prob. Coloraia se datoreaz
formrii unor tautomeri colorai ai creatininei, unul din ei fiind stabilizat prin
complexare de un mezomer al acidului picric (reacia Jaff).
121
Calcul:
Ep/Es = mg creatinin/100ml ser.
Valori normale: 0,6-1,8 mg/100ml ser sau 53-159 moli/l.
Variaii fiziologice: nivelul seric al creatininei sufer doar foarte mici variaii n
condiii fiziologice. El poate crete n condiiile unei diete foarte bogate n proteine.
Clearance-ul endogen de creatinin (fr aport exogen de creatinin) este un indicator al
filtrrii glomerulare la subiecii normali.
Valori patologice crescute: se ntlnesc n insuficien renal cronic (este ultima
substan azotat care crete n snge n aceste condiii, ca i n condiiile fiziologice),
distrofia muscular progresiv, eclampsie, acromegalie.
Principiu:
Bilirubina reacioneaz cu diazo-reactivul Ehrlich (acid sulfanilic diazotat) i
formeaz azopigmeni, care au culoare roie n mediu slab acid sau neutru (reacia van
den Bergh). Azopigmentul A este un fragment de bilirubin cuplat cu sarea de diazoniu
a acidului sulfanilic iar azopigmentul B este un fragment de bilirubin conjugat cuplat
cu aceiai sare de diazoniu. Intensitatea coloraiei este proporional cu concentraia
bilirubinei din ser.
O N CH N N=N SO H
Ionul de diazoniu H H 3
Azopigmnet A (B)
Reactivi:
- Soluie HCl 1N;
- Soluie de cofein-benzoat-acetat: se cntresc i se amestec 20 g
cofein pur, 30 g benzoat de sodiu, 50 g acetat de sodiu. Se adaug 400
ml ap bidistilat i se dizolv nclzind uor. Dup rcire se filtreaz.
- Reactiv diazo: Sol.A: se msoar 0,5 g acid sulfanilic ntr-un balon
cotat de 500 ml, se adaug 125 ml HCl 1N i se completeaz pn la
semn cu ap bidistilat
122
Sol.B: NaNO2 0,5%
nainte de ntrebuinare se amestec 10 ml soluie A cu 0,3 ml soluie B.
- NaCl 0,9%
Volumul final (Vf ) = 5,0 ml; volumul probei (Vp) = 1,0 ml; diluia probei =
Vf/Vp = 5
Ep = extincia citit
Concentraia bilirubinei (bilirubinemia) se calculeaz cu formulele:
123
Se calculeaz separat valoarea bilirubinemiei totale i a celei directe iar diferena
ntre aceste dou valori reprezint bilirubinemia indirect.
Valori normale: Circa 1 mg% (cca.17 moli/l) bilirubin total, din care
bilirubina direct cca. 0,25 mg% (4,3 moli/l).
Valori crescute: Bilirubina se va infiltra determinnd apariia unei coloraii
glbui a scleroticelor i a tegumentelor (icter) la valori de peste 3 mg% (51moli/l).
Hiperbilirubinemiile pot fi cauzate de:
- creterea vitezei de formare a bilirubinei n urma degradrii excesive
a hemoglobinei (hemoliz) n icterul hemolitic;
- scderea capacitii de conjugare a ficatului cauzeaz
hiperbilirubinemia indirect (10-40mg%) la homozigoi (sindromul
Crigler-Najjar de tip I);
- scderea capacitii de eliminare a bilirubinei de ctre ficat (boala
Gilbert);
- perturbarea eliminrii prin bil a bilirubinei n urma blocrii cilor
biliare (calculi, tumori cum ar fi neoplasmul de cap de pancreas) n
icterul mecanic;
- deficitul intrahepatic de eliminare activ a bilirubinei conjugate de la
nivelul microsomilor hepatici n canaliculele biliare (sindrom Dubin-
Johnson) determin hiperbilirubinemie direct (2-10 mg%);
- icterul neonatal, datorat imaturitii sistemelor de epurare a
bilirubinei la nou nscut cnd bilirubinemia este crescut (4-5 mg%)
temporar (1-2 zile) dup care revine la normal.
Glucoza
124
Principiu:
Glucoza prezent n filtratul de snge (deproteinizat), reduce cantitativ
fericianura de potasiu n ferocianur de potasiu.
CH COOH
2 K3[Fe(CN)6] + 2 KI 3 2 K4[Fe(CN)6] + I2
125
Modul de lucru:
Se lucreaz cu 4 eprubete, din care primele dou vor fi pentru probe, celelalte
dou pentru blancul reactivilor.
126
TABEL
Relaia dintre ml de Na2S2O3 N/200 consumat la titrare i glicemia n mg %
Na2S2O3 0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09
0,0 385 382 379 376 373 370 367 364 361 358
0,1 355 352 350 348 345 343 341 338 336 333
0,2 331 329 327 325 323 321 318 316 314 312
0,3 310 308 306 304 302 300 298 296 294 292
0,4 290 288 286 284 282 280 278 276 274 272
0,5 270 268 266 264 262 260 259 257 255 253
0,6 251 249 247 245 243 241 240 239 236 234
0,7 232 230 228 226 224 222 221 219 217 215
0,8 213 211 209 208 206 204 202 200 199 197
0,9 195 193 191 190 188 186 184 182 181 179
1,0 177 175 173 172 170 168 166 164 163 161
1,1 159 157 155 154 152 150 148 146 145 143
1,2 141 139 138 136 134 132 131 129 127 125
1,3 124 122 120 119 117 115 113 111 110 108
1,4 106 105 102 101 99 97 95 93 92 90
1,5 88 86 84 83 81 79 77 75 74 72
1,6 70 68 66 65 63 61 59 57 56 54
1,7 52 50 48 47 45 43 41 39 38 36
1,8 34 32 31 29 27 25 24 22 20 19
1,9 17 15 14 12 10 8 7 5 3 2
127
Rezultatul este dat de diferena: 92 - 36 = 56 mg/100 ml.
Mmoli/l = (mg/100 ml) 10/180 = (mg/100 ml) 0,055; (M glucoz = 180)
n condiiile de mai sus, mmoli/l = 56 x 0,055 = 3,08. Valoarea obinut indic
hipoglicemie.
Valori normale: 4,4 - 6,6 mmoli/l (80 - 120 mg %)
peroxidaz
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminoantipirina Chinonimin + 4 H2O
(rou)
Modul de lucru:
Se amestec coninutul unei sticlue de reactiv 2 cu coninutul unei sticlue de
reactiv 1, obinnd astfel reactivul de lucru. Stabilitatea soluiei la 20 - 25 oC este 2
sptmni, iar la 2 - 8oC este de o lun.
Se prepar urmtoarele soluii:
128
Blanc Standard Prob
H2O distilat 10 l - -
Standard - 10 l -
Prob - - 10 l
Reactiv de lucru 1 ml 1 ml 1 ml
n practica medical curent se folosesc tot mai des glucometrele (aparate mici,
asemntoare cu un calculator de buzunar), care determin glicemia prin metod
enzimatic specific pentru glucoz. Determinarea se face cu ajutorul unor stripsuri
(kituri, benzi de hrtie impregnate cu reactivi).
Mod de utilizare:
Efectum pregtirile pentru prelevarea sngelui din pulpa degetului, apoi pornim
aparatul, care ncepe numrtoarea invers. nepm un deget i punem o pictur de
snge pe strips. Peste un minut, la semnalul sonor al aparatului, nlturm prin
tamponare cu hrtie excesul de snge de pe banda cu reactivi. Introducem kitul n aparat
129
i, la unele tipuri, apsm butonul de msurare. Peste cteva momente apare pe ecran
valoarea glicemiei n unitatea de msur folosit de aparatul respectiv.
Avantajele metodei: - Este o metod rapid, precis i specific pentru glucoz
- Se poate folosi n dispensare medicale i la domiciliu,
fiind foarte util n monitorizarea glicemiei la bolnavii diabetici
- Unele aparate au i memorie n care sunt pstrate
ultimele valori ale glicemiei
- Necesit o cantitate foarte mic de snge (o pictur).
Valori normale: 70 - 110 mg % (3,89 - 6,11 mmoli/l)
Valorile obinute la determinarea glicemiei depind de metoda folosit.
n snge, alturi de glucoz, sunt i alte substane reductoare (glutation, acid
ascorbic, acid uric, cistein). Din acest motiv valorile glicemiei obinute prin metode
chimice, care se bazeaz pe proprietatea reductoare a glucozei (metoda Hagedorn-
Jensen, colorimetrie cu reactiv arseno-molibdenic) sunt mai ridicate dect cele obinute
prin metoda enzimatic specific cu glucozoxidaz. Metoda colorimetric cu o-toluidin
d rezultate mai apropiate de valorile obinute prin metoda enzimatic.
130
n cazurile uoare de diabet, cnd glicemia nu depete valoarea de 180 mg %
(10 mmoli/l), glicozuria este absent. n cazuri de gravitate medie valoarea glicemiei
este de 200-300 mg %, iar n cazuri grave poate crete pn la 39 mmoli/l (702 mg %)
sau mai mult, fiind nsoit de glicozurie masiv. Evidenierea accidental a glicozuriei
este uneori semnul care atrage atenia asupra unui diabet asimptomatic.
Sarcina este o stare care scade tolerana la glucoz i produce diabet gestaional
la aproximativ 3 % din gravide, uneori cu repercusiuni grave asupra ftului.
Monitorizarea glicemiei i glicozuriei este foarte important n aceste cazuri pentru
stabilirea dozelor de insulin.
Informaii suplimentare asupra valorilor retroactive ale glicemiei ne furnizeaz
nivelul hemoglobinei glicozilate. Valorile crescute ale acesteia se coreleaz bine cu
nivele mari de glicemie pe perioade lungi.
Creteri ale glicemiei apar n diferite disfuncii endocrine cum ar fi hipersecreia
de adrenalin, glucagon, ACTH (hormon adrenocorticotrop), STH (hormon
somatotrop), cortizol - hormonii enumerai avnd aciune antagonist cu cea a insulinei.
Ei stimuleaz adenilat ciclaza cu formare de AMP ciclic, care intensific glicogenoliza
i gluconeogeneza. Persoanele care sunt tratate timp ndelungat cu corticosteroizi (astm
bronic, poliartrit reumatoid) pot dezvolta aa numitul diabet steroid. Hormonii
tiroidieni (T3, T4) au aciune hiperglicemiant prin creterea absorbiei glucidelor la
nivel intestinal, stimularea gluconeogenezei i a secreiei de adrenalin.
Valori sczute ale glicemiei survin n primul rnd dup administrarea de doze
excesive de insulin. La valori sub 40 mg % apar simptome hipoglicemice manifestate
prin stri convulsive n urma deficienei de aport glucidic la nivelul celulelor cerebrale.
Hipoglicemie apare i n cazul insulinomului (adenomul insulelor Langerhans), tumor
131
care secret cantiti mari de insulin. Disfuncii endocrine cum ar fi insuficiena
hipofizar, tiroidian, corticosuprarenal precum i afeciunile hepatice grave i
tulburri de absorbie pot induce stri hipoglicemice. O uoar i trectoare
hipoglicemie poate s fie de origine alimentar.
Principiu:
Beta-lipoproteinele din ser sunt precipitate selectiv de heparinatul de calciu n
soluie de clorur de calciu cu for ionic joas. Se msoar turbiditatea soluiei i se
exprim n uniti arbitrare.
Reactivi: - Clorur de calciu 0,025 M
- Sol. heparin 0,2%
132
Modul de lucru:
Se pipeteaz n dou erubete, proba (P) i blanc (B), urmtoarele soluii:
P B
Clorur de calciu ml 5,0 5,0
H2O bidistilat ml - 0,1
Sol. de heparin ml 0,1 -
Ser ml 0,1 0,1
133
Tipul II.b: creterea concomitent a colesterolului i a trigliceridelor, ser
clar, sau opalescent. Cresc concomitent LDL i VLDL. Se mai numete hiperlipidemie
combinat familial.
Tipul III.: anomalie ereditar rar ntlnit (boala "betei late") cu cretera
concomitent a colesterolului i a trigliceridelor, ser lactescent. Se datoreaz deficitului
de clarificare hepatic a IDL i chilomicronilor remaneni. Este cauzat de lipsa de apoE
i de lipoproteinlipaz hepatic.
Tipul IV.: creterea trigliceridelor endogene (VLDL), ser clar sau
opalescent.
Tipul V.: creterea chilomicronilor endogeni i exogeni, a colesterolului,
cu LDL i VLDL crescute, HDL sczute, ser opalescent sau uneori lactescent.
Principiu:
Kit-ul enzimatic conine urmtoarele enzime care catalizeaz reaciile indicate
mai jos:
Colesterol esteraza catalizeaz reacia de hidroliz a esterilor de colesterol
rezultnd colesterol liber i acizi grai:
colesterol-esteaz
134
P S B
Reactiv pt. colesterol 2 ml 2 ml 2 ml
H2O bidistilat - - 20 l
Sol. standard de colesterol (200 mg%) - 20 l -
Ser 20 l - -
Principiu:
Colesterolul liber din ser se extrage cu etanol i apoi se precipit cu digitonin.
Diferena dintre colesterolul total i colesterolul liber reprezint colesterolul esterificat.
Reactivi: - Soluie de clorur feric: se prepar din 2,5g FeCl3. 6H2O n
urma adugrii a 100ml H3PO4 85%.
- Reactivul de culoare: 4ml soluie de clorur feric se dizolv n
50ml H2SO4 concentrat.
- Soluie de digitonin 1%: se dizolv 1g digitonin n 50ml
etanol 95% i se aduce la 100ml cu ap bidistilat. Se pstreaz la
ntuneric max. timp de 6 luni.
- Standard de colesterol (0,2%): se dizolv 2000mg colesterol pur
n 100ml acid acetic glacial i se dilueaz de 10 ori (1ml n 10ml)
cu acid acetic glacial.
Observaii: 1. Eprubetele i pipetele trebuie s fie perfect curate i uscate,
reacia fiind influenat de urmele de ap.
2. Puritatea acidului sulfuric i a acidului acetic este o condiie
indispensabil pentru dozare. n particular, acidul acetic nu
trebuie s conin acid glioxilic. Pentru ndeprtarea acidului
glioxilic, eventual prezent, se recomand distilarea acidului acetic
n prezena anhidridei cromice.
135
Dozarea colesterolului total
Modul de lucru:
Proba: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial i 0,1ml
ser. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit bine. Se citete extincia
probei dup 10 min. de ateptare la = 550 nm n cuva de 1 cm fa de blanc
(prepararea acestuia apare mai jos). Rezult extincia Ep.
Soluia standard: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial
i 0,1ml standard de colesterol. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit
bine. Se citete extincia standardului la = 550 nm n cuva de 1 cm fa de blanc.
Rezult extincia Es.
Blanc: ntr-o eprubet de centrifug se introduc 6ml acid acetic glacial i 0,1ml
ap bidistilat. Se agit. Se adaug 4ml reactiv de culoare i se agit bine.
Calcul: mg% colesterol total = (EP/ES) x conc. standard
Dozarea colesterolului liber
Se pipeteaz n eprubete de centrifug o prob P, un standard S i un blanc B.
P S B
Ser ml 0,1 - -
Standard de colesterol ml - 0,1 -
Ap bidistilat ml - - 0,1
Aceton-95% etanol (1:1,v/v) ml 1 - -
Sol. digitonin ml 1 1 1
136
Calcul:
mg% colesterol liber = (EP/ES) x conc.standard
mg%colesterol esterificat = mg% colesterol total - mg% colesterol liber
Valori normale: 60-80% din colesterol total. Prin urmare, raportul colesterol
esterificat/colesterol total se ncadreaz n mod normal n intervalul 0,60-0,80.
Variaii fiziologice: Colesterolemia este strns corelat cu lipidemia i prezint,
n mare, aceleai variaii fiziologice. Valoarea nivelului colesterolului seric la natere
este sczut, ncepe s creasc n cteva ore sau zile i variaz n funcie de vrst, sex,
ras, alimentaie, echilibru neuro-endocrin, profesie.
Exist diferene ale colesterolemiei n funcie de sex i de vrst. De exemplu: la
brbai valoarea medie este de 250mg/100ml la vrsta de 50 de ani, dup care scade
uor; la femei valorile cresc odat cu vrsta atingnd valoarea maxim de 280
mg/100ml n jurul vrstei de 50 ani, dup care scad uor.
Cea mai mare parte a colesterolului seric este de origine endogen, aportul de
colesterol exogen influennd n mic msur colesterolemia.
Variaii patologice: Acest raport este sczut n afeciuni hepatice grave (com
hepatic).
Raportul dintre colesterolul esterificat/colesterolul total permite diferenierea i
diagnosticul icterelor i este:
- normal n icterele obstructive
- moderat sczut n icterele catarale
- sczut n icterele parenchimatoase grave.
Valori crescute (hipercolesterolemii) se ntlnesc n: hipercolesterolemie
esenial, hiperlipemie esenial, hipotiroidism, diabet zaharat, obezitate, sindrom
nefrotic (nefroze lipoidice), ateroscleroz, intoxicaii cu fosfor, CCl4, alcool, morfin,
icter obstructiv (calea de excreie a colesterolului fiind cea biliar), pancreatite,
alcoolism.
Valori sczute (hipocolesterolemii) se ntlnesc n: afeciuni genetice ca:
analfalipo proteinemia (boala Tangier), abetalipoproteinemia; hepatite acute, hepatite
cronice i ciroze decompensate (numai colesterolul esterificat), hipertiroidism; infecii
bacteriene: pneumonie, tuberculoz, difterie, lepr; hemopatii severe: leucemii.
137
Obinerea, purificarea i identificarea lecitinei (glbenu de ou)
Identificarea lecitinei
Identificarea lecitinei se face astfel:
- adugarea 2 ml de acid sulfuric concentrat la 2 ml de soluie de molibdat de
amoniu 0,1% care conine cteva picturi de soluie eteric de lecitin, la nclzire
determin formarea unei zone de separaie colorat n albastru;
138
- o soluie alcoolic de lecitin la care se adaug o soluie alcoolic de aloxan se
coloreaz n roz, apoi n rou i n final formeaz un precipitat de culoare roie.
- dac se adaug cu precauie la 2 ml de acid sulfuric concentrat, 2 ml alcool
coninnd urme de lecitin i 4 picturi de soluie alcoolic 0,01% de benzaldehid,
furfurol sau vanilin, apare la suprafaa de separare a lichidelor o coloraie roie-brun.
Hidroliza lecitinei i observarea microscopica a cristalelor de colina
Lecitinele prin hidroliz se descompun ntr-o molecul de glicerol, 2 molecule
de acid gras, o molecula de acid fosforic i o molecul de colin.
Reactivi: - soluie de hidroxid de sodiu 10%
- soluie de acid acetic 10%
- soluie de iod 5% ( 1 g iod, + 2 g KI, + 20 ml ap)
- hrtie de turnesol
Modul de lucru:
Lecitina obinut din glbenuul de ou se trece ntr-un pahar Erlenmeyer, se
trateaz cu 20 ml NaOH 10%. Se fierbe 10 min. Lichidul obinut se neutralizeaz n
prezena hrtiei de turnesol cu acid acetic. Se adaug apoi n exces o pictur de acid. Se
rcete, se filtreaz. Pe o lam de sticl se ia o pictur din soluia obinut, se adaug o
pictur de iod, se acoper cu lamela. Se observ apariia cristalelor de periodur de
colin (cristale Florence).
Stabilitatea lecitinei
Stabilitatea lecitinei include determinarea indicelui de aciditate, a indicelui de
peroxid, i a indicelui de iod.
1. Determinarea indicelui de aciditate (Ia): Prin indice de aciditate se nelege numrul
de miligrame de hidroxid de potasiu necesare pentru neutralizarea acizilor grai liberi
coninui ntr-un gram de lecitin
139
Modul de lucru:
5 g lecitin se dizolv n 50 ml amestec preparat n pri egale din alcool i eter
neutralizat n prezena fenolftaleinei ca indicator (0,1g fenolftalein dizolvate n 100 ml
alcool din care se folosesc 3 picturi) i se titreaz cu KOH 0,1 N pn la coloraie roz
care trebuie s persiste minimum 30 de secunde.
Ia = 5,61 v / G unde v = ml KOH 0,1 N folosii la titrare i G = grame substan
luat n lucru
140
Hemoglobina
Principiu:
Fericianura de potasiu oxideaz Fe2+ din hemoglobina la Fe3+. Astfel
hemoglobina se transform n methemoglobin. Methemoglobina n prezena cianurii de
potasiu trece n cianmethemoglobin, derivat de hemoglobin stabil, fotometrabil la
= 540 nm.
Materiale: - pipet de hemoglobin de 0,02 ml.
Reactiv Drabkin: - 50 mg KCN, 1 g NaHCO3 i 200 mg fericianur de potasiu se
dizolv n ap bidistilat i se aduce volumul la 1000 ml cu ap bidistilat. Atenie!
Reactivul Drabkin este extrem de toxic.
Modul de lucru:
n dou eprubete se pipeteaz cte 5 ml de reactiv Drabkin. n una din eprubete
se pipeteaz cu o micropipet 0,02 ml soluie standard de hemoglobin (preparat
comercial), iar n cealalt se pipeteaz 0,02 ml snge n prealabil agitat pentru
resuspendarea celulelor sanguine. Se omogenizeaz eprubetele prin agitare, apoi dup
20 de minute se citete extincia probei de analizat i a probei standard fa de ap
distilat la = 540 nm n cuv de 1 cm.
Calcul:
g hemoglobin/100 ml snge=Ep/Es x Cst (Cst = concentraia standardului n g%)
Observaie: Metoda cu cianmethemoglobin detecteaz toate formele de
hemoglobin i permite determinri foarte precise.
141
extincia probei fa de ap distilat la = 540 nm n cuva de 1 cm.Rezultatul se
raporteaz la o curb de calibrare obinut cu diluii dintr-o prob de concentrat de
eritrocite cu concentraia hemoglobinei cunoscut.
Valori normale: femei: 14-17 g/100 ml snge
brbai: 15-20 g/100 ml snge
Dozarea hemoglobinei din sngele total prezint importan pentru diagnosticul unor
forme de anemii.
Observaie: Ca metod de referin (pentru obinerea unei curbe de calibrare n
absena unui standard de hemoglobin) se poate folosi metoda bazat pe dozarea ferului
eritrocitar.
Analiza urinei
Urina este un produs de filtrare, reabsorbie i excreie, reprezentnd exercitarea
funciei renale. Este un lichid biologic uor accesibil, care d multe informaii utile n
diagnostic.
Urina "de diminea" servete la determinri calitative (albumin, glucoz, pH,
aceton i sediment urinar). Se golete vezica de urina acumulat n timpul nopii i se
colecteaz urina proaspt de diminea, care este mai concentrat.
Urina de 24 ore se folosete la determinrile cantitative. Este necesar s se
msoare volumul diurn de urin fiindc rezultatele dozrilor se raporteaz la acest
volum. Se golete vezica de urina "de diminea" i se ncepe la or fix recoltarea urinii
n intervalul de 24 de ore.
Pentru prevenirea contaminrii probelor de urin cu microorganisme se
recomand efectuarea analizelor n cel mult 2-3 ore de la recoltare. Pstrarea nealterat
se poate realiza la rece (+4oC) sau prin tratare cu substane conservante, de preferat cu
timol (0,1 g la 100 ml de urin). Nu se recomand folosirea de cloroform, fenol, formol
fiindc acestea falsific rezultatele obinute.
142
Examenul fizic al urinei
143
formeaz un depozit n form de nor, el se datoreaz unui proces de
descuamare epitelial a cilor urinare. Acest depozit nu are nici o valoare
diagnostic.
Situaiile patologice se difereniaz n felul urmtor:
a). Dispariia tulburrii prin nclzire indic prezena urailor, oxalailor i a
acidului uric.
b). Dispariia tulburrii care a devenit mai abundent n urma nclzirii, prin
adugare de acid acetic 10 % indic prezena fosfailor i carbonailor (dac se produce
efervescen).
c). Dac tulburarea apare la cald i se intensific prin adugare de acid acetic,
urina conine albumin.
d). Dispariia tulburrii numai la adaus de HCl 12,5 % dup nclzire prealabil,
indic prezena oxalatului de calciu.
e). Din urina tulbure, chiar n momentul emisiei, puroiul, hematiile sau celulele
epiteliale se pot ndeprta prin centrifugare.
f). Dispariia tulburrii dup adugarea unui amestec de etanol-eter (1:1; v:v)
indic prezena grsimilor.
144
coli este o component a florei intestinale saprofite, dar poate cauza frecvent
infecii urinare).
Densitatea. Greutatea specific sau densitatea urinii se msoar cu un densimetru
special numit urodensimetru, format dintr-un tub de sticl care se termin la
partea inferioar printr-un rezervor cu mercur. n partea superioar se afl o tij
pe care este nscris scara gradat pentru intervalul 1,000 - 1,040 g/cm3 la 15
o
C, fiind anexat i o scal termometric, pentru c densitatea urinii variaz n
funcie de temperatur. Densitatea depinde de substanele dizolvate: srurile n
general i ureea la indivizi sntoi; glucoza i albumina n cazurile patologice.
Densitatea este de obicei invers proporional cu diluia urinii i direct
proporional cu intensitatea culorii. Excepie face diabetul zaharat, cnd, cu
toate c volumul urinar este mare, ceea ce ar determina o diluie mare,
densitatea este mare datorit prezenei glucozei.
Modul de lucru:
Urina de 24 ore se amestec pentru omogenizare, apoi se toarn ntr-un cilindru
gradat, evitndu-se formarea spumei. Se introduce urodensimetrul care trebuie s
pluteasc fr a atinge pereii cilindrului. Se citete diviziunea care este tangent la
meniscul inferior al suprafeei urinii. Valoarea citit trebuie corectat prin mrire cu
0,001 pentru fiecare depire cu 3oC respectiv prin micorare cu 0,001 pentru fiecare
scdere cu 3oC sub 15oC. Cnd urina conine cantiti mari de proteine, peste 7 g%, se
vor scdea cte 0,03 pentru fiecare gram de protein n plus.
Valori: 1,015 - 1,025 g/cm3, putndu-se modifica fiziologic la valori extreme de
1,001 - 1,035 g/cm3 n funcie de aportul sporit sau de eliminarea abundent de lichide.
Scderea densitii urinare se ntlnete n diabet insipid (se elimin o cantitate mare de
urin foarte diluat), insuficien renal cronic (datorit incapacitii de concentrare a
rinichiului). Creterea densitii urinare apare n diabetul zaharat, nefroz (boal renal
n care se elimin o cantitate mare de proteine prin urin).
145
determin o cretere a aciditii urinei datorit eliminrii crescute de acid uric, urai i
fosfai acizi. Un regim alimentar vegetarian determin o alcalinizare a urinei prin
excesul de sruri minerale i organice.
Msurarea pH-ului se face prin folosirea benzilor de hrtie indicator universal
sau cu pH-metrul.
Modul de lucru:
Se introduce n urina proaspt, pentru cteva secunde, o bucat de hrtie
indicator. Se stabilete valoarea pH-ului dup 30 de secunde comparnd culoarea hrtiei
cu cea a scalei de culori care nsoete fiecare pachet de hrtie indicator.
Prin metoda poteniometric (cu pH-metrul), dup calibrarea aparatului cu
soluii standard de pH, se introduc cei doi electrozi (de pH i de referin) ntr-un volum
adecvat de urin a crei temperatur se cunoate i se citete valoarea pH-ului.
Valorile: pH-ul urinei este slab acid, cu variaii n jurul valorii de 6 (4,8 - 7,4) la
un individ cu alimentaie mixt. Urini puternic acide se produc n cursul proceselor
maligne datorit distrugerii crescute de proteine, n febr, diaree abundent i acidoz
metabolic. pH puternic alcalin se constat n infecii urinare (prin fermentare
microbian) i n alcaloz metabolic. pH-ul se msoar din urina proaspt emis,
deoarece n timp se produce contaminarea produsului cu bacterii, care determin
schimbarea reaciei n sensul alcalinizrii urinei.
146
- afeciuni postrenale: leziuni ale mucoasei cilor urinare (litiaz, inflamaie,
tumori, etc). n aceste cazuri proteinuria se asociaz obligatoriu cu hematurie (apariia
sngelui n urin).
- afeciuni prerenale: stri febrile, boli cardiace, ictere, leucemie, apariia n
urin a proteinelor Bence-Jones (provenite din imunoglobuline patologice) n mielomul
multiplu (plasmocitom). Datorit hiperproteinemiei (creterea cantitii proteinelor n
snge), se satureaz capacitatea maxim de transport a celulelor mucoasei tubulare
renale, i proteinele care nu s-au reabsorbit se elimin prin urin.
n mod fiziologic, n cursul efortului fizic are loc o cretere a proteinuriei care
poate atinge de 5 ori valoarea normal. Cantitatea de proteine eliminat variaz n
timpul zilei, de aceea trebuie s se fac analiza pe urina de 24 ore (valori normale: 30-
40 mg/1500 ml).
Procedeul cu acid acetic la cald
Principiu:
Proteinele precipit prin nclzirea i acidularea urinei mbogite cu sruri de
sodiu.
Reactivi: - Acid acetic 10%
- NaCl cristale
Mod de lucru:
n 10 ml de urin filtrat se adaug cteva cristale de NaCl i se nclzete
eprubeta n flacr pentru aducerea la fierbere doar a prii superioare a coloanei de
lichid. Se adaug cteva picturi din soluia de acid acetic. Apariia unui precipitat
persistent indic prezena albuminei.
Aprecieri semicantitative asupra cantitii de albumin:
- opalescen, urmat de sedimentare la cteva minute . . . . cca 10 mg%
- precipitare i sedimentare imediat . . . . . . . . . . . . . . . . . . cca 50 mg%
nlimea coloanei de precipitat raportat la nlimea coloanei de urin dup
staionarea amestecului timp de 30 secunde:
- 1 : 4 . . . . . . . . . . . . cca 250 mg%
- 1 : 3 . . . . . . . . . . . . cca 500 mg%
- 1 : 2 . . . . . . . . . . . . cca 1000 mg%
Proba cu acid sulfosalicilic la rece
Principiu:
Proteinele sunt precipitate n mediu de acid sulfosalicilic.
147
Reactiv: Sol. acid sulfosalicilic 20%
Mod de lucru:
La 5 ml urin filtrat se adaug 10-15 picturi din soluia de acid sulfosalicilic.
Se agit i se apreciaz reacia innd eprubeta pe un fond negru. Rezultatele posibile
sunt:
- urina rmne limpede . . . . . . . albumin absent
- uoar opalescen . . . . . . . . cca 15 mg% albumin
- opalescen apreciabil . . . . . cca 20 mg% albumin
- floculare abundent . . . . . . . . > 20 mg% albumin
Reacii fals pozitive se observ n terapia diabetului cu antidiabetice orale
(tolbutamid), dup administrare de antibiotice din familia cefalosporinelor, etc.
Reacia cu acid azotic (proba Heller)
Reactiv: Acid azotic concentrat
Mod de lucru:
n cca. 1-2 ml acid azotic concentrat se las s se preling pe peretele eprubetei
1-2 ml urin. Apariia unui precipitat sub form de inel la zona de contact dintre cel
dou soluii indic prezena proteinelor.
Reacii fals pozitive pot fi date de urina conservat cu timol sau care conine
uree i urai n cantitate mare. Mucoproteinele secretate de mucoasa cilor urinare pot
da numai o tulbureal care nu este delimitat sub form de inel.
Proba cu acid tricloracetic
Reactiv: Acid tricloracetic 15%
Mod de lucru:
La 5 ml urin se adaug 1 ml acid tricloracetic. Formarea unui precipitat alb
floconos arat prezena proteinelor.
Evidenierea proteinelor Bence-Jones (termosolubile)
Principiu:
n urina slab acid proteinele Bence-Jones precipit ntre 45-55 oC i se
redizolv n apropiere de 100 oC.
Reactiv: Tampon acetat 2 N (pH=4,9)
Mod de lucru:
Se lucreaz din urinele la care am obinut rezultat pozitiv la reaciile de
precipitare a proteinelor. ntr-o eprubet se pun 4 ml de urin, se adaug 1 ml tampon
acetat i se incubeaz n baie de ap la 56 oC pn la apariia unui precipitat. Apoi se
148
introduce eprubeta n ap la fierbere timp de 3 minute. Descreterea cantitii de
precipitat, clarificarea tulburrii, confirm prezena proteinelor Bence-Jones. Prin rcire
la 56 oC reapare precipitatul iniial.
Proteinele Bence-Jones sunt lanurile uoare ale imunoglobulinelor. Ele apar n
60% din cazurile cu mielom multiplu (multiplicarea canceroas a unei clone de
plasmocite care produce imunoglobuline) i ocazional n alte boli care afecteaz
mduva osoas: leucemii, osteosarcoame (tumori canceroase ale esutului osos),
metastaze osoase, unele disproteinemii.
Test rapid pentru detectarea proteinelor urinare
Principiu:
Hrtia reactiv impregnat cu albastru de tetra-bromfenol este colorat n galben
deschis n mediu acid (pH 3). n prezena proteinelor urinare, culoarea vireaz spre
verde, verde-albstrui, albastru sau violet, nuana depinznd de tipul de protein i de
concentraia acesteia n urin.
Mod de lucru:
Se nmoaie captul benzii n urina de analizat. Dup 2 minute se apreciaz
prezena proteinelor urinare prin compararea culorii obinute cu o scal de etalonare.
Cantitativ urmele de proteine corespund la aproximativ 5-20 mg% de albumin. Testul
are valoare orientativ.
Evidenierea puroiului
Proba Donn
Principiu:
Cu ajutorul NaOH se lezeaz membrana leucocitar din care astfel se elibereaz
mucin, care mrete vscozitatea urinei i mpiedic ridicarea imediat a bulelor de aer.
Reactiv: Sol. NaOH 20%
Mod de lucru:
Se iau ntr-o eprubet 5 ml urin, se adaug cteva picturi de NaOH 20%, se
astup eprubeta i se rstoarn brusc, apoi se readuce n poziia iniial. Apariia unor
bule de aer n lichid, care rmn mai mult timp n suspensie i se ridic ncet la
suprafa denot prezena puroiului.
n cazul n care bulele de aer se ridic rapid, testul este negativ. Dac toate
bulele de are se ridic ncet la suprafa rezultatul se noteaz cu +. n cazul n care
bulele mici rmn pe fundul eprubetei, rezultatul este ++. Dac nici bulele mai mari nu
se ridic datorit prezenei unei cantiti mari de mucin, proba se noteaz cu +++.
149
Interpretare: Puroiul este constituit din leucocite degenerate care apar n urin n
urma proceselor inflamatorii ale tractului urinar (pielonefrit, cistit, uretrit). Probe fals
pozitive pot apare n albuminurie masiv, datorit prezenei polizaharidelor, a mucinei,
etc. Testele pozitive trebuie ntotdeauna verificate prin examenul microscopic al
sedimentului urinar.
150
substan reductoare din urin. O metod specific de evideniere a glucozei este
metoda cu glucozoxidaz.
Reacia Nylander
Principiu:
Glucidele reductoare reduc n mediu bazic ionii de Bi3+ la Bi metalic.
Reactivi: 20 g azotat de bismut, 40 g sare Seignette (tartrat dublu de sodiu i
potasiu) i 100 g NaOH se dizolv n ap pn la 1000 ml soluie.
Mod de lucru:
ntr-o eprubet, la 5 ml urin se adaug 1 ml reactiv Nylander i se nclzete la
flacr timp de 4 minute.
n prezena glucozei apare un precipitat brun pn la negru. Reacii fals pozitive
pot exista n proteinurie masiv, cnd apare un precipitat brun de sulfur de bismut
datorit reaciilor de reducere date de unele grupri funcionale ale radicalilor
aminoacizilor.
151
Reacia Barfoed
Principiu:
Reacia de reducere a Cu2+ la Cu+ din Cu2O n mediu slab acid este pozitiv
numai n prezena monozaharidelor i ea servete la identificarea acestora n prezena
dizaharidelor reductoare (lactoz, maltoz), pentru care aceast reacie este negativ n
condiiile de lucru. n mediu slab acid viteza reducerii Cu2+ Cu+ este mult mai mic
dect n mediu alcalin (se formeaz un precipitat rou-crmiziu), totui mecanismul
reaciei Barfoed nc nu este pe deplin cunoscut.
Reactiv: Reactiv Barfoed: 13,3 g acetat de cupru se dizolv n 200 ml ap
distilat, se filtreaz i se adaug 1,8 ml acid acetic glacial.
Mod de lucru:
Se pun ntr-o eprubet 2 ml urin i 2 ml reactiv Barfoed. Se amestec i se
nclzete eprubeta la fierbere timp de 5 minute. Pozitivitatea acestei reacii, adic
apariia pulberii roii de Cu2O la suprafaa i la fundul eprubetei, indic existena
monozaharidelor reductoare.
Reacia Whlk
152
Interpretare: Lactozuria este un fenomen inofensiv care poate apare n ultimele
luni de sarcin sau la nceputul alptrii.
Reacia Seliwanoff
Mod de lucru:
Se pun ntr-o eprubet 0,5 ml urin i 5 ml reactiv Selivanoff. n paralel se
execut doi martori, unul cu 0,5 ml urin normal i cellalt cu 0,5 ml urin normal
care conine fructoz 1%. Se aduc la fierbere cele trei eprubete.
Prezena fructozei este indicat de apariia unei coloraii rou intens. Prin rcire
se poate depune un precipitat rou care se dizolv n alcool.
Interpretare: Fructozuria esenial este o boal ereditar rar datorat blocrii
conversiei normale a fructozei n glucoz n ficat (deficit de fructokinaz). Se poate
produce o fructozurie alimentar n diabet i n unele boli hepatice.
Reacia Bial
Se folosete pentru identificarea pentozelor urinare.
Principiu:
n mediu puternic acid pentozele dau reacie de culoare cu orcina
(metilrezorcina).
153
Reactivi: - reactivul Bial: 6 g orcin se dizolv n 200 ml alcool etilic 96%
i se adaug 40 picturi sol. FeCl3 10%
- HCl conc.
- soluie 1% de fructoz, arabinoz, glucoz
Mod de lucru:
Se iau ntr-o eprubet 5 ml reactiv Bial i 0,5 ml urin. Se execut n paralel doi
martori, unul cu urin normal i altul cu o urin normal la care se adaug 1 ml soluie
de pentoze 0,1% (arabinoz sau xiloz). Se aduc la fierbere cele trei eprubete, apoi se
las n repaus 15-20 minute. Pentozele dau culoare verde, sau dac sunt prezente n
cantiti mari, un precipitat de culoare verzuie. Culoarea poate fi extras prin agitare n
alcool amilic.
Interpretare:
Pentozuria alimentar apare dup un consum substanial de fructe bogate n
pentoze. Pentozele sunt adesea excretate n urina diabeticilor. Pentozuria esenial (n
care se elimin xiluloza) este o boal ereditar rar n care apar cantiti considerabile
de L-xiluloz n urin datorit deficitului de reductaz care convertete pentoza n
xilitol.
Reacia cu fenilhidrazina
n laboratorul clinic formarea glucosazonei i a lactosazonei este utilizat ca test
pentru diferenierea glucozei de lactoz n urina femeilor gravide.
Reactivi: - Soluie fenilhidrazin n acid acetic glacial 10%;
- Soluie acetat de sodiu 25%;
- Acid acetic glacial;
- Reactiv Patein: se dizolv 200 g acetat de mercur n 600 ml ap
distilat, se alcalinizeaz (indicator hrtie de turnesol) cu soluie
de hidroxid de sodiu 10%. Se trece ntr-un balon cotat de 1000 ml
i se completeaz cu ap distilat la semn. Reactivul nu se
altereaz.
Mod de lucru:
ntr-o eprubet se pipeteaz 1 ml soluie fenilhidrazin, 1 ml acid acetic glacial
i 1 ml soluie acetat de sodiu 25%, apoi se adaug 10 ml urin defecat cu reactiv
Patein. Prin defecare se elimin celelalte substane reductoare pe care le-ar putea
154
conine urina trecnd n filtrat numai glucidele. Se filtreaz i eprubeta cu filtrat se ine
o or n baia de ap la fierbere, apoi se filtreaz imediat la cald ntr-o alt eprubet care
se las s se rceasc.
n prezena glucozei (n cantitate mai mare de 4 g%o) se obine glucosazon
insolubil la cald care rmne pe al doilea filtru i care examinat la microscop, se
prezint sub form de ace galbene aurii dispuse n snopi (vezi pag. 49). Fructosazona
are aspect asemntor. Dac urina conine i lactoz sau maltoz, osazonele acestora se
vor cristaliza n ultima eprubet, la rece. Cristalele de lactosazon apar la microscop
sub form de rozete, iar cele de maltosazon au form de lame aproape rectangulare
unite prin una din extremiti.
Reacia Legal
Servete la identificarea acetonei. n scop diagnostic este suficient identificarea
acesteia, fiindc acetona, acidul acetoacetic i -hidroxibutiratul sunt ntotdeauna
prezeni mpreun.
Reactivi: - Sol. nitroprusiat de Na 10% (proaspt)
- Acid acetic glacial
- NaOH 10%
Mod de lucru:
Se iau ntr-o eprubet 3 ml urin, se adaug 5 picturi de soluie de nitroprusiat
de Na 10% i 2-3 pic. de NaOH 10% pn la reacie alcalin. Apariia unei culori roii
sau portocalii se datoreaz acetonei sau creatininei urinare. Se adaug apoi 1-2 ml acid
acetic glacial. Dispariia culorii indic absena acetonei, iar intensificarea culorii cu
virare spre rou-violet indic prezena acetonei. Intensitatea culorii variaz n raport
direct cu concentraia corpilor cetonici din urin.
155
Reacia poate fi dat i de unele medicamente (salicilai - de ex. aspirina).
Diferenierea se face fierbnd n prealabil cteva minute urina, operaie prin care
acetona se ndeprteaz. O reacie pozitiv iniial, care nu mai apare dup fierberea
unei alte probe din urina respectiv, indic prezena acetonei.
Reacia Lieben
Principiu:
n reacia dintre aceton i iod n mediu alcalin, ia natere iodoformul care poate
fi recunoscut prin miros.
H3C - CO - CH3 + 3I2 + 3NaOH CH3 - CO - CI3 + 3NaI + 3H2O
156
Identificarea acizilor biliari
Eliminarea acizilor biliari n urin se mai numete colalurie. Apare n special n
caz de icter mecanic (din cauze obstruciei tubului coledoc, srurile acizilor biliari nu
mai sunt excretate n bil. Datorit presiunii ele trec n curentul sanguin i se elimin n
urin). Colaluria mai apare n ictere date de hepatit, cnd celula hepatic bolnav nu
mai poate excreta acizii biliari.
Proba Hay
Principiu:
Srurile acizilor biliari scad tensiunea superficial a urinei permind
sedimentarea florii de sulf.
Reactiv: Sulf sublimat (floare de sulf).
Mod de lucru:
Se presar floarea de sulf pe suprafaa urinei pus ntr-o eprubet. Dac urina
conine acizi biliari, sulful sedimenteaz n 5 minute. n absena acizilor biliari sulful
plutete cteva ore.
Reacia Pettenkoffer
Principiu:
Acidul sulfuric transform glucidele n derivai furfurolici care se condenseaz
cu acizii biliari dnd produi colorai.
Reactivi: - Acid sulfuric concentrat
- Zaharoz 10%
Mod de lucru:
ntr-o eprubet se iau 1 ml ap distilat, 1-2 ml urin, 5-6 picturi zaharoz 10%
i se agit. Se adaug cu grij, prelingndu-se pe peretele eprubetei inut ntr-o poziie
nclinat, 1-2 ml acid sulfuric. Apariia unui inel rou-violet la limita de separaie a
reactivului cu proba indic prezena acizilor biliari. n paralel se execut o prob martor
n aceleai condiii, nlocuind urina cu ap. Inelul obinut are o nuan brun crmizie.
157
Identificarea bilirubinei
Proba Popper
Principiu:
Oxidarea bilirubinei n biliverdin (de culoare verde) cu ajutorul iodului.
Reactivi: - Reactiv Popper: Se amestec 525 ml ap distilat, 125 ml alcool 95o,
3,5 ml tinctur de iod 10% i se adaug 12 g KI i 27 g NaCl.
Mod de lucru:
Se pun 5 ml urin ntr-o eprubet. Se adaug cu precauie, cu o pipet, 2 ml
reactiv, astfel ca cele dou lichide s nu se amestece. Reactivul fiind mai dens, se
introduce la fundul eprubetei. n prezena bilirubinei apare un inel verde la suprafaa de
contact dintre coloanele celor dou lichide.
Reacii fals pozitive: dup consum de antipirin (analgetic) i piramidon.
Testele rapide de determinare a bilirubinei din urin au la baz reacia de
condensare a bilirubinei cu un alt compus n mediu puternic acid, cu apariia unei
coloraii maronii de intensitate diferit. Reacia complet necesit 20 de minute.
158
Identificarea urobilinoizilor urinari
Reacia Ehrlich
Principiu:
n prezena p-dimetilaminobenzaldehidei n mediu puternic acid, urobilinogenul
i stercobilinogenul dau o coloraie roie intens prin formarea unui compus chinoid.
Reactivi: - Reactiv Ehrlich: se dizolv 2 g p-dimetilaminobenzaldehid n 100
ml HCl 20%.
- Cloroform
Mod de lucru:
La 3 ml de urin se adaug 2-3 picturi reactiv Ehrlich. Se las n repaus un
minut. Apariia unei coloraii roii intense la temperatura ambiant denot o eliminare
crescut de urobilinogen. Colorantul se poate extrage n cloroform. Porfobilinogenul
intermediar al sintezei hemului, care apare n urin n porfiria intermitent acut, d o
coloraie asemntoare. El nu este ns solubil n cloroform. Dac dup agitare cu
cloroform acesta rmne incolor, reacia pozitiv se datorete prezenei
porfobilinogenului.
Observaie: Urina de analizat trebuie s fie rece. n urina cald indolul eliberat n
condiiile de reacie poate da i el culoare roie cu reactivul Ehrlich. Sulfamidele dau o
coloraie galben care poate masca reacia bilinogenilor.
Interpretare: Eliminarea crescut a urobilinoizilor apare n urmtoarele situaii:
1). Hemoliz exagerat: funcia hepatic este n general intact, dar posibilitile
de glucuronoconjugare ale ficatului sunt depite.
2). Tulburarea funciei hepatice: ictere hepatocelulare, hepatite, ciroz sau
intoxicaii chimice cu cloroform i n special cu tetraclorur de carbon.
3). Icter prin obstrucie, n stadiile precoce, de obstrucie incomplet.
Identificarea sngelui
n urin apare fie hemoglobina liber (hemoglobinurie), fie hematii (hematurie).
Diferenierea se poate face numai prin examenul microscopic al sedimentului urinar, i
anume n primul caz n sediment nu se observ hematii.
Se folosete urina proaspt fiindc majoritatea testelor se bazeaz pe aciunea
pseudoperoxidazic a hemoglobinei: leucoderivatul unui colorant (benzidina,
fenolftalein redus n mediu alcalin, etc.) este oxidat cu ap oxigenat, n prezena
hemoglobinei, n colorantul respectiv. ntruct leucocitele dau o reacie peroxidazic
159
adevrat (enzimatic) este necesar s se fiarb urina cteva minute, dup acidularea
prealabil cu acid acetic.
Reacia cu benzidin
Reactivi: - Sol. benzidin: 5 g benzidin se dizolv n 50 ml acid acetic
glacial i se completeaz cu ap distilat la 1000 ml.
- Ap oxigenat 3%
Mod de lucru:
Se iau 3 ml urin, 2-3 pic. sol. benzidin i 2 ml ap oxigenat 3%. Se agit,
reacia pozitiv prezint o culoare albastr. Ordinea de adugare a reactivilor este
esenial.
Interpretare:
Hematuria macroscopic (vizibil cu ochiul liber) apare n caz de: calculi renali,
tumori renale sau ale cilor urinare (cancerul renal deseori are ca prim manifestare
hematuria), tuberculoz urogenital, traumatisme, chisturi renale, diatez hemoragic
(sngerri multiple, n diferite esuturi), cistit hemoragic. Hematuria microscopic,
deseori renal apare n caz de: calculi ureterali care produc leziuni ale mucoasei,
pielonefrit, nefrit interstiial, n colagenoze (boli autoimune cu frecvent afectare
renal), de nsoire n boli infecioase, efort fizic, glomerulonefrit (lezarea grav a
filtrului glomerular face posibil traversarea lui de ctre hematii) .
Stripsurile pentru analiza urinei sunt plci de celuloid care conin mai multe
benzi de hrtie impregnate cu reactivi. Parametri cei mai importani care se analizeaz
sunt: densitatea, pH-ul, bilirubina, urobilinogenul, proteinele, glucoza, corpii cetonici,
leucocitele, nitriii i sngele. Stripsul se introduce n proba de urin pentru cteva
secunde, timp n care au loc reaciile corespunztoare. Culoarea se compar cu o scal
de culori care arat aproximativ cantitatea de substane coninute, pH-ul, etc, sau se
introduce stripsul ntr-un aparat special care citete rezultatele.
160
valori sub 500 U/l testul este negativ. Principiul de determinare se bazeaz pe latex-
aglutinare, hemaglutinare, sau o metod imunoenzimatic, n funcie de testul folosit.
La metoda de latexaglutinare elementele de latex ale plcii de reacie a kitului
sunt acoperite cu hCG. Antiserul folosit conine anticorpi monoclonali specifici pentru
beta-hCG. n caz pozitiv (dac este sarcin) hCG din urin n concentraie de peste 800
U/l se leag de anticorpii monoclonali ai antiserului, mpiedicnd astfel aglutinarea
elementelor de latex acoperite cu anticorpi. n caz negativ, dac nivelul hCG n urin
este sub 500 U/l, atunci hCG de pe suprafaa elementelor de latex se poate lega de
anticorpii monoclonali cu locusurile de legare libere, astfel se produce aglutinarea.
n cadrul metodei imunoenzimatice n prima etap se adaug ntr-o eprubet
proba de urin la anticorpul anti-hCG legat de o enzim, apoi acest amestec este pus pe
o plac de reacie. Dac proba conine hCG, acesta se leag de anticorpul monoclonal i
complexul se leag de un alt anticorp (anti-hCG) legat de placa de reacie. n a doua
etap se adaug un substrat care este transformat de ctre enzima din complex ntr-un
compus colorat. Aceast reacie este foarte sensibil, fiind pozitiv peste valoarea de 25
U/l hCG.
161
Determinri n urina din 24 de ore.
162
Persoana la care se face analiza clorurilor n urin nu trebuie ca naintea analizei
s consume bromuri sau ioduri, deoarece i acestea precipit cu azotatul de argint i
rezultatele nu vor fi concludente.
Analiza chimic a urinei evideniaz:
- Amilaz: 10-80 UI/or
- 17 cetosteroizi: - brbai: 6-21 mg/24 ore
- femei: 4-17 mg/24 ore
- Clearance de creatinin: - brbai (20 ani): 90 ml/min/1,73 m2
- femei (20 ani): 84 ml/min/1,73 m2
- Proteine: < 150 mg/24 ore. Acid uric: 250-750 mg/24 ore. Glucozoxidaz: negativ.
Corpi cetonici: negativ
- Calciu: - brbai: < 275 mg/24 ore
- femei: < 250 mg/24 ore
- Fosfat: < 1000 mg/24 ore. Sodiu: 30-290 mEq/24 ore. Clor: 110-250 mEq/24 ore
163
530 nm. Martorul va conine 2 ml de ap bidistilat, 6 ml acid picric saturat i 0,25 ml
NaOH 10%. n paralel se execut aceleai operaii folosind n locul urinei diluate o
soluie standard de creatinin de concentraie cS = 10 g/ml pentru care se obine
extincia Es.
Eurin 1
Calcul: mg creatinin= cS 50
ES 1000
164
Fiecare substan din plasm are un coeficient de epurare indiferent de
concentraia sa n urin. Majoritatea constituenilor obinuii ai urinei au un coeficient
de epurare mai mic de 120 ml/min, datorit reabsorbiei tubulare pariale sau totale (de
ex. Cglucoz = 0). O alt categorie de substane au un clearance superior filtratului
glomerular, deoarece ele ajung n urina final i printr-un proces de secreie tubular.
Determinarea clearance-ului de creatinin permite deci explorarea capacitii de filtrare
glomerular.
Calcul:
Calculul clearence-lui de creatinin (C) se poate face cu urmtoarea formul
C = Eurin/Eser 50 1500/24 60
unde: Eurin i Eser sunt extinciile optice citite pentru probele de urin, respectiv
ser n metodele de dozare descrise la pag. 121.
Valori normale: 80-120 ml/min
165
4) Cistin: ntr-o eprubet se introduc un vrf de cuit de pulbere, 1 ml soluie de
NaOH 10% i 2-3 picturi soluie de Pb(CH3COO)2 saturat. Eprubeta se nclzete
la fierbere 1-2 minute. Prezena cistinei duce la formarea PbS (precipitat negru).
5) Urat (reacia murexidului): ntr-o capsul de porelan se introduce un vrf de cuit
de pulbere care apoi se umecteaz cu 2-3 picturi HNO3 concentrat (d = 1,42 g/ml)
i se evapor pe flacr la sec. Apariia unei culori roii indic formarea acidului
purpuric prin oxidarea acidului uric de ctre HNO3. Adugnd o pictur de soluie
NH3 25% i o pictur soluie NaOH 10% apare o culoare violet datorit
murexidului (purpurat de amoniu).
6) Xantina: Se face reacia cu HNO3 concentrat ca i n cazul evidenierii uratului.
Prezena xantinei determin un reziduu galben care nu-i schimb culoarea la
adugarea soluiei de NaOH. Adugnd soluie de NH3 culoarea vireaz spre rou.
7) Colesterolul: (reacia Liebermann-Burchardt): ntr-o eprubet se introduc 1 vrf de
cuit de pulbere, 1 ml cloroform, 4 picturi H2SO4 concentrat (d = 1,92 g/ml) i 2
picturi anhidrid acetic.
Prezena colesterolului determin formarea dicolestendienei de culoare ce variaz de la
roz la verde, extractibil n cloroform.
Calculii urinari apar n litiaza urinar cu urmtoarea frecven relativ: Oxalat
de Ca 34,2%. Oxalat de Ca + fosfat de Ca 26,2%. Acid uric 18,8%. Fosfat de Ca 9,7%.
Oxalat de Ca + acid uric 4,5%. Fosfat amoniaco-magnezian 2,2%. Carbonat de Ca
2,2%. Cistin 1,7%.
Analiza salivei
166
Compoziia salivei difer n funcie de urmtorii factori: perioada de zi n care se
face recoltarea; nainte sau dup mese; alimentele consumate; igiena bucal; stimulul
aplicat la recoltare.
Compoziia chimic a salivei este urmtoare:
- ap: 99,4%
- substane anorganice 0,2%: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, HCO3-, Cl-, SCN-, PO42-
- substane organice 0,4%: proteine, enzime salivare (amilaz, lizozim),
mucine (glicoproteine), micromolecule azotate (uree, creatin, etc.),
micromolecule neazotate (acid lactic, acid citric).
Reactivi: - CH3COOH 5%.
- NaOH 5%.
- Reactivul biuret - Soluia A: 4,5 g tartrat de sodiu i potasiu se
dizolv n 40 ml NaOH 0,2 N. Se adaug sub agitare 1,5 g CuSO45H2O dizolvat n 10
ml ap, apoi se adaug 0,5 g KI i se completeaz cu NaOH 0,2 N pn la 100 ml. Se
conserv n sticl brun timp nelimitat.
- Soluia B: se dizolv 5 g KI n 1000 ml de
NaOH 0,2 N. Se conserv timp nelimitat, n sticla brun.
- Soluia de lucru: se dizolv 1 volum soluie A
cu 4 volume soluie B. Se poate utiliza o sptmn, pstrndu-se n sticl brun.
- HCl 5%.
- Na2CO3 20%.
- Reactivul Benedict ( 173 g citrat de sodiu i 100 g carbonat de
sodiu anhidru se dizolv n 800 ml ap distilat fierbinte, se filtreaz i se aduce
volumul la 850 ml. Se dizolv apoi separat 17,3 g sulfat de cupru cristalizat n 100 ml
ap distilat, se adaug sub agitare n prima soluie i se completeaz volumul soluiei
finale la 1000 ml.
- HNO3 5%.
- AgNO3 5%.
- HNO3 concentrat.
- (NH4)2MoO4 5%.
- BaCl2 5%.
- (COO NH4)2 5%.
- FeCl3 5%
167
Identificarea mucinei: Mucinele au ca grupare prostetic compui din clasa
glucidelor ce deriv de la aminozaharuri.
a) Precipitarea mucinei: la 5 ml saliv se adaug 1 ml acid acetic 5%. Mucina
precipit, se filtreaz. Filtratul se pstreaz pentru identificarea altor
componeni, iar din precipitat se pune n eviden partea proteic i cea glucidica
a mucinei.
b) Identificarea prii proteice: o parte a precipitatului se dizolv n 1 ml NaOH 5%
i se adaug 1 ml din reactivul biuret. Datorit componentei proteice se
formeaz complexul de culoare violet.
c) Identificarea prii glucidice: partea ce rmne din precipitat se fierbe cteva
minute n 5 ml HCl 5%. Se rcete, se alcalinizeaz cu Na2CO3 20% i se
efectueaz reacia Benedict. Reacia va fi pozitiv datorit apariiei glucidelor
reductoare n urma hidrolizei prii glucidice.
Identificarea Cl-: La poriunea de filtrat de saliv (lipsit de mucin) se adaug
HNO3 5% AgNO3 5%. Formarea unui precipitat alb de clorur de argint indica
prezena ionilor Cl-
Identificarea PO43-: Filtratul de saliv se aciduleaz cu HNO3 conc., se adaug
cteva picturi de molibdat de amoniu 5% i se nclzete. Prezena ionilor de PO43-
este indicat prin apariia unui percipitat galben sau o coloraie galben.
Identificarea SO42-: Se aciduleaz filtratul de saliv cu HCl 5% i se aduga
BaCl2 5%. n prezena ionilor SO42- apare un precipitat alb de sulfat de bariu.
Identificarea Ca2+: Se adaug la filtratul de saliv oxalat de amoniu 5%. n
prezena ionului de Ca2+ apare un precipitat alb de oxalat de calciu.
Identificarea SCN-: La filtratul de saliv se adaug 1-2 picturi de HCl 5% i 1-
2 picturi FeCl3 5%. n prezena ionilor de SCN- se formeaz Fe(SCN)3 de culoare
roie. La fumtori, n general, concentraia ionului SCN- este mai mare ca la nefumtori.
168
- scderi dup mese
- scderi la gravide
ct i n unele stri patologice - tulburri sanguine acido-bazice
- leziuni ale cavitii bucale
n timpul pstrrii salivei recoltate, pH-ul iniial neutru devine alcalin, din cauza
pierderii de CO2.
Determinarea capacitii tampon:
Principiu: Saliva dispune de un important efect tampon exercitat de urmtoarele
sisteme tampon: dicarbonat, fosfat i protein (mucin)
Capacitatea sistemelor tampon se exprim prin numrul de echivaleni de acid
sau baz care schimb pH-ul unui litru de soluie tampon cu o unitate. n scopuri
practice capacitatea poate fi exprimat i prin numrul mililitrilor de acid sau baz de
concentraie cunoscut, tamponate de un anumit volum de soluie tampon.
Reactivi: - HCl 0,01 N;
- NaOH 0,01 N;
- Metilorange (soluie de indicator) 0,1%;
- Fenolftalein (soluie de indicator) 0,1% n alcool.
Modul de lucru:
6 ml saliv se dilueaz cu 14 ml ap distilat. Saliva diluat se mparte n dou
probe de cte 10 ml. ntr-una din probe se pune 3 picturi de metilorange, iar n cealalt
3 picturi de fenolftalein. Cu ajutorul microbiuretei se adaug primei probe HCl N/100
iar celei de-a doua prob NaOH N/100, pn la virajul indicatorilor. Se noteaz volumul
de HCl N/100 i de NaOH N/100 consumate. Aceste volume se nmulesc cu factorii
soluiilor respective i se raporteaz la 1000 ml saliv.
Sucul gastric provine din secreia unui mare i variat numr de celule ale
mucoasei gastrice. Zona glandelor fundice elaboreaz secreia primar acid (secreie
parietal) care este de fapt o soluie apoas de acid clorhidric. Zona antropiloric
169
elaboreaz secreia primar alcalin (secreia neparietal), care este un amestec de
proteine, mucus, ioni de sodiu, potasiu, calciu, clorur i bicarbonat. Secreia alcalin
are rolul de a reduce aciditatea gastric prin neutralizare i diluie.
Sucul gastric rezult deci din amestecul celor dou secreii parietale i
neparietale din care rezult lichidul intens acidulat (pH = 1-2).
Principiu:
n laborator se determin aciditatea total, liber i legat. Aciditatea liber
reprezint concentraia ionilor de hidroniu provenii din acidul clorhidric liber.
Aciditatea legat reprezint concentraia ionilor de hidroniu legai de proteine, fosfai
acizi, acizi carboxilici i alte substane. Aciditatea total este dat de nsumarea celor
dou aciditi (liber i legat) i se poate defini ca fiind suma ionilor de hidroniu
titrabili cu NaOH 0,1 N.
170
Reactivi: - Indicatorul Tpfer : p-dimetilaminoazobenzen 0,25 g
fenolftalein 2g
alcool etilic 96%. 100 ml
- Sol. NaOH 0,1 N cu factorul FNaOH
Modul de lucru:
n trei flacoane Erlenmeyer de 100 ml se msoar cte 10 ml suc gastric i se
adaug 1-2 picturi de indicator Tpfer. Soluia se titreaz cu NaOH 0,1 N pn la
portocaliu i se noteaz cantitatea de NaOH 0,1 N folosit. Aceast cantitate reprezint
volumul folosit pentru dozarea aciditii libere i se noteaz cu v. Se continu titrarea
trecnd prin culoarea galben pn la apariia culorii roii. Totalul mililitrilor de NaOH
0,1 N consumai de la nceputul titrrii se noteaz cu v' i vor fi luai n considerare
pentru calculul aciditii totale.
Calcul: Rezultatul se exprim n uniti clinice (UC, numrul de ml de NaOH
0,1 N folosii la titrarea a 100 ml suc gastric).
aciditatea liber = v FNaOH 10 UC
aciditatea total = v' FNaOH 10 UC
Valoarea aciditii legat se obine fcnd diferena dintre aciditatea total i cea
liber.
Valori normale: aciditatea liber = 30 UC; aciditatea total = 50 UC.
Valori patologice:
Valori crescute: Hiperaciditate se ntlnete n stri de stres (stimulul simpatic
induce creterea secreiei de HCl n mucoasa gastric), n gastrite hiperacide, ulcer
gastric i duodenal. n tumori pancreatice secretoare de gastrin (gastrinoame), se
produc ulceraii multiple datorit hiperstimulrii secreiei de HCl de ctre gastrin
(sindromul Zollinger-Ellison).
Valori sczute: Hipoaciditatea apare n unele tipuri de gastrit. Aclorhidria, lipsa
total de HCl se datoreaz atrofiei mucoasei gastrice sau proliferrii ei tumorale
(celulele canceroase i pierd funciile fiziologice). O stare i mai grav este aclorhidria
histamino-refractar, cnd nici la stimulare cu histamin nu se secret HCl. n afar de
HCl, celulele parietale ale mucoasei gastrice mai secret i o glicoprotein numit factor
extrinsec care leag vitamina B12 i o transport la celulele intestinale pentru a se
absorbi. n cazul atrofiei mucoasei sau proliferrii ei canceroase, nu se secret acest
factor intrinsec i apare anemia pernicioas (prin deficitul de absorbie a vitaminei B12).
171
Analiza lichidului cefalorahidian
Componentele lichidului cefalorahidian (LCR) provin din plasm prin difuzie
liber i printr-un proces de secreie. Aceasta se observ comparnd compoziia chimic
a lichidului cefalorahidian cu aceea a plasmei:
Examenul fizic
Culoarea: LCR normal este incolor i limpede. n unele afeciuni este colorat n
galben, roz sau verzui. Aceast culoare se datoreaz prezenei bilirubinei sau
biliverdinei i este indiciul unei hemoragii la nivelul sistemului nervos central. LCR
172
poate fi colorat n rou datorit sngelui care poate proveni fie n mod accidental
datorit unei puncii greit efectuate, fie datorit unei afeciuni.
Transparena: n mod normal, LCR este transparent. n unele afeciuni poate fi
opalescent datorit prezenei n cantitate mare a leucocitelor, albuminei sau
microorganismelor. LCR este tulbure n meningitele purulente. Un aspect particular l
prezint n cazul meningitei tuberculoase cnd probele vor forma o pelicul de fibrin la
suprafa.
Densitatea: Densitatea normal a LCR este foarte apropiat de aceea a apei:
1,006-1,008 g/cm3. Densitatea crete n unele afeciuni patologice. Ea se determin cu
areometre speciale de dimensiuni mici.
Modul de lucru:
n dou eprubete (I pentru cercetarea hipoglicorahiei i II pentru cercetarea
hiperglicorahiei) se msoar:
I II
L.C.R. ml 2,0 0,6
H2O dist. ml - 2,0
Reactiv Fehling ml 0,2 1,0
173
Fierbere 5 minute n baie de ap
Interpretarea: - I i II negativ (albastru) - hipoglicorahie
- I negativ (albastru) i II pozitiv (rou) - normoglicorahie
- I i II pozitiv (rou) - hiperglicorahie
Dozarea glucozei din LCR se poate efectua prin metoda enzimatic cu glucozo-oxidaz.
Valorile fiziologice ale glicorahiei: 55-70 mg/100 ml, sunt valoari cuprinse ntre
jumtate i 2/3 din glicemie. Acest raport, n cazuri normale, rmne constant, iar
variaiile glicorahiei sunt aceleai cu ale glicemiei.
Valori patologice: Valori crescute numai pentru glicorahie se ntlnesc n
tumori, encefalite, abcese cerebrale. Glicorahia scade mult n meningita tuberculoas.
Analiza scaunului
174
Patologie: Sngele apare n scaun cel mai frecvent datorit lezrii hemoroizilor
n timpul defecrii. Tumorile colonului (benigne i maligne) pot determina o sngerare
de obicei ocult (invizibil cu ochiul liber), care se poate decela cu aceast prob.
Uneori chiar sngerrile gastrice se pot exterioriza pe cale fecal prin snge proaspt
(cnd tranzitul intestinal este accelerat sngele nu are timp s fie digerat), dar cel mai
frecvent n caz de hemoragie digestiv superioar apare melena (scaun negru, ca
pcura).
Semnele de malabsorbie/maldigestie n scaun
Evidenierea glucidelor din scaun
- n scaun pot apare glucide reductoare (glucoz, fructoz, lactoz) detectabile
cu reaciile Benedict, Barfoed, etc. (v. cap. Analiza glucidelor). Aceste glucide sunt
eliminate prin scaune diareice n caz de malabsorbie glucidic.
- Se pot detecta i polizaharidele nedigerate din materiile fecale.
Mod de lucru:
Se adaug cteva picturi de soluie Lugol (cu coninut de iod) la scaunul
proaspt eliminat. Amidonul nedigerat d o coloraie albastr cu iodul, iar n caz de
digestie incomplet compuii intermediari de degradare (dextrinele) dau o coloraie
roie.
Patologie: n cazul secreiei deficitare de amilaz pancreatic apar amidonul i
dextrinele n materiile fecale.
Evidenierea lipidelor din scaun
n condiii normale materiile fecale conin o cantitate foarte mic de lipide. Dac
crete aceast cantitate (steatoree), scaunul capt un luciu caracteristic i, prin
amestecarea fecalelor cu ap, apar pete de grsime pe suprafaa apei.
Mod de lucru:
Scaunul proaspt eliminat se coloreaz cu Sudan III (rou Sudan). Cu acest
colorant se pot evidenia lipidele nedigerate, deoarece trigliceridele i esterii
colesterolului se coloreaz n rou.
Patologie:
n scaun apar lipide nedigerate n secreia insuficient de lipaz pancreatic i n
deficitul de acizi biliari datorat obstruciei cailor biliare sau incapacitii hepatice de
secreie a acestora, stri care au consecin malabsorbia lipidic.
175
Evidenierea proteinelor din scaun
Mod de lucru:
Se examineaz la microscop preparatul nativ (fr coloraie) al probei de scaun.
Se pot recunoate uor mai ales fibrele musculare nedigerate, care arat deficitul
digestiei proteice.
Patologie: Maldigestia proteic este datorat secreiei insuficiente de proteaze
pancreatice.
Fotometria
Principiu:
Fotometria se bazeaz pe excitarea luminoas a electronilor moleculelor
substanei.
Dup lungimea de und, exprimat n nanometri (nm) sau n ngstrmi (),
spectrul undelor electromagnetice folosite n fotometrie se mparte n 3 regiuni:
- ultraviolet 200 - 450 nm,
- vizibil 400 - 800 nm,
- infrarou 800 - 20000 nm,
Metoda spectrofotometric de analiz se bazeaz pe determinarea extinciei unui
strat de soluie colorat cu grosimea de 1 cm, la diferite lungimi de und
Pentru obinerea radiaiilor de diferite lungimi de und spectrofotometrele conin
trei tipuri de monocromaoare: prisme, reele de difracie sau filtre.
Lungimile de und corespunztoare diferitelor culori sunt redate n tabelul de
mai jos:
176
Efectuarea analizelor prin metoda colorimetric prezint avantajul c necesit
cantiti mici de substan i un timp relativ redus n comparaie cu analizele chimice.
Legea Bouguer-Lambert-Beer, lege fundamental a colorimetriei
n condiii similare, straturile de substan colorat de aceeai grosime absorb
aceeai cantitate de lumin incident, absorbie ce se exprim matematic prin ecuaia:
I = I 0 e K l
n care I este intensitatea fluxului luminos dup trecerea prin soluie; I0 - intensitatea
fluxului luminos incident; e - baza logaritmilor naturali; l - grosimea stratului; K -
coeficient de absorbie optic.
Dac se ia ca baz zecimal de logaritmare, rezult ecuaia:
I = I0 10 kl
Din aceast ecuaie, n care coeficientul k reprezint coeficientul de extincie, rezult c:
a. Raportul ntre intensitatea luminii care a trecut prin stratul de soluie i
intensitatea luminii incidente nu depinde de intensitatea absolut a luminii incidente.
b. Cnd grosimea stratului de soluie se mrete n progresie aritmetic,
intensitatea luminii care trece prin aceasta descrete n progresie geometric.
c. Coeficientul de extincie k, depinde numai de natura substanei dizolvate i
lungimea de und a luminii incidente i este valabil numai pentru lumin
monocromatic. Aceast lege a fost stabilit de ctre P.Bouguer i I.Lambert.
Beer a stabilit c, coeficientul de extincie k este liniar proporional cu concentraia
substanei absorbante, adic :
k=C
n care C este concentraia substanei colorate iar este un coeficient care nu depinde de
concentraie.
Legea lui Beer stabilete dependena absorbiei luminii de ctre stratul cu
grosime constant de concentraia substanei colorante.
Din ultimele dou ecuaii rezult ecuaia legii fundamentale a colorimetriei -
legea Bouguer-Lambert-Beer:
I = I0 10 Cl
Raportul dintre intensitatea luminii, I, care a trecut printr-o soluie i intensitatea
luminii incidente, I0, poart denumirea de transparen sau transmisie i se noteaz cu
litera T:
T = I/I0 = 10 Cl
177
Valoarea T pentru un strat de 1 cm grosime se numete coeficient de transmisie.
Logaritmul mrimii inverse transmisiei se numete extincie, E, sau densitate
optic, D.O.:
E = D.O. = lg 1/T = lg I0/I = C l
Din aceast ecuaie rezult c extincia E este liniar proporional cu
concentraia substanei colorate din soluie.
Spectrofotometru Spekol
178
Spectrofotometru Spekol
179
Recomandri:
Fotoelementul i pierde din sensibilitate dac este expus luminii timp ndelungat. De
aceea timpul de iluminare a fotoelementului va fi redus la minimul posibil.
Pentru a evita spargerea cuvelor se va lucra cu ele exclusiv deasupra mesei, la mic
nlime.
Suprafeele optice ale cuvelor trebuie s fie perfect curate, de aceea se va evita
atingerea pereilor transpareni.
Umplerea cuvei se va face innd cuva nclinat la aproximativ 45 i turnnd lichidul
pn la circa 2/3 din nlime.
Cuva se va goli prin rsturnare brusc n poziia cu gura n jos i pstrnd aceast
poziie se va aeza pe o hrtie de filtru curat.
Dup folosirea cuvelor se spal cu ap distilat i se aeaz cu gura n jos pe o hrtie
curat.
Principiu:
O parte din atomii speciei ce urmeaz a fi analizai sunt excitai n fllacr la un
nivel energetic superior emind apoi prin revenirea la nivelul iniial o radiaie
corespunztoare liniei de rezonan. Dar majoritatea atomilor rmn n starea
fundamental. n spectroscopia de absorbie atomic se trece prin flacr o radiaie
avnd frecvena liniei de rezonan. Atomii rmai n starea fundamental absorb
aceast radiaie (pe care ar emite-o dac ar fi excitai) i absorbia este proporional cu
concentraia atomilor n flacr i grosimea stratului strbtut de radiaia
monocromatic.
180
determinm. Sunt i lmpi care au catozi fcui din aliaje astfel c pot fi folosite pentru
determinarea tuturor elementelor din care este fcut aliajul.
2. Atomizorul are rolul de a trece elementul de analizat sub form de atomi. Se folosesc
atomizoare de flacr sau cu cuptor de grafit.
a) Atomizoarele de flacr sunt alimentate cu amestecuri de gaze cum ar fi:
aer-acetilen; aer-hidrogen; aer-propan; N2O-acetilen etc. Proba de analizat este
introdus n atomizor prin aspirare i pulverizare.
b) Atomizorul cu cuptor de grafit este nclzit cu curent electric dup un
program reglabil. Pentru a feri cuptorul (tubul de grafit), de ardere se folosesc gaze de
protecie. n general, ca gaz de protecie se folosete argonul sau azotul. La aparatele
dotate cu atomizor cu cuptor de grafit se pot analiza probe lichide sau solide. Probele
lichide se introduc cu ajutorul unor seringi iar probele solide cu ajutorul unor pensete.
3. Monocromatorul izoleaz linia de rezonan i o focalizeaz asupra detectorului.
4. Fotomultiplicatorul detecteaz i amplific intensitatea luminii care cade asupra sa.
Practic, aparatul este ajustat la extincia zero cnd o soluie martor este
vaporizat n prob i lumina lmpii ajunge la fotomultiplicator. Cnd se introduc soluii
coninnd specii absorbante o parte din lumin este absorbit i rezult o diminuare a
intensitii luminii ce ajunge la fotomultiplicator. Se determin extinciile obinute cu
soluii standard ale elementului de analizat cu care se construiete o curb de etalonare a
aparatului. Se introduc apoi probele de analizat prelucrate n mod corespunztor iar din
compararea extinciilor probelor cu curba de etalonare se calculeaz concentraia
elementului de analizat.
Flamfotometria
181
energetic inferior elibereaz energia absorbit sub form de lumin cu lungime de und
caracteristic elementelor chimice ai crui atomi sunt excitai.
Prin excitarea n flacr a acestui amestec complex iau natere diferite spectre de
emisie. Radiaia emis este focalizat pe o celul fotoelectric, dup ce au trecut prin
filtre optice de selecie. Ia natere astfel un fotocurent care se msoar cu ajutorul unui
galvanometru. n cazul determinrii unui anumit element (sodiu, potasiu, calciu etc.),
intensitatea fotocurentului este proporional cu concentraia elementului respectiv din
soluie.
Pulverizatorul pulverizeaz automat n picturi foarte fine soluia de analizat. El
este confecionat din sticl, cuar sau material plastic. Pulverizarea se realizeaz n felul
urmtor: gazul purttor comprimat, care iese cu vitez mare n apropierea tubului cu
soluie, antreneaz soluia de analizat i o pulverizeaz n particule foarte fine. Soluia
pulverizat ajunge in flacra arztorului, unde se vaporizeaz iar ionii absorbii se
excit. Pentru ca analiza s se desfoare n condiii optime este necesar meninerea
unei presiuni constante att pentru aer ct i pentru gazul de ardere. Reglarea presiunii
se realizeaz cu ajutorul unor reductoare de presiune i se msoar cu manometrul.
Gazul purttor poate fi aerul sau oxigenul.
182
Amestec de gaze Temperatura flcrii msurat n C
Gaz de iluminat aer 1700 1840
Propan aer 1925
Hidrogen aer 2000 2045
Acetilen aer 2125 2397
Hidrogen oxigen 2550 2660
Propan oxigen 2850 (calculat)
Acetilen oxigen 3100 3137
183
Aceast diferen de potenial este, cum se vede, ntr-o relaie linear cu pH-ul soluiei
probei, deoarece pHelectrod = constant. Ea se poate msura cu pH-metrul. Acesta este un
milivoltmetru cu impedan de intrare mare, datorit rezistenei electrice mari a
electrodului de sticl, cu scal de pH, numit pH-metru. Pentru msurarea pH-ului unei
soluii necunoscute este necesar n prealabil calibrarea pH-metrului cu ajutorul a dou
soluii tampon cu pH cunoscut.
Avantajele pe care le prezint metoda poteniometric fa de cea colorimetric
sunt:
- exactitate mare, 0,01 n cazul pH-metrelor obinuite ca de exemplu
cel de tip MV-84, sau chiar 0,001 n cazul pH-metrelor
performante ca de exemplu cel de tip Radiometer-Copenhagen.
- pot fi analizate soluii colorate, vscoase, cu proprieti redox
- timp de msurare foarte scurt (1-2 minute)
184
Valori patologice de laborator care amenin viaa
Na seric sub 120 mmol/l peste 160 mmol/l
K seric sub 3 mmol/l peste 8 mmol/l
Ca seric sub 1 mmol/l peste 4 mmol/l
Cl seric sub 80 mmol/l peste 120 mmol/l
HCO3- seric sub 10 mmol/l peste 40 mmol/l
pH sub 7,00 peste 7,7
PCO2 sub 20 mmHg peste 80 mmHg
PO2 sub 40 mmHg peste 400 mmHg
Glicemie sub 2,5 mmol/l peste 56 mmol/l
Hematocrit sub 20% (pierdere acut)
Indice de protrombin sub 20%
185
Amoniac Se 50 80 g/100 ml (29 47 mol/l)
U 0,3 1,2 g/24 ore (17,6 71 mmol/24 ore)
Bilirubina Se total cca. 1mg/100ml (17mol/l);
direct cca. 0,25 mg/100ml (4,3mol/l)
Calciu (total) Se Copii 7 14 mg/100ml (1,8 - 3,5 mmol/l; 3,57 mEq/l)
Aduli 9 11 mg/100ml (2,2 - 2,8 mmol/l; 4,5-5,5 mEq/l)
U Sugari 0,01 - 0,14 g/24 ore (0,25 - 3,5 mmol/24 ore)
Copii 0,10 - 0,14 g/24 ore (2,5 - 3,5 mmol/24 ore)
Aduli 0,10 - 0,40 g/24 ore (2,5 - 10,0 mmol/24 ore)
L 4 6 mg/100ml (1 - 1,5 mmol/l)
Clor St 280 320 mg/100ml (79 90 mmol/l)
Se 340 390 mg/100ml (96 110mmol/l)
L 410 460 mg/100ml (115 130mmol/l)
U 600 900 mg/100ml (169 254mmol/l)
SG 300 530 mg/100ml (85 149mmol/l)
Colesterol Se total 150 250 mg/100ml (3,9 - 6,5 mmol/l)
esterificat 60 80% din colesterolul total sau
colesterol esterificat / colesterol total = 0,6 - 0,8
Creatinin Se Brbai 0,8 - 1,8 mg/100ml (71 159 mol/l)
Femei 0,6 - 0,9 mg/100ml (53 80 mol/l)
0,6 1,8 mg/100 ml (53 - 159 mol/l)
U Brbai 26 mg/kg GC (230 mol/kg GC)
Femei 22 mg/kg GC (190 mol/kg GC)
Fer Se Brbai 90 160 g/ 100ml (16,1 28,6 mol/l)
Femei 80 130 g/ 100ml (14,3 23,3 mol/l)
Fosfataz alcalin Se Sugari 3 10 UB/100 ml (25 83 UI/l)
Copii 2 8 UB/100 ml (16,6 66,4 UI/l)
Aduli 2 4 UB/100 ml (16,6 33,2 UI/l)
Fosfataz acid Se
total 4,5 13,5 UI/l
prostatic 0,05 3,6 UI/l
186
Glucoz St Iodo- 80 120 mg/100ml (4,4- 6,6 mmol/l)
metric
o-tolu- 70 100 mg/100ml (3,9- 5,5 mmol/l)
idin
Se Glocoz- 70 104 mg/100ml (3,9 - 5,8 mmol/l)
Pl oxidaz
L 50 - 70 mg/100ml (2,8 3,9 mmol/l)
U <30 mg/100ml (<1,7 mmol/l)
GOT Se aduli 2 - 20 UI/l
copii sub 40 UI/l
3 luni
187
Fosfor anorganic St 30 50 mg/100ml (9,7 16,1 mmol/l)
Se Copii 4 6 mg/100ml (1,3 1,9 mmol/l)
Aduli 2,5 4,5 mg/100ml (0,8 1,15 mmol/l)
L 1 1,8 mg/100ml (0,3 0,6 mmol/l)
Proteine totale Se 6,5 - 8,2 g/100ml
Pl Copii 5 7,5 g/100ml
Aduli 6,5 - 8,5 g/100ml
L 10 30 mg/100ml
Fraciuni proteice Se Alb. 3,50-4,20 g/100ml
1 0,25-0,40 g/100ml
2 0,50-0,65 g/100ml
1+ 2 0,80-1,02 g/100ml
1,10-1,40 g/100ml
FBG 0,2 0,4 100 g/100 ml
Uree Se 21 54 mg/100ml (3,5 9 mmol/l)
U 20 30 g/24 ore (0,33 - 0,50 mol/24 ore)
L 20 60 mg/l (0,33 - 1,00 mmol/l)
188
189