Teste care realizeaza

vizualizarea complexelor
antigen-anticorp prin
artificii tehnice
Marirea sensibilitatii reactiei Ag-Ac se poate
face prin legarea unui marker usor de
identificat de complexul Ag-Ac format, marker
care nu interfereaza cu proprietatile
imunologice ale reactantilor.
Markeri pot fi:
o substanta fluorescenta ( izotiocianat de
fluoresceina, rodamina) in tehnica de
imunofluorescenta IF
un izotop radioactiv ( I125 ) in tehnica
radioimunotestarii RIA
o enzima ( peroxidaza din hrean, beta-
galactozidaza, fosfataza alcalina) in testele
imunoenzimatice ELISA.
teste imunochimice cu detectie prin
chemiluminiscenta (CLIA)
Prin cuplarea unei substante fluorescente cu
anticorpii se obtin anticorpi fluorescenti, care se
fixeaza pe antigenul omolog si formeaza
complexe imune fluorescente, vizibile in
ultraviolet la examinarea cu microscopul special.
Metoda indirecta
Se realizeaza in doi timpi.
Produsul patologic se incubeaza cu
anticorpii specifici, nemarcati. Pentru
vizualizarea complexului imun format se
adauga ser antiimunglobulina marcat.
(antiimunglobuline fata de imunglobulinele
speciei animale pe care s-au obtinut
anticorpii nemarcati.)
Un singur ser marcat poate fi utilizat la
detectarea complexelor Ag-Ac, anticorpii
fiind obtinuti pe aceeasi specie animala ca
serul antiglobulinic marcat.
Metoda directa
Anicorpi monospecifici sunt conjugati cu
substanta fluorescenta. Produsul patologic
care urmeaza a fi testat se etaleaza pe lama
dupa care se incubeaza cu anticorpii
fluorescenti.
Examinarea se face in lumina UV,
complexele formate fiind flurescente.
Pentru aceasta metoda trebuie sa avem
serurile fluorescente specifice fiecarui
atigen cautat.
Aplicatii:- evid Antigenelor dintr-un produs
patologic
Detectarea Anticorpilor dint-un ser , folosind
Ag cunoscut
Diagnostic in bacteriologie : Mycoplasama,
sifilis, Haemophilus.
Diagnostic in infectiile virale: in rabie este
metoda de electie.
Diagnostic in infectiile parazitare: toxoplasma
gondi, pneumocystis carini.
Diagnostic in infectiile fungice.
Antigenul sau anticorpul se cupleaza cu enzime
cu o mare activitate ( peroxidaza din hrean,
fosfataza alcalina, ureaza). Complexul imun
format este apreciat prin cuantificarea activitatii
enzimatice fata de un substrat specific.
Tehnica imunoenzimatică ELISA este bazată pe
reacţia Ag-Ac.
Sistemul de analiză constă din mai multe reacţii:
- Ag sau Ac este imobilizat pe suport solid
(plăci de pastic cu godeuri)
- Ag sau Ac din proba de testat se leagă
specific de reactantul imobilizat
- reactantul marcat enzimatic reacţionează cu
complexul reactant imobilizat-Ag (sau Ac) din
probă
Reactantul marcat enzimatic format din Ag (sau
Ac) conjugat cu o enzimă este activ atât
imunologic cât şi enzimatic şi reacţionează atât cu
Ag (sau Ac) din probă imobilizat pe suportul solid
cât şi cu substratul corespunzător enzimei.
Vizualizarea reacţiei dintre reactantul enzimatic şi
complexul Ag-Ac iniţial se realizează prin adăugarea
unui substrat corespunzător enzimei utilizate.
Formarea complexului este identificată prin reacţia de
culoare care apare la adăugarea substratului specific
(p-nitrofenilfosfat disodic pentru fosfataza alcalină şi
tetrametilbenzidina pentru peroxidază).
Intensitatea culorii indică prezenţa sau absenţa Ag,
respectiv Ac din probă (se citeşte spectrofotometric
folosind un cititor de plăci ELISA).
1.Tehnica indirecta
Antigenul cunoscut este adsorbit pe suport de
polistiren
Se pune serul cu anticorpii de identificat, se
incubeaza, se spala,
Se adauga serul antiimunglobulina marcat
enzimatic, se incubeaza
Se adauga substratul.
Se masoara intensitatea reactiei de culoare
prin spectrofotometrie.
ELISA indirectă. Utilizată în serodiagnostic. Ag
cunoscut este fixat la fundul godeurilor. Ac (serul
testat) se întroduce în godeu, după 1h se spală
totul şi se adaugă ligandul marcat cu enzimă
(anti-Ig sau proteina A cuplate cu enzimă). Acest
ligand se fixează pe Ac testaţi. Se adaugă apoi
substratul cromogen. Cantitatea de Ac se măsoară
după densitatea optică a lichidului din godeuri.
2. Tehnica sandwich
Ac cunoscuti sunt fixati pe suport solid
Se adauga proba cu antigen, se incubeaza, se spala
Se adauga anticorpi specifici marcati enzimatic,
incubare, spalare
Se adauga substratul pentru enzima
Se citeste intensitatea culorii prin
spectrofotometrie
ELISA directă (metoda sandwich). Utilizată doar în
sero-identificarea Ag. În godeurile din placa de
polistiren în care sunt fixaţi Ac cunoscuţi se toarnă
soluţia de Ag necunoscut. Se incubează 1h. După o
spălare minuţioasă a godeurilor se adaugă Ac marcaţi
cu enzime, care se fixează pe epitopii liberi ai Ag
polivalent. După incubare de 30 min-1h se spală iarăşi
godeurile. Prezenţa complexului Ac-Ag-Ac-marcat se
depistează cu ajutorul substratului cromogen
(substanţă iniţial incoloră, dar care se colorează sub
acţiunea enzimei, ex. apa oxigenata si
orthofenilendiamina.
Aplicatii:
detectarea anticorpilor bacterieni, virali,
parazitari, fungici
detectarea Ag. Virale, parazitare, bacteriene, a
toxinelor bacteriene.
Tehnica imunoblot (western blot) permite
identificarea Ag sau ai Ac dintr-un amestec.
I etapă – electroforeza în gel a probei de Ag
II etapă – transferul electric al Ag pe membrana de
nitroceluloză
III etapă – pe membrană sunt aplicaţi succesiv Ac
dirijaţi contra Ag, apoi conjugatul marcat cu enzimă,
care permite depistarea Ac fixaţi. După o spălare se
adaugă substratul cromogen. Fiecare complex Ag-Ac
formează zone colorate distincte. Utilizare: depistarea
Ac anti-HIV, caracterizarea Ac monoclonali.etc
Proteinele sunt separate electroforetic în gel poliacrilamid. Sub
acţiunea câmpului electric are loc difuzia proteinelor conform
greutăţii moleculare, aranjându-se în zone liniare subţiri
diferite: mai aproape de start se aranjează proteinele cu masă
moleculară mare (120-150 kDa), la final se aranjează proteinele cu
masă moleculară mică (5-10kDa).
•Apoi lamela de gel este transferată pe o foaie de nitroceluloză
amplasată între electrozii unei surse de curent continuu. Sub
acţiunea câmpului electric are loc trecerea proteinelor din gel pe
nitroceluloză, unde se fixează foarte bine pe hârtie.
•Proteinele fixate sunt marcate cu o enzimă (e.g. alkaline
phosphatase sau peroxidase) incoloră.
•Procedura ulterioară de montare a reacţiei este similară tehnicii
ELISA.
Se face prin marcare cu Iod 125, rar cu C14, H3, a
unuia dintre reactanti Ac, Ag, sau a serului
antiglobulinic care reactioneaza cu complexul
imun format, masurandu-se radioactivitatea
complexului imun format.
Reactiile se pot lucra fie in faza solida fie in faza
lichida.
Aplicatii:
Decelarea toxinei stafilococice, botulinice,
determinarea polizaharidelor capsulare, dg.
gripei, herpes, hepatitelor etc.
Analiza radioimunologică (RIA) este o tehnică de
determinare cantitativă a unui număr mare de
substanţe prezente în lichidele biologice în
cantitate foarte mică.
RIA este o tehnică obiectivă, cu mare
sensibilitate, parţial automatizată, aparatură
costisitoare (echipament nuclear), reactivi
scumpi, cu durată de utilizare scurtă, personal cu
calificare specială, supusă unei legislaţii speciale
(radioizotopi).
Utilizeaza pentru marcare molecule care
genereaza chemiluminiscenta, cum ar fi
derivati de luminol, esteri acridinici, derivati
de oxalat de nitrofenil. O varianta a acestora o
constituie testele imunochimice cu detectie
prin electrochemiluminiscenta (ECLIA) care
utilizeaza pentru marcare anumiti compusi
organici (complexe de ruteniu, osmiu, etc.)
care genereaza lumina electrochimic.