Structura receptorilor nuleari Receptorii nucleari sunt alcatuiti din urmatoarele regiuni distincte: -o regiune A/B amino-terminala, care

contine in interior un domeniu de activare transcriptionala AF1activation Function -a 2-a regiune C, de legare de ADN -aceasta regiune este pozitionata la nivelul adanciturii majore din ADN -contine 2 motive zinc-finger -in fiecare motiv zincul este asociat cu 4 cisteine, de unde denumirea clasei de C4 -aa-zii de la baza helixului primului motiv zinc-finger, interactioneaza cu promotorul genelor -poarta denumirea de P-Box -aa-zii de la baza structurii pliate a celui de-al 2 motiv zinc-finger sunt implicati in dimerizare -poarta denumirea de D-Box (D-dimerizare) -a 3-a regiune D, de intereactie cu co-represorii -a 4-a regiune E, de legare a ligandului, care contina inafara domeniului de legare a ligandului un al 2-lea domeniu de activare transcriptionala denumit AF-2 si un al 2-lea domeniu de dimerizare -a 5-a regiune F, COOH terminala, variabila ca lungime, care poate lipsi in unii receptori nucleari DESEN 1 -Analizele moleculare au evidentiat ca multi receptori nucleari prezinta secvente P-Box identice si din acest motiv s-a pus problema cum asigura acestia o specificitate biologica -s-a demonstrat ca multi receptori nucleari se leaga la secvente repetitive specifice denumite elemente de raspins la acid retinoic si anume, secventele RARE-RETINOIC ACID RESPONSE ELEMENT, sau elemente de raspuns la hormoni: HRE-HORMONE RESPONSE ELEMENT -aceste elemnte poti fi repetate direct, indirect sau opus si pot fi separate prin una pana la 5 nucleotide -posibilitatea de a lega 15 receptori nucleari diferiti DESEN 2 -receptorii nucleari pot forma homo sau hetero dimeri -de ex: - receptorii pentru hormoni steroizi se leaga de ADN sub forma de homo-dimeri - receptorii pentru acizii retinoici se pot lega de ADN, fie ca homo-dimeri (dimerii RXR) sau ca hetero-dimeri RAR/RXR -in cazul heterodimerilor RAR/RXR, monomerul RAR vine in contact cu complexul transcriptional bazal -a fost descrisa si o categorie de receptori nucleari denumiti orphan (orfani), care se pot lega sub forma monomerica de ADN -au fost numiti orfani, pentru ca nu li s-a descoperit ligandul -acest termen nu mai este de actualitate, pentru ca pe de o parte la unii s-a descoperit ligandul -iar altii nu au nevoie de ligand pentru a se lega de ADN Modelul activarii transcriptionale de catre receptorii nucleari -ex: heterodimerul RAR/RXR -in absenta ligandului heterodimerul RAR/RXR nu recunoaste secventele RARE(elem de raspuns la acidul retinoic), deoareec activitatea monomerului RAR este blocata de un co-represor -daca ligandul se leaga de monomerul RXR, heterodimerul nu poate recunoaste secventele RARE -in momentul in care ligandul reactioneaza cu monomerul RAR, are loc o modificare de conformatie a acestuia, care permite pe de o parte eliberarea co-represorului, recrutarea unui co-activator si initierea transcriptiei genei respective -daca ulterior un alt ligand se leaga de monomerul RXR, are loc recrutarea mai multor co-activatori care pot modula activitatea transcriptionala (gena respectiva este ment pe ON top indelungat, insa int cu care se realizeaza transcriptia este diferita) DESEN 3 extra -denumirea unui co-activator SRC-steroid receptor coactivator -co-represor-NCor-nuclear corepresor 1

Superclasa Factorilor Transcriptionali (FT) cu domenii bazice I. Clasa Leucin-zipper II. Clasa Helix-Loop-Helix (HLH) I. Clasa Leucin-zipper -in forma lor monomerica, acesti fari transcriptionali ctcontin 2 domenii caracteristice -un domeniu ...COOH terminal..........de dimerizare -un domeniu bazic-animo terminal de legare de ADN -regiunea de dimerizare -analiza secventei de aa, a aratat ca acest domeniu este format dintr-o succesiune de heptade (7 aa) -denumiti a, b, c, d, e, f, g, -aa din pozitiile a si d sunt localizati la suprafata alfa helixului -ei sunt implicati in formarea unei structuri coiled-coil, prin interactii Wan-der-walls cu acelasi tip de aa-zi, din domeniul de dimerizare al altei proteine leucin-zipper -prezenta acestor aa hidrofobi din pozitiile a si d, precum si prezenta leucinei, tot in pozitia g a heptadei, a dus la denumirea de leucin-zipper -coiled coil-cele 2 alfa helixuri se inconjoara una in jurul celeilalte -au fost intalnite la niste elemente de citoschelet Elementele citoscheletului -microtubuli -microfilamente de actina -filamente intermediare au structura coiled coil -a 2-a regiune bazica de legare de ADN -aa-zii de la nivelul suprafetei interne a regiunii bazice, inetactioneaa cu perechile de baze din ADN si recunosc o secventa generala TGACGTCA -intre acesti factori transcriptionali leucin zipper si ADN si realizeaza o serie de contacte cheie -intre aa din regiunea bazica si perechile de baze din ADN -factorii transcriptionali leucin-ziper pot forma homo sau heterodimeri -heterodimerii alcatuiti din monomeri cu specificitati de legare diferite, largesc fr mult posib de legare a acestoi factori transcriptionali de diferite gene tinta -ex: de factori transcriptionali leucin-zipper -AP1-Activating Protein 1 -CCAAT/EBR-Enhancer Binding Protein se leaga de secventa CCAAT (reprezinta un enhancer) -acesti FT st implicati in adipogeneza, hematopoeza, -EBR, prezinta in ficat 2 izoforme: -izoforma LAP-Liver Activator Protein-cont str normala a proteinelor leucin-zipper -izoforma LIP-Liver Inhibitory Protein-nu contine regiunae bazica de legare de ADN -cand izoforma LIP diemrizeaza cu forma LAP, ii blocheaza activitatea, deoarece se realizeaza doar jumatate din contactele necesare, pentru legarea de ADN. II. Clasa helix-loop-helix -FT din aceasta clasa contin 2 -helixuri, unite printr-o bucla flexibila si variabila ca lungime -regiunea bazica de legare de ADN recunoaste o secventa specifica CANNTG, unde NN (oricare nucleootide) -secventa care se numeste E-Box, pentru ca a fost descoperita initial intr-un enhancer -intre FT si ADN se formeaza o serie de contacte cheie -acesti FT se leaga sub forma dimerica de ADN, pot forma homo sau heterodimeri -si in acest caz pot exista proteine HLH incomplete (nu contin toata, sau o buna parte din regiunea bazica de legare de ADN) 2

-aceste proteine HLH incomplete, atunci cand dimerizeaza cu proteinele HLH integi, le blocheaza activitatea -dimerul este inactiv -Mecanismul miogenezei, serveste ca model, pentru explicarea mecanismului de actiune a FT miogeni -FT HLH miogeni sunt reprezentati de MyoD, Myf-5 si miogenina -aceste proteine devin functionale prin heterodimerizarea cu un membru al familiei de proteine HLH ubiquitare (in toate celulele) din care fac parte proteinele E12 si E47 -activitatea proteinelor miogene este blocata prin interactia cu o proteina HLH incompleta denumita IdInhibitor diferentiation -determinarea si diferentierea sunt stari care se exclud -celulele musculare se pot diferentia numai dupa ce si-au incheiat perioada de proliferare din cursul starii determinate -succesiunea acestor 2 stari (determinare si diferentiere) este asigurata de 2 mecanisme moleculare: -1. blocheaza diferentierea prematura a mioblastelor odata cu aparitia in citoplasma a FT MyoD si Myf-5 -acest mecanism asigura determinarea celulara si blocheaza dierentierea -in prezenta factorilor de crestere care stimuleaza mitoza prin legarea lor de receptorii din membrana plasmatica a mioblastelor, se initiaza cai de semnalizare care au urmatoarele consecinte: -a) consecinte care conduc la activarea diviziunii celulare: -activarea proteinelor Rb(retinoblastoma)-este o fosfoproteina localizata in nucleu si implicata in ciclul celular, ea se gaseste in stare defosforilata in celulele in repaus G0 sau G1 si fosforilata odata cu tranzitia la faza S. In cazul celulelor musculare, calea de semnalizare initiata de factorii de crestere activeaza o protein-kinza C, care fosforileaza retinoblastoma pe resturile de treonina -activarea FT AP-1 -Rb si AP-1 stimulaza diviziunea retinoblastelor -b) blocarea diferentierii mioblastelor caile de semnalizare induse de factorii de crestere determina 2 fenomene moleculare: -activarea unei protein-kinaze C care fosforileaza o parte din proteinele miogene, a.i. acestea in stare fosforilata, numai pot recunoaste secventa E-Box din ADN -are loc transcrierea intensa a genei Id, a.i. proteina Id, heterodimerizeaza cu alta parte din proteinele miogene (MyoD si Myf-5) blocandu-le activitatea -in consecinta, datorita acestor mecanisme, proteinele miogene desi prezinta in celula (in mioblaste), nu pot induce diferentierea musculara -2. initiaza diferentierea mioblastelor si impiedica reintoarcerea celulelor diferentiate in ciclul celular -se initiaza diferentierea si se blocheaza diviziunea celulara -in absenta cailor de semnalizare initiare de factorii de crestere, se sintetizeaza foarte multe proteine miogene (MyoD si Myf-5) -o parte din acestea heterodimerizeaza cu proteinele E12 si E47, initiind diferentierea celulara -iar altele heterodimerizeaza cu Rb si AP-1 -legarea de proteina Rb (retinoblastoma) acopera situsul de fosforilare a.i. Rb ramane in stare defosorilata inactiva -acest model este sustinut de obs experimentale, care au demonstrat ca in mom. diferentierii celulare, mioblastele pierd receptorii pentru factorii de crestere DESEN 4-teoria de mai sus pt examen Superclasa Ft cu motiv HTH -Helix Turn Helix -motivul HTH de aproximativ 20 de aa, a fost descooperit initial la PK -acest motiv este format din 2 alfa helixuri, unite printr-un elem str scurt, de forma unei bucle, denumit Turn -pentru ca cel de-al 2-lea helix al motivului se pozitioneaza la nivelul fosei majore din ADN -el poarta denumirea de Helix de recunoastere 3

-proteinele din aceasta superclasa, contin inafara motivului HTH si alte particularitati pe baza carora au fost impartiti in calse si familii Clasa proteinelor cu homeodomenii -in extremitatea carboxiterminala a proteinelor cu homeodomeniu -exista un motiv similar HTH -homeodomeniul insa, are 3 alfa helixuri impachetate intr-o structura globulara, in care primul si al 2-lea helix sunt perpendiculare pe al 3-lea -astfel homeodomeniul este format din: -un alfa helix precedat de un brat flexibil amino terminal si unit de al 2-lea helix printr-o bucla -motivul HTH este reprezentat de helixurile 2 si 3 -cel de-al 3-lea helix fiind de recunoastere -DESEN 5 -homeodomeniul este codificat de o regiune specifica dn ADN denumita homeobox -genele care contin homeobox codifica pentru proteine cu homeodomenii -spre deosebire de proteinele HTH de la PK, care se leagad e ADN ca dimeri -proteinele cu homeodomeniu functioneaza ca monomeri in procesul transcriptional -proteinele cu homeodomeniu recunosc secvente specifice din ADN, de tipul ATTA -aa din poz 50 a helixului de recunoastere, contactand perechea de baze localizata inaintea acestei secvente -de ex: GGAATTA este recunoscuta de aa din pozitia 50 a helixului de recunoastere a proteinelor Bicoid si Fushi tarazu -secventa CCATTA este recun de aa din poz 50 a helixului de recunoastere al proteinei Antennapedia -toate cele 3 proteine sunt de la Drosophila -bratul flexibil amino-terminal al homeodomeniului se infasoara in jurul ADN-ului si contacteaza fosa minora de pe fata opusa acidului nucleic -acest lucru sugereaza ca specificitatea functionala a homeodomeniilor este data, nu numai de helixul de recunoastere cat si de bratul flexibil amino-terminal Transportul si localizarea ARNm in embriogeneza -un mecanism eficient de a localiza o proteina intr-un anumit compartiment celular este acela de a localiza ARN-ul ei -desi localizarea ARN-urilor a fost demonstrata in celulele somatice -acest proces este foarte intens in cursul ovogenezei -desi localizarea ARN-urilor a fost demonstrat in ovogeneza ascidiilor, pestilor si amfibienilor -organismele preferate pentru astfel de studii sunt insectele Rolurile localizarii ARN-urilor -1.asigura un control translational local -de ex: ARN MAP2-Microtubule Annociated Protein este localizat in dendrite, traducerea avand loc independent in fiecare dendrita in parte -acest mecanism asigura o plasticitate sinaptica -ARNm poate fi pus in evidenta prin tehnica hibridizare in situu -daca punem in evid celule-imunohistochimia - 2.evitarea exprimarii gresite a unui ARN -de ex: proteina bazaica mielinica interactioneaza puternic cu membranele, pe care la compactizeaza pentru a forma teaca de mielina -cel Schwan in periferic si celulele oligodenndrocite in SNC -in acest caz, transportul ARN-ului din regiunea perinuclera in prelungirile oligodendrocitelor/cel Schwan -transportul este esential, deoarece daca ar fi transportata in forma proteica s-ar opri in prima mb cu care ar veni in contact -al 3-lea rol-impiedicarea formarii heteromerilor in celule care exprima mai multe izoforme ale unei proteine 4

-ex:in mioblastele nemigratorii din somite, ARN-ul -actina este situat in cortexul celular -in timp ce ARN-urile si (gamma) actina sunt situate........ -in mom in care mioblastele incep sa se deplaseze la locul de formare al muschilor -este tradus ARN-ul -actina, care este implicata in migrarea celulara -in momentul in care mioblastele ajung la locul de formare al muschilor si fuzioneaza pentru a forma miotuburi, are loc traducerea ARN-urilor si actina, care codifica pentru actine specific musculare DESEN 6 -al 4-lea rol: asigura polaritatea unei celule sau a embrionului -in embriogeneza localizarea ARN-urilor este implicata in formarea axelor antero-posterioaza si dorsoventrala

-cand celulele migreaza pe un substrat formeaza niste lameliipodii si se deplaseaza pe substrat