Sunteți pe pagina 1din 31

DIAGNOSTICUL DE

CONFIRMARE PRIN
EVIDENIEREA
RESTRUCTURRILOR
IMUNOLOGICE

SISTEMUL IMUN: acel sistem care recunoate


ce este propriu organismului, contribuind la
pstrarea integritii lui imunologice.

Componentele sistemului celular al imunitii:


- sistemul granulocitar (mieloblast, promielocit,
mielocit, metamielocit, neutrofil, bazofil, eozinofil),
i sistemul megacariocito-trombocitar,
limfoplasmocitar i monocitomacrofagic.
Din cadrul acestora intereseaz pentru imunologie
in special celulele specializate n interaciunea
specific cu non selful: limfocitul i macrofagul.

Efectorii imunologici recunosc pe de o parte un rspuns celular de


care este responsabil limfocitul T (aceti efectori sunt mult mai
prompi intervenind n 24 48 de ore) iar pe de alt parte un
rspuns imunologic umoral ce-i manifest activitatea dup 7 14
zile post-agresiune, reprezentat fiind de imunoglobuline i
complement.

METODE DE
IMUNODIAGNOSTIC

METODE DE IMUNODIAGNOSTIC
Aceste metode sunt utilizate n practic pe de o parte ca metode de
diagnostic (de confirmare sau de supraveghere) iar pe de alt parte ca
metode de identificare a structurii antigenice a unui agent patogen.
Aceste reacii au la baz nalta specificate a cuplului antigen-anticorp
(pentru fiecare antigen din natur organismele superioare pot sintetiza
un anticorp specific).
Elementele de baz (sau necesare) ale reaciilor
serologice sunt pe de o parte antigenul i anticorpul
iar pe de alt parte mediul de electrolii, complexul
imun rezultat din unirea acestora devine vizibil n
prezena ionilor de sodiu i clor.

Antigenul poate fi:


- corpuscular: bacterii, virusuri, parazii (denumii i
aglutinogeni)
- molecular: secreii, toxine, flageli (denumii i
precipitinogeni)
Anticorpii se pot gsii n diferite lichide ale
organismului, secreii i excreii ale acestuia cum sunt:
- serul sanguin,
- sngele,
- laptele, secreiile vaginale,
- secreiile lacrimale
n funcie de antigenul complementar se denumesc
aglutinine sau precipitine.

O reacie serologic pentru a putea fi utilizat cu valoare de diagnostic


trebuie s ndeplineasc dou caracteristici:
specificitate = capacitatea unei reacii serologice de a furniza un rspuns
pozitiv la un individ infectat;
sensibilitate = capacitatea unei reacii serologice de a furniza un rspuns
negativ la un individ indemn.
In vitro reaciile serologice sunt influenate de o serie de factori cum
sunt: temperatura, concentraia ionilor de hidrogen, pH, prezena
electroliilor.
Prezena sau absena anticorpilor din probele analizate
nu concluzioneaz prezena sau absena bolii cercetate.

Rezultatul examenului serologic trebuie s ia n calcul:


momentul investigaiei fa de momentul infeciei (dac au avut loc
restructurri imunologice),
vrsta animalului (durata meninerii anticorpilor maternali la bovine i
cabaline este de 6 luni, la purcei 3 5 luni, la cine i pisic circa 3 luni,
la gin aproximativ 2 3 sptmni)
momentul infeciei n perioada de gestaie (riscul apariiei de nounscui cu toleran imunologic)

1. REACIILE DE SERO-AGLUTINARE

REACIILE DE SERO-AGLUTINARE

Sunt CALITATIVE i CANTITATIVE.


I. REACIILE CALITATIVE
A. Reacia de Aglutinare Rapid pe Lam
Metod serologic expeditiv utilizat n practic pentru evidenierea
anticorpilor din ser cu ajutorul antigenelor cunoscute (culturi
bacteriene inactivate)

REACIILE DE SERO-AGLUTINARE

BRUCELOZ:
- antigen brucelic colorat cu roz bengal, ser brucelic pozitiv, ser negativ,
lame de sticl, proba (ser sanguin),
- se pune o pictur ser de analizat, o pictur antigen brucelic colorat
cu roz Bengal i se amestec 4 minute prin nclinri repetate ale lamei
suport (reacie pozitiv = aglutinare vizibil dup patru minute).
Utilizarea sngelui integral este posibil n acest tip de reacie un
exemplu fiind diagnosticul tifopulorozei aviare.

Pentru identificarea componentelor unui antigen (somatic, flagelar,


capsular, de suprafa) se pot face RARL cu anticorpi cunoscui pui n
contact cu o cultur bacterian pe mediu nutritiv solid.
B. Reacia de aglutinare rapid n tub (testul Ring) sau reacia inelar cu
lapte utilizat n diagnosticul brucelozei.
ntr-un tub Wassermann se pun 2 ml lapte i 2-3 picturi antigen brucelic
colorat (hematoxilin sau clorur de trifeniltetrazolium) se incubeaz 30
120 minute la 37 grade Celsius (reacia pozitiv = inel colorat la suprafaa
laptelui)

II. REACII CANTITATIVE


A. Reacia de Aglutinare Lent
Se utilizeaz pentru aprecierea titrurilor serice n infeciile cronice
(salmoneloz, bruceloz, tuberculoz, micoplasmoz, morv,
colibaciloz etc). Aceasta presupune punerea n eviden a anticorpilor
aglutinani prin apariia fenomenului de aglutinare (depunerea
complexului antigen-anticorp la fundul tubului de reacie) n urma
interaciunii cu un antigen specific (de deceleaz clasele de
imunoglobuline IgG2 i IgM).
Tehnicile sunt variate dar au principiul identic cu al reaciei Wright de
diagnostic al brucelozei la animale.
Concentraia minim de anticorpi exprimat n diluia maxim
reprezint titrul aglutinant al serului de cercetat.
B. Reacia de microaglutinare-liz
Se utilizeaz pentru diagnosticul leptospirozelor i pentru identificarea
tipului de leptospir.

2. REACII DE SEROPRECIPITARE

REACII DE SEROPRECIPITARE

Sunt numeroase tehnici care difer prin modul de obinere a antigenului i


prin mediul de reacie utilizat.
1. REACIA ASCOLI, se utilizeaz pentru diagnosticul curent al Antraxului,
se are dou variante: reacia la cald (utilizat pentru extragerea
antigenului din organele bine vascularizate) i reacia la rece sau prin
macerare (utilizat pentru extragerea antigenului din piei, ln)
ntr-un tub Wassermann se pun 1 2 ml antigen i cu o pipet Pasteur se
introduce pe la fundul eprubetei o cantitate egal de ser precipitant
anticrbunos fr a se amesteca mediile. Reacia se consider pozitiv
dac dup 2 3 minute se formeaz un inel sau disc la zona de contact
dintre cele dou medii dereacie)

2. REACII DE PRECIPITARE N GEL


IMUNODIFUZIA:
- vertical: cu variantele simpl sau unidimensional i dubl sau
bidimensional
- orizontal: simpl sau radial (unidimensional) i dubl sau
bidimensional.
Aplicaie: titrarea serurilor n vederea stabilirii statusului imunologic sau
de purttor, pentru identificarea fraciunilor antigenice, pentru
stabilirea gradului de nrudire antigenic, pentru evidenierea unor
deficiene imunologice.
Principiul: depunerea n puncte diferite din mediu a celor
doi reageni i ulterior n cursul incubrii la 25 grade C n
atmosfer umed, acetia difuzeaz unul ctre cellalt,
iar la locul formrii complexelor imune apare o linie de
precipitare vizibil macroscopic.

IMUNELECTROFOREZA
Tehnic serologic ce combin o metod fizic (electroforeza) cu o
metod imunologic (imunodifuzia n gel de agar).
Sub aciunea curentului electric are loc migrarea Ag
sau a Ac, fraciunile amestecului proteic separndu-se
ntre ele n funcie de greutatea lor molecular i
grosimea stratului de agaroz. Fraciunile separate sunt
identificate prin reacia de imunodifuzie n gel de agar.

3. REACII DE NEUTRALIZATE
1. REACIA DE INHIBARE A HEMAGLUTINRII
Se bazeaz pe faptul c anticorpii coninui de un ser imun, provenit
de la animalele trecute prin boal sau imunizate, sunt capabili s
neutralizeze capacitatea hemaglutinant a virusurilor.
Principiul: punerea n contact a serului care conine Ac specifici cu
suspensia viral i dup o incubaie de 30 minute la 37 oC amestecul se
pune n contact cu globule roii 0,5%.
Reacia se poate efectua n dou procedee.
- alfa suspensia de virus este diluat n serie i amestecat cu cantiti
egale de test cunoscut;
- beta serul diluat n serie este amestecat cu cantiti constante de virus
diluat la un numr cunoscut de uniti hemaglutinante.
n ambele cazuri dac are loc cuplarea specific
Ac-virus hemaglutinant fenomenul de aglutinare a
eritrocitelor nu mai are loc.
Aceast reacie permite stabilirea naturii Ac dintr-un
ser sau specia de virus izolat prin cultivare sau
existent n organele de la animalele bolnave.

2. TESTUL DE SERONEUTRALIZARE
Se bazeaz pe faptul c anticorpii formai n mod activ de ctre un
organism care a venit n contact cu un agent viral, sunt capabili s
neutralizeze valoarea infectant a virusului corespunztor.
Aplicaie: identificarea unui virus izolat, necunoscut, pe baza unor seruri
imune tipizate. Sau identificarea unor seruri necunocute utiznd virusuri
tipizate (identificarea Ac din serul sanguin).
Seroneutralizarea se poate raliza pe culturi celulare, ou embrionate sau
animale de laborator.

4. REACII MEDIATE DE COMPLEMENT

REACIA DE FIXARE A COMPLEMENTULUI


Principiu: Evidenierea fixrii alexinei pe complexul Ag-Ac, cu ajutorul
unui revelator reprezenta de sistemul hemolitic.
Elemente necesare:
Ag+Ac+Alexina (complement) = primul sistem imun
Suspensia de globule roii de oaie i serul hemolitic antioaie = al doilea
sistem imun
RFC = negativ hemoliz pozitiv (n serul examinat nu sunt anticorpi
specifici pentru Ag utilizat).

Aplicabilitate:
- boli infecioase n care alte tehnici serologice nu pot fi folosite;
- identificarea i titrarea anticorpilor fixatori de complement prezeni n
snge pentru determinarea strii de boal sau pentru identificarea
antigenelor existente ntr-un produs biologic;
- pentru stabilirea rapid i exact a infeciilor produse de virusuri (febra
aftoas, leucoze aviare), bacterii (leptospiroze, bruceloze, clamidioze),
protozoare;
- pentru identificarea structurii unor antigene, a tipului i puritii acestora
folosind seruri specifice.

5. IMUNELECTRONOMICROSCOPIE

Principiu: vizualizarea la microscopul electronic a


interaciunii imunoglobuline-virusuri.
Metoda mbin identitatea serologic cu cea
morfologic, ceea ce confer IEM cel mai nalt nivel
de specificitate dintre tehnicile de microscopie
electronic n contrast negativ.
Variante:
- absorbia specific pe gril (trapping),
- aglomerarea n ciorchine (clumping),
- nvelirea specific cu anticorpi (decorating).

TEHNICA IEM-TRAPPING: absorbia specific a


virusurilor dintr-o suspensie (prob) pe suprafaa unei
grile invelite n prealabil cu antiser specific sau IgG,
urmat de colorarea negativ i examinarea la
microscopul electronic.
Avantaje tehnice i aplicaii:
- pot fi examinai att virioni ntregi ct i
componentele antigenice ale acestora: anticorpii pot
atrage i agrega specific vironii din probele cu o slab
concentraie, fcnd posibil examinarea lor;
- se poate verifica monospecificitatea antiserurilor de
referin;
- interpretarea rezultatelor este mult mai uoar
datorit prezenei unui numr mare de particule virale
de acelai tip.

6. Reacii antigen-anticorp evideniate cu ajutorul reagenilor


marcai

REACIA DE IMUNOFLUORESCEN
Se bazeaz pe specificitatea raciei Ag-Ac n care Ac (imunoglobline)
purificai sau existeni n serul speciei donatoare sunt legai chimic
prin gruprile amin libere de un fluorocrom, cel mai frecvent utilizat
fiind izotiocianatul de fluorescein. Imuoglobulinele astfel marcate i
pstreaz capacitatea de a recunoate antigenul specific lor,
vizualizarea marker-ului fcndu-se la un microscop n lumin U.V.

Testele IF cele mai uzuale n practic sunt:


TESTUL DE IMUNOFLUORESCEN DIRECT (IFD)
- este folosit pentru decelarea antigenului (agentului infecios) cu ajutorul
anticorpor cunoscui. R + = fluorescen
TESTUL DE IMUNOFLUORESCEN INDIRECT (IFI)
- poate fi folosit att pentru decelarea Ag ct i a Ac
TESTUL DE NEUTRALIZARE I IMUNOFLUORESCEN
- este folosit pentru punerea n eviden a anticorpilor specifici (att
calitativ ct i cantitativ) . R + = lipsa fluorescenei
Avantaje:
- rapiditate
- simplitate
- sensibilitate mare
- reactanii sunt utilizai n cantiti mici.

REACII IMUNOENZIMATICE ELISA CU VARIANTE

Enzyme Linked Immunosorbant Assay


- varianta pentru detectarea Ac (metoda direct)
- varianta pentru detectarea Ag (simplu sandwich)
ELISA - de competiie (pentru virusul pestei porcine clasice)
competiia de ocupare a situsurilor Ag vPPC de ctre Ac din serul
anti vPPC preparat pe iepure.
Prezena sau absena Ac din serul de cercetat se
evideniaz cu IgG anti IgG de iepure marcat cu
peroxidaz.

Principiul ELISA: detectarea anticorpilor sau a antigenelor prin intermediul


enzimelor, folosind reacia clasic antigen-anticorp, enzimele modificnd
culoarea substratului specific lor.
Avantaje:
-deosebit de specific permite identificarea
unui reagent n cantiti foarte mici (nanograme);
-tehnica de prelucrare a reagenilor permite
o mare stabilitate a acestora;
-larg utilizare n diagnosticul calitativ i/sau
cantitativ al bacteriilor, virusurilor, ciupercilor,
paraziilor sau pentru controlul vaccinurilor.

DIAGNOSTIC DE CONFIRMARE PRIN EVIDENIEREA SECVENELOR


CARACTERISTICE DIN GENOM

REACIA DE AMPLIFICARE ENZIMATIC A GENELOR N VITRO


SAU PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)
Tehnica PCR se bazeaz pe funcionarea ciclic a unei ADN-polimeraze
care este capabil s copieze o caten ADN utilizat ca model, producnd
o caten complementar acesteia prin elongaie pornind de la
extremitatea 3OH liber a unei amorse oligonucleotidice.
Tehnica PCR const n realizarea a n cicluri succesive de amplificare
n cursul crora dou amorse dirijeaz amplificarea secvenei de ADN
dublu-catenar pe care o ncadreaz. Un ciclu de amplificare este compus
din trei etape, permind realizarea succesiv a denaturrii la 95 grade C,
hibridizarea amorselor la 37 grade C i extensia catenei de ADN sub
aciunea polimerazei. Teoretic cantitatea de ADN cuprins ntre cele dou
amorse se dubleaz dup fiecare ciclu de amplificare, realiznd o cretere
exponenial.
Cantitatea de ADN obinut prin amplificare este suficient pentru a fi
vizualizat direct n UV.
Specificitatea reaciei rezid n alegerea secvenei de amplificat cea mai
specific i constant speciei, tipului de acid nucleic de identificat i n
alegerea corect a amorselor n raport cu segmentul de amplificat.

REACIA DE AMPLIFICARE ENZIMATIC A GENELOR N VITRO


Model animat