Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
02 Microscopie
02 Microscopie
Fig. 2.1. Scala relativ a organismelor biologice i intervalele de msur ale ctorva dintre
instrumentele de investigaie
Microscopul formeaz imagini virtuale, mrite i rsturnate ale obiectului cu ajutorul unui
sistem de lentile (la microscopul electronic, lentilele sunt nite cmpuri electrice i magnetice
care deviaz fasciculele de electroni) grupate n obiectiv i ocular, prin care mersul razelor este
cel reprezentat n Fig. 2.2.
P=
tg 2
AB
(2.1)
2. Grosismentul sau mrirea unghiular - raportul dintre tangenta unghiului sub care se vede un
obiect prin instumentul optic ( ) i tangenta unghiului sub care se vede un obiect cnd este
2
= 25 cm
( ). Grosismentul
1
microscop
oc
obiectivului (G ).
ob
Gmicroscop =
tg 2
tg 1
(2.2)
P
e
=
4 4 f1 f 2
(2.3)
unde e este dinstana dintre focarul imagine al lentilei obiectiv i focarul obiect al lentilei ocular,
iar f1 i f2 reprezint distanele focale ale obiectivului i ocularului, respectiv (Fig. 2. 2).
3. Puterea separatoare () - inversul distanei separatoare (d ) care reprezint cea mai mic
distan la care se pot gsi imaginile a dou puncte care nu apar confundate:
1
d
(2.4)
Distana minim dintre dou puncte ale unui obiect care mai pot fi vzute separat unul de cellalt
prin microscop este
d=
1.22
2n sin u
(2.5)
unde reprezint lungimea de und a radiaiei folosite, n este indicele de refracie al mediului
strbtut de radiaie dintre obiect i obiectiv, u este unghiul dintre axa optic i razele cele mai
ndeprtate de ax care mai ptrund n obiectiv. Pentru a micora aceast distan, adic pentru a
mbunti performanele microsopului exist mai multe metode:
- folosirea unei radiaii cu lungime de unda ct mai mic (de exemplu, pentru radiaie
ultraviolet s-au putut distinge obiecte de dimensiuni de 0.15 m)
- folosirea unor medii ntre obiect i obiectiv cu indicele de refracie n ct mai mare (microscop
cu imersie)
- folosirea obiectivelor cu deschidere ct mai mare, astfel nct sin u s fie ct mai mare, dar
aceste obiective ridic probleme de construcie datorit aberaiilor de sfericitate.
n funcie de ceea ce se studiaz, se pot folosi diferite microscoape (Tabelul 2.1).
Microscopul optic folosete unde electromagnetice din domeniul vizibil. Lumina este
transmis de-a lungul axului optic al instrumentului, prin preparat, n aceste condiii obinndu-se
un cmp vizual puternic luminat, n care obiectele, pentru a putea fi vzute, se disting pe fondul
luminos fie prin opacitate, fie prin culoarea lor. Pentru a se face msurtori se folosesc nite
lamele de sticl pe care sunt gradate foarte fin nite scale, numite micrometre care sunt piese
auxiliare microscopului. Acestea au dimensiuni cunoscute sau uor de determinat i imaginea lor
se poate suprapune peste imaginea obiectului de cercetat. Micrometrele sunt de dou feluri:
oculare (sunt aezate n ocularul microscopului i imaginea lor este permanent n cmpul vizual al
experimentatorului) i obiective (acestea se aeaz pe platina microsopului n locul preparatului i
sunt folosite pentru calibrarea microscopului).
Tipul microscopului
Principiul de funcionare
Sursa de
radiaie
Natura
lentilelor
Focalizare
Ajustarea mririi
Microscopul
optic
Radiaie
e.m. n
vizibil
sticl
mecanic
Interschimbarea
obiectivelor
Ultramicroscopul
mprtierea luminii de
ctre obiectele
microscopice, acestea apar
ca nite puncte luminoase
pe un cmp ntunecat
Radiaie
e.m. n
vizibil
Sticl
Mecanic
Interschimbarea
obiectivelor
Microscopul cu
contrast de faz
Transformarea diferenelor
de faz aprute ca urmare a
detaliilor preparatului n
diferene de amplitudine; se
pot vizualiza obiecte
transparente fr a fi
colorate n prealabil
Radiaie
e.m. n
vizibil
Sticl
Mecanic
Interschimbarea
obiectivelor
Microscopul cu
fluorescen
Folosete fluorescena
proprie a probei; se poate
pune n eviden starea
fiziologic a unor
microorganisme
Radiaie n
vizibil, UV
sticl
Mecanic
Interschimbarea
obiectivelor
Microscopul
polarizant
Radiaie
e.m. n
vizibil
Sticl
Mecanic
Interschimbarea
obiectivelor
Fascicul de
electroni
Vid
Electric;
de ex.
schimbarea
valorii
curentului
electric
prin
solenoidul
lentilelor
obiectiv
Electric
Nu
folosete
radiaie
e.m., nici
fascicule
de
electroni,
limitarea
fiind dat
nu de
difracie ci
de
dimensiune
a probei
Microscopul
electronic
Microscopul de
for atomic
Folosete fascicule de
electroni. Imaginile sunt
tridimensionale.
Are mrire mare i rezoluie
bun. Se zrete conturul
specimenului, imaginea este
alb-negru. Nu se pot
observa specimene vii.
Cmpuri
magnetice
sau lentile
electrostatice
1) Piciorul microscopului, constituit dintr-o plac metalic grea care are rolul de a susine fix
microscopul, pe care se afl platina microscopului. Pe aceasta se aeaz frotiul (lamel de
sticl pe care se afl preparatul) ce urmeaz a fi studiat. Platina prezint un orificiu central
care permite trecerea razelor luminoase i niste orificii laterale n care sunt prini cavalerii cu
ajutorul crora frotiul este fixat pe platin. Proba poate fi deplasat pe dou direcii
perpendiculare cu ajutorul unor uruburi, deplasarea fiind msurat pe dou scale ataate
msuei.
2) Tubul microscopului pe care sunt prini ocularul i obiectivul; lui i se poate imprima o
micare ampl, vizibil cu ochiul liber cu ajutorul macrovizei i o micare fin cu ajutorul
microvizei. Ocularele de diverse puteri se monteaz la captul superior al tubului.
Microscopul poate fi mono sau binocular. n general, ocularele sunt construite din dou
lentile i anume aa numita lentil de cmp i lentila ocular propriu-zis. Ele sunt aezate ntr-un
tub care se introduce n partea superioar a tubului microscopului. Ocularele sunt de dou tipuri :
Huyghens (Fig. 2.4 a)) i Ramsden (Fig. 2.4 b)). Ambele sunt formate din lentile plan-convexe,
dar difer prin aezarea acestora, precum i prin mrimea lor.
a)
b)
Astfel, la ocularul Huyghens lentilele sunt aezate cu convexitatea n jos, ctre obiectiv i
lentila ocular este mic n timp ce lentila de cmp este mare. Lentila inferioar face parte din
sistemul obiectiv, avnd rolul de a de a clarifica imaginea i de a o forma n planul diafragmei,
care limiteaz cmpul optic. Lentila superioar a acestui tip de ocular este, de fapt, o lup care
mrete imaginea format n lentila de cmp i d imaginea final (care este virtual i mrit) la
25 cm de ochi.
La ocularul Ramsden, numit i ocular ortoscopic, cele dou lentile plan-convexe sunt egale ca
mrime i sunt aezate cu convexitatea fa n fa. Imaginea dat de obiectiv se formeaz chiar n
planul diafragmei. Acest tip de ocular se folosete pentru determinarea puterii de mrire a
microscopului sau pentru cazul n care se fac desene microscopice, deoarece d un cmp de
dimensiuni mari.
La microscoapele moderne ocularele moderne au mai multe lentile.
Obiectivul, care conine un set de lentile centrate, se monteaz n revolverul de la captul
inferior al tubului. Revolverul are locauri pentru mai multe obiective i permite schimbarea lor
prin rotire. Lentilele obiectivului au asemenea convergene nct s poat fi corectate aberaiile de
sfericitate. Lentila inferioar a obiectivului este plan convex avnd faa plan spre obiectiv. Cu
ct distana focal a obiectivului este mai mic cu att puterea de mrire este mai mare. Un
obiectiv cu putere separatoare mare determin o putere separatoare mare a microscopului.
Obiectivele cu putere mare au o vedere de ansamblu foarte bun, n timp ce obiectivele cu putere
mai mic sunt mai luminoase. Exist dou tipuri de obiective: uscate i cu imersie. Obiectivele
uscate primesc fasciculul de lumin ce trece prin preparat direct prin aer, astfel c o parte din
razele trimise de obiect ctre lentila obiectivului se pierd prin fenomenul de reflexie total.
Pierderea razelor de lumin datorit acestui fenomen se poate nltura dac ntre preparat i
obiectiv se pune o pictur dintr-un lichid (de exemplu ulei de cedru) cu indice de refracie
apropiat de cel al sticlei din care este fcut lentila frontal a obiectivului. Se obine astfel un
obiectiv cu imersie.
- condensorul format din 2 sau 3 lentile care concentreaz lumina reflectat de oglind asupra
obiectului; fasciculul paralel de lumin care cade pe condensor este transformat ntr-unul
convergent; pentru a obine o imagine clar condensorul se poate deplasa pe vertical pn
cnd obiectul se gasete n focarul fasciculului convergent care iese din condensor; razele de
lumin, nainte de intrarea n condensor, trec printr-un suport de filtre i o diafragm (apertura
cu rol de a controla diametrul bazei "conului" luminos); exist filtre de diferite culori care pot
modifica spectrul luminii transmise. n practic, diametrul aperturii poate fi redus uor pentru
obinerea unui compromis ntre rezoluie i contrast. Reglarea diametrului aperturii nu trebuie
fcut pentru a controla intensitatea luminoas deoarece acest procedeu nu face dect s
produc imagini cu contrast mare, dar cu rezoluie sczut.
- micrometrul obiectiv care este o lam de sticl pe care sunt trasate pe o lungime de 1mm, cu
un vrf foarte fin de diamant, 100 de diviziuni. Acest micrometru este folosit pentru
calibrarea microscopului. El se aeaz n locul preparatului, urmnd s se fac suprapunerea
scalei micrometrului ocular cu scala micrometrului obiectiv, pentru determinarea dimensiunii
unei gradaii a micrometrului ocular (Fig. 2.7).
- camera clar care este un dispozitiv ce se poate adapta ocularului microscopului i permite
suprapunerea n ochiul observatorului a imaginii unui obiect vzut direct n mrime natural
peste imaginea obiectului vzut prin microscop.
- camera de numrare sau hematocitometrul (Fig. 2.8) care este un dispozitiv auxiliar
microscopului cu ajutorul cruia se poate determina numrul de celule dintr-un volum
oarecare.
3. Mod de lucru
Materiale necesare:
-
microscop optic
- se observ cte diviziuni ale micrometrului obiectiv sunt necesare s acopere ntreaga scal a
micrometrului ocular i se determina valoarea dimensiunilor micrometrului ocular.
Odat microscopul calibrat, se poate trece la msurarea diametrelor celulelor sanguine, urmnd
paii:
- se rotete revolverul astfel nct s ajung deasupra probei obiectivul de mic putere;
se rotete din nou revolverul pentru alegerea obiectivului de mare putere i se clarific din
nou imaginea, folosind microviza;
- pentru dou eantioane de cte 15 hematii fiecare se vor compara mediile calculate stabilinduse dac diferena este semnificativ.