Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Staphylococcus

Stafilococii sunt coci gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulai, catalazo-pozitivi. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe grupe de microorganisme de interes medical (unele dintre aceste grupuri incluznd mai multe specii). Cele mai cunoscute specii sunt reprezentate de: Staphylococcus aureus; S. epidermidis; S. saprophyticus. S. aureus reprezint specia cel mai frecvent implicat n clinic, n timp ce alte specii sunt nepatogene sau condiionat patogene. n funcie de capacitatea de a elabora coagulaz, toi stafilococii coagulazo-pozitivi sunt grupai ca S. aureus.Stafilococii pot deveni patogeni i se pot manifesta ca atare fie prin multiplicare i invazivitate, fie prin multiplicare i toxinogenez (fiind posibil i combinarea acestor mecanisme). Determinanii patogenitii la stafilococ includ produsele toxice i enzimatice. S. aureus este implicat ca agent etiologic ntr-o mare varietate de infecii supurative (cu puroi), ncepnd cu infeciile superficiale ale tegumentelor i mucoaselor i continund cu panariii, furuncule, abcese profunde, infecii ale diferitelor organe interne cu sau fr generalizarea infeciei. Pe de alt parte, ar fi de menionat toxinozele (datorate n special toxinelor elaborate) i anume toxiinfeciile alimentare, necroliza toxic a epidermului, sindromul de oc toxic etc. Toxiinfeciile alimentare sunt provocate de exotoxinele preformate, existente n alimente n care s-au multiplicat stafilococi enterotoxigeni. Stafilococii coagulazo-negativi (SCN) sunt implicai n infecii aprute dup manevre medico-chirurgicale care penetreaz bariera cutaneo-mucoas (cateterisme, implante, protezri intravasculare etc). Ar mai fi de amintit infeciile tractului urinar i genital cu S. saprophyticus (la femeile tinere). O infecie grav produs de SCN este enterocolita postantibiotice a nou nscutului (mai ales a prematurului, la care administrarea necontrolat a antibioticelor poate produce disbacteriemii cu consecine grave). Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de stafilococi vom alege drept reprezentative infeciile purulente ale tegumentelor i mucoaselor i ne vom referi numai la Staphylococcus aureus. Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, cu urmtoarele etape. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca

pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: secreii purulente (din foliculite, abcese, celulite, fistule, infecii ale plgilor i arsurilor), lichide (de puncie sinusal, otic, mastoidian, articular, peritoneal, pleural, pericardic), exsudat nazal sau exsudat faringian, snge, LCR, sput, urin, secreie vaginal, tampoane vaginale, lichid de vom, materii fecale, alimente, prelevate de pe suprafaa cateterelor i a inseriilor iv. ale acestora. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de puroi (vezi i capitolul 6). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel tegumentar (eventual modificate fa de normal), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitivi, cu diametrul de 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate. Cocii se pot situa intra sau extraleucocitar. Se are n vedere locul de unde a fost recoltat p.p. (puroiul poate fi necontaminat, dac se recolteaz de ex. prin puncie-aspirare dintr-o colecie purulent profund i este foarte probabil contaminat cu flor de asociaie dac a fost recoltat dintr-o leziune superficial). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Stafilococii se dezvolt n general pe medii de cultur obinuite n 18-24 ore, la 35-37C. Coloniile au aspect de tip S, diametrul cuprins ntre 1-3 mm i sunt pigmentate n funcie de specia izolat (ex. pigment auriu). Pe mediul geloz-snge, n jurul coloniilor poate aprea o zon de hemoliz clar. Stafilococii se pot multiplica pe medii hiperclorurate, tolernd o concentraie de 7-10% NaCl (ex. mediul Chapman). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, cu diametrul de circa 0,5-1,5 m, dispui n lanuri scurte, perechi, izolai sau n grmezi neregulate Caractere de cultur: Produc colonii de tip S, pigmentate auriu; pe mediile cu snge pot produce hemoliz.

Caractere biochimice: Stafilococii au un metabolism glucidic att respirator ct i fermentativ. Fermenteaz glucoza, manitolul, xiloza, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid. Capacitatea de acidifiere a mediului coninnd manit este utilizat ca test de difereniere ntre S. aureus (manito-pozitiv) i SCN (manito-negativ). Stafilococii aurii sunt catalazo-pozitivi (vezi 12.5.B). Se poate face i testul fosfatazei. Exist sisteme multitest care se pot procura comercial (API, Micro Scan, Minitek etc). Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale care includ fibrinogen i IgG care cupleaz coagulaza legat i proteina A (tehnici de aglutinare indirect). Caractere de patogenitate: Trebuie efectuat testul coagulazei(vezi capitolul 12, punctul 12.7); pentru identificarea exotoxinelor se poate utiliza o tehnic de tip ELISA sau aglutinarea pasiv inversat (vezi i capitolul 11). Sensibilitatea la bacteriofagi: Susceptibilitatea la aciunea litic a bacteriofagilor a fost sistematizat pentru tulpinile de S. aureus ntr-un sistem care se poate utiliza la nivelul centrelor de referin. Alte caractere / teste utilizate n identificare: Se pot utiliza (n centre de referin) teste care se bazeaz pe proprieti fenotipice moleculare (studiul acizilor grai celulari, al unor enzime sau al unor polipeptide totale) sau genotipice (fragmente de restricie ale materialului genetic, hibridarea molecular, ribotipia). S-au dezvoltat tehnici rapide utiliznd truse de identificare i instrumente automatizate pentru evidenierea unor elemente ale peretelui celular (proteina A, coagulaza legat), a enzimelor elaborate n aliment sau lichidul de hemocultur (testul pentru termonucleaz) i a toxinelor (enterotoxine, TSST1, exfoliatine). Exist metode care utilizeaz markeri moleculari pentru evidenierea prezenei MRSA (stafilococ rezistent la meticilin) i pentru diferenierea intraspecific la S. aureus i SCN.5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

Diagnosticul de laborator n infeciile produse de microorganisme din genul Streptococcus

Streptococii sunt coci sferici gram-pozitivi care formeaz perechi sau lanuri n cursul diviziunii celulare. Sunt larg rspndii n natur. Unii fac parte din flora uman normal; alii sunt asociai cu afeciuni umane importante

datorate parial infeciei streptococice i parial rspunsului imun al gazdei. Nu s-a elaborat un sistem perfect pentru clasificarea tuturor streptococilor. Dintre speciile cu importan medical ar fi de amintit S. pyogenes (grup A), S. agalactiae (grup B), S. viridans (care aparine florei normale), S. pneumoniae (pneumococul) etc. Enterococii aparineau grupului D, ns n momentul actual fac parte dintr-un gen separat, genul Enterococcus. Streptococii sunt imobili, nesporulai i pot avea sau nu capsul. n acest capitol vom discuta diagnosticul de laborator al infeciilor produse de Streptococcus pyogenes.Cei mai muli dintre streptococii care conin antigenul de grup A sunt streptococi piogeni. Streptococii piogeni sunt betahemolitici (produc n mod caracteristic zone largi de hemoliz clar n jurul unor colonii de dimensiuni mici). De regul streptococii piogeni sunt sensibili la bacitracin.Streptococii sunt potenial implicai ntr-o mare varietate de boli. n principal streptococii piogeni pot deveni patogeni datorit multiplicrii i capacitii de invazivitate. Proprietile biologice ale microorganismelor infectante, natura rspunsului gazdei i poarta de intrare a infeciei au o mare influen asupra tabloului clinic. Infeciile streptococice ar putea fi grupate astfel: Boli invazive, n care putem include faringita, angina streptococic, erizipelul, diferite infecii n sfera ORL, pneumonia, impetigo streptococic, celulita, fasceita necrozant, febra puerperal, endocardita infecioas, sepsisul streptococic etc. Boli produse de streptococi lizogenizai, n care putem include scarlatina i sindromul de oc toxic streptococic. Bolile poststreptococice care includ reumatismul articular acut (RAA) i glomerulonefrita acut poststreptococic (GNA). Diferii autori iau n considerare i alte entiti clinice. Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de streptococii piogeni vom alege faringita streptococic. n vederea confirmrii unei boli poststreptococice vom discuta reacia ASLO (vezi i capitolul 19). Diagnosticul de laborator bacteriologic, direct, n faringita streptococic. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic, secreia purulent de la nivelul faringelui, trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie, recoltarea se face preferabil dimineaa nainte ca pacientul s mnnce i fr s se fi splat pe dini, fr s fi utilizat gargarisme cu diferite soluii, iar dac aceste condiii nu au fost

respectate, recoltarea se va face dup minim 4 ore etc (vezi i capitolul 6). Produsul recoltat trebuie prelucrat ct mai repede posibil, ns n nici un caz nu trebuie s treac mai mult de 2-3 ore de la recoltare pn la cultivare (preferabil 1-2 ore). n cazul n care se estimeaz depirea acestui interval de timp trebuie folosit un mediu de transport, ex. mediul Stuart (vezi i capitolul 9). Chiar i n aceast situaie, nu ar trebui s treac mai mult de 24 de ore pn la prelucrarea p.p. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel faringian, prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite, piocite) i prezena cocilor gram-pozitiviaezai separat, n perechi sau n lanuri, dar i a altor tipuri de microorganisme. Examenul microscopic al p.p. are doar un rol orientativ. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Streptococii piogeni sunt germeni pretenioi care nu se dezvolt pe medii de cultur obinuite. Mediul cel mai frecvent folosit este agar-snge, pe care cultura apare n n 18-48 ore, la 3537C. n cazul n care nu remarcm apariia de colonii caracteristice dup 24 de ore, reincubm placa Petri pentru nc o zi. Coloniile au aspect de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de b-hemoliz (zon clar de hemoliz, cu un diametru mult mai mare dect diametrul coloniei). n cursul nsmnrii, pe cel puin una dintre laturile poligonului descris trebuie s realizm i o nepare a mediului n aa fel nct inoculul s ajung mai n profunzime. Aceast manevr (exist i alte variante tehnice) este necesar pentru a permite activitatea hemolizinei O (aceast streptolizin este inactivat n prezena oxigenului). Speciile care produc material capsular, din acid hialuronic, adeseori dau natere unor colonii mucoide (de tip M). Se pot folosi pentru cultivare i medii selective (de ex. agar-snge plus trimetoprimsulfametoxazol). 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, sferici sau ovoidali, cu diametrul de circa 1. Se divid ntr-un plan perpendicular pe axa lor lung i se pot dispune n lanuri. Lungimea lanurilor variaz i este condiionat de factori de mediu. Caractere de cultur: Produc colonii de tip S cu diametrul de 0,5-1 mm, nconjurate de o zon de b-hemoliz sau colonii de tip M.

Caractere biochimice: Streptococii piogeni produc hemoliz de tip beta. Prin testul PYR este identificat sinteza pirolidonil-amidazei (actualmente exist i teste comerciale, rapide, pentru testul PYR). Multiplicarea streptococilor de grup A este inhibat de bacitracin (antibiotic produs de Bacillus licheniformis). Se apreciaz c dintre tulpinile de Streptococcus pyogenes, mai puin de 1% sunt rezistente la bacitracin (vezi capitolul 12). Streptococii piogeni sunt rezisteni la trimetoprimsulfametoxazol. Caractere antigenice: Se pot utiliza teste comerciale pentru detectarea rapid a polizaharidului specific de grup A al streptococilor piogeni n p.p., dup extracie chimic sau enzimatic (ex. cu pronaz). Tehnicile utilizate pot fi aglutinarea indirect (latexaglutinare), coaglutinarea sau ELISA. Prin reacii de aglutinare (latexaglutinare, coaglutinare) pe lam, sau precipitare se pot determina antigenele streptococice de grup (Lancefield) sau de tip. S. pyogenes este mprit n serotipuri pe baza antigenelor proteice M (peste 80) prin reacia de precipitare n tuburi capilare i T (28 serotipuri) prin reacia de aglutinare pe lam. Aceste testri se fac n centre de referin. Alte teste utilizate n identificare: Se pot utiliza sondele nucleotidice pentru detectarea direct a streptococilor de grup A n exsudatul faringian. 5. Streptococii piogeni i menin sensibilitatea cunoscut la penicilin (au fost identificate n ultima perioad tulpini tolerante, care sunt inhibate dar nu distruse de ctre penicilin). Pentru pacienii alergici la beta-lactamine se poate alege pentru tratament eritromicina, dar au fost identificate tulpini rezistente la acest medicament antimicrobian i n acest caz antibiograma devine necesar. n general antibiograma se realizeaz n scop epidemiologic. Diagnosticul de laborator serologic Diagnosticul imunologic al infeciilor produse de streptococii b-hemolitici din grupul A ar putea consta din investigarea fie a rspunsului imun umoral (prezena i titrul anticorpilor, n cadrul diagnosticuluiserologic), fie a rspunsului imun de tip celular. n continuare nu vom discuta dect diagnosticul serologic, care are importan practic.Diagnosticul serologic este util pentru certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA), identificarea unei eventuale stri de hipersensibilitate, diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice, evaluarea evoluiei clinice i eficacitii tratamentului. Diagnosticul serologic se realizeaz de obicei prin reacia ASLO, care identific titruri ale anticorpilor anti-streptolizin O (vezi i capitolul 19).

Testarea se face n dinamic, pe seruri recoltate la interval de 7 10 zile. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Este strict necesar realizarea controlului intern i extern de calitate.Exist teste serologice pentru determinarea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Titrul anticorpilor anti-streptodornaz este crescut la pacienii cu infecii tegumentare i trebuie investigat dac se suspicioneaz prezena unei glomerulonefrite acute. Se pot determina i anticorpii anticarbohidrat (hemaglutinare pasiv) sau anti-MAP (prin latex aglutinare). Diagnosticul de laborator n infeciile produse de Streptococcus pneumoniae

Streptococcus pneumoniae se prezint sub form de coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo pe axul longitudinal, ncapsulai, nesporulai, imobili. Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge determin a-hemoliz la fel ca Streptococcus viridans. Creterea lor este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 37C. Streptococcus pneumoniae poate deveni patogen prin multiplicare i invazivitate, conducnd la apariia unor variate infecii ale tractului respirator superior i inferior, ale urechii medii, ale sinusurilor, dar i alte infecii produse prin diseminare hematogen (ex. meningit, endocardit, care pot fi foarte grave). Pneumonia pneumococic se nsoete de prezena edemului alveolar i a unui exsudat fibrinos, urmat de apariia de hematii i leucocite.Datorit faptului c poate face parte din flora microbian normal, exist o serie de probleme n ceea ce privete interpretarea semnificaiei prezenei pneumococilor n produse patologice care pot fi contaminate cu aceast flor (ex. sputa recoltat prin expectoraie). Una dintre marile probleme terapeutice decurgnd din dezvoltarea rezistenei la antibioticeo reprezint apariia pneumococilor rezisteni la penicilin i alte medicamente antibacteriene.Pentru a discuta diagnosticul de laborator n infeciile produse de pneumococi vom alege drept entitate patologic reprezentativpneumonia pneumococic. Diagnosticul pneumoniei pneumococice Diagnosticul pneumoniei pneumococice este clinic, radiologic iar din punct de vedere al stabilirii etiologiei este un diagnostic bacteriologic (direct). Diagnosticul de laborator microbiologic este numai bacteriologic (direct). 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd o serie de reguli (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc).

n funcie de maladia provocat se pot recolta urmtoarele produse patologice: sput, aspirat bronic sau traheal, exsudat faringian, secreii otice sau conjunctivale, lichid pleural, lichid pericardic, LCR, puroi, snge, material necroptic. n pneumonia pneumococic agentul etiologic poate fi izolat i prin hemocultur. n continuare vom discuta cazul n care p.p. este reprezentat de sput (vezi i capitolul 6). 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor de la nivel alveolar (ex. macrofage alveolare), prezena celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai. Examinarea microscopic trebuie s demonstreze calitatea produsului patologic i s realizeze o identificare prezumtiv a microorganismului implicat (vezi i capitolul 52). n coloraia cu albastru de metilen, capsula poate aprea ca un halou n jurul pneumococilor. Utiliznd anticorpi anti-capsulari, se poate realiza o identificare rapid inclusiv direct, pe produsul patologic (de exemplu sput), prin reacia de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14). 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Pneumococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau de tip M, nconjurate de o zon de a-hemoliz (la fel ca Streptococcus viridans). Multiplicarea este favorizat n atmosfer de 5% CO2 la o temperatur de 35-37C. n mediile de cultur lichide tulbur omogen mediul.Produsul patologic se poate inocula i la animale de laborator sensibile, respectiv la oareci albi. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-pozitivi, alungii, lanceolai, dispui n general n diplo, ncapsulai (cu o capsul comun), nesporulai. Caractere de cultur: Pe geloz-snge formeaz colonii de tip S sau M, nconjurate de o zon de a-hemoliz (la fel ca Streptococcus viridans). Caractere biochimice: Glucoza reprezint principala surs de energie pentru pneumococi. Acetia elaboreaz enzime zaharolitice, proteolitice i lipolitice.

Fermentarea inulinei reprezint un caracter biochimic important, util n diferenierea pneumococilor de s. viridans (exist tulpini de S. viridans care fermenteaz inulina). Se utilizeaz un mediu n care exist inulin i un indicator de pH. n cazul reaciei pozitive are loc o modificare de pH i respectiv modificarea culorii mediului. Pneumococii elaboreaz enzime autolitice. Autoliza este indus i accelerat de bil, sruri biliare, acizi biliari; testul este util n identificarea pneumococilor (testul bilolizei, Neufeld; vezi capitolul 12, punctul 12.3). Sunt sensibili la optochin (etil-hidrocuprein), sensibilitatea la aceast substan fiind de asemenea util n identificare i diferenierea de Streptococcus viridans (vezi capitolul 12, punctul 12.13). Caractere antigenice: Cel mai important determinant antigenic i patogenic este capsula polizaharidic (antigenul K), ce protejeaz pneumococul fa de fagocitoz i permite invazivitatea. Structura polizaharidului capsular este specific fiecrui serotip n parte. Pn n prezent au fost identificate peste 85 de serotipuri capsulare diferite, a cror structur a fost determinat pentru majoritatea serotipurilor. Au fost produse seruri specifice anticapsulare polivalente i monovalente, utile n identificarea pneumococilor cu ajutorul reaciei de umflare a capsulei (vezi capitolul 12, punctul 12. 14). n acelai scop se poate utiliza i reacia de aglutinare. Datorit faptului c prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat prin reacii de latexaglutinare sau mai bine prin imunoelectroforez. Caractere de patogenitate: Se poate utiliza inocularea la oarecele alb (vezi capitolul 11). Alte teste utile n identificare: Se pot utiliza sonde nucleotidice pentru identificarea ARNr.5. Antibiograma (verificarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice n vederea stabilirii tratamentului) este obligatorie i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice pe medii suplimentate cu snge defibrinat de oaie. Pentru verificarea sensibilitii / rezistenei la penicilin se utilizeaz microcomprimate cu oxacilin (1 mg). n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14). Diagnosticul de laborator n infeciile produse microorganisme din genul Neisseria

Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, spre exempluNeisseria, Moraxella, Acinetobacter, Kingella.

n genul Neisseria, speciile importante pentru patologia uman sunt Neisseria meningitidis(meningococul) i Neisseria gonorrhoeae (gonococul), dar se pot aminti i N. lactamica, N. sicca, N. subflava etc. n acest capitol vom discuta numai diagnosticul de laborator n infeciile produse de meningococ i gonococ.Neisseriile se prezint sub form de coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun. n funcie de structura capsulei exist mai multe serogrupuri. Ambele microorganisme sunt oxidazo pozitive i au nevoie n vederea izolrii de utilizarea unor medii de cultur mbogite, necesitile nutritive fiind mai mari n cazul gonococului. Principial se pot multiplica pe mediul Mueller-Hinton (amintit i la antibiograma difuzimetric) dup ce izolarea din p.p. a fost realizat pe alte medii mbogite. Multiplicarea are loc la o temperatur de incubare de 3537C i n condiiile unei atmosfere de 3-10 % CO2. Coloniile apar n 24-48 de ore, mai rapid n cazul meningococului. Neisseria meningitidis Neisseria meningitidis poate face parte din flora microbian de la nivel oral, nazal sau faringian. Colonizarea poate persista sptmni sau luni de zile. Meningococul este un microorganism condiionat patogen care poate fi implicat n infecii respiratorii, dar este semnificativ de reinut faptul c prin invazivitate poate conduce la apariia unei bacteriemii n cursul creia complicaia principal este meningita meningococic. Meningococul reprezint una din primele trei cauze de meningit infecioas la aduli (alturi de Haemophilus influenzae i Streptococcus pneumoniae). Diagnosticul meningitei meningococice Diagnosticul meningitei meningococice pornete de la elementele clinice, eventual ntr-un anume context epidemiologic; din punct de vedere al stabilirii etiologiei este un diagnostic bacteriologic (direct). Diagnosticul de laborator n meningita meningococic diagnosticul este urgent (risc de evoluie cu sechele i / sau deces), de importan maxim fiind recoltarea i transportul rapid al LCR ctre laborator. Este de preferat realizarea unei cultivri la patul bolnavului, chiar dac pentru concentrarea germenilor ar putea fi necesar centrifugarea LCR. Analiza citologic i biochimic a LCR este util n stabilirea etiologiei. 1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere

al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). Aa cum am menionat, recoltarea LCR prin puncie (dup verificarea presiunii din artera central a retinei prin examinarea fundului de ochi) trebuie fcut pe ct posibil la patul bolnavului, avnd la dispoziie tot ce este necesar pentru pregtirea frotiurilor, cultivarea pe diferite medii de cultur, repartizarea unei cantiti de LCR pentru examenul citologic i biochimic (vezi i capitolul 6). LCR poate fi purulent. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Meningococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor nazale sau faringiene etc. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Dac LCR este franc purulent frotiurile se pot executa direct din p.p., n caz contrar realizm iniial centrifugarea LCR. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezenacelulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Meningococii sunt germeni pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. MuellerHinton, geloz-snge sau geloz-chocolat) pe care formeaz colonii de tip S sau de tip M. Este necesar o atmosfer de 3-5% CO2, la o temperatur de 37C. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere: Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Caractere de cultur: Coloniile de meningococ sunt de tip S, cu dimensiuni de circa 1-2 mm. Tulpinile ncapsulate (ex. grupele A, C) pot conduce la apariia unor colonii de tip M. Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Spre exemplu meningococul metabolizeaz att glucoza ct i maltoza. Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi i capitolul 12)

Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek etc). Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 12 serotipuri. Cel mai important determinant antigenic este capsula polizaharidic. Structura capsular permite subdivizarea speciei n 13 serogrupuri. Dintre acestea mai importante sunt grupele: A, B, C, Y i W135. Prezena meningococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin latex aglutinare, coaglutinare sau contraimunoelectroforez utiliznd seruri polivalente anti -A, C, Y, W-135 i respectiv seruri monovalente anti-B (se pot detecta 0,02-0,05 mg de Ag / ml). De notat posibilitatea unei reactiviti ncruciate fa de Ag grupului B, respectiv Ag K1 de la E. coli. Tehnici similare se pot utiliza pentru identificarea tulpinilor de meningococ izolate n cultur. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate: Exist diferite tehnici (imunologice, electroforetice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centre de referin. Utilizarea PCR are o sensibilitate i specificitate de circa 91%; foarte util la pacienii pentru care s-a iniiat deja antibioticoterapia. 5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice. n cazul unor infecii grave antibiograma trebuie s fie nsoit de alte determinri (vezi capitolul 14).

Neisseria gonorrhoeae Infeciile gonococice continu s reprezinte o problem important de sntate public.Dup ptrunderea n organismul receptiv, n funcie de calea de transmitere, gonococul se ataeaz de mucoase (genito-urinar, ocular, rectal, faringian etc) i produce local o supuraie acut. La brbai apare uretrita gonococic. La femei, gonoreea se localizeaz endocervical, dar se poate extinde la nivelul uretrei, vaginului, glandelor Bartholin, trompelor uterine. Dac mama are gonoree i nou-nscutul se nate pe cale natural, poate aprea oftalmia gonococic. Rareori gonococul poate disemina pe cale sanguin (bacteriemie), cu apariia unor leziuni dermice, artrite, tenosinovite gonococice etc.Diagnosticul de laborator n gonoree Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct), cu etapele cunoscute.

1. Recoltarea i transportul produsului patologic trebuie s se realizeze respectnd regulile cunoscute (ct mai aproape de debutul bolii, nainte ca pacientului s fi primit antibiotice, ct mai rapid i corect din punct de vedere al tehnicilor utilizate, respectnd toate normele de asepsie i antisepsie etc). La brbat se preleveaz secreia uretral(eventual pictura matinal) iar la femeie recoltarea trebuie efectuat pe mas ginecologic de la nivelul colului uterin i glandelor Bartholin (vezi i capitolul 6). Secreiile au de obicei un aspect purulent. Este de preferat cultivarea imediat, pe medii de cultur potrivite i n atmosfer de CO2. n cazul n care p.p. urmeaz a fi transportat ctre laborator, transportul trebuie realizat fr ntrziere (la o temperatur apropiat de 37C). Chiar i n cazul utilizrii mediilor de transport (ex. mediul Amies plus crbune activat), acesta nu ar trebui s dureze mai mult de 6 ore. Gonococul ar putea fi izolat i prin hemocultur, cultivarea secreiilor conjunctivale, faringiene, cultivarea urinei etc. n cazul n care nu exist nici o secreie, se poate utiliza urina care trebuie centrifugat i nsmnat imediat pe medii de cultur. 2. Examinarea microscopic a produsului patologic include realizarea a minim dou frotiuri din produsul patologic recoltat i transportat corespunztor, care se vor colora cu albastru de metilen (AM) i respectiv Gram. Frotiurile se examineaz la microscopul optic cu imersie i se noteaz prezena celulelor, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) i prezena cocilor gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, nconjurai de o structur capsular comun, situai intra sau extraleucocitar. 3. Cultivarea pe medii de cultur a produsului patologic se realizeaz n aa fel nct s se poat obine colonii izolate i respectiv o cultur pur, care se va identifica (vezi i capitolele 9 i 10). Gonococii sunt germeni foarte pretenioi, care nu se dezvolt pe medii simple, sunt aerobi, facultativ anaerobi. Se pot utiliza medii selective (ex. medii n care se include vancomicin, colistin, trimetoprim i nistatin) sau neselective (ex. mediul GC, geloz-snge sau geloz-chocolat cu diferite suplimente nutritive; se recomand utilizarea pulberii de hemoglobin i nu a sngelui proaspt). Este preferat cultivarea n dublu, pe medii selective i neselective; n cazul n care p.p. este reprezentat de secreie de la nivelul rectului sau de secreie faringian se vor folosi numai medii selective. Este necesar o atmosfer de 3-10% CO2, la o temperatur de 35-37C. Coloniile apar n 24-48 de ore. Gonococul produce colonii de tip S, cu dimensiuni de 0,5-1 mm sau colonii de tip M, nepigmentate, transparente sau opace. Este de remarcat faptul c n aceeai plac pot aprea pn la cinci tipuri de colonii (T1-T5), ceea ce poate facilita identificarea. Placa este eliminat n cazul n care nu se dezvolt colonii, dup 72 de ore. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai multor caractere:

Caractere morfotinctoriale: Sunt coci gram-negativi, dispui n diplo, reniformi, imobili, eventual nconjurai de o structur capsular comun, nesporulai. Se poate utiliza i coloraia fluorescent. Caractere de cultur: Coloniile de gonococ sunt de tip S sau M (vezi punctul 3). Caractere biochimice: Metabolizeaz diferii carbohidrai, activitate care poate fi util n identificare. Gonococul metabolizeaz glucoza dar nu i maltoza. Produc citocrom-oxidaz, un test cheie n identificare (vezi i capitolul 12). Testul catalazei (superoxol) este intens pozitiv. Exist o serie de sisteme comerciale pentru identificare exoenzimatic a Neisseriilor (ex. Quad Ferm+, RIM, Minitek, Gonochek II etc). Utiliznd galeriaAPI NH(manual) putem identifica specii deNeisseria, Haemophilus i Branhamella catarrhalis, n numai 4 ore. Caractere antigenice: n funcie de structura lipooligozaharidului exist 6 serotipuri. Gonococii pot exprima simultan mai multe structuri antigenic diferite, ceea ce creaz probleme tehnice. Aceste testri se realizeaz n centre de referin. Prezena gonococului poate fi detectat direct n produsul patologic prin coaglutinare (suspensie de S. aureus tip Cowan I stabilizat i sensibilizat cu Ac monoclonali antiprotein I din membrana extern a gonococilor) sau printr-o tehnic imunoenzimatic (cu Ac policlonali). Se pot utiliza Ac monoclonali cunoscui, pentru identificare gonococului prin tehnica imunofluorescenei directe. Caractere utilizate n tiparea (tipizarea) tulpinilor izolate sau direct pentru p.p.: Exist diferite tehnici (imunologice, biochimice, de biologie molecular) care sunt practicate numai n centrele de referin. Metodele biologiei moleculare au att o specificitate ct i o sensibilitate foarte bun; se pot utiliza fie pornind de la culturi fie de la p.p. Sondele nucleotidice PCR LCR (Ligase Chain Reaction); aceast metod se poate utiliza pornind de la urin sau de la secreii vaginale i are un singur dezavantaj, costul ridicat.

5. Antibiograma (testarea sensibilitii tulpinilor izolate n vederea stabilirii tratamentului) este recomandat i se realizeaz de obicei prin metode difuzimetrice (mediul utilizat este GC suplimentat nutritiv dar fr pulbere de hemoglobin). Au fost identificate tulpini rezistente la penicilin (fie datorit unui plasmid care codific o b-lactamaz de tipul TEM, fie datorit unor mutaii cromozomiale). Este necesar testarea producerii de b-lactamaz (de ex. folosind discuri cu nitrocefin). Determinarea CMI se poate realiza prin metode clasice sau cu ajutorul testului E (vezi capitolul 14).