Validarea metodelor de

analiză
Parametrii de
performanță - 2
Parametrii de performanță
Cerință analitică Parametru de performanță Verificare / Validare
confirmare completă
Rezultat cantitativ, interferențe și influența Selectivitate / Specificitate nu da
acestora asupra rezultatului Sensibilitate nu da
Comparabilitate cu rezultatele altor Robustețe nu da
laboratoare
Identificarea analitului de interes și nivelul Domeniul de lucru da da
de concentrație Domeniul liniar da da
Limită de detecție da da
Limită de cuantificare da da
Comparație cu specificația, Acuratețe Precizie Repetabilitate da da
fidelitatea rezultatului Precizie da da
intermediară
Reproductibilitate da da
Justețe Bias da da
Recuperare da da
Comparație cu specificația Incertitudine de măsurare da da
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 2
Limita de detecție – LOD (1)
 Definiție: semnalul de ieșire sau valoarea concentrației
peste care se poate afirma, cu un nivel de încredere
indicat, că o probă este diferită de o probă martor care
nu conține analitul de interes

 Cea mai mică, cantitate de analit din probă care poate fi

detectată în probă de matrice specificată (nu obligatoriu
cantitativ!)

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 3

Generalități despre LOD și LOQ
 Joacă un rol neobișnuit de semnificativ în procesul de verificare /
validare
 Semnificația lor – relativ simplă, dar
 Uneori, determinarea este problematică
 Există numeroase definiții
 Dificultăți practice de determinare a unui parametru de bază din
definirea LOD: magnitudinea zgomotului (noise) dat de o
măsurătoare instrumentală
 Posibilitatea de obținere sau de fabricare a probelor blanc (de
matrice)
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 4
 Aspecte de diferențiat
 Când măsurătorile sunt efectuate la niveluri foarte joase de concentrație:
 Să stabilim o valoare a rezultatului care să indice un nivel al analitului
semnificativ diferit de zero
 Se iau decizii la acest nivel (ex. declararea contaminării unui material)

 Nivelul = valoare critică, limită de decizie, limită de blank - CCα (chimia

clinică)
 CCα = 1,65*s

 Este important să cunoaștem cea mai mică concentrație a analitului ce

poate fi detectată de către metodă cu un nivel specificat de încredere –
LOD - CCβ
 CCβ = 3,3*s

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 5

 Informații suplimentare – limita de decizie

 Detalii în 2002/657/EC COMMISSION DECISION of 12 August 2002

implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance
of analytical methods and the interpretation of results (citat în
Eurachem MV, 2014)

 Commission Implementing Regulation (EU) 2021/808 of 22 March

2021 on the performance of analytical methods for residues of
pharmacologically active substances used in food-producing animals
and on the interpretation of results as well as on the methods to be
used for sampling and repealing Decisions 2002/657/EC
and 98/179/EC

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 6

 Tipuri de LOD
 LOD instrumentală: analiza unui eșantion, blanc de reactivi,
măsurat direct de echipament (omiterea pașilor de pregătire
a probei) sau raportul semnal-zgomot (S/N) >3
 LOD a metodei: analiza unui set de blanc de matrice sau
blanc de reactivi, analizate independent în condiții de
repetabilitate, care a fost prelucrat prin întreaga procedură
de încercare, utilizând aceeași ecuație de calcul a rezultatelor
ca și pentru probele de încercat

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 7

Abordare în determinarea LOD

Non- • Experiență analitică

• Estimare vizuală (a concentrației minim
instrumentale detectabile)

• Raportul S/N
• Utilizarea probelor blanc
Instrumentale • Din curba de calibrare
• Calculul LOD din LOQ dat

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 8

Determinarea LOD din S/N (1)
 Raportul S(semnal) / N(noise)
 Definiție: mărime adimensională care descrie relația dintre un
semnal analitic și nivelul mediu de zgomot pentru o probă dată
 Valoarea S/N – utilă în determinarea influenței nivelului de
zgomot asupra deviației relative a măsurării
 Este aplicabilă doar în cazul în care este posibilă obținerea
unei linii de bază a zgomotului atunci când este măsurată o
serie de probe blanc

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 9

 Determinarea LOD din S/N (2)
 Estimare S/N:
Raport dintre media aritmetică a
rezultatelor unor măsurări ale
unei serii de probe blanc sau
probe ce conțin o cantitate
foarte mică de analit și deviația
standard a respectivelor
rezultate
S/N = xm/s
S/N ÷ 3-10

De obicei, S/N = calculat de soft

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 10

Determinarea LOD din probe blanc (1)
Ce se face Nr. de Ce se obține Comentarii
teste
a) 10 probe blanc de matrice Se calculează abaterea standard a când probele
independente (probă de matrice care setului de 10 rezultate, s0. blanc dau s ≠
nu conține analitul de interes) 0 (când nivelul
măsurate o singură dată Se calculează LOD: de fond al
10 LOD = xm + 3 x s0´ blancului de
matrice este
situat peste
LOD
detectorului)
b) 10 probe blanc de matrice Se calculează abaterea standard a
independente fortificate la cea mai setului de 10 rezultate, s0.
scăzută concentrație de analit de
interes (LOD așteptat) 10 Se calculează LOD:
LOD = 0 + 3 x s0´

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 11

Determinarea LOD din probe blanc (2)
Ce se face Nr. de Ce se obține Comentarii
teste
a) 10 probe blanc de reactiv Se calculează abaterea Se utilizează această
independente măsurate o singură standard a setului de abordare atunci când nu
dată 10 rezultate, s0. există un blanc de matrice.
10 Când proba blanc de
Se calculează LOD. reactivi nu este procesată
LOD = xm + 3 x s0´. în niciun mod, ci se
introduce direct în
b) 10 probe blanc de reactiv Se calculează abaterea instrument, se obține
independente fortificate la cea mai standard a setului de limita de detecție
scăzută concentrație de analit de 10 rezultate, s0. instrumentală
interes (LOD așteptat) 10
Se calculează LOD.
LOD = 0 + 3 x s0´

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 12

Specificații de calcul pentru LOD
 Legea Apei Potabile

L 458/2002 și L 311/2004 Ord. 22/2017

a) o valoare de 3 ori mai mare decât a) de 3 ori deviația standard din
deviația standard asociată unui cadrul unui lot de probe naturale
nr. de determinări pentru o probă care conțin o concentrație redusă a
simplă de apă conținând o parametrului
concentrație mică a parametrului
b) o valoare de 5 ori mai mare decât b) de 5 ori deviația standard a unei
deviația standard a unei probe probe martor (în cadrul unui lot)
martor pentru fiecare serie de
probe

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 13

Determinarea LOD din probe blanc (3)
 În cazul în care fiecare valoare a concentrației xi se obține ca medie aritmetică a n
replicate, atunci abaterea standard 𝒔𝒔𝟎𝟎 devine 𝒔𝒔,𝟎𝟎 :
𝒔𝒔𝟎𝟎
𝒔𝒔,𝟎𝟎 =
𝒏𝒏
 În cazul în care procedura specifică de lucru (PSL) menționează că valoarea măsurată
se face prin corecție de blanc, atunci abaterea standard 𝒔𝒔𝟎𝟎 :
𝟏𝟏 𝟏𝟏
𝒔𝒔,𝟎𝟎 = 𝒔𝒔𝟎𝟎 +
𝒏𝒏 𝒏𝒏𝒃𝒃

 𝒔𝒔𝟎𝟎 = abaterea standard a șirului de m măsurători

 𝒔𝒔,𝟎𝟎 = abaterea standard utilizată la calculul LOD
 𝒏𝒏 = numărul de probe replicate utilizate la raportarea unui rezultat, în condițiile în
care fiecare probă replicată este analizată, independent, prin intermediul întregului
proces analitic
= numărul
𝒏𝒏𝒃𝒃Inspect
Integra de probe
Consulting Validarea metodelor de analiză – blanc
Parametrii de utilizate
performanță la calculul valorii medii
04.04.2022 a corecției de blanc. 14
Determinarea LOD din probe blanc (4)

 metode la care proba blanc intervine în corectarea rezultatelor (ex.:

metode spectrofotometrice):
𝟏𝟏 𝟏𝟏
LOD = 3 x s0´, unde s0´ = s0 √( + )
𝒏𝒏 𝒏𝒏𝒏𝒏
 metode la care proba blanc nu intervine în corectarea rezultatelor
(ex.: metode potențiometrice, gravimetrice, volumetrice):
LOD = 3 x s0´, unde s0´ = s0 / √𝒏𝒏 (dacă se măsoară n replicate)
 Limita de detecție se evaluează și se verifică, în principiu, o singură
dată

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 15

 ,
Exemplu de calcul al lui 𝒔𝒔𝟎𝟎
 10 măsurători independente de probă blanc de matrice (m=10)
 Valoarea medie xm = 2 mg/kg și s = 1 mg/kg
 Cazul 1: PS prevede o singură măsurare per probă (n=1), iar rezultatul
corectat cu o probă blanc (nb=1)
𝟏𝟏 𝟏𝟏
 𝒔𝒔,𝟎𝟎 = 𝟏𝟏 + = 𝟏𝟏 𝟐𝟐 = 1,4 mg/kg
𝟏𝟏 𝟏𝟏

 Cazul 2: PS prevede măsurarea probei în duplicat (n=2), iar rezultatul

corectat cu proba blanc măsurată în duplicat
𝟏𝟏 𝟏𝟏
 𝒔𝒔,𝟎𝟎 = 𝟏𝟏 + = 1,0 mg/kg
𝟐𝟐 𝟐𝟐

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 16

 Calculul LOD din curba de calibrare
 Principiu indirect de evaluare a LOD
𝟑𝟑.𝟑𝟑 𝐱𝐱 𝐬𝐬
 𝐋𝐋𝐋𝐋𝐋𝐋 = , unde
𝐛𝐛
 b = panta curbei de calibrare
 s – deviația standard:
 s bl – deviația standard a rezultatelor pentru o serie de probe blanc trecute
prin întreaga PS = LOD a metodei
 s y – deviația standard reziduală (s y / b = s x0 = deviația standard a metodei)
– LOD instrumental (din calculul parametrilor statistici ai cc)
 s a – deviația standara a ordonatei la origine – LOD instrumental (din funcția
”regression” in Excel
 Standard error of intercept (SE) – din ANOVA

 SD = SE x √n

 LOD = (3.3 x SD)/b

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 17
Calculul LOD din LOQ dat
 Doar atunci când există cerință de determinare a LOD

 Când este specificat LOQ în standardul de metodă (ex.

valoare minimă de determinare), această valoare se
consideră a fi primul punct de pe curba de calibrare și
confirmă pe matrice

 LOD = LOQ /3

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 18

 Limita de cuantificare – LOQ
 Definiție: un multiplu definit al LOD pentru o concentrație a substanței analizate care
poate fi rezonabil determinată la un nivel acceptabil de acuratețe și precizie
 Apar informații noi:
 Este mărime cuantificabilă
 Este obligatoriu de a fi calculată
 Criterii: acuratețe și precizie
 Legislație: D QA/QC (2009/90): Limita de cuantificare poate fi calculată utilizând un standard
adecvat sau o probă adecvată și poate fi obținută din cel mai jos punct de pe curba de calibrare,
excluzând proba martor;
 Sinonime: limită de raportare, limită de determinare>
 x < LOD: nedetectabil (ND)
 LOD < x < LOQ: necuantificabil (< LOQ)
 X > LOQ (valoarea măsurată)
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 19
Determinarea LOQ din probe blanc (1)
Ce se face Nr. de teste Ce se obține Comentarii

a) 10 probe blanc de matrice Se calculează abaterea standard a

independente (probă de setului de 10 rezultate, s0.
matrice care nu conține
10 Valoarea factorului
analitul de interes) Se calculează LOD:
măsurate o singură dată LOQ = xm + kQ x s0´ de multiplicare kQ
este, în mod uzual,
b) 10 probe blanc de matrice Se calculează abaterea standard a 10, dar se pot folosi
independente fortificate la setului de 10 rezultate, s0. și valorile de 5 sau 6
cea mai scăzută (conform criteriului
concentrație de analit de 10 Se calculează LOQ cu factorul de "adecvare la scop")
interes (LOQ așteptat) multiplicare kQ:
LOQ = 0 + kQ x s0´

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 20

Determinarea LOQ din probe blanc (2)
Ce se face
a) 10 probe blanc de reactiv
independente măsurate o singură
dată
b) 10 probe blanc de reactiv
independente fortificate la cea mai
scăzută concentrație de analit de
interes (LOQ așteptat)
Nr. de Ce se obține Comentarii
teste
Se calculează abaterea
standard a setului de
10 rezultate, s0.
10
Valoarea factorului de
Se calculează LOQ.
multiplicare kQ este, în
LOD = xm + kQ x s0´.
mod uzual, 10, dar se pot
folosi și valorile de 5 sau 6
Se calculează abaterea
(conform criteriului
standard a setului de
"adecvare la scop")
10 rezultate, s0.
10
Se calculează LOQ.
LOQ = 0 + kQ x s0´

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 21

Abordare în determinarea LOQ

 Se preiau informațiile din standardul de metodă /

documentat
 ca limită minimă de determinare
 ca LOD (LOQ = 3 x LOD)
 primul punct de pe curba de calibrare, relativ la
informația privind limita minimă de domeniului
 din LOD, dacă LOD a fost calculat și nu estimat
 Calcul din probe blanc
 Din LOQ estimat și criteriul stabilit pentru precizie
(metoda grafică)
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 22
Determinarea LOQ din metoda grafică
și criteriul pentru precizie
 Se pleacă de la LOQ așteptat și definiția LOQ (”nivel acceptabil de precizie”)
 Se aleg cel puțin 5 niveluri de concentrație pe un domeniu care să cuprindă și
LOQ așteptat (LOQ așteptat să fie situat în interiorul domeniului, nu capăt de
domeniu!)
 Pentru fiecare nivel de concentrație se efectuează câte 10 măsurători
 Pentru fiecare nivel de concentrație se calculează CV%
 Se reprezintă grafic CV% = f(c)
 Se consideră criteriul pentru precizie CV % = 10 %
 Prin extrapolare, se determină concentrația la care CV % = 10% (din ecuația
curbei)
 Se poate calcula LOD dacă nu a fost calculat într-o etapă anterioară
 LOD = LOQ /3
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 23
LOD față de LOQ și domeniul de măsurare

Credit: Zagreb & Theodorsson

Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 24
Limita de cuantificare - țintă de îndeplinit
 LOQ: necesitatea aplicării criteriilor de acceptabilitate față de o specificație tehnică
(concentrație Maxim Acceptabilă – CMA, valoare prag, etc)
În general, criteriul de acceptabilitate:
 LOQ ≤ 30% CMA (LOD ≤ 10% CMA – din Legea Apei Potabile)
 Se ia în considerare criteriul cel mai restrictiv!
Exemplu: Ordonanța 22/2017 pentru modificarea și completarea Legii nr.
458/2002 privind calitatea apei potabile
[…] caracteristicile de performanță specificate constau în faptul că metoda de
analiză utilizată trebuie să aibă cel puțin capacitatea de a măsura
concentrații egale cu valoarea parametrului stabilită în anexa nr. 1 cu o
limită de cuantificare mai mică sau egală cu 30% din valoarea-limită a
parametrului în cauză, stabilită în anexa nr. 1 și o incertitudine de
măsurare astfel cum se specifică în tabelul 1.
Integra Inspect Consulting Validarea metodelor de analiză – Parametrii de performanță 04.04.2022 25