1 SINTEZA PROTEINELOR Abilitatea celulelor de a menine un nalt nivel de ordine ntr-un univers haotic depinde de informaia genetic, informaie

care este exprimat, meninut, replicat i ocazional ameliorat printr-o serie de procese specifice cum ar fi: sinteza ARN i a proteinelor, repararea ADN, replicarea ADN i recombinarea genic. n cadrul acestor procese, informaia dintr-o secven linear de nucleotide este transpus fie ntr-un alt lan de nucleotide (ADN sau ARN) fie ntr-un lan de aminoacizi (peptid). Proteinele constituie mai mult de 50% din masa uscat a unei celule iar sinteza lor este esenial pentru meninerea statusului celular ca i pentru cretere i dezvoltare. Sinteza proteinelor reprezint cel mai complex proces biosintetic descris pn la momentul de fa; aceasta deoarece, la eucariote, procesul de sintez a proteinelor implic activitatea a 70 proteine ribozomale diferite, a peste 20 de enzime necesare activrii aminoacizilor precursori, a zeci de proteine auxiliare alturi de factori de iniiere, elongare i terminalizare, a aproximativ 100 enzime adiionale pentru procesare final a diferitelor proteine, a peste 40 de tipuri de ARNt. Circa 300 de macromolecule sunt implicate n cooperarea necesar sintezei proteinelor. NECESAR DE MATERIALE Sinteza proteinelor necesit, ca i construcia unei cldiri, - crmizi care n acest caz sunt reprezentate de aminoacizi - transportorii ARNt specifici - constructori ribozomii - un plan, aici reprezentat de informaia cuprins n ARNm, copiat pe baza codului genetic cuprins n ADN ARNt, transportorii aminoacizilor care vor constitui viitorul lan peptidic, acioneaz ca i adaptori ce vor transla secvena nucleotidic n secven proteic. Molecula de ARNt este o molecul mic, avnd circa 70-90 nucleotide. Are o structur specific, o extremitate posednd sistemul de conectare la secvena codonului de pe ARNm (deci un anticodon) i alta care cuprinde sistemul de conectare la un aminoacid specific. O a doua funcie a ARNt este aceea de a activa un aminoacid (AA) specific, cuplndu-l la captul carboxiterminal printr-o legtur de nalt energie; astfel, captul carboxi-terminal ncrcat din punct de vedere energetic va putea s se cupleze cu regiunea amino-terminal a urmtorului aminoacid adus de un alt ARNt. Activarea este necesar, deoarece un AA neactivat nu va putea fi adugat unui lan polipeptidic n cretere. Activarea AA necesit energia furnizat de hidroliza ATP.

Structura ARNt (forma desfurat)

Structura ARNt (structura tridimensional)

Ribozomii Structur. Ribozomii nu pot fi observai n microscopia fotonic. Ultrastructur. n microscopia electronic au fost descrii ca i corpusculi elipsoidali cu diametrul mare de 20-25 nm iar cel mic de 15-17 nm. Din punct de vedere ultrastructural cuprind 2 subuniti: Subunitatea mic la eucariote au un coeficient de sedimentare 40S (30S la procariote) Subunitatea mare la eucariote au un coeficient de sedimentare 60S (50S la procariote) Subunitatea mic prezint o proeminen numit cap, o platform i o baz sau corp (platforma i baza reprezint 2/3 din unitate). ntre cap i baz se gsete o strangulaie. Subunitatea mare prezint 3 proeminene din care una central numit protuberan central iar celelalte tulpin i creast. ntre protuberana central i creast exist o depresiune i un canal prin care se scurge lanul polipeptidic n reticulul endoplasmatic rugos. La nceputul i finalul sintezei unui peptid, subunitile sunt separate.

Ribozomii, structur tridimensional pe subuniti Subunitile ribozomale i componentele lor moleculare Scuze, n-am mai avut timp s traduc

Structura molecular a ribozomilor Structura chimic a ribozomilor cuprinde molecule de ARN ribozomal (ARNr), proteine bazice, acide i ioni (Mg, K, Ca). Subunitatea mare este format din ARNr 5S, ARNr 28S (responsabil de formarea legturii peptidice; la procariote are 23S) i 49 de proteine. Subunitatea mic este format din ARNr 18S i 33 proteine. Structura tridimensional a ribozomilor a fost descris complet pentru E. coli n august 2000. Astfel s-a constatat c proteinele din compoziie sunt structuri de asigurare a unitii i mobilitii ribozomale, fiind situate mai mult la suprafaa ribozomului de unde trimit extensii sinuoase spre interior, unde sunt locaiile de cuplare a ARNt.. Sinteza propriuzis a peptidului i mai ales formarea legturii peptidice reprezint opera aproape exclusiv a ARNr 23S (28S la eucariote). Astfel ribozomul poate fi privit ca o uria riboenzim. (asta e de actualitate !)

4 ARNm, planul construciei proteinelor. ARN este sintetizat pe baza ADN sub influena unor enzime denumite ARN-polimeraze; procesul poart numele de transcripie. Toate cele 3 tipuri de ARN (transfer, mesager sau ribozomal) reprezint copii ale unor secvene de ADN. ARNm este deci o molecul monocatenar, cu lungimea cuprins ntre 70 i 10.000 de nucleotide. Dei, n principiu, orice parte a moleculei de ADN poate fi transcris, numai anumite zone sunt utilizate n acest scop, n funcie de anumite secvene nucleotidice, denumite promotori. Sunt definite trei tipuri de ARN i anume ARNm, ARNt i ARNr. Codul genetic este degenerat. n timpul sintezei proteice, mainria translaional se mic dinspre captul 5 spre captul 3 al moleculei de ARNm. Secvena ARNm este citit cu cte 3 nucleotide odat (3 nucleotide succesive = codon). Fiecare aminoacid este specificat n secvena ARNm de ctre un triplet de nucleotide, denumit codon, care corespunde unei secvene similare de nucleotide la nivelul ARNt, anticodon.

a. Alinierea ARNm i ARNt este antiparalel. ARNt este reprezentat n configuraia caracteristic de frunz de trifoi. b. Trei tipuri de relaii posibile codon anticodon atunci cnd anticodonul ARNt conine inozinat.

Deoarece numai un anumit ARNt poate fi complementar unui anumit codon de pe ARNm, acesta din urm va determina aminoacidul specific ce va fi adugat. Avnd n vedere c ARN este compus din 4 tipuri de nucleotide, exist 64 de posibiliti de a aranja cte 3 nucleotide ntr-un codon (4x4x4). Trei secvene din aceste 64 nu codific pentru aminoacizi, reprezentnd codonii stop. Rmn deci, 61 de codoni care vor codifica pentru 20 de aminoacizi. De aceea majoritatea AA sunt reprezentai de mai mult de 1 codon, motiv pentru care codul genetic este denumit degenerat. Doi AA, Met i Trp sunt reprezentai de un singur codon i n acelai timp sunt cei mai puin abundeni AA dintr-o celul.

5 Degenerarea codului genetic const fie n faptul c exist mai muli ARNt specifici pentru acelai aminoacid fie n acela c un ARNt poate cupla mai muli codoni diferii. De fapt, ambele situaii sunt valabile. Pentru unii aminoacizi exist mai mult de un ARNt, iar unele molecule de ARNt sunt astfel construite nct necesit o omologie numai la nivelul primelor 2 nucleotide din codon, tolernd o nepotrivire la cel de-al treilea ipoteza wobble ovial. De exemplu, alanina (Ala) este codat de tripletele GCU, GCC, GCA sau GCG. Primele 2 perechi de baze (GC i AT) la nivelul cuplului codon-anticodon formeaz legturi puternice de hidrogen (numite legturi Watson-Crick); n schimb, a treia baz azotat din codon (A, U sau C) formeaz puni de hidrogen slabe cu reziduul inosinat, localizat n prima poziie a anticodonului (vezi figura de mai sus). REZUMAT - ! FAZE DE REINUT O secven de AA dintr-o protein este construit pe baza translrii informaiei codificate n ARNm, reprezentnd copia unei catene din ADN. Acest proces este realizat de ctre ribozomi. Aminoacizii sunt specificai de codonii ARNm care reprezint triplete de nucleotide. Procesul de translaie necesit molecule adaptor care sunt ARNt. Aceste molecule conin triplete de nucleotide anticodoni care corespund codonilor din ARNm. ARNt vor insera aminoacizi n poziiile lor specifice din lanul polipeptidic. Codonul AUG semnalizeaz nceputul translaiei. Tripletele UAA, UAG i UGA reprezint codoni stop. Codul genetic standard este degenerat: prezint multiple cuvinte cod pentru aproape fiecare aminoacid. Cuvintele de cod sunt universale la toate speciile cunoscute, cu mici excepii la mitocondrii i unele unicelulare. A treia poziie din fiecare codon este mai puin specific dect primele dou. SINTEZA PROTEINELOR - ETAPE Etapele sintezei proteice sunt divizate n 3 etape principale i 2 accesorii, una care precede sinteza propriu-zis activarea presintetic a precursorilor i una postsintetic procesarea lanului de aminoacizi. Pe scurt ETAPA I ACTIVAREA PRESINTETIC A PRECURSORILOR Pentru sinteza unui polipeptid cu o secven definit sunt necesare 2 condiii biochimice: - grupul carboxil al fiecrui aminoacid trebuie s fie activat pentru a facilita formarea legturii peptidice - trebuie stabilit o legtur ntre fiecare nou AA i informaia din ARNm-ul care l codeaz. Ambele necesiti sunt ndeplinite de ataarea unui AA la un ARNt specific n prima etap a sintezei proteice. Ataarea AA corect este esenial. Aceast reacie are loc n citoplasm i nu n ribozom. Fiecare din cei 20 de aminoacizi este cuplat covalent la ARNt specific prin energia furnizat de hidroliza ATP, n prezena unor enzime de activare dependente de Mg,

6 numite ARS (amioacil ARNt-sintetaze). Odat ce AA este ataat la ARNt, se formeaz un aminoacil-ARNt (AA-ARNt) iar AA este numit activat. ETAPA II - INIIEREA ARNm care transport codul pentru polipetidul de sintetizat se cupleaz la subunitatea ribozomal mic i la AA-ARNt. Apoi are loc cuplarea subunitii mari pentru a forma complexul de iniiere. AA-ARNt de iniiere i codonul AUG de pe ARNm semnalizeaz debutul sintezei polipeptidului. Acest proces necesit GTP i este indus de o serie de factori numii factori de iniiere. ETAPA III-a ELONGAREA Polipeptidul nascent este alungit prin legarea covalent succesiv a unitilor AA, fiecare fiind transportat la ribozom n poziia corect de ctre ARNt specific. Elongarea necesit proteine citoplasmatice numite factori de elongare. Ataarea fiecrui AA-ARNt i micarea ribozomului de-a lungul ARNm este determinat de hidroliza GTP (1 GTP la fiecare reziduu AA adugat la polipeptid). ETAPA IV-a TERMINALIZAREA I ELIBERAREA Completarea lanului polipeptidic este semnalizat de codonii stop din ARNm. Polipeptidul este eliberat din ribozom cu ajutorul factorilor de eliberare. ETAPA V PLIERE I PROCESARE POSTTRANSLAIONAL Pentru determinarea formei active biologic, polipeptidul trebuie pliat pentru determinarea conformaiei tridimensionale. nainte sau dup pliere, polipeptidele sufer procesare enzimatic care include nlturarea unor aminoacizi (de obicei de la captul aminoterminal), adiia gruprilor acetil, fosforil, metil, carboxil etc.), ataarea unor grupri carboxilice sau prostetice. ETAPA I ACTIVAREA PRESINTETIC A PRECURSORILOR Aminoacil-ARNt-sintetazele activeaz ARNt. Am vzut modul n care un anumit ARNt recunoate codonul care specific un anumit aminoacid. S vedem modul n care ARNt cupleaz AA devenind activat. Acest proces crucial este catalizat de 20 aminoacil-ARNt sintetaze (ARSs), fiecare fiind capabil de a recunoate un anumit AA i ARNt-ul su corespunztor. Aceste enzime de cuplare leag un AA la hidroxilii 2 sau 3 care sunt liberi la nivelul ribozei din adenozin, nspre captul terminal al moleculei de ARNt. Reacia de cuplare a AA este o reacie n doi pai, dependent de hidroliza ATP. Enzim + AA + ATP
Mg

Enzim(aminoacil-AMP) + PPi aminoacil-ARNt + AMP + Enzim

ARNt + Enzim(aminoacil-AMP)

n prima etap, enzima, aminoacidul i ATP formeaz un complex i elibereaz PP i n a doua etap, grupul aminoacil este transferat din complexul enzimatic pe ARNt, care va elibera AMP. Aproape jumtate din ARSs transfer grupul aminoacil la hidroxilul 2 al adenozinei, constituind sintetaze de clasa I, iar celelalte, care transfer aminoacilul la hidroxilul 3 al adenozinei reprezint sintetaze de clasa II. AA-ARNt rezultat pstreaz energia rezultat din hidroliza ATP, reziduul de aminoacid fiind astfel activat. Echilibrul reaciei este dirijat

7 nspre activarea aminoacidului datorit pirofosfatazei fosfoanhidridice nalt energetice din pirofosfat. ntreaga reacie se poate scrie: AA + ATP + ARNt
enzim

care

desface

legturile

aminoacil-ARNt + AMP + 2Pi

Recent, s-a determinat structura ARSs din E.Coli i din multe eucariote, observndu-se c fiecare tip de enzim are un anumit model (secven de AA) caracteristic fiecrei clase. Determinarea structurii tridimensionale a celor 2 tipuri de ARSs a artat diferene n ceea ce privete contactarea ARNt. Fiecare molecul de ARNt este recunoscut de o aminoacil-ARNt-sintetaz specific. Identificarea ARNt de ctre ARS specific este la fel de important pentru translaie ca i mperecherea corect codon-anticodon. Odat ARNt ncrcat cu un AA, mperecherea codon-anticodon va direciona ARNt pe locul corect din ribosom. Dac este ataat un alt AA se produce o eroare n sinteza lanului. Un experiment clasic demonstreaz acest fapt. Un reziduu de cistein deja ataat la ARNt a fost nlocuit cu un rest de alanin astfel nct cisteinil-ARNt Cys a devenit alanil-ARNtAla. Adugat n sinteza unei lan polipeptidic n cretere n dreptul codonilor pentru Cys a aprut Ala. S-a demonstrat astfel c numai anticodonul ARNt este implicat n recunoaterea ce va duce la ataarea unui anumit AA n polipeptid. Nu se tie nc precis modul n care ARS identific ARNt specific. Se tie totui c o ARS poate aduga acelai AA la 2 (sau mai muli) ARNt, cu anticodoni diferii care codeaz acelai AA. Astfel, fiecare din aceti ARNt diferii au situsuri de cuplare similare care vor fi recunoscute de sintetaze. n vederea identificrii unui anumit AA de ctre ARNt, un rol important l joac structura braului acceptor al ARNt. Inseria unei singure perechi de baze la nivelul braului acceptor pentru AA la ARNtPhe poate comuta identitatea acestuia de la Phe la Ala.

9 INIIEREA Semnalul de iniiere la nivelul ARNm este codonul AUG. Primul eveniment al etapei de iniiere este ataarea unei molecule libere de Met la ARNt Met (specific) sub aciunea unei aminoacil-ARNt-sintetaze specifice. Exist cel puin 2 tipuri de ARNtMet. Primul tip, desemnat sub sigla ARNtiMet, poate iniia sinteza proteic n timp ce al doilea poate incorpora Met dar nu particip la creterea lanului polipeptidic. Aceeai enzim, metionil-ARNt-sintetaza poate ataa Met la ambele tipuri de ARNt dar numai complexul metionil-ARNtiMet poate cupla subunitatea ribosomal mic n vederea iniierii sintezei proteice. (la bacterii, grupul amino al Met este formilat). Complexul Met-ARNt iMet (asistat de un complex protein-GTP) mpreun cu subunitatea ribosomal mic se leag la ARNm, pe un situs specific, localizat adesea n imediata vecintate a codonului de iniiere AUG. La majoritatea bacteriilor, subunitatea ribosomal mic identific situsul de iniiere prin interaciunea dintre anumite secvene din ARNr16s i ARNm. La nivelul ARNm exist aa numita secven Shine-Delgarno chiar lng situsul de start al sintezei proteice, secven care este complementar cu o secven la sau imediat lng captul 3 al moleculei de ARNr16s. Astfel: mRNA 5-UAAGGAGG-(5-10 nucleotide)-AUG HO-AUUCCUCC-(aprox.1400 nucleotide)-5 rRNA

Semnalele start pentru sinteza proteic nu se potrivesc exact cu secvena din ARNr dar n general exist o coresponden la 6 din 8 nucleotide. Astfel, ARNr bacterian joac un rol esenial n selectarea unui situs de start al sintezei proteice la nivelul ARNm. Astfel, ribosomii bacterieni pot iniia sinteza proteic la nivelul acestor situsuri chiar dac acestea sunt situate in mijlocul unor molecule de ARNm foarte lungi. La eucariote, mecanismul prin care subunitatea ribosomal mic recunoate situsul de iniiere nu este precizat. Primul semnal recunoscut este captul 5, prezent la toate moleculele ARNm la eucariote. Totui, unele molecule de ARNm viral care sunt translate prin mecanismul celul gazd n eucariotele infectate, nu posed capt 5. n acest caz, recunoaterea are loc cu ajutorul unor factori proteici adiionali. De obicei, dup recunoaterea capului 5, are loc o glisare a subunitii mici de-a lungul moleculei de ARNm n vederea localizrii AUG. De obicei este utilizat primul codon AUG dar eficiena iniierii este accentuat considerabil de prezena unor anumite nucleotide n preajma AUG. Aceast secven, esenial pentru iniiere, situat la captul 5 al ARNm se numete secven Kozak (Marilyn Kozak). mRNA 5-ACCAUGG-

Ca i suport al acestei ipoteze, menionm c un ARNm circular artificial care nu are capete nu va fi translat. De asemenea, ARNm fr captul 5 sunt slab translate iar mutaii survenite la nivelul secvenei Kozak duc la o scdere a iniierii sintezei proteice. Totui, chiar dac n cazul virusului poliomielitei, lipsete captul 5, ribosomul gsete situsul de iniiere la 600 de nucleotide de acest capt. Se pare c, la eucariote, translaia ARNm are loc dup recunoaterea capului 5 fie prin utilizarea primului AUG fie prin recunoaterea unui AUG proximal datorit secvenei Kozak specifice.

10

Factorii de iniiere, ARNt, ARNm i subunitatea ribozomal mic formeaz un complex de iniiere. Subunitatea ribosomal mic poate gsi situsul de iniiere datorit unui grup de proteine, denumite factori de iniiere (IF). Fr aceste proteine nu se poate forma complexul de iniiere (cu ARNm, ARNtMet i subunitatea mic). S-au caracterizat 3 IF la procariote i cel puin 5 la eucariote. La procariote, IF3 este esenial pentru gsirea AUG. La eucariote, complexul eIF4 asigur faptul c ARNm este monocatenar (astfel asigurnd att fixarea capului 5 ct i eliminarea unor structuri secundare nedorite); de asemenea, eIF 4 asigur faptul c 5 este pregtit pentru ca subunitatea mic s localizeze AUG. Numai dup ce subunitatea mic gsete i leag AUG, subunitatea mare poate fi adugat. Iniierea lanului polipeptidic. Ar cuprinde cteva subetape: eIF2 care aduce cuplat o molecul de GTP se va lega de Met-ARNt iMet. (la procariote, Met de la ARNtMet este formilat). eIF2+ Met-ARNtiMet leag eIF3 i complexul eIF4 alturi de ARNm i R40, formnd complexul de iniiere de 40S. Are loc poziionarea corect a Met-ARNtiMet la AUG, cu consum energetic (ATP i GTP). Este eliberat eIF3. Este cuplat R60, cu intervenia eIF 1 i eIF5. Se consum o molecul de GTP. Se formeaz R80, deci ribozomul funcional, gata de sintez i care va cuprinde locurile E i P (spre captul 5) i locul A (spre captul 3). Sunt eliberai factorii de iniiere care-i reiau funcia.

Capetele 3 i 5 ale ARNm sunt cuplate cu un complex proteic care cuprinde unii factori de iniiere i proteina de cuplare PAB. eIF4E i eIF4G sunt parte a unui complex mai mare numit eIF4F, complex care cupleaz subunitatea ribosomal mic (40S)

Elongarea lanului polipeptidic. Presupune intervenia unor factori de elongare (EFTu, EFTs i EF-G la eucariote). n acest moment, Met-ARNtiMet ocup locul P n ribosom. Inseria. Sub influena unui complex EFTu-GTP, are loc poziionarea corect a unui AA-ARNt n locul A al ribozomului. GTP este hidrolizat iar EFTu-GDP este regenerat sub influena EFTs fiind retransformat n EFTu-GTP.

11

Locul A este liber pentru al doilea AA-ARNt care va fi cuplat la lan

Al doilea AA-ARNt este adus de ctre EFTuGTP, eliberat i fixat pe locul A. GTP din complex este hidrolizat iar EFTu-GDP este eliberat n citoplasm unde va regenera EFTuGTP sub influena EFTs-GTP

Al doilea AA-ARNt este inserat n locul A

12 Transferul. Aici, lanul peptidic de pe locul P (n acest caz, doar Met) este desprins de ARNt de pe locul P i cupleaz AA de pe locul A printr-o legtur peptidic. Locul P va fi ocupat de un ARNt deacilat iar locul A de un dipeptidil ARNt.

13 Translocarea. Prin hidroliza unei molecule de GTP, ribosomul se deplaseaz ctre captul 3 cu un codon. Astfel, ARNt de pe fostul loc P este eliberat n citoplasm, locul P devine acum locul A i va fi ocupat de acelai dipeptidil ARNt. Locul A este acum liber i gata de a primi un nou AA-ARNt. Acest proces este mediat de EF-G, protein care aduce cuplat molecula de GTP necesar translocrii.

Prin acelai mecanism se adaug, pas cu pas cte un nou aminoacid, conform codonilor respectivi, la lanul polipeptidic n cretere.

14 S urmrim un film serial cu elongarea

15

16 Terminalizarea. Are loc n momentul cnd citirea ARNm ntlnete pe acesta unul din cei 3 codoni stop, UAA, UAG, UGA. Acetia nu fixeaz nici un ARNt ci unul din cei 2 factori specifici, RF 1 sau RF2. Acetia, induc hidroliza legturii lanului peptidic cu ultimul ARNt, cu regenerarea COOH terminal. Sinteza a luat sfrit.

17 COSTURI ENERGETICE ALE SINTEZEI Formarea fiecrui complex AA-ARNt necesit 2 grupri fosfat (ATP AMP). 1 molecul GTP suplimentar este consumat la fiecare activare incorect a unui AA. Primul pas al elongrii consum 1 GTP. Translocarea consum 1 GTP. Echivalentul energetic este 4x30,5 kJ/mol = 122 kJ/mol de legturi fosfodiesterice consumai per legtur peptidic n timp ce energia liber rezultat din hidroliza legturii peptidice este de numai -21 kJ/mol. Energia liber net n timpul sintezei unei legturi peptidice este de -101kJ/mol. POLIRIBOSOMII Reprezint complexe mari de 10-100 ribozomi care se formeaz mai ales n celulele cu capacitate crescut de sintez a proteinelor. Aceste complexe care pot transla simultan regiuni dintr-o singur molecul de ARNm reprezint un poliribozom sau polizom. Astfel, citirea ARNm este mult mai eficient fcnd posibil sinteza simultan a unor copii multiple din polipeptidul specificat. DE CE NE INTERESEAZ SINTEZA PROTEINELOR ? Sinteza proteinelor este un proces fundamental al fiziologiei celulare i inta principal pentru unele antibiotice sau toxine. Datorit diferenelor dintre mecanismele sintezei proteice la procariote i eucariote, antibioticele toxice pentru unele bacterii sunt relativ inofensive pentru eucariote. Evoluia natural a permis exploatarea unor diferene minore pentru a afecta selectiv sistemele bacteriene. Astfel, unele arme biologice sintetizate de unele microorganisme sunt toxice pentru altele. Exemple: Puromicina. Sintetizat de fungii Streptomyces alboniger este unul din cele mai bine studiate antibiotice. Structura sa este asemntoare cu captul 3 al unui AA-ARNt, ceea ce i permite cuplarea pe locul A i participarea la formarea legturii peptidice cu formarea unui peptidil-puromicin. Deoarece puromicina seamn numai cu terminaia 3 a ARNt, ea nu se angajeaz n translocare i se disociaz de ribozom scurt timp dup cuplarea cu captul caroxi-terminal al peptidului. Acest eveniment oprete sinteza proteic. Tetraciclinele inhib sinteza prin blocarea locului A, prevenind cuplarea AA-ARNt Cloramfenicolul inhib sinteza proteic prin blocarea peptidil transferazei, cea care mediaz formarea legturii peptidice. Nu afecteaz sinteza citoplasmic la eucariote. Cicloheximida blocheaz peptidil-transferaza la ribozomii eucariotici dar nu i la cei bacterieni. Streptomicina, un trizaharid, determin erori de citire a codului la concentraii sczute; la concentraii crescute inhib iniierea. Unii inhibitori sunt toxici pentru organismul uman i pentru eucariote n general. Toxina difteric catalizeaz ADP-ribozilarea unei diftamide (histidin modificat) de la nivelul factorului de elongare eEF2 pe care l inactiveaz. Ricinul, o protein extrem de toxic, inactiveaz subunitatea S60 a ribozomilor eucariotici prin depurinarea unei adenozine specifice din ARNr de 23S.

18

RETICULUL ENDOPLASMATIC (RE) RE este un organit celular membranar reprezentat de un sac ale crui membrane se continu, din loc n loc cu membrana nuclear extern. RE este abundent n celulele cu procese intense de sintez i secreie. RE se prezint n celul sub dou forme: RER, cu ribosomi ataai la suprafa i REN, fr ribosomi. Cele dou tipuri de RE difer i ca funcii i structur chimic. RER RER este format din saci (cisterne) i tuburi care au un lumen comun, avnd la suprafa ataai ribosomi.

n microscopia fotonic, RER se poate observa ca o formaiune bazofil perinuclear. n celul poate ocupa diverse poziii: n celulele pancreasului exocrin sau n celulele parotidei, RER ocup o poziie bazal. n hepatocite RER este dispus concentric n jurul nucleului formnd corpii Berg. n neuroni este bine dezvoltat la nivelul corpului neuronal formnd corpii Nissl. Membranele RER se continu cu membrana nuclear extern iar lumenul RER se continu cu spaiul perinuclear (vezi pozele de la nucleu). REN Este reprezentat de o reea de canalicule (canale mai mici) care comunic cu sacii care formeaz RER. Nu prezint ribozomi la suprafa. Se poate gsi n toate tipurile celulare, dar este mai bine dezvoltat n: - celule care sintetizeaz hormoni steroizi: suprarenal, celule interstiiale din testicul i ovar; - celule care sintetizeaz mari cantiti de glicogen: hepatocite, miocite; - celule care sintetizeaz pigmeni: melanocite. Structura chimic a RE - 60% proteine - 40% lipide fosfolipide i colesterol Enzimele cele mai frecvent ntlnite la RE sunt: NADH citocromul b5, ATPaza, i enzima marker glucozo-6-fosfataz. Originea RE nu este clar: este posibil s provin prin nmugurirea membranei nucleare externe.

19 Funciile RE Putem descrie trei tipuri de funcii: Funcii specifice RER - Sinteza i sortarea proteinelor prin prezena ribozomilor ataai. Proteinele sintetizate pot fi proteine de export sau proteine de structur; Ilustrm aici modul de sintez a proteinelor la nivelul RER

20 Sortarea intracelular a proteinelor

Sinteza polipeptidelor ncepe n citoplasm. n momentul n care polipeptidul are circa 30 de aminoacizi, sinteza poate urma dou ci:

IMPORT CO-TRANSLAIONAL Dac este destinat oricrui dintre compartimentele sistemului endomembranar, polipeptidul devine asociat cu membranele RER i este transferat prin aceste membrane n lumen (cisternele RER) n timp ce sinteza continu. Ulterior, polipeptidul complet rmne n RER sau este transportat prin vezicule la complexul Golgi sau ctre alte destinaii. Proteinele membranare integrale sunt inserate n membranele RER pe msur ce sunt sintetizate i nu sunt eliberate n lumen.

IMPORT POST-TRANSLAIONAL Dac polipeptidele sunt destinate citoplasmei sau importului nuclear, mitocondriilor, cloroplastelor sau peroxizomilor, sinteza lor continu n citoplasm. Atunci cnd polipeptidul este complet, este eliberat din ribozom i fie rmne n citoplasm, fie este transportat n organitele int prin transport posttranslaional. Mecanismele de transport sunt specifice pentru fiecare organit.

21 glicozilarea lanului polipeptidic, prin ataarea de grupri glucidice n timpul etapei de elongare; astfel proteinele sintetizate n RER difer de cele sintetizate direct n citoplasm pe ribosomi liberi;

Mecanismul de glicozilare a proteinelor n RER

modificri ale lanurilor laterale de aminoacizi prin formarea de puni disulfidice;

Funcii specifice REN - sinteza lipidelor, mai ales n celulele gonadelor, celulele mucoasei intestinale; caracteristic este sinteza trigliceridelor care se pot evidenia sub form de picturi de grsime; - funcie de detoxifiere, prin enzime care particip la reacii de oxidare, hidroliz, reducere sau conjugare. Produii toxici pentru celul devin solubili i care se pot elimina prin rinichi; - eliberarea glucozei din glicogen n special la nivelul hepatocitelor: enzima implicat este chiar enzima marker glucozo-6-fosfataza. Funcii comune RER i REN - RE este un sistem circulator intracitoplasmatic care induce o compartimentare funcional a citoplasmei; - RE sintetizeaz fosfolipide: procesul are loc n membranele RE iar precursorii sunt preluai din citoplasm; - RE joac rol de suport mecanic pentru citoplasm; - RE este o fabric de membrane pentru care sintetizeaz lipide i proteine. Aceste elemente determin creterea i nmugurirea membranelor RE care vor forma vezicule care conin parte din coninutul lumenului RE. Aceste vezicule sunt exportate prin exocitoz sau fuzioneaz cu membranele altor organite.

22 COMPLEXUL GOLGI (CG) CG este un organit celular membranar format dintr-un grup heterogen de compartimente delimitate de membrane un grup de cisterne.

Structura n microscopia fotonic

n microscopia fotonic, CG este vizibil doar datorit unor coloraii speciale, cum ar fi impregnaia argentic. Este un organit polimorf, cu variate aspecte morfologice: vacuole, trabecule anastomozate etc. Poziia CG n celul variaz n funcie de tipul i funcia celulei. n celulele nervoase (neuroni) CG este dispus perinuclear. n celulele glandelor cu secreie exocrin CG este situat ntre nucleu i polul apical, aproape de zona de sintez a produilor de secreie. n celulele endocrine este situat ntre nucleu i polul bazal. Este o structur n permanent transformare (dinamic) i micare, situndu-se n zonele din celul unde activitatea metabolic este mai accentuat. Structura n microscopia electronic (ultrastructura) Prezint dou componente delimitate de membrane: - un grup de saci aplatizai (cisterne) care prezint dilataii la extremiti. Mai multe cisterne formeaz un dichtiozom. Fiecare dichtiozom are dou fee: fa de formare, denumit cis, care este convex i orientat spre nucleu; fa de maturare, denumit trans, orientat spre plasmalem; - microvezicule care vin dinspre RER ctre faa cis cu care pot fuziona; - macrovezicule care se desprind de pe faa trans.

23

Funciile CG Funcii n secreia celular - formarea de granule de secreie: compuii sintetizai n RE sunt nglobai n microvezicule i trimii la dichtiozomi. Aici, microveziculele fuzioneaz cu acetia iar coninutul se vars n lumenul sacilor CG. Enzimele din CG acioneaz asupra acestor produi n variate moduri; - glicozilarea terminal a proteinelor: produii de secreie provenii din RE sunt glicozilai terminal n prezena glicozil-transferazei i -manozidazei; - glicozilarea gangliozidelor i cerebrozidelor are loc n celulele din creier i rinichi i este asistat de glicoziltransferaz; - sulfatarea produilor provenii din RE, n prezena sulfotransferazelor: CG are un rol important n secreia mucopolizaharidelor; - concentrarea produilor de secreie: are loc n sacii CG. Produii de secreie interacioneaz cu unele complexe protein-polizaharidice cu sarcin electric opus i i reduc presiunea osmotic, avnd ca rezultat eliminarea apei i concentrarea; - maturarea produilor de secreie: de exemplu, proinsulina este transformat n insulin - biogeneza lizozomilor: enzimele lizozomale prezint un marker, manoz-6-fosfat, pentru care exist receptori la nivelul zonelor dilatate din coarnele CG. Aici enzimele sunt mpachetate n vezicule care se desprind ca lizozomi primari. - traficul de membrane i reciclarea membranelor: traficul de membrane presupune transferul de vezicule de la RE la CG urmat de formarea de macrovezicule pe faa de maturare cu exocitoza acestora. Circuitul endocitoz-sintez-exocitoz face ca suprafaa total a plasmalemei s rmn constant.

24

Metodologii de reciclare a membranelor