Sunteți pe pagina 1din 450

Microbiologie Medical vol.

1 (2010) curs

o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o

Microbiologie Medical vol. 1 (2010) - curs 1. Date istorice privind microbiologia (MI Popa) - 3 2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 17 3. Fiziologia bacterian (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 31 4. Aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 47 5. Genetica bacterian (Gabriela Loredana Popa) - 63 6. Antibiotice i Chimioterapice (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 76 7. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice 100 8. Relaiile microorganism - gazd (Mara Mdlina Oanea, Gabriela Loredana Popa) - 112 9. Patogenitate i Virulen (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 124 Noiuni de imunologie - 138 10. Organele cu rol n imunitate (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Roxana Micu) - 142 11. Celulele imunitii (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 151 12. Complexul major de histocompatibilitate (MHC); Sistemul HLA (MI Popa) - 165 13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi (A Muntean, MI Popa) - 172 14. Imunoglobulinele (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 185 15. Sistemul complement (MI Popa, Roxana Micu) - 196 16. Antigenele (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 207 17. Rspunsul imun umoral i celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) -221 18. Reaciile de hipersensibilitate (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 233 19. Reacii antigen - anticorp utilizate n microbiologie (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) -254 20. Reacii de precipitare i reacii de aglutinare (Gabriela Loredana, MI Popa) - 260 21. Reacii care utilizeaz sistemul complement (MI Popa) - 268 22. Reacia de seroneutralizare (MI Popa) - 271 23. Reacii Ag-Ac cu reactivi marcai (MI Popa) - 273 24. Inflamaia i procesul infecios (MI Popa, Andreea Bara, Milena Tocu) - 274 25. Tolerana imun (A Muntean) - 291 26. Diagnosticul n bolile infecioase prima parte (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 302 27. Diagnosticul n bolile infecioase partea a 2-a (MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel, Gabriela Loredana Popa) - 305 28. Prezentare general a principalelor microorganisme studiate; necesitatea studierii microbiologiei (MI Popa) - 316 29. Genul Staphylococcus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Anca Streinu-Cercel, Oana Streinu-Cercel) 318 30. Genul Streptococcus. Streptococcus pyogenes (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa, Maria Ghi) - 322 31. Streptococcus pneumoniae (Gabriela Loredana Popa, Marina Pan, MI Popa) - 342 32. Genul Neisseria. Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) 345 33. Familia Enterobacteriaceae. Caractere generale. (Gabriela Loredana Popa) - 354 34. Genul Escherichia. Escherichia coli (Gabriela Loredana Popa, Codrua Usein, MI Popa) - 357 35. Genul Klebsiella. Klebsiella pneumoniae. (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, A Muntean) - 360 36. Genul Proteus (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 364 39. Genul Salmonella (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 366 40. Genul Shigella (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 369 41. Genul Yersinia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 371 42. Genul Acinetobacter (Alina Negu) - 373 43. Genul Pseudomonas. Pseudomonas aeruginosa (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 373 44. Genul Vibrio (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 375 45. Genul Campylobacter. Genul Helicobacter. Helicobacter pylori (Gabriela Loredana Popa, Mdlina Nodea) - 378

o 46. Bacilii Gram-pozitivi nesporulai. Genul Corynebacterium (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Cristiana Cerasella Dragomirescu) - 383 o 47. Ali bacili Gram-pozitivi nesporulai de importan medical (Gabriela Loredana Popa, Alina Borcan, MI Popa) - 385 o 49. Genul Clostridium. Clostridium tetani (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 386 o 50. Clostridium botulinum (Gabriela Loredana Popa) - 392 o 51. Clostridiile gangrenei gazoase (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 396 o 52. Genul Mycobacterium. Mycobacterium tuberculosis (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Henriette Stavri, D Stavri) - 410 o 53. Germeni spiralai. Genul Treponema. Treponema pallidum (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 422 o 54. Genul Borrelia (Gabriela Loredana Popa, MI Popa) - 436 o 55. Genul Leptospira (MI Popa, Gabriela Loredana Popa) - 442

1. Date istorice privind microbiologia (MI Popa)


Introducere Exist organisme i microorganisme vii care au dimensiuni att de mici nct nu pot fi observate dect la microscop (optic sau electronic). ntre aceste microorganisme putem discuta despre alge, fungi, bacterii, virusuri i parazii. Relativ de curnd au intrat n discuie i alte structuri numite prioni. Diferitele microorganisme sunt studiate n cadrul disciplinei de microbiologie. Ca un domeniu nrudit cu microbiologia poate fi considerat i imunologia. Se consider c microorganismele sunt dintre cele mai vechi, numeroase i diversificate forme de via. Pot fi identificate n mediul nconjurtor, au rol n descompunerea materiei organice i menin fertilitatea solulului. Majoritatea microorganismelor sunt utile global sau fcnd parte din flora normal a diferitelor gazde; o mai mic parte sunt implicate, n diferite grade, n patologie. n acest caz, bolile infecioase pot s afecteze o persoan, un grup de persoane sau o ntreag comunitate. Pe msur ce bolile infecioase au fost identificate a aprut i disciplina de epidemiologie, nscut din necesitatea studiului izbucnirilor epidemice. Datorit faptului c iniial nu era cunoscut etiologia epidemiilor, acestea au fost considerate drept fenomene ale naturii, invazii asupra poporului (de la cuvintele grecesti epi -pe, peste, demos - popor). Exist o serie de documente istorice care atest existena epidemiologiei ca tiin privind patologia n mas, precum tratatele lui Hipocrate (460-377 nainte de Iisus Christos), cele 7 cri Despre epidemii i Despre aeri, ap i locuri. Microbiologia a avansat continuu, de la nivelul unei tiine relativ simple la un nivel care a determinat progrese nsemnate n diagnosticul, prevenirea i tratamentul bolilor. n bun parte datorit aplicaiilor microbiologiei, sperana de via a crescut semnificativ. La nceputul secolului, se nregistrau frecvent decese datorit unor cauze infecioase (difterie, oreion, pest, poliomielit, rubeol, rujeol, tifos exantematic, tuberculoz, sifilis, varicel, variol, etc). n acest moment variola este eradicat. Pentru poliomielit a fost stabilit inta eradicrii, iniial pentru anul 2000, ulterior pentru 2012. Izbucnirea epidemic din 2010 a mpins aceast int peste ali ani (unica boal infecioas eradicat rmne variola). Pentru alte maladii sunt propuse alte inte de prevenire i control iar evoluia grav, letal, survine numai n anumite situaii (forme clinice avansate, atipice, neglijate). Datorit cunotinelor n domeniul microbiologiei s-au mbuntit condiiile sanitare, s-au descoperit i aplicat noi metode de conservare a hranei etc. Dezvoltarea tehnologiei ADN (n special dup anul 1973), bazat pe cunotinele acumulate pe parcursul ultimelor trei-patru decade de studiu i practic privind genetica microbian, are o nsemntate deosebit. Exist de un numr de ani posibilitatea inserrii de material genetic provenit de la oricare organism viu n bacterii selecionate i adaptate astfel nct s poat realiza sarcini speciale, normale la celula donatoare, ajungndu-se pn la posibilitatea ca tulpini de Escherichia coli modificate genetic s 3

sintetizeze structuri de tipul anticorpilor. Studiul bacteriologic a trecut de la un nivel morfologic, celular la unul biochimic, molecular. Microbiologia ca tiin este strict necesar pentru sntate, pentru meninerea sntii i prevenirea mbolnvirilor. Cunoaterea modului de transmitere a diferitelor microorganisme reduce numrul cazurilor de toxoplasmoz, tuberculoz sau grip. Cunoaterea noiunilor privind sterilizarea-antisepsia-dezinfecia poate permite (n cazul aplicrii corecte n practic a acestor noiuni) evitarea infeciilor de spital sau a altor infecii produse n uniti sanitare cu sau fr paturi. Cunoaterea imunologiei i imunopatologiei permite nelegerea legturilor i interrelaiilor microorganism-gazd, precum i importana procedeelor de imunizare i supravegherea aplicrii acestora. Msurile generale aplicate pentru evitarea apariiei bolilor infecioase sau a transmiterii ulterioare trebuie bazate pe un nivel avansat de cunotine microbiologice. Studiul microbiologiei nu este dificil n cazul n care se nelege faptul c microbiologia este o tiin foarte logic (cele mai multe principii pot fi nvate prin simpla nelegere a acestora). Pe de alt parte, pe msur ce reueti s i descifrezi o parte dintre taine poi realiza c este una dintre cele mai fascinante tiine. Microorganismele au fost descoperite relativ trziu, n 1680, cu toate c primul instrument de mrire asemntor cu dispozitivele actuale a fost realizat n 1590 de ctre Zacharias Janssen. n 1665 Robert Hooke a observat pentru prima oar celulele, el a studiat o seciune dintr-un dop de plut i a descoperit c structura plutei era format din nite cutii micue. Antony van Leeuwenhoek (1632-1723), dorind s examineze estura hainelor fine (dei era la baz un vnztor de mruniuri), se pare c a fost prima persoan care a vzut i a descris diferite microorganisme. Microscopul realizat de van Leeuwenhoek, instrument pe care l-a construit singur, a constat dintr-o lentil biconvex ntr-un cadru metalic, cu o mrire de pn la 270 de ori. Cu acest microscop a examinat iniial diferite esturi, ns manifestnd o curiozitate deosebit a dorit s studieze ulterior apa din bli, tartrul dentar, materiile fecale provenite de la un pacient cu dizenterie, etc. A fost mirat s observe n toate aceste substane, mici organisme sferice, altele n form de bastona, spirale, unele aflate n micare rapid, pe care le-a numit animalicule. Desenele pe care le-a fcut probeaz c a observat cu adevrat bacterii, protozoare i alte microorganisme. Pornind de la condiia sa iniial, pe parcursul a circa 4 decade, Antony van Leeuwenhoek a redactat 125 de scrisori traduse n englez i predate Societii Regale din Londra. n plus, 27 dintre lucrrile sale au fost publicate n Memoriile Academiei Franceze de tiine. Se pare c unul dintre microscoapele originale ale lui van Leeuwenhoek se afl n muzeul Universitii din Utrecht. n urma descoperirilor lui Leeuwenhoek s-a pus ntrebarea de unde au aprut aceste organisme?. Pn la mijlocul secolului al nousprezecelea cea mai acceptat teorie a fost teoria generaiei spontane. nvaii epocii credeau c bacteriile apreau spontan din materie anorganic. n 1858 Rudolf Virchof a introdus termenul de biogenez. Aceast teorie susinea faptul c un organism viu poate s apar numai din alt organism viu. Controversele ntre cele dou teorii s-au pstrat pn n 1861 cnd Pasteur a infirmat teoria generaiei spontane.

Geniul lui Pasteur a demonstrat c aerul contaminat cu microorganisme poate cotamina o soluie steril, n schimb aerul steril nu poate s determine apariia unor bacterii. Cu mult nainte de a se fi cunoscut faptul c microorganismele sunt cauza bolilor infecioase au fost imaginate o serie de metode de prevenire a bolilor. Spre exemplu, Edward Jenner (1796) a artat c variola ar putea fi prevenit prin vaccinare. Semmelweis a avut contribuii importante privind prevenirea rspndirii bolilor n materniti i spitale utiliznd substane chimice dezinfectante. Regulile principale (unele valabile i astzi) precum i metodele tiinei microbiologice inclusiv principiile imunizrii, utilizarea microbiologiei n medicina preventiv, prevenirea i controlul bolilor infecioase se bazeaz pe activitatea a doi cercettori nzestrai att cu geniu ct i cu tenacitate, probabil avnd i ansa de a fi trit n perioada marilor descoperiri, Louis Pasteur (1822-1895) i Robert Koch (1843-1910). Pe bun dreptate, perioada 1857-1914 e considerat drept epoca de aur a microbiologiei. Louis Pasteur a fost un chimist francez devenit faimos prin descoperirea polarimetriei. Tot el a demonstrat c fermentaia i putrefacia sunt cauzate de organisme vii i a notat o asemnare ntre aceste procese i bolile infecioase lund n discuie degradarea vinurilor i berii ca i boli ale acestor produse. Pasteur a fost cel care a realizat un experiment prin care a artat c, att ct era cunoscut pe baza datelor disponibile, organismele vii au luat natere numai din organisme vii, i nu din materie moart. n 1861 a descoperit fenomenul de anaerobioz i fermentarea butiric (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Dup elaborarea procedeului numit pasteurizare, a expus n 1877 teoria pasteurian cu privire la germeni desfiinnd (aa cum am mai menionat) teoria generaiei spontanee. Utiliznd substane simple, de origine natural i gaze, vapori i arcuri electrice sub temperatur i presiune crescut, microbiologii i biochimitii pot sintetiza o serie de compui organici care au fost descoperii iniial doar n celulele vii. Dup studiul fermentrii vinului, Pasteur a investigat o boal transmisibil la viermii de mtase i ca rezultat a formulat teoria legat de implicarea germenilor n producerea unor boli. n ceea ce privete maladiile umane, a insistat ca bandajele s fie curate i instrumentele din spital s fie fierte. Louis Pasteur a demonstrat n anul 1857, la aproape o jumtate de secol dup lucrrile redactate despre vaccinare de ctre Edward Jenner, legtura dintre infecii i microorganismele susceptibile a fi cultivate i studiate. n diferite experimente ingenioase, Pasteur a protejat de antrax diferite ierbivore prin vaccinarea cu un preparat extras din Bacillus anthracis. Tratamentul profilactic al rabiei a fost dezvoltat prin injectarea de material uscat obinut din mduva spinrii de la animalele care au murit de rabie. Joseph Meister, un biat mucat de un cine turbat, a fost primul om a crui via a fost salvat prin aceast metod fiind protejat de injeciile fcute de Louis Pasteur. Tot Pasteur a descoperit bacteriile anaerobe i a studiat septicemia i gangrena. Ca atare, a devenit posibil punerea la punct a tehnicilor de distrugere i de control al diferiilor germeni (stafilococi, streptococi, pneumococi etc). n 1880, Louis Pasteur a demonstrat c putem fi protejai contra bolilor infecioase prin injectarea unor germeni atenuai. Primul medic care a observat transmiterea infeciilor n instituii sanitare a fost Ignaz Semmelweis. Femeile ce nteau acas sufereau mai puine infecii comparativ cu cele ce 5

nteau la spital. A impus splarea riguroas i dezinfectarea cu clor a minilor personalului nainte de a aplica intra n sala de natere sau de a consulta o femeie nsrcinat. Chirurgul englez Joseph Lister (1827-1912) a aplicat descoperirile lui Pasteur n chirurgie chiar nainte ca bacteriile care determin infeciiile chirurgicale (nosocomiale) s fi fost descoperite. Lucrrile lui Lister reprezint baza tehnicii chirurgicale aseptice din ziua de astzi. Ferdinand Cohn (1828-1898) a fost unul dintre cei mai renumii microbiologi germani. El a extins cercetrile lui Pasteur lucrnd cu bacterii, alge i fungi. Fiind foarte interesat de bacteriologie, a scris una dintre primele cri referitoare la bacterii, realiznd una dintre primele clasificri bacteriene n genuri i specii. Cohn a reprezentat un mare sprijin pentru Robert Koch, ncurajndu-l s i publice lucrrile cu privire la antrax. Cu dou secole nainte de apariia bacteriologiei, Robert Boyle a sugerat c anumite boli sunt provocate de organisme vii. Anatomistul Henle a sugerat c bolile infecioase ar putea fi determinate direct de ctre microorganisme. Robert Koch i-a fost student lui Henle; a asigurat toate datele necesare pentru a demonstra teoria microbian a bolii. Dezvoltarea metodelor pentru izolarea bacteriilor n cultura pur a fost printre cele mai importante descoperiri ale tehnicilor microbiologice i a fost n mare parte opera lui Robert Koch. O cultur pur de microorganisme se dezvolt atunci cnd pornim de la un singur tip de microorganism care se dezvolt n eprubetele test sau n plcile cu mediu de cultur (n colonii izolate). n condiii naturale, mai multe microorganisme din specii diferite pot coexista n acelai mediu. Spre exemplu, n materiile fecale ale unui pacient cu febr tifoid, Salmonella typhi se afl amestecat cu un numr extrem de mare de celule din alte specii bacteriene (aerobe i anaerobe) sau chiar i alte forme de microorganisme. n cadrul diagnosticului medical microbiologic este important izolarea n cultur pur a germenilor patogeni. n exemplul menionat, pentru diagnostic este necesar folosirea metodelor care permit izolarea S. typhi n cultur pur, singura care permite identificarea i stabilirea sensibilitii / rezistenei la antibiotice i chimioterapice. n 1876 Koch a izolat n cultur pur bacteria care determin antraxul. Pornind de la splina recoltat de la vite infectate i procesat pentru a permite obinerea unui produs patologic; a fost capabil s infecteze oareci de laborator utiliznd aceast cultur. Implicat n cercetarea etiologiei exacte a bolilor infecioase, Robert Koch a rezumat ceea ce a considerat c reprezint datele eseniale pentru a demonstra c un anume germen este cauza unei infecii. Aceste date sunt cuprinse n patru postulate, denumite Postulatele lui Koch, respectiv: 1. Microorganismele care determin boala trebuie s poat fi identificate n toate cazurile de boal, n relaie patogenic direct cu simptomele i leziunile pe care le determin; 2. Microorganismul trebuie s poat fi izolat de la victimele bolii, n cultur pur, pentru studiul n laborator; 3. Cnd cultura este inoculat la un animal susceptibil, trebuie s reproduc boala (sau, cum s -a stabilit ulterior, s induc apariia anticorpilor specifici la noua gazd); 4. Microorganismul trebuie s poat fi izolat din nou n cultura pur din infecia produs experimental. 6

Utiliznd aceste reguli precum i diferitele tehnici microbiologice, Koch a descoperit bacilul tuberculos (bacilul Koch), bacilul holeric, etc., precum i modul de transmitere pentru numeroase alte boli infecioase (Babessia, Trypanosoma, Plasmodium etc.). Descoperirile menionate au reprezentat debutul bacteriologiei, micologiei, virusologiei, parazitologiei i imunologiei ca tiine. n doar aproximativ 15 ani (dup 1880) au fost descoperite i izolate n cultur pur microorganisme implicate n multe dintre bolile infecioase importante. Aceste descoperiri au fcut posibil stabilirea ca entiti bine definite a medicinei preventive i respectiv a terapiei specifice (etiologice). Ilia Mecinikov a evideniat modul natural de aprare a organismului fa de agenii infecioi prin anumite celule care au proprieti fagocitare i a scris n 1901 primul tratat de imunologie. n coala german apar o serie de nume celebre, cum ar fi Behring, care a studiat toxinele bacteriene, imunitatea umoral i seroterapia precum i Paul Ehrlich (1854-1915). Cercetrile lui Ehrlich stau la baza chimioterapiei antimicrobiene. Prin utilizarea derivailor arsenicali n tratamentul sifilisului ipotezele sale au fost confirmate. Mai mult dect att, n anul 1878 Ehrlich realizeaz c exist diferene de afinitate tinctorial fa de coloranii pe baz de anilin. Aceast descoperire l ajut s studieze efectul diferitelor substane chimice, dar st i la baza apariiei coloraiilor n microbiologie. Ehrlich arat c mycobacteriile au proprietatea de acido-rezisten iar doi ani mai trziu (1884), cercettorul danez Christian Gram pune bazele coloraiei care i poart numele i care are o remarcabil utilitate dup aproape 125 ani de la aceast descoperire. Dei asistena medical ntr-o anumit form a existat nc de la debutul vieii umane pe pmnt, nceputurile nursing-ului profesional au fost realizate de ctre Florence Nightingale (1820-1910), care a nceput munca sa cu mai bine de 140 de ani n urm, n cursul rzboiului din Crimeea (1854-1856). Descoperirile ulterioare, privind relaia dintre microorganisme i boal, au necesitat dezvoltarea unor proceduri de nursing mai complexe i mai rafinate dect cele utilizate de ngerii din Crimeea. Descoperirea msurilor profilactice precum administrarea de vaccin variolic (1796), de toxoizi i antitoxine (n difterie i tetanos), a serurilor imune (von Behring, Frnkel i Kitasato, 1890), a vaccinurilor polio i rujeolos (Enders, Weller i Robins 1949; Salk 1954; Sabin i alii, 1954 -1967), precum i utilizarea de gama globuline pentru prevenirea pojarului, rabiei, tusei convulsive etc., au fcut necesar dezvoltarea de noi concepte i educaie n prepararea i administrarea acestor substane. Identificarea cilor de transmitere a infeciilor a condus la dezvoltarea de metode eficace de prevenire a rspndirii bolilor. n 1895, sir Ronald Ross (1857-1932), medic militar n India, a demonstrat transmiterea agentului etiologic al malariei prin intermediul narilor. Parazitul a fost vizualizat n eritrocitele umane n 1881 de ctre Laveran, chirurg al armatei franceze n Algeria. n 1900 a fost demonstrat transmiterea virusului febrei galbene de ctre o specie particular de nari (Aedes aegypti), n Cuba. Descoperirea unor teste de diagnostic n domeniul microbiologiei a necesitat o pregtire microbiologic mai avansat a medicilor, asistentelor i a altor profesioniti ai sntii n 7

metode pentru colectarea produselor i raportarea specific de laborator, astfel nct terapia s demareze ct mai precoce. Descoperirea de substane chimice specifice (de exemplu sulfonamidele, Domagk 1935) i substane antibiotice (de exemplu penicilina, streptomicina, tetraciclina i cloramfenicolul) a contribuit la mbuntirea modului de abordare medical a problematicii bolilor infecioase. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit n anul 1944 (streptomicina - Scharty, Bugie, Waksman). Procedurile chirurgicale moderne ar fi imposibile fr dezinfecie i sterilizare. Industria laptelui, a conservelor, a hranei ambalate i congelate sunt dependente de microbiologie. Sanitaia sistemelor de ap i tratarea apelor poluate sunt posibile numai datorit cunotinelor acumulate prin microbiologie n cursul ultimului secol. n multe moduri profesiunea medical i fiecare latur a ei este dependent de cunoaterea, nelegerea i utilizarea informaiilor din microbiologie. La coala romn de microbiologie nfiinat de profesorii Victor Babe (1854-1926) i Ion Cantacuzino (1863-1934) s-au pregtit multe generaii de microbiologi, viitori cercettori i profesori, care au contribuit la dezvoltarea microbiologiei din ara noastr. Victor Babe s-a nscut la Viena n anul 1854, a studiat la Facultatea de medicin din Budapesta, apoi n Viena unde a fost numit preparator la catedra de Anatomie condus de profesorul Lauder. Ulterior este recomandat pentru a deveni asistent la catedra de Anatomie patologic la Facultatea de medicin din Budapesta. A fost n acelai timp anatomopatolog i microbiolog. A fost att elevul lui Robert Koch, ct i al lui Louis Pasteur. A fost numit docent i profesor la Facultatea de medicin din Budapesta la o vrst foarte tnr (27 ani). Cu patru ani mai trziu, n anul 1885, public mpreun cu A.V. Cornil primul tratat de bacteriologie medical din lume (n 1891 apare a treia ediie a tratatului). A doua ediie a acestui tratat se afl n Biblioteca Institutului Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino. Victor Babe a demonstrat importana introducerii tehnicilor microbiologice n anatomopatologie. Ar putea fi menionat i faptul c pe parcursul celor 10 ani de activitate la Facultatea din Budapesta, a dat indicaiile necesare pentru construirea unui nou Institut de anatomie patologic iar n cadrul acestuia a unei secii dedicate bacteriologiei. A evideniat proprietile neutralizante ale serurilor imune, a descoperit corpusculii metacromatici ai bacilului difteric (Babe-Ernst), o nou metod de preparare a serului antidifteric etc. n 1886 a fost numit profesor de anatomie patologic i bacteriologie la Facultatea de Medicin din Bucureti. Este fondatorul Institutului de Bacteriologie pe baza cruia s-a dezvoltat actualul Institut Victor Babe. n 1889 a preparat vaccin antirabic, ara noastr fiind a treia ar din lume care a reuit s prepare acest vaccin. A condus institutul creat pn aproape de sfritul zilelor sale, care a fost la puin timp dup pensionarea sa. Din pcate, n ciuda monumentalitii sale, nu a fost posibil s fie gsit un spaiu n care s-i poat continua cercetrile i dup pensionare, lucru din pcate mult prea des ntlnit n istoria medicinei noastre. Cu privire la poziia acestui mare cercettor precum i la situaii care par a fi foarte asemntoare peste ani, n ciuda trecerii timpului i a speranei c evoluia societii noastre este ntr-o direcie pozitiv, vom prezenta n continuare un fragment din discursul profesorului Victor Babe, inut la Universitatea din Cluj n anul 1919. Astzi lumea civilizat ateapt deci 8

lucruri mari din partea noastr; nu mbogirea oligarhiei politice n afaceri, certuri politice, persecuiuni i denunuri infame pentru interese egoiste i nguste, ci pstrarea i sporirea celor mai valoroase achiziiuni ale omenirii: sntatea, prosperitatea, fora, justiia, instruciunea i tiina, spre a asigura pacea i progresul i prin ele fora i fericirea poporului romn, servind de exemplu popoarelor din Orient. Dar politica noastr de pn acum n-a fcut dect s ne duc n cea mai mare desorganizare, desbinare i dezastru economic, permind prin egoism i nepsare ca rnimea s fie azi degenerat, analfabet, lipsit i ndatorat peste msur; politicienii notri au reuit s oprime toate valorile, nlocuindu-le prin clientela lor politic; au adus funcionarismul, birocratismul, nepotismul la culme; politicienii notri n nepsarea lor pentru interesele rii au lsat armata la nceputul rzboiului aproape nepregtit n clipele cele mai periculoase prin care a trecut ara i din care nu ne-a scpat dect vitejia fr pereche a soldatului romn. Trebue s ne ntrebm dac nu acest politicianism este cauza tuturor relelor i dac nu este o datorie patriotic s ntrebuinm toate mijloacele necesare ca s-l nimicim i s-l nlocuim cu o alt putere care s ne garanteze regenerarea i progresul. n adevr trebue s fim profund ngrijai i s ne ntrebm nainte de toate cum vom putea s eim din acest dezastru i cum vom putea face fa creanei mari pe care am contractat-o fa de lumea civilizat. Publicul care, pn deunzi, a observat la guvernanii notri aceleai viiuri politice, aceeai nepsare pentru interesele reale ale rii, acelai nepotism, aceeai venalitate, acelai egoism care ne-a condus la degenerare ca i nainte rzboiului, ateapt cu nerbdare o schimbare radical a moravurilor politice care s ne pun n poziiunea de a ndeplini mreaa noastr misiune. Fa de aceste adevruri ar fi trebuit s ne ateptm ca Romnia nou s pun piciorul n prag i s rup odat pentru totdeauna cu vechiul politicianism. ns ce vedem spre profunda noastr descurajare; c aceeai principii dezastruoase, egoiste, aceeai fraze goale domin i politica de astzi i c mergem orbi nainte spre un dezastru sigur. n loc ca ntinderea i bogia acestei ri binecuvntate s ne asigure un loc de frunte i stare economic briliant, ne gsim astzi n deplin faliment, expui ruinei i foametei i mai mult dect oricnd sub dependena i exploatarea nemiloas a naiunilor mari. Ion Cantacuzino a avut o personalitate cu totul deosebit, imposibil de cuprins ntr-o trecere att de sumar prin istoricul microbiologiei. A studiat la Paris Filozofia i Literele, tiinele naturale i Medicina. Pregtirea n microbiologie a desvrit-o pe parcursul a 9 ani, n laboratorul lui Ilia Mecinikov, la Paris. A cunoscut mai multe limbi strine, inclusiv latina i greaca. A studiat la Paris i a revenit n ar pentru satisfacerea stagiului militar (geniti, Jilava). A continuat studiile n Frana (tiine naturale 1886, medicin 1887). Lucreaz n Institutul Pasteur ncepnd cu 1892, devine doctor n medicin n 1894 i este numit profesor suplinitor de Morfologie animal la Facultatea de tiine din Iai (1894). A fost numit profesor la Facultatea de Medicin din Bucureti n anul 1901 i a grupat n jurul su un mare numr de tineri medici, care au devenit la rndul lor ndrumtori i creatori de coal (Al. Sltineanu, C.

Ionescu-Mihieti, M. Ciuc, Al. Ciuc, D. Danielopolu, D. Combiescu, N. Gh. Lupu, I. Blteanu, I. Nicolau, Lidia i I. Mesrobeanu i muli alii). n perioada 1908-1910, profesorul Cantacuzino este numit Director General al Serviciului Sanitar, face Legea de organizare a acestui serviciu, nfiineaz sanatoriile Bisericani, Brnova, Nifon, Crbuneti, Filaret precum i primele laboratoare regionale de bacteriologie i igien (Craiova, Galai, Constana, Iai, Sulina). ncepe n 1912 prepararea vaccinului contra febrei tifoide i a holerei asiatice, ulterior ncepe prepararea serului antidifteric. Este numit n 1917 Director al Directoratului Sntii Publice civile i militare, calitate n care coordoneaz combaterea epidemiilor de holer, tifos exantematic, febr recurent. n 1920 ncepe prepararea serurilor antimeningococic i anti gangrenos (n Laboratorul de Medicin experimental) iar n data de 4 iunie semneaz n calitate de prim delegat, Tratatul de la Trianon. Un an mai trziu se nfiineaz Institutul de Seruri i Vaccinuri, n 1926 ncepe vaccinarea BCG n Romnia iar n 1928 nfiineaz Archives Roumaines de Pathologie Exprimentale et de Microbiologie. Din pcate, n momentul de fa Romanian Archives of Microbiology and Immunology (numele actual al revistei, care a ajuns la volumul cu numrul 69) nu apare listat ntre publicaiile recunoscute oficial n ara noastr, cu toate c ncepnd cu anul 2005 a existat un reviriment, comitetul editorial strduindu-se s refac prestigiul revistei, ca o datorie moral fa de naintai. n perioada 1931-1932 face parte din Guvernul prezidat de Nicolae Iorga, n calitate de ministru al sntii publice. Lucreaz la elaborarea unei noi legi sanitare. Cu numai nou zile nainte de a nceta din via prezideaz Congresul de Tuberculoz i propune nfiinarea Ligii contra Tuberculozei. Pe lng coala pe care a format-o, una dintre cele mai mari realizri ale Profesorului Cantacuzino a fost nfiinarea n anul 1921 a Institutului de Seruri i Vaccinuri, numit astzi INCDMI Cantacuzino (Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie), centru de cercetare tiinific fundamental i aplicativ, centru de nvmnt de specialitate, instituie care a preparat i prepar seruri, vaccinuri i alte produse biologice utile n diagnosticul bolilor transmisibile. Alexandru Sltineanu (1873-1939) a organizat nvmntul universitar de microbiologie la Iai (cercetri n domeniul febrei tifoide, tuberculozei, tifosului exantematic, etc.). Constantin Ionescu-Mihieti (1883-1962) a abordat teme importante n domeniul virusologiei, bacteriologiei, parazitologiei, imunologiei, hematologiei, anatomiei patologice i epidemiologiei. A avut contribuii deosebite n studierea mycobacteriilor i enterovirusurilor. A muncit intens pentru dezvoltarea Institutului Cantacuzino a crui director a fost ncepnd cu anul 1934. A continuat activitatea tinific i administrativ promovat de Ion Cantacuzino. Mihai Ciuc (1883-1969) a dezvoltat o bogat activitate tiinific n domeniul bacteriologiei i epidemiologiei, experimental, terapeutic i clinic. A studiat mpreun cu Jules Bordet fenomenul lizogeniei (1921); a avut contribuii deosebite n domeniul malariei fiind numit secretar al Comisiei de Malarie de pe lng Liga Naiunilor. A fost profesor de microbiologie nti la Iai i din 1934 n Bucureti fiind al treilea profesor de bacteriologie din Bucureti dup Victor Babe i Ion Cantacuzino. 10

Alexandru Ciuc (1880-1872) a absolvit facultatea de medicin veterinar din Bucureti. Activitatea lui s-a ndreptat mai ales spre organizarea produciei de seruri hiperimune pentru tratamentul tetanosului, difteriei etc. A fost al treilea director al Institutului Cantacuzino. Dumitru Combiescu (1887-1961) a cercetat capitole majore ale patologiei infecioase (febra tifoid, febra recurent, dizenteria, tetanosul, antraxul, gangrena gazoas etc). A avut contribuii deosebite n domeniul rickettsiozelor i leptospirozelor. n timpul primului rzboi mondial a organizat msuri de prevenire a tifosului exantematic. Matei Bal (1905-1989) a fost cea mai proeminent personalitate a secolului XX, n Romnia, n domeniul bolilor infecioase. A fcut un stagiu de microbiologie la Institutul Pasteur din Paris i ulterior a intrat ntre personalitile cu formaie cantacuzinist, lucrnd alturi de Ion Cantacuzino, Mihai Ciuc, I. Blteanu. Dei era un foarte bun clinician a devenit i ntemeietorul colii moderne de bacteriologie clinic. Tehnicile i metodele de diagnostic imaginate i-au adus numeroase brevete i inovaii care i poart numele att n ar ct i n strintate. coala astfel ntemeiat a avut o activitate cu rezultate excepionale pentru tiina romneasc, pentru microbiologie i pentru sntatea public. Dup 1989, Institutul Cantacuzino a reintrat n Reeaua Internaional a Institutelor Pasteur i a Institutelor Asociate ceea ce a permis obinerea unor rezultate, importante. INCDMI Cantacuzino trebuie s continue tradiia naintailor i s i menin poziia important n cadrul instituiilor care se ocup de sntatea public la nivel naional i internaional. Eforturile de la nivel central din perioada 1997-2000 i respectiv eforturile depuse n perioada 2005-2007 au reprezentat un sprijin important n acest sens. George Emil Palade (1912-2008) Absolvent al facultii de medicin din Bucureti, a desfurat o prodigioas activitate tinific, n Statele Unite. A fost unul dintre pionierii microscopiei electronice i a fracionrii celulelor (separarea organitelor celulare). A fost iniial cercettor i ulterior profesor de biologie celular al Institutului Rockefeller din New York iar din 1973 al universitii Yale din New Haven. Ultimul loc n care George Emil Palade a fost profesor a fost facultatea din San Diego, California. A pus bazele unor noi departamente pentru studiul celular. Cercetrile lui au cuprins descrierea rolului i structurii mai multor organite (mitocondria n detaliu cu structura membranei i a cristelor, a definit rolul reticulului endoplasmic, sistem tubular ce este prezent in orice celula animal sau vegetal). ntr-un articol publicat n 1955, Palade a prezentat o fotografie de microscopie electronic ce reprezenta reticulul endoplasmic rugos i a explicat legtura ntre cele 2 structuri i rolul lor n eliberarea produilor de secreie). Cea mai important a fost descoperirea rolului corpusculilor citoplasmatici, denumii iniial corpusculii lui Palade. A precizat compoziia lor esenial (acizi ribonucleici) rezultnd altfel denumirea de ribozomi. n 1974 realizrile sale sunt ncununate cu premiul Nobel pentru Medicin i Fiziologie.

11

Datorit eforturilor depuse, incidena i prevalena anumitor boli infecioase a sczut. Trebuie avut ns n vedere emergena i re-emergena diferitelor maladii. Microbiologul, medicul clinician i asistenta medical trebuie s aplice cunotinele de microbiologie n practica de zi cu zi. Dei anumite tehnici pot fi nvate din rutin, persoana cu adevrat profesionist nelege faptele tiinifice precum i principiile aflate la baza acestor tehnici. Profesionistul tie de asemenea n ce mod ar trebui adaptate aceste tehnici n cazul anumitor tipuri de pacieni (ex. pentru cei supui chirurgiei cardiace, pacienilor care au suferit arsuri pe suprafee ntinse), ce tehnici trebuie utilizate n slile de operaie, de ateptare i n instituiile unde sunt ngrijii copii mici sau foarte mici, cum pot fi modificate acestea n condiii de urgen (de exemplu n caz de rzboi sau alte calamiti produse de om sau calamiti naturale) i cum trebuie fcut informarea pacienilor, populaiei, de exemplu referitor la imunizri. Un membru antrenat al echipei medicale poate s diferenieze adevrul de interpretarea greit i / sau dezinformarea din aa-zisa literatur medical scris pentru publicul larg i poate recunoate erorile aprute n mass media, dac are noiunile necesare de microbiologie. Persoanele care lucreaz n domeniul sanitar dar i orice alt persoan realmente interesat, constat sau pot constata c n aproape orice activitate cotidian exist o aplicabilitate a cunotinelor microbiologice.

Povestiri Adevarate 1.1.1. Girolamo Fracastoro (1478-1553) S-a nscut ntr-o veche familie de medici. A fost coleg la Facultatea de Medicin cu Nicolaus Copernicus (astronom i medic). S-a ocupat att de medicin ct i de astronomie, matematic, poezie, geografie, muzic etc. Poate fi considerat un bun diagnostician; este primul medic care a fcut diferena ntre cium i tifosul exantematic (au existat 2 izbucniri epidemice de tifos, analizate de aceast minte luminat, n 1505 i n 1528). Se poate spune c a descris corect din punct de vedere epidemiologic, n lumina datelor cunoscute la acea vreme, ciuma, variola, febra tifoid i tifosul exantematic. A scris mai multe lucrri n domeniul medical, care cuprind informaii incredibil de corecte, dintre care unele au fost confirmate ulterior aproape n totalitate. Prima dintre aceste lucrri a fost scris n versuri i se pare c a fost publicat la Veneia [Syphilis sive morbus Gallicus (Sifilisul sau boala galic), 1530, trei volume; numele se datoreaz faptului c se presupune c sifilisul ar fi fost rspndit n Italia de trupe franceze asediatoare]. n primele dou volume, Fracastoro descrie cu bune amnunte sifilisul; a descris i luesul ca entitate n cadrul acestei patologii, a discutat modalitile de debut i chiar diferenele ntre cele trei stadii ale bolii. Apar menionate i informaii despre modaliti de diagnostic i tratament (vapori de mercur, mixturi din sulf, mercur i extracte vegetale etc). n aceast scriere sunt discutate chiar i metode de prevenie. n al treilea volum, Girolamo Fracastoro prezint date 12

privind cltoriile lui Columb n Indiile de Vest (se pare c boala era foarte rspndit printre btinai) dar i o poveste din mitologie, povestea pstorului Syphil (numele sifilisului are, se pare, o vechime foarte mare) care a fost pedepsit de zeul Apollo, tocmai prin aceast boal. Lucrarea De contagione, contagionis morbis et eorum curratione (Despre contagiune, boli contagioase i tratamentul lor), publicat tot la Veneia, la vrsta de 68 de ani, include toate cunotinele i teoriile lui Fracastoro referitor la bolile contagioase ale acelor vremuri. n mod uimitor, cu sute de ani nainte ca aceste aspecte s fie studiate i parial demonstrate tiinific de ctre Louis Pasteur, ntr-o vreme cnd bolile erau considerate drept pedeapsa zeilor, teoria miasmelor morbigene a lui Hipocrate este combtut iar Fracastoro emite ipoteza conform creia bolile contagioase sunt transmise prin intermediul unor fiine invizibile [Seminaria morborum (seminele bolilor)]. Dup mai mult de 130 de ani, Antony van Leeuwenhoeck utilizeaz microscopul pentru a studia cteva dintre microorganisme. n plus, Girolamo Fracastoro discut cile de intrare a seminelor bolii n organism: a. pe gur, b. prin respiraie, c. prin rni, d. direct prin piele. Mai mult dect att, clasific contagiul drept fiind de trei feluri: a. prin contact direct (ex. n tuberculoz, lepr, sifilis); b. prin contact indirect, prin fomites (haine, aternuturi, farfurii) i c. la distan (seminele morbigene fiind purtate la distan de ctre vnt, ploaie, apa rurilor etc., ca n cazul ciumei). Cu toate c a oferit incredibil de multe explicaii, cu toate c teoriile sale au fost n bun parte confirmate ulterior, la acea vreme nu au fost acceptate iar teoria miasmelor morbigene a fost pentru nc mult timp considerat ca fiind valabil. Cu toate acestea, se poate spune c Girolamo Fracastoro poate fi recunoscut n istoria medicinei ca printele patologiei infecioase. revenire sus

1.1.2. Robert Koch (1843-1910) Alturi de Louis Pasteur poate fi considerat printele bacteriologiei. n 1905 meritele sale au fost recunoscute, primind premiul Nobel, acordat pentru cercetrile n domeniul tuberculozei. S-a nscut n 1843 n Clausthal. A studiat medicina la universitatea din Gottingen i Hanovra iar n 1866 a absolvit facultatea i a fost numit medic de circumscripie. A practicat medicina n mai multe localiti germane. n 1868 s-a stabilit n Wolstein (astzi aceast localitate se afl n Polonia). n timpul ederii la Wolstein a studiat Bacillus anthracis ntr-un laborator improvizat n propria locuina. Aici a creat celebrele postulate. Bacillus anthracis a fost descoperit de Pollender, Reyer i Davaine dar Robert Koch a fost cel ce a demonstrat c aceast bacterie e cauza mbolnvirilor cu antrax crbune (nume dat datorit culorii nchise a leziunilor din aceast boal). Prin studiile amnunite a descoperit fenomenul de sporulare i a fost primul cercettor care a folosit tehnica fotografiei n microbiologie, el fotografiind cmpurile microscopice. n 1880 a fost angajat n ministerul sntii unde i-a continuat cercetrile avndu-l colaborator printre alii pe Lofler. n 1891 s-a nfiinat Institutul pentru Studierea i Combaterea Bolilor 13

Infecioase din Berlin, instituie care la 30 de ani de la descoperirea bacilului tuberculozei a primit numele marelui savant. Infecia cu Mycobacterium era o mare problem n secolul 19. Unul din 7 oameni suferea de aceast boal, multe dintre mbolnviri evolund nefast, spre deces. n 1881 Robert Koch a izolat bacilul cauzator i a reuit s l cultive pe medii artificiale. n 1901 la congresul britanic despre tuberculoz, savantul a druit organizatorilor 5 eprubete n care se aflau colonii provenite din cultivarea succesiva de 435 de ori a bacililor pe care i identificase cu 20 de ani n urm (n 1891 Heinrich Gunther, un muncitor de 32 de ani, a fost internat i dup cteva zile a murit, se pare, datorit unei tuberculoze miliare; la necropsie Robert Koch a prelevat material bioptic, a inoculat iniial pe animale de laborator bacteriile provenite din acest material, ulterior reuind s le cultive i n vitro; n 24 martie 1882, Robert Koch a fcut publice descoperirile sale privind izolarea i identificarea agentului patogen al tuberculozei). Cercetrile nu s-au oprit aici, Robert Koch continund s aprofundeze studiul mycobacteriilor dar abordnd i alte microorganisme. Dup succesul identificrii bacilului tuberculos a urmat o perioada mai puin fast, el ncercnd s foloseasc iniial Alt-Tuberkulin ulterior NeuTuberkulin (un filtrat de cultur bacterian) ca i tratament. Insuccesul i-a adus numeroase critici dar experimentul a avut i o parte bun, aceste ncercri reprezentnd momentul de pionierat pentru evidenierea hipersensibilitii de tip IV, tuberculinic, iar tuberculina va fi ulterior utilizat n diagnostic i studii epidemiologice. revenire sus

1.1.3. Institutul Ion Cantacuzino Institutul Cantacuzino a existat cu muli ani nainte de a fi primit prin legea din 1921 o confirmare pe trm administrativ. nc din anul 1904, doi ani dup chemarea profesorului Cantacuzino la Catedra de Medicin Experimental de la Facultatea de Medicin, laboratorul su, destinat iniial exclusiv nvmntului i cercetrilor pur experimentale, instalat n cteva ncperi din institutul de Patologie i Bacteriologie condus de profesorul Victor Babe, a fost nsrcinat de ctre Direcia Sanitar s studieze metodele de preparare i valoarea practic a dou seruri curative de mare interes pentru medicin, serul antistreptococic i serul antidizenteric. Primele ncercri de aplicare la bolnavi s-au artat foarte ncurajatoare; ca atare s-a trecut de la faza experimental la prepararea pe o scar mai ntins i la utilizarea lor n practic. n perioada 1910-1913 a nceput experimentarea i prepararea vaccinurilor contra febrei tifoide i holerei asiatice. Rezultatele obinute convingeau i pe cei mai sceptici. Consiliul sanitar a adoptat ntrebuinarea acestor metode n combaterea epidemiilor de febra tifoida i holer, iar Serviciul Sanitar al armatei a decis aplicarea consecvent a vaccinrii antitifoidice la recrui realiznd prin aceasta dispariia aproape complet a cazurilor de febra tifoid din armat.

14

Toate aceste fapte au fost realizate cu mijloace improvizate, ntr-un modest laborator de nvmnt, n care ncperea cea mai impuntoare - sala de lucrri practice pentru studeni nu putea primi deodat mai mult de 25-30 de persoane. Conducerea profesorului crea o atmosfer de munca entuziast i dezinteresat, o motivaie admirabil printre colaboratori. Personalul tehnic se ntrea, numrul asistenilor benevoli de asemenea. Prin activitatea practic, laboratorul putea pune la ndemna studenilor mijloace de lucru care nu puteau fi gsite ntr-un simplu laborator universitar. Institutul Cantacuzino, exista de fapt. Rzboiul din 1916-1918 a demonstrat imperios promovarea unei legi dedicate nfiinrii, aa cum am menionat. De altfel, istoria nu se schimb; n ultimii 20 de ani aproape fiecare pas realizat n dezvoltarea sistemului de sntate public din Romnia a beneficiat de cte o problem de sntate care a demonstrat autoritilor (cel puin pentru o perioad de timp) c este necesar o intervenie concret. Mijloacele improvizate nu mai puteau fi suficiente pentru o ara ntregita, cu o populaie de trei ori mai mare i care suferise pe timpul i din cauza ocupaiei strine. n reorganizarea sanitar a rii, s-a impus, ca o msur de prim necesitate, organizarea unui Institut central de seruri i vaccinuri, echipat n aa fel nct s corespund nevoilor considerabil crescute ale Romniei Mari, institut de producie, de cercetare dar i de nvmnt. Prin Legea din 1921, graie guvernului de atunci, s-a creat o instituie avnd urmtoarele scopuri: - s prepare toate serurile, vaccinurile, precum i alte produse similare, necesare n profilaxia i tratamentul specific al maladiilor infecioase din ar; - s fac toate lucrrile necesare pentru cercetarea tiinific a acestor maladii i s stabileasc metodele tip pentru serologie i de microbiologie; - s serveasc drept organ de control pentru toate analizele bacteriologice i s-i dea avizul n ce privete introducerea n ar a serurilor i vaccinurilor preparate aiurea; - s pregteasc medici specialiti n microbiologie; - s tipreasc publicaii periodice n legtur cu activitatea tiinifica a acestui Institut, precum i cu activitatea medical i biologic din ntreaga ar. Institutul prepara i da spre ntrebuinare numai serurile i vaccinurile care fceau dovada eficacitii lor. n acelai timp, n laboratoarele institutului se cerceta i se ncercau metodele noi de diagnostic microbiologic i serologic, sau de tratament. Una dintre remarcabilele realizri ale cercetrilor din institut a fost realizarea vaccinului BCG i nceperea vaccinrii tuturor copiilor. La acea vreme vaccinul BCG se mai producea numai n cadrul Institutului Pasteur din Paris. Astzi n cadrul institutului exist laboratoare naionale de referin (multe dintre acestea fiind certificate internaional, de ctre Organizaia Mondial a Sntii), inclusiv un laborator foarte performant de biologie molecular. Producia nc mai continu, chiar dac preparatele pentru uz uman includ n principal (doar) vaccinul gripal sezonier. Anul trecut, INCDMI Cantacuzino a 15

fost una dintre puinele instituii la nivel mondial care a reuit s produc n timp util vaccinul gripal pandemic. n cldirea principal se gsete sala de curs i lucrri practice n care se pred bacteriologie, noiuni de imunologie i micologie, pentru studenii de anul doi ai facultii de medicin. La parter exist sala de curs i seminarii pentru studenii din anul cinci, epidemiologie. Institutul Cantacuzino rmne cel mai important centru de cercetare din Romnia. n ceea ce privete capacitatea de producie, existena acestuia este indispensabil (oricrei ri). Avem sperana c n ciuda anumitor evenimente din ultimii ani, nu vom vorbi niciodat despre Acest Institut la timpul trecut, ci doar la prezent i viitor.

16

2. Structura celulei bacteriene (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)


2. 1. Caracteristici Bacteriile se pot clasifica dup mai multe criterii, ns o variant util de clasificare este clasificarea n funcie de structur i aspectul peretelui bacterian, bacteriile putnd fi: - rigide, cu perete dens, imobile sau mobile; unele dintre aceste bacterii pot forma micelii (ex. bacterii din genurile Mycobacterium, Actinomyces, Streptomyces, Nocardia); dac majoritatea bacteriilor studiate sunt cultivabile pe medii artificiale exist i bacterii care pot fi denumite ca parazii strict intracelulari (ex. genurile Rickettsia, Chlamydia); - flexibile, cu perete celular subire (ex. spirochetele, Treponema spp, Leptospira spp.); - lipsite de perete celular (ex. bacteriile din genul Mycoplasma). Celula bacterian este o celul procariot i are caracteristici structurale diferite n comparaie cu celula eucariot

Tabelul nr. 1. Caracteristici comparative (celula eucariot / celula procariot)

2. 2. Forma i dimensiunile bacteriilor

Forma 2. 2. 1. n funcie de form, bacteriile se pot grupa n mai multe categorii i pot avea: a). form cocoidal, cu diametre egale sau inegale (coci), dispuse izolat sau grupat. Majoritarea steptococilor i stafilococii sunt sferici, enterococii sunt ovalari, pneumococii sunt lanceolai, gonococii i meningococii pot fi reniformi. Dispunerea bacteriilor depinde de mediul de cultur n care se dezvolt, de vrsta culturii bacteriene, de alte aspecte fiziologice precum i de modul n care are loc diviziunea n cursul procesului de cretere i multiplicare (planul de diviziune). Modul de dispunere poate fi considerat, cu anumite rezerve, caracteristic pentru unele genuri de bacterii, de ex.: - stafilococii sunt coci sferici dispui n grmezi (ciorchine); - pneumococii sunt coci lanceolai dispui doi cte doi, eventual nconjurai de o capsul comun (n diplo); - streptococii sunt coci dispui n lanuri etc.;

17

b). form de bastona (bacili, rods), drepi cu capetele uor rotunjite (enterobacterii), drepi cu capetele tiate drept (Bacillus anthracis), fuziformi, cu ambele capete ascuite (Fusobacterium nucleatum), dispui uneori ntr-un mod caracteristic (de exemplu n palisade, ca i scndurile dintr-un gard - bacilii pseudodifterici); c). aspect cocobacilar (exemplu H. influenzae, B. pertussis, B. abortus); d). actinomicete, care n culturi tinere formeaz filamente lungi, ramificate (asemntor mucegaiurilor); aceste filamente se fragmenteaz i rezult aspecte bacilare (ex. Actinomyces israelli); e). forma spiralat (bacili curbi - V. cholerae, spirili i spirochete - T. pallidum). Unele bacterii, chiar i atunci cnd rezult prin multiplicarea unei singure celule mam prezint un pleomorfism deosebit de accentuat (de exemplu Proteus spp.). n culturi vechi sau sub influena unor factori fizici, chimici, biologici, sub tratament cu antibiotice etc., pot aprea forme modificate: filamentoase, umflate, ramificate etc., care pot crea confuzii de diagnostic pentru examinatorul fr experien sau care nu face o examinare innd cont de context. Dac are loc repicarea acestora pe mediu de cultur proaspt iar examinarea ulterioar se face la timpul potrivit (avnd n vedere durata optim de multiplicare) vor rezulta forme tipice pentru specia respectiv.

Dimensiunile 2. 2. 2. Dimensiunile variaz n funcie de gen, specie, condiiile de mediu, vrsta i stadiul de dezvoltare al culturii. n general bacteriile au dimensiuni de ordinul micrometrilor, de exemplu, pentru coci 0,5-2 m, iar pentru bacili 0,3-2/0,5-10 m. Dintre bacteriile vizibile la microscopul optic, Francisella tularensis (discutat astzi n legtur cu posibile atacuri teroriste) poate avea dimensiuni mici, de circa 0,3-0,6 m / 0,2 m. Rickettsiile, chlamydiile i mycoplasmele nu sunt vizibile la microscopul optic datorit dimensiunilor foarte mici. Flagelii pot atinge dimensiuni de pn la 10m. Formele filamentoase rezultate dup tratamentul cu antibiotice pot depi aceast dimensiune. Bacteriile din genul Proteus pot prezenta n mod natural forme filamentoase, de dimensiuni mari. Dac n 1993 a fost pus n eviden Epulopiscium fishelsoni (60-800 m / 200-500 m), cea mai mare bacterie cunoscut astzi este Thiomargarita namibiensis, o proteobacterie Gram negativ, potenial vizibil cu ochiul liber (dimensiuni ntre 100300 m i pn la 750 m). (1999) Datorit dimensiunilor mici, bacteriile pot fi vizualizate numai cu ajutorul microscopului, fie clasic, cu lumina transmis direct, atunci cnd utiliznd un ocular cu o mrire de 10 i un obiectiv (de imersie) cu o mrire de 90-100 X, se realizeaz o amplificare a dimensiunilor bacteriene de circa 900-1.000 X, fie utiliznd alte tipuri de microscoape. Spre exemplu, utilizarea preparatelor colorate prin metode n care marcajul se face cu subtane fluorescente va crete puterea de rezoluie iar numrul de cmpuri investigate poate fi mai redus n 18

comparaie cu investigarea unui preparat colorat clasic (a se vedea capitolul referitor la genul Mycobacterium). Iluminarea n cmp obscur permite examinarea preparatelor proaspete i evidenierea agentului etiologic al sifilisului (T. pallidum), agentul etiologic al leptospirozei (Leptospira spp.), inclusiv mobilitatea acestora. Informaii privind preparatele microscopice, executarea i colorarea frotiurilor, tehnica examenului microscopic n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 1.

2. 3. Componentele structurale ale celulei bacteriene

Att din punct de vedere structural ct i funcional, exist o serie de asemnri ntre celula procariot i celula eucariot. Bacteriile prezint att elemente structurale interne ct i structuri externe care pot i merit a fi studiate avnd implicaii n relaiile dintre celula bacterian i organismul gazd. Exist dou tipuri de elemente structurale, unele dintre acestea fiind ntlnite la toate speciile de bacterii (constante), altele fiind ntlnite numai n anumite condiii i doar la anumite specii sau tulpini bacteriene (facultative).

2. 3. 1. Structuri constante ale celulei bacteriene

Structurile constante ale celulei bacteriene sunt reprezentate de: - perete, - membran citoplasmatic, - citoplasm (cu ribozomi i facultativ cu incluzii, vacuole, plasmide) i de - nucleu. 2. 3. 1. 1. Peretele bacterian Peretele bacterian nconjoar membrana citoplasmatic. Lipsete la bacteriile din genul Mycoplasma. Are o grosime de circa 15-30 nm. Bacteriile Gram-pozitive conin aproximativ 80-90% murein (peptidoglican, glicopeptid parietal). Mureina este un heteropolimer al crui schelet este format din lanuri polizaharidice. Aceste lanuri sunt formate prin polimerizarea, alternant, a 2 structuri zaharidice: - acidul N-acetil-muramic (NAM) i - N-acetil-glucozamina (NAG). 19

Fiecare molecul de NAM are substituit un tetrapeptid alctuit din D i L-aminoacizi. Se consider c aminoacizii n form D confer un grad de protecie fa de enzimele proteolitice. ntre tetrapeptidele substituite, la lanurile polizaharidice alturate, se stabilesc legturi peptidice prin gruparea terminal COOH a unui tetrapeptid i grupri terminale libere ale tetrapeptidului vecin. Astfel se formeaz structuri bidimensionale, destul de complicate, sub forma unor straturi care nconjoar ntreaga celul bacterian. Bacteriile Gram-pozitive rein violetul de metil (violet de genian n coloraia clasic) i au culoare violet pe frotiul colorat Gram. La unele bacterii, reeaua de baz este acoperit de reele suplimentare cu specificitate antigenic, alctuite de exemplu din acid teichoic (polimer de ribitol fosfat i glicerol fosfat), legat de regul covalent la peptidoglican. n cazul n care structurile fosfat se gsesc n cantiti limitate sau nu pot fi sintetizate, la nivelul peretelui bacterian putem ntlni acidul teichuronic. Dintre bacteriile Gram-pozitive se pot aminti stafilococul, streptococul, enterococul, bacilul difteric, bacilul listeriozei, actinomicetele, bacilul antraxului, clostridiile etc. n cazul bacteriilor Gram-negative se descrie un perete celular n general mai subire dar mult mai complex. Peretele este alctuit dintr-un strat fin de peptidoglican (circa 10-20% din structura peretelui) care este acoperit de o membran extern. Spaiul dintre membrana citoplasmatic i membrana extern (include peptidoglicanul) reprezint spaiul periplasmic. Din punct de vedere chimic, membrana extern este alctuit din fosfolipide, proteine i cantiti variabile de lipopolizaharide. Alte proteine importante care se afl la acest nivel sunt porinele. Lipopolizaharidul (endotoxina) are n componen dou structuri eseniale: lipidul A i polizaharidul O. Bacteriile Gram-negative se decoloreaz cu alcool-aceton i se recoloreaz cu fucsin diluat (au culoare roie la coloraia Gram). Dintre bacteriile Gram-negative am putea aminti meningococul, gonococul, enterobacteriile, vibrionul holeric, bacilul piocianic, cocobacilii Gram-negativi (ex. Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Brucella abortus) etc. Bacteriile acid-alcool rezistente (de exemplu, mycobacteriile sau nocardiile) conin o cantitate substanial de lipide la nivel parietal. Rezist decolorrii cu acid-alcool (au culoare roie pe fond albastru la coloraia Ziehl-Neelsen); aceast coloraie continu s reprezinte o etap esenial n diagnosticul bacteriologic al tuberculozei, indiferent de cele mai recente descoperiri privind tehnicile moderne de laborator (inclusiv utilizarea sondelor nucleotidice sau amplificarea genetic). n afar de mycobacterii (n special M. tuberculosis, dar i numeroase mycobacterii atipice (non-tuberculous mycobacteria, NTM), ex. M. avium, M. intracellulare, M. kansasii), exist i alte specii bacteriene care pot aprea colorate asemntor dup utilizarea metodei Ziehl-Neelsen, spre exemplu bacilul difteric (C. diphteriae). Rolurile peretelui bacterian: - prin rigiditate asigur forma caracteristic bacteriei (coci, bacili etc); - asigur rezistena bacteriei (de exemplu la variaii ale presiunii osmotice i la presiuni interioare care pot ajunge pn la 20 atm.); - flexibilitatea peretelui celular la unele bacterii (ex. spirochete) poate fi explicat att prin flexibilitatea membranei ct i prin grosimea redus a peptidoglicanului; 20

- are rol antigenic (carbohidratul C la streptococ, antigenul O - polizaharidic, n cazul bacteriilor Gram-negative etc); - prezint receptori, de exemplu pentru bacteriofagi; - are rol n diviziunea bacterian participnd la formarea septului transversal; - la nivelul lui pot aciona unele antibiotice (exemplu beta-lactaminele, vancomicina, Dcicloserina); - la bacteriile Gram-negative este asociat cu numeroase enzime (situate n spaiul periplasmic i la nivelul membranei externe). Protoplastul (form rotund nconjurat de membrana citoplasmatic) reprezint bacteria Gram-pozitiv dup ndeprtarea complet a peretelui, de exemplu sub aciunea lizozimului care lizeaz mureina. n medii hipotone protoplastul se lizeaz. Este o structur care nu se poate multiplica. Sferoplastul reprezint bacteria Gram-negativ dup degradarea parial a peretelui (conine o cantitate mai mic de murein). Lizozimul poate aciona asupra peptidoglicanului numai dup alterarea membranei externe (ex. dup tratare cu EDTA). n medii hipotone sferoplastul se lizeaz. Spre deosebire de protoplast, se poate multiplica. Anumite bacterii produc autolizine (enzime hidrolitice care degradeaz peptidoglicanul, spre exemplu glicozidaze, amidaze, peptidaze). Este probabil ca aceste substane s aib un rol n creterea i multiplicarea bacterian. Formele L n 1935 s-a observat prezena unor germeni modificai structural. Au fost numite forme L, dup numele Institutului Dr. Lister unde au fost descoperite. Nu sunt microorganisme noi, ci variante ale unor microorganisme cu peretele bacterian modificat. Utilizndu-se lizozim sau penicilin ca ageni inductori s-au putut obine forme L de la majoritatea bacteriilor. Este posibil ca aceste forme L s explice, prin prezena lor n organism, anumite infecii cronice (de exemplu infecii ale aparatului urinar). 2. 3. 1. 2. Membrana citoplasmatic ntre perete i citoplasm exist membrana citoplasmatic avnd grosimea de 7-10nm; poate reprezenta circa o zecime din greutatea uscat a peretelui bacterian. Electronomicrografic apare format din 2 straturi ntunecoase separate de un strat mai clar. Este considerat un mozaic fluid, compus dintr-un film fosfolipidic n care floteaz proteine globulare cu extremitile polare hidrofile expuse spre spaiul intracelular, extracelular sau ambele. Aproape 10% din proteinele celulei bacteriene, peste 200 de feluri de proteine, sunt localizate la nivelul membranei citoplasmatice. Fosfolipidele, dispuse n dublu strat, au extremitile polare, hidrofile, expuse contactului cu apa pe ambele fee ale membranei i extremitile nepolare, hidrofobe, orientate spre stratul mijlociu al membranei. Nu conine steroli (excepie Mycoplasma spp).

21

Rolurile membranei citoplasmatice sunt de: - filtru selectiv, datorit permeazelor (rol n permeabilitate i transport); - barier osmotic; - a conine enzime ale metabolismului respirator (de exemplu citocromi); - a fi sediul majoritii activitilor enzimatice ale celulei bacteriene (de exemplu intervine activ n procesele de biosintez); - excreie a unor enzime hidrolitice; - a interveni activ n procese de biosintez; - a contribui la formarea septului transversal (rol n diviziunea celular); - a participa la procesul de chemotaxie prin receptorii de pe suprafaa sa. Asupra membranei pot aciona anumite antibiotice (de exemplu polimixinele). 2. 3. 1. 3. Mezozomii Mezozomii sunt structuri care se formeaz prin invaginarea membranei citoplasmatice de care rmn legai. Sunt prezeni n special la bacteriile Gram-pozitive. Au structura chimic a membranei citoplasmatice i aceleai funcii n permeabilitate i respiraie. Cu un capt se pot fixa de materialul nuclear, favoriznd distribuirea n mod egal a genomului ntre cele dou celule fiice. Au rol i n formarea septului transversal. 2. 3. 1. 4. Citoplasma La microscopul optic, pe preparatele colorate uzual, observm numai citoplasma bacterian, intens bazofil. Detaliile structurale (nucleoplasm, ribozomi, incluzii) se pot observa numai cu ajutorul microscopului electronic. Are o structur mai simpl fa de citoplasma eucariotelor. Este constituit dintr-un sistem coloidal format din proteine, enzime, lipide, pigmeni, hidrai de carbon, sruri minerale i ap. Conine n mod caracteristic 80% ap, menine ntr-un sistem coloidal proteine, carbohidrai, lipide, sruri etc, conine o mare cantitate de ARN (ex. ARNm, ARNt). Particulele citoplasmatice studiate sunt: ribozomii, incluziile, vacuolele; n citoplasm pot exista i elemente facultative, plasmidele (formate din ADN extracromozomial). La celula tnr citoplasma este intens colorat, omogen, conine ARN n cantitate mare, este clar n timp ce la celula btrn citoplasma are aspect granular. 2. 3. 1. 5. Ribozomii: structur, rol Ribozomii au form aproximativ sferic, pot fi vzui la microscopul electronic. Mrimea lor (circa 10-20 nm) depinde de concentraia ionilor Mg2+ i K+. Unii ribozomi sunt liberi n citoplasm, n timp ce alii apar legai de faa intern a membranei citoplasmatice. Din punct de vedere chimic conin circa 65% ARNr (ribozomal). Au constanta de sedimentare de 70 uniti 22

Swedberg dar sunt constituii din dou subuniti de cte 30S i respectiv 50S. n subunitatea mic intr o singur molecul de ARNr, 16S i 21 de tipuri de proteine ribozomale. n subunitatea mare intr mai multe tipuri de molecule de ARNr (ex. ARNr 23S). ntre cele dou subuniti se formeaz canalul prin care trec moleculele de ARNm (mesager) n cursul sintezei proteice. Se apreciaz c ntr-o bacterie cu dimensiuni medii, aflat n faza de cretere activ, se sintetizeaz circa 500 ribozomi / minut, metabolismul bacterian fiind foarte intens. Ribozomii au rol esenial n procesul de biosintez proteic. Au tendina de a se grupa n polisomi (poliribozomi) cu eficien sporit n biosinteza proteic. n aceste condiii, la un moment dat pe aceeai molecul de ARNm se afl n scopul traducerii mesajului genetic mai muli ribozomi, care constituie un ansamblu care poart numele de polisom. Biosinteza proteic Biosinteza proteinelor are loc la nivelul ribozomilor. Cu toate c secvena de aminoacizi din structurile proteice este dictat de secvena de baze azotate din ADN, pentru c nu exist afinitate i posibilitate de cuplare ntre ADN i aminoacizi este necesar ca o alt structur s permit poziionarea aminoacizilor n lanul viitoarei proteine. Iniial are loc transcrierea informaiei genetice pe ARNm (mesager), care va transporta aceast informaie de la genom la nivelul ribozomilor, sub forma unei copii complementare. Gena este segmentul de ADN care deine informaia genetic pentru sinteza unei proteine. Segmentul de ADN care controleaz sinteza unui polipeptid poart numele de cistron. ARNm care deine informaia genetic pentu sinteza unei singure catene de polipeptid poart numele de ARNm monocistronic. La bacterii, de obicei, o molecul de ARNm trebuie s poarte informaia necesar pentru sinteza mai multor catene diferite i n acest caz ARNm poart numele de ARNm policistronic. Aceast situaia particular este datorat dimensiunii mici a acestor procariote precum i metabolismului intens care are loc n cursul procesului de cretere i multiplicare. Spre exemplu, la E. coli, pentru metabolizarea lactozei sunt necesare potenial 3 enzime diferite, iar mesajul genetic pentru sinteza acestora se afl deinut de o singur molecul de ARNm policistronic. De regul, numai o caten de ADN este folosit drept matri pentru ARNm. Transcrierea mesajului genetic este selectiv (se desfoar ntre promotor i semnalul de terminare) i este controlat de ARN polimeraza ADN-dependent. Pentru traducerea mesajului genetic este necesar intervenia la nivel ribozomal a moleculelor de ARNt (de transfer). Acestea au o dubl specificitate (pentru fiecare dintre cei 20 de aminoacizi exist una sau mai multe molecule de ARNt; n acelai timp exist enzime specifice fiecrui tip de aminoacid care controleaz legarea corect a aminoacizilor activai pe ARNt corespunztor). La nivelul fiecrui ARNt exist trei nucleotide (anticodon) complementar codonului care corespunde aminoacidului.

23

ARNt nu are niciodat la anticodon succesiunea UUA, CUA sau ACU i n aceste condiii ne putem explica motivul pentru care codonii UAA, UAG i UGA sunt codoni stop. Succesiunea specific a nucleotidelor este transpus ntr-o secven specific de aminoacizi care intr n constituia lanului polipeptidic din proteina n curs de formare. 2. 3. 1. 6. Incluziile Incluziile sunt formaiuni care apar n citoplasm la sfritul perioadei de cretere activ. Dimensiunea i forma incluziilor citoplasmatice pot varia n funcie de condiiile externe. Pot conine polimeri anorganici (de exemplu, corpusculii metacromatici ai genului Corynebacterium, la a cror descoperire a avut un rol important Profesorul Victor Babe), substane anorganice simple, polimeri organici (rezervor energetic mai ales la germenii sporulai aerobi), lipide, cristale, granulaii de sulf etc. 2. 3. 1. 7. Vacuolele Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n mai ales la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora. 2. 3. 1. 8. Nucleul Masa nuclear vine n contact direct cu citoplasma. Este localizat n partea central a celulei. Conine ADN, nu are nucleoli. Are afinitate pentru coloranii bazici, dar pe preparatele colorate uzual este mascat de bazofilia intens a citoplasmei bogat n ARN. Unicul cromozom bacterian este alctuit dintr-o singur molecul de ADN dublu catenar, cu aspectul unui fir lung (1.000-2.000 m), nchis ntr-un inel i replicat pe el nsui, superspiralat. Mrimea cromozomului poate s difere n funcie de specia bacterian (i respectiv numrul de perechi de baze); cea mai mic celul bacterian ar fi cea de Mycoplasma spp., la care dimensiunea este de 4.700 kpb, n timp ce cromozomul de E. coli poate avea o dimensiune de circa 3 ori mai mare. Avnd n vedere c dimensiunea bacteriilor este de circa 1-2 mm n cazul cocilor i de cteva ori mai mare n cazul bacililor, pentru ca materialul genetic s poat fi coninut n acest spaiu redus, acesta trebuie s fie compactat ntr-un mod remarcabil i astfel, rezult nucleoidul bacterian care poate fi difereniat microscopic. Nucleoidul este format din molecula de ADN asociat cu proteine i o cantitate variabil de ARN. Relativ recent (1989) s-a descoperit c exist i bacterii care dein cromozomi lineari (ex. Borrelia burgdorferi). Toate speciile din genul Borrelia dein i plasmide lineare. Replicarea cromozomului bacterian se face printr-un mecanism semiconservativ. Aa cum am menionat, cromozomul este unic, ns n celula care se dezvolt rapid exist posibilitatea ca nainte ca prima replicare s se fi ncheiat s se iniieze nc o replicare i n acest caz celula bacterian va putea fi meroploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori). Dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena mai multor cromozomi. Cromozomii suplimentari 24

(n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit pentru c ei sunt copii ale cromozomului iniial (identici cu acesta). Nucleul deine informaia genetic necesar proceselor vitale de cretere i multiplicare. Codonul Din punct de vedere funcional, 3 nucleotide consecutive din structura moleculei de ADN formeaz un codon. Codonii dein informaia genetic pentru a plasa ntr-o anumit secven un anumit aminoacid, n lanul polipeptidic care va fi sintetizat la nivelul ribozomilor. Cistronul Cistronul reprezint o subunitate funcional a genei, capabil s determine independent sinteza unui lan polipeptidic. Gena Gena structural reprezint o poriune a genomului, respectiv o anumit secven de nucleotide dispuse liniar. Genele structurale reprezint circa 90% din ansamblul informaiei genetice. Poart nscris n structura sa informaia genetic necesar pentru sinteza unei proteine specifice, structurale sau funcionale (enzime).

2. 3. 2. Structuri facultative

Structurile facultative ale celulei bacteriene sunt reprezentate de capsul, cili (flagelii), fimbrii (pili) i spori (forme de rezisten). 2. 3. 2. 1. Capsula: structur, rol, evideniere Numeroase bacterii sintetizeaz polimeri organici (de obicei polizaharide) care formeaz n jurul celulei o matrice fibroas, numit glicocalix. La unele bacterii glicocalixul ader strns de celula bacterian i reprezint capsula. Exist bacterii care dein o capsul bine definit, cu structur polizaharidic (S. pneumoniae, K. pneumoniae, unele tulpini de E. coli etc) sau cu structur polipeptidic (Bacillus anthracis etc). La alte bacterii, glicocalixul formeaz o reea lax de fibrile care se pierde parial n mediu i poate fi separat de corpul bacterian prin centrifugare, capsula flexibil, care nu este vizibil la microscopul optic. Roluri: - factor de virulen, mpiedicnd fagocitarea bacteriei i favoriznd invazivitatea; - rezisten fa de surfactani, anticorpi; - permite aderarea unor bacterii (rol de adezin); 25

- barier protectoare fa de bacteriofagi, protozoare; - conine substane cu specificitate antigenic (de specie sau de tip) - antigenul K. Spre exemplu, n cazul S. pneumoniae exist peste 90 tipuri antigenice capsulare n timp ce la E. coli sau la Klebsiella pneumoniae exist peste 80 tipuri antigenice capsulare. Referitor la modalitile de evideniere ale structurilor capsulare, este de menionat c prin coloraia cu albastru de metilen sau tu de China / India, n jurul bacteriei apare un halou necolorat. Exist i coloraii speciale pentru capsul, de exemplu coloraia Hiss. Structura antigenic a capsulei permite identificarea bacteriilor, spre exemplu prin reacia de umflare a capsulei (Neufeld) atunci cnd se folosesc seruri polivalente sau monovalente anti-capsulare pentru identificarea pneumococilor. 2. 3. 2. 2. Flagelii: structur, rol, localizare Cilii sau flagelii confer mobilitate bacteriilor. Mobilitatea poate fi evideniat n preparatul proaspt (ntre lam i lamel) sau pe anumite medii speciale (ex. MIU). Mobilitatea germenilor din genul Proteus este observat pe orice mediu de cultur solid pe care acest microorganism foarte mobil se dezvolt (fenomenul de invazie). Flagelii sunt formaiuni fine, alungite, flexibile, cu origine la nivelul corpusculului bazal. Acesta este alctuit (de ex. la majoritatea bacteriilor Gram-negative) din patru discuri aranjate ca dou perechi pe o structur care trece prin mijlocul lor. Corpusculul bazal este plasat n perete i membrana citoplasmatic. Din punct de vedere chimic flagelul este de natur proteic (flagelina). Roluri: - n mobilitate (cu o vitez de circa 50 m / secund); cilul are o micare de rotaie, asemntoare unei nurubri n mediu i ca atare corpul bacterian este mpins n direcia opus; motorul rotaiei e reprezentat de corpusculul bazal iar energia este obinut din ATP; - antigenic (datorit structurii proteice - antigenul H, specific de tip); - n clasificarea bacteriilor (prin numr i distribuie), bacteriile putnd fi - monotriche (cu un flagel dispus la o extremitate), de exemplu Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa; - lofotriche (cu un mnunchi de flageli dispus la o extremitate); - peritriche (cu mai muli flageli dispui de-a lungul suprafeei bacteriene), de exemplu E. coli, Proteus mirabilis, Salmonella typhi. 2. 3. 2. 3. Fimbriile (pilii) Sunt formaiuni scurte, fine, nu au rol n mobilitate. De obicei pilii sunt mai subiri dect cilii. Pot fi foarte numeroase pe suprafaa majoritii bacteriilor; pot fi observate numai la microscopul electronic.

26

Exist pili comuni, cu urmtoarele roluri: - n aderena bacterian (adezine); - conin receptori specifici pentru bacteriofagi; - antigenic (la unele bacterii), ex. N. meningitidis i N. gonorrhoeae. Exist pili F (sexuali), determinai genetic de factorul de fertilitate F (episom). Acetia ndeplinesc rolul canalului de conjugare. 2. 3. 2. 4. Sporii: structur, compoziie chimic, rol, localizare Fenomenul de sporogenez este mai des ntlnit la Bacillaceae (genurile Clostridium i Bacillus). Pe sol, n condiii de uscciune, la adpost de lumina solar direct, endosporii persist zeci i poate sute de ani. Materialul genetic este concentrat i, mpreun cu apa legat, lipide, Ca++, Mg++, este nconjurat de un strat protector (membrana sporal, cortexul sporal, nveliurile sporale). Smburele sporal mpreun cu membrana citoplasmatic formeaz protoplastul sporal. Roluri: - form de rezisten i conservare a speciei (n condiii favorabile un spor se poate transforma ntr-o bacterie / forma vegetativ; procesul de formare a sporului ar putea fi considerat una dintre cele mai primitive forme de difereniere, dar nu este un proces de reproducere celular aa cum se ntmpl la fungi sau parazii); - rezist la cldur, uscciune, la anumite substane chimice i antibiotice, raze UV etc. Sporul poate fi localizat: - central sau subterminal, mai mic dect celula (ex. la Bacillus anthracis); - central sau subterminal, mai mare dect celula (ex. la Clostridium hystoliticum etc); - terminal (ex. la Clostridium tetani, cu aspectul de b de chibrit). Poate fi evideniat prin coloraii speciale (de exemplu verde malachit) sau prin coloraia Gram (locul sporului rmne necolorat). Este sensibil la formol, propiolacton etc. Este distrus prin autoclavare.

2. 4. Povestiri adevrate

2. 4. 1. Sporii bacterieni; Izbucnire epidemic de infecii cu Clostridium novyi tipA n rndul utilizatorilor de droguri administrate injectabil, n Scoia

27

n Scoia, n perioada aprilie-august a anului 2000, s-a raportat un numr fr precedent de mbolnviri n rndul utilizatorilor de droguri pe cale injectabil. Au fost identificate 60 de cazuri (23 confirmate i 37 probabile), la subieci cu vrsta medie de 30 de ani, dintre care 31 erau de sex feminin (51,66%). Toi pacienii erau consumatori de droguri administrate prin injecie intramuscular i subcutanat (n acest caz a fost vorba despre un preparat compus din heroin i acid citric). 20 (87%) dintre cazurile confirmate au evoluat ctre deces. Din totalul pacienilor, 15 au prezentat fasciit necrozant, 22 au dezvoltat edem la locul de injectare, iar 13 au prezentat pleurezie. n 20 (54%) dintre cazurile probabile i 14 (61%) dintre cele confirmate au existat legturi familiale sau sociale ntre subieci. Semnele clinice cel mai des nregistrate au fost: durere i edem marcat la nivelul locului de injectare; n cteva dintre cazuri, n afar de aceste semne, pacienii au prezentat insuficien multi-organic. O caracteristic a sindromului de afectare multi-organic a fost reprezentat de reacia leucemoid, cu leucocitoz la valori foarte ridicate, cu deviere la stnga a formulei leucocitare (numeroase leucocite tinere, nesegmentate). Probe din heroina confiscat (pur i n combinaie cu acid citric), probe de snge i fragmente tisulare (recoltate antemortem i postmortem) au fost trimise ctre laboratoarele de referin din Glasgow i Londra, dar i ctre laboratorul Centrului pentru prevenirea i controlul bolilor (CDC, Atlanta, SUA). Supoziia iniial (infirmat prin testele de laborator) a fost cea de contaminare a drogurilor cu spori de Bacillus anthracis. Testele efectuate pe probele recoltate au evideniat contaminarea masiv cu spori de Clostridium novyi, tip A, a drogurilor injectabile recuperate (probabil datorit condiiilor precare de obinere, stocare i transport ale acestora). Autoritile au emis ipoteza c o cantitate mult mai mare de droguri se poate afla n circulaie i aceast situaie ar putea fi considerat ca o adevrat bomb biologic pentru populaia consumatoare de droguri. Microorganismul cel mai frecvent izolat din probele recoltate de la pacieni (n condiii de anaerobioz i transportate corespunztor, la adpost de oxigen) a fost Clostridium novyi. Din probele recoltate s-au izolat, de asemenea, Clostridium perfringens i Clostridium saccharolyticum. n cazul n care autoritile de sntate public nu s-ar fi gndit, n cazul diagnosticului diferenial, i la o ipotez n care germenii anaerobi s fie implicai, izbucnirea epidemic ar fi putut s rmn fr diagnostic etiologic. Pe lng prezena sporilor, demonstrat prin tehnici de laborator, a fost utilizat testarea efectului citopatic asupra culturilor monostrat de linii celulare Vero i astfel s-a demonstrat prezena alfa-toxinei produs de C. novyi,tip A, n probele recoltate. Alfa-toxina este eliberat la nivelul procesului infecios (locul injectrii drogului, unde prin realizarea condiiilor de anaerobioz, sporii trec n form vegetativ se multiplic i bacteriile sintetizeaz exotoxina), n esutul subcutanat, conduce la instalarea unui rspuns inflamator local intens, cu edem marcat. Alfa-toxina are o contribuie patogenic i n situaiile cu evoluie spre insuficien multi-organic, asociat cu hipotensiune arterial, reacie leucemoid i fasciit necrozant. Condiiile de anaerobioz sunt atinse deoarece soluia de heroin tamponat cu acid citric produce necroz tisular la locul injectrii (n cazul n care soluia ar fi fost injectat intravenos, sporii ar fi fost distrui de ctre mecanismele de aprare ale gazdei, la nivel sanguin).

28

n cazul n care ipoteza unei afectri datorit sporilor provenii de la bacterii anaerobe ar fi fost emis de la nceput i dac nu s-ar fi instituit (la o parte dintre cazuri) antibioterapia empiric cu antibiotice / chimioterapice cu spectru larg anterior recoltrii probelor, procentul de infecii cu etiologie confirmat ar fi putut s fie mai mare. S-au emis mai multe comunicate de pres pentru a pune n tem populaia i pentru a alerta comunitatea medical i pe eventualii consumatori de droguri. 2. 4. 2. Capsula bacterian Multe s-au scris despre Neisseria meningitidis, meningococul, rspunztor pentru izbucniri epidemice de meningit, cu urmri ngrijortoare (decese, sechele). Infeciile meningococice rmn nc o problem de sntate la nivel mondial iar nelegerea mecanismelor prin care Neisseria meningitidis eludeaz mecanismele de aprare ale gazdei este foarte important. Meningococul determin boala prin invazivitate i multiplicare, adernd la celulele umane i invadndu-le ns dup aceast etap procesul rmne, n mare parte, un mister. Unul din atributele de patogenitate ale meningococului este reprezentat de capsula polizaharidic, cu un rol clar demonstrat n supravieuirea bacterian n fluidele extracelulare. Studii recente au artat c aceeai structur contribuie i la supravieuirea intracelular. Sistemul complement este unul dintre factorii de aprare foarte importani n protecia subiecilor fa de infecia cu N. meningitidis; totui acest microorganism s-a adaptat i a dezvoltat mecanisme proprii de protecie anti-complement. Structurile bacteriene de genul capsulei polizaharidice precum i cele care imit structurile proprii (self) ale gazdei sau leag molecule proprii organismului salveaz germenul de la liz celular i fagocitoz. Se pare c Neisseria meningitidis i folosete eficient proprietile, att extra- ct i intracelular. Prin inocularea de tulpini capsulate i necapsulate marcate izotopic n culturi celulare de celule fagocitare i nefagocitare umane s-a ncercat monitorizarea invazivitii i multiplicrii intracelulare. Rezultatele au fost surprinztoare deoarece capsula, care diminueaz capacitatea de aderare la membrana celular i de intrare a germenului n celul, este esenial pentru supravieuirea intracelular a microorganismului. Un posibil mecanism prin care se produce aceast supravieuire ar fi cel al rezistenei capsulare la peptidele cationice antimicrobiene (CAMPs cationic antimicrobial peptides), componente ale sistemului imun nnscut. Degradarea intracelular a bacteriilor internalizate poate fi legat de o multitudine de mecanisme, printre care aciunea pH-ului, stresul oxidativ sau aciunea enzimelor litice i a peptidelor antimicrobiene. Teoretic prezena capsulei ar putea interfera, direct sau indirect, cu oricare din aceste mecanisme. n particular s-a evideniat deja medierea rezistenei pentru Klebsiella pneumoniae la CAMPs de ctre capsula sa, polizaharidic. n ceea ce privete capsula N. meningitidis, studii preliminare au artat deja c tulpinile necapsulate sunt mai susceptibile aciunii defensinelor, protegrinelor i polimixinei B, asemntoare CAMPs. Polimixina B, un peptid ciclic de origine microbian, a fost folosit ca model al CAMPs datorit proprietilor ei de permeabilizare a membranei externe a germenilor 29

Gram-negativi. Experimental s-a msurat rata de supravieuire a meningococilor timp de 45 de minute n diferite concentraii de polimixin B. Rezultatele au confirmat c absena capsulei scade viabilitatea microbian n prezena polimixinei B. Acest model pe culturi celulare susine ipoteza conform creia capsula N. meningitidis reprezint un mecanism major pentru supravieuirea intracelular a bacteriei din cursul infeciei. 2. 4. 3. Importana examenului microscopic Examenul bacteriologic direct are o mare importan pentru diagnosticul de etap, dar i pentru cel definitiv; poate schimba radical indicaia de tratament precum i prognosticul pentru respectivul pacient. n cadrul examenului bacteriologic direct, examenul preparatului proaspt ntre lam i lamel a rmas ruda srac, fiind mai rar folosit (prea rar); informaiile obinute pot fi ns foarte utile. La un pacient seropozitiv stadiul C3, cu diaree trenant i sever, examenul citobacteriologic a artat prezena unor formaiuni rotund ovalare interpretate ca levuri, probabil candidozice. n ciuda tratamentului antifungic pentru levuri diareea a rmas la fel de sever i starea grav. La o nou examinare a materiilor fecale, de data aceasta i a preparatului proaspt ntre lam i lamel, colorat cu albastru de metil, s-au vzut (datorit colorantului) aceleai formaiuni rotunde dar cu capsul, ridicndu-se suspiciunea unei infecii cu criptococ, care ulterior s-au identificat dup culturi i repicri repetate pe medii specifice. Dar ce este de subliniat este c schimbarea imediat a tratamentului a condus la remiterea simptomatologiei i mbuntirea strii pacientului.

2. 5. Direcii de cercetare
1. Bader J, Albin A, Stahl U, Spore-forming bacteria and their utilisation as probiotics, Benef Microbes 2012 Mar 1; 3(1):67-75 2. Beceiro A, Toms M, Bou G, [Antimicrobial resistance and virulence: a beneficial relationship for the microbial world?], Enferm Infecc Microbiol Clin. 2012 Mar 1 (to be published) 3. Salman V, Amann R, Girnth AC, Polerecky L, Bailey JV, Hgslund S, Jessen G, Pantoja S, SchulzVogt HN, A single-cell sequencing approach to the classification of large, vacuolated sulfur bacteria, Syst Appl Microbiol. 2011 Jun; 34(4):243-59 4. Segura M., Fisher Scientific Award Lecture - The capsular polysaccharides of Group B Streptococcus and Streptococcus suis differently modulate bacterial interactions with dendritic cells, Can J Microbiol. 2012 Mar; 58(3):249-60

2. 6. Evaluarea cunotinelor
1. Alegei afirmaia fals: a. Bacilii au form rotund i se adun n grmezi b. Haemophilus influenzae este un cocobacil

30

c. Dimensiunile bacteriene sunt de ordinul micrometrilor i din acest motiv bacteriile se pot examina la microscopul optic d. Aspectul in diplo este caracteristic pneumococilor e. Exist bacterii cu dimensiuni foarte mici (ex.: Chlamydia spp. i Mycoplasma spp.) care nu pot fi vizualizate la microscopul optic 2. Despre componentele structurale ale celulei bacteriene este adevrat urmtoarea afirmaie: a. Peretele bacteriilor Gram-negative nu conine murein b. Membrana celular este o structur facultativ c. Nucleul bacterian este nvelit de membran nuclear i conine numeroi nucleoli d. Capsula bacterian reprezint un factor de virulen i favorizeaz invazivitatea e. Bacteriile cu flageli sunt imobile 3. Peretele bacterian: a. Este o component constant a bacteriilor din toate genurile b. Este degradat cu uurin sub aciunea lizozimului (muramidazei) c. Are aceeai grosime att la bacteriile Gram-negative, ct i la cele Gram-pozitive d. Nu este sediu de aciune pentru nici un tip de antibiotic e. Conine antigene capsulare 4. Care dintre enunuri este corect n ceea ce privete structurile facultative bacteriene: a. Sporii bacterieni au rol n replicarea ADN-ului b. Mobilitatea bacteriilor este dat de fimbrii c. Sporul este o form de rezisten bacterian d. Capsula este ubicuitar la toate genurile bacteriene e. O bacterie nu poate avea mai mult de un singur flagel 5. Sporii bacterieni: a. Nu se distrug prin autoclavare b. Sunt forme de rezisten ale bacteriilor i se pot transforma n forme vegetative c. Nu se vizualizeaz microscopic d. Pentru orice tip bacterian, sunt localizai n acelai loc i anume central e. Sunt caracteristici tuturor speciilor bacteriene

31

3. Fiziologia bacterian (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)


3. 1. Constituia chimic a bacteriilor 3. 1. 1. Apa: procent, rol Apa reprezint peste 75-85% din greutatea umed a bacteriei. Exist ap liber (mediu de dispersie) i ap legat fizico-chimic cu diferite structuri. Sporii au puin ap, n special ap legat. Bacteriile sunt fiine acvatice prin excelen. Vacuolele sunt formaiuni sferice care conin diferite substane n soluie apoas. Au o membran lipoproteic numit tonoplast. Au fost descrise n special la bacteriile acvatice i ar putea avea un rol n plutirea acestora. Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti faptul c apa reprezint un mediu de dispersie, este reactiv n reaciile metabolice, reprezint etapa final a unor reacii oxidative etc. Prin deshidratare (desicare) este posibil prezervarea culturilor bacteriene timp ndelungat. O metod des utilizat datorit eficienei sale este liofilizarea (criodesicarea). Studiile tiinifice au artat c, n general, germenii Gram-negativi rezist mai puin timp liofilizrii dect cei Grampozitivi, fenomen care a fost pus pe seama stratului mai subire de peptidoglican. (1) 3. 1. 2. Substanele minerale Substanele minerale reprezint 2-30% din greutatea uscat a bacteriei i variaz n funcie de specie, vrsta culturii, compoziia chimic a mediului. Unele elemente intr n compoziia diferitelor structuri (exemplu sulful intr n structura aminoacizilor, fosforul n structura fosfolipidelor etc). Dintre rolurile ndeplinite am putea aminti urmtoarele: favorizeaz schimburile cu mediul, particip la reglarea presiunii osmotice, pot stimula creterea i funcia bacteriei (de exemplu fierul n cazul bacilului difteric, care condiioneaz i producerea de toxine), activeaz unele sisteme enzimatice, contribuie la reglarea pH-ului i a potenialului de oxido-reducere. Aa cum am menionat anterior, la nivel ribozomal se gsesc Mg++ i K+. 3. 1. 3. Glucidele n structura bacterian se pot gsi glucide simple cu rol n metabolismul intermediar glucidic, precum i glucide complexe, de exemplu poliozide. Acestea din urm au o serie de roluri, spre ex. particip la realizarea structurii peretelui celular, fac parte din capsula unor bacterii etc. Exist teste biochimice n care se urmrete utilizarea sau imposibilitatea utilizrii unui anumit zahar de ctre o bacterie. Aceste teste sunt utile pentru identificarea bacteriei respective (n special n cazul enterobacteriilor folosind mediile TSI, MIU, sistemele API etc). Testrile biochimice sunt de mare utilitate i n studiul fungilor (auxanogram, zimogram). 3. 1. 4. Proteinele Exist proteine simple (cu rol n metabolismul intermediar protidic) i proteine complexe, cum ar fi: mucoproteinele (ex. mucopolizaharidul de grup al S. pneumoniae, acidul hialuronic din structuri de tip capsular), 32

cromoproteinele (ex. catalaze, peroxidaze, citocromi), nucleoproteinele (ex. n acizii nucleici). Este de remarcat prezena n structurile bacteriene a unui aminoacid special, acidul diaminopimelic, precum i a aminoacizilor n forma D (ceea ce reprezint o adaptare biochimic a bacteriilor fa de aciunea nociv a enzimelor proteolitice). 3. 1. 5. Lipidele Reprezint mai puin de 10% din greutatea uscat a bacteriilor i variaz cantitativ n funcie de specie, vrsta culturii (cresc n celulele mbtrnite, reprezentnd probabil un semn de degenerescen) i compoziia mediului. La mycobacterii, sunt n cantitate mai mare (circa 2040%), n special la nivel parietal i determin o serie de proprieti specifice, inclusiv afinitatea tinctorial. Lipidele se pot gsi libere n vacuole, combinate sau fcnd parte din diferite structuri ale celulei bacteriene (perete, membran, mezozomi). Dintre lipidele bacteriene putem aminti: acizii grai speciali (ex. acidul mycolic la mycobacterii), cerurile (acizi grai plus alcooli monovaleni superiori), care se gsesc n cantitate mare la bacteriile acid-alcoolo-rezistente (ex. n peretele mycobacteriilor, nocardiilor etc). Dintre acestea, ceara D pare a fi implicat n inducerea hipersensibilitii ntrziate (de tip IV). fosfolipidele, cum este lipoidul ubiquitar (difosfatidil glicerol) din Treponema pallidum (agentul etiologic al sifilisului) sau lipidul A din structura lipopolizaharidului bacteriilor Gramnegative, cu activitate toxic. 3. 1. Constituia chimic a bacteriilor (b) 3. 1. 6. Pigmenii Pigmentogeneza este caracteristic bacteriilor cromogene i este dependent de condiiile de cultivare. Producerea de pigmeni poate reprezenta un criteriu de identificare (ex. n cazul tulpinilor de Pseudomonas aeruginosa sau n cazul unor specii din genul Staphylococcus). Trebuie s reinem nc de la nceput faptul c n cazul stafilococilor, pigmentogeneza este doar un caracter orientativ i nu vom clasifica drept patogen o tulpin de stafilococ n funcie de culoarea coloniei. Stafilococii sunt condiionat patogeni. Testul orientativ privind patogenitatea este testul coagulazei care ar trebui efectuat n mod obligatoriu pentru toate tulpinile izolate de la pacieni. Dup localizarea pigmentului, bacteriile pot fi: cromofore (pigmentul este legat n citoplasm); paracromofore (pigmentul este prezent n perete sau n stratul mucos, de exemplu la S. aureus sau la Staphylococcus epidermidis); cromopare (pigmentul este difuzibil n mediu, de exemplu la Pseudomonas aeruginosa). n afar de faptul c datorit producerii de pigmeni (albastru, galben-verde, maro etc. n cazul Ps. aeruginosa sau auriu, citrin, alb n cazul tulpinilor de Staphylococcus) medicul de laborator se poate orienta n alegerea testelor de identificare ntr-un anumit context clinic i microbiologic.

33

Putem aminti i faptul c pigmenii pot avea o serie de roluri, de ex.: rol de protecie fa de radiaiile UV (pigmeni carotenoizi), rol antibiotic (exemplu piocianina elaborat de P. aeruginosa fa de B. anthracis) i rol enzimatic. 3. 1. 7. Enzimele n cazul bacteriilor se poate aprecia c metabolismul este foarte intens. Capacitatea de a elabora anumite enzime este determinat genetic (exist peste 2000 de determinani genetici diferii), precum i prin mecanisme de control care pot modifica bagajul enzimatic n funcie de necesiti. Dup locul de aciune, enzimele bacteriene se pot mpri n: enzime extracelulare (exoenzime), de exemplu hidrolazele; enzime ectocelulare (n membrana citoplasmatic, reglnd permeabilitatea selectiv), de exemplu permeazele; enzime intracelulare. n raport cu reacia catalizat, enzimele pot fi: hidrolaze, transferaze, oxidoreductaze, liaze, izomeraze etc. Dup modul de apariie, enzimele pot fi: constitutive (exist totdeauna n celul, indiferent de natura mediului); inductibile (sunt sintetizate de ctre bacterie numai ca rspuns la anumii compui aprui n mediu). Studierea comportamentului enzimatic este foarte util n taxonomie. Fiecare unitate taxonomic bacterian (gen, specie) are un spectru de activitate enzimatic propriu; studierea acestuia poate avea o deosebit importan n identificarea bacteriilor. 3. 1. 8. Substane cu aciune antibiotic: plasmidul Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora bacteriocine, cu efect asupra altor bacterii receptive nrudite (de exemplu colicinele elaborate de E. coli); unele bacterii din genul Bacillus produc antibiotice polipeptidice (de exemplu, B. licheniformis produce bacitracina, B. brevis sintetizeaz gramicidina, iar B. polymyxa sintetizeaz polimixina; ultimele 2 specii fac parte, astzi, din alte genuri, vezi capitolul nr. 48). 3. 1. 9. Vitaminele bacteriene Dintre vitaminele produse de bacterii putem aminti: biotina, care poate fi secretat de exemplu de E. coli, B. subtilis, B. anthracis etc; tiamina (B1), care poate fi sintetizat de E. coli, riboflavina sintetizat de B. subtilis, vitaminele B2 i B12 sintetizate de B. megaterium etc. sau vitaminele din grupurile B i K, care pot fi sintetizate sub influena florei bacteriene intestinale umane. 3. 1. 10. Factorii de cretere Factorii de cretere sunt metaboliii eseniali pe care bacteria nu-i poate sintetiza pe baza substanelor care se gsesc n mediul extern. Factorii de cretere trebuie neaprat inclui n mediul de cultur n cazul n care dorim s izolm microorganismul respectiv, numit microorganism pretenios (ex. factorii X i V trebuie inclui n mediul de izolare pentru Haemophilus influenzae).

34

Bacteriile patogene sunt heterotrofe. Adaptndu-se la viaa parazitar, devin dependente de o serie de astfel de factori de cretere (unele sunt att de dependente nct nu pot fi cultivate in vitro, de exemplu bacilul leprei - Mycobacterium leprae). 3. 2. Metabolismul bacterian 3. 2. 1. Nutriia bacterian Nutriia bacterian reprezint suma proceselor metabolice care conduc la producerea de materiale convertibile n energie i n diferite componente celulare. Nutrienii sunt substane ale cror soluii pot traversa membrana citoplasmatic pentru a fi antrenai n reaciile metabolice care asigur creterea i multiplicarea celular. n raport cu sursa de energie, bacteriile se mpart n: bacterii care folosesc energie luminoas i triesc la lumin (photobacterii) i bacterii care i procur energia prin procese de oxidoreducere catalizate enzimatic i triesc la ntuneric (scotobacterii, chimiosintetizante). n raport cu sursele folosite ca material de sintez n ambele diviziuni se difereniaz: bacterii autotrofe, capabile s-i sintetizeze toi compuii organici din materie anorganic i bacterii heterotrofe, dependente de prezena unor compui organici. Nutriia principalelor bacterii studiate Majoritatea bacteriilor comensale, condiionat patogene sau patogene importante pentru om, sunt chimiosintetizante, heterotrofe. Se difereniaz n funcie de tipul respirator. Exist i bacteriile paratrofe, a cror energie trebuie oferit de gazd. Bacteriile paratrofe sunt parazite strict intracelular (de exemplu microorganismele din genurile Rickettsia i Chlamydia, care depind nutriional de o gazd vie). Creterea microbian necesit polimerizarea unor substane mai simple pentru a forma: proteine, acizi nucleici, polizaharide i lipide. Aceste substane se obin fie din mediul de cultur, fie sunt sintetizate de ctre celulele n cretere (sunt necesare diferite coenzime i legturi macroergice de tipul celor din ATP). Substanele necesare i coenzimele implicate se pot obine dintr-un numr relativ redus de precursori metabolici. Dac o celul bacterian primete substanele necesare, va sintetiza diferite macromolecule, iar secvena aranjrii componentelor n aceste macromolecule este determinat fie dup un model ADN-ADN (pentru acizii nucleici) sau ADN-ARN (pentru proteine), fie cu un determinism enzimatic pentru carbohidrai i lipide. Dup ce moleculele au fost sintetizate, ele se autoansambleaz, formnd structuri supramoleculare: ribozomi, perete, flageli, pili etc. Rata sintezei macromoleculelor i activitatea cilor metabolice sunt foarte bine reglate (exist o permanent balan a biosintezei). Microorganismele reprezint un grup de celule vii care utilizeaz o mare diversitate de ci metabolice; de exemplu, mai multe ci diferite pot fi utilizate pentru asimilarea unui singur compus simplu, benzoatul, iar o singur cale metabolic pentru benzoat poate fi reglat de mai multe sisteme de control. Principiul determinant pentru cile metabolice este acela al organizrii unui numr relativ mic de tipuri de reacii biochimice, ntr-o ordine specific. Multe dintre cile biosintetice se pot deduce avnd n vedere structura chimic de la care se pornete, produsul final i eventual unul sau doi metabolii intermediari. Principiul determinant al reglrii 35

metabolismului este acela c enzimele par a fi chemate n joc numai cnd activitatea lor este necesar. Activitatea unei enzime poate fi modificat variind fie cantitatea ei, fie cea a substratului pe care acioneaz. n unele cazuri activitatea enzimelor poate fi diminuat prin cuplarea unor efectori specifici (metabolii care moduleaz activitatea enzimatic). De multe ori, activitatea unei enzime care catalizeaz o etap metabolic iniial este (poate fi) inhibat de produsul final al cii respective. O astfel de inhibiie nu poate depinde de competiia pentru situsul de legare al enzimei la nivelul substratului. Inhibiia depinde de faptul c enzimele reglatoare sunt allosterice. Fiecare enzim are att un situs catalitic de legare cu substratul, ct i unul sau mai multe alte situsuri de legare cu mici molecule reglatoare (numite efectori). Legarea unui efector de situsul su duce la o modificare conformaional a enzimei, astfel nct afinitatea situsului catalitic scade (inhibiie allosteric) sau crete (activare allosteric). Cnd o bacterie peritriche se mic, flagelii se asociaz i se mic mpreun, rezultnd o deplasare liniar. La diferite intervale de timp, bacteria i schimb direcia (flagelii se dau peste cap). Acest comportament face posibil chemotaxia: o celul care se ndeprteaz de sursa atractantului chimic i schimb sensul de micare mult mai frecvent n comparaie cu una care se apropie de atractant i ca o nsumare, bacteria se va deplasa nspre atractant. Spre exemplu, prezena unui zahar sau a unui aminoacid este sesizat de receptori specifici localizai pe membrana celular (de multe ori acelai receptor particip i la transportul membranar al acelei substane). Celula bacterian este prea mic pentru a fi capabil s detecteze existena unui gradient chimic (n spaiu), dar s-a demonstrat experimental c detecteaz gradienii n timp (de exemplu, concentraia unei substane scade n timp ce bacteria se ndeprteaz de surs i crete n timp ce aceasta se apropie de surs). Anumii compui acioneaz ca respingtori (R), iar alii ca atractani (A). Un mecanism care ar explica rspunsul celulei fa de A/R ar implica metilarea i respectiv demetilarea unei proteine specifice din membran, care depinde de GMPc. Atractanii produc o inhibiie tranzitorie a demetilrii acestei proteine. Respingtorii stimuleaz demetilarea. Mecanismul prin care o modificare n comportamentul celular se produce ca rspuns la o modificare de mediu poart numele de transducie senzorial. Aceasta pare s fie responsabil de: chemotaxie; aerotaxie (deplasarea ctre concentraia optim de O2); fototaxie (deplasarea bacteriei fototrofe ctre lumin); deplasarea spre acceptorul de electroni etc. 3. 2. 2. Respiraia bacterian Respiraia reprezint suma reaciilor biochimice aerobe sau anaerobe productoare de energie. Mecanismul de baz este reprezentat de oxido-reducerea biologic (pierderea ionilor de hidrogen sau a electronilor) de ctre o substan chimic (donor) i transportul lor pe molecula unei alte substane numit acceptor (prima se oxideaz, a doua se reduce: AH2 + B <=> A + BH2). n funcie de natura acceptorului final, respiraia poate fi: aerob sau anaerob. Respiraia aerob (oxibiotic) n respiraia aerob, acceptorul final de electroni este reprezentat de oxigen. Respiraia aerob necesit existena membranei celulare. Electronii sunt pasai de la un reductor la un oxidant

36

prin membran cu ajutorul unui set specific de transportori. Substratul reductor frecvent utilizat este NADPH-ul. Enzimele catenei respiratorii sunt: - nicotinice (cu coenzima NAD i NADP); - flavinice (cu gruparea proteic FMN sau FAD); - ferice (grupul prostetic conine Fe sub form de derivai ai protohemului, spre exemplu citocromi, citocromoxidaz, peroxidaz etc). NAD (nicotin adenin dinucleotid), NADP (nicotin adenin dinucleotid fosfat), FMN (flavin mononucleotid); FAD (flavin adenin dinucleotid). Pentru sinteza ATP-ului se utilizeaz fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. Respiraia anaerob (anoxibiotic) n respiraia anaerob acceptorul final de electroni este reprezentat de orice substan anorganic diferit de oxigen sau de orice substan organic (fermentaia); fosforilarea se face la nivelul substratului. Tipul fermentativ este reprezentat de ansamblul acizilor care rezult prin fermentaia zaharidelor i reprezint un caracter fiziologic stabil, foarte important din punct de vedere taxonomic i biochimic. Etapele fermentaiei sunt mai reduse, ctigul energetic fiind mai mic. De exemplu n cazul genului Clostridium, prin fermentaie acetic se obine 1 mol ATP, iar prin fermentaie butiric se obin 0,5 moli ATP. Fermentaia butiric a fost descoperit de Louis Pasteur n anul 1861 (produs de Vibrion butyrique, numit ulterior Clostridium butyricum). Rolul biologic al fermentaiei este reprezentat de producerea energiei i nu de obinerea unor produi finali. Sinteza ATP-ului Sinteza ATP-ului se realizeaz prin cuplarea reaciilor de oxidoreducere cu reaciile de fosforilare. n respiraia aerob se utilizeaz mai ales fosforilarea oxidativ (la nivel de catalizator) cuplat cu partea terminal a lanului respirator. n respiraia anaerob fosforilarea se face la nivelul substratului, donatorii i acceptorii fiind metabolii anorganici (dar nu O2) sau organici (fermentaia). Energetica respiraiei bacteriene Prin fosforilarea oxidativ se pot obine 38 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Prin fosforilarea substratului se pot obine circa 2 moli ATP pentru 1 mol de glucoz. Energia este folosit apoi n procese metabolice de asimilaie. Tipul respirator n raport cu utilizarea proceselor pentru obinerea energiei i de relaia cu oxigenul din mediu, bacteriile se pot grupa n 4 tipuri respiratorii principale (vezi i Tabelul nr. 1): - strict aerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Bordetella pertussis) se dezvolt numai n prezena unei presiuni crescute a O2, care este folosit ca acceptor final unic. Aceste bacterii posed catalaz, peroxidaz, citocromi (de exemplu catalaza desface H2O2 toxic pentru celula bacterian; vezi Figura nr. 1) i utilizeaz numai procese de respiraie. Unele specii aerobe (exemplu Pseudomonas aeruginosa) se pot dezvolta n medii lipsite de oxigen, dac n mediu sunt prezeni nitratul sau nitritul;

37

- strict anaerob, atunci cnd bacteriile (spre exemplu Clostridium tetani, Clostridium botulinum, Fusobacterium, Veillonella, Peptostreptococcus etc) cresc numai n absena O2. Nu pot supravieui n prezena O2, care nefiind redus are o aciune bactericid. Nu au catalaz, peroxidaz (care acioneaz asupra ionilor de O2 sau asupra H2O2). Aceste bacterii folosesc pentru obinerea energiei numai procese de fermentaie. Pentru cultivarea lor este necesar utilizarea unui mediu cu potenial redox foarte sczut. - aerob facultativ anaerob, atunci cnd bacteriile (E. coli, S. aureus, S. pyogenes etc) se dezvolt mai bine n mediile cu oxigen, prin procese de respiraie, dar pot prezenta ambele tipuri respiratorii, n funcie de potenialul redox. Majoritatea au catalaz sau citocromoxidaz, dar nu au peroxidaze flavoproteice. n acest tip se ncadreaz majoritatea bacteriilor studiate. - anaerob microaerofil, atunci cnd bacteriile (de exemplu Campylobacter) tolereaz mici cantiti de O2. 3. 3. Ci metabolice Metabolismul glucidic Polizaharidele utilizabile de ctre bacterii nu pot ptrunde ca atare n celul. Ele sunt degradate de 2 categorii de enzime extracelulare: exohidrolaze (care scindeaz unitile monozaharidice din extremitile lanurilor polizaharidice) i endohidrolaze (care hidrolizeaz unitile interne). Polizaharidele existente n celul ca materiale de rezerv au o degradare diferit, prin fosforoliz, rezultnd hexozo-monofosfai. Principalele ci metabolice (de catabolism) sunt: a). calea hexozo-difosfailor (Embden-Meyerhof-Parnas), prin care n final pentru 1 mol de glucoz se obin 1 mol de acid piruvic i 2 moli ATP; b). calea pentozo-monofosfailor; c). calea Entner-Doudoroff (pentru bacterii din grupul Pseudomonas). Metabolismul lipidic Multe bacterii degradeaz trigliceridele prin lipaze exocelulare n glicerol i acizi grai liberi. Activitatea lipazic poate fi cercetat pe medii care conin glicerol-tributirat. Pentru degradarea lipidelor unele bacterii, de exemplu Clostridium perfrigens, posed enzime specifice (lecitinaza D, fosfolipaza C). Prin degradarea fosfolipidelor din membrana hematiilor, fosfolipaza C confer bacteriilor proprietatea de hemoliz. Acizii grai sunt degradai preponderent prin procesul de beta-oxidare; acizii grai reprezint surse de energie foarte utile (ex. 1 mol de acid palmitic genereaz 129 moli de ATP). Bacteriile saprofite au proprieti lipolitice intense, participnd la biodegradarea grsimilor i uleiurilor (mai ales n mediul marin). Metabolismul proteic n lumea bacterian mai rspndii sunt D-aminoacizii. Acetia pot forma diferite polipeptide cu activitate antibiotic (gramicidina, polimixina, bacitracina) sau de exemplu capsula bacilului anthraxului. Particip de asemenea i la formarea peretelui celular (de exemplu D-Ala). Cile de degradare sunt reprezentate mai ales de: a). transaminarea i dezaminarea aminoacizilor (de exemplu, enterobacteriile au ci proprii de catabolism, utile n identificare); 38

b). decarboxilarea aminoacizilor.

3. 4. Ci biosintetice particulare 3. 4. 1. Formarea structurilor precursorilor biosintetici glutamat, aspartat etc. se realizeaz utiliznd inclusiv structuri chimice care n lumea vie sunt utilizate numai de ctre bacterii, de exemplu acidul diaminopimelic sau acidul dipicolinic. 3. 4. 2. Sinteza peptidoglicanului Sinteza peptidoglicanului se desfoar pe parcursul mai multor etape (vezi Figura nr. 3). ncepe prin sinteza n citoplasm a UDP-acid N-acetil muramic-pentapeptid (NAM). Aceast structur se ataeaz de bactoprenol (un lipid din membrana celular), dup care urmeaz un lan de reacii biochimice. Legarea ncruciat final se realizeaz printr-o reacie de transpeptidare n care terminaiile amino libere ale pentaglicinei nlocuiesc reziduurile terminale ale D-Ala de la peptidul nvecinat. Reacia este catalizat de transpeptidaze, un set de enzime numite i PBPs (penicillin binding proteins) care au att activitate de transpeptidaze i carboxipeptidaze, dar controleaz i gradul de legare a peptidoglicanului (aspect foarte important n diviziunea celular). La nivelul lor se pot lega penicilinele i alte medicamente beta-lactamice (Figura nr. 4). Aceast cale de biosintez are o importan particular n medicin, oferind i baza aciunii selective a unor antibiotice (peniciline, cefalosporine, bacitracin, vancomicin, cicloserin etc). Spre deosebire de celulele gazdei, microorganismele sunt izotone cu fluidele organismului. n interiorul lor presiunea osmotic este foarte mare i viabilitatea lor depinde de integritatea peretelui (peptidoglican) pe tot parcursul ciclului celular. Orice compus care inhib o etap n biosinteza peptidoglicanului la o bacterie n cretere va putea produce liza bacterian (efect bactericid). 3. 4. 3. Sinteza LPZ Sinteza este asemntoare cu cea a peptidoglicanului; n ambele situaii, o serie de subuniti se asambleaz pe un lipid transportor la nivelul membranei i apoi sunt transferate n fabrica polimerului n cretere pentru realizarea peretelui celular. Toate componentele LPZ sunt sintetizate i ansamblate la nivelul membranei citoplasmatice. 3. 4. 4. Sinteza capsulei extracelulare Capsula se sintetizeaz enzimatic din subuniti activate. n sinteza capsulei extracelulare (poate avea structur polizaharidic sau peptidic) nu sunt implicate lipide transportoare de provenien membranar. Prezena capsulei este adesea determinat de condiiile de mediu. De exemplu, dextranii se pot sintetiza pornind de la sucroz i acest lucru se va realiza doar dac exist sucroz n mediu. 3. 4. 5. Sinteza substanelor de rezerv Cnd nutrienii sunt n exces, bacteria poate converti o parte din ei n granule de rezerv (vacuole), de exemplu glicogen, polihidroxibutirat, volutin, care difer de la o bacterie la alta. 3. 5. Cultivarea bacteriilor 39

3. 5. 1. Definiii utile Populaia reprezint o multitudine de indivizi ai unei specii care convieuiesc ntr-un anumit biotop. Clona este populaia care rezult dintr-o singur celul prin nmulire vegetativ (diviziune binar). Tulpina reprezint populaia microbian alctuit din descendenii unei singure izolri n cultur pur. Temperatura de dezvoltare n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: - mezofile, cu temperatura optim de 30-37C; - psichrofile, cu temperatura optim n jur de 20C (unele acceptnd temperaturi apropiate de 0C; Listeria spp. poate supravieui sau se poate chiar i multiplica la temperatura din frigider). Ele sunt adaptate la acest mediu prin numrul mare de acizi grai nesaturai coninui de membrana plasmatic. Gradul de nesaturare al unui acid gras se coreleaz cu timpul de solidificare sau stadiul de tranziie termic (temperatura la care se topete sau se solidific lipidul). Acizii grai nesaturai rmn n faz lichid la temperaturi joase, dar sunt denaturai la temperaturi moderate. Fie c acizii grai din membran se afl n faz lichid sau solid, ei afecteaz fluiditatea membranei, care afecteaz n mod direct capacitatea de a funciona. - termofile, cu temperatura optim de 50-60C (unele putnd s se multiplice i la temperaturi apropiate de 95C, ca de ex. Thermus aquaticus). Bacteriile termofile sunt adaptate s reziste la temperaturi de peste 60C printr-o varietate de modaliti. Acizii grai din membrana bacteriilor termofile sunt acizi grai saturai, permind membranelor s rmn stabile i funcionale la temperaturi ridicate. - extrem termofile sau hipertermofile, cu temperatura optim de 80C sau mai mare i o temperatur de dezvoltare maxim de 115C. (2) Nu sunt patogene. Bacteriile studiate de microbiologia medical sunt n marea lor majoritate mezofile. 3. 5. 2. Noiuni de cretere i multiplicare bacterian Creterea oricrui organism are loc prin sinteza de noi molecule. Deoarece creterea volumului celular raportat la creterea suprafeei este mai mare, n cursul creterii se ajunge la un punct critic. Multiplicarea celular este o consecin a creterii. Se restabilete raportul optim dintre volumul i suprafaa celulei. Multiplicarea majoritii bacteriilor se face prin diviziune simpl (binar). Sporii nu reprezint forme de multiplicare (aa cum se ntmpl n cazul fungilor sau paraziilor). 3. 5. 3. Cultivarea bacteriilor Pentru a identifica agentul etiologic al unei infecii, trebuie ca din produsul recoltat de la pacient s obinem mai nti respectivul microorganism n cultur pur, pentru ca ulterior s i putem studia diferitele caractere n vederea identificrii. Metodele de cultivare a bacteriilor urmresc mai multe obiective: obinerea unei populaii microbiene suficiente cantitativ pentru investigaiile propuse, prevenirea contaminrii produsului cercetat cu un microorganism strin i izolarea fiecrei tulpini microbiene urmrite n cazul unui produs plurimicrobian n culturi monomicrobiene denumite culturi pure. 40

Nu exist un mediu unic, valabil pentru cultivarea oricrei bacterii. Termenul nsmnare definete operaia de introducere a unei cantitai de germeni ntr-un mediu de cultur artificial, n timp ce pentru culturile celulare, ou embrionate i mai ales animale de experien folosim termenul inoculare. Cultivarea se realizeaz prin nsmnarea bacteriilor pe medii de cultur. Mediile solide sau lichide care asigur nutrienii i condiiile fizico-chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene se numesc medii de cultur. Totalitatea bacteriilor acumulate prin multiplicarea ntr-un mediu de cultur poart numele de cultur bacterian. Mediile de cultur Microorganismele pot fi cultivate pe gazde vii i pe medii artificiale. Exist anumite microorganisme (de exemplu virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu pot fi cultivate dect pe gazde vii, aa cum se ntmpl n cazul virusurilor, respectiv: animale de laborator, ou de gin embrionate sau culturi de celule. Majoritatea bacteriilor, fungii i unele protozoare se pot cultiva i pe medii artificiale. Mediile de cultur artificiale trebuie s fie nutritive (s conin factorii de cretere necesari), s fie sterile, s aib un anumit pH (de obicei ntre 7,2-7,6), s aib o anumit presiune osmotic, s aib umiditatea favorabil multiplicrii germenilor etc. Factorii de cretere reprezint substane eseniale pe care microorganismele nu sunt capabile s le sintetizeze din nutrienii de care pot s dispun. Ei sunt necesari n cantitai mici. ndeplinesc anumite roluri n biosintez. Factorii de cretere pot fi grupai n: 1. Purine si pirimidine: necesare pentru sinteza acizilor nucleici (ADN i ARN); 2. Aminoacizi: necesari pentru sinteza proteinelor; 3. Vitamine: necesare n calitate de coenzime i grupri funcionale pentru enzime. Unele bacterii (de exemplu E. coli) nu necesit factori de cretere. Aceste bacterii pot sintetiza purinele eseniale, pirimidinele, aminoacizii i vitaminele pornind de la o surs de carbon. Alte bacterii necesit purine, pirimidine, vitamine i anumii aminoacizi pentru a crete. Aceti compui trebuie adugai n prealabil n mediile de cultur. Factorii de cretere nu sunt metabolizai direct ci sunt asimilai de ctre bacterii pentru a-i ndeplini rolul n metabolism. Tulpinile mutante care necesit anumii factori de cretere ce nu sunt necesari tulpinii din care au provenit sunt numite auxotrofe. Spre exemplu, o tulpina de E. coli care necesit triptofan pentru dezvortare se va numi auxotrof-triptofan i va fi desemnat E. coli trp- (2). Clasificarea mediilor de cultur artificiale Aceste medii se pot clasifica dup starea de agregare, dup natura ingredientelor, dup complexitatea ingredientelor (de exemplu medii speciale), dup scopul urmrit (de transport, de izolare, de identificare etc.), dup coninutul n ap, etc. Exist medii de cultur simple (agar, ap peptonat, bulion simplu etc) i medii de cultur mai complexe (agar-snge, bulion glucozat, agar Muller-Hinton etc). (vezi anexa nr. 2) Medii speciale Mediul electiv conine ingredientele care convin cel mai bine dezvoltrii unei anumite bacterii (de exemplu mediul Lffler, cu ser coagulat de bou, pentru bacilul difteric) (Figura nr. 5).

41

Prin coninutul su n substane antimicrobiene, mediul selectiv inhib dezvoltarea altor bacterii dect cea a crei izolare se urmrete. De exemplu, mediul cu telurit de potasiu pentru izolarea bacilului difteric sau medii n care includem antibiotice (fa de care bacteria care se dorete a fi izolat este rezistent) (Figura nr. 6) Mediul de mbogire favorizeaz nmulirea anumitor bacterii patogene, inhibnd dezvoltarea florei de asociaie dintr-un produs patologic. Funcioneaz concomitent ca mediu selectiv i ca mediu electiv (de exemplu, mediul hiperclorurat pentru stafilococ sau mediile de mbogire utilizate pentru izolarea Salmonella typhi). Mediul diferenial conine un anumit substrat (de exemplu unele zaharuri) care poate fi sau nu metabolizat, determinnd modificarea culorii sau aspectului culturii. De exemplu, agarul cu albastru de brom-timol lactozat (AABTL) care difereniaz bacteriile lactoz-pozitive (cum este E. coli) de bacteriile lactoz-negative (Shigella, Salmonella). Alte exemple: ADCL (agar dezoxicolat citrat lactoz), TSI (3 zaharuri i fier), MIU (mobilitate indol uree). (Figurile nr. 7-10). Colonia izolat Pe medii solide, germenii nsmnai n suprafa produc colonii. Colonia este totalitatea bacteriilor rezultate din multiplicarea unei singure celule bacteriene. O colonie este o clon bacterian. Coloniile izolate se pot obine de exemplu prin tehnica nsmnrii prin dispersie (cu ansa bacteriologic sau cu tamponul). Dup prelevarea cu ansa a unei poriuni din produsul patologic, inoculul este dispersat pe latura unui viitor poligon; se resterilizeaz ansa; se verific temperatura, prin atingerea mediului ntr-o zon nensmnat, ct mai periferic; cu ansa steril se traseaz a doua latur a poligonului; se resterizeaz ansa i se repet procedeul descris pn la realizarea a 4-5 laturi, fr a atinge prima latur. n acest mod, pe ultimele laturi ale poligonului se vor putea observa dup trecerea timpului necesar multiplicrii bacteriene, colonii izolate, bine individualizate. (Schema nr. 1) Incubarea const n meninerea mediilor de cultur nsmnate, n condiiile necesare pentru dezvoltarea culturii. Majoritatea speciilor bacteriene se dezvolt i duc la apariia unei culturi n circa 18-24 de ore de incubare la temperatura optim de dezvoltare (asigurat n termostat) pentru c timpul de generaie este de circa 30 minute. Mycobacterium tuberculosis are un timp de generaie de 12-27 ore i n acest caz cultura devine pozitiv n 2-8 sptmni. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesar incubarea n anaerobioz (ex. n medii la care s-au adugat ingrediente cu activitate reductoare sau n anaerostat); dorim s subliniem c dac transportul nu se face n condiii de anaerobioz, nu vom mai obine nici un rezultat indiferent de mediile utilizate (Figura nr. 11). Dinamica multiplicrii bacteriilor n culturi Culturile bacteriene sunt discontinue cnd se realizeaz n volum limitat de mediu, care nu este rennoit i continue atunci cnd mediul de cultur este continuu rennoit. O populaie bacterian poate fi meninut indefinit n faza de multiplicare exponenial dac se adaug continuu mediu de cultur proaspt, cu omogenizare prin curent de aer steril i evacuare a unei cantiti corespunztoare de cultur (de exemplu n dispozitivul numit chemostat sau turbidostat). Chemostatul utilizeaz un mediu de cultur n care unul dintre nutrieni, aflat n concentraie mai redus dect ceilali, funcioneaz ca factor limitant al creterii. Mediul de cultur proaspt 42

este admis n vasul de cultur n ritmul n care este consumat factorul limitant, iar cultura este evacuat cu acelai ritm. Cultura este meninut astfel la o valoare constant i submaximal ratei de cretere, reglat prin factorul limitant. Chemostatele sunt foarte utile pentru obinerea de tulpini mutante pentru c dup ce rata de multiplicare a fost determinat ansa de selectare a acestor tulpini este mai mare (Figura nr. 12). n laboratorul de microbiologie clinic, de regul se utilizeaz culturile discontinue. Timpul de generaie Populaia care rezult prin diviziunea unei bacterii crete n progresie geometric cu raia 2. Timpul necesar pentru dublarea populaiei se numete timp de dublare sau timp de generaie. Timpul de generaie n faza exponenial i n condiii optime de cultivare este determinat genetic. De exemplu, pentru E. coli este de circa 20 minute (ca i pentru majoritatea bacteriilor studiate). Pentru Mycobacterium tuberculosis timpul de generaie poate avea o valoare ntre 12-27 ore. Fazele dezvoltrii unei culturi bacteriene Teoretic, dinamica unei populaii bacteriene ar trebui s evolueze exponenial. Dinamica real a populaiei bacteriene n cultur discontinu are ns o evoluie caracterizat printr-o curb la care distingem patru faze: faza de lag; faza de multiplicare logaritmic; faza staionar i faza de declin (Figura nr. 13). Faza de lag Numrul bacteriilor nsmnate rmne staionar sau scade; germenii se adapteaz la condiiile mediului. Bacteriile sunt foarte active metabolic, i consum pn la dispariie incluziile, cresc mult n dimensiuni, sintetizeaz enzime, proteine, acizi nucleici etc., dar nu se divid; sunt foarte sensibile la antibiotice. Faza de lag dureaz aproximativ 2 ore. Aceast faz este aparent dependent de o varietate de factori incluznd dimensiunea inoculului, timpul necesar pentru a-i reveni din ocul fizic datorat transportului, timpul necesar pentru sinteza coenzimelor eseniale sau a factorilor de diviziune i timpul necesar pentru sinteza a noi enzime ce sunt necesare pentru a metaboliza substratul prezent n mediu. (2) Faza de multiplicare logaritmic (exponenial) Celulele bacteriene prezint caracteristicile tipice speciei (dimensiunile sunt ns ceva mai mari), citoplasma este intens bazofil i omogen, lipsit de incluzii. Bacteriile sunt foarte sensibile la antibiotice. Aceast faz este adecvat pentru studierea bacteriilor sau pentru recoltarea lor n vederea preparrii de vaccinuri. Faza de multiplicare exponenial dureaz aproximativ 2-3 ore. Faza staionar Multiplicarea este realizat n progresie aritmetic, dar pentru c numrul bacteriilor care sunt distruse este aproximativ egal cu numrul bacteriilor nou aprute rata de cretere devine nul. Germenii au morfologia caracteristic speciei; n aceast faz realizm identificarea germenilor. Apar incluziile caracteristice. La speciile sporogene ncepe formarea sporilor. Faza staionar dureaz aproximativ 2-3 zile. Faza de declin Substratul nutritiv srcete, apar metabolii toxici, bacteriile sunt distruse progresiv, se produc i enzime autolitice, rezervele de hran din incluzii (ex. acidul poli--hidroxi butiric sau glicogenul) se consum, pentru un timp sursa de energie rmne doar ARN-ul celular. Unele 43

bacterii pot persista 2-3 luni. n acest scop se pot activa mecanisme speciale de reglare i se exprim o serie de gene care duc la sinteza unor proteine speciale care permit adaptarea pentru o durat limitat de timp. La speciile sporogene, fenomenul de sporogenez devine foarte intens. Aspectul culturilor pe medii solide Condiiile de cultivare i aspectul culturii sunt caractere cheie n identificarea bacteriilor. Aspectul coloniilor variaz ntre diferitele bacterii, fr a permite diferenieri definitive de specie (dar au utilitate n contextul studierii tuturor caracterelor bacteriene i n contextul general al diagnosticului de laborator, care la rndul su trebuie s aib loc ntr-un context n care punem n balan i alte elemente, clinice, paraclinice; colaborarea ntre medicii de diferite specialiti este esenial). Se examineaz: dimensiunea (coloniile pot fi mari, de peste 2 mm; medii, de circa 1-2 mm i mici, sub 1 mm), conturul (circular, lobat, zimat), relieful (plat, bombat, acuminat, papilat), suprafaa (lucioas, granular, rugoas), culoarea (pigmentate, nepigmentate), opacitatea (transparente, opace), consistena, aderena la mediu, prezena sau absena hemolizei (pe medii de tipul geloz-snge). (Figura nr. 14) Colonia S (smooth) are suprafa bombat i neted, margini circulare i adesea aspect strlucitor. Germenii pstreaz structura antigenic i nu aglutineaz spontan cu soluie salin fiziologic. Germenii capsulai i pstreaz capsula. Virulena este conservat. Majoritatea bacteriilor studiate formeaz colonii de tip S (S. aureus, S. pyogenes, E. coli etc). (Figura nr. 15) Colonia R (rough) este plat, suprafaa ei prezint rugoziti, marginile sunt crenelate. Structura antigenic nu este caracteristic. Nu pstreaz capsula. Virulena nu este conservat (excepii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium diphteriae). O bacterie care n mod caracteristic duce la apariia unei colonii de tip S (ex. o enterobacterie), n cazul n care testele de identificare prin reacii antigen-anticorp (ex. aglutinare pe lam, folosind anticorpi cunoscui) nu se efectueaz la timpul potrivit ci mai trziu, prin nbtrnire va suferi anumite modificri, coloniile vor deveni de tip R iar identificarea pe baza caracterelor antigenice nu va mai fi posibil. (Figura nr. 16) Colonia M (mucoid) este mare, strlucitoare, mucoas. Este dat de exemplu de bacteriile care prezint capsule mari (exemplu Klebsiella pneumoniae). (Figura nr. 17) Coloniile de Streptococcus pneumoniae pot fi i de tip S i de tip M. n cazul bacteriilor foarte mobile (de ex. Proteus spp.) pe mediile obinuite nu vom putea obine colonii izolate (a fost descris fenomenul de invazie). (Figura nr. 18) Cultura se ntinde pe toat suprafaa plcii n strat continuu sub forma unor valuri succesive. Fenomenul de invazie poate fi inhibat prin incorporarea n mediu de acizi sau sruri biliare, tiosulfat de sodiu etc. Aspectul culturilor pe medii lichide Bacteriile i fungii facultativ anaerobi se dezvolt n toat masa de lichid, tulburndu-l. Bacteriile strict aerobe se dezvolt preponderent la suprafaa mediului. Ca un aspect particular, n apa peptonat Vibrio cholerae se poate dezvolta i formeaz un vl la suprafaa mediului. n acest caz, pH-ul mediului este 9-9,5. 44

Bacteriile care pe medii solide produc colonii de tip S, pe medii lichide tulbur omogen mediul (majoritatea bacteriilor). (Figura nr. 19) Variantele R realizeaz o tulburare mai puin omogen. Pot lsa mediul limpede, formnd flocoane care se depun sau un strat (vl) la suprafaa mediului (de exemplu bacilul difteric sau bacilul tuberculos). (Figura nr. 20) Alte informaii privind mediile de cultur, diferitele tehnici de cultivare, examinarea culturilor bacteriene i diferitele tehnici de identificare fenotipice utile n diagnosticul microbiologic sunt prezentate n anexa nr. 2. 3. 6. Povestiri adevrate 3.6.1. Penicilina, o mare descoperire ... nscut dintr-o mic neglijen Era prin anul 1928 cnd Alexander Fleming, investignd caracteristicile stafilococilor, a descoperit n mod accidental penicilina printr-o eroare de cultivare. Fleming era deja cunoscut drept un cercettor de excepie prin activitatea deja desfurat, de ex. datorit descoperirii lizozimului (1922); pe de alt parte, omul de tiin demonstra un grad de neglijen n activitatea de laborator. ntors din concediu n septembrie 1928, a gsit cteva dintre plcile cultivate anterior, contaminate cu un fung din genul Penicillium i a decis s le arunce ntr-o soluie de dezinfectat. Puin mai trziu, vrnd s arate unui coleg cteva dintre rezultatele activitii sale, a gsit cteva plci care nu fuseser nc dezinfectate iar de aceast dat a observat o mic zon, la contactul dintre cultura fungic i cultura bacterian, zon n care bacteriile nu s-au dezvoltat. Pornind de la aceast observaie, Fleming a obinut un extract din cultura fungic, cu proprieti bactericide. Pentru c fungul fcea parte din genul Penicillium a denumit acest extras penicilin. A publicat rezultatele acestei descoperiri n anul 1929. Au mai trecut aproape 16 ani, timp n care s-a reuit izolarea i stabilizarea acestui extract, i n anul 1945 s-a nregistrat producerea antibioticului revoluionar numit penicilin. Pentru descoperirea sa, Fleming mpreun cu biochimistul Ernst Chain i farmacologul Howard Florey au fost laureai cu Premiul Nobel pentru Fiziologie i Medicin n anul 1945. 3.6.2. O fost rickettsie rescrie vechile clasificri n 2009, o echip de cercettori i-a oferit Coxiellei burnetii mijloacele de a evada din mediul intracelular. Pn la aceast dat, agentul etiologic al febrei Q era unul dintre exemplele stereotipe de bacterie strict parazit, imposibil de cultivat pe medii artificiale. Nu a fost una dintre acele descoperiri rapide, neateptate, ci a ncununat o munc minuioas de studiere a necesitilor metabolice ale acestor bacterii. Cercetrile au evoluat progresiv: ntro prim etap, a fost obinut un mediu de cultur artificial, care reproducea condiiile de pH acid din interiorul vacuolelor asemntoare lizozomilor, n care Coxiella spp. se multiplic n celulele gazdei. Pe acest mediu, denumit ulterior Complex Coxiella Medium (CCM), Coxiella burnetii i-a putut desfura activitatea metabolic timp de aproximativ 24 de ore. ntr-o a doua etap, cercettorii au reuit s dovedeasc faptul c bacteria este microaerofil. Au adaptat mediul n consecin i l-au numit ACCM (Acidified Citrate Cysteine Medium). Cultivarea Coxiella burnetii pe medii de cultur artificiale ar putea permite studierea factorilor de patogenitate, studierea structurii genetice i poate i realizarea unui model de abordare pentru ali germeni strict intracelulari. (3-4) 45

3. 7. Direcii de cercetare Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual. Cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: - Economical Evolution: Microbes Reduce the Synthetic Cost of Extracellular Proteins, http://mbio.asm.org/content/1/3/e00131-10 - The genome sequence of Rickettsia prowazekii and the origin of mitochondria, http://www.nature.com/nature/journal/v396/n6707/full/396133a0.html - Engineering of Lactobacillus jensenii To Secrete RANTES and a CCR5 Antagonist Analogue as Live HIV-1 Blockers, http://www.asm.org/images/Communications/hiv-aac.pdf 3. 8. Evaluarea cunotinelor La urmtoarele ntrebri alegei un singur rspuns corect: 1. Care dintre urmtoarele bacterii este cromopar? A. Staphylococcus aureus B. Staphylococcus epidermidis C. Pseudomonas aeruginosa D. Escherichia coli E. Bacillus anthracis 2. Unul dintre urmtoarele este un microorganism strict aerob: A. Clostridium tetani B. Clostridium botulinum C. Bordetella pertussis D. Escherichia coli E. Staphylococcus aureus 3. Penicilina se leag la nivelul: A. hidrolazelor B. oxidoreductazelor C. izomerazelor D. permeazelor E. transpeptidazelor 4. Se cultiv numai pe gazde vii: A. Staphylococcus aureus B. Chlamydia trachomatis C. Streptococcus pyogenes D. Streptococcus pneumoniae E. Haemophilus influenzae 5. Pe ce mediu se produce modificarea culorii sau aspectului culturii datorit prezenei unui substrat? 46

A. Mediu electiv B. Mediu selectiv C. Mediu diferenial D. Mediu Lffler E. Mediu de mbogire Bibliografie recent 1. Miyamoto-Shinohara Y, Sukenobe J, Imaizumi T, Nakahara T, 2008, Survival of freezedried bacteria, J. Gen. Appl. Microbiol., 54, 9-24 2. Todar Kenneth, 2008, The Growth of Bacterial Populations, Todars Online Textbook of Bacteriology, disponibil pe internet la adresa: http://textbookofbacteriology.net 3. Omsland A, Cockrell DC, Fischer ER, Heinzen RA, 2008, Sustained axenic metabolic activity by the obligate intracellular bacterium Coxiella burnetii, J. Bacteriol., 190, 3203-12 4. Omsland A, Cockrell DC, Howe D et al., 2009, Host cell-free growth of the Q fever bacterium Coxiella burnetii, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 106, 4430-4

47

4. Aciunea factorilor fizici, chimici i biologici asupra bacteriilor (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
4. 1. Definiii de baz Septic nseamn contaminat cu microbi patogeni sau infectat (de exemplu infecia unei plgi). Aseptic nseamn lipsit de microbi, indiferent dac microbii sunt patogeni sau nepatogeni. Asepsia reprezint ansamblul de metode prin care evitm contaminarea mediului ambiant cu germeni microbieni sau prin care putem menine sterilitatea esuturilor, mediilor de cultur, medicamentelor injectabile etc. Antisepsia reprezint nlturarea sau distrugerea formelor vegetative microbiene de pe tegumente, mucoase sau din plgi. Se realizeaz cu ajutorul substanelor antiseptice, netoxice pentru tegument (ex. alcool etilic 70, tinctur de iod 5%, KMnO4 0,1%, detergeni cationici etc). Contaminare, este un termen utilizat n instituiile sanitare (deosebit de contaminarea radioactiv) care se refer, n general, la contactul cu microorganisme condiionat patogene sau patogene (capabile s produc infecii sauboli infecioase ). Decontaminarea reprezint utilizarea agenilor fizici / chimici pentru a ndeprta, a inactiva sau a distruge unele sau toate microorganismele condiionat patogene sau patogene de pe suprafee sau obiecte, astfel nct acestea s nu mai poat reprezenta o surs de infecie sau de transmitere a infeciei, iar obiectele sau suprafeele s poat fi manipulate i / sau utilizate n siguran. Sanitizarea reprezint totalitatea msurilor pentru asigurarea sntii publice. Prezervarea presupune prevenirea multiplicrii unor microorganisme n produse farmaceutice, vaccinuri, alimente etc. Curarea reprezint utilizarea agenilor fizici i / sau chimici pentru a ndeprta murdria (materie organic i anorganic) de pe suprafee (inclusiv tegument) sau obiecte, prin procedee mecanice sau manuale, pregtind astfel suprafeele sau obiectele pentru utilizare n siguran sau, pentru trecerea la o alt etap de decontaminare. Detergentul este un produs sintetic pentru curare. Detergenii pot fi anionici, cationici, amfoterici i neionici. Nu prezint aciune antimicrobian. Detergentul enzimatic este un produs sintetic pentru curare care conine o enzim. Echipamentul de protecie este un echipament special (mbrcminte, mnui, ochelari etc) purtat de personalul care manipuleaz produse dezinfectante i realizeaz dezinfecia. Enzima este o protein care descompune murdria ntr-o form care poate fi uor ndeprtat de produsul de curare. Are rol de catalizator pentru reacie, mrind puterea de curare a produsului. De exemplu: amilaza acioneaz asupra urmelor de amidon; lipaza acioneaz asupra urmelor de grsimi i uleiuri; proteaza acioneaz asupra materiei proteice.

48

Produsul de curare este un agent chimic care ndeprteaz murdria (materie organic i/sau anorganic) de pe suprafee sau obiecte, dar nu prezint activitate antimicrobian (bactericid, virucid, fungicid sau sporicid) i care nu reduce nivelul de contaminare microbian. Splarea minilor este procedura prin care se elimin murdria i se reduce flora tranzitorie prin aciune mecanic, utiliznd ap i spun (Figura nr. 1, Film nr. 1). Factori care influeneaz eficacitatea metodelor de control: - mrimea populaiei bacteriene; - timpul de expunere la agentul decontaminant (creterea timpului de expunere crete rata distrugerii); - efectul concentraiei, a temperaturii i a pH-ului (o concentraie mai mare crete rata distrugerii); - stabilitatea agentului; - structura microorganismului etc. Dezinfecia reprezint distrugerea formelor vegetative microbiene (uneori i a sporilor) din anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafee. Se realizeaz cu ajutorul unor ageni fizici sau cu ajutorul substanelor dezinfectante bactericide (cu efecte negative asupra esuturilor gazdei). mpiedic rspndirea bolilor infecioase. Dezinfecia igienic a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia, fr a aciona asupra florei rezidente. Dezinfecia chirurgical a minilor, prin splare, reprezint utilizarea unui produs cu aciune direct asupra florei tranzitorii, pentru a preveni transmiterea acesteia i cu aciune asupra florei rezidente. Produsul pentru dezinfecie de nivel sczut este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, unii fungi (ex. Candida albicans), virusurile capsulate i virusurile mari necapsulate. Produsul pentru dezinfecie de nivel intermediar este un agent chimic care distruge bacteriile vegetative, fungii, virusurile capsulate, virusurile necapsulate i mycobacteriile. Produsul pentru dezinfecie de nivel nalt este un agent chimic care, n condiii bine definite de timp i temperatur, distruge microorganismele, are aciune sporicid i reprezint un potenial sterilizant chimic (Figura nr. 2). Sterilizantul chimic este un agent chimic (nu n form gazoas), utilizat pentru sterilizarea dispozitivelor medicale critice, care nu se pot steriliza prin metode fizice. Un sterilizant chimic distruge toate categoriile i formele viabile de microorganisme, nivelul de supravieuire al acestora fiind mai mic sau egal cu 10-6 (probabilitatea prezenei unui singur microorganism viu pe un dispozitiv medical sterilizat este egal sau mai mic cu 1/1.000.000). Termenul de valabilitate reprezint perioada de timp n care un produs dezinfectant este eficient, din punct de vedere al concentraiei substanei active i eficacitii antimicrobiene. Timpul de contact (timp de aciune) reprezint perioada de timp n care produsul dezinfectant este n contact direct cu suprafaa sau obiectul care trebuie dezinfectat. Perioada de timp n care produsul antiseptic este n contact direct cu esuturile vii. Sterilizarea reprezint distrugerea sau ndeprtarea tuturor microorganismelor patogene sau nepatogene, forme vegetative sau spori, de pe o suprafa sau dintr-un mediu (lichid sau 49

solid). Toate materialele utilizate n laboratorul de microbiologie trebuie s fie sterile nainte de utilizare. Exist o mare diversitate de materiale care trebuie sterilizate, astfel nct i metodele de sterilizare sunt destul de variate, dup cum urmeaz: - Metode de sterilizare prin cldur (cldura uscat sau cldura umed); - Metode de sterilizare prin filtrare; - Metode de sterilizare utiliznd radiaiile, dar i - Metode chimice de sterilizare. Metodele de sterilizare care utilizeaz radiaiile (cu excepia radiaiilor ultraviolete) i metodele chimice de sterilizare (ex. cu oxid de etilen) sunt utilizate rareori n laboratorul de microbiologie. Sterilizarea va fi ntotdeauna precedat de pregtirea materialului care urmeaz s fie sterilizat, respectiv: splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor curate, necontaminate) urmat de autoclavare, splare, uscare, ambalare (n cazul materialelor contaminate refolosibile). Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc. trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Sticlria de laborator este colectat n recipiente speciale i se sterilizeaz prin autoclavare; pipetele vor fi meninute n amestec dezinfectant pn a doua zi. Instrumentarul metalic, seringile i acele (dei este necesar utilizarea pe scar larg a seringilor i acelor de unic ntrebuinare) contaminate se vor introduce n baie de amoniac 1-2% timp de 15-30 minute, se vor peria n soluie de 1-2% detergent cationic i se vor spla cu jet de ap pentru ndeprtarea substanelor chimice (Figura nr. 3). Instrumentele de unic utilizare sunt, n general, destinate chirurgiei moderne. Pot fi izolate (aparate de sutur mecanic toracic, abdominal, vascular etc) sau pot fi furnizate n seturi de instrumente de unic utilizare. Sterilizarea acestor instrumente se face industrial prin iradiere cu raze gamma sau etilenoxid. Utilizarea instrumentelor de unic utilizare (disposable) confer un plus de siguran, n pofida unui pre relativ ridicat. Exist o serie de metode pentru a controla eficiena sterilizrii, prin indicatorii fizici (ex. termometru), chimici (ex. floare de sulf, tiouree) sau biologici (ex. spori de Bacillus stearotermophilus din genul Geobacillus). Pentru verificarea eficacitii sterilizrii cu ajutorul radiaiilor, pot fi utilizai spori de Bacillus pumilus, din genul Bacillus) (Figura nr. 4).

4. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici, chimici sau biologici se pot traduce n principiu prin: distrugerea microorganismelor (efect bactericid) i respectiv inhibarea reversibil a multiplicrii microorganismelor (efect bacteriostatic). 4. 2. 1. Efectele antimicrobiene ale factorilor fizici 4. 2. 1. 1. Influena temperaturii ridicate asupra microorganismelor n funcie de temperatura de dezvoltare, bacteriile pot fi: mezofile (temperatur optim 30-37C), psichrofile (temperatur optim n jur de 20C) i termofile (temperatur optim 50-60C). 50

Prin aciunea cldurii procesele chimice i fizice sunt mult accelerate; distrugerea se produce dup atingerea temperaturii de 50-60C prin ruperea legturilor intramoleculare, mai ales a punilor de hidrogen care menin proteinele i alte macromolecule n stare nativ. Ca urmare protoplasma se denatureaz. Celulele bogate n ap sunt mult mai sensibile la aciunea cldurii dect microorganismele care conin puin ap sau sunt liofilizate. Apa din compoziia microorganismelor absoarbe cldura proporional cu volumul su. Sterilizarea prin cldura are loc n dou variante principale: prin cldur uscat i umed. Sterilizarea prin cldur: a). Sterilizarea prin cldur uscat are ca mecanism oxidarea sau carbonizarea structurilor bacteriene. Amintim cteva dintre variantele tehnice: a1. Sterilizarea prin nclzire la incandescen (la rou) reprezint introducerea i meninerea n flacra becului Bunsen pn la nroire, pe toat lungimea, a obiectului care urmeaz a fi sterilizat. Se poate aplica pentru ansa bacteriologic (cu bucl sau fir) sau pentru spatul (Figura nr. 5, Film nr. 2). Flambarea reprezint trecerea prin flacr (de cteva ori) a unui obiect, fr a se atinge temperatura de incandescen. Flambarea se aplic pentru portans, gtul unui recipient de sticl (tub, eprubet, flacon etc) sau pentru capilarul pipetelor Pasteur i nu reprezint sterilizare. a2. Sterilizarea cu aer cald se realizeaz n etuv (pupinel, cuptor Pasteur) (Figura nr. 6). Etuva este o cutie metalic cu perei dubli. Cu ajutorul unor rezistene electrice i a unui termostat se obine i menine temperatura pentru sterilizare. Uniformizarea temperaturii n interiorul aparatului este realizat cu ajutorul unui sistem de ventilaie (Schema nr. 1). Pentru majoritatea materialelor care urmeaz a fi sterilizate, temperatura din etuv trebuie s ating 180C, pentru o durat de 1 or sau 160C pentru o durat de 2 ore. Pot exista i alte variante, de exemplu n funcie de dimensiunea obiectelor de sterilizat. Sterilizarea cu aer cald este indicat pentru obiecte de sticl, obiecte de porelan, pulberi inerte i termostabile, uleiuri anhidre, instrumentar chirurgical (pentru instrumentarul metalic este de menionat faptul c repetarea sterilizrii, n timp, conduce la declirea oelului) etc. Nu se vor steriliza n etuv soluiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de cauciuc, vat, bumbac, fibr sintetic, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator. a3. Incinerarea reprezint arderea pn la obinerea de cenu (Figura nr. 7). Exist anumite reguli stricte privind incinerarea, pentru a preveni diferitele tipuri de poluare. n cazul spitalelor, n Romnia au existat astfel de incineratoare n structura unitii sanitare respective. Odat cu procesul de aderare la Uniunea European i respectiv necesitatea aplicrii unor reguli impuse pentru toate rile membre, majoritatea incineratoarelor de spital au fost nchise. Modul n care s-a realizat n perioada 2003-2004 negocierea privind stoparea activitii acestor incineratoare nu a inut cont de situaia real din ara noastr. n lipsa unui incinerator propriu, unitatea sanitar trebuie s ncheie un contract de prestri servicii cu o firm de profil. Din punctul de vedere al laboratorului de microbiologie ar putea fi supuse incinerrii materiale de unic folosin din plastic, reziduuri organice solide, gunoi, cadavrele animalelor de experien etc. 51

b). Sterilizarea prin cldur umed este cea mai eficient metod de sterilizare i are ca mecanism coagularea proteinelor i degradarea enzimelor. Se poate folosi pentru diferite substane n soluie, sticlrie (cu excepia pipetelor i lamelor), instrumentar chirurgical (metalic, de cauciuc sau bumbac), medii de cultur, aparate de filtrat etc. b1. Autoclavarea este esenial att pentru laboratoarele de microbiologie ct i pentru unitile sanitare n general, indiferent de sistemul public sau privat. Vaporii de ap realizeaz la 0,5 atmosfere o temperatur de 115C, la 1 atmosfer o temperatur de 121C i respectiv 134C la 2 atmosfere. Autoclavul are ca pies principal un cazan cu perei metalici, care se nchide etan cu un capac prevzut cu un sistem special de nchidere i n interiorul cruia, vaporii de ap sunt comprimai la presiunea necesar n vederea sterilizrii (Schema nr. 2). Exist mai multe tipuri de autoclave: - autoclave cu perete simplu verticale orizontale - autoclave cu manta de aburi verticale orizontale. n continuare, drept exemplu, vom discuta numai despre autoclavul cu perete simplu, vertical, la care vaporii provin din apa aflat n cazanul de presiune i ajung n camera de sterilizare de jos n sus (Figura nr. 8). Presiunea din interiorul cazanului este nregistrat de un manometru. Pentru punerea n funciune a autoclavului, n dotare exist 2 robinete: unul superior (robinetul de aer i vapori, care permite legtura ntre cazan i mediul exterior) i unul inferior (robinetul care permite evacuarea apei din cazan). Pentru a evita accidentele exist o supap de siguran care se deschide i permite evacuarea vaporilor atunci cnd, accidental, presiunea vaporilor depete limita de siguran. n momentul de fa pentru evitarea riscului de a veni n contact cu vapori de ap fierbini aflai sub presiune, autoclavele sunt dotate cu un sistem care nu permite deschiderea capacului pn cnd presiunea din interior nu o egalizeaz pe cea din exterior. Cazanul de presiune este inclus ntr-un perete exterior solid care la partea inferioar are un spaiu n care se afl sursa de cldur. n partea inferioar a cazanului de presiune se afl un suport pe care se aeaz o plac de metal perforat (Figura nr. 9). Pe suport se aeaz materialele care trebuie sterilizate iar faptul c placa este perforat permite trecerea vaporilor de ap produi dup nclzirea apei. n vederea sterilizrii se procedeaz astfel: verificm nivelul apei din partea inferioar a cazanului, care trebuie s fie pn la o distan de 2-3 centimetri de suport; dac nivelul a sczut, se completeaz (recomandabil se va utiliza ap distilat); aezm pe suport obiectele i materialele de sterilizat, ambalate corespunztor; nchidem etan capacul, folosind sistemul special de etaneizare cu care este dotat autoclavul pe care l avem la dispoziie; conectm sursa de cldur;

52

deschidem robinetul pentru evacuarea aerului i vaporilor (dac rmne aer n cazanul cu presiune eficiena sterilizrii va scdea considerabil; vaporii de ap fiind mai uori, vor nclzi n special partea superioar a cazanului n timp ce aerul, care va atinge temperaturi inferioare, fiind mai greu, va rmne n partea inferioar a cazanului) ; nchidem robinetul dup evacuarea aerului i apariia unui jet continuu de vapori; presiunea din cazan ncepe s creasc i este urmrit cu ajutorul manometrului; atunci cnd presiunea atinge valoarea dorit (de ex. 1 atmosfer), reglm sursa de cldur n aa fel nct aceast presiune s fie meninut pentru toat durata sterilizrii (de ex. 30 minute) ; dup trecerea celor 30 minute ntrerupem sursa de cldur i lsm autoclavul s se rceasc pn cnd presiunea din interior ajunge la nivelul presiunii atmosferice; deschidem lent robinetul de vapori; deschidem sistemul de etaneizare i capacul autoclavului; lsm obiectele i materialele s se rceasc n autoclavul deschis; atunci cnd temperatura scade suficient de mult putem scoate materialele sterilizate. b2. Tindalizarea (sterilizarea fracionat) este o metod de sterilizare prin cldur umed care evit depirea unei temperaturi de 100C. Substanele de sterilizat se menin la 56-100C timp de 30-60 minute, 3 pn la 8 zile succesiv. Astfel, utiliznd medii care permit germinarea, dup prima nclzire timp de 30-60 minute sunt distruse formele vegetative iar dup rcire are loc germinarea sporilor. n ziua urmtoare sunt distruse prin nclzire formele vegetative rezultate din germinarea sporilor iar dup rcire are loc germinarea sporilor care nu au germinat n prima zi etc. Din punct de vedere tehnic pot fi utilizate autoclave la care se va menine permanent deschis robinetul de vapori (i astfel nu se va depi n interior temperatura de 100C), bi de ap sau bi de nisip. Prin tindalizare se pot steriliza alimente, unele medii de cultur etc. b3-4. Pasteurizarea i fierberea nu reprezint metode de sterilizare, dar sunt utilizate n anumite situaii. Pasteurizarea folosete cldura umed i are aplicaii n conservarea pentru scurt durat a unor alimente (lapte, bere etc). Exist o pasteurizare joas (30 minute la 56-65C), o pasteurizare medie (15 minute la 65-75C) i o pasteurizare nalt (2-5 minute la 85-90C). Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile n form vegetativ dar nu i sporii. Fierberea poate fi utilizat atunci cnd nu dispunem de alte metode eficiente de sterilizare, iar mecanismul de aciune este denaturarea proteinelor. Fierberea timp de 30 minute la 100oC, distruge bacteriile n form vegetativ, fungii i virusurile, dar nu i sporii bacterieni. Timpul se nregistreaz dup ce apa a nceput s fiarb. Eficiena acestei metode poate fi crescut prin adugarea de carbonat de sodiu 1-2%. 4. 2. 1. 2. Influena temperaturii sczute asupra microorganismelor Temperaturile joase (n jur de 0-4C) au n general un efect bacteriostatic. La temperaturi sczute, reaciile biochimice ncetinesc, multiplicarea poate fi stopat. Majoritatea produselor biologice/patologice pot fi transportate (meninnd viabilitatea germenilor i ncetinind n acelai timp multiplicarea acestora) la o temperatur de circa 4C. O serie de culturi pot fi de

53

asemenea meninute la temperatura frigiderului pentru o durat limitat de timp n vederea prezervrii i posibilitii de a repeta anumite teste de identificare etc. n funcie de viteza cu care are loc rcirea, ntlnim situaii diferite, cu urmtoarele posibile efecte asupra structurilor celulare bacteriene. a). Congelarea lent, la temperaturi mai mici -21,3C are efecte bactericide prin formarea de cristale de ghea i prin hiperconcentrarea salin cu denaturarea proteinelor; b). Congelarea brusc la -70C are efecte de conservare a bacteriilor prin solidificarea n mas a apei fr apariia cristalelor de ghea; c). Liofilizarea (criodesicarea) reprezint congelarea brusc concomitent cu desicaia (deshidratarea n vid). O suspensie microbian n mediu protector, liofilizat, poate fi pstrat n fiole nchise timp ndelungat (de exemplu vaccinul BCG). 4. 2. 1. 3. Filtrarea Microorganismele pot fi reinute mecanic i electrostatic n porii unui filtru. Trecerea unui lichid printr-o substan prevzut cu pori care va reine microorganismele din lichidul respectiv poart numele de sterilizare prin filtrare. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porelan, sticl poroas, azbest impregnat cu caolin, pmnt de infuzori) (Figura nr. 10). Actualmente se folosesc din ce n ce mai frecvent membrane filtrante din acetat de celuloz cu poroziti ntre 8 i 0,025 mm (Figura nr. 11). n vederea filtrrii sunt necesare o serie de piese precum: un recipient n care se introduce lichidul care urmeaz a fi filtrat, un recipient n care se va colecta lichidul sterilizat, o plnie care se monteaz etan ntre cele 2 recipiente, o pomp de vid care va aspira lichidul din primul n al doilea recipient, prin membrana filtrant. Toate aceste piese sunt sterilizate prin autoclavare nainte de nceperea filtrrii. Exist i alte variante tehnice. Cu o importan practic particular ar fi de menionat filtrele pentru sterilizarea aerului din cabinetele de siguran biologic (clasa II i clasa III), filtrele HEPA (High Efficiency Particulate Air Filters) (Figura nr. 12). Sterilizarea prin filtrare este utilizat pentru decontaminarea aerului, a unor medii de cultur (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la temperaturile atinse n cazul sterilizrii prin cldur etc. 4. 2. 1. 4. Radiaiile neionizante (UV) sau ionizante (X etc) au efecte bactericide prin ruperea legturilor de hidrogen, oxidarea legturilor duble etc. Radiaiile UV sunt utile n sterilizarea suprafeelor de lucru (pentru repartizarea mediilor de cultur, alte manevre aseptice etc) n cazul n care nu exist cabinete de siguran biologic cu flux laminar dar i atunci cnd avem la dispoziie astfel de cabinete de siguran biologic i dorim s sterilizm incinta n care am prelucrat spre ex. produse n care exist Mycobacterium tuberculosis. Lmpile cu UV sunt numite lmpi germicide. Astfel de lmpi sunt plasate de ex. i n instituiile sanitare n care sunt internai pacieni cu tuberculoz (Figura nr. 13). Radiaiile ionizante se pot utiliza n sterilizri industriale (pentru alimente, medicamente, seringi de unic ntrebuinare etc). 4. 2. 1. 5. Ultrasunetele au efecte bactericide prin aciune mecanic, micare activ a coninutului celular, formare n mediul extern de bule mici de gaze dizolvate care se mic energic i se izbesc de membran (fenomenul de cavitaie) i creterea temperaturii la 50-80C. Sporii rezist acestor efecte. 54

4. 2. 1. 6. Presiunea osmotic Plasmoliza (pierderea apei, deshidratarea) n medii hipertone are efecte letale asupra unor bacterii. n medii hipotone are loc acumularea de ap n celula bacterian; aceasta devine turgescent i peretele bacterian cedeaz.

4. 2. 2. Efectele antimicrobiene ale factorilor chimici Exist o serie de substane chimice necesare creterii i multiplicrii bacteriene. Alte substane chimice (antibioticele i chimioterapicele) au efect bactericid sau bacteriostatic selectiv. Antisepticele i dezinfectantele sunt substane cu aciune antimicrobian neselectiv, alterndstructuri i funcii comune microorganismelor i organismelor superioare. Antisepticele pot fi utilizate pe tegumente i mucoase. Dezinfectantele pot fi utilizate numai pe suprafee i structuri care nu sunt vii. O parte dintre dezinfectante au efect sterilizant. Aa cum am menionat anterior, trebuie s existe o etap de pregtire a materialelor n vederea sterilizrii. Materialele de laborator, instrumentarul, materialele chirurgicale etc, trebuie curate perfect, de ex. prin splare cu ajutorul unor detergeni. Dac aceste materiale au fost contaminate cu snge, nainte de splare se vor dezinfecta. Substanele antiseptice i dezinfectante se pot clasifica n funcie de mecanismul de aciune, dup cum urmeaz: a). Substane care denatureaz proteinele (au n general efect bactericid): acizii, bazele, alcoolii i derivaii lor (de exemplu alcoolul etilic, CH3-CH2OH, de 70, folosit pentru antiseptizarea tegumentelor). b). Substane care oxideaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): hipermanganatul de potasiu, KMnO7 1, util n antiseptizarea mucoaselor, peroxidul de hidrogen, H2O2, soluie 3% n ap, utilizat n antiseptizarea plgilor, halogenii (Cl2, I2, Br2) i derivaii lor (hipoclorii, cloramine, soluii iodurate etc. Exist i diferite clase de compui halogenai cu poten mai mare, cum ar fi cei care au n componena lor radicalul benzil -C6H5. Indiferent de substana folosit este necesar realizarea concentraiei corespunztoare. c). Substane care blocheaz gruprile chimice libere ale enzimelor (de exemplu, SH): metale grele [srurile de mercur, preparatele organomercuriale (cum ar fi spre exemplu merthiolatul de sodiu, C9H9HgO2SNa ), srurile de argint, compui de argint coloidal (exemplu colargol, protargol) cu efecte bactericide], gruprile alchil ale formaldehidei, glutaraldehidei (C9H9HgO2SNa), oxidului de etilen (C2H4O) etc. d). Substane care lezeaz membranele celulare: fenolii [acidul fenic are utilizri limitate datorit proprietilor caustice i toxicitii sale; este etalonul fa de care se msoar activitatea antimicrobian a antisepticelor i dezinfectantelor (indicele fenolic), crezolii, hexaclorofenul, clorhexidina (cu efecte toxice mai reduse) etc], detergenii [anionici (spunuri, perlan etc),

55

cationici (sruri cuaternare de amoniu, de exemplu bromocet), amfolitici (de exemplu acidul dodecilaminoacetic), neionici (de exemplu propilenglicolul)]. e). Substane care altereaz acizii nucleici: coloranii bazici (violet de genian, albastru de metilen, fucsin bazic etc), derivaii de acridin, de exemplu rivanolul. Dintre exemplele prezentate mai sus,alcoolul etilic de 70, diferii derivai halogenai, hipermanganatul de potasiu 1, peroxidul de hidrogen, rivanolul, sunt exemple de substane antiseptice. Dorim s menionm i s subliniem c att n cazul antisepticelor ct i n cazul dezinfectantelor este important ca substana utilizat s aib concentraia corespunztoare, s fie aplicat pentru o durat de timp corespunztoare, s se afle n termenul de garanie. Aceeai substan chimic (de ex. cloramina) poate intra n categoria antisepticelor sau n categoria dezinfectantelor, n funcie de concentraie (concentraia este mai mare n al doilea caz). n continuare vom prezenta pe scurt cteva exemple de substane dezinfectante. Dorim s menionm faptul c, pn n prezent, nu exist nici un dezinfectant ideal. Exist numeroase substane i numeroi productori de antiseptice i dezinfectante. Hipocloriii: soluiile de hipoclorit se prepar periodic (se inactiveaz dup mai mult de 24 ore), concentraia n clor activ este diferit n funcie de scopul urmrit (ex. 2.500 ppm clor activ pentru dezinfectarea pipetelor contaminate); au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, sporilor bacterieni, fungilor (100 ppm n o or), virusurilor (200 ppm n 10 minute); efectul este diminuat considerabil n prezena substanelor organice (n special proteine), maselor plastice, detergenilor. Derivaii fenolici: din cauza toxicitii, potenialului carcinogenetic i corozivitii, fenolii nu se folosesc ca atare, ci sub forma derivailor fenolici; soluiile fenolice se prepar periodic (dup cel mult 24 ore); concentraia poate fi diferit n funcie de scopul urmrit (de obicei este de 2-5%); au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, fungilor, unor virusuri (ex. HIV este inactivat de soluia 0,5%); efectul este diminuat pe suprafeele de cauciuc, lemn sau material plastic. Glutaraldehida: cel mai frecvent este utilizat concentraia de 2%, la un pH alcalin; are efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ (n cazul mycobacteriilor este necesar un timp mai lung de expunere), fungilor, virusurilor; datorit faptului c nu corodeaz metalele (aa cum se ntmpl n cazul substanelor prezentate mai sus) se poate folosi i la dezinfectarea suprafeelor metalice;

56

nu poate fi folosit pentru suprafee, datorit vaporilor iritani i timpului mare de expunere; ideal pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate ce pot fi imersate o perioada mai mare de timp n containere meninute nchise. Iodoforii: sunt substane care complexeaz iodul pe care l elibereaz n soluii apoase; au efect dezinfectant asupra bacteriilor n form vegetativ, unor spori bacterieni, fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu nveli lipidic); sunt inactivai de substane organice (n special proteice), mase plastice, detergeni; pot fi utilizai pentru dezinfecia suprafeelor, dezinfecia pipetelor contaminate. Sterilizarea cu etilenoxid (CH2CH2O): exercit activiti bactericide prin alkilarea acizilor nucleici i prin nlocuirea hidrogenului labil printr-o grupare hidroxietil (-CH2CH2OH); sporii de Bacillus subtilis nu sunt distrui; acest tip de sterilizare se utilizeaz pentru materiale care nu rezist atunci cnd sunt supuse aciunii temperaturii sau radiaiilor (ex. materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc.); fiind o substan exploziv, etilenoxidul este utilizat n camere speciale n care se menine o presiune negativ, iar pentru a preveni o explozie dioxidul de carbon poate fi combinat cu aceast substan n ncperi de oel speciale; o alt variant de protecie ar fi combinarea cu hidrocarburi fluorinate. indiferent de varianta folosit trebuie respectate toate recomandrile productorului; exist o serie de inconveniente n ceea ce privete acest tip de sterilizare (pot s apar efecte carcinogenetice i afectarea sistemului nervos etc., dar e posibil afectarea ntregului organism); sterilizarea este n principiu influenat de: concentraia etilenoxidului, temperatur, umiditatea relativ i timpul de expunere (spre ex. o dublare a concentraiei va reduce la jumtate timpul necesar pentru sterilizare).

4. 2. 3. Produsele biocide Directiva 98/8/CE definete produsele biocide dup cum urmeaz: Substane active i preparatele coninnd una sau mai multe substane active, condiionate ntr-o form n care sunt furnizate utilizatorului, avnd scopul s distrug, s mpiedice, s fac inofensiv i s previn aciunea, sau s exercite un alt efect de control asupra oricrui organism duntor, prin mijloace chimice sau biologice (vezi directiva CE). Din categoria produselor biocide sunt excluse produsele de curenie, detergenii sub form de pulbere sau lichid i alte produse similare, ce nu sunt destinate a avea efect biocid. 57

Produsele biocide includ: produsele utilizate pentru dezinfecia suprafeelor mari inerte, a aerului, a echipamentului medical, a mobilierului, sau pentru dezinfecia i curarea acestora; produsele pentru dezinfecia / sterilizarea instrumentarului, endoscoapelor, .a., prin imersie; produsele dezinfectante / antiseptice pentru tegumente, spunurile dezinfectante, spunurile antiseptice, spunurile antibacteriene / antimicrobiene, gelurile de curare antibacteriene / antimicrobiene, soluiile de curare antibacteriene / antimicrobiene (dup cum sunt denumite de productor); produsele dezinfectante/antiseptice pentru mucoase, ex. pentru igiena oral, .a.; erveele umede dezinfectante, detergenii i produsele de curare care au activitate biocid dovedit (distrug sau inhib multiplicarea bacteriilor, fungilor sau a altor microorganisme). n aceast categorie ar putea intra i substanele sintetizate de Bacillus thuringiensis din genul Bacillus, cu efect biopesticid. 4. 2. 4. Efectele antimicrobiene ale factorilor biologici 4. 2. 4. 1. Interrelaiile microbiene n cadrul nielor ecologice proprii n natur microorganismele nu se dezvolt izolat. Relaiile pot fi de comensualism, simbioz sau antagonism, noiuni care vor fi prezentate ulterior. n cadrul relaiilor de antagonism, acesta se poate datora vitalitii mai mari a speciilor antagoniste sau elaborrii de ctre specia antagonist a unor substane nocive pentru speciile concurente. Aceste substane pot avea (ex. antibioticele i bacteriocinele) sau nu (ex. acidifierea mediului) aciune selectiv. 4. 2. 4. 2. Bacteriofagul Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaz bacteriile (de exemplu, bacteriofagii T1-T7 cu specificitate pentru E. coli). Bacteriofagii (fagii) au fost descoperii n 1915. Prof. Mihai Ciuc obine n anul 1921 primele tulpini lizogene. n 1949 se nfiineaz n Romnia un Centru naional pentru bacteriofagi. Fagii au o structur mai complex dect cea a virusurilor obinuite. Se descriu (Figura nr. 14): 1. capul fagului are form de prism hexagonal bipiramidal. Conine ADN dublu catenar helicoidal sau ARN nconjurat de capsida format din capsomere (nveli proteic); fagii ARN pot avea un numr mic de gene (ex. 3) n timp ce fagii ADN pot avea pn la 150 gene; 2. coada fagului are structur proteic, simetrie helicoidal; are rol de adsorbie, ajutnd fagul s penetreze bacteria. Se descriu urmtoarele formaiuni: - cilindrul axial; - teaca cozii; - placa bazal (cu croetele de fixare); - fibrele cozii (formnd un strat n jurul tecii cozii).

58

Toate proteinele fagice pot conduce la apariia de anticorpi, descoperire utilizat n studierea nrudirii dintre diferii bacteriofagi. Relaii bacteriofag-bacterie ntre bacteriofag i bacteria gazd se pot stabili dou tipuri de relaii: - de tip litic sau productiv (Figura nr. 15); - de lizogenizare sau de tip reductiv (Figura nr. 16). Relaiile sunt strict specifice i sunt mediate de receptori. Ciclul litic are mai multe etape i anume: 1. Adsorbia: Ataarea este specific. Exist receptori strict specifici la nivelul bacteriofagului, ce recunosc receptori de la nivelul bacteriei. Fixarea pe receptori este iniial reversibil (prin fibrele cozii), apoi ireversibil (prin croetele plcii bazale). Adsorbia fagic modific permeabilitatea membranei citoplasmatice bacteriene. 2. Penetrarea: Fagul elibereaz muramidaza care lizeaz mureina din peretele bacterian. Teaca cozii se contract i antreneaz cilindrul axial prin peretele bacterian, ducnd apoi la injectarea ADN-ului fagic n citoplasma bacterian; 3. Multiplicarea: Dup aproximativ 4-5 minute, funcia ADN-ului bacterian este blocat i preluat de ADN-ul fagic ce coordoneaz sinteza componentelor proprii. Se sintetizeaz un numr nsemnat de proteine virale. 4. Maturarea (ansamblarea) fagului 5. Liza bacteriei (ex. datorit sintezei unor enzime asemntoare lizozimului) i eliberarea bacteriofagului matur, virulent. Bacteriile lizosensibile permit adsorbia, penetrarea i multiplicarea fagilor viruleni pn la realizarea lizei celulei bacteriene. Evidenierea ciclului litic la nivelul culturilor bacteriene n mediu lichid (tulbure), inocularea fagului litic corespunztor duce dup cteva zeci de minute (uneori chiar i cteva zile) la limpezirea mediului; pe mediu solid, nsmnat uniform, inocularea fagului litic duce la apariia unei zone de liz, clar, bine circumscris (spotul de bacteriofagie), metod utilizat n lizotipie; dac se amestec o suspensie de fagi cu o pictur de cultur (pur) bacterian, iar tulpina respectiv are receptori potrivii bacteriofagilor i aceast suspensie se amestec cu geloz nclzit putem transfera suspensia ntr-o plac Petri; bacteriofagii infecteaz bacteriile; dup circa 30 minute bacteriile sunt lizate i elibereaz fagii; acetia difuzeaz prin geloz i infecteaz bacteriile situate n apropiere i ciclul se reia; o parte dintre bacterii (cele care nu au receptori potrivii) nu sunt infectate i n timp se multiplic iar cultura bacterian opacizeaz mediul; dup circa 18-24 de ore putem observa arii cu celule lizate (transparente) pe un fond produs de cultura bacterian (bacterii nelizate), aceste 59

arii numindu-se plaje de bacteriofagie; plajele produse de bacteriofagii viruleni sunt clare, n comparaie cu plajele mai puin clare produse de bacteriofagii temperai (fagii viruleni sunt acei bacteriofagi care nu pot evolua dect n ciclul litic) Ciclul reductiv (de lizogenizare) are aceleai etape, iniial. Dup adsorbie i penetrare, ADN-ul fagic: fie se integreaz liniar n cromozomul bacteriei gazd i se replic sincron cu aceasta, fie se circularizeaz i ataat de membrana citoplasmatic se replic sincron cu diviziunea bacteriei. Bacteria a devenit lizogen, se reproduce i transmite descendenilor fagul latent (profag, fag temperat). n anumite condiii profagul poate deveni fag virulent. Fagul temperat cel mai bine studiat este bacteriofagul Lambda specific pentru E. coli capsulat (K12). Proprietile bacteriei lizogene: 1. este imun fa de un fag omolog profagului; 2. pot aprea fenomene importante din punct de vedere genetic: transducia; conversia genetic (cu producerea de exotoxine de ctre unele bacterii lizogenizate, cum ar fi toxina difteric, toxina scarlatinoas, toxina botulinic de tip C etc); recombinarea genetic (atunci cnd o bacterie parazitat de doi fagi diferii, dar nrudii, elibereaz la sfritul ciclului litic pe lng tipurile parentale i tipuri de fagi care nsumeaz unele din proprietile celor doi fagi parentali) etc.; inducia fagic (sub influena unor ageni inductori, de ex. raze UV, sau spontan, profagul i rectig virulena, devine fag virulent, i produce liza bacteriei respective). Bacteriile lizorezistente nu permit infecia cu un fag fie datorit lipsei receptorilor specifici, fie datorit unei stri de imunitate. Bacteriile lizogene sunt imune la fagii viruleni omologi profagului gzduit. Fagul defectiv reprezint profagul care persist indefinit n stare latent (nu se reactiveaz). Aplicaii practice ale fenomenului de bacteriofagie: fagii viruleni sunt un element de echilibru ecologic n mediul natural de via al bacteriilor (n nia ecologic respectiv); fagii temperai pot avea un rol deosebit n reasortarea materialului genetic al bacteriilor, ntruct atunci cnd se detaeaz (inducie) de cromozomul bacterian pot antrena poriuni din ADN-ul bacterian; fagii se pot folosi pentru a descoperi gradul de poluare a apelor (datorit specificitii relaiei fag-bacterie); anumite mutante ale fagilor se folosesc n ingineria genetic drept vectori ai ADN recombinant (ex. fagii Charon Lambda); fagii reprezint un model pentru studii teoretice i practice privind virusurile i oncogeneza, precum i alte aspecte ale biologiei moleculare; s-au evideniat tipuri fagice (lizotipuri) pentru tulpini bacteriene care biochimic i antigenic par identice. Lizotipia (stabilirea sensibilitii la un anumit tip fagic) este una dintre cele mai fine

60

metode de diagnostic bacteriologic i epidemiologic, pentru identificarea lanurilor de transmisie a germenilor i pentru determinarea originii unei epidemii. 4. 3. Povestiri adevrate 4. 3. 1. Epidemia de holer din Peru - Legend urban n 1991, n Peru, a izbucnit o epidemie de holer. Boala nu este foarte frecvent pe continentul american, motiv pentru care iniial a fost dificil stabilirea cauzelor. Situaia a aprut oarecum n paralel cu o dezbatere public ce avea loc n SUA cu privire la raportul risc / beneficii adus de clorinarea apei. Dintre istoriile adevrate aceasta ca i istoria epidemiei de difterie n fostele state sovietice arat ct de mult poate fi influenat sntatea public de ctre dezbateri, de ctre mass-media etc (de multe ori n mod negativ). Este cunoscut faptul c prin clorinarea apei, pe lng efectul de distrugere a unor microorganisme ar putea s apar i fenomene nedorite, datorit apariiei unor produi de tipul trihalometanului. n USA se discut foarte mult despre efectul cancerigen al acestei substane. Diveri oficiali americani, avnd se pare relaii n industria chimic, i care doreau ca metoda clorinrii s rmn cea mai important metod de antiseptizare a apei, au folosit mult vreme exemplul acestei epidemii pentru a demonstra ce se poate petrece dac clorinarea apei va fi stopat. Pornind de la date reale (epidemia de holer) dezbaterile au ajuns s prezinte o situaie foarte diferit (numeric) ajungndu-se s se discute de 1,3 milioane de cazuri de holer soldate cu peste 11.000 de decese. n aceste dezbateri s-a afirmat c pentru a preveni apariia unui numr foarte mic de cancere (ipotetice) s-a precipitat apariia unui numr extrem de mare de cazuri de holer i respectiv a unui enorm numr de decese datorate infeciei cu Vibrio cholerae. A fost criticat i aa-zisa Teorie a precauiei, principial corect, bazat pe urmtoarele idei generice: a. stabilete un el n cadrul unui proces decizional deschis, care s se adreseze tuturor celor implicai; b. analizeaz toate modalitile de a realiza ceea ce i propui i alege varianta care va conduce la cele mai puine efecte nedorite; c. dac nu eti sigur de calea pe care vrei s o urmezi, asigur-te c o alegi pe aceea care creeaz cele mai mici probleme mediului, sntii publice, comunitii n general; d. monitorizeaz rezultatele i asigur-te c iei msuri rapide de remediere, n cazul n care ar aprea o problem i e. consult-te n permanen cu cei asupra crora vor avea un efect msurile pe care le-ai stabilit. Totui, nu aplicarea greit a teoriei a fost cea care a provocat epidemia de holer. n final, reprezentani oficiali din Peru au afirmat c au decis s aplice clorinarea intermitent i nu continuu din motive economice (pre prea mare pentru clorinarea continu) i nu au fost influenai de teoria precauiei; nu au luat n calcul riscul apariiei cancerului. Investigaia epidemiologic realizat mpreun cu colegii de la CDC a demonstrat c epidemia de holer a avut o cauzalitate multipl, factorii cei mai importani fiind reprezentai de: a. clorinarea intermitent a apei; b. diferite branamente ilegale sau amatoristic fcute la linia de aprovizionare cu ap a oraului; c. conectarea instalaiilor ilegale de irigaie la liniile de aprovizionare cu ap potabil; d. perioade lungi n care apa a avut o presiune sczut sau nu a existat presiune deloc, situaii n care colonizarea i multiplicarea bacterian este favorizat; e. depozitarea apei potabile n butoaie, n condiii neigienice sau la limit i f. lipsa unor

61

canalizri construite corespunztor, care au permis refularea apei din zonele poluate n reeaua de ap potabil etc. Cu toate c la baza acestei epidemii au stat mai muli factori, cel mai important dintre acetia a fost lipsa clorinrii (antiseptizrii) corespunztoare a apei potabile. Datele reale cu privire la aceast epidemie sunt prezentate succint la punctul 44. 8. 2. 4. 3. 2. Epidemia de holer din Dhaka - bacteriofagii Holera se transmite cel mai frecvent prin consumul de ap contaminat cu tulpini de Vibrio cholerae, n special n zonele cu educaie sanitar precar. Datele epidemiologice i de mediu obinute n urma unei izbucnirii epidemice (outbreak) de holer n Bangladesh, au sugerat rolul bacteriofagului litic specific pentru V. cholerae, care ar putea limita gradul de severitate al epidemiei prin efectul de distrugere a bacteriilor prezente n sursele de ap contaminat, sau chiar i n cazul unor persoane infectate. Au fost emise dou ipoteze privind rolul potenial al bacteriofagilor specifici: a. n cadrul relaiei bacterie-bacteriofag, bacteriofagii lizeaz un numr mare de bacterii, ulterior densitatea bacteriofagilor scade i la un moment dat bacteriile se pot multiplica exponenial i densitatea bacterian atinge nivelul la care pot determina o izbucnire epidemic (severitatea izbucnirii epidemice va fi cu att mai mare cu ct densitatea bacteriofagilor rmai n sursele de ap contaminate este mai mic); b. dac izbucnirea epidemic este datorat multiplicrii bacteriene, necorelat cu diminuarea densitii fagice, introducerea bacteriofagilor n sursele de ap ar putea reduce amploarea izbucnirii epidemice i ar putea duce chiar i la declinul acesteia. n ambele situaii amploarea efectului bacteriofagilor depinde de balana care se stabilete ntre rata de multiplicare a vibrionilor i de rata de distrugere a fagilor. n timpul izbucnirii epidemice din Dhaka, Bangladesh, au fost cuantificate: a. incidena infeciilor, b. densitile tulpinilor de V. cholerae implicate (serotipul O1, rezistent la streptomicin) i c. concentraiile bacteriofagilor litici specifici pentru aceast tulpin (JSF4), att n scaunul pacienilor spitalizai ct i n rezervoarele de ap potabil. Studiul a fost posibil pentru c implica o singur tulpin, a crei densitate a putut fi uor monitorizat prin susceptibilitatea/rezistena la streptomicin. Pe baza observaiilor n dinamic, studiul a sugerat c infeciile sunt cauzate de consumul de ap dintr-un rezervor comun, n care bacteria i fagul se reproduc i interacioneaz independent de populaia uman. Iniial, schimbrile temporare climaterice au creat condiiile unei descreteri a concentraiei fagice, cu o multiplicare exponenial a vibrionilor n sursele de ap. Populaia a nceput s se infecteze consumnd apa respectiv, s-a creat un cerc vicios de multiplicare bacterian n rezervor prin recontaminarea rezervorului datorit igienei precare i astfel epidemia s-a amplificat. Dup un timp producia de fagi a nceput s creasc, datorit concentraiei mari de vibrioni din rezervor i n persoanele infectate. Amplificarea densitii fagice a dus la un declin al densitii bacteriene i respectiv la scderea numrului de persoane infectate, pn la dispariia cazurilor. Studiul (a fost realizat i un model matematic foarte interesant) a sugerat i posibilitatea ca fagul s se dezvolte iniial n gazdele infectate cu V. cholerae, i abia apoi s ajung n rezervor (datorit lipsei de igien). Aceast amplificare (numeric i funcional) a bacteriofagilor ar putea reprezenta o important component n prevenirea / controlul epidemiilor de holer. 62

5. Genetica bacterian (Gabriela Loredana Popa)


5. 1. Suportul ereditii Genetica bacterian studiaz ereditatea i variabilitatea la bacterii. Suportul material al ereditii este reprezentat de ADN (acidul dezoxiribonucleic). Molecula de ADN conine codificat informaia ereditar, care se exprim prin sinteza unor proteine i se transmite prin replicare i diviziune la descendeni. Gena reprezint unitatea funcional a ereditii iar noiunea de gen este cunoscut nc din anul 1909. Dac nu au loc modificri genetice, toi descendenii unei bacterii vor fi identici cu bacteria mam i identici ntre ei. O celul bacterian inoculat pe un mediu de cultur (avnd la dispoziie nutrienii necesari) va produce prin multiplicare n condiii prielnice (de pH, temperatur, umiditate etc.) o colonie bacterian, o clon. Materialul genetic al unei celule bacteriene poate fi modificat fie prin incorporarea unui fragment de material genetic exogen (prin procesul de recombinare genetic), fie prin apariia spontan sau indus a unei mutaii care poate consta n adugarea, pierderea, substituirea sau inversarea ordinii unor baze n secvena ADN-ului. Structura acidului dezoxiribonucleic ADN-ul este un macropolimer de dezoxirbonucleotide. Unitatea structural este format dintr-o baz azotat purinic (adenina, A; guanina, G) sau pirimidinic (timina, T; citozina, C), o pentoz (dezoxiriboza) i acid fosforic. Legturi fosfodiester unesc carbonul 5 al unei molecule de dezoxiriboz cu carbonul 3 al moleculei adiacente, formnd o caten lung polinucleotidic. Prin analiza compoziiei n baze azotate a ADNului (provenit din surse diferite) s-a demonstrat c exist o anumit compoziie care difer la diversele specii. Compoziia de nucleotide a ADN-ului este surprinztor de variabil. Suma procentual a citozinei i guaninei variaz la bacterii de la 22% pn la 74%, n timp ce la organismele eucariote intervalul este ceva mai restrns (28 - 58%). La om variaz ntre 39-40% n funcie de tipul de esut (timus 39%; ficat 39,4%). Acest fapt se explic prin evoluia n decursul a mai multor mii de ani a procariotelor comparativ cu a eucariotelor n general i a omului n particular. Comparaiile coninutului de C+G ale diferitelor organisme i microorganisme au fost folosite drept fundament n vederea stabilirii relaionrii/legturii genetice. Timina fiind susceptibil la alterri fotochimice (lumin UV), bacteriile cu un coninut bogat de C+G este posibil s fi evoluat n medii supuse unei lumini solare foarte puternice sau unor temperaturi nalte, iar cele cu coninut redus de C+G s-ar fi dezvoltat n locuri mai protejate. Aadar, compoziia n baze azotate, numit i procentul de C+G, este diferit n funcie de specie, dar se pstreaz constant n cadrul unei anumite specii. Procentul de C+G se calculeaz dup formula: (C+G)/ (C+G+A+T). De exemplu acest raport difer la diferitele specii bacteriene, sper exemplu este 26,8% la Clostridium perfringens, 40% la Streptococcus pneumoniae, 40,5% la Proteus vulgaris, 51,7% la Escherichia coli, 53% la Proteus

63

morgani i67% la Pseudomonas aeruginosa. Aa cum a fost precizat de ctre diveri autori, compoziia de baze azotate este un index taxonomic. (1) La celulele procariote ADN-ul este inelar, mpachetat n nucleoidul din citoplasm. La bacteria intestinal E. coli cele 4,7 milioane de perechi de baze alctuiesc o macromolecul de 1,4 milimetri lungime, dar numai 2 nanometri lime. Aceasta conine 4.400 de gene deja secveniate. n ciuda lungimii sale, de peste o mie de ori diametrul celular, ADN-ul este extrem de bine nfurat n nucleoid, n aproximativ jumtate din diametrul celular. ADN-ul apare ca o macromolecul format din dou catene polinucleotidice antiparalele i complementare rsucite n dublu helix. Cele dou catene sunt unite prin puni de hidrogen formate ntre bazele azotate opuse (A=T i GC). Modelul structural al ADN-ului a fost propus de ctre Watson i Crick n anul 1953. Complementaritatea bazelor azotate este cea mai important proprietate a acizilor nucleici i condiioneaz toate proprietile ADN-ului, mai ales cea de autoreplicare i cea de transfer al informaiei genetice. Rolul genetic al ADN-ului a fost dovedit prin experiene succesive, iniial prin cercetrile lui W. Griffith (1928) privind fenomenul de transformare bacterian, ulterior prin experiene care au confirmat rezultatele obinute de Griffith, dar abia n 1944 Avery, MacLeod i Mc Carthy demonstreaz faptul c ADN-ul este substratul chimic al ereditii i reprezint materialul genetic al oricrei celule (funcie ndeplinit aa cum tim astzi de ARN, la ribovirusuri). La temperatura camerei ADN-ul este o structur stabil n condiii fiziologice normale, datorit legturilor intercatenare (2 ntre A i T i 3 ntre C i G). Dac temperatura depete 65C, stabilitatea punilor de hidrogen ncepe s cedeze, dublul helix ncepe s se desfac i rezult dou catene complementare (proces numit denaturare termic). Denaturarea devine complet la temperaturi care depesc valoarea de 90C. Renaturarea (reannealing) reprezint refacerea structurii bicatenare a ADN-ului, iar prin acest proces se poate stabili relaia filogenetic ntre dou specii (n funcie de procentul de renaturare). De exemplu dac se utilizeaz ADN denaturat provenit de la E. coli i ADN denaturat provenit de la Salmonella spp., fiecare marcat cu acelai izotop (ex. C14), fraciunea de ADN marcat i evaluat prin diferite tehnici va fi fraciunea din ADN care este complementar pentru cele dou specii (aceste experiene au stat la baza brevetrii tehnicilor de hibridare molecular). Renaturarea este un proces mai lent dect denaturarea. Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice importante, folosite fie n tehnologia ADN-ului recombinant, fie n studierea relaiilor filogenetice ntre diferite specii. Cu ct speciile sunt mai nrudite, cu att secvenele de baze azotate au un mai mare grad de similitudine (lanurile lor monocatenare renatureaz mai rapid). Genom. Genotip. Fenotip Genomul reprezint suma genelor unui organism. Totalitatea informaiei genetice a unui organism se numete genotip. Suma caracterelor observabile, specifice unui organism, produse de genotip n interaciune cu mediul ambiant se numete fenotip. Funciile ADN-ului ca material genetic sunt: - conservarea informaiei genetice; 64

- replicarea; - transcrierea i traducerea materialului genetic; - protejarea materialului genetic propriu (self); - reglarea i controlul activitii celulare. Transmiterea mesajului genetic la bacteriile descendente Transmiterea mesajului genetic se face prin dublarea cantitii de material genetic urmat de diviziune. Replicarea ADN const n sinteza unor noi molecule de ADN, identice cu molecula parental i identice ntre ele, pe baz de complementaritate (replicare semiconservativ). Dup ruperea legturilor de hidrogen i separarea celor 2 catene, fiecare caten servete drept matri pentru sinteza unei noi catene. Replicarea ADN este una dintre cele mai importante reacii din lumea vie. Watson i Crick au fost primii care au propus modelul semiconservativ de replicare a ADN. n celula care se dezvolt rapid, exist posibilitatea ca nainte de terminarea primei replicri s se iniieze nc o replicare. n acest caz celula bacterian va putea fi merodiploid (doar anumite regiuni cromozomiale sunt copiate de mai multe ori dect n mod normal) sau chiar poliploid (tot cromozomul a fost copiat de mai multe ori dect n mod normal). n general, dac replicarea cromozomial nu este succedat de diviunea celulei (aa cum se ntmpl n mod obinuit), putem remarca n celula bacterian existena cromozomilor supranumerari. Cromozomii suplimentari (n total 2 sau 4) nu aduc o informaie genetic diferit, pentru c ei reprezint copii ale cromozomului iniial (deci sunt identici cu acesta). Repliconul (Jacob, Brenner, Cuzin) In vivo se pot replica numai moleculele de ADN constituite ntr-o unitate de replicare independent numit replicon. Indiferent dac celula are mai muli cromozomi (celula eucariot este diploid) sau un singur cromozom (celula procariot), tot genomul trebuie s fie replicat. Repliconul bacterian este bicatenar i circular, caracterizat prin: - o secven nucleotidic specific marcnd nceperea replicrii; - gene care codific sinteza unor proteine specifice numite iniiatori; - o secven nucleotidic semnal pentru terminarea replicrii. Exemple de repliconi: - cromozomul i plasmidele bacteriene; - genomul bacteriofagilor. Cromozomul bacterian este unul dintre cele mai ilustrative exemple de repliconi. O gen structural din cromozom are toat informaia necesar sintezei iniiatorului replicrii (o protein complex). Dup ce replicarea a nceput, nu mai poate fi oprit pn n momentul cnd se ajunge la dedublarea cromozomului. Cromozomul bacterian funcioneaz ca un replicon, fapt dovedit de experiena n care fragmentele de ADN introduse ntr-o celul bacterian (de ex. prin conjugare) nu se pot replica dac rmn libere n citoplasm, dar vor putea fi replicate odat cu ntregul cromozom n cazul n care sunt integrate n cromozomul bacterian. 65

Replicarea corect este controlat de un mecanism foarte precis care identific apariia de nucleotide libere, mperecheate eronat i n momentul apariiei unui astfel de eveniment nucleotidul este tiat iar polimerizarea se oprete (corectitudinea citirii este realizat cu ajutorul ADN-polimerazei I). 5. 2. Hibridizarea acizilor nucleici Reacia de hibridizare a acizilor nucleici se poate realiza datorit complementaritii nucleotidelor (structura primar). Prin aceast tehnic se poate demonstra nrudirea sau eventual identitatea a dou microorganisme, pe baza gradului (procentului) de omologie a secvenelor nucleotidice. Din punct de vedere tehnic, cultivm o bacterie de referin (cunoscut) n aa fel nct s putem marca ADN-ul cromozomial (ns uneori aceste experiene se fac prin marcarea ADN-ului plasmidic). Spre exemplu, o variant poate fi reprezentat de cultivarea n mediu cu timidin tritiat, astfel nct rezult marcarea radioactiv a ADN-ului cu tritiu. ADN-ul extras din fiecare microorganism este tratat pentru a obine fragmente monocatenare. ADN-ul dublu catenar se reface, dac fragmentele de ADN (int) ale bacteriei testate au secvene nucleotidice complementare cu fragmentele ADN (sond molecular) de referin. Cu ct gradul de complementaritate dintre sonda molecular i int este mai mare, cu att structura hibrid format va fi mai stabil i mai greu de disociat. Actualmente sondele moleculare sunt sintetizate chimic sau enzimatic. Utilitatea hibridizrii acizilor nucleici Aceast tehnic se utilizeaz n taxonomia microbian i st la baza funcionrii sondelor nucleotidice, care depisteaz rapid i cu foarte mare sensibilitate microorganisme sau numai unii determinani genetici ai acestora. Un alt aspect important este reprezentat de specificitatea sondei utilizate. Se apreciaz, c pentru a elimina riscul unei hibridizri ntmpltoare, sonda nucleotidic ar trebui s aib cel puin 20 nucleotide.

5. 3. Amplificarea genetic conceptul amplificrii cantitii de acizi nucleici a fost introdus n 1983 de ctre Mullis, dar anul 1955, odat cu descoperirea ADN polimerazei I, a reprezentat un moment crucial. Folosind ADN-polimeraza i dou secvene scurte de ADN (oligonucleotide, primeri), s-a pus la punct un test repetitiv de sintetizare a ADN-ului care a fost numit Reacia de polimerizare n lan (Polymerase Chain Reaction, PCR). ADN-polimeraza este capabil s conduc la sinteza unui al doilea lan de ADN, ntotdeauna orientat 5-3, folosind ca substrat patru nucleotide trifosfat, un lan de ADN ca matrice (model) i un fragment scurt de ADN complementar utilizat drept primer (amors). Pentru un lan polinucleotidic, vom utiliza de fapt doi primeri, care sunt complementari pentru dou secvene specifice i diferite ale ADN-ului int. Iniierea sintezei de ADN va putea avea loc numai dup ce ADN-ul dublu catenar este denaturat (termic). Urmeaz o etap de rcire, permind astfel ataarea primerilor (care sunt furnizai n exces) de fragmentele de ADN complementar. Sinteza de ADN mediat de ADN-polimeraz va produce dou molecule dublu catenare. Dac procesul se repet, vor rezulta patru molecule de 66

ADN. ADN-ul se multiplic exponenial (dublndu-se de fiecare dat) ori de cte ori se repet reacia. Teoretic, PCR poate amplifica un fragment scurt de ADN pornind de la o singur molecul la 1.000 de copii, dac procesul se repet de 10 ori i la circa un milion de copii, dac procesul se repet de 20 de ori. Acest proces poate avea loc automat ntr-un aparat numit termociclor; aparatul repet ciclul constnd n denaturarea prin cldur (la 94-96C), ataarea primerilor (la 40-60C) i sinteza ADN-ului (la 65-75C), folosind ADN-polimeraza termostabil (Taq-polimeraza) izolat de la o bacterie, care triete n izvoarele termale din Yellowstone National Park, Thermus aquaticus. Aplicaiile tehnicii de amplificare genetic PCR a nceput s fie aplicat n numeroase domenii ale cercetrii medicale fundamentale. Succesul depinde de puritatea sursei de ADN, precum i de metoda de extragere i de recuperare a ADN-ului. Datorit sensibilitii extrem de mari a procesului, contaminarea datorat manipulrii produselor de amplificare PCR obinute anterior n acelai laborator poate reprezenta o problem deosebit de serioas. Contaminarea se poate realiza fie ntre probe, n timpul desfurrii protocolului de lucru, fie datorit diferitelor manipulri. Prima variant este mai uor de evitat, astfel nct sursa major de contaminare n laboratorul de biologie molecular rmne eventuala contaminare a reactivilor. Verificarea acestei posibile erori este obligatorie pentru orice reacie PCR, printr-o reacie de control (control negativ) la care nu se adaug ADN. Aceast problem a contaminrii nu este superpozabil cu cea a rezultatelor fals pozitive. O contaminare ntre probe este mult mai dificil de identificat. Principalele msuri de precauie ar fi reprezentate de: utilizarea unor camere de lucru separate pentru manipularea produselor care conin ADN i respectiv pentru prepararea celorlali reactivi, folosirea micropipetelor (dou seturi de micropipete, pentru produse cu i fr ADN), utilizarea conurilor cu filtru, lucrul ntr-o ni special amenajat i dotat cu hot cu flux laminar de aer. Recent s-a demonstrat faptul c lumina ultraviolet are capacitatea de a inactiva ADN-ul dublu catenar contaminant. Alte modaliti de a elimina (diminua) riscurile contaminrii sunt reprezentate de: includerea unei nucleotide modificate n PCR (nlocuirea deoxiuridinei-P cu deoxitimidin-3P) i respectiv folosirea enzimelor de restricie pentru ndeprtarea ADN-ului contaminat din RT-PCR (transcriere invers). Utilizarea PCR n diagnosticul bolilor infecioase PCR poate fi util n diagnosticul bolilor virale, bacteriene, fungice sau parazitare. n infecia cu HIV, PCR i-a dovedit utilitatea att n diagnostic (secvenele HIV-1 sunt detectabile n 100% din cazuri atunci cnd virusul este cultivabil i n 64% din cazuri n situaia unor culturi negative), ct i n stabilirea prognosticului. n cazul infeciilor cu citomegalovirus (CMV), PCR poate detecta ADN viral n snge cu 7-10 zile mai devreme dect sunt identificate antigenemia sau viremia. n mod asemntor, PCR este util n identificarea altor ageni etiologici (n contextul general epidemiologic, clinic i paraclinic) precum virusurile hepatitei B i C, virusurilor papilloma, herpes virusurilor sau a unor enterovirusuri. Diagnosticul infeciilor bacteriene poate beneficia de asemenea de tehnicile moleculare prin amplificare genic. Actualmente sunt puse la punct protocoalele de lucru utile identificrii 67

agenilor etiologici ai tusei convulsive (Bordetella pertussis), legionellozei (Legionella pneumophila), pneumoniei atipice (Mycoplasma pneumoniae), tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis), proceselor inflamatorii pelviene (Chlamydia trachomatis), gonoreei (Neisseria gonorrhoeae), sifilisului (Treponema pallidum), meningitei (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis), gastritelor i ulcerului (Helicobacter pylori), febrei tifoide (Salmonella typhi), dizenteriei bacteriene (Shigella dysenteriae), septicemiei cu E. coli (enterotoxigen), bolii Lyme (Borrelia burgdorferi), leprei (Mycobacterium leprae) etc. Dac n cazul majoritii bolilor enumerate exist alternative bacteriologice sau imunologice clasice decisive, atunci cnd sunt implicate microorganismele aparinnd genului mycobacterium (Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae) se ridic anumite probleme. n tuberculoz, agentul etiologic se izoleaz relativ dificil din produsele patologice, se multiplic lent, coloniile vizibile aprnd pe mediile de cultur dup 2-8 sptmni, iar testele necesare identificrii fenotipice clasice necesit 2 -6 sptmni suplimentare i nu au relevan n 100% din cazuri. Pe de alt parte, Mycobacterium leprae nu se multiplic pe nici un tip de mediu de cultur. Cu alte cuvinte, aplicarea unor metode sensibile i specifice este foarte necesar. Sunt puse la punct protocoalele de lucru PCR utile n scopul diagnosticrii infeciilor grave produse de Candida albicans, pneumoniei la pacieni imunodeprimai (Pneumocystis carinii), meningitei cu Cryptococcus neoformans sau al unor infecii cu Coccidioides immitis (ex. la persoane infectate cu HIV), pentru a enumera cteva din aplicaiile biologiei moleculare n domeniul afeciunilor produse de fungi. n domeniul parazitologiei, exemplele cele mai bine cunoscute sunt legate de diagnosticul dizenteriei amoebiene (Entamoeba histolytica), altor diarei de origine parazitar (de exemplu, cele produse de Giardia lamblia), malariei (Plasmodium falciparum) sau diagnosticul toxoplasmozei (Toxoplasma gondii). Actualmente s-au pus la punct i alte metode de amplificare genetic utile n diagnosticul sau n identificarea agenilor etiologici ai maladiilor transmisibile. n mod suplimentar dorim s menionm faptul c dac iniial tehnicile de baz ale biologiei moleculare (hibridizarea molecular, utilizarea sondelor nucleotidice marcate radioactiv sau neradioactiv, amplificarea genic) erau utilizate individual, majoritatea protocoalelor de lucru actuale cuprind combinaii de tehnici, din ce n ce mai complexe i mai subtile. Pe de o parte, exist i o ntreg serie de variante tehnice ale reaciei de amplificare genic, de ex. Invers-PCR (pentru amplificarea unei regiuni la care nu este cunoscut secvena, dar zonele nvecinate au secvene cunoscute); LCR (ligase chain reaction) n care este necesar s cunoatem integral secvena ADN-ului int; RTPCR (PCR nainte de care are loc o revers-transcriere, pornind de ex. de la ARNm i obinnd ADNc); Nested PCR (n care are loc o amplificare dubl a acidului nucleic folosind 2 perechi de primeri diferii) etc. Pe de alt parte, tehnica PCR este utilizat din ce n ce mai frecvent ca o completare esenial a unei alte tehnici (de exemplu RFLP, restriction fragment length polymorphism; SSCP-PCR; DRE-PCR, double repetitive element PCR; DRV-PCR, direct variable repeat-PCR; UP-PCR, single universal primer-PCR; spoligotyping etc). 5. 4. Organizarea genomului bacterian Plasmidele Genomul bacterian este alctuit din dou categorii de determinani genetici: 68

1. genele eseniale, localizate n structura cromozomului bacterian i 2. genele accesorii extracromozomale prezente n structura: - plasmidelor i - elementelor genetice transpozabile. Plasmidele sunt elemente genetice extracromozomiale, capabile de replicare fizic independent de cromozom (replicon), dar depinznd de factori codificai de nucleul bacterian. Conin informaie genetic neesenial pentru viaa celulei bacteriene. Sunt transmise stabil de-a lungul generaiilor. Dimensiunea plasmidelor variaz ntre 1kb i circa 200 kb. Majoritatea sunt alctuite din molecule de ADN circular, dar exist i plasmide liniare (ex. la Borrelia burgdorferi). Unele plasmide sunt ADN dublu catenar, dar exist i plasmide de ADN monocatenar (se consider c plasmidele de ADN monocatenar reprezint de fapt o situaie intermediar n cursul procesului de replicare; au fost detectate de ex. la Staphylococcus aureus). Unele plasmide (numite i epizomi) pot exista alternativ n stare autonom (libere n citoplasm) sau integrate n cromozomul celulei gazd (de exemplu factorul F, bacteriofagul temperat etc). Celelalte plasmide persist indefinit numai n stare autonom (de exemplu plasmida R, Col, F etc). Clasificarea plasmidelor n raport cu caracterele exprimate fenotipic, plasmidele se pot clasifica n: 1. plasmide care codific rezistena la ageni antibacterieni: - factorii R (primul factor R a fost izolat de la o tulpin de Shigella dysenteriae); - plasmidele de rezisten la UV etc. 2. plasmide care codific sinteza unor ageni antimicrobieni: - factorii Col (conferind capacitatea de producere de colicine cu activitate antibiotic) etc. 3. plasmide de patogenitate care codific sinteza de: - hemolizine; - factori de colonizare; - enterotoxine sau alte exotoxine etc. 4. plasmide care codific enzime ale unor ci metabolice particulare: - n anumite condiii, unele bacterii pot utiliza ca surs de C diferite substane cu potenial toxic, precum octanul sau toluenul, iar plasmidele care permit supravieuirea i dezvoltarea n aceste condiii se numesc plasmide degradative; 5. plasmide care permit transferul genelor cromozomiale de la o celul care deine respectivul plasmid (F) la alta, putnd fi transmis inclusiv plasmidul (factorul) F; 6. plasmide criptice, pentru care nu se cunosc caracterele fenotipice exprimate. Plasmidele R

69

Plasmidele R (de rezisten la antibiotice) confer celulei purttoare rezistena la unul sau la mai multe antibiotice. Plasmidele R au o structur genetic complex, fiind alctuite din: - gene care asigur proprietatea de rezisten la antibiotice; - gene care formeaz factorul de transfer al rezistenei (RTF). Asigur capacitatea de replicare autonom i de transfer prin conjugare (cele dou tipuri de elemente pot exista independent sau se pot asocia). Transferul plasmidelor R se poate face prin conjugare bacterian sau prin transducia mediat de bacteriofagi. Plasmidele Col Plasmidele Col codific proprietatea unor bacterii de a elabora substane antibiotice de tip special, numite bacteriocine (colicine, pesticine, vibriocine, piocine etc). Plasmidele Col sunt transferabile de la tulpinile Col+ la tulpini Col- prin transformare genetic, transducie fagic sau prin conjugare. Bacteriocinele sunt bactericide, au un spectru de activitate limitat (fa de specia omolog), iar biosinteza lor nu are efect letal pentru specia productoare. Factorul F (factorul de sex, factorul de fertilitate) Factorul F controleaz capacitatea unor bacterii de a aciona ca donoare de material genetic n procesul de conjugare. Factorul F codific structurile (de exemplu pilul F) i enzimele necesare transferului de ADN. n funcie de prezena plasmidelor F, de raportul lor cu cromozomul bacterian i de modul n care faciliteaz transferul de material genetic, bacteriile se pot grupa n patru categorii distincte: bacterii F-; bacterii F+; bacterii Hfr; bacterii F. Bacteriile FBacteriile F- sunt lipsite de factorul F. Sunt echivalente unor celule femele care se comport ca receptoare de material genetic. Bacteriile F+ Bacteriile F+ dein factorul F autonom n citoplasm. Sunt echivalente unor celule masculine, donoare de material genetic, capabile s transmit factorul F. Bacteriile Hfr (High frequency of recombination) Bacteriile Hfr (cu mare frecven de recombinare) dein factorul F integrat n cromozomul bacterian. Se comport ca donoare de material genetic, au o mare frecven de conjugare i recombinare. De obicei prezena factorului F integrat determin transferul unui numr variabil de gene cromozomale i mai rar, chiar transferul factorului F. Bacteriile F Bacteriile F dein o structur plasmidic de tip special (factor de fertilitate recombinant) care a fost anterior integrat n structura unui cromozom i s-a desprins din acesta, ncorpornd n structura sa unele gene cromozomale. Aceste bacterii au caracter de mascul i se comport ca donoare de material genetic (factorul F).

70

Elemente genetice transpozabile O anumit secven specific de ADN constituie un element genetic transpozabil dac i menine integritatea fizic, structural i genetic, funcional n cursul translocaiei de la o poziie la alta n acelai genom, replicon (intramolecular) sau n genomuri diferite (intermolecular). De obicei fenomenul de transpoziie poate avea loc la nivelul oricrui replicon, la ntmplare, dar exist i situaii n care un transpozon are anumite zone specifice unde se va insera (zone calde). Pe baza complexitii lor, elementele care ndeplinesc aceast condiie se pot grupa n trei categorii: - secvene de inserie (IS); - transpozoni (Tn); - bacteriofagi. Secvenele de inserie (IS) Secvenele de inserie nu conin nici o gen i nu au nici o alt funcie (cunoscut) n afar de cea de inserie. Sunt cele mai simple elemente transpozabile. Dup inseria lor pot aprea modificri n expresia unor gene sau modificri n rata incidenei deleiilor n regiunile adiacente situsului lor de inserie. Exist anumite secvene de inserie care au intrat n istoria practic medical datorit importanei n diagnosticul anumitor afeciuni. De ex. IS6110 se ntlnete n una sau mai multe copii n genomul Mycobacterium tuberculosis i poate fi pus n eviden prin reacia PCR pornind fie de la cultur, fie chiar i de la produsul patologic, permind un diagnostic mai rapid. Transpozonii (Tn) Transpozonii difer de secvenele de inserie prin complexitate i prin faptul c poart gene care confer bacteriilor funcii noi, detectabile, de exemplu: - rezistena la antibiotice; - capacitatea de sintez a unor enzime; - producerea de enterotoxine; - sinteza antigenelor bacteriene de suprafa (de exemplu K88 la E. coli); - sinteza unor factori de colonizare intestinal etc. Exist transpozoni compui, care pe lng funcia de transpoziie includ i o serie de determinani genetici i transpozoni compleci. Dintre acetia din urm, transpozonul Tn3 a fost identificat la o tulpin de E. coli. El codific 3 elemente: tnpA- cu activitate de transpozaz, rezolvaza tnpR i beta-lactamaza (produsul genic notat bla) cu activitate beta-lactamazic. Bacteriofagii Spre exemplu bacteriofagul Mu (numele rezult prin prescurtarea mutator, pentru c a fost identificat ca factor mutagen la tulpini de E. coli) are un genom de 30kb i o structur linear. Dup infectarea celulei bacteriene, bacteriofagul Mu se inser n cromozom la ntmplare i ulterior n diferite poziii ale cromozomului bacterian apar copii ale acidului nucleic Mu. Atunci cnd structura genetic Mu va prsi genomul bacterian va prelua o parte din structura genetic bacterian (circa 100-150 pb).

71

5. 5. Mecanismele de variabilitate bacterian Bacteriile sunt microorganisme haploide (cu excepiile prezentate anterior), au un singur cromozom iar pentru remanierea prin recombinare a genomului este necesar transferarea de material genetic de la o tulpin (donoare) la tulpina receptor (acceptoare). n mod clasic poate avea loc un transfer pe orizontal ntre tulpini care fie fac parte din aceeai specie fie fac parte din specii foarte nrudite, chiar dac genotipic sunt diferite. Relativ recent a fost demonstrat posibilitatea unor schimburi genetice ntre tulpini din specii diferite (ex. n ecosistemul intestinal). Variabilitatea bacterian presupune modificarea la un moment dat a comportamentului celulei bacteriene sau a descendenilor ei i pot exista n principiu dou variante: - variabilitatea fenotipic i - variabilitatea genotipic; Variaiile fenotipice reprezint modificri morfologice sau fiziologice de tip adaptativ, care nu se transmit ereditar. Genomul nu este afectat. Variaiile genotipice reprezint modificri definitive ale materialului genetic (cromozomial sau extracromozomial) care se transmit descendenilor. Mecanismele variaiei genotipice sunt reprezentate de: - mutaie; - transfer genetic urmat de recombinare genetic. Mutaia Mutaia reprezint o modificare accidental n secvena nucleotidic a unei gene, ducnd la modificri ale mesajului genetic. Mutaiile pot aprea la nivelul materialului genetic prin: - substituii; - inversii; - inserii; - deleii. Mutaia spontan Mutaiile care apar n condiii de mediu obinuite i fr intervenia unui factor decelabil se numesc mutaii spontane. Mutaia indus Mutaiile care se produc sub aciunea unor factori fizici (de exemplu raze UV, radiaii ionizante etc.) sau chimici (de exemplu agenii alchilani), care acioneaz ca ageni mutageni, se numesc mutaii induse. Rata mutaiilor induse este semnificativ mai mare dect rata mutaiilor spontane. Mutaia punctiform are ca substrat alterarea unui singur nucleotid, respectiv a unui singur codon. 72

Mutaiile extinse reprezint alterri care depesc limitele unui codon, putnd afecta secvene mai mari ale uneia sau mai multor gene (mutaie poligenic). Mutaiile regresive (retromutaii) afecteaz celule mutante, determinnd revenirea acestora la tipul iniial, restabilind secvena nucleotidic originar. Mutaiile supresoare permit exprimarea funciei anterioare a genei, dei o modificare a secvenei bazelor nucleotidice persist. Principalele mecanisme de transfer al materialului genetic de la o bacterie donor la o bacterie receptor sunt: - transformarea; - transferul mediat de bacteriofagi (transducia); - conjugarea. Transformarea Transformarea este un transfer genetic realizat atunci cnd bacteria accept ADN liber provenit de la o bacterie donor sau din alte surse. Bacteria receptor trebuie s fie competent n a accepta ADN-ul de la bacteria donor. Prima transformare a fost descris n 1928 de ctre Griffith, n experimente referitoare la virulena pneumococilor fa de oarecele alb. Transformarea poate avea loc doar atunci cnd bacteriile intr n faza staionar a ciclului celular. Ptruns n celula receptoare, un fragment de ADN exogen poate nlocui (prin recombinare genetic) o secven nucleotidic omolog, bacteria receptoare dobndind un caracter genetic nou (de exemplu sinteza unei structuri capsulare/capsidice). Unele bacterii sunt competente n mod natural. n cazul bacteriilor care nu sunt natural competente, pentru a putea realiza fenomenul de transformare este necesar tratarea chimic a acestora, de ex. cu ioni de calciu. Transferul genetic mediat de bacteriofagi se poate realiza prin: - transducie; - conversie lizogenic. Transducia reprezint transferul unui fragment genetic (cromozomial sau extracromozomial) de la o bacterie la alta prin intermediul unui bacteriofag (de obicei un fag temperat). Fagul se numete transductor. Bacteria receptoare se numete transductant. Transducia specializat (restrictiv) este caracteristic fagilor transductori care au proprietatea de a transfera numai un numr restrns de gene bacteriene situate n imediata apropiere a situsului de legare a profagului n cromozomul bacterian. Transducia generalizat (nerestrictiv) presupune c teoretic, oricare din genele cromozomului bacterian, indiferent de poziia lor n genom, pot fi ncorporate n mod accidental n particula viral matur pentru a forma un fag transductor, care le poate transmite unor bacterii

73

receptoare. Transducia generalizat poate fi realizat de un mare numr de fagi neintegrai n cromozomul bacterian atunci cnd acetia intr n ciclul litic. Conversia lizogenic reprezint apariia unui caracter nou la bacteriile care gzduiesc un profag, de exemplu producerea toxinei difterice este realizat numai de ctre C. diphtheriae purttor al fagului temperat (profagul care deine gena tox) iar producerea toxinei scarlatinoase este posibil numai n cazul n care Streptococcus pyogenes de grup A este lizogenizat. Exist i fagi care sunt integrai n regiuni care codific un anumit produs din genomul bacterian (ex. fagul P4 de la E. coli se integreaz ntr-o gen care codific leucina). Conjugarea bacterian reprezint un proces de transfer de material genetic (cromozomial sau extracromozomial) realizat prin intermediul unei legturi intercelulare directe. Este condiionat de prezena factorului F n celula donoare. Receptorii specifici Pentru realizarea legturii intercelulare este necesar existena unor receptori de suprafa att la celula donoare, ct i la celula receptoare. Acetia vor permite recunoaterea reciproc. Fiziologia conjugrii bacteriene Dup un numr de alipiri ntmpltoare, bacteriile F+ formeaz cu bacteriile F- perechi de recombinare i ntre celulele alturate se formeaz un canal de conjugare. Prin canalul de conjugare se realizeaz transferul unidirecional al materialului genetic. Fragmentul transferat poate fi apoi integrat parial sau total n genomul celulei receptoare, ducnd la apariia unor proprieti noi ale acesteia, manifeste sau nu.

5. 6. Povestire adevrat Folosirea cunotinelor din domeniul geneticii, n munca de detectiv mbinarea examinrii foarte detaliate a secvenelor genomice microbiene cu o cunoatere aprofundat a evoluiei bacteriilor poate fi util att n obinerea unor diagnostice de mare precizie, ct i n aplicarea unor teste de diagnostic relevante n medicina legal. Spre exemplu, dorim s amintim situaia creat n 2001 n urma atentatelor teroriste din SUA, cnd o serie de instituii, dar i persoane particulare, au primit plicuri avnd un praf alb sau maroniu, care n unele cazuri (au existat i alarme false) s-a dovedit a conine spori de Bacillus anthracis. Cteva elemente concrete cu privire la situaia din acea perioad vor fi prezentate n capitolul dedicat genului Bacillus. Dup cartografierea genomului de B. anthracis s-au evideniat ca fiind posibile circa 3.500 de mutaii nucleotidice unice. n funcie de acestea se tie actualmente, c tulpinile cunoscute pot fi mprite n 8 grupe, fiecare grup fiind la rndul su divizat n mai multe subgrupe. Toate aceste grupe studiate sunt foarte stabile privind o posibil variaie genetic (nu exist cross link-uri ntre grupe), ceea ce face ca Bacillus anthracis s reprezinte un candidat ideal pentru studii de biologie molecular folosite n scopul punerii la punct a unor teste, care s identifice cu mare finee o anumit tulpin, inclusiv originea acesteia.

74

Prin metode ale biologiei moleculare s-a demonstrat de exemplu c tulpina de B. anthracis folosit n atacurile teroriste fcea parte din grupul Ames. Aceast ncadrare a putut s fie stabilit prin evidenierea a 6 mutaii specifice grupului Ames (4 la nivel cromozomial, una la nivelul plasmidului pX01 i una la nivelul plasmidului pX02). Aadar, iat cum, pentru o bacterie stabil din punctul de vedere al unei posibile variaii genetice, se poate realiza o adevrat munc de detectiv i prin metode specifice de laborator se poate stabili originea i apartenena sa, pornind de la caracteristicile genetice.

75

6. Antibiotice i Chimioterapice (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)


6. 1. Definiie Antibioticele i chimioterapicele antimicrobiene reprezint un grup de substane medicamentoase capabile s distrug sau s inhibe multiplicarea unor microorganisme implicate etiologic n bolile infecioase. Au o aciune selectiv asupra celulelor microorganismelor, exercitnd aciuni minime asupra celulelor organismului gazd. Aceste substane pot fi: - antibacteriene, - antivirale, - antifungice, - antiparazitare. n mod clasic, n aceast grup de medicamente au fost incluse i antineoplazicele (ex. dactinomycina, doxorubicina, bleomycina). Exist i antibiotice folosite ca: inhibitori enzimatici (ex. Lipstatin, sintetizat de Streptomyces toxytricini), imunosupresori (ex. Ciclosporina, sintetizat de Tolypocladium inflatum), hipocolesterolemiante (ex. Lovastatin, sintetizat de Aspergillus terreus), insecticide, ierbicide etc (1).

6. 2. Date cu privire la descoperirea antibioticelor (Figura nr. 1) Antibioticele au revoluionat lumea n multe aspecte. Nenumrate viei au fost salvate. Din nefericire ns, exist i aspecte mai puin plcute legate n special de apariia i dezvoltarea rezistenei la antibiotice i chimioterapice precum i de nregistrarea diferitelor reacii adverse. O baz de date recent ntocmit arat prezena a mai mult de 20.000 de gene potenial rezistente (2). nc din 1820 chinina a fost folosit drept chimioterapic n tratamentul malariei, antimalaricele de sintez fiind introduse n practic o sut de ani mai trziu, n 1926. n acelai an (1926) Fleming testeaz penicilina pentru efectul ei antimicrobian in vitro, pentru ca n 1946 s se demonstreze n practic utilitatea acestui antibiotic (cu ajutorul penicilinei este vindecat un pacient cu septicemie stafilococic). n 1935 sunt descoperite primele molecule de sulfonamide (Domagk) iar rezistena la aceste molecule a fost raportat spre sfritul anilor 1930. Primul medicament anti-tuberculos este descoperit n anul 1944 (streptomicina, Scharty, Bugie, Waksman). n 1949 se pune n eviden n structura penicilinei nucleul betalactam, iar din acest moment toate substanele antibiotice cu o astfel de particularitate structural au primit numele de betalactamine. n 1950 sunt descrise betalactamazele, eveniment urmat ncepnd cu 1977 de obinerea inhibitorilor de betalactamaze (acid clavulanic, sulbactam, tazobactam). Din 1960 se folosesc deja penicilinele semisintetice antistafilococice, anul 1976 aducnd cu sine utilizarea n clinic a ureidopenicilinelor cu spectru ultralarg. Sulfamidele (sulfonamidele) au fost medicamentele antimicrobiene utilizate aproape exclusiv n perioada 1946-1950 (numit din acest motiv era sulfamidelor). Anul 1948 impune n tratamentul antiinfecios clasa tetraciclinelor, ncepnd cu clortetraciclina i continund cu 76

oxitetraciclina, tetraciclina, rolitetraciclina, minotetraciclina, doxitetraciclina. Primul medicament din clasa macrolidelor, eritromicina, este obinut n 1952. Cotrimoxazolul este introdus pe scar larg n clinic ncepnd cu anul 1969. n 1979 este pus n eviden nucleul carbapenem, descoperire care duce la apariia unei noi clase de substane antibiotice: tienamicinele. Printre reprezentanii acestei clase se numr tienamicina, imipenemul, care este asociat n terapie cu cilastatina. Ulterior s-au realizat structuri chimice rezistente la aciunea dihidropeptidazei 1 renale, respectiv biapenemul i meropenemul. n perioada 1979-1982 sunt descoperite fluorochinolonele (norfloxacina, enoxacina, ofloxacina, pefloxacina, ciprofloxacina etc) iar n 1982 sunt produi monobactamii, cu activitate pe germenii Gram-negativi (ex. aztreonam). La nceputul secolului 21 se utilizau la nivel mondial peste 250 de molecule de antibiotice i chimioterapice antiinfecioase diferite. Avnd n vedere utilizarea mai puin raional a acestor medicamente, Organizaia Mondial a Sntii elaboreaz periodic o list a medicamentelor eseniale, inclusiv antibiotice i chimioterapice. n aceast list apar medicamente betalactamice (penicilin, amoxicilin, cloxacilin, piperacilin etc), medicamente antituberculoase i antileproase (clofazimin, dapson, ethambutol, izoniazid, pirazinamid, rifampicin etc), alte medicamente antiinfecioase (cloramfenicol, co-trimoxazol, doxiciclin, eritromicin, gentamicin, metronidazol, spectinomicin, sulfadiazin etc), medicamente complementare (ciprofloxacin, clindamicin, acid nalidixic etc) dar nu apar pe lista principal nici cefalosporinele i nici chinolonele ceea ce demonstreaz cel puin indirect recomandarea de reducere a utilizrii n exces a medicamentelor antimicrobiene, aceas noiune avnd o legtur direct cu subiectul prezentului capitol. n acelai sens, este recomandat citirea unui document relativ recent (How to improve the use of medicines by consumers, OMS, 2007), adresat att specialitilor n sntate ct i celor care utilizeaz diferitele medicamente, inclusiv antibiotice i chimioterapice. Interesul pentru acest subiect este dovedit i de faptul c editarea acelui manual a fost fcut cu asisten financiar de la Comunitatea European.

6. 3. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor Clasificarea se poate face dup: a) originea lor; b). efectul bacteriostatic sau bactericid; c). mecanismul de aciune; d). spectrul de aciune i e). structura chimic (Tabelul nr. 1). 6. 3. 1. n funcie de originea lor, agenii antimicrobieni pot fi clasificai n urmtoarele categorii: a). Substane cu origine biologic elaborate de anumite microorganisme (antibioticele), de exemplu penicilina G; bacteriocinele (piocine, colicine etc) au origine biologic, dar nu pot fi utilizate n tratamentul infeciilor umane; b). Produi de semisintez realizai pornind de la un nucleu elaborat de un microorganism, nucleu care sufer apoi prelucrri chimice (de exemplu meticilina);

77

c). Produi de sintez chimic integral (chimioterapice antiinfecioase), de exemplu acidul nalidixic sau sulfamidele (sulfonamidele). Deoarece n momentul actual o mare parte a medicamentelor antimicrobiene sunt produse prin metode chimice, diferenierea net dintre antibiotice i chimioterapice este mai rar ntlnit n limbajul medical curent, cel mai frecvent toate aceste medicamente fiind numite antibiotice (totui trebuie s cunoatem c exist aceast diferen). 6. 3. 2. n funcie de efectul lor, medicamentele antimicrobiene pot fi bacteriostatice i bactericide. Un antibiotic este bacteriostatic dac efectul su se limiteaz la oprirea multiplicrii bacteriene (ex. tetraciclinele, cloramfenicolul, eritromicina, clindamicina, sulfonamidele etc). Un antibiotic este bactericid dac aciunea sa duce la distrugerea bacteriilor (ex. penicilinele, cefalosporinele, polimixinele, aminoglicozidele, rifampicina, vancomicina, streptograminele etc). Trebuie cunoscute situaiile patologice n care se poate administra un antibiotic bacteriostatic, precum i situaiile n care este absolut necesar administrarea unui antibiotic cu efect bactericid (spre exemplu la persoanele care prezint imunodepresie). 6. 3. 3. Clasificarea dup mecanismul de aciune a). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei peretelui celular; au efect bactericid i sunt reprezentai de antibioticele beta-lactamice (peniciline, cefalosporine, carbapeneme etc), glicopeptidele (vancomicina, teicoplanina), bacitracina, cicloserina, fosfomicina, izoniazida etc; b). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea funciei membranei celulare; au efect bactericid i sunt reprezentai de polimixine (polimixin B, colistin), gramicidin, tirocidin, imidazoli, nistatin, amfotericin B etc (ultimele trei fiind medicamente antifungice); c). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei proteice la nivelul ribozomilor; de exemplu aminoglicozidele, tetraciclinele, cloramfenicolul, macrolidele, lincosamidele (lincomicina, clindamicina), acidul fusidic, streptograminele etc; d). ageni antimicrobieni care acioneaz prin inhibarea sintezei acizilor nucleici, de exemplu rifampicina, chinolonele, sulfonamidele, trimetoprimul, pirimetamina, novobiocina etc. Antibioticele beta-lactaminice inhib selectiv sinteza peretelui celular n mod diferit la bacteriile Gram-pozitive fa de cele Gram-negative (datorit diferenelor dintre acestea n ceea ce privete structura peretelui). Pentru realizarea acestei aciuni este necesar legarea de receptori celulari numii PBPs (penicillin-binding proteins). Beta-lactaminele inhib de exemplu reacia de transpeptidare (de formare a punilor peptidice) ntre lanurile adiacente de peptidoglican. Rezistena la beta-lactamice apare de ex. atunci cnd microorganismele produc enzime numite beta-lactamaze, care desfac inelul beta-lactamic. Alte mecanisme de rezisten sunt reprezentate de: alterarea porinelor din membrana extern (Gram-negativi) ceea ce afecteaz transportul beta-lactaminelor ctre sediul de aciune, mutaii care afecteaz structura PBSs i respectiv afinitatea fa de beta-lactamine etc. Polimixinele (polimixina B, colistinul) acioneaz selectiv pe membrana germenilor Gramnegativi, printr-un mecanism asemntor cu cel al detergenilor cationici deteriornd membrana. Se leag i de lipo-poli-zaharid i acioneaz asupra membranei externe a microbilor Gram-negativi. Nu se recomand (de prim intenie) pentru administrare pe cale general. Rezistena la polimixine apare rar. 78

Aminoglicozidele (streptomicina, kanamicina, gentamicina, spectinomicina, tobramicina etc) se ataeaz iniial de o protein receptoare specific aflat pe subunitatea 30S a ribozomului bacterian i blocheaz ulterior activitatea normal a complexului de iniiere necesar formrii de peptide. n final determin dezintegrarea poliribozomilor i separarea lor n ribozomi, incapabili de sintez proteic. Rezistena la aminoglicozide apare n special dac exist o modificare a procesului de transport activ n interiorul celulei bacteriene. La streptococi, enterococi, germeni anaerobi etc. nu exist un astfel de sistem de transport i n aceste condiii aceste bacterii nu sunt sensibile la aminoglicozide. n cazul bacteriilor sensibile, rezistena poate aprea de ex. prin producerea de enzime care adenileaz sau fosforileaz grupul hidroxil de pe molecula aminoglicozidului. Dintre cele mai redutabile reacii adverse putem aminti nefrotoxicitatea i ototoxicitatea. Ciclinele (ex. tetraciclina) se leag de subunitatea 30S a ribozomilor bacterieni i nu permit introducerea de noi aminoacizi ntr-un lan polipeptidic n curs de formare. Rezistena este de regul mediat plasmidic, dar i prin intermediul transposonilor, ducnd de ex. la sinteza unei proteine membranare care mediaz un aflux excesiv de tetraciclin i astfel nu se mai pot atinge concentraiile bacteriostatice. Ciclinele se absorb n stomac i intestin. Sunt bacteriostatice. Acioneaz pe germeni gram pozitivi i gram negativi, spirochete, mycoplasme, rickettsii, chlamydii. Printre reaciile adverse amintim senzaiile de grea, voma, diareea, toxicitatea renal i hepatic, acumularea la nivel osos i dentar. Cloramfenicolul se leag de subunitatea 50S a ribozomilor bacterieni i inhib peptidiltransferaza, interfernd cu legarea de noi aminoacizi n lanul peptidic n curs de formare. Rezistena poate aprea de ex. prin sinteza de ctre bacterii a unei acetil-transferaze sau a unei nitrat-reductaze. Acioneaz pe germeni aerobi i anaerobi gram pozitivi i gram negativi. Este un medicament bacteriostatic). Are indicaii n abcesul cerebral, febra tifoid, salmoneloze sistemice, infecii severe cu anaerobi. Printre reaciile adverse cele mai grave la care poate s duc enumerm anemia aplastic cu leucopenie i agranulocitoz. Macrolidele (eritromicina, claritromicina etc) i lincosamidele (lincomicina i clindamicina) se leag de subunitatea 50S a ribozomului bacterian, interfernd cu formarea complexului de iniiere pentru sinteza lanurilor proteice. Rezistena poate aprea datorit unei alterri a proteinelor ribozomale sau datorit sintezei unei enzime care metileaz reziduuri de adenin la nivelul ARNr. Macrolidele sunt bacteriostatice. Acioneaz pe cocii gram pozitivi i gram negativi, bacili gram pozitivi i unii bacili gram negativi. Pot aciona pe specii de Mycobacterium. Au efect asupra Treponema, Mycoplasma i Chlamydia. Sunt indicate n infeciile strectococice la bolnavii cu hipersensibilitate la betalactamine dar i n difterie, tuse convulsiv, pneumonii atipice etc. Dintre reaciile adverse amintim: grea, vom, diaree, febr, rash, reacii anafilactice. Lincosamidele (bacteriostatice) acioneaz pe germeni gram pozitivi aerobi i anaerobi i pe germeni gram negativi anaerobi. Rifampicina inhib creterea bacterian prin legarea de ARN-polimeraza ADN-dependent. Acioneaz pe mycobacterii, coci gram pozitivi i gram negativi, unii bacili gram negativi, germeni anaerobi gram pozitivi i gram negativi. Dintre indicaii putem meniona tratamentul tuberculozei, leprei, infeciilor stafilococice meticilino-rezistente sensibile (testarea sensibilitii tulpinilor respective este necesar). Chinolonele (de exemplu acidul nalidixic, norfloxacina, ofloxacina, ciprofloxacina) inhib sinteza ADN-ului microbian prin blocarea ADN-girazei. Acioneaz pe unii bacili gram negativi i gram

79

pozitivi, coci gram negativi i gram pozitivi, micoplasme, chlamydii. Dintre posibilelel reacii adverse am putea aminti: fotosensibilitate, cefalee, vertij, convulsii. Sulfamidele (sulfonamidele) sunt analogi structurali ai acidului paraaminobenzoic (PABA) i inhib dihidro-pteroat-sintetaza. Se formeaz analogi nefuncionali ai acidului folic, metabolismul celulei bacteriene fiind astfel inhibat. Rezistena apare prin alterarea dihidropteroat-sintetazei scznd capacitatea de legare a sulfonamidelor i este mediat plasmidic. Rezistena la un membru al familiei trebuie nregistrat ca rezisten i fa de celelalte substane cu structur similar. Trimetoprimul, omolog al acidului dihidrofolic, inhib reductaza acestui acid. Sulfamidele i trimetoprimul pot fi utilizate separat pentru a inhiba creterea bacterian. Dac sunt ns utilizate mpreun, vor produce o blocare dubl n secvena sintezei de ADN, rezultnd o cretere marcat a activitii lor (sinergism). O astfel de substan, frecvent folosit n practica medical, este cotrimoxazolul (ex. biseptol), coninnd sulfametoxazol i trimetoprim. Pirimetamina, la fel ca i trimetoprimul, inhib dihidro-folat-reductaza. Unele antibiotice, cum ar fi actinomicinele, sunt inhibitori eficieni ai sintezei de ADN; dar realizeaz aceast inhibiie att la nivelul celulei bacteriene ct i la nivelul celulei animale, nefiind suficient de selective pentru a putea fi utilizate n terapia antibacterian. 6. 3. 4. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor dup spectrul de aciune Prin spectrul de aciune antimicrobian se nelege lista grupurilor (speciilor) de bacterii asupra crora un anume antibiotic sau chimioterapic este activ. n practic, trebuie cunoscut nu numai spectrul antimicrobian iniial al fiecrui preparat antimicrobian, ci i modificrile ulterioare, survenite n urma apariiei germenilor rezisteni. Spectrul antimicrobian iniial este stabilit pentru fiecare antibiotic n parte, o dat cu introducerea sa n terapeutic. Antibiotice cu spectru ngust Aceste antibiotice pot fi submprite n dou subgrupuri: - antibiotice cu spectru de tip penicilinic, active pe bacili Gram-pozitivi, coci Gram-pozitivi i coci Gram-negativi. Din acest grup fac parte majoritatea penicilinelor, macrolidele, lincosamidele etc; - antibiotice cu spectru de tip streptomicin, active pe bacili Gram-negativi, coci Gramnegativi, coci Gram-pozitivi. n acest grup sunt incluse aminoglicozidele, polimixinele etc. Antibiotice cu spectru larg Antibioticele din acest grup sunt active pe bacili Gram-pozitivi i negativi, coci Gram-pozitivi i negativi. Sunt active i pe spirochete, leptospire, rickettsii, chlamydii, mycoplasme. n acest grup au fost incluse cloramfenicolul i tetraciclinele. La acest grup clasic de antibiotice cu spectru larg se pot aduga alte antibiotice, cum ar fi: penicilinele cu spectru lrgit (ampicilina, amoxiciclina etc), ureidopenicilinele, tienamicinele, cefalosporinele din generaiile II-IV, unele fluorochinolone, unele sulfamide etc. 6. 3. 5. Clasificarea antibioticelor i chimioterapicelor antibacteriene dup structura chimic 1. Antibioticele betalactaminice a). Penicilinele - penicilinele naturale (de exemplu penicilina G); 80

-penicilinele penicilinazorezistente (de exemplu meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, flucloxacilina, nafcilina); - aminopenicilinele (de exemplu ampicilina, amoxicilina); - alte peniciline cu efect asupra enterobacteriilor (mecilinamul, pivmecilinamul, ciclacilina, epicilina); - peniciline stabile n prezena unor beta-lactamaze produse de enterobacterii (temocilina; n aceast categorie ar putea intra i ampicilina, amoxicilina, ticarcilina i piperacilina); - peniciline cu efect asupra Pseudomonas aeruginosa (carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina, piperacilina, apalcilina); - alte peniciline i inhibitori de beta-lactamaze (de exemplu acid clavulanic + amoxicilin / ticarcilin, sulbactam + ampicilin, tazobactam + piperacilin); b). Cefalosporinele - din generaia I (de exemplu cefalotina, cefaloridina); - din generaia a II-a (de exemplu cefamandola, cefoxitina, cefuroxima); - din generaia a III-a (de exemplu cefotaxima, ceftriaxona); - din generaia a IV-a (de exemplu cefepima, cefpiroma). Cefalosporinele se mai pot clasifica i n: cefalosporine de uz oral (cefacitril, cefapirin, cefazedon, ceftezol etc); cefalosporine de uz parenteral (cefalotina, cefaloridina, cefazolina, cefamandola etc); cefalosporine care prezint o mai bun stabilitate n prezena beta-lactamazelor (cefuroxima, cefoxitima, cefotetanul, cefixima etc); cefalosporine cu activitate fa de Pseudomonas aeruginosa (ceftazidima, cefpiroma, cefepima, cefoperazona, cefsulodimul etc). c). Alte antibiotice beta-lactaminice - monobactamii (de exemplu aztreonamul); - penemii (de exemplu ritipenemul); -carbapenemii (de exemplu imipenenul, meropenemul, imipenemul + cilastatina; cilastatina este un inhibitor al dehidro-peptidazei); - oxacefemii (ex. latamoxef); - carbacefemii (ex. loracarbef). d). Inhibitori de beta-lactamaze (ex. acidul clavulanic, sulbactamul, tazobactamul). 2. Glicopeptidele (teicoplanina i vancomicina); Vancomicina este utilizat n tratamentul infeciilor cu S. aureus meticilino-rezistent. Se administreaz intravenos deoarece nu se absoarbe n tractul gastrointestinal. Printre reaciile adverse amintim reaciile anafilactice, febr, eozinofilie, neutropenie, pierderea auzului. 3. Aminoglicozidele - streptomicina (care este de fapt un oligozaharid); - kanamicina, gentamicina, amikacina, spectinomicina, tobramicina, netilmicina etc.; 4. ciclinele (ex. tetraciclina, oxitetraciclina, minociclina, doxiciclina etc); 5. Ansamicinele (ex. rifampicina, rifabutina);

81

6. Macrolidele (ex. eritromicina, claritromicina, azitromicina, telitromicina); 7. Polipeptidele ciclice (polimixina B, colistinul); 8. Antibioticele care nu se ncadreaz n nici una din grupele de mai sus - cloramfenicolul; - lincosamidele (lincomicina i clindamicina); - acidul fusidic (cu o structur asemntoare steroizilor); - streptograminele (pristinamicin, quinupristin, dalfopristin); - oxazolidinonele (linezolid); - mupirocinul; ultimele 4 grupe de medicamente au fost descoperite n special ca rspuns la apariia tulpinilor de stafilococ rezistente la meticilin etc. Chimioterapicele 1. Sulfamidele (sulfonamidele) (ex. sulfadiazina, sulfafurazolul); 2. Co-trimoxazolul (asociere trimetoprin + sulfametoxazol) 3. Dapsona (diaminodifenilsulfona); 4. Ethambutolul; 5. Hidrazida acidului izonicotinic (HIN, izoniazida); 6. Chinolonele (ex. acidul nalidixic, ofloxacina, ciprofloxacina, norfloxacina, levofloxacina, moxifloxacina, gatifloxacina, gemifloxacina etc); 7. Nitrofuranii (ex. furazolidonul, nitrofurantoina); 8. Nitroimidazolii (ex. metronidazolul, tinidazolul, ornidazolul) etc.

6. 4. Lantibioticele Denumirea de lantibiotice a fost introdus relativ recent, fiind vorba de un grup special de substane antimicrobiene cu o serie de proprieti datorit crora au fost clasificate ntre antibiotice i bacteriocine. Lantibioticele sunt sintetizate de bacterii Gram-pozitive (ex. din genurile Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus, Streptomyces) i prezint un spectru de activitate specific fa de anumite bacterii Gram-pozitive. Din punct de vedere al structurii chimice lantibioticele sunt polipeptide policiclice. Masa molecular a acestor substane se situeaz ntre 1.825 daltoni (mersacidina) i 3.488 daltoni (Pep5). Pe baza structurii lor diferite, s-au descris dou tipuri de lantibiotice: A i B. Tipul A: sunt lantibiotice produse de stafilococi, lactococi i bacili Gram-pozitivi, de ex. nisina, subtilina, epidermina, gallidermina i Pep5. Lantibioticele i au originea n proteine precursoare inactive (pre-lantibiotice) sintetizate la nivel ribozomal, convertite enzimatic n polipeptide active din punct de vedere biologic. n privina mecanismului de aciune se tie de ex. c nisina i Pep5 au activitate bactericid depolariznd membrana citoplasmatic a celulei bacteriene, formnd pori i inducnd autoliza acesteia. Datorit faptului c exist o specificitate a lantibioticelor fa de anumite bacterii se consider c exist i alte mecanisme implicate.

82

Genele responsabile de sinteza lantibioticelor pot fi localizate cromozomial sau plasmidic. De ex. n cazul nisinei, genele sunt localizate pe cromozonul celulei bacteriene (15) de Lactococcus lactis, iar informaia genetic pentru biosinteza epiderminei este localizat pe plasmidul pTu 32. Utilizarea lantibioticelor n industria alimentar i n practica medical Dintre lantibioticele cunoscute, nisina are cea mai larg aplicabilitate practic. Nisina inhib tulpinile din genurile Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Clostridium, Listeria la o concentraie 30 ml / ml, activitatea inhibitorie fiind maxim la pH < 5,5. Nisina inhib sporularea bacteriilor din genurile Clostridium i Bacillus; nu are efect asupra bacteriilor Gramnegative sau asupra fungilor. Nisina este folosit pe scar larg n industria alimentar drept conservant natural pentru vegetale, fructe, brnzeturi proaspete i procesate, carne, pete, cacao, buturi alcoolice (vinuri). Nu prezint dezavantajele nitrailor i nitriilor (produc nitrozamin cu aciune carcinogen). n practica medical este utilizat n unguente cosmetice. Este folosit i ca agent terapeutic n medicina veterinar (n tratamentul local al infeciilor bacteriene). Epidermina, produs de Staphylococcus epidermidis, are aciune antimicrobian fa de germeni care pot aciona patogen la nivel tegumentar: Propioniibacterium acnes, Streptococcus spp., Staphylococcus spp. Astfel, epidermina i gallidermina (sintetizat de Staphylococcus gallinarum) constituie alternative terapeutice pentru derivatele de vitamina A i eritromicin, de ex. n cazurile de acnee juvenil, eczem, foliculite etc. Dintre lantibioticele de tip B putem exemplifica lanthiopeptina, care are aciune antiviral fa de virusul Herpes simplex.

6. 5. Rezistena microbian la antibiotice Utilizarea cu succes a oricrui agent terapeutic poate fi compromis de dezvoltarea rezistenei. Rezistena poate s apar att pentru antibioticele utilizate n tratamentul infeciilor bacteriene ct i pentru antifungice, antivirale, antiparazitare sau pentru medicamentele utilizate n tratamentul unor boli cronice. Trei condiii trebuiesc ndeplinite ca un anumit antibiotic s inhibe bacteria susceptibil: 1-antibioticul trebuie s poat s ajung la int ntr-o concentraie suficient; 2-antibioticul nu trebuie s fie inactivat nainte s se lege de int; 3-trebuie s existe n celula bacterian o int vital susceptibil la aciunea antibioticului. Cititorul este rugat s consulte i http://ecdc.europa.eu/en/eaad/pages/video.aspx. Rezistena microbian la antibiotice reprezint capacitatea unor microorganisme de a supravieui i de a se multiplica n prezena antibioticului. Fenomenul de rezisten la antibiotice a fost descris relativ rapid dup introducerea acestora (ex. Streptococcus pyogenes rezistent la sulfonamide, Staphylococcus aureus rezistent la penicilin sau Mycobacterium tuberculosis rezistent la streptomicin) n practica medical. Pe msur ce au fost descoperite mecanismele prin care medicamentele antiinfecioase afecteaz multiplicarea sau distrug diferitele tipuri de bacterii (ex. mecanismul de aciune al beta-lactaminelor) au fost descoperite i mecanismele prin care bacteriile pot rezista fa de

83

aciunea medicamentului antibacterian (ex. producerea de enzime numite beta-lactamaze / penicilinaze, cefalosporinaze etc). Rezistena poate fi natural sau dobndit. 6. 5. 1. Rezistena natural (intrinsec) reprezint rezistena tuturor membrilor unei specii bacteriene fa de un antibiotic i este determinat genetic, de exemplu rezistena bacilului tuberculozei (Mycobacterium tuberculosis) la penicilina G. 6. 5. 2. Rezistena dobndit este acea rezisten necaracteristic unei specii bacteriene, dar achiziionat de anumite subpopulaii din acea specie n circumstane date; de exemplu, antibioticul acioneaz ca un presor selectiv (pacientul are o infecie n care majoritatea populaiei bacteriene este sensibil la agentul antimicrobian, dar exist tulpini care prezint rezisten; n aceste condiii, tulpinile sensibile vor fi inhibate sau distruse n timp ce tulpinile rezistente vor fi selectate; aceast situaie nu poate fi detectat dect utiliznd tehnicile de testare a sensibilitii bacteriilor la antibiotice i chimioterapice, de ex. antibiograma difuzimetric standardizat). Rezistena dobndit poate fi cromozomial sau extracromozomial. Mecanisme biochimice implicate n rezistena la antibiotice - producerea de ctre bacterie a unei enzime care inactiveaz antibioticul, de exemplu penicilinaza stafilococului auriu (codificat plasmidic) care inactiveaz nucleul beta-lactamic al penicilinelor sau diferitele tipuri de beta-lactamaze produse de bacteriile Gram-negative (ex. de enterobacterii); - scderea permeabilitii peretelui sau membranei citoplasmatice pentru antibiotic (de exemplu formele L); - elaborarea n exces de ctre bacterie a unor enzime complementare, care limiteaz sau anuleaz aciunea antibacterian a antibioticului, exercitat la nivelul enzimei respective; - alterarea intei intracelulare (ex. modificarea proteinelor ribozomale); - amplificarea sintezei de acid paraaminobenzoic, anulndu-se astfel prin diluare aciunea inhibitorie a sulfamidelor etc. (Tabelul nr. 2) 6. 5. 2. 1. Rezistena cromozomial se poate dezvolta ca rezultat al unei mutaii spontane, la ntmplare, la nivelul unui locus ce controleaz sensibilitatea fa de un anumit produs antimicrobian (deleie, substituie sau adiie de baz). Prezena substanei active antimicrobiene servete ca un mecanism selector, suprimnd organismele sensibile i favoriznd dezvoltarea unei populaii provenite din organismele mutante, rezistente la antibiotic. Mutaia spontan apare cu o frecven variind ntre 10-12-10-7. Mutaiile cromozomiale sunt definitive, afecteaz numai un anumit antibiotic sau o familie de antibiotice i se transmit vertical la toi descendenii suei bacteriene devenite rezistent. Pot fi clasificate n: mutaii ntr-un singur pas (single large step mutations) o singur mutaie duce la creterea CMI pentru un anumit antibiotic. Pot duce la euarea tratamentului atunci cnd acesta este instituit cu un singur antibiotic. mutaii n mai muli pai (multistep mutations) mutaii secveniale care duc la creterea gradat a CMI.

84

6. 5. 2. 2. Rezistena extracromozomial este mult mai frecvent dect cea cromozomial, reprezentnd circa 90% din cazurile de rezisten. n acest caz, transmiterea materialului genetic pentru rezisten se poate face transversal (orizontal), la toi membrii populaiei bacteriene existente la un anumit moment dat, prin plasmide, material plasmidic sau transpozoni. Transferul materialului genetic se poate realiza prin: - transducie; - transformare; - conjugare; - transpoziie. Transducia apare prin intervenia unor bacteriofagi care pot transporta ADN bacterian ncorporat n capsida sau genomul propriu. Dac acest material genetic include gene pentru rezistena la un antibiotic (factor R sau RTF), o celul bacterian infectat ulterior poate deveni rezistent la antibioticul respectiv i este capabil s transmit descendenilor aceast rezisten fr a veni n contact cu antibioticul respectiv. Transformarea reprezint un mod de transfer al informaiei genetice care implic ncorporarea de ADN liber din mediu (rezultat de exemplu n urma lizei unor bacterii care-l conin) ntr-o alt bacterie. Conjugarea reprezint pasajul genelor de la o celul la alta prin contact direct realizat prin intermediul unui pil sexual (pil F). Acest mecanism este considerat foarte important n rspndirea rezistenei la antibiotice. ADN-ul astfel transferat poate codifica simultan pentru germenul receptor rezistena fa de mai multe antibiotice. Transpoziia este un transfer al unor secvene scurte de ADN (transpozoni, elemente transpozabile) n interiorul unei celule bacteriene ntre dou plasmide sau ntre o plasmid i o poriune a cromozomului bacterian. 6. 5. 3. Tipuri de rezisten 6. 5. 3. 1. Rezistena fa de un agent antimicrobian poate fi: - monovalent (monorezistena), atunci cnd germenii rezist la un singur antibiotic; - plurivalent (rezistena multipl, la mai multe antibiotice); 6. 5. 3. 2. Din alt punct de vedere, rezistena se poate manifesta: - direct (leag o anumit bacterie de un singur anumit antibiotic); - ncruciat (rezistena unei bacterii fa de mai muli ageni antimicrobieni cu structur i/sau mecanism de aciune asemntor); de ex. rezistena la o sulfonamid sau la o tetraciclin confer rezisten la toate sulfonamidele sau la toate tetraciclinele n timp ce stafilococii rezisteni la meticilin (MRSA) sunt rezisteni la toate medicamentele beta-lactamice; 6. 5. 3. 3. Dup ritmul de instalare, rezistena poate fi: - cu ritm rapid de instalare (monostadial), tip streptomicin; - de ritm intermediar, tip eritromicin; - cu ritm lent de instalare (pluristadial), tip penicilin; - cu ritm foarte lent de instalare, tip vancomicin.

85

6. 5. 4. Modificri ale spectrului antimicrobian iniial Implicaiile clinice, terapeutice, epidemiologice i materiale ale fenomenului de rezisten bacterian la antibiotice i chimioterapice sunt extrem de mari. Selectarea tulpinilor rezistente prin antibioticoterapia excesiv, de multe ori abuziv, exercitat n spitale, alte uniti sanitare sau n ambulator (inclusiv prin fenomenul numit automedicaie), duce la variate aspecte negative: infecii cu germeni rezisteni, apariia i transmiterea germenilor de spital, devalorizarea i pierderea unor medicamente antibacteriene etc. O problem deosebit este i utilizarea medicamentelor antibiotice i chimioterapice n domeniul veterinar. Se estimeaz c anual se consum circa 100.000 tone de antibiotice i chimioterapice, o bun parte n ferme de animale, piscicole etc (Levy 2002). Acest exces de utilizare produce i un fenomen de poluare a mediului cu substane de acest tip, prin excreia acestora de ctre animalele tratate. Atunci cnd vorbim de utilizarea raional a antibioticelor i chimioterapicelor ar trebui s avem n vedere: utilizarea acestora n beneficiul pacientului; evaluarea clinic riguroas nsoit de teste de laborator sugestive sau care s confirme infecia i respectiv sensibilitatea la medicamente a tulpinilor izolate; instituirea tratamentului n cel mai scurt timp posibil n cazul pacienilor cu infecii severe, amenintoare de via; tratamentul trebuie s fie intit, s fie ndreptat strict ctre bacteria care a produs respectiva infecie, s se utilizeze calea de administrare cea mai potrivit, doza corespunztoare, intervalul ntre doze, durata optim a tratamentului iar pacientului s i se explice toate elementele care vor permite ca acesta s fie compliant i s respecte indicaiile medicale. Este strict necesar supravegherea fenomenului de rezisten la antibiotice i chimioterapice, testarea sensibilitii germenilor, notificarea i evaluarea statistic, publicarea periodic a datelor i punerea lor la dispoziia sistemului sanitar. Cu toate acestea, datele menionate mai sus nu sunt disponibile la nivel naional. n Romnia, profesionitii din sistemul sanitar se bazeaz fie pe experiena proprie, fie pe datele statistice din literatura internaional. Se vorbete tot mai des n zilele noastre despre superbugs, i anume, bacterii rezistente la foarte multe antibiotice. Printre acestea amintim Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Clostridium difficile, Enterobacter spp., Escherichia coli, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, M. tuberculosis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae etc. Termenul de superbug se refer la microbi care duc la o mortalitate i morbiditate ridicat datorit mutaiilor multiple i respectiv rezistenei la antibiotice i chimioterapice rezultate. Variantele terapeutice devin limitate iar spitalizarea este de durat mare i poate duce la costuri deosebit de mari. (3) NDM (New Delhi metallo-beta-lactamase gene; blaNDM-1) este o gen nou descoperit. Bacteriile care dein gena devin impermeabile pentru o serie de antibiotice i inactiveaz carbapenemazele. Gena se gsete la nivelul unei plasmide i din aceast cauz poate fi uor transmis. A fost prima dat identificat n India; a fost ulterior recunoscut n Pakistan, Bangladesh, UK, SUA, Canada, Australia, Belgia etc (4-7). 6. 5. 5. Date privind controlul extinderii rezistenei la antibiotice Utilizarea oricrui antibiotic n mod potenial duce la rezisten. De-a lungul anilor s-au realizat i aplicat diferite strategii de ctre CDC, Organizaia Mondial a Sntii i mai de curnd de ctre ECDC, pentru prevenirea i controlul rezistenei la antibiotice, spre exemplu:

86

controlul strict al folosirii acestor medicamente dup o prescriere corect (ex. nu pentru un guturai sau alt infecie insensibil la antibiotice anti-bacteriene) achiziionarea antibioticelor i chimioterapicelor doar n baza prescripiei medicale controlul strict al medicamentelor utilizate la animale i n agricultur (multe dintre moleculele de antibiotice i chimioterapice folosite n terapie la om se gsesc sub alte denumiri comerciale i n tratamentul animalelor) prevenirea bolilor infecioase etc. Rezistena la antibiotice datorat rspndirii utilizrii acestora de ctre om i pentru animale a devenit o problem tot mai mare n ultimele decenii. n 2001 European Union Ministers of Health a adoptat Recomandrile legate de folosirea prudent a antibioticelor n medicina uman. Prima recomandare a fost ca statele membre s ntocmeasc i s ntreasc un sistem de supraveghere pentru folosirea antibioticelor i prevenirea rezistenei la acestea. Din 1999, Sistemul European de Supraveghere Antimicrobian (European Antimicrobial Surveillance System EARSS) ofer date legate de prevalena i rspndirea majoritii bolilor cauzate de bacterii rezistente la unul sau mai multe antibiotice. n raportul anual din 2007 EARSS afirm c datele pe care EARSS le-a adunat de-a lungul anilor aduc un mesaj neplcut dar important: rezistena la antibiotice devine o problem tot mai mare de sntatea publica an dup an i doar un efort cumulat poate schimba aceast situaie. (8) Copiii sunt cei care primesc cele mai multe antibiotice n UE mai ales pentru infecii ale tractului respirator superior. Exist date care arat c n acest caz apare i rezistena la antibiotice i chimioterapice. Tulpinile rezistente sunt rspndite printre copiii care sunt dui la cre sau la alt form de educaie precolar. La nivelul UE dei au existat cteva iniiative, s-a fcut mult prea puin n ceea ce privete aceast grup de vrst. Ar fi totui de menionat nfiinarea Reelei de Prescriere i Rezistena la Antibiotice a Copiilor din UE (The Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children network ARPEC) care are urmtoarele scopuri: s foloseasc metodologia i datele oferite de celelalte sisteme de supraveghere pentru a dezvolta un sistem de supraveghere a rezistenei la antibiotice, pentru copiii din UE s determine diferenele legate de alegerea antibioticului, doza i indicaiile care apar ntre diferite comuniti i spitale s pun la punct recomandri privind dozele de antibiotice i chimioterapice administrate zilnic copiilor s colecteze date s initieze referine legate de rata prescrierii i rezistenei n colaborare cu Societatea European pentru Bolile Infecioase Pediatrice (European Society for Paediatric Infectious Diseases ESPID) s trimit rezultatele obinute n cadrul fiecrui proiect ctre toate rile membre. (9) CDC a dezvoltat la rndul su un plan de aciune cu privire la rezistena la antibiotice care cuprinde patru mari puncte: Supraveghere, Prevenire i Control, Cercetare i Producie. (10)

87

6. 6. Noiuni legate de alegerea corect a antibioticelor n tratamentul bolilor infecioase Instituirea i continuarea unei terapii cu antibiotice pe o durat optim (nici prea scurt i nici prea lung, existnd recomandri specifice n funcie de agentul etiologic i respectiv n funcie de patologie) trebuie s urmeze ntotdeauna parcurgerea unor etape minimale care s justifice aceast opiune terapeutic. n acest mod s-ar putea evita principalele erori n utilizarea antibioticelor, erori extrem de frecvente n momentul actual, inclusiv la nivel mondial, erori care favorizeaz n principal abuzul de antibiotice / chimioterapice i permit selectarea de microorganisme rezistente. 6. 6. 1. Etape de urmat n vederea instituirii corecte a unui tratament cu antibiotice Etapa n care se ia decizia de instituire a antibioticoterapiei Aceast etap se bazeaz pe o serie de date concrete (ns uneori pornim doar de la ipoteze) ntr-un anumit context clinic, epidemiologic, paraclinic i de laborator. Este strict necesar s reinem c ntotdeauna exist un context i c nici una dintre informaii luat singular nu permite luarea celei mai bune decizii. Nu exist o prioritate pentru clinic sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate i integrate n contextul general. Pentru a susine decizia ncercm s rspundem ct mai precis posibil la cel puin dou ntrebri, respectiv: 1. Este n discuie o infecie cert sau cel puin foarte probabil? Argumentele principale n favoarea unei infecii pot fi: creterea temperaturii, prezena frisoanelor, identificarea unor supuraii sau inflamaii locale, modificarea evident a strii generale, icterul (colorarea n galben a tegumentelor i mucoaselor), prezena unor erupii la nivel tegumentar sau pe mucoase, modificri ale tranzitului intestinal nsoite de eliminarea de scaune mai numeroase sau de consisten sczut (diaree), tusea, condensrile pulmonare percepute auscultator sau prin examinare radiologic, sindromul meningian (foarte important de sesizat prin manevre clinice relativ simple), leucocitoza (att ca numr ct i ca procent n analiza formulei leucocitare), testele nespecifice de inflamaie (numr de leucocite, VSH, protein C reactiv, fibrinogen etc.), identificarea prezenei bacteriilor la nivel tisular sau n umori n mod normal sterile prin examene simple n cadrul diagnosticului bacteriologic direct etc. Sindromul de rspuns inflamator sistemic (SIRS) sugereaz de cele mai multe ori o infecie, dar el poate fi produs i de cauze neinfecioase (imunologice, cancer, politraumatisme, alte agresiuni fizice etc.). n acest sindrom este evaluat prezena a cel puin dou din urmtoarele condiii: temperatur central peste 38C sau mai mic de 36C, frecven cardiac peste 90 de bti pe minut, frecven respiratorie peste 20 de respiraii pe minut sau PaCO2 sub 32 mmHg, numrul leucocitelor periferice peste 12.000 pe mm3 sau sub 4.000 pe mm3 sau cu peste 10% forme imature (n band). Noiunea de sepsis include prezena infeciei alturi de sindromul de rspuns inflamator sistemic. n prezent, este recomandat o nou terminologie care s nlocuiasc vechile denumiri de septicemie, stare septic, septicopiemie etc. Sepsisulreprezint SIRS determinat de infecie. Sepsisul sever se definete ca un sepsis asociat cu disfuncie organic, hipoperfuzie sau hipotensiune. ocul septic este sepsisul nsoit de hipotensiune (indiferent de aportul normal de lichide) i de anomalii de perfuzie (cel puin acidoz lactic, oligurie sau alterarea acut a strii mentale). Hipotensiunea este definit ca tensiune arterial (maxim) sub 90 mmHg sau 88

reducerea tensiunii arteriale maxime cu peste 40% fa de nivelul obinuit. Prezena sau suspiciunea sepsisului, ocului septic sau a sindromului de disfuncie multiorganic, chiar i atunci cnd nu sunt clar demonstrate, constituie un argument hotrtor pentru administrarea de antibiotice sau chimioterapice datorit gravitii deosebite a acestor entiti clinice. Totui, chiar i n aceast situaie nu exist nici un argument logic de a institui antibioticoterapia nainte de a recolta produse pentru a fi examinate n cadrul diagnosticului bacteriologic direct. 2. Care este terenul pe care s-a instalat infecia? Evaluarea terenului, a situaiei gazdei care urmeaz a fi tratat, are un rol important n stabilirea oportunitii antibioticoterapiei. Infeciile uoare, aprute la persoane tinere anterior sntoase, de obicei nu necesit tratament cu antibiotice sau chimioterapice. Aceleai infecii aprute la pacienii cu imunodepresie fac antibioticoterapia strict necesar (i este indicat s utilizm medicamente bactericide). Existena unor factori favorizani mrete prezumia de infecie i necesit instituirea terapiei cu antibiotice, chiar n contextul unor semne fizice (exemplu febr) aparent minore. Aceti factori sunt de obicei reprezentai de imunodepresia la nivelul ntregului organism (la pacieni cu diabet, ciroz, cancer, SIDA, politraumatisme, operaii extinse etc.) sau de imunodepresie local (datorit prezenei unor catetere, sonde, unturi, proteze implantate etc.). La bolnavii imunodeprimai se va opta de obicei pentru antibiotice bactericide; n aceast situaie este de obicei acceptat asocierea de antibiotice. Etapa n care se alege medicamentul antimicrobian care urmeaz a fi administrat Din gama larg de antibiotice disponibile la ora actual (peste 250 de molecule diferite), selectarea celui mai indicat se face dup mai multe criterii. Relativ frecvent, alegerea se bazeaz pe criteriul prezumiei etiologice, cu condiia nceperii diagnosticului microbiologic direct anterior nceperii terapiei (nu exist nici o justificare, indiferent de eventuala gravitate a maladiei, pentru a administra nti antibiotice i apoi a-i aduce aminte c era preferabil s recoltezi produsul patologic, s l trimii ctre laborator n vederea izolrii, identificrii i stabilirii sensibilitii/rezistenei la antibiotice i chimioterapice a germenului implicat n respectiva patologie). Ulterior, alegerea poate fi corectat pe baza precizrii definitive a etiologiei (cu condiia ca diagnosticul microbiologic direct s fi fost lansat), dar i pe baza aprecierii eficienei clinice i a efectelor adverse ale terapiei iniiale. n vederea alegerii medicamentului antimicrobian pe care urmeaz s l administrm pacientului cu o boal infecioas este strict necesar s: a). stabilim diagnosticul etiologic, s ncercm i s reuim diferenierea infeciilor bacteriene (tratabile cu antibiotice i chimioterapice antibacteriene) de infeciile virale; elementele care ne permit orientarea spre etiologia bacterian ar fi: un tablou clinic mai sever (exist i infecii virale foarte grave, nsoite de modificri substaniale ale strii generale a pacienilor), febra mai nalt, frisoanele, inflamaia mai accentuat, prezena supuraiilor, leucocitoza (numeric i procentual n analiza formulei leucocitare). Trebuie s realizm de asemenea o examinare clinic n detaliu a pacientului (din cretet i pn la tlpi), examenul microbiologic (inclusiv examinarea microscopic citobacteriologic); b). testm sensibilitatea la antibiotice a bacteriei izolate i implicate n infecia supus antibioticoterapiei (de ex. antibiograma); c). realizm sau primim informaii privind diagnosticul anatomo-clinic al bolii; d). cunoatem proprietile farmacologice ale antibioticelor propuse a fi folosite; e). avem n vedere i criteriul economic (raportul costeficien); f). analizm necesitatea unei eventuale asocieri de antibiotice.

89

Trebuie de asemenea s avem n vedere i s decidem care este calea i modul de administrare pentru antibioticul ales n funcie de gravitatea, localizarea infeciei, caracterul acut sau subacut al bolii, tipul antibioticului ales, tolerana pentru acest antibiotic a pacientului tratat. Spre exemplu, putem folosi penicilina V (de administrare oral) n infecii de gravitate medie sau chiar i n unele infecii grave, n funcie de localizare, ca alternativ pentru penicilina G sau alte preparate beta-lactamice, dac bacteria izolat i pstreaz sensibilitatea fa de penicilin, dac gazda nu prezint hipersensibilitate de tip I fa de penicilin i dac vom reine care este procentul de absorbie al acestui medicament i n acest sens vom administra doze duble comparativ cu dozele utilizate pentru administrarea parenteral i pe stomacul gol. n cazul n care analiza noastr a permis rspunsul la toate ntrebrile listate mai sus se vor stabili dozele necesare, intervalele ntre administrri, durata tratamentului, precum i momentul opririi acestuia. Controlul terapiei antimicrobiene se va realiza pe tot parcursul administrrii incluznd metode clinice (de ex. ameliorarea semnelor i simptomelor) i metode de laborator (examene paraclinice, dozarea antibioticelor n ser etc.).

6. 7. Erori n practica antibioticoterapiei Antibioterapia se afl ntr-un impas constatat clinic prin diferite eecuri terapeutice (n cadrul tuturor specialitilor att medicale dar mai ales chirurgicale) i confirmat de numeroase studii de laborator (aceste studii sunt realizate n special n SUA i Europa de Vest i sunt mai puine i mai puin semnificative n ara noastr; constatrile diferitelor eecuri exist, chiar dac sunt prezentate de regul anecdotic i nu n publicaii accesibile ntregului sistem sanitar). n strintate, exist o tendin de a atrage n echipe mixte microbiologi, farmaciti etc. cu scopul de a monitoriza calitatea utilizrii antibioticelor i chimioterapicelor, mai mult, de a pregti specialiti pentru formarea de echipe multidisciplinare cu participarea managerilor unitilor sanitare, pentru limitarea problemelor legate de numeroasele erori comise n antibioticoterapie (Arnold 2004). Principalele cauze ale situaiei actuale sunt un numr imens de prescrieri abuzive i folosirea iraional a unor antibiotice; se estimeaz c 60% din antibioticele i chimioterapicele produse anual se risipesc inutil. Principalele rezultate sunt: apariia de specii sau de tulpini (mutante) bacteriene cu rezisten la antibiotice, nmulirea reaciilor adverse la antibiotice i chimioterapice precum i modificarea tablourilor clinice clasice ale patologiei infecioase. Cel puin teoretic soluia ar fi descoperirea de noi antibiotice (ns din ce n ce mai multe companii farmaceutice transfer interesul pentru descoperirea de medicamente antivirale i antifungice i au tendina de a renuna la cercetarea fundamental n vederea producerii de medicamente antibacteriene, Shlaes 2003) dar mult mai logic, mai corect i mai la ndemn este folosirea raional a medicamentelor antimicrobiene deja existente i evitarea erorilor fcute n practica antibioticoterapiei. Dar, care sunt cele mai frecvente erori n folosirea antibioticelor? n primul rnd este incorect s ncepem un tratatament antibiotic fr s fi examinat clinic (complet) pacientul i fr s utilizm informaiile pe care le putem obine printr-o anamnez riguroas. Este incorect s indicm folosirea acestor medicamente n stri febrile n care exist 90

doar bnuiala unei infecii. Este incorect s decidem antibioticoterapia la ntmplare sau pe ncercate (cu o eventual eroare suplimentar reprezentat de schimbarea succesiv a antibioticului n raionamentul c poate de data aceasta va merge fr s ncercm s ne fundamentm decizia pe criterii raionale (cel puin pe criterii de probabilitate). Raionamente simpliste de tipul febr = infecie = antibiotice i chimioterapice (deseori ntlnite n practic, din pcate) nu pot conduce dect la eec, la modificarea evoluiei bolii i la mpiedicarea stabilirii ulterioare a diagnosticului (mascare clinic i bacteriologic) i tratamentului corect. Cu privire la criteriile de probabilitate este adevrat c n Romnia nu exist ghiduri i recomandri privind utilizarea corect a antibioticelor, bazate pe studii actuale, realizate pe eantioane reprezentative statistic pentru Romnia i n aceste condiii referina este reprezentat de studiile fcute n SUA sau n Europa de Vest i de manualul domnului profesor Mircea Angelescu (1998). n al doilea rnd este incorect s utilizm antibiotice fr a solicita, fr a obine i fr a interpreta corect datele de laborator. Indiferent de specialitate (medical, chirurgical) i indiferent de supra-specialitate este necesar cunoaterea i utilizarea corect a unor noiuni elementare de bacteriologie. Este absolut incorect s ncepem antibioticoterapia nainte de recoltarea produsului patologic. n funcie de contextul clinic i de gravitatea patologiei n cazul creia presupunem drept etiologie o infecie bacterian este recomandabil s solicitm i efectuarea unor examene paraclinice de baz (leucogram, VSH, radiografie, sumar de urin etc). Nu trebuie s uitm c atunci cnd suspicionm o infecie bacterian, indiferent de specialitate (aceste analize pot fi efectuate chiar i personal; ca alternativ trebuie s stabilim o foarte bun colaborare ntre clinic i laborator) avem la ndemn posibilitatea i necesitatea efecturii de preparate ntre lam i lamel (native) i frotiuri (colorate Gram, cu albastru de metilen, Giemsa etc.) din produsul obinut prin recoltare de la pacientul cu o presupus infecie bacterian. Realizarea i examinarea frotiurilor poate dura chiar i numai 5 minute, permind n scurt timp obinerea unui rezultat orientativ, uneori foarte important. Nu ar trebui s indicm tratamentul cu antibiotice fr a ine seama de sensibilitatea la antibiotice a germenului. n cazul unor infecii grave se poate ncepe antibioticoterapia, dup criterii de probabilitate. ns, n cazul n care produsul patologic a fost recoltat anterior, a fost transmis ctre laborator, a fost prelucrat iar agentul etiologic a fost identificat i s-a stabilit care este sensibilitatea la antibiotice i chimioterapice iar evoluia clinic i paraclinic nu este favorabil, demonstrnd c antibioticul ales nu a fost cel mai potrivit, pentru c avem rezultate de laborator vom putea schimba tratamentul, de aceast dat pe criterii tiinifice evitnd schimbri repetate i la ntmplare sau chiar inducerea unui prognostic rezervat pacientului supus tratamentului din clinica n care ne desfurm activitatea). Trebuie s nu greim i s lum n considerare drept ageni etiologici diferii germeni saprofii sau condiionat patogeni, cultivai din focare sau caviti septice deschise, sau izolai din produse contaminate n cursul recoltrii. O alt eroare ar fi ignorarea posibilitii ca germenul izolat s fie doar unul dintre cei 2 sau mai muli germeni implicai. nc din anul doi de studiu se obin primele date cu privire la toate aspectele descrise mai sus precum i cu privire la testarea sensibilitii la antibiotice (de ex. antibiograma), metod care nu trebuie interpretat mecanic, nu trebuie nici subestimat i nici supraevaluat (mai ales atunci cnd este efectuat difuzimetric i / sau nu este standardizat).

91

Aa cum am mai subliniat n cadrul acestui capitol, nu trebuie niciodat s absolutizm datele clinice, datele paraclinice, datele de laborator, luate fiecare n parte i scoase din contextul general. Nu exist o prioritate pentru clinic sau o prioritate pentru laborator; datele trebuie interpretate, integrate i utilizate n contextul clinic, paraclinic i de laborator general. Aceasta reprezint, dup opinia noastr, un aspect esenial al medicinii pe care dorim s o practicm la cel mai nalt nivel, n favoarea pacienilor pe care trebuie s i tratm. n al treilea rnd este incorect s prescriem fr justificare antibiotice i chimioterapice, spre ex. n stri febrile neinfecioase (maladii cu mecanism prin hipersensibilitate, maladii ale esutului colagen, neoplazii etc), n boli infecioase cu ageni patogeni care nu sunt sensibili la antibiotice (ex. este absurd s utilizm penicilin sau orice alt antibiotic antibacterian n tratamentul gripei). Este de subliniat c este incorect s indicm antibioterapia (i s ateptm ca indicaia noastr s aib efect curativ) n cazul unor supuraii colectate neglijnd i / sau temporiznd incizia i drenajul (antibioticul nu difuzeaz n focarul purulent; n plus, va fi inactivat la acest nivel). n al patrulea rnd, atunci cnd este necesar antibioterapia, este incorect s alegem eronat un antibiotic sau o asociere de antibiotice (n cazul n care aceast asociere este strict necesar), prin necunoaterea sau nerespectarea spectrului antimicrobian, prin nefolosirea antibioticului de elecie (ex. folosirea augmentinului sau cloramfenicolului sau tetraciclinei n angina streptococic la pacientul care nu prezint hipersensibilizare la penicilin), prin utilizarea de antibiotice nedifuzibile n focar (infecia urinar nu se poate trata cu cloramfenicol deoarece cloramfenicolul se elimin prin bil sau prin urin sub form de metabolit inactiv). n plus nu trebuie s uitm faptul c lucrm cu bolnavi i nu cu boli i n acest sens pentru un anume pacient pot exista anumite contraindicaii specifice (ex. hipersensibilizare fa de antibioticul pe care dorim s l utilizm, cu posibilitatea apariiei unui oc anafilactic). Este incorect s indicm asocierea antibioticelor antagoniste din punct de vedere al mecanismului (ex. penicilin G + tetraciclin) sau s indicm asocierea de antibiotice cu acelai spectru (eroare poate fi dramatic n cazul asocierii a dou aminoglicozide sau a dou antibiotice cu spectru larg). Primul exemplu a fost ales pentru a atrage atenia privind eroarea de a asocia antibiotice care pot da reacii adverse serioase (ex. afectarea pn la determinarea apariiei surditii prin afectarea nervului acustico-vestibular), reacie de notorietate n cazul aminoglicozidelor (streptomicin, kanamicin, gentamicin, amikacin etc.). n al cincilea rnd, este incorect s indicm din start antibiotice i chimioterapice ntr-un aazis scop profilactic. Spre ex. n cazul n care pacientul prezint un panariiu la degetul inelar singura atitudine corect este de realiza incizia, drenajul, antiseptizarea i pansarea local, vindecarea urmnd a se produce; nu este necesar ci este chiar contraindicat s recomandm administrarea de antibiotice i chimioterapice. nc din primii ani de studenie se poate reine faptul c, n principiu, utilizarea antibioticelor n scop profilactic trebuie privit cu rezerve serioase. Pe de alt parte, trebuie cunoscute situaiile n care antibioticoprofilaxia este util i recomandabil (de ex. nainte i dup efectuarea unei extrageri dentare, manevr sngernd, la un pacient care are stenoz mitral).

92

n al aselea rnd, este incorect s nu studiem i s nu acumulm cunotinele necesare de microbiologie, farmacologie, fiziopatologie, semiologie medical, medicin intern, chirurgie etc. care contribuie la evitarea erorilor n conducerea tratamentului sau / i greelilor n tehnica de administrare; cunotinele acumulate ne permit s avem n vedere posibilele reacii adverse i s evitm situaii care pot deveni dramatice. Circulaia substanelor antimicrobiene n organism din momentul resorbiei i pn n momentul eliminrii (farmacocinetica substanelor antimicrobiene) trebuie cunoscut att pentru evaluarea efectului terapeutic ct i pentru prevenirea acumulrii i apariiei fenomenelor toxice (de ex. vom indica substane antimicrobiene la pacieni cu insuficien renal numai n condiiile monitorizrii valorii creatinei i creatininei sanguine, a ureei sanguine, a ratei de filtrare glomerulare, a ionogramei i a sedimentului urinar). Exist anumite caracteristici farmacocinetice pentru fiecare substan antimicrobian. Datele farmacocinetice condiioneaz biodisponibilitatea medicamentului n cazul concret al bolnavului tratat. Aceste proprieti caracteristice privesc absorbia de la locul de administrare, difuziunea n organism (esuturi i fluide), metabolizarea substanei n organism, eliminarea (ci i forme de eliminare) etc. Dup mecanismul patogenic reaciile adverse la antibiotice i chimioterapice ar putea fi reprezentate de: a. efecte toxice directe, la locul administrrii (fenomene iritative, flebite etc.), sau la distan (hepatice, renale, hemopoietice etc.); b. reacii de hipersensibilizare (erupii, oc anafilactic etc.) i c. efecte secundare (dismicrobisme de ex. prin utilizarea antibioticelor cu spectru larg, inducerea de suprainfecii, reacii autoimune etc.). n al aptelea rnd, este incorect ca atunci cnd avem un dubiu cu privire la decizia pe care urmeaz s o lum s nu ne consultm cu ali colegi, pentru a alege ntotdeauna cea mai bun variant posibil. Considerm c tria este atunci cnd ne recunoatem limitele i nu atunci cnd ncercm s demonstrm c acestea nu ar exista.

6. 8. Povestiri adevrate 6. 8. 1. Gentamicina administrat n aerosoli Datorit conjuncturii actuale internaionale, s-a concluzionat c probabilitatea unui atac terorist cu arme biologice este din ce n ce mai mare. Avnd n vedere c prevenirea poate fi o mai bun form de aprare, specialitii occidentali au hotrt s pun la punct un program naional de protecie anti-bioterorism. n Statele Unite, acest program poart numele de BioShield. Iniial au fost identificate structurile microbiene sau tulpinile care ar putea fi utilizate n cazul unui atac biologic, cele mai importante fiind: toxina botulinic, Bacillus anthracis, virusurile febrei hemoragice, Yersinia pestis, Francisella tularensis i virusul variolic. n afar de identificarea problemelor poteniale a fost necesar gsirea soluiilor de prevenire / control / combatere. n cadrul acestui capitol vom discuta numai subiectul legat de un antibiotic cunoscut, dar condiionat ntr-o form special, prezentnd astfel o serie de avantaje. Gentamicina i respectiv mecanismul de aciune al acesteia sunt elucidate. Condiionarea n aa fel nct administrarea s poate fi fcut pe care inhalatorie prezint o serie de avantaje, spre exemplu: 93

a. eliberare mai rapid; b. biodisponibilitate mai bun; c. remanen mai bun; d. posibilitate de dozare mai bun; e. capacitatea de a ajunge mai uor i mai direct la nivelul organelor afectate. Att n cazul tularemiei ct i n cazul pestei, formele pulmonare sunt cele mai grave, cu cea mai mare mortalitate i cu cea mai mare contagiozitate, cu alte cuvinte tratamentul acestor forme de boal reprezint o prioritate. Avnd n vedere toate aceste meniuni, gentamicina administrat pe cale inhalatorie trebuie avut n vedere att pentru tratament ct i pentru profilaxia post-expunere n cazul unui atac bioterorist. Aceste studii sunt foarte recente iar informaiile au devenit disponibile n ultima parte a anului 2007. 6. 8. 2. A da sau a nu da aceasta este intrebarea! Cnd administrm antibiotic? Mai ales c, spre exemplu, administrarea unui antibiotic adecvat la pacienii cu sepsis diminu mortalitatea ntr-un procent semnificativ cu ct se face mai precoce (de ordinul orelor). Aadar, administrarea de urgen a unui antibiotic depinde de capacitatea de a recunoate bolnavul critic. Legarea ulterioar de etiologia infecioas a strii critice nu face dect s confirme decizia. Dac va fi incriminat, ulterior, o alt etiologie a strii critice (IMA, pancreatita acut, HDS cu oc etc) oprirea antibioticului nu afecteaz n sens negativ evoluia, aa cum ar fi fost afectat de ntrzierea administrrii acestuia. La vrstnici, infecia urinar poate fi frecvent o cauz de sepsis. La un pacient vrstnic, febril, cu hipotensiune, cu imagine EKG nespecific pentru un IMA (posibil in primele ore), ateptm chiar i 4 ore fr s administrm antibiotic, pn la elucidarea modificrilor EKG, dar dac sursa hipotensiunii era un sepsis cu punct de plecare renal, sau altul, atunci mortalitatea poate crete de la simplu la dublu (17%-30%). La pacientul care nu e critic, se pot monitoriza semnele clinice i se poate atepta cu administrarea antibioticului pn la determinarea posibilei etiologii infecioase. Dar pe de alt parte nu trebuie s uitm c nimeni nu ne oprete, indiferent de decizia care va fi luat, s recoltm snge pentru hemoculturi, urin pentru uroculturi sau alte produse, care pot fi trimise ctre laborator nainte de nceperea tratamentului antibiotic. 6. 8. 3. S-a ntmplat nu demult n Romnia ... V aducem la cunotin cazul pacientei n vrst de 21 de ani, care s-a prezentat la medic pentru o plag tiat la nivelul falangei distale a policelui minii stngi. Pacienta se tiase n marginea unei conserve pe care o desfcuse de curnd. Plaga era n aparen profund i secionase coronar pulpa degetului ptrunznd i n patul unghial. Sngerarea abundent i ndelungat a plgii, dar i durerea pulsatil la nivelul policelui, aprut dup aproximativ o or, au fost motivele prezentrii la medic. Pacienta a menionat faptul c acas a aplicat ap oxigenat pe plag (a procedat corect, fiindc apa oxigenat, prin efectul de spumare, antreneaz cheagurile de snge i resturile anorganice de la nivelul leziunii, dar realizeaz i o uoar hemostaz, oxigennd totodat plaga i prevenind astfel dezvoltarea germenilor anaerobi). De asemenea, a aplicat local un antibiotic sub form de pulbere (ceea ce nu este la fel de corect). La spital, din cauza durerii intense care a cuprins ntre timp ntreaga mn pn la articulaia pumnului, medicul a evitat aplicarea unui prinit alcoolizat, realiznd hemostaza plgii i efectund n continuare toaletarea marginilor i interiorului acesteia, aplicnd i ap oxigenat. 94

Leziunea s-a dovedit a fi minor i n mod cert nu necesita suturare. Totui, medicul curant cunotea faptul c pacienta este student la facultatea de medicin i studiind n diferite spitale, lua aproape zilnic contact cu bolnavii, cu echipamentul medical, dar i cu celelalte cadre medicale. n mediul spitalicesc, att pacienii ct i membrii personalului sanitar se pot infecta dac exist soluii de continuitate i dac nu se respect msurile de prevenire i control. n acest context, medicul i-a propus pacientei iniierea unei antibioterapii cu oxacilin (menionnd c stafilococul alb i auriu rspund bine), timp de cinci zile, pentru a preveni apariia unei infecii piogene a degetului. Un motiv de ngrijorare l constituia durerea chinuitoare, pulsatil la nivelul minii (apare de obicei ca un fenomen nsoitor pentru un panariiu subcutanat pulpar, ns abia dup 24 - 48 de ore; n cazul de fa durerea s-a instalat la o or de la lezarea zonei). Dei iniial reticent la ideea de a lua antibiotice n scop profilactic, pacienta a acceptat, convins de ctre medic c riscul apariiei unei infecii era mare. A doua zi, sftuindu-se cu un medic din universitate, pacienta a cntrit mai bine acest risc, ajungnd la concluzia c antibioterapia pe care o urma nu era nici pe departe necesar. Medicul de la spital a tratat leziunea ca pe o plag chirurgical pentru care antibioterapia ar fi putut s fie instituit n scop profilactic (nainte de realizarea contaminrii plgii) sau metafilactic (n contextul unei inoculri bacteriene prezumtive). O alt eroare, de aceast dat a pacientei, a fost aplicarea local de pulbere antimicrobian imediat dup lezarea zonei. Evident c riscul apariiei unei infecii exista, la fel ca i n povestea drobului de sare. Pacienta a decis s urmeze antibioterapia timp de trei zile n loc de cele cinci recomandate; evoluia a fost favorabil, iar plaga s-a cicatrizat fr complicaii. Suntem convini c acest lucru a fost posibil nu datorit antibioticelor administrate, ci datorit faptului c leziunea a fost minor, precum i datorit capacitii de rspuns a organismului. Pacienta a decis ca pe viitor, n situaii similare, s analizeze mai atent beneficiile i riscurile administrrii de antibiotice, acest caz constituind un elocvent contra-exemplu. n concluzie, chiar dac fenomenul apariiei rezistenei la antibiotice este bine cunoscut i neles, iat c n Romnia anului 2007 nc se mai prescriu antibiotice pentru orice zgaib! 6. 8. 4. Antibiotice folosite ca biostimulante Nu doar fiinele umane sunt supuse uzului iraional al antibioticelor, ci i animalele de ferm. Situaiile de necesitate, n care acestea chiar sunt bolnave, reprezint numai o mic parte din totalul situaiilor n care le sunt administrate antibiotice. n majoritatea cazurilor, medicamentele antimicrobiene sunt introduse n doze mici n hrana sau apa lor pentru efectul biostimulant. nc din anii 40, antibioticele au nceput s fie folosite n fermele din toat lumea pentru capacitatea de a determina o cretere mai rapid n greutate a animalelor. O alt consecin este c acestea devin adevrate rezervoare de germeni rezisteni, care pot fi apoi transferai omului. Producia de carne crete spre beneficiul ctorva productori, dar crete concomitent i ponderea bacteriilor rezistente la antibiotice, n dauna sntii unei lumi ntregi. n UE, de la 1 ianuarie 2006 a intrat n vigoare o directiv a Comisiei Europene, care interzice folosirea antibioticelor n scop biostimulant. Lista antibioticelor utilizate n alt scop dect cel terapeutic s-a micorat treptat, de la an la an, pentru ca n 2006 responsabilii europeni, pe deplin convini de concluziile cercettorilor n domeniul microbiologiei, s le interzic complet.

95

Fenomenul rezistenei microbiene la antibiotice are o istorie aproape la fel de lung ca i cea a antibioticelor. n discursul rostit cu ocazia primirii Premiului Nobel, Alexander Fleming avertiza n legtur cu uurina cu care pot fi produse microorganisme rezistente la invenia sa penicilina. Nu este nevoie de altceva dect ca acestea s fie expuse la doze mai mici dect doza bactericid. Aceasta se ntmpla n 1945. Foarte curnd temerile sale s-au adeverit, ncepnd s apar primele tulpini rezistente. n 2009 s-a dovedit clar transmiterea de la animal la om a unui germen redutabil - stafilococul auriu rezistent la meticilin (MRSA). Aadar, n condiiile eforturilor pentru prevenirea apariiei i rspndirii germenilor rezisteni, sistarea abuzului de antibiotice n ferme ar trebui s se gseasc n lista de prioriti. (11) 6. 8. 5. Antibiotice fr reet? Tot n 2009 civa cercettori s-au adunat i au avut ca scop verificarea numrului de site-uri care ofer antibiotice fr reet. Cu ajutorul motoarelor de cutare Google i Yahoo au gsit 138 de astfel de site-uri. Dintre acestea, 36,2% vindeau antibiotice fr reet iar 63,8% ofereau o reet online. Penicilinele erau disponibile pe 94,2% din aceste site-uri, macrolidele pe 96,4%, fluoroquinolonele pe 61,6% iar cefalosporinele pe 56,5%. 98,6% exportau spre SUA. Rezultatele descrise n acest studiu sugereaz c exist o surs mare de antibiotice n SUA care nu este afectat de iniiativele legate de schimbarea prescrierii antibioticelor i care poate contribui la extinderea rezistenei la antibiotice i chimioterapice. Comunitatea medical mpreun cu instituiile de sntate public i companiile farmaceutice trebuie s-i extind eforturile pentru a controla rezistena la antibiotice. n timpul anamnezei medicul poate oferi informaii legate de antibiotice, rezistena la antibiotice i posibilele interaciuni ntre antibiotice. Pacienii au nevoie s fie educai n acest sens! (12) 6. 8. 6. i care s fie soluia? n SUA i UK se estimeaz c un foarte mare procent din infeciile nosocomiale cu S. aureus este produs de tulpini meticilino-rezistente (MRSA) i o bun parte sunt MDR. O mai mic parte din aceste tulpini (i totui numrul este n cretere) prezint nivele joase de rezisten la vancomicin. S-au descoperit noi antibiotice care pot fi utilizate n tratamentul MRSA i chiar i a tulpinilor rezistente la vancomicina (ex. daptomicina) dar nu o s treac mult timp pn se va dezvolta rezistena i la ele. Este o soluie inventarea continu de noi antibiotice? Unele tulpini de E. coli (una din cauzele comune de ITU) sunt rezistente la antibiotice din ase clase diferite incluznd cele mai nou recomandate, fluoroquinolonele. Mai mult dect att, n sudul Asiei i n China, 60-70% E. coli sunt rezistente la fluoroquinolone. (13) Aa c rmne ntrebarea - ce este de fcut? Sau mai bine zis, ce va face cititorul dup ce va citi aceste rnduri? Care este atitudinea pe care o va adopta medicul curant, studentul viitor medic sau omul care dorete pur i simplu s se informeze? Am avea o propunere: n cazul n care nu va reui s nvee sau s aplice noiunile nvate secundum arte, mcar s nu participe la implementarea n practic a celor mai frecvente erori n utilizarea antibioticelor i chimioterapicelor.

96

6. 9. Direcii de cercetare Vom prezenta mai jos cteva dintre direciile de cercetare actual pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: -Predicting resistance mutations using protein design algorithms http://www.pnas.org/content/107/31/13707.full -Rapid molecular detection of Tuberculosis and Rifampin resistance http://www.nejm.org/doi/pdf/10.1056/NEJMoa0907847 - Antibiotics Are Not Automatic AnymoreThe French National Campaign To Cut Antibiotic Overuse http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000080 - Significant Reduction of Antibiotic Use in the Community after a Nationwide Campaign in France, 20022007 http://www.plosmedicine.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pmed.1000084 - Prevalence and Antimicrobial Resistance Pattern of Bacterial Meningitis in Egypt http://www.medscape.com/viewarticle/715718 - Global Health Advocates Call for Renewed Focus on Drug Resistance http://www.medscape.com/viewarticle/727041 - CDC Issues Plan to Combat Extensively Drug-Resistant Tuberculosis http://www.medscape.com/viewarticle/588332 - New Drugs and New Regimens for the Treatment of Tuberculosis: Review of the Drug Development Pipeline and Implications for National Programmes http://www.medscape.com/viewarticle/720268 - ID Society Calls for 10 New Antimicrobials by 2020 http://www.medscape.com/viewarticle/718786 -Despre antibiotice, rezistenta si testarea sensibilitatii http://wwwn.cdc.gov/dls/master/ams/intro/open.swf -Institutul National de Alergie si Boli Infectioase http://www.niaid.nih.gov/topics/antimicrobialresistance/Pages/default.aspx -European Antibiotic Awareness Day http://ecdc.europa.eu/en/eaad/Pages/Home.aspx - Alliance for the prudent use of antibiotics (a se citi si actiunile intreprinse in Romania si planurile lor de viitor) http://www.tufts.edu/med/apua/index.shtml -Antibiotics for the prevention of malaria, http://www.mpg.de/english/illustrationsDocumentation/documentation/pressReleases/2010/p ressRelease20100721/index.html

6. 10. Evaluarea cunotinelor Alegei rspunsul corect 1. Neutralizeaz aciunea unei clase de antibiotice: 97

A. nucleul betalactam B. nucleul carbapenem C. betalactaminele D. betalactamazele E. inhibitorii de betalactamaze 2. Au/Are efect bactericid: A. cefalosporinele B. tetraciclinele C. sulfonamidele D. cloramfenicolul E. eritromicina 3. Inhib sinteza peretelui celular: A. macrolidele B. tetraciclinele C. cloramfenicolul D. sulfonamidele E. penicilinele 4. n cazul rezistenei extracromozomiale, transmiterea materialului genetic NU se poate realiza prin: A. transducie B. transformare C. mutaie spontan D. conjugare E. transpoziie 5. NU se obinuiete administrarea de antibiotice bactericide la pacienii cu: A. cancer B. SIDA C. politraumatisme D. proteze valvulare E. grip

Bibliografie Liu B, Pop M, 2009, ARDB Antibiotic Resistance Genes Database, Nucleic Acid Res., 37, D443-D447 Demain AL, Sanchez S, 2009, Microbial drug discovery: 80 years of progress, J. Antibiotics, 62, 5-16 (e 16) Davies J, Davies D, 2010, Origins and Evolution of Antibiotic Resistance, Microbiol. and Molecul. Biol. Rev., 74, 417-433 98

DeNoon DJ, 2010, Extremely Drug-Resistant Infections Spreading Fast, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/726857) Auwaerter PG, 2010, New Antibiotic Resistance Gene NDM-1: A Worrisome Peek Into the Future?, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/728039) Kelland K, Hirschler B, 2010, New Superbugs Are Spreading From India, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/726720) Goodman A, 2010, NDM-1 Gene Spreading to Multiple Bacteria Species, Making Them Antibiotic-Resistant, Medscape (http://www.medscape.com/viewarticle/729202) Kristinsson KG, Monnet DL, 2008, Increasing Multidrug Resistance and Limited Treatment Options: Situation and Initiatives in Europe, Eurosurveillance, 13 Henderson KL, Mller-Pebody B, Johnson AP, Goossens H, Sharland M, 2009, First set-up meeting for Antibiotic Resistance and Prescribing in European Children (ARPEC), Eurosurveillance ***, CDC, 2001 Public Health Action Plan, http://www.cdc.gov/drugresistance/actionplan/actionPlan.html Smith TC, Male MJ, Harper AL, Kroeger JS, Tinkler GP, Moritz ED, Capuano AW, Herwaldt LA, Diekema DJ, 2009, Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strain ST398 is present in midwestern U.S. swine and swine workers., Epub, 4(1), e4258, (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19145257) Mainous AG, Everett CJ, Post RE, Diaz VA, Hueston WJ, 2009, Availability of Antibiotics for Purchase Without a Prescription on the Internet, Annals of Family Medicine, 7(5), 431435(http://www.medscape.com/viewarticle/710060) Levy SB, Marshall B, 2004, Antibacterial resistance worldwide: causes, challenges and responses, Nature Medicine Sup., 10, S122-S129

99

7. Testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice


Testarea sensibilitii la medicamentele antimicrobiene se realizeaz (din punct de vedere didactic) n ultima etap a diagnosticului de laborator microbiologic, pentru majoritatea microorganismelor implicate etiologic. Testarea este necesar datorit apariiei i extinderii rezistenei microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Rezistena poate fi natural sau dobndit. Rezistena natural este determinat genetic. Rezistena dobndit este achiziionat de anumite subpopulaii dintr-o anumit specie microbian, n circumstane date, ex. prin presiunea de selecie exercitat de antibiotic. Noiuni privind evaluarea sensibilitii la ageni antimicrobieni n general, o tulpin poate fi considerat sensibil atunci cnd germenii sunt n mod eficient afectai de ctre antibiotic, iar efectul terapeutic poate fi obinut cu doze i pe ci de administrare obinuite. Tulpina va fi considerat moderat sensibil dac germenii sunt afectai ntr-o msur mai mic, iar efectul terapeutic nu poate fi obinut dect n condiii speciale (ex. prescrierea unor doze mai mari dect cele obinuite, calculate de exemplu pe kilogram/corp; utilizarea unor ci de administrare speciale injectare intravenoas, intrarahidian etc) (Figura nr. 1, Figura nr.2). n mod absolut se consider c o tulpin este rezistent dac rezultatul testrii sensibilitii in vitro este negativ. Totui, trebuie s avem n vedere c ntre rezultatele in vitro i efectul in vivo pot exista diferene. 7. 1. Metode de testare a sensibilitii bacteriilor la ageni antimicrobieni Deoarece ntre rezultatele testrii in vitro i efectul terapeutic in vivo pot exista anumite diferene, metodele de testare a sensibilitii pot fi difereniate n: a. metode de testare a sensibilitii in vitro; b. metode in vivo (metode care in cont de relaia agent terapeutic-infecie). 7. 1. 1. Metode de testare a sensibilitii in vitro Antibiograma face parte din prima categorie de metode menionate. Reprezint metoda de laborator prin care se apreciaz sensibilitatea la antibiotice a germenilor recoltai de la bolnavii cu infecii bacteriene, dup cultivare pe medii mbogite, care s permit dezvoltarea optim a microorganismului pentru care se efectueaz testarea (de exemplu pe agar Mueller-Hinton). Pentru antibiograme trebuie s folosim culturi pure (reprezentnd o singur tulpin bacterian), chiar n cazul infeciilor multibacteriene. Cele mai frecvent utilizate tehnici sunt: Tehnicile calitative o antibiograma difuzimetric comun (cu discuri) o antibiograma difuzimetric comparativ o antibiograma difuzimetric standardizat o antibiogramele difuzimetrice rapide Tehnicile cantitative o metoda diluiilor n mediu lichid o metoda diluiilor n agar o metoda microdiluiilor n agar o metoda punctelor de ruptur 100

o testul E o metode i sisteme comerciale, automatizate, de testare etc. 7. 1. 1. 1. Antibiograma difuzimetric comun Din punct de vedere tehnic nsmnm germenul de testat pe mediul solid (ex. agar MuellerHinton) turnat n plci Petri. nsmnarea se poate realiza de exemplu prin inundarea plcii urmat de aspirarea, aseptic, a excesului de inocul sau cu ajutorul unui tampon (exist i alte variante tehnice). Dup circa 20 minute (timp n care placa Petri se las cu capacul ntredeschis n vecintatea becului de gaz, aprins) se aplic microcomprimatele n care sunt ncorporate antibiotice n concentraie standardizat. Aplicarea microcomprimatelor se poate face cu ajutorul unei pense, n condiii aseptice, sau cu ajutorul unui aplicator automat (la minim 30 mm distan ntre ele i minim 15 mm de marginea plcii; vom utiliza 5 antibiotice diferite pentru o plac Petri cu diametrul de 9 cm). Microcomprimatele trebuie s vin n contact perfect cu mediul, motiv pentru care, cu ajutorul unei pense le presm uor (dup caz). Dup nc 15-20 minute, incubm plcile peste noapte n termostat, la 28 sau 35-37C, n funcie de temperatura optim de multiplicare a microorganismului testat. Antibioticul eliberat din microcomprimat difuzeaz n mediu, realiznd zone de inhibiie n care coloniile microbiene nu se dezvolt (Figura nr. 3). Cu ct zona de inhibiie este mai larg, cu att germenul va fi considerat mai sensibil. Dac n interiorul zonei de inhibiie (chiar dac diametrul nregistrat este foarte mare) se dezvolt colonii, mutani rezisteni, germenul va fi considerat rezistent (Figura nr. 4). Aceast metod, cu toate c este folosit pe scar larg n laboratoare, permite de fapt numai eliminarea antibioticelor complet inactive i eventual selecionarea antibioticelor foarte active, pentru c tehnica nu este standardizat. 7. 1. 1. 2. Antibiograma difuzimetric comparativ (Stokes, Bal) Se efectueaz pentru microorganismul de testat n paralel cu un microorganism de referin, din aceeai specie (sau o specie asemntoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram-pozitivi putem alege pentru comparaie o tulpin de Staphylococcus spp. Tulpina de referin are o sensibilitate cunoscut la diferitele antibiotice pe care le utilizm. Prin aceast metod se nltur o parte din factorii de eroare ai metodei precedente, spre ex. calitatea mediului, calitatea discurilor de antibiotice, care vor fi identice pentru microorganismul de referin i pentru microorganismul testat. Rezultatele se exprim cu termenii: sensibil, intermediar, rezistent, n funcie de diametrul zonelor de inhibiie a multiplicrii celor doi germeni, fa de acelai antibiotic (jumtile de cerc se examineaz comparativ). n cazul n care cunoatem CMI (concentraia minim inhibitorie) a microorganismului de referin, putem face aprecieri cu privire la CMI pentru microorganismul testat. Din punct de vedere tehnic, pe o plac de forma unui ptrat (mprit n 3 zone egale marcnd pe partea extern a plcii liniile de demarcaie) se inoculeaz n treimea medie microorganismul de referin iar n treimile exterioare 2 microorganisme diferite, pentru care dorim s realizm testarea. Inoculul trebuie s fie astfel realizat nct s conduc la apariia dup incubare a unor colonii foarte apropiate, dar care s nu fie confluente. Plasm microcomprimatele cu antibiotice pe liniile de demarcaie dintre culturi. Incubm peste noapte la 35-37C urmnd ca n ziua urmtoare s citim i s interpretm rezultatele. (Figura nr. 5) 101

7. 1. 1. 3. Antibiograma difuzimetric standardizat (Kirby-Bauer, NCCLS) Din punct de vedere tehnic se realizeaz asemntor cu prima metod prezentat, dar este standardizat, fiind singura metod difuzimetric recunoscut pe plan internaional, care permite obinerea unor rezultate reproductibile i corelabile ntre laboratoare diferite (Film nr. 1). Elementele necesare standardizrii sunt: mediul (n majoritatea cazurilor agar Mueller-Hinton, pentru c are o valoare nutritiv corespunztoare i nu conine substane cu aciune inhibitoare) o exist elemente minerale care trebuie adugate n cazul testrii anumitor microorganisme (ex. Mg2+ i Ca2+, pentru tulpini de Pseudomonas aeruginosa, atunci cnd este testat sensibilitatea la aminoglicozide); o se va verifica pH-ul mediului (de obicei cuprins ntre 7,2 i 7,4); o exist suplimente nutritive care trebuie adugate n cazul testrii unor microorganisme pretenioase; o grosimea mediului trebuie s fie de 4 mm (25 ml de mediu/plac de 9 cm); inoculul, care se obine de preferat din 5 colonii izolate (cultur pur) i trebuie s aib o turbiditate corespunztoare standardului turbidimetric 0,5 McFarland (circa 108 uniti formatoare de colonii/ml) n majoritatea cazurilor; timpul de incubare (n majoritatea cazurilor 16-18 ore la 35-37C, nu mai mult de 2-3 plci suprapuse), atmosfera de incubare, umiditatea atmosferei de incubare; concentraia substanelor antimicrobiene din microcomprimate i dimensiunea microcomprimatelor (6 mm diametru); alegerea substanelor antimicrobiene pentru care se face testarea; pstrarea plcilor cu mediu pn n momentul utilizrii (maxim 7 zile, n pungi de polietilen, la +4C); utilizarea tulpinilor de referin pentru controlul de calitate; interpretarea rezultatelor (se msoar diametrul zonei de inhibiie i se compar rezultatele cu cele din tabelele puse la dispoziie de productori i/sau centrele de referin). Metodele difuzimetrice au dezavantajul c nu permit aprecierea concentraiilor eficace ale antibioticului la nivelul focarului infecios. 7. 1. 1. 4. Metoda diluiilor n mediu lichid Acest tip de metod ofer informaii cu privire la CMI ale antibioticelor studiate, fa de microorganismul testat. CMI = concentraia minim inhibitorie, reprezint cea mai mic concentraie de agent antimicrobian, exprimat n micrograme/ml, care mai exercit o aciune bacteriostatic asupra germenului testat. Din punct de vedere tehnic, pentru fiecare antibiotic avem nevoie de mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton n concentraii descrescnde (diluii binare) pornind spre ex. de la 16 micrograme/ml i pn la 0,125 micrograme/ml, n total 8 tuburi, plus 2 tuburi martor, fr antibiotic (cantitatea final va fi de 1 ml n fiecare tub). Preparm un inocul standardizat turbidimetric i n condiii aseptice inoculm toate cele 10 tuburi cu cte 1 ml de inocul. Agitm pentru a omogeniza. Incubm cele 8 tuburi cu antibiotice i 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37C iar al doilea tub martor l meninem pentru aceeai perioad la temperatura frigiderului

102

(Figura nr. 6). Pentru controlul de calitate utilizm i un ir de tuburi pe care le inoculm cu o tulpin de referin corespunztoare. n ziua urmtoare citim i interpretm rezultatele. Deoarece am utilizat o cantitate de inocul egal cu cantitatea de mediu, concentraia final de antibiotic se va njumti (de ex. n tubul n care diluia iniial a fost de 16 mg/ml, diluia final va fi 8 mg/ml etc.). n tubul martor meninut la +4C ar trebui s nu fie prezent creterea, n tubul martor meninut la 35-37C creterea trebuie s fie prezent (Figura nr. 7). n tuburile inoculate cu tulpina de referin trebuie s avem rezultatul corespunztor datelor pe care le cunoatem privitor la respectiva tulpin. n tuburile cu microorganismul testat, ultima diluie care a inhibat dezvoltarea microorganismului corespunde CMI. Se consider (n general, pentru c CMI difer n funcie de specia microbian) c microorganismele n cazul crora CMI este 3 mg/ml vor fi eficient inhibate de ctre antibioticul respectiv i in vivo. CMI nu are aceeai valoare pentru genuri, specii sau tulpini diferite. De ex. CMI la amoxicilin n cazul unor tulpini sensibile este de 0,1 mg/ml pentru Staphylococcus aureus, 0,03 mg/ml pentru Streptococcus pneumoniae, 0,25 mg/ml pentru Haemophilus influenzae, 2 mg/ml pentru E. coli, 16 mg ml (i practic aceasta semnific rezisten in vivo) pentru Bacteroides fragilis iar n cazul Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa sau Chlamydia trachomatis tulpinile sunt rezistente. 7. 1. 1. 5. Determinarea CMB (concentraia minim bactericid) Pornind de la rezultatul obinut prin metoda diluiilor n mediu lichid, se vor utiliza ca surs de inocul tuburile n care dezvoltarea microbian a fost inhibat (Figura nr. 8). Este necesar o plac Petri cu agar Mueller-Hinton care va fi mprit n sectoare, numrul de sectoare fiind corespunztor numrului de tuburi fr cretere microbian. nsmnm n condiii aseptice din fiecare tub fr cretere microbian, fiecare n sectorul de plac corespunztor (Figura nr. 9). Incubm pentru 16-18 ore la 35-37C. CMB va corespunde ultimei concentraii de antibiotic care a distrus microorganismele nsmnate (sectoare de plac fr apariia culturii) (Figura nr. 10). Se consider c antibioticul va fi eficient in vivo dac n serul pacientului se pot atinge concentraii de antibiotic care s depeasc de 4-8 ori CMB. Determinarea CMI i CMB este extrem de important pentru aprecierea eficacitii antimicrobiene a unui antibiotic asupra unei tulpini bacteriene. Pentru tratamentul infeciilor severe (de exemplu endocardite, meningite, sepsis etc), precum i la imunodeprimai, efectuarea acestei metode este indispensabil. 7. 1. 1. 6. Metoda punctelor de ruptur (breakpoints) Metoda este folosit n laboratoarele moderne de microbiologie i este utilizat pentru a defini sensibilitatea i rezistena la antibiotice. Depinznd de metoda de testare rezultatele sunt exprimate sub forma unei concentraii (mg/l sau g/ml) sau sub forma unui diametru (mm). (1) Metoda este practicat de multe dintre laboratoarele din Europa de Vest, mai ales dac volumul de munc este mare sau foarte mare. Prin aceast metod se pot testa mai multe microorganisme, n acelai timp. Antibioticele sunt incorporate n mediul de cultur, la o anumit concentraie limit, n funcie de cunotinele i datele acumulate n ceea ce privete activitatea in vivo a respectivelor medicamente. Plcile sunt inoculate simultan cu mai multe tulpini bacteriene, n spot, folosind un inoculator construit special, sunt incubate n condiii corespunztoare pentru 16-18 ore. n cazul n care tulpina sau tulpinile din diferitele specii 103

bacteriene nu se dezvolt la aceast concentraie limit de antibiotic (considerat ca fiind eficace in vivo), bacteria izolat este considerat sensibil. n cazul n care bacteria se dezvolt (apare cultur bacterian), bacteria izolat este considerat rezistent. Aceast concentraie limit (breakpoint) trebuie setat n funcie de urmtoarele date: distribuia CMI, evaluarea raportului PK/PD (farmacocinetic/farmacodinamic) i rezultatele obinute n clinic n tratamentul pacienilor. PD reprezint studiul efectelor medicamentului de-a lungul timpului i este n strns legtur cu PK care reprezint modificrile concentraiilor medicamentului n timp. Punctele de ruptur trebuie stabilite nainte ca un antibiotic s fie folosit n clinic i trebuie s fie revzute cnd apar cazuri de rezisten la antibiotice. Totui setarea de puncte de ruptur nu este perfect. Metoda este util i n realizarea unor studii epidemiologice n ceea ce privete modificarea rezistenei la antibiotice n anumite zone geografice. (1-2) 7. 1. 1. 7. Testul E; Determinarea CMI prin E test E test reprezint o metod de testare in vitro a sensibilitii la antibiotice pentru diferite microorganisme, inclusiv pentru bacteriile pretenioase i germenii anaerobi. E test se aseamn metodei diluiei n agar combinnd principiile metodei difuzimetrice cu cele de diluie. E test este uor de utilizat i spre deosebire de metoda difuzimetric permite determinarea valorii CMI. (3) Din punct de vedere tehnic sunt necesare: o plac Petri cu agar Mueller-Hinton, inoculul standardizat i langhetele din plastic pe care au fost fixate antibiotice n gradient, de ex. la un capt 256 mg/ml ajungnd la cellalt capt la 0,016 mg/ml (cte o langhet pentru fiecare antibiotic, cte 15 diluii marcate pe fiecare langhet). nsmnm microorganismul care urmeaz a fi testat n condiii standardizate i depunem radiar langhetele cu antibiotice (Figura nr. 11 - Aplicarea benzii E-test pe suprafaa mediului de cultur; Film nr. 2). Principiu: Asemntor metodei difuzimetrice, E test necesit un inocul bacterian ajustat ca turbiditate (standardizat), ce urmeaz a fi depus pe mediul de cultur potrivit microorganismului studiat (ex. mediul Mueller-Hinton, geloz-snge etc), n plci Petri. Benzile E test conin un gradient de agent antimicrobian i se aplic dup nsmnare. n funcie de antibiotic, gradientul acoper un ir continuu de concentraii ntre 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,0641024 mg/ml. Dup incubare (timp de 16-18 ore la 35-37C) se formeaz o zon eliptic de inhibiie. Valoarea CMI se citete acolo unde creterea bacterian intersecteaz banda E test (Figura nr. 12 ). Materiale i reactivi necesari: plci Petri cu agar Mueller-Hinton (pstrate la 2-8C pn n momentul utilizrii); bulion Mueller-Hinton (cu 20-25 mg Ca2+ i 10-12,5 mg Mg2+/litru; se repartizeaz cte 5 ml n tuburi sterile cu capac; se pstreaz la 2-8C); medii de cultur pentru meninerea n stare viabil a tulpinilor bacteriene necesare efecturii controlului de calitate ; tulpini martor; inocul bacterian; soluie salin steril (0,85% NaCl) sau bulion Mueller-Hinton, pentru ajustarea inoculului bacterian;

104

benzi E test (a. cu ageni antimicrobieni cu nucleu lactam, b. cu ali ageni antimicrobieni); se pstreaz n congelator la -20C pn n momentul utilizrii (Figurile nr. 1314. Modul de prezentare a benzilor E-test); au o durat de utilizare de 1-2 ani (pentru prima grup) i respectiv de 2-3 ani tampoane sterile; standard de turbiditate McFarland de 0,5 i 1,0; pipete Pasteur sterile; foarfece; plci Petri sterile cu diametrul de 90 mm i respectiv de 150 mm; incubator cu atmosfer obinuit reglat la 34-35C; incubarea n atmosfer mbogit cu CO2 este necesar n cazul testrii anumitor microorganisme; surs de lumin; aplicator E testi band adeziv (opional). Tehnica de lucru (Film nr. 2): A. Benzile E test scoatem plcile cu mediul de cultur i benzile E testdin congelator, le lsm la temperatura camerei pentru echilibrare termic timp de 20 minute sau pn cnd nu mai observm nici o urm de umezeal nainte de a deschide folia care include benzile, inspectm pentru a observa dac exist perforri; dac folia respectiv nu este intact, atunci benzile din interiorul ei nu se mai pot folosi; dac nu sunt probleme, pentru a deschide o folie mai nti tiem cu o foarfec de-a lungul liniei ntrerupte apoi ntre compartimentele ce conin benzile scoatem benzile din folie cu ajutorul unei pensete i le punem n plci Petri sterile; apoi le putem aplica pe mediul de cultur care conine inoculul microbian de testat pstrm restul benzilor n tuburi n care introducem o substan desicant pentru a le proteja fa de umezeal; este necesar protecia i fa de cldur i expunerea direct la lumin (punem tuburile n congelator, la -20C) B. Inoculul bacterian: cu ajutorul ansei sau a unei pipete, transferm mai multe colonii dintr-o cultur bacterian de 18-24 de ore ntr-un tub cu soluie salin steril sau bulion; omogenizm (exist i varianta s transferm mai multe colonii n bulion, s incubm timp de 2-8 ore pn cnd obinem densitatea dorit) ajustm (vizual) densitatea folosind soluie salin steril 0,85% sau bulion, la un standard de turbiditate echivalent cu 0.5 McFarland; alternativ, suspensia se poate ajusta la standardul dorit cu ajutorul unui nefelometru (aprecierea vizual a turbiditii inoculului nu garanteaz numrul corect al unitilor formatoare de colonii). C. Inocularea plcilor: introducem tamponul steril n tubul care conine suspensia bacterian de testat, rotim de cteva ori, apoi eliminm excesul de lichid prin presarea tamponului de pereii interiori ai tubului;

105

depunem inoculul pe suprafaa plcii cu mediul de cultur avnd grij s acoperim complet suprafaa mediului (ex. inoculm pe 3 direcii diferite, rotind placa cu cte o treime); lsm placa timp de circa 10 minute, ca s se usuce, nainte de a aplica benzile E test. D. Aplicarea benzilor E test: lum cu grij o band fr s atingem sau zgriem partea pe care este depus agentul antimicrobian; dac folosim pensa steril, apucm cu grij de captul benzii notat cu E (benzile trebuie s fie complet separate una de cealalt nainte de a le aplica pe suprafaa mediului de cultur inoculat cu tulpina de testat); dac se folosete aplicatorul E test, banda adeziv trebuie s fie n poziia corect (la fiecare capt al aplicatorului); aplicm banda E test pe suprafaa mediului de cultur, cu captul ce conine concentraia cea mai mare aproape de marginea plcii; dac lucrm cu plci cu diametrul de 90 mm, aplicm una sau dou benzi; dac lucrm cu plci cu diametrul de 150 mm, putem aplica ase benzi E test (benzile se pun la distane egale, radial, pornind din centrul plcii; marginea captului benzii notat cu E trebuie s ating marginea plcii); banda trebuie s fie n contact cu suprafaa agarului; eliminm eventualele bule de aer de sub band cu ajutorul unei pense ncepnd de la marginea bulei i mutnd-o n sus pe gradient pn la captul notat cu E (prezena bulelor mici nu va afecta rezultatul testrii); banda aplicat pe suprafaa agarului nu se mut n alt poziie (lund contact cu mediul de cultur, agentul antimicrobian de pe partea posterioar se elibereaz imediat); dac banda a fost aplicat cu partea posterioar n sus atunci se apuc cu grij, se ntoarce i se pune corect pe suprafaa mediului; dac banda a atins suprafaa mesei de lucru sau un alt obiect, se poate folosi n continuare att timp ct nu a luat contact cu o substan lichid. E. Incubarea: timpul i temperatura de incubare depind de variantele de microorganism-agent antimicrobian ce urmeaz a fi testate; incubarea n atmosfer de CO2 modific pH-ul mediului de cultur i poate afecta activitatea agenilor antimicrobieni; se folosete numai n cazul n care microorganismele supuse testrii necesit pentru multiplicare CO2 (Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae etc). Interpretarea rezultatelor: putem citi rezultatul n cazul n care creterea bacterian este confluent sau aproape confluent (Figura nr. 15 - Interpretare rezultate E-test pentru E. coli); inem placa lng o surs de lumin (atunci cnd mediul este Mueller-Hinton); citim valoarea CMI n punctul n care creterea bacterian intersecteaz banda E test; dac am utilizat agar Mueller-Hinton suplimentat cu 5% snge de oaie, sau geloz-chocolate MuellerHinton sau alt mediu opac, vom utiliza pentru citirea rezultatului o surs de lumin reflectant i o lup; pe geloz-snge citim zona de inhibiie a creterii bacteriene nu zona de inhibiie a hemolizei; n cazul n care nu apare nicio zon de inhibiie, raportm valoarea CMI ca fiind mai mare dect cea mai mare concentraie a agentului antimicrobian de pe banda E test (Figura nr. 16 Interpretare rezultate E-test pentru stafilococ); dac zona de inhibiie nu intersecteaz banda 106

(zona de inhibiie se afl sub banda E test), valoarea CMI se raporteaz ca fiind mai mic dect concentraia cea mai sczut a agentului antimicrobian de pe banda E test; n cazul unei valori CMI situat ntre dou marcaje ale gradientului benzii, rezultatul pe care l notm va fi valoarea cea mai mare; raportm rezultatul obinut pentru tulpina studiat dup ce verificm rezultatul obinut pentru tulpina de referin (control de calitate); rezultatele CMI se interpreteaz conform criteriilor stabilite de NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (Figura nr. 17 - Tabel NCCLS pentru enterobacterii). 7. 1. 1. 8. Alte tehnici de testare clasice Testarea sensibilitii la antibiotice a bacteriilor anaerobe o metodele sunt utile n special din punct de vedere al supravegherii epidemiologice, dar sunt rezervate pentru laboratoarele de referin o se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid, tehnici de microdiluii n mediu lichid, teste pentru producerea de -lactamaz etc. Testarea sensibilitii mycobacteriilor o se efectueaz respectnd prevederile Programului Naional de Control al Tuberculozei (care indic situaiile n care vor fi efectuate aceste testri) o se pot utiliza metoda concentraiilor absolute, metoda proporiilor, metoda rapoartelor de rezisten, metode radiometrice etc (Figura nr. 18). Testarea sensibilitii altor bacterii o exist i alte bacterii pentru care trebuie respectate condiii particulare o spre exemplu pentru testarea sensibilitii stafilococilor la oxacilin/meticilin se recomand ca mediul s conin 4% NaCl, pentru testarea sensibilitii la antibiotice a streptococilor se recomand ca mediul s conin 5% snge defibrinat de berbec etc. (4) Testarea sensibilitii fungilor (antifungigrama) o ine cont de temperatura i durata de incubare, care difer fa de cele pentru bacterii, mediul utilizat fiind mediul Sabouraud o se pot utiliza tehnici de diluie n mediu lichid sau solid (Figura nr. 19). Testarea producerii de -lactamaze o este util atunci cnd se verific sensibilitatea la antibiotice a microorganismelor care pot produce -lactamaz (ex. Haemophilus spp., Staphylococcus aureus etc) o se pot utiliza teste iodometrice, teste acidimetrice, teste cu cefalosporine cromogene etc; exist i metode puse la punct pentru testarea sintezei de -lactamaze cu spectru extins (ESBL) (Figura nr. 20). Exist i sisteme automate (ex. ATB i rapid ATB) sau sis teme semiautomate (ex. ATB Expression sau miniAPI), pentru testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, utiliznd criteriile de interpretare NCCLS (Figura nr. 21). 7. 1. 1. 9. Tehnici de biologie molecular utilizate n testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice Au fost imaginate o serie de metode semi-automatizate sau automatizate pentru a optimiza obinerea unor rezultate corecte i n timp ct mai scurt, cu privire la sensibilitatea/rezistena microorganismelor la antibiotice i chimioterapice. Metodele care au la baz tehnicile de 107

biologie molecular pot fi foarte utile (chiar dac costurile sunt mai ridicate). De ex. se cunoate c agentul etiologic al tuberculozei se multiplic lent pe medii de cultur i n aceste condiii rezultatele vor fi obinute n circa 2 sptmni prin metodele clasice. Se pot utiliza diferite tehnici i n final hibridizarea molecular pentru a studia diferite mutaii care pot s dea informaii cu privire la sensibilitatea/rezistena tulpinilor studiate. Spre ex. INNO-LIPA Rif. TB (LIPA= Line Probe Assay), se realizeaz cu ajutorul unei truse comerciale puse la punct n USA. Metoda permite concomitent identificarea M. tuberculosis precum i testarea sensibilitii la rifampicin, dup o amplificare genetic a unui material (ADN) provenit fie din culturi mycobacteriene, fie chiar din produse clinice (Figura nr. 22). Principiul INNO-LIPA este hibridizarea ADN-ului rezultat dintr-o amplificare prin PCR (Polymerase Chain Reaction) cu sonde nucleotidice specifice, imobilizate sub forma unor linii (benzi) paralele, pe fii de nitroceluloz. Sondele nucleotidice (S1-S5) sunt biotinilate (cuplate cu biotin). Dup hibridizare se adaug streptavidin conjugat cu fosfataz alcalin, acest conjugat atandu-se de produii de hibridizare rezultai anterior. Incubarea n prezena unui reactiv cromogen conduce, n cazul existenei hibridizrii, la apariia unor benzi colorate, vizibile. n cazul testrii rezistenei la rifampicin, se urmrete apariia unei/unor mutaii la nivelul genei care codific pentru subunitatea a ARN polimerazei (gena rpoB). (5-6) Identificarea apartenenei tulpinii testate la specia M. tuberculosis, este certificat cu ajutorul unei oligonucleotide specifice, situat n poziia a 3-a, dup linia care marcheaz fiecare fietest i respectiv linia care permite verificarea calitii conjugatului (conjugate control). Produsul unei tulpini sensibile la rifampicin deine fragmente amplificate, care hibridizeaz cu sondele specifice S1, S2, S3, S4 i respectiv S5. Absena uneia sau a mai multor benzi demonstreaz c tulpina este rezistent la rifampicin (Figura nr. 23). Pentru tulpinile rezistente la rifampicin, trusa comercial INNO-LIPA permite suplimentar aprecierea locusului mutaiei. De exemplu, o tulpin poate prezenta o mutaie n regiunea R5 (serin-leucin) n timp ce alt tulpin prezint o mutaie n regiunea R4a (histidin), aceste mutaii aprute la nivelul genei rpoB fiind dintre cele mai frecvente i pot fi identificate prin aceast metod.

7. 1. 2. Metode de testare a sensibilitii in vivo i de apreciere a eficienei terapeutice Eficiena terapeutic poate fi apreciat clinic, paraclinic i prin teste de laborator. Exist unele criterii nespecifice de laborator care sunt utile n aprecierea eficienei terapeutice, precum leucograma, examenul sedimentului urinar, examenul citologic al LCR, VSH, proteina C reactiv etc. Dintre metodele specifice utilizate pentru aprecierea eficacitii terapeutice sau pentru evaluarea eventualei nociviti a medicamentelor folosite, vom enumera: determinarea NEI (nivel de eficien inhibitorie) pentru ser, LCR sau alte umori (Figurile nr. 24-26 - Citirea NEI din hemocultur sub terapie cu ertapenem; Film nr. 3); determinarea NEB (nivel de eficien bactericid) pentru ser, LCR sau alte umori; puterea bactericid a serului celor tratai (NEB) msoar capacitatea diluiilor din serul unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul coninnd germenul infectant; se determin diluia cea mai nalt de ser care mai manifest capacitate bactericid (Figurile nr. 27-29); 108

utilizarea acestor metode a fost indicat n cazul endocarditelor bacteriene, osteomielitelor, fibrozei chistice sau sepsisului la pacieni cu variate grade de imunodepresie; produsele se recolteaz de obicei la o or dup administrarea unei doze i cu cteva minute nainte de administrarea urmtoarei doze de antibiotic; (Film nr. 4 Citirea NEI, Efectuarea NEB) determinarea nivelului de antibiotic realizat n snge, LCR sau n alte umori (prin metode microbiologice, enzimatice, HPLC etc).

7. 2. Povestiri adevrate 7.2.1. Rezistena la antibiotice a tulpinilor de S. aureus n Romnia, comparativ cu EU n statele Uniunii Europene, serviciile de sntate public i-au ndreptat atenia n ultimii ani ctre stafilococul auriu meticilino-rezistent (MRSA), incidena acestei specii microbiene fiind ntr-o permanent cretere att n infeciile nosocomiale, ct i n cele comunitare. Alturi de ali ageni patogeni care stau la baza declanrii de infecii nosocomiale (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Aspergillus spp. etc.), MRSA este agentul etiologic izolat n aproximativ 5% din totalul acestor infecii. n vederea monitorizrii n timp i spaiu a susceptibilitii, dar i a rezistenei la antibiotice a diferitelor specii bacteriene cu potenial patogen crescut, s-a pus la punct EARSS (European Antimicrobial Resistance Surveillance System) un program de supraveghere a sensibilitii la antibioticele folosite n practica medical curent a tulpinilor izolate de Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, E. coli, Enterococcus faecalis / faecium, K. pneumoniae i P. aeruginosa). Supravegherea tulpinilor de S. aureus i implicit a MRSA este realizat ncepnd cu anul 1999. n anul 2006, 31 de state din Europa au raportat ctre EARSS efectuarea testrii sensibilitii la antibiotice pentru un numr de 29.552 de tulpini de S. aureus izolate. Dintre acestea, 7.037 (23,81%) au fost identificate ca fiind MRSA. Dintre cele 31 de state, 15 au raportat o inciden a infeciilor cu MRSA mai mare de 25%. n ri precum Croaia, Grecia, Islanda, Malta, Turcia, MRSA s-a izolat cu precdere n unitile de terapie intensiv (peste 60% din totalul tulpinilor de MRSA). Din raportul pe 2006 al EARSS reiese faptul c n statele din Europa Central, rata infeciilor nosocomiale i comunitare cu MRSA se situeaz ntre 7-22%, comparativ cu partea de nord a continentului, unde rata este sub 4%. Marea Britanie a raportat ntre 1.500 i 4.000 de tulpini de MRSA pe an, Frana ntre 1.700 i 3.900 de tulpini pe an, Suedia ntre 1.300 i 2.000 de tulpini pe an, Germania ntre 800 i 1.300 de tulpini pe an, Slovenia ntre 150 i 365 de tulpini pe an, iar Bulgaria a raportat ntre 100 i 170 de tulpini pe an. n comparaie cu aceste stateRomnia a raportat n perioada 2002-2006 un numr foarte sczut de tulpini, variind ntre 78 i 92 de tulpini pe an (circa jumtate din numrul de tulpini raportate de Slovenia i de circa 16 ori mai puine dect Suedia); n acest context, datele raportate la ECDC nu au valori statistic semnificative. n anul 2005 s-a efectuat n ara noastr, la Institutul de Boli Infecioase Matei Bal, un studiu al crui obiectiv principal a fost stabilirea spectrului de sensibilitate la antibiotice pentru un numr de 589 de tulpini de S. aureus izolate. Peste jumtate din tulpini au fost izolate de la nivel faringian, dar s-au izolat tulpini i din leziuni cutanate, prin hemocultur etc. Testarea sensibilitii la antibiotice a fost efectuat prin E-test, evideniindu-se 92 (15,61%) tulpini de 109

MRSA. Acest nivel redus al meticilino-rezistenei poate fi corelat, printre altele, cu numrul mare de tulpini izolate din exsudat faringian, la care nivelul de meticilino-rezisten este mai mic de 10%. Studiul a relevat faptul c macrolidele, ciclinele i cotrimoxazolul constituie n prezent alternative terapeutice compromise, rmnnd active (pentru tulpinile identificate n institut) n antibioterapie clindamicina, rifampicina i aminoglicozidele. Procentul de tulpini de S. aureus penicilino-rezistente raportat a fost de 26% (i nu de 100% cum ar putea prea c este sugerat atunci cnd, n relaie cu o tulpin de S. aureus, penicilina este uitat complet). Tulpinile de MRSA constituie o problem de sntate public pe tot cuprinsul Europei. Totui, faptul c n unele ri (cum ar fi Cipru sau Turcia) incidena infeciilor cu MRSA este n scdere, reprezint o speran n ncercarea de a controla rata infeciilor nosocomiale i respectiv a celor comunitare n care sunt implicate tulpinile de MRSA. 7.2.2. Este nceputul sfritului erei antibioticelor? Conform unor studii recente s-a descoperit o nou gen numit New Delhi metallo beta lactamaz sau NDM 1. Aceast gen se gsete la nivelul plasmidelor i astfel poate fi copiat cu uurin i transmis altor tipuri de bacterii. Pentru prima dat bacteria care purta gena NDM a fost izolat de la un pacient suedez de origine indian care a avut infecie urinar n timp ce vizita New Delhi. Studiile arat c ntre 1 i 4% dintre bacteriile Gram negative din sudul Asiei poart gena NDM. NDM a fost identificat cu precdere la E.coli i Klebsiella pneumoniae, tulpinile devenind nalt rezistente la toate antibioticele cu excepia tigecycline i colistin. Dar exist cazuri n care nici aceste antibiotice nu sunt eficiente. n prezent nu exist alte antibiotice pentru a distruge bacteriile purttoare ale acestei gene. Pot aprea infecii obinuite precum infeciile tractului urinar cauzate de microorganisme rezistente la antibiotice. O ncercare pentru tratarea acestor infecii ar putea fi administrarea unor cocktail-uri de antibiotice n sparana c acestea vor avea un efect sau se pot folosi doze foarte mari dar exist pericolul de intoxicaie sau a altor reacii adverse. Din cauza turismului medical n general mai ales pentru proceduri precum chirurgia estetic aceast nou superbacterie se poate rspndi n ntreaga lume. n urma unui studiu s-a constat c NDM1 a fost identificat mai ales n Bangladesh, India i Pakistan i a ajuns n Marea Britanie prin intermediul unor pacieni care s-au ntors din aceste ri dup tratament. Rezistena la antibiotice trebuie considerat o problem global, mondial. (7)

Bibliografie 1. Turnidge J, Paterson DL, 2007, Setting and Revising Antibacterial Susceptibility Breakpoints, Clin. Microbiol. Rev., 20(3), 391-408. 2. Goue Denis Gohore Bi, Jun Li, Fahima Nekka, 2009, Antimicrobial breakpoint estimation accounting for variability in pharmacokinetics, Theor. Biol. Med. Model., 6, 10. 3. Kuper KM, Boles DM, Mohr JF, Wanger A, 2009, Antimicrobial Susceptibility Testing: A Primer for Clinicians, Pharmacotherapy, 29(11), 1326-1343. 4. Mandell, Bennett, Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed.

110

5. Cavusoglu C, Turhan A, Akinci P, Soyler I, 2006, Evaluation of the Genotype MTBDR Assay for Rapid Detection of Rifampin and Isoniazid Resistance in Mycobacterium tuberculosis Isolates, J. Clin. Microbiol., 44(7), 2338-2342. 6. Morgan M, Kalantri S, Flores L, Pai M, 2005, A commercial line probe assay for the rapid detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis: a systematic review and meta-analysis, BMC Infect. Dis., 5, 62. 7. Kumarasamy K, Toleman MA, Walsh TRR, Bagaria J, Butt F, Balakrishnan R, 2010, Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study, The Lancet Infect. Dis., 10, 597-602.

111

8. Relaiile microorganism - gazd (Mara Mdlina Oanea, Gabriela Loredana Popa)


Fiina uman poate intra n contact cu microorganismele nc din perioada intrauterin, ns acest contact se realizeaz numai n cazuri patologice (infecioase, traumatice etc). n perioada postnatal ncepe stabilirea relaiilor operaionale ntre fiina uman i populaia microbian din mediul nconjurtor, fie prin colonizare saprofitic, fie prin agresiune ce devine evident. Imediat dup natere, microorganismele se stabilesc treptat pe tegumente i pe majoritatea mucoaselor. Este vorba n principal de microorganismele care vor alctui microflora normal a organismului. Aceasta joac un rol important n protejarea gazdei fa de o invazie microbian ulterioar, acionnd prin urmtoarele mecanisme: - competiia fa de aceiai nutrieni (interferen); - competiia pentru aceiai receptori de pe celulele gazdei (tropism); - producia de bacteriocine (colicine, piocine); - producerea de acizi grai volatili sau ali metabolii; - stimularea continu a sistemului imun pentru a menine un nivel sczut (dar constant) al exprimrii moleculelor din clasa a II a de histocompatibilitate (DR) pe macrofage i alte celule prezentatoare de antigen; - stimularea producerii unor factori imuni de protecie ncruciat, ca de exemplu aa-numiii anticorpi naturali. Cu alte cuvinte, trebuie avute n vedere toate aceste aspecte atunci cnd se utilizeaz antibiotice cu spectru larg, care vor scdea numrul microorganismelor la nivel intestinal i vor permite multiplicarea fungilor i a microorganismelor rezistente la aceste antibiotice. Ca urmare, la oprirea terapiei pot aprea fenomene de rebound, manifestate prin repopularea tractului digestiv n avantajul enterobacteriilor fa de germenii anaerobi.

8. 1. Flora microbian a organismului Flora microbian a organismului poate fi divizat n dou grupuri: - flora normal rezident, care se gsete n mod regulat i care dac este perturbat se restabilete prompt (sau destul de prompt) - flora tranzitorie care poate coloniza gazda pe o perioad variabil de timp, de la ore la sptmni. Flora microbian prezint tropism pentru anumite regiuni anatomice. (Tabelul nr. 1) a). La nivelul tegumentului n funcie de contactul cu mediul nconjurtor, flora bacterian prezint un grad marcat de variabilitate. Mai frecvent, la nivel tegumentar se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Corynebacterium spp., Micrococcus spp., dar,temporar, tegumentul poate fi contaminat cu germeni coliformi, chiar stafilococi potenial patogeni precum Staphylococcus aureus, ns fr manifestri nete de agresivitate.

112

b). La nivelul conjunctivei oculare Conjunctiva este puin colonizat, deoarece secreiile lacrimale conin substane bactericide (ex. lizozim), iar clipitul asigur ndeprtarea mecanic a corpilor strini, inclusiv a bacteriilor. Pot fi totui identificai Staphylococcus epidermidis, Propionibacterium spp., Corynebacterium spp. c). La nivelul mucoasei nazale n mod normal se pot gsi stafilococi aurii i albi, streptococi, corynebacterii, pneumococi etc, flor supus numeroaselor contaminri prin contacte i traumatisme locale. d). La nivelul cavitii bucale La nivelul cavitii bucale flora conine diferii coci i bacili Gram-pozitivi i Gram-negativi, aerobi i anaerobi (de exemplu stafilococi, streptococi precumS. salivarius, S. sanguis, S. mutans, lactobacili, spirochete, neisserii saprofite, sau anaerobii Veillonella spp., Actinomyces spp., Fusobacterium spp., Bacteroides spp., Prevotella spp., Porphyromonas spp.), de origine aerian sau alimentar. Exist o adevrat microbiologie oral, cu diferene n funcie de localizare. Spre exemplu, pentru o celul de la nivelul dosului limbii exist aproximativ 100-150 bacterii, ntr-un ml de saliv sunt circa 100.000.000 bacterii, iar la nivelul plcii dentare, circa 100.000.000.000 bacterii (aproximativ 35 de specii bacteriene diferite, cele dominante fiind Streptococcus sanguis i Streptococcus mutans). Placa dentar, cariile i boala parodontal sunt cauzate de bacteriile ce constituie flora normal bucal. e). La nivelul tractului respirator Mucoasa nazal este ntotdeauna bogat colonizat, fiind supus unor numeroase contaminri prin contacte i traumatisme locale. n mod normal se pot gsi Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus (la aproximativ 20% din populaie), streptococi, corynebacterii, pneumococi etc. Flora de la nivelul faringelui se aseamn n compoziie cu flora cavitii bucale. Astfel se pot gsi streptococi, neisserii saprofite, bacili Gram-negativi-Lactobacillus spp, Bacteroides spp. Tractul respirator inferior este steril, fapt datorat i clearance-ului mucociliar. f). La nivelul tractului digestiv La acest nivel exist o diferen evident n funcie de segmentele acestuia, exprimate mai ales prin chimismul local. Lund ca exemplu colonul copilului mare i al adultului, la acest nivel se gsesc o serie de bacili Gram-negativi (enterobacterii), precum i foarte numeroi germeni anaerobi (Bacteroides spp., enterococi) etc, n total existnd aproximativ 1011 bacterii la 1 g de materii fecale. Se va detalia mai jos (8.2) despre compoziia i funciile florei normale digestive. g). La nivel urogenital Urina este n mod normal steril, iar n timpul miciunii bacteriile de pe tractul urinar inferior sunt cel mai frecvent ndeprtate. Totui, n uretra anterioar poate exista o flor care este cel mai frecvent alctuit din fungi, staflococi, corinebacterii i enterobacterii. Flora vaginal este dominat de lactobacili (flora Dderlein) asociai n proporii diferite cu mycoplasme nepatogene, stafilococi, streptococi, enterococi, clostridii, Candida spp., Bacteroides spp. etc. Predominana lactobacililor menine local un pH acid nefavorabil multiplicrii altor germeni (n special patogeni). Mucusul cervical are n plus o aciune 113

bactericid prin lizozim. La femeile fr activitate sexual predomin lactobacilii, pe cnd la restul compoziia florei este mixt.

8. 2. Flora microbian normal din sistemul intestinal Cea mai puin neleas parte a organismului ndeplinete funcii eseniale fiziologice, nutriionale i de protecie. Complexitatea acestui sistem ascunde mecanisme ce influeneaz anatomia, fiziologia, ct i patologia uman. Flora normal intestinal cntrete aproximativ 1 kg i conine o bun parte din celulele corpului uman. Speciile bacteriene ce colonizeaz sistemul intestinal sunt foarte variate. Flora normal este unic, variind semnificativ de la un individ la altul, iar compoziia ei se menine constant lungi perioade de timp. Astfel a aprut noiunea de amprent microbian unic.Aceste bacterii sunt de 10 ori mai numeroase dect celulele eucariote ale corpului uman. n colon exist cele mai multe microorganisme comensale: 1011-1012 UFC/ml. Colonul este organul cel mai activ metabolic din ntreg organismul. (Figura nr. 1) 8. 2. 1. Achiziia florei normale nainte de natere, n condiii fiziologice, ftul este germ-free (nu prezint microorganisme). Apoi, ntreg corpul uman i implicit i tractul gastro-intestinal este colonizat de bacterii aerobe ce aparin microflorei materne, de ex. Escherichia coli sau Streptococcus spp. Dup aproximativ o sptmn, ncep s predomine bacteriile anaerobe. n cazul n care nou-nscutul este hrnit cu lapte matern, vor exista mai multe bacterii Grampozitive, de tipul Bifidobacterium spp. sau Lactobacillus spp. n cazul alptrii artificiale, situaie nedorit i nerecomandat pentru dezvoltarea sugarului, vor predomina bacteriile Gram-negative, iar flora microbian intestinal va deveni foarte asemntoare cu cea a adultului incluznd Enterobacteriaceae i specii din genul Bacteroides. Flora normal a adultului conine reprezentani din toate cele 3 domenii de via: Eukaryota, Bacteria, Archaea, dup cum urmeaz. Din domeniul Bacteria, regsim microorganisme din genurile Bacteroides (care reprezint circa 30% din flora normal), Clostridium, Fusobacterium, Eubacterium, Ruminococcus, Peptococcus, Peptostreptococcus, Bifidobacterium, Escherichia i Lactobacillus. Din domeniul Archaea, regsim microorganisme din genul Methanobrevibacter. Iar din domeniul Eukaryota, regsim microorganisme din genurile Candida, Sacharomyces, Aspergillus i respectiv Penicillium. 8. 2. 2. Cultivarea n laborator Majoritatea speciilor bacteriene rezidente n intestin nu au putut fi cultivate pe medii standard de laborator. Acestea necesit condiii speciale, ct mai asemntoare celor din sistemul intestinal. Fiziologia acestui ecosistem este extrem de complex: interaciunile dintre factorii secretai de bacterii nu sunt nelese complet, iar efectele per ansamblu ale substanelor proprii organismului asupra florei microbiene sunt, de asemenea, puin cunoscute. Prin metode moderne ale biologiei moleculare, se poate studia, n timp util i ntr-un mod foarte eficient, ADN-ul bacterian.

114

Dintre toate structurile moleculare studiate, ARNr este cea mai puin variabil. S-a demonstrat c anumite poriuni ale secvenei ADNr a diferitor organisme nrudite ntre ele sunt remarcabil de similare. Astfel, se poate deduce urmtoarea idee: secvenierea genelor unor organisme apropiate filogenetic poate fi aliniat foarte precis, astfel obinndu-se o evaluare mult mai exact a diferenelor existente. Cum? Prin compararea zonelor hipervariabile ale ARNr, extrem de specifice unei anumite specii. Din acest motiv, genele care codific pentru ARNr (ADNr) au fost utilizate pentru a determina taxonomia, filogenia i pentru a specifica ratele de difereniere dintre speciile bacteriene. De asemenea, analiza dup realizarea secvenierii ARNr 16S ofer numeroase informaii asupra evoluiei bacteriene i asupra relaiilor dintre specii. Iniiatorul acestor metode a fost Carl Woese, cel care a propus ulterior clasificarea microorganismelor n sistemul celor trei domenii Archaea, Bacteria i Eucarya. Spre exemplu, ntr-un studiu s-a analizat prin secvenierea ARNr 16 S (aparine subunitii mici 30 S ribozomale) acid nucleic bacterian provenit de la 50 tulpini. Astfel, s-au descoperit 1.250 secvene diferite, dintre care 85% nu au putut fi identificate. Majoritatea nu aparin grupurilor taxonomice cunoscute i clasificate pn n momentul de fa, n timp ce mai mult de jumtate nu au mai fost descoperite n nici un alt situs sau n afara organismului. Pn n prezent au fost identificai aproximativ 420 membri ai florei normale, fcnd parte din 117 genuri diferite. Se presupune c exist peste 1.000 de specii bacteriene n sistemul nostru intestinal. Un exemplu de algoritm de diagnostic/identificare ar fi urmtorul: 1. Prelevarea de produs (materii fecale) 2. Depozitarea preparatului n una din urmtoarele variante: -procesare imediat sau - ngheare la -80 C sau -depozitare ntr-un aparat de depozitare i prelucrare special (PSP Spin Stool DNA Plus Kit), la temperatura camerei 3. Purificarea acidului nucleic -exist i kituri comerciale -liza celular cu ajutorul unui kit 4. Amplificarea ADN prin tehnica PCR utiliznd primeri ale cror inte sunt regiunile variabile ale genei ARNr 16S 5. Analiza i interpretarea rezultatelor 8. 2. 3. Modificri ale florei intestinale normale Compoziia florei microbiene normale este influenat de numeroi factori, precum stilul de via, dieta, starea de sntate versus starea de boal, vrsta. Astfel, dac este urmrit evoluia n timp a prezenei speciilor de Bifidobacterium i Enterobacteriaceae n sistemul intestinal, se vor observa diferene semnificative: Bifidobacterium spp. se afl n cantitate maxim la copil, n cantitate medie la adult i respectiv n cantitate minim la persoanele n vrst, n timp ce Enterobacteriaceaele se afl n cantitate maxim tot la copil, n cantitate minim la adult i n cantitate medie la persoanele n vrst. (Schema nr. 1; Factori ce determin modificarea compoziiei florei normale) 115

De-a lungul tractului gastro-intestinal se realizeaz o selecie prin cooperarea dintre gazd i diferitele bacterii. O serie de factori locali determin o distribuie neuniform a florei, dintre acetia putem aminti: -factori fizici: temperatura; gradientul de oxigen (majoritatea speciilor bacteriene sunt anaerobe); -factori chimici: pH-ul (ntre mese, nu exist microorganisme la nivel gastric); procentul de H2O; acizii biliari; secreia pancreatic; nivelele diferiilor nutrieni; secreia local de imunoglobuline; diferitele substane produse tocmai de ctre bacterie; -factori mecanici: peristaltismul intestinal (bacteriile se pot ataa de mucoas atunci cnd peristaltismul este sczut; iat i unul dintre motivele pentru care medicamentele anti-peristaltice nu sunt benefice n infeciile digestive); (Tabelul nr. 2) fenomenul de competiie ntre diferitele specii bacteriene etc.

8. 3. Funciile florei microbiene normale din sistemul intestinal 8. 3. 1. Flora normal i sistemul imun 8. 3. 1. 1. Dezvoltarea sistemului imunitar n studiul unor cercettori de la Harvard Medical School au fost urmrite efectele colonizrii cu Bacteroides fragilis a unor oareci germ-free(crescui n mediu steril). Dac n lipsa bacteriilor animalele prezentau timusul i splina incomplet dezvoltate i un numr al limfocitelor T CD4+ naive foarte mic, dup colonizarea cu Bacteroides fragilis toate defectele au disprut. Mecanismul prin care flora determin o dezvoltare normal a sistemului imunitar se pare c este urmtorul: - bacteriile au la nivelul membranei externe un carbohidrat (PSA) cu o structur special; - PSA este recunoscut i cooptat de celulele dendritice din mucoasa intestinal; - celulele dendritice l prezint limfocitelor T naive i determin proliferarea limfocitelor Th1, cu adoptarea unui rspuns imun de tip celular . Dac n lipsa florei, organismul tinde spre un rspuns imun de tip umoral, realizat prin limfocitele Th2, n prezena acesteia se echilibreaz reacia sistemului imunitar Th1-Th2. Astfel, flora microbian normal educ sistemul imun i contribuie la dezvoltarea i funcionarea normal a acestuia. Tolerana fa de bacteriile nepatogene, precum i sensibilitatea fa de bacteriile patogene se dezvolt ncepnd cu primele zile de dup natere, iar echilibrul dintre ele este esenial. (Figura nr. 2)

116

8. 3. 1. 2. Flora microbian intestinal ar putea reprezenta cheia n prevenirea unor stri de hipersensibilitate Conform acestor explicaii, n lipsa florei, sistemul imun tinde s se orienteze spre un rspuns de tip umoral. Acest tip de rspuns imun poate fi implicat n apariia strilor de hipersensibilitate (ex. de tip I), printr-o secreie excesiv de imunoglobuline. ntr-un studiu al cercettorilor de la University of Michigan Medical School, s-a observat o hipersensibilitate la nivel respirator, aprut fa de ovalbumin (un cunoscut alergen) la oarecii cu flora normal gastro-intestinal distrus de antibiotice. Un alt argument al implicaiilor florei normale asupra sistemului imunitar este diferena cunoscut dintre compoziia florei normale a copiilor cu diversele forme de hipersensibilitate, comparativ cu flora intestinal la copiii sntoi; copiii din prima categorie prezint un nivel crescut al speciilor de Clostridium difficile i Staphylococcus aureus, n timp ce speciile din genurile Bacteroides i Bifidobacteria sunt n cantitate mic. 8. 3. 1. 3. Stresul produs de ctre sistemul imunitar pare s reprezinte un semnal de atac pentru bacterii S-a descoperit faptul c Pseudomonas aeruginosa, ce aparine florei normale la 3% din oameni, deine receptori pentru IFN-, mesager al sistemului imun, util n reglarea rspunsului imun, inclusiv n cazul activrii rspunsului imun anti-infecios. Aceast citokin este recunoscut drept o structur negativ i, drept consecin, bacteria i activeaz genele de patogenitate. n aceste condiii, Pseudomonas aeruginosa reuete s eludeze rspunsului imun, se multiplic, selecteaz factori de rezisten la antibiotice, secret toxine, sau poate penetra peretele intestinal (P. aeruginosa a fost izolat n sepsis, iar unica surs posibil era reprezentat de flora intestinal). n urma unor intervenii chirurgicale majore a fost raportat o frecven crescut a sepsisului cu implicarea Pseudomonas aeruginosa. Ipoteza foarte interesant i relativ recent, care decurge din diversele studii realizate de cercettori din universitile americane este c bacteriile nu simt nevoia i nici nu intenioneaz s descopere o oportunitate de atac, dar, atunci cnd se simt ameninate, dezvolt un plan de reacie. 8. 3. 1. 4. Bacteriile au propriul sistem imunitar La ntrebarea privind modul de rspuns al bacteriilor fa de informaia genetic extern sistemului n care se dezvolt n mod obinuit, cercettorii au lansat o serie de ipoteze. Se pare c bacteriile au capacitatea de a recunoate ADN-ul strin. n materialul nuclear bacteriile dein proteina H-NS care are funcia unui receptor pentru moleculele de adenin i timin din structura ADN-ului existent n mediul exterior. Aceast protein previne activarea lui i blocheaz exprimarea informaiilor ce ar putea duna bacteriei. Se pare c microorganismele pot folosi ADN din surse externe pentru a exprima caractere de patogenitate. Cercettorii sugereaz un fapt foarte interesant: bacterii cunoscute n prezent drept patogene, n trecut au fost nepatogene (Shigella spp., Vibrio cholerae, Yersinia pestis etc., ar fi devenit patogeneprin cooptarea de ADN-ului din mediul extern). Aceste studii ofer i o nou viziune asupra evoluiei bacteriilor dar i asupra utilizrii capacitii unor bacterii (modificate genetic) de a produce proteine recombinate. La bacteriile lipsite de HNS, care nu inactiveaz structurile genetice umane, producia de proteine este mai eficient.

117

8. 3. 1. 5. Diferenierea bacteriilor comensale de cele patogene Mecanisme ale gazdei Organismul gazd deine sistemul PRR (pattern recognition receptor), care include familia TLR (toll-like receptors) de receptori extracelulari i NOD/CARD (nucleotide binding oligomerization domain / caspase recruitment domain isoforms), familie de receptori intracelulari. (Figura nr. 3) Celule implicate n procesul de difereniere sunt: - enterocitele de suprafa; - celulele M din foliculii limfoizi i - celulele intestinale dendritice. Enterocitele dein receptori PRR, iar la contactul cu bacteriile patogene elibereaz IgA, chemokine, citokine i peptide antibacteriene. Celulele M transport antigenele luminale ctre celulele prezentatoare de antigen (celule dendritice, macrofage etc.) care le prezint n continuare limfocitelor T naive. Celulele intestinale dendritice dein receptori PRR. Ele i trimit dendritele ctre suprafa, recunosc antigenele, le coopteaz i le transport ctre ganglionul limfatic. Aici prezint antigenele limfocitelor T naive. n ganglion este declanat rspunsul imun care poate fi efector, prin intermediul limfocitelor T helper (Th1, Th2), sau reglator, prin limfocitele T cu rol n reglarea rspunsului imun. La contactul dintre bacteria comensal i receptori nu apare rspuns inflamator sau chiar poate s apar un efect de protecie, prin inhibiia reaciilor inflamatorii care ar putea fi declanate de bacteriile patogene. Molecule precum TOLLIP (Toll interacting protein), SIGIRR (single Ig IL-1 R-related molecule) i NOD2 determin tolerana fa de flora normal gastro-intestinal, prin inhibarea TLR sau prin blocarea cascadei inflamatorii. Limfocitele T reglatoare i celulele intestinale dendritice deprim la rndul lor reacia inflamatorie. Mecanisme ale florei Tolerana fa de flora normal nu este determinat doar de structurile gazdei. Bacteriile comensale dein mecanisme efectoare care le permit supravieuirea n sistemul intestinal. Astfel, ele pot prezenta pe suprafa molecule asemntoare cu cele ale gazdei (ex. Bacteroides spp.) sau pot secreta molecule care mediaz eludarea mecanismelor de aprare ale gazdei. Recent s-a demonstrat c secreia se realizeaz prin sisteme de secreie de tip III (injectarea unor molecule n celulele eucariote, prin intermediul unui flagel) i de tip IV (transportul ADNului sau a unor proteine n celulele eucariote, asemntor mecanismului de conjugare), mecanisme pn acum descrise doar la bacteriile patogene. (Figura nr. 4) Flora normal limiteaz semnalele inflamatorii declanate de bacteriile patogene prin urmtorul mecanism (Figura nr. 5): - NF-kB (transcription factor nuclear factor) este un factor prin care bacteriile patogene transmit semnale inflamatorii la nivelul celulelor epiteliale intestinale. Acest factor determin transcripia genelor p55-p65, cu producia de chemokine i citokine. - flora microbian intestinal activeaz PPAR (peroxisome proliferator-activated receptor) care export p65 n citoplasma enterocitului. Astfel transcripia este blocat, de asemenea i cascada inflamatorie. Spre exemplu, flora intestinal normal scade rspunsul inflamator fa de Salmonella typhimurium.

118

8. 3. 2. Flora microbian normal inhib dezvoltarea bacteriilor patogene prin efectul de barier sau fenomenul de competiie ntr-un organism gazd sntos, flora normal realizeaz un strat protector de-a lungul sistemului intestinal. Bacteriile comensale ocup situsurile de ataare ale mucoasei i consum factorii nutriionali produi de enterocite. La rndul lor, celulele intestinale secret produi antibacterieni, chemokine, citokine i IgA. (Figura nr. 6) n anumite condiii, spre exemplu atunci cnd: - exist o cantitate mai mare de tulpini din specii bacteriene patogene; - este urmat un tratament ndelungat cu antibiotice (mai ales dac au spectru larg); - exist factori care deprim mecanismele de aprare ale gazdei (ex. o stare de imunosupresie, o modificare a tranzitului prin peristaltism sczut etc.); - se exercit aciunea unor factori externi (ex. radiaii, arsuri, substane chimice etc.) flora microbian este afectat, iar bacteriile patogene pot invada mucoasa intestinal. 8. 3. 3. Flora normal intestinal determin greutatea fiecrui individ ntr-un studiu realizat n anul 2006 pe oareci germ-free, hrnii cu alimente bogate n polizaharide, s-a observat c animalele colonizate doar cu Methanobrevibacter smithii i cu Bacteroides thetaiotaomicron au prezentat o depunere semnificativ mai mare de grsime n comparaie cu animalele din alte grupuri de control. S-a demonstrat c: - Bacteroides thetaiotaomicron intervine n dezvoltarea vascularizaiei intestinale; induce formarea reelelor capilare i stimuleaz absorbia i procesarea carbohidrailor; n timp ce - Methanobrevibacter smithii deine funcia unui reglator caloric n intestinul distal i prin sinergie cu B. thetaiotaomicron stimuleaz digestia zaharurilor i crete absorbia caloriilor. Mai recent, s-au descoperit numeroase mecanisme prin care flora microbian normal intervine n reglarea greutii corporale i a depunerilor adipoase. (Figura nr. 7) Primul dintre acestea ar fi influenarea metabolizrii nutrienilor i a reglrii energetice. S-a demonstrat faptul c bacteriile metabolizeaz polizaharide nondigerabile transformndu-le n produi digerabili, astfel crescnd extracia energetic. O alt ipotez stabilete o legtur ntre flora normal intestinal i homeostazia metabolic. O dieta bogat n lipide moduleaz populaiile bacteriene dominante la nivel intestinal: cresc bacteriile Gram negative i scad bifidobacteriile, eubacteriile i Bacteroides spp. Aceast modificare determin creterea nivelului plasmatic al lipopolizaharidelor (LPZ) care induce un rspuns inflamator cronic de mic intensitate la nivelul ficatului, al esutului adipos i al hipotalamusului. Apare o cretere n greutate i o acumulare excesiv a lipidelor la nivel hepatic. n timp, crete riscul apariiei rezistenei la insulin i al dezvoltrii diabetului zaharat de tip 2. (Figura nr. 8) Un al treilea mecanism este acela prin care flora normal induce reglarea unor gene ale gazdei. Acestea sunt implicate n modularea depozitelor i a consumului energetic. Aceste descoperiri ar putea s aib o mare importan att n tratamentul obezitii ct i n tratamentul celor subnutrii. Ar putea explica de ce oameni care consum aceeai cantitate de hran, prezint modaliti diferite de depunere a grsimilor. Totui ar rmne un semn de ntrebare: diferenele observate n flora normal a pacienilor obezi este cauza sau consecina obezitii? 8. 3. 4. Fermentarea i absorbia polizaharidelor n colonul proximal 119

Corpul uman nu deine enzimele necesare fermentrii polizaharidelor. Flora normal ndeplinete aceast funcie. Prin fermentare zaharolitic, bacteriile produc acizi grai cu lan scurt de carbon i gaz. Microorganismele florei normale stimuleaz i controleaz dezvoltarea celulelor intestinale (epiteliale i ale esutului limfoid), prin furnizarea factorilor nutriionali necesari. Bacteriile previn lezarea mucoasei, aceasta constituind o posibil funcie anti-cancerigen. Acizii grai cu lan scurt de carbon, produi de flor, au ca efect scderea pH-ului n lumenul intestinal. Astfel este redus numrul bacteriilor patogene, deoarece acestea au o rezisten sczut la pH acid. Prin fermentarea zaharolitic, flora are o important funcie energetic, crete reabsorbia apei, precum i absorbia unor nutrieni (Ca, Mg, Fe). 8. 3. 5. Alte funcii 8. 3. 5. 1. Fermentarea proteolitic n colonul distal - importana dietei reduse n proteine Prin fermentarea proteolitic flora normal intestinal produce o serie de toxine i substane cu posibil rol n carcinogenez. Cantitatea acestor substane este n relaie direct cu cantitatea de proteine ingerate. 8. 3. 5. 2. Conversia acizilor biliari n cocarcinogeni Bacterii precum Streptococcus faecalis, Veilonella spp. metabolizeaz prin deconjugare sau hidroliz acizii biliari dezoxicolic i litocolic, cu producie de cocarcinogeni. Lactobacillus bifidus blocheaz acidul colic intracelular i astfel mpiedic formarea de cocarcinogeni. 8. 3. 5. 2. Biosinteza vitaminei K Flora normal produce 50% din necesarul zilnic de vitamin K. Bacteroides fragilis i Escherichia coli particip la sinteza vitaminei K2. 8. 3. 5. 3. Absorbia vitaminei B12 A fost dovedit rolul florei intestinale normale n absorbia de vitamin B12. 8. 3. 6. Flora microbian normal - partenerul silenios n manifestarea bolii Boala inflamatorie intestinal (boala Crohn i colita ulcerativ) reprezint un exemplu care trebuie luat n discuie i aflat n relaie cu flora intestinal normal. (Figura nr. 9) Boala inflamatorie intestinal include: - boala Crohn, n care procesele inflamatorii apar n principal la nivel intestinal, dar i la nivelul altor organe. Cel mai frecvent sunt afectate segmentele terminale ale intestinului subire; n cazul afectrii colonice pot aprea fistule i abcese n regiunea anal. - colita ulcerativ include rspunsul inflamator la nivelul mucoasei ce cptuete interiorul rectului (proctita) sau la nivelul ntregului colon (colit ulcerativ). n momentul actual, nu a fost stabilit cu exactitate cauza apariiei acestei entiti patologice. Totui, s-a observat c exist anumii factori declanatori, prezeni la persoanele afectate: - o predispoziie genetic; - lipsa alptrii la sn n perioada de sugar i nou-nscut; - igiena excesivn copilrie, cu o insuficient dezvoltare a rspunsului imun; 120

- excese n consumul de grsimi animale i carbohidrai; - tratament cu antibiotice utilizat frecvent. Se pare c unul dintre elementele de luat n consideraie ar fi pierderea toleranei fa de flora normal intestinal, cu apariia unui rspuns imun aberant, cu stri de hipersensibilitate i reacii autoimune. Apare o permeabilitate intestinal crescut. Compoziia florei normale este modificat (de ex. specii din genul Clostridium apar n proporie mai mare fa de normal), dar nu s-a putut demonstra dac aceasta determin boala sau dac este doar un efect al inflamaiei intestinale. Se pare c exist i o serie de alte boli n care este implicat flora normal, spre ex. neoplazii (digestive sau n afara sistemului digestiv), infecii produse n alte sisteme dup modificarea habitatului (ex. Escherichia coli n momentul n care ajunge la nivelul tractul urinar), obezitate, stri de hipersensibilitate, autism, depresie etc. 8. 3. 7. Farmabioticele Reprezint orice form de exploatare farmaceutic a florei normale (probiotice, prebiotice, sinbiotice). Probioticele sunt suplimente alimentare care conin microorganisme vii (bacterii, fungi) cu efecte benefice asupra corpului uman; bacteriile folosite sunt n general cele productoare de acid lactic (scad pH i mpiedic dezvoltarea bacteriilor patogene). (Figura nr. 7) Genurile utilizate sunt Lactobacillus i Bacteroides. Prebioticele reprezint ingrediente alimentare non-digerabile care afecteaz n mod pozitiv gazda, stimulnd n mod selectiv creterea i/sau activitatea unei sau a unui numr limitat de bacterii din colon; majoritatea sunt carbohidrai iar bacteriile stimulate sunt Bifidobacteria sau bacteriile productoare de acid lactic. Sinbioticele sunt produse care conin att probiotice, ct i prebiotice. Exist dovezi ce susin rolul terapeutic al probioticelor n boala inflamatorie intestinal, infecii, cancer, artrit.

8. 4. Relaii microorganism-gazd Cu o parte din microorganismele ntlnite organismul stabilete relaii de simbioz, convieuirea fiind folositoare pentru ambii parteneri (de exemplu sinteza de vitamine la care particip unii coliformi intestinali). Foarte multe din microorganismele care alctuiesc microflora normal se afl n relaii de comensualism cu organismul, germenii depinznd nutriional de gazd, creia nu i creeaz prejudicii. Aceast convieuire exprim ns un echilibru instabil, care poate fi uor tulburat. Diferii factori (ai gazdei, din mediul extern sau biologici intrinseci ai germenilor) pot modifica aceste relaii, astfel nct unele microorganisme din flora normal pot manifesta aspecte patogene - este vorba de microorganismele condiionat patogene. Relaia de parazitism tipic apare ns doar atunci cnd microorganismele se dezvolt n detrimentul gazdei, cu manifestri clinice mai mult sau mai puin evidente. Astfel, n cazuri extreme unele bacterii sunt obligatoriu parazite, nu se pot dezvolta dect n organismul gazdei (de exemplu Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia pneumoniae etc). Alte bacterii sunt facultativ parazite, putnd tri i libere n natur, dar o dat 121

ptrunse n organism stabilesc cu acesta relaii de parazitism (de exemplu Clostridium tetani, Clostridiile gangrenei gazoase, Salmonella typhi etc).

8. 5. Povestire adevrat Rolul i importana florei microbiene normale a organismului, sunt mai mult dect bine stabilite. Rolul infecionistului este, ca pe durata tratamentelor cu antibiotice pentru diverse afeciuni, s afecteze ct mai puin aceast flor. O prim idee este utilizarea de antibiotice cu spectru ct mai intit (ngust), cu efect asupra patogenului respectiv. Pe de alt parte piatra de ncercare a medicilor, credem, o reprezint evitarea tratamentelor antibiotice inutile. Ci dintre medici nu recomand scheme dup scheme de medicamente anti-stafilococice doar pentru c la exsudatul faringian se izoleaz un stafilococ, fie el chiar i auriu? Mai toi. ncercm sterilizarea de acel stafilococ, doar dac pacientul urmeaz s primeasc un transplant (ex. medular sau hepatic) sau dac va primi un tratament intens imunosupresor, altfel nici nu trebuie cutat! Iar pe de alt parte, rmne o ntrebare pe care o punem tuturor generaiilor de studeni cu care lucrm: n cte dintre cazurile de infecii stafilococice ntlnite i raportate n foile de observaie pe care le vor vedea este menionat i testul coagulazei? ns, revenind la subiectul acestui capitol, nu trebuie s uitm niciodat c utilizarea medicamentelor antibiotice i chimioterapice, n special a celor cu spectru larg, afecteaz uneori decisiv flora microbian normal a crei utilitate este n momentul de fa binecunoscut.

8. 6. tiai c ... ....Gregor Reid, director al Centrului Canadian petru Cercetarea i Dezvoltarea Probioticelor a afirmat: Lactobacilul este doar o bacterie. S spui c un produs conine lactobacil este ca i cum ai spune c l aduci pe George Cloney la o petrecere. Poate fi actorul sau poate fi doar un tip de 85 de ani din Atlanta pe care ntmpltor l cheam George Cloney. n cazul probioticelor exist diferene importante ntre tulpini? ....atunci cnd dorii s achizionai produse ce conin probiotice ar trebui s le cutai pe acelea pe a cror etichet este specificat tulpina coninut i care ofer cititorilor acces liber la studiile tiinifice de suport? O surs bun pentru informarea asupra efectelor variatelor tulpini probiotice este www.PubMed.gov. ....putei s v facei singuri iaurt cu probiotice? Avei nevoie de 1l lapte steril-orice tip, chiar i de soia, un iaurt-sursa de probiotice i de un recipient n care dorii s facei iaurtul. Cuptorul se ncalzete timp de 15 minute la 180 grade, se las s se mai rceasca timp de 10 minute. Se aeaz n cuptor recipientul i compoziia pentru iaurt. Se nchide ua de la cuptor i se las 12 ore, peste noapte. Dac diminea observai c nu a ajuns la consistena dorit mai lsai-l n cuptor timp de 12-24 ore.

8. 8. Evaluarea cunotinelor

122

Descoperii rspunsul corect: 1. Unde exist numrul cel mai mare de bacterii comensale? a. Pe tegumente b. n intestine c. n orofaringe 2. Care sunt celulele implicate n educarea sistemului imunitar de ctre flora intestinal? a. bacteriile comensale, celulele dendritice, limfocitele T, limfocitele B b. bacteriile comensale, celulele dendritice din mucoasa intestinal, limfocitele T c. celulele epiteliale intestinale, limfocitele T, limfocitele B 3. Factorul ce stimuleaz dezvoltarea florei normale intestinale este: a. peristaltismul redus b. antibioticele c. alptarea

8.7. Direcii de cercetare Pentru o cunoatere suplimentar a acestei problematici, putei examina i urmtoarele articole: Probiotics in inflammatory bowel disease: is it all gut flora modulation? S Ghosh, D van Heel, R J Playford Gut. 2004 May; 53(5): 620622. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1774052/ Inflammatory Bowel Disease Live Transmission, Gail A. Hecht, M.D. N Engl J Med; 358:528530 January 31, 2008 http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMcibr0707718 Alterations in Intestinal Microbial Flora and Human Disease Mohamed Othman; Roberto Agero; Henry C. Lin Curr Opin Gastroenterol. 2008;24(1):11-16. 2008 Lippincott Williams & Wilkins http://www.medscape.com/viewarticle/568375

123

9. Patogenitate i Virulen (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)


9. 1. Agenii infecioi Agenii cauzali ai bolilor infecioase (microorganismele condiionat patogene, dar mai ales germenii patogeni) sunt foarte numeroi. Ei se pot mpri n urmtoarele grupe mari: - virusuri = agent patogen care se reproduce numai n interiorul celulelor vii i care provoac boli infecioase numite viroze; - chlamydii = bacterii Gram-negative, strict parazite, imobile, care se multiplic n citoplasma celulelor gazd printr-un ciclu de dezvoltare caracteristic; - mycoplasme = cele mai mici microorganisme care pot tri liber n natur i care se pot dezvolta pe medii artificiale mbogite; - rickettsii = microorganisme care au dimensiuni mai mici dect bacteriile; de regul nu se pot cultiva n afara celulelor vii; - bacterii propriu-zise; - fungi; - protozoare = grup de organisme unicelulare, din grupul protistelor; - metazoare. n ultimii 25-30 de ani se discut din ce n ce mai mult despre rolul jucat de prioni, constituii dintr-o particul de natur proteic avnd caracter infecios, lipsit de acid nucleic, cu potenial patogen destul de subtil exprimat. Prionii rezist la aciunea a numeroi factori fizici i chimici care inactiveaz virusurile. Sunt capabili de a se reproduce. Afecteaz att oamenii ct i mamiferele. Sunt implicai etiologic n maladii cu evoluie lent, precum encefalopatia spongiform transmisibil care include spre exemplu boala Creutzfeldt-Jacob, insomnia fatal familial etc, afeciuni n care sunt prezente leziuni degenerative la nivelul SNC. Pornindu-se de la encefalopatia spongiform bovin, ncepnd cu anul 1996 au fost descrise afeciuni umane, dup consumul de carne de vit; maladia poart numele de Creutzfeldt-Jacob noua variant. Principalele manifestri sunt reprezentate de: depresie, anxietate, alterarea ritmului somnveghe. La o treime din pacieni, manifestrile oculare pot masca demena. Deteriorarea mental este rapid progresiv, de la descoperirea simptomelor pn la deces trecnd n medie 7-9 luni. (1) Microorganismul patogen este capabil s colonizeze diferite zone ale gazdei, producnd un proces infecios n primul rnd prin invazia i penetrarea barierelor dermice i ale mucoaselor, multiplicarea ducnd la distrucia tisular i invadarea arborelui limfatic i vascular (sepsis). Aceste aspecte sunt influenate n larg msur de: - factorii de patogenitate ai microorganismului; - factorii de aprare ai gazdei.

9. 2. Patogenitate i virulen. Caracterele de patogenitate ale bacteriilor

124

Patogenitatea reprezint capacitatea unui germen de a declana n organismul gazd fenomene morbide, patogene, modificri locale, generale i functio laesa. Patogenitatea este un atribut de specie i este determinat genetic. Virulena reprezint gradul diferit de patogenitate exprimat n cadrul unei specii. Este un atribut al tulpinii microbiene agresoare. Variabilitatea n exprimarea patogenitii depinde de condiiile n care triete microorganismul respectiv (de exemplu, o populaie bacterian care a pierdut virulena n condiii nefavorabile poate redeveni virulent n anumite condiii, aa cum se ntmpl cu tulpina vaccinal BCG la pacienii cu infecie HIV / SIDA). Virulena poate fi cuantificabil de ex. prin numrul de microorganisme necesare n condiii standard pentru a omor 50% dintr-un grup de animale (acest numr este numit DL50, adic doza letal 50%). Factorii care condiioneaz patogenitatea i virulena unei specii (tulpini) microbiene pot fi: - multiplicarea i invazivitatea manifestat de germenii patogeni; - multiplicarea i elaborarea de toxine de ctre germenii toxigeni (n general exotoxine).

9. 2. 1. Multiplicarea i invazivitatea Germenii patogeni se multiplic la poarta de intrare i invadeaz organismul prin formarea de abcese i prin propagarea din aproape n aproape n pat de ulei, dar pot trece i direct n circulaia general. n acest caz produc infecii la distan. Pentru a avea loc aceast succesiune a evenimentelor, germenii trebuie s poat rezista reaciilor de aprare nespecific a gazdei (de exemplu fagocitozei) i s poat adera de celulele mucoaselor (prin adezine) sau de anexele dermului. Exist o aderen nespecific, de fapt un proces chimic i fizic, reversibil, cu implicarea atraciei hidrofobe, electrostatice dar i a micrii browniene i a existenei biofilmului de polimeri. Aderena specific poate fi la rndul su reversibil dar, dac implic suficient de muli factori (structurali, diferite fore de legtur), poate deveni ireversibil. Biofilmul include populaii bacteriene aparinnd uneia sau mai multor specii, nconjurate de polimeri extracelulari (EPS - extracellular polymeric substances). Microorganismele ader ntre ele, dar i la suprafee, formndu-se o structur asemntoare unui sistem circulator ce permite accesul nutrienilor i eliminarea substanelor reziduale, precum i comunicarea interbacterian. Dezvoltarea biofilmului cuprinde 5 etape (Figura nr. 1): ataarea reversibil, ataarea ireversibil, maturarea 1, maturarea 2 i dispersia. Industrial, biofilmele sunt responsabile de ancrasarea rezervoarelor de stocare i de nfundarea conductelor de ap. Din punct de vedere medical, se pot observa n cazul endocarditei (pe valve), otitei medii, plcii dentare i pot reprezenta o problem pentru pacienii cu fibroz chistic. Biofilmele se dezvolt i pe implanturi sintetice cum ar fi: catetere intravasculare, valve, pacemakere, instrumente ortopedice, lentile de contact etc. O caracteristic foarte important a biofilmelor este reprezentat de rezistena crescut la antibiotice, de pn la 500 de ori mai mare. Responsabile de aceasta sunt att EPS, care acioneaz ca o barier sau care pot chiar inactiva antibioticele, ct i faptul c n cadrul biofilmului bacteriile cresc mult mai greu, astfel nct o activitate metabolic sczut va conduce la o asimilarea mai lent a antibioticelor. 125

Dintre bacteriile implicate n producerea de biofilme amintim: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, streptococi i hemolitici etc. (2) Poate fi luat n discuie i tropismul, care poate fi specific pentru anumite structuri ale gazdei [ex. tulpinile de E. coli uropatogene ader cu ajutorul unei adezine papG (pyelonephritisassociated pili), numai la anumii receptori situai la suprafaa celulelor epiteliale renale] sau ar putea fi specific de specie (de ex. streptococul piogen din grupul A, meningococul sau gonococul infecteaz numai gazda uman). 9. 2. 1. 1. Factori somatici care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor - pilii comuni (fimbriile), cu rol n aderare. Bacteriile pot produce unul sau mai multe tipuri de pili, astfel c cele care produc pili specifici, vor fi asociate cu capacitatea de a infecta un anumit tip de esut. De exemplu, E. coli uropatogen prezint pili de tip P sau Pap, avnd tropism pentru tractul urinar. (3) - lectinele (proteine care au tropism pentru carbohidrai); - liganzii (molecule care realizeaz legturi specifice cu anumite molecule complementare de la nivelul substratului); - glicocalixul (component structural extern a polizaharidului de la suprafaa celulei bacteriene); - noroiul (un mediu vscos peribacterian, constnd dintr-o subclas de substane polimerice extracelulare ce conin n general polizaharide i mediaz ataarea nespecific a bacteriilor ntrun strat vscos); - capsula (are proprieti antifagocitare i uneori este implicat n aderare, spre ex. n cazul Streptococcus mutans, cu efecte cario-genetice); - adezinele (de fapt, toi factorii enumerai mai sus pot fi definii drept adezine); - substane componente ale peretelui bacterian - proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A (Figura nr. 2); Proteina M este un dimer ancorat n membrana citoplasmatic, ce va proemina la suprafaa peretelui bacterian, msurnd de la acest nivel 50-60 nm. Aceasta are rolul de a mpiedica fagocitoza sau opsonizarea de ctre PMN, n lipsa anticorpilor specifici; anticorpii se vor lega la captul variabil N-terminal al dimerilor. - antigenul Vi de suprafa al unor bacili Gram-negativi (de exemplu, Salmonella typhi etc). Antigenul Vi este un polizaharid capsular ce are capacitatea de a mpiedica aciunea anticorpilor, are proprieti antifagocitare i crete rezistena la peroxid. Serotipurile care prezint acest antigen sunt: Typhi, Paratyphi C i Dublin. Unele tulpini de Citrobacter freundii produc un compus asociat bacteriei identic cu Vi al primelor dou serotipuri, fiind sursa ideal de antigen Vi, necesar preparrii antiserului. - polizaharidul A al S. aureus (un acid teichoic); - antigenul O al bacteriilor Gram-negative (Figura nr. 3); Antigenul O face parte din lipopolizaharid/lipooligozaharid (LPZ/LOZ), structur ce are rolul de a proteja bacteria de enzime ce au capacitatea de a degrada peptidoglicanul (de exemplu, lizozimul) i ofer rezisten mpotriva srurilor biliare, complementului (diminund activitatea MAC membrane attack complex) i fagocitozei; prezint i activitate mitogen, stimulnd diferenierea policlonal i multiplicarea limfocitelor B, determinnd astfel secreia de imunoglobuline, precum IgM i IgG.

126

LPZ cuprinde 3 regiuni: lipidul A (regiunea I), o poriune centrala rugoas polizaharidic (regiunea II) i polizaharidul O / antigenul O (regiunea III). - antigenele de tip K (cu structur polizaharidic sau polipeptidic - pentru Bacillus anthracis) etc. n ceea ce privete procesul aderenei, se cunoate faptul c orice obiect aflat n imersie atrage particulele suspendate, inclusiv microorganismele, la suprafaa lui. Teoria coloidal DLVO (dup numele autorilor) menioneaz c la nivelul suprafeei de imersie exist 2 poziii de stabilitate termodinamic, prin intervenia gravitaiei, chemotaxiei, forelor de tip van der Waals, forelor electrostatice i tensiunii superficiale (Schema nr. 1). Contrabalansarea forelor de atracie i repulsie conduce la mpingerea dezordonat a particulelor spre un minim secundar, poziie ce se situeaz la suprafaa de imersie. Acest minim secundar corespunde fenomenului de adsorbie sau reinere (docking), proces reversibil. Ulterior sunt implicate i alte fore de legtur (covalente, de hidrogen, ionice, hidrofobe) care vor duce la atingerea minimumului primar, cnd particulele devin legate ireversibil de substrat. Aderena se produce atunci cnd particulele prsesc minimumul secundar i intr n minimumul primar. Pentru unele bacterii (ex. V. cholerae, unele tulpini de E. coli, B. pertussis, Helicobacter pylori) ataarea este destinaia final, n timp ce pentru altele (ex. Salmonella, Shigella, Yersinia) reprezint doar o etap, urmnd penetrarea tisular i / sau diseminarea n organism. 9. 2. 1. 2. Factori solubili care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor (agresine) (Tabelul nr. 1) - coagulaza liber i/sau legat a S. aureus care transform fibrinogenul n fibrin i pe de o parte poate masca bacteria nconjurat de structuri asemntoare cu ale gazdei, pe de alt parte poate preveni fagocitarea sau chiar mpiedica ajungerea antibioticelor i chimioterapicelor la sediul infeciei; - leucocidina secretat dup ce stafilococul a fost fagocitat i care transform leucocitul n piocit (se inser n membrana leucocitului i produce pori sau degradeaz enzimatic fosfolipidele de la nivelul membranei); - producerea unor substane care cresc concentraia intracelular de AMPc pn la concentraii ce inhib fuzionarea fagozom-lizozom (de exemplu la Mycobacterium tuberculosis); - producerea de catalaz (de exemplu: Staphylococcus aureus, Mycobacterium fortuitum), glutation peroxidaz, superoxid dismutaz, citocrom oxidaz (Vibrio spp., Pseudomonas aeruginosa, Neisseria spp.) care inhib sau inactiveaz radicalii activi de oxigen; - producerea unor factori care confer rezisten la enzimele lizozomale, dup fuzionarea fagozom-lizozom (Salmonella enteritidis, Mycobacterium leprae etc); - producerea de enzime litice: 1. colagenaza (este produs de Clostridium histolyticum i Clostridium perfringens i distruge colagenul prezent n muchi facilitnd rspndirea procesului infecios), hialuronidaza (scindeaz acidul hialuronic, o component a esutului conjunctiv), fibrinolizina (determin liza cheagului prin convertirea plasminogenului n plasmin) etc (streptococ, stafilococ, unele clostridii);

127

2. lecitinaza (distruge lecitina din structura membranei celulare, de exemplu Clostridium perfringens, Bacillus anthracis); 3. fosfolipaza (toxina a) (realizeaz hidroliza fosfolipidelor din membrana celular, prin ndeprtarea capetelor polare, de exemplu Clostridium perfringens); 4. neuraminidaze (degradeaz acidul sialic, de exemplu V. cholerae, Shigella dysenteriae); 5. proteaze, nucleaze ( DN-aze, RN-aze cu activitate endo- i exonucleazic asupra ADN i ARN, genernd 3-nucleotide), carbohidraze, lipaze etc; 6. hemolizine sunt enzime ce lizeaz hematiile din mediile de cultur cu snge (streptococ, stafilococ, unele clostridii) etc. - producerea unor substane care inhib sau modific rspunsul imun 1. IgA proteaza (cliveaz IgA n regiunea balama, de exemplu gonococ, meningococ, H. influenzae); 2. proteina A stafilococic (inhib opsonizarea); 3. endotoxina care crete sinteza de IL-1, IL-6, IL-8, TNF- etc; 4. inducerea apariiei unor reacii autoimune; 5. producerea superantigenelor (de exemplu S. aureus prin producerea toxinei implicat n sindromul de oc toxic, TSST-1), molecule care pot activa independent celulele T4 (sunt printre cei mai puternici mitogeni ai limfocitelor T); stimularea datorat lor poate determina att anergie, ct i hiperactivarea sistemului imun. (Figura nr. 4) Rezult o secreie n exces de IL-2 care interfer cu sinteza altor citokine (TNF-, IL-1, IL-8 etc). Alte exemple de superantigene ar fi: toxina pirogenic streptococic (produs de tulpinile lizogenizate), enterotoxinele stafilococice (S. aureus), subtane cu efecte asemntoare hormonilor (ex. toxina stabil termic produs de E. coli enterotoxigen) etc. Fiecare din substanele de mai sus are un rol bine definit n evoluia reaciei inflamatorii locale.

9. 2. 2. Multiplicare i toxinogenez Germenii se multiplic la poarta de intrare i elaboreaz exotoxine care produc alterri celulare i distrucii tisulare la distan, prin inhibarea metabolismului celulei eucariote i prin functio laesa (toxikon era otrava n care erau nmuiate sgeile lupttorilor greci). Din punct de vedere didactic trebuie menionate urmtoarele noiuni: 9. 2. 2. 1. Exotoxinele

128

Exotoxinele sunt elaborate n general de microbi Gram-pozitivi lizogenizai (de exemplu bacilul difteric, streptococul beta hemolitic de grup A, Clostridium botulinum) sau codificat plasmidic (Clostridium tetani, Bacillus anthracis), dar i de bacili Gram-negativi, prin mecanism cromozomial (V. cholerae, Bordetella pertussis, Shigella shiga, Pseudomonas aeruginosa) sau sub control plasmidic (unele tulpini de E. coli). (Tabelul nr. 2) Au structur proteic, fiind formate dintr-un domeniu B (bind) obligatoriu, necesar legrii de receptorii celulei gazd i internalizrii ulterioare a poriuni enzimatice A (active). Exotoxina nu i exercit efectele toxice dect dup ce poriunea A este eliberat din structura iniial. Sunt secretate n timpul vieii germenilor. Sunt difuzibile la distan. Toxicitatea lor este foarte mare, doza letal fiind de circa 0,1 g/kg corp (pn la 1 ng/kg corp n cazul toxinei botulinice). Au afinitate diferit n funcie de specia care le-a elaborat (de exemplu pentru miocard, SNC, rinichi n cazul bacilului difteric). Manifestrile clinice apar dup o perioad de laten (cnd toxina este deja fixat pe celulele int). Multe din bolile produse pot fi considerate toxiinfecii i reprezint urgene medicale, toxina putnd fi neutralizat numai dac este liber n circulaie. Au putere antigenic mare, fa de ele aprnd anticorpi antitoxin. Un alt exemplu important privind exotoxinele se refer la Tcd A i Tcd B, produse de Clostridium difficile i care acioneaz asupra celulelor intestinului gros, fiind responsabile de o boal diareic uoar, pn la colit fulminant. Ele produc la acest nivel leziuni microscopice, dar i leziuni mari, asemntoare unor plgi; endoscopic, se vor identifica noduli. Prin degradarea proteinelor Rho, Rac i Cdc 42, responsabile de reglarea proceselor structurale dependente de polimerizarea actinei, se poate observa la microscopul electronic alterarea microfilamentelor de actin, rezultnd marginalizarea nucleului, schimbri n morfologia citoscheletului, dar i alte modificri (alterarea suprafeei celulare i rearanjarea microvililor). (Figura nr. 5) Astfel, modificrile produse de toxinele Tcd A i Tcd B sunt: inflamaia, creterea permeabilitii esutului epitelial intestinal, stimularea producerii de chemokine i citokine, acumularea de neutrofile, producerea intermediarilor reactivi ai oxigenului, activarea mastocitelor, producerea substanei P, distrugerea direct a mucoasei intestinale, ruperea jonciunilor strnse (Zonula occludens), degradarea actinei F. Substana P este responsabil de: activarea neuronilor din submucoas, eliberarea TNF-, activarea macrofagelor din lamina propria; este implicat n diareea inflamatorie. 9. 2. 2. 2. Antitoxinele Avnd structur proteic, exotoxinele sunt imunogene i determin apariia de anticorpi specifici (antitoxine) care pot neutraliza in vitro sau in vivo activitatea toxic prin cuplare specific cu toxina. (Tabelul nr. 3) Se pot obine astfel seruri imune utile n seroterapia specific. De regul aceste seruri sunt preparate pe cal i sunt utile n neutralizarea exotoxinelor (ex. n tratamentul difteriei, tetanosului, botulismului). Administrarea antitoxinelor trebuie fcut cu precauie datorit faptului c anticorpii preparai pe cal reprezint n acelai timp i antigene pentru gazda uman, dar n acelai timp ct mai curnd posibil. Tratamentul acestor entiti clinice este complex i nu reprezint subiectul acestui manual. Administrarea antitoxinelor trebuie fcut dup o testare a unei eventuale hipersensibiliti i n cazul c aceasta exist se recurge la desensibilizare i abia ulterior la seroterapie (administrarea 129

de antitoxin). O alternativ ar fi administrarea de imunoglobuline umane specifice, dac acestea sunt disponibile. 9. 2. 2. 3. Anatoxinele Exotoxinele pot fi detoxifiate ntr-un anumit interval de timp sub aciunea conjugat a temperaturii i formolului. Prin acest procedeu i pierd puterea toxic, dar i menin puterea imunogen i devin anatoxine. Anatoxinele se utilizeaz n profilaxia bolilor produse de germenii respectivi (n cadrul vaccinurilor DTP, DT, dT, ATPA, ADPA etc), precum i pentru hiperimunizarea animalelor n scopul obinerii de seruri antitoxice (antidifteric, antitetanic, antibotulinic etc). 9. 2. 2. 4. Endotoxinele Endotoxinele au fost evideniate la germenii Gram-negativi, la nivelul membranei externe. Sunt elaborate de acetia i apoi incluse n peretele bacterian, eliberndu-se n urma distrugerii germenilor. Au structur lipopolizaharidic (LPZ sau LOZ), n constituia lor intrnd acizi grai, un lipid A i lanuri de polizaharide. (Figura nr. 6) Au efecte toxice la nivelul celulelor majoritii mamiferelor; aceste efecte sunt similare indiferent de specia bacterian care le elibereaz. Toxicitatea lor este ceva mai redus (n comparaie cu exotoxinele), dar pot aciona la mai multe nivele inducnd apariia febrei, leucopeniei, hiperpermeabilitii vasculare, hipotensiunii arteriale pn la colaps, sindromului de coagulare intravascular diseminat etc. Sunt implicate ntre altele n apariia ocului endotoxic (se elibereaz o cantitate de endotoxin proporional cu numrul germenilor distrui). Studiile arat c mortalitatea n ocul endotoxic este n relaie destul de direct cu cantitatea de endotoxin / ml, fiind de circa 80% la cazurile la care se identific 100 uniti endotoxin / ml de plasm. Aa cum am menionat n capitolul privind structura bacterian, componenta toxic este reprezentat de lipidul A; totui, i polizaharidul O (structur antigenic) contribuie la patogenitate s-a dovedit c bacteriile de la care s-a extras polizaharidul O sunt mai uor distruse prin mecanisme care implic sistemul complement. LPZ aflat n circulaie se cupleaz cu proteine plasmatice (LPS-binding plasma proteins) i apoi este recunoscut prin intermediul receptorilor CD14 de ctre monocite i macrofage. Se activeaz rspunsul inflamator, coagularea intravascular, apariia de hemoragii i n final poate rezulta ocul. Sunt implicate mai multe citokine, de ex. IL-1, IL-6, IL-8 i TNF- care la rndul lor stimuleaz cutia Pandorei i respectiv producia de leucotriene i prostaglandine (cu efect de cretere a fenomenelor inflamaiei). Sunt activate att sistemele de coagulare ct i sistemul complement iar cascadele de reacii care apar sunt rareori reversibile n urma tratamentului. Puterea antigenic i imunogen este mai redus fa de exotoxine. LPZ n calitate de mitogen stimuleaz o activare policlonal a LB, cu secreia de IgG i IgM. n afara LPZ sau LOZ, mai sunt i alte endotoxine, prezente la bacteriile Gram-pozitive: - delta endotoxina prezent la Bacillus thuringiensis, toxin care nu afecteaz omul, deoarece acesta nu prezint enzime i receptori care s o proceseze; - Listeria monocytogenes produce o substan endotoxin-like etc.

9. 3. Aprarea organismului fa de infecii 130

Aprarea organismului fa de infecii se realizeaz prin diferite mijloace nespecifice i specifice. Acestea exprim mpreun capacitatea normal de pstrare a homeostaziei organismului prin rezistena fa de aderarea microorganismelor de celulele esuturilor expuse, fa de colonizarea i multiplicarea germenilor n organism, prevenind invazia agenilor patogeni. Principalele componente ale aprrii antiinfecioase sunt reprezentate de: 9.3.1. bariera anatomic cutaneo-mucoas, care acioneaz prin: - Integritatea sa anatomic: Pielea este o barier n faa invaziei microorganismelor deoarece este format din straturi de celule strns unite ntre ele, dar i datorit stratului de keratin. Descuamarea continu a straturilor pielii are rol n eliminarea microorganismelor. n general bacteriile nu pot penetra pielea. Procesul infecios poate debuta n urma unor traumatisme, intervenii chirurgicale, utilizarea de catetere iv, interveniei unor vectori. (3) - Sinteza unor peptide cu rol dezinfectant: dermicidin, -defensin. Acestea au i rol de chemokine, favoriznd migrarea celulelor cu rol n fagocitoz. - Mucoasele sunt umede i dein mai multe bacterii dect pielea. Majoritatea celulelor epiteliale secret aceleai peptide ca i cele ale pielii. n plus conin saliv, mucus, lacrimi, cu rol antimicrobian. Lacrimile au rol protector i prin coninutul crescut de lizozim. - Prezena de: IgA secretorii (sunt secretate IgA i IgG cu rol n aglutinarea, dar i blocarea competitiv a receptorilor celulelor. Cantitatea de IgA la nivelul fluidelor mucoaselor este mai mare dect IgG datorit rezistenei acesteia la proteoliz prin cuplarea cu un polipeptid. IgA se poate lega de bacteriile patogene intracelulare mpiedicnd ptrunderea acestora n celule.), lactoferin (protein cu rol n legarea fierului. Fierul este un element important pentru supravieuirea bacteriilor. Cu toate acestea, bacteriile care colonizeaz pielea i mucoasele au mecanisme de achiziionare a fierului chiar n prezena acestor proteine), alfa 1 antitripsin, lizozim (joac unul din rolurile cele mai importante, avnd efect antimicrobian asupra bacteriilor gram pozitive prin hidroliza aminoacizilor din componena peptidoglicanilor) etc.; - pH-ul acid al unor secreii locale: pH-ul acid i flora bacterian au rol n inhibarea invaziei bacteriilor patogene. Zonele inflamate au susceptibilitate crescut la colonizare. - Prezena microflorei normale, ce constituie nia ecologic pe care germenii nou venii tind s o ocupe. Flora comensal este un ecosistem cu rol n aprarea mpotriva invaziei microorganismelor patogene. Mecanismele competitive sunt: competiia pentru aceleai substane nutritive, competiia pentru aceiasi receptori. Secret i bacteriocine, fiind toxice pentru alte bacterii, dar de obicei din aceeai specie, acizi grai volatili sau ali metabolii toxici. 9.3.2. barierele de organ - Bariera hematoencefalic: este o barier fiziologic ntre sistemul sangvin i sistemul nervos central (SNC). Aceasta servete la meninerea unei homeostazii constante n SNC. Aceast barier are rolul de filtru, mpiedicnd ptrunderea n creier a unor substane toxice, germeni patogeni, care se pot afla n snge. n acelai timp bariera permite ptrunderea din snge a substanelor nutritive necesare SNC. - Tractul respirator: particulele inhalate pot supravieui filtrrii n tractul respirator superior i traheobronic. Fluxul turbulent determin depunerea particulelor de dimensiuni mari la nivelul mucusului tractului respirator, iar sistemul mucociliar le ndeparteaz din plmani. Efortul de 131

tuse ajut la eliminare. Secreiile bronice conin substane precum: lizozim, -defensine, lectine. Cnd particulele inhalate ajung la nivelul alveolelor ndeprtarea este realizat de macrofage i histiocite. Toate aceste mecanisme de aprare pot fi nvinse de microorganisme prin cantitatea acestora sau prin expunere ndelungat. Poluarea aerului, prezena traheostomei, agenii alergici, defectele genetice etc. pot diminua mecanismele de aprare ale tractului respirator. - Tubul digestiv: Bariera acestuia este reprezentat de aciditatea gastric i rolul antibacterian al diferitelor enzime (pancreatice, intestinale, biliare). Peristaltismul i descuamarea celulelor epiteliale au i ele rol n aprarea antimicrobian. Salmonella spp. i M. tuberculosis produc infecii la persoanele cu aclorhidrie, iar peristaltismul ncetinit favorizeaz infecia cu Shigella spp. Pierderea jonciunilor strnse dintre enterocite poate favoriza translocarea bacteriilor n circulaie. - Tractul genitourinar: urina este n mod normal steril. Factorii care mpiedic colonizarea bacterien sunt pH-ul, ureea, hipertonicitatea, glicoproteina Tamm-Horsfall (produs de rinichi i excretat n cantitate mare n urin). Glicoproteina Tamm-Horsfall acioneaz ca un burete, bacteriile leagndu-se de aceasta i astfel mpiedicnd colonizarea esuturilor. Tractul urinar inferior este splat de fluxul urinar de 4-8 ori pe zi, eliminnd organismele patogene. Retenia urinar este una dintre principalele cauze ale infeciilor urinare. 9.3.3. ganglionii limfatici de pe traiectul vaselor limfatice; Link Capitolul 10 9.3.4. sistemul fagocitar: Fagocitoza este mecanismul de nglobare i distrugere a microorganismelor de ctre celulele dendritice, PMN, macrofage etc. Macrofagele se gsesc n toate esuturile corpului, iar celulele PMN i monocitele circul prin snge i sistemul limfatic. Chemokinele au rol n iniierea migrrii celulelor fagocitare spre esuturi, avnd rol n inflamaie. Cnd o bacterie este internalizat ntr-un fagozom, este distrus de radicalii de oxigen, i de diverse peptide. Microorganismele sunt digerate, iar peptidele se cupleaz cu moleculele complexului major de histocompatibilitate, fiind ulterior prezentate limfocitelor T, determinnd multiplicarea acestora i activarea rspunsului imun celular i umoral. Fagocitoza este mai eficient n spaiile intratisulare nguste (alveolele pulmonare), dect la nivelul suprafeelor ntinse (sinovial) sau n snge. Opsonizarea favorizeaz fagocitoza. 9.3.5. sistemul complement; Link Capitolul 15 (Sistemul complement) 9.3.6. citokinele: Link Capitolul 13 (Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi) - interferonii (alfa, beta, gamma); - interleukinele; - colony-stimulating factor (CSF); - citolizinele-factorul de necroz al tumorilor (TNF) alfa i beta; - poliperforinele; - factorii de cretere, de exemplu transforming growth factor (TGF) alfa i beta; - factorii supresori i inhibitori ai multiplicrii. 9.3.7. sistemul imun (umoral i celular);

132

9.3.8. ali factori: - complexul major de histocompatibilitate (MHC); Link Capitolul 12 - imunitatea de specie (natural, nnscut); - factorii nutriionali (vitamine, fier, zinc etc): Scderea fierului seric poate fi rezultatul rspunsului inflamator. Bacteriile necesit fier pentru cretere. Transferina are rol n legarea fierului i transportarea sa n macrofage, scznd astfel, cantitatea de fier pe care o pot folosi bacteriile. Nivelul de zinc scade n timpul inflamaiei. Acesta grbete vindecarea rnilor, are rol n sinteza proteic i crete responsivitatea limfocitelor. Persoanele malnutrite sunt predispuse la infecii severe. Cele mai importante vitamine (din acest punct de vedere) sunt vitaminele A i D. Anecdotic, anterior descoperirii tuberculostaticelor, tuberculoza se trata prin diet; pacientul consuma pn la 30 de ou zilnic. - factorii endocrini: vasopresina, insulina, glucagonul cresc cantitativ. Catabolismul proteic produce aminoacizi care ulterior vor fi folosii la sinteza celulelor de aprare i a proteinelor. Estrogenii au rol n protecie la nivel vaginal. Activitatea limfocitelor T este inhibat n timpul sarcinii, astfel pot aprea infecii severe cauzate de virusul poliomielitei, streptococii hemolitici de grup A, N. gonorrhoeae mai ales pn n trimestrul al III-lea de sarcin. - factori genetici: Susceptibilitatea, mortalitatea i morbiditatea legate de infecie sunt influenate de bagajul genetic. Cauzele pentru aceast susceptibilitate crescut sunt polimorfismul genetic, defecte ale componentelor complementului, citokinelor, chemokinelor sau ale receptorilor acestora. - stresul: Stresul crete susceptibilitatea organismului la infecii. - sistemul nervos central.

9. 4. Povestiri adevrate 9. 4. 1. LPZ i CID Coagulare intravascular diseminat n cadrul unei enterocolite ulceronecrotice la un prematur cu nutriie parenteral total (Punct de plecare: LPZ-ul germenilor Gram-negativi) n primvara anului 2007, ntr-o maternitate din Bucureti s-a nscut pe cale natural un prematur cu vrsta de gestaie de 30 sptmni i greutate de 1.600 g, cu scorul Apgar 7 (la 5 minute de la natere). Mama copilului a prezentat n cursul sarcinii infecii urinare recidivante cu Escherichia coli. Cu circa 12-14 ore nainte de natere a avut loc ruperea prematur a membranelor (travaliul cu membrane rupte peste 12 ore implic riscul producerii de infecii). Prematurul a prezentat de la natere o detres respiratorie, pentru care a necesitat ventilaie cu presiune pozitiv continu i nutriie parenteral total (avnd, n plus, intoleran digestiv). Nutriia parenteral continu a presupus cateterizarea venoas central a copilului. ntruct aceast cateterizare, asociat cu ventilaia asistat cresc riscul infecios al nou-nscutului, s-a instituit antibioterapia empiric de protecie cu ampicilin i gentamicin. Evoluia copilului a fost iniial favorabil timp de o sptmn, pentru ca ulterior acesta s dezvolte o patologie digestiv manifestat prin abdomen meteorizat (mrit de volum), vrsturi bilioase i scaune sanguinolente, asociate cu febr (39C). S-a pus diagnosticul clinic i radiologic de enterocolit ulceronecrotic (necroz intestinal de etiologie incert) i sepsis neonatal.

133

Testele de laborator efectuate (procalcitonin, proteina C reactiv) au fost intens pozitive. Culturile din aspiratul gastric i materii fecale au evideniat prezena E. coli. Hemocultura a fost negativ, ceea ce nu este surprinztor n contextul n care nou-nscutul a primit tratament cu antibiotice anterior recoltrii probelor. Pe parcursul urmtoarelor zile, copilul a dezvoltat simptome clinice i paraclinice de CID (coagulare intravascular diseminat): sngerri la locurile de injectare, hemoragie pulmonar, trombocitopenie, timp parial de tromboplastin i timp de protrombin crescute, hipofibrinogenemie, prezena n cantitate mare a produilor de degradare ai fibrinei). S-a instituit terapia de urgen cu imipenem i gentamicin (la care E. coli se dovedise a fi sensibil), cu plasm proaspt congelat i cu concentrat trombocitar. Starea copilului nu s-a ameliorat sub tratament, hemoragia pulmonar agravndu-se. S-a efectuat, ca ultim alternativ, o transfuzie de snge izogrup i s-a recurs la ventilaie asistat n sistem IPPV Intermittent Positive Pressure Ventilation. Evoluia copilului a fost n continuare nefavorabil, hemoragia pulmonar continund s se agraveze i ducnd n final la stop cardiorespirator ireversibil la manevrele de resuscitare. Nou-nscutul a decedat dup 10 zile din cauza sindromului de CID. Discuii Sursa infeciei cu E. coli nu a putut fi precizat cu certitudine (medicii au suspicionat, totui, ca surs cea mai probabil, lichidul amniotic infectat al mamei). Detresa respiratorie, ventilaia asistat i cateterizarea venoas central au constituit factori de risc major n producerea enterocolitei ulceronecrotice. Necroza esutului intestinal a favorizat diseminarea pe cale sanguin a E. coli existent la acel nivel. Astfel, s-a instalat sepsisul neonatal, care s-a complicat ulterior cu CID. Complexitatea cazului, prin multitudinea complicaiilor aprute, a fost un factor de gravitate care a condus n final la decesul copilului. 9. 4. 2. Infeciile cu Staphylococcus aureus comunitar meticilino-rezistent la pacienii transplantai renal Tnr de 32 ani, afro-american, cu hipertensiune i diabet zaharat tip 1, transplantat renal n urm cu 28 luni se interneaz pentru febr, durere n flancul stng, i o scdere n greutate de peste 10 kg n ultima lun. De aproximativ 6 luni pacientul acuz dureri intermitente n flancul stng. n ultimul an, pacientul a avut multiple episoade de furunculoz i celulit fesier. Culturile efectuate evideniaz un Stafilococ auriu meticilino-rezistent, cu urmtoarele rezultate la antibigram: rezistent la oxacilin, eritromicin, dar sensibil la vancomicin, biseptol, tetraciclin, rifampicin, linezolid. Leziunile au fost incizate i drenate, iar apoi a primit tratament cu cefalexin, augmentin, biseptol i a efectuat decolonizarea nazal cu mupirocin. (4) n cursul anamnezei, pacientul relateaz raporturi sexuale cu persoane de acelai sex i i se efectueaz serologia HIV, rezultatul fiind negativ. Cura posttransplant a fost efectuat fr complicaii cu tacrolimus, micofenolat mofetil i prednison. La examenul obiectiv: temperatura 36,9C, puls 74/min, TA 100/68 mmHg, frecvena respiratorie 19/min. Analizele de laborator evideniaz o leucocitoz (20.200 cel/mm3) cu neutrofilie, VSH de 107 mm/h, Proteina C reactiv 21,5 mg/dl, creatinina 1,8 mg/dl.

134

Examenul CT abdomino-pelvin evideniaz un abces la nivelul iliopsoasului de 6,6 pe 8,5 cm, iar pe IRM-ul de coloan lombar se observ osteomielit la nivelul corpului vertebral L5 i a procesului stng transvers. Abcesul a fost drenat, iar n culturi a crescut Staphylococcus aureus meticilino-rezistent. Culturile n anaerobioz au fost negative. Hemoculturile nu s-au pozitivat. A efectuat 6 sptmani tratament parenteral cu vancomicin, urmat 2 sptmni de tratament cu linezolid per os datorit dorinei pacientului de a merge la munc. A primit apoi Biseptol nc 8 sptmni. Dup terminarea tratamentului VSH-ul a sczut la 14 mm/h, cu o Protein C Reactiv 0,7 mg/dl. La 6 luni nu s-au nregistrat recderi. n afar de identificare bacteriei i antibiogram s-a efectuat i latex aglutinare pentru evidenierea PB2 (protein binding 2). Cu ajutorul tehnicii PCR a fost detectat fraciunea genic responsabil de sinteza leucocidinei Panton-Valentine. (5) Discuii: Infeciile reprezint complicaiile cele mai frecvente la pacienii transplantai. Infeciile cu Stafilococ auriu meticilino-rezistent sunt predominant infecii intraspitaliceti i au devenit o problem de sntate public. (6) Un alt factor de risc important pentru infecia cu Stafilococ este i diabetul zaharat. Leucocidina PantonValentine este un factor solubil, care permit multiplicarea i invazivitatea stafilococului. Determin liza polimorfonuclearelor i monocitelor. Este considerat un factor de virulen, care determin creterea severitii bolii att n afeciunile cutanate, ct i n osteomielit sau pneumonii necrotizante.

9. 5. Direcii de cercetare 1) Un nou mecanism ce afecteaz virulena i sensibilitatea la antibiotice a Salmonella spp. http://www.sciencedaily.com/releases/2010/07/100729172433.htm 2) Toxinele: prieteni sau dumani? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2640701/pdf/10221874.pdf 3) Penetrarea barierei snge-creier de ctre Staphylococcus aureus (rolul acidului lipoteichoic) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2893325/ 4) Reglarea expresiei hemolizinelor i a virulenei Stafilococului auriu de ctre diverse kinaze i fosfataze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2884019/ 5) Noi Metalo--Lactamaze http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20577157 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2786356/ 6) Patogenitate bacterian http://textbookofbacteriology.net/pathogenesis.html

9. 6. Evaluarea cunotinelor

135

1. Prionii sunt constituii din: A. ADN-nveli proteic B. ARN-nveli proteic C. o particul proteic D. miez glucidic + nveli proteic 2. Lactoferina are capacitatea de legare a: A. fierului B. zincului C. cuprului D. magneziului 3. Biofilmul: A. reprezint o populaie bacterian aparinnd unei specii B. cuprinde bacterii ce ader doar ntre ele C. se poate dezvolta pe un cord transplantat D. cuprinde bacterii sensibile la penicilin E. cuprinde bacterii i polimeri extracelulari 4. Sunt factori solubili care permit multiplicarea i invazivitatea germenilor: A. coagulaza, glicocalixul, capsula B. superoxid dismutaza, proteina M, antigenul Vi C. leucocidina, catalaza, hemolizine D. antigenul K, pilii, capsula 5. Una dintre urmtoarele reprezint o substan ce modific rspunsul imun: A. neuramidaza B. Ig A proteaza C. pilii D. noroiul

Bibliografie 1. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2009, Principles and Practice of Infectious Diseases, 7th edition, 37-47, 2423-2435. 2. Topley, Wilson, 2006, Microbiology and Microbial Infections 10th edition 3. Gerald L. Mandell, John E. Bennett, Raphael Dolin, 2005, Principles and Practice of Infectious Diseases, 6th ed., 20-23 4. Dehority W., E. Wang, P. S. Vernon, C. Lee, F. Perdreau-Remington, and J. Bradley, 2006, Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus necrotizing fasciitis in a neonate, Pediatr. Infect. Dis. J., 25, 1080-1081

136

5. Salliot C., V. Zeller, X. Puechal, V. Manceron, S. Sire, N. Varache, J. Etienne, N. Desplaces, J. M. Ziza, 2006, Panton-Valentine leukocidin-producing Staphylococcus aureus infections: report of 4 French cases, Scand. J. Infect. Dis., 38, 192-195 6. Linares L., C. Cervera, F. Cofn, M. J. Ricart, N. Esforzado, V. Torregrosa, F. Oppenheimer, J. M. Campistol, F. Marco, and A. Moreno, 2007, Epidemiology and outcomes of multiple antibiotic-resistant bacterial infection in renal transplantation, Transplant. Proc., 39, 2222-2224

137

Noiuni de imunologie
Imunologia este o tiin care a aprut relativ recent, iniial ca un domeniu al Microbiologiei, studiind mecanismele de aprare a organismelor (uman i animal) fa de agresiunea din cursul procesului infecios. n Imperiul Roman immunitas nsemna scutirea de anumite obligaii. n primul secol dup Iisus Christos, descriind rezistena la veninul unor erpi veninoi, Lucanus a considerat c immunitas nseamn scutit de a te mbolnvi. Observaiile medicului englez Edward Jenner privind faptul c o parte dintre persoanele care mulgeau vacile nu s-au mbolnvit n cursul epidemiei de variol, dar i faptul c pustulele care apreau pe ugerul vacilor, ca i pe tegumentul minii persoanelor care mulgeau se asemnau, au dus la concluzia c ntre aceste fenomene exist o legtur. n 1796, Jenner a realizat una dintre primele experiene pe om (a inoculat secreie din pustulele de la vaci la un copil; ulterior a inoculat secreie de la pacieni cu variol, iar copilul se pare c nu s-a mbolnvit de variol). Cu toate acestea, reaciile n mass-media vremii nu au ntrziat s apar. (Figura nr. 1) vacile din poza de la RM Imunologia a fost fundamentat de studiile realizate de ctre marii cercettori Pasteur i Metchnikoff. Louis Pasteur a vaccinat gini mpotriva holerei aviare, a vaccinat oi mpotriva antraxului i a reuit prevenirea infeciei cu virusul rabic. Pasteur a decis s denumeasc procedeul de inoculare cu germeni atenuai, urmat de protecia fa de boal, vaccinare (probabil pentru c Jenner a obinut primele sale rezultate recoltnd i inoculnd produsul obinut de la vaci). Ilia Metchinikoff a descoperit fagocitoza. Emil von Behring i S. Kitasato au studiat fenomenul prin care se obin antitoxinele i ulterior au realizat experimentele care au stat la baza seroterapiei. Despre hipersensibilitate a nceput s se discute n 1902, iar termenul de histocompatibilitate este cunoscut din 1946. Aceste studii i multe altele, care ar merita dedicarea unui volum ntreg, mult amplificate n deceniile care au urmat sunt mai departe n continu micare, cu numeroase descoperiri chiar i n prezent. Relaia ntre organismul gazd i sistemul imun (organe, celule, anticorpi, citokine etc) ar putea fi asemnat cu relaia stabilit ntre o ar i armata rii respective, cu sisteme de control, sisteme de comand, reacii la nevoie (uneori n regim de urgen) n care exist implicare important i din partea altor sisteme (nervos, endocrin). Mai mult dect n exemplul privind situaia la nivelul unei ri, soldaii din sistemul imun (de ex. LT citotoxice, celulele NK) pot avea att o activitate efectoare ct i de control i retro-control (i depesc limitele de simpli soldai). S-ar putea ridica o ntrebare i anume: de ce avem nevoie de un sistem imunitar? S nu uitm faptul c n fiecare zi organismul nostru se ntlnete cu nenumrabile microorganisme: bacterii, virusuri, parazii etc. Unele microorganisme nu ne afecteaz n nici un mod, altele au efecte benefice fa de organismul nostru, n timp ce o mare parte dintre microorganisme pot duce la apariia unor mbolnviri. n acest context, sistemul imun a fost nevoit s gseasc modaliti prin care s lupte mpotriva microorganismelor patogene i condiionat patogene. Mai mult dect att, chiar i substane strine (non-self) neinfecioase dar i structuri proprii modificate pot duce la un rspuns imun. S-a demonstrat i faptul c mecanisme care n mod normal protejeaz organismul de eventualele infecii pot fi implicate n determinarea unor leziuni tisulare sau de organ. 138

Avnd n vedere toate aceste aspecte (dorim s subliniem faptul c realitatea este cu mult mai complex), o definiie a imunitii ar putea fi urmtoarea: imunitatea reprezint o reacie fa de orice structur non-self (fie microorganism sau o substan strin de tipul unei macromolecule proteice, glicoproteice etc) sau fa de o celul sau structur proprie care a suferit modificri. Informaiile privind sistemul imun sunt prezentate n cadrul mai multor catedre i discipline. Avnd drept int o ct mai bun nelegere a capitolelor pe care ne-am gndit s le introducem n Manualul de Microbiologie dorim s facem o scurt trecere n revist a organelor, celulelor, moleculelor i mecanismelor implicate n imunitate. Menionm faptul c nu vei gsi aici toate definiiile i explicaiile; pentru aceasta cititorul va trebui s parcurg fiecare capitol n parte. Etapele pe care le descriem au doar scop didactic; n realitate fenomenele se petrec simultan i sunt mult mai complexe dect pot fi explicate ntr-un simplu manual sau chiar i dect ar putea fi acestea explicate de oamenii de stiin, n acest moment. Ceea ce noi cunoatem este, de fapt, o pictur ntr-un ocean. Astfel, ne propunem s lum ca exemplu un microorganism oarecare - un antigen. n cazul n care acesta reuete s depeasc barierele naturale ale organismului (piele, mucoase etc) i s ptrund n gazd, urmtoarea linie de aprare este reprezentat de imunitatea nnscut. Fagocitele reprezentate spre exemplu de macrofage i granulocite recunosc microbii de orice fel (recunoaterea nu este specific) i ncep procesul de fagocitoz. Apare i rspunsul inflamator. Ulterior intr n aciune imunitatea adaptativ care se manifest cu ajutorul limfocitelor. Aceasta din urm este specific deoarece dezvolt n timp (cateva zile) celule i molecule specifice pentru a lupta strict mpotriva acestui antigen. O alt deosebire major ntre cele dou tipuri de imunitate este reprezentat de capacitatea limfocitelor de a se transforma n limfocite cu memorie dup ntlnirea cu un anumit antigen. Astfel, spre deosebire de macrofage i granulocite, la o a doua ntlnire cu acelai antigen, limfocitele l vor recunoate iar procesul de aprare se va declana mult mai rapid. Explicnd puin mai n n profunzime (menionm c explicaii mai detaliate vor fi furnizate n capitolul 11 i n alte capitole care urmeaz) avem n vedere faptul c antigenul ptruns n organism este captat de ctre celulele prezentatoare de antigen (APC) (macrofage, celule dendritice, limfocite B etc). Antigenul nu poate fi recunoscut ca atare de ctre sistemul imun deoarece doar o anumit parte a lui numit epitop prezint proprietatea de imunogenicitate la valoare maxim i poate declana un rspuns imun. Antigenul este endocitat de ctre APC, prelucrat n lizozomi iar epitopii rezultai vor fi prezentai limfocitelor n complex cu moleculele sistemului major de histocompatibilitate (MHC). MHC include molecule prezente pe celulele organismului uman (vezi capitolul 12). Limfocitele vor declana un rspuns imun. Exist dou tipuri principale de limfocite i anume limfocitele T i limfocitele B, dup cum exist dou tipuri de rspuns imun, umoral i celular. Limfocitele T secret citokine care pot activa oricare din cele dou tipuri de rspuns imun iar limfocitele B (dup proliferare i blastizare) secret imunoglobuline (anticorpi) implicate n rspunsul imun umoral. Antigenele pot fi clasificate n mai multe grupe: exogene/endogene, timodependente/ timoindependente etc. Rspunsul imun umoral este declanat de antigene exogene timodependente i independente prezentate pe MHC II, iar rspunsul imun celular este declanat de antigene endogene timodependente prezentate pe MHC I. 139

n cazul n care ne ntrebm: cine produce aceste celule i unde se desfoar rspunsul imun? O parte a explicaiei ar include existena organor limfoide primare precum mduva osoas hematogen (sediul producerii limfocitelor T i B i maturrii limfocitelor B) i timusul (sediul maturrii limfocitelor T) i organe limfoide secundare precum pulpa alb a splinei unde se desfoar rspunsul imun umoral i este iniiat cel celular care se desfoar apoi la locul infeciei i ganglionii limfatici (vezi i capitolul 10). Sistemul imun se poate confrunta cu o mare problem, i anume, aceea de a menine balana ntre un rspuns imun eficace i limitarea apariiei de leziuni tisulare (n cadrul unui RI exagerat). Cnd aceast balan se rupe apar bolile autoimune i strile de hipersensibilitate. Povestire adevrat: Povestea vaccinului Edward Jenner s-a nscut pe data de 17 mai 1749 n Berkeley, Gloucestershire. nca de mic el a fost interesat de tiine i natur. Pe atunci circula zvonul cum c lptresele sunt protejate de variol, zvon pe care l-a auzit i el. La 21 ani a plecat n Londra i a devenit studentul lui John Hunter, cel mai renumit chirurg din Anglia i un respectat i cunoscut biolog i anatomist. ntre cei doi s-a nchegat o prietenie adevrat. Jenner a studiat geologia i a fcut mai multe experimente cu snge uman. A ctigat experien n biologie i bineneles, n chirurgie. De-a lungul anilor, Jenner a tot auzit zvonul c lptresele erau protejate de variola. Punnd lucrurile n balan, Jenner a concluzionat c forma de variol fcut de vaci ar putea avea o oarecare legtur cu un posibil mecanism de protecie. n mai 1796 a gsit o tnr lptreas, Sarah Nelms, care avea leziuni nou aprute datorit variolei vacilor pe mini i brae. Pe data de 14 mai 1796 a inoculat material din leziunile ei la biatul unui servitor n vrst de 8 ani, James Phipps. Ulterior, biatul a prezentat febr i discomfort n zona axilar. La 9 zile a prezentat simptomele unei rceli i i-a pierdut apetitul dar ziua urmtoare era iar bine. n iulie 1796 Jenner l-a inoculat iar pe biat, de data aceasta cu material dintr-o leziune nou aprut de variol uman. Baiatul nu a dezvoltat boala aa c Jenner a concluzionat c acesta era protejat complet. n 1797, Jenner a trimis un scurt comunicat spre Societatea Regal descriind experimentul i observaiile sale. Totui, lucrarea a fost respins. n 1798, dup ce a mai experimentat pe civa oameni, Jenner a publicat o mic carte numit O incursiune n cauzele i efectele vaccinului antivariolic, o boal descoperit n unele din rile vestice ale Angliei, mai ales n Gloucestershire i cunoscut sub numele de variola vacilor. Cuvntul latin pentru vac este vacca iar pentru variola vacilor este vaccinia. Jenner a decis s denumeasc aceast nou procedur vaccinare. n 1798 publicaia avea trei pri. n prima parte Jenner prezint viziunea sa legat de variola vacilor ca o boal a cailor transmis la vaci. Teoria a fost infirmat n timpul vieii lui Jenner. Apoi a prezentat ipoteza c infecia cu variola vacilor protejeaz de infecia cu variol uman. n cea de-a doua parte sunt continuate observaiile critice relevante pentru testarea ipotezei sale. A treia parte a fost o discuie lung, n parte polemic, legat de descoperirile i problemele variate legate de variol. Reaciile la aceast publicaie au fost din cele mai diverse. Jenner a plecat la Londra n cutare de voluntari pentru vaccinare. Dup trei luni nu gsise nici mcar unul singur. El a pornit un studiu la nivel naional n cutarea persoanelor care prezint rezisten la variol n rndul celor care fcuser variola vacii. Rezultatul acestui studiu i-a confirmat teoria. n ciuda erorilor i controverselor nenumrate folosirea vaccinrii s-a rspndit rapid n ntreaga Anglie i pn n 1800 a atins majoritatea rilor Europene (Jenner a vaccinat n 140

1801 populaia din Cluj i Trgu Mure, apoi aceast procedur s-a extins n ntreaga ar n urmtorii 31 de ani (1). Dei a fost apreciat la nivel mondial i i s-au acordat multe onoruri, Jenner nu a avut intenia s se mbogeasc. n 1802, Parlamentul Britanic i-a oferit suma de 10,000 pentru descoperirea sa, iar cinci ani ulterior i-a oferit nca 20,000. Pe de alta parte, el a fost i subiectul ridiculei i atacurilor, nu doar al onorurilor. n ciuda acestor lucruri el i-a continuat activitile n slujba vaccinrii. Lucrarea lui Jenner reprezint prima ncercare tiinific de control a bolilor infecioase prin folosirea deliberat a vaccinrii. Totui, nu el este cel care a descoperit vaccinarea, dar a fost primul care a oferit un status tiinific acestei proceduri. Benjamin Jesty este cel care a vaccinat primul mpotriva variolei. La sfritul secolului XIX s-a descoperit c vaccinarea nu confer imunitate pentru toat viaa i de aceea este nevoie de revaccinare. Mortalitatea datorat variolei era n scdere, dar epidemiile artau c boala nc nu era inut sub control. n 1950 s-au implemantat mai multe msuri de control i variola a fost eradicat n mai multe zone ale Europei i America de Nord. Procesul de eradicare la nivel mondial al variolei a fost discutat atunci cnd Adunarea Mondial a Sntii a primit un raport, n 1958, legat de consecinele catastrofale ale variolei n 63 de ri. n 1967 s-a nceput o campanie global condus de Organizaia Mondial a Sntii care a dus la eradicarea variolei n 1977. n data de 8 mai 1980 Adunarea Mondial a Sntii a anunat c lumea nu mai are variol i a recomandat ca toate rile s nceteze vaccinarea. (2) Nu am dorit s povestim totul legat de vaccinare n cadrul acestui capitol, ci doar s v introducem puin n povestea acestei tehnici pentru a arta evoluia lucrurilor i efectul benefic pe care l-a avut aceast descoperire n ntreaga lume. Aa cum se tie, vaccinarea rmne momentan singura metoda cu cel mai bun raport cost-eficien. Pe aceast cale dorim s sensibilizm studenii la medicin i cititorii acestei cri n ceea ce privete vaccinarea i s infirmm teoriile greite care au circulat i continu s circule n ultimul timp.

Bibliografie 1. Mihancea N., 1979, History of smallpox vaccination in Romania and source of the IC strains of vaccinia virus, Rev Ig Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol Pneumoftiziol Bacteriol Virusol Parazitol Epidemiol., 24(4), 247-52 2. Riedel S, 2005, Edward Jenner and the history of smallpox and vaccination, Proc. (Bayl Univ Med Cent), 18(1), 21-25.

141

10. Organele cu rol n imunitate (Gabriela Loredana Popa, MI Popa, Roxana Micu)
Dup secvena de intrare n funcie i rolul deinut, se descriu trei tipuri de organe imune: stem, primare i secundare. (Tabelul nr. 1) 10. 1. Organele su (stem) 10. 1. 1. Sistemul hematopoietic i celulele stem Sistemul hematopoietic cuprinde organele stem cu funcie dubl, hematologic i imunologic. Celula multipotent, primordial (su, stem, matc) se formeaz iniial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior n esutul hematopoietic din ficatul embrionului. Celula stem se afl la originea tuturor liniilor hematopoietice (vezi i 11.1.). Din celulele stem multipotente rezult celulele liniei limfocitare (din care iau natere limfocitele B i T) i celulele liniei mieloide (precursoare pentru liniile eritrocitar, megakariocitar, monocito-macrofagic i granulocitar). 10. 1. 2. Mezodermul embrionar i ficatul fetal Organele care conin celulele stem hematopoietice sunt active de-a lungul vieii embrionare i fetale, ntr-o anumit succesiune. n primele sptmni de via, ele sunt situate n mezodermul intra-embrionar i extra-embrionar (sacul vitelin). La ft, celulele stem migreaz i se localizeaz la nivel hepatic. n cea de-a zecea sptmn de via intrauterin, apar primele celule stem n os. dup cea de-a 20-a sptmn, la ftul uman, hematopoieza devine exclusiv medular. 10. 1. 3. Mduva osoas Teritoriul hematopoietic (MOH) se reduce odat cu vrsta: la copil, toate oasele au funcie hematopoietic; la adult, teritoriul hematopoietic se restrnge la oasele trunchiului i bazinului, atingnd un volum de circa 5 litri la un subiect de 60 kg; la persoanele vrstnice, funcia hematopoietic se menine la nivelul sternului, vertebrelor i al oaselor coxale.

10. 2. Organele limfoide primare organele limfoide primare, numite i centrale, sunt situate n afara cilor de acces i circulaie antigenic. n aceste organe diferenierea apare precoce, n viaa embrionar, naintea celor secundare. Proliferarea limfocitar este intens i independent de stimularea antigenic. Organele limfoide primare au urmtoarele roluri: permit multiplicarea limfocitelor T (timodependente) i B (dependente de mduva roie hematogen / bone marrow - la mamifere). gzduiesc primele stadii de difereniere, pn la limfocitele T sau B mature, apte s recunoasc structurile antigenice i s fie stimulate de antigene. efectorii imuni nva la acest nivel s recunoasc i s tolereze constituenii propriului organism (auto-recunoatere i toleran fa de self).

142

Un limfocit T sau B matur care a prsit timusul, respectiv mduva osoas hematogen, nu mai revine niciodat la acest nivel, cele dou organe fiind n afara cilor de recirculare a limfocitelor antigen-specifice din organele limfoide secundare. 10. 2. 1. Timusul Timusul se formeaz n perioada de dezvoltare a celui de-al treilea arc branchial. nc din stadiul de dezvoltare fetal, timusul este prezent n cavitatea toracic, fiind dispus retrosternal, ca un organ bine difereniat, deja funcional. Agenezia acestei regiuni duce la apariia unui deficit congenital rar, sindromul Di George (aplazia congenital timic sau boala pipernicirii), caracterizat prin tulburri ale imunitii celulare i implicit prin susceptibilitate crescut la infecii (respiratorii, digestive i cutanate, produse n special de fungi i virusuri i mai rar de ctre bacterii), tetanie neonatal (datorat absenei paratiroidelor) i malformaii congenitale diverse (arc aortic dublu, tetralogie Fallot, micrognatism, atrezie de esofag etc). Timusul este un organ situat n mediastinul anterior i superior, retrosternal, format din doi lobi unii printr-un istm median. Fiecare lob este format din lobuli compartimentai de septuri derivate din capsula organului. Lobulul timic este alctuit din 2 zone: cortical (la exterior) i medular (la interior). Iniial se dezvolt zona cortical. Greutatea sa variaz cu vrsta (este bine dezvoltat la ft, greutatea crete pn la pubertate dezvoltarea maxim se realizeaz la vrsta de 10-12 ani, apoi sufer o involuie lent, fr s dispar total). n zona cortical, trama de-a lungul creia se plaseaz protimocitele (sosite n timus de la MOH) cuprinde celule epiteliale, celule dendritice intratimice i macrofage. Limfocitele mici, denumite i timocite corticale, sunt numeroase, grupate n grmezi, n jurul celulelor epiteliale. Ele se divid activ, dar nu se structureaz n noduli limfatici. n zona medular, celulele epiteliale sunt izolate sau grupate formnd corpusculii lui Hassal (formaiuni de celule epiteliale care degenereaz, fiind mereu nlocuite cu alte celule similare), caracteristici timusului. Se consider c au rol fagocitar. Cresc att numeric ct i ca dimensiuni, probabil datorit contactului cu microorganismele din flora normal, dar i contaminrii cu alte microorganisme. Medulara mai conine i celule dendritice, macrofage i timocite. Timocitele medulare sunt mult mai dispersate dect cele din zona cortical. La acest nivel are loc selecia negativ a timocitelor. Timusul are capacitatea de a elimina prin selecie pozitiv celulele care, odat eliberate n circulaie, nu ar fi putut produce efectul scontat, deoarece nu ar fi recunoscut structurile non self i prin selecie negativ celulele care ar fi dat reacii autoimune. Populaia limfocitar aflat n proces de multiplicare n timus, este foarte sensibil la aciunea corticosteroizilor, 95% din limfocite fiind distruse. Restul de 5% din limfocitele cortico-rezistente sunt cele care, la finalul maturaiei, trec n circulaie. Se pare c iniial are loc distrugerea a 80% dintre limfocite, 20% ajung la nivel medular i dintre acestea supravieuiesc cele 1-5% limfocite cortico-rezistente. Timocitele ajunse n zona medular sunt mai rezistente la aciunea cortizolului dect cele din zona cortical. (Figura nr. 1) Rolul timusului se manifest local i la distan: rolul local, const n transformarea limfocitelor nedifereniate n limfocite T mature, cu achiziia de receptori pentru antigene (TCR). Procesul de multiplicare i difereniere are loc, n principal, n regiunea cortical. Celulele achiziioneaz progresiv markeri ai limfocitului T adult: 143

molecule CD2, CD3, CD4, CD8 i TCR. Urmeaz o dubl selecie, pozitiv i negativ. n selecia pozitiv, timocitele care recunosc antigenele strine fixate pe moleculele MHC pot prolifera (timocitele CD4+ recunosc moleculele MHC clasa II, timocitele CD8+ recunosc moleculele MHC clasa I), n timp ce acele limfocite care nu i-au dezvoltat receptori pentru antigene sunt distruse. n selecia negativ, timocitele care recunosc structurile self sunt distruse, eliminnduse astfel timocitele puternic autoreactive, care ar conduce la apariia unor fenomene autoimune imediat dup natere. n timus are loc multiplicarea, diferenierea i selecia limfocitelor T. Tot la nivel timic are loc producerea celulelor de control, cu rol n prevenirea bolilor autoimune (experienele realizate prin nlocuirea limfocitelor proprii cu limfocite de la persoane sntoase a dus, pentru un timp, la dispariia semnelor de boal, dovedind astfel existena acestor celule timice). (Figura nr. 2) rolul la distan se realizeaz prin factorii timici peptidici umorali (timostimulina, timopoietinele, timozinele, factorul umoral timic etc). Aceti factori au funcii diverse, unii dintre ei influennd diferenierea limfocitelor T n ariile timodependente din organele limfoide periferice. Acioneaz att la nivelul timusului ct i la distan. Cteva informaii despre factorii timici: Timozina are efecte asupra limfocitelor T, stimulndu-le activitatea citotoxic i crescnd sinteza de IL-6. In vivo, stimuleaz LH i GnRH, iar in vitro Prolactina i GH. Timostimulina necesit Zn pentru a aciona. Are efect asupra dezvoltrii protimocitelor n MOH. Factorul umoral timic induce producerea de IL-2 (are potenial antiviral). Timopoietina intervine n procesul de difereniere a limfocitelor T. 10. 2. 2. Mduva osoas hematogen la mamifere La mamifere, se menine divizarea funcional n limfocite T i B, dar nu exist bursa lui Fabritzius. Transformarea celulei stem n limfocit B matur are loc n mduva osoas hematogen (bone marrow, LB). La copii, rolul de organ limfoid primar este asigurat att de mduva din oasele late ct i din oasele lungi; ulterior, mduva de la nivelul oaselor lungi este nlocuit cu esut adipos, care mai trziu se fibrozeaz, iar mduva activ rmne la nivelul oaselor late (stern, coxal, coaste, vertebre). Cazurile cu deficit imunitar selectiv pentru limfocite B (ex. maladia Bruton), confirm existena unei autonomii a acestei populaii. Transplantul de mduv osoas hematogenrestaureaz imunitatea umoral, ducnd la dispariia perturbrilor. Dintre funciile mduvei osoase hematogen n imunitate amintim: 1. meninerea unui procent de celule stem cu difereniere spre linia limfocitar i primele stadii ale seriei T i B; 2. maturarea i diferenierea complet a limfocitelor B n celule B mature, apte s colonizeze organele limfoide secundare. La nivelul mduvei exist mai multe tipuri de celule: celule cap de serie i celule tinere care deriv din acestea, celule din seria granulocitar, celule din seria megakariocitar, celule din seria eritrocitar, celule din seria monocito-macrofagic, celulele din seria limfoid (dar nu exist LT, ci doar protimocite, limfocite T nedifereniate).

10. 3. Organele limfoide secundare

144

Dezvoltarea organelor limfoide secundare, numite i periferice sau efectoare, este tardiv fa de cea a organelor limfoide primare, atingnd dezvoltarea deplin numai dup stimularea antigenic. Amintim ca exemple de organe limfoide secundare: ganglionii limfatici, splina i organele limfoide ataate sistemului digestiv (apendice, amigdale, plci Peyer) etc. La nivelul acestor organe se cantoneaz limfocitele T provenite din timus i limfocitele B provenite din mduva osoas hematogen, migrate pe calea torentului circulator. n organele limfoide secundare, aceste celule se vor activa n urma contactului cu antigenele. n anumite zone ale organelor limfoide secundare, precum cele din ganglionii limfatici sau din splin, se gsesc grupuri de celule, constituite n special din limfocite B, denumite foliculi sau noduli limfatici. naintea stimulrii antigenice, aceti foliculi primari sunt n repaus, cu limfocite mici apropiate unele de altele, determinnd un aspect dens, caracteristic. Aceste limfocite mature sunt denumite naive, deoarece nu au avut contact cu antigenul. Dup circa 3-6 zile de la stimularea antigenic, foliculii primari se transform n foliculi secundari, cu un centru germinativ clar, nconjurat de o zon mai ntunecat. n jurul foliculului exist o zon marginal puin vizibil, constituit din limfocite B cu memorie. Foliculul secundar persist cteva sptmni dup care redevine folicul primar. Organele limfoide secundare cuprind urmtoarele grupe: 10. 3. 1. Ganglionii limfatici Ganglionii limfatici (nodulii limfatici) reprezint structuri imune, organizate, situate la interseciile traseelor limfatice. Au urmtoarele roluri: colecteaz structurile antigenice care traverseaz teritoriul vaselor limfatice aferente (libere sau captate de macrofage i/sau de celulele dendritice); induc un rspuns imun fa de antigenele de tip celular, n regiunea paracortical (dnd natere la limfocite T specifice) sau fa de antigene de tip umoral, n foliculii limfatici cu limfocite B active, maturate n mduva osoas hematogen i stocheaz informaiile imune datorit limfocitelor cu memorie dar au rol i n diseminarea rspunsului imun prin circulaia limfocitelor pe calea traseelor limfatice eferente, ctre torentul circulator i ulterior spre alte teritorii ganglionare, splenice, digestive sau respiratorii. n seciune anatomo-patologic transversal remarcm la exterior o zon cortical (cuprinde n special limfocite B, instruite la nivel medular, aglomerate sub form de noduli limfatici. n mijlocul nodulilor se afl centrii germinativi. Foliculii cresc mult n dimensiuni dup infecie, iar ganglionii limfatici devin palpabili i dureroi. Sub zona cortical se afl zona paracortical (cuprinde n special limfocite T). n mijloc se afl zona medular, n care se gsesc att limfocite B ct i limfocite T. n ganglionii limfatici se mai gsesc macrofage, celule dendritice etc. (Figura nr. 2) 10. 3. 2. Splina Splina este cel mai mare organ limfoid secundar, avnd ns i alte funcii: joac rolul unui filtru care n mod nespecific ndeprteaz/elimin complexele antigenanticorp circulante, diferite microorganisme, eritrocite parazitate (ex. cu Plasmodium spp., Babesia microti); are o eficien remarcabil n ndeprtarea/eliminarea microorganismelor slab opsonizate precum i celor capsulate (ex. Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Capnocytophaga spp.); 145

eliminarea hematiilor degradate, mbtrnite; reglarea volumului sngelui etc. Pe seciune, splina are o culoare roie, cu formaiuni albe diseminate, numite corpusculii Malpighi (foliculi splenici). Splina este compus din dou tipuri de esuturi: pulpa roie implicat n distrugerea hematiilor i pulpa alb, corespunztoare esutului limfoid. Aceasta din urm este organizat sub forma unor grupri de limfocite T dispuse n imediata vecintate a arteriolelor (manoane de limfocite T - teaca limfatic periarterial), iar spre periferia acestora se gsesc cordoane de limfocite B (zona marginal). Se consider c zona bogat n limfocite T este zona timo-dependent, n timp ce zona cu limfocite B este zona medulo-dependent. Vascularizaia splinei are o serie de particulariti. Artera splenic intr prin hilul splenic iar ramificaiile sale, arterele trabeculare, urmeaz cloazoanele conjunctive. Din aceste artere se nasc ramificaii, arterele centrale nconjurate de manoane de limfocite T, vase care asigur irigaia foliculilor limfatici i artere penicilate care intr direct n contact cu sinusurile venoase ale pulpei roii. Din arteriole se nasc capilarele, apoi venulele postcapilare situate n zona sinusului marginal. (Figura nr. 3) la nivelul zonei marginale are loc captarea antigenelor de ctre celulele reticulare. Dup 24 de ore, antigenul se regsete la nivelul centrului germinativ al foliculului sau n zona timodependent. La periferia foliculilor splenici se gsesc plasmocite. La acest nivel are loc sintez de anticorpi (n special dup stimuli antigenici solubili, venii pe calea torentului circulator). Dup sintez, moleculele de anticorpi sunt antrenate sanguin i pot ajunge n tot organismul. Splina reprezint un organ n care are loc sinteza anticorpilor de tip IgM i diferenierea spre LB cu memorie n cadrul RI primar. Splina are i rol n sinteza unei enzime care desprinde tuftsina (tetrapeptid rezultat din clivarea enzimatic a poriunii Fc din molecula de IgG) de pe molecula de IgG (tuftsina la rndul ei are rol n creterea funciei fagocitare a PMN i n chemotactism). Hipofuncia splenic i n special splenectomia favorizeaz apariia unor infecii grave, inclusiv sepsis, cu microorganisme capsulate i microorganisme care paraziteaz eritrocitele. Este necesar aplicarea unei strategii de prevenire a infeciilor, incluznd vaccinarea i uneori profilaxia cu antibiotice i chimioterapice. 10. 3. 3. Sistemul limfoid asociat mucoaselor (MALT - mucous associated lymphoid tissue) Cile respiratorii, tractul digestiv i cel uro-genital sunt nconjurate pe toat lungimea lor de esut limfoid difuz (sau nodular), bogat n limfocite B i plasmocite care secret sIgA. Datorit particularitilor funcionale, MALT se subdivide n: Sistemul imunitar nazo-faringian (NALT - nasopharynx associated lymphoid tissue) reprezentat de inelul lui Waldeyer cu diferitele amigdale (palatine, faringian, linguale) i structuri adenoide. Amigdalele sunt constituite din foliculi limfoizi agregai i esut limfoid difuz n strns asociere cu epiteliul faringian. Amigdalele sunt lipsite de vase limfatice, la fel ca i splina. Amigdalele au un rol protector important n regiunea esofagian, faringian i a arborelui traheobronic, constituind un prim obstacol mpotriva infeciilor. Cu toate c dup amigdalectomie nu rezult infecii severe, decizia privind aceast operaie trebuie luat numai dup o analiz critic, punnd n balan att beneficiile ct i posibilele urmri negative.

146

Structurile adenoide se inflameaz frecvent n timpul copilriei (dup diferitele i frecventele infecii respiratorii) i deseori, crescnd n dimensiuni, trebuie extirpate; Sistemul imunitar asociat tubului digestiv (GALT - gut associated lymphoid tissue) cuprinde plcile Peyer i formaiunile limfoide ale apendicelui (secret IgA), limfocitele intra-epiteliale i limfocitele sub-epiteliale. Plcile Peyer reprezint aglomerri de celule limfoide (la nivelul jejunului, duodenului i ileonului). Dup infecii bacteriene se mresc i se pot uni n adevrate cordoane limfoide. Nu au vase limfatice proprii; Sistemul imunitar asociat arborelui bronic (BALT - bronchus associated lymphoid tissue); Sistemul imunitar asociat cilor uro-genitale, prezent n special la nivelul vaginului; Sistemul imunitar asociat glandelor mamare (mammary associated lymphoid tissue). Laptele matern conine IgA secretorie (sIgA) cu rol protector pentru noul nscut fa de infeciile digestive. IgA nu poate trece prin bariera hemato-placentar, dar sIgA poate fi primit n timpul alptrii, asigurnd protecia nou-nscutului i sugarului fa de o serie de patogeni, n primele luni de via. n organele limfoide secundare, distribuia limfocitelor i a celorlalte celule imune este controlat de citokine i chemokine. Membrii familiei TNF (tumour necrosis factors) (citokine implicate n reacii inflamatorii) au un rol deosebit de important n dezvoltarea normal a organelor limfoide. Celulele imune au receptori pentru aceti mediatori, acest lucru fiind demonstrat pe cobai la care s-au distrus o serie de receptori pentru a se pune n eviden care este rolul lor. Molecula MIP-3 face parte din categoria chemokinelor pentru care limfocitele T prezint receptori. Datorit acestei substane, limfocitele T se localizeaz cu strictee n zonele timodependente. Receptorul pentru MIP-3 se numete CCR7, iar la cobaii la care receptorii CCR7 au fost distrui s-a observat absena marcat a zonelor timodependente i un rspuns imun primar extrem de slab. Celulele dendritice interdigitate produc chemokina MIP-3 i pentru c sunt prezente n zonele timodependente, atrag acolo limfocite T mature. Receptorul CCR7 este prezent n proporie mic i la nivelul limfocitelor B, lucru care explic migrarea acestora prin zonele timodependente ctre foliculii limfatici.

10. 4. Povestire adevrat Apendicele vermiform, o prelungire a cecumului, reprezint un organ ce aparine GALT (Gut Associated Lymphoid Tissue). Rolul GALT este de a interveni n aprarea mucoasei tractului digestiv, avnd n alctuire esut limfoid abundent organizat n structuri specializate (amigdale, apendice, plci Peyer) sau distribuit difuz n submucoasa peretelui tubului digestiv. La scurt timp dup natere, apendicele, fiind un segment al intestinului gros, devine colonizat de flora enteric ce populeaz cecumul i colonul. Este presupus ideea c un contact ndelungat al esutului limfoid din componena apendicelui cu flora comensal a intestinului, contribuie la meninerea toleranei imune fa de populaiile bacteriene. Aadar, funcia apendicelui difer de cea a plcilor Peyer sau a amigdalelor prin faptul c nu apr organismul de microorganisme poteniat patogene nou-ptrunse n organism, ci favorizeaz desfurarea relaiei simbiotice ntre gazd i germenii saprofii.

147

Inflamarea apendicelui (apendicit) este o afeciune frecvent ntlnit n seciile de chirurgie, iar apendicectomia a devenit o procedur de rutin, avnd puine riscuri (n general datorate efectelor anesteziei). Studii recente afirm c apendicectomia (desfurat n cazul unei apendicite acute i nu atunci cnd nu exist de fapt aceast afeciune) are efecte benefice n scderea incidenei dezvoltrii colitei ulcerative. S-a constatat c la pacienii suferinzi de apendicit la vrste tinere care au fost supui operaiei, a sczut riscul de apariie a colitei ulcerative cu pn la dou treimi. Se pare c efectul este dat de o stimulare a limfocitelor T supresoare ce survine n urma procedurii chirurgicale. ns apendicectomia nu reprezint o soluie n cazul celor la care boala s-a instalat deja. Colita ulcerativ este o boal inflamatorie a intestinului caracterizat prin apariia ulceraiilor n peretele colonului, diaree cu snge i crampe abdominale. Cauzele instalrii bolii sunt multiple, de natur genetic, cauz autoimun, alimentaie necorespunztoare. Un parcurs de 10 ani netratat poate degenera n cancer de colon sau cancer rectal. Chiar dac apendicectomiile au devenit floare la ureche pentru muli medici chirurgi iar pacienii nu se tem de o operaie uoar, este de reinut faptul c diagnosticul trebuie instaurat corect de ctre medic care adesea uit c durerea la nivelul zonei inghinale drepte nu este semnul patognomonic pentru apendicit i nu se mai obosete s mai fac alte teste, realiznd uneori o operaie inutil i netratnd pn la urm suferina pacientului.

10. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://emedicine.medscape.com/article/207891-overview http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=imm&part=A869 http://www.jimmunol.org/cgi/content/abstract/183/4/2205 http://vet.sagepub.com/content/36/5/357.long http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/ibd.20453/pdf http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/reprint/106/6/1901

10. 6. Verificai-v cunotinele La ntrebrile urmtoare, alegei un singur rspuns corect. Care este diferena dintre organele limfoide primare i cele secundare? localizarea lor: cele primare au localizare visceral, cele secundare se localizeaz n mucoase; n organele limfoide primare nu apare rspunsul imun fa de un antigen, pe cnd n cele secundare da; nu exist diferene ntre cele dou tipuri de organe; organele limfoide secundare sunt sediul formrii i diferenierii limfocitelor, iar organele limfoide primare sunt destinaiile la care ajung limfocitele mature. 148

Care este organul care pe lng funcia limfoid, are i funcie hematoformatoare n ansamblu? splina; ganglionul limfatic; timusul; mduva osoas hematogen.

Ce este fenomenul de selecie a limfocitelor? un mecanism prin care se genereaz un rspuns imun mpotriva unei substane non-self; un proces generalizat ce are loc n toate organele limfoide, avnd ca rezultat limfocite B i T mature; un fenomen prin care sunt alese limfocitele T cele mai potrivite s intre n circulaia sanguin (5% din limfocitele T totale); totalitatea reaciilor prin care trece un limfocit B pentru a deveni plasmocit (celul secretoare de anticorpi).

Care dintre aceste roluri i se atribuie splinei? rol n distrugerea hematiilor mbtrnite; rol hematoformator, fiind un organ limfoid primar; rol n aprarea mucoaselor, aparinnd MALT; rol n selecia i maturarea limfocitelor T.

Care este afirmaia adevrat? un folicul secundar prezint, din punct de vedere histologic, o zon periferic i un centru germinativ; plcile Peyer sunt agregate de foliculi limfatici prezente n timus; ganglionii limfatici sunt relee pe calea circulaiei sanguine; n mduva osoas hematogen se matureaz att limfocitele T, ct i limfocitele B.

10. 7. Bibliografie recent 1. Charles A Janeway, Jr, Paul Travers, Mark Walport, Mark J Shlomchik, 2001, Immunobiology 5th edition 2. Gerd-Rudiger Burmester, Antonio Pezzutto, 2003, Color Atlas of Immunology 149

3. http://ebooks.unibuc.ro/biologie/mihaiescu/index.htm 4. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology 5. http://www.nejm.org 6. http://www.medscape.com 7. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition 8. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition 9. Junqueira, Carneiro, 2005, Basic Histology Text & Atlas 10. T. W. Sadler, 2006, Medical Embryology

150

11. Celulele imunitii (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)


11. 1. Celula stem Celula multipotent, primordial, su, stem, matc, se formeaz la circa 3 sptmni de la nidaia zigotului, iniial la nivelul peretelui sacului vitelin, ulterior n esutul hematopoietic din ficatul embrionului. Dup natere, celula stem ar mai putea fi pus n eviden n mduva oaselor late i lungi (la copii) i n mduva oaselor late (la aduli); un numr foarte mic de celule stem mai pot fi identificate n circulaie. Primul derivat al celulei stem este hemocitoblastul (hematopoietic progenitor), care seamn foarte mult cu celula stem dar deine probabil un semnal de orientare ctre mduva roie hematogen sau ctre timus. Exist i un alt derivat, limfoblastul (lymphoid progenitor). Celula stem se afl la originea tuturor liniilor hematopoietice. n funcie de gradul de potenialitate exist celule stem totipotente (CFU-LM), pluripotente, multipotente (CFU-M, GEMM), bipotente, unipotente (CFU-Eo, CFU-Baso, CFU-Mega). Prezint capacitate de autontreinere (self-renewal) i genereaz descendeni n lipsa stimulilor antigenici. Rspunde la diferite mecanisme de control complexe. Din punct de vedere morfologic se aseamn foarte mult cu limfocitul imunocompetent. Este foarte uor de distrus de ctre radiaii dar nu i de ctre chimioterapice. Descoperirea metodelor de izolare i cultivare a celulelor stem (1998) a creat o nou speran: tratamentul cu celule stem ar putea ajuta la vindecarea unor boli grave (considerate astzi ca fiind incurabile). Celulele stem fiind progenitori nedifereniai se pot divide i dezvolta ntr-o multitudine de alte tipuri de celule, putnd duce la formare de esuturi i organe. Cercettorii estimeaz c aceste celule ar putea fi folosite, n viitor, pentru repararea diferitelor structuri distruse sau n suferin, dar chiar i pentru sinteza de organe. Totui, sunt nc destul de multe probleme tehnice care trebuie surmontate. (Figura nr.1 Evoluia celulei stem)

11. 2. Celulele implicate n rspunsul imun Toate celulele sistemului hematopoietic intervin, n diferite msuri, n imunitate. Aa cum am menionat anterior, aceste celule acioneaz ca nite adevrai soldai (de ex. LT citotoxice, celulele NK), care pot avea att o activitatea efectoare ct i de control i retro-control (depindu-i condiia de simpli ostai). Limfocitele T i B suntelementele centrale alerspunsului imun specific. Celulele NK sunt celule fundamentale (alturi de fagocite) n imunitatea nnscut. Monocitele / macrofagele, neutrofilele, eozinofilele, bazofilele i mastocitele acioneaz n diferite momente ale rspunsului imun. Plachetele sanguine intervin n lupta anti-parazitar iar globulele roii particip la eliminarea complexelor imune. Celule pot reaciona n mod nespecific, indiferent de natura agentului agresor (ex. granulocitele PMN, eozinofilele, bazofilele, mastocitele, monocitele, macrofagele, celulele dendritice etc) sau pot participa la o reacie specific, condiionat de structura moleculelor antigenice, prin intermediul receptorilor (ex. limfocitele). 151

Termenul generic de limfocite, include o multitudine de celule distincte, imposibil de difereniat morfologic (n microscopia obinuit sau chiar i n microscopia electronic). Pe baza caracterelor morfologice, este totui posibil identificarea a dou tipuri de limfocite: - limfocitele mici (small lymphocytes), cele mai numeroase (circa 85% din numrul total al limfocitelor); aici se ncadreaz majoritatea limfocitelor T, limfocitelor B, celulelor dendritice i rarelor celule stem hematopoietice aflate n circulaie. - limfocitele mari cu granulaii (large granular lymphocytes), reprezentnd circa 5-15% din totalul limfocitelor. Dintre acestea amintim celulele NK (ucigae n mod natural / natural killer) i limfocitele T citotoxice. Aspectul morfologic nu ne permite s apreciem care este starea de activare celular. Dac folosim culturi celulare, n prezena unor ageni mitogeni nespecifici [ex. fitohemaglutinin, concavalin A, lipopolizaharide, lectine cum ar fi PWM (pokeweed mitogen) etc] sau a unor antigene specifice, limfocitele T sau B aflate anterior n repaus cresc n dimensiuni, prezint modificri la nivelul nucleului (cromatin fin, citoplasm mai abundent i mai albastr pe frotiu), fiind denumite imunoblaste.

11. 3. Clasificarea limfocitelor Clasificarea limfocitelor se realizeaz pe baza: funciilor i identificrii markerilor celulari. Funciile limfocitelor. S-a demonstrat c pe lng limfocitele B, exist o mare varietate funcional de limfocite T [ajuttoare (helper, LTh), supresoare, citotoxice sau responsabile de imunitatea celular]. Funcionalitatea limfocitelor este dificil de studiat n practica curent, mai ales c o singur celul poate avea mai multe funcii. Una dintre tehnicile de cercetare curent, citometria n flux, utilizeaz anticorpi monoclonali obinui n urma imunizrii oarecilor cu limfocite umane normale sau patologice. Markerii celulari sunt nregistrai cu prefixul CD, termen derivat din cluster of differentiation (clas de difereniere), nomenclatur stabilit n anul 1982. De atunci au fost identificai peste 300 markeri sau sub-markeri CD. Celulele stem hematopoietice i diferitele celule cu rol n imunitate pot fi mprite n grupe i subgrupe. Pentru activarea limfocitelor este nevoie de dou semnale: unul care provine de la antigen altul provenit de la moleculele accesorii de pe suprafaa APC (B7/CD80) pentru LT sau de pe LTh (CD40L) pentru LB. Limfocitele care sunt stimulate doar de primul semnal devin neresponsive la alte semnale antigenice i nici nu se activeaz pentru a reaciona fa de primul semnal antigenic. Etapele activrii limfocitelor: sinteza de citokine dar i de receptori pentru acestea de ctre limfocitele naive dar mature proliferarea limfocitar (expansiunea clonal) - n unele infecii numrul LT poate crete de 50.000 ori, iar al LB de 5.000 ori transformarea limfocitelor naive n limfocite efectoare cu rol n eliminarea antigenului 152

diferenierea limfocitelor efectoare n limfocite cu memorie. Aadar, avem de-a face cu trei tipuri de limfocite: naive mature dar care nu au avut contact cu antigenul; acestea urmeaz s fie distruse n cazul n care ntr-o perioad de 1-3 luni nu au contact antigenic efectoare cu memorie - care vor reaciona mai rapid la a doua stimulare cu acelai antigen.

11. 3. 1. Limfocitele T (LT) (Figura nr. 2 Maturarea limfocitelor) Limfocitele T sunt majoritare n circulaia sanguin, reprezentnd circa 70% din totalul limfocitelor [2/3 sunt LT4 (CD4+) i 1/3 sunt LT8 (CD8+)]. Limfocitele T sunt localizate la nivelul organelor limfoide secundare n zone speciale: zona paracortical a ganglionilor, manonul limfoid n jurul arterelor centrale splenice. Limfocitele T sunt implicate n principal n imunitatea mediat celular. Pe de o parte particip la eliminarea structurilor strine dar i a structurilor proprii modificate (prin mbtrnire, n urma unei infecii, cu multiplicare neoplazic) iar pe de alt parte coopereaz cu limfocitele B n rspunsul imun umoral. De fapt, funciile exercitate de LT sunt mult mai complexe. Cea mai important funcie a limfocitelor T este inducerea unui rspuns sau a unei reacii imune specifice la antigene, prin recunoaterea unor peptide antigenice fixate pe moleculele MHC (complex major de histocompatibilitate). n acest scop pe limfocitul T exist un receptor pentru antigen (TCR), asociat ntotdeauna cu un complex molecular transductor CD 3. Linia limfocitar T se matureaz n dou organe: (a) mduv osoas i (b) timus. Din celula stem hematopoietic multipotent (CD34+, CD38-), prima difereniere conduce la apariia CFU-L (colony forming unit-lymphocyte) comun limfocitelor T i B (CD34+, CD45RA+, CD10+) din care rezult protimocitul. Protimocitul prsete mduva roie hematogen i se cantoneaz n corticala timic. Maturizarea timocitelor nu a putut fi studiat la om, astfel nct datele se obin prin extrapolarea informaiilor obinute experimental, la animale de laborator. Protimocitele i apoi timocitele imature se gsesc n corticala timic (subcapsular), n contact cu celulele epiteliale i cu macrofagele (rare) de la acest nivel. Aceste celule tinere au o capacitate foarte mare de multiplicare. Se deplaseaz prin cortex spre jonciunea cortico-medular i vin n contact cu celulele dendritice i cu macrofagele. La acest nivel are loc o nou multiplicare relativ intens. Este de remarcat faptul c n cursul acestui proces, doar 1-5% din celulele tinere ajung limfocite T mature. Restul, de cel puin 95% din celule, mor prin apoptoz. Activarea unui limfocit T specific se face printr-un mecanism dublu: 1. contactul (direct) celul celul, cu o celul prezentatoare de antigen (APC); 2. stimularea (indirect) de ctre citokine: IL1, IL-6, IFN-g i IL-2. Limfocitul produce la rndul su att IL-2 ct i lanul a al receptorului Il-2, contribuind la activarea altor LT specifice. LT sunt activate doar de ctre antigenele timodependente (vezi Cap. 16, paragraf 16.1.2.); procesul se desfoar la distan de locul de ptrundere al antigenului, i anume n organele limfoide secundare unde o APC i prezint structurile antigenice. Consecina activrii LT este transformarea acestuia n limfoblast T.

153

Tipuri de limfocite T Limfocitele T ajuttoare (T helper, CD4+) (LTh/Th) Limfocitul Th este un veritabil coordonator, orientnd rspunsul imun (RI) ctre RI celular sau ctre RI umoral. Exist cinci subtipuri de LTh (Th0, Th1, Th2, Th3 i Th17): limfocitele Th0 sunt limfocite tinere (sub influena unor stimuli moleculari, ex. IL-4, IL12, se vor transforma n limfocite Th1 sau n limfocite Th2); limfocitele Th1 sintetizeaz limfotoxin, IL-2, IFN-, TNF- i TNF- o au rol foarte important n aprarea anti-viral, i anti-neoplazic (dar i n aprarea antifungic i anti-bacterian), o sunt implicate mai ales n RIC, o stimuleaz switch-ul izotipic spre IgG2 i IgG3, o amplific rolul citotoxic al macrofagelor i stimuleaz proliferarea LTc; limfocitele Th2 sintetizeaz IL2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13; o au rol mai ales n RIU, o sunt implicate n reaciile de hipersensibilitate, o stimuleaz proliferarea LB i secreia de anticorpi; o sunt stimulate de semnale venite de la bazofile i eozinofile (papaina duce la sinteza de IL-4 de ctre bazofile care duce la stimularea rspunsului Th2) (1). limfocitele Th3 (limfocitele T reglatorii) deprim funcia altor limfocite (CD4+, CD8+, LB, NK); secret Il-10 (inhib Th1 i Th2, deci RIU i RIC) i TGF- (inhib rspunsul imun); sunt CD4+ i CD25+; relativ recent au fost identificate limfocitele Th17; acestea se gsesc la interfaa dintre mediul extern i mediul intern (ex. la nivelul tegumentului, de-a lungul tractului gastrointestinal); sintetizeaz IL-6, IL-17 i TNF-; o au rol de protecie la nivelul acestor suprafee, o studii recente au aratat c sunt implicate n inducerea i exacerbarea autoimunitii i inflamaiei (datorit IL-17), o activeaz RIC (importante n RI prin recrutarea neutrofilelor i macrofagelor la locul infeciei), o sunt n relaie cu LT reglatorii care previn fenomenele inflamatorii i mediaz tolerana imun (2), o secreia lor este stimulat de IL-23, o LTh-17 cu memorie reacioneaza fa de antigenele Candida albicans (3). Limfocitele T citotoxice (Tc, CD8+) Se refer n principal la LT CD8+, cu toate c aceast proprietate a fost observat i la unele LT CD4+, cu urmtoarele diferene: LTc CD8+ pot liza oricare dintre celulele organismului care exprim molecule HLA I (HLA human leukocyte antigen system) LTc CD4+ i limiteaz funcia la celulele care exprim molecule HLA II. Au mai multe roluri, de ex. realizeaz supravegherea imunologic prevenind multiplicarea anarhic a celulelor. Dac de ex. apar antigene tumorale, LTc au capacitatea de a le recunoate, de a se multiplica/activa i de a le distruge. n aceast supraveghere, LTc sunt ajutate de celulele NK. Distrugerea antigenelor este indus prin dou mecanisme: inducerea apoptozei prin intermediul unui receptor al morii celulare, ceea ce duce la fragmentarea ADN-ului celulei int; 154

atacul asupra celulei int prin perforine (proteine ce rup membrana plasmatic sau lizozomal) i granzine (serin proteaze care lizeaz substraturi sau activeaz diverse proteaze) sintetizate i eliberate de ctre LTc. LTc au un rol important n aprarea mpotriva celulelor infectate viral. Activitatea lor este intensificat de IFN-g. Importana activitii litice a LTc a fost demonstrat att experimental (pe modele animale) ct i la pacieni care prezentau defecte ale citotoxicitii. Exist sindroame genetice transmise autozomal recesiv n cadrul crora este afectat citotoxicitatea sau prezentnd mutaii la nivelul genei ce codific informaia pentru sinteza de perforine. Aceste sindroame au fost asociate cu imposibilitatea controlrii infeciilor virale, mai ales cu CMV, EBV i HSV (4). Limfocitele T inductoare ale hipersensibilitii ntrziate Sunt celule care secret IL-2 i n acelai timp IFN-g, activatoare pentru alte limfocite T, macrofage i celulele NK. Limfocitele T supresoare (Ts, CD8+) Limfocitul T supresor este o celul CD8+, ca i LT citotoxic. Limfocitele Ts au rol n reglarea rspunsului imun, meninndu-l n limite normale. n lipsa Ts, orice stimul antigenic ar putea fi urmat de o proliferare anarhic a unei clone de limfocite (acele limfocite dotate cu receptorul specific pentru respectiva structur antigenic). n mod normal, ntre populaiile de limfocite Th i Ts exist un echilibru, care se cuantific prin raportul Th/Ts, raport care trebuie s fie supraunitar. Exemplul cel mai cunoscut n care valoarea raportului devine subunitar este infecia HIV / SIDA. O parte dintre limfocitele T nu au funcie efectoare i se transform n LT cu memorie. Limfocitele T ( T cells) Limfocitele T sunt sechestrate la nivelul barierelor epiteliale sau la nivelul focarului inflamator i manifest citotoxicitate fa de diverse inte. Sunt activate direct de antigen (non-peptide de dimensiuni mici) fr a fi necesar prezentarea n conjuncie cu MHC. Reacioneaza fa de extractele mycobacteriene. Sunt stimulate de gruprile fosfat din diveri compui precum NTP (nucleotid trifosfat din ADN i ARN). Teste efectuate pe animale de laborator care au fost infectate cu Listeria spp., Leischmania spp., Mycobacterium spp., Plasmodium i Salmonella spp. au artat un nivel de protecie mediu realizat de aceste limfocite. Se acumuleaz la nivelul focarului inflamator n boli cu implicare imun precum artrita reumatoid sau sarcoidoza (cauza nu este cunoscut). Sunt implicate att n imunitatea nnscut ct i n cea adaptativ, prin secreia de citokine i chemokine abilitatea de a ajuta LB s se transforme n limfocite cu memorie. Limfocitele T NK (NKT cells) Limfocitele T NKintervin n RIP i produc cantiti crescute de IL-4. mprumut proprieti att de la LT ct i de la NK.

155

11. 3. 2. Limfocitele B (LB) (Figura nr. 2 Maturarea limfocitelor) Limfocitele B reprezint 5% pn la 15% din limfocitele din snge (300 pn la 600 elemente/mm3) i constituie majoritatea celulelor din foliculii limfatici, ganglioni i splin. Rolul lor esenial este sinteza anticorpilor, n cursul RIU specific. Au fost denumite astfel deoarece s-a descoperit c la psri LB se dezvolv n bursa lui Fabricius. La om LB se dezvolt n mduva osoas hematogen (bone marrow). Limfocitele B provin (la om i la mamifere) din celulele stem hematopoietice (CD34+, CD38 -). Toat linia limfocitar B (celule imature sau mature) are markeri specifici de suprafa CD19 i CD20, utilizai pentru identificarea celulelor B (ex. n citometria n flux); identificarea prin aceeai metod a markerului CD10 permite ncadrarea n stadiul de limfocit matur. Limfocitul B prsete mduva osoas i trece n zonele B din organele limfoide secundare (ganglioni limfatici, splin etc). LB naiv (virgin) este pregtit pentru a rspunde stimulului antigenic, dei se gsete n stare de repaus, n ateptarea primei stimulri antigenice. n acest stadiu, LB are urmtoarele caracteristici: exprim la nivelul membranei imunoglobuline din clasele IgM i IgD; exprim receptori pentru interleukinele IL-1 i IL-4; exprim receptori pentru complement CR1 (CD35) i CR2 (CD21). Ultimul recunoate fragmentul C3d, component degradat al fragmentului C3 al complementului. Acesta contribuie la activarea limfocitului B. exprim receptori pentru anumite lectine (ex. PWM) utilizate in vitro pentru transformarea limfoblastic a limfocitelor B, dar i receptori pentru endotoxine bacteriene (LPZ). Transformarea unui LB naiv ntr-un LB activ i apoi n plasmocit necesit intervenia succesiv a citokinelor (ca ntr-o cascad). Activarea are loc datorit recunoaterii antigenice dar i datorit secreiei de IL-1 de ctre celula prezentatoare de antigen (APC) i respectiv secreiei de IL-4 de ctre Th2. Limfocitul B activ exprim receptori pentru alte interleukine, n special IL-5 i IL-6 i lanul a al IL-2. LB se va divide i va da natere la numeroase celule identice n foliculul limfoid secundar. Limfocitul B se difereniaz progresiv ntr-un limfoblast sau imunoblast care secret IgM. Sub aciunea diferitelor citokine are loc comutarea izotipic (isotypic switch) de la IgM la IgG, IgA sau IgE; n urma acestei comutri plasmocitul va secreta IgG, IgA sau IgE. De exemplu, sub aciunea IL-4 are loc comutarea izotipic a IgM n IgG sau IgE iar sub aciunea IL-5 n IgA. Exist i limfocite B active care nu se transform n plasmocite ci persist sub form de limfocite B cu memorie, cu o durat de via lung (asigurnd spre exemplu protecia fa de o nou mbolnvire, de ex. dup scarlatin/infecie cu streptococul piogen de grup A, lizogenizat). Limfocitul B are urmtoarele funcii: 1. Prezentarea antigenelor ctre LT; 2. Sinteza imunoglobulinelor (anticorpilor). n cazul antigenelor timo-dependente, are loc trecerea de la rspunsul primar cu secreie predominent de IgM, la un rspuns secundar cu predominena IgG sau mai rar a IgA sau IgE. n cazul antigenelor timo-independente, se menine sinteza anticorpilor din clasa IgM. Limfoblastul (lymphoid progenitor) d natere la trei linii celulare (LT, LB i NK). Exist o gen (Pax5) care este esenial pentru maturarea LB (5).

156

11. 3. 3. Celulele NK (Natural killer cells) Numele de celule NK a fost dat acestei populaii celulare datorit puterii lor citotoxice spontane, fr a avea nevoie de un stimul imun sau de prezena MHC (complexul major de histocompatibilitate). Numite iniial celule de clasa a III-a (nefiind LB sau LT), ulterior celule nule (pentru c pe suprafaa lor nu fuseser, nc, pui n eviden receptori), n final au fost numite celule NK (ucigae n mod nativ, natural killer).Fac parte dintre limfocitele mari cu granulaii (large granular lymphocytes). Se gsesc n mduva osoas hematogen, splin i n sngele periferic. Celulele NK reprezint o linie primordial de aprare a organismului (imunitatea nnscut), pe care l ajut s elimine celulele modificate datorit unor infecii, sau celulele modificate neoplazic, n special n neoplazii hematologice (ex. leucemie). Spre deosebire de limfocitele Tc celulele NK nu au TCR (au ns, de ex., receptori pentru molecule de IgG), n cazul celulelor NK nu exist rspuns imun secundar (de memorie).

11. 4. Celulele prezentatoare de antigen (antigen presenting cells) Capacitatea de a prezenta antigene limfocitelor Th, iar prin aceasta de a induce un RI specific, este asigurat de dou categorii de celule prezentatoare de antigen (APC): - celulele profesionale / specializate celulele dendritice, monocitele / macrofagele i limfocitele B; - celulele ocazionale (ndeplinesc funcia doar n anumite condiii de activare celular) neutrofilele, celulele endoteliale i celulele epiteliale. Celulele prezentatoare de antigen (APC) au urmtoarele funcii (Figura nr. 3): recunosc antigenele T dependente prin receptorii membranari, le endociteaz i prelucreaz, transport antigenele native de la esuturi la organele limfoide secundare, prezint antigenele native LT urmnd selecia clonei de limfocite specifice acelui antigen, activeaz fie LTc fie LTh. Celulele dendritice se gsesc n aproape toate esuturile organismului, incluznd sngele i organele limfoide. La nivelul esuturilor periferice formeaz o reea care se extinde i n spaiile dintre celulele parenchimatoase astfel nct pot detecta orice microorganism aflat n acea zon. Celulele dendritice posed dou sisteme de supraveghere imunologic: macropinocitoz (n fiecare or inger echivalentul volumului lor; nu ateapt pasiv apariia antigenului care s le stimuleze), au pe membran mai multe tipuri de receptori pentru mai multe tipuri de particule. Sunt clasificate, n funcie de distribuia n organism i de particularitile fenotipice, n trei mari clase i ase tipuri: 157

a). Celule dendritice tisulare celule Langerhans CDL, care la nivel cutanat formeaz un strat continuu ntre derm i epiderm (dar le gsim i la nivelul tubului digestiv i organelor genitale), celule interstiiale - CDI, care se gsesc n interstiiul esuturilor; b). Celule dendritice limfoide (din organele limfoide secundare) celule interdigitate - CDID, n ariile T dependente din organele limfoide secundare, celule foliculare - CDF, n ariile B dependente din organele limfoide secundare; c). Celule dendritice circulatorii celule sanguine - CDS, n vasele sanguine, aflate n tranzit, celule limfatice, vluroase - CDV, n vasele limfatice, aflate n tranzit. Toate celulele dendritice au origine medular, provenind din aceeai entitate celular - CDS (o parte dintre CDS ptrund n esutul cutanat i mucoase, iar alt parte n interstiiu). Pot s ndeplineasc funcia de APC deoarece prezint receptori de tip CR, FcR i sintetizeaz molecule MHC II (cu excepia CDF). Aadar, celulele dendritice sunt eliberate n circulaie din mduva osoas hematogen i se transform n CDS. De aici pot urma dou ci: n esutul cutanat se transform n CDL (capteaz antigenele opsonizate), apoi iau calea vaselor limfatice transformndu-se n CDV, ajung la nivelul organelor limfoide secundare unde se transform n CDID care prezint pe membrana epitopi n conjuncie cu MHC II. n interstiiu se transform n CDI, apoi fie iau calea vaselor limfatice (i urmeaz drumul de mai sus), fie trec n circulaie, se transform din nou n CDS i ajung n splin unde fie o ajung periarteriolar (zona cu LT) i se transform n CDF care reprezint filtre pentru antigenele solubile, o ajung n jurul zonei periarteriolare (zona cu LB) i se transform n CDID. Subliniem c este vorba despre aceeai celul dendritic, n circulaie prin organism; n funcie de locul n care ajunge are alte caracteristici structurale i funcionale. Celulele dendritice tipice (CDL, CDI, CDID) au form neregulat, cu prelungiri numeroase, lungi i efilate (de unde vine i denumirea lor). n citoplasma celulelor dendritice se gsesc numeroase mitocondrii. CDF nu au att de multe prelungiri i se dispun n grmezi. CDS au aspect rotund ovalar iar CDL sunt celule vluroase. Au rol important n maturizarea precursorilor LT. Induc tolerana LT, eliminnd LT autoreactive (cele care la nivel timic au interacionat cu MHC i ar putea s reacioneze la fel de puternic i cu celulele somatice normale din organismul uman i s genereze autoimunitatea). Astfel, CD elimina LT care au scpat seleciei negative (vezi Cap. 10, paragraf 10.2.1.). Se pare c aceste celule intervin n declanarea RI naintea macrofagelor. Monocitele / macrofagele pot fagocita exo-antigenele ntr-o vacuol numit endozom primar. Fuziunea endozomilor secundari cu lizozomii permite degradarea antigenelor n peptide imunogenice. Moleculele MHC II, produse la nivelul reticulului endoplasmic, pot ncrca aceste peptide. Fago-lizozomii fuzioneaz cu membrana plasmatic i astfel, peptidul de pe MHC II se exprim la suprafaa extern a macrofagelor. Macrofagele reprezint APC majoritare n organism, ns nu toate pot ndeplini funcia de APC, respectiv: cele care nu au capacitatea s funcioneze ca APC vor rmne implicate n rspunsul inflamator, 158

celelalte vor funciona ca APC n cinci etape 1. captarea Ag (proces imunologic nespecific, mediat de receptori); 2. endocitarea Ag captate (realizat doar de ctre macrofagele activate metabolic); 3. prelucrarea Ag native captate (are loc la nivel lizozomal iar la finalul ei, rmne un epitop, format dintr-o hapten cu specificitate maxim i o protein carrier); 4. conservarea epitopilor n anumite sectoare subcelulare (n acest fel este asigurat autontreinerea RI n timp); 5. prezentarea epitopilor pe membrana APC, cuplai n permanen cu molecule MHC. Sistemul MM exprim molecule MHC II, mai ales dup activarea prin interferonul gamm a (IFNg). Dup contactul cu limfocitul T, macrofagele secret IL-1 i IL-6 i TNF-a; TNF-a activeaz RI i procesul inflamator local. Limfocitele B pot funciona ca APC profesionale numai n condiii de activare metabolic. Au capacitatea de a recunoate epitopii conformaionali ai antigenelor i de a-i prezenta limfocitelor T (de peste 30 de ani a fost dovedit faptul c RI la antigenele timo-dependente necesit cooperarea LB-LT). Prezint pe suprafaa lor receptori de tip CR i FcR i pot sintetiza molecule MHC II. LB recunosc i prezint numai Ag solubile. Exist studii care afirm faptul c LB au o mai mare eficien n procesul de prezentare al antigenelor n comparaie cu macrofagele. LB naive dar mature (nc nu au avut contact cu antigenul, dar au fost maturate n mduva osoas hematogen) sunt stimulate de antigen. Ag este captat prin intermediul BCR (receptor pentru antigen de pe LB). LB capteaz antigenul, l proceseaz, prezint apoi epitopii n complex cu molecule MHC II spre LTh CD4+. Acesta din urm trimite semnale ctre alte LB prin citokine i molecule de suprafa iar LB ncep s prolifereze, se transform n limfoblaste B, apoi n plasmocite care vor secreta anticorpi.

11. 5. Sistemul mononuclear fagocitar (sistemul MM) Monocitele / macrofagele reprezint o linie celular cu funcie important n imunologie, prin intervenia lor n imunitatea natural, n prezentarea antigenic i n reacia imun specific. Principalele funcii ale sistemului MM sunt reprezentate de: recunoaterea structurilor strine (non-self) sau modificate, fagocitarea, prelucrarea i prezentarea acestora (n context MHC), citotoxicitate, citostatism, secreie a diferitelor molecule (ex. IL-1, TNF-) i reglarea reaciilor n cadrul rspunsului imun. Macrofagele, alturi de celulele dendritice i celulele epiteliale, formeaz sistemul reticulohistiocitar (SRH). Macrofagele pot fi observate n toate esuturile. Se formeaz n mduva osoas hematogen, dintr-un precursor comun monoblast-mieloblast i cnd devin mature poart numele de monocite. n acest stadiu, moleculele MHC II fie nu exist fie sunt slab exprimate, ca semn al unui status funcional redus (devin foarte bine reprezentate dup stimulare). Monocitele circul n snge 6-8 ore, dup care migreaz n esuturi unde iau nume diferite i ndeplinesc funcii diferite: histiocite n esutul conjunctiv; celule gliale (microglii) n esutul nervos; osteoclaste; macrofage alveolare pulmonare; celule Kuppfer n ficat; macrofage 159

splenice; macrofage peritubulare n rinichi; macrofage ganglionare, n mduva osoas i timus (macrofagele din aceste organe nu trebuie confundate cu celulele dendritice, care pot avea, la rndul lor, o capacitate fagocitar fa de limfocitele n apoptoz). Monocitele / macrofagele prezintreceptori pentru carbohidrai, receptori pentru M-CSF, receptori pentru imunoglobuline i complement. n cadrul procesului de recunoatere, fagocitare i prelucrare a structurilor strine sau a structurilor proprii modificate, spre deosebire de PMN care distrug complet structurile fagocitate, sistemul MM produce un anumit grad de distrugere, cu conservarea gruprilor specifice, necesare stimulrii rspunsului imun. Citotoxicitatea exercitat de macrofage poate fi direct (n cursul procesului de fagocitoz), n urma contactului cu membrana celulei int sau prin citotoxicitate mediat celular, dependent de anticorpi (ADCC) (n acest caz, anticorpii se fixeaz cu captul Fab pe epitopii celulei int i cu fragmentul Fc de macrofag). Macrofagul produce substane litice cu care perforeaz membrana celulei int (asemntor cu aciunea ADCC a celulelor NK). Macrofagele secret un numr foarte mare de substane: cea mai mare parte a factorilor sistemului complement, enzime proteolitice (ex. colagenaze, serinproteaze, hidrolaze), proteine cu rol n adeziunea celular (ex. fibronectin), factori de coagulare, interleukine (IL-1, IL-6, TNF-a, factorul de cretere al trombocitelor/fibroblastelor, factorul de stimulare al coloniilor de granulocite/granulocite-macrofage, endorfine etc) etc. Etapele fagocitozei (Schema nr. 1): 1. Migrarea macrofagelor la locul infeciei, 2. Aderarea macrofagelor la celula int, 3. Ingestia celulei int, 4. Formarea fagolizozomului, 5. Inactivarea intracelular a celulei int, 6. Digestia intracelulara a celulei int. Iat cteva studii interesante legate de funciile macrofagelor i modul n care acestea interacioneaz cu diferitele microorganisme. Lipoarabinomananul (LAM) este considerat unul din factorii de virulen ai Mycobacterium tuberculosis. S-a demonstrat c LAM este incorporat n plutele lipidice din interiorul membranei macrofagelor prin intermediul glicozil-fosfatidil-inozitolui ducnd la reducerea maturrii fagozomilor i protejnd astfel celula fagocitat (6). Toxina pertusis (TP) produs de Bordetella pertussis este implicat n tusea convulsiv. S -a studiat interrelaia dintre TP i macrofagele alveolare n cursul procesului infecios. La un lot de oricei s-au eliminat macrofagele alveolare ceea ce a condus la intensificarea manifestrilor procesului infecios, cu toate c imediat s-a produs un influx de neutrofile la locul infeciei. Mai mult dect att, lipsa macrofagelor a dus la declanarea procesului infecios chiar i cu tulpini care erau deficitare n sinteza TP (7). Endocardita poate fi cauzat de streptococii orali. Mecanismul nu este complet elucidat, dar se pare c monocitele au un rol important. Dei celulele monucleare din sngele periferic sintetizeaz titruri crescute de IL-12, monocitele tind s dispar. Acest lucru scoate n eviden 160

faptul c monocitele infectate streptococic se transform n celule dendritice secretoare de IL12 i nu n macrofage. Celule sanguine mononucleare periferice de la subieci sntoi au fost infectate cu ase tulpini de streptococi orali. S-a observat c monocitele stimulate de aceste antigene exprim fenotipul i funcia celulelor dendritice (8). Mai multe studii au artat c M. leprae activeaz puine macrofage i celule dendritice. S-a demonstrat c la nivelul monocitelor naive M. leprae induce niveluri crescute de citokine ce inhib monocitele. M. leprae este implicat att ntr-o stimulare ct i ntr-o inhibare a monocitelor (9).

11. 6. Alte celule implicate n rspunsul imun Neutrofilele Sunt cele mai abundente granulocite din circulaia periferic. Neutrofilele intervin n: imunitatea natural prin fagocitoz i imunitatea specific, datorit receptorilor proprii pentru imunoglobuline i complement, n colaborare cu limfocitele i alte APC. Principalii factori care atrag PMN la nivelul focarului infecios sunt: complexele Ag-Ac, subcomponenta C5a a sistemului complement, derivaii acidului arahidonic (ex. leucotriena B4). Dup fagocitare, PMN utilizeaz pentru degradarea structurilor strine diferite enzime precum: lizozim, proteinaze neutre (ex. elastaze), hidrolaze acide (ex. glicerofosfataze). Sunt generai i radicali activi de oxigen. S-a studiat relaia ntre neutrofile i macrofage n cadrul infeciei cu Mycobacterium tuberculosis. Dup infectarea experimental a cobailor, neutrofilele au fagocitat microbul i au secretat IL-8 i TNF- (cu rol activator asupra macrofagelor). Neutrofilele i macrofagele au fost prelevate i cultivate mpreun i separat, apoi infectate. IL-8 a fost detectat la nivele mult crescute n culturile care conineau att macrofage ct i neutrofile n comparaie cu situaia n care culturile conineau separat macrofage, respectiv neutrofile. S-au folosit mai multe tehnici de cultivare i s-a ajuns la concluzia c i TNF- este la un nivel mai nalt n culturile ce conineau ambele tipuri de celule. Ulterior, cultura a fost tratat cu anticorpi policlonali anti TNF- iar rspunsul macrofagelor la stimularea neutrofilelor infectate a fost complet anulat. Acest studiu demonstreaz c TNF- produs de neutrofilele infectate ar putea fi responsabil de activarea macrofagelor alveolare (10). Eozinofilele Eozinofilele reprezint n mod normal ntre 1% i 3-5% din leucocitele sanguine. Procentul eozinofilelor crete n alergii sau n infeciile parazitare. Funcia lor fagocitar, prin receptorii de IgG i IgE i mecanismul ADCC, este relativ limitat. Totui, eozinofilele pot fagocita fungi, complexe Ag-Ac, bacterii. Granulele lor conin produi toxici pentru diferii parazii.

161

Pe de alt parte, eozinofilele produc histaminaz i arilsulfataz care inactiveaz histamina i respectiv leucotrienele produse de mastocite. Prin aceti factori se reduce rspunsul inflamator i migrarea leucocitelor n focarul infecios. Mai multe studii au demonstrat rolul eozinofilelor n cadrul imunitii nnscute i adaptative ndreptate mpotriva infeciilor cu parazii. Nu a fost dovedit c eozinofilele ar iniia rspunsul imun fa de parazii. Plecnd de la ipoteza c eozinofilele ar putea fi celule prezentatoare de antigen n infeciile parazitare, eozinofilele au fost expuse la un anumit parazit i s-a examinat expresia diferiilor markeri de suprafa implicai n activarea celular. S-a remarcat o cretere de 6 ori a CD69 i MHC II, de 4 ori a CD86 (molecula costimulatoare pentru LT). Abilitatea eozinofilelor de a prezenta antigenul a fost explorat i prin cultivarea lor mpreun cu LTCD4+. Eozinofilele au avut capacitatea de a transforma LT naive n LTh2 productoare de IL-5 (11). Bazofilele i mastocitele Conin granule metacromatice i receptori pentru IgE. Au rol n reacia de hipersensibilitate mediat umoral (tip I). Principalul mediator n declanarea HS de tip I este histamina. Ambele sunt implicate n aprarea anti-parazitar. Mastocitele nu se gsesc n cantitate mare n snge, dar sunt ntlnite la nivelul esuturilor conjunctive n apropierea vaselor sanguine i limfatice, aproape de sau n interiorul nervilor i sub epiteliile organelor care vin n contact cu mediul extern (plmn, intestin, piele). Bazofilele se difereniaz i matureaz n mduva osoas hematogen, apoi circul prin snge. Att bazofilele ct i mastocitele secret citokine dar spre deosebire de mastocite, bazofilele secret i IL-4. A fost studiat un eventual rol n diferenierea limfocitelor helper spre linia Th2 (proces care necesit IL-4) (12). A fost demonstrat prezena bazofilelor n ganglionii limfatici, n apropierea LT ca i faptul c secreia de IL-4 poate fi declanat de un stimul independent de IgE (13). Mastocitoza (Figura nr. 4) - Mastocitoza) este o boal n care apare hiperplazia mastocitelor cu exces de mediatori la nivelul pielii, tractului gastrointestinal, mduvei osoase hematogene, ficatului, splinei i ganglionilor limfatici. Incidena bolii este de 3-7/1.000.000 locuitori. Poate aprea la orice vrst (valorile cele mai mari sunt nregistrate n primii doi ani de via i n decada a treia i a patra). Se datoreaz mutaiei genei ce activeaz factorul de cretere pentru mastocite. Plachetele Plachetele au un rol accesoriu n reacia imun. Ele conin serotonin i exprim receptori pentru IgG i IgE. Plachetele ader la endoteliul vascular, se agreg i elibereaz substane care cresc permeabilitatea capilar i activeaz sistemul complement. Datorit Ig fixate pe membrana lor, plachetele pot adera la parazii i pot elibera radicali liberi ai oxigenului cu efect toxic pentru acetia. Globulele roii Alturi de rolul principal de a transporta oxigenul la esuturi i bioxidul de carbon la plmni, globulele roii dein receptori pentru sistemul complement, faciliteaz transportul complexelor imune din snge la celulele Kuppfer din ficat, prin fixarea lor pe receptorii pentru complement.

162

11. 7. Direcii de cercetare Prezentm cteva dintre posibilele direcii de cercetare pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: 1. Human endometriosis is associated with plasma cells and overexpression of B lymphocyte stimulator (http://www.pnas.org/content/104/30/12451.abstract?sid=053b0c70-97fc-4804ac6a-622ed823e269 ) 2. CD8 tumor-infiltrating lymphocytes are predictive of survival in muscle-invasive urothelial carcinoma (http://www.pnas.org/content/104/10/3967.abstract?sid=0d4f7416-7328-4a638325-a06694781bf8 ) 3. 3D visualization of HIV transfer at the virological synapse between dendritic cells and T cells (http://www.pnas.org/content/107/30/13336.abstract?sid=71cd1eae-e84c-42db-803718274860d243 ) 4. T cells turn professional(http://www.nature.com/nri/journal/v5/n7/full/nri1651.html) 5. Th17 cells and regulatory T cells: new light on pathophysiology of preeclampsia (http://www.nature.com/icb/journal/v88/n6/full/icb201068a.html) 6. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer (http://www.nature.com/nri/journal/v5/n4/abs/nri1592.html) 7. Lung inflammation: Disarming neutrophils in cystic fibrosis (http://www.nature.com/nri/journal/v8/n1/full/nri2244.html) 8. Effect of Malnutrition on K+ Current in T Lymphocytes (http://cvi.asm.org/cgi/content/full/12/7/808?maxtoshow=&hits=80&RESULTFORMAT=1&ando rexacttitle=and&titleabstract=T+lymphocytes&andorexacttitleabs=and&andorexactfulltext=and &searchid=1&FIRSTINDEX=0&sortspec=relevance&fdate=1/1/2005&resourcetype=HWCIT)

11. 8. Evaluarea cunotinelor 1. Una din urmtoarele afirmaii legate de celula stem este adevrat: A. Se formeaz la circa 3 luni de la nidaia zigotului; B. D natere hemocitoblastului i limfoblastului; C. Poate fi gsit n mduva spinal; D. Se afl la originea unor linii hematopoietice. 2. Legat de limfocite, o afirmaie este fals: A. LT sunt majoritare n snge; B. LT se gsesc n paracorticala ganglionilor i manonul limfoid din jurul arterelor centrale splenice; C. LT induc o reacie specific antigenic; D. LB au rol esenial n sinteza anticorpilor n cursul RIC specific. 3. LTh: A. LTh1 stimuleaz switch-ul izotipic spre IgM; B. LTh0 sunt limfocite tinere care dau natere celorlalte tipuri de limfocite; C. LTh2 sunt implicate n aprarea antineoplazic; D. LTh17 duc la reacii de hipersensibilitate; E. LTh0 genereaz inflamaie tisular. 163

4.

Una din urmtoarele celule nu este APC: A. Celula Langerhans; B. Celula dendritic; C. Monocitul/macrofagul; D. LT 5. Eozinofilele: A. Procentul lor crete n alergii sau infecii parazitare; B. Sunt majoritare n infeciile bacteriene; C. n mod normal reprezint 50% din leucocitele sanguine; D. Pot duce la o boal numit mastocitoz.

Bibliografie 1. Bird L, 2008, Allergy and Asthma: Calling all TH2 cells, Nature Rev. Immunol., 8, 162 2. Bettelli E, Korn T, Oukka M, Kuchroo VK, 2008, Induction and effector functions of TH17 cells, Nature, 453, 1051-1057 3. Dong C, 2008, TH17 cells in development: an updated view of their molecular identity and genetic programming, Nature Rev. Immunol., 8, 337-348 4. Trapani JA, Smyth MJ, 2002, Functional significance of the perforin/granzyme cell death pathway, Nature Rev. Immunol., 2, 735747 5. Bell E, 2007, Turning B cells into T cells, Nature Rev. Immunol., 7, 838-839 6. Welin A, Winberg ME, Abdalla H et al., 2008, Incorporation of Mycobacterium tuberculosisLipoarabinomannan into Macrophage Membrane Rafts Is a Prerequisite for the Phagosomal Maturation Block, Infection Immunity, 76, 2882-2887 7. Carbonetti NH, Artamonova GV, Rooijen N, Ayala V, 2007, Pertussis Toxin Targets Airway Macrophages To Promote Bordetella pertussis Infection of the Respiratory Tract, Infection Immunity, 75, 1713-1720 8. Hahn CL, Schenkein HA, Tew JG, 2005, Endocarditis-Associated Oral Streptococci Promote Rapid Differentiation of Monocytes into Mature Dendritic Cells, Infection Immunity, 73, 50155021 9. Sinsimer D, Fallows D, Peixoto B et al., 2010, Mycobacterium leprae Actively Modulates the Cytokine Response in Nave Human Monocytes, Infection Immunity, 78, 293-300 10. Sawant KV, McMurray DN, 2007, Guinea Pig Neutrophils Infected with Mycobacterium tuberculosis Produce Cytokines Which Activate Alveolar Macrophages in Noncontact Cultures, Infection Immunity, 75, 1870-1877 11. Padigel U, Lee J, Nolan T et al.,2006, Eosinophils Can Function as Antigen-Presenting Cells To Induce Primary and Secondary Immune Responses to Strongyloides stercoralis, Infection Immunity, 74, 3232-3238 12. MacGlashan D, 2008, New roles for basophils, Immunol. Cell Biol., 86, 637-638 13. Sokol CL, Barton GM, Farr AG, Medzhitov R., 2008, A mechanism for the initiation of allergen-induced T helper type 2 responses, Nat. Immunol., 9, 310-318

12. Complexul major de histocompatibilitate (MHC); Sistemul HLA (MI Popa)


164

12. 1. Definiie i istoric Complexul major de histocompatibilitate (MHC) uman, sau sistemul HLA, corespunde unor moleculele exprimate pe membrana celular. Au fost descoperite ca alloantigene (alloantigen = antigen ce exist n forme alternative = alele n cadrul unei specii; alloantigenul induce rspuns imun atunci cnd este transferat la indivizii din aceeai specie, crora le lipsete respectiva form a antigenului; exemplu: sistemul ABO al grupelor sangvine) de care depindea compatibilitatea grefelor cutanate sau de organ. Un fragment de esut recoltat de la o gazd i grefat la un receptor diferit, chiar dac face parte din aceeai specie, este de regul eliminat. Dac dup eliminare se ncearc o nou grefare, cu acelai tip de esut, eliminarea este mai rapid. Pornind de la aceste observaii s-a pus numele de antigene de histocompatibilitate [primul rol identificat pentru acestea (dar existena lor nu este legat doar de fenomenul de compatibilitate/respingere a grefelor de esut sau organ]. Eliminarea esuturilor este controlat genetic, de mai multe gene care codific pentru sinteza de proteine diferite la subieci diferii (gene de histocompatibilitate). Exist antigene majore de histocompatibilitate (MHC) i antigene minore (situaie n care eliminarea grefelor are loc, de regul, tardiv). nelegerea acestor fenomene este legat de 3 descoperiri succesive: Complexul major de histocompatibilitate. Cercetrile lui Gorer (1963) pe grefe tumorale prelevate de la un oarece i grefate la altul, au artat c grefa este respins n caz de histoincompatibilitate sau tolerat n caz de histo-compatibilitate. Rejetul sau tolerana sunt dictate genetic. Aceasta a dus la descoperirea sistemului major numit H2 la oarece i a mai multor sisteme minore. Ulterior, existena MHC a fost confirmat la toate mamiferele, regiunea fiind denumit n funcie de specie (ex. H2 la oarece, ChLA la cimpanzeu). Sistemul HLA. n 1958 se pune n eviden, n serul unui pacient cu aplazie medular i politransfuzat, un alloanticorp care aglutineaz leucocitele altor subieci. Aceasta st la originea descoperirii sistemului allotipic HLA (human leucocyte locus A), evideniat la nivelul leucocitelor, apoi la majoritatea celulelor. Exist o mprire a sistemului HLA pe mai multe gene HLA-A, HLAB, HLA-C, HLA-DR, HLA-DP i HLA-DQ. Studiul supravieuirii grefelor cutanate, ntre donor i receptor HLA identic sau diferit a dovedit c sistemul HLA corespunde genetic i funcional cu MHC uman. Rspunsul imun. Rolul fiziologic a fost descoperit ulterior. Proprietatea de a rspunde la un anumit antigen depinde de genele MHC, numite din acest motiv gene ale rspunsului imun. Doherty i Zinkeragel au demonstrat n 1974 c rspunsul imun este limitat de complexul major de histocompatibilitate (MHC) individual.

12. 2. Structur i clasificare Sistemul HLA cuprinde un ansamblu de gene localizate pe un segment al braului scurt al cromozomului 6 (Figura nr. 1). 165

Genele HLA posed trei caracteristici importante: 1. polimorfismul - fiecare gen este polialelic (cu excepia HLA-DRA), fiind evideniate peste 50 de alele n sistemul MHC uman; aceasta este principala caracteristic a HLA ce face ca organismul uman s fie capabil de recunoaterea a miliarde de antigene din natur prin arsenalul de MHC cu conformaie specific fiecrui antigen. 2. codominana - la un subiect heterozigot, sunt exprimate dou alele diferite; 3. legtura strns -toate genele situate pe acelai cromozom se transmit n bloc descendentului, sub form de haplotip. Moleculele HLA aparin superfamiliei imunoglobulinelor, modelul lor structural de baz fiind motivul imunoglobulinic cu o punte disulfidic intramolecular. Sistemul HLA este mprit n dou grupe principale: HLA clasa I i HLA clasa II, denumirea respectnd cronologia descoperirii lor, i nu organizarea pe cromozom. Exist i HLA clasa III (nu este implicat n histocompatibilitate). Moleculele HLA clasa I Aceste molecule sunt heterodimeri formai prin legtur noncovalent ntre un lan greu polimorf a i un lanuor nonpolimorf 2m (Figura nr. 2) lanul greu a (44 kDa) este o protein transmembranar cu polimorfism alelic, codat de o gen a sistemului HLA; cuprinde 3 domenii extracelulare, o poriune transmembranar i o parte intracitoplasmatic scurt; lanul 2m (11,5 kDa) este codat de o gen de pe cromozomul 15 i cuprinde un singur domeniu; este extracelular, legat noncovalent de lanul a. Moleculele HLA-I sunt prezente pe majoritatea celulelor organismului, formnd pe suprafaa acestora un receptor constitutiv. Dintre celulele anucleate, aceste molecule sunt adesea absente la nivelul globulelor roii dar prezente n cantitate mare la nivelul plachetelor sanguine. Expresia lor pe celulele nucleate este variabil, n funcie de tipul celular: pe limfocitele T sau B i polimorfonucleare sunt exprimate 104-5105 molecule/celul n timp ce pe hepatocite sunt slab exprimate iar pe celulele nervoase i spermatozoizi aproape lipsesc. Pentru HLA-I exist 3 gene ce codific antigene majore de histocompatibilitate: HLA-A, HLA-B, HLA-C i 3 gene pentru antigene minore: HLA-E, HLA-F, HLA-G. Moleculele HLA clasa a II-a Aceste molecule sunt heterodimeri cuprinznd un lan polipeptidic a i un lan polipeptidic (Figura nr. 3) lanul greu a (33-34 kDa) cuprinde dou domenii externe a1 i a2, o poriune transmembranar i o terminaie carboxilic scurt intracitoplasmatic; lanul uor (28 kDa) are o structur asemntoare, cu dou domenii externe 1 i 2. Moleculele clasei a II-a au o distribuie mult mai restrns n comparaie cu moleculele clasei I. Ele sunt exprimate pe celulele prezentatoare de antigen (APC): celule dendritice (celule Langerhans din piele, celule interdigitate ganglionare i din timus, celule dendritice din epiteliul cilor respiratorii), monocite / macrofage i limfocite B. Limfocitele T nu exprim astfel de molecule dect dup activare.

166

Moleculele clasei a II-a au fost descoperite i la nivelul endoteliului vascular i al celulelor epiteliale ale intestinului gros. n cazuri patologice, moleculele clasei a II-a au fost depistate la nivelul celulelor din insulele lui Langerhans n diabetul insulinodependent, al canalelor biliare n ciroza biliar primitiv i al celulelor tiroidiene n afeciunile tiroidiene autoimune. Expresia moleculelor este indus de mediatori precum: IFN-g, TNF-a i , IL-4, IL-13 i GM-CSF cu rol esenial n rspunsul imun. Prostaglandina E2 inhib sinteza lor pe monocite / macrofage. Regiunea HLA-II conine gene ce codific HLA-DR, DQ, DP, DM, i pe lng acestea, cteva molecule accesorii: PSMB8, PSMB9, TAP1, TAP2, BTNL2. Moleculele HLA-III nu sunt implicate n histocompatibilitate. Sunt total diferite de cele de clasele I i II. Nu se afl ataate pe membranele celulare i nu intervin n recunoaterea peptidelor antigenice.

12. 3. Roluri Limfocitele T protejeaz organismul uman de 2 mari categorii de ageni patogeni: virusurile, care preiau comanda celulei pe care o infecteaz (devenind astfel antigene endogene) i bacteriile care se replic autonom, majoritatea extracelular. Cele 2 clase ale MHC sunt eseniale n recunoaterea i rspunsul imun fa de peptide derivate din agresori. n lupta dintr-o infecie viral, virusul este eliminat de ctre LT CD8+ care recunoate peptide virale endogene ataate de MHC-I. n schimb, o bacterie e eliminat prin fagocitare de ctre macrofage sau neutrofile. LT CD4+ recunoate peptidele bacteriene legate de MHC-II i direcioneaz rspunsul imun ctre activarea macrofagelor i producia de anticorpi care opsonizeaz bacteria. Moleculele de histocompatibilitate au aadar un rol fundamental n prezentarea peptidului antigenic ctre: limfocitul T helper - HLA-II sau limfocitul T citotoxic - HLA-I. n aceast comunicare intercelular intr n contact 3 molecule: HLA peptidul antigenic TCR. Rolul moleculelor HLA clasa I Au rol n principal n reacia imun care implic intervenia LTc. Moleculele HLA I prezint un peptid endogen sintetizat de o celul contaminat de o bacterie/un virus/un parazit cu dezvoltare intracelular sau un peptid endogen rezultat din degradarea unor celule self tumorale sau mbtrnite ctre receptorul de antigen (TCR) al limfocitului T CD8+. Se va obine astfel un rspuns imun celular prin activarea i multiplicarea LTc avnd ca rezultat liza celulelor int ce au prezentat antigenul prin HLA-I. (Figura nr. 4) Rolul moleculelor HLA clasa a II-a

167

Ele intervin n principal n rspunsul imun n care sunt implicate APC i LTh. Moleculele HLA II prezint limfocitului Th CD4+ peptide de origine exogen, provenite din proteinele endocitate i degradate de APC. (Figura nr. 5) Etape: a) Legarea antigenului exogen de molecula HLA clasa II: 1. Endocitoza - particulele antigenice (bacterii, proteine strine) sunt internalizate nespecific de monocite / macrofage sau specific de limfocitele B prin IgM. Ele urmeaz calea endocitozei; 2. Generarea peptidelor antigenice - prin fuzionarea endozomilor cu lizozomii, proteinele sunt degradate n peptide prin activarea proteazelor lizozomale la un pH acid; 3. Asocierea cu HLA II - moleculele HLA clasa II-a sintetizate n reticulul endoplasmic sunt asociate, sub forma unui complex, cu o protein accesorie, lanul invariabil II. Aceasta mpiedic legarea peptidelor endogene de HLA-II prin blocarea situsului de legare n timpul sintezei sale i permite legarea peptidelor exogene prin distrugerea lanului dup terminarea sintezei; 4. Trecerea prin membrana celular - ansamblul HLA-II-peptid exogen este exprimat la suprafaa APC. (Figura nr. 6) b) Interaciunea ntre APC i limfocitul T helper: Peptidele antigenice sunt recunoscute de ctre LTh prin TCR numai dac sunt prezentate de ctre APC pe MHC-II. Pe de alta parte, limfocitul helper CD4+, prin TCR-ul su nu poate interaciona cu o APC dect dac recunoate antigenele cuplate cu moleculele MHC ale individului (restricie allogenic). Molecula accesorie CD4 a limfocitului helper interacioneaz cu domeniul 2constant al HLA-II declannd astfel primul semnal ctre limfocit pentru activarea sa. n urma unor reacii n cascad LT va intra n mitoz, va secreta o serie de citokine i va colabora cu LB spre producia de anticorpi avnd ca scop eliminarea antigenelor exogene. Specificitatea reaciei este datorat asocierii trimoleculare TCR, HLA, peptid antigenic. O parte din moleculele codificate de regiunea HLA-II sunt implicate n procesarea i ncrcarea peptidelor pe HLA-I. Astfel, PSMB8 i PSMB9 sunt subuniti ale proteozomului iar TAP1 i TAP2 transport peptidele endogene din citoplasm n RE. BTNL2 este implicat n susceptibilitatea la sarcoidoz Moleculele HLA-III sunt mprite n dou categorii n funcie de rol: a.) cu rol n imunitate i inflamaie: componentele complementului C2 i C4, TNF, HSP (proteina de oc termic); b.) cu rol enzimatic: CYP21

12. 4. Povestiri adevrate 12.4.1. Polimorfismul HLA Orice celul care prezint un tip de HLA diferit de cel al organismului este considerat non-self, un invadator, iar rezultatul este acela de rejecie a esutului compus din respectivele celule. Din cauza importanei HLA n transplant, locusurile HLA sunt printre cele mai frecvent serotipate sau analizate prin PCR fa de oricare alte alele autozomale.

168

n diferite studii, s-a analizat importana compatibilitii HLA n transplantul de inim, rinichi, celule stem hematopoietice. Polimorfismul sistemului HLA este foarte mare i de aceea probabilitatea ca organele donoare s fie potrivite primitorului este foarte mic. n transplanturi a existat practica de a se aloca organe fr a se lua n considerare compatibilitatea HLA donor-receptor. De aceea, n trecut, nu a fost posibil analizarea corespunztoare a ratei de succes a transplantului cu organe compatibile HLA. ntr-un studiu realizat pe 8.331 de pacieni, internai n 104 centre din 24 state din USA, doar 128 subieci au primit cte o gref cardiac compatibil HLA (A, B sau DR) sau doar cu o singur incompatibilitate. S-a observat supravieuirea esutului pe o durat de 3 ani, iar rezultatele au fost dependente de sistemul HLA. Astfel, au avut succes: la compatibilitate maxim 834% transplanturi fa de 76 2% transplanturi la 2 nepotriviri. Aadar, supravieuirea grefei n transplantul de cord este semnificativ influenat de compatibilitatea HLA. Exist dou tipuri de incompatibilitate: a antigenelor (detectabil serologic) i a alelelor (detectabil prin metode de analizare a ADN-ului). ntr-un studiu s-a testat ipoteza conform creia incompatibilitatea alelelor este mai puin imunogen dect incompatibilitatea antigenelor i, astfel, este mai puin asociat cu rejecia de transplant cu celule stem hematopoietice. Peste 450 de pacieni cu leucemie mieloid cronic au primit transplant de mduv de la donori diferii. Prin secvenierea ADN, s-au analizat alelele clasei I HLA (A, B, C) i s-au observat ratele de respingere a grefei la transplanturile fr nici o incompatibilitate, la cele cu o singur incompatibilitate a alelelor sau a antigenelor sau la transplanturile cu 2 sau mai multe nepotriviri. Rezultatele au confirmat ipoteza i, astfel, riscul rejeciei de transplant a fost semnificativ mai mare la cei cu o incompatibilitate antigenic HLA, fa de cei cu o incompatibilitate alelic. Riscul a fost de asemenea crescut la cei cu mai multe nepotriviri HLA i la primitorii homozigoi HLA n locusul de incompatibilitate. n concluzie, transplanturile de la donori cu o singur incompatibilitate a alelelor HLA au un risc sczut de rejecie i pot fi realizate cu succes. n schimb, incompatibilitatea de antigene HLA, detectabil serologic, crete riscul de respingere a esutului. 12.4.2. Asocierea subtipurilor HLA cu susceptibilitatea la boli Studii epidemiologice au demonstrat c peste 40 de boli se ntlnesc mai frecvent la indivizi purttori ai anumitor alele HLA I sau II dect la populaia general. Importana acestor efecte este extrem de mare, dei nu vor fi probabil niciodat demonstrate ca absolute. De exemplu, ntre 90% i 95% din pacienii caucazieni cu spondilit ankilozant posed HLA-B27 (1), iar 30%50% din pacienii caucazieni cu diabet zaharat tip I sunt HLA-DQ2/DQ8 heterozigoi. Interesant este faptul c HLA-DQ6 pare a fi responsabil de protecia mpotriva diabetului zaharat de tip I. Majoritatea bolilor care au legtur cu anumite gene HLA au un caracter autoimun. Baza molecular a acestei legturi este necunoscut din cauza lipsei identificrii autoantigenului primar care reprezint trigger-ul. (2) Cu toate c mecanismele prin care genotipurile HLA controleaz susceptibilitatea la aceste boli sunt nc incomplet definite, se crede c participarea moleculelor MHC n stabilirea toleranei imunologice i n recunoaterea antigenelor st la baza acestor fenomene. Alelele HLA ce ofer protecie pot media eliminarea n timus a LT potenial patogene responsabile de autoimunitate, n timp ce alelele HLA susceptibile pot eua n eliminarea LT patogene. 169

Pe de alt parte, genotipurile HLA pot guverna receptivitatea la anumite vaccinuri. Spre exemplu, subiecii care au alela HLA-DR3 sunt, ntr-o proporie crescut substanial, nereceptivi la vaccinarea cu antigenul de suprafa al hepatitei B. Totodata, indivizii cu HLA-DRB1*03 sau HLA-DQA1*0201 au o inciden crescut de seronegativitate la vaccinarea mpotriva pojarului. (3) Un studiu realizat de curnd pe ceteni americani caucazieni certific faptul c homozigoii HLA-DR13-DQ6 prezint risc crescut de asociere a distoniei cervicale. (4) O alt boal cu caracter autoimun i conexiuni certe cu sistemul HLA este scleroza multipl. (5 6) 12.4.3. Prezentarea de antigene independent de MHC Recent s-a fundamentat ideea conform creia exist o clas nou de LT care recunosc antigene prezentate de molecule ce nu sunt MHC-I sau MHC-II. Una dintre aceste clase de LT folosete un receptor pentru antigen ce recunoate antigene lipidice prezentate pe molecule CD1. CD1 sunt asemntoare structural cu MHC-I, ns lanurile CD1 formeaz un situs ce poate acomoda componente glicolipidice ale patogenilor microbieni. Astfel, complexele CD1-glicolipide servesc drept int pentru recunoaterea de ctre LT ce au un tip special de receptor: TCR. Aceast prezentare a glicolipidelor microbiene pe molecule CD1 pare s fie responsabil de recunoaterea independent de MHC a mycobacteriilor. (3)

12. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. Early selection in Gag by protective HLA alleles contributes to reduced HIV-1 replication capacity that may be largely compensated in chronic infection, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20810731 2. Additive contribution of HLA class I alleles in the immune control of HIV-1 infection. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20660184 3. The impact of HLA genotyping on survival following unrelated donor haematopoietic stem cell transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20560963 4. Impact of human leukocyte antigen matching on hepatitis B virus recurrence after liver transplantation, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20382583

12. 6. Verificai-v cunotinele 1. Principala caracteristic a sistemului HLA este: A. codominana B. specificitatea C. polimorfismul D. histocompatibilitatea 170

E. imunogenicitatea. 2. Moleculele MHC-II se afl pe: A. majoritatea celulelor din organism B. numai pe celulele nucleate C. numai pe macrofage D. toate APC E. limfocite 3. Colaborare intercelular exist ntre: A. HLA-II i LTc B. HLA-I i LTc C. APC i HLA-I D. HLA-I i LTh E. HLA-I i HLA-II 4. Moleculele HLA-II prezint ctre limfocite n situsul lor: A. imunoglobuline B. sfingolipide C. peptide exogene D. TCR E. peptide endogene

Bibliografie 1. Reveille JD., 2009, Recent studies on the genetic basis of ankylosing spondylitis, Current Rheumatology Reports., 11(5), 340-8 2. Caillat-ZuchmanS., 2009, Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune disease, Tissue Antigens, 73 (1), 1-8 3. David D Chaplin, 2010, Overview of the immune response, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 125 (2 Suppl 2), S3-23 4. Deitiker PR, Oshima M., Jankovic J., Duane DD., Aoki KR., Atassi MZ., 2010, Association of HLA Clas II alleles and haplotypes with cervical dystonia: HLA DR13-DQ6 (DQB1*0604) homozygotes are at greatley increased risk of cervical dystonia in Caucasian Americans, Autoimmunity, Epub ahead of print 5. Romero-Pinel L., Pujal JM, Martinez-Yelamos S., Gubieras L, Matas E., Bau L., Torrabadella M., Azqueta C., Arbizu T., 2010, HLA-DRB1: genetic susceptibility and disability progression in a Spanish multiple sclerosis population, European Journal of Neurology, Epub ahead of print 6. Link J., Lorentzen AR., Kockum I., Duvefelt K., Lie BA., Celius EG., Harbo HF., Hillert J., Brynedal B., 2010, Two HLA class I genes independently associated with multiple sclerosis, Journal of Neuroimmunology, Epub ahead of print

13. Molecule de adeziune; Citokine; Mesageri secunzi (A Muntean, MI Popa)


171

Interaciunile ntre celulele imunitare se realizeaz prin dou mecanisme complementare: contactul celular strns, care necesit prezena moleculelor de adeziune (direct); prezena factorilor stimulatori, citokine, secretate de una din cele dou celule aflate n contact sau, uneori, de o celul aflat la distan (indirect). Rezultatul va fi activarea sau inhibarea funciei celulare, ca urmare a transportului informaiei prin mesagerii secunzi spre organitele intracitoplasmatice, membrana celular sau genele nucleare. 13. 1. Moleculele de adeziune Contactul ntre dou celule nu se face spontan. Rolul moleculelor de adeziune este complex i nu se limiteaz la procesele imunologice. Legturile intercelulare asigurate de liganzi sunt reacii chimice clasice specifice, saturabile i reversibile. Clasificarea moleculelor de adeziune se poate face n dou moduri, structural i funcional.

13. 1. 1. Clasificarea structural a moleculelor de adeziune Clasificarea structural a moleculelor de adeziune se bazeaz pe caracteristicile chimice ale moleculei care permit legarea sa de o anumit superfamilie sau familie de proteine. Expresia lor pe suprafaa celulei poate fi constitutiv sau indus n urma activrii celulare. Selectinele (LECAM-family, leucocyte-endothelial cell adhesion molecule) Selectinele sunt glicoproteine transmembranare cu un domeniu N-terminal lectinic-calciudependent i domenii reglatoare pentru sistemul complement. Selectinele au rol n adeziunea intercelular; joac un rol important n amorsarea procesului inflamator. L-selectinele sunt exprimate constitutiv pe suprafaa leucocitelor, n timp ce expresia Eselectinelor pe endoteliu este indus de ctre TNF-a, IL-1 i lipopolizaharidele bacteriene iar a Pselectinelor de ctre C5b, histamin i trombin. L-selectinele joac un rol important pentru LT imature i APC (celule dendritice) care sunt astfel direcionate ctre situsuri cu rol imunologic important, precum nodulii limfatici sau GALT. P-selectinele formeaz mpreun cu factorul Willebrand granule denumite corpusculii Weibel-Palade. P-selectinele sunt primele expuse pe versantul circulator, fiind stocate n vezicule. Integrinele Familia integrinelor cuprinde peste 20 de membri, glicoproteine transmembranare cu structur heterodimeric (a, ). Iniial au fost caracterizate 3 subfamilii, cu lanul comun i lanul a diferit, pentru ca n prezent s se cunoasc faptul c lanul a se poate asocia cu mai multe lanuri ( 1-8). Localizarea integrinelor este ubicuitar (cel puin un membru al acestei familii pe toate celulele nucleate). Leucocitele pot exprima cel puin 13 astfel de receptori. Celulele epiteliale exprim la rndul lor o serie de integrine, constitutiv sau indus, n urma procesului inflamator. Integrinele intervin n legarea intercelular i ntre celul i substrat, prin care contribuie la organizarea tisular i migrarea celular, alturi de superfamilia imunoglobulinelor; subfamilia 172

2-integrinelor stimuleaz proliferarea limfocitelor T, la contactul cu celulele dendritice; cresc sinteza de citokine (1 i 2-integrinele stimuleaz producia de TNF-a i a celulei T; 2integrinele stimuleaz producia de IL-1 a monocitelor, la contactul cu limfocitul T). Integrinele au dou stadii conformaionale, cu specificitate diferit fa de substrat (Figura nr. 1). Acestea sunt influenate de procese celulare interne de fosforilare ce induc schimbri conformaionale, ca rspuns la factori din mediu (vezi seciunea de integrare a cunotinelor: recrutarea celulelor din torentul sangvin). Superfamilia imunoglobulinelor (imunoglobulin-like) Moleculele de adeziune din aceast clas au o structur imunoglobulin-like prin expresia extracelular a unor domenii repetitive de tip imunoglobulinic. Sunt clasificate n trei subfamilii: ICAM (intercellular adhesion molecule), VCAM (vascular cell adhesion molecule) i PECAM (platelet-endothelial cell adhesion molecule). Moleculele de adeziune din aceast clas intervin n legarea intercelular, mai ales n interaciunea leucocit-endoteliu. Prin cuplarea lor cu liganzii de selecie (integrine) intervin n legarea leucocitar i prin aceasta n controlul infiltratului inflamator local. Expresia lor pe suprafaa celular este constitutiv sau indus de citokine. Caderinele Caderinele sunt formate dintr-un singur lan polipeptidic i sunt exprimate constitutiv pe suprafaa celulelor. Au rol n legarea intercelular prin aderarea unora de altele, pe celulele adiacente, printr-un mecanism calciu-dependent. Prin funcia lor asigur integritatea epiteliilor. Caderinele sunt clasificate n patru subfamilii: E-caderine (pe epitelii), V-caderine (pe endoteliu), P-caderine (placentare), N-caderine (n sistemului nervos central i ochi). adresine vasculare Sunt glicoproteine exprimate pe suprafaa celulelor endoteliale i intervin n homing-ul limfocitar, respectiv n direcionarea limfocitelor spre ganglionii limfatici i esuturile extraganglionare. Carbohidraii Reprezint liganzii specifici pentru selectine i nu constituie o clas distinct de molecule de adeziune. 13. 1. 2. Clasificarea funcional a moleculelor de adeziune

13. 1. 2. 1. Moleculele accesorii asociate cu TCR molecula CD4 Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 2/3 din LT mature circulante, definind subsetul de LT CD4+. Molecula CD4 este prezent i pe suprafaa celulelor dendritice cutanate i pe 173

monocitele/macrofagele activate. Este o molecul de 55-67 kDa, cu o parte extracelular compus din 4 domenii din superfamilia Ig, care recunoate o parte constant situat la nivelul domeniului 2 a moleculei HLA II. molecula CD8 Aceast molecul este exprimat pe suprafaa a 1/3 din LT mature circulante. Definete subsetul de LT cu activitate citotoxic i unele celule NK (n proporie mai mic) (Figura nr. 2). Molecula CD8 este homodimeric (CD8a/CD8a) sau heterodimeric (CD8a/CD8b). Rolul su primordial este s asigure interaciunea cu o parte monomorf a moleculei HLA I, pentru recunoaterea domeniului a3 al acestei molecule. Molecula CD8, ca i molecula CD4, este asociat cu tirozinkinaza. NB. Pentru mai multe informaii despre apoptoz, vezi capitolul Toleran Imunologic. 13. 1. 2. 2. Moleculele de adeziune necesare costimulrii ntre celulele prezentatoare de antigen i limfocitele T n permanen, ntre APC i LT se stabilesc cupluri de adeziune intercelular. Este nevoie de prezena APC dar i de o colaborare bidirecional (crosstalk) ntre APC i LT (trebuie s existe o dubl activare a celor dou tipuri de celule, n sens anterograd i retrograd), ntruct n lipsa acestora, limfocitul T nu este capabil s capteze i cu att mai mult, s prelucreze Ag native T-dependente (Figura nr. 3). Cuplurile de adeziune stabilesc un efect de fermoar ntre membrana APC i LT, legtura avnd loc nainte ca TCR s vin n contact cu epitopul (cuplul se formeaz chiar dac APC prezint un epitop pentru care LT nu are receptori specifici). Se descriu trei cupluri: Cuplul B7-CD28 Molecula B7 se exprim pe suprafaa majoritii APC (celule dendritice n repaus, macrofage activate i LB activate). Dei este absent pe macrofagele i LB n repaus, n urma costimulrii acestora, molecula B7 se exprim pe suprafaa lor, pentru a asigura o cooperare celular pozitiv. Molecula CD28, care recunoate receptorul B7, este prezent pe toate LT, cu excepia LT supresoare i permite costimularea ntre APC i LT. Rezultatul este transcripia unor factori antiapoptotici precum Bcl-x i IL-2. Cuplul B7-CTLA-4 (CD80) Molecula CTLA-4 nu este exprimat dect de LT CD4+ sau T CD8+, ntr-o proporie mai mic dect molecula CD28 dar cu o afinitate de 20 de ori mai mare pentru molecula B7. Interaciunea cu APC poate induce inhibiie i chiar apoptoz. NB. CTLA-4 competiioneaz cu CD28 pentru legarea moleculei B7, exprimat pe membrana APC. Datorit efectelor discrepante activatoare/inhibitoare se pune problema nelegerii modului n care LT va traduce semnalul primit. 1). Dac APC este activat de prezena n mediu a citokinelor pro-inflamatorii (ex. IL2), va prezenta un numr mai mare de molecule B7, favoriznd legarea CD28, iar semnalul transmis va fi activator (Figura nr. 4).

174

2). n cazul n care APC este puin activat, va exprima pe membrana sa puine molecule B7. Acest fapt va oferi un avantaj de legare moleculelor cu afinitate mai mare, aa nct majoritatea moleculelor legate vor fi de tip CTLA-4 (CD80), iar semnalul transmis va fi inhibitor (Figura nr. 5). Raportul semnalului activator/inhibitor transmis de aceste cupluri moleculare este modulat de factorii de mediu i decide comportamentul ulterior al LT (vezi capitolul Toleran Imunologic pentru mai multe detalii). Cuplul CD40 i CD40L Molecula CD40 se exprim pe toate celulele prezentatoare de antigen n repaus - celule dendritice, LB i monocite/macrofage dar i pe progenitorii hematopoietici i celulele epiteliale. Molecula CD40L (L pentru ligand) nu se exprim dect pe LT activate CD4+ sau CD8+ i nu pe cele n repaus. Este de asemenea prezent pe bazofile i mastocite. Sindromul hiper-IgM, Xlinkat se caracterizeaz prin absena moleculei CD40L funcionale. Mecanismul prin care interaciunea CD40-CD40L stimuleaz rspunsul LT pare a fi reprezentat de intensificarea secreiei de IL-12 i creterea numrului de molecule B7 de pe membrana APC (APC licensing), ducnd la recrutarea mai multor celule prezentatoare de antigen i potenarea semnalului costimulator transmis de aceste celule. 13. 1. 2. 3. Moleculele de adeziune necesare costimulrii ntre celulele prezentatoare de antigen i limfocitele T helper sau limfocitele T citotoxice i int. Aceti liganzi cuprind urmtoarele dou cupluri: Cuplul LFA2 (CD2) i LFA3 (CD58) (LFA - leukocyte function - associated antigen) Molecula LFA2 (CD2) permite formarea rozetelor E (E pentru eritrocite) ntre LT umane i eritrocitele de oaie. Fenomenul se datoreaz prezenei LFA3 pe eritrocitele de oaie. Molecula LFA3 (CD58) are o distribuie larg, care cuprinde celulele endoteliale vasculare, fibroblatii, limfocitele i macrofagele. Cuplul LFA1 i ICAM 1, 2 i 3 Molecula LFA1 corespunde integrinei aL/2 (CD11a/CD18). Prezena sa este relativ difuz la nivelul diferitelor leucocite (neutrofile, monocite, LT, LB i LT de memorie). ICAM1 (CD54), ICAM2 i ICAM3 sunt puternic exprimate la nivelul LT citotoxice i permit activarea lor. ICAM1 se gsete pe neutrofile n repaus, celule endoteliale, monocito/macrofage i LB activate. Aceste dou cupluri de adeziune permit recunoaterea i interaciunea ntre LT CD4+ i APC sau ntre LT CD8+ i celula int, proces completat de specificitatea TCR. Conexiunea constituit ntre LT CD4+ i APC a fost numit sinaps imunologic, subliniind transferul informaional implicat n recunoaterea epitopului exprimat pe moleculele MHC II de ctre TCR (Figura nr. 6).

13. 2. Citokinele (Interleukinele)

175

Citokinele sunt substane proteice, solubile, cu greutate molecular mic, 8-70 kDa. cel mai frecvent sunt sintetizate de ctre celule dup activare prealabil, acionnd ca mediatori asupra altor celule sau asupra lor nsi, n cantiti foarte mici, de ordinul pico sau nanogramelor. n momentul de fa au fost identificate peste 100 de molecule diferite de citokine. O parte dintre citokine au n special efecte chemotactice i din acest motiv au fost numite chemokine. Termenii de limfokine (substane sintetizate de limfocite) sau de monokine (provenind din monocite) nu se mai folosesc deoarece citokinele sunt sintetizate de o gam mult mai larg de celule. Termenul de interleukine, care indic o aciune ntre dou leucocite, a persistat i continu s persiste n denumirea prescurtat, de la IL-1 la IL-35. Termenul de citokine pare s fie cel mai adecvat. n unele cazuri, denumirea provine de la una din activitile care au permis descoperirea citokinei: TNF (tumor necrosis factor), IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte/monocyte-colony stimulating factor), G-CSF (granulocyteCSF), M-CSF (monocyte-CSF), TGF (transforming growth factor). n afara sistemului imun i hematopoietic au fost descoperii i ali factori de cretere: NGF (nerve growth factor), FGF (fibroblast growth factor), EGF (epithelial growth factor) etc. Citokinele acioneaz datorit prezenei receptorilor specifici, desemnai prin denumirea lor englez: IL-1R, IL-2R, TNF-R etc. Ei sunt prezeni uneori pe aceeai celul care a sintetizat citokina (efect autocrin) sau pe alte celule (efect exocrin). O clasificare atotcuprinztoare a citokinelor este foarte dificil, din punct de vedere funcional, pentru motivele prezentate (i care reprezint un punct din cutia Pandorei la care se face uneori referire, atunci cnd sunt luate n discuie aceste structuri). Din punct de vedere didactic (i funcional), vom ncerca s prezentm n continuare o grupare a celor mai cunoscute dintre citokine.

13. 2. 1. Citokine pro-inflamatorii n cadrul procesului infecios, diferitele microorganisme care au sau dobndesc prin variabilitate un efect de agresiune fa de organismul gazd, antreneaz un rspuns la nivelul endoteliului vascular; una dintre primele reacii este reprezentat de mobilizarea leucocitelor polimorfonucleare neutrofile (PMN). n aceast etap intervin i o serie de citokine. TNF- i TNF- TNF- este produs de monocite / macrofage dar i de diverse alte celule (limfocite T, limfocite B, celule NK, fibroblaste, mastocite, bazofile, celule gliale etc), ca reacie la contactul cu diferite bacterii sau lipopolizaharidele din peretele germenilor Gram-negativi. Sursa cea mai important pentru TNF- rmne ns sistemul monocito-macrofagic. TNF- favorizeaz expresia moleculelor de adeziune la nivelul endoteliului vascular i al monocitelor; atrage ctre sediul procesului infecios alte monocite i leucocitele PMN. Are o activitate anti-viral, anti-parazitar i anti-tumoral. Stimuleaz lipoliza, glicoliza muscular i reabsorbia osoas prin care poate antrena apariia caexiei (TNF a fost numit iniial caexin). Induce formarea altor mediatori ai inflamaiei (leucotriene, PAF). Formarea sa este la rndul su indus de IFN, IL-1, factori de cretere sintetizai de monocit, endotoxinele bacteriilor Gram-negative, diferite virusuri, bacterii, unele componente ale sistemului complement, leucotriene i prostaglandine. Eliberarea TNF- este inhibat de glucocorticoizi, 2-macroglobuline, 2-antitripsin etc. TNF- 176

este sintetizat de LT activate i celule NK i are aciuni identice cu TNF-, acionnd pe acelai tip de receptori. n momentul de fa este clasificat ntre limfotoxine (LT-). IL-1 i IL-6 Sunt dou citokine cu rol asemntor. Sunt produse de numeroase celule: monocite, macrofage, LT, LB, celule endoteliale vasculare, keratinocite (din piele), astrocite i celule gliale (din creier) etc. IL-1 se gsete sub dou forme: IL-1a fixat la membran i IL-1 secretat. Experimental a fost demonstrat c stimularea cu orice structur microbian a celulelor care n mod potenial sintetizeaz IL-1 va duce la sinteza acestor molecule (IL-1a i IL-1). Ele sunt codificate de gene diferite dar recunosc aceeai receptori: primul receptor IL-1R1 induce transducia informaiei la nivel celular, n timp ce IL-1R2 nu induce un semnal celular. IL-1 are funcie imunologic, activnd la nivel superior LTh, care se vor divide mitotic i se vor diferenia n diverse clase. IL 1, eliberat n spaiul extracelular i n snge, exercit o puternic aciune proinflamatorie. Celulele care sintetizeaz IL-1 produc cteva ore mai trziu un antagonist al receptorului de IL-1, numit IL-1Ra, care face ca aciunea IL-1 s fie tranzitorie. IL-1 induce creterea expresiei moleculelor de adeziune; activeaz limfocitele T i B; crete sinteza proteinelor de faz acut la nivel hepatic; crete catabolismul celulelor musculare i al osteoclastelor (rezorbie osoas); activeaz sistemul nervos central cu febr, anorexie i insomnie. Fiind i prima interleukin numit ca atare, IL-1 a fost considerat iniial drept o molecul piretogen. Inocularea de IL-1 la subieci umani conduce la apariia febrei i frisonului. Concentraia de IL-1 din plasm poate s creasc i n condiii fiziologice (ex. n stres nepatologic, exces de vitamin A, n timpul menstruaiei). IL-6 are o aciune att asupra sistemului imun ct i asupra unor celule care nu aparin acestuia, asemntoare cu aceea a Il-1, cu o singur diferen: ea acioneaz mai ales pe maturaia terminal a LB n plasmocite i pe diferenierea LT citotoxice. Ca i IL-1, produce proteoliz endogen, induce sinteza proteinelor inflamatorii la nivel hepatic (fibrinogen, haptoglobin, 1antitripsin, protein C reactiv etc) i activeaz sistemul nervos central conducnd la apariia febrei, anorexiei, somnolenei etc. IL-6 induce sinteza de imunoglobuline; are i rol n maturarea celulelor pe linia megakariocitar. Sinteza IL-6 este stimulat de IL-1. Limfotoxinele Limfotoxina (LTx) a fost identificat n urma efectului citotoxic exercitat de limfocitele activate, ulterior a fost sintetizat i caracterizat, dar s-a dovedit c nu exist un singur factor de acest tip, ci o serie de substane care ar putea fi grupate ntr-o superfamilie. Iniial LT-, o limfotoxin solubil, a fost definit drept factor de necroz tumoral (TNF-). Dintre numeroii membri ai superfamiliei limfotoxinelor menionm LT- i LT-, sintetizate n special de LT i LB activate, dar i de ctre celulele NK sau celule LAK (lymphokine activated killer cells). Au rol n etapele de iniiere a inflamaiei i se pare c au un rol n realizarea unei protecii fa de agresiunea microbian. IFN-g Dintre efectele pro-inflamatorii ale IFN- amintim activarea macrofagelor (acest interferon este probabil cea mai important substan care produce trecerea macrofagelor de la o stare n ateptare la starea activ, bactericid) i astfel intervine n fazele iniiale ale inflamaiei dar i n 177

diferenierea clonelor de limfocite care reacioneaz fa de structurile bacteriene agresoare (Figura nr. 7). Alte efecte vor fi prezentate n urmtoarele subpuncte. IL-10 Acioneaz att asupra celulelor hematopoietice ct i asupra altor celule. Dac iniial s-a considerat c are efecte pro-inflamatorii, n momentul de fa se cunoate faptul c, prin efectele inhibitorii asupra monocitelor, neutrofilelor, celulelor dendritice, este de fapt o interleukin cu efect anti-inflamator. A fost numit i factor de inhibare al macrofagelor. IL-11 Sinteza IL-11 poate avea loc la nivelul fibroblastelor, condrocitelor, sinoviocitelor, keratinocitelor, celulelor endoteliale, celulelor epiteliale etc. Administrarea de IL-11 stimuleaz sinteza unor reactani de faz acut, la fel ca i IL-6. Totui, efectul esenial al IL-11 se adreseaz creterii trombocitare. Are i efecte anti-inflamatorii la nivelul adipocitelor i osteoclastelor. Relativ recent, a fost avizat utilizarea IL-11 n tratamentul asociat chimioterapiei din cancer, pentru a preveni apariia unei trombocitopenii severe la pacienii care primesc medicaie citotoxic, anti-tumoral. IL-12 Cunoscut drept o substan care induce sinteza de IFN-, IL-12 are i alte efecte de stimulare a rspunsului inflamator al gazdei, n urma unui proces infecios. Sursa cea mai important de IL12 este reprezentat de celulele dendritice. IL-16 Iniial a fost considerat o chemokin pentru LT Helper (CD4 +), dar poate exercita astfel de activiti i fa de alte celule implicate n procesul infecios i n inflamaie. Sursa principal de IL-16 este reprezentat de LT CD8+. IL-17 (A, B, C, F) Au efecte proinflamatorii i de stimulare a hematopoiezei. IL-18 A fost considerat drept o molecul care induce sinteza de IFN-. Ulterior s-a dovedit c singur, nu duce la o stimulare eficient, dar n asociere cu IL-12, efectul de stimulare al sintezei de IFN- demonstreaz sinergism. IL-18 este sintetizat n special de macrofagele activate i de ctre celulele dendritice, dar exist i alte celule productoare de IL-18 (monocite, keratinocite, celule epiteliale intestinale etc). Are efecte pro-inflamatorii, efecte n procesul infecios declanat de o serie de bacterii (ex. Listeria spp.), parazii (ex. Cryptococcus neoformans) sau virusuri (ex. virusul gripal), efecte anti-tumorale i intervine n patogenia unor boli n care exist inflamaie cronic sau n boli autoimune. IL-22 Este o citokin nrudit cu IL-10, dar cu puternice proprieti pro-inflamatorii. ntr-un studiu pe celule pulmonare, s-a demonstrat un rspuns semnificativ IL-22 mARN la 6 ore de la debutul infeciei cu Klebsiella pneumoniae. Rspunsul indus n celule cultivate n prezena aceastei 178

citokine, este de exprimare a moleculelor defensive n celulele epiteliale traheale. Unul din efectele induse de aceast citokin este exprimarea moleculei lipocalin-2, cu rol n sechestrarea fierului. ntr-un model de infecie colonic s-a demonstrat c lipsa IL-22 duce la instabiltatea barierei epiteliale i diseminare bacterian. IL-23 Are efecte asemntoare cu IL-12, exercitate n combinaie cu IL-12. Este sintetizat mai ales de celulele dendritice. HMGB1 (high mobility group box chromosomal protein 1) Iniial a fost caracterizat ca o protein non-histonic cu rol n arhitectura cromozomilor. S-a demonstrat c aceast citokin cu totul particular are rol pro-inflamator, fiind eliberat din celulele necrotice (i doar n mic msur de cele apoptotice), jucnd rol de DAMP (Damage Associated Molecular Pattern) dar i secretat activ de macrofage stimulate. Receptorul membranar specific, numit RAGE (Receptor for Advanced Glycation End-products) mediaz efectele sale. Aceast protein are un rol patogenic important n sepsis i medierea efectelor de faz trzie ale LPZ-ului. Astfel, s-a demonstrat experimental, la animale, c mortalitatea n sepsis a fost redus prin administrarea pasiv de anticorpi anti-HMGB1.

13. 2. 2. Citokine cu aciune anti-viral i anti-proliferativ n aceast categorie sunt cuprinse mai multe interleukine. Spre exemplu interferonul a i . IFN-a este produs de monocite i celulele hematopoietice iar IFN- este produs de alte celule de tipul fibroblatilor i al celulelor endoteliale. Cele dou citokine prezint aciune anti-viral i anti-proliferativ; stimuleaz celulele NK; cresc expresia moleculelor MHC I; activeaz producia de IL-2 de ctre monocite/macrofage i celule dendritice; induc sinteza de IFN-g, cu aciune anti-viral i antiproliferativ. IL-2, cu efect autocrin i paracrin, a fost prima interleukin utilizat n terapia cancerului (administrarea pe cale intravenoas a fost asociat, din nefericire, cu efecte toxice severe; datorit acestor efecte, dar i descoperirii unor efecte similare prin administrarea altor molecule n alte situaii clinice, n momentul de fa a intrat ntre noiunile medicale clasice i definirea sindromului de toxicitate al citokinelor). Mai recent, se ncearc administrarea IL-2 la pacienii cu infecie HIV / SIDA, n sperana c efectele proliferative asupra LT CD4+ vor mbunti istoria natural a bolii. O analiz recent a datelor din dou mari studii clinice a artat un efect neutru al terapiei. (1) Prin potenarea activitii citotoxice a LT i a celulelor LAK, IL-12 ar putea avea utilitate clinic n inhibarea procesului infecios determinat de virusuri dar i n diferite forme de neoplazii. IL-18 are sau induce efecte mpotriva virusului Epstein-Barr, virusului gripal, virusului herpes simplex etc dar are i efecte anti-tumorale.

179

13. 2. 3. Citokine activatoare ale rspunsului imun celular Citokinele cu rol n rspunsul imun celular au ca surs de provenien limfocitele Th1. n aceast categorie sunt incluse urmtoarele citokine. IL-2 este produs n special de LT CD4+ de tip Th0 i Th1 (cu rol n RIP de tip celular) activate i ntr-o mai mic msur de celulele NK i de celulele dendritice. i LT Th2 (cu rol n RIP de tip umoral) pot sintetiza IL-2. IL-2 acioneaz asupra diferitelor celule cu rol n imunitate [asupra limfocitelor T acioneaz printr-un mecanism autocrin, antrennd proliferarea i activarea spre subsetul Th1 dar i Th2; transform celulele Nk n celule LAK (lymphokine activated killer cells); antreneaz proliferarea limfocitelor B]. Acioneaz sinergic cu IL-12 i IFN stimulnd activitatea citotoxic a celulelor NK. IL-2 a fost prima dintre interleukine care a fost caracterizat pn la nivel structural. Este o interleukin cu 133 aminoacizi, o greutate molecular de 15,5 kDa; gena care codific sinteza de IL-2 se gsete pe cromozomul 4. IFN-g este produs de limfocitele Th1; sursa esenial pentru aceast interleukin este reprezentat de celulele NK. Rolul principal al IFN-g este activarea macrofagelor, cu producerea speciilor reactive ale oxigenului i NO, cu efect bactericid asupra microorganismelor intracelulare. Prin aciunea sa anti-Th2, reduce rspunsul imun umoral. IFN- controleaz funcii imune implicate n aprarea antibacterian, antiviral i antiparazitar.

13. 2. 4. Citokine activatoare ale rspunsului imun umoral Aceste citokine sintetizate de ex. de ctre limfocitele Th2 i unele mastocite, orienteaz rspunsul imun umoral spre diferitele clase i subclase de imunoglobuline. IL-4 acioneaz n etapa iniial a rspunsului imun umoral, permind trecerea LB din stadiul G0 la stadiul G1. Stimuleaz producerea i maturarea intramedular a LB. Aciunea sa este ntrit de IL-1. De asemenea, stimuleaz producerea de IgG, specific RIU secundar i blocheaz producerea de IgM, specific RIU primar. Mecanismul are loc la nivel de genom i se numete izotipic switch (comutare izotipic) (Figura nr. 8). Citokina este totodat un factor de cretere pentru bazofile i mastocite. Are de asemenea rol n hematopoiez. Acioneaz sinergic cu IL-3 n cursul diferenierii mastocitelor i limfocitelor. Dac exist o sintez crescut peste normal a IL-4 de ctre LT Th2, se nregistreaz o cretere semnificativ a sintezei de IgE iar din punct de vedere clinic apariia manifestrilor hipersensibiliti de tip umoral (tip I). IL-5 stimuleaz RIU la nivelul mucoaselor. Intr n aciune mai trziu, alturi de IL-2, permind multiplicarea LB. IL-5 are rol de factor de cretere pentru leucocitele polimorfonucleare eozinofile dar are efecte stimulatoare i asupra bazofilelor. La fel ca i IL -4 i IL-5, are rol hematopoietic. Stimuleaz sinteza de Ig A de ctre limfocitele B. Datorit efectelor menionate, un tratament novator al afeciunilor datorate hipersensibilitii de tip I ar putea s se adreseze tocmai IL-5 (medicamente anti- alergice care s aib drept int molecula IL-5). Printre numeroasele sale activiti, IL-6 este o citokin proinflamatorie, cu aciune tardiv n procesul de maturaie a imunoblastelor n plasmocite.

180

IL-10 induce diferenierea iniial a liniei de celule B. IL-10 inhib citokinele proinflamatorii i sinteza de IFN-g, comportndu-se ca o citokin reglatorie negativ pe subsetul Th1. Are de asemenea i rol stimulator, n cazul maturrii mastocitelor, n cazul aprrii antivirale i antitumorale, precum i rol chemoatractant pentru limfocitele T (CD8+). IL-13 este produs de LT Th2 activate (dar exist i clone de LT Th1, Th0 sau LT CD8+ care pot sintetiza aceast molecul). IL-13 inhib sinteza citokinelor proinflamatorii i, ca i IL-4, stimuleaz sinteza IgE.

13. 2. 5. Chemokine Aceste molecule de adeziune cuprind aproximativ 50 de membri divizai n mai multe familii (CC, CXC, XC, CX3C). Denumirea familiilor i moleculelor aferente a fost standardizat n raport cu structura chimic, pe baza numrului i poziionrii gruprilor de cistein. Numele receptorilor chemokinelor (citokine cu rol n chemotaxie) se stabilete pornind de la grupul de litere prezentat, la care se adaug litera R i un numr, n timp ce liganzii conin litera L i un numr. Ele prezint o activitate chemotactic fa de limfocite, monocite, eozinofile etc. Neutrofilele, de exemplu, exprim receptori CXCR1 i CXCR2, n timp ce eozinofilele, bazofilele i monocitele exprim receptori CCR1, CCR2, CCR3 i CCR5. Aceste structuri exist n permanen pe suprafaa celulelor normale circulante i pot fi detectate prin metode de laborator. Majoritatea liganzilor sunt molecule solubile, ce se secret n torentul circulator, n timp ce unii liganzi (CX3CL1, CXCL16) conin o poriune transmembranar, permind ancorarea celulelor de endoteliul vascular n condiii de flux fiziologic. Prin intermediul acestor receptori, celulele menionate vor reaciona la stimulul primit de la celulele endoteliale sau de la alte celule agresate de toxine bacteriene; un alt stimul este reprezentat de citokinele pro-inflamatorii (ex. IL-1, TNF, IFN etc). Trebuie menionat c studiile arat tot mai des rolul chemokinele n procese patologice, precum ateroscleroz, scleroza multipl etc.

13. 2. 6. Hematopoietine Hematopoieza este controlat de ctre un sistem fiziologic autoreglabil, prin care se menine un compartiment de celule stem i un compartiment de difereniere pentru toate liniile sanguine. Sistemul necesit un echilibru ntre sinteza osoas i meninerea unui spaiu hematopoietic medular graie echilibrului ntre osteoblaste i osteoclaste. n procesul de proliferare i difereniere a celulelor stem intervin numeroase citokine: SCF (stem cell factor) provine n principal din celulele stromale ale mduvei osoase. SCF este produs att n form solubil ct i ntr-o form legat de membrana citoplasmatic. IL-3 sau multi-CSF (multi-colony stimulating factor) este un polipeptid cu greutatea molecular 20-30 kDa, cu 133 aminoacizi. Sinteza IL-3 este apanajul LT activate n urma stimulrii antigenice dar i al mastocitelor sau eozinofilelor. Gena care codific pentru sinteza IL 181

3 se afl pe cromozomul 5. Rolul su este de-a stimula proliferarea i diferenierea celulelor stem spre diferitele linii. IL-4, IL-5, IL-7, IL-10, IL-11 i IL-15: - IL-4 stimuleaz diferenierea i creterea bazofilelor i mastocitelor; - IL-5 are acelai rol fa de eozinofile; - IL-7 este un factor de cretere produs de celulele stromale medulare i timice care induce proliferarea L pre T i pre B; - IL-10 favorizeaz dezvoltarea megacariocitelor; - IL-11 este un factor de cretere pentru linia trombocitar, dar are i efect pro-inflamator; - Il-15 permite diferenierea celulelor stem spre NK. Factorii de cretere ai liniilor hematopoietice: factorii de cretere stimuleaz celulele hematopoietice deja difereniate, respectiv progenitorii, permind creterea i evoluia lor spre stadiile ulterioare, pn la maturizare. Se cunosc GM-CSF (granulocyte-macrophage colonystimulating factor) pentru linia monoblastic i mieloblastic, G-CSF (granulocyte CSF) pentru linia mieloblastic, M-CSF (macrophage GSF) pentru linia monoblastic, alturi de interleukinele menionate anterior, n special IL-3.

13. 3. Mesagerii secunzi Stimularea celular debuteaz prin interaciunea unui numr mare de receptori membranari celulari. Alturi de moleculele de adeziune i receptorii de citokine, mai trebuie amintii receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (FcR) i receptorii pentru complement (CR). Acetia au o importan sporit n recunoaterea patogenilor i reprezint startul procesului de procesare antigenic n cadrul rspunsului imun nscut. Transducia semnalului primit necesit intervenia mesagerilor secunzi, care transmit informaia printr-o reacie n cascad, pn la nivelul membranei celulare, al organitelor intracitoplasmatice sau al nucleului. n acest ultim caz, este vorba de o aciune asupra unor gene, care va antrena sinteza unor proteine sau activarea ciclului celular (modificri transcripionale). ntregul mecanism este complex i necesit interaciunea ntre partea intracitoplasmatic a receptorilor membranari i mesagerii secunzi. n unele cazuri, molecula receptor membranar care primete semnalul extracelular comunic direct cu mesagerii secunzi printr-un motiv intracelular (de exemplu, motivul activator ITAM). n alte cazuri, molecula receptor cu o parte intracelular limitat la civa aminoacizi, este asociat la alte molecule, fomnd adevrate domenii de amplificare a semnalului (molecular scaffolds). Partea intracelular astfel dezvoltat poart motivul de interaciune cu mesagerul secund. n acest sens pot fi citate diverse exemple: complexul CD3 al TCR, moleculele Iga i Ig ale BCR, moleculele gc ale receptorilor membranari pentru interleukine. (Figurile nr. 9-10)

Recrutarea leucocitelor circulante Molecule de adeziune i Citokine 182

Primii mediatori ai inflamaiei sunt molecule preformate, cu caracter nespecific ce apar ca rezultat al agresiunii tisulare (reflex axonal epinefrin, activarea mastocitelor rezidente histamin, sau ca urmare a activrii cascadei coagulrii trombin). Aceti mediatori sunt responsabili de modificrile reologice specifice inflamaiei i de recrutarea leucocitar prin activarea celulelor endotelialiale adiacente. Consecinele sunt permeabilizarea patului vascular i expunerea pe versantul circulator a moleculelor de adeziune. P- i E-selectinele sunt primele expuse, avnd rol n marginalizarea leucocitelor din torentul sangvin (Figura nr. 11). Un antigen glicozilat de pe leucocite joac rol de ligand (Sialyl-Lewis X) pentru cele dou selectine, ducnd la contactul celulelor cu endoteliul, cu rol n ncetinirea leucocitelor rolling leucocitar (adeziunea este insuficient de puternic pentru a constitui o legtur ferm). Citokinele (IL1 i TNFa) duc la exprimarea pe endoteliul activat a moleculelor immunoglobin like (ICAM-1). Acestea sunt liganzi pentru integrine aflate pe suprafaa leucocitelor (LFA-1 i Mac-1). Chemokine solubile din focarul inflamator (ex: IL-8) leag receptori specifici de pe membrana leucocitar (IL-8R). Ca urmare a semnalizrii intracelulare determinat de citokine, se induc schimbri conformaionale n structura integrinelor (semnalizare inside-out). Integrinele trec astfel de la stadiul conformaional cu afinitate redus la cel cu afinitate crescut pentru ligandul lor. Rolul integrinelor este de a stabili o adeziunea ferm a leucocitelor la endoteliu. Urmeaz reorganizarea scheletului celular i diapedeza leucocitar mediat tot de integrine (semnalizare outside-in). Integrinele mediaz i ataarea leucocitar la componentele matricei extracelulare, conducnd la exocitoza enzimelor de clivare a matricei pentru a permite naintarea leucocitelor spre focarul de inflamaie. Procesul de dirijare a migrrii leucocitare se bazeaz pe emiterea de prelungiri membranare n direcia dictat de gradientul de concentraie a mediatorilor chemotactici.

13. 4. Povestire adevrat Povestirea adevrat este preluat din literaur i subliniaz mai multe principii care merit nsuite nc din anul al 2-lea de studenie. Introducerea n practica medical curent a unui nou medicament reprezint concomitent un maraton (ntruct dureaz n jur de 15 ani) ct i un concurs (ntre companii farmaceutice, echipe de cercetare). Exist ns un proces riguros de testare ce trebuie urmat cu strictee. Studiile sunt coordonate astfel nct se efectueaz studii de siguran i de eficacitate, pe modele celulare, apoi animale de laborator, iar abia n final pe oameni (voluntari). De multe ori ns, rezultatele foarte promitoare ale studiilor preclinice sunt drmate de ineficiena noilor substane n clinic. Aceste date conflictuale trebuie foarte bine investigate i trebuie efectuat un bilan riguros care s aib drept scop binele pacienilor. Toate aceste faze trebuie foarte bine documentate i supervizate. Prima etap a studiilor clinice, o reprezint validarea siguranei de administrare la tineri voluntari sntoi. Asemntor terapiilor cu anticorpi anti-CTLA4 sau cu IL-2 pentru activarea limfocitelor T, investigaiile preclinice au artat un potenial beneficiu n folosirea anticorpilor direcionai antiCD28, cu aciune de superagoniti i rol de a activa i expansiona numrul de limfocite T in vivo, 183

independent de stimularea receptorului TCR. n modelul murin, s-a demonstrat c un anticorp cu aceeai specificitate a expansionat preferenial sectorul CD4+CD25+, de limfocite reglatoare, avnd un profil bun de siguran. Noul anticorp, numit TGN1412, fost administrat la 6 voluntari tineri, sntoi. n decursul a 90 de minute, voluntarii au suferit evenimente adverse sistemice, polimorfe, ce au fost atribuite unei descrcri masive de citokine (furtun citokinic/ cytokine storm). Fenomene asemntoare au fost identificate ntr-un numr impresionant de patologii, existnd n continuare destul de multe necunoscute. Toi pacienii au prezentat rspuns inflamator sistemic caracterizat prin eritem, hipertermie, scdere a tensiunii sistolice cu cel puin 20 mmHg i tahicardie compensatorie. Majoritatea pacieni au dezvoltat o suferin pulmonar nsoit de permeabilizare vascular i infiltrare a spaiilor alveolare cu lichid, ducnd la suferin sever. Toi pacienii au necesitat tratament suportiv cu intubaie, tratament de stabilizare hemodinamic i dializ, iar tratamentul specific, imunomodulator, a constat n administrarea de anticorpi anti-IL2 i corticoterapie. Conform protocolului de studiu, s-au monitorizat limfocitele i citokinele circulante. S-a constatat o cretere dramatic a TNF- la o or de la infuzia anticorpului ct i a IL-2, IL-4, IL-10 i IFN- n decurs de 4 ore. Pacienii cu evoluia cea mai grav au avut nivele ridicate de citokine circulante pentru o durat mai lung de timp. Toi voluntarii au supravieuit sindromului de rspuns inflamator sistemic (Systemic Inflammatory Response Syndrome - SIRS). Analiza acestor reacii precum i publicarea rezultatelor a contribuit la o mai buna nelegere a patofiziologiei furtunii citokinice. Mai mult, urmrirea acestor fenomene, ca evoluie natural i sub tratament a contribuit la nelegerea tratamentului. Merit admirat faptul c o poveste de eec pentru o molecul candidat a fost publicat i a contribuit, n felul acesta, la viitorul succes n domeniu.

13. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. Charo IF, Ransohoff RM, 2006, The Many Roles of Chemokines and Chemokine Receptors in Inflammation, N Engl J Med., 354, 610-621 2. Andersson U, Erlandsson-Harris H,Yang H, Tracey KJ, 2002, HMGB1 as a DNA-binding cytokine, Journal of Leukocyte Biology, 72, 1084-1091 3. Cai B, Deitch EA, Ulloa L, 2010, Novel Insights for Systemic Inflammation in Sepsis and Hemorrhage, Mediators Inflamm., Article ID 642462. 4. Lee WL, Slutsky AS, 2010, Sepsis and Endothelial Permeability, N Engl J Med., 363, 689-691 5. Suntharalingam G, Meghan RP, Ward S, Brett SJ et al., 2006, Cytokine Storm in a Phase 1 Trial of the Anti-CD28 Monoclonal Antibody TGN1412., N Engl J Med., 355, 1018-1028.

13. 6. Verificai-v cunotinele La ntrebrile urmtoare, alegei rspunsul corect. 184

1. a. b. c. d. 2. a. b. c. d. 3. 4. 5. a. b. c. d. e.

Rolling-ul leucocitar este mediat de interaciunea: Receptorii pentru chemokine (CXCR) - Chemokine Selectine Antigen Lewis X Integrine Receptori de integrine Integrine Fibrin Inducerea comutrii izotipice IgM IgG este realizat de: TNF alfa IL-1 IL-4 HMGB-1 Descriei cuplurile moleculare componente ale sinapsei imunologice. Enumerati rolurile Interferonului Gamma. Au efect imunoinhibitor (rspuns multiplu): TLR IL-4 IL-10 CTLA-4 IL-13

Bibliografie 1. The INSIGHTESPRIT Study Group and SILCAAT Scientific Committee, Interleukin-2 Therapy in Patients with HIV Infection. N Engl J Med., 2009, 361(16), 1548-1559

14. Imunoglobulinele (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

185

Imunoglobulinele sunt glicoproteine cu rol de anticorpi. Imunoglobulinele exist n plasm, lichid interstiial i secreii i au capacitatea de a recunoate i de a se combina specific cu antigenul inductor al rspunsului imun. Lor li se adaug proteinele patologice cu aceeai structur dar fr activitate de anticorpi. De exemplu, n mielomul multiplu sau n macroglobulinemia Waldenstrm's a fost identificat proteina patologic Bence-Jones (poate fi identificat n snge sau n urin; este vorba de o sintez anormal de lanuri uoare; a fost descris de H. Bence Jones n 1847). Termenul de imunoglobuline (Ig) l nlocuiete pe cel de gama-globuline. Acest termen nu este corect, deoarece nu toi anticorpii migreaz electroforetic n regiunea gama. Toi anticorpii sunt imunoglobuline. Imunoglobulinele pot fi anticorpi, dar au i alte roluri. Denumirea de anticorp se pare c a fost dat pentru substanele mpotriva corpilor bacterieni, ceea ce nu este corect, deoarece exist anticorpi i fa de alte structuri (inclusiv mpotriva structurilor proprii, n bolile autoimune) sau chiar i n cazul bacteriilor, pot exista anticorpi diferii fa de structuri diferite ale aceleai bacterii (ex. anticorpi fa de cele peste 90 de tipuri capsulare ale Streptococcus pneumoniae). Imunoglobulinele sunt diferite de alte structuri proteice: - recunosc i reacioneaz specific cu structura antigenic din cauza creia au aprut; - au funcie de anticorp, dar dac sunt inoculate la un individ dintr-o specie diferit vor avea rolul de antigene pentru respectivul individ; - sunt singurele structuri proteice care sunt sintetizate dup un stimul antigenic; - pot activa sistemul complement etc. S-a reuit sinteza de anticorpi monoclonali himerizai, alctuii dintr-o parte de molecul uman i alta animal; fiind de izotip uman nu vor mai aprea ca i structuri antigenice i nu vor mai fi respini.

14. 1. Structura general Structura de baz a unei Ig monomer (ex. IgG1) cuprinde dou lanuri grele identice i dou lanuri uoare identice, legate ntre ele prin puni disulfurice: dou puni ntre cele dou lanuri grele (n cazul IgG1) i o singur punte ntre fiecare lan greu i uor. Aceast schem structural a fost identificat n urma mai multor experimente (reducere i alchilare, aciunea papainei, aciunea pepsinei). Pepsina poate de ex. s degradeze enzimatic o molecul de imunoglobulin, acionnd la nivelul aminoacidului Leucin din structura lanurilor grele. Duce astfel la apariia unui fragment cu greutate molecular destul de mare format la rndul su din 2 fragmente Fab unite [acest fragment poart numele de F(ab)2]. Fragmentele unei Ig sunt urmtoarele: - Fab: prima jumtate a lanului greu i ntregul lan uor, legate ntre ele printr-o punte disulfuric, obinute sub aciunea papainei, prin scindarea naintea regiunii balama, cu un singur situs de legare; - F(ab) 2: cele dou fragmente Fab i regiunea balama, care rezult dup aciunea pepsinei, constituie un fragment superior celor dou fragmente Fab i conine dou situsuri de legare; - Fc: jumtile terminale ale celor dou lanuri grele unite prin puni disulfurice la nivelul regiunii balama;

186

- pFc: cuprinde fragmentele peptidice rezultate dup aciunea pepsinei, cu ntregul domeniu CH3 situat dup aminoacidul 333 al lanului greu; - Fd: corespunde primei pri a lanului greu dup aciunea papainei, cu formarea fragmentului Fab, i dup reacia de reducere-alchilare, pentru a extrage lanul uor; - Fv: corespunde prilor variabile ale lanului greu i lanului uor (VH+VL). Pentru Ig, noiunea de domeniu se regsete la lanurile grele n 4 exemplare (IgG, IgA, IgD) sau 5 exemplare (IgM, IgE) i la lanurile uoare n 2 exemplare. Terminologia utilizat este urmtoarea: Lanurile grele: - VH - pentru fragmentul greu variabil (variable heavy), comun tuturor claselor i subclaselor cu aceeai specificitate. - CH 1, CH 2, CH 3 i CH 4, - pentru fragmentul greu constant (constant heavy), care conine diferenele pentru fiecare clas i subclas; de exemplu pentru IgG1 exist fragmentele Cg11 , Cg12 i Cg13 i pentru IgM, fragmentele Cm1, Cm2, Cm3,Cm4. Lanurile uoare: - VL pentru fragmentul uor variabil (variable light), diferit pentru lanurile kappa i lambda: Vk i Vl. - CL pentru fragmentul uor constant (constant light), cu un singur lan Ck i patru Cl funcionale. Domeniile variabile VL i VH formeaz locul unde anticorpul se cupleaz cu determinantul antigenic (epitop). Faa interioar a situsului anticorpului (situs combinativ) vine n contact direct cu epitopul i se numete paratop. Faa exterioar a situsului combinativ se numete idiotip.

14. 2. Structura particular a fiecrei clase sau subclase de Ig IgG IgG (prototipul de Ac) reprezint circa 75% din totalul imunoglobulinelor din ser i are o distribuie aproximativ egal n vase i esuturi. Exist patru subclase de IgG (molecule cu termorezisten mai mare), cu structur asemntoare, o mas molecular de 146.000 (excepie fcnd IgG3 cu o mas de 170.000), 3 domenii constante pentru lanul greu i un procentaj de hidrai de carbon de 2-3 %. Concentraia sanguin a IgG este de ordinul 11 g/l, din care IgG1 - 66 %, IgG2 - 23 %, IgG3 - 7% i IgG4 - 4 %. IgG are receptori pentru sistemul complement. Poate trece prin bariera hemato-placentar (dup a 20-a sptmn de via intra uterin). Apare n RI secundar. IgM Sunt anticorpi aglutinani i reprezint cei mai eficace activatori ai complementului. Ac IgM sunt caracteristici pentru RI primar, producia lor fiind stimulat de ctre IL-4, care nu activeaz mecanismul de switch izotipic. IgM membranar (IgMm) este exprimat pe suprafaa LB. Are structur monomeric i se termin prin aminoacizii 556-597, cuprinznd n mod particular o parte intramembranar hidrofob i 3 aminoacizi intracitoplasmatici. Fiecare molecul de IgMm este asociat cu 2 187

lanuri Iga i 2 lanuri Ig. Ansamblul formeaz BCR (B cell receptor), comparabil cu TCR-ul limfocitului T. IgM seric (IgMs) cuprinde un lan greu cu un domeniu variabil VH, 4 domenii constante Cm1 Cm4 i un procent ridicat de hidrai de carbon (12 %). Molecula nsi este un pentamer cu un prim inel al punii disulfurice la sfritul lui Cm3, un al doilea la terminarea lui Cm4 i un lan J (joining chain). Masa molecular este foarte mare (circa 970.000 D), cu un coeficient de sedimentare de 19 S. Concentraia seric este de 1,2 g / l. Reprezint circa 5-10% din totalul imunoglobulinelor din ser. Are 10 situsuri combinative dintre care numai 5 sunt funcionale. IgM are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Apare n RI primar. IgA IgA seric. Sub forma IgA1 (80%) i IgA2 (20%), ea se gsete ca monomer (GM 160.000, 7 S) sau ca dimer sau trimer, ultimele dou forme cu lanul J de jonciune. IgA2 are o structur original. Lanurile uoare unite ntre ele printr-o punte disulfuric nu sunt legate printr-o legtur covalent cu lanurile grele. Concentraia sanguin a IgA este de 2,4 g / l. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate trece prin bariera hemato-placentar. Nu particip la aglutinarea, precipitarea sau liza antigenelor corpusculare. Are activitate bactericid mai mare dect IgG i dect IgM. IgA exocrin sau secretorie cuprinde dou subclase IgA1 i IgA2. Masa molecular este de 400.000, cu coeficient de sedimentare de 11 S. Molecula cuprinde dou uniti de IgA reunite printr-un lan J. Acest ansamblu este nconjurat de unitatea secretorie sintetizat de celulele epiteliale ale tubului digestiv. Au rol important n aprarea la nivelul mucoaselor (digestiv, respiratorie etc) i n reglarea compoziiei florei microbiene de la suprafaa acestora. Este important ca nou-nscutul s primeasc de la mam colostrul i apoi s fie alimentat pe cale natural pentru a primi IgA (sinteza proprie ncepe dup circa 1 lun de la natere). IgD Are un nivel seric sczut iar rolul su nc nu este pe deplin cunoscut. IgD se afl, mai ales, la suprafaa limfocitului B n asociere cu IgMm unde ar putea juca rolul de receptor activ de difereniere celular i memorie. Nu are receptori pentru sistemul complement. Nu poate traversa bariera hemato-placentar. Concentraia de IgD crete n ser de la natere i pn la vrsta de 15 ani. Crete n serul femeilor nsrcinate. IgE Dei concentraia lor seric este infim (0,0001 g/l), fixarea pe bazofile i mastocite le confer un rol important n inflamaie i hipersensibilitatea de tip imediat. posed, ca i IgM, un al patrulea domeniu constant, care i confer o mas molecular de 190.000 D i un coeficient de sedimentare 8S, superior IgG. IgE se fixeaz pe receptor prin intermediul domeniilorCe2 i Ce3,ntr-o poziie aproape orizontal. Lanurile uoare Acestea sunt n proporie de 2/3 lanuri kappa i 1/3 lanuri lambda, excepie fcnd IgD la care lanurile lambda sunt majoritare.

188

14. 3. Determinanii antigenici ai imunoglobulinelor Imunoglobulinele inoculate la o specie diferit vor avea rol de antigene i n aceast calitate prezint 3 tipuri diferite de determinani sau markeri antigenici. Izotipia Determinanii izotipici sunt prezeni la toi indivizii aceleiai specii. Ei iau natere n cursul diferenierii speciei. Anticorpii anti-izotip sunt obinui prin injectarea Ig umane policlonale sau monoclonale la animal (ex. iepure). Anticorpii anti-IgA apar uneori la subiecii cu deficit de IgA dup transfuzia de snge i stau la originea ocului cu hipotensiune arterial. Ei pot fi considerai anticorpi anti-izotip. Allotipia Caracterele antigenice prezente la unii indivizi dintr-o anumit specie, bazate pe deosebirea a 13 aminoacizi, corespund variaiei aprute n cadrul respectivei specii. n mod natural (n lipsa unei injectri prealabile de snge sau plasm), se pot gsi anticorpi anti-allotipici la subiecii care nu au allotipurile corespunztoare, la 1% din subiecii normali i la 3-5% dintre bolnavii cu poliartrit reumatoid. Diferitele sisteme cunoscute se noteaz folosind litera clasei de Ig i litera K pentru kappa, urmate eventual de numrul subclasei i n final litera m pentru marker (ex. sistemul Gm, sistemul A2m, sistemul Km). Idiotipia n definiia iniial, acest caracter antigenic era propriu unei imunizri, la un animal care a produs anticorpi. Oudin a obinut primii anticorpi anti-idiotipici n modul urmtor: ntr-o prim etap a imunizat un iepure mpotriva Salmonella spp. i a obinut un prim tip de anticorpi numii Ab1 mpotriva acestei specii. Apoi un al doilea iepure a fost imunizat cu acest imunoser i s -au obinut anticorpi numii Ab2 sau anticorpi anti-anti-Salmonella sau anti-idiotip Ab1. Aceti anticorpi nu recunosc dect serul primului animal imunizat i nu serul dinaintea imunizrii sau serul unui alt animal imunizat pentru aceeai Salmonella. Un anticorp Ab2 poate recunoate m ai muli Ab1 de la animale diferite, recunoscnd anticorpii cu aceeai specificitate anti-Salmonella. Pornind de la Ab2 se poate imuniza un alt animal care sintetizeaz anticorpi Ab3, anti-idiotip Ab2, aa-zii anti-anti-idiotip. Pentru anticorpii Ab2 se disting Ab2-a care nu inhib reacia antigen-Ab1 i Ab2- care, dimpotriv, inhib aceast reacie. Anticorpii Ab2- sunt numii imagine intern a epitopului de plecare E1, ceea ce nseamn ce au o structur imunologic asemntoare, recunoscut de Ab1. Determinanii antigenici idiotipici se gsesc la nivelul prilor variabile ale lanului greu i lanului uor, i uneori sunt constituii din cele dou lanuri. Ei pot corespunde segmentelor hipervariabile, respectiv paratopilor imunoglobulinelor.

14. 4. Proprieti fizico-chimice 14. 4. 1. Ig policlonale 189

Termenul de clon a fost mprumutat din bacteriologie, unde toate microorganismele care deriv dintr-o bacterie sunt identice ntre ele i cu prima bacterie. n imunologie, aceasta desemneaz toate celulele derivate dintr-un limfocit (cu o specificitate imunologic). Un rspuns imun obinuit corespunde unui rspuns policlonal cu imunoglobuline: de diferite clase i subclase de imunoglobuline: IgM, IgG1 etc.; cu dou allotipuri, dac subiectul este heterozigot; de ex. Gm (1,2,17) / Gm (3); cu lanuri uoare kappa i lambda; cu diferite specificiti fa de antigen, n recunoaterea diverilor determinani antigenici iar pentru fiecare determinant antigenic, prezena unor epitopi diferii; cu diferite afiniti. Ansamblul sintezei determin o hipergamaglobulinemie difuz datorat heterogenitii Ig prezente, corespunztoare numrului de clone limfocitare diferite, i se traduce prin molecule cu ncrctur electric diferit. 14. 4. 2. Ig monoclonale au urmtoarele caracteristici: o singur i subclas de Ig, de exemplu IgA2; un singur lan uor, de exemplu lambda; un singur allotip prezent, de ex. A2 m2 la un subiect heterozigot A2 m1/ A2 m2; o specificitate unic, ce recunoate un anumit epitop; afinitate unic. Acest aspect poate rezulta din proliferarea benign (imunoglobulin monoclonal benign) sau malign (mielom multiplu, boal Waldenstrom) a unui LB matur. Toate Ig secretate de clon au o structur chimic identic, cu mobilitate electroforetic unic, astfel nct electroforetic proteinele prezint un vrf cu baz ngust, iar imunoelectroforetic se caracterizeaz prin apariia celei de-a doua curburi a arcului normal, avnd urmtoarele 3 caracteristici: linie groas, curb foarte marcat, poziie mai apropiat de imunoserul revelator.

14. 5. Ontogenia imunoglobulinelor Ftul este capabil s sintetizeze, din a zecea sptmn, cantiti foarte mici de IgM i cantiti importante din a 12-a sptmn. IgG materne nu traverseaz bariera placentar dect dup a 20-a sptmn. n absena unei infecii congenitale (toxoplasmoz, sifilis etc), n sngele nou nscutului se gsete o cantitate de IgM fetal care nu depete 10% din valoarea adultului. Nivelul IgG la nou-nscut este de 110% din nivelul adultului normal, ca urmare a transferului activ, de la mam la ft. Dup scderea nivelului IgG materne (care pot persista pn n lunile 3-6 de via i chiar pn la 18 luni) se observ o sintez activ a diferitelor clase: IgM are nivel normal la 1 an; IgG ajunge la valori normale la 3 ani; IgA i IgE au un nivel normal la 14 ani.

14. 6. Funcii

190

Proprietile fragmentului Fab Fragmentul Fv particip singur la formarea situsului de legare al anticorpilor, cu intervenia egal a domeniului VH al lanului greu i al domeniului VL al lanului uor. Aminoacizii celor 3 regiuni hipervariabile ale fiecrui lan, situai la distan n structura primar, dar apropiai n structura cuaternar, contribuie la formarea acestuia. Legtura antigen-anticorp se realizeaz prin legturi non covalente, reversibile. Proprietile fragmentului Fc Unele dintre aceste proprieti nu apar dect dac anticorpul a fixat antigenul sau a fost alterat de cldur, formnd agregate. Acest aspect este valabil pentru fixarea complementului i recunoaterea factorului reumatoid. n cazul subclaselor de IgG ordinea reactivitii este urmtoarea: IgG3 > IgG1 > IgG2 > IgG4. Viteza de catabolizare depinde de regiunea CH 2 a diferitelor clase i subclase de Ig. IgG (cu excepia IgG3) au un timp de njumtire de 21 de zile. Toate IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) traverseaz activ placenta, IgG1 trecnd cel mai uor. Aa cum am artat mai sus, nou-nscutul are o concentraie a IgG de 110% fa de cea matern, ceea ce indic prezena unui transfer foarte activ. IgM i IgA materne nu traverseaz placenta, Ig din aceste clase gsite la nou-nscut fiind de origine fetal. Cunoaterea acestor aspecte este foarte util pentru evidenierea unei afectri intrauterine sau a unui simplu transfer de Ig materne. n caz de suspiciune de toxoplasmoz congenital, se indic dozarea IgM i IgA antitoxoplasma n serul nou-nscutului (au existat, din nefericire, recomandri de ntrerupere a sarcinii n cazul n care la mam au fost identificai anticorpi anti-toxoplasma de tip IgG). Fixarea complementului poate avea loc n calea clasic; IgG1, IgG2 i IgG3 i IgM au un receptor ascuns n stare nativ pentru C1q, care va fi activat n timpul fixrii anticorpului pe antigen. Acest receptor se afl n regiunea CH2 a IgG i n domeniul CH4 al IgM. Teoretic, o singur molecul de IgM pentameric este suficient pentru activarea complementului, datorit celor dou situsuri apropiate. tiind c IgG sunt de 1.000 de ori mai puin eficace dect IgM, pentru activarea complementului sunt necesare dou molecule IgG, apropiate una de cealalt. Calea altern poate fi activat de IgG sau IgA, prin fixarea pe C3b. Receptorii pentru fragmentul Fc al imunoglobulinelor (Fc receptor, FcR) sunt molecule membranare specifice pentru fiecare clas de Ig, care induc o activare a celulelor purttoare. Se disting receptori cu mare afinitate Fc RI, care fixeaz un monomer de Ig i sunt activai cnd antigenul se leag de anticorp formnd o punte ntre doi receptori cu slab afinitate Fc R II i Fc R III, care nu pot fixa dect complexe antigen-anticorp multivalente, formate n prealabil. Celulele purttoare de receptori pentru Ig sunt: macrofagele, monocitele i neutrofilele au urmtorii receptori: Fc g RI, Fc g RII, Fc g RIII, care permit fagocitarea complexelor imune, a celulelor sau microorganismelor acoperite cu anticorpi IgG; celulele NK cu receptori Fc g RIII, care permit inducerea unei citotoxiciti fa de celula int sau un microorganism, prin citotoxicitate anticorp dependent (ADCC) (antibody dependent cellular cytotoxicity). n acest mod celulele NK se pot fixa pe celula int i o pot liza; bazofilele circulante i mastocitele au receptori pentru IgE (Fc e RI i Fc e RII), inductoare ale hipersensibilitii imediate;

191

eozinofilele i plachetele au receptori de slab afinitate Fc e RII. Plachetele au i receptori Fc g care le confer o activitate antiparazitar; limfocitele au diveri receptori de slab afinitate. Receptorul numit poly Ig R (receptor Ig polimeric) permite fixarea de IgA dimeric sintetizat pe plasmocite i faciliteaz intrarea lor ntr-o vacuol care traverseaz citoplasma celulelor epiteliale intestinale. Este prezent i la nivelul canalelor secretorii ale glandelor exocrine.

14. 7. Povestiri adevrate Apariia unor infecii respiratorii severe la persoane cu deficit de IgA Cele 2 cazuri prezentate demonstreaz importana existenei unor valori normale a imunoglobulinelor, discutndu-se ca i exemplu concret situaia IgA. n ambele cazuri, deficitul imun congenital a fost diagnosticat tardiv, la 2 ani i jumtate i respectiv la 5 ani, cu ocazia unor infecii respiratorii joase. n nici unul dintre cazuri nu a fost posibil stabilirea etiologiei, pentru c s-au administrat antibiotice i chimioterapice nainte de a se recolta produse patologice pentru nceperea diagnosticului bacteriologic, direct. Primul caz Un copil de sex masculin, n vrst de 5 ani, se interneaz ntr-o clinic de pediatrie, datorit faptului c n cursul internrii ntr-un spital de nivel inferior nu s-a obinut vindecarea pneumoniei de care suferea. Motivele internrii au fost: stare general alterat, lipsa evoluiei favorabile n cursul internrii precedente. Istoricul bolii a artat c este vorba de un copil care a fcut n fiecare an mai multe infecii respiratorii joase (3-5 / an, n fiecare an) i mult mai numeroase infecii acute ale cilor respiratorii superioare (IACRS). Boala a debutat n finalul anului precedent, cu simptome respiratorii pentru care prinii au administrat paracetamol i picturi cu un decongestiv nazal. Dup 2 sptmni, datorit intensificrii semnelor respiratorii, medicul de familie recomand internarea n cel mai apropiat spital, diagnosticul la internare fiind pneumonie cu pleurezie. n spital s-a administrat o asociere de ceftriaxon cu gentamicin, dar semnele respiratorii s-au meninut, aprnd n plus semne de insuficien respiratorie; n aceste condiii copilul se transfer n clinica de pediatrie. Examenul clinic la camera de gard relev o stare general foarte alterat, dificulti n respiraie, respiraii frecvente, tiraj intercostal, lipsa murmurului vezicular la baza hemitoracelui stng, submatitate la percuie i raluri crepitante nsoite de frectur pleural la auscultaie n treimea medie a hemitoracelui stng. n clinica de pediatrie sa recoltat snge pentru hemoculturi i lichid pleural, produsele fiind trimise pentru diagnosticul bacteriologic, direct. Hemoculturile au fost negative. Cultura din lichidul pleural a fost negativ. Valorile celorlalte analize de laborator au fost urmtoarele: VSH = 85 mm/or, numr de leucocite = 28.000/mm3 (dintre care, peste 20.000/mm3 neutrofile, 72%), proteina C reactiv=9,8 mg/dL. Dozarea imunoglobulinelor serice a artat valori mari pentru Ig G (1.800 mg/dL), o valoare de 242 mg/dL pentru Ig M, n timp ce IgA a fost nedozabil (0 mg/dl). Fraciunea C3 a complementului a fost dozabil, n cantitate de circa 10 ori mai mare dect valorile normale, cu complexe imune circulante dozabile, la valori mari. 192

Diagnosticul de pneumonie stng cu pleurezie, probabil de etiologie bacterian, n condiiile unui deficit absolut de IgA, a condus la instituirea tratamentului cu o asociere de medicamente antibacteriene (ceftriaxon, amikacin i teicoplanin) alturi de dezobstruante, meninerea permeabilitii cilor respiratorii i administrare de oxigen. S-au administrat de asemenea imunoglobuline pe care intravenoas. Datorit faptului c n ciuda unei evoluii favorabile din punct de vedere clinic, semnele fizice de la nivel pulmonar s-au meninut iar temperatura nu a cobort sub 38,1C, s-a administrat suplimentar un medicament antifungic evoluia fiind favorabil. Tratamentul a fost continuat timp de 3 sptmni, dup care copilul a fost externat cu recomandarea de a reveni la control clinic, radiologic i bio-umoral. La controlul efectuat s-a constatat c deficitul de IgA nu a fost corectat i s-a meninut i dup vindecarea pacientului, fiind probabil o cauz a patologiei i nu un rezultat al acesteia. Al doilea caz Un copil de sex feminin, se interneaz la vrsta de 2 ani i 6 luni ntr-o clinic de pediatrie, prin transfer dintr-un spital de nivel inferior, datorit evoluiei nefavorabile a unei pneumonii. S-a nscut prematur, dup 8 luni de gestaie, cu greutate de 1.100 g, Apgar 7. A fost ngrijit n maternitate pn la vrsta de 2 luni i jumtate. Pn la vrsta de 2 ani i jumtate a fcut repetate infecii acute ale cilor respiratorii inferioare (IACRI) (minim 4 episoade / an). Motivele internrii au fost: febr, tuse i dispnee. Din discuia cu prinii s-a aflat c tusea i febra au aprut cu 10 zile anterior internrii; ulterior copilul a nceput s respire din ce n ce mai dificil. A primit n ambulatoriu ampicilin (pe cale oral), apoi cotrimoxazol (biseptol). Pentru c evoluia a fost nefavorabil, mama a fost sftuit s se prezinte pentru internare, la spital. S-au prezentat la primul spital. Examenul clinic la internare a evideniat: febr (38,3C), paloare, numr ridicat de respiraii/minut, tiraj (deprimare a structurilor suprasternale n timpul inspirului) i sindrom de matitate n treimea inferioar a hemitoracelui drept (la inspecie, auscultator i la percuie). La examenul radiologic s-a vzut opacifierea neomogen a jumtii inferioare a hemitoracelui drept. Din rezultatele celorlalte investigaii se amintesc: VSH= 120 mm/or, leucocitoz (12.400 / mm3) cu neutrofilie (75%), hipoxemie (cu scderea presiunii de oxigen). Imediat dup internare s-a administrat ceftriaxon, apoi amoxicilin-acid clavulanic n asociere cu ciprofloxacin, fr ca evoluia s fie pozitiv. n aceste condiii, s-a recomandat transferul ntr-o clinic de pediatrie, de nivel superior. Diagnosticul la internare n clinica de pediatrie a fost: pneumonie dreapt, sepsis bacterian. Examenul clinic la internare a revelat o stare general profund alterat, prezena unui facies suferind, foarte palid, hipertermie (39C), deficit al strii de nutriie (greutate = 10,7 kg), cianoz peri-oro-nazal accentuat la plns i alte eforturi, polipnee (80 respiraii / minut), bti ale aripioarelor nazale, matitate cu absena murmurului vezicular n dou treimi inferioare ale hemitoracelui drept, raluri crepitante la baza hemitoracelui drept, ficat la 2,5 cm sub rebordul costal, dureros la palpare. Radiografia pulmonar efectuat la internare a evideniat opacifierea omogen a hemitoracelui drept. Celelalte investigaii de laborator au avut urmtoarele valori: VSH = 75 mm/h, hemoglobin = 8,2 g/dL, leucocitoz (L = 24.800/mm3) cu neutrofilie (peste 15.600 neutrofile/mm3, 63%), modificri ECG. S-a pus diagnosticul de pneumonie cu pleurezie dreapt important, insuficien respiratorie acut, insuficien cardiac, anemie, hipotrofie ponderal. S -a realizat 193

puncia pleural (att pentru a elimina aceast cauz de presiune mecanic asupra arborelui cardiovascular ct i pentru punerea diagnosticului etiologic i stabilirea sensibilitii la antibiotice a agentului sau agenilor etiologici). S-a recoltat i snge pentru hemoculturi, nainte de administrarea altor medicamente antibiotice sau chimioterapice. Lichidul pleural era sub presiune; s-au extras cu uurin peste 375 mililitri de lichid opac, tulbure. Produsele au fost trimise imediat ctre laboratorul de bacteriologie. Frotiul colorat Gram a pus n eviden rare PMN (2-5 / cmp) i rari coci Gram-pozitivi, aezai unul cte unul sau n diplo. Coloraia ZiehlNielsen nu a pus n eviden bacili acid-alcoolo rezisteni. Att culturile din lichidul pleural ct i cele hemoculturi au rmas sterile. Prin reacii antigen-anticorp s-a ncercat punerea n eviden a prezenei antigenelor capsulare n lichidul pleural (pneumococ, H. influenzae, meningococ), dar reaciile au fost negative. Dozarea imunoglobulinelor serice a artat valori mari pentru Ig G (1.400 mg/dL), o valoare de 160 mg/dL pentru IgM, n timp ce IgA a fost nedozabil (0 mg/dl). Fraciunea C3 a complementului a fost dozabil, n cantitate mai mare dect valorile normale. n condiiile obinerii acestor date clinice, paraclinice i de laborator, s-au administrat antibiotice n asociere [iniial o combinaie ntre un glicopeptid i o cefalosporin de generaia a III-a (pentru 2 sptmni), apoi o combinaie ntre vancomicin i amikacin (pentru nc 2 sptmni)], n afar de drenajul lichidului pleural (sub control clinic i paraclinic), administrare de oxigen, administrare de lichide, electrolii i substane nutritive intravenos. Avndu-se n vedere rezultatul dozrii imunoglobulinelor, s-au administrat i imunoglobuline intravenos. Lent, evoluia din punct de vedere clinic a fost favorabil. Pe partea dreapt, radiologic s-a constatat organizarea unui proces pahipleuritic. Copilul a fost spitalizat pentru o lun, iar nainte de externare valorile bio-umorale au fost urmtoarele: VSH =12 mm/or, numr de leucocite= 6.500/ mm3 (fr neutrofilie), hemoglobin = 10.2/dL, hematocrit = 34%, IgA = 0 mg/dL. Discuii Cu excepia vrstei, au existat o serie de asemnri ntre cele dou cazuri. Ambii copii au avut n antecedente episoade de IACRS i IACRI, mai multe / an, n fiecare an, fr diagnostic etiologic, pentru care au primit tratament la domiciliu, de regul incluznd antibiotice sau chimioterapice. Episodul infecios discutat, datorit evoluiei grave, a condus la recomandarea de internare i n fiecare dintre cele dou cazuri internarea a fost realizat, succesiv, la dou nivele spitaliceti. n ambele cazuri, la spitalul de nivel inferior, copii au primit tratament antibiotic nainte de recoltarea produselor pentru punerea unui diagnostic etiologic. n aceste condiii nu a fost posibil nici stabilirea sensibilitii microorganismelor implicate i tratamentul anti-infecios a fost condus empiric, ceea ce ar fi putut reprezenta un important factor de risc, inclusiv pierderea pacientului. n primul caz nu s-a putut emite nici o ipotez privind etiologia (alta dect bacterian) iar n al doilea caz, elementele observate la studierea frotiului din lichidul pleural au permis suspicionarea unei pneumonii de etiologie pneumococic. Tratamentele conduse n ambulatoriu, auto-tratamentele stabilite de prini (n baza amintirii unor recomandri medicale anterioare), lipsa unei culturi medicale care s ridice suspiciunea privind o cauz de baz care s explice un numr de infecii respiratorii, repetate, mai numeroase dect n mod obinuit, ne fac s realizm motivele pentru care deficitul imun a fost descoperit relativ tardiv (cu toate c n ambele cazuri a existat un deficit absolut n sinteza de IgA, foarte probabil un deficit primar).

194

Pe de o parte, din aceste prezentri sesizm, foarte concret, importana bunei funcionri a sistemului imun i una dintre situaiile care pot aprea n cazul existenei unor deficiene, iar pe de alt parte este de subliniat c tratamentul bolilor infecioase ar trebui realizat numai dup diagnosticul etiologic, cu testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice, singura variant corect, care poate veni n sprijinul pacienilor pe care trebuie s i ngrijim.

15. Sistemul complement (MI Popa, Roxana Micu)


195

Complementul, un complex multienzimatic format din circa 30 de componente, reprezint unul dintre principalii constitueni ai aprrii naturale, ai imunitii umorale i respectiv un element important al reaciei imune survenite ca urmare a formrii complexelor antigen-anticorp (are rol esenial n rspunsul inflamator). Sistemul complement (C') reprezint o component normal a serului. Sistemul complement are o serie de funcii importante: aprarea nespecific mpotriva infeciei (liza virusurilor, liza bacteriilor, liza celulelor strine, favorizarea prin opsonizare a fagocitozei, chemotactism pentru PMN i sistemul MM etc); eliminarea complexelor imune i a celulelor apoptotice; reglarea fiziologic a RI, dar particip i la creterea permeabilitii capilarelor, stimularea contractilitii musculaturii netede etc. n cele mai multe mprejurri, sistemul complement are efecte benefice; totui sunt de menionat i unele efecte negative (ex. particip la reaciile anafilactice, este implicat n hipersensibilitatea citolitic-citotoxic etc). Sistemul complement cuprinde circa 30 de componente celulare sau plasmatice. Componentele sale suntsintetizate de hepatocite, macrofage, celule epiteliale intestinale etc. Substanele activatoare reprezint 5% din suma proteinelor serice (circa 3 g/l); componenta C3 este componenta care se gsete n cantitatea cea mai mare (circa 1,3 g/l). (Tabelul nr. 1) Sistemul C' se poate activa pe trei ci, respectiv calea clasic, calea lectinic i calea altern. Activarea pe calea clasic este declanat n primul rnd de formarea complexelor imune (AgAc), dar i de apariia celulelor apoptotice, anumite virusuri sau de proteina C reactiv cuplat cu anumii liganzi (Figura nr. 1). Calea lectinic poate fi activat de lectina care leag manoza de pe suprafaa bacteriilor (MBL, Mannan-Binding Lectin), dar i de alte proteine asemntoare. Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ce nu au origine imun i prezint cel puin dou situsuri identice de legare specific a unor structuri glucidice; MBL este o protein din clasa colectinelor, avnd domenii lectinice prin care se ataaz glucidelor i un domeniu colagen-like. MBL se gsete n cantitate mic n serul indivizilor sntoi, ns n cazul infeciilor acute, concentraia acesteia crete semnificativ. S-a constatat c persoanele care au deficit de MBL dezvolt n copilrie mult mai multe infecii dect copiii normali, lucru ce atest importana aprrii organismului prin activarea complementului pe calea lectinic la vrste la care sistemul imun nu s-a constituit n totalitate din punct de vedere funcional. Interaciunea acestora formeaz un complex asemntor celui format n primele subetape ale cii clasice (C1qrs) i activeaz calea clasic fr a necesita prezena complexelor antigenanticorp. Pe lng MBL, alte trei proteine pot, prin legarea lor de anumite structuri antigenice, s declaneze activarea complementului pe calea lectinic. Aceste proteine sunt ficolina-1, ficolina2 i ficolina-3. Pot lega zaharuri sau compui acetilai prezeni pe suprafaa microorganismelor. Dintre MBL i ficoline, cea mai abundent n plasm i cea care intervine cel mai adesea n declanarea cii lectinice, este ficolina-3, numit i antigenul Hakata sau -2 macroglicoproteina termolabil. (1) Calea altern poate fi activat de bacterii, fungi, virusuri, parazii, venin de viper, produi de coagulare, celule tumorale etc.

196

Calea clasic i calea altern (alternativ) converg ctre C3, apoi urmeaz o cale efectoare comun, implicnd ultimele componente ale sistemului complement (Figura nr. 3). n fiecare dintre etape, intervin proteine activatoare, inhibitoare sau reglatoare precum i receptorii pentru complement. Aceste elemente se gsesc fie n plasm fie la nivelul peretelui celulelor autologe sau omologe. n mod curent, sistemul complement este desemnat prin litera C. Pentru fiecare component studiat i bine delimitat n cadrul cascadei de activare se adaug o cifr, de la C1 la C9, care este eventual urmat de o liter (care reprezint o anumit subdiviziune; spre exemplu, pentru C1 exist C1q, C1r i respectiv C1s). Ca urmare a activrii sistemului C', unele componente (C4, C2, C3, C5), sunt fragmentate, aceste fragmente fiind desemnate printr-o liter ataat componentei iniiale (exemplu C3a i C3b). n general componenta b este de dimensiuni mai mari (excepie C2a, fragment nglobat ntr-un complex proteolitic i care are dimensiuni mai mari dect C2b) i se fixeaz la nivelul structurii int, n timp ce componenta a este mai mic, este solubil i posed o activitate anafilactoid sau chimiotactic. Anafilatoxinele sunt polipeptide mici, eliberate n cursul cascadei de activare a complementului, care prezint receptori pe mastocite, monocite, macrofage, neutrofile, trombocite i au efect proinflamator. Cea mai puternic dintre anafilatoxine este C5a. Aciunile anafilatoxinelor sunt de tipul: contracie a musculaturii netede, cretere a permeabilitii vasculare, degranulare bazofilic i mastocitar, chemotactismul i activarea granulocitelor care vor conduce la eliberarea enzimelor litice i a radicalilor liberi. Compusul b poate fi mai departe fragmentat (exemplu C3c i C3d). Un compus inactivat este indicat prin litera i (exemplu: C3bi sau iC3b). Componentele sistemului complement sunt prezentate n tabelul nr. 1.

15. 1. Calea clasic Activarea sistemului complement Componentele C' se gsesc n ser, n stare inactiv. Pentru a declana activarea lor este necesar un stimul. Pentru calea clasic, punctul de pornire este reprezentat de ctre complexele antigen-anticorp (Figura nr. 1), unde anticorpii sunt de tip IgM (domeniul CH4) sau de tip IgG (domeniul CH2) corespunznd subclaselor IgGl, IgG2 sau IgG3. Complementul poate fi activat de o singur molecul de IgM sau de ctre dou molecule de IgG apropiate una de alta. Activarea este posibil i n cazul unor molecule de IgG agregate. n mod asemntor, calea clasic poate fi activat i de ctre unele microorganisme sau diferite substane chimice: bacterii Gram-negative (Salmonella spp., E. coli, Neisseria spp.), retrovirusuri, glicoproteina anvelopei HIV, complexe heparin-protamin etc. n cursul activrii intervin urmtoarele proteine:

197

C1. n sngele circulant exist un complex plurimolecular ce conine o molecul de C1q (molecul ce aparine familiei colectinelor, precum MBL), dou molecule de C1r i dou molecule de C1s, situate n jurul ionilor de calciu i asociate inhibitorului C1, denumit C1inh. La persoanele cu deficit congenital de C1 inh, complementul se activeaz cronic n mod spontan, provocnd episoade severe i recurente de edem edem angioneurotic. Compusul C1q, cu o greutate molecular de 400.000 Da, a fost comparat cu un buchet de 6 lalele. Fiecare floare este la rndul su compus din 3 lanuri de proteine alipite i terminate n mod globular. Fixarea C1q prin mai puin de dou pri globulare periferice pe fragmentele Fc ale imunoglobulinelor permite activarea sa cu eliberarea C1inh din complexul plurimolecular. Acest fenomen antreneaz pe de alt parte autoactivarea moleculelor C1r i C1s. Componenta C1s are o activitate serinesterazic, prin care poate s cliveze urmtoarele 2 componente: C4 i C2. C4 este fragmentat n C4a, molecul mic, cu activitate anafilactoid i respectiv C4b, de dimensiuni mai mari, care se leag printr-o legtur covalent fie de fragmentul Fab al anticorpului fie la nivelul peretelui bacterian sau la nivelul unor celule (strine, proprii modificate, infectate etc). Ansamblul formeaz complexul C1-C4b, notat pe scurt C14b. C2. Aceeai esteraz (C1s) mpreun cu fragmentul C4b, cliveaz o molecul de C2 n C2b (o molecul mic, cu activitate de tip kinin) i n C2a (molecula de dimensiune mai mare, care se leag de structura int). Ansamblul necesit prezena Mg2+ i formeaz C3 convertaza cii clasice sau C4b2a. n acest moment, anticorpii i respectiv componenta C1 pot s se detaeze de structura int, iar procesul poate continua. C3 este clivat n C3a i C3b de ctre C4b2a. C3a este o molecul mai mic i are, n mod primordial, o activitate anafilactoid i chimiotactic, n timp ce subcomponenta C3b se fixeaz pe structura int datorit unei puni realizate ntre un radical tioester i o grupare ( -OH) sau (NH2) de pe suprafaa celular acceptoare. Pe de alt parte, C3b poate fi inactivat de factorul I (rezultnd C3bi), iar apoi clivat ntr-o molecul mare C3c (liber) i o molecul C3dg restant pe structura int, care poate apoi s se transforme n C3d. C3b format permite constituirea C5 convertazei (C4b2a-C3b) pe calea clasic. (Figura nr. 1) Calea clasic de activare a complementului poate fi amplificat foarte mult. Fiecare complex antigen-anticorp leag o molecul de C1, iar C1s n stare activ cliveaz pn la 100 molecule de C4. Din acestea, doar 20 de fragmente C4b se ataaz complexelor antigen-anticorp. C3 convertaza cii clasice cliveaz mii de molecule de C3. Aceste lucru dovedete imensa capacitate de amplificare a acestui lan de reacii biochimice.

15. 2. Calea altern i calea de amplificare Calea altern constituie una dintre primele linii de aprare a organismului fa de un agent patogen, naintea constituirii rspunsului imun.

198

Aceast cale poate fi activat de ctre diferite microorganisme, de componente ale acestora, de numeroase substane neimune, spre exemplu: bacterii Gram-pozitive (ex. Streptococcus pneumoniae) sau Gram-negative, virusuri (dar i celule infectate sau transformate de ctre virusuri), fungi (ex. Candida albicans), parazii (ex. Schistosoma mansoni, Trypanosoma cruzi), endotoxine bacteriene, alte substane (insulin, hemoglobin, zymosan, fibre de azbest, gluten, prafuri, unele substane de contrast utilizate n radiologie, venin de viper sau veninul altor erpi etc.). Calea altern poate fi activat de complexele imune care cuprind IgG sau IgA. Printre componentele cii alterne se numr: C3. n plasm, prin proteoliza spontan a C3, sunt formate n permanen mici cantiti de C3b. Moleculele de C3b se fixeaz de suprafeele acceptoare, n particular de peretele microorganismelor sau de celulele infectate i alterate. Cteva bacterii, a cror structur este bogat n acid sialic, pot evita aciunea sistemului complement. La rndul su, C3b acioneaz asupra factorului B. Factorul B. Element al cii de amplificare, factorul B este clivat n Ba i Bb. Complexul C3bBb, format n prezena ionilor de Mg2+, constituie C3-convertaza alternativ, care cliveaz noile molecule de C3 n C3b. Acest clivaj accelerat de C3, d natere C5-convertazei (C3bBb)n. Factorul D, factor prezent sub form activ n ser nainte de activarea C, cliveaz factorul B, ceea ce faciliteaz formarea complexului C3bBb. Ansamblul factorilor activatori ai cii clasice i alternative realizeaz o bucl de amplificare, care permite transformarea numeroaselor molecule de C3 n C3b astfel nct C3b s acopere (opsonizeze) peretele bacterian. (Figura nr. 2)

15. 3. Calea final comun Calea final comun mai este numit i calea efectoare sau calea litic. Activarea ncepe de la C5-convertaza cii clasice (C4b2a-C3b)n i respectiv de la (C3bBb)n n cadrul cii alternative. Activarea cuprinde de fapt complexul de atac al membranei (Membrane Attack Complex), MAC): C5. Convertazele-C5 pentru calea clasic i respectiv pentru calea altern cliveaz C5 n C5a, molecula mic, liber i C5b, molecula mare care se fixeaz pe structura int. Att C5a, ct i molecula care rezult n urma transformrii sale n C5-dezarginin, acioneaz la nivelul receptorului C5a-R al mastocitelor i bazofilelor. C6, C7, C8. C5b antreneaz legtura dintre C6 i C7, formnd un complex C5b67 notat prescurtat C5b7. Complexele C5b7 se leag de o molecul de C8 care se implanteaz n membran apoi mai multe molecule de C9 vor forma un complex membranar C5b9m.

199

C9. Aceast protein are dou proprieti: 1. de a se insera la nivel membranar, graie unei fee hidrofobe; 2. de a polimeriza, formnd astfel peretele unei soluii de continuitate de circa 10 nm n diametru la nivelul membranelor celulelor int (limfocitul T utilizeaz o substan numit perforin, cu efect asemntor cu cel produs de C9). Formarea sau fixarea complexului C5b9 n cantiti sublitice la suprafaa celulelor antreneaz sinteza i eliberarea mediatorilor inflamaiei (leucotriene, IL-1 etc). (Figura nr. 3) Exist o serie de mecanisme de reglare a activitii sistemului complement, acestea fiind mediate de proteine reglatoare care intervin la un moment dat n cursul cascadei de activare, avnd capacitatea de a o limita sau chiar opri. (Tabelul nr. 2) n general, aceste proteine inhib formarea C3 convertazei sau promoveaz disocierea ei (cnd aceasta deja s-a format). Decay Accelerating Factor (DAF) Factorul de accelerare a disocierii C3 convertazei este o protein care poate dezactiva C3 convertaza cii clasice, dar are i rolul de a inhiba formarea ei, nepermind elementelor C2a i C4b s interacioneze. mpreun cu CR1 (complement receptor 1), DAF competiioneaz cu factorul B la legarea de C3b, prevenind astfel constituirea C3 convertazei cii alterne. Acest complex DAF-CR1 poate s disloce Bb din compusul C3bBb, disociind C3 convertaza cii alterne. Factorul H are aciune similar. Tot din categoria proteinelor reglatoare face parte i Factorul I, o proteaz din plasm care cliveaz C3b n mai multe situsuri, inactivndu-l. Iniial rezult C3bi, apoi C3c i C3dg (fragment ce rmne ataat membranei celulare). Properdina (factorul P), n contrast cu toi compuii enumerai anterior, intervine n reglarea sistemului complement prin stabilizarea C3 convertazei cii alterne. Deficienele de properdin au fost asociate cu creterea susceptibilitii fa de infeciile provocate de Neisseria spp.

15. 4. Receptorii pentru complement (CR) Cei mai importani receptori recunosc C3b sau derivaii si C3bi i C3d. CR1 (CD35) sau receptorul pentru C3b CR1 sau receptorul pentru C3b i C4b este prezent pe hematii, trombocite, neutrofile, eozinofile, monocite i macrofage, limfocite B i T4 precum i la nivelul podocitelor glomerulare. Acest receptor permite transportul complexelor imune prin intermediul globulelor roii spre macrofagele hepatice sau celulele Kuppfer. Pe de alt parte, fenomenul de aderen imun realizat prin intermediul macrofagelor de particulele ncrcate cu C3b, permite fagocitoza complexelor i eliminarea lor. Dac sunt prezeni i anticorpii, aceast aciune este decuplat, graie aciunii conjugate a receptorilor de Ig. Ar mai fi de menionat c CR1, prezent pe celulele dendritice intrafoliculare, permite prezentarea antigenului situat n cadrul complexului imun acoperit de componente ale complementului. CR1 acioneaz drept cofactor al factorului I, fiind una dintre componentele ce intervin n reglarea aciunii complementului. (2) Variaiile expresiei genetice a CR1 se coreleaz direct cu apariia lupsului eritematos i formelor severe de malarie. n prezent este speculat scopul terapeutic pe care l are CR1 solubil. (3) 200

CR2 (CD21) sau receptorul pentru C3d Receptorul pentru C3dg sau C3d, este prezent pe limfocitele B, pe celulele foliculare dendritice i pe celulele mucoase din orofaringe. C3d antreneaz stimularea i proliferarea limfocitelor B prin intermediul complexelor imune acoperite de C3d sau permite prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Spre ex. penetrarea la nivel faringian i respectiv infectarea ulterioar a limfocitelor de ctre virusul Epstein-Barr se realizeaz prin intermediul acestui receptor. CR2 este implicat direct n inducerea rspunsului imun umoral primar. CR3 (CD11b/CD18) sau receptorul pentru C3bi CR3 sau receptorul C3bi se gsete pe monocite, macrofage, neutrofile i pe celulele foliculare dendritice. El permite fenomenele de aderen imun precum i fagocitoza particulelor acoperite de C3bi sau citoliza bacteriei prin fenomenul de ADCC (antibody dependent cellmediated cytotoxicity). CR3 permite de asemenea prezentarea antigenului prin intermediul celulelor dendritice. Are un rol important n stabilirea adeziunii dintre leucocite i endoteliu, fiind presuspus faptul c CR3 este ligand pentru ICAM (Intercellular Adhesion Molecule) exprimat pe celula endotelial. (4) CR3aR, C4a, C5a, C1q, HR Exist, de asemenea, receptori pentru fragmentele mici C3a (C3aR), C4a (C4aR) i C5a (C5aR) la nivelul mastocitelor, monocitelor, macrofagelor, neutrofilelor i trombocitelor. Aceti receptori activai antreneaz fenomene inflamatorii, activnd aceste celule i permind eliberarea substanelor inflamatorii sau atragerea neutrofilelor. Receptorul pentru C1q (C1qR) precum i receptorul pentru factorul H (HR) permit fagocitoza particulelor opsonizate.

15. 5. Rolul biologic al sistemului complement Sistemul complement prezint numeroase activiti biologice: 15. 5. 1. n inflamaie sunt implicai diferii compui solubili de talie mic. C3a i C4a au o mas molecular apropiat de 10.000 Da i sunt numite anafilatoxine. Ele pot s se fixeze pe bazofile i pe mastocite atrgnd eliberarea de histamin precum i vasodilataie, unul dintre primele elemente ale rspunsului inflamator. C2b (kinina-C2) este capabil s creasc permeabilitatea vascular. C5a posed o activitate chimiotactic pozitiv fa de neutrofile i conduce la agregarea polinuclearelor, n urma activrii complementului. Complexul C5b7 fixat pe membrane sau pe complexele imune are de asemenea aciune chimiotactic pentru polinucleare. 15. 5. 2. n aprarea anti-infecioas. Agenii infecioi extracelulari pot fi acoperii de componente ale sistemului complement fie n urma activrii directe (calea alternativ activnd direct C3), fie prin intermediul anticorpilor care fixeaz complementul. n final, complexele de 201

atac ale membranei (componentele C5-C9) lizeaz diferite microorganisme: bacterii, virusuri sau parazii. Aceasta reprezint o activitate citolitic direct a complementului cu sau fr prezena anticorpilor. Prin mecanisme asemntoare, agenii infecioi pot fi acoperii de C3b sau C3bi care sunt recunoscui de diferii receptori, prezeni la nivelul diferitelor celule fagocitare eseniale: neutrofile i macrofage. Dup aderare, acestea vor fagocita microorganismele. Diferite microorganisme au dezvoltat mecanisme de rezisten la aciunea complementului: ex. prezena unei capsule care mpiedic activarea cii alternative (S. pneumoniae, Haemophilus influenzae), sintetizarea unor substane care fixeaz C3b sau antreneaz o rezisten la inseria complexului de atac al membranei. 15. 5. 3. n metabolismul complexelor imune. Curarea (clearance-ul) complexelor imune este facilitat n mare msur de ctre sistemul complement. Simpla fixare a complementului inhib formarea complexelor imune de talie mare (calea clasic) i le solubilizeaz. Totui complexele circulante acoperite de C3b pot adera la hematii, iar apoi pot fi transportate pn la nivelul celulelor Kuppfer hepatice, pentru a fi fagocitate. C1q are proprietatea de a precipita complexele imune in vitro. Aceast proprietate st la baza diverselor metode de detectare a complexelor imune circulante. 15. 5. 4. n reglarea rspunsului imun.Pe limfocitele B se gsesc receptori pentru C3d sau C3dg (CR2). 15. 5. 5. n inducerea secreiei de citokine de ctre monocite i macrofage prin intermediul receptorilor C3. (5) Sistemul C' poate aciona n sistem heterolog (C' recoltat de la animale, de ex. nurc, cobai se poate folosi n reacii de diagnostic n microbiologia medical, sistemul indicator provenind de la un alt animal de ex. oaie, bou) i din aceast cauz a fost i este nc folosit n foarte multe situaii. Trebuie ns reinut faptul c sistemul C' se degradeaz rapid la temperaturi mai mari de 56C i din aceast cauz reactivii care conin C' trebuie meninui la rece (0C) inclusiv pe timpul transportului.

15. 6. Povestiri adevrate 15. 6. 1. Infecie grav cu SGB n cazul deficitului de complement Streptococii de grup B (Streptococcus agalactiae) reprezint o cauz frecvent a infeciilor grave la nou-nscui i copiii mici. Prognosticul cel mai nefavorabil l au sepsisul i infeciile localizate la nivelul sistemului nervos central. n special n sepsis, dar i n cazul meningitelor, evoluia poate fi ctre oc i insuficien multipl de organ (eliberarea sistemic a TNF-, de ctre monocite i macrofage este corelat cu gravitatea i riscul evoluiei ctre deces). Gravitatea infeciilor este ns dependent i de imaturitatea mecanismelor de aprare la vrste mici. Se poate constata o insuficient producie de PMN neutrofile, o activitate mai sczut a sistemului complement, un procent mai nsemnat de limfocite T naive.

202

Dei sinteza elementelor care formeaz sistemul complement ncepe relativ repede, n perioada fetal (ntre sptmnile 6 - 14 de via intrauterin), concentraia acestora la natere nu depete jumtate din cea de la adult. Dintre efectele necesare ale sistemului complement, opsonizarea reprezint o etap esenial n cadrul unei fagocitoze eficiente. Componenta C3 a sistemului complement reprezint punctul de convergen ntre calea clasic i calea alternativ (altern). C3 favorizeaz fagocitoza prin structuri care se ataeaz suprafeei bacteriene i sunt recunoscute de anumii receptori. Pe suprafaa neutrofilelor sunt expui receptorii CR1 (CD35) - care se leag de componenta C3b. Neutrofilele prezint i receptori CR3. Comparativ cu configuraia receptorilor la adult, neutrofilele nou-nscuilor sunt deficitare n exprimarea CR3. Un studiu recent a demonstrat c blocarea (la adult) receptorilor CR3 mpiedic buna desfurare a proceselor de opsonizare i fagocitoz. Acelai studiu a emis ipoteza c depozitarea unor anumii compui de clivare ai C3 pe suprafaa streptococului de grup B ar fi un factor important n aprarea gazdei mpotriva agravrii infeciei. Alte experimente au artat c la oriceii cu deficit de C3 eliberarea de TNF- indus de streptococ este semnificativ redus. n concluzie, calea altern a complementului i factorul C3 ar putea reprezenta cheia eliberrii de TNF-. Abilitatea streptococului de grup B de a activa sistemul complement a fost demonstrat n vitro. Dei se tie c nou-nscuii prezint concentraii relativ mici ale complementului, n mod aparent calea altern este suficient de activ nct s amplifice eliberarea de TNF- n cazul infeciilor streptococice. Acest fapt a fost demonstrat de diferite studii care au certificat creterea marcat a eliberrii TNF- de ctre monocitele nou-nscuilor. Avnd n vedere c eliberarea de TNF- ca rspuns la infeciile grave cu streptococ de grup B pare s aib o strns legtur cu fiziopatologia acestor infecii, se consider c terapia adjuvant imunomodulatoare administrat cu scopul de a reduce activitatea pro-inflamatorie a streptococului ar putea fi eficient. O astfel de terapie ar include i modularea cii alterne a complementului. 15. 6. 2. Consecine ale deficitului de properdin Sistemul complement este un complex de molecule care face parte din ansamblul imunitii nespecifice. De-a lungul timpului, s-au descoperit o serie de afeciuni corelate cu deficiene ale acestor compui dintre care i boli autoimune, dar i reacii de hipersensibilitate. Un subiect ndelung studiat l reprezint deficitul de properdin i predispoziia persoanelor care posed aceast caren fa de infeciile cu specii din genul Neisseria. Properdina este o glicoprotein reglatoare a cii alterne de activare a complementului, singura care regleaz pozitiv cascada enzimatic prin stabilizarea C3 i C5 convertazei cii alterne. Concentraia seric fiziologic de properdin este de 5-15 g/ml, fiind un amestec de monomeri, dimeri, trimeri i tetrameri n raport de 1:2:1. n 1982, ntr-o familie suedez, a fost descris primul caz de caren de properdin n asociere cu o infecie meningococic cu debut fulminant. Ulterior, studiindu-se aceast problem, s-a ajuns la concluzia c exist 3 tipuri diferite de deficit de properdin (observate clinic la indivizi diferii). Primul tip se caracterizeaz prin absena proteinei n plasm. Cel de-al doilea se manifest printr-un titru foarte sczut al properdinei, iar cel de-al treile tip presupune o concentraie seric normal, dar o variant nefuncional a proteinei.

203

Detectarea unei astfel de condiii la un pacient este foarte dificil de fcut. Pe lng testele de laborator care sunt foarte laborioase, este necesar un istoric infecios al pacientului i al familiei acestuia. Din pricina diagnosticului greu de stabilit, deficitul de properdin este rar ntlnit, ns prezent n faz ocult (nediagnosticat) n special n cadrul rasei caucaziene, nefiind reportate cazuri la nici o alt populaie. Formele de deficit de properdin sunt maladii genetice transmisibile, X-linkate. Se cunoate deja, n toate trei tipurile bolii, care sunt mutaiile ce survin i unde sunt acestea localizate. Predispoziia fa de infeciile cu Neisseria meningitidis apare ca manifestare clinic n toate tipurile deficitului de properdin. Serotipurile cel mai des implicate n astfel de infecii sunt W135 i Y, mai puin serotipul B, fa de care s-a constatat c organismul uman i-a dezvoltat metode mai eficiente de aprare prin mecanisme de fagocitoz. Indivizii cu deficit de properdin au un risc mai crescut de 250 de ori de a dezvolta o infecie meningococi dect restul populaiei sntoase. Dac la o persoan normal, ansele cele mai mari de a face infecie cu meningococ sunt la vrsta de 6 ani, la un individ cu deficit de properdin, vrful riscului dezvoltrii infeciei este n jurul vrstei de 14 ani. Mortalitatea n astfel de cazuri este de pn la 75%. Infeciile recurente sunt extrem de rare n condiiile date, fapt ce atest c probabil aprarea umoral devine mai eficient la aceste persoane. Pacienii cu deficit de properdin au un rspuns umoral adecvat la vaccinul tetravalent antimeningococic (care conine antigene din serotipurile A, C, Y, W135), organismul genernd anticorpi anticapsulari ce devin eficieni n combaterea instalrii infeciei. Partea bun este c nu la toi pacienii la care este detectat deficitul de properdin se dezvolt infecii meningococice. Acest lucru a sugerat c exist i ali factori adiionali care favorizeaz predispoziia ctre aceste infecii. S-a constatat astfel c la o parte dintre indivizii cu deficit de properdin, lipsea alotipul G2m(n) (alotipul reprezentnd o secven aminoacidic de pe lanul g al moleculei de IgG2 specific fiecrui individ). Se speculeaz c aceast combinaie: deficit de properdin lipsa alotipului G2m(n) este un temei relevant care explic de ce indivizii afectai prezint un risc net superior de a se imbolnvii de infecii meningococice.

15. 7. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0900381#article Studiu clinic despre deficitul moleculelor implicate n activarea complementului pe calea lectinic. http://www.jci.org/articles/view/20309 Implicarea sistemului complement n sidromul antifosolipidic i n artrita reumatoid. http://pharmrev.aspetjournals.org/content/50/1/59.full Ageni farmacologici inhibitori ai aciunii complementului. http://emedicine.medscape.com/article/886128-overview Deficiene ale structurilor sistemului complement.

204

15. 8. Verificai-v cunotinele Urmatoarele ntrebri au un singur rspuns corect. 1. C3 convertaza: A. este o enzim proteolitic, cu activitate anafilactoid B. se poate constitui pe dou ci, rezultnd 2 compui diferii structural, dar cu aceeai funcie C. scindeaz componenta C5 n C5a i C5b D. sub aciunea sa, n membrana celulei atacate se formeaz MAC (Membrane Attack Complex) E. nici un rspuns nu este corect. 2. Afirmaia adevrat este: A. sistemul complement este una dintre componentele implicate n aprarea nespecific B. nu exist nici o bacterie care s poat scpa de aciunea sistemului complement, ntruct toate bacteriile reprezint structuri non-self care genereaz un rspuns imun C. calea clasic de activare a complementului presupune interaciunea componentei C1q cu paratopii (Fab) anticorpilor din complexele antigen-anticorp D. componentele sistemului complement se gsesc permanent n ser n stare activ, pregtite pentru a interveni ori de cte ori apare un agent patogen E. rspunsurile de la punctele A i C sunt adevrate. 3. Receptorii pentru complement: A. sunt proteine circulante n ser care se pot combina cu structurile complementului pentru a fi transportate ctre splin B. se gsesc pe toate celulele din organism C. sunt proteine prezente n membrana celulelor imunitare care intervin n multiple roluri ale sistemului complement (cum ar fi transportul eritrocitelor senescente ctre splin sau ficat) D. sunt doar de dou tipuri i prin intermediul lor, moleculele de C3b pot opsoniza celula int E. nici un rspuns nu este corect. 4. Calea comun de activare a sistemului complement: A. are ca rezultat formarea C3 convertazei B. poate fi inhibat de ctre properdin C. este amplificat sub aciunea DAF (Decay Accelerating Factor) D. debuteaz prin scindarea componentei C5 sub aciunea C5 convertazei E. toate rspunsurile sunt corecte. 5. Care dintre componente activeaz cel mai uor calea clasic? A. complexele antigen-anticorp B. bacteriile care au un coninut bogat n manoz la nivelul peretelui celular C. bacteriile ncapsulate D. celulele tumorale E. sunt corecte rspunsurile A i D.

205

Bibliografie recent Munthe-Fog L, Hummelshoj T, Honore C et al., 2009, Immunodeficiency associated with FCN3 mutation and ficolin-3 deficiency, N Engl J Med, 360, 2637-2644 Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement receptor in physiology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369732 Rochowiak A, Niemir ZI, Merkur Lekarski P, 2010, The structure and role of CR1 complement receptor in pathology, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20369733 Schwartz RA, Thomas I, 2010, Complement receptor deficiency, http://emedicine.medscape.com/article/1051238-overview Erdei A, Molnar E, Csomor E et al., 2004, Indirect effects of C3 on the adaptive responses, IN: The Complement system. Novel Roles in Health and Disease

16. Antigenele (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)


206

Antigenul se definete drept o substan recunoscut specific de ctre sistemul imun. Ali autori consider c antigenul este o substan capabil s induc un rspuns imun (imunogenicitate) i s fie recunoscut de ctre sistemul imun (specificitate). Rspunsul imun (RI) tinde s neutralizeze i s elimine antigenul din cauza cruia s-a declanat. Antigenele (Ag) care pot declana RI sunt definite drept substane imunogene. Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana activarea limfocitelor (fr de care nu apare RI). Haptenele devin imunogene numai dac se combin cu macromolecule carrier. Aadar, haptena este un antigen incomplet, are specificitate dar nu are imunogenicitate. Spre exemplu acidul penicilinoic rezultat prin degradarea moleculei de penicilin este o hapten. Pot aprea reacii de hipersensibilitate dup cel puin al doilea contact cu aceast structur i numai n condiiile n care gazda ntr n categoria persoanelor atopice, avnd structura genetic de codificare pentru o protein carrier, care cupleaz acidul penicilinoic stimulnd astfel RI. Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat. Orice bacterie trebuie vzut ca un ansamblu de antigene, din care nu toate sunt imunogene (unele pot fihaptene altele tolerogene). Mecanismele de aprare mpotriva microorganismelor sunt diferite dar pot fi deduse n funcie de structura i caracterele de patogenitate ale respectivei bacterii. Acesta este un alt exemplu care demonstreaz faptul c ntre capitole diferite exist legturi importante, iar noiunile citite i nelese la timpul lor pot fi foarte utile, ulterior. Exist 4 tipuri principale de perete bacterian (tip gram pozitiv, gram negativ, tip micobacterian i spirochetal) iar patogenitatea poate varia ntre 2 extreme (toxicitate fr invazivitate i invazivitate fr toxicitate). (Figura nr. 1) Recunoaterea antigenului depinde de structurile complementare ale sistemului imun, preexistente introducerii sale. Moleculele CMH clasa I sau II pot prezenta o multitudine de peptide antigenice diferite i nu sunt specifice unui antigen n mod particular. Moleculele simple precum apa, srurile minerale i ureea sau comune majoritii speciilor (ca acizii grai, creatinina, mono- i dizaharidele, fibrina) nu sunt antigene. Pe de alt parte, moleculele mici de tipul metalelor grele (crom, nichel), responsabile de apariia hipersensibilitii, sau medicamentele, pot deveni antigene dup ce se asociaz cu diferite macromolecule.

16. 1. Clasificarea antigenelor

16. 1. 1. n relaie cu subiectul n care are loc RI Heteroantigenele sunt substane diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o alt specie. Imunizarea este cu att mai uor de obinut cu ct ntre specii diferenele sunt 207

mai mari i ndeprtarea filogenetic este mai important. Termenul izotip indic un caracter comun tuturor indivizilor unei specii, i, n acelai timp, corespunde unui xenoantigen pentru celelalte specii. Alloantigenele sunt prezente la unii indivizi din aceeai specie. Alloanticorpii sunt obinui prin imunizarea intra-specie sau inter-specii, dup absorbia anticorpilor anti-izotip. Autoantigenele sunt substane recunoscute prin rspunsul imun i prezente la animalul imunizat sau la om n contextul unei afeciuni autoimune. n mod normal, un individ nu declaneaz un rspuns imun mpotriva structurilor proprii. Un rspuns autoimun se poate obine prin imunizarea animalului cu substane proprii mpreun cu adjuvani sau prin injectarea unor substane self uor alterate. Idiotipul se refer la un caracter propriu prilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor aprui dup imunizarea fa de un antigen dat.

16. 1. 2. n relaie cu tipul de rspuns imun Antigenele timodependente Rspunsul celular sau umoral timodependent nu se poate produce la un animal timectomizat n timpul vieii intrauterine sau la natere, la oarecele nud, timectomizat sau la un subiect cu maladia di George, caracterizat prin absena congenital a timusului. Antigenele timodependente sunt n general de natur proteic dar pot fi i de natur glucidic. Ele induc un rspuns primar iniial slab, de izotip IgM, cu memorie, urmat de un rspuns secundar specific, cu IgG, IgA sau IgE. Pentru obinerea sa, sunt necesare 3 celule (o celul prezentatoare de antigen, un limfocit T helper i un limfocit B) sau 2 celule (atunci cnd LB joac i rolul de APC). Antigenele timoindependente Producerea de anticorpi fa de antigenele timoindependente nu necesit prezena LT. Antigenele sunt n general glucide cu determinani antigenici repetitivi, cu o metabolizare i o rat de degradare lent.Cele mai importante exemple sunt polizaharidele bacteriene care au aceeai structur glucidic repetitiv dispus de-a lungul peretelui celular. flagelina, antigen proteic cu determinani antigenici repetitivi, face parte din antigenele timoindependente.

16. 1. 3. n funcie de repartiia antigenelor n natur Existena anticorpilor naturali i a celor aprui n urma unui rspuns imun face necesar divizarea antigenelor n dou categorii: Antigene ubicuitare: Antigenele ABH ale grupului sanguin ABO sunt larg rspndite n natur. Prezena lor n bacteriile intestinale saprofite duce la imunizare n primele luni de via. Rspunsul imun este de tip timoindependent. Anticorpii naturali anti-A i anti-B sunt din clasa 208

IgM, uor adsorbabili de substanele A sau B salivare. Aceti anticorpi, considerai alloanticorpi n cazul transfuziilor sanguine, sunt de fapt heteroanticorpi. Antigene restrnse: Unele antigene sunt limitate la o singur specie i la un singur tip celular (un exemplu fiind antigenele sanguine Rh). Anticorpii aprui n urma rspunsului imun nu apar dect dup contactul cu hematiile unui subiect de grup diferit, dup o transfuzie sau dup pasajul hematiilor fetale n sngele femeii gravide.

16. 1. 4. n funcie de natura chimic Polizaharidele ca i partea glucidic a glicoproteinelor sunt n general antigene. Exemplele cele mai cunoscute sunt antigenele care definesc grupele sanguine (la acestea, specificitatea este dat de diferitele zaharuri) i antigenele clasice ale diferitelor microorganisme. Antigenele lipidice i datoreaz antigenicitatea cuplrii cu pri glucidice sau proteice, aa cum este cardiolipina, extras din mitocondrii, fa de care apare reacia imun n sifilis. Atunci cnd au o greutate molecular mai mare de 4.000 Da, polipeptidele sau proteinele devin antigene i imunogene. Cel mai mic imunogen cunoscut este vasopresina (greutate molecular 1.000, cu doar 9 aminoacizi). Lectinele sunt proteine sau glicoproteine ubicuitare; sunt antigene i imunogene. Lipidele cuplate cu zaharuri formeaz lipopolizaharide/lipooligozaharide (LPZ/LOZ), de ex. n peretele bacteriilor Gram-negative (Neisseria spp., Salmonella spp., Vibrio spp., Brucella spp. etc). Obinerea de anticorpi anti-acizi nucleici dup imunizarea unui animal este dificil. n unele afeciuni autoimune, de tipul lupusului eritematos diseminat, se observ diferite tipuri de anticorpi anti-acizi nucleici. Compuii sintetici cu structura cea mai variat pot fi antigene dac greutatea lor molecular este suficient de mare sau dac sunt legai de proteine purttoare (carrier). Compuii sintetici au importan n determinarea imunogenicitii i specificitii antigenice. Un posibil tip de antigene este reprezentat de medicamente, responsabile de reacia alergic din patologia uman (ex. hipersensibilitatea de tip I fa de beta-lactamine). Superantigenele sunt molecule care se leag n exteriorul moleculelor MHC II i de o secven peptidic din familia TCR; aceste molecule, fr a fi recunoscute specific, acioneaz pe numeroase clone celulare T cu structur comun. Aceast proprietate a fost observat la enterotoxinele stafilococice, la nucleocapsida virusului rabiei etc. Se consider c superantigenele pot avea un rol n inducerea bolilor autoimune.

16. 1. 5. n funcie de potenialul de a stimula RI i de a reaciona cu Ac n funcie de potenialul de a stimula RI i de a reaciona cu Ac formai n cadrul acestui RI, antigenele pot fi: - Ag complete (majoritatea) care pot declana RI i pot reaciona cu Ac aprui;

209

- Ag incomplete care nu pot declana RI dar pot reaciona (in vitro) cu Ac; sunt de ex. epitopi izolai, nelegai de grupri purttoare (pot fi haptene).

16. 1. 6. n funcie de specia microorganismului implicat Antigenele bacteriene includ substane legate de corpul celular (proteina M a streptococului beta-hemolitic de grup A, polizaharidul A de la stafilococul auriu, antigenul O al bacteriilor Gram-negative, antigenul Vi de la Salmonella typhi, antigenele K i de tip K de la bacteriile capsulate, antigenele H ale bacteriilor ciliate) sau eliberate sub form de exotoxine sau enzime extracelulare (bacil difteric sau streptococ beta-hemolitic de grup A dac sunt lizogenizai, Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Vibrio cholerae, Shigella shiga, Bordetella pertussis etc). (vezi i capitolele 2 i 9) Antigenele virale sunt localizate la nivelul capsidei, fac parte din nveliul extern (ex. hemaglutinine) sau constituie proteine i glicoproteine structurale. Antigenele parazitare au un caracter complex i un aspect mozaicat, datorat de ex. marii diversiti a ciclurilor biologice parazitare. La o singur specie parazitar pot fi evideniate mai multe tipuri de antigene (ex. 20 de antigene la Plasmodium falciparum). Antigenele parazitare pot fi somatice i metabolice.

16. 2. Proprietile antigenelor Dup majoritatea autorilor, antigenele prezint dou proprieti fundamentale: specificitatea i imunogenicitatea.

16. 2. 1. Specificitatea imunologic Specificitatea unui antigen este proprietatea de a fi recunoscut prin RI pe care l-a declanat i nu prin RI declanat de alte antigene, diferite. Toate tehnicile imunologice se bazeaz pe aceast proprietate fundamental. Reacia ncruciat Dei specificitatea reaciei imune este regula, exist totui i excepii, reaciile ncruciate, atunci cnd 2 antigene de origine diferit reacioneaz cu acelai anticorp (datorit unei asemnri structurale). Epitopul este o parte bine definit din structura antigenului, care intr n contact cu situsul de combinare al anticorpului. Structura corespondent sau receptorul de antigen al imunoglobulinei se numete paratop. Determinantul antigenic este un punct cald al antigenului, recunoscut n cadrul diferitelor rspunsuri imune. El corespunde mai multor epitopi centrai pe acelai loc. ntr-un Ag, determinanii antigenici sunt situai frecvent la extremiti sau n unghiurile moleculei. Un Ag prezint n general mai muli determinani antigenici, fie sub forma aceleiai structuri glucidice 210

repetitive, fie sub forma mai multor motive proteice diferite, recunoscute de ctre sistemul imun. Numrul determinanilor antigenici care pot fi recunoscui de ctre sistemul imun constituie repertoriul imun. Pe baza cunotinelor asupra structurii prii variabile a imunoglobulinelor, genomul uman codific pentru aproximativ 107-108 tipuri posibile de anticorpi diferii. n plus, mutaiile frecvente n linia B aduc posibiliti suplimentare, lrgind repertoriul imun. Acelai Ac poate recunoate mai muli determinani antigenici diferii, cu afiniti variabile. Pe de alt parte, o molecul de antigen are mai muli epitopi (10-20), valena antigenului fiind dat tocmai de numrul acestora (de ex. dac exist 16 epitopi, valena este 16 i ar putea fixa 8 molecule de anticorpi din clasa IgG, fiecare cu cte 2 situsuri combinative). Fiecare epitop este recunoscut i declaneaz un RI i sinteza de anticorpi care l recunosc doar pe el.

16. 2. 2. Imunogenicitatea Imunogenicitatea este capacitatea unui Ag de a induce un rspuns imun umoral sau celular. O hapten este o molecul mic (natural sau artificial), incapabil s induc singur un rspuns imun dar care poate fi recunoscut de componentele sistemului imun. Termenul a fost introdus de Landsteiner n 1930. Haptena are specificitate dar nu are imunogenicitate. Termenul de hapten nu este sinonim cu cel de determinant antigenic: haptena poate fi mai mic, egal sau mai mare ca epitopul. Purttorul(carrier-ul) este partea Ag cu structur proteic, n general, care prin cuplare cu haptena face ca aceasta s devin imunogen.

16. 2. 3. Alergenicitatea Unele antigene sunt capabile s induc producia de anticorpi IgE i prin aceasta s provoace o reacie de hipersensibilitate mediat umoral (tip I). Principalele alergene cunoscute sunt polenul, veninul de viper, praful de acarieni i unele fragmente sau produse de origine animal.

16. 2. 4. Asocierea cu factorii adjuvani Un adjuvant poate crete intensitatea rspunsului imun fa de un antigen la care acesta este asociat. Adjuvanii pot fi utili atunci cnd antigenele sunt eliminate rapid i nu exist timpul necesar pentru stimularea RI. Pentru ca Ag s persiste ct mai mult, ele sunt asociate cu aceste substane numite generic adjuvani (ex. hidroxid de aluminiu, saponin, adjuvant Freund etc).

16. 2. 5. Rspunsul la mitogene

211

Pe lng rspunsul imun specific, antigenele pot antrena o hipergamaglobulinemie global, stimulnd diviziunea limfocitelor B. Aceasta se observ frecvent n cursul infeciilor sau inoculrii de lipopolizaharide enterobacteriene.

16. 2. 6. Alte efecte datorate antigenelor Pot aprea i alte modificri n organismul gazd, care in de rspunsul imun. Persistena activrii macrofagelor ntr-un focar poate determina formarea granuloamelor. Acestea sunt formate (concentric, dinspre interior spre exterior) din structuri proprii i antigene fagocitate sau nu de macrofage, celule gigante multinucleate numite i celule epitelioide (formate din fuziunea macrofagelor activate), acumulare periferic de celule T, neutrofile i celule dendritice printre fibrele de colagen. n cazul tuberculozei (TB) centrul granulomului este reprezentat de cazeum. n cazul persoanelor diabetice, a persoanelor cu SIDA sau cu alte stri de imunodepresie procesul de formare a granuloamelor poate fi afectat, infecia nu trece n stadiu latent ci rmne activ. Un alt argument poate fi reprezentat de urmtoarea constatare: adminstrarea de anticorpi blocani ai TNF (de exemplu, ca tratament simptomatic n artrita reumatoid) reactiveaz rapid tuberculoza. Rspunsul organismului la agresiunea bacterian se poate solda i cu alte afectri i chiar distrugeri la nivel tisular, oc toxico-septic sau reacii de tip Schwartzman. ocul toxico septic este provocat de o producere excesiv de citokine n cursul sepsisului, n special n infeciile cu germeni Gram negativi i respectiv cu eliminare important de LPZ. Apar febr nalt, colaps circulator, CID (coagulare intravascular diseminat), necroz hemoragic i eventual afectare multipl de organ (MOF - multiple organ failure). n mod paradoxal, pacienii care i revin dup acest tip de oc pot dezvolta paralizie imun, fiind susceptibili unei infecii secundare. Reacia Schwartzman (Sanarelli-Schwartzman) poate s apar experimental atunci cnd, injectnd subcutanat o doz mic de endotoxin, rezult inflamaie uoar; ulterior, la injectarea intravenoas dup 24 de ore a endotoxinei, zona anterior inflamat devine hemoragic n cteva ore. Aceast reacie poate aprea dup infecii cu bacterii Gram negative, streptococi, mycobacterii, Corynebaterium diphteriae etc. O a doua injectare dup nc 24 de ore de la prima injectare intravenoas a endotoxinei/bacteriei poate determina colaps circulator i necroz bilateral a cortexului renal. Mai pot aprea necroze la nivelul pancreasului, epifizei, corticosuprarenalelor, tubului digestiv, tromboze i CID. La nivel microscopic apar modificri endoteliale, depozite de fibrin, acumulare de neutrofile i degranularea acestora. Titrul interferonului se coreleaz cu distrugerile tisulare, iar titrul TNF se coreleaz cu manifestrile sistemice. Aceasta reacie Schwartzman ar putea s se afle la originea rash-ul ce apare la copii cu meningita meningococic sau a ocului septicotoxic. Organismul uman reuete, de obicei, s menin o balan i nu apar agresiuni (auto-agresiuni) evidente n cursul infeciilor bacteriene. Principalele citokine imunoregulatoare sunt IL-10 si TGF. Exist i bacterii care profit tocmai de aceast balan a organismului. Hemaglutinina i adenilat ciclaza (factori de virulen ai B. pertussis) favorizeaz secreia de Il-10, ceea ce conduce la favorizarea persistena bacteriene n organism prin inhibarea TH1. O perturbare a acestei balane o poate determina omul prin tratament antibiotic (auto-administrat sau nu)

212

soldat cu distrugerea masiv a bacteriilor. Poate rezulta un rspuns inflamator sever cu distrugeri tisulare.

16. 3. Factorii de care depinde imunogenitatea 1. Structura chimic trebuie s fie ct mai diferit (provenind de la o specie ct mai ndeprtat) fa de structurile proprii [noiunea de structur strin este de fapt o noiune chimic; modificarea unui singur aminoacid din structura primar a unei molecule proteice va fi sesizat ca atare i va duce la un RI, ca i cum ar fi vorba de o structur nou (diferit, strin, modificat)]; cu ct structura chimic antigenic provine de la o specie mai ndeprtat filogenetic, cu att RI va fi mai puternic; 2. Structura trebuie s aib un grad de rigiditate (s se menin ca atare); 3. Structura trebuie s persiste suficient de mult n organism (n cazul n care respectiva structur este rapid epurat, nu va duce la apariia unui RI); n acest sens pot fi date ca exemplu anumite structuri antigenice care sunt necesare pentru prevenirea unor mbolnviri (vaccinuri), dar care nu persist suficient de mult n organismul gazd, motiv pentru care au fost asociate cu substane adjuvante (srurile de aluminiu au fost folosite n calitate de adjuvani pentru prima dat n 1950, n vaccinul Salk; diferite substane adjuvante sunt utilizate n vaccinul DTP, vaccinurile anti-HBV, anti-Haemophilus influenzae tip b etc); 4. Greutatea molecular trebuie s fie ct mai mare (de regul peste 4-5.000 Da); antigenele cu molecul mic pot stimula rspunsul imun dup cuplarea cu o protein carrier; 5. Structura chimic trebuie s fie ct mai complex (cele mai imunogene sunt proteinele iar cele mai puin imunogene sunt lipidele i acizii nucleici); 6. Doza de antigen, calea de administrare, momentul administrrii antigenului etc. sunt ali factori de care depinde imunogenitatea. Toi aceti factori sunt valabili n contextul CMH al gazdei care urmeaz s reacioneze fa de respectivul antigen.

16. 4. Povestiri adevrate 16.4.1. Antigene ... reacii ... aprare ... Dar care ar fiutilitatea clasificrii antigenelor? Diferite categorii de antigene vor dirija diferit rspunsul imun i vor ncearca s l pcleasc, fiecare in stil propriu. Prima linie de aprare a organismului este reprezentat de piele i mucoase, de acizii grai secretai la nivel dermic (toxici pentru majoritatea bacteriilor), de micrile cililor traheali, de fluxul urinar, de pH-ul acid stomacal sau vaginal etc. Bacterile comensale pot limita invazia bacteriana prin producerea unor proteine antibacteriene numite colicine. A doua linie de aprare este reprezentat de rspunsul imun nnscut (innate), fr intervenia LT sau LB. Aciunea este ndreptat mpotriva aa-ziselor Ag microbiene comune, reunite sub denumirea de PAMPs (pathogen-associated molecular patterns) i cuprinde molecule ce n literatura anglo-saxon sunt grupate sub denumirea de patern recognition molecules (ex: colectine, ficoline, TLR-Toll like receptor, receptorul manozei, proteinele NOD, proteina A din 213

surfactantul pulmonar, complementul, PCR - proteina C reactiv). Spre exemplu, LPZ-ul bacteriilor Gram negative este unul dintre cei mai importani reprezentani ai PAMPs. LPZ se cupleaz cu TLR4, activnd astfel raspunsul imun, cu stimularea secreiei de TNF alfa, Il-1, creterea adezivitii celulare, secreia de peptide i amine vasoactive i scderea consecutiv a tensiunii arteriale. Bacteriile Gram pozitive posed acid lipotechoic i peptidoglicani (polizaharidele nu au suficient potenial imunogen). TLR-urile implicate sunt de data aceasta 1, 2 si 6. n recunoaterea lipoproteinelor mycoplasmelor, mycobacteriilor i spirochetelor intervin LBP i TLR4. TLR4 se mai numete i CD14. Cum se prezint aceste pattern recognition molecules? Majoritatea sunt exprimate la suprafaa celulelor organismului (in special de la nivelul porilor de intrare) i sunt ndreptate mpotriva patogenilor extracelulari. Dar exist i molecule pentru patogenii care au ptruns n celul, care se afl nu la nivelul membranei celulare ci la nivelul fagozomilor (TLR 9) sau solubili n citosol. (Figura nr. 2). Listeria spp., Helicobacter pylori i Salmonella spp. genereaz PAMPs intracelulare. (Film nr. 1) http://www.youtube.com/watch?v=2LchUweyRx0 16.4.2. Rspuns imun nespecific ... specific ... Rspunsul nespecific presupune: -activarea complementului pe calea alternativ (bacteriile Gram negative sunt succeptibile la liza iniiat de complexul C5b-9) -eliberarea de citokine proinflamatorii, care cresc proprietiile adezive ale sistemului endotelial (C5a, eliberat n cadrul formrii complexului litic, funcioneaz pe post de chemoatractant pentru neutrofile i mastocite), i leucotriene care vor crete permeabilitatea. Macrofagele elibereaz TNF i Il-1, care mpreun cu chemokinele CCL2, CCL3 i CXCL8 direcioneaz recrutarea de populaii leucocitare. TNF, IL-1 i IL-6 iniiaz rspunsul inflamator acut i cresc producia de componente ale complementului. PCR opsonizeaz bacteriile favoriznd fagocitoza acestora. IL-12 i IL-18 stimuleaz NK sa produca IFN gama, care va activa macrofagele) -genereaz semnale care influeneaz si rspunsul imun specific (Celulele dendritice joac un rol crucial n activarea LT. Activarea acestora n periferie induce migrarea lor la nivelul nodulilor limfatici, unde crete exprimarea MHC, a moleculelor co-stimulatoare: CD40, CD80, CD86 i a citokinelor ce induc diferenierea LT. Contactul PAMPs-TLR crete producia local de IFN gama, IL-12 i IL-18 care vor stimula diferenierea LT, n special a TH1) Rspunsul specific se bazeaz pe activitatea LB i a LT. Are loc un proces complex de interacii celulare cu rol de amplificare a semnalizrii iniiale i de evitare a rspunsului imun la un semnal fals. LB au n principal rolul de a secreta Ac i de a pstra o memorie a agresiunilor infecioase. Anticorpii pot fi suficieni numai dac patogenitatea este indus de o singur toxin sau molecul de adeziune iar Ac produi sunt directionai mpotriva acestei molecule cu rol patogen. Anticorpii opsonizani sunt importani pentru rezistena mpotriva bacteriilor extracelulare. Bacterile patogene pot eluda rspunsul n anticorpi, aa cum se petrece n cazul Neisseria gonorrhoeae, de aceea omul se poate infecta n mod repetat cu acest microorganism, ns n sngele su s nu se gseasc dovezi ale imunitii protective. (Film nr. 2) http://www.youtube.com/watch?v=23lSlwzXnKM 214

16.4.3. Dar alte modaliti de eludare a rspunsului imun? Antigenul O, avnd un lan polizaharidic lung, poate fixa complementul la distan de bistratul lipidic, astfel nct acesta nu ii poate exercita aciunea litic. E. coli, Salmonella spp. i Pseudomonas aeruginosa fixeaz complementul dar l taie rapid de pe suprafaa celular. Alte microorganisme exploateaz mecanismele fiziologice ale organismului gazd pentru a pcli sistemul imun. Cnd C3b s-a ataat de o membran celular poate interaciona cu factorul B, care va amplifica activarea complementului sau poate interaciona cu factorii H i I, care vor inhiba complementul. Prezena acidului sialic favorizeaz interacia complementului cu factorii H i I iar celulele organismului uman reprezint un mediu bogat n acid sialic. Prin acest mod se apr Neisseria meningitidis, E. coli K1 dar i streptococii beta hemolitici de grup B. Proteina M a steptococcilor de grup A funcioneaz ca un acceptor al factorului H (s nu uitm c aceti streptococi posed i o gen ce codific sinteza unei C5a proteaze). 16.4.4. Leucocite ... macrofage ... fagocitoz ... Totui, mpotriva majoritii bacteriilor este neaprat nevoie de intervenia fagocitelor. Fagocitele elimin cea mai mare parte a bacteriilor prin chemotaxie, adeziune, internalizare i apoptoz. Activarea optim a macrofagelor este dependent de TH1 (CD4+). Macrofagul este principala celul prezentatoare de antigen, dar are i rolul de a secreta citokine, enzime, molecule ale complementului, are efect procoagulant, produce specii reactive de oxigen i NO care sunt foarte toxice, i endociteaz bacterii i fungi. Rolul su n ansamblu este de a iniia, propaga, preveni, supresa i finaliza rspunsul imun. Macrofagele se dezvolt din monocitele circulante (ca i celulele dendritice mieloide i osteoclastele) i pot exista sub form ciculant sau sub form tisular. Citokinele eliberate de TH1 stimuleaz inflamaia i activitatea antimicrobian a macrofagelor, n timp ce citokinele eliberate de TH2 induc o prezentare antigenic eficient ctre LB. TGF beta, corticosteroizii i IL-10 induc un fenotip antiinflamator. Macrofagele internalizeaz patogenii, utiliznd o varietate de receptori (receptorul pentru LPZ, TLR, beta-glucanR, manoseR, receptorii pentru complement CR1, CR3, CR4). (Film nr. 3) http://www.youtube.com/watch?v=CHrk0ofcLDo Ataarea de antigenele bacteriene a macrofagelor se poate face direct, prin intermediul TLR, manose receptor (MR), scavenger receptors i dectin-1b sau indirect, dup opsonizarea bacteriei cu Ac, fibronectin, vitronectin sau complement, prin intermediul CR1, CR3, CR4, MBL, integrine, FcRI, FcRII, FcRIII. Macrofagele tisulare (alveolare, celulele Kupfer etc.) ofer o oarecare protecie, ns necesit intervenia altor fagocite (leucocite, neutrofile) care vor fi atrase n focarul inflamator de componente bacteriene, de componenta C5a a complementului, de chemokine i citokine sintetizate de macrofagele din esutul respectiv i de unele celulele epiteliale. Streptococcus pyogenes va determina leziuni acute i atragerea la nivelul focarului infecios n special a neutrofilelor, n timp ce Mycobacterium tuberculosis determin leziuni cronice i va atrage macrofage, LT i celule multinucleate derivate din macrofage. Dup cum tii, macrofagele produc specii reactive de oxigen (foarte toxice pentru microorganism, dar i pentru celulele organismului gazd). O specie reactiv de oxigen se 215

formeaz n principal pe calea anionului superoxid. O astfel de substan are adugat un electron, care o va face instabil i care va determina un ir de reacii n lan n organism. Studii recente pe neutrofile au demonstrat c speciile reactive de oxigen sunt bactericide i indirect (prin inducerea unui flux de Kn fagozomi) activeaz producerea de proteaze. NO se formeaz din L-arginin sub aciunea NO-sintetazei, care poate fi indus de IFN i TNF, NO fiind tot o specie reactiv de oxigen, format pe alt cale dect a anionului superoxid. Dar exist i metode oxigen-independente prin care fagocitele pot distruge bacteriile, de exemplu, prin intermediuil proteinelor cationice. Defensina din granulele neutrofilelor se inser ntre lipidele membranei bacteriene i creaz un canal transmembranar care va duce la liza respectivului microorganism. Microbii sensibili la defensin sunt Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Cryptococcus neoformans. Catepsina G i azurocidina sunt active pe bacteriile Gram negative. Fierul este foarte important pentru dezvoltarea bacteriilor intracelulare, neutrofilele ngreunnd accesul microorganismelor la acest element. ns, organismul gazd are nevoie crescut de fier de vreme ce este co-enzim pentru generarea NO i pentru lanul respirator. E foarte important de reinut c neutrofilul are o via scurt dar este foarte agresiv cu bacteriile, n timp ce macrofagul are o via mai lung, ns neactivat, este un ... prieten al bacteriilor. Cel mai important factor de activare a macrofagelor este IFN, iar acesta este produs n cele mai mari cantiti de TH1 (CD4+). Exist diferite metode prin care patogenii pclesc aprarea fagocitar. Listeria monocytogenes, Shigella spp. i Burkholderia pseudomallei elibereaz enzime care distrug membrana fagozomilor, mpidedicnd asfel unirea cu lizozomii i formarea complexului fagolizozom. M. leprae i Salmonella spp. se ndreapt spre celulele Schwann, hepatocite i celulele epiteliale, care au o capacitate mai redus de aprare. Streptococcus pneumoniae i C. neoformans au un nveli protector, care inhib ataarea macrofagelor de aceste bacterii. Stafilococii posed catalaz, care scade stresul oxidativ. M. leprae se nconjoar cu un glicolipid care absoarbe radicalii liberi. Micobacteriile, n general, elibereaz lipoarabinoman, care scade eficiena IFN n activarea macrofagelor. Celulele gazdei infectate cu Salmonella enteritidis, M. tuberculosis sau Chlamydia trachomatis nu ii exercit corespunztor funcia de prezentare a antigenelor. Yersinia spp. induce apoptoza celulei gazd. Dup internalizarea anumitor antigene urmeaz expunerea acestora la suprafaa APC. Recunoaterea de ctre TCR (T cell receptor) a Ag impune ca acest Ag s fie legat de o molecul MHC (major histocompatibility complex). Ag endogene (peptide) vor fi prezentate pe MHC I, iar Ag exogene (peptide derivate din proteine extracelulare, care au ajuns la nivelul APC prin fagocitoz sau endocitoz, aa cum este cazul antigenelor bacteriene) pe MHC II. Genotipic, MHC I sunt codificate de genele HLA-A, HLA-B, iar MHC II, de HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR. CD1 este o molecul asemntoare MHC I care prezint antigene lipidice (M. tuberculosis, H. influenzae). (Film nr. 4) http://www.youtube.com/watch?v=m0ShUtbPllY 16.4.5. Intervenia LT ... LTc (CD8+) pot elibera microorganismele care s-au ascuns la nivelul celulelor gazd. S-a demonstrat c prbuirea sistemului MHC I la oareci duce la lipsa de rspuns din partea LTc i consecutiv, aceti oareci devin susceptibili la infecia cu M. tuberculosis. Tendinele actuale sunt de a gsi un vaccin care s stimuleze formarea LTc (Figura nr. 3). S-a mai observat c pe 216

lng dependena activrii LTc de prezentarea MHC I-Ag, mai exist i o dependen de activitatea litic a fagozomilor. TCR (fie ei situai pe LT CD4+ sau CD8+) sunt de 2 tipuri: cu lanuri i cu lanuri . Aceste 2 tipuri difer prea puin ca structur i mai mult ca distribuie. Consecutiv, cele 2 specii de receptori vor avea funcii diferite. TCR se gsesc la nivelul sngelui periferic i a timocitelor, iar TCR la nivelul pielii, mucoaselor, aparatului digestiv i reproductor. De aceea s-a ridicat ipoteza conform creia LT n care predomin TCR s nu aib neaparat nevoie de prezentare MHC-Ag pentru activare (Unele LT recunosc fosfoliganzi derivai din M. tuberculosis care le determin activarea). Superantigenele activeaz direct LT, fr a mai fi nevoie de prezentarea lor de ctre un APC pe un MHC. Stafilococcii i streptococcii posed 21 de superantigene, probabil cu rol adaptativ. S ar putea ca motivul s fie o ct mai rapid depleie de LT a gazdei i inhibarea producerii de anticorpi. Certa e ns toxicitatea determinat de eliberarea masiv de citokine. TSST-1 (toxic shock syndrom toxin-1) aparinnd stafilococcilor este un exemplu de superantigen. i proteina M a Streptococcus pyogenes formez un complex cu fibrinogenul, complex care se leag de integrinele de pe neutrofile, determinnd eliberarea n cantiti mari a mediatorilor inflamatori. Dac un antigen convenional activeaz 0,01-0,1% LT, superantigenele activeaz 5-30% din populaia LT. 16.4.6. TSS ... HSP ... utilitatea antigenelor ... Datele din USA referitoare la TSS (toxic shock syndrome) publicate ntr-un articol n 2010 relev o incidena a infeciilor GAS (group A streptococci) de 1,5-5,2o/oooo/an, din care 8-14% au dezvoltat TSS, cu o mortalitate de 30-70%. O epidemie de varicel crete riscul de TSS la 62,74o/oooo. La 50% din pacienii cu TSS au avut afectri severe de esuturi moi, precum fasciita necrozant, miozit, celulit. (1) HSP (Heat shock proteins) sunt proteine comune att organismelor umane, ct si bacteriilor i au fost denumite astfel datorit faptului c s-a remarcat creterea expresiei acestora n condiii de temperaturi ridicate sau fa de ali factori de stres (ex. un proces infecios). HSP au rol n asamblarea, formarea structurii cuaternare a proteinelor i n transportul altor molecule. n timpul unei invazii bacteriene, sistemul imun se ndreapt i mpotriva HSP, att a celor autohtone, ct i a celor bacteriene. HSP activeaz sistemul imun prin intermediul CD91, CD40, CD14 i anumii TLR. Datorit asemnrii structurale ntre cele 2 tipuri de HSP se presupune c aceste proteine ar avea un rol important n generarea bolilor autoimune. Tot timpul ne aflm sub influena antigenelor bacteriene. Unele asigur sau nlesnesc procese fiziologice, aa cum se ntmpl la nivelul intestinului gros, altele, prin competiie ne protejeaz de germeni viruleni, aa cum se ntmpl de ex. la nivelul foselor nazale. Dar exist i teoria igieniei, neconfirmat i nu neaprat adevarat sau aplicabil tuturor microorganismelor, conform creia i infecia uoar i tranzitorie (nu boala) cu bacterii patogene este de folos. Alergiile (strile de hipersensibilitate), bolile inflamatorii ale intestinului subire i bolile autoimune ar fi generate de un dezechilibru imun generat de igien, vaccinuri i antibiotice. Ideea este nu de a elimina aceste 3 modaliti clasice de aprare mpotriva infeciilor, ci de a afla cum, cnd i ct trebuie folosit fiecare arm i de a cunoate ct mai bine adversarul mpotriva cruia o folosim. 16.4.7. oc toxico septic sau alergie? Streptococ sau Stafilococ? 217

Pacienta n vrst de 25 ani, se prezint la camera de gard dup 2 zile de rash cutanat i o durere surd difuz n cadranul stng inferior al toracelui. n urm cu o sptmn a fost diagnosticat cu faringita streptococic i a primit amoxicilin. Sa prezentat dup 3 zile la serviciul de dermatologie datorit rash-ului, unde i s-a pus diagnosticul de alergie la amoxicilin. Prin urmare, a fost ntrerupt tratamentul cu amoxicilin i s-a recomandat prednison. Este corect atitudinea dermatologului? Argumentai. La efectuarea anamnezei pacienta acuz grea, vrsturi, febr, fatigabilitate, dezorientare i durerea surd menionat mai sus. Neag s fi avut sngerri (melen, hemoptizie, hemoroizi). Examen i analize: TA=65/35 mmHg, AV=110-120bpm, FR=20/min, T:39,7C, SO2=93%. La examenul fizic: pacienta este palid, cu starea general alterat. Orofaringele clar, fr exsudate sau eritem, crepitaii difuze la auscultaia pulmonar, fr sufluri supraadugate sau zgomote patologice cardiace, abdomen suplu, mobil cu respiraia. n tabel sunt listate determinrile biochimice i hematologice anormale (comparativ, valorile normale). (Tabelul nr. 1) Se efectueaza o radiografie (Rx) cardio-pulmonar, care este n concordan cu explorrile paraclinice i cu examenul clinic, punndu-se diagnosticul de etap, ARDS (adult respiratory distress syndrome). (Figura nr. 3) La ntoarcerea de la radiologie, pacienta devine iar hipotensiv, tahicardic, tahipneic; febra se menine n ciuda adminitrrii de acetaminofen. Se decide intubarea pacientei datorit insuficienei respiratorii ce se agraveaz, se recolteaz probe de snge, urin, exsudat faringian i se face o puncie lombar. Se solicit titrul ASLO i TSST-1. Se iniiaz tratament cu clindamicin, vancomicin i meropenem iar pacienta este transferat n serviciul de ATI. Comentarii explicative n 1993 s-a ajuns la un consens privind TSS produs de streptococi, care presupune stabilirea diagnosticului pozitiv dac sunt ndeplinite concomitent urmtoarele condiii: 1) Izolarea streptococcilor de grup A (GAS) dintr-o zon n mod normal steril (snge, fluid cerebro-spinal, pleural, peritoneal) 2) Hipotensiune 3) 2 sau mai multe dintre urmtoarele: Insuficien renal (creatinina>2mg/dL sau valori de 2 ori mai mari dect n mod normal la pacienii cu boal renal) Coagulopatie Enzime hepatice crescute ARDS (adult respiratory distress syndrome) Rash maculo-eritematos Necroz de esut moale. Introducerea vaccinurilor antivaricel a sczut incidena TSS de la 27% n 1993-1995 la 2% 19952001. Utilizarea de medicamenteantiinflamatorii nesteroidiene (AINS) se pare c favorizeaz TSS. Un articol din 1995 a Chuang si colab. arat c 92% din pacienii cu TSS folosiser anterior AINS. Mai mult, AINS pot masca simptomatologia ocului toxico-septic. Diferenierea ntre TSS stafilococic i steptococic este greu de fcut. Pacienii cu infecie stafilococic pot prezenta diaree, vom, eritrodermie generalizat, insuficiena conjunctival, 218

mialgie sever. Pacienii cu infecie streptococ pot prezenta necroz de esut moale (celulit, fasciit, abces, miozit), simptomatologie influenza-like, varicel n antecedente n cazul celor nevaccinai. n cazul TSS stafilococic, se pare c toxina TSST-1 este responsabil de 75% din cazuri. Pentru TSS steptococic, proteina M este responsabil de 75% cazuri iar SPEs A, B, C sunt responsabile de circa 13% (SPEs = Streptococcus pyogenes exotoxins). Specificitatea determinrii Ac anti TSST-1 este de 90%, n timp ce pentru determinarea titrului proteinei M nu exist teste fiabile. Se poate folosi n schimb titrarea ASLO n dinamic. n ciuda ambiguitii privind etiologia, tratamentul rmne acelai: cristaloizi i ageni inotrop pozitiv contra ocului hipovolemic, cu monitorizarea TA i a PVC antibiotice: penicilin, vancomicin i clindamicin (penicilin sau alte beta-lactamine pentru streptococ; vancomicin sau peniciline sintetice pentru stafilococ; clindamicina s-a introdus pentru c are un efect mai ndelungat dup administrare, faciliteaz fagocitoza bacteriei, inhib liza celulelor bacteriene cu eliberarea consecutiv suplimentar de citokine n circulaie). terapii adjuvante (nc n stadiu de cercetare): =imunoglobuline administrate intravenos, O2 hiperbar, Ac antiTNF. Evoluia pacientei: Statusul respirator s-a mbuntit, cu detubare la 48 de ore. Titrul Ac anti TSST-1 s-a pozitivat dup 2 sptmni, ASLO a rmas normal. S-a trecut pe antibiotice orale, funcia renal i WBC au revenit uor la normal, s-au efectuat radiografii toracice zilnice, care au confirmat i rezolvarea ARDS. Pacienta a fost externat dup 14 zile de spitalizare. Diagnosticul final: oc toxico-septic stafilococic, probabil post-pneumonic.

16. 5. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0014374 Analogii alfa-galactozil ceramidului - candidai pentru terapia antiinflamatorie http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015225 Antigenele cuplate cu lipozomi - posibile aplicaii n fabricarea vaccinurilor http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21178114 Eliberarea de oxid nitric n cadrul infeciilor virale poate influena funcia de prezentare antigenic ulterioar http://www.biomedcentral.com/1746-6148/6/57 Modificrile genetice i antigenice H5N2 - impactul asupra supravegherii epidemiologice http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0015227 Injectarea unor antigene ale E. coli n celulele umane, cu scop curativ

16. 6. Verificai-v cunotinele 219

La ntrebrile urmtoare, alegei rspunsul corect. 1. Care dintre urmtoarele microorganisme au toxicitate dar nu i invazivitate? a) Klebsiella pneumoniae i Vibrio cholerae b) Corynebacterium diphteriae i Vibrio cholerae c) Escherichia coli i Salmonella typhi d) Corynebacterium diphteriae i Mycobacterium tuberculosis 2. Care este rspunsul corect? a) Administrarea ndelungat de antibiotice nu afecteaz flora intestinal. b) Administrarea de antibiotice fr realizarea i respectarea antibiogramei, fr a ine cont de CMI i CMB nu determin fenomenul de rezisten la antibiotice. c) Cnd flora normal este distrus pot aprea infecii cu Candida spp. sau Clostridium difficile. d) Este mai corect s administrm probiotice (de exemplu lactobacilii) i o doz foarte mare de antibiotic n cazul unei infecii localizate, dect s drenm chirurgical respectivul abces sau flegmon. 3. Ce este un granulom? a) o marc a RIC mpotriva bacteriilor intracelulare b) un tip de modificare anatomo-patologic acut c) o marc a RIU mpotriva bacteriilor extracelulare d) o marca a RIC mpotriva bacteriilor extracelulare. 4. Gsii afirmaia greit a)Haptenele reprezint Ag care sunt recunoscute de receptorii limfocitari, dar nu pot declana activarea limfocitelor b) Tolerogenele sunt Ag care declaneaz activarea limfocitelor, ns RI este inhibat activ, imediat. c) Idiotipul se refer la un caracter propriu prilor variabile ale TCR-ului limfocitului T sau anticorpilor aprui dup imunizarea fa de un antigen dat d) Autoantigenele sunt substane diferite de antigenele proprii animalului imunizat, provenite de la o alt specie. 5.Iat 3 afirmaii: (1) cu ct structura chimic antigenic provine de la o specie mai ndeprtat filogenetic, cu att RI va fi mai slab; (2) structura chimic trebuie s fie ct mai simpl i (3) greutatea molecular trebuie s fie ct mai mare (de regul peste 4-5.000 Da). Alegei varianta corect dintre urmatoarele: a) (1) i (3) sunt false b) (1) i (2) sunt adevrate c) doar (3) este adevrat d) doar (2) este fals

17. Rspunsul imun umoral i celular (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)
220

n momentul n care un Ag ptrunde pentru prima dat n organism, sistemul imun nu posed dect un numr redus de limfocite T sau B specifice recunoaterii poriunilor peptidice (epitopilor) acestui Ag. Astfel, dintr-un repertoriu preexistent de limfocite, Ag le va selecta numai pe cele care sunt capabile s recunoasc i s se combine cu Ag. n acelai timp (cu mici excepii) nu exist nici o celul sau molecul capabil s elimine Ag sau microorganismul care l poart, motiv pentru care este necesar apariia limfocitelor T citotoxice, secretoare de citokine (imunitate celular) sau a plasmocitelor anticorp-secretante (imunitate umoral).

17. 1. Definiia i caracteristicile rspunsului imun Rspunsul imun (RI) include totalitatea evenimentelor care au loc dup introducerea unui Ag, i anume: activarea limfocitelor, eliberarea a diverse molecule, multiplicarea celulelor specifice, producerea de limfocite T citotoxice sau de anticorpi capabili s se fixeze pe Ag i s participe la eliminarea acestuia (direct sau indirect). Dup acest prim contact (ca i n cursul imunizrii consecutive), sistemul imun produce limfocitele T i B de memorie, capabile s reacioneze mai rapid, mai amplu, cu ocazia unei reintroduceri ulterioare a aceluiai antigen. Aa cum a fost menionat anterior, principala caracteristic a imunitii este specificitatea. Pentru a sugera ct de specific este rspunsul imun, o modalitate este de a discuta despre potrivirea dintre cheie i broasc, ntre structurile Ag i Ac. Acest exemplu are un grad de sugestivitate, dar este incomplet n comparaie cu realitatea. O alt modalitate de a sugera specificitatea rspunsului imun ar fi potrivirea dintre mna aezat n faa oglinzii i imaginea din oglind. Probabil, o modalitate i mai sugestiv ar fi cea discutat la cursurile de imunologie din INCDMI Cantacuzino: rspunsul imun este att de specific, nct dac ne-am nchipui c Ag este reprezentat de o pagin dintr-un manual, dac am schimba nu o fraz, un rnd, un cuvnt ci chiar o singur liter ntr-un cuvnt de pe o anumit pagin, aceast schimbare ar fi sesizat de sistemul imun iar Ac produi se vor potrivi cu aceast pagin n care a fost schimbat o singur liter. Totui, aa cum am menionat la punctul 16. 2. 1., exist i reacii ncruciate. O alt caracteristic foarte important a RI, n condiii fiziologice, este capacitatea de a discerne ntre self i non-self i de a reaciona numai fa de moleculele care ndeplinesc definiia de antigen (vezi i MHC/CMH). Rspunsul imun poate fi de tip umoral, mediat prin anticorpi sau de tipcelular, mediat de ctre celule. n cazul antigenelor timodependente (cea mai mare parte a antigenelor), se dezvolt un rspuns imun celular specific prin LT citotoxice i unul umoral specific prin anticorpi. Diferite citokine pot activa sau inhiba, n mod preferenial, unul sau ambele tipuri de rspuns. n cazul antigenelor timoindependente, rspunsul imun este umoral. n continuare vor fi prezentate n mod schematic aceste dou tipuri de rspuns imun umoral i celular. 221

17. 2. Rspunsul imun de tip umoral Rspunsul imun umoral (RIU) const n producerea de Ac specifici i este transferabil pentru o perioad de timp (3-6 sptmni), prin ser, la un alt animal. Imunitatea umoral intervine n distrugerea bacteriilor extracelulare, neutralizarea virusurilor, inhibarea toxinelor. Natura antigenelor fa de care se dezvolt un rspuns imun umoral include poliozide, proteine, substane sintetice, rareori lipide i acizi nucleici sau anticorpi (n cazul proceselor autoimune). Unele antigene (alergenii) determin un RI cu anticorpi de tip IgE. Introducerea antigenului pe cale subcutan, intramuscular sau intravenos determin un RIU cu producerea de IgM i/sau IgG iar administrarea pe cale oral determin un rspuns preferenial cu IgA. Dup o prim administrare intravenoas, la un subiect care nu a mai venit n contact cu respectivul antigen, Ag molecular parcurge urmtoarele etape succesive: 1. descreterea cantitativ rapid, datorat difuziei n spaiile extravasculare; 2. dispariia lent, datorat catabolismului propriu al antigenului; 3. descreterea rapid dup 8-10 zile, ca urmare a eliminrii formaiunilor imune (complexele imune) rapid fagocitate. n cazul antigenelor particulate (celule, bacterii, virusuri) sau al antigenelor sub form de agregate, eliminarea este mult mai rapid, prin procesul de fagocitoz (care antreneaz o imunizare mai precoce). n cazul utilizrii cii subcutanate, antigenul rmne, n parte, la locul de inoculare. Adugarea unui adjuvant menine antigenul n acest loc i favorizeaz o stimulare imunologic de durat (eventual i formarea unui granulom inflamator). n urmtoarele ore, antigenul migreaz n sinusurile subcapsulare ale ganglionilor corespunztori anatomic, apoi n zona medular i n final (24 de ore) ajunge n regiunea cortical, la periferia foliculilor primari. n interiorul organelor limfoide, antigenul se regsete n celulele fagocitare. n prezena anticorpilor preformai i a sistemului C', unele antigene se localizeaz la suprafaa celulelor dendritice intrafoliculare din centrii germinativi. Contactul cu antigenul antreneaz importante modificri histologice ale organelor limfoide: centri germinativi se dezvolt n foliculi i persist mai multe sptmni; n paralel apar att imunoblatii i plasmocitele, ct i limfocitele de memorie; dup 3-4 zile se pot detecta limfocite cu anticorpi membranari, apoi celule care sintetizeaz anticorpi serici. 17. 2. 1. Rspunsul imun primar (RIP) naintea primului contact cu un anumit antigen, nu exist anticorpi potrivii fa de acesta. Stimulul antigenic primar selecteaz LB care au receptori pentru respectivul Ag. Dup primul contact cu Ag se dezvolt RIP, cu urmtoarele caracteristici: Latena: reprezint perioada de la contactul cu Ag pn la prezentarea structurilor Ag ctre LB (n conjuncie cu moleculele MHC); variaz n funcie de natura antigenului, calea de administrare i doza administrat; dureaz ntre 2 i 3 zile;

222

Creterea logaritmic: (sintez activ de Ac, de ctre plasmocite) dureaz circa 3 zile; n timpul acestei perioade, Ac devin decelabili prin reacii Ag-Ac; urmeaz o faz de stagnare (cteva zile), timp n care titrul anticorpilor serici se menine relativ constant; Ulterior are loc scderea progresiv a titrului anticorpilor serici. De regul, tehnicile imunologice uzuale permit identificarea Ac dup 5-14 zile de la stimulul antigenic primar. Natura anticorpilor: examinarea claselor de anticorpi produi arat c primii anticorpi care apar sunt de tip IgM (cei din clasa IgG apar cteva zile mai trziu iar nivelul lor crete pe msur ce nivelul IgM scade); n urmtoarele 2-3 sptmni, n ser predomin anticorpii de tip IgG; n urmtoarele luni, eventualii anticorpi care persist sunt de tip IgG. 17. 2. 2. Rspunsul imun secundar (RIS) Rspunsul imun secundar apare dup al doilea contact cu acelai antigen (sau dup contacte ulterioare). RIS are urmtoarele caracteristici: poate aprea chiar i dup administrarea unor doze destul de mici de antigen; latena este redus la circa 24 ore; se ajunge repede, abrupt la faza de cretere logaritmic; anticorpii sunt de tip IgG; titrul Ac produi este mult mai nalt; persistena acestora este mai lung (Ac produi se menin timp mai ndelungat, luni de zile). Diferena dintre RIP i RIS este datorat n primul rnd existenei limfocitelor cu memorie. Dup eliminarea Ag, n organism continu s circule celule cu memorie, reacia imun la al doilea contact cu acelai Ag avnd caracteristicile de mai sus. Memoria imun se stabilete din timpul RIP i este specific. Determinarea claselor IgM i IgG are o dubl importan practic: face posibil distincia ntre o afeciune recent i una mai veche i permite recunoaterea unei infecii congenitale (cu anumite excepii). Cunoaterea caracteristicile RIP i RIS are importan practic. Ne permite s nelegem i motivul pentru care reaciile Ag-Ac trebuie fcute, de regul, n dinamic. 17. 2. 3. Succesiunea de evenimente n producerea anticorpilor Dup ptrunderea antigenului i recunoaterea acestuia ca non-self urmeaz fagocitarea i prelucrarea de ctre celulele prezentatoare de antigen care sunt reprezentate n principal de celulele dendritice foliculare, macrofage i limfocitele B. APC, prin IgM i IgD membranar, posed tot ce este necesar pentru recunoaterea epitopilor antigenici (diversitatea rearanjrii genice demonstreaz un repertoriu bogat de limfocite B, estimat la 107 posibiliti; mutaia somatic conduce la posibiliti mult mai mari de diversificare). Pentru majoritatea antigenelor (n special cele de natur proteic), activarea i etapele urmtoare ale RIU necesit prezena limfocitelor Th CD4+ (cu intervenia TCR, APC cu expunerea pe MHC II de peptide antigenice, molecula CD4 i moleculele de aderen).

223

Dup contactul cu antigenul i activarea complet, LTh se vor numi LThp (primitive), care ulterior vor ncepe proliferarea i sinteza de IL2. Prin stimulri autocrine repetate LThp se vor diferenia n LTh0 i apoi n LTh1 sau LTh2 n funcie de mediul citokinic din jur i de citokinele produse (vezi i 11.3.1.). Limfocitele Th2 sunt reprezentative pentru RIU (Figura nr. 1). LTh2 secret IL-2, IL-4, IL-5 i IL-6, care activeaz LB i stimuleaza mecanismul de switch izotipic n genomul LB. Acest switch se realizeaz prin rearanjarea ADN-ului, pentru sinteza Ac diferii structural, dar cu aceeai specificitate pentru antigen. Limfocitele B pot fi activate i direct, n cazul antigenelor timoindependente de origine polizaharidic, cu epitopi repetitivi. Aceasta se realizeaz prin formarea unor puni ntre receptorii de suprafa i determin redistribuia Ig pe suprafaa membranei celulare. n lipsa interleukinelor produse de LT, activarea LB este limitat la sinteza de IgM, fr comutarea spre IgG. Prima etap const n activarea limfocitelor B din stadiul G0 al ciclului celular spre stadiul G1 (celula sintetizeaz ARN i crete n volum); stimulul este reprezentat de contactul cu antigenul. IL-4, secretat de limfocitele Th, poate transforma limfocitele B din stadiul G0 i G1 i crete expresia moleculelor MHC. n acest stadiu LB activat exprim molecule noi: CD23, CD34 i CD40. Al doilea timp corespunde proliferrii policlonale a celulelor B activate, care trec din stadiul G1 n fazele S i M. Aceast faz necesit prezena IL-2 i IL-5. Ultima faz const n diferenierea n celule productoare de anticorpi - plasmocite; secreia de IL-6 ajut procesului de maturizare iar diferitele interleukine permit orientarea izotipic spre sinteza unei clase particulare de imunoglobuline. Aadar, exist o intens colaborare ntre LB, LTh i APC att prin contact direct cu ajutorul unor molecule de adeziune, ct mai ales prin intermediul citokinelor, adevrai mesageri (hormoni) ai imunitii. 17. 2. 4. Teoria seleciei clonale Teoria seleciei clonale a fost propus n jurul anului 1950 de ctre McFarlane Burnet. Aceast teorie afirm c la nivelul sistemului imun exist un numr imens de capi de clone de limfocite, fiecare dintre aceti capi de serie corespunznd unei structuri antigenice (unui anume epitop); n cadrul aceleai teorii, Burnet a fcut estimarea c n lume ar exista circa 100 de milioane de tipuri de epitopi diferii. Clona, aa cum se cunoate, este o populaie de celule identice din punct de vedere genetic, descendente ale unei singure celule mam. Toate celulele unei anumite clone au la suprafa, molecule identice cu structur imunoglobulinic; aceste imunoglobuline au rol de receptori pentru structurile antigenice (pentru fiecare antigen diferit exist un receptor diferit). Structurile antigenice selecteaz din acest numr imens de limfocite cap de serie pe acelea care au receptori complementari (configuraie spaial etc) i astfel determin proliferarea i diferenierea lor n celule productoare de anticorpi. Celulele unei clone au aceeai specificitate pentru structura antigenic datorit creia au proliferat. Clonele de limfocite care ar putea s produc anticorpi fa de structurile proprii (self) sunt reprimate n timpul vieii intra-uterine i numai celelalte clone pot ajunge la maturitate. n lipsa acestei represii apar boli autoimune grave, potenial fatale.

224

17. 3. Rspunsul imun de tip celular Imunitatea celular presupune n special dezvoltarea unui rspuns imun fa de celulele infectate cu virusuri, celulele infectate cu microorganisme cu multiplicare intracelular (mycobacterii, Listeria spp., Brucella spp. etc), parazii intracelulari, allogrefe, celule tumorale. Un microorganism cu dezvoltare intracelular penetreaz n diverse celule i n particular n macrofage (aflate n stare de repaus i neactivate) i se poate divide fr ca acest proces s induc o reacie imun celular natural i specific. Macrofagul care a fost infectat cu un microorganism secret o serie de citokine (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12, TNF-a i TNF-) care la rndul lor vor aciona dup cum urmeaz (Figura nr. 2): TNF-a va activa macrofagul infectat; TNF-a, TNF- vor activa macrofagele neinfectate nc; TNF-a, IL-10, IL-12 vor activa celulele NK. Aceast prim faz va pune n micare celulele imunitii celulare specifice i astfel limfocitele Th0 vor fi activate i se vor diferenia n Th1, datorit IL-12, secretat de macrofage i a IFN-g, secretat de celulele NK activate. Antigenele proteice sunt transformate de ctre APC n peptide de 12-20 aminoacizi. Acest tip de antigene induce o dubl imunizare celular i umoral. Nu a fost nc demonstrat, complet, RIC fa de antigenele ne-proteice. 17. 3. 1. Etapele rspunsului imun celular Imunitatea celular intervine n mai multe etape succesive. Rspunsul celular presupune ca antigenul prezentat limfocitelor s fie degradat n peptide i asociat cu molecule MHC II. Dintre APC menionm celulele dendritice (cele mai bune prezentatoare de antigen), celulele Langherhans, macrofagele i limfocitele B (eficiente numai dup stimulare). Recunoaterea peptidelor antigenice de ctre LT helper i activarea lor necesit contactul direct ntre APC i limfocitele Th, interaciunea fiind trimolecular: TCR, peptide antigenice i MHC clasa II. moleculele CD4 i moleculele de adeziune consolideaz aceast interaciune. Toate aceste contacte duc la activarea i multiplicarea limfocitelor T CD4+. Drept rezultat, LT CD4+ activate sintetizeaz IL-2 i lanul a cu rol de receptor pentru IL-2 (IL-2R), ceea ce permite o aciune autocrin i exocrin; multiplicarea limfocitelor T antigen-specifice duce la formarea de clone celulare specifice antigenului. Generarea limfocitelor T citotoxice LT CD8+ sunt selecionate dup specificitatea lor fa de antigen i activate de diferitele citokine (IL-2, IFN-g) secretate de limfocitele Th1 activate n prealabil. Recrutarea altor celule pentru cooperare Prin citokinele secretate, imunitatea celular permite recrutarea i activarea unor celule care nu sunt specifice antigenului: IL-2 - produs numai de LT (n principal CD4+ i numai ntr-o mic msur de ctre CD8+), are o aciune autocrin asupra LT dar i asupra monocitelor, macrofagelor, LT CD8+ i a celulelor NK; 225

IFN-g - produs n principal de LT (CD8+ i mai puin din CD4+) dar i de celulele NK, activeaz macrofagul, crete sinteza de molecule MHC II, recruteaz celule NK i le activeaz funcia citotoxic sub efectul TNF-a i mpiedic infectarea celulelor cu virusuri (aciune antiviral).

17. 4. Povestire adevrat 17.4.1. Tratamentul n imunosupresie n stabilirea i aplicarea tratamentului unui anumit pacient, nu trebuie niciodat uitat rolul rspunsului imun (nici n plus i nici n minus). De exemplu, pacientului imunodeprimat trebuie s-i administrezi antibiotice bactericide i nu bacteriostatice. Pacientul imunodeprimat, fiind sub tratament etiologic eficient, dar la care din diverse motive se restaureaz imunitatea, poate face reacii cu impact fatal asupra evoluiei. O infecie cronic cu VHB la un pacient cu tratament imunosupresor n diverse situaii, nu ridic probleme deosebite hepatice. Reducerea imunosupresiei, creterea rspunsului imun, gsete pacientul ntr-o situaie n care viremia este nalt. Reacia imun, recent restaurat, poate induce leziuni hepatice severe, hepatit fibrozant colestatic cu mortalitate uneori pn la 90%. Un alt exemplu ar fi pacientul cu infecie HIV, aflat la debutul unui tratament antiretroviral. Acesta, datorit aceluiai proces de restaurare imun, poate s dezvolte afeciuni nemanifeste pn atunci, numite sindrom de reconstrucie imun, cu mortalitate foarte mare. Aadar, este necesar o atenie deosebit att n ceea ce privete imunodepresia ct i n cazul revenirii imunitii. 17.4.2. Stresul i rspunsul imun Stresul este cunoscut ca avnd efect inhibitor al rspunsului imun, crescnd astfel susceptibilitatea la infecii i cancer. Paradoxal, stresul este nvinuit pentru exacerbarea astmului i a bolilor inflamatorii i autoimune, dei astfel de boli ar trebui s fie ameliorate de un anumit grad de imunosupresie. Mai mult, rspunsul de tip fight-or-flight este unul dintre mecanismele naturale de aprare care prin activarea aparatelor cardiovascular si musculoscheletal promoveaz supravieuirea, i de aceea este puin probabil ca acest rspuns la stres s suprime funcia imun, n momentul n care este esenial pentru supravieuire. Fr acest rspuns un tigru nu poate prinde o cprioar, n timp ce cprioara nu ar avea nici o ans de supravieuire. Aceste observaii sugereaz c stresul poate suprima funcia imun n anumite condiii i o poate ntri n altele. Aadar, efectele stresului pot fi att benefice ct i duntoare. Studiile au demonstrat c o serie de factori influeneaz direcia efectelor stresului: 1. durata stresului (acut vs. cronic): stresul acut exprimat n timpul activrii imune stimuleaz att imunitatatea nnscut ct i pe cea adaptativa; stresul cronic suprim rspunsul imun scznd numrul celulelor i/sau potennd mecanismele imunosupresoare (limocitele T reglatorii). Stresul cronic poate perturba RI i prin promovarea rspunsului proinflamator. 2. distribuia leucocitelor: compartimentele cu un numr crescut de leucocite n timpul stresului acut determin imunostimulare; 226

3. concentraia fiziologic vs. farmacologic a glucocorticoizilor i structura endogen vs. sintetic a acestora: hormonii endogeni n concentraie fiziologic au efect imunostimulant, n timp ce hormonii endogeni n concentraii farmacologice i hormonii sintetici au efect imunosupresor. 4. corelaia timp de aciune al agentului stresor timp de activare a rspunsului imun: imunostimularea se observ cnd agentul stresor acioneaz n stadii incipiente ale activrii imune, iar imunosupresia este asociat cu stadiile tardive ale RI. Se consider c stresul pe termen scurt induce o redistribuie a celulelor imune n organism, funcia imun fiind semnificativ stimulat n organe pe unde leucocitele trec n timpul stresului acut. Un exemplu interesant este cel al unor parautiti crora li s-au msurat nivelul plasmatic al cortizolului i al celulelor LT i NK cu 2 ore nainte, i la 1 or dup sritur. Rezultatele arat o cretere semnificativ n numrul celulelor imune nainte de sritur, urmat de o scdere dramatic la 1 or dup, modificri concomitente cu creterea catecolaminelor, respectiv creterea cortizolului plasmatic. (2) Aadar, imediat dup debutul unui stres (minute) sau n timpul unui stres de intensitate uoar, sau efort fizic catecolaminele determin ieirea soldailor (leucocite) din tranee (splin, plmni) i intrarea pe bulevarde (vase sangvine i limfatice). Ulterior, cortizolul induce trecerea leucocitelor din snge la locurile de lupt (piele, plmni, tract gastrointestinal, mucoase, ganglioni limfatici). Stresul cronic, numit i distres are drept mecanism fiziopatologic persistena RI dup ncetarea aciunii agentului stresor sau activarea repetat. Rspunsul la stresul acut are rol critic n adaptarea organismului, hormonii de stres pregtind sistemul imun pentru eventuale provocri (ex. rnire, infecie). 17.4.3. Interaciunea somn rspuns imun Dei deprivarea de somn este considerat un factor de risc pentru sntate, asocierea consecinelor a fost dificil, ntruct semnele clinice msurabile, specifice acesteia, lipsesc. S -a constatat ns c peste 64 de ore fr somn la persoane sntoase au consecine cognitive marcate, dar numai cteva semne fiziologice i neurologice minore. Similar, 9 zile de deprivare de somn au ca rezultat colapsul iarspitalizarea devine obligatorie. Se tie c exist o relaie ntre somn i sistemul imun, ns natura acesteia nu este foarte clar. Unele studii au sugerat c deprivarea de somn determin un dezechilibru cronic energetic, deteriorarea gradual a sntii, cu scderea activitii rspunsului imun, accelerarea catabolismului, malnutriie putnd conduce la deces, n cele din urm. Cauza morii obolanilor deprivai de somn (3 sptmni) a fost sepsisul cu bacterii facultativ anaerobe, prin multiplicare excesiv (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae i Corynebacterium jejikum). Translocarea bacteriilor i a toxinelor extraintestinal, sangvin, reprezint trigger-ul unei stri hipermetabolice i inflamatorie sistemice avnd ca rezultat sepsisul fr a se putea pune n eviden un focar septic. Semnele care certific prezena unui status de imunosupresie includ absena abceselor n ciuda colonizrii cu S. aureus, absena febrei i bacteriemia primar indus de microorganisme oportuniste, similar cu patogenia sepsisului la pacienii imunocompromii.

227

17. 5. Tipuri de imunitate Imunitatea poate fi motenit (trstur de specie, se transmite ereditar) i dobndit. Imunitatea poate fi dobndit activ, dup contactul cu un anumit antigen (ex. bacterian). Evenimentul imunologic poate aprea dup o infecie (natural) sau dup administrarea unor vaccinuri (artificial). Avantajul imunitii dobndite activ este faptul c, de regul, protecia este de durat. Dezavantajul principal este reprezentat de faptul c instalarea rspunsului imun are loc lent, mai ales n cazul RIP. Imunitatea poate fi dobndit i pasiv, prelund anticorpi produi de ctre o alt gazd. Spre exemplu, administrarea de anticorpi anti toxin difteric / tetanic / botulinic (artificial) pune la dispoziia gazdei infectate, imediat, o cantitate important de antitoxin, n vederea neutralizrii ct mai rapid a toxinei implicate patogenic. n mod natural, ftul i nou nscutul beneficiaz de protecie prin intermediul anticorpilor (IgG transplacentar, IgA prin colostru, lapte) provenii de la mam. Avantajul imunitii dobndite pasiv este rapiditatea, n tim p ce dezavantajul este reprezentat, pe de o parte, de timpul scurt pentru care este oferit protecia iar pe de alt parte, de riscurile unei hipersensibilizri, atunci cnd sunt utilizai anticorpi provenind de la o alt specie (ex. n cazul administrrii de ser recoltat de la cal hiperimunizat). Exist i posibilitatea dobndirii unei imuniti activ - pasiv, atunci cnd se administreaz concomitent (dar n locuri diferite) ser imun i un vaccin (ex. n suspiciunea infeciei cu Clostridium tetani). Mult timp s-a considerat c cele 2 tipuri de imunitate acioneaz independent, imunitatea nnscut oferind prima linie de aprare mpotriva microbilor invadatori, iar imunitatea dobndit intervenind mai trziu, pentru a elimina infecia. ns, interaciunea dintre cele 2 tipuri de imunitate este evident: imunitatea adaptativ profit de abilitatea imunitii nnscute de a distinge ntre agenii patogeni, microbii benefici i factorii de mediu. Cele 2 tipuri de imunitate sunt complementare, n strns colaborare (un adevrat exemplu pentru studeni, medici sau orice membru al sistemului sanitar). Existena celulelor NK ntrete aceste considerente. Conform unor descoperiri recente, celulele NK au o proprietate esenial, atribuit numai celulelor imunitii memoria; n plus, au fost identificate celule NK n locuri atribuite n mod clasic imunitii adaptative: timus i ganglionii limfatici. (4)

17. 6. Definiia vaccinurilor Pornind de la observaiile i experimentele lui Edward Jenner, Louis Pasteur a fundamentat tiinific vaccinurile alctuite din corpi microbieni. Gaston Ramon a pus la punct metodele de neutralizare a toxinelor i a identificat utilizarea lor ca anatoxine. Vaccinul este 1. o suspensie de microorganisme (bacterii, virusuri) vii atenuate sau inactivate sau 2. cuprinde fraciuni din microorganisme (subuniti), n vederea stimulrii mecanismelor de rspuns imun, de regul pentru prevenirea apariiei unor infecii.

228

Vaccinarea este definit drept o metod profilactic, care urmrete creterea rezistenei specifice a unei gazde, printr-o imunizare activ, cu stimularea rspunsului umoral sau celular, dup caz. De fapt, vaccinrile incluse n programele naionale de vaccinare (conform recomandrilor Organizaiei Mondiale a Sntii, OMS) reprezint metodele profilactice cu cel mai bun raport ntre cost i eficien, n comparaie cu orice alt metod cunoscut. Strategiile de vaccinare au n vedere mai multe aspecte, inclusiv statusul imun al gazdei respective (imunocompetent sau imunodeprimat). Unele vaccinuri se pot administra i n timpul unei izbucniri epidemice (outbreak) sau a unei epidemii, pentru prevenirea apariiei de cazuri noi i scurtarea duratei epidemiei. Exist i posibilitatea administrrii unor vaccinuri n scop curativ, gazda fiind deja infectat n momentul inoculrii (ex. vaccin HBV la persoanele cu hepatit cronic, cu HBV).

17. 7. Clasificarea vaccinurilor n funcie de infecia care se dorete a fi prevenit, vaccinurile pot fi bacteriene sau virale. n funcie de modul de preparare exist: Vaccinuri corpusculare (bacteriene, virale), incluznd, dup caz, corpi vii atenuai sau distrui (inactivai) prin aciunea unor factori fizici (ex. cldur) sau chimici (ex. mertiolat de sodiu). Vaccinul BCG conine bacterii vii atenuate, stimuleaz RIC i se administreaz pentru a preveni tuberculoza. Vaccinurile poliomielitic (Salk) sau hepatitic A includ virusuri omorte. Vaccinurile poliomielitic (Sabin), rujeolos, rubeolos conin virusuri vii, atenuate i stimuleaz RIU i rspunsul imun la poarta de intrare. Vaccinurile subunitare, preparate prin inginerie genetic, au un grad superior de siguran (vaccin hepatitic B, vaccin pertussis acelular). Vaccinurile care conin anatoxine bacteriene, purificate i adsorbite pe suport mineral (DTP conine anatoxin tetanic i difteric plus corpi de Bordetella pertussis omori, DT, dT, ADPA, ATPA/VTA). n funcie de numrul componentelor antigenice exist: Vaccinuri monovalente (rujeolos/VVR, rubeolos, hepatitic A, hepatitic B, pertussis acelular, BCG etc), Vaccinuri asociate, care conin amestecuri de antigene (DTP, DT, dT, rujeolos-rubeolos etc). Date privind schema de vaccinare aflat n uz n ara noastr la acest moment, precum i cteva informaii privind substanele imuno-modulatoare (ex. Cantastim) sunt prezentate n anexa nr. 4.

17. 8. Povestire adevrat Ianuarie 1993 ... un articol semnaleaz faptul c difteria, o boal practic eliminat n Europa de Vest, capt proporiile unei epidemii, n Rusia.

229

Situaia a fost de asemenea periculoas n Ucraina, unde mai mult de 1.300 de cazuri au fost raportate n primele zece luni ale anului 1992. Ameninarea extinderii n alte state, foste membre URSS, a fost real. Eforturile uriae de a vaccina att copiii ct i adulii au fcut, pn la urm, posibil controlul epidemiei. Totui, n perioada 1990-1998, peste 150.000 de cazuri de difterie au fost raportate, din toate statele foste membre ale URSS, nregistrndu-se i un foarte mare numr de decese. Dar care a fost motivul i de ce a aprut o epidemie de difterie dup 1990 ? Incidena difteriei n Rusia era foarte mare n prima jumtate a secolului 20; peste 750.000 de cazuri au fost raportate doar n Rusia n anii 50 (imunizarea mpotriva difteriei a nceput n anumite zone ale Uniunii Sovietice n 1920, ns abia n 1958 a fost statuat imunizarea universal a copiilor, n toat Uniunea Sovietic). Este adevrat c n 1977, au nceput s fie din nou raportate cazuri de difterie, n URSS, atingnd o valoare maxim n 1984 (1.609 cazuri). Din 1978, pentru prima dat, majoritatea cazurilor au aprut la aduli. Mass-media a avut un rol extrem de negativ prin atitudinea advers fa de imunizare. Multe dintre bolile prevenite de vaccin aveau o inciden sczut i n acest context a aprut o micare anti-imunizare n pres, n contextul unei perioade (1985-1990) de profund nencredere n guvern. Dup 1990, prinii nu mai erau de acord s permit imunizarea copiilor cu vaccinuri produse n Rusia fiind fcui s cread c acestea le fac ru i i mbolnvesc. Chiar i membri ai comunitii medicale au avut ieiri n pres n care au exprimat prerea c aceste vaccinuri duneaz. n plus, o parte din prini considerau c amnarea (nerespectarea schemelor de vaccinare, neprezentarea la medic atunci cnd erau invitai s o fac) sau evitarea vaccinrii copiilor sunt o nou-descoperit libertate, n cadrul democraiei instaurate odat cu dizolvarea URSS. Epidemia aprut n anii 90 a ngrijorat comunitatea medicala internaional n legtur cu vaccinul produs n Rusia. Contrar opiniilor anecdotice, studiile realizate au demonstrat c vaccinul era eficient [este totui posibil ca vaccinul s fi fost transportat n condiii improprii i astfel s fi avut, n mod real, o eficacitate mai mic (presupunere care nu a fost demonstrat)]. Este adevrat c i schemele de vaccinare din URSS au suferit n anii '80 unele modificri, diferind de schemele recomandate de OMS (ex. coninut mai mic de antigen, creterea intervalului ntre vaccinri, renunarea la administrarea DT la intrarea n coal) iar preocuparea pentru sntatea public a sczut, din diverse motive. Rata vaccinrii la copii a sczut n anii 80, la mai puin de 70% (mult sub recomandrile OMS). Reacia fa de aceast epidemie s-a concentrat iniial asupra vaccinrii a ct mai multor copii dar i a adulilor din grupele de risc. Vaccinarea tuturor adulilor a fost aprobat abia n 1993. S au fcut vaccinri la locul de munc dar i vizite la domiciliu pentru vaccinarea omerilor. Pentru a crete rata imunizrii la copii s-a diminuat lista contraindicaiilor i a nceput s se foloseasc schema complet de vaccinare. n octombrie 1994, s-a reintrodus vaccinarea copiilor la intrarea n clasa I. n 1995 - 1996, epidemia a nceput s fie controlat. Dar care au fost pierderile umane i materiale, reale, probabil c nu vom cunoate, vreodat. n timp ce apariia epidemiei a fost unul dintre cele mai spectaculoase exemple ale interveniei negative a mass-media n problemele de sntate public, controlul epidemiei de difterie a fost unul dintre cele mai spectaculoase succese ale interveniei de sntate public n secolul 20.

17. 9. Direcii de cercetare 230

Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. 1. The open window of susceptibility to infection after acute exercise in healthy young male elite athletes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Kakanis%20MW%22 2. New strategies of mammary cancer vaccination: based on the administration of tumor cells genetically modified to express major histocompatibility complex (MHC) class II gene products; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21050309 3. Receptor tyrosine kinase signaling favors a protumorigenic state in breast cancer cells by inhibiting the adaptive immune response; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20924104 4. Replacement of dietary fish oil by vegetable oils affects humoral immunity and expression of pro-inflammatory cytokines genes in gilthead sea bream Sparus aurata; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20817101 5. Model systems to the rescue: The relationship between aging and innate immunity; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21057627 6. Innate Immune Response to Mycobacterium tuberculosis Beijing and Other Genotypes; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21049036 7. Skin Commensals Amplify the Innate Immune Response to Pathogens by Activation of Distinct Signaling Pathways; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21048787 8. An Effective HIV Vaccine: A Combination of Humoral and Cellular Immunity? http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20636279

17. 10. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. 1. Principala caracteristic a imunitii este: A. selectivitatea B. memoria C. specificitatea D. unicitatea 2. RIU reprezint o cooperarea intercelular, n care rolul principal revine: A. macrofagelor B. NK C. LT B D. LTc 3. Pe parcursul RIC intervin: A. IL 2, IL 4 B. TNF-a, TNF- ,IFN-g C. IL 12, IL 2 D. IL 4, IL 5 231

4. Urmtoarele afirmaii despre imunitatea dobndit sunt adevrate, cu excepia: A. apare n urma infeciilor B. cea activ se dezvolt rapid C. vaccinurile au o contribuie important n dezvoltarea imunitii dobndite D.cea pasiv se dezvolt rapid 5. Vaccinul DTP este: A. monovalent B. viu C. corpuscular D. un amestec de antigene

Bibliografie 1. Firdaus SD, 2009, Enhancing versus supressive Effects of Stress on Immune Function: Implications for Immunoprotection and Immunopathology, Neuroimmunomodulation, 16(5), 300-317 2. Schedlowski M, Jacobs R, Stratmann G et al., 1993, Changes of natural killer cells during acute psychological stress, J. Clin. Immunol., 13(2), 119-126 3. Everson CA, Toth L, 2009, Systemic bacterial invasion induced by sleep deprivation, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol., 278(4), R905-R916 4. Cooper MA, Colonna M, Yokoyama WM, 2009, Hidden talents of natural killers: NK cells in innate and adaptive immunity, EMBO Rep., 10(10), 1103-30

232

18. Reaciile de hipersensibilitate (MI Popa, Gabriela Loredana Popa)

18. 1. Definiie, clasificare

Reacia imun este un rspuns normal fiziologic fa de microorganisme sau celule tumorale. Totui, RI poate mbrca i aspecte patologice, de tipul hipersensibilitii (HS) sau al autoimunitii. Primele observaii privitoare la reaciile de hipersensibilitate au fost fcute de Charles Richet n urm cu un secol, observaii care vor acoperi tipul I din clasificarea Gell i Coombs de mai trziu. Pornind de la diferite tipuri de reacii observate, Gell i Combs (1968) au propus o clasificare folosind termenul de hipersensibilitate de tip I-IV. n 1974, Roitt adaug hipersensibilitatea de tip V, stimulant (pornind de la anticorpii stimulani ai funciei tiroidei, prezeni n hipertiroidia primitiv, boala Basedow). n mod clasic, HS reprezint o stare de reactivitate crescut a organismului, pe baza unui mecanism imunologic, indus de expunerea (repetat) la anumite structuri antigenice (sau haptene). Cuvntul alergen a fost pentru prima oar utilizat de Riquet; desemneaz un antigen care d natere unei reacii de hipersensibilitate. HS este specific i include un contact sensibilizant, o perioad de laten i un nou contact, contactul declanator, cu acelai antigen care a fost implicat n contactul sensibilizant. HS se poate clasifica n funcie de tipul de rspuns imun n: HS mediat prin mecanism imun umoral (rol primordial LB i anticorpii) -HS de tip I (anafilactic, atopic), aa cum se nregistreaz n cazul ocului anafilactic, edemului Quincke, conjunctivitelor sau rinitelor alergice, astmului alergic, urticariei, eczemei atopice etc; -HS de tip II (citotoxic), aa cum se ntmpl n liza celular prin anticorpi, complement dependent sau n citotoxicitatea anticorp dependent, complement independent (mecanisme ce pot fi implicate de ex. n patogenia reumatismului articular acut, n anemii hemolitice inclusiv dup infecii cu Mycoplasma pneumoniae, reacii posttransfuzionale, sindromul Goodpasture etc); -HS de tip III (prin complexe antigen-anticorp), aa cum se nregistreaz n reacia Arthus, boala serului, boala plmnului de fermier, glomerulonefrita extramembranar, lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefrita i periarterita poststreptococic etc. HS de tip IV mediat prin mecanism imun celular (rol primordial LT i citokinele), spre exemplu n -HS tuberculinic sau -HS n testrile intradermice care utilizeaz lepromin, candidin, histoplasmin, tricofitin etc i -HS n multe dintre infeciile virale.

233

18. 2. Hipersensibilitatea de tip I (anafilactic) Reacia imun anafilactic se poate instala rapid (n mai puin de 15-30 minute) dup un nou contact cu un antigen la care organismul este sensibilizat. n aceast reacie intervin celulele (mastocite, bazofile) acoperite de reagine (n principal IgE), care elibereaz mediatori chimici (histamina fiind cel mai important i cel mai cunoscut dintre acetia). Anafilaxia este un fenomen general, obinut ca rspuns la antigene variate: toxine, proteine, medicamente, alloantigene de transplant. Codeina, morfina, vancomicina i substanele de contrast folosite n imagistic pot determina oc anafilactoid, cu aceleai manifestri ca n ocul anafilactic, ns fr participarea IgE. Anticorpii anafilactici (reaginele) sunt anticorpi care se fixeaz prin fragmentul lor Fc pe receptorii specifici exprimai la suprafaa bazofilelor i mastocitelor. Controlul producerii de IgE este realizat de LT. LTh2 stimuleaz producerea IgE (sunt implicate IL-4, IL-5, IL-10). LTh1 inhib producerea IgE (fiind implicate IFN i IL-12). Th2 (Figura nr. 1) are o aciune autocrin, secret IL-4 cu aciune att asupra LB ct i asupra celulei secretoare. Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul acelorai citokine i se realizeaz de aceeai populaie celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin sunt situate foarte apropiat una de cealalt, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independent de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10. Efectele diferite induse de cele 2 tipuri de imunoglobuline se datoreaz structurii diferite. IgE prezint fa de IgG4 un domeniu constant suplimentar, o zon balama diferit i zone de recunoatere pentru ambele tipuri de receptori: FcRI (afinitate nalt) i FcRII (afinitate joas). IgE au un timp de via mai scurt (<2 zile) comparativ cu 21-23 zile pentru IgG, iar concentraia acestora este foarte sczut n serul individului normal. Ataarea IgE de mastocite i bazofile (ca dimeri cuplai cu alergenul) duce la creterea duratei de via a IgE de la mai puin de 2 zile la 10 zile. IgE nu trec de bariera feto-placentar datorit faptului c placenta nu conine FcR. n sngele fetal se pot gsi IgE n cantiti sub 1UI/ml prin ataare de FcRI de pe macrofagele fetale. FcRI pot semnaliza pentru degranulare i dup cuplarea cu alte molecule (ex. lectine, Ac anti lant FcRI). Bazofilele i mastocitele se caracterizeaz prin prezena unor granule metacromatice, roii dup coloraia cu albastru alcyan, datorit histaminei i heparinei. Mediatorii mastocitari sunt reprezentai de histamin, leucotriene, prostaglandine, factorul activator plachetar (PAF), adenozin, factori chemotactici pentru eozinofile (ECF) i neutrofile (NCF) i o serie de citokine proinflamatorii (IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, GM-CSF, TNF-a, TGF-1, IFN-g). La suprafaa bazofilelor i mastocitelor sunt exprimai diveri receptori, dintre care cei mai importani sunt FceRI, FceRII (CD23) i C3aR i C5aR (CD88). Legarea reaginelor de receptorii FceRI, FceRII iniializeaz semnalizarea spre interiorul celulei, ducnd la activarea celular. Activarea bazofilelor i mastocitelor se realizeaz prin mecanisme mediate imun i necesit prezena unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). Procesul de activare const dintr-o serie de reacii biochimice n trepte, cu participarea fosfolipidelor membranare, activarea PKC, fosforilarea tirozinei, toate ducnd la creterea influxului de Ca2+ extracelular alturi de mobilizarea rezervelor de Ca2+ intracelular. Rolul Ca2+ este de a iniia eliberarea mediatorilor preformai i sinteza de novo a mediatorilor lipidici. Exemplificm efectele acestor mediatori prin histamin care produce: bronhoconstricie prin aciune direct pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheobronice, 234

vasodilataie arterio-capilar prin contracia fibrelor musculare netede din peretele venulelor postcapilare, creterea permeabilitii capilare, creterea motilitii intestinale i reacie urticarian la nivel cutanat. Mastocitele elibereaz histamin i LTD4, care vor determina edem, hipersecreie de mucus i bronhoconstricie, cu scderea FEV1, ns elibereaz i IL-5, TNF, care vor atrage eozinofile, limfocite, neutrofile i macrofage. Aceste celule inflamatorii vor determina modificri cronice la nivelul plmnului: hiperplazie a celulelor secretoare de mucus, depunere de colagen la nivelul membranei bazale i hiperplazie muscular neted. Aceste modificri vor determina o hiperreactivitate bronic, dar de data aceasta, nespecific (hiperreactivitate bronic la aer rece, efort). Activitatea inflamatorie care are loc la nivelul bronhiilor se coreleaz cu valoarea NO expirat (inducere iNOS la nivelul macrofagelor), cu un numr crescut de eozinofile i cu valori mari ale ECP (eozinophil cationic protein) n sputa indus. Aceste teste nu au valoare diagnostic, nsa pot fi utilizate orientativ pentru aprecierea severitii astmului. Faptul c mastocitele intervin n ambele faze, imediat i tardiv, o demonstreaz efectul benefic pe care l are cromoglicatul (stabilizator de membran, se opune degranulrii) n tratamentul astmului bronic. Corticosteroizii acioneaz numai pe rspunsul tardiv. Ei nu pot face discriminarea ntre implicarea mastocitelor i LT n inflamaia cronic datorit faptului c inhib ambele celule. Dintre manifestrile clinice sistemice care pot aprea n cazul unei stri de HS de tip I, sunt de reinut: - ocul anafilactic, care la om se manifest prin colaps cardio-vascular i bronhospasm; n lipsa tratamentului poate evolua ctre deces. Principalele antigene care pot declana ocul anafilactic sunt nepturile de himenoptere (albine, viespii), injectarea unor medicamente (penicilina, miorelaxante, ACTH etc), latexul (la infirmiere, chirurgi) i - edemul Quincke care cuprinde faa, gura i uneori faringele i laringele, ducnd la asfixie i deces. Dintre manifestrile clinice localizate ar fi de amintit: - manifestrile localizate la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii, avnd drept principali ageni declanatori polenul, acarienii, praful de cas, sporii de ciuperci (conjunctivite alergice, rinite alergice inclusiv febra de fn, traheita spasmodic i astmul alergic); - manifestrile cutanate (urticarie, dermatite sau eczema atopic) i - manifestrile digestive (diaree, vomismente n caz de alergie la laptele de vac, ou, pete, fructe, elin etc).

18. 3. Povestiri adevrate 18. 3. 1. Anafilaxie sau atac astmatic sever? O tnr de 19 ani ajunge la camera de urgen din cauza unui atac acut de dispnee, respiraii uiertoare (wheezing), nroire (erupie eritematoas) generalizat la nivelul tegumentelor i vrsturi. Era cunoscut ca suferind de astm bronic, inut sub control cu tratament 235

medicamentos. Din antecedentele din copilrie, avea notat n carnetul de sntate o reacie alergic (dermatit atopic i urticarie) dup ingerarea de unt de arahide. Dup spusele colegilor care au nsoit-o la spital, nainte de a-i aprea simptomele, a mncat o ciocolat de la un tonomat din cmin. Pe ambalaj nu apreau notate alunele ca ingredient. Totui ... Iat cteva elemente privind alergiile la diferite alimente Reaciile de hipersensibilitate aprute dup ingestia anumitor alimente afecteaz aproximativ 68% dintre copiii mai mici de 4 ani i aproape 2% din populaia SUA cu vrsta mai mare de 10 ani. Alergia la produsele alimentare reprezint una dintre cele mai importante cauze pentru reaciile anafilactice tratate n departamentele de urgen din SUA i din multe state occidentale. n fiecare an sunt raportate circa 30.000 reacii anafilactice, 2.000 de spitalizri i 200 de decese din cauza reaciilor de sensibilitate la diferite produse alimentare. Reaciile n urma consumului de arahide i alune de pdure conduc la un procent important de reacii anafilactice fatale sau foarte grave. n SUA, de unde putem obine date statistice privind aceast situaie, 3 milioane de oameni sufer astfel de alergii. Dei exist numeroase programe de informare (tot n SUA) cu privire la alergiile alimentare, majoritatea pacienilor nu tiu cum s acioneze i cum s se salveze n cazul unei reacii anafilactice. Cum s-ar putea pune diagnosticul? La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, n absena unor semne recente de astm, trebuie s ridice ntotdeauna suspiciunea anafilaxiei. Anafilaxia indus de produse alimentare poate fi confundat de ex. cu un atac astmatic sever. Cu alte cuvinte, anamneza i examenul clinic pot contribui la orientarea diagnosticului. Tratamentul alergiei la alune n primul rnd i cel mai important este ca reacia de hipersensibilitate (HS) de tip I s fie prevenit i msurile includ educarea pacienilor i a familiilor acestora cu privire la modul n care s evite ingestia accidental de alune, cum s recunoasc primele semne i simptome ale unei reacii alergice i cum s reacioneze n primele stadii ale unei reacii anafilactice. Spre deosebire de imunoterapia tradiional (pentru reaciile de HS la nepturi de insecte etc) n cazul HS la alune sunt investigate metode de tratament neconvenionale precum injectarea lunar de anticorpi anti-IgE (care, prin scderea nivelelor de IgE, pot preveni activarea rspunsului la alergenul proteic din alune) sau obinerea prin inginerie genetic a unor proteine de alune recombinante (prin substituirea unor aminoacizi critici se poate preveni activarea reaciilor mediate de IgE). Tratamentul reaciei anafilactice Pacienii care au HS de tip I la alune trebuie s primeasc urgent adrenalin (injectat intramuscular), antagoniti ai receptorilor histaminici H1 i H2 (administrai oral, intramuscular sau intravenos), oxigen, albuterol (pe cale inhalatorie) i corticosteroizi (injectabil). Datorit faptului c pot aprea reacii bifazice (definite ca o agravare simptomelor, ce necesit o nou terapie dup tratarea iniial a reaciei anafilactice) i deoarece circa 90% din rspunsurile

236

bifazice apar n primele 4 ore de la reacia anafilactic iniial, pacienii trebuie inui sub observaie cel puin 4 ore nainte de a fi externai din camera de urgen. Se recomand continuarea tratamentului timp de 3 zile (prednison i antihistaminice), cu toate c nu a fost demonstrat c aceast recomandare ar reduce riscul simptomelor recurente. 18. 3. 2. Dar cum s-ar putea modula secreia IgG4/IgE? Pentru a bloca interaciunea Th2 - IL-4 se pot folosi Ac anti IL-4 sau receptori solubili pentru IL-4. Utilizarea receptorilor solubili IL-4 s-a ncercat terapeutic, cu rezultate bune in vitro (administrare inhalatorie), dar nu i in vivo (probabil datorit contracarrii aciunii acestora prin intervenia altor citokine implicate n sinteza de IgE). Sinteza de IgG4 i sinteza de IgE se afl sub controlul acelorai citokine i se realizeaz de aceeai populaie celular. Genele pentru cele 2 tipuri de imunoglobulin sunt situate foarte apropiat una de cealalt, pe cromozomul 14. Mecanismul prin care sinteza de IgG4 devine independent de cea de IgE nu este clar elucidat, dar se pare c un rol l-ar putea juca Il-10. Copii care triesc n cas cu o pisic e posibil s nu dezvolte hipersensibilitate la alergenii aceasteia, prin modificarea raspunsului Th2 va crete sinteza de IgG4 i va scdea sinteza de IgE. Cercettorii ncearc s gseasc un mod de a induce Th2 s sintetizeze numai a IgG4, cu blocarea produciei de IgE, cu scopul de a induce tolerana la venin de insecte, proteine diferite, alergeni alimentari, pr de animale etc. Merit menionat faptul c imunizrile antitetanos i antidifterie nu induc producerea de IgE, n timp ce imunizrile repetate antipertussis cu adjuvant Freund incomplet induc o sintez crescut de IgE (e foarte interesant faptul c exist variaii mari n funcie de tulpina utilizat pentru fabricarea vaccinului). Cteva exemple de alergeni O descriere orientativ a alergenilor implicai n HS de tip I ar fi cea de proteine hidrosolubile cu greutate molecular ntre 10 i 40kDa, chiar dac structura, proveniena i calea pe care o urmeaz aceste proteine poate fi extrem de diferit. Cloning a descoperit o anumit secven de aminoacizi omoloag pentru o parte din alergeni i diferite enzime. Pentru polen sau prul de pisic nu exist nici omologia structural cu enzimele i nici capacitatea enzimatic, deci nu acetia sunt factorii eseniali. Pentru acarieni, n schimb, s-a dovedit o strns corelaie ntre activitatea proteazic i imunogenitate (Der p 1 taie CD23 sau CD25 de pe limfocite, intensificnd rspunsul imun; de asemenea, distruge jonciunile dintre celulele epiteliale, ceea ce le faciliteaz acarienilor ptrunderea n organism). 18. 3. 3. Testarea HS de tip I

237

Testele cutanate, prick-test, reprezint metoda cel mai des utilizat n diagnosticul HS de tip I. Se introduc cte 0,1l din fiecare preparat antigenic de testat intradermic (de obicei se testeaz 25 de astfel de preparate), un martor pozitiv (histamina), i unul negativ (soluie salin fiziologic). Modificrile cutanate apar n 5-15 min i dureaz 30 minute sau mai mult. Vor fi 2 tipuri de rspuns: macul, determinat de descrcarea de histamin, cu prurit i edem i papul, cu aspect eritematos i dimensiuni mai mari i care are ca mecanism reflexul de axon. Alt tehnic ar include dozarea IgE, ns testul este mai puin sensibil dect testele cutanate. Un test cutanat pozitiv nu inseamn neaprat c persoana prezint HS de tip I, ci c exist o mare probabilitate s fie aa. Numai un test cutanat pozitiv de mari dimensiuni (>10mm diametru) este urmat i de un rspuns tardiv, caracterizat prin eritem i induratie. Rspunsul tardiv apare la 2-3 ore dup injectarea intradermica a antigenului, ine pn la 24 ore i este sugestiv pentru inflamaie cronic la nivelul foselor nazale, plmnului, pielii, datorndu -se: efectelor directe ale prostaglandinelor, leucotrienelor i citokinelor eliberate de mastocite, infiltrrii cu limfocite, eozinofile, bazofile i neutrofile i produilor de secreie ai acestor 4 tipuri de celule. Rspunsul tardiv se ntlnete n cazul administrrii de tuberculin, candidin i tricofitin.

Testele patch reprezint aplicarea cutanat a 10g alergen i realizarea unei biopsii din zona respectiv dup 24 sau 48 ore. Exist 3 moduri de aplicare a antigenului n cazul patchtest: injecii intradermice locale, plasture sau godeu. Ultima metod are avantajul c se pot lua probe repetate fr traumatizarea suplimentar a pielii la fiecare prelevare. Un test patch pozitiv nseamn prezena eczemei cu spongioliza epidermului (formarea de vezicule pline cu lichid ntre cheratinocite) la nivel macroscopic i prezena unui infiltrat celular dermic la nivel microscopic (eozinofile, bogate n MBP-major basic protein, bazofile, limfocite). S-a reuit clonarea de LT specifice mpotriva acarienilor din pielea persoanelor cu eczem (produs n mod natural, nu prin aplicarea unui patch), lucru care nu este posibil i din pielea persoanelor alergice dar care nu dezvolt eczem, ceea ce sugereaz nu doar rolul de helper, ci 238

chiar pe cel de celul efectoare, al LT in hipersensibilitatea tip I. Se pare c rolul LT ca efector n HSI nu se limiteaz doar la nivel cutanat, dar i la nivelul mucoasei nazale i conjunctivei n rinita alergic i a epiteliului bronic n astm. Un alt test care se poate folosi este testul de provocare prin nebulizarea antigenului, cu rspuns rapid n 20 minute constnd n bronhospasm i cu un raspuns tardiv n 4-8 ore, constnd n eliberare de mediatori de novo i infiltrat celular. Rspunsul tardiv pozitiv se poate pune n eviden prin LBA (lavaj bronho-alveolar), cnd se identific nu celulele, ci produi ai acestora (histamina, prostaglandine, leucotriene, MBP, ECP) sau prin biposie, cnd se pot identifica toate modificrile patologice care pot s apar n astm (celule inflamatorii, depunere de colagen, subierea peretelui broniolelor), reunite sub denumirea de remodelare bronic. Pentru demonstrarea hiperreactivitii bronice nespecifice se fac teste de provocare cu histamin, metacolin sau aer rece. Teoriile spun c evaporarea crescut de ap, care va rci epitelilul, ori stimuleaz direct terminaiile nervoase, ori stimuleaz eliberarea de mediatori din celulele locale (histamin din mastocite). Pe frotiul de snge periferic se remarc eozinofilie, iar n secreiile nazale ale unui astmatic, titrurile de ECP i CXCL8 (IL-8) vor fi crecute. pH-ul vaporilor de ap n criz va fi acid. Examenul CT al sinusurilor nazale poate arta opacifierea acestora, situaie ntlnit la o treime din astmatici. Ca i n cazul oricrei alte patologii nu se poate rmne doar la stadiul de observare, nici la cel de diagnostic, ci trebuie s se mearg la urmtorul nivel, identificarea unui tratament. Imunoterapia sau hiposensibilizarea prin injectarea alergenului n cantiti mici pentru o perioad de cteva luni, a fost ncercat n 1911 de Noon i Freeman. Acum se folosete mpotriva reaciilor fa de veninul de albine, viespi i pentru tratamentul rinitei alergice. Doza iniial este de 1-10ng i crete progresiv cu cte 10g alergen/doz. O form mai nou de imunoterapie e cea folosind, nu structura natural a alergenilor, ci un fragment coninnd numai primii 20 aminoacizi din structura primar a alergenului. De asemenea, se pot sintetiza forme recombinate genetic, cu o capacitate de legare de IgE sczut. ns i acestea ar putea provoca oc anafilactic aa c administrarea lor se va face dup luarea tuturor precauilor necesare. Sunt n studiu i vaccinuri ADN, cu introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vectorin celulele gazdei, cu modificarea rspunsului imun al acesteia. Experimente s -au facut pe oareci, unde expresia tisular de CpG a facut s creasc activitatea TH1 i s scad cea a TH2. Anticorpii monoclonali anti-IgE umanizai se ataeaz de Fab a IgE circulani, i astfel i ndeprteaz din circulaie. ns, pot i scdea producia de IgE prin ataarea de receptorii situai pe LB, care nu vor mai semnaliza pentru producerea de reagine (Ac anti-IgE). i-au dovedit eficacitatea n cazul astmului alergic i al rinitei alergice, i urmeaz s se stabileasc dac au efect benefic n cazul alergiei alimentare, dermatitei atopice sau alergiei la medicamente.

18. 4. Verificai-v cunotinele

239

Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 1). Anafilaxia apare dup un contact nou cu un antigen la care organismul nu era sensibilizat. 2). n HS de tip I intervin mastocite, bazofile cuplate cu Ac anafilactici care se mai numesc i reagine. 3). mediatorul mastocitar principal este histamina, care este un mediator sintetizat de novo. Dintre cele 3 afirmaii de mai sus, care este adevrat/care sunt adevrate? A) 2 B) toate C) nici una D) (1) si (3) ntrebarea 2 Alegei afirmaiile care sunt amndou corecte i se afl n relaie de cauz-efect. a). Activarea bazofilelor i mastocitelor se realizeaz prin mecanisme mediate imun pentru c necesit prezena unui mesager secund intracelular (Ca2+ sau AMPc). b). Histamina determin bronhoconstricie la nivelul plmnului pentru c acioneaz pe receptorii H1 ai musculaturii netede traheo-bronice c). ocul anafilactic la om se manifest prin colaps cardio-vascular i bronhospasm pentru c n lipsa tratamentului poate evolua ctre deces d). Polenul, acarienii, praful de cas, sporii de ciuperci nu pot determina leziuni la nivelul mucoasei oculare sau respiratorii deoarece ei nu pot declana un raspuns imun. Intrebarea 3 Care dintre urmtoarele nu reprezint un test diagnostic al hipersenibilitii tip I a). prick-test b). dozarea IgE c). patch test d). dozarea IgG Intrebarea 4 Nu se folosete ca tratament al hipersensibilitii tip I a). hiposensiblizarea prin injectarea alergenului n cantiti mici pentru o perioad de cteva luni b). un fragment antigenic coninnd numai primii 20 aminoacizi din structura primar a alergenului caruia i s-a crescut i capacitatea de legare de IgE c). introducerea genomului alergenului bacterian cu ajutorul unui vector n celulele gazdei, cu modificarea rspunsului imun al acesteia d). anticorpii monoclonali anti-IgE umanizai Intrebarea 5 Pentru a gsi afirmaia corect ajutai-v de povestirea adevrat a).La un pacient astmatic, un atac acut, sever, de bronhospasm, n absena unor semne recente de astm, nu ar trebui s ridice niciodat suspiciunea anafilaxiei. b). Cel mai important este ca reacia de hipersensibilitate (HS) de tip I s fie prevenit c). n cazul HS tip I se evit adrenalina, antagonitii receptorilor histaminici H1 i H2, oxigenul, albuterolul i corticosteroizii d). Pentru c aproximativ 90% din rspunsurile bifazice apar n primele 4 ore de la reacia anafilactic iniial, pacienii pot fi externai din camera de urgen nainte de atingerea a 4 ore de la prezentare.

240

18. 5. Hipersensibilitatea de tip II (citotoxic) Reacia imun citotoxic reprezint unul dintre mecanismele importante de aprare a organismului gazd fa de microorganisme. Rolul acestei reacii este multiplu: distrugerea bacteriilor extracelulare i intracelulare, eliminarea celulelor infectate cu virusuri dar i distrugerea unor parazii sau fungi. Pentru ndeplinirea acestor funcii sunt utilizate mecanismele imunitii naturale (implicnd PMN, macrofage, celule NK). Imunitatea specific completeaz imunitatea natural, adugnd aderena celulelor fagocitare i a celulelor NK la antigene prin intermediul anticorpilor i complementului. Un rol aparte n imunitatea specific l dein limfocitele Tc cu efect litic fa de celulele infectate viral. HS de tip citotoxic apare dup cuplarea anticorpilor cu antigene fixate pe membrana celular. Spre deosebire de hipersensibilitatea de tip I, Ac implicai n acest tip de rspuns imun sunt IgG sau IgM. Ei sunt ataai celulelor gazdei sau se gsesc n matricea extracelular (n HS III, Ac sunt n ser, cu formarea de complexe circulante care se vor depune nespecific n esuturi). (Figura nr. 10) Se cunoate faptul c un neutrofil recunoate i fagociteaz fagocita bacteria opsonizat cu Ac, formeaz fagolizozomi urmnd distrugerea produsului fagocitat.Receptorii pentru complement sunt necesari pentru c bacteria poate fi opsonizat i de fragmente ale sistemului complement. A fost demonstrat experimental (pe oareci) c rolul esenial nu revine C3R, ci FcR. n loturile cu deficit de sintez a lanului al FcR, HS de tip II nu apare, n timp ce la oarecii cu deficit al componentelor sistemului complement, nu s-a constatat nici o diferen fa de lotul de control. n cazul HS de tip II, n locul endocitozei bacteriei, are loc o exocitoz a enzimelor lizozomale asupra celulei/matricei tapetate cu Ac. Dup formarea complexului antigen-anticorp este activat sistemul complement, se genereaz complexul de atac al membranei cu lezarea membranei celulare. Odat cu liza celulei gazd are loc eliberarea de tromboxan, precursor al prostaglandinelor i leucotrienelor. Alturi de neutrofile participi macrofagele, trombocitele, celulele K, eozinofilele datorit prezenei FcR pe membrana lor. Macrofagele, eozinofilele i neutrofilele au un rspuns mai puternic datorit prezenei i a C3R pe membrana celular. Amplitudinea fenomenelor la nivel celular depind de cantitatea de Ac dar i de rezistena celulelor int la liz. De exemplu, n cazul eritrocitelor este suficient un singur MAC, n timp ce pentru celulele nucleate exist o capacitate mai mare de a se reechilibra ionic precum i mecanisme de aprare anti-complement. Liza mediat de C' este implicat n anemiile hemolitice, reaciile postransfuzionale n incompatibilitatea ABO sau Rh etc. Leziunile membranare sunt accentuate de atragerea fagocitelor i eliberarea local a enzimelor litice. Organismul uman posed n mod normal n snge anticorpi fa de Ag sistemului ABO pe care nu le deine. n aceste condiii, Ac nu se vor ntlni niciodat cu fr o intervenie din afar. n cazul unei transfuzii cu snge incompatibil simptomele vor fi reprezentate de febr, hipotensiune, vomismente, dureri la nivelul toracelui (anterior i posterior), datorit hemolizei intravasculare. Este de menionat c o femeie nsrcinat poate pstra sarcina n cazul unui ft cu o alt grup de sngepentru c Ac formai mpotriva Ag eritrocitare sunt de tip IgM (pentameri) care nu vor trece bariera fetoplacentar. Sistemul Rh, ns, poate provoca sindromul hemolitic al nou-nscutului. Mama, sensibilizat mpotriva Ag Rh fetale, produce Ac anti Rh fetal de tip IgG, care vor trece bariera fetoplacentar. Manifestrile sindromului hemolitic al nou-nscutului constau n hepatosplenomegalie, icter i peteii aprute de exemplu la nivel facial. Primul copil Rh incompatibil cu mama sa, nu va suferi, ns, urmtorii, da. Situaia caracteristic este: mama, Rh- iar ftul, Rh+. Ac anti Rh+ rmn in amonte de placent. Pornind de la aceste constatri s a imaginat un tratament care i-a dovedit eficiena. Se administreaz mamei imediat postpartum Ac anti RhD, care vor distruge hematiile Rh+ materne. 241

Alte sisteme sangvine implicate n reaciile posttransfuzionale, n afar de sistemele ABO i Rh, sunt MN, Duffy i Kell. Formarea de IgG vor induce o reacie hemolitic mai puin accentuat. Eritrocitele transfuzate vor fi preluate de fagocitele de la nivelul ficatului i splinei, i nu vor da o hemoliz intravascular sistemic. ns poate aprea i n acest caz necroza acut tubular datorit eliberrii masive a componentelor eritocitare. Pot aprea reacii postransfuzionale ndreptate i mpotriva altor componente celulare sangvine, ns consecinele nu sunt la fel de pregnante ca n cazul eritrocitelor. Reaciile de respingere de gref se manifest la nivelul esuturilor vascularizate direct (un exemplu de esut care nu sufer reacii de respingere este corneea). Cele mai severe manifestri se datoreaz tot sistemului ABO, cu activarea complementului, liza eritrocitelor, recrutare de neutrofile i trombocite. ns frecvente sunt i manifestrile datorate incompatibilitii MHC. Alte exemple: - anemia hemolitic dup ataarea de proteinele de suprafa a hematiilor a unor medicamente (penicilin, fenacetin, chinidin etc) i iniierea producerii i cuplrii unor anticorpi de tip IgG. HS de tip II la medicamente se poate produce n 3 modaliti diferite: prin ataarea medicamentului la membranna celular cu producerea ulterioar de Ac (cazul penicilinei, quininei, sulfonamidelor), prin formarea de complexe imune circulante medicament-anticorp care se ataeaz pe membrana celular i prin inducerea producerii de autoanticorpi (alfa metildopa). (Figura nr. 11) - trombocitopenia i tendina la hemoragie dup administrarea de chinin, care se ataeaz de trombocite i stimuleaz producerea de autoanticorpi; - apariia unui sindrom asemntor lupusului eritematos dup administrarea de hidralazin care stimuleaz producerea de autoanticorpi anti-ADN; - anemia hemolitic dup infecii cu Mycoplasma pneumoniae, datorit stimulrii producerii de anticorpi care se fixeaz pe hematii; - cardita reumatismal din reumatismul articular acut (anticorpii fa de streptococul betahemolitic de grup A reacionnd ncruciat cu esutul cardiac); - sindromul Goodpasture (dup apariia de Ac care se fixeaz pe membrana glomerular renal sau la nivel pulmonar, se activeaz C', rezultnd leziuni grave ale membranelor celulare). Studiul mecanismului de producere a HS de tip II a stat la baza imaginrii unor tratamente ce folosesc Ac citotoxici: Trastuzumab (antihuman epidermal growth factor receptor 2) n terapia cancerului de sn; Infliximab (Ac anti-TNF) n boala Crohn; Rituximab (Ac anti-CD20) n limfoamele non-Hodgkin, trombocitopenie autoimun, artrit reumatoid i lupus eritematos sistemic; Alemtuzumab (Ac anti CD25) n leucemii i pentru inducerea imunosupresiei la pacienii ce sufer un transplant de celule stem. 18. 6. Povestire adevrat (Cardita reumatismal, entitate a hipersensibilitii tip II ce nu trebuie subestimat) n urm cu 30-40 de ani, reumatismul articular acut (RAA) (febra reumatic) reprezenta un subiect foarte frecvent dezbtut n publicaiile tiinifice, mai mult chiar dect infarctul miocardic acut, de ex. Atunci existau att de muli copii cu aceast boal, nct spitale ntregi erau dedicate tratamentului RAA. n prezent, majoritatea medicilor din rile dezvoltate nu au mai vzut cazuri de RAA (profilaxia primar i secundar a atacului reumatismal realizndu-se n mod corespunztor); experiena n rile occidentale este astzi limitat la constatarea prezenei leziunile de valv mitral la pacieni care au fost afectai de RAA n tineree. 242

n rile dezvoltate, populaia cumulat este mai mic de 20% din populaia globului; pentru restul populaiei (peste 80%), RAA i cardita reumatismal continu s reprezinte o problem important. Se estimeaz c la nivel mondial exist 15,6 milioane de persoane cu RAA, n fiecare an apar peste 450.000 de cazuri noi, iar circa 230.000 decese sunt provocate fie de RAA fie de diferitele complicaii ale RAA. Este posibil ca numrul real de cazuri s fie mai mare. O consecin negativ a scderii interesului fa de RAA n rile dezvoltate este reducerea cercetrii n acest domeniu i singurele progrese din ultima jumtate de secol au fost realizate n domeniul tratamentului medical i chirurgical al RAA. Principala modalitate de control al RAA rmne tratamentul corect al faringitelor cu streptococ -hemolitic de grup A i administrarea de injecii cu penicilin retard (varianta depozit cu intervalul cel mai lung ntre 2 administrri poate fi administrat la 3-4 sptmni), de-a lungul unei perioade lungi de timp, la persoanele cu o istorie de RAA pentru a preveni episoadele recurente (profilaxie secundar). Ambele strategii au fost publicate nc din anii 50, n SUA. n prezent se ncearc i obinerea unui vaccin, pentru profilaxie primar (se estimeaz c n 10-20 ani va putea fi obinut un vaccin sigur i eficient). n lipsa unor cercetri realizate n rile dezvoltate, se ncearc obinerea unor date n statele n care RAA are o frecven crescut. Spre exemplu, studii realizate n Mozambic, Cambodgia, Frana i Australia, au demonstrat utilitatea ecocardiografiei n detectarea pacienilor cu boal cardiac reumatic (copii cu vrst colar), detectndu-se astfel cu 90% mai multe cazuri dect prin metoda clasic, de diagnostic clinic. S-a descoperit c 2-3% dintre copii cu vrst colar din Cambodgia i Mozambic sufereau de boal cardiac reumatic, majoritatea nefiind diagnosticai n cursul acestui studiu. Aceste date confirm faptul c RAA i cardita reumatismal au o suficient de mare importan pentru a atrage atenia publicului internaional i a comunitilor de cercetare.

18. 6. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Printre rolurile hipersensibilitii de tip II se numr: a). distrugerea bacteriilor extracelulare i intracelulare b). eliminarea celulelor infectate cu virusuri c). distrugerea unor parazii sau fungi d). toate cele de mai sus ntrebarea 2 Care dintre urmtoarele afirmaii este incorect? a). n HS de tip II limfocitele Tc cu efect litic fa de celulele infectate viral. b). n HS de tip II sunt utilizate att mecanismele imunitii naturale (implicnd PMN, macrofage, celule NK) ct i ale imunitii specifice. c). Imunitatea specific presupune, printre altele, formarea de Ac care vor forma ulterior complexe imune circulante. d). Complexele imune circulante sunt rapid epurate din organism, ele neavnd posibilitatea de a se depune la nivelul esuturilor.

243

18. 7. Hipersensibilitatea de tip III (prin complexe imune circulante) Fenomene experimentale Patologia uman HS de tip III se poate datora: - unei infecii persistente (ex. lepr, malarie, hepatit viral, endocardit stafilococic); - unei boli autoimune (ex. artrit reumatoid, lupus eritematos sistemic, polimiozit); - inhalrii de material antigenic (ex. actinomicete n cazul plmnului de fermier, antigene aviare n cazul plmnul cresctorilor de psri). Complexele imune activeaz o serie de ci ale rspunsului imun. Aminele vasoactive eliberate n cadrul activrii acestor ci determin retracia celulelor endoteliale, ceea ce are ca efect creterea permeabilitii vasculare, depunerea complexelor imune, dar i expunerea colagenului, care va stimula agregarea trombocitelor i formarea de microtrombi. Se intr ntr-un cerc vicios deoarece complexele imune depuse pe membrana bazal continu s genereze C3a i C5a (anafilatoxine). Astfel, complementul, iniial cu rol protectiv, determin ulterior creterea suplimentar a permeabilitii capilare. Polimorfonuclearele sunt atrase i i exociteaz coninutul n loc s endociteze complexele imune (acestea nu pot fi desprinse de pe membrana bazal vascular). Enzimele inhibitoare serice mpiedic enzimele lizozomale s acioneze la nivel sistemic, ns nu i local, de aceea se vor genera leziuni tisulare locale. Eritrocitele primatelor conin receptori pentru C3b, importani pentru preluarea complexelor imune i transportul lor ctre splina i ficat, unde vor fi fagocitate. n HS de tip III, sistemul este suprasaturat, ceea ce i scade eficiena. Complementul menine complexele Ag-Ac solubile pe calea clasic i resolubilizeaz complexele Ag-Ac agregate pe calea altern, de aici putndu-se deduce rolul depleiei de componente ale complementului sau a unor boli ereditare (deficit C2) n patologia HS de tip III. Este important i dimensiunea complexelor imune. Cele mari sunt repede preluate de ficat i eliminate, n timp ce complexele mici rmn n circulaie o perioad mai lung de timp. Un defect genetic ce determin sinteza de Ac cu afinitate joas, va favoriza producerea de complexe Ag-Ac mici i deci, leziunile caracteristice HS de tip III. Depunerea complexelor imune Administrarea de metilsergida sau clorfenilamina (antagoniti ai aminelor vasoactive) reduce considerabil depunerea complexelor imune prin scderea permeabilitii vasculare. Depunerea complexelor mai este dependent de regimul presional crescut i de prezena turbulenelor. n capilarele glomerulare presiunea sngelui este de 4 ori mai mare dect n restul capilarelor. Turbulene se ntlnesc n zonele de bifurcaie a arterelor i n zonele de filtru vascular (plexurile coroide i corpii ciliari). Preferina pentru un esut sau altul poate fi dependent de sarcina electric a complexului imun, de gradul de glicozilare a Ac. Fenomene experimentale Reacia Arthus a fost descris n 1903 de Maurice Arthus i Nicholas Breton, dup injectarea subcutanat de ser de cal la un iepure hiperimunizat. Leziunile au fost maxime dup aproximativ 6 ore. Boala seric acut, descris n 1911 de von Pirquet, a fost studiat din nou n anii 1960, descriindu-se zece modele de glomerulonefrite experimentale (Dixon). Deoarece complexele imune circulante (CIC) se depoziteaz n esuturi, apare conceptul de antigen in situ. Dup ce complexul imun se formeaz n locul respectiv sau este fixat secundar, se iniiaz (aa cum am menionat anterior) o cascad de evenimente: activarea complementului i a factorilor anafilactoizi chimiotactici C3a i C5a; afluxul de neutrofile, care produc leziuni prin enzimele lizozomale i 244

afluxul de trombocite, cu generarea fenomenelor de tromboz. Fenomenul Arthus a fost observat la iepure, cobai, oarece etc, dar i la om. Experimentul a fost efectuat pe iepure prin injectarea de antigen netoxic (ex. albumin) de la alt specie, asociat cu un adjuvant imun. Dup unele rapeluri, necesare uneori pentru obinerea de anticorpi circulani IgG precipitani, reacia Arthus poate fi obinut prin injectarea subcutanat a antigenului. Manifestrile apar dup 2 ore, atingnd maximum la 6 ore i dispar dup 24-48 ore. Constau n edem, eritem indurat, peteii i uneori purpur necrotic sau chiar necroz. Leziunile de la locul injectrii antigenului duc la fixarea de igG i C3b cu sediul perivascular sau n peretele vascular. Boala serului a) Boala serului acut. naintea erei antibioticelor, multe boli infecioase erau tratate prin injectarea de ser de cal hiperimunizat. n 1911, von Pirquet descrie complicaiile acestei terapii sub termenul de boal seric (febr, artralgii, vasculit cutanat), survenit la unii bolnavi dup 8-12 zile de la prima injecie. Injectarea unic, pe cale intravenoas, a unei substane netoxice, ca serumalbumina bovin (BSA), n cantitate mare, la animalul neimunizat (iepure), este urmat de apariia bolii serice acute (experimental) cu 3 faze: 1. faza anterioar imunizrii (dureaz 5-8 zile. BSA marcat radioactiv, scade, iniial brutal prin difuziune n spaiile extravasculare, apoi dup 24 de ore, lent, corespunztor propriului catabolism); 2. faza complexelor imune (corespunde prezenei concomitente de BSA i a anticorpilor anti-BSA); este boala seric cu glomerulonefrit. n jurul zilei a 5-a, concentraia sangvin de BSA scade rapid. Anticorpii anti-BSA liberi nu sunt decelabili dect dup dispariia BSA liber. Detectarea complexelor imune corespunde acestei perioade, ca i scderea complementului seric. Manifestrile patologice nu sunt datorate anticorpilor antiBSA liberi i nici complexelor imune circulante. Ca i n reacia Arthus, leziunile sunt datorate aciunii complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile. La animalul fr complement apare o simpl albuminurie fr glomerulonefrit); 3. faza de restitutio ad integrum (nu mai exist antigen liber sau conjugat decelabil; anticorpii anti-BSA sunt crescui; manifestrile clinice, n special glomerulonefrita, regreseaz rapid). b) Boala seric cronic. Este dificil de reprodus la animal. Totui administrarea repetat a antigenului (din 2 n 2 zile), permite producerea unei glomerulonefrite cronice extramembranare proliferante. Patologia uman Principalele afeciuni umane sunt: bolile comparabile cu reacia Arthus (n care antigenul induce o reacie local prin difuziunea anticorpilor IgG precipitani); un exemplu este boala plmnului de fermier [dup contactul n timpul zilei cu fnul mucegit (Actinomyces thermophylus), apare la nceputul nopii (dup 6 ore) o stare de asfixie care dispare n urmtoarele ore]; manifestri mai generale, cu atingerea rinichiului, articulaiilor, pielii i uneori a creierului; apar leziuni de tipul glomerulonefritei extramembranare, uneori proliferative. Afeciunile mai frecvente sunt lupusul eritematos diseminat, crioglobulinemia mixt, glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice etc. n 2/3 din cazurile de anemie hemolitic imuno-alergic medicamentoas se formeaz anticorpi IgM anti-medicament. n aceste cazuri apar adesea manifestri generale: febr, frison, mialgii cu dureri lombare i uneori anurie tranzitorie, prin necroz tubular acut.

18. 8. Povestiri adevrate Vasculit necrozant aparut n cadrul glomerulonefritei difuze postinfecioas Vor fi prezentate dou cazuri de glomerulonefrit i evoluia lor clinic i anatomopatologic. Biopsiile efectuate au evideniat aspectul de glomerulonefrit difuz acut postinfecioas, 245

asociat cu necroz fibrinoid i infiltrat inflamator leucocitar n peretele arteriolelor i arterelor interlobulare. Au fost observate proliferri celulare. n ambele cazuri a aprut insuficiena renal acut (IRA) sever (n cazul celui de al doilea, evoluia a fost nefast, spre deces). Primul caz Un copil de sex masculin, 11 ani, a fost internat n spitalul din oraul de reedin. Motivele internrii au fost reprezentate de inapeten, edem facial, diaree, vom i hematurie macroscopic, constatate n ultimele 2 zile. La internare s-a constatat c pacientul era febril (38C) i prezenta hipertensiune arterial (TA = 220/120 mmHg). Dup o sptmn, n timpul internrii, a aprut oligurie i a fost trimis la un spital de un nivel superior. A evoluat spre anurie i a necesitat dializ peritoneal. Dup 4 sptmni de la internare, anuria a continuat s persiste, asociindu-se cu episoade de vom; TA a putut fi controlat medicamentos. A fost transferat la spital de nivel superior. Examenul clinic la internare a artat o stare general relativ bun, edem prezent n ptrimea distal la nivelul membrelor inferioare, greutate = 78,4 kg, nlime = 157 cm, TA = 100/70 mmHg, 26 respiraii/minut, 76 bti cardiace/minut. A fost meninut n dializ peritoneal continu. Rezultatele analizelor de laborator la aceast internare au fost urmtoarele: hematocrit 28%, hemoglobin 9,2 g / dl, proteine totale 8,2 g%, albumin 2,9 g%, Na = 138 mEq/l, K = 4,3 mEq/l, Ca = 8,4 mg%, P = 8,6 mg%, Mg = 1,5 mg%, uree = 172 mg%, creatinin = 18,3 mg%; factor antinuclear negativ. Ecografia renal a fost n limite normale pentru vrsta lui. Datorit prezenei vrsturilor, s-a indicat efectuarea endoscopiei digestive (n a doua zi de la ultima internare), evideniindu-se hernie hiatal i duodenit (la examenul microbiologic nu s-a identificat H. pylori). A primit tratament cu domperidon i omeprazol, n urma cruia greaa i vrsturile au disprut. n a 5-a zi de la internare s-a efectuat o biopsie renal, iar diagnosticul a fost: glomerulonefrit proliferativ difuz endocapilar exsudativ, cu 17% proliferri celulare. La examenul n imunofluorescen s-au observat depozite granulare difuze de C3 n structura capilarelor i arteriolelor. Prin examenul cu ajutorul microscopului electronic s-au observat depozite electronodense mezangiale, subendoteliale i subepiteliale. n ziua a 14-a de la internare s-a iniiat tratament (puls-terapie / doze mari administrate pentru perioade scurte) cu metilprednisolon 1g i.v. i prednison, pe cale oral, 40 mg/zi. Dup a 3-a zi de corticoterapie s-a continuat cu prednison 40 mg/zi. n a 20-a zi de internare, datorit unei HTA acut, pacientul a primit propanolol i minoxidil. Abia din a 26-a zi de internare, pacientul a prezentat diurez de 10 ml/zi, iar dup nc trei zile diureza a ajuns la 120 ml/zi (cu hematurie macroscopic). Rezultatul analizelor de laborator n a 4-a sptmn de la ultima internare au fost: uree = 80 mg%, creatinin = 3,5 mg% (o valoare nc foarte mare, dar de circa 5 ori mai mic dect n momentul internrii), clearance-ul creatininei = 13ml /min /1,73 m2 (suprafaa corporal), ASLO = 974 UI/ml, C3 = 48,4 mg% (Normal = 0,5 - 1,5 mg%). n a 29-a zi de la internare diureza a ajuns la de 900 ml iar TA era fost inut sub control. n aceste condiii, pacientul a fost externat, i s-a recomandat s revin la control, sptmnal. Dup nc dou sptmni diureza s-a meninut la de 900-1000 ml/zi, valoarea pentru uree a fost de 50 mg% iar pentru creatinin de 2,1 mg%; nu a mai fost necesar dializa, dar s -a meninut tratamentul antihipertensiv. Al doilea caz O pacient de sex feminin, n vrst de 66 ani, a fost internat n spitalul Facultii de Medicin din localitatea de reedin. Motivele internrii au fost reprezentate de: anorexie, diurez sczut i hematurie macroscopic. La internare s-a vzut c pacienta este apatic i prezint tuse cu expectoraie spumoas. 246

Prin anamnez s-a aflat c n urm cu circa o lun, pacienta a fcut o infecie orofaringian, pentru care a primit tetraciclin. Examenul clinic la internare a relevat o stare general bun, absena temperaturii, greutate = 63 kg, nlime = 147 cm, TA = 140/80 mmHg, 80 bti cardiace / minut, 20 respiraii / minut, jugulare turgescente, raluri ronflante la nivelul bazelor pulmonare, ficat palpabil la 5cm sub rebordul costal. Au fost nregistrate urmtoarele valori pentru analizele de laborator efectuate: hematocrit 40,2%, hemoglobin 13,5 g/dl, numr leucocite = 15.600/mm3. Examenul de urin a artat o densitate de 1025, pH = 5, proteinurie = 4+, fr glicozurie, hematurie = 3+, hemoglobinurie = 3+, leucocite, hematii i cilindri numeroi n sedimentul urinar iar urocultura a fost negativ. Dup 12 ore de la internare, proteinuria a crescut. Iar celelalte analize de laborator au avut urmtoarele rezultate: proteine totale = 6,4 g%, albumin = 3,6 g%, globuline = 2,8 g%, glicemie = 156 mg%, Na = 136 mEq/l, K = 4 mEq/l, Ca = 10 mg%, P = 8,2 mg%, acid uric = 10,6 mg%, uree = 174 mg%, creatinin = 1,84 mg%, proteina C reactiv = 100 mg%, C3 = 8,3 mg% (Normal = 0,5 1,5 mg%), C4 = 42,9 mg% (Normal = 400-500 g/ml), ASLO = 833 UI/ml. Factorul anti-nuclear a fost absent. Examenul ecografic renal a fost n limite normale. Funcia renal s-a deteriorat progresiv, i n aceste condiii, la 20 de zile de la internare, ureea a ajuns la valoarea de 223 mg%, creatinina la valoarea de 8,3 mg%, clearance-ul creatininei la 5,34 ml/min, iar proteinuria la 3,9 g/24 h. S-a efectuat o biopsie renal care a evideniat o glomerulonefrit proliferativ difuz endocapilar exsudativ, cu necroz tubular acut (25% proliferri celulare). La imunofluorescen s-au observat depozite granulare difuze de C3 n capilare i mezangiul arteriolelor. Prin ME s-au observat depozite voluminoase mezangiale i subepiteliale. n acest context s-a pus diagnosticul de glomerulonefrit acut post-infecioas. Pacienta a primit un tratament n urma cruia funcia renal s-a ameliorat progresiv, iar la 6 zile ureea a ajuns la valoarea de 122 mg%, creatinina = 2,85 mg% i clearance-ul creatininei = 14 ml/min, moment n care a fost externat (la cerere). Dup aproximativ dou sptmni, pacienta a revenit, iar la acel moment valoarea diurezei era sczut, prezenta proteinurie = 9,2 g/24 h, uree = 180 mg%, creatinin = 3,17 mg, clearance-ul creatininei = 9 ml/min; din punct de vedere clinic pacienta era dispneic i prezenta fatigabilitate intens. A doua biopsie a demonstrat nrutirea tabloului anterior, cu 80% proliferri celulare i 42% scleroz glomerular i necroz fibrinoid pe arterele mici, cu depozite de C1q, C3, IgG i fibrin. Pacienta a evoluat foarte rapid ctre IRA. Dup 3 sptmni s-a nceput dializa. Dup 9 sptmni, a prezentat erizipel la membrul inferior drept i oc septic, urmat de deces.

18. 9. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Este corect afirmaia: a). Pentru HS de tip III apare conceptul de Ac in situ b). Complexul imun se formeaz n esuturi sau este fixat secundar c). Reacia Arthus a fost descris dup injectarea subcutanat de ser de iepure la un cal hiperimunizat. 247

d). Boala seric se caracterizeaz prin febr, artralgii, vasculit cutanat survenit imediat dup injectarea de ser de cal hiperimunizat ntrebarea 2 Care dintre urmtoarele nu este faz a bolii serice acute? a). faza leziunilor vasculare b). faza anterioar imunizrii c). faza de restitutio ad integrum d). faza complexelor imune ntrebarea 3 Urmtoarea afirmaie leziunile sunt datorate aciunii complementului, care este urmat de un aflux de neutrofile este valabil: a). pentru reacia Arthus b). pentru boala serului c). att pentru reacia Arthus ct i pentru boala serului d). pentru nici una dintre ele. ntrebarea 4 Printre principalele afeciuni umane datorate HS de tip III nu se numr: a). boala plmnului de fermier b). lupusul eritematos diseminat c). cardita reumatismal d). glomerulonefritele i periarteritele poststreptococice. ntrebarea 5 Depunerea complexelor imune este dependent de: a). permeabilitatea presional b). regimul presional crescut c). prezena turbulenelor d). nici una dintre meniunile de mai sus e). primele 3 afirmaii sunt corecte.

18. 10. Hipersensibilitatea de tip IV (ntrziat, mediat celular) Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie (mai) ntrziat, care apare la 48-72 de ore dup contactul cu antigenul i se datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului. HS de tip IV este un tip exagerat de rspuns imun celular. HS de tip IV poate fi considerat ca un martor al mecanismelor protective fa de germenii intracelulari dar i de alte substane chimice care se leag puternic de membrana celular. Totui, corelaia protecie-hipersensibiltate nu e perfect, n sensul c se poate ca un pacient cu HS de tip IV la un anumit germen s dezvolte infecii progresive cu acel patogen (ex. situaia din infeciile cu M. leprae). Au fost descrise patru tipuri diferite de hipersensibilitate (de tip IV), dintre care ultimele trei sunt importante n patologia uman. 248

- Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote (nu are echivalent la om); - Hipersensibilitatea de contact Este o reacie epidermic, care corespunde la om cu eczema de contact / dermatita de contact. n experimentele pe animal se plaseaz pe piele diferite antigene, care penetreaz uor n epiderm i se leag solid de celule. Cel mai frecvent se utilizeaz DNCB (dinitroclorbenzen), DNFB (dinitrofluorbenzen), Oxazolina sau Clorura de picryl. DNCB este un exemplu de hapten care sensibilizeaz aproape toi contacii, i pe care o putem folosi ca s stimulm imunitatea mediat celular. Un rol important n sensibilizare l joac keratinocitele i celulele Langerhans. Reacia de hipersensibilitate de contact survine dup ce animalul a fost sensibilizat n prealabil. Dup o injecie ulterioar intradermic sau dup aplicarea antigenului pe tegument, urmeaz legarea haptenei de un carrier, complexul antigenic este fagocitat de o celul Langerhans care se va activa, matura i i va ncepe migrarea spre zona paracortical a nodulilor limfactici sub aciunea IL-1 i TNF secretai de keratinocitele agresate. Corespunde unei infiltrri dermice i epidermice, edemului epidermic i eritemului aprut dup 48-72 ore, care va persista cteva zile. Absena reaciei se datoreaz unui deficit imun celular. Sensibilizarea prealabil cu DNCB (ex. la fotografii) poate declana un oc anafilactic la IgE. Primele modificri apar ncepnd cu a 6-a pn la a 8-a or dup contactul cu alergenul; LT activate i cele cu memorie vor ajunge n circulatie i ulterior n zona inflamat, alturi de monocite, unde vor ndeprta complexul hapten-carrier. Ele nconjoar vasele sanguine, glandele sudoripare, glandele sebacee, foliculii piloi i infiltreaz epidermul. Infiltratul celular se accentueaz progresiv i ajunge maxim spre a 72-a or. Infiltratul conine celule T CD4+ (n majoritate), T CD8+, celule Langerhans, macrofage i bazofile. Aceleai keratinocite, dar i macrofagele, vor produce ulterior PGE, cu rol inhibitor al reaciei inflamatorii. LTs intervin de asemenea n terminarea reaciei de HS (la fel ca i ultravioletele), prin scderea producerii de IL-1. Ultravioletele inhib direct i celulele Langerhans. n concluzie, fenomenele apar n urmtoarea succesiune: celulele Langherhans activeaz LT CD4+ cu memorie; acestea produc diferite citokine: IL-2, IL-3, IFN-g i GM-CSF. Celelalte celule sunt recrutate i activeaz o reacie inflamatorie n care predomin celulele mononucleare. - Hipersensibilitatea de tip tuberculinic (Figura nr. 12) Persoanele infectate cu unul din germenii (M. tuberculosis, M. leprae, Leishmania tropica etc.) / sau care vin n contact cu substanele chimice (beriliu, zirconiu etc.) care pot provoca hipersensibilitatea de tip tuberculinic au LT deja activate. n laborator, pentru sensibilizare se injecteaz la un animal Ag mpreun cu adjuvantul complet Freund (pregtirea animalului prin imunodepresie cu ciclofosfamid permite i utilizarea adjuvantului Freund incomplet). Aceast faz de sensibilizare ncepe cu 2-3 sptmni nainte de testarea HS. Dup injectarea antigenului la animalul sensibilizat, LT specific sensibilizate migreaz n jurul vaselor sanguine (la 12 ore) iar activarea lor duce la secreia de interleukine care recruteaz alte celule nesensibilizate. Infiltratul desparte fibrele de colagen din derm i atinge un maxim la 48 72 ore dup injecie. Celulele observateiniial sunt LT [predomin T CD4+ (raport CD4/CD8 2/1)], ulterior ncep s se acumuleze macrofagele (atingnd un maxim spre finalul celei de a treia zi de la inoculare). Fenomenele sunt maxime la nivelul dermului dar pot atinge i epidermul; keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR (la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei), circulaia aferent i eferent a celulelor imunocompetente seamn cu cea observat n hipersensibilitatea de contact; se poate observa o infiltrare uoar cu bazofile; n timp se poate dezvolta o reacie granulomatoas. La om se practic intradermoreacia cu tuberculin (PPD, derivat proteic purificat, un amestec relativ bine standardizat de antigene proteice mycobacteriene). Citirea rezultatului se face dup 249

72 ore, asigurnd o bun iluminare a zonei examinate (de preferat lumina natural). Se identific existena unei eventuale arii intens eritemato-violacee, circumscriind urma nepturii dermice. Apoi se apreciaz tactil (prin repetate micri ntr-un sens i altul deasupra zonei de reacie) cu pulpa inelarului, limitele unei zone de induraie (perceput ca fiind reliefat) i care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat. Se msoar i se nregistreaz diametrul maxim al zonei de infiltraie (a se vedea i anexa nr. 3). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n 5-7 zile; persistena acestora face ca leziunea s se transforme dintr-una tuberculinic ntr-una granulomatoas. - Hipersensibilitatea granulomatoas Este o form mai grav de hipersensibilitate (ntrziat) de tip IV care survine atunci cnd antigenul persist i nu poate fi eliminat. Se caracterizeaz printr-o acumulare i o proliferare de macrofage, care stau la originea granulomului care apare la 21-28 zile dup sensibilizare i poate s persiste mai multe sptmni. Hipersensibilitatea granulomatoas poate succeda diferite hipersensibiliti ntrziate precedente, n general dup o perioad de 3 - 4 sptmni. Elementul distinctiv al hipersensibilitii granulomatoase este formarea de celule epiteloide, celulele derivate din macrofage, de dimensiuni mari pe seama dezvoltarii reticulului endoplasmatic, cu rolul lor de a ntreine inflamaia prin secreia continu de TNF. Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame, ns nici nu se apr eficient mpotriva tuberculozei, leprei, leishmaniozei, schistosomiazei etc. Prin fuziunea celulelor epiteloide rezult celule gigante. Mai sunt denumite i celule Langhans. Atenie, sunt diferite de celulele Langerhans! Aceste celule gigante au mai muli nuclei, ns periferici, reticulul endoplasmic este puin dezvoltat, iar mitocondriile i lizozomii sunt n degradare. Se pare ca aceste celule Langhans ar reprezenta etapa final din diferenierea macrofagelor. Reaciile de hipersensibilitate de tip IV observate n patologia uman pot fi observate n trei grupe principale de afeciuni: 1. Eczema de contact care poate aprea datorit bijuteriilor care conin nichel, produselor din piele de animal, produselor cu sruri de crom, cremelor solare, compuilor chimici de cauciuc, produselor farmaceutice (penicilin, streptomicin, neomicin) etc; 2. Maladii infecioase n care agenii patogeni se dezvolt intracelular (tuberculoz, lepr, leishmanioz, listerioz, micoze profunde etc); n cazul M. tuberculosis, leziunea granulomatoas conine pe lng macrofage, celule epiteloide, celule gigante i LT dispuse centrifug, i o zon de necroz central, un fel de puroi numit cazeum. n jurul ntregului ansamblu se afl o zon de fibroz i o cantitate crescut de colagen. n cazul M. leprae, reacia granulomatoas se numete reacia Mitsuda. Apariia de leziuni la injectarea de antigene splenice de la un alt pacient cu sarcoidoz unei alte persoane cu sarcoidoz, constituie pozitivarea testului Kweim. 3. Alte maladii (sarcoidoz ciroz biliar primitiv, hepatitele cronice virale B i C, SIDA, infecia HIV, poliartrita reumatoid, reumatismul articular acut, b. Crohn etc).

18. 11. Povestire adevrat Un tuberculom, o tumor malign sau sarcoidoz? Tuberculoza sistemului nervos central se poate prezenta ca meningit tuberculoas, sub form de tuberculoame sau, rareori, sub form de abcese. Examenul clinic este de obicei nespecific, n faza acut putnd sugera o tumor malign (25-85% dintre pacieni sunt asimptomatici). Localizrile extracerebrale trebuie investigate sistematic. 250

Cazul prezentat este cel al unui pacient de sex masculin, n vrst de 53 de ani, internat pentru slbiciune muscular la nivelul membrelor inferioare, cu deficit proprioceptiv. Investigaiile de laborator au fost n limite normale, iar testul HIV a fost negativ. Examenul tomografic (CT) cranian a revelat o leziune masiv n lobul parietofrontal drept, cu zone omogene perilezionale relativ sugestive pentru un proces malign (cancer) cu localizare cerebral; examenul RMN a confirmat existena i dimensiunile leziunii. Datorit simptomatologiei i valorilor crescute ale reactanilor de faz acut, s-a nceput terapia cu corticosteroizi, pacientul prezentnd o remisie a simptomelor. S-a efectuat biopsie din zona afectat, histologic descoperindu-se leziuni foliculare cu celule epitelioide dar fr necroz. S-au realizat frotiuri colorate Gram, Ziehl-Neelsen i PAS; nu au fost evideniate microorganisme iar decizia a fost de a nu se trimite produsele recoltate spre laboratorul de bacteriologie. Pentru a se elucida motivul apariiei acestei leziuni, au fost realizate i o serie de investigaii extracerebrale (CT toraco-abdominal, lavaj bronhoalveolar i bronhoscopie) fr a se obine date suplimentare pentru un diagnostic pozitiv. n aceste condiii, medicul curant a pus diagnosticul de sarcoidoz localizat la nivelul SNC iar pacientul a fost externat, continund la domiciliu tratamentul cu corticosteroizi, conform scrisorii medicale eliberat n spital. Dup 2 luni brbatul a fost reinternat cu deficiene motorii i febr (38,2C). S-a indicat din nou examen CT; rezultatul nu a permis explicarea simptomatologiei. Recoltndu-se produse din mai multe zone, examenul bacteriologic, complet, a permis punerea diagnosticului de tuberculoz diseminat. S-a continuat tratamentul cortizonic, dar s-a nceput tratamentul anti-tuberculos cu o asociere de 4 medicamente (izoniazid, rifampicin, pirazinamid i etambutol). Dup 4 luni simptomele au reaprut i s-a luat decizia interveniei chirurgicale, pentru excizia formaiunii. Analiza anatomo-patologic a pus n eviden structura tipic pentru granulomul tuberculos (ceea ce prin biopsia oarb efectuat cu cteva luni nainte, nu s-a reuit). Tratamentul a continuat, dar a fost adugat amikacina, penta-terapia anti-TB realizndu-se pentru o durat de 6 luni. Pacientul nu a prezentat reacii adverse. Dup un an, au fost scoase din asocierea medicamentoas 3 medicamente iar pacientul a primit pentru nc 6 luni (durata total a tratamentului anti-TB a fost de 18 luni) numai izoniazid i rifampicin. Discuii Tuberculoza cerebral are o rat de mortalitate care variaz ntre 5 i 60%. Tratamentul de elecie este cel medicamentos, cu o durat de circa 18 luni, pn la dispariia leziunilor sau pn la calcificarea acestora. O cretere paradoxal n dimensiuni a leziunii, sub tratament, poate duce la recomandarea interveniei chirurgicale de excizie a tuberculomului, aa cum s-a ntmplat i n aceast situaie.

18. 12. Verificai-v cunotinele Alegei rspunsul corect. ntrebarea 1 Alegei rspunsul greit: a). HS de tip IV reprezint o reacie imediat; b). HS de tip IV apare la 48-72 de ore dup contactul cu antigenul; c). HS de tip IVse datoreaz limfocitelor Th1 specifice antigenului; d). HS tip Jones-Motenu are echivalent la om;

251

ntrebarea 2 Alegeti dintre urmtoarele afirmaii adevrate pe cea care nu se potrivete n context (ca sens de desfurare a reaciilor imune): a). Ultravioletele inhib direct celulele Langerhans, care au un rol important n sensibilizare b). Persoanele cu deficit de IFN nu dezvolt granuloame c). Absena reaciei epidermice la contactul tegumentului cu DCNB se datoreaz unui deficit imun celular d). Keratinocitele exprim la suprafaa lor molecule HLA DR la 48-96 de ore dup apariia infiltratului limfocitar, fapt care va amplifica rspunsul imun al gazdei ntrebarea 3 Alegei varianta care se potrivete pentru spaiile libere din urmtoarea afirmaie: Intradermoreacia la .................... presupune apariia unei eventuale arii intens..................., circumscriind urma nepturii dermice, ...................... si reliefate, care corespunde histopatologic infiltraiei dermice (edem, limfocite, macrofage, PMN), reprezentnd rspunsul imun fa de antigenul injectat a). tuberculin; eritemato-violacee, indurate b). bacil Koch; eritemato-violacee; indurate c). tuberculin; cianotice; retractile d). bacil Koch; cianotice; indurate ntrebarea 4 (avei de stabilit asocierea corect) 1). Leziunile dezvoltate la injectarea intradermic de tuberculin se rezolv n mod normal n........... 2). Citirea rezultatului se face dup........... 3). Hipersensibilitatea de tip IV reprezint o reacie ntrziat, care apare la............... a). 5-7 zile b). 48-72 ore c). 72 ore Care este asocierea corect? a). 1-a; 2-b; 3-c b). 1-c; 2-b; 3-a c). 1-a; 2-c; 3-b d). 1-b; 2-a; 3-c ntrebarea 5 Care dintre urmtoarele tipuri de HS de tip IV nu are echivalent la om? a). Hipersensibilitatea tuberculinic b).Hipersensibilitatea de tip Jones-Mote; c). Hipersensibilitatea de contact d). Hipersensibilitatea granulomatoas

18. 14. Hipersensibilitatea de tip V n cadrul acestui tip de reacie fiziopatologic, anticorpii nu se ataeaz de structurile celulare de suprafa ci de receptori membranari, mpiedic aderarea liganzilor specifici acelor receptori (mimeaz efectul ligandului). n aceste condiii, semnalizarea celular este compromis, iar funcia celulei respective este alterat sau inhibat. Acest tip de HS este ntlnit n boala Graves (Basedow) i miastenia gravis. 252

Boala Graves, o afeciune a glandei tiroide (gu exoftalmic, tegument cu aspect de coaj de portocal, hipertiroidism) a fost considerat o boal autoimun, n care organismul produce autoanticorpi anti-receptor pentru hormonul tireotrop (TSH) i autoanticorpi anti-tiroxin i anti-tireoglobulin (mecanismul nu a fost elucidat complet). Celulele foliculare tiroidiene (prezint pe suprafa receptori pentru TSH), sunt stimulate att fiziologic de ctre hormonul hipozar, ct i patologic, de ctre autoanticorpii (de tip IgG) care imit structura i funciile TSH. Aceast dubl stimulare conduce la o hipersecreie de hormoni tiroidieni (T3 i T4), putnd provoca tireotoxicoz. Simptomele din hipertiroidism pot fi, parial, explicate de ctre aceste mecanisme. De exemplu, exoftalmia poate fi explicat prin faptul c att glanda tiroid i muchii externi ai globului ocular prezint un Ag comun care este recunoscut de ctre auto-Ac; rezult un proces inflamator retroocular i protruzia globilor oculari. Aspectul de coaj de portocal al pielii se datoreaz infiltrrii de Ac subcutanat, determinnd un proces inflamator la acest nivel. Miastenia gravis este o boal neuromuscular caracterizat clinic prin hipotonie muscular intermitent (accentuat n efort, ameliorat n repaus) i oboseal muscular. Mecanismul de producere este autoimun, prin blocarea receptorilor de tip N (nicotinic) ai acetilcolinei de ctre auto-Ac circulani, care ajung la nivelul jonciunii musculare post-sinaptice

18. 15. Direcii de cercetare Cititorul care dorete s aprofundeze unele dintre aspectele menionate n acest capitol poate s acceseze informaiile oferite de site-urile de mai jos sau i alte site-uri. http://www.pnas.org/content/107/50/21553.long Un nou ajutor n managementul terapeutic al pacienilor cu anemie Fanconi http://www.biomedcentral.com/1471-2148/10/264 Sistemul nostru imun i infeciile parazitare http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61 Fumatul pasiv al copiilor http://www.biomedcentral.com/1471-2431/10/61 Un exemplu de influen a mediului asupra fenotipului http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S180637132010000300003&lng=en&nrm=iso&tlng=en Pot doze repetate de vaccin BCG s protejeze mpotriva astmului? http://www.jci.org/articles/view/43964 Colagenul endogen-terapeutic? http://www.plosone.org/article/info%3Adoi%2F10.1371%2Fjournal.pone.0011983 Bordetella perttusis pentru inducerea bolilor autoimune n cercetarea fundamental.

253

19. Reacii antigen - anticorp utilizate n microbiologie (Gabriela Loredana Popa, MI Popa)
19. 1. Mecanism general Reacia antigen-anticorp este o reacie ntre un antigen (Ag) i un anticorp (Ac) i const n legarea gruprii determinante de pe suprafaa antigenului (epitop - o proeminen) cu situsul de combinare de pe suprafaa anticorpului (paratop - o adncitur). (Figura nr. 1) Reacia Ag-Ac are 2 proprieti principale, specificitatea i reversibilitatea. Specificitatea se refer la faptul c un antigen nu este recunoscut dect de anticorpii care au fost produi n urma inoculrii respectivului antigen, iar anticorpii nu recunosc dect antigenul fa de care au aprut. Trebuie menionat c specificitatea nu este absolut, ntruct un Ag cu reactivitate ncruciat, poate reaciona cu un Ac format fa de un alt antigen (reacia ncruciat se explic prin aceea c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Reversibilitatea complexului Ag-Ac se datoreaz faptului c legturile necovalente sunt reversibile la cald sau pH acid (<3). Legarea antigenului cu anticorpul este determinat de complementaritatea reciproc dintre conturul suprafeei epitopului i paratopului, care apropie la civa Angstromi gruprile chimice care le alctuiesc, permind stabilirea unor fore intermoleculare ntre epitop i paratop (hidrofobe ntre gruprile nepolare, de atracie electrostatic ntre gruprile ionizate de semn contrar). Iniial are loc cuplarea ntre Ag i Ac rezultnd complexe Ag-Ac mici, solubile, care se pot desface relativ uor. n continuare, datorit existenei mai multor situsuri de legare, complexele Ag-Ac mici se reunesc formnd structuri de dimensiuni mai mari, adevrate reele Ag-Ac, care pot fi evideniate fie direct, fie dup utilizarea unor artificii tehnice (19.4., 19.5). 19. 2. Bazele moleculare ale interaciunii Ag-Ac Reacia dintre antigen (Ag) i anticorp (Ac) necesit interaciunea determinantului antigenic (epitop) cu situsul de combinare al anticorpului (paratop). Factorii care condiioneaz interaciunea Ag-Ac sunt: - complementaritatea structural dintre epitop i paratop (reacia este specific); complementaritatea presupune adaptarea conformaional a celor dou grupri, de tipul cheie n broasc (vezi i 17. 1.); Fiecare anticorp posed, n poriunea Fab, o regiune hipervariabil care const n 3 bucle de legtur ntre pliurile adiacente ale domeniilor variabile de la nivelul lanului greu (VH) i celui uor asociat (VL). Aceste fragmente mai poart denumirea de CDR (complementarity-determining regions) sau fragmente ce determin complementaritatea n reacia cu antigenul. ns ntr-o reacie Ag-Ac, nu doar aminoacizii din CDR interacioneaz cu epitopul, ci i alte poriuni din regiunea variabil, uneori existnd posibilitatea ca o poriune CDR s nici nu fie implicat n reacie. - complementaritatea electrochimic a gruprilor care intr n reacie este o consecin a complementaritii structurale; pentru stabilizarea legturii intr n aciune fore intermoleculare, care sunt legturi necovalente, fore nespecifice cu valoare mic, spre exemplu legturi de hidrogen / energie de legare 3-7 kcal / mol; fore electrostatice (coulombiene sau ionice) / energie de legare 5 kcal / mol; legturi van der Waals / energia de legare 1-2 kcal / mol legturi hidrofobe. Complementaritatea structural sau forele intermoleculare nu sunt suficiente, fiecare n parte, pentru a forma legturi stabile; este necesar ndeplinirea ambelor condiii. Cu ct energia de legare a reactanilor este mai mare, cu att complexele Ag-Ac sunt mai stabile.

254

Fiecare determinant antigenic poate avea o structur liniar lucru posibil pentru orice tip de molecul: protein, carbohidrat, lipid, acid nucleic iar n cazul proteinelor, n plus fa de secvena liniar, un epitop poate fi determinat de conformaia proteinei structura teriar. Astfel se definesc dou tipuri de epitopi: liniari i conformaionali. Pe o protein se pot gsi ambele tipuri de epitopi, crescnd astfel ansele ca aceasta s interacioneze cu paratopul specific. Pe de alt parte, secvenele de aminoacizi cunoscute de anticorpi pot fi ascunse n cadrul proteinei, reacia Ag-Ac neputnd avea loc. Aranjamentul spaial al epitopilor pe o protein poate influena modul de legare a Ac. Astfel c atunci cnd determinanii antigenici se situeaz la o distan net unul fa de cellalt, anticorpii se pot lega fr s se suprapun. Cnd epitopii sunt foarte apropiai, ntre anticorpii specifici apar restricii de natur steric, ajungnd s se suprapun. Legarea unui anticorp de epitop poate conduce, n cazuri mai rare, la modificarea conformaional a unui alt epitop, cu consecine pozitive sau negative asupra reaciei Ag-Ac. Acest efect se numete efect alosteric, iar mecanismul este asemntor celui asociat enzimelor alosterice la care centrul activ se poate modifica dup ce enzima a interacionat cu un cofactor activator sau inhibitor. Interaciunea dintre epitop i paratop este definit de 2 parametri (afinitatea i aviditatea anticorpilor). (Figura nr. 2) Afinitatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop. Afinitatea este rezultanta forelor de atracie i de respingere care mediaz interaciunea celor doi reactani. O interaciune cu afinitate nalt presupune structuri complementare perfecte, n timp ce complementaritatea imperfect a gruprilor reactante determin o afinitate sczut, deoarece forele de atracie sunt active numai pe distane foarte mici i sunt diminuate de forele de respingere. Afinitatea anticorpilor se poate msura prin dializ la echilibru. Afinitatea reprezint caracteristica unei singure perechi Ag-Ac i este definit printr-o constant, (Kd), care relev ct este de uor s despari un complex Ag-Ac n componentele sale. Cnd Kd este sczut, afinitatea este crescut. n serul uman, anticorpii au diferite afniti fa de antigene, lucru determinat n principal de secvenele din CDR. Aviditatea este un parametru al interaciunii Ag-Ac care rezult din multivalena Ag. Cele mai multe Ag posed mai mult dect un epitop. De exemplu, bacteriile, polizaharidele etc, au pe suprafa un numr mare de epitopi repetitivi (antigene multivalente). Ag proteice au epitopi multipli, dar diferii. Antigenele multivalente leag un numr echivalent de molecule de anticorpi. Energia total de legare a epitopilor multipli ai unui Ag, cu paratopii specifici este mult superioar n comparaie cu energia separat a fiecrei interaciuni dintre epitop i paratop. Aviditatea caracterizeaz energia medie de legare a unui Ag multivalent cu Ac specifici i msoar fora rezultant a afinitii dintre epitopii multipli ai unui Ag i paratopii complementari. Complexele Ag-Ac formate de antigenele multivalente sunt stabile, disocierea lor fiind dificil, deoarece este necesar ruperea tuturor legturilor existente. O molecul pentameric de IgM care are afinitate sczut fa de un antigen multivalent, poate s se lege ferm de Ag, reacia avnd aviditate crescut datorit nsumrii interaciunilor de joas afinitate dintre fiecare epitop i paratop. Spre exemplu, lund n considerare ceea ce se ntmpl n cursul RIP i RIS: Anticorpii din clasa IgM, care apar n RIP au afinitate mare i aviditate mic pentru Ag (se cupleaz uor cu epitopul, dar legtura dureaz puin); Anticorpii din clasa IgG, care apar n RIS au afinitate mic, dar aviditate mare pentru Ag (i legturile sunt mult mai stabile).

19. 3. Reacii ncruciate 255

n anumite cazuri pot avea loc reacii ncruciate; un Ag reacioneaz cu un Ac care a fost sintetizat fa de un alt Ag (aceste reacii pot aprea de ex. datorit faptului c anumite Ag posed anumite grupri determinante comune). Spre exemplu, serul imun anti-polizaharid capsular de Streptococcus pneumoniae aglutineaz eritrocitele umane de grup A (cu specificitate antigenic conferit de N-acetil-galactozamin), iar serul imun anti-Escherichia coli aglutineaz eritrocitele umane de grup B (cu specificitate antigenic conferit de galactoz). Persoanele alergice la diferite mncruri sau substane, pot dezvolta foarte uor alte stri de hipersensibilitate la structuri asemntoare.. De exemplu un individ alergic la alune, poate s dezvolte alergie i fa de soia, mazre sau alte semine.

19. 4. Stadiile reaciilor antigen-anticorp Interaciunea primar se datoreaz legrii efective a Ac de Ag i depinde n mod direct de cantitatea i afinitatea Ac. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune primar pot fi puse n eviden prin nefelometrie (reacie de precipitare n mediu lichid n care folosindu-se lumina laser, se pun n eviden complexele Ag-Ac; razele laser sunt dispersate de complexele n soluie i apoi focalizate cu ajutorul unei lentile spre un fotometru; aici se prelucreaz semnalul luminos i pe baza lui se face o curb de determinare a concentraiei complexelor imune). n cazul unora dintre tipurilor de reacii care vor fi discutate n capitolele urmtoare, interaciunea primar nu devine vizibil (complexele Ag-Ac sunt de dimensiuni mici, solubile i se pot desprinde uor). In vivo aceste interaciuni sunt spre exemplu necesare i suficiente n vederea neutralizrii unor exotoxine circulante (difteric, botulinic etc), pentru inhibarea activitii unor bacterii sau virusuri, sau n declanarea unor reacii de hipersensibilitate (ex. n reacia de HS de tip I). Interaciunile secundare apar la circa 30 de minute dup interaciunile primare. Datorit faptului c Ag poate avea mai muli epitopi iar Ac are minim 2 paratopi (minim 2 pentru molecule de anticorpi izolate, precum IgE, IgD, IgG, dar n cazul IgM sunt 10 paratopi molecula stabil de IgM este pentameric, iar n cazul IgA, 4 paratopi, IgA secretorii fiind complexe dimerice) complexele primare mici, solubile, interacioneaz ntre ele formnd complexe secundare, produsul final fiind un complex Ag-Ac ca o reea tridimensional, insolubil, mult mai stabil dect complexele primare. Din punct de vedere diagnostic, reaciile Ag-Ac n care reactanii se afl n interaciune secundar pot fi puse n eviden prin tehnici care vor fi enumerate n finalul acestui capitol i discutate n capitolele urmtoare. In vivo, manifestrile interaciunilor secundare sunt dependente de natura reactanilor i de condiiile de reacie. Interaciunile teriare definesc manifestrile in vivo ale reaciilor Ag-Ac i depind n special de anumite variabile care sunt caracteristice gazdei. Interaciunile teriare pot conduce la un rezultat pozitiv (protecia gazdei) sau negativ (degradare tisular).

19. 5. Tipuri de reacii Ag-Ac n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, dup cum urmeaz: reacii de precipitare o pot avea loc n gel (imunodifuzia radial simpl Mancini, dubla difuzie Ouchterlony etc) sau o pot avea loc n mediu lichid (reacia Ramon, Ascoli etc.) reacii de aglutinare 256

o o o o o o o o o o o

se pot folosi n diagnosticul bacteriologic (ex. reacia Huddleson) sau se pot folosi n diagnosticul serologic (ex. reacia Wright) reacia de fixare a complementului (RFC) n diagnosticul serologic al sifilisului (RBV Reacia Bordet-Wasserman), leptospirozei etc. n diagnosticul serologic al infeciilor virale etc. reacii de seroneutralizare reacia ASLO (n diagnosticul serologic al infeciilor streptococice) testul plcilor semineutralizate diferite intradermoreacii cu mecanism imun umoral etc. reacii n care componentele sunt marcate izotopic (radio immunoassay, RIA) enzimatic (enyzme-linked immunoassay, ELISA) fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA) chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA).

19. 6. Povestire adevrat

Utilizarea ASLO n diagnosticul infeciilor aparatului locomotor Dintre patologiile infecioase n ansamblu, infeciile aparatului locomotor sunt printre cele mai mortale i mai greu de ngrijit. Un rspuns terapeutic satisfctor depinde de abordarea multidisciplinar a afeciunii: chirurgia trebuie coroborat cu diagnosticul microbiologic corect executat. n general exist tendina de a se instaura un tratament antibiotic empiric fr un diagnostic de laborator prealabil, iar dac tratamentul nu se arat eficient, se va aborda un altul, tot empiric, cu un spectru mai larg. Administrarea antibioticului conform antibiogramei ar fi soluia cea mai buna i cea mai ieftin, dar frecvent nu se recurge la ea. Marea majoritate a infeciilor aparatului locomotor sunt produse de stafilococi (osteomielite, fasciite, miozite etc.), nsa un procent de pn la 7% au ca etiologie streptococii. ntr-un studiu retrospectiv la un spital din Geneva, a fost analizat un grup de pacieni cu infecii musculoscheletale dovedite clinic prin culturi i crora li s-a msurat i titrul ASLO n dinamic n timpul internrii. Doar 5 dintre cei 21 de pacieni urmrii aveau titrul ASLO crescut, iar agenii patogeni identificai la aceti pacieni au fost: S. pyogenes si streptococi -hemolitici din grupurile C i G. La restul de 16 pacieni care aveau titrul ASLO normal, germenii infectani au fost stafilococi, enterobacterii, streptococul -hemolitic de grup B i bacilul piocianic. Din aceste date se constat c titrul ASLO a fost crescut doar n infeciile streptococice cu streptococi de grup A, C i D i nu n alte infecii date de ali germeni. n literatura se cunoate c detectarea ASLO are drept scop identificarea aproape exclusiv a infeciilor provocate de S. pyogenes i mai ales a sechelelor post-infecioase precum reumatismul articular acut, cardita reumatismal sau glomerulonefrita poststreptococic. Se dovedete aadar c titrul ASLO nu este o metod specific pentru detectarea infeciei exclusiv cu S.pyogenes. Streptolizina O este secretata de streptococii din grupurile A, C i G i de Streptococcus canis. Msurarea n dinamic a titrului ASLO este o metod simpl i eficient pentru a diagnostica infeciile cu aceste tipuri de streptococi. Toi dintre ei sunt implicai n infecii musculoscheletale i toi au rmas sensibili la penicilin. Aadar la un pacient cu semne de osteomielit sau fasciit la care nu se pot lua probe din produsul patologic, este recomandat s se utlizeze msurarea titrului ASLO i dac acesta este foarte mare, balana se nclin ctre o 257

infecie streptococic, uor de tratat cu penicilin. Aceast abordare ar fi ideal pentru a reduce administrarea abuziv de antibiotice cu spectru larg, fiind nevoie doar de un test de laborator simplu i sensibil.

19. 7. Direcii de cercetare 1. Sudha Pottumarthy, Virginia C. Wells, Arthur J. Morris; A Comparison of Seven Tests for Serological Diagnosis of Tuberculosis; J Clin Microbiol. 2000 June; 38(6): 22272231 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC86769/) 2. Lennox K. Archibald; Rapid Diagnostic Testing of Infectious Diseases (http://www.medscape.com/viewarticle/748139) 3. Mohammad Reza Hasanjani Roushan, Mohammad Jafar Soleimani Amiri, Abolghasem Laly, Amrollah Mostafazadeh ,A. Bijani; Follow-up standard agglutination and 2-mercaptoethanol tests in 175 clinically cured cases of human brucellosis; International Journal of Infectious DiseasesVolume 14, Issue 3 , Pages e250-e253, March 2010 (http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2809%2900211-2/fulltext) 4. A. Gupta, N.T. My Thanh, S.J. Olsen, S. Sivapalasingam, T.T. My Trinh, N.T. Phuong Lan, R.M. Hoekstra, W. Bibb, N.T. Minh, T.P. Danh, P.D. Cam, E.D. Mintz; Evaluation of community-based serologic screening for identification of chronic Salmonella Typhi carriers in Vietnam; International Journal of Infectious Diseases Volume 10, Issue 4 , Pages 309-314, July 2006 (http://www.ijidonline.com/article/S1201-9712%2805%2900176-1/fulltext)

19. 8. Verificai-v cunotinele ntrebrile au un singur rspuns corect. 1. Ce presupune o reacie antigen-anticorp? A. activarea sistemului complement B. interaciunea dintre determinantul antigenic (epitop) i fragmentul corespunztor din molecula anticorpului (paratop) C. pH i temperaturi extreme D. neaprat prezena unei bacterii n snge E. opsonizarea particulei patogene 2. Specificitatea reciei antigen-anticorp: A. este absolut B. este o msur a compatibilitii structurale i electrochimice ntre antigen i anticorp C. descrie ce for este necesar pentru a separa un complex imun n componentele sale D. reprezint o caracteristic prin care un antigen este recunoscut de un anumit anticorp compatibil, iar anticorpul recunoate doar antigenul respectiv E. nu permite apariia reaciilor ncruciate

258

3. Care este afirmaia fals? A. ntre epitop i paratop nu se stabilesc legturi covalente, ci fore intermoleculare B. un determinant antigenic liniar nu este recunoscut de anticorpul specific C. o reacie antigen-anticorp este reversibil deoarece ntre cei doi reactani nu se stabilesc leguturi greu de scindat D. un anticorp specific unui antigen poate s lege un alt antigen nrudit datorit fenomenului de reacie ncruciat E. epitopii conformaionali sunt determinai de structura teriar a proteinelor 4. Despre afinitate i aviditate este adevrat c: A. sunt caracteristice doar moleculelor IgG B. sunt sinonime C. sunt parametri ai interaciunii antigen-anticorp i au semnificaie diferit D. nu se pot defini n cazul unei reacii ncruciate E. aviditatea msoar fora de legare dintre epitop i paratop 5. n cursul unei reacii antigen-anticorp: A. exist 3 stadii de desfurare B. este un stadiu al interaciunilor primare care se pot pune n eviden prin reacii de precipitare, aglutinare, fixare a complementului etc. C. nu se formeaz complexe imune care pot s precipite D. toi anticorpii au aceeai afinitate i aviditate fa de antigenele implicate E. in vitro, n oricare stadiu al reaciei, complexele imune sunt vizibile cu ochiul liber

19. 9. Bibliografie recent

1. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, Shiv Pillai, 2007, Cellular and Molecular Immunology, 3rd edition, 6, 143-161 2. Jawetz, Melnick, Adelberg, 2007, Medical Microbiology, 24th edition, II-8, 128-137 3. Kayser, Bienz, Eckert, Zinkernagel, 2005, Medical Microbiology, 121-132 4. Lee Goldman, Dennis Ausiello, 2008, Cecil Medicine, 3rd edition, Section VII, 249-270 5. Strohl, Rouse, Fisher, 2001, Lippincott's Illustrated Reviews: Microbiology, 79-101, 437-455 6. Ilker Ukay, Tristan Ferry, Richard Stern, Juan Ambrosioni, Axel Gamulin, Diego Andrey, Marina Djordjevic, Louis Bernard, Pierre Hoffmeyer, Daniel Lew; Use of serum antistreptolysin O titers in the microbial diagnosis of orthopedic infections; International Journal of Infectious Diseases, Volume 13, Issue 4 , Pages 421-424, July 2009 7. http://pathmicro.med.sc.edu/mayer/ab-ag-rx.htm - Immunoglobulins-Antigen-Antibody Reactions, Dr Gene Mayer

259

20. Reacii de precipitare i reacii de aglutinare (Gabriela Loredana, MI Popa)

20. 1. Reacia de precipitare Reacia de precipitare ntre Ag i Ac poate avea loc n mediu lichid sau solid i const n unirea Ag solubile cu Ac specifici, rezultnd complexe antigen-anticorp, care nu devin insolubile i stabile dect n cazul formrii unei reele tridimensionale ntre antigen i anticorp, conform teoriei reelei care presupune: un antigen cel puin trivalent pentru amplasarea anticorpilor, anticorp bivalent i condiii fizice favorabile precipitrii (ex. Ac puin glicozilai / de tip IgG cu 3% glucide superiori celor IgM cu 10% glucide). Reacia de precipitare este sensibil i specific n evidenierea prezenei Ag (pentru realizarea reelei Ag-Ac este necesar ca n reacie s intre o anumit cantitate de Ag i Ac, care s s e gseasc ntr-un anumit raport / proporie, iar Ag care particip la formarea agregatelor sunt ntr-o cantitate proporional mai mic, n raport cu Ac). n cadrul cursului se discut diferitele situaii legate de prezon (exces de Ac), exces relativ de Ac, zona de echivalen (Ag i Ac se gsesc n totalitate n precipitat), exces relativ de Ag i respectiv postzon (exces de Ag). Pentru anumite sisteme Ag-Ac va fi definit i noiunea de proporie optim.

20. 2. Clasificarea reaciilor de precipitare Reaciile de precipitare se pot clasifica dup cum urmeaz. A. Reacii de precipitare n mediu lichid Reacii de precipitare n amestec, reacii de floculare o titrarea toxinei difterice (metoda Ramon), determinarea titrului Ac antitoxici etc., o VDRL (Veneral Disease Research Laboratory), USR (Unheated Serum Reagin), o RPR (Rapid Plasma Reagin) etc, n diagnosticul serologic al sifilisului Reacii de precipitare n inel o reacia Ascoli, determinarea grupului streptococic etc. Reacii de precipitare n tub capilar o determinarea prezenei proteinei C reactive, o determinarea prezenei tipului M streptococic (streptococi de grup A) etc. Dozajul nefelometric etc. B. Reacii de precipitare n mediu gelifiat Imunodifuzia radial simpl (ex. metoda Mancini) Difuzia dubl o metoda Elek, o difuzia dubl radial (Ouchterlony) C. Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza Electroforeza urmat de imunofixare Electroimunodifuzia. 20. 2. 1. Reacii de precipitare n mediu lichid Au la baz unirea Ag cu Ac n mediul lichid, formndu-se complexe Ag-Ac, care vor precipita atunci cnd Ag i Ac se gsesc n anumite proporii. 20. 2. 1. 1. Reacii de precipitare n amestec 260

Reacia de precipitare ntre Ag i Ac se poate cuantifica i este foarte util pentru a demonstra prezena i respectiv absena precipitatului n funcie de concentraiile relative de Ag i Ac. Spre exemplu, pentru titrarea toxinei difterice (metoda Ramon) se pun n contact, n amestec n tuburi, cantiti egale din componenta care trebuie titrat (toxina difteric, Ag) cu cantiti variabile de Ac la care titrul este cunoscut. Cantitatea maxim de precipitat se gsete n tubul unde exist raportul de echivalen. Pentru sistemul toxin difteric - anticorpi anti-toxin difteric (ca i n cazul sistemului toxin tetanic - anticorpi anti-toxin tetanic), raportul de echivalen se suprapune peste proporia optim, astfel nct se poate observa relativ uor tubul n care apare cantitatea cea mai important de precipitat. Cunoscnd titrul anticorpilor, se afl imediat titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxin care se combin cu o unitate de antitoxin = 1 UA = 1 unitate antitoxic). Dac spre exemplu precipitarea maxim apare n tubul n care titrul anticorpilor este de 10 UA, titrul toxinei este de 10 Lf. n mod asemntor, prin metoda Dean i Web se poate determina titrul anticorpilor anti-toxici, cunoscnd titrul toxinei. 20. 2. 1. 2. Reacii de precipitare n inel Reacia de precipitare n inel, const n punerea n contact a Ag i Ac astfel nct s nu se amestece; reacia care apare la interfaa dintre Ag i Ac se concretizeaz printr-un inel de precipitare albicios. Se utilizeaz pentru identificarea originii petelor de snge (reacia Uhlenhut, n medicina legal) i pentru identificarea provenienei unor preparate pe baz de carne (n industria alimentar). Demonstrativ, n cursul lucrrilor practice, reacia de precipitare n inel (reacia Ascoli) se poate utiliza pentru identificarea prezenei antigenului crbunos (Ag obinut de la Bacillus anthracis). Istoric, soluia de antigen se prepara pornind de la organe (de ex. splin) recoltate de la un animal care a decedat i pentru care se suspecta c decesul a fost produs de o infecie generalizat cu Bacillus anthracis. Fragmentul de organ se mojareaz n soluie de clorur de sodiu steril, adugndu-se ulterior cteva picturi de acid acetic, apoi se meninea la temperatura de fierbere timp de 5-10 minute. Dup decantarea i alcalinizarea cu NaOH, urma filtrarea i rezulta soluia antigenic. Din punct de vedere tehnic vom utiliza 3 tuburi, 1 pentru reacie i 2 tuburi martor. n primul tub martor vom pipeta 0,5 ml ser anticrbunos i 0,5 ml soluie salin fiziologic iar n al doilea tub martor vom pipeta 0,5 ml ser normal de cal i 0,5 ml soluie de antigen. n ceea ce privete tubul de reacie trebuie s pipetm nti 0,5 ml din serul anticrbunos, urmnd ca soluia de antigen (n cantitate de 0,5 ml) s fie pipetat foarte lent, eventual prin scurgere pictur cu pictur pe peretele interior al tubului, n aa fel nct cele 2 soluii s nu se amestece. n cazul reaciei pozitive (prezena Ag crbunos n soluia antigenic), dup circa 5 minute, la interfaa dintre cei 2 reactivi apare un inel de precipitare. 20. 2. 1. 3. Reacia de precipitare n tub capilar a fost utilizat pentru evidenierea prezenei proteinei C reactive (CRP). 20. 2. 1. 4. Dozajul nefelometric: n prezena unei cantiti constante de Ag sau Ac, se formeaz complexe Ag-Ac care modific intensitatea i dispersia luminii direct proporional cu concentraia de Ag sau Ac (principiul de msurare este proporionalitatea dintre cantitatea de complex antigen-anticorp format i lumina mprtiat). Cu ajutorul unui nefelometru, care utilizeaz fascicule luminoase monocromatice intense i a unei msurri a precipitatului n mediu lichid prin difracie de raze luminoase, este posibil dozarea uoar, reproductibil a antigenului sau a anticorpilor, folosind o curb de etalonare. Nefelometria se utilizeaz curent i determin cantitativ proteine specifice din ser i urin (IgG, IgA, IgM, CRP, haptoglobin, orosomucoid, fibrinogen, C3, C4, prealbumin, alfa1-antitripsin etc). 20. 2. 2. Reacii de precipitare n mediu gelifiat Utilizarea gelozei, n care pot s migreze cei doi reactivi (se va utiliza o anumit concentraie de agar n soluie de tampon veronal, n aa fel nct porii gelului s permit migrarea), va duce la vizualizarea reaciei Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare. 20. 2. 2. 1. Imunodifuzia radial simpl (IDRS Mancini) 261

Imunodifuzia radial simpl (Mancini) se bazeaz pe difuzia spontan i radial a Ag din proba de cercetat, ntr-un gel care conine o cantitate constant de anticorpi, determinnd apariia unui cerc de precipitare al crui diametru este direct proporional cu concentraia de antigen din prob. Pentru a obine un cerc de precipitare de mrime convenabil, concentraia Ac nglobai n gel trebuie s fie aleas n funcie de titrul acestora i de concentraia Ag care urmeaz a fi testat. Metoda permite determinareacantitativ a imunoglobulinelor (IgG, IgM, IgA), fraciunii C3 a complementului, alfa1-antitripsinei, siderofilinei etc. Sunt necesare plcue (de ex. cu diametrul de 5 cm) n care se toarn un gel care include Ac fa de structura a crei concentraie dorim s o determinm. Exist un cod al culorilor i spre exemplu, plcuele care vor fi utilizate pentru determinarea concentraiei de IgG au culoare roie, pentru IgA culoarea este albastr, pentru siderofilin culoarea este portocalie etc. n gel sunt perforate mici godeuri (3 mm diametru). Sunt necesare seruri de cercetat i un ser de referin n care se cunoate concentraia diferitelor componente (spre ex. cte 100 UI / ml pentru fiecare dintre cele 3 imunoglobuline). nainte de pipetarea serurilor n godeuri se realizeaz diluarea acestora, diluia fiind pentru IgG, IgA i siderofilin i respectiv pentru IgM, complement C3 i alfa1-antitripsin. Diluia serului de referin se face n funcie de proteina care urmeaz a fi determinat. Cantitatea de ser introdus n fiecare godeu este de 5 ml (un godeu pentru serul de referin i restul pentru serurile de cercetat). Dup 10 minute de meninere a plcuei pe masa de lucru aceasta se incubeaz la 37C, cu stratul de gel poziionat n sus, timp de 48 ore pentru IgA i IgM i respectiv 24 de ore pentru celelalte componente. Citirea se realizeaz cu ajutorul unei rigle gradate, din plastic, o rigl special pentru aceast analiz (demonstrat n cursul lucrrilor practice). Se va msura iniial diametrul cercului de precipitare din jurul godeului n care se afl serul de referin iar rezultatul obinut trebuie s corespund ateptrilor (de ex. 6 mm pentru IgG care a fost diluat i astfel are concentraia de 25 UI / ml). n cazul c rezultatul este cel ateptat, se poate face direct citirea diametrelor cercurilor de precipitare pentru serurile de cercetat; n caz contrar este necesar o corecie (dac spre exemplu diametrul este 6,5 mm n loc de 6 mm, din valoarea obinut pentru serurile de cercetat se scad 0,5 mm). Dup citirea diametrelor, se compar rezultatele cu cele puse la dispoziie n tabele iar cifra obinut se nmulete cu diluia probei (spre ex. dac obinem o valoare de 50 UI / ml pentru IgG, vom nmuli cu 4 pentru a obine rezultatul real). 20. 2. 2. 2. Imunodifuzia dubl radial (Ouchterlony) Imunodifuzia dubl se bazeaz pe difuzia Ag i Ac (unul spre cellalt) ntr-un gel. Deoarece mrimea moleculelor de Ag i Ac este mai mic dect diametrul porilor gelului, iar distana parcurs de reactant ntr-un anumit timp este direct proporional cu gradientul concentraiei sale i invers proporional cu greutatea sa molecular, migrarea reactanilor unul spre cellalt determin formarea unor linii de precipitare la locul de ntlnire Ag-Ac. n gelul transparent vor aprea linii opace, numrul lor corespunznd numrului sistemelor Ag-Ac studiate. Metoda certific prezena sau absena proteinei cercetate. Se pot evidenia alfa-fetoproteina, proteina C reactiv, beta-2 microglobulina, proteine Bence-Jones tip kappa i lambda, produi de degradare ai fibrinogenului (PDF) etc. n micologie, prin imunodifuzie se poate identifica prezena exoantigenelor fungice (Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatidis, Coccidioides immitis etc) sau prezena Ac fa de Ag fungice, spre exemplu n diagnosticul serologic al unei aspergiloze invazive. Aceast metod este nc frecvent utilizat pentru determinarea specificitii anticorpilor antinucleari sau a altor anticorpi n patologia uman. Sunt necesare lame de microscop pe care se toarn un gel de agar 1%, lama putnd fi folosit pe parcursul unei zile (dac acest lucru nu se poate ndeplini, lama trebuie pstrat n camer umed, la temperatura frigiderului, pentru maxim o sptmn). n gelul de pe lam se perforeaz 3 grupe de godeuri, cte 7 godeuri n fiecare grup (1 godeu central i 6 godeuri periferice, fiecare cu diametrul de 3 mm). Dac spre exemplu dorim s determinm prezena proteinei C reactiv (CRP) n seruri de cercetat, avem nevoie de un ser cu Ac anti-CRP, seruri de cercetat i un ser de referin care conine CRP. Numerotnd godeurile periferice, pipetm Ac 262

anti-CRP n godeul central i ser de referin cu CRP n godeurile 1 i 4. n celelalte godeuri pipetm serurile de cercetat. Incubm la 37C, timp de 24 de ore, n camer umed (ntr-o cutie Petri putem pune o bucat de vat mbibat n soluie salin fiziologic, alturi de lama respectiv). Liniile de precipitare pot deveni vizibile dup 2-4 ore dar sunt mult mai clare dup 24 de ore. Pentru citire pot fi necesare o lup i o surs de lumin. ntre godeul central i godeurile 1 i 4 (martori pozitivi) vor aprea linii (arcuri) de precipitare. n cazul n care de ex. n godeul 2 exist CRP, va aprea un arc de precipitare i ntre godeul central i godeul nr. 2. Este certificat prezena CRP n cazul n care cele 2 linii de precipitare (dintre godeul central i godeurile 1 i 2) sunt una n continuarea celeilalte (imagine de genunchi ndoit). 20. 2. 2. 3. Dubla difuzie Elek Aceast metod permite depistarea capacitii toxigene a unei tulpini de Corynebacterium diphteriae. n cazul n care tulpina este toxigen, toxina va difuza n mediu iar dup unirea cu Ac anti-toxin, complexele Ag-Ac vor da natere unor linii de precipitare. ntr-o cutie Petri turnm mediul Elek i dup ce mediul s-a ntrit, decupm un an pe unul din diametre. n anul respectiv pipetm 0,5 ml ser antidifteric, ser care conine Ac anti-toxin difteric n concentraie de 1.000 UI / ml. Ac anti-toxin difteric vor difuza n mediu. Dup circa 2 ore nsmnm perpendicular pe anul cu Ac anti-toxin, de fiecare parte a anului, o tulpin de Corynebacterium diphteriae toxigen (martor pozitiv), o tulpin de Corynebacterium diphteriae ne-toxigen (martor negativ) i tulpini de cercetat, cte un striu (de fiecare parte a anului) pentru fiecare tulpin. Incubm la 37C pentru 48 ore, dar urmrim zilnic apariia culturii i precipitatului (liniilor de precipitare). De-a lungul liniilor de nsmnare apare cultur bacterian. Din cultura de Corynebacterium diphteriae toxigen, toxina (Ag) difuzeaz n mediu. Unirea dintre Ag i Ac duce la formarea unor complexe Ag-Ac care precipit, iar n mediu vor aprea linii de precipitare n unghiurile dintre cultur i anul cu Ac anti-toxin. n cazul n care apar linii de precipitare n unghiul dintre una dintre tulpinile de cercetat i anul cu Ac antitoxin, respectiva tulpin este toxigen. Reacia va fi negativ pentru martorul negativ i pentru tulpinile de cercetat ne-toxigene. 20. 2. 3. Reacii de precipitare n care difuzia n gel este combinat cu migrarea n cmp electric 20. 2. 3. 1. Electroforeza proteic n gel Electroforeza proteic n gel este folosit n laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice. Deplasarea proteinelor ntr-un strat de gel care este supus aciunii unui cmp electric se va realiza difereniat, pentru fiecare structur proteic n parte, n funcie de greutatea molecular i ncrctura electric a proteinelor. Pentru vizualizare este necesar fixarea, uscarea i colorarea liniilor de precipitare care corespund fraciunilor proteice din serul normal sau unor eventuale proteine patologice (ex. o component monoclonal). 20. 2. 3. 2. Imunoelectroforeza Se asociaz electroforeza n gel cu imunodifuzia dubl (realizndu-se separarea prin electroforez a proteinelor n mediu gelozat, urmat de o imunodifuzie dubl utiliznd un antiser corespunztor). Reacia Ag-Ac se va vizualiza prin apariia unor arcuri de precipitare. Este o metod foarte util n studierea puritii unui Ag (sau Ac), ns n mod curent are indicaii didactice. Datorit faptului c n boala pneumococic prin urin se elimin cantiti destul de importante de Ag K, prezena acestuia poate fi evideniat de ex. prin imunoelectroforez. 20. 2. 3. 3. Contraimunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza reprezint o dubl difuzie n care deplasarea unul fa de cellalt a Ag i Ac este accelerat de un cmp electric. Pe o lam de microscop se toarn un gel de agar 1% i se perforeaz 3 grupe de perechi de godeuri, fa n fa. Metoda poate fi utilizat pentru acele structuri antigenice care n cmp electric migreaz ctre anod. Lund n discuie spre exemplu doar una dintre cele 3 grupe de perechi de godeuri, n godeurile care vor fi poziionate spre catod (polul negativ) pipetm Ag iar n godeurile care vor fi poziionate spre anod (polul pozitiv) pipetm Ac cunoscui, specifici Ag pe care dorim s-l identificm. Reacia este mai rapid i mai sensibil dect dubla difuzie deoarece migrarea celor doi reactani unul ctre 263

cellalt este amplificat de cmpul electric. Reacia (apariia unei linii de precipitare ntre godeuri, n cazul n care n godeul catodic se gsete Ag presupus) poate fi citit dup numai 3090 minute n loc de 24 de ore aa cum se ntmpl n dubla difuzie Ouchterlony. Metoda a fost utilizat din punct de vedere istoric pentru identificarea prezenei Ag HBs. Se poate utiliza pentru identificarea antigenelor capsulare n lichidul cefalorahidian la pacieni cu meningit acut (Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae). 20. 2. 3. 4. Electroimunodifuzia Electroimunodifuzia are la baz electroforeza probelor care conin proteina-antigen, ntr-un strat de gel, care conine o cantitate constant de anticorpi monospecifici (anti-protein antigen), rezultnd zone de precipitare n form de rachet sau conuri, a cror arie este direct proporional cu concentraia antigenului. Metoda are o sensibilitate mai mare dect IDRS.

20. 3. Reacia de aglutinare n reacia de aglutinare antigenele sunt de natur corpuscular. Reacia de aglutinare const n reacia Ac cu Ag (natural sau artificial) de pe suprafaa unor particule (bacterii, hematii, latex, cristale de colesterol etc), determinnd aglutinarea acestora prin scderea forelor electrostatice de repulsie dintre particule i formarea unor puni de legtur. Aglutinareaeste mai sensibil dect precipitarea, Ag fiind o particul i nu o molecul solubil. Anticorpii de tip IgM sunt mai aglutinani dect Ac de tip IgG (pentru c au mai multe valene). Exist i Ac neaglutinani (incomplei / blocani) sau care aglutineaz numai la rece.

20. 4. Cteva tipuri de aglutinare Exist mai multe variante tehnice de aglutinare. Dintre acestea vom prezenta n continuare, pe scurt, aglutinarea direct, aglutinarea indirect, inhibarea aglutinrii, aglutinarea n coloan i aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline. Ulterior vom discuta reaciile de aglutinare utilizate n bacteriologie i micologie. 20. 4. 1. Aglutinarea direct Aglutinarea direct reprezint aglutinarea Ag naturale ale unor particule (bacterii, celule) de ctre Ac specifici. Se poate utiliza n a. diagnosticul bacteriologic, de ex. pentru identificarea enterobacteriilor (Shigella, Salmonella, E. coli etc) sau a altor germeni Gram-negativi (Vibrio cholerae) etc., pe baza structurii antigenice, n b. diagnosticul serologic al unor boli infecioase (febr tifoid, bruceloz etc), c. pentru determinarea grupelor sanguine (ABO) etc. 20. 4. 2. Aglutinarea indirect sau pasiv Este o reacie n care particule artificiale (globule roii formolate, particule de latex, cristale de colesterol, colodiu etc) sau naturale sunt ncrcate in vitro cu Ag sau Ac i sunt aglutinate de ctre Ac sau Ag corespondente din proba de cercetat. Se utilizeaz n principal pentru decelarea factorului reumatoid, determinarea CRP, determinarea grupului streptococic etc. 20. 4. 3. Inhibarea aglutinrii Reacia const n inhibarea aglutinrii particulelor ncrcate cu Ag, dup ce n prealabil Ac reacioneaz cu Ag corespondent. Se utilizeaz de ex. pentru decelarea mioglobinei sau n diagnosticul imunologic al sarcinii. 20. 4. 4. Aglutinarea n coloan Metoda permite o mai bun vizualizare a reaciei. Dispozitivul utilizat are 2 compartimente, partea n care se introduc reactivii (situat superior) i o coloan situat inferior, plin cu microparticule de sticl. Dup introducerea hematiilor i a serului de cercetat i incubarea 264

acestora, dispozitivul este centrifugat. n cazul unei reacii pozitive complexul Ag-Ac se va putea vizualiza la nivelul coloanei, n timp ce n cazul unei reacii negative, hematiile se depun n poriunea inferioar a coloanei. 20. 4. 5. Aglutinarea mediat de Ac anti-imunoglobuline Anticorpii anti-Ig se vor cupla cu particule ncrcate cu Ac i vor duce la apariia unor aglutinate (prin apariia complexului imun). Se utilizeaz spre exemplu n decelarea factorului reumatoid (tehnica Waaler-Rose).

20. 5. Utilizarea reaciei de aglutinare n microbiologie Vom prezenta att exemple de utilizare a reaciei de aglutinare n diagnosticul direct ct i n diagnosticul indirect (serologic). Reamintim faptul c n cadrul diagnosticului de laborator serologic se va determina prezena (sau se va dovedi absena) Ac necunoscui, n serul pacientului respectiv, utiliznd Ag cunoscute. n diagnosticul serologic, de regul, trebuie s putem rspunde la minim trei ntrebri eseniale: exist anticorpi n serul pacientului investigat? care este titrul anticorpilor? cum evolueaz n dinamic (n timp) acest titru? n acest scop vom realiza minim dou determinri diferite la un interval de 7-10 zile (pentru majoritatea infeciilor care pot fi diagnosticate astfel). n acest capitol vom discuta att exemple de reacii serologice calitative ct i exemple de reacii serologice cantitative.

20. 5. 1. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul de laborator microbiologic direct Tehnica de aglutinare se execut n a patra etap a diagnosticului de laborator, respectiv n etapa de identificare, pe baza caracterelor antigenice. n momentul aplicrii acestei reacii avem o serie de date pornind de la informaiile clinice, paraclinice, epidemiologice, s-a prelevat un anumit p.p., care s-a examinat din punct de vedere microscopic i a fost cultivat. Aa cum am menionat anterior, n vederea identificrii este necesar s avem colonii izolate, cultur pur. 20. 5. 1. 1. Aglutinarea pe lam Spre exemplu, n cursul identificrii unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., Salmonella spp., E. coli etc), dup cultivarea p.p. pe medii selectivo-difereniale se obin colonii izolate i din poriunea superioar (bombat) a coloniilor izolate facem treceri pe medii multitest (ex. TSI, MIU). n ziua urmtoare, avem deja mai multe elemente pentru ncadrarea tulpinii izolate ntr-o specie, dar, folosind spre exemplu cultura bacterian dezvoltat pe mediul TSI, putem face reacia de aglutinare. n nici un caz nu se vor utiliza pentru identificarea pe baz de caractere antigenice tulpini mai vechi de 18-24 ore. Pentru realizarea reaciei de aglutinare sunt necesare urmtoarele: cultura de identificat (colonii de tip S, de 18-24 ore), soluie salin fiziologic, Ac cunoscui fa de Ag pe care dorim s le identificm (Ac polivaleni, Ac monovaleni de grup, Ac monovaleni de tip, dup caz), lame de microscop curate, pahar Berzelius cu amestec dezinfectant etc. Iniial, pe o lam de microscop curat i degresat punem la una dintre extremitile lamei o pictur de soluie salin fiziologic, n care suspendm un fragment din colonia de identificat n aa fel nct s obinem o suspensie omogen, opalescent. n cazul n care suspensia rmne omogen, putem trece la etapele urmtoare; n cazul n care pictura se limpezete i apar grunji, tulpina este ne-tipabil prin aceast metod (apare aglutinarea nespecific), ar putea fi vorba de o tulpin care provine dintr-o colonie de tip R. n urmtoarea etap, la cealalt extremitate a lamei, punem o pictur de ser cu Ac cunoscui, de ex. polivaleni i realizm o suspensie omogen, opalescent, a coloniei de identificat. nclinm lama de cteva ori, uor, n 265

toate direciile, pentru a favoriza contactul dintre cei 2 reactani i unirea complexelor Ag-Ac mici, solubile, pentru a forma reele de complexe Ag-Ac. n cazul reaciei pozitive (coresponden ntre Ac cunoscui i Ag pe care dorim s l identificm) pictura se limpezete i apar grunji de aglutinare. Este indicat s citim reacia pe fond negru. De cele mai multe ori citirea se face cu ochiul liber ns n cazul unor aglutinate de dimensiuni foarte mici poate fi necesar s folosim o lup, un microscop sau un aglutinoscop. Pentru identificarea diferitelor microorganisme exist scheme care orienteaz etapele de urmat (tabelele i schemele respective se livreaz de ctre productori mpreun cu serurile cu Ac specifici). Lamele pe care se fac reaciile de aglutinare, dup terminarea reaciilor se introduc n amestecul dezinfectant. n cadrul lucrrilor practice vor fi discutate aglutinrile pentru identificarea E. coli, Salmonella spp. pn la nivel de specie (conform clasificrii Kauffmann-White) i respectiv a grupurilor de Shigella spp. Tot prin aglutinare direct se mai pot identifica tulpini de Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae tip b, tulpini de Brucella spp., tulpini de E. coli entero-patogen, iar n cazul leptospirelor i unor rickettsii apariia aglutinrii trebuie verificat cu ajutorul microscopului. Reacii de aglutinare indirect se pot utiliza pentru detectarea n p.p. a streptococilor de grup A sau B, pneumococilor, meningococilor, E. coli tip capsular K1, H. influenzae tip capsular b, pentru detectarea unor enterotoxine (stafilococice, clostridiene etc), pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.) sau a unor virusuri. Tot prin tehnica de aglutinare indirect se pot identifica exotoxine n filtratul de cultur, streptococii de grup A-D, E. coli O:157, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes etc. 20. 5. 1. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi pentru confirmarea unui rezultat pozitiv la aglutinarea pe lam sau atunci cnd rezultatul unei aglutinri pe lam nu este suficient de clar. Vom avea la dispoziie cultura pur de identificat care se va prepara difereniat n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm. Spre exemplu, dac ncercm s identificm Ag de tip O iar bacteria ar putea s prezinte i Ag H sau Ag K (care ar putea inhiba aglutinarea cu Ag O) cultura se va menine 1-2 ore la 100C pentru inactivarea Ag de nveli, dup care se va trece la realizarea aglutinrii n tuburi (o procedur asemntoare poate fi necesar i n cazul tehnicii de aglutinare pe lam). Vom utiliza un ir de eprubete n care vom introduce Ac cunoscui, care se vor dilua succesiv, binar, cu soluie salin fiziologic. n tuburile respective vom aduga o cantitate echivalent de suspensie Ag (spre ex., la 0,5 ml Ac vom aduga 0,5 ml suspensie Ag). Incubarea se va face difereniat, n funcie de tipul de Ag pe care dorim s-l identificm (ex. 20 ore la 52C pentru identificarea Ag O). Reacia este pozitiv n cazul apariiei aglutinatelor (grunjoase - n cazul prezenei Ag O, floconoase - n cazul prezenei Ag H etc). Reacia de aglutinare n tuburi permite i verificarea titrului la care are loc formarea complexelor Ag-Ac.

20. 5. 2. Reacii de aglutinare utilizate n diagnosticul serologic n diagnosticul serologic, n mod obinuit, reaciile utilizate permit detectarea prezenei Ac n serul de cercetat dar i stabilirea titrului. Totui exist i cteva exemple de reacii de aglutinare calitative. 20. 5. 2. 1. Aglutinarea pe lam Reaciile de aglutinare pe lam Huddleson (n diagnosticul brucelozei) i respectiv Kudicks Steuer (n diagnosticul tifosului exantematic) au intrat n istoria medicinii. Prima dintre reacii o utilizm demonstrativ n cadrul lucrrilor practice, apariia aglutinatelor fiind clar iar tehnica de lucru foarte simpl. Sunt necesare urmtoarele materiale: lame de microscop curate, Ag brucelos inactivat (colorat n violet), ser de cercetat. Pe o lam de microscop depunem o pictur din soluia de Ag brucelos i n imediata vecintate a acesteia, o pictur de ser de 266

cercetat. Cu colul unei alte lame amestecm i omogenizm cei 2 reactani. Prin micri de nclinare a lamei n toate direciile facilitm formarea complexelor Ag-Ac, n cazul n care n serul de pacient sunt prezeni Ac anti-Brucella spp. Reacia este pozitiv n cazul n care se remarc prezena aglutinatelor. Chiar i n perioada n care aceast se utiliza n diagnostic, o reacie pozitiv pe lam trebuia s fie confirmat prin aglutinare n tuburi. Tehnica de aglutinare indirect poate fi utilizat n diagnosticul serologic al infeciilor produse de Helicobacter pylori, Treponema pallidum (hemaglutinare pasiv) etc. 20. 5. 2. 2. Aglutinarea n tuburi Tehnica de aglutinare n tuburi se poate folosi n diagnosticul serologic al brucelozei (reacia Wright), diagnosticul serologic al infeciilor produse de Cryptococcus neoformans, diagnosticul serologic al febrei tifoide etc. Denumirea de reacie Widal pentru diagnosticul serologic al febrei tifoide a intrat n istoria medicinii. Lund n discuie diagnosticul serologic al febrelor enterice, inclusiv febra tifoid, sunt necesare urmtoarele: seruri recoltate (n dinamic) de la pacienii la care se suspicioneaz acest diagnostic, tampon fosfat salin, baie de ap cu temperatur reglabil, Ag cunoscute (Ag O i Ag H). Se va lucra cu 2 rnduri de eprubete, un rnd pentru detectarea prezenei i titrului Ac antiO, al doilea pentru detectarea prezenei i titrului Ac anti-H (pentru persoanele n convalescen sau n cazul suspicionrii strii de purttor vom ncerca s identificm n serul de cercetat Ac i titrul Ac anti-Vi, de ex. prin hemaglutinare pasiv). Serul de cercetat, pentru fiecare rnd de tuburi, va fi diluat cu tampon fosfat salin, n diluii binare. Dac amestecul de ser de cercetat i diluant va fi n cantitate de 0,5 ml, vom aduga o cantitate similar de Ag, cte 0,5 ml Ag O n primul rnd de tuburi i respectiv cte 0,5 ml Ag H n al doilea rnd de tuburi. Vom proceda n aa fel nct s obinem n primul tub o diluie de 1/20, n al doilea tub 1/40 etc. Un tub va conine doar un amestec de tampon fosfat salin i soluie Ag (tub martor). Dup ce omogenizm coninutul tuburilor, vom incuba tuburile cu Ag O timp de 20 ore la 52C iar tuburile cu Ag H vor fi incubate timp de 2 ore la 52C urmat de 10 minute la temperatura camerei. Citirea se va realiza dup incubare, comparnd rezultatul din fiecare tub cu martorul pentru Ag. Pentru evidenierea reaciei vom agita uor tuburile. Aglutinarea H difer de aglutinarea O. Aglutinatul O este mai dens, mai grunjos, n timp ce aglutinatul H este mai floconos i uor de disociat prin agitare. Ultimul tub care mai prezint aglutinare vizibil permite stabilirea titrului reaciei. n capitolul 38 vom relua acest tip de diagnostic i vom discuta modalitile de interpretare.

267

21. Reacii care utilizeaz sistemul complement (MI Popa)


21. 1. Reacia de fixare a complementului (RFC) Face parte dintre reaciile al cror rezultat nu poate fi vizualizat fr un artificiu tehnic, n acest caz utilizarea unui sistem hemolitic indicator. Motivul pentru care este necesar acest sistem indicator se datoreaz faptului c Ag este fie sub form macromolecular fie este reprezentat de corpi microbieni de dimensiuni foarte mici, iar complexul Ag-Ac format nu devine vizibil cu ochiul liber. RFC a fost imaginat nc din anul 1901 de ctre Jules Bordet i s-a perfecionat destul de mult de-a lungul timpului. Aceast reacie este utilizat n peste 100 de sisteme Ag-Ac, prin tehnici clasice sau tehnici care au suferit modificri, inclusiv introducerea micrometodelor RFC. Se utilizeaz de ex. Ag cunoscute, puse n contact cu serul testat (n care cutm Ac) care este decomplementat (prin nclzire la 56C timp de 30 minute) i cu o cantitate de C' de cobai (alexin); dac n serul cercetat exist Ac, ei se vor cupla cu Ag formndu-se complexe Ag-Ac, pe care se ataeaz C', care se va consuma i nu va mai aciona n timpul doi (nu va mai produce hemoliza). ntr-un al doilea timp este adugat un sistem hemolitic (substrat indicator) compus din globule roii de oaie (acoperite cu anticorpi IgG de iepure). Dac globulele roii nu sunt hemolizate, nseamn c a fost utilizat C' n cursul primului timp i reacia este pozitiv (Ac prezeni n serul de cercetat); dac globulele roii sunt hemolizate, nseamn c nu s-a utilizat C' care a rmas disponibil pentru a se ataa de sistemul hemolitic, reacia este negativ (nu sunt prezeni Ac n serul de cercetat). Reacia de fixare a complementului se poate folosi att pentru identificarea Ag ct i n diagnosticul serologic. Pentru c nu urmeaz s discutm pe larg prima variant, vom enumera doar cteva dintre exemple, RFC permind identificarea unor Ag rickettsiene, chlamydiene, virale etc. n diagnosticul serologic, cea mai cunoscut metod rmne nc RFC BordetWasserman, utilizat nc n diagnosticul serologic al sifilisului. Subliniem faptul c RFC este o metod laborioas, n care nu se admit erori tehnice, dar fiind executat corect este foarte exact, are o mare sensibilitate i specificitate. Este de asemenea una dintre metodele cu un mare grad de reproductibilitate. Principiul RFC: RFC se bazeaz pe proprietatea sistemului C' de a se fixa pe complexul imun Ag-Ac. n prima faz a reaciei se introduce serul de cercetat iar dac acest ser conine Ac specifici fa de Ag cunoscut se va forma un complex Ag-Ac, urmat de fixarea C', care se va activa pe calea clasic i nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul hemolitic indicator (hematii + Acantihematie). n cazul n care serul de cercetat nu conine Ac specifici fa de Ag cunoscut, nu va avea loc formarea unui complex Ag-Ac n prima etap a RFC. Dup introducerea n reacie a sistemului hemolitic indicator, hematiile i Ac-antihematie se vor cupla, vor forma un complex imun iar C' liber se va fixa pe acesta. Dup fixare va urma activarea C' i respectiv liza hematiilor, hemoliza putnd fi examinat cu ochiul liber. Materiale i reactivi necesari: - serul de cercetat recoltat de la pacientul suspect sau o pereche de seruri, obinute n dinamic; - seruri de referin (martor pozitiv i negativ); - Ag cunoscut (suspensie corpuscular sau soluie coloidal, dup caz); - sistemul C' obinut din ser proaspt sau conservat recoltat de la cobai; - sistemul hemolitic indicator format din o hematii de berbec, soluie 4%, valabil timp de o sptmn la 4C i o ser hemolitic anti-hematii de berbec (obinut prin injectri repetate de hematii de oaie la iepurele de laborator, splate cu soluie salin fiziologic) titrat i conservat la 4C; - baie de ap cu temperatur reglabil; 268

- plci cu godeuri, tuburi de hemoliz, pipete diferite etc. Tehnica de lucru: Aa cum am menionat, tehnica de lucru este laborioas i nu va fi prezentat n totalitate, n cele ce urmeaz. Serul de cercetat se va menine 30 minute la 56C, n baia de ap, pentru inactivarea C' propriu. Aa cum am menionat anterior, principial, RFC are loc n 2 etape (Figura nr. 1): o n prima etap se pun n reacie C', serul de cercetat i Ag cunoscut; exist 2 posibiliti: a. n serul de cercetat exist Ac specifici, rezultnd un complex Ag-Ac pe care se va fixa C'; b. n serul de cercetat nu exist Ac specifici, nu se formeaz complex Ag-Ac, C' rmne liber; o n a doua etap se introduce n reacie sistemul hemolitic indicator (hematii + Ac antihematie); exist 2 posibiliti: a. C' nu este liber, nu are loc hemoliza, b. C' se fixeaz pe sistemul hemolitic, lizeaz hematiile i observm apariia hemolizei. Toi reactivii utilizai trebuie standardizai, respectiv se vor realiza: o omogenizarea suspensiei de hematii cu eventual etalonare prin spectrofotometrie; o titrarea serului hemolitic; o titrarea C' n prezena Ag; o titrarea bidimensional a Ag i a serului de referin. n RFC final se va proceda astfel: o se dilueaz conform indicaiilor din protocolul de lucru reactivii utilizai (serul hemolitic, serurile de cercetat, Ag, serurile de referin, C'); o se repartizeaz n godeurile corespunztoare serurile de cercetat, Ag i C'; o pe o plac separat se prepar martorii (martor pentru sistemul hemolitic, martor pentru C', martor pentru Ag, 2 martori pentru serul de referin, martor sigur negativ); o plcile se introduc pn a doua zi la 4C; o a doua zi, plcile se menin la 37C timp de 30 minute; o se adaug n toate godeurile sistem hemolitic; o plcile se menin la 37C timp de 30 minute; o se pun plcile la 4C, pn la sedimentarea hematiilor. Exist anumite diferene ntre tehnicile cantitative i cele calitative, dar principiile sunt aceleai. n RFC Bordet-Wasserman (RBW), metod calitativ, reacia se realizeaz n eprubete, 2 pentru reacia propriu-zis (una cu ser diluat 1/8, cealalt cu ser diluat 1/16), 2 pentru martori sigur pozitiv i sigur negativ i cte una pentru fiecare din ceilali martori, respectiv martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru C', martor pentru serul hemolitic). (Figura nr. 2) Interpretare: Iniial se verific rezultatele aprute pentru martori (fie c este vorba de o metod cantitativ sau calitativ); spre ex. n cazul metodei calitative, n tubul martor pentru serul de cercetat trebuie s fie hemoliz, la fel ca i n tuburile martor pentru Ag, C' i ser sigur negativ. n tuburile martor sigur pozitiv i martor pentru sistemul hemolitic, nu trebuie s fie hemoliz. n tuburile cu serul de cercetat, dac apare hemoliza, nseamn c nu exist Ac iar testul este negativ (lichidul din tub va avea un aspect rou, limpede). Testul este pozitiv atunci cnd n tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliz, hematiile se depun formnd un buton n partea inferioar a tubului (n serul de cercetat exist Ac). Pentru a stabili diagnosticul final, este necesar ca RBW s fie confirmat prin reacii specifice (vezi capitolul dedicat genului Treponema). Control de calitate: Cu privire la controlul de calitate am menionat utilizarea martorilor, pentru fiecare reacie. n RFC utilizat n diagnosticul serologic, Ag cunoscut va fi ales n funcie de suspiciunea de diagnostic. RFC cantitativ se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infeciilor produse de 269

Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia spp., Rickettsia spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Brucella spp., diferite virusuri etc. n scopul creterii sensibilitii i specificitii se aleg proprietile Ag cunoscut, o anumit temperatur de incubare (de ex. 4C n loc de 37C n RFC Kolmer) etc. Ac fixatori de C' apar precoce n cursul bolii astfel nct identificarea prezenei lor poate semnifica o infecie acut sau recent.

21. 3. Direcii de cercetare Prezentm cteva dintre posibilele direcii de cercetare pe care cititorul le poate evalua deschiznd urmtoarele link-uri: http://highered.mcgrawhill.com/sites/0072552980/student_view0/chapter16/animation_quiz_1.html http://www.cehs.siu.edu/fix/medmicro/cfix.htm http://aje.oxfordjournals.org/content/94/4/351.short http://pediatrics.aappublications.org/cgi/content/abstract/4/4/443 http://www.jci.org/articles/view/107949

21. 4. Verificai-v cunotinele 1. A. B. C. D. 2. A. B. C. D. E. 3. A. B. C. D. Legat de RFC, una din urmtoarele afirmaii este adevrat: Poate fi vizualizat doar prin folosirea unui sistem hemolitic indicator. Se folosete doar pentru identificarea Ag. Este foarte folosit n diagnosticul tuberculozei. Este o metod nou descoperit. Unul dintre urmtoarele materiale nu se folosete n RFC: Sistemul complement de la cobai Chemiluminometrul Sistemul hemolitic indicator - hematii de berbec i ser hemolitic anti-hematii de berbec Seruri de referin Ser de cercetat Legat de RFC, o afirmaie este fals: n serul de referin se inactiveaz sistemul complement propriu. Lipsa hemolizei indic prezena Ac n serul de cercetat, deci o reacie pozitiv. Lipsa hemolizei indic absenta Ac n serul de cercetat, deci o reacie negativ. Sistemul complement este recoltat de la cobai.

270

22. Reacia de seroneutralizare (MI Popa)


La fel ca i n cazul RFC, n reacia de seroneutralizare (RSN) este necesar un artificiu tehnic pentru a permite vizualizarea rezultatelor. n cazul RSN, Ag are o anumit proprietate biologic (toxic, enzimatic) care poate fi blocat (neutralizat) prin cuplarea cu Ac specific. Neutralizarea efectului biologic respectiv se poate realiza doar n cazul n care determinantul pentru toxicitate sau pentru activitatea enzimatic respectiv este acelai cu determinantul antigenic (epitop). Reaciile de seroneutralizare ar putea fi utilizate n mai multe mprejurri, spre exemplu n: diagnosticul microbiologic direct o identificarea Clostridium perfringens prin metoda plcilor semineutralizate (vezi anexa nr. 2 i capitolul 51); o testarea toxigenezei unei tulpini de Corynebacterium diphteriae (test de seroprotecie, vezi anexa nr. 2); o toxinotipia n cazul suspicionrii unei toxi-infecii alimentare cu Clostridium botulinum (vezi anexa nr. 2 i capitolul 50); diagnosticul serologic o reacia ASLO (vezi i capitolul 28); prevenirea unor boli infecioase prevenibile prin vaccinare i evaluarea eficacitii vaccinale o vaccinarea cu anatoxine (DTP, DT, dT, ATPA, ADPA; vezi i anexa nr. 4); o titrarea prezenei Ac anti-toxine (difteric, tetanic etc); o testarea prin IDR (intra-dermo-reacie) a susceptibilitii fa de o anumit boal infecioas care are la baz drept mecanism patogenic efectul unei exotoxine. Intradermoreaciile Schick sau Dick, pentru a dovedi susceptibilitatea persoanei testate fa de o infecie difteric sau scarlatinoas au intrat n istoria medicinii. tratamentul / profilaxia unor boli infecioase prin utilizarea de imunoglobuline specifice omologe sau utilizarea unor seruri hiperimune heterologe.

22. 1. Reacia ASLO Aceast reacie poate fi utilizat n diagnosticul retrospectiv al unei infecii streptococice sau pentru confirmarea etiologiei unei boli poststreptococice (mpreun cu criteriile minore i majore de diagnostic). Reacia ASLO determin titrul Ac anti streptolizin O (SLO). Principiu: Titrarea Ac anti-SLO se bazeaz pe faptul c SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. n cazul n care n serul de cercetat exist Ac anti-SLO, aciunea hemolitic a SLO este neutralizat. Combinnd diluii din serul de cercetat cu o cantitate constant de SLO vom putea determina titrul ASLO. Materiale i reactivi necesari: - ser de cercetat (sau seruri pereche, recoltate la interval de 2 sptmni); - SLO liofilizat (standardizat de ctre productor); - snge defibrinat de iepure / berbec; - soluie salin izoton, soluie de rivanol 0,3%; - eprubete, pipete gradate foarte curate; - baie de ap, centrifug etc Tehnica de lucru: Trebuie urmate toate indicaiile din protocolul de lucru, respectiv 271

- se omogenizeaz suspensia de hematii; - se ndeprteaz inhitorii SLO din serul de cercetat (utilizm soluie de rivanol i suspensie de crbune activ, realizm o diluie de 1/10 a serului care se va menine 30 minute la 56C); - se realizeaz diluiile de ser i se repartizeaz n tuburile de reacie (ser n diluii succesive) mpreun cu SLO (n cantitate constant, cte 0,5 ml / tub); combinarea serului de cercetat cu SLO reprezint prima etap a reaciei; - se agit tuburile pentru omogenizare i se menin timp de 15 minute la 37C; - urmeaz a doua etap a reaciei ASLO, respectiv adugarea suspensie de hematii (5%), cte 0,5 ml n fiecare tub; - se agit pentru omogenizare i se incubeaz timp de 45 minute la 37C; - se centrifugheaz tuburile timp de 1 minut (1.500 rotaii / minut) i se menin pn a doua zi la 4C (temperatura frigiderului). Interpretare: Pornind de la o diluie iniial a serului de 1/10, dup adugarea tuturor reactivilor titrul (numrul de uniti ASLO) va fi 12, 50 n tubul urmtor, 100, 125, 166, 250, 333 etc n tuburile urmtoare. Titrul reaciei ASLO este dat de cea mai mare diluie de ser la care lipsete complet hemoliza. Pentru zona noastr geografic se accept ca normal un titru de 200 (maxim 250) uniti ASLO. Exist teste serologice i pentru evidenierea prezenei i titrului anticorpilor fa de alte structuri antigenice (de exemplu streptodornaz, hialuronidaz, streptokinaz). Control de calitate: Ultimele 2 tuburi sunt reprezentate de tubul martor pentru hematii, n care se verific rezistena hematiilor i respectiv tubul martor pentru SLO n care se pun SLO i suspensia de hematii. Exist i posibilitatea de a realiza o micrometod ASLO, reacia efectundu-se n plci de material plastic cu godeuri.

22. 2. Utilizarea RSN n profilaxia i tratamentul unor boli infecioase 22. 2. 1. Vaccinarea n scopul obinerii unei protecii prin seroneutralizare Vaccinul DTP include o suspensie de germeni (Bordetella pertussis) n faza I, combinat cu anatoxina difteric i tetanic. Primovaccinarea se ncepe vrsta de 2 luni a nou-nscutului, administrndu-se 3 doze la interval de 2 luni (la 2, 4, 6 luni). Pentru meninerea imunitii se practic revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar revaccinarea a II-a se practic la 36 de luni de via a copilului respectiv. Datorit posibilelor reacii adverse (fa de componenta pertussis) se recomand eliminarea acesteia la nou-nscuii cu probleme ale sistemului nervos, la cei predispui la boal i la cei care au avut o reacie advers semnificativ la o administrare anterioar a DTP-ului. Se studiaz posibilitatea utilizrii pe scar larg a unui vaccin acelular n care s fie inclus toxina pertussis inactivat i care s permit obinerea unui RI eficient i de durat. Vaccinul DTPa este deja utilizat n SUA i n ri din UE. 22. 2. 2. Evaluarea eficacitii vaccinurilor Se recomand testarea strii de imunitate indus prin vaccinare, conform normativelor elaborate de autoritile de sntate public; metodele au la baz titrarea Ac anti-toxin (difteric, tetanic etc) n seruri prelevate de la copii vaccinai, prin diferite tehnici. Spre exemplu se consider c un copil este protejat (prezint rezisten specific n cazul unei infecii difterice) dac titrul Ac-anti toxin difteric este mai mare de 0,03 UAI / ml (UAI = unitate antitoxic internaional). n mod asemntor se consider c exist protecie fa de tetanos dac titrul Ac-anti toxin tetanic este mai mare de 0,01 UAI / ml. Se pot face teste de susceptibilitate, in vivo, pentru a verifica dac persoana investigat este sau nu protejat fa de o eventual infecie. n acest scop se practic IDR. n istoria medicinii au 272

intrat IDR Dick, care permite testarea susceptibilitii fa de scarlatin (toxina este elaborat de ctre streptococul de grup A lizogenizat) i respectiv IDR Schick, care permite testarea susceptibilitii fa de difterie (toxina este elaborat de ctre bacilul difteric lizogenizat). o Ambele IDR se realizeaz similar din punct de vedere tehnic; o Spre ex. n cazul IDR Schick se injecteaz n treimea medie a antebraului, strict intradermic o cantitate de 0,1 ml toxin difteric diluat corespunztor. n cazul n care n sngele persoanei testate se gsete o cantitate de Ac anti-toxin mai mare de 0,03 UAI / ml, toxina inoculat va fi neutralizat i nu va aprea nici o modificare la locul inoculrii (lipsa eritemului semnific faptul c persoana testat nu este susceptibil s fac difterie, n cazul n care se infecteaz cu un bacil difteric toxigen). n cazul n care persoana respectiv nu prezint Ac anti-toxin difteric, Ag inoculat va conduce la apariia unui eritem la locul de inoculare. 22. 2. 3. Terapia sau profilaxia specific (imunoterapie pasiv) Administrarea de imunoglobuline specifice omologe, obinute de la persoane imunizate (natural sau artificial) fa de o anumit maladie infecioas, de ex. n imunoterapia infeciei cu Clostridium tetani (tetanos) se pot administra intramuscular 3-6.000 UAI. Administrarea de seruri imune heterologe, obinute prin hiperimunizarea cailor, n tratamentul tetanosului, difteriei, botulismului etc. Terapia bolilor n care mecanismul patogenic implic exotoxine trebuie instituit ct mai rapid, deoarece exotoxinele pot fi neutralizate numai atunci cnd se gsesc n circulaie. Pe de alt parte, administrarea de ser heterolog trebuie realizat numai n caz de necesitate (datorit strii de hipersensibilitate care ar putea fi indus i care ar duce la reacii adverse).

23. Reacii Ag-Ac cu reactivi marcai (MI Popa)


Reamintim c, n funcie de natura antigenului, metodele aplicate pentru vizualizare, scopul urmrit exist mai multe tipuri de reacii Ag-Ac, i anume: reacii de precipitare reacii de aglutinare reacia de fixare a complementului (RFC) reacii de seroneutralizare. Dac n cazul primelor 2 tipuri de reacii vizualizarea se poate face direct (cu ochiul liber, cu ajutorul unei lupe etc) n cazul RFC i RSN este necesar utilizarea unor sisteme indicator. n continuare vom discuta despre reaciile Ag-Ac n care pentru interpretare este necesar marcarea reactanilor, ceea ce se poate face: - izotopic (radio immunoassay, RIA); - enzimatic (enzyme-linked immunoassay, ELISA); - fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA); - chemiluminiscent (chemiluminiscent assay, CLA) etc. n prezent aceste metode sunt extrem de folosite avnd avantajul unei mari sensibiliti, sunt automatizate i adaptabile la testri utile n toate disciplinele bio-medicale.

273

24. Inflamaia i procesul infecios (MI Popa, Andreea Bara, Milena Tocu)

24. 1. Inflamaia 24. 1. 1. Inflamaia este un proces fiziopatologic complex ce include: fenomene alterative, fenomene de tip reactiv, vasculo-exudative i proliferative (este vorba despre o reacie tisular nespecific, cu caracter de aprare local) i fenomene reparatorii. Inflamaia are drept principal scop limitarea aciunii i eventual neutralizarea agentului agresor (indiferent de natura acestuia). Cu alte cuvinte, discutm despre fenomenul inflamator i n cadrul unor agresiuni microbiene (bacteriene, fungice, parazitare, virale, prionice), dar inflamaia reprezint un concept mult mai complex (apare n mult mai multe circumstane, dect n cele infecioase). (Figura nr. 1) Inflamaia poate interesa esuturi, organe, sisteme sau chiar ntregul organism i are drept semne / simptome clasice, urmtoarele: tumor (umflare, edem), rubor (eritem, nroire local), calor(temperatur crescut n zona n care evolueaz fenomenul inflamator), dolor(durere), nsoite sau nu de functio laesa (tulburri funcionale mai ample sau mai puin ample, mergnd pn la impoten funcional, de ex. imposibilitatea deplasrii membrului inferior datorit unei inflamaii la articulaia genunchiului, n cadrul unei infecii diseminate cu Neisseria gonorrhoeae). 24. 1. 2. Exist o mare diversitate de ageni determinani ai unui proces inflamator, printre acetia putnd fi enumerai: - diferiii ageni fizici (radiaii, frig, cldur, curent electric, traumatisme etc.); - microorganismele (prioni, virusuri, bacterii, fungi, parazii); - agenii chimici exogeni, unii nc necunoscui pn n acest moment, dar exemplificarea ncearc s dea n primul rnd sensul diversitii i s explice faptul c fenomenul inflamator poate fi determinat de foarte multe substane dintre care vor fi enumerate doar cteva, exogene (ex. ulei de croton, terebentin, caolin, dextran etc) i / sau endogene (uree, acizi biliari etc.), care produc leziuni la nivelul sediului eliminrii lor din organism pe alte ci dect cele fiziologice (de exemplu n situaia apariiei unui reflux bilio-gastric). Indiferent de agentul determinant, n urma aciunii acestuia va putea aprea o afectare a vaselor mici, a esutului colagen (noiune foarte important pe care o vom rentlni n cadrul discutrii diferitelor maladii, cu sau fr o determinare precizat), a proteinelor interstiiale etc., rezultnd astfel eliberarea i de cele mai multe ori activarea unor mediatori i a unor enzime. Acestea din urm pot fi considerate mecanismelele de declanare sau trigger pentru procesul inflamator. n rezumat, inflamaia reprezint reactivitatea diferitelor structuri ale organismului, structuri care aparin diferitelor reele informaionale (de exemplu reeaua imun ce include organe ale sistemului imun, celule ale sistemului imun, substane sintetizate i eliberate n cursul reaciilor imune, inter-relaii mediate celular sau umoral etc) ce declaneaz diferite tipuri de rspunsuri care urmresc, cel puin n stadiile iniiale, s realizeze o reechilibrare i aducere la normal, la situaia anterioar intrrii n contact cu agentul agresor. Dintre variantele de posibile reacii putem s amintim:

modificri la nivelul microcirculaiei, cu creterea calibrului vascular, creterea permeabilitii vaselor mici i scderea vitezei de circulaie (staz); modificri ale hemostazei i respectiv marginaia, diapedeza, migrarea leucocitelor.

Rezultatul acestei reactiviti este reprezentat de ex. de apariia exsudatului inflamator (care poate fi examinat prin metode de laborator). 274

Aa cum am menionat mai sus, toate aceste fenomene sunt declanate pentru neutralizarea activitii agentului determinant (al inflamaiei). Fenomenele vasculo-exsudative, la fel ca i exsudatul inflamator, ncearc s limiteze efectele produse de agentul pro-inflamator i s mpiedice extinderea procesului inflamator spre zonele nvecinate sau la nivelul ntregului organism. n cazul n care aceste activiti au succes, alte fenomene vor conduce la asanarea focarului inflamator. Aceste fenomene, n ansamblu, pot determina: - vindecarea anatomic n totalitate (restitutio ad integrum), - vindecarea nsoit de cicatrizare sau - cronicizarea inflamaiei. Aa cum am aminitit, procesul inflamator este un proces fiziopatologic. Cel mai frecvent exist tendina ctre vindecarea esuturilor lezate. Inflamaia devine un fenomen patologic n cazul n care sistemele de control sunt dezorganizate sau atunci cnd procesul inflamator se cronicizeaz. Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de agentul determinant. Chiar dac acesta este reprezentat de un traumatism prin compresiune, o neptur sau o tietur (de ex. cu un instrument chirurgical), o arsur (indiferent de procentul de tegument afectat), de bacterii, virusuri, parazii, sau este vorba de o necroz (mortificare) tisular care apare n cursul dezvoltrii unui neoplasm (cancer) sau n urma apariiei metastazelor tumorii primare, n cursul procesului inflamator va rezulta sinteza i eliberarea reactanilor de faz acut (RFA). Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea explica (parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre acelai agent etiologic. Spre exemplu, Salmonella enteritidis serotipul typhimurium produce inflamaii proliferative la nivelul sistemului limfatic i respectiv inflamaii exsudative n parenchimul pulmonar. Mycobacterium tuberculosis, agentul etiologic al tuberculozei, produce inflamaii alterative (la nivel pulmonar), inflamaii exsudative (la nivel pleural) sau inflamaii proliferative (la nivel dermic). 24. 1. 3. Din punct de vedere didactic, etapele inflamaiei sunt urmtoarele: 1.Etapa de declanare, n care agentul determinant produce modificri la nivelul esutului interstiial i n celulele parenchimatoase. Rezultatul detectabil prin metode de laborator este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze. Factorii eliberai conduc la apariia rspunsului inflamator acut, respectiv: - vasodilataie capilar (eritem, nroire), - exsudare de proteine plasmatice (edem, umflare) i - acumulare de leucocite PMN. Principalele proteine care apar n aceast etap sunt componentele sistemului complement, dar i diferite citokine. Elementele celulare importante n realizarea procesului inflamator sunt reprezentate de sistemul monocit-macrofag (sistemul mononuclear fagocitar), colagenul vascular i celulele endoteliale. Este de menionat i subliniat rolul important al ficatului. Acumularea de celule inflamatorii la locul unde se afl agentul determinant este esenial n declanarea inflamaiei. Dorim s menionm c examinarea prin metode de laborator a prezenei acestor celule (de ex. ntr-o inflamaie de natur infecioas aprut la nivel faringian, realizm un frotiu colorat i n primul rnd cutm s identific prezena leucocitelor PMN, astfel avnd o informaie care susine ipoteza unei infecii bacteriene) poate fi foarte util. PMN i macrofagele sunt atrase de moleculele chemotactice i migreaz direcionat de aceste molecule prin procesul de diapedez, iar la locul inflamaiei fagociteaz, endociteaz, secret enzime lizozomale i genereaz anioni superoxid. Pe de alt parte, leucocitele PMN i macrofagele prezint receptori specifici de suprafa pentru componenta C5a a sistemului complement, pentru CCF (crystal-induced chemotactic factor) i LTB4 (leucotriena B4), precum i pentru peptidele din factorii chemotactici. Aceste peptide servesc cuplrii PMN-factor chemotactic i astfel fagocitele se ndreapt spre locul unde acesta a fost produs. Ajungnd la nivelul respectiv, 275

PMN sau macrofagele i pierd configuraia rotund, devin oarecum triunghiulare, cu baza spre factorul chemotactic. Pentru ca modificarea de form s fie posibil, are loc o rearanjare a elementelor din citoschelet, microtubulii genereaz o polarizare fa-spate, filamentele de actin se acumuleaz n faa i n spatele celulei. Se asigur astfel forele necesare deplasrii (motilitatea celular depinde de polimerizarea monomerilor de actin n filamente de actin). (Figura nr. 2) Fagocitarea agentului determinant al procesului inflamator (de ex. o structur bacterian) este favorizat de opsonizare. Materialul fagocitat este inactivat la nivelul fagolizozomilor (atunci cnd acest lucru este posibil) i / sau transformat n superantigen cu rol n declanarea unor cascade de reacii imune. Pn n acest moment, sistemul complement a reprezentat elementul esenial, fie c a fost activat pe cale direct sau pe cale altern. Fragmentele rezultate n cascada complementului particip la stimularea secreiei macrofagice (mediatori ai rspunsului inflamator acut). Activitatea leucocitelor PMN este facilitat i de prezena unei ntregi game de proteine active de tipul moleculelor de adeziune celular (selectine, integrine, ICAM-1 (intercellular adhesion molecule), ELAM-1 (endothelial cell leucocyte adhesion molecule), GMP-140, adezine, LECAM-1 (leucocyte endothelial cell adhesion molecule), ISCOM (immunostimulating complex), PAF, MAC (membrane atack complex), MACIF (MAC inhibitory factor), precum i o serie de proteine sintetizate i eliberate de ficat drept reactani de faz acut (RFA). Dintre RFA am putea meniona: proteina C reactiv (PCR este secretat n mod predominant de ficat i esuturile adipoase ca rspuns la stresul inflamator i este reglat, n mare parte, de interleukina-6. Valoarea semnificativ pentru prezena inflamaiei este de 1mg/dl sau mai mult. Fiind de ncredere i uor de dozat, este foarte utilizat n practica medical ca metod de screening i monitorizare a inflamaiei, ns nu trebuie s uitm ca PCR poate fi crescut i n sarcin sau n arsuri etc). (1) Ali RFA sunt:a2-macroglobulina, a1-antitripsina, a1-antichimotripsina, fibrinogenul, haptoglobina, hemopexina, ceruloplasmina, componenta C3 i amiloidul P seric. Am subliniat cu caractere speciale RFA care se testeaz mai frecvent n practic, n ara noastr. Aceste proteine de faz acut mediaz procesul inflamator, n cursul cruia se i consum. Majoritatea sunt glicoproteine sintetizate de ficat (mici cantiti sunt sintetizate i de ctre macrofage). Rolul RFA nu este pe deplin elucidat. Se cunoate, totui, c o serie de RFA sunt implicai att n procesele de necrobioz ct i n cele de remaniere tisular. Informaii cu privire la existena unui proces inflamator putem obine i verificnd valoarea VSH. n continuare, evoluia procesului inflamator este determinat de tipul agentului agresor, agresivitatea acestuia i momentul declanrii conflictului imun. Acesta din urm corespunde de regul apariiei semnelor clinice (de ex. febr). n completare la rspunsul celular, citokinele sintetizate de ctre diferitele celule stimulate specific, antigene, mitogeni, endotoxine etc. vor influena / stimula i activitatea celulelor productoare de citokine, rezultnd sinteza i eliberarea de noi tipuri de citokine. Se constituie anse de tip feed-back endocrine i autocrine, care sporesc sinteza de citokine de ctre o singur celul, n timp ce o singur citokin poate aciona asupra mai multor celule. (Figura nr. 6) Spre exemplu, IFN-g(sintetizat i eliberat de limfocitul T) are cel puin trei aciuni importante i anume: deviaz sinteza la nivelul mduvei osoase hematopoietice spre linia monocitomacrofagic, activeaz exprimarea Ag HLA de clasa a II-a la nivelul membranei macrofagelor i crete puterea de fagocitoz a sistemului MM n vederea fagocitrii att a actualelor antigene, ct i a viitoarelor complexe imune ce se vor constitui n cursul procesului inflamator. Aproape simultan, celulele endoteliale reacioneaz elibernd diferii produi de secreie, precum endotelinele (ET) i EDRF (endothelium-derived relaxing factor). Jocul dintre cele dou 276

proteine vasoactive condiioneaz pentru un timp aportul local de oxigen i nivelul acidozei. Iniial se elibereaz local factorii vasodilatatori (EDRF) i NO, care au drept scop creterea fluxului sanguin local, cu creterea atraciei de celule ale rspunsului imun la locul impactului cu agentul determinant al procesului inflamator. EDRF este rapid inactivat de hemoglobin i de substane antioxidante (care apar n urma stimulrii activitii PMN dar i datorit prezenei eritrocitelor). Pe msur ce debitul sanguin local crete (determinat de sistemul kinin / bradikin), crete i sinteza de EDRF (EDRF are ns o via de numai 6-10 secunde). Vasodilataia local se dezvolt pn n momentul n care celulele endoteliale, fiind comprimate de edemul perilezional, ncep s sintetizeze i s elibereze local endoteline (ET), n special ET1. Aceast endotelin (care are de asemenea o via foarte scurt) induce vasoconstricie brutal i foarte intens, tocmai pentru scderea debitului sanguin i limitarea amplitudinii rspunsului inflamator local (endotelina este considerat cel mai puternic vasoconstrictor din organism). Rezultatul etapei de declanare este reprezentat de rspunsul inflamator acut, manifestat prin vasodilataie capilar (eritem, nroire), exsudarea proteinelor plasmatice (edem) i acumulare de leucocite PMN. 2.Etapa efectoare, care la rndul ei se submparte n trei subetape: A) Subetapa molecular, n care se activeaz: - cascada complementului; - sistemul de coagulare-fibrinoliz; - diferitele ci de metabolizare ale acidului arahidonic (care provine din peretele bacterian n urma scindrii date de fosfolipaz), respectiv: a) calea ciclooxigenazei prin care rezult prostaciclin (PGI) care determin vasodilataie, inhib agregarea trombocitelor i aderarea PMN, prostaglandin (ex. PGE2) i tromboxan (TxA2) care determin agregare plachetar, are efect vasoconstrictor i de cretere a permeabilitii capilare); b) calea lipooxigenazei, care duce la apariia leucotrienelor, de exemplu LTD4, LTG4(care determin bronhoconstricie, vasoconstricie sistemic, vasodilataie la nivelul microcirculaiei) i c)calea epooxigenazei; (Figura nr. 7, Cile ciclooxigenazei si liopooxigenazei) - sistemul kinin-bradikinin; - familia citokinelor; - superfamilia interferonilor; - sistemul extracelular gunoier al actinei. Actina este o protein care se gsete n cantiti mari i este responsabil pentru motilitatea celular, schimbarea formei i mrimii celulelor (care depinde de proprietatea monomerilor de a polimeriza). Dup apoptoz, actina eliberat are tendina de a polimeriza, ducnd la apariia de filamente de actin n vase, cu un rezultat catastrofal (de exemplu n ocul septic, necroza hepatic etc). Exist ns i un mecanism homeostatic ce are la baz dou proteine plasmatice, gelsolina i proteina Gc (care sunt depite ns din punct de vedere funcional n distrugerile masive). B) Subetapa vascular, n care au loc modificri ale calibrului vaselor mici, ale vitezei de circulaie a sngelui, ale permeabilitii vaselor mici din aria tisular lezat. Iniial se produce vasoconstricie, n decurs de secunde / minute (are loc un aflux masiv de celule sanguine proinflamatorii - neutrofile, monocite, eozinofile - sub aciunea unor mediatori solubili eliberai din zona tisular afectat, care produc dou categorii de efecte: a) vasculare (dilataie arteriolocapilar cu creterea numrului de capilare active, hiperemie, stimularea expresiei pe celulele endoteliale din zon a unor receptori de adeziune intercelular astfel nct celulele sangiune recrutate vor adera la endoteliul vascular prin cuplaj receptorial i n final o faz de staz vascular pasiv, cu hipoxie i creterea permeabilitii vaselor mici) i b) chemotactice (celulele proinflamatorii sunt atrase ctre esutul lezionat i activate metabolic).. C) Subetapa exsudativ, n care se formeaz exsudatul inflamator (plasma exsudat, bogat n proteine i LDH) la care se adaug elementele figurate extravazate, elementele celulare mobilizate local i produi rezultai din diferite modificri locale. Prin constituenii si celulari i 277

moleculari, exsudatul asaneaz focarul inflamator i tinde s blocheze procesul infecios la poarta de intrare, constituind bariera fibrino-imuno-leucocitar. 24. 1. 4.Consecinele activrii mecanismelor implicate n procesul inflamator n funcie de cascadele activate poate rezulta un anumit tip de inflamaie. Putem lua n discuie diferitele forme clinice evolutive (acut, subacut, cronic) precum i formele anatomoclinice. 24. 1. 4. 1.Evoluia spre cronicizare se datoreaz agenilor inflamatori care au proprietatea de a stimula n special sistemul efector timodependent, autoantigenelor sau persistenei stimulului inflamator. Inflamaia cronic este din ce n ce mai mult privit nu numai ca o consecin a unui risc infecios continuu, dar i ca o parte integrant a multor boli neinfecioase, cum ar fi disfunciile autoimune, diabetul sau bolile cardiovasculare etc. Astfel, nu este surprinztor c unele sisteme hormonale, cum ar fi sistemul renin-angiotensin (SRA), care a fost descris prima dat n contextul bolilor cardiovasculare, s-a dovedit a fi factorul major de reglare a rspunsului inflamator. (4) (Figura nr. 8) 24. 1. 4. 2.Evoluia spre vindecare presupune: - asanarea focarului inflamator (ncepe concomitent cu constituirea barierei fibrino-leucocitare i cu ndeprtarea resturilor celulare i a eventualelor microorganisme care sunt ageni determinani); devine maxim dup acumularea de leucocite PMN i macrofage. - vindecarea propriu-zis ncepe relativ rapid n cursul procesului inflamator; vindecarea ncepe aproape concomitent cu fenomenele distructive, pe care tinde s le nlocuiasc pentru a conduce la una dintre variantele evolutive menionate anterior. Varianta cea mai favorabil este reprezentat de vindecarea complet, anatomic (numit i restitutio ad integrum). Cealalt posibilitate este reprezentat de evoluia spre apariia unei cicatrici (cicatrizarea). Cicatrizarea apare n cazul unor inflamaii nsoite de fenomene lezionale ntinse, pierderi de esut i eventual de infecii i cronicizarea infeciei. 24. 1. 4. 3.Aspecte anatomo-clinice: - inflamaii alterative n care predomin procesele distrofice i necrobiotice (de exemplu n miocardita difteric sau n miozita produs de Clostridium spp.); - inflamaii exsudative n care predomin procesele exsudative i care se pot submpri n inflamaii: a) seroase (3-5% proteine, numr sczut de leucocite, cu eozinofile), de exemplu n pleurezia sau meningita produse de Mycobacterium tuberculosis; b) fibroase, destul de frecvent rezultate n urma unui proces infecios, cu acumulare de fibrinogen care determin apariia fibrinei i formarea de depozite care se organizeaz i duc la apariia aderenelor, care se organizeaz (de ex. n pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, n dizenteria bacterian, n miocardita difteric etc.); c) purulente, produse de exemplu de coci piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis etc., de ex. cu formarea de abcese; d) hemoragice, de exemplu n cium (produs de Yersinia pestis) sau n pneumonia hemoragic produs de Bacillus anthracis (extrem de grav, nsoit de hemoptizie i asociat frecvent cu pleurezie hemoragic i adenopatie mediastinal important). - inflamaii proliferative, avnd ca form particular granulomul, de aspect nodular (de ex. aprute dup infecii cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, diferite specii de Brucella sau datorate prezenei unui corp strin). (Video nr. 1, Inflamaia acut http://www.youtube.com/watch?v=yQwxHmn6tvw); (Video nr. 2, Rspunsul inflamator http://www.youtube.com/watch?v=aIzE-XsBrcg-)

Febra 278

Febra (pyrexia) este un semn i simptom medical caracterizat de creterea temperaturii corpului o anumit valoare (ex. peste 37,8C; ns este important de cunoscut valoarea temperaturii bazale, pentru fiecare subiect) datorit stabilirii unui alt punct de echilibru la nivelul centrului reglator din hipotalamus. Se acompaniaz de creterea tonusului muscular, tremurat (frison) i paradoxal, de senzaia de frig. Senzaia de cald apare odat ce noua temperatur de echilibru este atins. Etimologia termenului este dubl: din grecescul pyretos (foc)i din latinesculfevris (febr). Febra este o dovada funcionrii sistemului imun, deoarece prin aceast modificare de temperatur, organismul ncearc s distrug bacteriile i virusurile. Dar infeciile nu sunt singurul mecanism declanator al febrei. De obicei nu este nevoie de tratament antipiretic. Acesta se administreaz doar n cazurile n care temperatura crete foate mult sau pentru confortul pacientului. Hipertermia, spre deosebire de febr, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depirea capacitii de termoreglare (ex. o zi n soare nnbuitor fr consum adecvat de lichide) sau supranclzirea (ex. dup un efort fizic foarte intens). Temperatura se msoar clasic la nivel anal, la nivel axilar, n cavitatea bucal, sau la nivel auricular. Vorbim despre febr dac temperatura intrarectal depete 37,5-38,3C i/sau cea din cavitatea bucaldepete 37,7 C (n mare vorbim de subfebr ntre 37-38C i de febrpeste 38C). Persoanele main vrsta au o abilitate sczut de a genera caldur, astfel c i o temperatur nu foarte crescut poate fi expresia unei afeciuni grave. Cauze posibile de febr ar fi: hemoragia intracranian, administrarea anumitor medicamente, boli ale esutului colagen, distrucii tisulare de diverse cauze (traumatisme, intervenii chirurgicale, iradieri, arsuri, infarcte), neoplazii, hemopatii maligne,reacii alergice, conflicte de ordin psihologic, probleme neurologice, endocrine, metabolice sau pot fi de cauz iatrogen (de cauz medical). Infecia este ce mai comun cauz de febr. Febra infecioasse instaleaz n: infecii generalizate acute i cronice fr semne de localizare (n viroze, bacteriemii, rikettsioze, spirochetoze etc.); infecii generale cu semne de localizare (tuberculoza pulmonar ganglionar, endocardita septic etc.);infecii localizate superficiale (celulite, plgi infectate) sau profunde (flegmon, abces subfrenic, abces apendicular, salpingite, pielonefrite, colecistite) etc. Un trigger al febrei se numete pirogen. Pirogenul determin secreia de PGE2, care acioneaz la nivelul hipotalamusului (aria preoptic), determin un rspuns sistemic (simpatic) de cretere a temperaturii (prin vasoconstricie, secuse ale muchilor, catabolism crescut i creterea activitii diferitelor organe endocrine. Aceste modificri duc i la creterea TA. n cazul nou nscuilor, se mai obine cldur n principal prin consumarea grsimii brune perirenale. Reversul presupune vasodilataie i transpiraie. PGE2 provine din acidul arahidonic, sub aciunea PLA2, COX-2 i PGE2-sintetaza. Pirogenii pot fi endogeni sau exogeni. LPZ-ul din peretele bacteriilor Gram - (precum i alte superantigene) reprezint exemplul clasic de antipiretic exogen. Pirogenii endogeni sunt citokinele. Il-1; Il-6; TNF-sunt pirogeni majori. Ali pirogeni: Il-8, macrophage inflammatory protein-, IFN , si . Febra evolueaz n 3 stadii: a) stadium incrementi: stadiul de cretere a temperaturii, de la cteva minute la cteva ore, zile sau sptmni. b) stadium fastigium: stadiul de temperatura maxim reprezint perioada de apogeu a temperaturii. c) stadium decrementi stadiul de scdere a temperaturii, de declin sau defervescen se caracterizeaz prin creterea termolizei. Iat tipurile de febr, fiecare patologie caracterizndu-se prin una din urmatoarele: Febra prelungit. Orice stare febril care persist mai mult de trei sptmni reprezint o febr 279

prelungit. Febra continueste o febr ridicat n care diferena dintre temperatura matinal i cea vesperal timp de mai multe zile nu depete 1 grad C. Ea este ntlnit n pneumonia franc lobar, febra tifoid (n perioada de stare a bolii), tifosul exantematic, osteomielit etc. Febra remitenteste febra ce se caracterizeaz prin aceea c diferena dintre temperatura matinal i cea vesperal depete 1 grad C. Ea apare n septicemii, supuraii pulmonare, tuberculoza pulmonara grav, n perioada a doua a febrei tifoide. Febra intermitentse caracterizeaz printr-o alternan n timp de 24 de ore a temperaturii normale cu febr mult ridicat. Cnd oscilaiile devin foarte mari (ex. 3-5 grade C pe parcursul a 24 de ore) febra foarte ridicat oscilnd cu temperatura normal sau chiar subnormal vorbim de febr hectic. Ea apare n supuraiile pulmonare, infecii urinare i unele septicemii etc. Febra recurentevolueaz cu febr ridicat i continu timp de 5-8 zile alternnd cu perioade afebrile. Ea apare n limfogranulomatoza malign, tuberculoza pulmonar, infecii urinare sau biliare, leptospiroze etc. Febra recidivanteste o variant de febr recurent caracterizat prin faptul c ascensiunile termice survin la intervale foarte variate i mbrac caracter de puseuri (o ntlnim n colangite, pielite, carcinom i unele forme de tuberculoz etc.). Febra ondulanteste caracterizat prin ascensiuni termice ce se repet periodic. Ridicarea temperaturii este progresiv, iar defervescena este lent pn la afebrilitate sau subfebrilitate urmat de cicluri repetate. Febra de tip inverseste febra n care temperatura matinal este mai ridicat dect cea vesperal. Apare n tuberculoza pulmonar grav, supuraii profunde i inflamaii cavitare etc. Febra neregulatse refer la febra care nu poate fi ncadrat n nici unul din tipurile descrise i care nu poate fi descris aa cum s-a menionat mai sus. (3) Febra de origine necunoscuteste luat n consideraie atunci cnd, dup 1 sptmn de ncercri n a pune diagnosticul i a stabili etiologia febrei (clinic, paraclinic, alte metode de laborator), nu am reuit s identific o cauz pentru creterea temperaturii.

VSH-ul VSH reprezint rata la care sedimenteaz hematiile dintr-o prob de snge cu anticoagulant, ntr-o or. n mod normal hematiile dintr-o prob de snge sedimenteaz lent datorit ncrcturii de suprafa negative a acestora, care face ca celulele adiacente s se resping cnd distana intercelular scade sub un nivel minim. n anumite afeciuni care determin creterea proteinelor de faz acut (alfa-globuline, fibrinogen) sau creterea valorii imunoglobulinelor, proteinele plasmatice se ataeaz pe suprafaa hematiilor i reduc potenialul de suprafa determinnd agregarea hematiilor i creterea sedimentrii acestora. Care sunt recomandrile efecturii acestui test? VSH poate fi folosit ca test screening n suspiciunea unor reacii inflamatorii, infecii, boli autoimune, discrazii plasmocitare, dar i pentru monitorizarea evoluiei i tratamentului n anumite boli (ex. arterit temporal, polimialgie reumatic, artrita reumatoid, reumatism articular acut, lupus eritematos sistemic, boal Hodgkin, tuberculoz, endocardit bacterian). De reinut: VSH nu este un test diagnostic pentru o anumit boal i nu trebuie utilizat pentru screening-ul pacienilor asimptomatici. Sngele se recolteaz a jeun (pe nemncate) sau postprandial (dup mas) pe anticoagulant (vacutainer cu dop negru cu citrat de sodiu 3,8 % tamponat). Dup prinderea venei se desface garoul pentru a nu liza hematiile. S nu uitm c o mas lipidic poate determina alterri 280

plasmatice i modific i VSH-ul. Se va recolta ct permite vacuumul; raportul snge/anticoagulant trebuie s fie 4/1. Pentru citire se folosesc 2 metode: 1. metoda Westergren: se aeaz tubul n poziie vertical ntr-un suport gradat milimetric i se citeste nivelul de sedimentare a hematiilor n mm dup 1 or; n unele teste este citit rezultatul i dup un interval de 2 ore, dar aceasta nu furnizeaz informaii suplimentare. (Figura nr. 3) 2. Metoda automat (cititor automat de VSH) Proba este stabil timp de 2 orela temperatura camerei (18-26o C): testul ar trebui efectuat la cel mult 2 ore dup recoltare. Dac este ratat citirea la 1 or, sngele nu poate fi remixat i refolosit pentru VSH. Testul trebuie efectuat la temperatura camerei. La 2-8o C i menine stabilitatea 12 ore; dac sngele a fost refrigerat, trebuie reechilibrat la temperatura camerei naintea efecturii testului. 1. Variaii fiziologice: a. n menstruaie: VSH crete n timpul ciclului menstrual, atingnd nivelul maxim n faza premenstrual i scznd n timpul menstruaiei. b. n sarcin: VSH-ul crete continuu ncepnd cu a 4-a sptmn de sarcin pn n a 3-a sptmn postpartum i atinge un nivel maxim de pn la 45 mm/h n prima sptmn postpartum. c. la nou-nscui: VSH-ul este sczut datorit hematocritului crescut i nivelului sczut de fibrinogen. d. la femei vrstnice (70-89 ani) aparent sntoase VSH poate atinge valori de pn la 60 mm/h. 2. Factori care determin creterea VSH: a. Refrigerarea sngelui; b. Anemia: datorita numrului sczut de eritrocite; n anemia feripriv creterea VSH nu corespunde numrului de eritrocite deoarece microcitoza concomitent ncetinete sedimentarea hematiilor; c. Macrocitoza.; d. Medicamentele: contraceptive orale, dextrani (datorit absorbiei pe suprafaa eritrocitelor), anticonvulsivante, carbamazepin, cefalotin, ciclosporin A, dexametazon, etretinat, fluvastatin, hidralazin, indometacin, isotretinoin, sulfametoxazol, ofloxacin, lomefloxacin, metisergid, misoprostol, procainamid, propafenon, quinin, zolpidem etc. 3. Factori care determin scderea VSH: a. Temperaturi >20-24o C; b. Hiperglicemia; c. Hiperlipoproteinemia (n special chilomicronii); d. Hipofibrinogenemia; e. Policitemia; f. Leucocitoza; g. Prezena de eritrocite anormale: microcite, drepanocite, echinocite, poichilocite, stomatocite, acantocite, sferocite (prin scderea suprafeei necesare pentru agregarea hematiilor); h. Caexia; i. Medicamentele: aspirin, aur, corticotropin, ciclofosfamid, glucocorticoizi, hidroxiclorochin, metotrexat, antiinflamatorii nesteroidiene, penicilamin, sulfasalazin, tamoxifen, trimetoprim etc. Concomitent, macrofagele dezvolt o serie de activiti i anume: pregtesc superantigenul, elibereaz n circulaie monokine i i expun (la suprafaa membranei) Ag HLA de clasa a II-a (vezi i capitolul 11). (Figurile nr. 4 i 5)

281

24. 2. Procesul infecios

Infecia reprezint un tip particular de relaie ntre microorganismele condiionat patogene i patogene pe de o parte i organismul gazd pe de alt parte. Pentru ca s se declaneze un proces infecios i s apar infecia, microorganismele trebuie s ptrund n organismul gazd, s depeasc barierele i mecanismele de aprare, s-l colonizeze, s se multiplice i eventual s intre ntr-un lan de transmitere prin intermediul cruia poate contamina o nou gazd. Procesul infecios definete ansamblul relaiilor stabilite ntre microorganism i gazd, aprute dup infecie. Starea de boal (manifest clinic sau fr ca modificrile aprute s fie exteriorizate i constatabile de ctre medicul clinician) se datorete interaciunii dintre microorganism (bacterie, parazit, virus, fung, prion) - gazd i este urmat de apariia unor simptome (de ex. temperatur peste 39C, cefalee, eliminarea unor scaune diareice etc.) i de reacii funcionale din partea gazdei (de ex. stare general modificat, senzaie de febr, frisoane, creterea numrului de respiraii pe minut, creterea numrului de bti cardiace pe minut etc). Infecia nu este urmat obligatoriu de starea de boal, putnd fi inaparent, subclinic sau latent. Poate aprea i starea de purttor i / sau eliminator de germeni. Datorit infeciei pot aprea, sau nu, manifestri foarte variate n funcie de: - agentul infecios (factori de patogenitate, gradul de virulen); - organismul gazd (rezistena specific i nespecific); - mediul extern (factori geografici, climatici, sociali, economici etc). Manifestri subclinice a) Infecia inaparent nu se asociaz cu semne sau simptome i ar putea fi decelat numai prin examene de laborator. Spre deosebire de infecia latent, infecia inaparent este limitat n timp i poate contribui la crearea unei stri de imunitate (ex. infecia cu Neisseria meningitidis, infecii cu Haemophilus influenzae etc). b) Boala subclinic se deosebete de infecia inaparent prin apariia unor tulburri funcionale (febr, transpiraii, dureri etc) i chiar a unor leziuni organice (de multe ori fr o simptomatologie distinct / specific, dar exist i situaii n care nu este decelat nici un simptom, de exemplu n formele subclinice de hepatit viral acut). c) Infecia latent este asimptomatic, agenii patogeni putnd persista timp ndelungat n esuturile gazdei. Dup un timp variabil, infecia latent poate deveni evident clinic, de obicei n urma aciunii unor factori favorizani externi sau interni, proprii organismului (de exemplu infecia cu Mycobacterium tuberculosis care este un microorganism condiionat patogen, infecteaz circa o treime din populaia globului dar produce tuberculoz la circa 8 milioane de persoane, pe an). d) Starea de purttor de germeni se refer la bolnavul cu o stare infecioas, la persoana aflat n convalescen, nainte de eradicarea infeciei suferite dar i la persoanele aparent sntoase care adpostesc germeni patogeni (de exemplu Salmonella typhi la nivelul veziculei biliare, microorganismul putndu-se cantona la acest nivel dup o febr tifoid). Starea de purttor reprezint atingerea unui echilibru relativ ntre cele dou verigi, de multe ori fiind nsoit de eliminarea n mediu a germenilor care au produs infecia i se afl n diferite focare latente (precum n exemplul de mai sus, situaie n care starea de purttor se elimin doar prin extirparea veziculei biliare). De exemplu, n ara noastr apar din cnd n cnd izbucniri epidemice (outbreak) de febr tifoid, dup inundaii, dac n zona respectiv exist un purttor de S. typhi, iar condiiile igienico-sanitare pentru prevenirea transmiterii pe calea fecaloral nu sunt respectate. n cursul strii de purttor exist teste biologice i imunologice care pot certifica prezena microorganismelor (direct, de ex. dup cultivare sau amplificare genic i 282

/ sau indirect). Manifestri clinice a) Infecia local, n care agenii patogeni rmn cantonai la poarta de intrare i n vecintatea acesteia, unde se multiplic (de exemplu n furunculul stafilococic, infecia amigdalian produs de streptococul piogen). b) Infecia de focar este o form particular a infeciei locale. Evolueaz cronic, cu manifestri locale minime (acestea putnd chiar lipsi), adesea ns cu tulburri la distan (subfebrilitate, mialgii, artralgii etc.) a cror apariie nc nu a fost complet explicat. c) Infecia regional cuprinde un teritoriu mai extins, de obicei aferent porii de intrare, prin afectarea vaselor limfatice i a ganglionilor limfatici regionali (de exemplu, infecia tuberculoas, cu producerea de manifestri anatomo-clinice i paraclinice relativ caracteristice). d) Boala infecioas cu manifestri clinice la nivelul ntregului organism (sistemice), n care germenii patogeni disemineaz pe cale circulatorie (bacteriemie) n diferite esuturi i organe, la distan de poarta de intrare sau de focarul infecios primar. Se descriu dou forme: - boala infecioas ciclic, cu evoluie regulat, n mai multe etape care se succed ntr-un timp limitat, de exemplu febra tifoid produs de S. typhi. - septicemia (conform nomenclaturii mai vechi) are evoluie clinic neregulat, de obicei foarte grav, fiind definit prin existena unei pori de intrare, a unui focar septic (detectat sau suspectat), bacteriemiei i a unor metastaze septice care pot deveni focare secundare; din focarele secundare au loc descrcri secundate de germeni n circulaie. Drept bacteriemie definim prezena pasager de germeni viabili n snge. Bacteriemia nu duce, de regul, la apariia de metastaze septice i nici la apariia unui tablou clinic manifest. Bacteriemii pot apare de ex. dup extracii dentare sau intervenii chirurgicale pe focare septice, ca i n multe dintre bolile infecioase (exemplu n pneumonia cu pneumococ, meningita cu meningococ etc; se explic astfel utilitatea recoltrii de snge pentru hemocultur, cu toate c produsul patologic principal este reprezentat de sput n primul caz i lichid cefalorahidian n al doilea caz). n momentul de fa, s-a decis utilizarea noiunii de sepsis, entitate care reunete existena unui proces infecios i respectiv existena rspunsului inflamator sistemic. Starea de sepsis include prin definiie dou sau mai multe din urmtoarele elemente:

febr (peste 38C) i frisoane, sau hipotermie (sub 36C); tahicardie (bti cardiace peste 90/minut); polipnee (peste 20 respiraii / minut) cu hiperventilaie sau Pa CO2sub 32 mmHg; leucocitoz peste 12.000 / mm3sau leucopenie sub 4.000 / mm3, cu forme tinere n circulaia periferic (peste 10%), respectiv deplasarea la stnga a formulei leucocitare.

Sindromul septic reunete sepsisul i modificrile circulatorii i funcionale la nivelul diferitelor organe i sisteme, care conduc la hipoxemie, oligurie, alterri psihice etc. ocul septic evolueaz cu hipotensiune (presiunea sistolic scade cu peste 40 mmHg fa de nivelul bazal) i sepsis sever. Sindromul de disfuncie multiorganic (MODS, Multiorgan Dysfunction Syndrome) reprezint ultimul i cel mai grav stadiu evolutiv, cu letalitate mai mare de 80%; este un sindrom clinic, cu apariia insuficienei la 2 sau mai multe organe sau sisteme. Agresiunea microbian declaneaz un rspuns inflamator sistemic, care aa cum a fost prezentat anterior, din mecanism de aprare poate deveni un fenomen de autodistrugere. Dup aspectul evolutiv, bolile infecioase pot fi: - acute i - cronice (persistente), atunci cnd agentul patogen persist i acioneaz vreme ndelungat n 283

esuturile gazdei, de exemplu n bruceloz. Poarta de intrare Pentru a produce infecia (dup parcurgerea etapelor menionate anterior privind definiia infeciei) i a invada organismul gazd dup multiplicare sau prin intermediul unor produse toxice specifice (ex. exotoxine), fiecare microorganism patogen utilizeaz una sau mai multe ci de ptrundere. Spre exemplu, vibrionul holeric (Vibrio cholerae) ptrunde pe cale digestiv (ex. consum de ap contaminat), se multiplic i produce manifestrile caracteristice la nivel intestinal (rolul esenial revenind toxinei holerice) etc. Difuzarea n organism a microorganismului patogen de la poarta de intrare se realizeaz n diferite moduri i pe mai multe ci: - extindere local n suprafa, ex. n cazul erizipelului produs de streptococul beta-hemolitic de grup A; - extindere n profunzime, ex. n miozita produs de Clostridium spp. (C. septicum, sporogenes, histolyticum etc.); - extindere regional; - diseminare sanguin, de exemplu n febra tifoid (produs de Salmonella typhi); - diseminare pe cale nervoas, de exemplu n infecia cu virusul rabic. Perioadele bolii infecioase: - Incubaia reprezint intervalul de timp din momentul infectrii pn la apariia primelor semne i simptome ale bolii; durata incubaiei variaz n limite relativ stabile (ex. 1-5 zile n dizenterie, circa 14 zile n febra tifoid); - Invazia este de obicei concomitent cu debutul bolii, care poate fi brusc (n plin stare de sntate) sau lent progresiv; n momentul invaziei este posibil s surprindem prezena bacteriemiei (recoltm snge pentru hemocultur); - Perioada de stare se caracterizeaz prin manifestrile eseniale i deseori caracteristice ale bolii; - ncheierea evoluiei bolii, care se poate face prin: 1. convalescen, n care boala clinic a ncetat i organismul i recapt treptat capacitatea de aprare i revine la starea anterioar bolii infecioase respective; 2. vindecare, urmat de stabilirea unui grad de imunitate; n unele cazuri imunitatea este de durat, chiar i pentru tot restul vieii; instalarea rspunsului imun, precum i statusul imun n relaie cu un anumit microorganism / produs al acestuia, pot fi dovedite prin teste de laborator (reacii antigen-anticorp); pentru unele entiti este stabilit nivelul de protecie (de ex. prezena anticorpilor n valoare de 0.01 UAI/mLasigur protecie fa de apariia tetanosului); 3. cronicizare (uneori prin atingerea unui echilibru microorganism i gazd; n alte situaii cronicizarea poate crea probleme importante) sau 4. exitus, fie datorit agresivitii (virulenei) particulare a tulpinii bacteriene implicate, fie datorit incapacitii organismului de a reaciona n mod eficient.

24. 3. Povestiri adevrate 24. 3. 1. Artrita gonococic O pacient n vrst de 21 ani se prezint la camera de gard cu durere la nivelul articulaiei minii drepte evolund de circa 36 de ore. Anamneza nu a identificat existena unor traumatisme sau a unui efort fizic deosebit, care s justifice prezena acestor dureri. Medicul de gard a indicat efectuarea unei radiografii a articulaiei minii. Rezultatul radiografic nu a pus n eviden aspecte patologice. Concluzia medicului examinator a fost c este vorba de o entors (chiar i n lipsa datelor anamnestice), a aplicat o fa gipsat i a indicat tinerei s ia un 284

medicament antiinflamator (diclofenac), pe cale oral (2 50 mg / zi, timp de 5 zile) i s revin, la nevoie, pentru reevaluare. La circa 48 de ore de la debutul durerii n articulaia minii drepte, pacienta a decis s revin la camera de gard pentru c prezenta lipsa poftei de mncare, ameeli i senzaie de febr. Termometrizarea a artat c pacienta are, ntr-adevr, febr (38,3C). Discuia cu pacienta i examenul clinic au permis nregistrarea urmtoarelor date: pacienta nu a avut greuri, vrsturi, tulburri de tranzit intestinal i nici semne care s poat fi ncadrate ntrun sindrom meningean; erau prezente edem (umfltur) de culoare uor eritematoas (roiatic) al articulaiei minii drepte, cldur la nivelul acestei articulaii (n comparaie cu articulaia simetric), dificultate n utilizarea minii; la nivel palmar, bilateral, a fost pus n eviden o erupie cu mai multe elemente de culoare violacee, dureroase spontan i la palpare. De aceast dat, medicul clinician a luat n considerare mai multe variante de diagnostic. Totui, o parte dintre supoziii au putut fi eliminate relativ uor (reumatism articular acut, lupus eritematos diseminat) n timp ce datele obinute n cadrul unei anamneze mai riguros realizate (dar i n contextul n care pacienta, ngrijorat de condiia fizic personal, a fost de acord s ofere date suplimentare) au permis restrngerea ipotezelor la o reacie n cadrul unei infecii care a fost transmis pe cale sexual. Examenul ginecologic a evideniat congestie i eritem la nivelul colului uterin i leucoree (secreie abundent la nivel vaginal, cu aspect purulent). S-a recoltat secreia vaginal dar s-a realizat i o recoltare cu un tampon fin, de la nivelul endocolului (tamponul a fost introdus n endocol pe o distan de circa 1,5-2 cm). S-a administrat tratamentul minut recomandat n unele dintre infeciile cu transmitere sexual, respectiv ceftriaxon (o doz, 250 mg, injectabil, intramuscular). Examenul microscopic a relevat numeroase leucocite PMN n secreia genital i un numr mai mic de PMN pe frotiul din produsul recoltat de la nivelul endocolului. Pacientei i s-a recomandat o internare de scurt durat, ceea ce a acceptat. Dup 36 ore, medicul de gard din laboratorul de microbiologie clinic, examinnd cultura din secreia vaginal a realizat frotiuri, a executat textul oxidazei i testul superoxol i a nceput testarea sensibilitii la antibiotice i chimioterapice. Diagnosticul microbiologic a fost infecie cu Neisseria gonorrhoeae, iar diagnosticul final a fost cel de artrit gonococic. Rezultatul testrii sensibilitii la antibiotice (antibiograma difuzimetric standardizat) a demonstrat o tulpin cu sensibilitate la majoritate antibioticelor i chimioterapicelor testate, inclusiv la penicilin. Pentru mai mult siguran, dei n literatur a fost descris faptul c tratamentul minut este eficient, s-a prescris penicilin G, 1 doz la 12 ore, timp de 10 zile. n a treia zi de la internare, starea general a pacientei era bun, durerea articular diminuase semnificativ, edemul i erupia erau abia perceptibile, curba febril a nregistrat valori normale iar pofta de mncare a revenit. Comentarii cu privire la caz Exist statistici n literatura de specialitate internaional care consider c artrita gonococic reprezint una dintre cele mai frecvente cauze de artrit inflamatorie localizat la o singur articulaie, la tineri. Nu exist date statistice relevante la nivel naional. n aceste condiii, trebuie s lum n seam datele puse la dispoziie cu generozitate de CDC (Center for Diseases Control and Prevention); pe site-ul CDC se discut c 3% dintre cazurile de infecie gonococic sunt nsoite de diseminarea N. gonorrhoeae, mai frecvent la femei dect la brbai. Infecia gonococic se poate nsoi de diseminare, indiferent de calea de ptrundere. Ca i n cazul meningitei produs de meningococ, un factor de risc este reprezentat de deficiene ale sistemului complement. Sindromul infeciei gonococice diseminate include n mod clasic: dermatit, sinovit, artrit migratorie (prinznd eventual mai multe articulaii). n funcie de localizare, diagnosticul microbiologic se poate pozitiva dup cultivarea unor produse recoltate de la nivel genital, de la nivel articular sau poate fi vorba de snge. 285

O problem care poate aprea este legat de tulpinile de gonococ rezistente la antibiotice i chimioterapice, ceea ce nu a fost constatat n aceast situaie. 24. 3. 2. Antibioterapia n unele afeciuni fr etiologie microbian - o eroare discutabil? n anumite circumstane, abilitatea de a institui antibioterapia n scop profilactic poate fi considerat salutar. Un astfel de exemplu l constituie administrarea de antibiotice locale n afeciunile oculare acute de natur neprecizat (infecioas sau inflamatorie) care necesit intervenire de urgen, acest tratament salvnd, de multe ori, vederea pacientului. Totui, de cele mai multe ori, antibioticele locale (topice) sunt folosite n scop preventiv sau profilactic n terapia ocular primar, fr ca acest lucru s fie necesar. Este demonstrat statistic faptul c aproape toate keratoconjunctivitele la aduli sunt de origine inflamatorie i nu infecioas. Prin urmare, tratamentul local cu corticosteroizi reprezint alegerea adecvat. n comunitatea medical exist tendina de a limita prescrierea antibioticelor topice, n sperana ncetinirii apariiei fenomenului de rezisten la medicamentele antimicrobiene. n prezent, cea mai frecvent indicaie pentru prescrierea unui antibiotic ntr-o afeciune ocular acut este reprezentat de ctre secreia mucopurulent la acest nivel, cu recomandarea recoltrii secreiei respective i realizarea diagnosticului microbiologic direct, nainte de administrarea oricrui alt medicament. Trebuie menionat faptul c marea majoritate a presupuselor ulceraii corneene nu sunt altceva dect infiltrate leucocitare sterile, care n nici un caz nu justific administrarea de medicamente antimicrobiene. Este uimitor ns faptul c tratamentul cel mai frecvent al acestora se face cu antibiotice locale! 24. 3. 3. Urmri ale unei inflamaii n legtur cu sepsisul bacterian Este luat n discuie situaia unei paciente cu endocardit infecioas n antecedente, la care, n urma unei intervenii stomatologice (moment n care a primit profilaxie cu antibiotice) a aprut o osteit la nivel mandibular. Aceast descriere are relevan pentru mai multe aspecte care pot fi luate n discuie, pornind de la sepsisul cu germeni Gram-negativi i continund cu utilizarea corect a antibioticelor i chimioterapicelor, inclusiv situaia n care gestul chirurgical reprezint alegerea optim. De asemenea, este exemplificat o urmare a fenomenului inflamator. O pacient n vrst de 59 de ani s-a aflat n supravegherea unei clinici cu specific de boli infecioase datorit unei afeciuni valvulare pe care s-a grefat n urm cu civa ani un proces infecios. ntr-o perioad de civa ani, pacienta a necesitat mai multe controale sau intervenii stomatologice i n cteva dintre aceste cazuri a primit antibiotice, datorit faptului c interveniile au fost sngernde. Cu toate acestea, n urma uneia dintre aceste intervenii (timp n care a primit o cefalosporin cu spectru lrgit), la cteva zile de la intervenie pacienta a nceput s prezinte febr (38,8C), transpiraii, oboseal i dureri la nivelul toracelui. Numai dup nc o sptmn a decis s se adreseze spitalului (necjit datorit prea multelor spitalizri din ultimii ani), iar la camera de gard i s-a propus internarea, ceea ce pacienta a acceptat. Atitudinea a fost corect i susinut de datele anamnestice, pentru c n urm cu circa 3 ani pacienta mai fusese internat n spitalul de profil, iar diagnosticul la acea dat a fost cel de sepsis cu Enterobacterspp., ca urmare a unei extracii dentare (i de acea dat pacienta a primit antibiotice, dar tulpina izolat s-a dovedit a fi rezistent la toate medicamentele beta-lactamice care au fost testate prin antibiogram difuzimetric standardizat, inclusiv la medicamentele administrate profilactic). La internare, tensiunea arterial era n limite normale, dar auscultator medicul de gard a detectat suflu sistolic att n focarul mitral ct i n focarul tricuspidian, iar dup cteva ore de la internare, la contravizit, au putut s fie auscultate frecturi pericardice. Datele de laborator obinute n regim de urgen au relevat leucocitoz (15.850/l) cu neutrofilie (10.900 PMN/l), valori crescute ale reactanilor de faz acut (protein C reactiv 6mg/l, VSH 112 mm/or, fibrinogen 526 mg/dl) i anemie (nr. hematii 3,1106/l). A fost recoltat snge pentru trei 286

hemoculturi incubate att n aerobioz ct i n anaerobioz. Prima hemocultur a fost recoltat imediat dup internare. n dou dintre cele trei hemoculturi a fost izolat Enterobacterspp., tulpin care s-a dovedit sensibil la ampicilin, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin, carbenicilin i asocierea piperacilin-tazobactam. S-a decis instituirea unui tratament cu ampicilin plus gentamicin, pentru o durat de 3 sptmni. Nu a fost utilizat ampicilina n monoterapie, fiind cunoscut faptul c ntr-o astfel de eventualitate ar fi fost posibil dezvoltarea rezistenei nu numai fa de acest antibiotic dar i fa de alte antibiotice (ex. piperacilin). Temperatura a rmas ridicat, iar pacienta a menionat c simptomele nu se amelioreaz, n cursul primelor dou sptmni de terapie. Reactanii de faz acut au diminuat ca valoare, meninndu-se ns peste valorile normale. Examenul clinic realizat (repetat) de ctre medicul stomatolog al unitii nu a revelat o afeciune care s par a fi n legtur cu evoluia insuficient de favorabil, sub tratament. Totui, dup ce mandibula a fost examinat radiologic, cu foarte mult atenie, a fost remarcat o situaie patologic i s-a presupus existena unui granulom care nu era cunoscut anterior. Lund n calcul aceste noi informaii i solicitnd un examen de specialitate la o clinic universitar cu profil stomatologic, s-a decis extracia dintelui situat n vecintatea granulomului respectiv, chiuretarea zonei i asanarea presupusului focar de infecie. Intervenia stomatologic a avut rezultate foarte bune, dup 14 ore de la aceasta constatndu-se diminuarea temperaturii. n urmtoarele 2-3 zile simptomele s-au ameliorat semnificativ. S-a decis continuarea tratamentului antibiotic n aa fel nct durata total s fie de 4 sptmni. Dup a treia sptmn de tratament probele biologice au revenit la valori normale, starea general a fost considerat ca fiind bun iar dup patru sptmni de tratament pacienta a fost externat, vindecat. 24. 3. 4. Rspunsul tegumentului la injurii Cnd pielea este rnit, un Ag necunoscut i gsete expresia n keratinocitele deteriorate. Celulele gamma-delta T nvecinate se grupeaz i contribuie la vindecarea rnii prin producerea, pe plan local, de factori epiteliali de cretere i citokine inflamatoare. n absena celulelor gamma-delta T ale pielii, vindecarea rnilor este mpiedicat (5). n mod tradiional, keratinocitele au fost considerate drept constitueni ineri ai epidermului cu mai multe straturi. Conceptul actual s-a modificat n mod fundamental. Keratinocitul este recunoscut azi ca un juctor activ n rennoirea epidermului i avnd funcii cheie n aprarea imun a pielii. n condiii homeostatice, se presupune c celulele generatoare de keratinocite se divizeaz n mod simetric sau asimetric, ceea ce nseamn c ele continu s prolifereze sau continu s se diferenieze n form definitiv constituind epiderma de suprafa. Procesul fin de rennoire a epidermului se bazeaz pe o reea extraordinar de cascade semnalizatoare care sunt guvernate de interaciunile receptorului keratinocitului cu mediul nconjurtor prin circuitele paracrine si autocrine. Opuse acestui proces homeostatic coordonat sunt semnalele de rnire i inflamare. Ele modific soarta keratinocitului i rspunsul su la mediul nconjurtor prin alterarea moleculelor de adeziune i receptorii de suprafa, prin completarea declanrii unui rspuns inflamator imediat al keratinocitului, prin secreia de citokine, chemokine i peptide antimicrobiene. Dac nu sunt controlate, modificrile fundamentale impuse de rnire i inflamare asupra programului homeostatic, pot conduce la leziuni severe ale pielii inclusiv disfuncii inflamatorii cronice (6). De asemenea Factorul de cretere a hepatocitului (HGFA) este cunoscut a avea importan major n morfogeneza esuturilor, n regenerare i n progresul tumorilor, prin receptorii si, MET. n vivo, HGFA activeaz, de asemenea, proteina stimulatoare de macrofage, care prin receptorii si RON, are roluri n recrutarea macrofagelor, declanarea procesului infecios, supravieuirea celulelor i vindecarea rnilor. Prin urmare, activitatea pericelular a HGFA poate constitui un factor important de reglare a activitilor citokinelor multifunctionale n vivo. (7)

287

24. 3. 7. Posibile terapii n ocul septic ocul septic determin imunosupresie. De aici usurina unor suprainfecii cu germeni condiionat patogeni sau cu tulpini multirezistente, precum: Stenotrophomonas spp., Acinetobacter spp., Candida spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp, citomegalovirusuri etc. Mecanismele prin care conduc la imunosupresie sunt variate: induc depleia celulelor sistemului imun prin apoptoza acestora, suprim exprimarea MHC II, induc supraexpresia citokinelor antiiinflamatorii i a moleculelor co-stimulatoare negative, cresc numrul de LTs. Privind din acest unghi, prevenia imunosupresiei induse de sepis devine o prioritate n tratamentul acestei entitati. Vom parcurge acum cteva terapii propuse de oamenii de tiin. PD-1 (programed death 1) este o protein de origine macrofagic, co-stimulatoare negativ, a crei sintez creste n infecia HIV, concomitent cu a ligandului su, PDL-1. PD-1 scade capacitatea de aprare a organismului prin inducerea apoptozei, prin creterea sintezei de IL-10 (antiinflamatoare), prin impiedicarea proliferrii LT, pe care le face neresponsive. S-a ncercat blocarea PD-1 cu rezultate promitoare n cazul infeciilor fungice i a sepsisului bacterian (n experimentele pe oareci). i-au dovedit eficiena i imunostimulatoarele, precum: IFN (interferon), GM-CSF (granulocyte macrophage colony-stimulating factor)i G-CSF(granulocyte colony-stimulating factor). Au fost rezerve n legtura cu posibilitatea inducerii unei boli autoimune sau a hiperinflamaiei. Acest lucru se pare c nu se produce pentru c rezervele organismului sunt mult prea sczute. Il-7 i Il-15 sunt citokine antiiapoptotice i imunostimulatoare care i-au demonstrat eficiena pe animale de laborator. Il-7 restaureaz funcia limfocitelor i mbuntete migrarea limfocitar prin creterea activitii integrinelor. Folosirea IL-7 ca medicament este deja n faz de trialuri clinice pentru cancer i infecie cu VHC i HIV. S-ar putea folosi flow-citometria pentru cuantificarea moleculelor co-stimulatoare sau proba de stimulare total a secreiei citokinice (rapid whole-blood stimulation assays of cytokine secretion). (8) 24. 3. 6. Farmacogenomic? Ai mai auzit termenul acesta? Dar farmacogenetic? Credei c exist vreo diferen? Si dac da, ce legtur au ele cu inflamaia? S vedem. S-a estimat c genele sunt responsabile de 20-95% din variabilitatea interpersonal cu privire la rspunsul la medicamente. Primele investigaii pe aceast latur au fost fcute n 1950, constituind baza farmacogeneticii, iar mai apoi, a farmacogenomicii. Termenii sunt parial sinonimi. Farmagenomica studiaz efectul unui medicament n relaie cu ntregul genom, n timp ce farmacogenetica, n relaie cu o singur gen sau cu un anume set de gene. Principala ocupaie actual a farmacogenomicii i a farmacogeneticii este detecia unui profil de risc, ce va permite probabil, 2 eventualiti:

identificarea precoce a indivizilor susceptibili la o boal, cu aplicaii n prevenie i tratament dezvoltarea unor metode care s amelioreze progresia bolii.

S lum un caz ... alegem... boala Alzheimer. Bine, bine....dar Alzheimer-ul acesta nu e o boal neurologic? Da, foarte bine. ns, ca i n situaia multor altor boli, astzi i se recunoate i o component inflamatorie. Iat cteva argumente pentru a susine componenta de inflamaie cronic a bolii degenerative Alzheimer: Unii se bazeaz pe dovezi terapeutice, respectiv pe faptul c AINS amelioreaz evoluia (n special AINS de tipul ibuprofen, indometacin, sulindac) Alii se bazeaz pe markeri biologici, artnd c PCR este crescut, cu valori n cele 3 quartile superioare ale valorilor, cu 25 ani naintea diagnosticului bolii. 288

Sunt luate n discuie i teste genetice, spre exemplu mutaia genei M694 pentru gena Pyrin, care reprezint un factor de risc pentru boala Alzheimer pentru populaia reprezentativ >65 ani din Italia. i se pare c este factor de risc i pentru alte boli, cum ar fi infarctul miocardic. Iat i cteva exemple concrete ale farmacogeneticii/farmacogenomicii n cadrul bolii Alzheimer, luate ca exemplu (nu poate fi o abordare exhaustiv). Asocierea dintre genotipul ApoE i boala Alzheimer reprezint una din ntrebrile tiintifice ridicate de dezvoltarea farmacogenomicii. Dar genotipul nu este numai profil de risc, ci i indiciu terapeutic. Tacrina (inhibitor de acetilcolinesteraza) se pare c ncetinete progresia bolii pentru cei care nu sunt homozigoi pentru ApoE4. Pe de alt parte, exist i studii cu rezultate negative privind valoarea predictiv a genotipului ApoE. Un al doilea exemplu relevant este cel al promotorului sintezei 5-LO. n urm cu civa ani s-a observat c inhibitorii cii lipooxigenazei aveau efect numai pentru unii pacieni, variabilitate n strns legatur cu polimorfismul 5-LO. S-a tras concluzia c putem stabili un tratament diferenial, n funcie de genotipul pacientului, concluzie extrapolat de la astm la boala Alzheimer. Un alt exemplu se refer la polimorfismul TLR4, receptor ce se pare c este implicat in fiziopatologia bolii Alzheimer i care ar putea fi folosit pentru nelegerea rolului profilaxiei cu antibiotice n acest caz. (9)

24. 4. Verificai-v cunotinele Alegei A dac 1, 2, 3 sunt adevrate; B dac 1, 3 sunt adevrate; C dac 2, 4 sunt adevrate; D dac 4 este adevrat, E dac toate sunt adevrate (meniunea este valabil pentru primele 2 ntrebri) ntrebarea 1: Urmtoarele evenimente au loc n cazul declanrii unui rspuns inflamator: 1).Modificri la nivelul microcirculaiei, cu creterea calibrului vascular. 2).Creterea permeabilitii vaselor mici i scderea vitezei de circulaie (staz). 3).Modificri ale hemostazei i respectiv marginaia, diapedeza, migrarea leucocitelor. 4).Creterea vitezei de circulaie i scderea riscului trombotic. ntrebarea 2: Sunt false urmtoarele afirmaii: 1).Febra este o dovad a alterrii sistemului imun. 2).Diferitele particulariti structurale ale organismului gazd sau ale unui anumit esut ar putea explica (parial) diversitatea fenomenelor inflamatorii identificate ca fiind produse de ctre acelai agent etiologic. 3).Rezultatul detectabil prin metode de laborator al etapei de vindecare este eliberarea unor factori chemotactici, a unor proteaze i kinaze. 4).Modificrile fiziopatologice apar independent de cauza inflamaiei sau, cu alte cuvinte, indiferent de agentul determinant. Alegei doar un rspuns corect: ntrebarea 3: A).Hipertermia, spre deosebire de febr, nu presupune un nou punct de echilibru, ci depirea capacitii de termoreglare. B).Persoanele mai n vrst au o abilitate sczutde a genera caldur, astfel c o temperatur nu foarte crescutne pune n situaia de a sta linitii, vrstnicul respectiv nu are sigur nici un 289

proces inflamator n derulare n organism. C).n mare, vorbim de febr ntre 37-38C i de subfebr peste 38C. D).Cel mai fidel loc de preluare a temperaturii corporale este axila. E).Infeciile generalizate superficiale nu pot genera febr. ntrebarea 4: A).Fibrinogenul va fi mereu normal ntr-o inflamaie de orice etiologie. B).PCR este secretat de ctre adipocite i ficat n mod fiziologic, ns valori mai mari de 1mg/dL indic existena unui proces inflamator. C).VSH-ul este un test diagnostic pentru infecie localizat sau generalizat. D).VSH-ul reprezint rata la care sedimenteaz hematiile dintr-o prob de snge coagulat, ntr-o or. E).Ceruloplasmina i amiloidul P seric nu sunt RFA (reactani de faza acut). ntrebarea 5: A).Coccii piogeni, precum Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Neisseria meningitidis nu pot provoca inflamaii exsudative purulente. B).Inflamaiile fibroase, care reprezint acumularea de fibrinogen, cu apariia fibrinei i formarea de depozite care se organizeaz i duc la apariia aderenelor, nu apar n pneumonia cu Streptococcus pneumoniae, n dizenteria bacterian, n miocardita difteric. C).Vindecarea propriu-zis ncepe tardiv n cursul procesului inflamator. D).Inflamaii proliferative, avnd ca form particular granulomul, de aspect nodular, apar n infecia cu Mycobacterium tuberculosis, Treponema pallidum, infecia cu diferite specii de Brucella sau datorate prezenei unui corp strin. E).n miocardita difteric sau n miozita produs de Clostridium spp predomin procesele distrofice i necrobiotice, care corespund inflamaiei seroase.

24. 5. Direcii de cercetare Pentru o cunoatere suplimentar a acestei problematici, putei examina i urmtoarele articole: (1) Cum poate inflamaia influena strategiile terepeutice i vindecarea http://www.medscape.com/viewarticle/557490 (2) Terapii n inflamaie care au drept int celulele dendritice http://www.journal-inflammation.com/content/7/1/37 (3) Models of Infectious Disease Study (MIDAS)...Ghiduri, ghiduri, ghi