GENETICA, BIOLOGIA MOLECULAR I AMELIORAREA

DUBLAREA NUMRULUI DE CROMOZOMI LA PLANTELE HAPLOIDE DE PORUMB

Rotarenco V.1, Sarmaniuc M.1, Popescu V.2, Cliciuc D.1 Mihailov M.,1 Maslobrod S.,1 Jacot A.1
1

Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor al Academie de tiine a Moldovei, 2 Universitatea Academie de tiine a Moldovei Introducere

n ultimul deceniu, majoritatea celor mai mari companii de producere a porumbului, utilizeaz dublarea cromozomilor la plante haploide, ca tehnologie nou de creare a liniilor homozigote i hibrizilor. Dup metoda tradiional, pentru obinerea liniilor homozigote sunt necesare 5-7 autopolenizri. Tehnologia liniilor dublate haploid permite obinerea liniilor pure timp de dou sezoane, iar procesul se micoreaz de 2-3 ori. Primul sezon prevede obinerea haploizilor din materialul iniial, al doilea sezon dublarea genomului haploid. n prezent, obinerea haploizilor n numr mare a devenit posibil odat cu crearea inductorilor genetici efectivi: Stock 6 [7], MHI [5], etc. Haploizii reprezint plante cu garnitur redus de cromozomi (n), comparativ cu forma iniial (2n), dezvoltndu-se din ovule nefecundate, ca haploizi matroclini. De asemenea, din cauza dereglrilor ce au loc n meioz, la haploizi nu se formeaz celule generative. Astfel, pentru restaurarea setului diploid, prin diferite metode cromozomii se dubleaz. Dublarea cromozomilor poate avea loc pe diferite ci: natural i articial. Spontan, frecvena dublrii cromozomilor atinge valori de pn la 3 % [6, 3, 8]. Astfel, pentru o utilizare ecient a haploizilor n genetic i ameliorare, cea mai necesar este dublarea articial. S-a determinat, c dublarea articial poate indus de diferii factori: chimici, zici, etc. Dintre factorii zici, cel mai frecvent se utilizeaz temperaturile sczute i ridicate [4].

39

Din factorii chimici n prezent, la dublarea numrului de cromozomi, cel mai frecvent se utilizeaz colchicina (C22H24O6). Acesta este un alcaloid, care se obine din semine de Colchicum autumnale L. [20]. Mecanismul aciunii, const n evitarea dividerii celulare n timpul mitozei. Ca rezultat, anafaza i telofaza nu are loc, iar dup metafaz n celul rmne numrul dublu de cromozomi [12]. Un criteriu important, n elaborarea metodelor de dublare a numrului de cromozomi, este concentraia reagentului. S-a determinat, c efectul aciunii reagentului depinde de un sistem ntreg de factori, dintre care temperatura, faza de dezvoltare, modul de tratare, vigurozitatea plantei [11]. Colchicina se utilizeaz la obinerea liniilor dublate haploid, att in vivo, ct i in vitro. In vitro, utilizarea colchicinei prevede tratarea calusului obinut din cultura de stamine. Rezultatele obinute, indic o frecven a dublrii de pn la 50% de plante tratate [1]. Din cauza sensibilitii nalte a multor genotipuri de a se dezvolta in vitro, aceast metod are o utilizare mult mai restrns. In vivo, colchicina induce dublarea cromozomilor prin tratarea materialului la diferite faze de dezvoltare prin diferite metode [8 11, 13 16, 21, 22]. n prezent una din cele mai cunoscute i utilizate metode de dublare a cromozomilor in vivo la plantele haploide este metoda Deimling [8]. ns aceast metod, la fel posed un ir de dezavantaje: viabilitate joas a plantelor tratate n jur de 50 %, dintre acestea doar 40 % sunt fertile, dar cu cantitate limitat de polen, ceea ce mpiedic semnicativ autopolenizarea i n nal doar 10-15 % de plante (din cele iniiale) formeaz semine. n medie, pe tiulete se formeaz cte 5 boabe, ceea ce necesit un sezon adugtor pentru nmulirea lor. n afar de colchicin, la obinerea liniilor dublate haploid se mai folosesc i ali ageni chimici. Ca exemplu: nitrous oxide [18, 19] sau diferite erbicide cu aciune asupra dividerii celulare, ca pronamidele, oryzalinul, triuralinul [2, 17]. n general se poate constata, c metodele de dublare a cromozomilor la plantele haploide, elaborate pn n prezent, au o ecacitate sczut, reprezint un lucru minuios i costisitor. De asemenea, ele permit dublarea parial a plantei (mixoploizi), aa plante posed celule, att diploide, ct i haploide, ceea ce reprezint cauza polenului limitat i a numrului redus de boabe. n prezent sunt necesare metode ce ar permite o dublare complet a plantelor ntr-un numr mult mai mare, fr probleme ce in de cantitatea mic a polenului pentru autopolenizare, i numrul redus de boabe. De altfel, noile metodele trebuie s e simple la realizare i cu cheltuieli minime. Astfel, scopul prezentei lucrri, const n testarea metodei de dublare a plantelor haploide n condiii de cmp, prin diferite moduri. Material i metode A fost testat metoda de dublare a numrului de cromozomi n condiii de cmp. Ca material de cercetare n condiii de cmp au servit haploizii crescui pn la faza de 3 4 frunze a doi hibrizi MK109 x Rf7 i Ku123 x Rf7. n calitate de material de cercetare n condiii de laborator au servit haploizii la faza de boabe uscate a populaiei sintetice SPC4. n calitate de reactiv de dublare a servit colchicina cu concentraiile de 0,06 %

40

i 0,12 %. Tratarea cu colchicin n condiii de cmp, s-a realizat la nivelul meristemei apicale, prin diferite procedee, iar n condiii de laborator la nivel de coleoptil. n condiii de cmp, au fost testate trei procedee. Primul procedeu numit prin gurire (1) const n gurirea la nivelul de meristem apical, dup care tulpina ind nfurat cu a tehnic, n prealabil mbibat cu soluie reactiv i nvelit cu lipici, pentru a nu permite evaporarea ei. Al doilea procedeu numit modul eprubetei (2) const n coaserea zonei de cretere, iar capetele aei cu lungimea de 6-10 cm, ind introduse n eprubet cu soluie reactiv. Al treilea procedeu numit fr gurire (3) este asemntor primului procedeu, dar fr gurire. Ca perioad de tratare, a servit expoziiile timp de una i respectiv dou nopi. Ca metod de dublare n condiii de laborator a servit metoda Deimling [8], care const n germinarea seminelor pn la faza, cnd coleoptilul va avea n medie 4 cm., dup care se nltur partea superioar a coleoptilului, iar plantulele se introduc n soluie colchicin de 0,06%+DMSO de 0,5%, pentru 12 ore. Dup tratare, plantulele se planteaz n condiii de cmp. n calitate de martor au servit plante haploide netratate. Dup tratare i pn la faza de maturitate deplin, s-au efectuat observaii fenologice, ce ine de dezvoltarea plantelor dup tratare. Ecacitatea dublrii s-a determinat dup numrul de plante fertile i dup numrul de plante, care dup polenizare au produs boabe. Panicula s-a considerat fertil, dac dup o singur colectare, cantitatea de polen este sucient pentru polenizare. Fiecare plant cu panicul fertil, s-a ncercat de autopolenizat pentru obinerea boabelor, indiferent de numrul acestora. Rezultate i discuii ncepnd cu faza noririi, pn la faza de maturitate deplin, n dependen de numrul de plante tratate, s-a determinat procentul de plante, care au produs polen i plante, care n rezultatul autopolenizrii au format boabe normale (tabelul 1). Corelaia factorilor ca: modul, concentraia, i faza de tratare, pentru ecare genotip n parte a inuenat diferit dublarea plantelor haploide. Unicul factor, care nu a inuenat considerabil a fost expoziia. n baza rezultatelor obinute, s-a determinat c modul (1) la genotipul n(MK109 x Rf7), n dependen de concentraia reactivului i faza de tratare, a acionat diferit. Tratarea materialului la faza de 4 frunze cu soluie de 0,12%, a determinat obinerea valorii de 10,5 % a plantelor ce au produs boabe. La faza de 3 frunze s-a nregistrat o valoare de 5,3 %. Utilizarea concentraiei de 0,06%, la faza de 3 frunze a inuenat slab dublarea numrul de plante ce au produs boabe demonstrnd valori de 2 ori mai mici dect a martorului, iar utilizarea aceeai concentraii la faza de 4 frunze nu a indus dublarea la nici o plant tratat. La genotipul n(Ku123 x Rf7), modul (1) prin utilizarea concentraiei de 0,12% la faza de 3 frunze, a favorizat obinerea celei mai nalte valori a dublrii - de 22,2%, iar la faza de 4 frunze de 19,4 %. Comparativ cu primul genotip, valorile nregistrate pentru genotipul n(Ku123 x Rf7), nu difer esenial, de la o faza la alta. Comparativ cu primul procedeu, utilizarea procedeului (2) a inuenat diferit dublarea haploizilor. Astfel, att n cazul utilizrii concentraiei de 0,06%, ct i 0,12%, rezultatele variaz considerabil de la o faz la alta i nu depesc valorile nregistrate de martor.

41

Tabelul 1. Rezultatele tratrii haploizilor cu colchicin de diferite concentraii, n condiii de cmp i laborator.
Genotip Modul de tratare control 0,06 prin gurire 0,12 N(MK109 x Rf7) 0,06 modul eprubetei 0,12 control prin gurire N(Ku123 x Rf7) modul eprubetei fr gurire SPC4 Metoda Deimling 0,12 0,12 0,12 0,06 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. 3 fr. 4 fr. Concentraia reactivului % Faza de tratare (frunze) Nr. de plantule tratate 31 34 37 19 38 26 25 34 42 34 36 36 18 26 31 46 129 Nr. de plante Cu panicul fertil % 25,8 8,8 13,5 10,5 31,6 42,3 36 29,4 26,2 26,5 36,1 41,7 22,2 11,5 9,7 17,4 10,07 Care au format boabe normale % 6,5 3,2 0 5,3 10,5 11,5 4 5,9 2,4 11,8 22,2 19,4 5,6 0 3,2 4,5 8,5

Dintre procedeelor testate, cele mai mici rezultate s-au obinut n cazul utilizrii procedeului (3). Acest procedeu de tratare a provocat multe aberaii n dezvoltarea plantelor, iar procentul de plante fertile este cu mult mai mic dect martorul. De asemenea, atrage atenia i procentul destul de mare al dublrii spontane al martorului 6-12%. Posibil s e inuenat de genotipul Rf7, care este prezent n ambele ncruciri. Acest genotip i-n cercetri anterioare a demonstrat dublare spontan ridicat a cromozomilor. Dac ntr-adevr aceast linie inueneaz dublarea cromozomilor, atunci elaborarea metodelor genetice de dublare, fr reactivi de dublare, ar foarte efectiv. Dup cum am menionat mai sus, paralel cu cercetarea procedeelor de dublare a haploizilor n condiii de cmp, a fost utilizat metoda Deimling [8]. Aceasta este una din cel mai des utilizate metode de dublare n condiii de laborator, iar n cercetarea noastr ea a servit ca grad de comparaie dintre diferite metode de dublare. Avantajul de baz al acestei metode este procentul nalt al plantelor ce produc boabe, din numrul mic de plante care supravieuiesc dup tratare. n cazul nostru din 10,7 % de plante, care s-au dezvoltat normal dup tratare i au format panicule fertile, 8,5 % de plante au produs boabe. Totui, cel mai mare dezavantaj al acestei metode rmne procentul nalt de plante care nu rezist aciunii reactivului de dublare. Acestea sau pier, sau formeaz aberaii care nu permit dezvoltarea normal a plantelor dup tratare. De asemenea, pentru a

42

obine un rezultat ecient, aceast metod necesit un volum enorm de lucru, ceea ce nu permanent este posibil. Astfel, dintre procedeele de dublare a numrului de cromozomi, testate n condiii de cmp, cele mai efective s-au dovedit a : 1. Tratarea materialului prin procedeul (1) cu colchicin de 0,12% n fazele de 3 i respectiv 4 frunze. Frecvena dublrii variaz de la 10% la genotipul n(MK109 x Rf7) pn la 22% pentru genotipul n(Ku123 x Rf7). 2. Tratarea dup procedeul (2) cu concentraia de 0,06%, n faza de 3 frunze a demonstrat o valoarea a dublrii de 11,5% n cazul genotipului n(MK109 x Rf7). De altfel, acest mod este mai dicil de realizat, dar poate demonstra o ecacitate mult mai nalt, dac concentraia reactivului se va micora. 3. Dublarea spontan n ncrucirile cu genotipul Rf7 a demonstrat o frecven a dublrii de 6,5% n cazul genotipului n(MK109 x Rf7) i valori de 11,8% pentru n(Ku123 x Rf7) Bibliograa
1. Antoine-Michard S., Beckert M. Spontaneous versus colchicine-induced chromosome doubling in maize anther culture. // Plant Cell. Tissue and Organ Culture, 1997. V. 48. 203-207. 2. Bajer A.S., Mole-Bajer J. Drags with colchicines like effects that specically disassemble plant but not animal microtubules. // In: Sorfer (ed) Dynamic aspects of microtubule biology. Ann NY Acad. Sci., 1986. V. 466. 767-784 3. Beckert M. Advantages and disadvantages of use of in vitro in maize produced DH maize plants. // In Biotechnology in Agriculture and Forestry, V. 23. Maize (ed. By Y.P.S. Bajoj). Springer-Verlag, Berla Heidelberg, 1994. 201-213 4. Belling J., Blakeslee A.F. The assorttment of chromosomes in tetraploid Datura S. // Amer. Nat. 1924. V. 58. 60-70. 5. Chalyk S.T. Use of maternal haploid improved maize inbred lines. // Maize Genetic Cooperation News Letter, 1999. V. 73. 73-77. 6. Chase S.S. Monoploids and monoploid-derivatives of maize (Zea mays L.). // The Botanical Review, 1969. V. 35. 117-167. 7. Coe E.H. A line of maize with high haploid frequency. // Amer. Nat. -1959, V.93. 381-382. 8. Deimling S., Rober F.K., Geiger H.H., Methodik und genetic der in vivo Haploideninduktion bei Mais.// Vortr. 1997, Panzenzuchtg 38, 203-224 9. Esser K., Eine Eintauchmethode zur Colchicinebehaudlung. // Der Zuchter, 1953. V.23. 148 p. 10. Faris N.M., Rakoczy-Trojanowska M., Malepszy S. et al. Induction and regeneration of cucumber (Cucuber sativus L.) doubled haploids. // Teoret. Appl. Genet, 1963. V.37. 181-186. 11. Gerrish E.E Studies of the monoploid method of producing homozygous diploids in Zea mays. // Ph. D. Thesis. Univ. of Minnesota. Minneapolis, 1956. 140 p. 12. Nebel B.R. Mechanism of polyploidy trough colchicine. // Nature, 1937. V. 140. 1101 p. 13. Nikolova V., Niemierowicz Szczutt K. Diploidization of cucumber (Cucumis Sativus L.) haploids by colchicine treatment. // Acta Soc. Bot. Pol, 1996. V. 65. 7p. 14. Seaney R.R. Studies on monoploidy in maize. // Ph. D. Thesis. Cornel Univ., Ithaca. New York, 1955. 160 p. 15. Shaver D.L. A successful colchicines method for Zea. // Maize Genetics Cooperation Newsletter, 1964. V. 38. 21-22. 16. Veilleux R.E. haploidy in important crop plants-potato. // In: In vitro haploid production in higher plants (Eds.) Jain S.M., Sopory S.K., Veilleux R.F. Kluwer Academic Publishers Dordrecht. Boston. London, 1996. V. 3. 37-49. 17. Wan Y., Duncan D.R., Rayburn A.l.. The use of antimicrotubule herbicides for the production of doubled haploid plants from anther-derived maize cullus. // Theor. Appl. Genet., 1991. V. 81. 205-211. 18. Zeilinga A.E., Schouten H.H. Poliploidy in garten Tulips. The production of tetraploids. // Euphytica. 1968. V. 17. 303-310.

43

19. .. . // : . , 1984. 111-119. 20. .., .. , , , . : , 1975. 215 . 21. .., .., .., .. . // , 1996. 4. 17-19. 22. .. . // . . - , 1976. . 30. 136-145.

HETEROZISUL NREGISTRAT LA HIBRIZI F1 DE SALVIA SCLAREA L.

Gonceariuc Maria1, Cotelea Ludmila1, Balmu Zinaida1, Gille Elvira2, Gita Georgiana2, Spac A3
1 2

Institutul de Genetic i Fiziologie a Plantelor, Academia de tiine a Moldovei Institutul Naional de Cercetare-Dezvoltare pentru tiine Biologice Bucureti / Centrul de Cercetri Biologice Stejarul Piatra Neamt, Romania 3 Universitatea de Medicin i FarmacieGr.T.Popa, Iai, Romnia

Fenomenul heterosis este utilizat cu succes n ameliorarea multor specii de plante alogame, inclusiv a serlaiului (Salvia sclarea L.), specie aromatic i medicinal valoroas datorit uleiului esenial pe care l conine n inorescene i care este foarte apreciat n industria parfumeriei, medicin, industria de fabricare a vinurilor de tip muscat etc. Pentru Moldova specia este important prin faptul c uleiul esenial i concretul fabricat aici sunt produse destinate pentru export. n rezultatul cercetrilor efectuate au fost creai hibrizi simpli de Salvia sclarea L., ce manifest heterosis nu numai n generaia F1, ci i n generaiile F2 Fn [1,2,3,5], or cercetrile anterioare au demonstrat c crearea soiurilor noi de provenien hibrid cu perioada de maturizare diferit, coninut ridicat de ulei esenial, productivitate nalt este mai ecient, folosind n acest scop hibrizii compleci: dubli, backcross i n trepte care manifest heterozis la un ir de caractere cantitative [3]. n acest context, materialul prezentat este dedicat rezultatelor obinute recent n crearea genotipurilor hibride perspective i evaluarea valorii heterozisului la caracterele cantitative care inueneaz direct productivitatea i calitatea. MATERIAL I METODE Materialul vegetal folosit este reprezentat de 14 hibrizi F1 de Salvia sclarea simpli, tripli, dubli i n trepte, precum i formele parentale ale acestora linii consangvinizate S6-S12 de provenien genetic i geograc diferit, hibrizi F2-F7, B4-B5 de diferit complexitate. Uleiul esenial s-a obinut prin hidrodistilare n aparate Ginsberg, iar coninutul uleiului s-a recalculat la substan uscat. Dup distilare uleiul esenial s-a uscat cu Na2SO4 i s-a pstrat n congelator. Efectul heterozis a fost calculat n procente n raport cu ambele forme parentale ale ecrui hibrid la urmtoarele caractere cantitative: talia plantei, lungimea inorescenei, numrul de ramicaii ale inorescenei de ordinul I i II, coninutul de ulei esenial, numrul de verticile pe spicul central al paniculului.

44