Sunteți pe pagina 1din 27

Tehnici imunologice de diagnostic

Sistemul imun asigură mecanismele răspunzătoare de menţinerea (apărarea)


integrităţii organismului în faţa agresiunii microorganismelor şi a altor antigene.
Principala funcţie a sistemului imun este aceea de a preveni sau de a limita infecţia
produsă de microorganisme cum ar fi bacteriile, virusurile, fungii, paraziţii.
Protecţia este asiguratã, în primul rând de mecanisme mediate celular, umoral ale
sistemului imun, cât şi sistemul Complement şi celulele fagocitare.

DIAGNOSTICUL IMUNOLOGIC poate fi împărţit în:

A. REACŢII ANTICORP-ANTIGEN
B. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNITĂŢII MEDIATĂ CELULAR

A. REACŢIILE ANTICORP-ANTIGEN

Reacţiile antigenelor cu anticorpii prezintă o mare specificitate. Un antigen va


reacţiona doar cu anticorpul a cărui sintezã a fost indusã de el sau de un alt antigen
cu structură apropiată. 
Datorită gradului ridicat de specificitate, reacţiile dintre antigene şi anticorpi pot fi
utilizate pentru identificarea unuia dintre componente. Există două situaţii:
1. Identificarea unui antigen (Ag) necunoscut izolat din proba de cercetat, folosind
seruri standard (Ab) (care sunt seruri obţinute de la animale imunizate cu antigene
purificate cunoscute).

Ag + Ac Ag - Ac

2. Evidenţierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utilizând antigenele
standard (diagnosticul serologic).

Ag + Ab Ag - Ac

Antigene şi anticorpi: definiţii de bază

Antigenele sunt substanţe care pot fi recunoscute şi dependente de sistemul imun, în


timp ce imunogenii sunt molecule care induc un răspuns imun. 
În majoritatea cazurilor, antigenele sunt imunogene, astfel încât se utilizează ambii
termeni. Însă, existã câteva excepţii cu importanţã deosebitã, cum sunt haptenele. O
haptenă este o moleculă care nu e imunogenă prin ea insăşi, dar poate reacţiona cu
anticorpul specific. 
Un epitop (determinantul antigenic) este structură moleculară care interacţionează
practic cu o singură moleculă de anticorp. Antigenele şi imunogenii conţin de obicei,
mai mulţi epitopi, fiecare dintre ei fiind capabil să se lege de o moleculă de anticorp
diferit. 
Anticorpii sunt imunoglobuline care reacţionează specific cu antigenul care a stimulat
producerea lor. Ei reprezintă 20% din proteinele plasmei sanguine. 
Anticorpii pot fi utilizaţi ca elemente sensibile şi specifice pentru detectarea,
identificarea şi dozarea antigenelor. 
Anticorpii specifici pot fi obţinuţi de la pacienţi în perioada de convalescenţã a
anumitor afecţiuni (de exemplu, anticorpii antivirali) sau pot fi purificaţi de la
animale imunizate cu antigenul care ne interesează.
Un tip special de anticorpi, utilizaţi în scopuri diagnostice, sunt anticorpii monoclonali
care recunoaşte un singur epitop, de aceea aceşti anticorpi au o mare specificitate
Anticorpii monoclonali în special pentru antigenele de suprafaţă ale limfocitelor, se
preparã pentru a fi comercializate. Datorită faptului că anticorpii monoclonali au
revoluţionat atât de profund metodele de detectare a antigenelor, producerea
acestor molecule va fi prezentată ulterior.
Un alt tip de anticorpi, sunt anticorpii policlonali, care sunt preparate heterogene de
anticorpi, capabili sã recunoascã mai multe tipuri de epitopi ai unui antigen.

Reacţii Ag - Ac utilizate în diagnosticul imunologic

I. In vitro: 1. Reacţia de aglutinare (în care antigenul este particulat)


2. Reacţia de precipitare (în care antigenul este solubil)
3. Reacţia de fixare a complementului
4. Reacţia de neutralizare
5. Imunofluorescenţa (IF), testul ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay),
Radioimunotestarea (Radioimmunoassay - RIA).

II. In vivo: Intradermoreacţii (teste cutanate)


1. Prick - testul cutanat 
2. Patch - testul cutanat 

I. In vitro

1. Reacţia de aglutinare

În această reacţie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) sau
este o particulă inertă (de latex) învelită cu un antigen.
Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leagă de particulele antigenice
multivalente şi formează o reţea, reacţia de aglutinare devenind vizibilă. 
Tehnica este sensibilă şi poate fi aplicată atât pentru antigene dar şi moleculele de
anticorpi.

1.a Aglutinarea directă implică aglutinarea particulelor antigenice (cum sunt


bacteriile sau fungi) cu participarea anticorpilor specifici.

Determinarea antigenului
Bacteriile sunt identificate în mod obişnuit, preparând din cultura purã o suspensie
lichidianã pe o lamă de sticlă sau în tuburi şi urmãrind dacă acestea sunt aglutinate
sub forma unor agregate vizibile, în urma adăugării de antiseruri specifice care au
fost obţinute ca rãspuns la antigene bacteriene cunoscute.

Determinarea anticorpului
Suspensia de bacterii de aceastã data cunoscute, poate fi utilizată invers, pentru
determinarea şi dozarea anticorpilor serici. 
Se efectueazã prin testarea pe o serie de diluţii de ser a unei suspensie bacteriane
standard şi determinarea celei mai mari diluţii de ser la care încă este prezentă
reacţia de aglutinare (care reprezintã titrul reacţiei).
Reacţia de aglutinare are sensibilitate mai mare decât reacţia de precipitare.

1b. Aglutinarea pasivă


În ceea ce priveşte aglutinarea pasivă, pot fi detectate antigenele sau anticorpii, în
funcţie de reactantul legat de carrier.

Antigene cunoscute legate de carrier, pentru determinarea anticorpului


În această situaţie, antigenul este particulat având astfel particularitatea de a fi
aglutinabil. Legarea de carrier este posibilã prin fixarea antigenelor solubile la
suprafaţa unor particule care din punct de vedere immunologic sunt inerte. 
De exemplu, numeroase polizaharide aderă uşor, dar ferm la suprafaţa eritrocitelor
spălate; numeroase antigene proteice aderă în mod similar la hematii tratate cu
diferiţi agenţi, ori la particulele de polistiren, latex, bentonită, colodiu, cărbune.
Determinarea anticorpilor antivirus rubeolic prin reacţia de aglutinare pe latex este
realizată prin amestecarea antigenelor imunodominante de rubella virus fixate pe
particulele de latex, cu probe de ser şi urmărirea apariţiei reacţiei de aglutinare (fig.
38).

..................................

Fig. 38 - Detectarea anticorpilor de rubella prin aglutinare pe latex

..................................

Determinarea antigenului

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici sunt aglutinate în prezenţa unui


antigen omolog (fig. 39). 
În practicã acest test este folosit pentru determinarea:
- Factorului reumatoid (FR) care este o proteină care apare în mod patologic, având
proprietăţile clasei IgM, care apare în serul pacienţilor cu artrită reumatoidă. Aceastã
proteinã mai poate apare şi în cazul altor afecţiuni: lupus eritematos, sindrom
Sjögren, boli hepatice, tuberculoză, sifilis, infarct miocardic chiar şi la persoane
sănătoase (mai ales la vârstnici);
- Proteina C reactivă (PCR) în serul persoanelor sănătoase este prezentă în
concentraţii minime (foarte dificil de detectat prin tehnici obişnuite). Proteina C
reactivă este una dintre "proteinele de fază acută" a cărei concentraţie creşte în
decursul proceselor inflamatorii acute, în fazele de reactivare ale inflamaţiilor cronice
şi în procesele necrotice (infarct miocardic, tumori maligne);
- Determinarea directă a antigenului streptococului de grup A din tampoanele
faringiene este realizată prin tratarea probei fie la pH scăzut (cu acid azotic) fie cu
diferite enzime; ulterior se pune în contact lichidul extras, cu particule de latex
acoperite cu anticorpi anti-streptococ de grup A.

...................................

Fig. 39 - Detectarea antigenului prin aglutinarea pe latex

........................................

1c. Reacţia de coaglutinarea este utilizată, în special în detectarea antigenelor


diferitelor grupuri de steptococi, Neisseria meningitidis şi Neisseria gonorrhoeae,
Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae etc. 
Anumite tulpini de Staphylococcus aureus (tulpina Cowan, ATCC 12498) prezintă un
conţinut ridicat de proteină A de suprafaţă. Proteina A din peretele celular al
stafilococului aureu se leagă de fragmentul Fc al moleculei de imunoglobulină, lăsând
liber fragmentul Fab pentru legarea antigenului. Aglutinarea vizibilă a stafilococilor
reprezintă un test pozitiv care indică legătura antigen-anticorp (fig. 40).

...................................

Fig. 40 - Coaglutinarea 

...................................

Particulele de latex acoperite cu anticorpi specifici servesc ca bază pentru multe


sisteme disponibile în comerţ, folosite pentru detectarea directă a antigenelor
bacteriene. Una dintre aplicaţiile importante este identificarea antigenelor capsulare
solubile în cazul mai multor agenţi etiologici ai meningitei acute sau cronice, şi
anume: Haemophylus influenzae, S. pneumoniae, N. meningitidis, streptococii de
grup B, E.coli şi Cryptococcus neoformans.

1d. Hemaglutinarea
Testul hemaglutinării active identifică anticorpii pentru antigenele eritrocitare.
Anticorpul este diluat succesiv în ser fiziologic şi apoi depus în godeurile plăcii de
hemaglutinare. Sunt utilizaţi întotdeauna martori pozitivi şi negativi. 
Se adaugă în fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care conţine o proteină ce
prevene aglutinareai nespecificã a hematiilor). 
În cazul în care există suficienţi anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibilã (prin
cross-reacţii/reacţii încrucişate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub forma
unui covor neomogen. 
Daca anticorpii sunt insuficienţi, celulele se vor rostogoli pe pereţii oblici ai plăcii,
formând un "buton" roşu pe fundul godeului (fig. 41).

...................................

Fig. 41 - Reacţia de hemaglutinare

...................................

Unii anticorpi nu au capacitatea de a aglutina direct hematiile şi pot fi detectaţi


numai cu ajutorul testului de aglutinare indirectă; aceastã reacţie are loc prin
adăugarea unui al doilea anticorp (cu proprietãţi hem-aglutinante) care se leagă de
anticorpul neaglutinant, ataşându-l astfel (indirect) de eritrocit. 
Factorul reumatoid (FR) poate fi evidenţiat în serul pacienţilor folosind reacţia de
hemaglutinare: hematiile sensibilizate de berbec, sunt aglutinate în prezenţa
factorului reumatoid (reacţia Waaler-Rose).

Reacţia de hemaglutinarea cu participarea virusuri: 


Unele virusuri, de exemplu virusul gripal, paragripal, urlian, adenovirusul şi virusul
febrei galbene pot produce aglutinarea eritrocitelor umane, precum şi a eritrocitelor
de cocoş, por de Guineea, şoarece şi alte animale. 
Această reacţie este utilizată pentru detectarea şi titrarea virusurilor hemaglutinante
în materialele de cultură. 
Pe de altă parte, inhibarea reacţiei de hemaglutinare poate fi folosită pentru
decelarea anticorpilor în probele de ser. Aceasta este cunoscută ca testul inhibării
hemaglutinării virale (HAI).
Prin legarea covalentã sau necovalentã de diferitele antigene de pe suprafaţa
hematiei, utilitatea testului poate fi extinsă şi la detectarea anticorpilor pentru alte
antigene decât cele aflate pe hematii. 

1e. Testul Coombs


Testul Coombs mai este cunoscut ca testul antiglobulinic. În multe cazuri de anemie
hemolitică (de exemplu în boala hemolitică a nou-născutului /incompatibilitate de Rh
şi anemii hemolitice determinate de medicamente) anticorpii sunt legaţi pe suprafaţa
eritrocitului. Aceste imunoglobuline pot fi evidenţiate prin testul Coombs
antiglobulinic direct, în care antiserul anti-imunoglobulină umană este folosit pentru
aglutinarea hematiilor de la pacient (fig. 42).

...................................

Fig. 42 - Testul Coombs direct

...................................

În unele cazuri, cantitatea de anticorpi legaţi este prea mică pentru a fi detectaţi prin
testul Coombs direct şi se recurge la testul antiglobulinic indirect pentru evidenţierea
anticorpilor în serul pacientului. În acest test, serul de la pacient este amestecat cu
eritrocite normale şi se adaugă antiser anti-imunoglobulină umană. Dacă anticorpii
sunt prezenţi în ser, se produce reacţia de aglutinarea (fig. 43).

...................................

Fig. 43 - Testul Coombs indirect

..................................

2. Reacţia de precipitare

În această reacţie, antigenul se află în soluţie. Tehnicile de precipitare sunt bazate


pe:
- capacitatea majorităţii anticorpilor de a interacţiona cu mai mult de un epitop al
unei proteine sau agent infecţios 
- faptul că fiecare moleculă de anticorp interacţionează cu mai mult de un antigen
(de exemplu, imunoglobulina G are două domenii pentru legarea antigenului). 
Între anumite limite ale concentraţiei antigenului şi anticorpului (zona de
echivalenţă) anticorpul leagă încrucişat antigenul într-un complex prea mare pentru
a sta în soluţie (suspensie) şi, de aceea precipită, iar supernatantul nu conţine în
exces nici anticorpi, nici antigene. 
În zona excesului de anticorpi, există o cantitate prea mare de anticorpi pentru
formarea eficientă a unei reţele de legãturi, iar precipitarea este mai redusă faţă de
intensitatea din zona de echivalenţã.

În zona excesului de antigene, toţi anticorpii sunt combinaţi, dar precipitarea este
redusă, deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, ele
rămân solubile (fig. 44).

...................................

Fig. 44 - Reacţia de precipitare

...................................

Reacţiile de precipitare pot avea loc în soluţie sau în mediu semisolid (agar).

A. Precipitarea în soluţie

a) Reacţia de precipitare inelarã 

Antigenul şi serul sunt puse în contact în tuburi capilare, astfel încât să nu se


amestece, dar să se păstreze interfaţa limpede. Rezultatul pozitiv este dat de apariţia
unui precipitat alb la nivelul interfeţei, după 15-20 minute (Figura 45).

...................................
Fig. 45 - Reacţia de precipitare inelarã 

..................................

Reacţia poate fi utilizată în:

- industria alimentară - la diferenţierea originii cărnii;


- medicina legală - la identificarea originii petelor de sânge;
- diagnosticul microbiologic: 

 pentru gruparea streptococilor;


 reacţia Ascoli - folosită în diagnosticul retrospectiv al antraxului;
 reacţia Vincent-Bellot - utilizată în diagnosticul infecţiilor meningococice.

b) Precipitarea în tub capilar

Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46).

...................................

Fig. 46 - Reacţia de precipitare în tub capilar

...................................

B. Precipitarea în gel de agar

Poate fi simplă sau dublă difuzie. De asemenea, poate avea loc în prezenţa unui
câmp electric.

Difuzia simplă sau imunodifuzia radială (RID) este o metodă cantitativă pentru
antigene care pot precipita. În această tehnică, anticorpul este încorporat într-un
strat subţire de agaroză, în timp ce antigenul proteic difuzează din godeul în care a
fost inoculat. 
Acolo unde concentraţia antigenului este optimă pentru a produce reacţia de
precipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indică o concentraţie
crescută de antigen. 
Aceasta este o metodă destul de sensibilă, putând detecta 1 - 10 µg de proteină şi
nu necesită antigen pur pentru determinarea concentraţiei. 
Durata tehnicii este de 24 - 48 ore şi indică doar prezenţa, nu şi funcţia proteinelor. 
Imunodifuzia radială este utilizată pentru măsurarea IgA, IgM, IgG, componentelor
complementului (C3), transferine şi altor substanţe din ser (IgE nu pot fi măsurate
deoarece concentraţia lor este prea scăzută) (fig. 47).

...................................

Fig. 47 - Imunodifuzia radială simplă

..............................

Dubla difuzie - metoda Ouchterlony 

În această metodă, antigenul şi anticorpul sunt plasate în godeuri diferite efectuate


în gelul de agar; cele douã componente pot difuza unul spre celălalt, cu scopul
stabilirii gradientului de concentraţie a fiecăruia. 
Acolo unde se atinge concentraţia optimă, apar liniile de precipitare. Pe baza
modelului liniilor de precipitare, acest test poate fi utilizat, de asemenea, pentru a
determina daca probele sunt identice, dacă participă sau nu toţi epitopii (identitate
parţială) sau dacă probele sunt diferite (fig. 48).
Această tehnică se foloseşte pentru detectarea: proteinei C reactive, antigenului HBs,
antigenului carcino-embrionar (care apare în unele tipuri de cancer), produşilor de
degradare ai fibrinogenului, antigenelor fungice (de exemplu: Histoplasma spp.,
Blastomyces spp., Coccidioides) etc.

...................................
Fig. 48 - Imunodifuzia dublă 

...................................

C. Precipitarea în gel de agar cu ajutorul câmpului electric

Electroforeza reprezintã metoda de separare a proteinelor într-un câmp electric.


Metoda este utilizată în laboratorul clinic pentru detectarea valorilor concentraţiei de
imunoglobuline şi a altor proteine serice.
Câteva dintre bolile care pot fi diagnosticate, utilizând această tehnică sunt:
mielomul multiplu, macroglobulinemia Waldenström şi hipergamaglobulinemia. De
asemenea, electroforeza poate fi folosită pentru detectarea modificărilor în
compoziţia lichidului cerebro-spinal al pacienţilor cu scleroză multiplă.

1. Imunoelectroforeza foloseşte atât separarea electroforetică, cât şi precipitarea


proteinelor. Se poate utiliza atât pentru proteinele specifice (identificare şi dozare)
din serul sanguin, cât şi din urină sau alte lichide.
Astfel, o probă de ser este plasată într-un godeu realizat în gelul de agar turnat pe o
lamă de sticlă. Un curent electric trece prin agar şi proteinele se deplasează în
câmpul electric, conform sarcinii electrice şi dimensiunii lor. 
Apoi, în gelul de agar se taie un şanţ care se va umple cu anticorp. Deoarece
antigenul şi anticorpul difuzează unul spre celălalt, se vor forma o serie de arcuri de
precipitare (fig. 49).

...................................

Fig. 49 -Imunoelectroforeza

...................................

Aceste arcuri permit caracterizarea proteinelor serice în funcţie de: prezenţã/absenţã


sau traiectul lor neobişnuit (de exemplu, human myeloma protein). 
Metoda este utilă pentru identificarea paraproteinelor cu lanţ greu şi uşor. 
Pot fi determinate de asemenea, scăderea sau absenţa imunoglobulinelor în
imunodeficienţe, iar originea monoclonală a proteinei Bence-Jones din mielom poate
fi confirmată.
Imunelectroforeza este o metodă valoroasă în studiul bolilor autoimune şi
neurologice.
2. Radioimunoelectroforeza este utilizatã în primul rând ca tehnicã de cercetare, care
combină imunoelectroforeza cu folosirea antigenelor marcate. 
Metoda foloseşte culturi de ţesuturi. Când antigenele marcate reacţionează cu
antiserurile antiumane şi antiserurle ce conţin lanţuri grele şi uşoare, se confirmă
originea unei proteine specifice (de exemplu proteinã de: organ, ţesut sau populaţie
celulară crescută în cultură).

3. Contraimunoelectroforeza (CIE) sau electroimunodifuzia dublă combină


caracteristicile imunodifuziei în gel şi electroforezei. 
Probe din lichidele organismului în care se suspicionează prezenţa agenţilor
microbieni sunt plasate în godeuri separate realizate într-un mediu de difuzie
tamponat (agaroză). Godeuri similare situate la 3 mm distanţă sunt umplute cu
anticorpi cunoscuţi. Prin trecerea unui curent electric, antigenele polizaharidice care
au tendinţa de a fi încărcate negativ la pH neutru migrează în direcţia opusă, spre
catod. 
În 30 - 60 de minute antigenul şi anticorpul se vor întâlni, se vor cupla în caz de
specificitate structuralã formând o linie de precipitare distinctă. Principiul este acelaşi
ca la imuno-dubla-difuzie, dar sensibilitatea metodei este mai mare (de 10-20 de
ori).
CIE poate fi utilizată pentru identificarea atât a antigenelor şi a anticorpilor
necunoscuţi, de exemplu Ag HBs, a-feto-proteina, polizaharidul pneumococic (în
sângele unui pacient cu pneumonie sau în lichidul cefalorahidian al unuia cu
meningită), criptococoză, meningită produsă de Haemophylus influenzae,
endocardită stafilococică (fig. 50).

...................................

Fig. 50 - Contraimunoelectroforeza

...................................

4. Electroforeza în "rachetã" sau electroimunodifuzia unidimensionalã implicã


electroforeza antigenelor dintr-un godeu printr-un mediu de gel cu anticorp fixat. 
pH-ul gelului este ales în aşa fel încât anticorpul să fie imobil, iar antigenul să aibă
sarcina negativă. Liniile de precipitare care rezultă au forma de "ţeapă" sau "rachetă"
iar înălţimea lor este proporţională cu concentraţia de antigen. Principala aplicaţie a
acestei tehnici este determinarea cantitativă a antigenelor în lichidele biologice (fig.
51).

...................................
Fig. 51 - Electroforeza in "racheta"
...................................

3. Reacţia de fixare a Complementului (RFC)

Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice care
interacţionează între ele şi cu membrana celulară. Fiecare componentă proteică
trebuie sã fie activată secvenţial în condiţii potrivite pentru declanşarea reacţiei. 
Complexele antigen-anticorp se numără printre activatori şi reactia de fixare a
complementului poate fi utilizată pentru identificarea unuia dintre ei, când celălalt
este cunoscut.
In situaţia în care reacţia de fixare a complementului urmãreşte detecţia de anticorpi
necunoscuţi, procedura este urmãtoare:
(1) Serul de testat (de la pacient) se titrează în dublă diluţie şi se adaugă o cantitate
stadardizatã de antigen în fiecare tub sau godeu. Dacă anticorpul specific este
prezent în serul de testat se vor forma complexele imune.
(2) Apoi, la acest amestec se adaugă complementul (de obicei, obţinut de la porcul
de Guineea). Dacă sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si îl
vor "consuma".
(3) În etapa finală, este adăugat sistemul indicator reprezentat de eritrocite
sensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (în cantitate subaglutinantă)
extraşi din ser de iepure] (fig. 52).

...................................

Fig. 52 - Reactia de fixare a complementului

..................................

Interpretarea rezultatului:

- dacă anticorpul se potriveşte antigenului în prima fază a reacţiei, complementul a


fost fixat nemaifiind disponibil să se lege de hematiile sensibilizate; astfel, eritrocitele
rămân nehemolizate testul fiind interpretat ca pozitiv (hematiile rãmân în "dop" la
baza tubului de reacţie);
- dacã anticorpul nu se potriveşte cu antigenul (nu existã specificitate),
complementul este liber şi se leagã la eritrocitele sensibilizate care vor fi lizate, iar
testul va fi negativ (aspectul în tubul de reacţie va fi de hemolizã/roşu difuz).
Folosind cantităţi standardizate de anticorp cunoscut şi eşantion de antigen, metoda
poate fi utilizată pentru testarea antigenelor. 
Complementul trebuie standardizat cu grijă, iar serul de testat trebuie prelucrat în
vederea inactivării oricărei activităţi a complementului seric. Efectuarea controalelor
recomandate (martorii probei de reacţie) este foarte importantă în această tehnică
deoarece anumite preparate de anticorpi folosesc complement fără adăugarea
antigenului, de exemplu, dacă este vorba de ser care conţine deja complexe imune.
De asemenea, unele antigene pot avea activitate anti-complement. De aceea,
controlul trebuie să includă anticorp singur, respectiv antigen singur, pentru a
verifica dacã nu cumva unul dintre aceştia nu fixează complementul fără intervenţia
celuilalt.

Exprimarea rezultatelor:

- concentraţia anticorpilor este exprimată ca cea mai ridicată diluţie a serului care
indică fixarea complementului (diluţie la care nu apare hemoliza)
- concentraţia de antigen este exprimată ca fiind titrul de antigen care limitează
acţiunea hemolitică a complementului.

Reacţia de fixarea a complementului este foarte mult utilizată în cercetare şi în


laboratoarele clinice în scopul diagnosticãrii infecţiei cu M. pneumoniae, micozelor,
pentru identificarea paraziţilor, virusurilor, a infecţiei cu Treponema pallidum (testul
Wassermann).

4. Reacţia de neutralizare

Această reacţie se bazează pe capacitatea anticorpului de a bloca efectul antigenelor


toxice, litice sau infectante prin combinaţii specifice dintre antigen şi anticorp "in
vivo" sau "in vitro".

Neutralizarea virusurilor

Neutralizarea activităţii virale este cea mai sensibilă şi specifică metodă pentru
determinarea identităţii unui izolat şi pentru determinarea anticorpilor specifici în
serul pacientului.
Dacă anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar
infectivitatea este blocată. O fracţiune a virusului infectant poate rămâne chiar şi în
prezenţa antiserului specific, astfel încât infecţia poate fi mai degrabă amânată,
decât blocată complet. 
Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate
cunoscută. Pentru testarea serologică, suspensia din virusurile de referinţă este
testată împotriva serurilor de testat.
Aceastã reacţie se poate folosi pentru evidenţierea:
- efectului citopatic (cel mai frecvent);
- hemadsorbţiei şi hemaglutinãrii pentru evidenţierea orthomyxovirusurilor şi
paramyxovirusurilor;
- inhibiţiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu roşu-fenol prin
dezvoltarea celulelor, dacă replicarea virusurilor a fost neutralizată;
- reducerii "plãcii": celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate aşezarea
monostratificatã cu soluţie de agar nutritiv, care conţine un colorant vital, cum ar fi
roşu neutru; celulele infectate apar ca "plãci" necolorate faţă de fundalul roşu format
de celulele viabile; reducerea numărului de "plãci" indică reacţia de neutralizare.

Neutralizarea toxină-antitoxină

Când o toxină este pusă în contact cu antitoxina corespunzătoare, efectul toxic al


toxinei este neutralizat. Se poate utiliza:
1) In vivo: testul Schick este folosit pentru determinarea susceptibilităţii unui individ
la difterie. Prin injectarea intradermică a unei cantităţi mici de exotoxină difterică,
toxina este neutralizată de antitoxinele din ser dacă individul respectiv este imun şi
nu se produce nici o reacţie. Situaţia inversã este apariţia unei zone erimatoase
necrotice în cazul în care individul nu prezintă antitoxine (individul este susceptibil la
acestã infecţie).
2) In vitro: testul ASLO (Antistreptolizină "O") - este o reacţie de neutralizare folosită
pentru a măsura titrul de antistreptolizină "O"= anticorp induşi de streptolizina "O"
un antigen virulent (hemolizina) al bacteriei Streptococcus pyogenes.

Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului de
febră reumatică sau glomerulonefrită acută, situaţii în care poate fi determinat,
atunci când streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent.

Principiul 

În acest test, diluţia succesivă dublu seriale a unei probe de ser de la pacient este
pusă în contact cu o cantitate de streptolizină "O" standard (Ag) şi, apoi, după o
scurtă incubare necesară pentru combinarea specifică, se adaugă o suspensie de
eritrocite, ca sistem indicator.
În tuburile (godeurile) în care diluţiile de ser conţin suficientă streptolizină "O"
(anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce înseamnă lipsa hemolizei,
în timp ce în tuburile (godeurile) în care anticorpii nu sunt suficienţi pentru a
neutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezenţa hemolizei.
Titrul reacţiei este dat de diluţia din ultimul tub (godeu) în care nu se observă
hemoliza; valori normale: 166 - 250 U/ml.
Titruri crescute existã în boli streptococice şi post-streptococice: angina, scarlatina,
febra reumatică, glomerulonefrita acută.

5. Teste care utilizeazã antigene sau anticorpi marcaţi

Imunofluorescenţã (IF) 

Principiul
Proteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marcaţi folosind coloranţi fluorescenţi (de
exemplu, fluoresceina si auramina) prin combinaţii chimice, fără a altera ori a
interfera cu proprietăţile biologice sau imunologice ale proteinelor.
Apoi, aceste proteine pot fi observate în preparatele microscopice folosind
microscopul cu fluorescenţă (în lumina ultravioletă).
Astfel de anticorpi marcaţi pot fi utilizaţi pentru identificarea antigenelor pe suprafaţa
bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) în celule sau secţiuni histologice ori în
alte probe.
Imunofluorescenţa este folosită frecvent pentru detectarea anticorpilor si a
autoanticorpilor pentru antigenele tisulare şi celulare (de exemplu, anticorpi
antinucleari, anticorpi antimuşchi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii
apar în bolile autoimune.
Imunofluorescenţa poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o masă congelată de ţesut,
cu ajutorul criostatului, se realizează o secţiune; aceasta conferă siguranţa că
antigenele labile nu sunt distruse de substanţe fixatoare.
Imunofluorescenţa (IF), (fig. 53) poate fi:

...................................

Fig. 53 - Imunofluorescenţa directă şi indirectă

...................................

IMUNOFLUORESCENŢÃ DIRECTA, când anticorpul marcat cunoscut interacţionează


direct cu un antigen necunoscut şi se foloseşte, în mod obişnuit, pentru detectarea
antigenului.
Anticorpul specific este conjugat cu un compus fluorescent (de obicei, izotiocianat de
fluoresceină), rezultând un sistem trasor vizibil cu reactivitate imunologică
nealterată. 
Serul conjugat este adãugat la celule sau ţesuturi pe o lamă şi se fixează pe antigen,
formând un complex imun stabil. Substanţele care nu au participat la reacţie sunt
îndepărtate prin spălare, apoi preparatul este colorat şi examinat la microscopul cu
fluorescenţă. Antigenul specific legat la anticorpul fluorescent poate fi observat ca un
element strălucitor de culoare verde deschis sau galben-portocaliu pe fond întunecat,
în funcţie de fluorocrom şi de filtrele utilizate. Aspectul fluorescenţei este caracteristic
pentru fiecare antigen tisular.
IMUNOFLUORESCENTA INDIRECTA. În acest test se foloseşte un proces cu două
etape. Un antigen cunoscut se fixează pe lamă, se adaugă ser necunoscut, apoi
preparatul este spălat; dacă anticorpul seric necunoscut corespunde antigenului, va
rămâne fixat pe acesta pe lamă şi va putea fi detectat prin adăugarea unui anticorp
antiglobulină marcat fluorescent şi examinarea cu ajutorul microscopului cu
fluorescenţă.
Imunofluorescenţa indirectă este de multe ori mai sensibilă decît cea directă,
deoarece pe locul antigenului aderă mai mulţi anticorpi marcaţi. În plus, antiglobulina
marcată devine un "reactiv universal" independent de antigenul utilizat, va intra în
reacţie cu toate imunoglobulinele G ale acelei specii.

Teste cu marcaj enzimatic (ELISA)

Există multe variante ale acestei metode în funcţie de legarea unei enzime de
antigen sau anticorp. Enzima este detectată prin testarea activităţii enzimatice cu
substratul său.
Pentru măsurarea anticorpului, se foloseşte metoda indirectă: antigene cunoscute se
fixează pe un suport solid (de exemplu, microplăci din material plastic) se incubează
cu diluţii din serul de testat, se spală, apoi se reincubează cu o anti-imunoglobulină
marcată cu o enzimă (de exemplu, fosfataza alcalină, peroxidaza).
Activitatea enzimatică este măsurată prin adăugarea unui substrat enzimatic, care
-în general- determină formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual
sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reacţie pozitivă indică faptul că anticorpul a
fost prezent în proba, iar intensitatea reacţiei este proporţională cu concentraţia de
anticorpi din produs (fig. 54).

...................................

Fig. 54. Testul ELISA - metoda indirectă


1. Antigen adsorbit pe faza solida; 2. Anticorp de testat, in ser; 3,5. Spalare; 4.
Antiglobulina marcata enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

Pentru a măsura un antigen se foloseşte metoda cu doi anticorpi, specifici unul faţã
de altul.
Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaugă proba de testat care
conţine antigenul, iar excesul se spală. Se adaugă un anticorp specific marcat
enzimatic.
După o nouă spălare, se adaugă un substrat şi activitatea enzimatică este măsurată
colorimetric şi raportată la concentraţia antigenului (fig. 55).
...................................

Fig. 55 - Tehnica identificãrii unui antigen - test ELISA


1. Anticorp adsorbit pe faza solida; 2. Antigen de testat; 3,5. Spalare; 4. Anticorp
specific marcat enzimatic; 6. Substrat; 7. Intensitatea de virare a culorii

...................................

Tehnica Western blot este o variantă a metodei ELISA. În această tehnică, proteinele
virale separate prin electroforeză în funcţie de greutatea lor moleculară sau sarcina
electrică sunt transferate (blotted) pe o hârtie de filtru (de exemplu, nitroceluloză,
nylon). Când hârtia este expusã serului unui pacient, proteinele imobilizate
capturează anticorpul viral specific şi este vizualizat cu ajutorul unui anticorp
antiuman legat enzimatic.
Tehnica Western blot este utilizată pentru a confirma rezultatele obţinute prin ELISA
la pacienţii suspectaţi că ar fi infectaţi cu HIV, hepatite virale.

Radioimundozarea (Radio Immune Assay)

Principiul de bază al radioimunotestării este similar celui prezentat la testul ELISA.


Diferenţa esenţială este aceea că markerul utilizat la ELISA este o enzimă, iar cel
folosit în RIA este un izotop radioactiv (I125, P32). Etapa finalã a acestei metode o
reprezintă detectarea activităţii radioactive cu ajutorul unui contor de scintilaţie, care
sesizează atât emisiile β, cât şi pe cele γ.
Deşi are un grad ridicat de sensibilitate şi specificitate, această metodă prezintă
dezavantajul că este costisitoare, reactivii expiră repede (short-life), iar în ceea ce
priveşte izotopul este necesară îndeplinirea unor condiţii deosebite.
Cele mai multe variante RIA folosesc un sistem de testare competitiv. În testul
cantitativ pentru anticorpi, suportul solid este întâi standardizat prin legarea unui
antigen nemarcat şi o concentraţie standard pentru anticorp care este marcat cu o
substanţă radioactivă.
Proba (necunoscută) care conţine anticorpul ce trebuie testat (şi care este nemarcat)
se adaugă la mediul de reacţie. Concentraţia anticorpului în proba necunoscută este
determinată prin citirea comparativă a valorilor pe o curbă standard. 
Curba e funcţie de gradul de inhibiţie a legării anticorpului marcat combinat cu
valorile diluţiilor în serie ale cantităţilor cunocute de anticorp nemarcat. 
Metoda de lucru este similară când antigenele sunt cele care se detectează, cu
excepţia situaţiei în care antigenul marcat este folosit pentru dozarea antigenului
liber în probă. 
RIA se foloseşte pe scară largă în chimia clinică, endocrinologia clinică şi toxicologie,
dar nu reprezintă un test de rutină în microbiologia clinică. În practica curentă,
metodele RIA includ teste pentru hormoni steroizi (cum ar fi aldosteronul, cortizonul,
progesteronul) hormoni peptidici (corticotropina, hormonul corticostimulant,
vasopresina). 
În unele laboratoare se mai utilizeazã metoda RIA pentru testarea markerilor pentru
hepatita B (Ag HBs, Ac HBs, Ac HBc, Ag Hbe, Ac HBe) dar a fost, în genral, înlocuită
de tehnica ELISA.

Testul RAST (radioallergosorbent test) este o variantă specializată a RIA, utilizată


pentru a măsura cantitatea de anticorpi IgE serici care reacţionează cu un alergen
cunoscut (antigen).

II. in vivo

Intradermoreacţia (test cutanat)

1. Prick - test-ul este un test uşor de efectuat şi foarte eficient în diagnosticul


diferitelor alergii. Alergenii introduşi la nivel tegumentar (de obicei la nivelul
antebraţului) în câteva minute induce eliberarea de mediatori preformaţi ce cauzeazã
secundar vasodilataţie localã, edem local şi prurit. Acest tip de reacţie caracterizeazã
hipersensibilitatea de tip I.
Testul este pozitiv la pacienţii cu o varietate mare de tulburãri atopice şi de obicei se
coreleazã cu testul RAST (Radioallergosorbent test) pozitiv pentru IgE seric specific şi
testul de provocare cu alergeni specifici, pozitiv la nivelul mucoasei nazale sau
bronşice. 
Faptul cã aceşti pacienţi cu tulburãri atopice dezvoltã o reacţie imediatã la locul de
inoculare (prick test) demostreazã cã molecule de IgE sunt fixate pe suprafaţa
celulelor mastocitare, chiar dacã simptomatologia este nazalã sau bronhialã.

2. Patch test-ul implicã aplicarea alergenului pe suprafaţa normalã tegumentarã


ştearsã în prealabil. De exemplu pacienţii cu eczemã atopicã ce posedã Ac specifici
(IgE) faţã de acarienii din praful de casã, vor dezvolta un patch test pozitiv.
Este interesant cã o parte din pacienţii cu rinitã alergicã cauzatã de praful de casã
(ce conţine acarieni) dezvoltã o reacţie patch pozitivã la acest allergen, manifestat
printr-un infiltrat bazofilic local, sugerând faptul cã infiltrarea nu este specificã
eczemei atopice.
Keratina de suprafaţã a unei zone neafectate este îndepãrtatã printr-o ştergere
uşoarã şi extractul este plasat pe tegument, într-o manierã ocluzivã, pentru 48 de
ore, dupã care urmeazã examinarea localã. Leziunile ce apar sunt macroscopice
eczematoase, iar microscopic conţin infiltrate de eozinofile şi bazofile.

Metode de izolare a anticorpilor


Cercetãtorii imunologi au deseori nevoie de izolate pure de anticorpi, care pot fi
imunoglobuline nespecifice sau antigen nespecifice. 

Izolarea imunoglobulinelor nespecifice din ser, se poate obţine prin fracţionare


secvenţialã a proteinelor serice, etape ce includ :
- precipitarea gama-globulinelor - în soluţie de 30-50% sulfat de amoniu
- filtrarea gelului, pentru obţinerea de molecule de dimensiuni corecte
- cromatografie de schimb ionic - pentru a izola moleculele care sunt încãrcate
pozitiv, la un pH neutru.
- Cromatografia de afinitate pentru liganzii naturali ai imunoglobulinelor, cum sunt
proteina A (proteina A fiind un component al peretelui celular al Stafilococului, ce are
capacitatea de a lega regiunile Cγ2 şi Cγ3 a majoritãţii subclaselor de IgG, de
exemplu: IgG1, IgG2 şi IgG4).

Izolarea anticorpilor antigen-specifici se poate realiza prin cromatografia de afinitate,


utilizându-se antigenul cuplat cu Sepharozã ; anticorpul pur este izolat prin metoda
imunoabsorbantã.

Producerea de anticorpi monoclonali

Intenţia tehnicilor serologice imunologice sunt de a reduce heterogenicitatea


antiserurilor utilizate în terapie. 
Moleculele de antigen ce posedã un singur epitop sunt rar întâlnite de-a lungul vieţii
unui individ. Cele mai multe antigene, conţin sute chiar mii de determinanţi
antigenici ce exisţã pe suprafaţa celularã sau în interiorul unor mixturi de substanţe.
Când aceşti antigeni mixaţi sunt injectaţi unui animal, un numãr egal de clone
limfocitare sunt stimulate. Chiar dacã fiecare clonã produce un anticorp specific,
rezultatul final este o mixturã heterogenã de molecule de anticorpi, a cãrei
specificitate şi afinitate este deseori necunoscutã şi dificil de a fi controlatã. 
Când aceste seruri policlonale sunt utilizate în sistemele de testare bacteriene, pot
apare cross-reacţii, fie din cauza determinanţilor antigenici care se regãsesc la
diferite specii sau din cauza mutaţiilor care pot induce apariţia unor epitopi suficient
de apropiaţi ca specificitate pentru a produce reacţii detectabile.
Intenţia de a produce antigene pure prin tehnici de absorbţie au avut parte de un
succes parţial.
Cum ştiinţa testãrii serologice a evoluat, impresia a fost cã disponibilitatea unui
anticorp ce posedã un grad înalt de heterogenicitate molecularã cu o specificitate
îngustã pentru un singur epitop antigenic, fãrã dezvoltarea unor cross-reacţii, ar
putea rezolva multe din problemele cu care se confruntã utilizarea anticorpilor
monoclonali.
Specificitatea înaltã a anticorpilor monoclonali, ca şi produs al unei singure clone de
celule limfoide, s-a putut obţine prin investigaţii în fuziunea celularã şi tehnologia
hibridoamelor, cercetãri efectuate pe şoarecei, de Kohler şi Milstein.
Prin descoperirile acestor 2 oameni de ştiinţã, este acum posibil sã se izoleze linii de
clone a unui singur limfocit care este capabil sã producã un singur tip de moleculã de
anticorpi. 
Cea mai mare realizare a fost nu numai izolarea unei singure linii celulare capabile sã
sintetizeze un singur tip de moleculã de anticorp ci şi fuzionarea acestor limfocite de
şoarece cu celule din mielomul de şoarece, cu intenţia reuşitã de a produce celule
hibride (fig. 56) cu 2 caractere moştenite importante:

- capacitatea de a produce anticorpi monospecifici (achiziţionaţi de la limfocitele


parentale) şi
- abilitatea de a creşte continuu în culturã, caracter de imortalitate moştenit de la
linia de celule mielomatoase.

Animalele (de obicei şoareci sau şobolani) sunt imunizaţi cu un antigen. Odatã ce
animalele dezvoltã un rãspuns imun eficient, sunt splenectomizate şi se preparã o
suspensie celularã (se utilizeazã de asemenea ganglionii limfatici). 
Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adiţia de PEG
(Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare.
Numai o micã parte a acestor celule vor fuziona (frecvenţa este de 1/105 sau
1/106). 
Mixtura fuzionatã este transferatã într-o culturã ce conţine "HAT" care este o mixturã
de hipoxantinã, aminopterin şi timidinã..
În aceste condiţii celulele splenice pot creşte în mediul cu "HAT", în timp ce celulele
mielomatoase mor în aceste condiţii, din cauza defectului metabolic ce nu le permite
utilizarea acestor metaboliţi. 
Mediul cu "HAT" în acest moment conţine: celule splenice, celule mielomatoase şi
celule fuzionate. Celulele splenice mor în acest mediu, în mod natural dupã 1-2
sãptãmâni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezenţa "HAT". 
Celulele fuzionate supravieţuiesc oricum, din cauza "imortalitãţii" bodândite de la
celulele mielomatoase. 
Unele dintre aceste celule care supravieţuiesc au capacitatea de a produce anticorpi
la fel ca şi celulele splenice. 
Prin tehnici imune, godeurile în care sunt culturile celulare, sunt testate în scopul
identificãrii anticorpilor doriţi. Şi dacã se reuşeşte identificarea, urmeazã clonarea
celulei din godeul în care s-a identificat anticorpul dorit. 
Clona care rezultã dintr-un singur progenitor, posedã caracter de imortalitate şi are
capacitatea de a produce anticorpi monoclonali.

..................................
Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali

...................................

B. Testele pentru evaluarea imunitãţii mediate celular

Evaluarea competenţei imune

Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea funcţiei sistemului imun celular. Aceste
teste include teste cutanate destinate identificãrii Hipersensibilitãţii întârziate tip IV,
evaluãri ale funcţiei limfocitelor T şi B, determinãri ale funcţiilor limfocitelor şi
neutrofilelor.
Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilitãţii biologice astfel standardizarea
lor fiind dificilã. Oricum evaluãrile furnizeazã date importante despre funcţia celularã
în infecţiile cu patogeni intracelulari, în imunologia tumorilor şi rejetului de
transplant.
Evaluarea competenţei celulelor T şi B, ca şi funcţia celulelor fagocitare au o
importanţã primordialã în determinarea statusului imun al unui individ cu infecţii
cronice, sindroame de imunodeficienţã sau pacienţi cu terapii imunosupresive (în
patologia malignã).

1. Teste cutanate DTH (delayed T hypersensitivy)

Imunocompetenţa şi expunerea la anumiţi agenţi infecţioşi pot fi mãsurate prin testul


cutanat. Aceste proceduri sunt simplu de efectuat şi dacã sunt interpretate corect,
pot fi utilizate în practica medicalã.
Existã 2 tehnici de testare cutanatã: fie injectarea intradermicã a antigenului, fie
testul prin contact direct. Aceste teste pot fi interpretate la 24-72 de ore de la
efectuare.
a. injectarea intradermicã a antigenului - s-a utilizat în special pentru evaluarea
statusului imunocompetent şi a contactului cu agentul etiologic în diferite infecţii,
cum sunt: tuberculoza, lepra, bruceloza, varicela, limfogranulomatoza venerianã,
psitacoza, bola hidaticã, leishmanioza, afecţiuni fungice.
b. teste de contact sunt efectuate prin plasarea antigenului pe suprafaţa
tegumentarã şi acoperirea zonei cu un plasture; testul este util în determniarea
hipersensibilitãţii la diferite produse: cosmetice sau sãpunuri.

Interpretarea corectã a rezultatelor este punctul critic al testelor cutanate.


Indurarea în jurul locului de injectare, este rezultatul infiltratului mononuclear şi al
edemului. Aceastã reacţie apare la 24-48 de ore dupã ce se efectueazã testul.
Diametrul zonei de indurare este un indicator al intensitãţii rãspunsului imun celular
împotriva antigenului testat.
Eritemul (bine delimitat) de la locul inoculãrii este un indicator al hipersensibilitãţii
imediate. Deobicei dispare la 12-18 ore dar poate persista perioade mai lungi de
timp. Reacţia eritematoasã nu ar trebui luatã în considerare în interpretarea testului
cutanat.
În cazul copiilor testele au o valoare mai micã şi nu sunt recomandate, mai ales în
cursul primului an de viaţã. Copiii probabil nu au fost îndeajuns de expuşi la antigene
cât sã-şi dezvolte un rãspuns adecvat, astfel putând fi sensibilizaţi în momentul
injectãrii antigenului.
Pacienţii imunosupresaţi cum sunt indivizii cãrora li s-a efectuat un transplant,
deobicei sunt anergici şi lipseşte rãspunsul la acest test.
Reacţiile adverse la testele cutanate pot apare la indivizi hipersensibilizaţi şi
imunizaţi. Reacţii locale severe reprezentate de eritem, induraţie şi necrozã se pot de
asemenea dezvolta. Simptomele sistemice cum sunt: febra şi reacţia anafilacticã
sunt rare.

2. Evaluarea limfocitelor

Identificarea şi evaluarea funcţiei celulelor T şi B la nivelul sângelui periferic este


foarte importantã în diagnosticarea bolilor însoţite de imunodeficienţe, boli
autoimune şi în reacţii imune în patologia tumoralã.
Metodele disponibile pentru separarea limfocitelor şi a subpopulaţiilor specifice
includ: separarea pe gradient de densitate, sortarea celulelor activate prin utilizarea
fluorescenţei, panning-ul, rozetarea, separarea magneticã.

Separarea în gradient de densitate - se bazeazã pe faptul cã limfocitele sunt mai


puţin dense decât eritrocitele şi granulocitele (fig. 57) şi este utilizatã pentru a izola
majoritatea limfocitelor sanguine.

..................................

Fig. 57. Separarea pe baza gradientului de densitate a limfocitelor 

...................................

Sângele total este defibrinat prin agitare într-un recipient cu bile de sticlã iar cheagul
care rezultã este îndepãrtat. Apoi sângele este diluat într-un mediu de culturã
tisularã şi stratificat într-o eprubetã plinã pe jumãtate cu soluţie Ficoll. Ficoll are o
densitate mai mare decât cea a limfocitelor dar mai micã decât a eritrocitelor şi
granulocitelor. 
Dupã centrifugare eritrocitele şi polimorfonuclearele neutrofile vor trece în parte
inferioarã a porţiunii cu Ficoll formând un depozit la fundul eprubetei, în timp ce
limfocitele se aşeazã la interfaţa mediului cu Ficoll. 
Prepararea limfocitelor poate continua prin îndepãrtarea macrofagelor şi PMN
reziduale prin adiţie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea fi
îndepãrtate prin acţiunea unui magnet. 
Macrofagele pot fi îndepãrtate prin lãsarea suspensiei celulare sã se aşeze pe un
platou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, în timp ce limfocitele vor putea fi
îndepãrtate prin spãlare.

Sortarea celulelor activate prin fluorescenţã 

Disponibilitatea anticorpilor monoclonali faţã de o multitudine de antigene şi


dezvoltarea flow-citometriei a dus la apariţia unei metode foarte eficiente de studiu a
clasificãrii celulare. 
În aceastã tehnicã, recunoscutã ca şi sortarea celulelor activate prin fluorescenţã,
anticorpii marcaţi cu substanţe fluorescente sunt incubaţi mai întâi cu o populaţie
celularã. 
Celulele conţin antigene specifice pe suprafaţa lor şi se vor lega de anticorpii
marcaţi; celulele sunt diluate excesiv înainte de a fi inoculate într-o singurã picãturã
celularã; citometrul scaneazã fiecare picãturã cu o excitaţie intensã tip laser. 
Fluxul celular ce traverseazã laser-ul are o ratã de peste 5000 celule per minut iar
analiza se efectueazã electronic. 
Dacã celula este marcatã, va fi fluorescentã şi poate fi separatã sau sortatã prin
deflecţie electrostaticã. 
Lumina ce rezultã în cursul scanãrii dã informaţii despre mãrimea celulelor şi
densitatea antigenelor de suprafaţã. 
Citometrele cu fascicol dual, oferã informaţii în plus prin scanarea a 2 antigene
diferite sitate pe aceeaşi celulã. 
Instrumentele utilizate sunt foarte sofisticate şi necesitã o mentenanţã foarte atentã
pentru obţinerea de rezultate optime (fig. 58).

Citometrul oferã informaţii asupra lungimii vieţii celulelor, în timp ce tehnicile


microscopice necesitã distrugerea şi fixarea celulelor pe lame speciale care pot altera
antigenele de suprafaţã. 
Oricum, antigene intracelulare trebuie sã fie analizate cu metode microscopice. Se
fac eforturi continue pentru a se îmbunãtãţi calitatea anticorpilor monoclonali pentru
a furniza informaţii corecte despre histologia, structura celularã şi localizarea
antigenelor.
Flow citometria poate efectua o analizã diferenţiatã a celulelor albe sanguine
furnizând informaţii despre numãrul celulelor B (cu CD19, CD 20 şi HLA-DR pe
suprafaţa lor) celulelor T (CD3), celulelor Th (CD4) şi limfocitelor Tc şi Ts (CD8). 
Aceastã tehnicã este de asemenea utilã pentru analiza unor antigene prezente pe
celulele maligne în anumite patologii hemoproliferative (fenotiparea celulelor
tumorale pentru diagnostic şi clasificarea leucemiilor şi limfoamelor, evaluarea şi
prognosticul unei boli maligne, determinarea aneuploidiei ADN-ului). 
..................................

Fig. 58. Sortarea celulelor activate prin fluorescenta

..................................

Aceastã metodã mai oferã informaţii despre numãrul celulelor T, al raportului


CD4/CD8 care este foarte important în sindroamele imunodeficienţelor, dar mai ales
în SIDA.

Rozetarea

Se bazeazã pe faptul cã unele populaţii limfocitare au receptori pentru eritrocite.


Celulele T umane au receptori pentru eritrocitele de oaie (E) reprezentate de
moleculele CD2. Când sunt amestecate celulele T cu aceste eritrocite, se formeazã
rozete astfel se pot separa de limfocitele ce nu formeazã rozete, reprezentate de
limfocitele B (fig. 59) pe gradient Ficoll.

...................................

Fig. 59.Izolarea subpopulaţiilor limfocitare prin rozetare

...................................

O modificare adusã acestei tehnici permite sã se izoleze celulele cu alţi receptori, de


exemplu unele celule T (celulele Tγ) au receptori pentru fragmentul Fc al IgG (Fcγ). 
Aceste celule pot fi identificate şi izolate prin rozetare cu eritrocite de bou,
sensibilizate cu anticorpi anti eritrocite de bou.

"Panning"

Populaţiile celulare pot fi separate pe platforme sensibilizate cu anticorpi. Anticorpii


se leagã non-covalent la suprafaţa de plastic (ca în cazul unei tehnici imune pe fazã
solidã) şi mixtura celularã pe aplicã pe platformã. 
Celulele antigen (+) se leagã de anticorpi iar celulele antigen (-) pot fi îndepãrtate
prin spãlare. 
Prin schimbarea condiţiilor de culturã sau prin digestie enzimaticã celularã pe
suprafaţa platformei uneori este posibil sã se recupereze celulele ce s-au fixat pe
suprafaţã. 
Astfel, metoda este mult mai eficientã pentru îndepãrtarea unei subpopulaţii celulare,
mai degrabã decât izolarea ei. 
De exemplu se poate utiliza pentru separarea CD4 de CD8 şi separarea Th de Ts prin
utilizarea de anticorpi anti Ig care se leagã la suprafaţa anticorpului de pe celula B.
Prin sensibilizarea platformei cu molecule de antigen, celulele ce se vor lega de
acesta pot fi separate dintre celulele care nu s-au legat de antigen (fig. 60).

...................................

Fig. 60.Iizolarea subpopulaţiilor limfocitare prin metoda "panning"

...................................

Separarea magneticã

Aceastã metodã utilizeazã bile magnetice îmbrãcate în anticorpi specifici (de exemplu
anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu populaţia celularã şi se leagã de acelea
care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi îndepãrtate sau izolate prin
aplicarea unui câmp magnetic.
O altã metodã utilã pentru îndepãrtarea populaţiilor celulare care nu reprezintã
interes, se bazeazã pe anticorpi şi pe sistemul Complement. Când un anticorp
specific (de exemplu CD8) este adãugat la o mixturã celularã, urmatã de adãugare
de Complement, acea subpopulaţie celularã va fi lizatã; în mod natural aceastã
metodã se aplicã doar anticorpilor care fixeazã Complementul şi unde populaţia
celularã ţintã are suficiente antigene pentru a fixa Complementul în dozã liticã.

Evaluarea competenţei celulelor T

Enumararea celulelor T
1. enumerarea numãrului total al celulelor T poate fi efectuatã prin utilizarea
anticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substanţe cu fluorescenţã. Celulele sunt
numãrate prin microscopie cu fluorescenţã sau prin flow citometrie; subsetul
celulelor T poate fi numãrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali faţa de CD4 sau
CD8.
2. metoda rozetelor -E poate fi utilizatã pentru numãrarea celulelor T: celulele T au
receptori pentru eritrocitele de oaie; dacã limfocitele din sângele periferic sunt
amestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de eritrocitele
de oaie şi vor forma rozete ce pot fi numărate la microscopia opticã.

Evaluarea funcţiei celulelor T


Transformarea limfoblasticã
În mod normal, celulele T funcţionale se transformã în celule blastice mari, cu o
intensificare a sintezei ADN-ului, când sunt expuse la fitohemaglutininã (o substanţã
mitogenicã) sau concavalina A (un extract de plante care stimuleazã în mod specific
celulele T). Gradul mitozei este mãsurat prin gradul de încorporare a timidinei
triturate la mediul de reacţie, apoi se mãsoarã prin scintilaţie spectrometricã.

Evaluarea competenţei limfocitelor B


Enumerarea limfocitelor B
1. prin tehnici imunofluorecente prin utilizarea anticorpilor policlonali marcaţi cu
fluoresceinã sau prin flow citometrie
2. antiseruri monoclonale împotriva lanţurilor grele sau uşoare, se pot utiliza pentru
evaluarea subclaselor limfocitelor B
3. rozete EA sau EAC: celulele B au receptori pentru C3 şi Fc a moleculei de anticorpi
astfel pot forma rozete cu eritrocitele de oaie mbricate cu anticorpii lor (EA); de
asemenea pot forma rozete cu eritrocitele de oaie îmbrãcate cu anticorpi şi
Complement (EAC) şi pot fi numărate la microscop.

Testele pentru evaluarea funcţiilor celulelor B


2. transformarea limfocitarã; în mod normal celulele B funcţionale pot fi stimulate sã
se transforme în celule blastice mari cu sintezã crescutã de ADN, când sunt expuse la
LPS (lipopolizaharid). Acesta poate fi mãsurat prin gradul de încorporare a timidinei
triturate adãugate la mediul de reacţie
3. determinarea nivelului imunoglobulinelor prin electroforeza poteinelor; o scãdere
sau o creştere a gamma-globulinelor poate atrage atenţia asupra unei sinteze
anormale de anticorpi
4. cuantificarea diferitelor tipuri de imunoglobuline, prin diferite metode: RIA, ELISA,
IF etc 
5. imunizarea activã poate fi utilizatã in vivo, pentru a testa capacitatea de a produce
anticorpi. De exemplu, persoana este imunizatã cu trivaccinul DiTePer (anti diftero-
tetano-pertusis) apoi este testat prin testul Schick pentru a se evalua dezoltarea
imunitãţii antidifterice.

Evaluarea funcţiei fagocitare


1. evaluarea chemotaxiei este efectuatã prin testarea capacitãtii celulelor fagocitare
de a migra prin membrane spre substanţa chemotacticã
2. evaluarea digestiei sau fagocitozei este efectuatã prin vizualizare directã a
numãrului de particule ingerate utilizând microscopul
3. evaluarea ingestiei şi/sau distrugerea intracelularã prin utilizarea testului de
reducere cu NBT (nitro blue tetrazolium). În mod normal celulele fagocitare când
sunt stimulate (de exemplu de endotoxinã) ingerã colorantul şi îl reduce (virarea
culorii din galben în albastru). În condiţii anormale capacitatea de distrugene
intracelularã este asociatã cu scãderea testului de reducere.

Evaluarea sistemului Complement


Cea mai simplã mãsurã a activitãţii Complementului este determinarea concentraţiei
serice, care induce liza a 50% din preparatul standardizat de eritrocite sensibilizate
cu anticorpi (EA). Acest test se poate efectua în godeuri sau în eprubete.
Un sistem simplu care furnizeazã o mãsurã a activitãţii Complementului este
hemoliza radialã. Tehnica este similarã cu cea a imunodifuziei radiale, cu excepţia
faptului cã godeurile conţin un ser test şi gelul conţine EA. 
O zonã de hemolizã se dezvoltã în jurul godeului şi mãrimea acestei zone este
proporţionalã cu cantitatea de Complement din godeu. Aceastã tehnicã mãsoarã
activitatea totalã a cãilor clasicã şi liticã (C1-C9) dar dacã serul prezintã o deficienţã
a Complementului, nu se poate identifica care dintre proteine lipseşte.
Componentele individuale pot fi mãsurate separat pentru a determina fie nivelul total
fie nivelul funcţional. 
Aceasta este o distincţie foarte importantã atât timp cât un component poate fi
prezsent în cantitãţi normale dar nefuncţional. 
Nivelul total al proteinelor sistemului Complement este deobicei mãsurat cu RIA
(Radio Immune Assay) sau prin tehnica ELISA, prin utilizarea unui anticorp specific
pentru proteina care este investigatã. 
Nivelele funcţionale sunt mãsurate pentru a detecta fiecare componentã proteicã a
Complementului, prin furnizarea unui cocktail de celule roşii sensibilizate plus toate
componentele necesare pentru lizã, cu excepţia celei care este investigatã.