Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
A. REACŢII ANTICORP-ANTIGEN
B. TESTE PENTRU EVALUAREA IMUNITĂŢII MEDIATĂ CELULAR
A. REACŢIILE ANTICORP-ANTIGEN
Ag + Ac Ag - Ac
2. Evidenţierea anticorpului specific (Ac) din serul unui pacient, utilizând antigenele
standard (diagnosticul serologic).
Ag + Ab Ag - Ac
I. In vitro
1. Reacţia de aglutinare
În această reacţie, antigenul este particulat (de exemplu, bacterii sau eritrocite) sau
este o particulă inertă (de latex) învelită cu un antigen.
Anticorpul, fiind bivalent sau multivalent, se leagă de particulele antigenice
multivalente şi formează o reţea, reacţia de aglutinare devenind vizibilă.
Tehnica este sensibilă şi poate fi aplicată atât pentru antigene dar şi moleculele de
anticorpi.
Determinarea antigenului
Bacteriile sunt identificate în mod obişnuit, preparând din cultura purã o suspensie
lichidianã pe o lamă de sticlă sau în tuburi şi urmãrind dacă acestea sunt aglutinate
sub forma unor agregate vizibile, în urma adăugării de antiseruri specifice care au
fost obţinute ca rãspuns la antigene bacteriene cunoscute.
Determinarea anticorpului
Suspensia de bacterii de aceastã data cunoscute, poate fi utilizată invers, pentru
determinarea şi dozarea anticorpilor serici.
Se efectueazã prin testarea pe o serie de diluţii de ser a unei suspensie bacteriane
standard şi determinarea celei mai mari diluţii de ser la care încă este prezentă
reacţia de aglutinare (care reprezintã titrul reacţiei).
Reacţia de aglutinare are sensibilitate mai mare decât reacţia de precipitare.
..................................
..................................
Determinarea antigenului
...................................
........................................
...................................
Fig. 40 - Coaglutinarea
...................................
1d. Hemaglutinarea
Testul hemaglutinării active identifică anticorpii pentru antigenele eritrocitare.
Anticorpul este diluat succesiv în ser fiziologic şi apoi depus în godeurile plăcii de
hemaglutinare. Sunt utilizaţi întotdeauna martori pozitivi şi negativi.
Se adaugă în fiecare godeu o suspensie de eritrocite (care conţine o proteină ce
prevene aglutinareai nespecificã a hematiilor).
În cazul în care există suficienţi anticorpi pentru a produce aglutinarea vizibilã (prin
cross-reacţii/reacţii încrucişate) celulele se vor depune la fundul godeului, sub forma
unui covor neomogen.
Daca anticorpii sunt insuficienţi, celulele se vor rostogoli pe pereţii oblici ai plăcii,
formând un "buton" roşu pe fundul godeului (fig. 41).
...................................
...................................
...................................
...................................
În unele cazuri, cantitatea de anticorpi legaţi este prea mică pentru a fi detectaţi prin
testul Coombs direct şi se recurge la testul antiglobulinic indirect pentru evidenţierea
anticorpilor în serul pacientului. În acest test, serul de la pacient este amestecat cu
eritrocite normale şi se adaugă antiser anti-imunoglobulină umană. Dacă anticorpii
sunt prezenţi în ser, se produce reacţia de aglutinarea (fig. 43).
...................................
..................................
2. Reacţia de precipitare
În zona excesului de antigene, toţi anticorpii sunt combinaţi, dar precipitarea este
redusă, deoarece complexe antigen-anticorp sunt prea mici pentru a precipita, ele
rămân solubile (fig. 44).
...................................
...................................
Reacţiile de precipitare pot avea loc în soluţie sau în mediu semisolid (agar).
A. Precipitarea în soluţie
...................................
Fig. 45 - Reacţia de precipitare inelarã
..................................
Acest test este efectuat pentru detectarea proteinei C reactive (PCR) (fig. 46).
...................................
...................................
Poate fi simplă sau dublă difuzie. De asemenea, poate avea loc în prezenţa unui
câmp electric.
Difuzia simplă sau imunodifuzia radială (RID) este o metodă cantitativă pentru
antigene care pot precipita. În această tehnică, anticorpul este încorporat într-un
strat subţire de agaroză, în timp ce antigenul proteic difuzează din godeul în care a
fost inoculat.
Acolo unde concentraţia antigenului este optimă pentru a produce reacţia de
precipitare, apar inele albe. Diametre mai mari ale acestora indică o concentraţie
crescută de antigen.
Aceasta este o metodă destul de sensibilă, putând detecta 1 - 10 µg de proteină şi
nu necesită antigen pur pentru determinarea concentraţiei.
Durata tehnicii este de 24 - 48 ore şi indică doar prezenţa, nu şi funcţia proteinelor.
Imunodifuzia radială este utilizată pentru măsurarea IgA, IgM, IgG, componentelor
complementului (C3), transferine şi altor substanţe din ser (IgE nu pot fi măsurate
deoarece concentraţia lor este prea scăzută) (fig. 47).
...................................
..............................
...................................
Fig. 48 - Imunodifuzia dublă
...................................
...................................
Fig. 49 -Imunoelectroforeza
...................................
...................................
Fig. 50 - Contraimunoelectroforeza
...................................
...................................
Fig. 51 - Electroforeza in "racheta"
...................................
Sistemul complement este compus din 20 sau mai multe proteine plasmatice care
interacţionează între ele şi cu membrana celulară. Fiecare componentă proteică
trebuie sã fie activată secvenţial în condiţii potrivite pentru declanşarea reacţiei.
Complexele antigen-anticorp se numără printre activatori şi reactia de fixare a
complementului poate fi utilizată pentru identificarea unuia dintre ei, când celălalt
este cunoscut.
In situaţia în care reacţia de fixare a complementului urmãreşte detecţia de anticorpi
necunoscuţi, procedura este urmãtoare:
(1) Serul de testat (de la pacient) se titrează în dublă diluţie şi se adaugă o cantitate
stadardizatã de antigen în fiecare tub sau godeu. Dacă anticorpul specific este
prezent în serul de testat se vor forma complexele imune.
(2) Apoi, la acest amestec se adaugă complementul (de obicei, obţinut de la porcul
de Guineea). Dacă sunt prezente complexele imune, ele vor lega complementul si îl
vor "consuma".
(3) În etapa finală, este adăugat sistemul indicator reprezentat de eritrocite
sensibilizate [eritrocite de oaie sensibilizate cu anticorpi (în cantitate subaglutinantă)
extraşi din ser de iepure] (fig. 52).
...................................
..................................
Interpretarea rezultatului:
Exprimarea rezultatelor:
- concentraţia anticorpilor este exprimată ca cea mai ridicată diluţie a serului care
indică fixarea complementului (diluţie la care nu apare hemoliza)
- concentraţia de antigen este exprimată ca fiind titrul de antigen care limitează
acţiunea hemolitică a complementului.
4. Reacţia de neutralizare
Neutralizarea virusurilor
Neutralizarea activităţii virale este cea mai sensibilă şi specifică metodă pentru
determinarea identităţii unui izolat şi pentru determinarea anticorpilor specifici în
serul pacientului.
Dacă anticorpul neutralizant este prezent, virusul nu poate ataca celulele, iar
infectivitatea este blocată. O fracţiune a virusului infectant poate rămâne chiar şi în
prezenţa antiserului specific, astfel încât infecţia poate fi mai degrabă amânată,
decât blocată complet.
Pentru identificarea izolatelor virale, se folosesc antiserurile specifice cu reactivitate
cunoscută. Pentru testarea serologică, suspensia din virusurile de referinţă este
testată împotriva serurilor de testat.
Aceastã reacţie se poate folosi pentru evidenţierea:
- efectului citopatic (cel mai frecvent);
- hemadsorbţiei şi hemaglutinãrii pentru evidenţierea orthomyxovirusurilor şi
paramyxovirusurilor;
- inhibiţiei metabolice (colorimetric): acidifierea mediului cu roşu-fenol prin
dezvoltarea celulelor, dacă replicarea virusurilor a fost neutralizată;
- reducerii "plãcii": celulele infectate de numeroase virusuri pot fi detectate aşezarea
monostratificatã cu soluţie de agar nutritiv, care conţine un colorant vital, cum ar fi
roşu neutru; celulele infectate apar ca "plãci" necolorate faţă de fundalul roşu format
de celulele viabile; reducerea numărului de "plãci" indică reacţia de neutralizare.
Neutralizarea toxină-antitoxină
Acest test este valoros mai ales pentru confirmarea sau infirmarea diagnosticului de
febră reumatică sau glomerulonefrită acută, situaţii în care poate fi determinat,
atunci când streptococul (Streptococcus pyogenes de grup A) nu mai este prezent.
Principiul
În acest test, diluţia succesivă dublu seriale a unei probe de ser de la pacient este
pusă în contact cu o cantitate de streptolizină "O" standard (Ag) şi, apoi, după o
scurtă incubare necesară pentru combinarea specifică, se adaugă o suspensie de
eritrocite, ca sistem indicator.
În tuburile (godeurile) în care diluţiile de ser conţin suficientă streptolizină "O"
(anticorp) efectul litic al antigenelor este inhibat, ceea ce înseamnă lipsa hemolizei,
în timp ce în tuburile (godeurile) în care anticorpii nu sunt suficienţi pentru a
neutraliza antigenele, efectul litic al acestora va fi sugerat de prezenţa hemolizei.
Titrul reacţiei este dat de diluţia din ultimul tub (godeu) în care nu se observă
hemoliza; valori normale: 166 - 250 U/ml.
Titruri crescute existã în boli streptococice şi post-streptococice: angina, scarlatina,
febra reumatică, glomerulonefrita acută.
Imunofluorescenţã (IF)
Principiul
Proteinele, inclusiv anticorpii serici, pot fi marcaţi folosind coloranţi fluorescenţi (de
exemplu, fluoresceina si auramina) prin combinaţii chimice, fără a altera ori a
interfera cu proprietăţile biologice sau imunologice ale proteinelor.
Apoi, aceste proteine pot fi observate în preparatele microscopice folosind
microscopul cu fluorescenţă (în lumina ultravioletă).
Astfel de anticorpi marcaţi pot fi utilizaţi pentru identificarea antigenelor pe suprafaţa
bacteriilor (streptococi, neisserii, treponeme) în celule sau secţiuni histologice ori în
alte probe.
Imunofluorescenţa este folosită frecvent pentru detectarea anticorpilor si a
autoanticorpilor pentru antigenele tisulare şi celulare (de exemplu, anticorpi
antinucleari, anticorpi antimuşchi netezi, anticorpi anticelule parietale). Autoanticorpii
apar în bolile autoimune.
Imunofluorescenţa poate detecta anticorpi in situ. Dintr-o masă congelată de ţesut,
cu ajutorul criostatului, se realizează o secţiune; aceasta conferă siguranţa că
antigenele labile nu sunt distruse de substanţe fixatoare.
Imunofluorescenţa (IF), (fig. 53) poate fi:
...................................
...................................
Există multe variante ale acestei metode în funcţie de legarea unei enzime de
antigen sau anticorp. Enzima este detectată prin testarea activităţii enzimatice cu
substratul său.
Pentru măsurarea anticorpului, se foloseşte metoda indirectă: antigene cunoscute se
fixează pe un suport solid (de exemplu, microplăci din material plastic) se incubează
cu diluţii din serul de testat, se spală, apoi se reincubează cu o anti-imunoglobulină
marcată cu o enzimă (de exemplu, fosfataza alcalină, peroxidaza).
Activitatea enzimatică este măsurată prin adăugarea unui substrat enzimatic, care
-în general- determină formarea unui produs colorat, care poate fi detectat vizual
sau cu ajutorul spectrofotometrului. O reacţie pozitivă indică faptul că anticorpul a
fost prezent în proba, iar intensitatea reacţiei este proporţională cu concentraţia de
anticorpi din produs (fig. 54).
...................................
Pentru a măsura un antigen se foloseşte metoda cu doi anticorpi, specifici unul faţã
de altul.
Un anticorp cunoscut este fixat pe un suport solid. Se adaugă proba de testat care
conţine antigenul, iar excesul se spală. Se adaugă un anticorp specific marcat
enzimatic.
După o nouă spălare, se adaugă un substrat şi activitatea enzimatică este măsurată
colorimetric şi raportată la concentraţia antigenului (fig. 55).
...................................
...................................
Tehnica Western blot este o variantă a metodei ELISA. În această tehnică, proteinele
virale separate prin electroforeză în funcţie de greutatea lor moleculară sau sarcina
electrică sunt transferate (blotted) pe o hârtie de filtru (de exemplu, nitroceluloză,
nylon). Când hârtia este expusã serului unui pacient, proteinele imobilizate
capturează anticorpul viral specific şi este vizualizat cu ajutorul unui anticorp
antiuman legat enzimatic.
Tehnica Western blot este utilizată pentru a confirma rezultatele obţinute prin ELISA
la pacienţii suspectaţi că ar fi infectaţi cu HIV, hepatite virale.
II. in vivo
Animalele (de obicei şoareci sau şobolani) sunt imunizaţi cu un antigen. Odatã ce
animalele dezvoltã un rãspuns imun eficient, sunt splenectomizate şi se preparã o
suspensie celularã (se utilizeazã de asemenea ganglionii limfatici).
Aceste celule sunt fuzionate cu linii celulare din mieloame, prin adiţia de PEG
(Poliethylene glycol) are are rolul de a promova fuziunea membranelor celulare.
Numai o micã parte a acestor celule vor fuziona (frecvenţa este de 1/105 sau
1/106).
Mixtura fuzionatã este transferatã într-o culturã ce conţine "HAT" care este o mixturã
de hipoxantinã, aminopterin şi timidinã..
În aceste condiţii celulele splenice pot creşte în mediul cu "HAT", în timp ce celulele
mielomatoase mor în aceste condiţii, din cauza defectului metabolic ce nu le permite
utilizarea acestor metaboliţi.
Mediul cu "HAT" în acest moment conţine: celule splenice, celule mielomatoase şi
celule fuzionate. Celulele splenice mor în acest mediu, în mod natural dupã 1-2
sãptãmâni iar celulele mielomatoase sunt distruse de prezenţa "HAT".
Celulele fuzionate supravieţuiesc oricum, din cauza "imortalitãţii" bodândite de la
celulele mielomatoase.
Unele dintre aceste celule care supravieţuiesc au capacitatea de a produce anticorpi
la fel ca şi celulele splenice.
Prin tehnici imune, godeurile în care sunt culturile celulare, sunt testate în scopul
identificãrii anticorpilor doriţi. Şi dacã se reuşeşte identificarea, urmeazã clonarea
celulei din godeul în care s-a identificat anticorpul dorit.
Clona care rezultã dintr-un singur progenitor, posedã caracter de imortalitate şi are
capacitatea de a produce anticorpi monoclonali.
..................................
Fig. 56. Producerea de anticorpi monoclonali
...................................
Diferite teste s-au dezvoltat pentru evaluarea funcţiei sistemului imun celular. Aceste
teste include teste cutanate destinate identificãrii Hipersensibilitãţii întârziate tip IV,
evaluãri ale funcţiei limfocitelor T şi B, determinãri ale funcţiilor limfocitelor şi
neutrofilelor.
Multe din aceste proceduri sunt supuse variabilitãţii biologice astfel standardizarea
lor fiind dificilã. Oricum evaluãrile furnizeazã date importante despre funcţia celularã
în infecţiile cu patogeni intracelulari, în imunologia tumorilor şi rejetului de
transplant.
Evaluarea competenţei celulelor T şi B, ca şi funcţia celulelor fagocitare au o
importanţã primordialã în determinarea statusului imun al unui individ cu infecţii
cronice, sindroame de imunodeficienţã sau pacienţi cu terapii imunosupresive (în
patologia malignã).
2. Evaluarea limfocitelor
..................................
...................................
Sângele total este defibrinat prin agitare într-un recipient cu bile de sticlã iar cheagul
care rezultã este îndepãrtat. Apoi sângele este diluat într-un mediu de culturã
tisularã şi stratificat într-o eprubetã plinã pe jumãtate cu soluţie Ficoll. Ficoll are o
densitate mai mare decât cea a limfocitelor dar mai micã decât a eritrocitelor şi
granulocitelor.
Dupã centrifugare eritrocitele şi polimorfonuclearele neutrofile vor trece în parte
inferioarã a porţiunii cu Ficoll formând un depozit la fundul eprubetei, în timp ce
limfocitele se aşeazã la interfaţa mediului cu Ficoll.
Prepararea limfocitelor poate continua prin îndepãrtarea macrofagelor şi PMN
reziduale prin adiţie de fier, care va fi ingerat de fagocite, care vor ptea fi
îndepãrtate prin acţiunea unui magnet.
Macrofagele pot fi îndepãrtate prin lãsarea suspensiei celulare sã se aşeze pe un
platou de plastic. Macrofagele vor adera de plastic, în timp ce limfocitele vor putea fi
îndepãrtate prin spãlare.
..................................
Rozetarea
...................................
...................................
"Panning"
...................................
...................................
Separarea magneticã
Aceastã metodã utilizeazã bile magnetice îmbrãcate în anticorpi specifici (de exemplu
anticorpi anti CD4); bilele sunt amestecate cu populaţia celularã şi se leagã de acelea
care recunosc anticorpul. Aceste celule pot fi apoi îndepãrtate sau izolate prin
aplicarea unui câmp magnetic.
O altã metodã utilã pentru îndepãrtarea populaţiilor celulare care nu reprezintã
interes, se bazeazã pe anticorpi şi pe sistemul Complement. Când un anticorp
specific (de exemplu CD8) este adãugat la o mixturã celularã, urmatã de adãugare
de Complement, acea subpopulaţie celularã va fi lizatã; în mod natural aceastã
metodã se aplicã doar anticorpilor care fixeazã Complementul şi unde populaţia
celularã ţintã are suficiente antigene pentru a fixa Complementul în dozã liticã.
Enumararea celulelor T
1. enumerarea numãrului total al celulelor T poate fi efectuatã prin utilizarea
anticorpilor monoclonali la CD3 conjugat cu substanţe cu fluorescenţã. Celulele sunt
numãrate prin microscopie cu fluorescenţã sau prin flow citometrie; subsetul
celulelor T poate fi numãrat prin utilizarea anticorpilor monoclonali faţa de CD4 sau
CD8.
2. metoda rozetelor -E poate fi utilizatã pentru numãrarea celulelor T: celulele T au
receptori pentru eritrocitele de oaie; dacã limfocitele din sângele periferic sunt
amestecate cu o suspensie de eritrocite de oaie, celulele T se vor lega de eritrocitele
de oaie şi vor forma rozete ce pot fi numărate la microscopia opticã.