Teza Strugaru Anca Monica

Digitally signed by
renata.bando renata.bandol@umfiasi.ro
DN:
l@umfiasi.ro CN=renata.bandol@umfiasi.ro
Date: 2016-12-07 13:53:27
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“GRIGORE T. POPA” – IAȘI
FACULTATEA DE FARMACIE
- TEZĂ DE DOCTORAT -
STUDIUL CHIMICO- ȘI CLINICO-

TOXICOLOGIC AL UNOR MEDICAMENTE
ANTIDIABETICE ORALE
CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC
Prof. Univ. Dr. Elena BUTNARU
DOCTORAND
Asist. Univ. Anca-Monica STRUGARU
IAȘI 2016
Investeşte în oameni !
Proiect cofinanţat din Fondul Social European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane
2007 – 2013
Axa prioritară 1 „Educaţie şi formare profesională în sprijinul creşterii economice şi dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”
Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale și post-doctorale în sprijinul cercetării”
Titlul proiectului: Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice din universitățile medicale prin acordarea
de burse doctorale și postdoctorale – DocMed.Net_2.0
Contract nr.: POSDRU/159/1.5/S/136893
Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie ”Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca
Partener P4 Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași
Această lucrare a fost parțial finantată de proiectul POSDRU 159/1.5/S/136893 având titlul
“Parteneriat strategic pentru creșterea calității cercetării științifice din universitățile medicale prin
acordarea de burse doctorale și postdoctorale – DocMed.Net_2.0”, proiect cofinanțat din Fondul Social
European prin Programul Operaţional Sectorial pentru Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013
Mulțumiri
Adresez mulțumiri doamnei Prof. Univ. Dr. Elena Butnaru, conducătorul științific al
lucrării, pentru profesionalismul și îndrumarea științifică, pentru sprijinul acordat pe
parcursul desfășurării studiilor doctorale și a elaborării tezei de doctorat.
De asemenea, pentru recomandările oferite doresc să mulțumesc membrilor comisiei
de îndrumare: Prof. Univ. Dr. Anca Miron, Prof. Univ. Dr. Antonia Poiată, Conf. Univ. Dr.
Luminița Agoroaei și Conf. Dr. Cornelia Mircea, pentru sprijinul acordat în efectuarea
determinărilor prin electroforeză capilară.
În egală măsură, doresc să multumec doamnei Prof. Univ. Dr. Rut Maria Fernandez
Torres, profesor la Universitatea Sevilla, Facultatea de Chimie, Spania, pentru sprijinul
necondiționat pe parcursul stagiului de mobilitate transnațională și doamnei Prof. Univ. Dr.
Lenuța Profire, pentru susținerea în realizarea acestui stagiu de cercetare.
Sincere mulțumiri doamnelor Conf. Univ. Dr. Cristina Tuchiluș și Șef Lucr. Dr. Gina
Botnariu pentru colaborarea în realizarea analizelor de laborator și a studiului clinic.
Alese mulțumiri întregului colectiv al Disciplinei de Toxicologie pentru suportul moral
și științific acordat pe perioada studiilor doctorale.
Nu în ultimul rând, mulțumirile se îndreaptă spre familie, pentru răbdarea, înțelegerea
și sprijinul oferit pe parcursul acestor ani.
Studiul chimico- și clinico- toxicologic al unor medicamente antidiabetice orale
CUPRINS
A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
1. DIABETUL ZAHARAT. GENERALITĂȚI ................................................................................9

1.1. DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2 ........................................................................................9
1.1.1. Epidemiologia diabetului zaharat de tip 2 .......................................................................9
1.1.2. Cauzele diabetului zaharat de tip 2 ........................................................................11
1.1.3. Complicațiile cronice ale diabetului zaharat de tip 2 .....................................................12
1.1.3.1. Nefropatia diabetic ..................................................................................................12
1.1.3.2. Retinopatia diabetică ...............................................................................................12
1.1.3.3. Neuropatia diabetică ...............................................................................................12
1.1.3.4. Bolile cardiovasculare .............................................................................................13
1.2. TERAPIA ORALĂ ÎN DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2 ................................................13
1.2.1. Sulfoniluree ....................................................................................................................13
1.2.2. Biguanide .......................................................................................................................13
1.2.3. Meglitinide .....................................................................................................................13
1.2.4. Tiazolidindione ..............................................................................................................14
1.2.5. Gliptine ..........................................................................................................................14
1.2.6. Alte structuri ..................................................................................................................14
1.2.6.1. Inhibitori al alfaglucozidazei ..................................................................................14
1.2.6.2. Inhibitori ai aldoreductazei .....................................................................................15
2. METFORMIN .............................................................................................................................16
2.1. SCURT ISTORIC ................................................................................................................16
2.1.1. Originile naturale ale metforminului – Galega officinalis Linn ....................................16
2.1.2. Derivați biguanidici de sinteză.......................................................................................17
2.1.3. Istoricul metforminului ..................................................................................................17
2.2. CARACTERISTICI FIZICO-CHIMICE ALE METFORMINULUI ..................................18
2.3. MECANISMUL DE ACȚIUNE AL METFORMINULUI ÎN TERAPIA DIABETULUI
ZAHARAT ..................................................................................................................................19
2.4. ALTE ACȚIUNI TERAPEUTICE ALE METFORMINULUI ...........................................22
2.5. PARTICULARITĂȚI TOXICOCINETICE ALE METFORMINULUI .............................23
2.6. EFECTELE ADVERSE ALE TERAPIEI CU METFORMIN ............................................23
2.7. CONTRAINDICAȚII ...........................................................................................................24
2.8. INTERACȚIUNI MEDICAMENTOASE............................................................................24
3. EFECTE TOXICE CARACTERISTICE ÎN TERAPIA CU METFORMIN .............................26
3.1. TULBURĂRILE DIGESTIVE ASOCIATE TERAPIEI CU METFORMIN ......................26
1
3.2. ACIDOZA LACTICĂ ..........................................................................................................27

3.2.1. Definiție. Caracterizare ..................................................................................................27
3.2.2. Prezentarea unor cazuri de acidoză lactică la pacienți tratați cu metformin ..................28
3.3. INFLUENȚA METFORMINULUI ASUPRA VITAMINEI B12 ........................................32
3.3.1. Structură chimică și forme coenzimatice ale vitaminei B12............................................32
3.3.2. Distribuție și surse de vitamină B12 ...............................................................................33
3.3.3. Particularități cinetice pentru vitamina B12 ....................................................................33
3.3.4. Rolul enzimatic pentru vitamina B12..............................................................................34
3.3.5. Cauzele deficitului de vitamină B12 ...............................................................................35
3.3.6. Manifestările clinice ale deficitului de vitamină B12 .....................................................36
3.3.7. Metforminul și influența acestuia asupra vitaminei B12.................................................36
3.3.7.1. Influența metforminului asupra nivelului seric de vitamina B 12 – studii pe subiecți
umani....................................................................................................................................36
3.3.7.2. Mecanisme propuse pentru influența metforminului asupra nivelului seric de
vitamina B12 .........................................................................................................................37
3.3.7.3. Cazuri clinice cu niveluri serice scăzute sau deficit de vitamină B 12 la pacienți tratați
cu metformin ........................................................................................................................37
3.3.7.4. Precauții generale ....................................................................................................37
4. GLIMEPIRID ..............................................................................................................................38
4.1. CARACTERISTICI FIZICO-CHIMICE ALE GLIMEPIRIDULUI ...................................38
4.2. MECANISMUL DE ACȚIUNE ..........................................................................................39
4.3. COMPARAREA GLIMEPIRIDULUI FAȚĂ DE ALTE SULFONILUREE ÎN
TRATAMENTUL DIABETULUI ZAHARAT ..........................................................................40
4.4. PARTICULARITĂȚI TOXICOCINETICE ALE GLIMEPIRIDULUI ..............................40
4.5. INTERACȚIUNI MEDICAMENTOASE............................................................................41
4.6. EFECTE ADVERSE ALE TERAPIEI CU GLIMEPIRID ..................................................42
4.7. INTOXICAȚIA CU GLIMEPIRID ȘI TRATAMENTUL INTOXICAȚIILOR .................42
5. ASOCIEREA MEDICAMENTOASĂ METFORMIN – GLIMEPIRID ....................................44
5.1. TERAPIA ANTIDIABETICĂ CU METFORMIN ȘI GLIMEPIRID .................................44
5.2. PREZENTAREA UNOR CAZURI DE INTOXICAȚII LA PACIENȚI TRATAȚI CU
METFORMIN ȘI GLIMEPIRID .................................................................................................44
5.3. METODE ANALITICE DE EXTRACȚIE, SEPARARE ȘI DOZARE A
METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI..............................................................................46
5.3.1. Metode de analiză a metforminului ...............................................................................46
5.3.2. Metode de analiză a glimepiridului................................................................................46
5.3.3. Metode de analiză simultană a metforminului și glimepiridului ...................................46
2
B. CONTRIBUȚII PROPRII
6. MOTIVAȚIA ALEGERII TEMEI ȘI OBIECTIVELE PROPUSE ............................................49

7. STUDIUL STATISTIC PRIVIND INCIDENȚA PATOLOGIEI ASOCIATE ȘI A
MEDICAȚIEI ANTIDIABETICE LA PACIENȚII CU DIABET ZAHARAT DE TIP 2 DE LA
CENTRUL DE MEDICINĂ DE FAMILIE IAȘI ...........................................................................51
7.1. INTRODUCERE ..................................................................................................................51
7.2. MATERIAL ȘI METODĂ ...................................................................................................51
7.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII ................................................................................................52
7.4. CONCLUZII .........................................................................................................................55
8. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METFORMINULUI PRIN ELECTROFOREZĂ
CAPILARĂ CU DETECȚIE ÎN UV CU APLICAȚII PE SER UMAN ........................................56
8.1. INTRODUCERE ..................................................................................................................56
8.2. PRINCIPII TEORETICE ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE .....................................56
8.3. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE CANTITATIVĂ A
METFORMINULUI PRIN ELECTROFOREZĂ CAPILARĂ CU DETECȚIE ÎN UV............57
8.3.1. Material și metodă .........................................................................................................57
8.3.2. Optimizarea metodei de determinare electroforetică .....................................................58
8.3.2.1. Influența valorii pH-ului soluției tampon................................................................59
8.3.2.2. Influența tipului de soluție tampon .........................................................................59
8.3.2.3. Stabilirea lungimii de undă optime de detecție în UV ............................................60
8.3.2.4. Rezultate și discuții .................................................................................................60
8.3.2.5. Concluzii .................................................................................................................61
8.3.3. Validarea metodei de determinare electroforetică .........................................................62
8.3.3.1. Selectivitatea ...........................................................................................................62
8.3.3.2. Liniaritatea ..............................................................................................................63
8.3.3.3. Limita de detecție și limita de cuantificare .............................................................64
8.3.3.4. Precizia ....................................................................................................................65
8.3.3.5. Acuratețea ...............................................................................................................67
8.3.4. Concluzii ........................................................................................................................68
8.4. APLICAȚII ALE METODEI DE DETERMINARE A METFORMINULUI PRIN
ELECTROFOREZĂ CAPILARĂ CU DETECȚIE ÎN UV PE SER UMAN .............................68
8.4.2. Optimizarea metodei de extracție a metforminului din probe de ser uman ...................69
8.4.3. Rezultate și discuții ........................................................................................................72
8.4.4. Concluzii ........................................................................................................................73
9. DETERMINAREA CANTITATIVĂ SIMULTANĂ A METFORMINULUI ȘI
GLIMEPIRIDULUI PRIN UPLC-QTOF/MS CU APLICAȚII PE SER UMAN ..........................74
9.1. INTRODUCERE ..................................................................................................................74
3
9.2. PRINCIPII TEORETICE......................................................................................................74

9.3. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE CANTITATIVĂ
SIMULTANĂ A METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI PRIN UPLC-QTOF/MS .........76
9.3.2. Optimizarea metodei de determinare cantitativă simultană a metforminului și
glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS .....................................................................................78
9.3.2.1. Material și metodă ...................................................................................................78
9.3.2.2. Rezultate și discuții .................................................................................................79
9.3.2.3. Concluzii .................................................................................................................82
9.3.3. Validarea metodei de determinare cantitativă simultană a metforminului și
glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS .....................................................................................82
9.3.3.1. Specificitatea ...........................................................................................................82
9.3.3.2. Liniaritatea ..............................................................................................................83
9.3.3.3. Limita de detecție și limita de cuantificare .............................................................86
8.3.3.4. Precizia ....................................................................................................................86
9.3.3.5. Acuratețea ...............................................................................................................89
9.3.3.6. Concluzii .................................................................................................................89
9.4. APLICAȚII ALE METODEI DE DETERMINARE CANTITATIVĂ SIMULTANĂ A
METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI PRIN UPLC-QTOF/MS ......................................89
PE PROBE DE SER UMAN .......................................................................................................89
9.4.2. Optimizarea metodei de extracție a metforminului și glimepiridului ............................90
9.4.4. Concluzii ........................................................................................................................97
9.5. DETERMINAREA METFORMINULUI LA UN GRUP DE PACIENȚI INTERNAȚI ÎN
CLINICA DE DIABET, NUTRIȚIE ȘI BOLI METABOLICE – STAȚIONAR, SPITALUL
CLINIC JUDEȚEAN DE URGENȚE “SF. SPIRIDON” IAȘI ..................................................98
9.5.3. Concluzii ......................................................................................................................100
10. STUDIUL CLINIC AL PACIENȚILOR DIAGNOSTICAȚI CU DIABET ZAHARAT
INTERNAȚI ÎN CLINICA DE DIABET, NUTRIȚIE ȘI BOLI METABOLICE – STAȚIONAR,
SPITALUL CLINIC JUDEȚEAN DE URGENȚE “SF. SPIRIDON” IAȘI ................................101
10.1. PREZENTAREA UNOR CAZURI CLINICE PRIVIND PRECAUȚIILE
TRATAMENTULUI CU METFORMIN..................................................................................101
10.1.1. Introducere .................................................................................................................101
10.1.2. Prezentarea cazurilor clinice ......................................................................................101
10.1.2.1. Cazul 1 ................................................................................................................101
4
10.1.2.2. Cazul 2 ................................................................................................................102

10.1.3. Rezultate și discuții ....................................................................................................102
10.1.4. Concluzii ....................................................................................................................103
10.2. INFLUENȚA TRATAMENTULUI CU METFORMIN ASUPRA NIVELULUI SERIC
DE VITAMINĂ B12 ..................................................................................................................103
10.2.1. Introducere .................................................................................................................103
10.2.2. Material și metodă .....................................................................................................103
10.2.2.1. Designul studiului ...............................................................................................103
10.2.2.2. Protocol de lucru .................................................................................................104
10.2.2.3. Aparatură.............................................................................................................105
10.2.3. Caracterizarea grupurilor de pacienți luați în studiu ..................................................106
10.2.4. Analiza influenței tratamentului cu metformin asupra nivelului seric al vitaminei B 12
...............................................................................................................................................111
10.2.4.1. Date privind deficitul de vitamină B12 la pacienții tratați cu metformin .............111
10.2.4.2. Influența duratei tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamină B12
............................................................................................................................................114
10.2.4.3. Influența duratei de la diagnosticarea DZ asupra nivelului seric de vitamină B 12
pentru pacienții care nu au primit tratament cu metformin ................................................116
10.2.4.4. Influența tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamină B 12,
independent de durata tratamentului cu metformin ...........................................................118
10.2.4.5. Influența tratamentului cu metformin asupra valorilor acidului uric ..................121
10.2.4.6. Analiza corelației dintre concentrația serică de metformin și nivelul vitaminei B12
serice ..................................................................................................................................124
10.2.4.7. Concluzii .............................................................................................................125
10.3. EVALUAREA RISCULUI CARDIOVASCULAR LA PACIENȚII CU DIABET
ZAHARAT DE TIP 2 ................................................................................................................126
10.3.1. Introducere .................................................................................................................126
10.3.2. Material și metodă .....................................................................................................126
10.3.3. Rezultate și discuții ....................................................................................................127
10.3.4. Concluzii ....................................................................................................................129
11. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUȚII ORIGINALE. PERSPECTIVE DE CERCETARE
.......................................................................................................................................................130
CONCLUZII GENERALE........................................................................................................130
CONTRIBUȚII ORIGINALE ...................................................................................................132
PERSPECTIVE DE CERCETARE...........................................................................................132
BIBLIOGRAFIE ...........................................................................................................................133
ANEXE .........................................................................................................................................141
Listă cu articole publicate ..........................................................................................................141
5
Aviz Comisie de Etică a Cercetării ............................................................................................142

Consimțământ informat .............................................................................................................143
6
LISTĂ DE ABREVIERI
HDL – High density lipoprotein

VLDL – Very low density lipoprotein
OCT1 – Transportatorul de cationi organici 1
HC – Haptocorine
IF – Factorul intrinsec
BNF – British National Formulary
TGP – Transaminaza glutamic-piruvică
TGO – Transaminaza glutamic-oxalacetică
IMC – Indice de masa corporală
UPLC – Ultra high performance liquid chromatography
LC – Liquid chromatography
MS – Mass spectrometry
HPLC – High-performance liquid chromatography
RP – Reversed phase
HPTLC – High performance thin layer chromatography
TLC – Thin layer chromatography
HbA1c – Hemoglobină A1c glicozilată
DZ – Diabet zaharat
RSD – Relative standard deviation
SD – Standard deviation
ICH – International Conference on Harmonisation
QTOF/MS – Quadrupole Time-of-Flight / Mass Spectrometry
ESI – Electrospray ionization
APCI – Atmospheric pressure chemical ionization
LD – Limita de detecție
LQ – Limita de cuantificare
UKPDS RE – UK Prospective Diabetes Study Risk Engine
7
A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII
8
1. DIABETUL ZAHARAT. GENERALITĂȚI
Diabetul zaharat reprezintă o tulburare metabolică cronică, descrisă prin dezechilibre

ale metabolismului glucidic cu niveluri ridicate ale glucozei în sânge și glicozurie. În cazul
diabetului zaharat secreția de insulină la nivel pancreatic este absentă sau insuficientă, cu sau
fără afectarea concomitentă a acțiunii insulinei. Secundar, apar și dezechilibre metabolice la
nivel lipidic sau proteic (1–3).
După criteriul clinic, diabetul zaharat poate fi clasificat în diabet zaharat
insulinodependent (sau de tip 1) și diabet zaharat insulinoindependent (sau de tip 2).
1.1. DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2
Diabetul zaharat de tip 2 este cea mai întâlnită formă de diabet zaharat. Se caracterizează
prin rezistența tisulară la acțiunea insulinei, diminuarea secreției de insulină și chiar insuficiența
celulelor β-pancreatice.
Deși insulina este secretată la nivelul pancreasului, nu este combătută rezistența la nivel
tisular. În consecință, crește concentrația glucozei în sânge. Este afectat și metabolismul lipidic,
cu creșterea nivelului de trigliceride și scăderea concentrației de lipoproteine cu densitate
ridicată (HDL – high density lipoprotein). Ultimele studii menționează implicarea disfuncției
mitocondriale în apariția rezistenței la insulină și consecutiv în etiologia diabetului zaharat de
tip 2 (1, 3).
1.1.1. Epidemiologia diabetului zaharat de tip 2
Conform estimărilor oficiale, în anul 2011 un număr de 366 milioane de persoane erau
diagnosticate cu diabet zaharat, cu o creștere până la 552 milioane de persoane preconizată
pentru anul 2030. Pentru diabetul zaharat de tip 2 statisticile arată că în anul 2009 existau
aproximativ 285 milioane pacienți, iar numărul lor va crește la 439 milioane pentru anul 2030.
În anul 2010, prevalența diabetului zaharat la nivel mondial a fost de 6,4%, atingând un
maxim de 30,9% în Nauru și minimul de 1,6% pentru țările Islanda, Mongolia și Rwanda.
Pentru următoarele două decenii se estimează, de asemenea, o creștere a numărului adulților
diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2, mai ales în țările în curs de dezvoltare.
Conform Organizației Mondiale a Sănătății, diabetul zaharat este principala cauză de
orbire, amputare și insuficiență renală. În anul 2004, aproximativ 3,4 milioane de persoane au
decedat din cauza consecințelor hiperglicemiei, iar pentru următorii 10 ani se prevede o creștere
a deceselor cauzate de diabetul zaharat cu peste 50%. Până în anul 2030, diabetul zaharat ar
putea deveni a șaptea cauză a deceselor în lume (1, 4).
9
Potrivit datelor publicate pe www.data.gov.ro, prin compararea numărului pacienților

cu diabet zaharat rămași în evidență pentru semestrul 1 al anului 2015 cu cel din semestrul 1 al
anului 2014, se constată o creștere a numărului pacienților, în aproape toate județele României
(37 județe din totalul de 42) (tabel 1.I) (5).
Tabel 1.I. Evidența pacienților cu diabet zaharat în semestrul 1 al anului 2015, comparativ cu
semestrul 1 din 2014 (adaptat după www.data.gov.ro) (5)
Nr. Indici la 100000 Rămași în Indici la 100
Județ Cazuri noi
crt. locuitori evidență locuitori
2014 2015 2014 2015 2014 2015 2014 2015
0 Total 36904 34801 373,7 352,4 901883 939734 4,5 4,7
1 Alba 449 353 268,6 211,2 16393 16880 4,9 5,0
2 Arad 960 937 453,1 442,3 24105 25733 5,6 6,0
3 Argeș 1037 1344 346,8 449,4 28291 30671 4,7 5,1
4 Bacău 668 762 222,5 253,8 22202 23198 3,7 3,8
5 Bihor 1450 1459 510,6 513,7 29279 30942 5,1 5,4
6 Bistrița-Năsăud 379 280 269,7 199,3 7936 8163 2,8 2,9
7 Botoșani 540 451 270,6 226,0 13506 14061 3,4 3,5
8 Brașov 342 196 125,4 71,9 26930 26698 4,9 4,8
9 Brăila 515 541 333,3 350,2 10565 11371 3,4 3,6
10 Buzău 788 819 361,0 375,2 22063 23346 5,0 5,3
11 Caraș-Severin 800 811 559,3 567,0 14178 14699 4,9 5,1
12 Calarași 410 380 274,9 254,8 7314 8032 2,4 2,7
13 Cluj 1334 645 385,5 186,4 35945 32638 5,1 4,7
14 Constanța 1120 910 330,6 268,6 28174 32183 4,1 4,7
15 Covasna 307 377 297,3 365,1 7015 6217 3,4 3,0
16 Dâmbovița 1017 962 400,7 379,0 19382 20873 3,8 4,1
17 Dolj 2349 1594 729,4 494,9 36455 38774 5,6 6,0
18 Galați 1368 1032 523,4 394,8 23274 24094 4,4 4,6
19 Giurgiu 134 235 97,2 170,5 6153 4865 2,2 1,7
20 Gorj 617 664 372,2 400,6 11412 12439 3,4 3,7
21 Harghita 431 477 280,5 310,5 10198 10801 3,3 3,5
22 Hunedoara 1032 1182 511,1 585,4 25875 26835 6,3 6,6
23 Ialomița 407 665 305,3 498,9 9781 10832 3,6 4,0
24 Iași 982 1286 254,0 332,6 30908 32375 4,0 4,1
25 Ilfov 577 570 279,0 275,6 12158 12988 2,9 3,1
26 Maramureș 1101 850 470,9 363,5 20378 21275 4,3 4,5
27 Mehedinți 666 693 519,4 540,5 7256 8771 2,8 3,4
28 Mureș 1048 1116 386,5 411,6 26450 24571 4,8 4,5
29 Neamț 795 1505 347,7 658,2 23099 25913 5,0 5,6
30 Olt 419 419 199,9 199,9 10948 11843 2,6 2,8
31 Prahova 1210 1315 324,9 353,1 37306 38770 5,0 5,2
32 Satu-Mare 654 637 387,4 377,4 18366 19380 5,4 5,7
33 Sălaj 684 301 626,8 275,8 12048 12912 5,5 5,9
34 Sibiu 874 886 441,2 447,2 21868 23042 5,5 5,8
35 Suceava 903 1049 288,9 335,6 24328 25763 3,9 4,1
36 Teleorman 824 904 453,4 497,4 14321 15115 3,9 4,1
37 Timiș 1028 1029 299,6 299,9 43121 44364 6,2 6,4
38 Tulcea 288 348 279,4 337,6 7227 7578 3,5 3,6
39 Vaslui 640 646 331,9 335,1 18110 18962 4,6 4,9
40 Vâlcea 606 663 334,8 366,3 16519 17221 4,5 4,7
41 Vrancea 524 498 315,4 299,8 10936 11645 3,3 3,5
42 M,București 4627 3010 501,1 326,0 110110 112901 5,9 6,1
Sursa: CNSISP (Centrul Național de Statistică și Informatică în Sănătate publică)
Indicii sunt calculați cu populația rezidentă la 1 ianuarie 2014.
10
1.1.2. Cauzele diabetului zaharat de tip 2
Fig. 1.1. Patogeneza diabetului zaharat de tip 2 (adaptat după Giorgino, 2005) (6)
Diabetul zaharat de tip 2 are ca principale cauze stilul de viață și factorii genetici (fig.
1.1). Lipsa activității fizice, sedentarismul, fumatul și consumul de alcool sunt incriminate în
apariția și evoluția diabetului zaharat de tip 2. De asemenea, s-a constatat că obezitatea este
responsabilă de aproximativ 55% din cazurile de diabet zaharat de tip 2. Creșterea ratei
obezității infantile în perioada 1960-2000 a dus la creșterea frecvenței diabetului zaharat de tip
2 la copii și adolescenți. Toxinele din mediul înconjurător pot fi printre cauzele creșterii recente
a incidenței diabetului zaharat de tip 2. S-a observat o corelație pozitivă minoră între
concentrația urinară de bisfenol A, componentă a unor materiale plastice, și incidența diabetului
zaharat de tip 2.
Există însă și alte patologii care pot declanșa sau agrava diabetul zaharat de tip 2. Cele
mai cunoscute sunt: hipertensiunea, obezitatea, nivelul ridicat în sânge de colesterol, sindromul
metabolic, acromegalia, sindromul Cushing, pancreatita cronică, cancerul, feocromocitomul
(1).
Fig. 1.2. Factorii care determină hiperglicemia (adaptat după Harvey, 2013) (7)
11
Hiperglicemia pe nemâncate este cauzată de rezistența la insulină de la nivel hepatic, pe

când cea postprandială are drept cauză secreția necorespunzătoare de insulină, dereglarea
producerii glucozei hepatice și afectarea preluării glucozei la nivelul țesuturilor periferice.
Ulterior se manifestă glucotoxicitatea, sau efectul hiperglicemiei cronice, cu afectarea celulelor
β-pancreatice și scăderea sensibilității la insulină. Corespunzător figurii 1.2, deficitul de
insulină și rezistența la insulină contribuie împreună la patogeneza diabetului zaharat de tip 2.
Există studii care ilustrează faptul că funcționarea defectuoasă a celulelor β-pancreatice precede
declanșarea diabetului zaharat de tip 2, iar funcția secretoare a acestor celule este redusă
semnificativ în momentul declanșării diabetului (6).
1.1.3. Complicațiile cronice ale diabetului zaharat de tip 2
Complicațiile cronice ale diabetului zaharat de tip 2 sunt mai ales de natură
microangiopatică, la nivelul ochilor, rinichilor și sistemului nervos. Cele mai importante sunt
retinopatia diabetică, neuropatia diabetică, nefropatia diabetică, afectarea vaselor mari de sânge
și infecțiile cronice (8). În timp ce retinopatia și nefropatia diabetică pot avea o evoluție
încetinită de un control al glicemiei și tensiunii arteriale, neuropatia diabetică cauzează afectare
majoră, reprezentând o problemă semnificativă (9).
1.1.3.1. Nefropatia diabetic
Nefropatia diabetică este una din cauzele majore pentru insuficiența renală aflată în
stadiul terminal, la pacienții din țările occidentale. Este descrisă prin apariția proteinuriei și
consecutiv scăderea ratei de filtrare glomerulară. Această complicație a diabetului zaharat
evoluează în timp, pe perioade de chiar 10-20 de ani, iar în lipsa tratamentului poate determina
uremie letală.
Afectarea renală reprezintă și un factor de risc pentru infarctul miocardic acut sau
accidentul vascular cerebral. Pe de altă parte, hipertensiunea arterială și controlul glicemic
precar sunt fundalul pe care evoluează nefropatia diabetică.
1.1.3.2. Retinopatia diabetică
Reprezintă o altă complicație cronică a diabetului zaharat. Se caracterizează prin leziuni

ale retinei și este, pentru adulți, principala cauză de orbire. Leziunile de la nivelul retinei
presupun moodificări ale permeabilității vasculare, degenerarea capilară, formare de noi vase
de sânge. Din punct de vedere clinic, sunt delimitate stadiile de evoluție nonproliferative și
proliferative, etapa inițială nefiind însoțită de nici o tulburare de vedere. Evoluția retinopatiei
diabetice parcurge etapele de degenerare a capilarelor, ischemie, edem macular, și chiar
dezlipire de retină.
1.1.3.3. Neuropatia diabetică
Apare la mai mult de jumătate din populația diagnosticată cu diabet zaharat, fiind
estimat un risc de 15% de amputare a uneia sau mai multe extremități. Neuropatia diabetică este
un factor important în afectarea procesului de vindecare a rănilor, disfuncția erectilă sau
afectarea cardiovasculară. Hiperalgezia și paresteziile apar la o parte dintre pacienți, cu durere
la aproximativ 40-50% dintre persoanele diagnosticate cu neuropatie diabetică. Durerea apare
și la 10-20% dintre pacienții care nu prezintă și semne clinice ale neuropatiei.
12
1.1.3.4. Bolile cardiovasculare

Riscul crescut de boli cardiovasculare în rândul populației diabetice este în concordanță
cu o proporție de mai mult de 50% a mortaliătii atribuită afectării cardiovasculare la pacienții
cu diabet zaharat. Totodată, prezența diabetului zaharat reprezintă un risc de trei ori mai mare
pentru infarctul miocardic, comparativ cu populația generală (10).
1.2. TERAPIA ORALĂ ÎN DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2
1.2.1. Sulfoniluree
Acești compuși sunt în general bine tolerați, dar din cauza stimulării secreției endogene
de insulină, prezintă risc de hipoglicemie.
Mecanismul de acțiune constă în creșterea eliberării de insulină de la nivelul
pancreasului. Au fost propuse și 2 mecanisme adiționale: o reducere a nivelului seric de
glucagon și închiderea canalelor de potasiu în țesutul extrapancreatic.
Pacienții vârstnici, cu diabet zaharat, ce sunt tratați cu sulfoniluree, prezintă un risc
crescut de 36% pentru hipoglicemie, comparativ cu pacienții mai tineri. Gliburid este asociat
cu o rată mai mare de hipoglicemie, comparativ cu glipizid. Cei mai importanți factori de risc
pentru hipoglicemie sunt afectarea renală legată de vârstă, utilizarea simultană a insulinei sau a
sensibilizitorilor de insulină, vârstă mai mare de 60 de ani, externare recentă din spital, abuzul
de alcool, restricțiile calorice, polimedicația sau medicația care potențează acțiunea compușilor
de tip sulfoniluree.
Sulfoniluree de generația I: clorpropamid, tolazamid.
Sulfoniluree de generația a II-a: gliburid, glipizid, glimepirid, glibenclamid, glicazid,
gliquidon.
Reacțiile adverse ale acestei clase sunt: hipoglicemia, cu efect mai intens la vârstnici;
apare în caz de supradozare sau de insuficientă hepatică sau renală; tulburări digestive, alergii
cutanate.
1.2.2. Biguanide
Metforminul este cel mai cunoscut compus biguanidic, utilizat mai ales la pacienții
obezi și supraponderali. Mecanismul de acțiune constă în reducerea producerii hepatice de
glucoză, prin activarea enzimei AMP-protein kinazei, o enzimă ce joacă un rol în exprimarea
genelor hepatice gluconeogenice. Crește sensibilitatea la insulină, favorizează asimilarea
glucozei, stimulează oxidarea acizilor grași și diminuează absorbția glucozei din tractul gastro-
intestinal.
Reprezentanți: metformin, buformin.
Ca reacții adverse se pot menționa: tulburări digestive, unele particulare (anorexie, gust
metalic, greață, vomă). Caracteristică este acidoza lactică, care este favorizată de: dozele mari,
diabet zaharat neechilibrat, cetoza diabetică, insuficiența renală și hepatică, insuficiența
respiratorie, insuficiența cardiacă, stări hipoxice, și prin urmare biguanidele sunt contraindicate
în situațiile menționate. Acești compuși prezintă o incidență scăzută a hipoglicemiei,
comparativ cu cei de tip sulfoniluree.
1.2.3. Meglitinide
Acești compuși sunt secretagogi non-sulfoniluree care acționează la nivelul canalului K

ATP-dependent din celulele β pancreatice, stimulând astfel eliberarea insulinei din celulele β
pancreatice, similar sulfonilureelor, însă cu un alt situs de legare. Meglitinidele au o latență
13
mică și o durată scurtă de acțiune (4-6 ore) și astfel au un risc scăzut de hipoglicemie.
Meglitinidele sunt administrate înaintea meselor pentru controlul glicemiei postprandiale.
Reprezentanți: repaglinid, nateglinid.
1.2.4. Tiazolidindione
Tiazolidindionele sunt sensibilizatori pentru insulină, agoniști selectivi pe receptorul

nuclear PPAR-gamma (receptor gamma al proliferării peroxizomale). Scad rezistența la
insulină în țesutul adipos, mușchi striați, ficat. Cresc transportul glucozei în mușchi și țesutul
adipos, prin creșterea sintezei și translocării de forme specifice ale proteinelor transportoare ale
glucozei.
Reprezentanți: rosiglitazon, pioglitazon, lobeglitazon.
Utilizarea pioglitazonei nu este asociată cu hipoglicemie și poate fi folosită în caz de
afectare renală, fiind astfel bine tolerată de adulții mai în vârstă. Pe de altă parte, din cauza
edemelor periferice, a retenției de fluid și a riscului de fracturi la femei, utilizarea sa poate fi
limitată în cazul adulților mai în vârstă cu diabet zaharat.
În cazul asocierii cu metformin, pot da: anemie, cefalee, hipo- și hiperglicemie, acidoză
lactică, iar la asocierea cu sulfoniluree: tulburări de coagulare, hipo- și hiperglicemie, greață,
dureri abdominale.
Nu se asociază cu insulina și sunt contraindicate în insuficiență cardiacă, hepatică.
1.2.5. Gliptine
Sunt inhibitori ai dipeptidil peptidazei 4, enzimă ce inactivează rapid atât GLP-1

(glucagon-like peptid 1), cât și GIP (peptid inhibitor gastric). Rezultă o creștere a nivelului
acestor hormoni, cu îmbunătățirea funcției celulelor pancreatice și a controlului glicemic în
diabetul zaharat de tip 2. Acești agenți terapeutici sunt eficienți ca monoterapie la pacienții cu
dietă și exerciții insuficiente și ca terapie adițională tratamentelor cu metformin, tiazolidindione
și insulină.
Reprezentanți: vildagliptin, sitagliptin.
Inhibitorii dipeptidil-peptidazei IV sunt bine tolerați, au un risc scăzut de producere a
hipoglicemiei și nu influențează greutatea corporală.Sunt contraindicate în sarcină și alăptare și
pot determina hipoglicemie la asociere cu metformin și/sau sulfoniluree. Alte reacții adverse:
edeme periferice, flatulență, infecții ale căilor respiratorii superioare, amețeli.
1.2.6. Alte structuri
1.2.6.1. Inhibitori al alfaglucozidazei
Reprezentanți: acarboza, miglitol.

Inhibă alfaglucozidaza din peretele intestinal și diminuă degradarea polizaharidelor în
monozaharide absorbabile.
Dozele mari produc tulburări digestive (datorită fermentației bacteriene). Pot crește
transaminazele serice. Contraindicațiile acestor substanțe sunt: boli inflamatorii ale intestinului,
afecțiuni hepatice, sarcină și alăptare, asocierea cu adsorbante sau enzime digestive.
Acarboza, vogliboza și miglitol nu sunt încă folosite la scară largă în tratamentul
diabetului zaharat de tip 2, dar prezintă un profil sigur și eficient. Acești agenți terapeutici sunt
cei mai eficienți în cazul hiperglicemiei postprandiale și trebuie evitată utilizarea lor în cazul
afectării renale semnificative. Utilizarea în terapeutică este limitată din cauza frecvenței
crescute a reacțiilor adverse precum diaree și flatulență.
14
1.2.6.2. Inhibitori ai aldoreductazei
Reprezentanți: tolrestat, epalrestat.

Împiedică transformarea glucozei în sorbitol. Sorbitolul produs în exces (în condițiile
hiperglicemiei diabetice) contribuie la dezvoltarea complicațiilor tisulare ale diabetului:
nefropatie, neuropatie, retinopatie.
Pe lângă aceste categorii, terapia antidiabetică mai include: insulina și analogi, terapiile
bazate pe incretine, bromocriptina, inhibitorii cotransportatorilor sodiu-glucoză 2 (1–3).
15
2. METFORMIN
2.1. SCURT ISTORIC
Originile metforminului sunt legate de planta Galega officinalis Linn (liliac francez), al
cărei ingredient principal – guanidina – prezintă asemănări structurale, dar și acțiune terapeutică
similare cu metforminul.
2.1.1. Originile naturale ale metforminului – Galega officinalis Linn
Galega officinalis Linn (fig. 1.1) este o plantă medicinală utilizată în Europa medievală.
G. officinalis (liliac francez) este o plantă perenă cu flori albe, albastre sau purpurii. Crește până
la peste un metru înălțime în regiunile temperate. Părțile aeriene au fost utilizate în medicina
medievală pentru a trata ciuma, viermii, mușcăturile de șarpe sau disuria. A fost utilizată, de
asemenea, ca hrană pentru animale pentru a stimula producția de lapte, însă s-a dovedit a fi prea
toxică pentru utilizare pe scară largă în agricultură.
Fig. 1.1. Galega officinalis Linn (11)
Se consideră că G. officinalis a fost utilizată în medicina populară pentru a trata

simptome atribuite acum diabetului zaharat de tip 2, de exemplu pentru a reduce urinările
frecvente. Anumite versiuni ale tratatelor de botanică ale lui Culpeper sugerează faptul că
această plantă posedă proprietăți antidiabetice. Tratatul lui Nicholas Culpeper a fost publicat
16
pentru prima dată în secolul al XVII-lea, în aceeași perioadă în care medicii descopereau tot
mai multe informații despre diabet (12, 13).
Studii de la sfârșitul secolului al XIX-lea au arătat că G. officinalis este bogată în
guanidină, însă prea toxică pentru utilizare în terapeutică. În 1918 s-a demonstrat acțiunea
hipoglicemiantă a guanidinei în studii pe animale (13). Din cauza toxicității, atenția s-a îndreptat
spre un alt compus conținut de G. officinalis, galegina (izoamilen guanidina). Structura
galeginei a fost confirmată în anul 1923 de către un grup de cercetători din Edinburgh, Marea
Britanie, și utilizată pentru o scurtă perioadă de timp ca antidiabetic (12).
Date clinice privind galegina sulfat au fost descrise de Muller și Reinwein în 1927. La
administrarea a 109 mg de galegină sulfat s-au observat efecte hipoglicemice, de intensitate
medie la subiecții normoglicemici și semnificative la pacienții diabetici.
2.1.2. Derivați biguanidici de sinteză
Tot în anii 1920, doi compuși biguanidici de sinteză (sintetizați de Frank și colaboratorii)
au fost utilizați în terapeutică: Synthalin A sau decametilen biguanida și Synthalin B sau
dodecametilen biguanida. Unul din compuși a fost testat în clinica lui Oskar Minkowski din
Worclaw, Polonia. Cei doi compuși erau mai bine tolerați, însă apariția insulinei, dar și riscul
de hepatotoxicitate au diminuat utilizarea acestora, ducând la întreruperea tratamentului cu
Synthalin la începutul anilor 1930. În Germania Synthalin B a fost totuși utilizată până la
mijlocul anilor 1940 (12, 14, 15).
2.1.3. Istoricul metforminului
În anul 1929 au fost sintetizați mai mulți compuși biguanidici cu acțiune

hipoglicemiantă, inclusiv dimetilbiguanida (metformin). Metforminul a fost descris pentru
prima dată în anul 1922, de către Emil Werner și James Bell, ca produs în sinteza N,N-
dimetilguanidinei.
În 1929, cercetătorii Slotta și Tschesche au observat acțiunea metforminului de a scădea
nivelul glicemiei la șobolani, menționând că este cel mai eficient compus biguanidic dintre cei
studiați. Acest rezultat a fost uitat, atunci când alți analogi guanidinici - cum au fost sintalinele,
au înlocuit compușii inițiali (12).
Jean Sterne și contribuția sa în evoluția biguanidelor
Fig. 2.2. Jean Sterne și Spitalul Laennec din Paris (12)
17
Jean Sterne (1909-1997) (fig. 2.2) a fost un medic și farmacolog clinician care s-a
specializat în diabetologie avându-l ca mentor pe Francis Rathery, la Spitalul Pitie din Paris.
Aici Sterne a desfășurat primele studii cu galegina. În 1956, el a deținut funcții la Laboratoarele
Aron și Spitalul Laennec din Paris. În colaborare cu Denise Duval și alții, el a cercetat
proprietățile antidiabetice pentru mai mulți compuși biguanidici, neștiind de studiile efectuate
în Germania în 1929. Sterne a ales dimetilbiguanida (metforminul) pentru studii clinice
avansate și a propus denumirea de “Glucophage” (consumator de glucoză). Rezultatele sale au
fost publicate în 1957. Metforminul a demonstrat o scădere a valorilor glicemiei la pacienții cu
diabet zaharat de tip 2, însă nu și la indivizii sănătoși. În aceste studii au fost menționate și
efectele adverse gastrointestinale ale metforminului (12, 16).
Tot în 1957, un grup de cercetători americani au publicat rezultate similare pentru
fenformin (feniletil biguanida). Acidoza lactică raportată la pacienți tratați cu fenformin a
condus la retragerea acestui compus din Statele Unite ale Americii în anul 1977, dar și din alte
țări.
Deși restricțiile au fost atât pentru fenformin, cât și pentru metformin, compusul
comercializat de o companie franceză mică – metforminul – a fost în continuare prescris în țări
precum Franța sau Scoția.
În anul 1995 beneficiile metforminului au fost redescoperite, fiind acceptat și utilizat ca
agent terapeutic antihiperglicemiant în Statele Unite ale Americii. Însă metforminul este utilizat
în terapie încă din 1958 în Anglia și în Canada din 1972. Au fost realizate numeroase studii ce
au confirmat eficacitatea terapeutică a acestui compus. Astfel, metforminul a devenit
tratamentul de elecție la pacienții obezi cu diabet zaharat de tip 2 (17).
2.2. CARACTERISTICI FIZICO-CHIMICE ALE METFORMINULUI
Metforminul, C4H11N5, face parte din clasa biguanidelor, având denumirea chimică
N,N-dimetil-imidodicarbonimidic-diamidă (fig. 2.3), conform nomenclaturii IUPAC
(International Union of Pure and Applied Chemistry – Uniunea Internațională de Chimie Pură
și Aplicată).
NH NH
H3C
N N NH2
H
CH3
Fig. 2.3. Structura chimică a metforminului (18)
Clorhidratul de metformin se prezintă sub formă de pulbere albă, cristalină,

higroscopică. Solubilitatea metforminului în apă este de 1:2, în etanol este de 1:100, iar în
cloroform și eter este practic insolubil (19).
În cazul încălzirii până la temperatura de descompunere, metforminul emite vapori de
oxizi de azot, cu potential toxic (20).
Principalele proprietăți fizice sunt sumarizate în tabelul 2.I.
18
Tabel 2.I. Proprietăți fizice ale metforminului (18,21)

Proprietate Valoare
Masă monoizotopică 129,101440 Da
Densitate 1,3 ± 0,1 g/cm3
Punct de fierbere 172,5 ± 23,0 oC la 760 mmHg
Indice de refracție 1,576
Punct de topire 223-226 oC
pKa (bazic) 12,33
Solubilitate în apă 1,38 mg/mL (sub formă de clorhidrat)
Entalpie de vaporizare 40,9 ± 3,0 kJ/mol
Presiunea vaporilor 1,3 ± 0,3 mmHg la 25 oC
Polarizabilitate 13,2 ± 0,5·10-24 cm3
Volum molar 100,8 ± 7,0 cm3
2.3. MECANISMUL DE ACȚIUNE AL METFORMINULUI ÎN TERAPIA

DIABETULUI ZAHARAT
Mecanismul de acțiune al metforminului asupra metabolismului glucidic și lipidic se

conturează pe mai multe direcții:
- Inhibarea gluconeogenezei hepatice,
- Creșterea preluării glucozei mai ales la nivelul mușchilor și tesutului adipos (fig. 2.4),
- Întârzierea absorbției glucozei la nivel intestinal,
- Stimularea oxidării acizilor grași,
- Diminuarea sintezei hepatice a lipoproteinelor cu densitatea foarte scăzută (VLDL –
very low density lipoprotein):
o Scade nivelul trigliceridelor în plasmă cu 5-10%,
o Crește ușor nivelul lipoproteinelor cu densitate ridicată.
Fig. 2.4. Acțiunea metforminului asupra metabolismului glucidic

(adaptat după www.mechanismsinmedicine.com) (22)
19
În plus, metforminul acționează ca antidiabetic prin creșterea sensibilității la insulină la

nivelul țesuturilor. În contrast cu sulfonilureele și meglitinidele, metformin nu acționează prin
creșterea concentrației insulinei plasmatice. Stimularea preluării glucozei este obținută printr-o
creștere a transportului glucozei prin membrana celulară, iar la nivelul ficatului acționează prin
inhibarea unor enzime-cheie în calea gluconeogenezei (de exemplu, fosfoenolpiruvat
carboxikinaza, fructozo-1,6-bifosfataza și glucozo-6-fosfataza) și activarea piruvat kinazei.
Alte mecanisme propuse au fost: reducerea preluării hepatice a substraturilor gluconeogenice
(lactat și alanină) și inhibarea respirației mitocondriale, care poate reduce sursa de energie
necesară pentru efectuarea gluconeogenezei (7, 23, 24).
Este dovedit efectul metforminului asupra greutății corporale. Studiile au raportat
reducerea moderată sau stabilizarea greutății la pacienții care sunt sub tratament cu metformin,
în contrast cu creșterea greutății observată la pacienții cu sulfoniluree, tiazolidindione sau cu
terapie cu insulină.
Adipozitatea abdominală este frecventă în cazul diabetului zaharat de tip 2 și reprezintă
o componentă a sindromului metabolic. Țesutul adipos visceral este mai activ din punct de
vedere metabolic decât cel subcutanat. La nivelul țesutului adipos visceral sunt secretate
citokine cu rol proinflamator, protrombotic și de remodelare vasculară. Acumularea adipozității
viscerale este, de asemenea, asociată cu un risc crescut de ficat gras. Un raport preliminar
ilustrează faptul că metforminul acționează preferențial pentru scăderea adipozității viscerale.
Este raportată și îmbunătățirea funcției endoteliale în cazul tratamentului cu metformin,
comparativ cu placebo. În studii de evaluare a metforminului pe animale de experiență sau
culturi celulare, s-au observat efecte antioxidante, inhibarea inflamației, activarea endotelială,
îmbunătățirea microcirculației și reducerea preluării lipidice de către macrofage.
Tensiunea arterială nu este afectată de tratamentul cu metformin, cu toate că s-au
raportat îmbunătățiri ale tensiunii arteriale pentru pacienții tratați cu metformin, comparativ cu
cei sub tratament cu sulfoniluree (7, 23, 25).
Figura 2.5 schematizează conduita terapeutică în cazul inițierii terapiei orale
antidiabetice la pacienții cu diabet zaharat de tip 2, cu evidențierea circumstanțelor pentru
introducerea metforminului ca monoterapie sau în combinații medicamentoase (23).
20
Fig. 2.5. Conduita terapeutică în inițierea terapiei orale antidiabetice

(adaptat după Goodarzi, 2005)
21
2.4. ALTE ACȚIUNI TERAPEUTICE ALE METFORMINULUI
Pe lângă efectele terapeutice ale metforminului expuse în subcapitolul 3.3, această

substanță medicamentoasă este studiată pentru contribuția benefică în cancer. Însuși diabetul
zaharat crește riscul apariției cancerului, cu un probabil risc mai ridicat în cazul
hiperinsulinemiei din diabetul zaharat de tip 2, insulina având efecte proliferative și
determinând dezvoltarea cancerului. Metforminul determină un efect indirect prin scăderea
rezistenței la insulină și unul direct, la nivel celular, prin reducerea producerii de specii reactive
ale oxigenului endogene și a afectării ADN-ului, prin inhibarea proliferării celulare și creșterea
apoptozei celulare la anumite linii de celule canceroase. Metformin este menționat că
îmbunătățește durata de viață la pacienții diabetici diagnosticați cu cancer, față de cei aflați sub
tratament cu alte antidiabetice sau față de pacienții fără diabet zaharat.
Inhibarea proliferării celulare poate potența, de asemenea, efectul medicamentelor
chimioterapice (26, 27).
Mecanismul de acțiune antitumoral este schematizat în figura 2.6 (28).
Fig. 2.6. Mecanismul antidiabetic și antitumoral al metforminului

(adaptat după Emami Riedmaier, 2013) (28)
Sindromul ovarului polichistic este un sindrom complex, una dintre afecțiunile

endocrine cele mai frecvente la femei. Afectează aproximativ 5-10% dintre femeile aflate la
vârsta de reproducere. Sensibilizatorii de insulină, în special metforminul, se utilizează în
terapia femeilor cu sindromul ovarului polichistic. Rezistența la insulină și hiperinsulinemia
sunt cunoscute ca mecanisme patogenice. Nivelurile mari de insulină afectează funcția
hipotalamo-pituitar-ovariană, precum și utilizarea glucozei la nivelul țesuturilor periferice.
Metforminul reduce hormonii androgeni circulanți și rezistența la insulină, ameliorând
astfel rata de ovulație.
22
Unele studii afirmă că efectele benefice ale metforminului în sindromul ovarului

polichistic se observă mai ales la pacientele cu obezitate și cu rezistență crescută la insulină.
Astfel, tratamentul cu substanțe medicamentoase sensibilizatori de insulină nu reprezintă
întotdeauna terapia optimă pentru reducerea hiperandrogenismului sau pentru a reface ovulația,
ci trebuie să fie direcționat către anumite probleme metabolice sau reproductive.
Alte studii susțin utilizarea metforminului în sindromul ovarului polichistic, prezentând
efectele benefice în inducerea ovulației, dereglările menstruale, fertilitate și hirsutism, obezitate
și calitatea vieții la femeile cu diagnostic de sindrom al ovarului polichistic (27, 29).
2.5. PARTICULARITĂȚI TOXICOCINETICE ALE METFORMINULUI
Profilul cinetic al metforminului este caracterizat de: instalarea efectului în câteva zile,
apariția efectului maxim la cel mult 2 săptămâni. Legarea metforminului de proteinele
plasmatice este neglijabilă, cu o biodisponibilitate absolută pe nemâncate de 50% până la 60%.
Volumul de distribuție este 654 ± 358 L, iar timpul de înjumătățire a concentrației plasmatice
este de 6,2 ore. Eliminarea metforminului are loc la nivel urinar, sub formă nemodificată (90%),
prin filtrare glomerulară și secreție tubulară (30, 31).
Etapele principale parcurse de molecula de metformin de la absorbție până la eliminare
sunt ilustrate în figura 2.7 (32).
Fig. 2.7. Cinetica metforminului (adaptat după Gong, 2012) (32)
2.6. EFECTELE ADVERSE ALE TERAPIEI CU METFORMIN
Efectele adverse ale metforminului sunt sumarizate în tabelul 2.II. Unul dintre cele mai
grave efecte adverse ale terapiei cu biguanide este acidoza lactică. Rezultă din acțiunea
stimulantă a biguanidelor asupra metabolismului glucidic non-oxidativ, care determină o
conversie accelerată a piruvatului în lactat și acetil CoA. În condițiile unei producții crescute de
23
lactat și a unui clearance redus al lactatului, cum ar fi afecțiuni ale ficatului, disfuncție renală
sau alte boli care determină hipoxie (de exemplu, insuficiență cardiacă sau respiratorie),
biguanidele pot determina acidoză lactică, care are o mortalitate crescută. Însă, incidența
globală a acidozei lactice asociate metforminului este mică, fiind estimată la un caz la 30000
pacienți pe an (15).
Mai mult, studii recente menționează posibilitatea utilizării metforminului în cazul
afectării renale sau insuficienței cardiace moderate. Însă, din cauza evoluției silențioase a
afectării renale, este necesară evaluarea funcției renale atât la inițierea terapiei cu metformin,
cât și pe parcursul tratamentului (25, 33).
Tabel 2.II. Efectele adverse ale metforminului (30)

Efecte adverse ale metforminului
Cardiovasculare Vasculită
Dermatologice Vasculită cutanată
Endocrine și metabolice Acidoză lactică, hiponatremie, hipoglicemie,
hiperinsulinemie, deficit de vitamină B12
Gastrointestinale Diaree, anorexie, greață, vomă, constipație, arsuri la
stomac, plenitudine epigastrică, gust metalic,
pancreatită
Hematologice Anemie megaloblastică, anemie hemolitică
Hepatice Hepatită, icter
Neuromusculare și scheletice Fasciculații
Respiratorii Vasculită pulmonară
Diverse Diaforeză, pneumonie de hipersensibilitate
2.7. CONTRAINDICAȚII
Principalele contraindicații ale terapiei cu metformin sunt: hipersensibilitatea la

metformin, afectarea renală (creatinina serică ≥1,5 mg/dL la bărbați sau ≥1,5 mg/dL la femei,
clearance-ul creatininei anormal, indiferent de cauză, inclusiv șoc, infarct acut de miocard sau
septicemie), insuficiență cardiacă congestivă, acidoză metabolică acută sau cronică cu sau fără
instalarea comei (30). Alte situații clinice în care metforminului este contraindicat sau trebuie
utilizat cu precauție: administrare intravasculară de agenți de contract iodurați, insuficiență
hepatică, intoxicație acută cu alcool, alcoolism, lactație (25).
2.8. INTERACȚIUNI MEDICAMENTOASE
Interacțiuni medicamentoase semnificative clinic sunt rare. Acarboza, inhibitor al α-

glucozidazei, a fost incriminată în reducerea semnificativă a biodisponibilității și a picului
plasmatic de metformin atunci când sunt coadministrate.
Medicamentele cu potential hiperglicemic (de exemplu, diuretice, corticosteroizi,
contraceptive orale, simpatomimetice) pot determina pierderea controlului glicemiei.
Substanțele cationice (de exemplu, digoxin, morfină, chinină, chinidină, ranitidină) care sunt
eliminate la nivel renal prin secreție tubulară pot interacționa cu metforminul prin competiție
pentru sistemele de transport de la acest nivel (23,30). Combinația dintre inhibitorii enzimei de
conversie a angiotensinei, prescriși și pentru efectele nefroprotectoare la pacienții cu diabet
zaharat (34), și metformin ar putea da un posibil efect sinergic în dezvoltarea acidozei lactice
hiperkaliemice (35).
24
Sunt menționate, de asemenea, interacțiuni posibile între antidiabeticele orale și diverși

compuși terapeutici, cu creșterea efectului hipoglicemiant (inhibitori de monoaminooxidază,
fenilbutazonă, clofibrat, ciclofosfamidă) sau scăderea efectului antidiabetic (în cazul asocierii
cu acidul nicotinic) (36).
25
3. EFECTE TOXICE CARACTERISTICE ÎN

TERAPIA CU METFORMIN
Metforminul poate cauza intoxicații, cu consecințe particulare, în funcție de

variabilitatea individuală a pacienților. Caracteristice metforminului sunt: tulburările de la nivel
gastro-intestinal, acidoza lactică sau malabsorbția vitaminei B12.
În cazul intoxicației cu metformin, decontaminarea se poate realiza prin lavaj gastric cu
cărbune activat, dacă se intervine în prima oră de la ingestie. Terapia de susținere este bazată
pe administrarea de glucoză, pentru combaterea hipoglicemiei, de bicarbonat de sodiu – în cazul
acidozei severe. Se poate accelera eliminarea metforminului din organism prin efectuarea
hemodializei, cu utilizarea bicarbonatului de sodiu ca tampon acido-bazic (30).
3.1. TULBURĂRILE DIGESTIVE ASOCIATE TERAPIEI CU METFORMIN
Efectele adverse gastro-intestinale cauzate de terapia cu metformin sunt raportate

frecvent la pacienți. Mai mult, au fost realizate studii care au analizat și observat modificări
structurale și/sau funcționale la nivelul tractului gastrointestinal. Studii recente menționează
faptul că terapia cu metformin nu influențează evacuarea gastrică, dar stimulează secreția
gastrică și a peptidelor intestinale. De asemenea, metforminul poate induce refluxul gastro-
duodenal.
În plus, au fost propuse mecanisme de acțiune directă a metforminului asupra
enterocitelor, cu reducerea transferului activ al sărurilor biliare, independent de activitatea ATP-
azei Na+/K+. Acest mecanism ar fi implicat în scăderea nivelului colesterolului, dar și în apariția
diareei în terapia cu metformin (31).
Svare raportează un caz de hipomagnezemie cauzată de diaree indusă de metformin.
Tabloul clinic general al pacientului la internare include: spasme la nivelul carpienelor și
gambei, durere (mai ales la nivelul membrelor inferioare), parestezia buzelor, mâinilor și
picioarelor. Sunt constatate hipomagnezemia, hipocalcemia și hipokaliemia.
Pacientul de 57 de ani este fost fumător, cu istoric de boală coronară, hipertensiune și
reflux gastrointestinal și diabet zaharat de tip 2 diagnosticat de 12 ani. Terapia antidiabetică
include metforminul, inițiat în urmă cu 9 ani, fiind asociat la momentul internării cu glimepirid,
metoprolol, clopidogrel, acid acetilsalicilic și lansoprazol. Diareea este prezentă de o perioadă
îndelungată, însă cu agravare generală în ultimele luni.
Deoarece s-a concluzionat că hipomagnezemia prezentă a fost cauzată de diaree, cel mai
probabil indusă de tratamentul cu metformin, s-a întrerupt tratamentul cu metformin, inițiindu-
se suplimentarea cu magneziu și potasiu. În decurs de câteva zile, scaunele s-au îmbunătățit, iar
pacientul a ajuns la o stare generală bună și un control glicemic acceptabil la 6 luni de la
internare.
26
S-a apreciat că diareea a fost cauzată de tratamentul cu metformin, deși diabetul sau
medicația asociată ar fi putut determina acest efect. Însă, analizând evoluția generală a
pacientului, împreună cu ameliorarea semnificativă la întreruperea tratamentului cu metformin,
diareea necauzată de metformin este improbabilă în acest caz (37).
Cazul prezentat – singurul raportat pentru hipomagnezemie asociată tratamentului cu
metformin, marchează faptul că diareea indusă de metformin poate avea consecințe importante
și necesită monitorizare corespunzătoare.
3.2. ACIDOZA LACTICĂ
3.2.1. Definiție. Caracterizare
Acidoza lactică este o complicaţie rară, dar gravă a terapiei cu biguanide şi poate fi
întâlnită atât în utilizarea terapeutică, cât şi în caz de supradozare (38).
Acidoza lactică poate fi, după o clasificare obişnuită, de tip A (asociată sau cauzată de
transportul necorespunzător de oxigen la nivelul ţesuturilor) şi de tip B (cu transport
corespunzător al oxigenului la nivelul ţesuturilor). La tipul B există 3 subcategorii: B1, unde
acidoza lactică este asociată cu o afecţiune (de ex., diabet zaharat, astm etc.), B2 - acidoza
lactică cauzată de medicamente sau toxine (de ex., cianuri, metformin, epinefrină etc.) şi B3 -
cauzată de tulburări metabolice congenitale.
Dependent de cauză, hiperlactatemia este definită prin nivelul de lactat între 2 şi 5
mmol/L, deşi se menţionează că acidoza lactică este prezentă când nivelul lactatului depăşeşte
5 mmol/L şi pH arterial este mai scăzut de 7,35. Aceste definiţii pot fi însă arbitrare (39).
Lactatul reprezintă produsul final în metabolismul anaerob (reprezintă produsul obţinut
în urma reducerii piruvatului prin intermediul enzimei lactat dehidrogenazei). Se obţine iniţial
în muşchii scheletici, intestin, creier şi eritrocitele circulante, cu o rată de aproximativ 1
mmol/kg/h. Ficatul sănătos preia cea mai mare parte din lactat şi îl reciclează prin 3 căi
principale: conversie în glucoză (ciclul Cori), oxidare la piruvat, care ulterior poate fi oxidat la
CO2 (ciclul Krebs) sau transaminare la alanină. Scăderea nivelului de oxigen la nivelul
ţesuturilor şi celulelor determină afectarea fosforilării oxidative, cu creşterea concentraţiei
intracelulare de NADH, cofactor în conversia piruvatului în lactat. Datorită legăturii apropiate
cu metabolismul anaerob, lactatul a fost considerat produsul final al glicolizei datorate hipoxiei
(39).
Fig. 3.1. Acidoza lactică şi circumstanţele particulare care pot creşte riscul producerii acesteia,
asociate terapiei cu metformin (adaptat după Scheen, 2013) (40)
27
Factorii de risc pentru dezvoltarea acidozei lactice asociate utilizării metforminului,

precum insuficienţa renală, afecţiuni cardiace preexistente, afectare pulmonară cronică (cu
hipoxie), insuficienţă cardiacă congestivă, sunt de obicei considerate contraindicaţii ale terapiei
cu metformin. Înaintarea în vârstă poate fi asociată cu scăderea funcţiei renale şi creşterea
comorbidităţilor (41). În figura 3.1 este schematizat mecanismul de producere a acidozei lactice,
în cazul circumstanţelor particulare.
La pacienţii la care apare acidoza lactică severă, simptomatologia este caracteristică:
agitaţie, confuzie, absenţa reflexelor corneene, pupile dilatate fixe, letargie, convulsii, comă şi,
în final, moarte (42).
3.2.2. Prezentarea unor cazuri de acidoză lactică la pacienți tratați cu metformin
Din literatura de specialitate, au fost consultate și sintetizate mai multe cazuri (13 cazuri)
de intoxicaţie acută cu metformin, asociată cu acidoză lactică.
Tabel 3.I. Particularităţi ale declanşării acidozei lactice induse de metformin

Ingerare de
Sursa bibliografică Patologie asociată Medicaţie asociată
metformin
insuficienţă renală cauzată
Van Velzen, 2008 (44) tratament cronic medicaţie variată
de diclofenac
Saidi, 2010 (43) 500 mg x 2/zi * creatină
Yang, 2009 (45) tentativă de suicid nefropatie diabetică *
Van Sloten, 2012 (46) tratament cronic * *
boală coronariană, boală
vasculară periferică, lisinopril, aspirină, metoprolol,
Kreshak, 2010 (47) tratament cronic hipertensiune, clopidogrel, acetaminofen,
hipercolesterolemie, hidrocodonă
osteoartrită
tentativă de
Akoglu, 2011 (48) * *
suicid: 144,5 g
colectomie totală,
Browers, 2009 (49) tratament cronic enalapril, atorvastatin, glicazid
insuficienţă renală acută
supradoză:
Dell' Aglio, 2010 (38) * *
75-100 g
supradoză cu: risperidonă,
Perrone, 2011 (17) supradoză * sertralină, hidroclorotiazidă,
gliburid
amiodaronă, clonidină,
valsartan, gabapentin, gliburid,
patologie multiplă, boală
Perrone, 2011 (17) tratament cronic furosemid, atorvastatin,
renală în stadiu terminal
lisinopril, amlodipină,
omeprazol
HTA, boală renală în stadiu
Perrone, 2011 (17) tratament cronic *
terminal
Al-Makadma, 2010 tentativă de
* *
(50) suicid: 40-45 g
supradoză:
Kim, 2008 (51) HTA carvedilol (Dilatrend®)
30 g
* Nu este precizat.
Circumstanţele enunţate care au dus la apariţia acidozei lactice sunt sistematizate în

tabelul 3.I. Efectul advers grav de acidoză lactică a apărut atât în cazul supradozării în scop de
suicid, cât şi în cazul administrării cronice pentru tratarea hiperglicemiei. De asemenea, acidoza
28
lactică asociată administrării de metformin a fost prezentă la pacienţi cu afectare renală, dar şi
în lipsa acestei patologii. În ceea ce priveşte medicaţia asociată incriminată în apariţia şi/sau
agravarea efectelor adverse induse de metformin, s-a stabilit o legătură certă în cazul co-
administrării de creatină (43).
Simptomatologia marchează, în primul rând, afectarea gastro-intestinală produsă de
metformin, când apar: greaţă,vomă, diaree, crampe abdominale, anorexie, disconfort şi durere
epigastrică, inapetenţă. Instalarea acidozei lactice determină apariţia letargiei, confuziei,
dispneei, hipotermiei, hipotensiunii şi instabilităţii hemodinamice. În tabelul 3.II sunt
menţionate toate observaţiile clinice pentru pacienţii intoxicaţi acut cu metformin.
Tabel 3.II. Simptomatologia intoxicaţiei acute cu metformin, asociate cu acidoză lactică

Simptome
Sursa Alte
bibliografică gastro- ale sistemului cardio- pulmo simptome
renale
intestinale nervos central vasculare nare
Van Velzen,
* * confuzie * * inapetenţă
2008 (44)
oliguri
Saidi, somnolenţă, stop edem
* e, apoi anorexie
2010(43) indispoziţie cardiac pulmonar
anurie
Yang, oliguri inapetenţă,
* letargie * *
2009 (45) e hipotermie
Van Sloten,
* * delir * * prostatită acută
2012 (46)
pierderea
vederii
Kreshak,
* * * * * bilaterale, fără
2010 (47)
durere asociată,
hipotermie
Akoglu,
* * * * * hipotermie
2011 (48)
greaţă,
vomă,
Browers,
durere * * * * *
2009 (49)
abdominală,
diaree
Dell' Aglio,
* * letargie * * *
2010 (38)
Perrone,
* * letargie * * *
2011 (17)
respiraţie
tip
Kussmaul,
Perrone, slăbiciune,
* * * * raluri
2011 (17) mucoase uscate
difuze la
nivelul
pieptului
Perrone,
* * * * dispnee *
2011 (17)
iritabilitate
marcată,
Al-Makadma,
* * deteriorarea * * *
2010 (50)
stării de
conştienţă
Kim,
* * iritabilitate * * *
2008 (51)
*Nu este precizat.
29
Parametrii paraclinici înregistraţi în cazul intoxicaţiei acute cu metformin ilustrează

prezenţa şi evoluţia stării de acidoză lactică, de la momentul diagnosticării până la finalizarea
tratamentului medicamentos şi a hemodializei. Tabelul 3.III prezintă evoluţia testelor
paraclinice ale pacienţilor.
Tabel 3.III. Valorile indicatorilor paraclinici înregistraţi la pacienţii

intoxicaţi acut cu metformin
Valorile parametrilor la internare Valorile parametrilor după tratament
Creati Creati
Sursa biblio TA 1
Glucoză Lactat Măsuri Glucoză Lactat
nină pH Tc2 nină pH Tc2
grafică mm Hg, serică seric terapeutice serică seric
serică arterial 0C serică arterial 0
C
puls mg/dL mmol/L mg/dL mmol/L
mg/dL mg/dL
Van Velzen, Nivel
* * * * * hemodializă * * * * *
2008 (44) ridicat
insulină,
Saidi, bicarbonat de
130/70, * 3,5 493 17,2 7,25 * * * * * *
2010 (43) sodiu iv,
hemodializă
glucoză iv,
5,01 cărbune activat
115/59(la (la 12 po, gluconat de
2 ore: ore: calciu, 25,85
Yang,
68/34), 8,1 17 21,6; 6,99 30 bicarbonat de 6.2 127-203 (la 36 * *
2009 (45)
132 la 20 de sodiu iv, ore)
ore: dopamină iv,
39,3) norepinefrină iv,
dializă
întreruperea
Van Sloten,
130/76, 75 1,14 * 5,9 7,5 * tratamentului cu 1,14 * 1,1 * *
2012 (46)
metformin
gluconat de
calciu, insulină,
glucoză,
Kreshak,
117/59, 55 * * 19,9 6,65 32,3 bicarbonat de * * 1,9 7,48 *
2010 (47)
sodiu,
fomepizol,
hemodializă
17,0
Akoglu, 110/70, (după 4
2,7 142 7,27 35,4 hemodializă * * 8 7,46 *
2011 (48) 112 ore:
17,8)
bicarbonat de
Browers, sodiu iv, nivel
100/50, 88 13,69 28,8 16,3 6,87 * * * * *
2009 (49) hemodializă, normal
glucoză
dopamină iv,
Dell' Aglio, bicarbonat de
91/54, * * * 29,9 6,72 33,0 2,0 * 7,8 7,36 36,5
2010 (38) sodiu iv,
hemodializă
cărbune activat,
bicarbonat de
Perrone,
126/49, 79 * 140 * 6,95 * sodiu, * * * * *
2011 (17)
hemodializă,
octreotid
Perrone, 151/85, dextroză,
10,9 38 18,9 36,2 * * * * *
2011 (17) 100 hemodializă
hemodializă cu
Perrone,
* * * 16 7,03 * bicarbonat de * * 8,4 7,22 *
2011 (17)
sodiu
epinefrină iv,
Al- norepinefrină iv,
80-100
Makadma, * 1100 34 6,8 * glucoză iv, * * * * *
(sistolică)
2010 (50) insulină,
hidrocortizon iv
bicarbonat de
Kim,
* * 434 * 7,35 * sodiu iv, * * * * *
2008 (51)
hemofiltrare
1 - Tensiune arterială
2 - Temperatură corporală
* Nu este precizat.
30
Abordarea terapeutică a presupus, în primul rând, normalizarea dezechilibrului acido-

bazic, accelerarea metabolismului lactatului, eliminarea metforminului şi, concomitent, tratarea
bolilor asociate. Urmărind evoluţia pacienţilor din cazurile consultate, acidoza lactică asociată
administrării de metformin este reversibilă, atunci când diagnosticarea şi iniţierea tratamentului
sunt realizate imediat, astfel încât măsurile terapeutice să fie eficiente.
Sintetizând datele consultate din literatura de specialitate, acidoza lactică asociată
administrării de metformin este o complicaţie foarte rară, atunci când nu sunt co-morbidităţi
prezente (boală renală cronică, infarct de miocard, septicemie), care pot cauza acidoza lactică
chiar fără utilizarea de metformin. Patologiile şi condiţiile particulare asociate, întâlnite în
cazurile consultate, au fost: administrarea de creatină, afectarea renală cauzată de medicaţia
asociată (de ex., diclofenac), insuficienţa renală. Este menţionat în literatură faptul că
aproximativ 25% dintre pacienţii aflaţi sub tratament cu metformin prezintă cel puţin o
contraindicaţie pentru acest medicament, contraindicaţie care poate favoriza apariţia şi chiar
agrava evoluţia unei acidoze lactice (45, 52). Această complicaţie poate sa apară atât în caz de
supradozare cu metformin, cât şi în timpul unui tratament cronic, cu doze terapeutice normale.
S-a constatat că nu există nicio corelaţie între nivelurile plasmatice de metformin şi severitatea
intoxicaţiei şi a acidozei lactice (52). Acest fapt susţine tocmai importanţa patologiei asociate
şi a contraindicaţiilor clare în cazul administrării de metformin.
Este cunoscut faptul că hipoxia tisulară şi afectarea renală sunt factori favorizanţi pentru
acidoza lactică. Mai mult, pacienţii care suferă de diabet zaharat pot avea un control ineficient
al glicemiei, cu valori mari ale hemoglobinei glicate, fapt ce determină afectarea renală prin
nefropatia diabetică. Astfel, încercarea unui tratament eficient cu metformin, asociată cu
declanşarea unei complicaţii cronice a diabetului zaharat, poate avea consecinţe grave. Conform
studiilor, chiar şi în cazul intervenţiei prompte, rata mortalităţii pentru acidoza lactică este
încadrată între 60% şi 90% (43).
În unele studii s-a punctat chiar şi o explicaţie biologică pentru acidoza lactică asociată
administrării de metformin. Modificările genetice ce pot să apară la proteina OCT1 pot afecta
farmacocinetica metforminului. OCT1, sau transportatorul de cationi organici 1, facilitează
asimilarea hepatică a metforminului, iar o singură nucleotidă polimorfă a OCT1 poate fi
asociată cu niveluri intracelulare crescute de metformin, şi implicit cu un risc crescut de a
dezvolta acidoză metabolică la concentraţii plasmatice terapeutice (46).
Schemele terapeutice de intervenţie în cazul acidozei lactice asociată administrării de
metformin includ şi bicarbonatul de sodiu iv Se urmăreşte corectarea acidozei şi restabilirea
echilibrului hidro-electrolitic, însă bicarbonatul de sodiu poate prezenta şi unele dezavantaje:
apariţia hipervolemiei cauzate de sodiu, agravarea acidozei intracelulare şi descompunerea
oxihemoglobinei.
Hemodializa este, de asemenea, instituită pentru tratarea acidozei lactice asociate
administrării de metfomin; însă, deoarece metforminul are un volum mare de distribuţie, prin
hemodializă este eliminată o cantitate mică de medicament, măsura terapeutică fiind eficientă
mai ales pentru corectarea efectelor grave asociate - acidoza. În cazul iniţierii hemodializei, s-a
observat şi un efect de rebound. Metforminul se acumulează în intestin şi eritrocite, cu
producerea şi creşterea concentraţiei serice de lactat. Se recomandă continuarea hemodializei,
când ulterior se normalizează nivelul lactatului seric şi este corectată acidoza lactică.
Metforminul, ca atare, nu determină hipoglicemie, însă schema de tratament include, de
obicei, şi o sulfoniluree antidiabetică. Situaţiile în care metforminul, în monoterapie, poate
determina hipoglicemie sunt: starea de post, efortul fizic susţinut, insuficienţa renală. În aceste
condiţii poate să apară hipoglicemie, corectată prin administrarea intravenoasă de glucoză.
Totuşi, unii autorii afirmă că administrarea glucozei poate agrava acidoza lactică, deoarece
metabolismul glucozei intracelulare este direcţionat spre formarea lactatului.
31
În plus, s-a constatat faptul că insulina manifestă efecte benefice în cazul acidozei lactice
asociată administrării de metformin, fiind însă necesară o atenţie sporită pentru monitorizarea
nivelului glicemiei (49).
Afectarea vederii în cazul administrării de metformin este, de asemenea, foarte rară, dar
prin intervenţie optimă este reversibilă. Producerea acesteia este explicată prin apariţia acidozei
lactice asociată metforminului, care determină afectarea celulelor retinei, a căror funcţionare
poate fi dependentă de pH (47). Ajustarea pH-ului sanguin a determinat reluarea funcţionării
normale şi reapariţia vederii în limite normale.
Hipotermia este un alt simptom întâlnit în cazul acidozei lactice asociată administrării
de metformin, de asemenea reversibil. Este probabil legată şi de hipoglicemia severă, împreună
cu dezechilibrul acido-bazic sanguin.
Trebuie menţionat faptul că acidoza lactică asociată administrării de metformin este un
fenomen rar, cu o frecvenţă de 1 până la 9 la 100000 pacienţi, conform studiilor (38). Dacă în
cazurile de administrare cronică de metformin, acidoza lactică reprezintă un fenomen de
excepţie (a cărei apariţie este pusă pe seama, mai ales, a comorbidităţilor prezente), în caz de
supradozare accidentală sau în scop de suicid cu metformin, fenomenul de acidoză lactică este
foarte probabil să apară, iar evoluţia stării pacientului şi gravitatea intoxicaţiei sunt diferenţiate
de la caz de caz.
Testele de diagnostic în caz de supradozare cu metformin includ, cel puţin, determinarea
electroliţilor serici, a bicarbonatului seric, teste de funcţionare renală, determinarea gazelor din
sângele arterial (pentru determinarea pH-ului), şi determinarea glicemiei şi a lactatului seric.
Mai mult, toţi pacienţii cu acidoză ar trebui testaţi pentru o eventuală intoxicaţie cu salicilaţi,
pentru a putea exclude această variantă (38).
În concluzie, fenomenul de acidoză lactică poate fi asociat administrării de metformin,
însă există o varietate de condiţii particulare de declanşare şi evoluţie. Prin urmare, nu se poate
enunţa o corelaţie între cantitatea de metformin ingerată, concentraţiile plasmatice de metformin
şi lactat, gradul de afectare al pacientului şi prognosticul final.
3.3. INFLUENȚA METFORMINULUI ASUPRA VITAMINEI B12
3.3.1. Structură chimică și forme coenzimatice ale vitaminei B12
X=5’-deoxiadenozil, Me, OH, CN

Fig. 3.2. Structura chimică și formele vitaminei B12 (54)
32
Vitamina B12, considerată și vitamină antipernicioasă, mai este denumită și

cianocobalamină deoarece, în structura sa chimică, conține o grupare cian și un ion de cobalt
(fig. 3.2). În ficatul omului sănătos se pot găsi trei compuși cobalaminici: metil-, hidroxi- și
deoxiadenozil- cobalamina. Aceste forme, sau vitamina B12 ca atare, au rol de coenzime, în
special pentru unele transmetilaze și anumite izomeraze (mutaze) (53).
3.3.2. Distribuție și surse de vitamină B12
Vitamina B12 nu este prezentă în plante, fiind sintetizată doar de către microorganisme.
La om, sursa de vitamină B12 este propria floră bacteriană normală sau consumul unor alimente
de origine animală. Cobalamina este prezentă în cantități considerabile în ficat, lapte integral,
ouă, stridii, creveți proaspeți, carne de porc și de pui (55).
Vitamina B12 poate fi obținută și prin biosinteză – din medii de cultură de Pseudomonas
denitrificans, Propionibacterium shermanii (56).
Necesarul zilnic recomandat de vitamină B12 este 1-2 µg (57).
3.3.3. Particularități cinetice pentru vitamina B12
Absorbția vitaminei B12 din alimente are loc în mai multe etape la nivelul tractului
gastro-intestinal (fig. 3.3). În stomac, cobalamina legată de alimente este disociată de proteine
în prezență de acid și pepsină. Cobalamina eliberată se leagă de haptocorine (HC). HC au fost
menționate în literatură ca proteine R sau “R-binder”.
HC sunt secretate de mai multe tipuri de celule incluzând celulele glandulare (glande
salivare, mucoasa gastrică și altele). În intestinal subțire, proteazele pancreatice degradează
partial complexul cobalamină-HC la pH neutru și eliberează cobalamina care se leagă apoi cu
factorul intrinsec (IF). IF este o glicoproteină secretată de celulele parietale de la nivelul
stomacului.
Complexul cobalamină-factor intrinsec traversează intestinul și, în cele din urmă, se
leagă de receptorii specifici de pe suprafața celulelor mucoase din ileon. Cobalamina este
transportată în celulele mucoase și, ulterior, în circulația sistemică, unde este vehiculată sub
formă legată de proteine (57).
Cobalamina este depozitată la nivelul ficatului în proporție de aproximativ de 80%, acest
deposit asigurând necesarul pentru organism în cazul unui deficit. Perioada acoperită de această
rezervă de vitamină este aproximată până la 5 ani. Alte organe în care vitamina se poate găsi
depozitată sunt rinichiul, inima, pancreasul și creierul.
La nivelul celulelor, vitamina B12 este înglobată prin endocitoză și ajunsă în citoplasmă,
își manifestă rolul biologic prin participarea la diferite reacții biochimice sub formă de
coenzimă (56).
33
Fig. 3.3. Absorbția vitaminei B12 la nivel gastro-intestinal

(adaptat după Andres, 2004) (58)
3.3.4. Rolul enzimatic pentru vitamina B12
Vitamina B12 este necesară organismului uman pentru două reacții enzimatice esențiale,
conform figurii 3.4.
Prima reacție descrisă determină reducerea concentrației homocisteinei. Homocisteina
este un factor de risc proaterogen implicat în creșterea riscului afecțiunilor cardiovasculare și a
gradului de coagulare intravasculară (56).
Având la bază mecanismul expus în cea de-a doua reacție, în cazul hipovitaminozei, are
loc o acumulare de acizi grași anormali care sunt încorporați în membranele celulare. Acest
fenomen poate avea loc inclusiv la nivelul sistemului nervos, putându-se explica unele dintre
manifestările neurologice ale deficienței vitaminei B12 (55).
34
Fig. 3.4. Rolul enzimatic al vitaminei B12 (55)
3.3.5. Cauzele deficitului de vitamină B12
Este necesar un mediu acid la nivel gastric pentru ca vitamina B12 să fie eliberată de
proteinele alimentare. Gastrita atrofică este însoțită de hipoclorhidrie, fiind mai frecventă odată
cu creșterea vârstei pacienților. Deficitul de vitamină B12 este mai frecvent la vârstnici și cauzat,
cel mai probabil, de malabsorbția de vitamină dată de aclorhidrie. Pot fi prezente și alte cauze
ale deficitului de vitamină B12, cum sunt terapia antiacidă sau infecția cu Helicobacter pylori.
Malabsorbția cobalaminei legată de alimente nu influențează cobalamina liberă, incluzând-o și
pe cea biliară. Debutul deficitului de vitamină B12 poate fi asimptomatic și doar rareori deficitul
este asociat cu manifestări clinice.
Deficitul de vitamină B12 este adesea observat după intervenții chirurgicale la nivel
gastric, justificat de aport inadecvat, eliberare incompletă a vitaminei din alimente, pierderi de
factor intrinsec sau interacțiune anormală cobalamină-factor intrinsec.
Reducerea acidității gastrice dată, de exemplu, de utilizarea antahistaminicelor H2, sau
utilizarea îndelungată a unor medicamente precum metformin poate determina deficit de
vitamină B12. Malabsorbția vitaminei a mai fost raportată și la utilizarea altor medicamente, însă
nesemnificativ clinic.
Alte cauze ale deficitului de vitamină B12 includ afectare sau rezecție ileală, tuberculoză
intestinală, boală celiacă, boala Whipple, boală inflamatorie intestinală, enterită provocată de
radiații, afectare pancreatică.
Aciditatea crescută asociată sindromului Zollinger-Ellison determină inactivarea
tripsinei pancreatice, cu împiedicarea eliberării cobalaminei din complexul cu haptocorine.
Infecția cu Helicobacter pylori poate fi asociată cu atrofia mucoasei gastrice, hipoclorhidrie și
afectarea eliberării cobalaminei legate de proteinele alimentare. Deficitul de vitamină mai poate
35
fi asociat și cu infestarea cu tenie de pește, Diphyllobothrium latum, mai frecvent întâlnit în

țările baltice, Finlanda și Rusia.
Anumite deficite enzimatice ereditare și mutații ale genelor ce codifică receptorii
implicați în absorbția ileală a vitaminei pot avea implicații în afectarea metabolismului
cobalaminei.
Protoxidul de azot (N2O) determină deficit de vitamină B12 prin mecanism celular, de
oxidare ireversibilă a nucleului cobalaminei cu obținerea metilcobalaminei inactive.
Deficitul de vitamină B12 apare rar ca o consecință a aportului alimentar redus. Dieta
strict vegetariană poate dezvolta, arareori, un ușor deficit în timp (după mai mulți ani).
Manifestările clinice apar mai ales atunci când aportul deficitar este prezent din copilărie, iar
stocarea inadecvată sau cerințele de creștere sunt cofactori (57).
3.3.6. Manifestările clinice ale deficitului de vitamină B12
Organismul este capabil să depoziteze cantități ridicate de vitamină B12, astfel încât
simptomele deficitului apar, de obicei, după 3 – 6 ani.
Manifestările clinice ale deficitului de vitamină B12 pot fi de natură hematologică sau
neurologică.
Manifestările neurologice pot fi primele sau singurele efecte clinice ale deficitului de
cobalamină, incluzând mielopatie asociată sau nu cu neuropatie, neuropatie optică și parestezie.
Manifestările neuropsihice includ somnolență, slăbiciune accentuată, pierderi de
memorie, schimbări de personalitate, instabilitate emoțională, psihoză, rar delir și comă.
Atunci când există un deficit de concomitent de folat și cobalamină, poate să fie
manifestă anemia megaloblastică (57, 59).
Anemia pernicioasă apare prin mecanism autoimun asupra celulelor parietale de la
nivelul stomacului, responsabile cu secreția și eliberarea factorului intrinsec. Apare deficit de
absorbție, cu anemie și ulterior, manifestări neuro-psihice. Pacienții trebuie să continue
administrarea de vitamină B12 (oral sau intramuscular) pe tot parcursul vieții (55).
3.3.7. Metforminul și influența acestuia asupra vitaminei B12
3.3.7.1. Influența metforminului asupra nivelului seric de vitamina B12 – studii pe

subiecți umani
În studiul de cohortă publicat în 2013 de Greibe și colaboratorii,tratamentul cu
metformin timp de șase luni determină o scădere a cobalaminei serice, pe când nici un alt marker
al statusului cobalaminei nu prezintă modificări semnificative. Totuși, la pacientele din studiu
– cu sindrom al ovarului polichistic, modificările cobalaminei serice nu prezintă relevanță
pentru statusul vitaminei în organism.Se recomandă investigarea prezenței deficitului de
vitamină B12 la pacienții cu nivel seric scăzut de vitamină B12 indus de metformin (60).
Conform lui Sato și colaboratorii, nivelurile scăzute de vitamin B12 întâlnite la pacienții
tratați cu metformin sunt corectate în cazul suplimentării cu vitamin B12, măsură preferată în
locul înlocuirii metforminului cu un alt agent terapeutic antidiabetic (61).
În 2012, în Statele Unite, este publicat un studiu realizat pe adulți de peste 50 de ani cu
sau fără diabet zaharat, în care se menționează o incidență a nivelurilor serice de vitamină B12
de 5,8% la pacienții cu diabet zaharat aflați sub tratament cu metformin, comparativ cu 2,4 %
la cei care nu aveau tratament cu metformin sau 3,3 % la cei fără diabet zaharat (62).
Studiile publicate susțin ipoteza că metforminul poate determina scăderea concentrației
serice de vitamină B12; totodată, sunt menționate și limitările studiilor: durata scurtă a studiului,
imposibilitatea observării permanente a pacienților, posibilitatea prezenței unor co-factori
36
determinanți ai nivelurilor scăzute de vitamină B12, monitorizarea parțială a markerilor pentru

deficitul de vitamină B12.
3.3.7.2. Mecanisme propuse pentru influența metforminului asupra nivelului seric

de vitamina B12
Mecanismul influenței metforminului asupra nivelului seric de vitamină B12 este
incomplet elucidat. Se consideră că metforminul interferă absorbția vitaminei la nivel gastro-
intestinal. Conform mai multor surse de specialitate, metforminul inhibă secreția de factor
intrinsec și determină un antagonism la nivelul membranei ileale, calciu-dependent, care
afectează preluarea complexului vitamină B12-IF. Preluarea complexului vitamină B12-IFde
către receptorii de la suprafața celulelor ileale depinde de disponibilitatea calciului, și
metforminul afectează în special rolul membranei dependent de calciu; acest efect poate fi
inversat prin suplimentare cu calciu, sau la întreruperea tratamentului cu metformin (62, 63).
3.3.7.3. Cazuri clinice cu niveluri serice scăzute sau deficit de vitamină B 12 la

pacienți tratați cu metformin
În literatură sunt descrise cazuri de aparație a diferite efecte adverse în cazul terapiei cu
metformin. În afară de acidoza lactică, efect advers grav, dar rar, produs de metformin, sunt
menționate: tromboză venoasă profundă, deficit de vitamină B12, tulburări de tranzit (64–66).
Liu și colaboratorii (2006) descriu cazul unei femei de 82 de ani, cu diabet zaharat de
tip 2 de 20 de ani. Medicația la internare este metformin 1 g/zi și famotidină. Analizele sanguine
arată nivelul hemoglobinei de 10.3 g/dL, vitamina B12 131 pg/mL, nivel normal pentru folat și
anticorpul antifactor intrinsec negativ. După întreruperea metforminului și suplimentare cu
vitamina B12, s-a constatat îmbunătățirea caracteristicilor hematologice și a stării generale (66).
Melgar și colaboratorii (2008) raportează cazul unui bărbat de 65 de ani, diagnosticat
cu diabet zaharat de tip 2, dislipidemie, hipertensiune și hiperplazie benignă de prostată.
Pacientul a prezentat în ultimele 6 luni schimbări în tranzitul intestinal, cu alternarea episoadelor
diareice și de constipație. Acuză dureri abdominale, astenie, diaree și pierdere în greutate.
Rezultatele analizelor arată valori ale vitaminei B12 de 166 pg/mL (valorile normale pentru
nivelul seric de vitamin B12 se încadrează în intervalul 197-866 pg/mL). Hemoglobina și acidul
folic prezintă valori normale, iar anticorpul antifactor intrinsec și markerii tumorali negativi. La
o lună după întreruperea metforminului se repetă analizele, iar nivelul vitaminei B12 este în
limite normale (64).
În niciunul din cazurile prezentate nu s-a putut stabili o relație între concentrația de
metformin administrată zilnic și intensitatea efectului advers produs.
3.3.7.4. Precauții generale

Metforminul este menționat în literatură drept cauză a scăderii absorbției intestinale a
vitaminei B12, iar pe termen lung se poate manifesta clinic deficitul de vitamină. După alți
autori, deficitul absorbției vitaminei B12 cauzat de tratamentul cu metformin este comparabil cu
cel din cazul unei gastrectomii (61).
Atenționările privind afectarea absorbției vitaminei B12 de către metformin apar în
ghidurile tip memorator de farmacologie naționale și internaționale:“Dacă apare anemie, trebuie
să se excludă deficitul de vitamin B12; poate interfera cu absorbția vitaminei B12” (MEdEx
2011), “reacții adverse: deficit de vitamină B12 și acid folic, în tratament îndelungat”
(MemoMed 2010), “efecte adverse: scăderea absorbției vitaminei B12” (BNF 2013-2014, BNF
= British National Formulary) (67). Astfel, efectul advers este cunoscut și înțeles atât de medici,
cât și de farmaciști, fiind necesară monitorizarea pe termen lung a pacienților tratați cu
metformin.
37
4. GLIMEPIRID
4.1. CARACTERISTICI FIZICO-CHIMICE ALE GLIMEPIRIDULUI
Glimepiridul, C24H34N4O5S, face parte din clasa sulfonilureelor, având denumirea

chimică 3-etil-4-metil-N-(4-[N-((1r,4r)-4-metilciclohexilcarbamoil)sulfamoil]fenetil)-2-oxo-
2,5-dihidro-1H-pirol-1-carboxamidă (fig. 4.1), conform nomenclaturii IUPAC (International
Union of Pure and Applied Chemistry – Uniunea Internațională de Chimie Pură și Aplicată).
CH3
CH3 O
O O
CH3 S
N N
H H
O N
O N
H
Fig. 4.1. Structura chimică a glimepiridului (68)
Glimepiridul se prezintă sub formă de pulbere albă sau alb-gălbuie, cristalină, fără
miros. Este practic insolubil în apă, acizi, baze, tampon borat sau tampon fosfat. Glimepiridul
este parțial solubil în metanol, etanol, acetonă și acetat de etil și solubil în dimetilformamidă
(19, 69).
Tabel 4.I. Proprietăți fizice ale glimepiridului (68, 71)

Proprietate Valoare
Masă monoizotopică 490,224976 Da
Densitate 1,3 ± 0,1 g/cm3
Punct de fierbere 677,0 ± 65,0 oC la 760 mmHg
Indice de refracție 1,628
Punct de topire 207 oC
pKa (acid) 4,32
Solubilitate în apă 0,0384 mg/mL
Entalpie de vaporizare 104,4 ± 3,0 kJ/mol
Presiunea vaporilor 0,0 ± 2,2 mmHg la 25 oC
Polarizabilitate 51,7±0,5·10-24 cm3
Volum molar 367,4 ± 7,0 cm3
38
Prezența structurii sulfonilureice, a legăturii de tip carboxamidă, a inelului lactamic și a

sistemului α,β-carbonil nesaturat în molecula glimepiridului determină susceptibilitatea pentru
degradare, din cauza posibilității hidrolizei și fotolizei de la nivelul acestor grupări funcționale
(69). Produșii de descompunere ai glimepiridului cu potential toxic sunt monoxidul de carbon,
dioxidul de carbon, oxizii de azot și oxizii de sulf (70).
Principalele proprietăți fizice ale glimepiridului sunt sumarizate în tabelul 4.I.
4.2. MECANISMUL DE ACȚIUNE
Glimepiridul a fost introdus în terapeutică în anul 1984 (72). Face parte din clasa
sulfonilureelor cu acțiune antidiabetică de generația a doua. Acționează la nivelul canalelor
ATP-potasiu sensibile (KATP) de la nivelul celulelor β-pancreatice pentru a favoriza eliberarea
de insulină. În plus, scade producția hepatică de glucoză și crește sensibilitatea periferică la
insulină (fig. 4.2).
Fig. 4.2. Mecanismul de acțiune pentru sulfoniluree (adaptat după DeRuiter, 2003) (73)
Glimepirid a fost de asemenea asociat cu o reducere mai mare a insulinemiei față de

glibenclamidă în timpul exercițiilor, în ciuda reducerilor/scăderilor similar a glicemiei.
Efectele glimepiridului asupra mecanismelor extrapancreatice par să fie similare cu ale
altor sulfoniluree. Substanța pare să acționeze la nivelul celulelor periferice după interacțiunea
cu receptorii pentru insulină, crescând/stimulând transportul de glucoză și expresia
transportorului pentru glucoză (GLUT1 și GLUT4), lipogeneza și glicogeneza. Glimepirid pare,
de asemenea, să reducă rezistența la insulină și să crească disponibilitatea glucozei hepatice în
modele pe animale, dar nu influențează utilizarea glucozei la pacienții cu diabet zaharat de tip
1; aceste observații necesită confirmări ulterioare. Spre deosebire de glibenclamidă,
glimepiridul are puține efecte adverse asupra variabilelor cardiovasculare, și niciun efect asupra
deschiderii canalelor KATP diazoxid-induse la voluntari umani. De asemenea are efecte mai
39
reduse decât glibenclamida asupra funcționării cordului și vascularizației (modificări ale

segmentului ST și a presiunii sanguine) în studii in vitro și pe animale (7,74,75).
4.3. COMPARAREA GLIMEPIRIDULUI FAȚĂ DE ALTE SULFONILUREE ÎN

TRATAMENTUL DIABETULUI ZAHARAT
Prin analiza comparativă a glimepiridului față de alte sulfoniluree antidiabetice

(glibenclamid, glipizid, gliclazid) în cadrul studiilor clinice, s-au obținut:
- glimepirid prezintă eficiență terapeutică similară cu glibenclamid, însă incidența
hipoglicemiei este mai scăzută pentru glimepirid,
- glimepirid și gliclazid sunt la fel de eficiente în terapia diabetului zaharat, însă gliclazid
prezintă o siguranță mai mare,
- incidența efectelor adverse este, în general, mai scăzută pentru glimepirid, față de alte
sulfoniluree,
- unele studii afirmă că glimepiridul nu influențează greutatea corporală, un aspect important la
pacienții cu diabet zaharat de tip 2, în timp ce alte studii au concluzionat că glimepiridul
determină o scădere a greutății corporale mai mare decât glibenclamidul, în condiții similare
ale controlului glicemic.
Prin cumularea rezultatelor a numeroase studii clinice, se evidențiază faptul că incidența
în ansamblu a reacțiilor adverse pentru glimepirid este mai scăzută față de alte sulfoniluree (75).
4.4. PARTICULARITĂȚI TOXICOCINETICE ALE GLIMEPIRIDULUI
După administrare orală, glimepiridul este absorbit complet, atingând peak-ul

concentrației plasmatice (cmax) la 2,4 până la 3,75 ore la pacienții cu diabet zaharat de tip 2.
Legarea de proteinele plasmatice este de peste 99%. Acumularea nu apare după
administrări multiple. Absorbția este completă, iar în prezența alimentelor este întârziată.
Volumul de distribuție pentru glimepirid este de 8,8 L, iar timpul de înjumătățire a concentrației
plasmatice este de 5-9 ore.
Substanța medicamentoasă este metabolizată majoritar la nivelul ficatului prin
intermediul CYP2C9 la metabolitul activ M1 (hidroxi), cu dehidrogenare ulterioară la
metabolitul inactiv M2 (carboxi) (fig. 4.3). În cazul bolilor hepatice, excreția urinară a M1 poate
fi redusă, dar nicio altă schimbare de farmacocinetică nu este cunoscută. Eliminarea
glimepiridului are loc urinar (60%) și prin fecale (40%). Metaboliții M1 și M2 se elimină, de
asemenea, prin urină (80% până la 90%) și prin fecale (70%) (30,74,76).
40
.
Fig. 4.3. Metabolizarea glimepiridului (adaptat după DeRuiter, 2003) (73)
4.5. INTERACȚIUNI MEDICAMENTOASE
Interacțiunile glimepiridului cu alte substanțe medicamentoase pot avea ca efect

creșterea concentrației serice sau amplificarea efectului terapeutic (asocierea cu beta-blocante,
cloramfenicol, cimetidine, inhibitori ai CYP2C9: fluconazol, AINS – antiinflamatoare
nesteroidiene, sulfonamide) sau, din contră, scăderea nivelului plasmatic al glimepiridului (la
asociere cu inductori ai CYP2C9: carbamazepină, fenobarbital, fenitoină). La asociere cu
etanolul poate să apară o reacție de tip disulfiram. Anumite medicamente au potential
hiperglicemic (de exemplu, thiazide, corticosteroizi, estrogeni, simpatomimetice, contraceptive
orale), putând duce la pierderea controlului terapeutic (30, 74).
41
4.6. EFECTE ADVERSE ALE TERAPIEI CU GLIMEPIRID
Glimepiridul, ca toate substanțele medicamentoase de tip sulfoniluree, prezintă riscul de

producerea hipoglicemiei severe. Acest efect advers poate să apară mai ales atunci când aportul
caloric este deficitar, când există aport concomitent de etanol, după exerciții fizice susținute sau
în cazul asocierii cu alte medicamente hipoglicemiante. Principalele efecte adverse ale terapiei
cu glimepirid sunt prezentate în tabelul 4.II (30).
Tabel 4.II. Efectele adverse ale glimepiridului

Efecte adverse ale glimepiridului (30)
Sistemul nervos central Amețeli, cefalee
Endocrine și metabolice Hipoglicemie
Gastrointestinale Greață
Slăbiciune
Neuromusculare și scheletice
Agranulocitoză, anorexie, anemie aplastică, icter
colestatic, constipație, diaree, reacție tip disulfiram,
efect diuretic, edem, plenitudine epigastrică, durere
Rare, dar importante sau gastro-intestinală, arsuri la stomac, anemie hemolitică,
grave hepatită, hiponatremie, leucopenie, greață, pancitopenie,
fotosensibilitate, porfirie cutanată tardivă, prurit, erupții
cutanate, trombocitopenie, vasculită (alergică),
modificări ale adaptării vizuale, vărsături
4.7. INTOXICAȚIA CU GLIMEPIRID ȘI TRATAMENTUL INTOXICAȚIILOR
Intoxicațiile cu sulfoniluree, inclusiv glimepirid, pot determina apariția hipoglicemiei.

Semnele și simptomele ce pot apărea în cazul unei supradoze cu glimepirid sunt: nivel scăzut
al glicemiei, greață, agitație și confuzie, tahicardie, transpirații, convulsii, apatie și comă.
Această intoxicație este combătută cu glucoză, administrată oral sau intravenos (în funcție de
severitatea intoxicației). Decontaminarea se poate realiza prin spălături gastrice și administrare
de cărbune activ.
Pacienții intoxicați sunt menținuți sub observație minim 24 ore după ingestia de
sulfoniluree, iar tratamentul de susținere constă în: glucoză (intravenos), glucagon (injectabil),
diazoxid sau octreotid (30).
Hipoglicemia indusă de sulfoniluree, inclusiv de glimepirid, este prezentată în
numeroase cazuri in literatura de specialitate. Conform unui studiu realizat în anul 2012 la o
unitate de Primire Urgențe (77), hipoglicemia severă indusă de glimepirid este mai frecventă
comparativ cu alte sulfoniluree antidiabetice. Covvey și colaboratorii (78) descriu un caz
hipoglicemie indusă de glimepirid, la un pacient cu afectare renală acută, aflat sub tratament
cu ciprofloxacină și metronidazol. Factorii cauzali pentru hipoglicemie au fost: afectarea renală,
cât și interacțiunea cu metronidazolul – inhibitor al CYP2C9. Astfel, concentrația plasmatică a
glimepiridului a crescut datorită eliminării lente, dar și a diminuării metabolizării la compuși
inactivi. Hipoglicemia severă a fost combătută cu dextroză, glucagon și octreotid, primele două
antidoturi fiind insuficiente pentru normalizarea nivelului glicemic.
În plus, în literatură sunt descrise cazuri de colestază hepatică indusă de tratamentul cu
glimepirid. Afectarea hepatică în care este incriminat glimepiridul ca agent cauzal este prezentă
în două cazuri raportate, sintetizate în tabelul 4.III. Acest tip de reacție toxică este rar, fiind
consemnat în literatură un număr limitat de astfel de cazuri.
42
Tabel 4.III. Particularități ale colestazei hepatice induse de glimepirid la două cazuri raportate
Sursa bibliografică Chounta, 2005 (79) Omar, 2009 (80)
Vârstă (ani) 65 59
Date
Sex Masculin Masculin
pacient
Fumător * Timp de 40 de ani
Icter, durere abdominală (în partea de
Simptome sus, în dreapta), scaune ușoare și Febră, frisoane, vomă timp îndelungat
urină închisă la culoare
Tratamentul cu glimepirid 2 mg/zi, timp de 2 săptămâni 3 mg/zi, timp de 5 luni
Bilirubina serică 6,91 mg/dL 5 mg/dL
Fosfataza alcalină
403 mU/mL 300 U/I
serică
Data
TGP1 141 mU/mL 90 U/mL
paraclinice
2
TGO 63 mU/mL 70 U/mL
Factorul tumoral
* 300 U/mL
CA 19-9
Hepatită virală colestatică, icter
Diagnostice excluse Hepatită virală A, B sau C obstructiv, carcinom gastrointestinal,
carcinom pancreatic, colangiocarcinom
Nivelul folatului, a vitaminei B12, a

hemoglobinei, a hematocritului,
timpul protrombinei, testări Evaluare ultrasonografică, rezonanță
Investigații suplimentare
imunologice – valori normale magnetică colangiopancreatografică
Biopsie hepatică – hepatită acută

Întreruperea tratamentului cu Întreruperea tratamentului cu glimepirid și
Măsuri terapeutice
glimepirid inițierea terapiei cu insulină
Valorile testelor de laborator au revenit la
limite normale la o lună de la externare, cu
Valorile nivelurilor serice ale
Reexaminarea pacientului excepția fosfatazei alkaline, care a atins
enzimelor au revenit după o lună.
valori normale la un interval de două luni
de la externarea pacientului.
Ameliorarea stării generale a pacientului a
Colestaza hepatică a fost indusă de fost direct corelată cu întreruperea
Concluzii glimepirid. Fiziopatologia producerii tratamentului cu glimepirid, și au fost
acestui efect advers este încă incertă. excluse alte patologii cu colestază
hepatică asociată.
* Nu este precizat.
1 - transaminaza glutamic-piruvică serică
2 - transaminaza glutamic-oxalacetică serică
43
5. ASOCIEREA MEDICAMENTOASĂ
METFORMIN – GLIMEPIRID
5.1. TERAPIA ANTIDIABETICĂ CU METFORMIN ȘI GLIMEPIRID
Glimepiridul și metforminul au mecanisme de acțiune diferite. Glimepiridul scade

nivelul de glucoză din sânge prin stimularea eliberării de insulină din celulele beta-pancreatice,
pe când metforminul reduce nivelul de glucoză din sânge predominant prin îmbunătățirea
sensibilității țesuturilor hepatice și periferice la insulină, adică scade rezistența la insulină la
nivel hepatic și periferic prin creșterea numărului de receptori pentru insulină. Astfel, scade
hiperinsulinemia. De asemenea, scade gluconeogeneza hepatică, reduce absorbția intestinală a
glucozei și reduce nivelurile de glucoză din sânge (pe nemâncate și postprandială).
Scăderea în greutate îmbunătățește astfel rezistena la insulină. Metforminul are, de
asemenea, efecte benefice asupra nivelului de lipide serice și activității fibrinolitice, scăzând
astfel riscul cardiovascular. Datorită mecanismelor lor de acțiune complementare, terapia
combinată cu glimepirid și metformin este rațională și asociată cu un efect benefic aditiv asupra
controlului glicemic. Terapia combinată este potential eficace în menținerea controlului
glicemiei și evitarea tratamentului cu insulină pentru o durată medie de 7,9 ani.
Există astfel dovezi care sugerează că inițierea tratamentului cu doze mai mici ale celor
doi agenți care au efecte complementare poate crește eficacitatea globală și scade incidența
efectelor adverse (81).
5.2. PREZENTAREA UNOR CAZURI DE INTOXICAȚII LA PACIENȚI TRATAȚI

CU METFORMIN ȘI GLIMEPIRID
Principalul efect advers ce poate să apară la asocierea în terapie a metforminului și

glimepiridului este hipoglicemia. Deși intoxicația cu această asociere medicamentoasă este rar
raportată, în literatură sunt descrise două cazuri grave (tabel 5.I), în care hipoglicemia severă a
determinat comă și afectare neurologică (semipareză).
44
Tabel 5.I. Particularități ale hipoglicemiei raportate în cazul terapiei cu metformin și glimepirid
Sursa bibliografică Yoshino, 2012 (82) Baradol, 2014 (83)
Vârstă
89 63
(ani)
Date Sex Masculin Masculin
pacient
Fumător 1 pachet de țigări/zi, de 70 de ani *
IMC1 21,4 *
Diabet
Pacient cu diabet zaharat de tip 2 de 20 ani Pacient nediabetic
zaharat
Istoric Hipertensiune arterială, dislipidemie;
medical Istoric de infarct cerebral, ulcer gastric
Alte
hemoragic, hiperuricemie, boală renală Boală renală cronică (de 6 ani)
patologii cronică (stadiul 3), hipertrofie benignă de
prostată, angină stabilă
Metformin 500 mg/zi
Glimepirid 4 mg/zi
Acid acetilsalicilic 100 mg/zi Metformin 500 mg +
3 comprimate, la 10-
Doze Glimepirid 1 mg +
Omeprazol 10 mg/zi 12 ore distanță între
medicamentoase Vogliboză 0,2 mg /
administrări
Alopurinol 100 mg/zi comprimat
Pravastatină sodică 10 mg/zi
Naftopiridil 50 mg/zi
Comportament anormal, transpirații, privire
Dizartrie, semipareză dreaptă;
fixă timp de 4 ore, inconștiență, apatie de 2
Simptome la Devierea limbii spre dreapta, slăbiciune
ore;
internare musculară la brațul drept, scăderea simțului
În ultimele 2 zile: letargie, somnolență
vibrațional la ambele glezne
excesivă după administrarea medicamentelor.
Glicemie 1,8 mmol/L (hipoglicemie) Glicemie 11 mg/dL (hipoglicemie)
Creatinină 0,22 mmol/L (agravarea afectării
renale)
Valori paraclinice
Hemoglobină 9,8 g/dL, hematocrit 29,2% *
(anemie)
K+ 5,8 mmol/L (hiperkaliemie)
Dextroză 40% i.v.
Dextroză 25% i.v., apoi dextroză 5% (și 10%)
Măsuri terapeutice Întreruperea tratamentului cu glimepirid și
perfuzabil
metformin.
Valoarea glicemiei după inițierea Pacientul a redevenit conștient după 4 ore de
tratamentului: 9,6 mmol/L; la inițierea tratamentului cu glucoză;
Evoluție Semnele neurologice s-au ameliorat rapid; Și-a recăpătat complet orientarea după 24 ore;
Pacientul a fost externat după 48 ore, fără alte Externare după 72 ore, cu status glicemic
episoade hipoglicemice ulterioare. normal.
Administrarea medicației antidiabetice în
Eroare de eliberare a medicației – pacientul
condițiile unui aport alimentar scăzut,
avea prescrise comprimate cu calciu, fiindu-i
Cauza intoxicației afectarea funcției renale (cauzată de vârstă) și
eliberate comprimate sub formă de
consecutiv diminuarea eliminării renale a
combinație fixă antidiabetică
glimepiridului
Deși semipareza hipoglicemică este rară, a
fost exclus accicentul cerebral. Mecanismul 97,47% dintre pacienții cu comă
de producere a semiparezei hipoglicemice hipoglicemică similară acestui caz și-au
Concluzii este incomplet elucidat, fiind propuse: revenit fără sechele;
vasospasmul, modificarea toleranței Administrarea accidentală a medicației
hipoglicemice, incapacitatea autoreglării antidiabetice poate avea consecințe grave.
debitului sanguin.
1- indice de masă corporală
* Nu este precizat.
45
5.3. METODE ANALITICE DE EXTRACȚIE, SEPARARE ȘI DOZARE A

METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI
5.3.1. Metode de analiză a metforminului
Pentru analiza cantitativă a metforminului, literatura de specialitate menționează diferite

metode:
 spectrofotometrie UV (84) și VIS (85,86),
 cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță cu detecție în UV (87–89),
 cromatografie în fază lichidă cu detecție prin spectrometrie de masă (90–93),
 electroforeză capilară (94–96),
 cromatografie pe strat subțire de înaltă performanță (97),
 voltametrie (98).
Ponderea cea mai însemnată a metodelor de determinare a metforminului revine
cromatografiei în fază lichidă asociată spectrometriei de masă, dar și cu detecție în UV. Aceste
metode sunt aplicate în domenii farmaceutice și toxicologice, utilizând pentru analiza calitativă
și cantitativă substanțe farmaceutice pure, produse farmaceutice, probe biologice (urină, ser,
plasmă, pete de sânge uscate).
În vederea determinării metforminului din probe biologice (ser, plasmă), sunt propuse
și optimizate diferite metode de extracție:
 precipitarea proteinelor plasmatice cu acid percloric (99,100), acetronitril
(90,92,93,101), acid tricloroacetic (102), metanol (103),
 extracție în fază solidă (SPE – solid phase extraction) (104,105).
5.3.2. Metode de analiză a glimepiridului
Determinarea cantitativă a glimepiridului poate fi realizată, de asemenea, prin diferite

metode:
 spectrofotometrie UV (106),
 cromatografie în fază lichidă de înaltă performanță cu detecție în UV (107)
 cromatografie în fază lichidă ultraperformantă (UPLC – ultra high performance liquid
chromatography) cu detecție prin spectrometrie de masă (108),
 cromatografie în fază lichidă cu detecție prin spectrometrie de masă (109,110)
Pentru a izola glimepiridul din matricele complexe biologice (ser, plasmă), metodele de
extracție din literatura de specialitate au ca principiu:
 precipitarea proteinelor cu acetonitril (108), metanol (107),
 extracție lichid-lichid cu eter etilic (111) sau dicloretan (112), acetat de etil (110),
 extracție în fază solidă (SPE – solid phase extraction) (109,113).
5.3.3. Metode de analiză simultană a metforminului și glimepiridului
În literature sunt publicate studii care propun metode performante pentru separarea și
determinarea cantitativă simultană a metforminului și glimepiridului. În tabelul 5.II sunt
prezentate exemple de metode cromatografice raportate pentru analiza concomitentă a celor doi
compuși medicamentoși.
46
Tabel 5.II. Metode analitice de analiză simultană a metforminului și glimepiridului

Timpul de
Regăsirea (din
Separarea cromatografică retenție
Metoda de probe biologice)
Sursa (minute)
Metoda de Tipul izolare (din
bibliogr Coloana
analiză probei probe
afică cromatografică
Faza mobilă M1 G2 biologice) M1 G2
(faza
staționară)
C18 Peerless Metanol:apă (acid Extracție lichid-
Probă
Sengupta Basic (33 x 4.6 formic 0,5%) lichid:
biologică:
, 2009 LC3-MS4-MS mm, 5 µm 8:2 (v/v), 1,84 4,59 clormetan: >91% >91%
plasmă
(114) mărimea debit 0.6 mL/min alcool izoamilic
umană
particulelor) (eluție izocratică) 9:1 (v/v)
Acetonitril:tampon
Siddiqui, C18 Nucleosil fosfat (pH 4,3) Probă
HPLC5-UV
2013 (10 µm, 25 x 60:40 (v/v), 5,8 13,7 biologică: ser * * *
(115) 0,46 cm) debit 1 mL/min uman; Pf9
(eluție izocratică)
RP Purospher
STAR (5 μm, 25
Sultana, Metanol:apă (pH 3,0) Probă
× 0,46 cm) și Pp10 proteinelor
2014 LC-UV 70:30 (v/v) 2 9 biologică: ser >99% >99%
C18 Supelco cu acetonitril
(116) (eluție izocratică) uman; Pf
(150×4.6 mm, 5
µm)
Acetonitril:acetat de
amoniu 10mM (pH Probă
Polagani, C18 Alltima HP
3,0) biologică: Pp proteinelor
2013 LC–MS/MS (50 mm x 4,6 1 1,25 72,88% 74,16%
60:40 (v/v), plasmă cu acetonitril
(117) mm, 3 µm)
debit 1,1 mL/min umană
Prepacked Metanol:apă (pH 3,0)
Arayne, Probă
RP6-HPLC- Purospher Star 90:10 (v/v), Pp proteinelor 99.92 – 99.92 –
2013 2,05 4,20 biologică: ser
UV C18 (5 μm, 25 × debit 1 mL/min cu acetonitril 102.08% 102.08%
(118) uman; Pf
0,46 cm) (eluție izocratică)
Sulfat de
Patel, Placă TLC8 cu
HPTLC7 amoniu:metanol Rf = Rf =
2015 silicagel 60F254 - - - -
7,5:2,5 (v/v) 0,43 0,67
(119) 0.5%
Acid fosforic 25 mM
Biswas, C18 (Spherisorb
(pH 3,0):acetonitril Extracție cu
2011 RP-HPLC ODS 2: 250 mm 3,194 6,923 Pf 99,37% 94,25%
40:60 (v/v) acetonitril
(120) x 4,6 µm)
Acetonitril:tampon
Lakshmi, Phenomenex RP-
fosfat (pH 3) Extracție cu 98,02-
2009 HPLC-UV 18 (150 x 4,6 2,75 8,75 Pf 98-99%
65:35 (v/v), metanol 99,11%
(121) mm, 5 µm)
debit 0,5 mL/min
1 – Metformin
2 – Glimepirid
3 – Liquid chromatography – Cromatografie în fază lichidă
4 – Mass spectrometry – Spectrometrie de masă
5 – High-performance liquid chromatography – Cromatografie de înaltă performanță
6 – Reversed phase – Fază inversă
7 – High performance thin layer chromatography – Cromatografie pe strat subțire de înaltă performanță
8 – Thin layer chromatography – Cromatografie pe strat subțire
9 – Produse farmaceutice
10 – Precipitare
* Nu este precizat.
Metodele de analiză sunt în conformitate cu nivelurile de concentrații serice estimate.

Nivel seric terapeutic al metforminului este de 1-2 mg/L. Nivelul picului plasmatic după
administrarea unei doze de 1,5 g metformin a fost aproximat la 3 mg/L, iar nivelurile >45 mg/L
sunt asociate cu toxicitatea (30). Nivelurile serice raportate pentru glimepirid sunt 163,77 µg/L
(la administrarea a 2 mg), 352 µg/L (la doze de 4 mg) și 591 µg/L (la doze de 8 mg) (30,110).
47
B. CONTRIBUȚII PROPRII
48
6. MOTIVAȚIA ALEGERII TEMEI ȘI

OBIECTIVELE PROPUSE
Diabetul zaharat reprezintă o patologie complexă cu frecvență ridicată în rândul

pacienților, la nivel global, dar și teritorial. Datele epidemiologice atrag atenția asupra
numărului mare de persoane diagnosticate cu diabet zaharat (366 milioane în 2011 la nivel
global), pentru care se estimează o creștere în perioada următoare (4). La nivelul României, prin
compararea semestrului 1 din anul 2015 cu cel din 2014, se observă de asemenea o creștere a
numărului pacienților cu diabet zaharat. Pentru județul Iași, de exemplu, au fost înregistrate
1286 cazuri noi corespunzătoare anului 2015, față de 982 cazuri pentru anul 2014. Astfel,
procentul celor diagnosticați cu diabet zaharat este de 4,1% în 2015, față de 4,0% în 2014 (5).
Declanșarea și evoluția diabetului zaharat este atribuită unei serii de factori complecși,
ce includ un stil de viață neadecvat (lipsa activității fizice, sedentarismul, fumatul și consumul
de alcool) sau alte patologii (obezitatea, hipertensiunea arterială, sindromul metabolic și altele),
întâlnite la nivelul populației la vârste din ce în ce mai scăzute.
Terapia antidiabetică prezintă clase medicamentoase pentru administrare orală și
injectabilă, cu mecanisme farmacodinamice diferite și complementare, pentru a obține controlul
glicemic optim și eficiența terapeutică unui număr foarte mare de pacienți, cu patologie diversă
și manifestări clinice și evoluție particulare. Medicația antidiabetică prezintă o dinamică a
schemelor terapeutice, adaptate nevoilor specifice fiecărui pacient și respectării profilului de
siguranță din punct de vedere farmacotoxicologic.
Dintre medicamentele antidiabetice orale, printre primele clase introduse în terapie sunt
sulfonilureele și biguanidele. Corespunzător acestor grupe terapeutice, cu prescriere vastă
pentru pacienții cu diabet zaharat, sunt metforminul (compus biguanidic) și glimepiridul
(compus sulfonilureic).
Metforminul este, în momentul actual, medicamentul de elecție în inițierea terapiei
antidiabetice orale la pacienții supraponderali, în absența contraindicațiilor specifice. Profilul
toxicologic include reacții adverse gastro-intestinale, iar în mod particular, metforminul este
incriminat în apariția acidozei lactice și malabsorbției vitaminei B12.
Glimepiridul este o sulfoniluree de generația a 2-a administrat monoterapie sau în
asociere cu alți compuși anitidiabetici, în special metformin, cu mecanisme de acțiune
complementare. Din punct de vedere toxicologic, glimepiridul prezintă caracteristicile
sulfonilureelor de generație nouă, cu o incidență scăzută a hipoglicemiei. Pentru acest compus
sunt raportate cazuri de colestază hepatică și hipoglicemie, în cazul asocierilor medicamentoase
favorizante.
Scopul lucrării de față a fost de a completa caracterizarea profilului toxicologic al celor
doi compuși prin studii chimice și clinice de actualitate.
Obiectivele care stau la baza cercetării personale sunt:
49
 Analiza statistică a pacienților diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2, aflați în evidența

Centrului de Medicină de Familie Iași, cu identificarea următoarelor caracteristici:
parametri clinici și paraclinici, patologia asociată și medicația.
 Dezvoltarea și validarea unei metode de determinare cantitativă a metforminului prin
electroforeză capilară cu detecție în UV și aplicarea metodei pentru analiza probelor de
ser uman.
 Determinarea cantitativă simultană a metforminului și glimepiridului prin
Cromatografie în fază lichidă ultra performantă cu detecție prin spectrometrie de masă
asociată cu QTOF, cu parcurgerea următoarelor etape:
o Dezvoltarea și validarea metodei UPLC-QTOF/MS.
o Optimizarea metodei de extracție pe probe de ser uman.
o Aplicarea metodei pentru probe de la pacienții din Clinica de Diabet, Nutriție și
Boli Metabolice.
 Studiul clinic al pacienților internați în Clinica de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice,
cu realizarea:
o Analizei descriptive a lotului de pacienți.
o Studiului influenței tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de
vitamină B12.
o Evaluării riscului cardio-vascular la pacienții diagnosticați cu diabet zaharat de
tip 2.
În obținerea rezultatelor științifice din cadrul studiilor doctorale, un rol important l-a
avut stagiul de mobilitate din cadrul proiectului POSDRU 159/1.5/S/136893, la Facultatea de
Chimie, Departamentul de Chimie Analitică, din cadrul Universității Sevilla, Spania.
Formarea abilităților personale de cercetare a reprezentat rezultatul activității mele la
Disciplina de Toxicologie, Facultatea de Farmacie, în cadrul colaborărilor interdisciplinare
realizate la Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași, cât și la Laboratorul
de Microanaliză din Sevilla.
50
7. STUDIUL STATISTIC PRIVIND

INCIDENȚA PATOLOGIEI ASOCIATE ȘI A MEDICAȚIEI
ANTIDIABETICE LA PACIENȚII CU DIABET ZAHARAT DE
TIP 2 DE LA CENTRUL DE MEDICINĂ DE FAMILIE IAȘI
7.1. INTRODUCERE
Diabetul zaharat prezintă o incidență crescută pentru populația globală, dar și la nivelul
României, cu o frecvență de 4,7% dintre locuitori (5). Maladia prezintă consecințe cu atât mai
grave pentru organism, cu cât sunt prezente și manifeste complicațiile cronice ale diabetului
zaharat, obezitatea și bolile cardiovasculare.
Acest studiu își propune caracterizarea pacienților de la nivel teritorial privind:
- Medicația antidiabetică, orală și injectabilă, și adjuvantă,
- Complicațiile cronice ale diabetului zaharat de tip 2,
- Patologia asociată,
- Terapia medicamentoasă cardiovasculară asociată.
7.2. MATERIAL ȘI METODĂ
S-a realizat un studiu descriptiv retrospectiv al pacienților cu diabet zaharat de tip 2

aflați în evidență la Centrul de Medicină de Familie Iași în perioada iulie 2013 – decembrie
2014. Au fost centralizate date demografice și clinice din dosarele medicale ale acestora.
Parametrii analizați au fost: vârsta, sexul, înălţimea, greutatea, durata diagnosticului de
diabet zaharat de tip II, prezența antecedentelor heredo-colaterale pentru diabet zaharat,
patologia asociată, prezența fumatului, rezultatele paraclinice (hemoglobina glicozilată,
glicemia à jeun, LDL-colesterolul, HDL-colesterolul, colesterolul total, trigliceridele),
tensiunea arterială sistolică şi diastolică.
Au fost incluse date cu privire la medicaţia pentru tratamentul diabetului zaharat de tip
II, la medicaţia adjuvantă (acid alfa-lipoic, combinaţia benfotiamină / clorhidrat de piridoxină /
ciancobalamină), dar şi la medicaţia bolilor de la nivelul sistemului cardiovascular.
Datele au fost prelucrate statistic utilizând programul Microsoft Office Excel 2013.
51
7.3. REZULTATE ȘI DISCUȚII
Studiul s-a efectuat pe un eșantion de 221 de pacienți. 63,3% dintre aceștia sunt de sex
feminin , cu o vârstă medie de 64 ani (pacienții încadrându-se în intervalul de vârstă de 30-86
ani). Distribuția pe intervale de vârste este ilustrată în figura 7.1.
≥ 75 ani 20-44 ani
13.10% 3.20%
45-64 ani
48%
65-74 ani, 35.70%
20-44 ani 45-64 ani 65-74 ani ≥ 75 ani
Fig. 7.1. Distribuția pacienților pe grupe de vârste
Tabelul 7.I sumarizează rezultatele obținute prin prelucrarea statistică a datelor clinice
și paraclinice pentru eșantionul de pacienți studiat.
Tabel 7.I. Caracteristici ale eșantionului de pacienți analizat

Sex
Parametru Feminin Masculin
Medie Vmin1 Vmax2 Medie Vmin1 Vmax2
Număr pacienți 140 81
Vârstă (ani) 64 36 83 63 30 86
IMC (kg/m2) 32,79 19,53 48,12 31,21 18, 94 47,32
Tensiunea arterială
138,09 90 185 144,23 101 214
sistolică (mmHg)
Diagnostic DZ2 (ani) 10 1 27 9 1 35
Fumător (%) 9,28 23,46
Antecedente
33,57% 25,92%
heredo-colaterale
HbA1c (%)4 7,0 4,8 12,1 6,9 4,9 12
Colesterol total
196,9 105,9 506 181,6 83 304
(mg/dl)
HDL (mg/dl) 48,86 18 109 46,67 18,3 132
Raport
4,46 1,68 16,89 4,42 1,98 12,08
colesterol total:HDL
1 – Valoare minimă
2 – Valoare maximă
3 – Diabet zaharat
4 – Hemoglobină glicozilată
52
Valoarea medie pentru IMC este de 32,2 kg/m2, fără diferențe semnificative statistic
între cele două sexe.
Din punctul de vedere al duratei diagnosticului de DZ, s-au înregistrat valori de la 1 an
până la 35 de ani, cu o valoare medie de 10 ani pentru femei și de 9 ani pentru bărbați.
În ceea ce privește prevalența fumătorilor, s-a constatat un procent de 14,4% pacienți
fumători, cu o frecvență mai mare în rândul bărbaților. Pentru foștii fumători, distribuția pe sexe
este egală (8,9%).
Antecedentele heredo-colaterale au fost constatate la 30,8% dintre pacienți, cu o
prevalență mai mare la cei de sex feminin. De asemenea, s-a observat că o valoare crescută a
acestui procent apare în rândul categoriei de vârstă 45-64 ani.
Pacienții diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 prezintă complicații cronice, conform
figurii 7.2, cu frecvența cea mai ridicată pentru complicațiile neurologice (33,65 dintre cazuri).
Neuropatii periferice 33.65
Complicații renal 13.12
Complicații oculare 9.95
0 20 40 60 80 100 (%)
Fig. 7.2. Complicațiile cronice ale diabetului zaharat
Ca patologie asociată, dislipidemiile prezintă o frecvență ridicată (62,89%). Bolile

cardiovasculare asociate sunt prezentate în figura 7.3. Incidența acestor afecțiuni este mai
ridicată la pacienții de sex feminin, iar pe categorii de vârstă, frecvența cea mai ridicată o au:
- 45-64 ani: hipertensiunea arterială, cardiopatia ischemică cronică,
- 65-74 ani: infarctul miocardic în antecedente, cardiopatia ischemică cronică,
- ≥75 ani: fibrilația atrială.
100
90 83.71
80
70
60
%
50
40
30 20.8
20
7.69 6.33
10
0
HTA Cardiopatie Insuficiența Fibrilație atrială
ischemică cronică cardiacă cronică
*HTA – hipertensiune arterială

Fig. 7.3. Bolile cardiovasculare aasociate diabetului zaharat de tip 2
53
Din punct de vedere al terapiei medicamentoase, tabelul 7.II centralizează tratamentul

antidiabetic antihiperglicemiant primar, cât și terapia adjuvantă. Se constată faptul că
biguanidele (76,01%) și sulfonilureele (31,67%) au frecvența cea mai ridicată de prescriere.
Tabel 7.II. Terapia antidiabetică

Terapie primară Număr cazuri
Insuline cu acțiune rapidă 16
Insuline cu acțiune intermediară 13
Insuline și analogi cu durata lungă de acțiune 40
Biguanide 168
Sulfoniluree 70
Inhibitori ai 4-dideptilpeptidazei (DDP) 4
Inhibitori ai alfa-glucozidazei 15
Alte hipoglicemiante orale 7
Terapie adjuvantă Număr cazuri
Acid alfa-lipoic 74
Combinația benfotiamină/clorhidrat de
43
piridoxină/ciancobalamină
Medicația în terapia cardiovasculară este sumarizată în figura 7.4, unde se observă

frecvența prescrierii cea mai ridicată pentru inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei
(100 cazuri). Acest rezultat este în concordanță cu recomandările pentru terapia hipertensiunii
arteriale la adulții diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2 (122).
Agenții hipolipemianți au fost prescriși la 66,51% dintre cazuri, în concordanță cu
frecvența ridicată întâlnită pentru diagnosticele de dislipidemii.
100
90
80
70
60
45.25 44.34
%
50
37.1
40
30 24.43 23.08
20
10
0
IECA Agenți beta- Diuretice Antagoniști Blocante ale
blocanți RR-AT II canalelor de
calciu
*IECA: Inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei

RR-AT II: Receptori ai angiotensinei II
Fig. 7.4. Medicația cardiovasculară
54
7.4. CONCLUZII
 A fost realizat un studiu statistic descriptiv privind patologia asociată și medicația

antidiabetică pentru 221 pacienți cu diabet zaharat de tip 2 aflați în evidență la Centrul
de Medicină de Familie Iași, în perioada iulie 2013 – decembrie 2014.
 Evaluarea parametrilor biochimici înregistrați pentru pacienți nu a relevat diferențe
statistic semnificative între media parametrilor biochimici dintre sexe. S-a constatat ca
prevalența cea mai mare a procentului maxim se afla în categoria de vârstă 45-64 de ani,
indiferent de parametrul biochimic.
 Pentru cazurile analizate, complicațiile cronice ale diabetului zaharat cele mai frecvente
au fost neuropatiile (33,65%), urmate de complicațiile renale și oculare. Patologia
cardiovasculară este prezentă, pentru 83,71% dintre cazuri fiind menționată
hipertensiunea arterială, umată ca frecvență de cardiopatia ischemică cronică și
insuficiența cardiacă cronică.
 Compușii biguanidici reprezintă medicația antidiabetică cea mai frecvent prescrisă (la
168 din cele 221 cazuri de diabet zaharat, iar pentru afectarea cardiovasculară, inhibitorii
enzimei de conversie a angiotensinei prezintă cea mai ridicată pondere a prescrierii
(45,25%).
55
8. DETERMINAREA CANTITATIVĂ A METFORMINULUI

PRIN ELECTROFOREZĂ CAPILARĂ CU DETECȚIE ÎN UV
CU APLICAȚII PE SER UMAN
8.1. INTRODUCERE
Metforminul reprezintă unul din cele mai cunoscute medicamente antidiabetice orale și sunt
dezvoltate, la momentul actual, numeroase metode analitice pentru determinarea acestei substanțe din
produse farmaceutice sau probe biologice animale și umane.
În laboratoarele de analiză din țara noastră au fost aplicate mai ales metode cromatografice
pentru analiza metforminului (123,124). Însă, datorită caracterului polar, metforminul se poate
determina și prin electroforeză capilară. Această metodă nu a fost menționată în literatură pentru analiza
metforminului în laboratoarele locale.
Acest studiu își propune dezvoltarea și validarea metodei de determinare a metforminului prin
electroforeză capilară cu detecție în UV și optimizarea unei metode de extracție a metforminului din
produse biologice. Astfel, metoda de analiză prin electroforeză capilară cu detecție în UV se va putea
aplica în studii chimico-toxicologice ale metforminului.
8.2. PRINCIPII TEORETICE ALE ELECTROFOREZEI CAPILARE
Electroforeza capilară reprezintă o metodă nouă care îmbină mecanismele de separare

ale electroforezei cu performanțele de automatizare ale cromatografiei. Utilizează cantități mici
de probă, este cantitativă, automată, cu un domeniu vast de aplicare, inclusiv pe lichide
biologice umane.
Principiul de funcționare este simplu, instalaţia fiind constituită dintr-un capilar,
conectat de instalaţia optică a unui detector, o sursă de voltaj înalt și un injector pentru probă
(fig. 8.1). Capilarul, în care a fost introdusă în prealabil soluția tampon, are capetele introduse
în rezervoarele de soluție tampon. Apoi, electrozii (din material inert) sunt introduşi în soluția
tampon. După injectarea probei în capilar, se aplică voltajul. Ionii din probă se deplasează spre
electrodul corespunzător, trecând prin detector. Astfel, se generează un semnal și se
înregistrează componentele separate în funcţie de timp – sub formă de electroforegramă (126).
56
Fig. 8.1. Schema principalelor componente pentru electroforeza capilară

(adaptat după Funduc, 2006) (125)
8.3. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE

CANTITATIVĂ A METFORMINULUI PRIN ELECTROFOREZĂ CAPILARĂ CU
DETECȚIE ÎN UV
8.3.1. Material și metodă
Aparatură
Determinările au fost efectuate utilizând un sistem de electroforeză Beckman Coulter
P/ACE System MDQ (fig. 8.2), cu detector UV, sistem de reglare a temperaturii (4oC – 60oC)
și o sursă de curent capabilă să producă 30 kV. Sistemul software utilizat a fost 32 Karat
Software, Version 5.0, Build 1021.
Fig. 8.2. Sistemul de electroforeză Beckman Coulter
57
Analiza electroforetică s-a realizat pe o coloană Bare fused-silica capillary, 67 cm total

lenght, 50 cm effective lenght, 50 µm I.D., 375 µm O.D. (Beckman Coulter Inc., USA).
Pentru filtrarea soluțiilor utilizate s-a utilizat o membrană filtrantă de 0.22 µm
(producător Tehnokroma), la o pompă de vid KifLab, tip N86KT.18. pH-ul s-a determinat
utilizând pH-metrul Checker tip A873.1, Hanna instruments.
Soluțiile au fost degazeificate la baia de ultrasunete Ultrasonic cleaner SB-120DT.
Reactivi
Toți reactivii utilizați au fost de puritate analitică:
- clorhidrat de metformin (Harman Finochem Ltd., India),
- hidroxid de sodiu (Lach–Ner, Cehia),
- dihidrogenofosfat de sodiu (Ucb, Belgia),
- acid ortofosforic 85% (Fisher Scientific, Marea Britanie),
- acid succinic (Austria),
- acetat de sodiu (Chemical Company Iași),
- acid acetic glacial (Chemical Company Iași).
Parametri de lucru
Parametrii de lucru caracteristici acestei metode:
- condiționarea coloanei prin spălare timp de 5 minute, la o presiune de 20 psi, cu NaOH
0.1 M, apă bidistilată și tampon fosfat;
- injectarea probei: timp de 3 secunde, la o presiune de 0,5 psi;
- temperatura coloanei și a compartimentului a fost menținută constantă la 25oC; voltajul
aplicat a fost de +15 kV;
- toate soluțiile au fost degazeificate la începutul fiecărei zile de lucru la 20oC, timp de 5
minute;
- lungimea de undă la care s-au realizat determinările a fost 200 nm.
Prepararea soluțiilor de lucru

Prepararea soluției stoc: Soluția stoc de clorhidrat de metformin a fost preparată în apă
bidistilată, în concentrație de 5000 µg/mL.
Prepararea soluțiilor de analizat: Soluțiile de analizat au fost preparate din soluția stoc
de clorhidrat de metformin, prin diluare cu soluția tampon fosfat.
Prepararea soluției tampon fosfat: Soluția tampon fosfat a fost preparată din soluția de
dihidrogenfosfat de sodiu 60 mM ajustată la pH=4,0 cu acid ortofosforic 85%. Soluția obținută
a fost filtrată prin membrană filtrantă de 0,22 µm.
Prepararea soluției de NaOH 0,1 M: Soluția de hidroxid de sodiu a fost preparată în
apă bidistilată, prin dizolvarea a 0,4 g hidroxid de sodiu la 100 mL soluție.
Soluțiile preparate au fost păstrate la frigider (4oC).
Prelucrarea statistică a datelor

Datele au fost prelucrate statistic cu ajutorul programului Microsoft Office Excel
(versiunea 2007 Pro).
8.3.2. Optimizarea metodei de determinare electroforetică
Substanțele cu caracter acid pot fi analizate în forma anionică prin electroforeză capilară
la un pH ridicat, pe când substanțele cu caracter bazic pot fi analizate în forma cationică la un
58
pH scăzut. Astfel, conform caracterului bazic al metforminului, se utilizează o valoare a pH-

ului pentru soluția tampon în domeniul acid.
Pentru a optimiza această metodă, s-a studiat influența pH-ului și a tipului de soluție
tampon asupra timpului de migrare și a ariei picului obținute pentru clorhidratul de metformin.
8.3.2.1. Influența valorii pH-ului soluției tampon
Mod de lucru
Pentru a evalua influența valorii pH-ului soluției tampon, au fost utilizate diferite soluții
de tampon fosfat, de aceeași molaritate, 60 mM, cu pH 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0.
Determinările au fost realizate pe soluții de clorhidrat de metformin, diluate cu soluția tampon
la aceeași concentrație.
Rezultate și discuții
Rezultatele sunt redate în figura 8.3. Valoarea pH-ului soluției tampon trebuie să asigure
prezenţa în soluţia de analizat a cât mai multor molecule încărcate electric, aspect ilustrat de o
valoare cât mai mai mare a ariei picului. Totodată, o valoare a pH-ului de lucru mai apropiată
de cel neutru asigură un efect protector față de coloana electroforetică şi componentele
aparatului. Astfel, s-a ales ca valoare optimă de lucru pH=4,0. Rezultate similare au fost
obținute și în cadrul altor studii de determinare a metforminului prin electroforeză capilară (94).
Fig. 8.3. Influența pH-ului soluției tampon asupra ariei picului
8.3.2.2. Influența tipului de soluție tampon
Mod de lucru
Pentru a determina efectul tipului de soluție tampon, au fost analizate comparativ soluţii
de tampon fosfat, succinat și acetat. Soluțiile tampon au fost preparate la aceeași concentrație
(60 mM) și la aceeași valoare a pH-ului (pH=4.0). Determinările au fost realizate utilizând
aceeași soluție de clorhidrat de metformin, diluată cu soluția tampon la aceeași concentrație.
Conform valorilor ariilor picurilor obținute (fig. 8.4), varianta optimă este soluția de
tampon fosfat. Soluția tampon fosfat este, de asemenea, accesibilă, stabilă, cu risc scăzut de
interacțiuni cu probele biologice.
59
Fig. 8.4. Influența tipului soluției tampon asupra ariei picului
8.3.2.3. Stabilirea lungimii de undă optime de detecție în UV
Mod de lucru
Pentru stabilirea lungimii de undă optime de detecție în UV a metforminului, a fost
analizată aceeași soluție de clorhidrat de metformin la 200 nm, 214 nm și 254 nm.
Rezultatele sunt redate în figura 8.5. La 200 nm a fost obţinută cea mai mare valoare a
ariei picului. Astfel, pentru o detecție mai bună a metforminului, se va utiliza lungimea de undă
(200 nm) ce asigură sensibilitatea mai ridicată a determinării.
Fig. 8.5. Influența lungimii de undă asupra ariei picului
8.3.2.4. Rezultate și discuții
În cadrul analizei electroforetice, rezultatele depind de mobilitatea electroforetică a

analitului, care este determinată de încărcarea electrică și de dimensiunea moleculei acestuia.
Utilizând condițiile experimentale descrise anterior, pentru metoda optimizată de determinare
electroforetică s-a obținut pentru metformin un timp de migrare mediu de 10,514 minute (fig.
8.6).
60
Fig. 8.6. Electroforegrama pentru metformin (600 µg/mL)
Timpul de migrare este constant (RSD = 1,85%) (deviația standard relativă, RSD =
relative standard deviation), conform figurii 8.7, unde este reprezentată grafic suprapunerea
electroforegramelor pentru metformin, la diferite concentrații (200 µg/mL, 400 µg/mL, 600
µg/mL, 800 µg/mL, 1000 µg/mL).
Fig. 8.7. Electroforegramele pentru metformin (200, 400, 600, 800, 1000 µg/mL)
8.3.2.5. Concluzii
Metoda a fost optimizată corespunzător condițiilor expuse anterior. S-au stabilit și

utilizat: o soluție de tampon fosfat, de concentrație 60 mM, ajustată la pH=4,0, lungimea de
undă pentru detecție de 200 nm.
61
Timpul de migrare electroforetică a fost constant pentru determinările realizate, având

o valoare medie de 10,514 minute.
8.3.3. Validarea metodei de determinare electroforetică
Validarea metodei s-a realizat conform normelor specifice: ICH (International

Conference on Harmonisation) (126), Bojiță și colaboratorii, 2003 (127), Roman și
colaboratorii, 2007 (128). Au fost verificați și stabiliți parametrii de validare:
8.3.3.1. Selectivitatea
Modul de lucru
Pentru evaluarea selectivității metodei, s-au preparat:
- o soluție de clorhidrat de metformin 600 µg/mL, prin diluarea cu soluție tampon fosfat
a soluției stoc de clorhidrat de metformin (5000 µg/mL):
Vi = Vf x Cf / Ci, unde:
Vi = volumul soluției stoc inițiale,
Vf = volumul soluției finale, după diluție (10 mL),
Cf = concentrația soluției finale (600 µg/mL),
Ci = concentrația soluției stoc (5000 µg/mL).
Rezultă că Vi = 1,2 mL.
- o soluție tampon fosfat 60 mM, pH=4,0.
S-au obținut electroforegramele corespunzătoare celor două soluții, conform metodei.
Comparând, prin suprapunere, electroforegramele pentru metformin și pentru soluția
martor de tampon fosfat (de concentrație 60 mM, pH=4,0), realizate în condiții identice, se
observă lipsa picurilor suplimentare, care să interfere analiza (fig. 8.8). Rezultă astfel că metoda
este selectivă pentru metformin.
Fig. 8.8. Electroforegramele pentru metformin (600 µg/mL) și pentru soluția tampon fosfat
62
8.3.3.2. Liniaritatea
Mod de lucru
Volume corespunzătoare din soluția stoc de clorhidrat de metformin (5000 µg/mL) au
fost diluate cu soluție tampon fosfat, astfel încât s-au obținut concentrațiile finale în intervalul
5-1000 µg/mL, conform tabelului 8.I. S-au realizat trei seturi de soluții de lucru, care au fost
analizate în condițiile menționate, determinându-se aria picurilor corespunzătoare
metforminului.
Tabel 8.I. Modul de preparare al soluțiilor de clorhidrat de metformin utilizate la realizarea

dreptei de calibrare
Completare cu
Tipul Concentrația
soluție tampon
soluției de soluției de Soluția stoc utilizată
fosfat la balon
preparat preparat
cotat – capacitate
1000 µg/mL =
1 mL soluție 5000 µg/mL 5 mL
Soluții stoc STOC I
intermediare 100 µg/mL =
200 µL soluție 5000 µg/mL 10 mL
STOC II
5 µg/mL 500 µL STOC II 10 mL
10 µg/mL 1 mL STOC II 10 mL
25 µg/mL 250 µL STOC I 10 mL
50 µg/mL 500 µL STOC I 10 mL
100 µg/mL 1 mL STOC I 10 mL
Scara etalon
200 µg/mL 400 µL soluție 5000 µg/mL 10 mL
1000 µg/mL 1 mL soluție 5000 µg/mL 5 mL
Ariile picurilor obținute pentru soluțiile de clorhidrat de metformin (5-1000 µg/mL) sunt
prezentate în tabelul 8.II.
Tabel 8.II. Valorile ariilor obținute în studiul liniarității metodei de determinare a

metforminului prin electroforeză capilară
Concentrația soluției de
Valoarea ariei picului
clorhidrat de metformin (µg/mL)
5 4747
10 6158 5656 7033
25 10113 10779 11343
50 21251 22478 22391
100 43972 43235 38668
200 79812 82177 78138
400 164516 160228 162719
600 240388 240396 243016
800 342396 323807 313156
1000 387134 411408 409365
63
Prin reprezentarea grafică a acestor valori, în funcție de concentrație, se obține dreapta

de calibrare (fig. 8.9).
450000
y = 402.48x + 1383.4
400000 R² = 0.9984
350000
300000
Aria picului
250000
200000
150000
100000
50000
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentrația clorhidratului de metformin (µg/mL)
Fig. 8.9. Dreapta de calibrare pentru determinarea metforminului prin electroforeză capilară
Parametrii de validare, conform calculului statistic pentru dreapta de regresie, sunt

prezentați în tabelul 8.III.
Tabel 8.III. Parametri de validare

Parametru Valoare
Domeniu de liniaritate (µg/mL) 5 – 1000
y = 402,48  x + 1383,4
Ecuația de regresie unde: y = aria picului
x = concentrația (µg/mL)
Intercept (a) 1383,4
Pantă (b) 402,48
Coeficientul de corelație (r) 0,9991
Eroarea standard (ES) 1558,982
Coeficientul de regresie obținut are o valoare foarte apropiată de unitate (r2 = 0,9984),
resultând că metoda de determinare a metforminului prin electroforeză capilară este liniară.
8.3.3.3. Limita de detecție și limita de cuantificare

Utilizând dreapta de calibrare, se determină valorile pentru limita de detecție (LD) și
limita de cuantificare (LQ). Formulele de calcul aplicate utilizează eroarea standard și panta
dreptei de calibrare, obținute prin prelucrarea statistică:
LD = 3,3 x ES / b
LQ = 10 x ES / b, unde:
ES = eroarea standard,
b = panta curbei de calibrare.
64
Astfel, pentru determinarea metforminului prin electroforeză capilară cu detecție în UV,

s-au obținut următoarele valori:
LD = 12,782 µg/mL,
LQ = 38,734 µg/mL.
8.3.3.4. Precizia
Pentru stabilirea preciziei, s-au studiat: repetabilitatea (prin determinarea preciziei
sistemului și preciziei metodei) și precizia intermediară.
Precizia sistemului
Mod de lucru
Precizia sistemului electroforetic a fost determinată folosind aceeași concentrație de
clorhidrat de metformin (400 µg/mL), care a fost analizată de 5 ori, conform metodei. Pe baza
electroforegramelor obținute s-au determinat ariile picurilor, valorile fiind prelucrate statistic,
cu obținerea valorii medii, a deviației standard și a deviației standard relative.
Analizând rezultatele obținute (tabel 8.IV), se observă că deviația standard relativă
obținută are valoarea mai mică de 5%. Rezultă că sistemul de determinare electroforetică a
metforminului este precis.
Tabel 8.IV. Precizia sistemului

Nr. determinării Aria picului
1 153983
2 158585
3 151449
4 168972
5 153962
Date statistice
Media 157390,2
Deviația standard (SD) 6968,233
Deviația standard relativă (RSD) (%) 4,427361
Precizia metodei
Mod de lucru
Precizia metodei electroforetice a fost determinată utilizând 3 concentrații diferite de
clorhidrat de metformin (200 µg/mL, 400 µg/mL, 600 µg/mL). Pentru fiecare concentrație au
fost preparate câte 3 probe, care au fost analizate conform metodei.
Pe baza electroforegramelor obținute s-au determinat ariile picurilor. Utilizând ecuația
dreptei de calibrare, s-au calculat concentrațiile pentru fiecare determinare, cât și regăsirea
procentuală, conform formulelor:
Concentrația calculată (µg/mL) = (Aria picului – 1383,4) / 402,48
% regăsire = Cc x 100 / Ct, unde:
Cc = concentrația calculată (conform ecuației dreptei de calibrare) (µg/mL),
Ct = concentrația teoretică (µg/mL).
65
Valorile au fost prelucrate statistic, cu obținerea valorii medii, a deviației standard și a

deviației standard relative.
Analizând rezultatele obținute (tabel 8.V), se observă că deviația standard relativă
obținută are valoarea mai mică de 5%. Rezultă că metoda de determinare electroforetică a
metforminului este precisă.
Tabel 8.V. Precizia metodei
Concentrația Concentrația calculată
Aria
clorhidratului de a clorhidratului de Regăsire (%)
picului
metformin (µg/mL) metformin (µg/mL)
84072 205,4477 102,7239
200 86564 211,6393 105,8197
85769 209,6641 104,832
241348 596,215 99,36916
600 247898 612,4891 102,0815
238497 589,1314 98,18856
396889 982,6714 98,26714
1000 388784 962,5338 96,25338
385363 954,034 95,4034
Date statistice
Media 100,3265
Precizia intermediară a metodei
Mod de lucru
Pentru determinarea preciziei intermediare a metodei de determinare a metforminului
prin electroforeză capilară cu detecție în UV s-au urmat aceiași pași de lucru ca la determinarea
preciziei metodei, dar în altă zi de lucru. S-au utilizat câte 3 probe pentru 3 concentrații diferite
de clorhidrat de metformin (200 µg/mL, 400 µg/mL, 600 µg/mL), care au fost analizate conform
metodei.
Pe baza electroforegramelor obținute s-au determinat ariile picurilor și au fost calculate
concentrațiile pentru fiecare determinare, cât și regăsirea procentuală.
Ulterior, valorile au fost prelucrate statistic, cu obținerea valorii medii, a deviației
standard și a deviației standard relative.
Analizând rezultatele obținute (tabel 8.VI), se observă că deviația standard relativă
obținută are valoarea mai mică de 5%. Rezultă că precizia intermediară a metodei de
determinare electroforetică a metforminului este verificată.
66
Tabel 8.VI. Precizia intermediară a metodei

Aria
picului
79590 194,311767 97,15588352
200 78128 190,6792884 95,33964421
78037 190,4531902 95,22659511
247580 611,6989664 101,9498277
600 237672 587,0815941 97,84693235
243697 602,0512821 100,3418803
412969 1022,623733 102,2623733
1000 372199 921,326774 92,1326774
388763 962,481614 96,2481614
Date statistice
Media 97,61155282
8.3.3.5. Acuratețea
Mod de lucru
Acuratețea metodei a fost evaluată, de asemenea, prin experiment de tip ‘recovery’,
efectuându-se 3 injectări succesive a unor soluții de metformin la 3 concentrații diferite. Pentru
calculul concentrației probelor s-a utilizat ecuația curbei de calibrare. S-au obținut: regăsirea
procentuală medie, deviația standard și deviația standard relativă.
Conform datelor obținute (tabel 8.VII), acuratețea metodei este caracterizată de
regăsirea medie calculată 100,39%, cu o valoare a RSD = 2,40%.
Tabel 8.VII. Acuratețea metodei

Aria
picului
82446 201,4077718 100,7038859
200 83928 205,0899424 102,5449712
82702 202,0438283 101,0219141
251169 620,6161797 103,4360299
600 246583 609,2218247 101,5369708
247907 612,5114291 102,0852382
389529 964,3848142 96,43848142
1000 395364 978,8824289 97,88824289
395587 979,4364937 97,94364937
Date statistice
Media 100,3999315
Valoarea minimă 96,43848142
Valoarea maximă 103,4360299
67
8.3.4. Concluzii
Conform rezultatelor prezentate, a fost dezvoltată, optimizată și validată o metodă

simplă, modernă și economică de determinare cantitativă a metforminului prin electroforeză
capilară cu detecție în UV.
S-au stabilit condițiile optime de analiză:
 separarea electroforetică s-a realizat pe o coloană Bare fused-silica capillary (67 cm total
lenght, 50 cm effective lenght, 50 µm I.D., 375 µm O.D.,
 deplasarea ionilor s-a realizat în soluție tampon fosfat, 60 mM, la pH=4,0,
 injectarea probei s-a realizat timp de 3 secunde, la o presiune de 0,5 psi,
 lungimea de undă la care s-a realizat detecția a fost 200 nm.
Metoda a fost validată, prin verificarea și stabilirea parametrilor de validare:
 liniaritatea, în domeniul 5-1000 µg/mL, cu un coeficient de corelație r = 0,9991,
 limita de detecție LD = 12,782 µg/mL și limita de cuantificare LQ = 38,734 µg/mL,
 precizia, cu determinarea preciziei sistemului (RSD = 4,42%), preciziei metodei (RSD
= 3,69%) și a preciziei intermediare (RSD = 3,45%),
 acuratețea (regăsire medie 100,39%, RSD = 2,40%).
Metoda de determinare a metforminului prin electroforeză capilară cu detecție în UV
poate fi aplicată în studii toxicologice, de analiză a probelor biologice.
8.4. APLICAȚII ALE METODEI DE DETERMINARE A METFORMINULUI PRIN

ELECTROFOREZĂ CAPILARĂ CU DETECȚIE ÎN UV PE SER UMAN
Metoda dezvoltată și validată de determinare a metforminului prin electroforeză capilară

cu detecție în UV a fost aplicată pentru analiza probelor de ser uman.
Aparatură
Determinările au fost efectuate utilizând un sistem de electroforeză Beckman Coulter
P/ACE System MDQ, cu detector UV.
Analiza electroforetică s-a realizat pe o coloană Bare fused-silica capillary, 67 cm total
lenght, 50 cm effective lenght, 50 µm I.D., 375 µm O.D. (Beckman Coulter Inc., USA).
Centrifugarea probelor s-a realizat la centrifuga Universal 320 Hettich D-78532
Tuttlingen, tip 1406 (Germania).
Soluțiile obținute după prelucrarea probelor de ser au fost filtrate prin membrană
filtrantă celulozică cu diametrul de 0,2 µm, tip Minisart RC 4 (Sartorius Stedim Biotech,
Germania).
Reactivi
- hidroxid de sodiu (Lach–Ner, Cehia),
- dihidrogenofosfat de sodiu (Ucb, Belgia),
- acid ortofosforic 85% (Fisher Scientific, Marea Britanie),
- clorură de calciu (UCB Pharma, România),
- acetonitril (Merck, Germania).
Plasmă umană: Macopharma (România).
68
Condițiile de lucru și metoda de determinare electroforetică pentru metformin sunt

aceleași cu cele descrise în subcapitolul anterior: condiționarea coloanei s-a realizat prin spălare
timp de 5 minute, la o presiune de 20 psi, cu NaOH 0.1 M, apă bidistilată și tampon fosfat;
injectarea probei s-a efectuat timp de 3 secunde, la o presiune de 0,5 psi; voltajul aplicat a fost
de +15 kV; lungimea de undă la care s-au realizat determinările a fost 200 nm.
Obținerea serului uman

Serul utilizat pentru determinări a fost obținut din plasmă, prin tratare cu o soluție de
clorură de calciu 20%: 10 mL plasmă au fost tratați cu 0,1 mL soluție clorură de calciu 20%
(proporția este 1:100 v/v), apoi soluția obținută se omogenizează și se păstrează 24 ore la 4 oC.
După centrifugare timp de 5 minute la 8000 rpm (rotații pe minut), supernatantul obținut fiind
serul utilizat pentru determinările ulterioare (129).
Prelucrarea probelor de ser uman

Probele de ser au fost prelucrate, în vederea izolării metforminului, prin parcurgerea
etapelor:
- 0,5 mL ser îmbogățiț cu metformin au fost tratați cu 0,5 mL acetonitril, pentru
precipitarea proteinelor;
- amestecul a fost centrifugat la 6000 rpm, timp de 10 minute;
- supernatantul obținut a fost separat și filtrat prin microfiltru de 0,2 µm.
- soluția obținută după filtrare a fost analizată electroforetic, conform metodei.

Datele au fost prelucrate statistic cu ajutorul programului Microsoft Office Excel
(versiunea 2007 Pro).
8.4.2. Optimizarea metodei de extracție a metforminului din probe de ser uman
Literatura de specialitate menționează diferite metode de extracție pentru metformin din

probe biologice de ser sau plasmă umană asociate determinării prin electroforeză capilară.
Salim și colaboratorii (94) și Lai și colaboratorul (95) aplică o metodă de izolare prin utilizarea
cartușelor pentru extracție în fază solidă de tip C18 SPE. Tuma (130) utilizează acetonitrilul
pentru deproteinizare, însă metoda publicată de acesta implică înlăturarea acetonitrilului pentru
evitarea interferării analizei ulterioare. Znaleziona și colaboratorii (131) propun, de asemenea,
o metodă de precipitare cu acetonitril, cu evaporarea acestuia și reluarea reziduului cu solvenți
aleși convenabil.
Pornind de la aceste date, s-a dorit stabilirea și optimizarea unei metode pentru extracția
metforminului din probe de ser uman cu un randament cât mai apropiat de 100%, dar și prin
parcurgerea a cât mai puțini pași de lucru.
În primul rând, am testat extracția metforminului din ser prin precipitarea proteinelor cu
acetonitril, urmată de evaporare pentru îndepărtarea solventului. Pentru aceasta am evaluat
efectul de matrice asupra detecției metforminului. Au fost parcurși următorii pași:
- 0,5 mL ser + 0,5 mL acetonitril,
- agitare,
- centrifugare la 600 rpm, 10 minute,
- evaporare la sec,
- reluarea reziduului cu 0,9 mL soluție tampon fosfat și 0,1 mL soluție clorhidrat de
metformin 100 µg/mL,
69
- agitare,
- filtrare prin membrană filtrantă.
S-au lucrat 3 probe identice. După analiza în sistemul electroforetic sau obținut ariile
corespunzătoare picurilor. Utilizând ecuația dreptei de calibrare s-a calculat concentrația
regăsită și regăsirea procentuală (tabel 8.VIII).
Tabel 8.VIII. Rezultatele evaluării efectului de matrice în metoda de izolare a

metforminului
Concentrația teoretică Concentrația calculată a
Aria Regăsire
a clorhidratului de clorhidratului de
picului (%)
3367 4,928444 49,2844
10 3674 5,69121 56,9121
3753 5,8875 58,875
Regăsire medie (%) 55,0238
Conform rezultatelor prezentate, regăsirea medie este scăzută și extracția metforminului

poate fi insuficientă sau insuficient detectabilă prin această metodă.
Ulterior, s-a realizat îmbogățirea serului cu metformin și prelucrarea urmând aceiași pași
ca în etapa anterioară (tabel 8.IX).
Tabel 8.IX. Rezultatele evaluării metodei de izolare a metforminului prin precipitare cu

acetonitril și evaporare
Concentrația Concentrația
teoretică a Aria calculată a Regăsire
Mod de lucru probe
clorhidratului de picului clorhidratului de (%)
0,45 mL ser + 0,05 mL soluție
clorhidrat de metformin 10 4274 7,18197 65,29
µg/mL + 0,5 mL acetonitril,
11
centrifugare, evaporare, reluare
cu 0,5 mL soluție clorhidrat de 4815 8,52614 77,51
metformin 10 µg/mL
0,45 mL ser + 0,05 mL soluție
clorhidrat de metformin 20
µg/mL + 0,5 mL acetonitril,
12 4692 8,22053 68,50
centrifugare, evaporare, reluare
cu 0,5 mL soluție clorhidrat de
metformin 10 µg/mL
Pentru a stabili dacă acest tip de metodă este optim, comparativ cu alte variante, am
aplicat precipitarea proteinelor cu acetonitril, fără a evapora supernatantul obținut, iar
îmbogățirea cu metformin a fost realizată direct în proba de ser inițială, prin dizolvare directă a
clorhidratului de metformin. S-au eliminat astfel erorile de măsurare pentru etapa de adăugare
a metforminului în probe și diluarea probei de ser cu o soluție apoasă.
Modalitatea de preparare a probelor de ser de diferite concentrații este prezentată în
tabelul 8.X.
70
Tabel 8.X. Prepararea probelor de ser îmbogățite cu metformin
Tipul Concentrația Mod de preparare

soluției de soluției de Clorhidrat de
preparat preparat mL ser
metformin
1000 µg/mL =
0,005 g 5
Soluții SOL I
intermediare 100 µg/mL =
0,1 mL SOL I 0,9
SOL II
20 µg/mL 0,1 mL SOL II 0,4
40 µg/mL 0,2 mL SOL II 0,3
Soluții de
50 µg/mL 0,25 mL SOL II 0,25
analizat
150 µg/mL 0,15 mL SOL I 0,85
500 µg/mL 0,25 mL SOL I 0,25
Modul de lucru aplicat este reprezentat în figura 8.10.
Extracția metforminului
0,5 mL ser
+
0,5 mL acetonitril
|
agitare
|
centrifugare la 6000 rpm, 10 minute
|
supernatant
|
evaporare
|
microfiltrare
|
analiză
Fig. 8.10. Prelucrarea probelor de ser în vederea izolării metforminului
Consecutiv aplicării metodei, au fost realizați aceiași pași: obținerea ariei picului
corespunzător metforminului, calculul concentrației conform ecuației dreptei de calibrare,
ajustarea concentrației obținute conform diluției realizate, calculul concentrației regăsite și a
regăsirii procentuale. Formulele de calcul sunt:
Cc = (Aria picului – 1383,4) / 402,48

Cr = Cc x Fd
Regăsirea (%) = Cr x 100 / Ct, unde:
Cc = concentrația calculată a clorhidratului de metformin în ser (µg/mL),

Cr = concentrația regăsită a clorhidratului de metformin în ser (µg/mL),
Ct = concentrația teoretică a clorhidratului de metformin în ser (µg/mL),
Fd = factorul de diluție (Fd=2).
71
8.4.3. Rezultate și discuții
Tabel 8.XI. Rezultatele extracției metforminului din probe de ser

Concentrația Concentrația
Concentrația teoretică
Aria calculată a regăsită a Regăsire
a metforminului în ser
picului metforminului metforminului (%)
(µg/mL)
(µg/mL) (µg/mL)
20 5623 10,53369 21,06738 105,337
20 5067 9,152256 18,304512 91,52256
20 5253 9,614391 19,228782 96,14391
40 7916 16,23087 32,46174 81,15434
50 10785 23,35917 46,71834 93,43669
50 9826 20,97645 41,9529 83,90578
150 37559 89,88173 179,76346 119,8423
500 115925 284,5895 569,179 113,8358
Date statistice
Rezultatele corespunzătoare metodei de izolare a metforminului din probe biologice de

ser uman sunt prezentate în tabelul 8.XI.
Analizând rezultatele obținute, metoda aplicată pentru izolarea metforminului din probe
de ser este optimă. Regăsirea medie este de 98,14%, valoare foarte apropiată de randamentul
maxim de extracție de 100%, iar deviația standard relativă este în limitele admise, sub 15%.
În plus, avantajele acestei abordări sunt:
 îmbogățirea serului s-a realizat în condiții cât mai fidele probelor reale, fără diluarea
probei de ser cu o soluție apoasă de clorhidrat de metformin;
 prin analiza supernatantului obținut în urma precipitării proteinelor serice cu acetonitril,
fără a mai realiza îndepărtarea acestuia prin evaporare, se realizează o simplificare
considerabilă a procedurii de lucru, prin economie de timp, reactivi, consumabile de
laborator;
 prezența acetonitrilului nu influențează analiza metforminului (timpul de retenție sau
aria picului) (fig. 8.11).
Fig. 8.11. Electroforegrama probei de ser îmbogățite cu metformin, de concentrație 500 µg/mL
72
140000
120000 y = 232.8x + 8.8599

R² = 0.9986
100000
Aria picului
80000
60000
40000
20000
0
0 100 200 300 400 500 600
Concentrația clorhidratului de metformin în ser (µg/mL)
Fig. 8.12. Dreapta de calibrare utilizând probe de ser îmbogățit cu clorhidrat de metformin
În plus, valorile obținute prezintă liniaritate, coeficientul de corelație având o valoare

apropiată cu unitatea (r = 0,9992), conform figurii 8.12.
Astfel, în analize ulterioare a probelor de ser se poate utiliza și ecuației acestei drepte.
Formula de calcul corespunzătoare este:
Concentrația metforminului în ser (µg/mL) = (Aria picului-8,8599) / 232,8
8.4.4. Concluzii
A fost dezvoltată și optimizată o metodă de extracție simplă și economică pentru

izolarea metforminului din probe de ser uman:
 S-a utilizat metoda de precipitare a proteinelor serice cu acetonitril.
 Randamentul de extracție a fost de 98,14%, o valoare apropiată de unitate, ilustrând
eficiența metodei optimizate.
 Electroforegramele obținute prin aplicarea acestei metode nu prezintă picuri
suplimentare, dovedind absența posibililor interferenți izolați concomitent cu
metforminul.
 Aplicată pe probe de ser îmbogățit de diferite concentrații, metoda de extracție este
liniară (coeficientul de corelație r = 0,9992).
 Aplicarea metodei pe probe de ser uman se poate realiza și prin utilizarea unei scări
etalon realizate pe probe de ser îmbogățite, conform ecuației dreptei de calibrare:
Aria picului = 232,8 x Concentrația metforminului (µg/mL) + 8,8599.
73
9. DETERMINAREA CANTITATIVĂ SIMULTANĂ A

METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI PRIN UPLC-
QTOF/MS CU APLICAȚII PE SER UMAN
9.1. INTRODUCERE
Atât în analiza toxicologică, cât și în alte determinări farmaceutice sunt utilizate metode
performante pentru analiza compușilor medicamentoși. Caracteristicele importante sunt
separarea eficientă a substanțelor analizate, o detecție precisă și limite cât mai mici de
cuantificare, ce vor permite aplicarea metodelor pentru analiza diferitelor probe.
Metforminul și glimepiridul prezintă în literatura de specialitate metode de analiză
simultană, însă determinarea prin UPLC-QTOF/MS (Ultra Performance Liquid
Chromatography - Quadrupole Time-of-Flight / Mass Spectrometry) nu a mai fost aplicată
anterior. Singura mențiune de utilizare a sistemului de detecție QTOF este pentru metformin,
într-un studiu de screening. Metforminul a fost doar identificat, fără a fi cuantificat, respectivul
studiu neavând aplicată metoda pe probe biologice (132).
Astfel, studiul prezent își propune dezvoltarea și validarea metodei de analiză simultană
a metforminului și glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS. În plus, un alt obiectiv este aplicarea
acestei metode pentru analiza celor doi compuși din probe biologice de ser uman, consecutiv
stabilirii și optimizării unei metode simple și eficiente de extracție.
9.2. PRINCIPII TEORETICE
Cromatografia este o metodă de analiză instrumentală folosită frecvent în determinări

ale substanțelor medicamentoase. Cu utilizare pe scară largă este cromatografia de lichide de
înaltă performanță, ce însumează metode cromatografice bazate pe repartiția lichid-lichid,
schimbători de ioni, adsorbția lichid-solid sau pe procesul de excludere.
Cromatografia HPLC (high performance liquid chromatography – cromatografie de
lichide de înaltă performanță) pe coloană utilizează mai ales tehnica de repartiție. Procedeele
abordate sunt cromatografia cu fază staționară normală (fază staționară polară) sau cu fază
inversă (fază staționară nepolară), alese în funcție de caracteristicile analitului.
Această metodă instrumentală are numeroase aplicații, mai ales în analiza
medicamentului, fiind utilizată în determinări cantitative asociată cu detecție: de absorbanță
(UV, VIS), de fluorescență, electrochimică, refractometrică, de conductivitate sau prin
spetrometrie de masă (133).
Detecția prin spectrometrie QTOF (quadrupole – time of flight) este considerată, din
punct de vedere analitic, robustă și performantă, cu caracteristici unice.
74
Această tehnică are la bază combinarea performanței TOF (time of flight – timp de zbor)
din spectrometria de masă (atât în modul MS, cât și în MS/MS) cu ionizarea ESI (electrospray
ionization – ionizare prin electropulverizare) sau APCI (atmospheric pressure chemical
ionization – ionizare chimică la presiune atmosferică). Astfel, instrumentul analitic permite
analiza precursorilor ionici, cât și a ionilor compusului studiat, cu o sensibilitate și acuratețe a
masei ridicate. În plus, analiza prin QTOF/MS asigură simplitatea operării și claritatea în
interpretarea rezultatelor.
Fig. 9.1. Reprezentarea schematică a spectrometrului de masă în tandem cu QTOF

(adaptat după Chernuchevich, 2001) (134)
Configurarea unui instrument QTOF poate fi constituită fie prin adăugarea unui
quadrupol și a unei celule de coliziune la un ESI-TOF, fie prin înlocuirea ultimului quadrupol
dintr-un triplu quadrupol cu un spectrometru de masă TOF. Totuși, un instrument QTOF este
constituit (fig. 9.1), de obicei, din trei componente quadrupol (Q0, Q1, Q2) și un analizor de
masă de tip TOF.
Rolurile principale ale acestor componente sunt: Q0 – răcirea coliziunii și direcționarea
ionilor pentru a pătrunde în instrumentul de analiză, Q1 – element de transmisie, Q2 – celulă de
coliziune, TOF - înregistrarea spectrelor.
Un alt aspect important este faptul că spectrele obținute în urma analizei au capacitatea
de a înregistra ioni în paralel, fără ca aceștia să fie scanați (134).
75
9.3. DEZVOLTAREA ȘI VALIDAREA METODEI DE DETERMINARE

CANTITATIVĂ SIMULTANĂ A METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI PRIN
UPLC-QTOF/MS
Aparatură
Determinările au fost realizate la un sistem Acquity Ultraperformance Liquid
Chromatography (UPLC H-CLASS) (Waters Corp., Milford) (fig. 9.2), cu o coloană Acquity
UPLC BEH C18 (50 mm × 2,1 mm, mărimea particulelor 1,7 µm). Sistemul UPLC a fost cuplat
pentru detecție cu un ansamblu hibrid spectrometru de masă cvadrupol-timp de zbor (Q-TOF),
Xevo G2-S QTOF.
Fig. 9.2. Acquity UPLC cuplat cu XEVO G2-S QTOF

(adaptat după www.investigacion.us.es) (135)
Sistemul de analiză Acquity UPLC-QTOF/MS prezintă următoarele caracteristici:

- Dublă ionizare, comutabilă, prin ESI și prin APCI, cu system LockSpray;
- Programarea temperaturii de desolvatare până la 650 oC;
- Capacitatea de căutare a ionilor precursori cu masă exactă;
- Capacitatea de căutare a pierderilor neutre cu masă exactă;
- Trecerea automată de la scanare MS la MS/MS;
- Achiziție independentă de date MSE;
- Cuplare cu cromatograf cu sistem cuaternar de pompe, cu termostatare a
compartimentului pentru coloana cromatografică, cu autoinjectare.
Sistemul de filtrare a apei Millipore Milli-Q Plus a fost utilizat pentru purificarea apei
utilizată la prepararea soluțiilor de analizat.
Reactivi
- glimepirid (Sigma),
- acid formic (Sigma),
- metanol (Fluka).
Apa și acetonitrilul utilizați la prepararea fazei mobile au fost de puritate UHPLC
(Fluka).
76
Prepararea soluției stoc

Soluțiile stoc de clorhidrat de metformin și glimepirid au fost preparate în metanol, în
concentrație de 400 mg/L: 0,04 g substanță pură la 100 mL soluție (măsurați la balon cotat).
Soluțiile de lucru au fost preparate prin diluții succesive ale soluțiilor stoc de metformin
și de glimepirid, folosind ca solvent apă purificată.
Parametrii de separare cromatografică

Temperatura compartimentului pentru probe a fost setată la 100C, iar cea pentru coloana
cromatografică a fost de 250C.
Componentele fazei mobile au fost acetonitril și acid formic în apă, în concentrație
0,05%.
Soluția de analizat a fost injectată automat, în volum de 10 µL.
Gradientul optim pentru separarea cromatografică este descris în tabelul 9.I.
Tabel 9.I. Gradientul de eluție utilizat în separarea cromatografică

Timp % A (acid formic Debit
% B (acetonitril)
(minute) 0,05% în apă) (mL/minut)
0 70 30 0,3
3 70 30 0,3
3,5 65 35 0,3
4,5 65 35 0,3
5,0 20 80 0,3
8,0 20 80 0,3
8,1 70 30 0,3
10,0 70 30 0,3
Parametrii pentru detecția prin MS/QTOF

Spectrometrul de masă Xevo G2 QTof a fost utilizat în modul rezoluție, ESI pozitiv. În
tabelul 9.II sunt sumarizați parametrii de lucru pentru detecția prin ESI+, în modul Rezoluție.
Tabel 9.II. Condiții experimentale pentru detecția prin MS/QTOF

Parametru Valoare
Capillary (kV) 1,50
Source Sampling Cone (V) 40
Source offset 80
Source 120
Temperatures (0C)
Desolvation 400
Cone Gas (L/h) 30
Gas Flows
Desolvation Gas (L/h) 400
Leucine Enkephalin 200 pg/µL, 10 mL/min
Lockspray conditions Lock mass (m/z) 554,2615
Frequency (s) 30
Capillary (kV) 2,54

Datele au fost prelucrate statistic cu ajutorul programului Microsoft Office Excel 2013.
77
9.3.2. Optimizarea metodei de determinare cantitativă simultană a metforminului

și glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS
Metoda de determinare simultană a metforminului și glimepiridului prin UPLC-

QTOF/MS a fost optimizată astfel încât intensitatea semnalului să fie cât mai ridicată, iar
separarea compușilor cât mai eficientă.
9.3.2.1. Material și metodă
Testările au fost realizate utilizând soluții de:

- clorhidrat de metformin 500 µg/L în apă purificată,
- glimepirid 500 µg/L în apă purificată,
- clorhidrat de metformin și glimepirid 500 µg/L în apă purificată.
Substanțele analizate au fost identificate pe baza masei exacte:
- metformin (m/z): 130,1050 Da,
- glimepirid m/z): 491,2311 Da.
A fost studiată influența asupra analizei a următorilor parametri:
- Capillary Voltage – Voltajul aplicat vârfului capilarului pentru analit. Este setat, în
general, la valori între 0,5 și 3,2 kV în modul ESI pozitiv și 2,6 în modul ESI negativ,
dar poate fi modificat corespunzător tipului de probă de analizat.
- Sample Cone – Voltajul aplicat între Stepwave și T-wave. Acest voltaj este utilizat pentru
optimizarea sensibilității (prin diminuarea aglomerării moleculelor și prin eliminarea
aducților). Dacă este setat la o valoare prea ridicată, poate să apară fragmentarea ionilor.
- Source Offset – este stabilită de obicei în jurul valorii de 80 V.
- Source Temperature – Reprezintă temperatura blocului sursă. Încălzirea acestui
compartiment împiedică aglomerarea moleculelor de solvent în regiunea de vid redus a
sursei. Temperatura este dependentă de debit și de tipul probei. Intervalul normal între
care se setează valoare de lucru este 60 până la 1200C.
- Desolvation – Temperatura setată pentru încălzirea desolvatării în cazul
electropulverizării. Are loc încălzirea gazului de desolvatare care este utilizat pentru
evaporarea solventului. Temperatura este setată în funcție de debitul și compoziția
solventului (de obicei între 150 și 6500C).
- Cone Gas – Debitul azotului în jurul conului pentru probă, gaz ce este utilizat pentru a
reduce formarea aglomerărilor de molecule de solvent. Valorile normale sunt între 0 și
50 L/h.
- Desolvation Gas – Debitul azotului în sursa API pentru evaporarea solventului. Debitul
gazului este dependent de debitul și compoziția solventului și este stabilit între 350 și
1000 L/h.
- Collision Energy – Controlează potențialul la care ionii intră în celula de coliziune.
Fragmentarea ionilor depinde de gradul de încărcare (este necesar un potential mai
scăzut pentru o încărcare mai ridicată) și puterea moleculară. În mod normal este setată
“OFF” pentru modul TOF/MS (valoarea implicită pentru modul “OFF” este 6).
Prin analiza directă a fiecărei soluții (metformin 500 µg/L, glimepirid 500 µg/L) s-a
căutat valoarea potrivită optimă fiecare parametru.
De asemenea, a fost studiată alegerea solvenților pentru eluție, tipul de eluție (izocratică
sau în gradient), cât și gradientul utilizat. Pentru aceste determinări a fost utilizată soluția de
metformin și glimepirid 500 µg/L.
78
9.3.2.2. Rezultate și discuții
Rezultate
Parametrii ESI+ optimi au fost stabiliți, având în vedere intervalele de valori
recomandate, cât și detecția metforminului și glimepiridului din soluțiile de analizat. S-a
observat faptul că la creșterea tensiunii (kV) capilarului (Capillary Source), crește intensitatea
semnalelor pentru fragmente (m/z 60,2, 71,06) și scade pentru metformin (m/z 130,1050).
Cele două substanțe au fost identificate pe baza spectrelor MS și a masei exacte (m/z):
130,105 Da pentru metformin și 491,2311 Da pentru glimepirid. Figura 9.3 ilustrează spectrele
celor doi compuși.
Fig. 9.3. Spectrele MS pentru: a. Metformin (50 µg/L), b. Glimepirid (50 µg/L)
Comparativ, figura 9.4 ilustrează spectrele celor doi compuși raportate în literatura de
specialitate.
79
Fig. 9.4. Spectrele MS pentru: a. Metformin (136), b. Glimepirid (137)
Se observă astfel că spectrele pentru cei doi compuși obținute în cadrul analizei UPLC-
QTOF/MS coincid cu cele raportate de sursele de specialitate.
Timpii de retenție obținuți în cadrul separării cromatografice pentru metformin și
glimepirid au fost constanți (fig. 9.5):
- metformin: Rt = 0,4004 minute (RSD = 0.4959%),
- glimepirid: Rt = 6,4718 minute (RSD = 0.8190%).
Fig. 9.5. Cromatogramele pentru: a. Metformin (0,5 µg/L), b. Glimepirid (0,5 µg/L)
Aceste valori ale timpilor de retenție au fost obținute prin modificarea corespunzătoare
a gradientului de eluție, conform metodei (fig. 9.6) (pompa C: apă cu acid formic 0,05%, pompa
D: acetonitril).
80
Fig. 9.6. Gradientul de eluție pentru separarea metforminului și glimepiridului prin

UPLC-QTOF/MS
În vederea stabilirii gradientului a fost utilizat ca punct de plecare metoda prezentată în

literatură de Qiu și colaboratorii (2015) (108) pentru analiza glimepiridului și fluoxetinei prin
UPLC-MS/MS , datorită utilizării unei separări cromatografice similare (prin UPLC și cu o
coloană de tip BEH C18). Ulterior, au fost realizate următoarele schimbări:
- Concentrația acidului formic în apă a fost modificată de la 1% la 0,05%,
- Timpul total de separare a fost mărit de la 4 la 10 minute,
- A fost modificată corespunzător și gradientul de eluție, cu proporțiile inițiale de 30%
acetonitril și 70% apă cu acid formic 0,05% (față de varianta inițială de 35% acetonitril
și 65% apă cu acid formic 1%),
- Debitul fazei mobile a fost stabilit la 0,3 mL/min (față de varianta inițială de 0,4
mL/min).
Discuții
În mod normal, pentru determinarea simultană a doi compuși, nu este necesară folosirea
eluției în gradient, dacă probele sunt suficient de simple.
Caracteristicile structurale, de solubilitate și ionizare ale celor doi compuși au evidențiat
un comportament diferit și, astfel, utilitatea realizării eluției în gradient, pentru o separare
optimă. Au fost utilizate două sisteme de solvenți complementare: organic, prin acetonitril, și
apos, prin apă cu acid formic. Metforminul este foarte ușor solubil în apă, pe când glimepiridul
nu este hidrosolubil. Deoarece la începutul separării cromatografice, proporția mai mare a fost
pentru faza apoasă, metforminul este primul compus separat (cu cel mai mic timp de retenție).
În funcție de modificarea gradientului și de momentul (timpul) în care se mărește faza
neapoasă, va fi separat și glimepiridul (timpul de retenție al glimepiridului depinde de momentul
în care ponderea mai mare va fi de solvent organic, respectiv acetonitril).
Atunci când a fost introdusă proporția de 80% acetonitril la minutul 1, timpul de retenție
al glimepiridului a fost de 2,19 minute. Odată cu modificarea gradientului (80% acetonitril la
minutul 5), timpul de retenție s-a modificat la 6,4 minute. Această modificare a permis o
81
separare eficientă a celor doi compuși, cât și posibilitatea identificării în cromatogramă a

metaboliților glimepiridului.
Conform literaturii (138), în condiții similare, metaboliții glimepiridului prezentau timpi
de retenție mai mici față de cel al glimepiridului. Prin mărirea timpului de retenție pentru
glimepirid a fost favorizată separarea cromatografică a potențialilor metaboliți și, ulterior,
identificarea acestora.
9.3.2.3. Concluzii
Metoda de analiză simultană a metforminului și glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS a

fost dezvoltată și optimizată, având următoarele caracteristici:
 Separarea cromatografică a fost realizată pe o coloană Acquity UPLC BEH C18 (50 mm
× 2,1 mm, mărimea particulelor 1,7 µm).
 Detecția a fost efectuată cu ajutorul unui ansamblu hibrid spectrometru de masă
cvadrupol-timp de zbor (Q-TOF), Xevo G2-S QTOF.
 Parametrii ESI+, modul Rezoluție, au fost stabiliți pentru detecția optimă a celor doi
compuși, prin intermediul maselor exacte: m/z 130,105 Da (metformin) și m/z 491,2311
Da (glimepirid).
 Eluția s-a realizat în gradient, folosind ca sisteme de solvenți apă cu acid formic 0,05%
(70%) și acetonitril (30%).
 Timpii de retenție au fost stabiliți prin ajustarea gradientului de eluție, având valori
constante în cadrul determinărilor: Rt = 0,4004 minute (RSD = 0,4959%) (metformin),
Rt = 6,4718 minute (RSD = 0,8190%) (glimepirid).
9.3.3. Validarea metodei de determinare cantitativă simultană a metforminului și

glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS
Validarea metodei s-a realizat conform normelor specifice: ICH (126), Bojiță și
colaboratorii, 2003 (127), Roman și colaboratorii, 2007 (128), prin stabilirea parametrilor de
validare:
9.3.3.1. Specificitatea
Datorită sistemului de detecție (MS/QTOF), specificitatea metodei pentru compușii

separați cromatografic este asigurată prin determinarea masei exacte (m/z). Figura 9.7 ilustrează
cromatogramele obținute pentru masele m/z 130,105 Da (metformin), 491,2311 Da
(glimepirid), în urma analizei unei soluții de concentrație 100 µg/L a celor doi compuși.
b.
a.
Fig. 9.7. Cromatogramele pentru: a. Metformin (100 µg/L), b. Glimepirid (100 µg/L)
82
9.3.3.2. Liniaritatea
Mod de lucru
Pentru verificarea liniarității au fost preparate soluții de metformin și glimepirid, în
domeniul 0,5 – 1000 µg/L.
Soluțiile de analizat au fost preparate prin diluții succesive cu apă purificată, utilizând
soluțiile stoc inițiale de metformin 400 mg/L și glimepirid 400 mg/L în metanol.
Ariile picurilor au fost reprezentate grafic în funcție de concentrație, pentru fiecare din
cei doi compuși analizați. Liniaritatea a fost verificată pentru două domenii de concentrație:
- metformin: 0,5 – 100 µg/L și 100 – 1000 µg/L,
- glimepirid: 1 – 100 µg/L și 100 – 1000 µg/L.
Pentru metformin, ariile obținute în cadrul determinării liniarității au fost grupate în
două domenii de concentrație: 0,5 – 100 µg/L și 100 – 1000 µg/L.
Prin reprezentarea grafică a valorilor ariilor, în funcție de concentrație, se obțin dreptele
de calibrare, pentru cele două domenii de liniaritate (fig. 9.8-9.9).
90000
y = 797.3x + 2571.5
80000 R² = 0.9962
70000
60000
Aria picului
50000
40000
30000
20000
10000
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentrația clorhidratului de metformin (µg/L)
Fig. 9.8. Dreapta de calibrare pentru determinarea metforminului prin UPLC-QTOF/MS

(domeniul 0,5 – 100 µg/L)
83
400000
350000 y = 279.37x + 69378

R² = 0.9836
300000
Aria picului 250000
200000
150000
100000
50000
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentrația clorhidratului de metformin (µg/L)

(domeniul 100 – 1000 µg/L)
Parametrii de validare, conform calculului statistic pentru dreapta de regresie, sunt

prezentați în tabelul 9.III.
Tabel 9.III. Parametri de validare pentru determinarea metforminului prin UPLC-QTOF/MS

Parametru Valoare
Domeniu de liniaritate (µg/L) 0,5-100 100-1000
y = 797,3  x + 2571,5 y = 279,37  x + 69378
Ecuația de regresie unde: y = aria picului unde: y = aria picului
x = concentrația (µg/L) x = concentrația (µg/L)
Intercept (a) 2571,5 69378
Pantă (b) 797,3 279,37
Coeficientul de corelație (r) 0,9980 0,9917
Eroarea standard (ES) 720,2003 8525,6385
Pentru glimepirid, ariile obținute în cadrul determinării liniarității au fost reprezentate

grafic, în funcție de concentrație. Au fost selectate două domenii de liniaritate: 1 – 100 µg/L și
100 – 1000 µg/L. Dreptele de calibrare pentru glimepirid, pentru cele două domenii de liniaritate
sunt reprezentate în figurile 9.10 și 9.11.
84
140000
y = 1200.3x + 1076.8
120000 R² = 0.9974
100000
Aria picului
80000
60000
40000
20000
0
0 20 40 60 80 100 120
Concentrația glimepiridului (µg/L)
Fig. 9.10. Dreapta de calibrare pentru determinarea glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS

600000
y = 455.3x + 69808
500000 R² = 0.9909
400000
Aria picului
300000
200000
100000
0
0 200 400 600 800 1000 1200
Concentrația glimepiridului (µg/L)

Prin prelucrarea statistică a datelor corespunzătoare celor două drepte de calibrare, se

obțin parametrii de validare (tabel 9.IV).
Tabel 9.IV. Parametri de validare pentru determinarea glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS

Parametru Valoare
Domeniu de liniaritate (µg/L) 1-100 100-1000
y = 1200,3  x + 1076,8 y = 455,3  x + 69808
Ecuația de regresie unde: y = aria picului unde: y = aria picului
x = concentrația (µg/L) x = concentrația (µg/L)
Intercept (a) 1076,8 69808
Pantă (b) 1200,3 455,3
Coeficient de corelație (r) 0,9986 0,9954
85
Coeficienții de regresie obținuți pentru ambele substanțe, la cele două domenii de

concentrații, au valori foarte apropiate de unitate (r² = 0,9962, r² = 0,9836, r² = 0,9974, r² =
0,9909), confirmând faptul că metoda de determinare simultană a metforminului și
glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS este liniară.
9.3.3.3. Limita de detecție și limita de cuantificare
Valorile pentru limita de detecție și limita de cuantificare se obțin prin prelucrarea

datelor fiecărei drepte de calibrare. Formulele de calcul utilizează eroarea standard și panta
dreptei de calibrare:
LD = 3,3 x ES / b
LQ = 10 x ES / b, unde:
ES = eroarea standard,
b = panta curbei de calibrare.
S-au obținut următoarele valori:

 determinarea metforminului:
o domeniul 0,5 – 100 µg/L:
LD = 2,98 µg/L,
LQ = 9,03 µg/L.
o domeniul 100 – 1000 µg/L:
LD = 100,70 µg/L,
LQ = 305,17 µg/L.
 determinarea glimepiridului:
LD = 2,52 µg/L,
LQ = 7,64 µg/L.
LD = 63,28 µg/L,
LQ = 191,76 µg/L.
8.3.3.4. Precizia
Precizia a fost stabilită prin verificarea repetabilității: precizia sistemului și precizia
metodei.
Precizia sistemului
Mod de lucru
Precizia sistemului UPLC-QTOF/MS a fost evaluată prin analiza, de 4 ori, a aceleiași
soluții de metformin și glimepirid, conform metodei.
Determinările au fost efectuate pe o soluție de concentrație de 100 µg/L în apă purificată.
Pe baza cromatogramelor obținute s-au determinat ariile picurilor pentru cele două
substanțe. Valorile au fost prelucrate statistic, cu obținerea valorii medii, a deviației standard și
a deviației standard relative.
Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 9.V.
86
Tabel 9.V. Precizia sistemului

Aria picului pentru Aria picului pentru
Nr. determinării
metformin glimepirid
1 77950,4 127085,4
2 76278,8 128246,1
3 77837,8 118400,7
4 75953,2 120445,3
Date statistice
Media 76689,93 123544,38
Deviația standard (SD) 1007,324 4854,782
Deviația standard relativă (RSD) (%) 1,313503 3,929586
Conform datelor obținute, deviația standard relativă are valori mai mici de 5% pentru
ambii compuși analizați. Rezultă faptul că sistemul UPLC-QTOF/MS este precis.
Precizia metodei
Mod de lucru
Precizia metodei a fost evaluată utilizând concentrații diferite ale soluțiilor celor doi
compuși, din domeniile de liniaritate prezentate anterior.
Fiecare probă a fost analizată conform metodei, iar pe baza cromatogramelor s-au
obținut ariile picurilor pentru metformin și glimepirid. Pe baza ecuațiilor dreptelor de calibrare,
s-au calculat concentrațiile regăsite și regăsirea procentuală, conform formulelor:
Concentrația calculată (µg/mL) = (Aria picului – Intercept) / Pantă

% regăsire = Cc x 100 / Ct, unde:
Cc = concentrația calculată (conform ecuației dreptei de calibrare) (µg/L),

Ct = concentrația teoretică (µg/L).
Valorile au fost prelucrate statistic, cu obținerea valorii medii, a deviației standard și a

deviației standard relative.
Rezultatele sunt prezentate în tabelele 9.VI (metformin) și 9.VII (glimepirid). Valorile
deviația standard selativă obținute pentru cele 4 seturi de determinări corespund ghidurilor de
validare, rezultând faptul că metoda este precisă.
87
Tabel 9.VI. Precizia metodei UPLC-QTOF/MS în determinarea metforminului

Concentrația soluției în Concentrația calculată a
clorhidrat de Aria picului clorhidratului de Regăsire (%)
metformin (µg/L) metformin (µg/L)
Domeniul 0,5 – 100 µg/L
10 10769,9 10,2827 102,827
50 40003,7 46,9487 93,8974
50 43858 51,7829 103,566
50 39061,3 45,7667 91,5334
100 80308,4 97,5002 97,5002
100 75541 91,5208 91,5208
100 75541 91,5208 91,5208
100 76108,8 92,2329 92,2329
100 78204,7 94,8617 94,8617
Date statistice
Media 95,49555
Domeniul 100 – 1000 µg/L
500 197235,5 457,6637 91,53273
750 280326 755,0847 100,678
1000 335427,1 952,3181 95,23181
1000 348799,1 1000,183 100,0183
Date statistice
Media 96,8652
Tabel 9.VII. Precizia metodei UPLC-QTOF/MS în determinarea glimepiridului

Concentrația soluției Concentrația calculată
Aria picului Regăsire (%)
în glimepirid (µg/L) a glimepiridului (µg/L)
5 7475 5,3305 106,61
10 14231,5 10,9595 109,595
25 32279 25,9953 103,981
50 59689,8 48,832 97,6639
50 58358,7 47,723 95,446
100 130741 108,026 108,026
Date statistice
Media 103,5538
100 118400,7 106,7268 106,7268
100 120445,3 111,2174 111,2174
500 278713,8 458,8311 91,76622
750 383916,2 689,8928 91,98571
Date statistice
Media 100,424
88
9.3.3.5. Acuratețea
Conform ghidurilor de validare pentru substanțele active (126), dacă metoda a fost
testată și verificată pentru parametrii specificitate, liniaritate și precizie, acuratețea este, de
asemenea, dedusă.
9.3.3.6. Concluzii
Metoda dezvoltată de determinare simultană a metforminului și glimepiridului prin

UPLC-QTOF/MS a fost validată, cu stabilirea parametrilor de validare:
 specificitate: detecția s-a realizat cu ajutorul sistemului QTOF/MS, prin determinarea
maselor exacte (m/z) pentru cei doi compuși: 130,105 (metformin), 491,2311
(glimepirid),
 liniaritate: în domeniul 0,5 – 100 µg/L (r = 0,9980), 100 – 1000 µg/L (r = 0,9917) pentru
metformin și în domeniul 1 – 100 µg/L (r = 0,9986), 100 – 1000 µg/L (r = 0,9954) pentru
glimepirid,
 limitele de detecție (LD = 2,98 µg/L pentru metformin și LD = 2,52 µg/L pentru
glimepirid) și limitele de cuantificare (LQ = 9,03 µg/L pentru metformin și LQ = 7,64
µg/L pentru glimepirid),
 precizie, cu determinarea preciziei sistemului (RSD = 1,31% pentru metformin și RSD
= 3,92% pentru glimepirid) și a preciziei metodei (RSD1 = 5,01%, RSD2 = 4,44% pentru
metformin și RSD1 = 5,57%, RSD2 = 9,99% pentru glimepirid).
Metoda UPLC-QTOF/MS este o metodă simplă și performantă pentru determinarea
simultană a metforminului și glimepiridului, cu limite de cuantificare scăzute, ce permit analiza
celor doi compuși din probe biologice.
9.4. APLICAȚII ALE METODEI DE DETERMINARE CANTITATIVĂ SIMULTANĂ

A METFORMINULUI ȘI GLIMEPIRIDULUI PRIN UPLC-QTOF/MS
PE PROBE DE SER UMAN
Aparatură
Determinările au fost efectuate la sistemul UPLC-QTOF/MS (Waters).
Centrifugarea probelor au fost realizată la centrifuga tip Heltich Universal 320R.
Soluțiile obținute din prelucrarea probelor de ser au fost filtrate prin microfiltre de 4
mm, cu mărimea porilor de 0,22 µm.
Reactivi
- glimepirid (Sigma),
- clorhidrat de propranolol (Sigma),
- glibenclamid (Sigma),
- acid formic (Sigma),
- metanol (Fluka),
- acetonitril (Sigma),
- clorură de calciu (Sigma).
Plasmă umană: Macopharma (România).
89
Condițiile de lucru și metoda de determinare pentru metformin și glimepirid prin UPLC-

QTOF/MS sunt aceleași cu cele descrise anterior.
Obținerea serului uman

Determinările au fost realizate pe ser obținut prin tratarea plasmei cu soluție de clorură
de calciu 20%: la 20 mL plasmă se adaugă 0,2 mL clorură de calciu 20%. După păstrarea 24
ore la 4 oC are loc centrifugarea soluției timp de 5 minute la 8000 rpm. Supernatantul obținut
reprezintă serul pentru determinările ulterioare (129).

Prelucrarea datelor s-a realizat cu ajutorul programului Microsoft Office Excel 2013.
9.4.2. Optimizarea metodei de extracție a metforminului și glimepiridului
Metodele de extracție menționate în literatură pentru izolarea simultană a metforminului

și glimepiridului din probe biologice de ser sau plasmă umană se bazează, mai ales, pe
precipitarea proteinelor cu acetonitril sau metanol, extracție lichid-lichid și extracție în fază
solidă.
Pentru a optimiza o metodă de extracție a celor doi compuși, a fost testată metoda de
precipitare a proteinelor cu acetonitril, urmată de tratarea precipitatului cu solvenți organici, în
vederea izolării structurilor insolubile în apă (compușii studiați sau metaboliți ai acestora)
(90,114). S-au parcurs următorii pași:
- obținerea serului îmbogățit: 492,5 µL ser + 7,5 µL soluție 20 µg/L metformin și
glimepirid,
- 0,5 mL ser îmbogățit + 1 mL acetonitril,
- centrifugare timp de 15 minute la 9000 rpm,
- filtrarea supernatantului,
- analiza prin UPLC-QTOF/MS.
Randamentul de extracție pentru metformin a fost mai scăzut de 10%, iar pentru
glimepirid s-a obținut un procent de 60%.
Ulterior, s-au testat diferite ajustări ale metodei inițiale:
- precipitarea proteinelor cu metanol,
- tratarea probei inițiale cu acid formic,
- evaporarea supernatantului obținut și reluare cu fază mobilă,
- reluarea reziduului obținut după evaporare cu diferite proporții acetonitril:apă,
- modificarea proporției ser:acetonitril de la 0,5:1 la 0,1:0,5 și 0,1:1,
- diluarea cu apă a supernatantului obținut după precipitarea cu acetonitril.
Rezultatele variantelor menționate au arătat randamente de extracție pentru metformin
situate între 10 și 20%, deși procentele pentru glimepirid au fost mai mari de 70%.
În concluzie, s-a recurs la folosirea standardelor interne, câte o substanță pentru fiecare
din cei doi compuși studiați.
Alegerea standardelor interne

S-au utilizat două standarde interne, propranolol și glibenclamid, pentru a obține o
cuantificare eficientă a celor doi compuși, metformin și respectiv, glimepirid. Aceștia sunt
menționați în literatură ca standard interne în metode similare de determinare cantitativă a
metforminului sau glimepiridului cu detecție prin spectrometrie de masă. Totodată, pot fi
folosiți ca standard intern și metformin deuterat, diazepam, carbamazepină, metoprolol,
fenformin, gliclazid (101,104,111,117,139).
90
OH
H
O N
Figura 9.12. Structura chimică a propranololului
Propranololul (fig. 9.12) a fost ales pentru metformin datorită comportării similare în
cadrul separării (substanță polară), masei moleculare relativ mici (mai apropiată metforminului)
și cu arie a picului semnificativ mai mare față de ceilalți compuși testați ca standard intern.
O
O O
S
O N NH
H
Cl
N
H
OCH3
Figura 9.13. Structura chimică a glibenclamidului
Glibenclamidul (fig. 9.13) prezintă masa (m/z) foarte apropiată de a glimepiridului

(494,15 pentru glibenclamid și 491,23 pentru glimepirid) și comportare similară în separarea
cromatografică.
Modul de lucru al metodei optimizate pentru extracția metforminului și

glimepiridului din probe de ser
S-a utilizat probă de ser uman îmbogățită cu metformin, glimepirid și cele două
standarde interne, astfel încât concentrațiile teoretice obținute în urma determinării să fie 100
µg/L (pentru metformin și glimepirid) și 50 µg/L (pentru standardele interne).
După tratare cu solventul de precipitare, probele au fost centrifugate, iar supernatantul
analizat prin UPLC-QTOF/MS după o dublă microfiltrare.
91
0,1 mL ser
+
10 µL soluție 1 mg/L (propranolol+glibenclamid)
|
agitare
+
1 mL acetonitril
|
agitare
|
|
supernatant
|
evaporare sub curent de azot
|
reziduu
+
0,2 mL apă purificată
|
agitare
|
|
microfiltrare x 2
|
analiză
Fig. 9.14. Schema generală de extracție a metforminului și glimepiridului
În urma determinărilor, s-a obținut metoda optimă de extracție simultană a

metforminului și glimepiridului din probe de ser uman prin precipitarea cu acetonitril, conform
protocolului de lucru prezentat în figura 9.14.
Pentru a putea verifica reproductibilitatea metodei de extracție, cât și pentru a calcula
concentrațiile compușilor în probe reale, a fost realizată o scară etalon în domenuiul de
concentrații 0,5 – 100 µg/L pentru metformin și 1 – 100 µg/L glimepirid, iar pentru cele două
standarde interne, concentrația fixă de 50 µg/L.
Rezultatele metodei optimizate de extracție a metforminului și glimepiridului

Pentru metoda stabilită, caracteristicele obținute pentru compușii studiați și pentru
standardele interne sunt prezentate în tabelul 9.VIII.
Tabel 9.VIII. Caracteristicile de identificare ale compușilor analizați

Metformin Glimepirid Propranolol Glibenclamid
tR (minute) 0,41 6,51 1,09 6,45
Masă exactă (Da), [H+] 130,1089 491,2353 260,1654 494,1499
Analiza UPLC-QTOF/MS a celor patru compuși este ilustrată prin cromatogramele

obținute în urma separării (fig. 9.15) și prin spectrele de detecție MS (fig. 9.16).
92
d.
c.
b.
a.
Fig. 9.15. Cromatogramele pentru: a. Metformin (100 µg/L), b. Propranolol (50 µg/L),
c. Glimepirid (100 µg/L), d. Glibenclamid (50 µg/L)
d.
Metformin
0.6
0.5 y = 0.2626x + 0.0154 c.
0.4 R² = 0.9895
0.3
0.2
0.1
0 b.
0 0.5 1 1.5 2 2.5
a.
Fig. 9.16. Spectrele MS pentru: a. Metformin (100 µg/L), b. Propranolol (50 µg/L),
c. Glimepirid (100 µg/L), d. Glibenclamid (50 µg/L)
93
Conform determinărilor realizate pentru obținerea scării etalon, s-au reprezentat grafic
rapoartele ariilor în funcție de rapoartele concentrațiilor, conform figurilor 9.17 și 9.18.
0.6
y = 0.2626x + 0.0154
0.5 R² = 0.9895
0.4
c/d
0.3
0.2
0.1
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
a/b
a – concentrația metforminului (µg/L)

b – concentrația propranololului (50 µg/L)
c – aria picului metforminului
d – aria picului propranololului

(domeniul 0,5 – 100 µg/L)
3
y = 1.3692x - 0.0851
2.5 R² = 0.9815
1.5
c/d
0.5
0
0 0.5 1 1.5 2 2.5
-0.5
a/b
a – concentrația glimepiridului (µg/L)

b – concentrația glibenclamidului (50 µg/L)
c – aria picului glimepiridului
d – aria picului glibenclamidului

94
Pe baza acestei calibrări, în tabelul 9.IX sunt sumarizați parametri de calibrare pentru
determinarea metforminului și glimepiridului prin UPLC-QTOF/MS cu ajutorul celor două
standard interne (propranolol pentru metformin și glibenclamid pentru glimepirid).
Tabel 9.IX. Parametri de calibrare

Valoare
Parametru
Metformin Glimepirid
Domeniu de liniaritate (µg/L) 0,5-100 1-100
Ecuația dreptei yA = 0,2626·xB + 0,0154 y = 1,3692·x – 0,0851
Intercept (a) 0,0154 -0,0851
Pantă (b) 0,2626 1,3692
Coeficient de corelație (r) 0,9947 0,9907
LD (µg/L) 6,601 10,621
LQ (µg/L) 20,003 32,185
A – aria compusului studiat/aria standardului intern
B – concentrația compusului studiat (µg/L)/concentrația standardului intern (50 µg/L)
Reproductibilitatea metodei de extracție

Metoda de extracție simultană a metforminului și glimepiridului din probe de ser uman
a fost verificată pentru reproductibilitate. S-au preparat șase probe de ser îmbogățite, conform
protocolului prezentat anterior. Fiecare probă a fost analizată de două ori, determinându-se, în
final, procentul de regăsire pentru metformin și glimepirid.
Formulele de calcul pe baza cărora s-a determinat regăsirea procentuală sunt:
 determinarea metforminului:
Xc = (Y – 0,0154) / 0,2626
Cc = Xc · CSI
Cr = Cc x Fd
Xc = Concentrația calculată a clorhidratului de metformin în ser (µg/L)/Concentrația

standardului intern,
Y = aria metforminului/aria standardului intern,
Cc = concentrația calculată a clorhidratului de metformin în ser (µg/L),
CSI = concentrația standardului intern (50 µg/L)
Cr = concentrația regăsită a clorhidratului de metformin în ser (µg/L),
Ct = concentrația teoretică a clorhidratului de metformin în ser (100 µg/L),
 determinarea glimepiridului
Xc = (Y + 0,0851) / 1,3692
Cc = Xc · CSI
Cr = Cc x Fd
95
Xc = Concentrația calculată a glimepiridului în ser (µg/L)/Concentrația standardului

intern,
Y = aria glimepiridului/aria standardului intern,
Cc = concentrația calculată a glimepiridului în ser (µg/L),
Cr = concentrația regăsită a glimepiridului în ser (µg/L),
Ct = concentrația teoretică a glimepiridului în ser (100 µg/L),
Rezultatele sunt prezentate în tabelul 9.X.
Tabel 9.X. Reproductibilitatea metodei de extracție

Concentrația MF/ Regăsirea Aria Concentrația Regăsirea
Aria MF1/
Concentrația pentru MF GLIM3/aria GLIM/ pentru
aria PROP2
PROP (%) GLIB 4
Concentrația GLIB GLIM (%)
0,208673253 0,735999 36,79993 2,141408993 1,6261386 81,30693
0,201790005 0,709787 35,48934 2,390263106 1,8078901 90,3945
0,230714224 0,819932 40,99662 3,817910971 2,8505777 142,5289
0,202514242 0,712545 35,62724 2,584356004 1,9496465 97,48233
0,286294264 1,031585 51,57926 2,704356408 2,0372892 101,8645
0,267650842 0,96059 48,02948 2,829723354 2,1288514 106,4426
0,337161076 1,22529 61,26449 2,343351351 1,7736279 88,6814
0,361902491 1,319507 65,97534 2,257429976 1,7108749 85,54375
0,221916625 0,78643 39,32152 2,375283447 1,7969496 89,84748
0,224369925 0,795773 39,78864 2,786594381 2,097352 104,8676
0,200017459 0,703037 35,15184 3,321594619 2,4880913 124,4046
0,21264678 0,75113 37,55651 3,219438191 2,413481 120,6741
1 – metformin
2 – propranolol
3 – glimepirid
4 – glibenclamid
Regăsirea medie pentru cele două substanțe este de 43,96% pentru metformin și
102,83% pentru glimepirid.
Discuții
Aplicarea metodei UPLC-QTOF/MS pentru determinarea simultană a metforminului și

glimepiridului din probe biologice a necesitat optimizarea unei metode de extracție cu
randament ridicat a celor doi compuși din ser uman.
Deși numeroase studii din publicațiile de specialitate au raportat regăsiri ale
metforminului de peste 80% în urma extracției prin precipitarea proteinelor serice, metoda
abordată în prezentul studiu a obținut inițial regăsiri procentuale foarte scăzute. Înafara testărilor
care au variat diferiți parametri ai acestei metode de extracție cu precipitarea proteinelor
(modificarea proporțiilor în volumele de soluții luate în lucru, utilizarea evaporării solventului
de precipitare, modificarea componentelor soluției pentru reluarea reziduului, ș.a.), s-au testat
și modificări ale metodei:
- schimbarea gradientului de eluție pentru a obține un timp de retenție mai mare pentru
metformin (față de cel inițial de 0,41 minute).
S-a considerat că un timp de retenție mai mare pentru metformin va determina o detecție
mai ridicată pentru compus, iar înaintarea pe coloană cromatografică va avea ca urmare un pic
96
cromatografic lipsit de impurități. Cu alte cuvinte, principala consecință va fi creșterea regăsirii

procentuale pentru metformin.
Rezultatele au fost însă similare, cu timpi de retenție în intervalul 0,45 – 1,0 minue.
Picurile cromatografice obținute nu au prezentat intensități mai ridicate, iar dezavantajul major
al modificării metodei a fost pentru determinarea glimepiridului: schimbarea gradientului de
eluție a afectat separarea compusului, acesta prezentând un pic foarte lat, necorespunzător, și
deci o separare ineficientă.
- schimbarea detecției din modul MS în modul MS/MS: Testările au arătat intensități mult
mai scăzute ale semnalelor înregistrate pentru compușii detectați. Astfel, metoda nu a
fost aplicată.
- schimbarea modului de ionizare: din modul ESI în modul APCI: Rezultatele au fost, de
asemenea, necorespunzătoare.
Prin urmare, nu a fost făcută nicio modificare din cele testate.
Determinarea glimepiridului a prezentat randamente de extracție optime (mai ridicate
de 75%), însă în cazul analizei simultane a metforminului și glimepiridului a fost necesară
obținerea unor regăsiri procentuale ridicate pentru ambele substanțe.
Varianta care a avut rezultate optime și constante a fost introducerea standardelor interne
în cadrul determinărilor. Avantajul acestei ajustări este corectarea erorilor ce pot să apară în
cadrul determinării. Deoarece substanțele utilizate ca standarde interne au caracteristici similare
compușilor inițiali (propranolol cu metformin, glimepirid cu glibenclamid), variațiile ce pot să
apară mai ales în cadrul separării cromatografice vor afecta atât compusul analizat, cât și
standardul intern corespunzător. Prin utilizarea raportului ariilor obținute, se realizează corecția
semnalului obținut pentru fiecare compus analizat (metformin sau glimepirid), cu rezultate mai
bune pentru metoda dezvoltată.
Deoarece metoda este specifică, liniară și reproductibilă, va putea fi utilizată în cadrul
prelucrării și analizei probelor de ser uman pentru determinarea simultană a metforminului și
glimepiridului.
9.4.4. Concluzii
A fost dezvoltată și optimizată o metodă simplă și eficientă de extracție a metforminului

și glimepiridului din ser uman:
- S-a utilizat metoda de precipitare a proteinelor serice cu acetonitril.
- Metoda a fost ajustată prin introducerea standardelor interne:
o propranolol pentru metformin,
o glibenclamid pentru glimepirid.
o Determinarea metforminului și glimepiridului utilizând standarde interne este specifică
și liniară (coeficientul de corelație pentru metformin r = 0,9947 și pentru glimepirid r =
0,9907).
o Randamentele de extracție obținute au fost de 43,96% pentru metformin și 102,83%
pentru glimepirid.
o Metoda este reproductibilă, iar utilizarea standardelor interne corectează posibilele erori
de determinare individuale.
o Aplicarea metodei UPLC-QTOF/MS se poate realiza pe probe de ser uman, limitele de
detecție și cuantificare permițând determinarea concentrațiilor terapeutice ale celor doi
compuși:
o determinarea metforminului:
LD = 6,601 µg/L,
LQ = 20,003 µg/L.
97
o determinarea glimepiridului:
LD = 10,621 µg/L,
LQ = 32,185 µg/L.
9.5. DETERMINAREA METFORMINULUI LA UN GRUP DE PACIENȚI

INTERNAȚI ÎN CLINICA DE DIABET, NUTRIȚIE ȘI BOLI METABOLICE –
STAȚIONAR, SPITALUL CLINIC JUDEȚEAN DE URGENȚE “SF. SPIRIDON”
IAȘI
Metoda de determinare simultană a metforminului și glimepiridului prin UPLC-

QTOF/MS a fost aplicată pe produse biologice de ser uman. A fost utilizată metoda optimizată
de izolare a celor doi compuși, cu precipitarea proteinelor serice cu acetonitril și utilizarea
standardelor interne.
Grupul de pacienți
Pacienții înrolați în studiu au fost internați în Clinica de Diabet, Nutriție și Boli
Metabolice – Staționar, din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași.
Diagnosticul principal a fost diabet zaharat de tip 2, iar medicația antidiabetică includea
metformin, administrare orală.
Pacienții au semnat formularul de consimțământ informat pentru prelevarea și utilizarea
probelor de sânge, cât și pentru utilizarea datelor din foile de observație.
Studiul a primit avizul Comisiei de Etică a Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf.
Spiridon” Iași (nr. 11227/11.03.2015) și avizul Comisiei de Etică a Cercetării a Universității de
Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași (8.04.2015).
Obținerea serului
Sângele a fost recoltat în recipiente de tip vacutainer de capacitate 5 mL, cu activator de
coagulare. Probele au fost centrifugate timp de 5 minute la 3000 rpm, supernatantul obținut
fiind serul utilizat în determinările ulterioare.
Determinarea metforminului
Probele de ser au fost prelucrate conform metodei stabilite anterior de extracție a
metforminului prin precipitarea proteinelor cu acetonitril și utilizarea standardelor interne.
Determinările au fost efectuate la sistemul UPLC-QTOF/MS conform metodei, pentru fiecare
probă realizându-se două analize identice.
Calcularea concentrației metforminului din probele de ser

S-au utilizat ecuațiile dreptelor de calibrare obținute în subcapitolul anterior (9.4.3)
pentru a calcula concentrația probei în funcție de aria picurilor obținute. S-a realizat ajustarea
cu procentul de regăsire și cu diluția realizată conform modului de lucru. Formulele de calcul
sunt următoarele:
Xc = (Y – 0,0154) / 0,2626
Cc = Xc · CSI
Cr = Cc x Fd
Cf = Cr · 100 / 43,96 , unde:
98
Xc = Concentrația calculată a clorhidratului de metformin în ser (µg/L)/Concentrația

standardului intern,
Y = aria metforminului/aria standardului intern,
Cc = concentrația calculată a clorhidratului de metformin în ser (µg/L),
Cr = concentrația regăsită a clorhidratului de metformin în ser (µg/L),
Cf = concentrația finală a clorhidratului de metformin în ser (100 µg/L),
Rezultatele obținute în urma determinărilor sunt sumarizate în tabelul 9.XI.
Tabel 9.XI. Rezultatele analizei metforminului din probele de ser uman

Date pacient Rezultatele determinării metforminului în ser
Concentrația
Nr. Posologia Aria Concentrația
crt. Sex Greutate medie a
tratamentului metforminului/aria metforminului
(M/F) (kg) metforminului în
cu metformin propranololului în ser (µg/L)
ser (µg/L)
0,287967 236,1139
1 F 72 1000 mg x 2/zi 268,94
0,363758 301,7678
0,748479 635,0358
2 M 109 1000 mg x 3/zi 681,65
0,856098 728,2624
2,662109 2292,734
3 M 85 1000 mg x 1/zi 2346,857
2,787065 2400,979
0,059234 37,97137
4 F 74 1000 mg x 3/zi 34,62979
0,051519 31,28821
1,133538 968,5965
5 M 100 1000 mg x 2/zi 967,4488
1,130888 966,301
0,755026 640,7073
6 M 91 1000 mg x 2/zi 571,3429
0,594879 501,9784
0,801739 681,1726
7 F 76 1000 mg x 3/zi 661,0527
0,755286 640,9327
1,077564 920,1091
8 F 84 1000 mg x 2/zi 818,597
0,843195 717,0848
0,647171 547,2767
9 F 90 850 mg x 3/zi 551,1829
0,656189 555,0891
0,173869 137,2749
10 M 105 1000 mg x 3/zi 227,732
0,382714 318,189
0,134509 103,1791
11 F 93 850 mg x 2/zi 116,4951
0,165253 129,8111
0,49577 416,125
12 M 96 1000 mg x 3/zi 515,7181
0,725709 615,3111
1,108472 946,883
13 F 69 1000 mg x 2/zi 1039,28
1,321796 1131,677
1,020204 870,4204
14 F 124 1000 mg x 3/zi 871,7543
1,023284 873,0881
0,405487 337,9159
15 M 70 1000 mg x 1/zi 426,1115
0,609111 514,307
Corespunzător probei serice celui de-al 8-lea pacient din tabelul anterior, s-au înregistrat
cromatogramele obținute în sistemul UPLC-QTOF/MS (fig. 8.19).
99
b.
a.
Fig. 9.19. Cromatogramele obținute prin prelucrarea unei probe de ser de la un pacient aflat sub
tratament cu metformin: a. m/z 130,11 (metformin), b. m/z 491,23 (glimepirid)
Conform figurii 9.19, se observă prezența metforminului (m/z 130,11) și absența

glimepiridului (m/z 491,23).
9.5.3. Concluzii
 Au fost analizate 15 probe de ser obținute de la pacienți aflați sub tratament cu

metformin.
 S-au utilizat precipitarea proteinelor cu acetonitril și standardele interne pentru o
extracție optimă a metforminului din probele de analizat.
 Rezultatele au ilustrat faptul că metoda este aplicabilă pentru determinarea
concentrațiilor serice terapeutice și toxice de metformin.
 Nivelurile serice obținute pentru metformin se încadrează în intervalul 34,629 –
2346,857 µg/L, ce corespunde cu valorile raportate în literatura de specialitate (30).
100
10. STUDIUL CLINIC AL PACIENȚILOR DIAGNOSTICAȚI

CU DIABET ZAHARAT INTERNAȚI ÎN CLINICA DE
DIABET, NUTRIȚIE ȘI BOLI METABOLICE – STAȚIONAR,
SPITALUL CLINIC JUDEȚEAN DE URGENȚE
“SF. SPIRIDON” IAȘI
10.1. PREZENTAREA UNOR CAZURI CLINICE PRIVIND PRECAUȚIILE

TRATAMENTULUI CU METFORMIN
10.1.1. Introducere
Metforminul reprezintă un medicament bine tolerat pentru pacienți și cu largă utilizare

în terapia antidiabetică orală. Manifestările adverse mai frecvente sunt de natură gastro-
intestinală, dar inițierea terapiei cu doze crescătoare ameliorează semnificativ tabloul clinic al
acestor efecte adverse.
În cazul acidozei lactice, efectul advers grav asociat terapiei cu metformin, prezintă o
incidență foarte scăzută, fiind luați în calcul mai ales factorii de risc asociați: vârstă, patologie
cardiacă, afectare renală.
Astfel, au fost luate în discuție cazuri clinice care au în vedere aceste precauții ale
tratamentului cu metformin, la pacienți din cadrul Clinicii de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice
a Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași.
10.1.2. Prezentarea cazurilor clinice
10.1.2.1. Cazul 1
Într-un studiu descriptiv retrospectiv realizat în perioada mai-iulie 2013 în cadrul

Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași, au fost analizate 529 foi de observație
ale pacienților diagnosticați cu diabet zaharat, în vederea selectării și prelucrării statistice a
cazurilor tratate cu metformin.
Din totalul cazurilor analizate, este menționat un caz de terapie cu metformin asociată
cu efecte adverse manifeste gastro-intestinale.
În luna iunie 2012, unei paciente de sex feminin, din mediul urban, în vârstă de 80 ani,
cu o greutate de 52 kg, i se inițiază terapie orală antidiabetică cu metformin, 850 mg o dată pe
zi. Consecutiv acestei terapii medicamentoase, pacienta acuză dureri abdominale intense și
scaune diareice.
Tratamentul antidiabetic ii este schimbat cu gliclazid 30 mg/zi. Ulterior întreruperii
tratamentului cu metformin, are loc și ameliorarea manifestărilor gastro-intestinale.
101
10.1.2.2. Cazul 2
Un bărbat de 49 de ani se prezintă în luna noiembrie 2015 la Clinica de Diabet, Nutriție

și Boli Metabolice – Staționar, pentru internare de zi și control de rutină. Pacientul este obez,
cu importantă patologie cardiovasculară, diagnosticat cu diabet zaharat din anul 2002,
insulinotratat din 2009.
Investigațiile au arătat control glicemic de durată precar (HbA1c = 13,4%),
hiperglicemie (379 mg/dL), hipertrigliceridemie (1242 mg/dL).
Pacientul era sub tratament oral cu metformin, 1000 mg o dată pe zi. Se constată
ecocardiografic hipokinezie difuză (contracție deficitară a mușchiului miocardic), fapt ce
limitează utilizarea metforminului. I s-a administrat insulină, asociată ulterior cu acarboză,
fibrați și heparină cu greutate moleculară mică.
Pacientul este transferat pentru spitalizare continuă în Clinica de Diabet, Nutriție și Boli
Metabolice, unde continuă terapia medicamentoasă și recuperarea de specialitate.
După 12 zile, la externarea pacientului, s-au constatat obținerea lentă a echilibrului
glicemic și ameliorarea lentă a profilului lipidic în dinamică, iar recomandările au fost: dietă
hipolipidică, hiposodată, insulinoterapie asociază cu acarboză, monitorizarea profilului lipidic,
evaluare cardiologică periodică și continuarea controalelor periodice prin Cabinetele Centrului
Clinic de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice Iași.
Cazurile prezentate reprezintă două situații clinice în care terapia antidiabetică cu

metformin este întreruptă. Cauzele acestei decizii medicale este asociată unor efecte adverse ale
terapiei cu metformin:
- Tulburările gastro-intestinale
Descrise în cazul 1, tulburările de la nivel digestiv au determinat întreruperea
tratamentului cu metformin. Afectarea gastro-intestinală este cea mai frecventă reacție adversă
asociată terapiei cu metformin, îndeosebi la inițierea terapiei (2). Managementul acestui efect
advers și creșterea complianței pacientului sunt realizate prin administrarea metforminului după
mese și inițierea terapiei cu creșterea treptată a dozelor până la atingerea celor optime. De
asemenea, pentru pacienta din cazul 1, intensitatea manifestărilor gastro-intestinale a fost
pronunțată, putând fi asociată și cu vârsta înaintată (80 de ani), iar continuarea tratamentului cu
metformin în doze mici nu a fost reprezentat o variantă viabilă.
- Acidoza lactică
Considerată un efect advers particular al metforminului, acidoza lactică se manifestă
rar(1), însă consecințele pot fi grave (2). Conform cazurilor manifeste prezentate în publicațiile
de specialitate, acidoza lactică asociată terapiei cu metformin nu este corelată cu o eventuală
supradozare, apariția acesteia fiind favorizată mai ales de situații particulare: vârsta înaintată,
insuficiență cardiacă, afectare renală și altele.
Cazul 2 prezentat descrie, în cadrul patologiei asociate recent descoperite, o formă de
insuficiență cardiacă (hipokinezie difuză - contracție deficitară). Consecutiv, este luată decizia
întreruperii tratamentului cu metformin – medicație îndelungată în istoricul pacientului. Astfel,
este evitat riscul apariției acidozei lactice, iar controlul glicemic optim va fi asigurat de
alternativele terapeutice care nu prezintă precauții sau contraindicații asociate insuficienței
cardiace.
102
10.1.4. Concluzii
 Au fost prezentate două cazuri clinice în care terapia cu metformin a fost întreruptă.
 Măsura a reprezentat o precauție pentru pacientul în cauză, fie pentru a îndepărta
efectele adverse manifeste asociate tratamentului (tulburări gastro-intestinale), fie
pentru a preveni un efect advers cu potențial grav al metforminului (acidoza lactică).
 Alternativele terapeutice antidiabetice orale au fost: compus sulfonilureic de generația
a 2-a (gliclazid) – cu tolerabilitate mai bună la nivel gastro-intestinal și acarboza – fără
risc asociat de declanșare a acidozei lactice.
10.2. INFLUENȚA TRATAMENTULUI CU METFORMIN ASUPRA NIVELULUI

SERIC DE VITAMINĂ B12
10.2.1. Introducere
Medicamentul antidiabetic oral metformin este incriminat în scăderea nivelului seric de

vitamină B12. În publicațiile de specialitate sunt raportate studii clinice și prezentări de caz în
care este analizată această ipoteză. Această reacție adversă este menționată în publicațiile
enciclopedice (30), cât și în ultimele cercetări publicate (140,141).
Pentru teritoriul țării nu au fost efectuate studii care să investigheze influența
tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamină B12. Având ca punct de plecare
aceste aspecte, prezentul studiu își propune:
- realizarea unui studiu clinic transversal care să investigheze influența medicației
antidiabetice cu metformin asupra vitaminei B12,
- analiza descriptivă a grupurilor de pacienți luați în studiu,
- prezentarea corelațiilor posibile între nivelul vitaminei B12 și caracteristicile grupurilor
de pacienți analizați,
- analiza statistică a ipotezelor de lucru pentru grupul de pacienți studiat, în vederea
stabilirii validității acestora:
o tratamentul cu metformin scade nivelul seric de vitamină B12,
o durata tratamentului cu metformin influențează nivelul seric de vitamină B12,
o durata de la diagnosticarea cu diabet zaharat nivelul seric de vitamină B12,
o terapia cu metformin influențează concentrația sanguină a acidului uric,
o concentrația serică a metforminului influențează nivelul seric de vitamină B12.
10.2.2.1. Designul studiului
Durată
Studiul a avut o durată de 9 luni.
Grupuri pacienți:
- pacienți aflați în tratament cu metformin (Grupul 1/DA),
- pacienți care nu au și nu au avut tratament antidiabetic cu metformin (Grupul 2/NU).
Criterii de includere
- pacienți diagnosticați cu diabet zaharat, aflați în evidența Clinicii de Diabet, Nutriție și
Boli Metabolice,
103
- vârsta de minim 18 ani.
Criterii de excludere
- oricare din situațiile care determină:
o creșterea nivelului seric de vitamina B12: insuficiență renală, tratament cu
vitamina B12, leucemie, hepatită acută/cronică, ciroză, insuficiență cardiacă
congestive severă, BPOC,
o scăderea nivelului seric de vitamina B12: anemie pernicioasă, malabsorbția
vitaminei B12 din alimente, insuficiență pancreatică, boli ileale, consum de
alcool, administrarea unor medicamente (anticonvulsivante, acid ascorbic,
colestiramină, clorpromazină, colchicină, neomicină, acid paraaminosalicilic,
ranitidină, rifampicină, contraceptive orale),
- femei însărcinate,
- dietă vegetariană.
Considerații etice
Studiul a primit avizul Comisiei de Etică a Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf.
Spiridon” Iași (nr. 11227/11.03.2015) și avizul Comisiei de Etică a Cercetării din cadrul
Universității de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași (8.04.2015).
Anterior demarării studiului, se realizează informarea pacienților, cu semnarea
consimțământului. Un exemplar al consimțământului informat rămâne în posesia pacientului,
iar un exemplar este păstrat de către echipa de cercetare.
10.2.2.2. Protocol de lucru
Culegerea datelor pacienților

După primirea acceptului din partea pacientului de participare la studiu, sunt centralizate
datele din foile de observație și din biletul de externare. Sunt utilizate:
- datele de identificare pacient: nume și prenume, sex, vârstă, mediu de proveniență,
- date clinice: greutate, IMC , tensiune arterială,
- diagnosticul principal și patologiile asociate: prezența diabetului zaharat, durata de la
diagnosticare,
- medicația: medicamentele antidiabetice prescrise, durata administrării, medicația
asociată diagnosticelor secundare,
- analizele de laborator: rezultatele investigațiilor clinice și paraclinice efectuate la
internarea pacientului, concentrația serică de vitamină B12,
- alte observații: fumător sau nefumător.
Pacienții sunt grupați conform criteriilor de includere în studiu: cei care au primit
tratament cu metformin (grupul DA) și cei care nu au avut tratament cu această substanță
medicamentoasă (grupul NU).
Recoltare probelor de sânge și obținerea probelor de ser

Recoltarea probelor de sânge venos (5-10 mL) a fost realizată de către personalul
specializat (asistente medicale), în cadrul controalelor de rutină la Clinica de Diabet, Nutriție și
Boli Metabolice, Spitalul Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași.
După aproximativ o oră de la recoltare, probele au fost centrifugate timp de 5 minute la
3000 rpm. Supernatantul obținut reprezintă serul utilizat pentru determinările ulterioare. A fost
separat și depozitat în flacoane de tip Eppendorf. Probele de ser au fost congelate la – 18 oC
până în momentul analizei.
104
Analiza de laborator
Determinarea serică a vitaminei B12 s-a realizat în cadrul Laboratorului de analize
medicale a Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași. Consecutiv determinării
se elaborează buletinele de analiză aferente, pentru fiecare pacient, avizate de personalul de
specialitate.
Interpretarea statistică
Prelucrarea statistică a datelor obținute a fost realizată cu ajutorul programului
Microsoft Office Excel 2013.
10.2.2.3. Aparatură
 Centrifugă Universal 320 Hettich D-78532 Tuttlingen, tip 1406 (Germania).
 Determinarea vitaminei B12 din probele de ser s-a realizat la sistemul Immulite 2000
(producător: Siemens Healthcare Diagnostics) (fig. 10.1).
Immulite 2000 Vitamin B12 este o determinare în fază solidă, bazată pe
chemiluminiscență competitivă imunoenzimatică, ce implică o procedură automată de
denaturare alcalină.
Specificații aparat Immulite 2000:
Reactivi/Consumabile: Vitamin B12 200 teste/kit, Probe Cleaning Kit, Probe Wash,
Reaction Tubes, Substrate,
Domeniu de analiză: 150-1000 pg/mL,
Specificitate: Anticorpul este înalt specific pentru vitamina B12,
Bilirubină: Prezența bilirubinei în concentrații de până la 200 mg/L nu are niciun efect
asupra rezultatelor, în precizia determinării.
Hemoliză: Prezența hemoglobinei în concentrații de până la 417 mg/dL nu are niciun
efect asupra rezultatelor, în precizia determinării.
Lipemie: Prezența trigliceridelor în concentrații de până la 4000 mg/dL nu are niciun
efect asupra rezultatelor, în precizia determinării.
Volum necesar: 75 µL ser sau plasmă heparinizată.
Figura 10.1. Elementele componente ale Immulite 2000 (Manual de utilizare)
105
10.2.3. Caracterizarea grupurilor de pacienți luați în studiu
Metodă
Au fost centralizate datele din foile de observație ale pacienților înrolați în studiu, în
perioada aprilie – decembrie 2015.
Datele pacienților din studiu au fost grupate în:
-date de identificare ale pacienților (vârstă, sex, mediu de proveniență),
-date de investigație clinică (greutate, IMC, tensiune arterială),
-patologie (diagnostic principal și diagnostice secundare),
-date farmacologice (medicația antidiabetică orală și injectabilă, posologie),
-terapia cu metformin (durata tratamentului, posologie),
-medicația asociată (corespunzătoare diagnosticelor secundare),
-date paraclinice (determinările unor parametri de laborator: glicemie, hemoglobină glicozilată,
uree, creatinină, colesterol, trigliceride, acid uric).
S-a respectat, de asemenea, distribuția pacienților în cele două grupuri de studiu: cu și
fără tratament cu metformin.
Datele obținute au fost prelucrate statistic în vederea caracterizării grupurilor de pacienți
aflați în studiu.
 Caracterizarea în funcție de vârstă și sex
Numărul total de pacienți luați în studiu a fost de 103, distribuția în cele două grupuri
de analiză fiind inegală:
- 72 pacienți cu tratament cu metformin (Grupul 1),
- 31 pacienți care nu au avut tratament cu metformin (Grupul 2).
Din totalul de pacienți luați în studiu, cei de sex feminin sunt majoritari, cu un procent
de 54,37%. În tabelul 10.I sunt descrise proporțiile grupurilor 1 și 2 în funcție de sex, împreună
cu vârsta medie pentru fiecare categorie.
Tabel 10.I. Caracterizarea în funcție de vârstă și sex

Sex Număr pacienți Procent (%) Vârsta medie (ani)
Total pacienți
Feminin 56 54,37 61,20
Masculin 47 45,63 59,80
Total 103 100 60,57
Pacienți cu tratament cu metformin (Grupul 1)
Feminin 43 59,72 63,14
Masculin 29 40,28 63,29
Total 72 100 63,18
Pacienți fără tratament cu metformin (Grupul 2)
Feminin 13,00 41,94 54,07
Masculin 18,00 58,06 54,69
Total 31,00 100,00 54,30
 Mediul de proveniență al pacienților
Din punct de vedere al mediului de proveniență pentru pacienții înrolați în studiu,

structura celor 103 cazuri este următoarea:
106
- 45 pacienți provin din mediul urban,

- 29 pacienți provin din mediul rural,
- pentru 29 de cazuri nu este menționată localitatea de domiciliu.
 Analiza pacienților în funcție de greutatea corporală, indicele de masă corporală

și gradul de obezitate
Media valorilor obținute pentru greutatea corporală a pacienților este de 87,13 kg, cu
deviație standard (SD) de 18,42. Indicele de masa corporală are valoarea medie de 32,25 kg/m2
(SD = 7,13). Tabelul 10.II centralizează numărul de pacienți corespunzător distribuției pe sexe,
intervale ale IMC și diagnostic de obezitate.
Tabel 10.II. Indicele de masă corporală și gradul de obezitate
Tratament IMC (kg/m2) Obezitate (grad)

Nr.
cu Sex
cazuri Nu este Nu este
metformin >25 25-30 30-35 35-40 >40 1 2 3
menționat menționat
DA F 43 1 8 17 11 6 0 15 10 5 13
DA M 29 2 10 9 3 2 3 8 4 2 15
NU F 13 3 5 2 1 2 0 5 2 2 4
NU M 18 7 3 2 2 1 3 3 1 1 13
Conform valorilor din tabelul 9.II, figura 10.2 evidențiază diferențele dintre grupurile
analizate, din punct de vedere al indicelui de masă corporală. Caracteristic diagnosticului de
diabet zaharat, sunt frecvente cazurile de obezitate (IMC > 30 kg/m2). Din figura 9.2 reiese, de
asemenea, un număr ridicat al pacienților de sex feminin aflați sub tratament cu metformin care
prezintă valori ridicate pentru IMC.
Această distribuție a valorilor ridicate ale IMC-ului pentru pacienții cu terapie cu
metformin este justificată de faptul că metforminul contribuie la scăderea în greutate, mai ales
prin diminuarea adipozității viscerale, spre deosebire de alte clase terapeutice antidiabetice,
unde poate fi observată chiar o ușoară creștere a greutății (sulfoniluree sau tiazolidindione).
peste 40
35 la 40
Bărbaţi (fără metformin)
IMC (Kg/m2)
Femei (fără metformin)

30 la 35
Bărbaţi (cu metformin)
Femei (cu metformin)
25 la 30
sub 25
0 5 10 15 20
Număr cazuri
Fig. 10.2. Distribuția numărului de cazuri în funcție de IMC
107
 Tratamentul cu metformin
Grupul 1 luat în studiu se află sub tratament cu metformin, durata terapiei fiind între
1,25 și 19,25 ani (cu o medie de 8,65 ani) (figura 10.3).
5
14 7%
20%
33
19 46%
27%
0-4 ani 4-8 ani 9-12 ani mai mult de 12 ani
Fig. 10.3. Numărul și procentul cazurilor cu metformin, în funcție de durata

tratamentului
Posologia tratamentului cu metformin include majoritar doze de 1000 mg (60 din cei 72
pacienți), administrate de 2 sau 3 ori pe zi. Doza de 3000 mg pe zi este menționată la 35 pacienți
(48,61%). Dozele de 850 mg s-au întâlnit la doar 12,5% dintre pacienți.
 Statistica privind medicația antidiabetică și terapia medicamentoasă nediabetică

asociată
 Tratamentul antidiabetic
Tabelul 10.III centralizează numărul de cazuri cu medicație antidiabetică asociată.
Valorile cele mai ridicate pentru terapia orală o înregistrează sulfonilureele, iar insulina este cea
mai frecventă asociere terapeutică pentru pacienții diagnosticați cu diabet zaharat, cu sau fără
tratament cu metformin. Prezența insulinei în schemele terapeutice este asociată cu diagnosticul
de diabet zaharat de tip 2 dezechilibrat, complicat, insulinotratat, unde controlul glicemic este
insuficient realizat doar prin medicația orală antidiabetică.
Tabel 10.III. Tratamentul antidiabetic
Tratament Medicaţia antidiabetică orală asociată

cu Exenatid Insulină
metformin acarboză sitagliptin pioglitazonă glimepirid gliclazid
DA 8 6 1 7 23 3 29
NU 1 0 0 0 0 0 28
Total 9 6 1 7 23 3 57
108
 Tratamentul antihipercolesterolemiant
Tratamentul antihipercolesterolemiant a fost constituit din fibrați, pentru 4 pacienți din
Grupul 1 (tratați cu metformin) și din statine, prezent la 14 pacienți din Grupul 1 și 7 din
Grupul 2.
 Tratamentul antihipertensiv
Tabel 10.IV. Tratamentul antihipertensiv

Clase terapeutice în tratamentul antipertensiv (număr cazuri)
Tipul tratamentului
Antagoniști Blocante ale Beta- Total
antidiabetic IECA1 Diuretice
RR-AT II2 canalelor de Ca blocante tratamente
Cu metformin 23 12 16 23 32 106
Fără metformin 10 6 6 6 8 36
Insulină şi metformin 9 6 7 10 12 -
Insulină, fără metformin 9 6 6 5 8 -
1 – inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei
2 – receptori ai angiotensinei II
Tabelul 10.IV centralizează cazurile cu terapie antihipertensivă la pacienții luați în

studiu. Sunt utilizate frecvent diuretice, inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei și
beta-blocante, ponderea mai mare fiind la pacienții tratați cu metformin.
Numărul relativ mare de tratamente antihipertensive este asociat faptului că
hipertensiunea arterială reprezintă o patologie asociată adesea diabetului zaharat.
Pacienţii diagnosticați cu diabet zaharat înrolați în studiu au avut tratament şi cu alte

medicamente din diferite clase medicamentoase (cu unul sau mai multe), în total 239 fiind
identificate tratamente individuale.
 Statistica pacienților din studiu în funcție de patologie

Datele privind patologia pacienților înrolați în studiu sunt centralizate în tabelul 10.V.
Diagnosticul principal pentru grupul de pacienți analizat este diabetul zaharat, cel de tip 2 fiind
majoritar (85 din 103 cazuri). În plus, formele agravate ale diabetului zaharat de tip 2 sunt de
asemenea prezente: diabet zaharat de tip 2 dezechilibrat (90 cazuri), complicat (85 cazuri),
insulinotratat (42 cazuri).
În plus, pacienții prezintă ca patologie asociată complicațiile cronice ale diabatului
zaharat: polineuropatia diabetică periferică senzitivo-motorie, prezentă în 83 dintre cazuri,
retinopatia diabetică, în 47 de cazuri. Pondere mai scăzută o are afectarea renală, de 10 cazuri
diagnosticate.
109
Tabel 10.V.Statistica grupului de pacienți în funcție de patologie
Patologie asociată
Diabet zaharat
Hipertensiune arterială
Număr cazuri
Afectare hepatică
Obezitate
Afectare renală
esențială1
Hiperuricemie
Alte afecțiuni
Retinopatie
diabetică
PDPSM2
DML3
insulinotrat
dezechilibr
complicat
Tip 1
Tip 2
at
at
G1 G2 G3 RA1 RA2 G1 G2 G3
17 85 90 85 42 4 28 51 15 64 31 18 10 83 22 47 42 14 10 85
menționat
Nu este
1 20 81 56 61 89 93 18
Total
103 103 103 103 103 103 103 103
1 – G1-G3 = gradul 1-3

RA1, RA2 = risc adițional 1, 2
2 – PDPSM = polineuropatie diabetică periferică senzitivo-motorie
3 – DML = dezechilibre ale metabolismului lipidic
Hipertensiunea arterială prezintă, de asemenea, o frecvență ridicată pentru cazurile

studiate. Sunt menționate 83 de cazuri de hipertensiune arterial esențială, 51 dintre acestea fiind
de gradul al 3-lea. Riscul adițional foarte înalt este prezent la 64 dintre pacienții hipertensivi.
Asociat tulburărilor metabolice glucidice și lipidice, diagnosticul de obezitate apare la
59 din cazuri, însă majoritar în forma ușoară, de grad 1 (la 31 de cazuri).
 Parametri paraclinici
Pentru parametrii de laborator înregistrați pentru cele două grupuri (1 și 2), valorile
medii și deviația standard (SD) sunt sumarizate în tabelul 10.VI.
Tabel 10.VI. Parametri paraclinici

Grup 1 Grup 2
Parametru
Media SD Media SD
HbA1c (%) 7,528333 1,259724 8,171667 1,556449
eAG (mg/dL)1 170,0169 34,33833 180,9256 40,89461
Glicemie à jeun (mg/dL) 174,871 65,35123 193,6097 81,81819
Glicemie la 2 ore (mg/dL) 190,08 71,77216 192,44 87,87163
Uree (mg/dL) 38,26667 13,18289 34,91333 9,789746
Creatinină (mg/dL) 0,860645 0,213026 0,834839 0,219422
TGP (U/L) 33,57143 28,44795 18,2 3,925981
TGO (U/L) 26,1 11,9392 22,28 15,89079
Colesterol (mg/dL) 186,9655 40,81095 180,3103 37,34884
Trigliceride (mg/dL) 222,8667 274,7849 122,6 68,61718
Acid uric (mg/dL) 5,66 1,620898 5,080333 1,94199
1 – glicemia medie estimată
110
Parametrii de control glicemic (glicemie à jeun, glicemie la 2 ore, hemoglobina glicată,

glicemie medie estimată) au prezentat valori medii puțin mai scăzute pentru grupul 1, aflat sub
tratament cu metformin. Acest lucru ar putea indica un control glicemic superior pentru acești
pacienți.
Concluzii
A fost efectuat studiul statistic descriptiv al grupului de pacienți luați în studiu, din
cadrul Clinicii de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice a Spitalului Clinic Județean de Urgențe
“Sf. Spiridon” Iași.
Grupul de pacienți a fost caracterizat având în vedere datele de identificare, medicația,
diagnosticul principal și diagnosticele secundare, parametrii clinici și paraclinici. S-au
constatat:
- Din totalul de pacienți luați în studiu, cei de sex feminin sunt majoritari, cu un procent
de 54,37%.
- Indicele de masa corporală are valoarea medie de 32,25 kg/m2 (SD = 7,13), indicând
prezența cazurilor de obezitate (la 57,28% dintre pacienți).
- Tratamentul cu metformin a fost întâlnit la 72 din totalul de 103 pacienți, dozele
maximale de 3 g zilnic fiind asociate pentru 35 cazuri.
- Insulina este recomandată în terapia diabetului zaharat de tip 1 și 2, fiind asociată cu
diagnosticul de diabet zaharat de tip 2 dezechilibrat, complicat, insulinotratat.
- Diabetul zaharat tip 2 este majoritar (85 din 103 cazuri), iar formele diabetului zaharat
de tip 2: dezechilibrat (90 cazuri), complicat (85 cazuri), insulinotratat (42 cazuri)
prezintă frecvență ridicată.
- Tratamentul antihipercolesterolemiant a fost constituit din fibrați și statine.
- Pentru tratamentul hipertensiunii arteriale esențiale sunt utilizate frecvent diuretice,
inhibitori ai enzimei de conversie a angiotensinei și beta-blocante, ponderea mai mare
fiind la pacienții tratați cu metformin.
- Diagnosticul de hipertensiune arterială esențială este frecvent în grupul de pacienți: 83
de cazuri (51 de gradul al 3-lea), cu risc adițional foarte înalt sunt menționate 64 cazuri.
- Controlul glicemic ușor îmbunătățit la grupul 1 (cu metformin), față de grupul 2 (fără
metformin).
10.2.4. Analiza influenței tratamentului cu metformin asupra nivelului seric al

vitaminei B12
10.2.4.1. Date privind deficitul de vitamină B12 la pacienții tratați cu metformin
Metodă
Conform recomandărilor de specialitate (140), se consideră:
- deficit de vitamină B12, atunci când valorile serice determinate sunt mai mici de 200
pg/mL,
- posibil deficit de vitamină B12, atunci când valorile serice determinate sunt încadrate în
intervalul 200 – 300 pg/mL,
- normal, atunci când valorile serice determinate ale vitaminei B12 sunt mai mari de 300
pg/mL.
Considerăm deficit şi posibil deficit limita de valori serice ale vitaminei B12 mai mici de
300 pg/mL.
Se selectează pacienţii cu deficit de vitamină B12 trataţi şi netrataţi cu metformin care
au durata de la diagnosticarea cu diabet zaharat mai mare de 10 ani. Prin aplicarea testului
111
ANOVA se urmăresțe stabilirea unei corelaţii dinte valorile serice ale vitaminei B12 pentru cele
două grupe de pacienţi.
Datele cu valorile serice ale vitaminei B12 au fost centralizate în funcție de durata de la
diagnosticare diabetului zaharat, cu durată mai mică de 10 ani (tabel 10.VII) și mai mare de 10
ani (tabel 10.VIII), pentru pacienți tratați și netratați cu metformin.
Tabel 10.VII. Valorile serice ale vitaminei B12 la pacienții cu durata de la diagnosticarea
diabetului zaharat mai mică de 10 ani
Durata de la diagnosticarea DZ mai mică de 10 ani
Pacienţi trataţi cu metformin Pacienţi netrataţi cu metformin
Deficit Normal Deficit Normal
Valorile serice ale
Valorile serice ale Valorile serice ale Valorile serice ale
vitaminei B12 mai
vitaminei B12 mai vitaminei B12 mai mari vitaminei B12 mai
mari decât 300
mici de 300 pg/mL decât 300 pg/mL mici de 300 pg/mL
pg/mL
125 501 257 302
125 356 296 359
177 450 261 384
270 517 212 482
283 430 295 466
193 315 294
279 574 221
242 311
212
205
291
284
289
199
Valoarea medie
226,71 431,75 262,29 398,60
Tabel 10.VIII. Valorile serice ale vitaminei B12 la pacienții cu durata de la diagnosticarea
diabetului zaharat mai mare de 10 ani
Durata de la diagnosticarea DZ mai mare de 10 ani
Valorile serice ale
Valorile serice ale Valorile serice ale Valorile serice ale
vitaminei B12 mai
vitaminei B12 mai vitaminei B12 mai mari vitaminei B12 mai
mari decât 300
mici de 300 pg/mL decât 300 pg/mL mici de 300 pg/mL
pg/mL
196 349 125 341
125 571 751
174 430 308
183 427 585
191 326 416
281 357 731
226 300 386
125 541 447
112
Durata de la diagnosticarea DZ mai mare de 10 ani

202 335 353
281 348 407
181 431 317
258 527
125 322
164
125
125
201
173
274
164
125
125
214
283
218
Valoarea medie
189,56 401,36 125,00 453,15
Se observă că majoritari sunt pacienţii cu deficit de vitamină B12 cu tratament cu

metformin.
Comparând grupele cu deficit de vitamina B12 (folosind testul ANOVA) pentru
vechimea diagnosticării DZ mai mică şi, respectiv, mai mare de 10 ani s-a constatat că nu există
diferenţe semnificative între valorile serice medii ale vitaminei B12.
Normal fără 453,15

metformin 398,60
Deficit fără 125,00 Media valorilor serice

ale vitaminei B12 pentru
metformin 262,29 durata diagnosticării DZ
mai mare de 10 ani
Media valorilor serice

Normal cu 401,36 ale vitaminei B12 pentru
metformin 431,75 durata diagnosticării DZ
mai mică de 10 ani
Deficit cu 189,56
metformin 226,71
0.00 100.00 200.00 300.00 400.00 500.00

pg/mL
Fig. 10.4 Media valorilor pentru vitamin B12 serică la pacienți, în funcție de prezența
metforminului și durata diagnosticării cu DZ
113
Conform figurii 10.4, prin compararea mediilor valorilor vitaminei B12, se observă o
tendință de scădere la creșterea duratei de DZ diagnosticat, pentru pacienții cu metformin.
Din punct de vedere a frecvenței procentuale de cazuri de deficit de vitamină B12 pentru
grupurile analizate, se constată o pondere ridicată pentru pacienții tratați cu metformin:
- 66,66% pacienți cu valori ale vitaminei B12 serice mai mici de 300 pg/mL pentru
pacienții tratați cu metformin,
- 32,25% pacienți cu valori ale vitaminei B12 serice mai mici de 300 pg/mL pentru
pacienții netratați cu metformin.
10.2.4.2. Influența duratei tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de

vitamină B12
Metodă
Pacienții din grupul 1, cu tratament cu metformin, sunt divizați în patru grupe, în funcție
de durata terapiei cu metformin:
- grupa A: 0 - 4 ani
- grupa B: 4 – 8 ani
- grupa C: 8 – 12 ani
- grupa D: mai mult de 12 ani
Ulterior, pacienții vor fi împărțiți și în funcție de sex, pentru fiecare grupă (A-D).
Se compară valorile pentru nivelurile vitaminei B12 serice între grupele de pacienți tratați
cu metformin prin testul ANOVA pentru a verifica dacă există diferențe semnificative statistic.
Rezultate și discuți
Media valorilor vitaminei B12 serice pentru pacienții tratați cu metformin, în funcție de
durata tratamentului este reprezentată grafic în figura 10.5.
mai mult de 12 ani 248,96
de la 8 la 12 ani 288,33
Nivel seric
mediu de
vitamina B12
de la 4 la 8 ani 302,91
(pg/mL)
sub 4 ani 288,50
0.00 50.00 100.00 150.00 200.00 250.00 300.00 350.00
Fig. 10.5. Nivelul seric mediu de vitamin B12 în funcție de durata tratamentului cu metformin
114
Prin analiza ANOVA asupra ipotezei de influențare a nivelului seric de vitamin B12 de
către durata tratamentului cu metformin, rezultatele nu sunt semnificative statistic. Ipoteza este
infirmată pentru grupele analizate: A cu B, A+B cu C, A+B cu D.
Prin divizarea grupelor de pacienți în funcție de sex, valorile medii ale vitaminei B12
serice obținute sunt sumarizate în tabelul 10.IX.
Tabel 10.IX. Valorile medii ale nivelului seric al vitaminei B12 în funcție de durata tratamentului
cu metformin și sexul pacientului
Valori medii ale nivelului seric al vitaminei B12 (pg/mL)
Durata tratamentului cu mai mult de Media
sub 4 ani 4 - 8 ani 8 - 12 ani
metformin 12 ani generală
Feminin 352,00 304,89 276,42 259,44 298,19
Masculin 248,50 281,18 273,86 161,00 241,13
Prin reprezentarea grafică a acestor valori la cele două serii (Feminin/Masculin) (fig.
10.6), se observă scăderea valorilor medii ale vitaminei B12, pentru ambele sexe, în funcție de
durata administrării metforminului, însă pentru tratamente îndelungate (mai mari de 4 ani).
400.00
ale nivelului seric al vitaminei B12 (pg/mL)
350.00 352,00
300.00 304,89
281,18 276,42
273,86 259,44
Valorile medii
250.00 248,50
Feminin
200.00
Masculin
161,00
150.00
100.00
50.00
0.00
sub 4 ani 4 la 8 ani 8 la 12 ani mai mult de 12
ani
Durata tratamentului cu metformin (ani)
Fig. 10.6. Nivelul seric mediu de vitamină B12 în funcție de

durata tratamentului cu metformin și sexul pacientului
Influența duratei tratamentului cu metformin este menționată și în alte studii raportate

în literatură. Cazurile clinice cu deficit de vitamin B12 pentru pacienți tratați cu metformin
prezintă perioade îndelungate ale terapiei cu acest compus biguanidic (142,143). Analizele
transversale mai ample au indicat o influență scăzută a duratei tratamentului cu metformin
(141), pe când alți autori afirmă faptul că severitatea scăderii nivelului vitaminei B12 este
proporțională cu doza și durata tratamentului (144).
Apariția deficitului vitaminic la tratament îndelungat cu metformin ar putea fi explicat
de faptul că organismul prezintă capacitate de depozitare a vitaminei B12 de 3-6 ani. În condițiile
115
unei malabsorbții de durată, determinată de terapia cu metformin, decelarea unui posibil deficit
este mai probabil odată cu creșterea duratei tratamentului cu metformin.
10.2.4.3. Influența duratei de la diagnosticarea DZ asupra nivelului seric de

vitamină B12 pentru pacienții care nu au primit tratament cu metformin
Metodă
Pacienții din grupul 2, fără tratament cu metformin, sunt divizați în patru grupe, în
funcție de durata de la diagnosticarea DZ:
- grupa A: 0 - 4 ani
- grupa B: 4 – 8 ani
- grupa C: 8 – 12 ani
- grupa D: mai mult de 12 ani
Media valorilor vitaminei B12 serice pentru pacienții netratați cu metformin, în funcție
de durata de la diagnosticarea diabetului zaharat este centralizată în tabelul 10.X, iar
reprezentarea grafică corespunde figurii 9.7.
Tabel 10.X. Valorile medii ale nivelului seric al vitaminei B12 în funcție de durata diagnosticării
DZ și sexul pacientului
Valori medii ale nivelului seric al vitaminei B12 (mg/mL)
Durata de la
mai mult de Media
diagnosticare sub 4 ani 4 - 8 ani 8 - 12 ani
12 ani generală
cu DZ
Feminin 482 256,5 557,5 383,8 419,95
Masculin 257,5 318,67 466 420,75 365,73
600.00
Valorile medii serice ale vitaminei B12
557,50
500.00
482,00 466,00
420,75
400.00
(pg/mL)
383,80
318,67 Femini
300.00
n
257,50 256,50
200.00
100.00
0.00
sub 4 ani 4 la 8 ani 8 la 12 ani
mai mult de 12
ani
Durata de la diagnosticare cu DZ (ani)
Fig. 10.7. Nivelul seric mediu de vitamină B12 în funcție de durata diagnosticării DZ și sexul
pacientului
116
Conform figurii 10.7, durata diagnosticării diabetului zaharat nu valorile medii obținute
pentru vitamina B12 serică.
În plus, nivelurile vitaminei B12 au fost analizate pentru pacienții netratați cu metformin
în funcție de durata diagnosticării cu DZ, comparativ cu pacienții tratați cu metformin și cu
aceeași durată a tratamentului medicamentos (fig. 10.8).
600
Valorile medii ale nivelului seric al vitaminei B12
500
400
(pg/mL)
Feminin cu metformin
300
Masculin cu metformin
Feminin fără metformin
200
Masculin fără metformin
100
0
sub 4 ani 4 la 8 ani 8 la 12 ani mai mult de Media
12 ani generala
Durata administrării/diagnosticării
Fig. 10.8. Compararea pacienților netratați cu metformin în funcție de durata diagnosticării DZ

cu pacienții tratați cu metformin, în funcție de aceeași durată de tratament
Pentru a realiza o analiză simplificată, au fost considerate următoarele serii de date, în

funcție durata de la diagnosticarea DZ, pentru pacienții cu și fără tratament cu metformin:
- X1: pacienți cu metformin, durata de la diagnosticare mai mică de 10 ani,
- X2: pacienți fără metformin, durata de la diagnosticare mai mică de 10 ani,
- Y1: pacienți cu metformin, durata de la diagnosticare mai mare de 10 ani,
- Y2: pacienți fără metformin, durata de la diagnosticare mai mare de 10 ani.
Datele analizate au reprezentat valorile serice pentru vitamina B12 (pg/mL).
Aplicând testul ANOVA pentru seriile X1 cu Y1 și X1 cu X2, rezultatele au evidențiat
că nu există diferențe semnificative statistic, respectiv faptul că nivelurile vitaminei B12 nu sunt
influențate de durata de la diagnosticarea cu DZ a pacienților.
Prin efectuarea aceluiași test statistic pentru seriile Y1 cu Y2, diferențele sunt
semnificative statistic (F = 7,861348 > Fcritic = 4,2252, p = 0,009424). Astfel, la durată mare de
la diagnosticarea cu DZ, mai mult de 10 ani, este constatată influența tratamentului cu
metformin asupra vitaminei B12 serice. Valoarea medie a vitaminei B12 serice pentru seria Y1 a
fost de 268,64 pg/mL, iar pentru Y2 de 429,71 pg/mL, rezultând tendința de scădere a nivelului
seric al vitaminei în cazul terapiei cu metformin.
117
Beulens și colaboratorii (141) au raportat, în cadrul unui studiu transversal similar, o

corelație între durata tratamentului cu metformin și durata de diagnosticare cu DZ, realizând
analiza fără acest ultim criteriu. În aceste condiții, concluzia studiului a fost că există o ușoară
legătură între durata mare de tratament cu metformin și nivelurile serice scăzute de vitamină
B12.
10.2.4.4. Influența tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamină

B12, independent de durata tratamentului cu metformin
Metodă
Ipoteza de lucru are în vedere influența tratamentului cu metformin asupra nivelului
seric al vitaminei B12, prin analiza valorilor serice ale vitaminei la lotul de pacienți tratat cu
metformin, comparativ cu lotul martor (Grupul 2/NU).
Pornim de la început cu lotul (L) de 103 pacienţi cu DZ care a fost împărţit în două loturi
majore:
- Lotul L1 cu pacienţii cu DZ care au primit tratament cu metformin (72 cazuri),
- Lotul L2 cu pacienţii cu DZ care nu au primit tratament cu metformin (31 cazuri).
Pentru a avea un singur factor (tratamentul cu metformin) de analiză, este necesară
stabilirea pentru L1 şi L2 a unei structuri cât mai similare. Astfel, se va putea aplica analiza
ANOVA: Single Factor.
Metoda de selecţie pentru aceste loturi a avut drept criteriu principal tratamentul cu
metformin. De aici au rezultat cele două serii de date (valorile serice ale vitaminei B12) care au
fost comparate.
Deoarece L1 prezintă un număr de cazuri dublu față de L2, a fost divizată aleatoriu seria
de date ale lotului L1 în două serii. În acest mod, componența datelor din L1 (pentru fiecare din
cele două serii) a fost similară datelor din lotul martor L2 (31 cazuri), putând fi aplicată analiza
statistică.
Rezultate şi discuţii
Cele două serii obținuțe au fiecare câte 31 date, deci aplicarea testului a fost posibilă,
conform metodei. Tabelele 10.XI și 10.XII centralizează valorile celor două serii, precum și
rezultatele prelucrării statistice.
Aplicând testul ANOVA Seriei 1 obţinem pentru funcţia F (10,12) o valoare de 2,5 ori
mai mare decât Fcritic (4), iar probabilitatea P (0,002326) pentru alfa egal cu 0,05 este mai mare
de 99%. Deci ipoteza nulă este infirmată şi putem afirma că diferenţa dintre mediile valorilor
serice ale vitaminei B12 pentru seria 1 este semnificativă statistic (274,19 şi respectiv 385,10
pg/mL).
Aplicând testul ANOVA Seriei 2 obţinem pentru F (16,98) o valoare de 4 ori mai mare
decât Fcritic (4), iar probabilitatea P (0,000117) pentru alfa egal cu 0,05 este mai mare de 99,9%.
Deci ipoteza nulă este infirmată şi putem afirma că diferenţa dintre mediile valorilor serice ale
vitaminei B12 pentru seria 2 este semnificativă statistic (251,94 şi respectiv 385,10 pg/mL).
Pacienţii trataţi cu metformin din studiul de față au avut nivelul seric de vitamină B12
semnificativ mai mic decât pacienţii care nu au primit tratament cu metformin. Astfel, pentru
ambele serii descrise, ipoteza de studiu este confirmată.
118
Tabelul 10.XI. Compararea nivelului seric al vitaminei B12 pentru seria 1

Pacienţi trataţi (DA) sau netratați
(NU) cu metformin
DA NU
190 459
294 531
30+8 564
256 279
212 257
205 296
372 341
125 125
187 302
573 751
238 261
196 308
322 212
424 585
Nivel seric de vit B12 (pg/mL)
349 416
125 731
125 386
174 295
183 447
207 359
191 353
281 384
501 407
571 294
356 482
430 317
226 527
125 466
125 322
427 221
202 260
Valoarea medie a vitaminei
274,19 385,10
B12 serice (pg/mL)
Anova: Single Factor
F P-value F crit
10,1167493 0,002326 4,001194
119
Tabelul 10.XII. Compararea nivelului seric al vitaminei B12 pentru seria 2

Pacienţi trataţi (DA) sau netratați
(NU) cu metformin
DA NU
181 459
326 531
258 564
125 279
164 257
357 296
125 341
125 125
177 302
300 751
517 261
201 308
270 212
430 585
Nivel seric de vit B12 (pg/mL)
283 416
193 731
173 386
279 295
242 447
274 359
212 353
164 384
125 407
541 294
125 482
335 317
205 527
214 466
283 322
315 221
291 260
Valoarea medie a vitaminei
251,94 385,10
B12 serice (pg/mL)
Anova: Single Factor
F P-value F crit
16,98481 0,000117 4,001194
Rezultatele acestei investigații sunt în aceeași direcție cu ale altor studii similare
raportate în literatura de specialitate. Astfel, rezultatele publicate confirmă influența
metforminului asupra vitaminei B12 serice. Metforminul reprezintă una din cauzele posibilei
malabsorbții a vitaminei B12, care ulterior se poate exprima prin nivel seric scăzut de vitamină.
Recomandările specialiștilor includ testări anuale ale vitaminei B12 la pacienții tratați cu
metformin (140,145) sau suplimentarea medicației cu calciu, implicat în procesul de absorbție
al vitaminei (146).
Cu toate că unele studii ilustrează o rezistență pentru vitamina B12 la pacienții
diagnosticați cu diabet zaharat (147), cercetările publicate confirmă rolul direct al
metforminului în scăderea concentrațiilor serice de vitamin B12 (141,148–150).
120
10.2.4.5. Influența tratamentului cu metformin asupra valorilor acidului uric
Metodă
Se stabilesc noi criterii de selecţie a pacienţilor din loturile L1 (cu tratament cu
metformin) şi, respectiv, L2 (fără tratament cu metformin) pentru a realiza omogenitatea
pacienţilor selectaţi. Astfel, factorul unic de influenţă analizat va fi tratamentul cu metformin.
Pentru selecţie s-au aplicat următoarele 8 criterii de eliminare a pacienţilor care ar
influenţa neomogenitatea loturilor selectate:
 Pentru lotul L1:
1. Trataţi cu metformin (DA)
2. Cu durată de diagnosticare DZ
3. Cu durată de administrare a metforminului
4. Cu greutate corporală
5. Cu DZ tip 2
6. Cu valori ale acidul uric determinate
7. Cu IMC
8. Insulinotratat (1)
 Pentru lotul L2:
1. Netratați cu metformin (NU)
2. Cu durată de diagnosticare DZ mai mare de 2 ani
3. Cu durată de administrare a metforminului 0 ani
4. Cu greutate corporală
5. Cu DZ tip 1 și 2
6. Cu valori ale acidului determinate
7. Cu IMC
8. Tratament cu insulină
Datele obținute în urma aplicării acestor criterii de selecție sunt prezentate în tabelele 10.XIII
(pentru lotul L1) și 10.XIV (pentru lotul L2).
Tabel 10.XIII. Pacienții selectați pentru lotul L1

Durata
Greutate Durata de la Nivel seric
Sex IMC administrării Ac uric
corporală 2 diagnosticare de vit B12
(M/F) (kg/m ) metforminului (mg/dL)
(kg) cu DZ (ani) (pg/mL)
(ani)
F 70,00 27,61 19 2,75 349 5,9
M 96,00 31,34 24 15,50 125 5,9
M 85,00 29,76 14 7,00 174 6,8
M 91,00 27,47 17 4,75 281 4
M 109,00 37,71 10 9,75 501 5,6
F 90,00 32,27 15 12,66 125 3,8
F 90,00 37,49 8 4,25 450 3,8
F 113,00 41,50 13 7,91 281 5,3
F 87,00 33,98 13 9,00 181 4,7
M 70,00 23,66 13 5,33 326 4,6
M 83,00 30,12 13 11,66 258 5,2
F 96,00 37,50 12 10,00 164 3,5
F 86,00 34,88 7 7,25 177 5,8
F 93,00 32,95 18 6,00 300 6,3
M 102,00 30,12 4 4,16 270 3,9
121
Durata
Sex IMC administrării Ac uric
corporală 2 diagnosticare de vit B12
(M/F) (kg/m ) metforminului (mg/dL)
(ani)
M 64,00 24,08 5 5,08 430 6,3
F 85,00 31,60 18 9,41 274 3,1
F 103,00 38,29 9 5,08 212 6,1
F 90,00 38,95 17 16,33 541 3,5
F 90,00 35,15 11 11,50 214 5
F 101,00 38,48 20 2,16 283 4,1
F 68,00 27,23 4 4,58 284 6,1
F 80,00 32,04 11 11,50 431 4,2
M 130,00 36,01 5 5,16 199 5,1
Valori
90,50 32,92 12,50 7,87 284,58 4,94
medii
F 15
Număr pacienți M 9
Total 24
Tabel 10.XIV. Pacienții selectați pentru lotul L2

IMC DZ Ac uric
Sex (M/F) corporală diagnosticare de vit B12
(kg/m2) (tip) (mg/dL)
F 66,00 21,79 5 257 1 4,4
F 58,00 28,76 7 296 2 5,5
M 62,00 21,45 16 341 1 3,3
M 94,00 27,76 25 125 2 3,30
M 68,00 25,91 7 302 2 5,5
M 64,00 19,32 18 751 1 13,4
F 106,00 38,93 8 261 2 4,7
M 56,00 23,01 15 308 2 5,8
F 83,00 34,54 8 212 2 5
M 65,00 19,60 22 585 1 5,2
F 85,00 30,40 22 416 1 5,2
F 68,00 30,22 11 731 1 5,4
F 91,00 33,42 13 386 1 2,3
M 107,00 36,00 8 295 2 3,4
F 97,00 49,48 16 447 2 5,2
M 136,00 44,40 8 359 2 5,2
F 127,00 57,98 13 353 2 6,5
F 48,00 18,06 10 384 1 4,1
M 92,00 24,95 13 407 1 4,8
M 102,00 29,80 4 294 1 6,7
F 60,00 23,43 3 482 1 3,7
F 80,00 33,71 19 317 2 6,2
M 60,00 18,11 19 527 1 3,6
M 94,00 30,69 9 466 1 4,6
Valori
82,04 30,07 12,46 387,58 - 5,13
medii
F 12
Număr pacienți M 12
Total 24
122
Pentru a analiza omogenitatea loturilor selectate, se compară valorile medii ale duratei
de diagnosticare cu DZ (ani), greutăţii corporale (kg), IMC (kg/m2), nivelului seric al vitaminei
B12 (pg/mL) și ale acidului uric (mg/dL) (fig. 10.9).
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
Greutatea corporală IMC (kg/m2) Durata de la Nivel seric de Acid uric (mg/dL)
(kg) diagnosticare cu DZ vitamină B12
(ani) (pg/mL)
Pacienți cu metformin Pacienți fără metformin
Fig. 10.9. Compararea valorilor medii ai unor parametri pentru loturile L1 și L2
Din punct de vedere a structurii pe sexe, cele două loturi prezintă componență diferită:
pentru L2 proporția dintre femei și bărbați este egală, în timp ce pentru lotul L1, femeile sunt
majoritare.
Se observă faptul că loturile L1 și L2 sunt omogene, obținându-se valori foarte apropiate
pentru mediile parametrilor: greutate corporală (90,5 kg și 82,4 kg), indice de masă corporală
(32,92 kg/m2 și 30,07 kg/m2), durata diagnosticării cu diabet zaharat (12,50 ani și 12,46 ani).
Nivelul seric al vitaminei B12 este un parametru pentru care există diferențe între loturile
L1 (284,58 pg/dL) și L2 (387,58 pg/dL), aspect confirmat prin analizele statistice anterioare.
A fost analizată influența tratamentului cu metformin asupra concentrației de acid uric.
Conform acestui criteriu, nu există diferențe statistice între loturile L1 și L2, aspect confirmat
de analiza ANOVA. Fcalculat (0,147737) este mult mai mic decât Fcritic (4,051742). Ipoteza nulă
este confirmată, diferenţa dintre mediile valorilor acidului uric pentru cele două loturi selectate
este întâmplătoare. Astfel, valorile acidului uric nu sunt influenţate de tratamentul cu
metformin.
Studii recente au analizat influența acidului uric asupra bolii metabolice, menționându-
se faptul că ar putea influența sindromul metabolic și, de asemenea, că ar putea fi considerat un
indicator al riscului cardio-metabolic (151,152). Mai mult, valorile crescute sanguine ale
acidului uric sunt incriminate în evoluția bolii renale de etiologie diabetică (153).
Pacienții din grupul luat în studiu (103 pacienți) sunt diagnosticați cu diabet zaharat, 22
dintre aceștia având ca patologie asociată și hiperuricemia (simptomatică sau asimptomatică).
Medicația asociată, cum este si cazul metforminului, poate fi analizată privind influența asupra
nivelului sanguin de acid uric. Pentru cele două loturi studiate (L1 și L2), mediile valorilor
acidului uric au fost mai scăzute la L1 (4,94 mg/dL) față de L2 (5,13 mg/dL), însă diferențe
sunt foarte mici, testul statistic confirmând lipsa influenței între cei doi parametri: prezența
tratamentului cu metformin și concentrația acidului uric.
123
10.2.4.6. Analiza corelației dintre concentrația serică de metformin și nivelul

vitaminei B12 serice
Metodă
Pentru 15 pacienți din grupul 1, tratat cu metformin, s-a determinat concentrația
metforminului în ser. Au fost utilizate aceleași probe de ser, pentru a minimiza sursele de eroare.
Metoda de determinare utilizată a fost UPLC-QTOF/MS, iar extracția a fost realizată prin
precipitarea proteineilor serice cu acetonitril.
Valorile obținute au fost analizate din punct de vedere al corelației cu nivelul seric de
vitamină B12.
În tabelul 10.XV sunt prezentate valorile obținute pentru nivelul seric de metformin și
vitamină B12, pentru cazurile analizate.
Tabel 10.XV. Concentrațiile serice de metformin și vitamină B12 la cazurile analizate

Greutate Concentrația Concentrația
Nr. Sex
corporală metforminului în ser vitaminei B12 în
crt. (M/F)
(kg) (µg/L) ser (pg/mL)
1 F 72 268,94 571
2 M 109 681,65 501
3 M 85 2346,857 372
4 F 74 34,62979 356
5 M 100 967,4488 191
6 M 91 571,3429 281
7 F 76 661,0527 430
8 F 84 818,597 369
9 F 90 551,1829 238
10 M 105 227,732 196
11 F 93 116,4951 424
12 M 96 515,7181 125
13 F 69 1039,28 125
14 F 124 871,7543 183
15 M 70 426,1115 207
Prin aplicarea regresiei statistice, și reprezentarea grafică a datelor, se obține figura

10.10.
124
600
Concentrația vitaminei B12

500
400
(pg/mL)
R² = 0.0081
300
200
100
0
0 500 1000 1500 2000 2500
Concentrația metforminului (µg/L)
Fig. 10.10. Corelația dintre concentrația serică a metforminului (µg/L) și nivelul seric de
vitamină B12 (pg/mL)
Coeficientul de regresie obținut pentru cei doi parametri ai lotului studiat are valoare
foarte apropiată de zero (r2 = 0,0081), indicând lipsa asocierii sau corelației. Nivelul
metforminului din ser nu influențează nivelul vitaminei B12.
Deși într-un studiu similar publicat de Beulens și colaboratorii (141), rezultatele au
indicat faptul că doza zilnică de metformin a fost asociată cu scăderea nivelului de vitamină B12
mai mult decât durata tratamentului cu metformin, în cazul acestei analize nu s-au evidențiat
corelații între nivelul vitaminei B12 și concentrația metforminului în ser sau doza zilnică
administrată.
În plus, același studiu publicat (Beulens, 2014) menționează prezența unei corelații între
doza cumulativă de metformin și nivelul vitaminei B12 serice. Astfel, pentru pacienții din grupul
1 (cu metformin) s-a realizat o analiză a influenței dozei cumulative asupra nivelului vitaminei.
Prin prelucrarea statistică, se constată o corelație slabă a celor doi parametri analizați
2
(r =0,0894) (fig. 10.11).
700
600
500 R² = 0.0894
400
Y
Y
300
200 Predicted Y
100 Linear (Y)
0
0 20000 40000 60000 80000
X Variable 1
Fig. 10.11. Analiza statistică a dozei cumulative a metforminului asupra

nivelului seric de vitamină B12
10.2.4.7. Concluzii
A fost analizată influența tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamină

B12 la pacienții internați în perioada aprilie – decembrie 2015 în Clinica de Diabet, Nutriție și
Boli Metabolice, din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași. S-au
125
studiat multiple aspecte privind parametrii înregistrați pentru grupurile de pacienți înrolați în
studiu, putându-se concluziona următoarele:
 Frecvența mai mare a pacienților cu valori ale vitaminei B12 serice mai mici de 300
pg/mL se înregistrează la cei tratați cu metformin (în 66,66% din cazuri), față de cei
netratați cu metformin (32,25% din cazuri).
 Concentrațiile serice de vitamină B12 nu sunt influențate de durata de la diagnosticarea
cu DZ a pacienților, diferențele nefiind semnificative statistic.
 Influențarea nivelului seric de vitamină B12 de către durata tratamentului cu metformin
nu este semnificativă statistic, deși s-a observat o ușoară scădere a mediilor
concentrațiilor serice de vitamină B12 odată cu creșterea duratei tratamentului, însă doar
pentru durate de peste 4 ani.
 Grupul de pacienți tratați cu metformin au prezentat un nivel seric al vitaminei B12
semnificativ mai mic decât pacienţii care nu au primit tratament cu metformin.
 Tratamentul cu metformin nu influențează concentrațiile sanguine ale acidului uric la
pacienții diagnosticați cu diabet zaharat.
 Concentrația serică a metforminului nu este corelată cu nivelul seric al vitaminei B12,
iar doza cumulativă de metformin este puțin corelată cu scăderea valorilor serice ale
vitaminei B12.
10.3. EVALUAREA RISCULUI CARDIOVASCULAR LA PACIENȚII CU DIABET

ZAHARAT DE TIP 2
10.3.1. Introducere
Bolile cardiovasculare reprezintă principala cauză de mortalitate la nivel global, iar

pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2 prezentă unul din factorii de co-morbiditate.
Conform unui raport al Organizației Mondiale a Sănătății, în anul 2012 diabetul zaharat
a cauzat 1,5 milioane decese. Nivelul glicemiei mai mare decât cel optim a provocat o
suplimentare de 2,2 milioane de decese, prin creșterea riscului de boli cardiovasculare si a altor
afecțiuni. În plus, adulții diagnosticați cu diabet zaharat prezintă o frecvență a bolilor
cardiovasculare de două până la trei ori mai mare decât adulții fără diabet zaharat (154).
În acest context, scopul studiului de față a fost evaluarea riscului cardiovascular la
pacienții cu diabet zaharat de tip 2.
Riscul cardiovascular la pacienții cu diabet zaharat de tip 2 din grupul studiat va fi

identificat utilizând programul UKPDS RE (UK Prospective Diabetes Study Risk Engine).
UKPDS RE este un instrument de calculare a riscurilor cardiovasculare destinat a fi
utilizat pentru pacienții cu diabet zaharat de tip 2. Pe baza datelor furnizate de către studiile
clinice (UKPS-United Kingdom Prospective Diabetes Study) din ultimii 20 de ani, programul
poate estima probabilitatea apariției unei boli coronariene sau a unui accident vascular cerebral
în rândul acestor pacienti. Printre limitările acestui program se numără și faptul ca nu permite
calcularea riscului cardiovascular total (155,156).
Riscul cardiovascular pentru următorii 10 ani pentru boala coronariană fatală și non-
fatală (BC), boală cardiovasculară fatală (BCV F), accident vascular cerebral fatal și non-fatal
(AVC) și pentu accident vascular cerebral fatal (AVC F) este determinat folosind programul
UKPDS RE pe baza următorilor parametric (fig. 10.12):
 Vârstă,
126
 Sex,
 Durata diabetului zaharat de tip 2,
 Prezența sau absența fibrilației atriale,
 Rasă,
 Fumător/nefumător/fost fumător,
 Hemoglobină glicozilată,
 HDL-colesterol,
 Colesterol total,
 Tensiune arterială sistolică.
Fig. 10.12. Programul UKPDS RE (155)
Analiza statistică a datelor obţinute a fost realizată prin intermediul programului

Microsoft Office Excel 2013.
Din grupul de pacienți luat în studiu din cadrul Clinicii de Diabet, Nutriție și Boli
Metabolice, au fost selectați cei diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2, care au prezentat date
complete pentru a permite evaluarea riscului cardiovascular cu ajutorul programului UKPDS
RE.
După aplicarea criteriilor de includere și excludere, 21 de cazuri au fost analizate pentru

evaluarea riscului cardiovascular.
În cazul bolii coronariane fatale și non-fatale (BC) s-au obținut cele mai ridicate valori
ale riscului estimat pentru următorii 10 ani, cu o medie de 19,81% (fig. 10.13).
127
35.00%
30.00%
Risc cardiovascular (%) 25.00%
19.81%
20.00%
14.59%
15.00%
9.97%
10.00%
5.00%
1.50%
0.00%
BC BC F AVC AVC F
Fig. 10.13. Riscul cardiovascular la pacienții cu diabet zaharat de tip 2
Prin compararea valorilor obținute, se constată că pacienții de sex masculin prezintă risc
cardiovascular mai ridicat față de cei de sex feminin, pentru cele 4 categorii evaluate (BC, BC
F, AVC, AVC F) (fig. 10.14).
40.00%
35.00%
30.00%
Risc cardiovascular (%)
25.00%
20.00%
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
-5.00%
BC BC F AVC AVC F
Feminin 14.73% 10.75% 8.67% 1.44%
Masculin 24.44% 18.08% 11.15% 1.55%
Feminin Masculin
Fig. 10.14. Riscul cardiovascular în funcție de sexul pacientului
Analizând datele obținute, se constată că riscul cardiovascular prezintă o tendință de

creștere a valorilor procentuale odată cu creșterea vârstei pacientului (fig. 10.15). Obținerea
corelațiilor semnificative statistic sunt limitate de numărul redus de pacienți analizați, inclusiv
pentru parametrii de investigație (hemoglobină glicozilată, colesterol, tensiunea arterială, indice
de masă corporală) sau medicația cardiovasculară.
128
50.00%
45.00%
Risc cardiovascular (%)

40.00%
35.00%
30.00%
25.00%
20.00%
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
40 45 50 55 60 65 70 75
Vârstă (ani)
BC BC F AVC AVC F
Fig. 10.15. Riscul cardiovascular în funcție de vârsta pacientului
10.3.4. Concluzii
A fost evaluat riscul cardiovascular estimat pentru următorii 10 ani prin intermediul
programului UKPDS RE la 21 de pacienți diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2, din cadrul
Clinicii de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice, Spitalul Clinic Județean de Urgențe “Sf.
Spiridon” Iași.
S-au obținut valori ale riscului pentru cele 4 categorii abordate în intervalele:
 6,00% - 46,70% (pentru boala coronariană fatală și non-fatală),
 3,80% – 36,00% (pentru boala coronariană fatală),
 2,10% - 27,70% (pentru accidentul vascular cerebral fatal și non-fatal),
 0,20% - 5,50% (pentru accidentul vascular cerebral fatal).
Distribuția pe sexe a riscului cardiovascular a evidențiat valori mai ridicate pentru
pacienții de sex masculin, la toate categoriile de risc analizate.
129
11. CONCLUZII GENERALE. CONTRIBUȚII ORIGINALE.

PERSPECTIVE DE CERCETARE
CONCLUZII GENERALE
Cercetările efectuate în cadrul acestei teze de doctorat au condus la următoarele

concluzii generale:
1. Studiul statistic al medicației și patologiei asociate pentru pacienții cu diabet zaharat de
tip 2 a avut rolul de a evidenția incidența patologiei asociate diabetului zaharat și
categoriile de clase medicamentoase prescrise.
 Designul studiului a fost de tip descriptiv-retrospectiv, pentru 221 pacienți aflați în
evidența Centrului de Medicină de Familie Iași.
 Rezultatele au evidențiat incidență crescută pentru complicațiile cronice ale
diabetului zaharat de tip 2 și pentru patologia cardiovasculară asociată
(hipertensiunea arterială este prezentă la 83,71% din cazuri), date care sunt în
concordanță cu raportările din publicațiile de specialitate.
 Medicația antidiabetică cel mai frecvent prescrisă este reprezentată de biguanide
(76,01%) și de sulfoniluree (31,67%). Datele obținute susțin alegerea studierii
acestor medicamente antidiabetice orale din punct de vedere toxicologic.
 Medicația asociată cardiovasculară prezintă pondere ridicată a prescrierii, pe primul
loc fiind inhibitorii enzimei de conversie a angiotensinei (45,25%).
2. Analiza cantitativă a metforminului prin electroforeză capilară cu detecție în UV oferă

o metodă simplă și eficientă de determinare, cu posibilitatea aplicării pe probe biologice.
 Separarea electroforetică s-a realizat în soluție tampon fosfat, la pH=4,0 la un voltaj
de +15 kV, iar detecția a fost efectuată la 200 nm.
 Metoda a fost validată, cu stabilirea parametrilor de validare. Domeniul de
concentrații pentru clorhidratul de metformin a fost de 5-1000 µg/mL.
 A fost dezvoltată o metodă de extracție a metforminului din probe de ser uman, în
vederea analizei prin electroforeză capilară cu detecție în UV, cu un randament de
extracție de 98,14%.
3. Determinarea cantitativă simultană a metforminului și glimepiridului prin UPLC-

QTOF/MS a fost efectuată pentru prima dată pentru acești compuși, fiind o metodă
modernă, performantă și specifică de analiză, cu aplicații în evaluări calitative și dozări
toxicologice.
 Compușii analizați au fost separați cromatografic pe o coloană UPLC BEH C18, cu
eluție în gradient cu acid formic 0,05% și acetonitril.
 Detecția s-a realizat cu ajutorul sistemului QTOF/MS pe baza maselor exacte: m/z
130,105 Da (metformin) și m/z 491,2311 Da (glimepirid).
130
 Metoda a fost validată prin verificarea parametrilor de validare, cu obținerea

limitelor de detecție și de cuantificare:
o LD = 2,98 µg/L pentru metformin și LD = 2,52 µg/L pentru glimepirid,
o LQ = 9,03 µg/L pentru metformin și LQ = 7,64 µg/L pentru glimepirid.
 Prin optimizarea unei metode de extracție din ser uman, metoda ULPC-QTOF/MS
poate fi aplicată pentru determinări din probe biologice.
o Randamentele de extracție obținute au fost de 43,96% pentru metformin și
102,83% pentru glimepirid.
o S-au utilizat standarde interne, pentru a corecta posibilele erori de
determinare: propranolol pentru metformin, glibenclamid pentru glimepirid.
o Au fost analizate 15 probe de ser obținute de la pacienți aflați sub tratament
cu metformin, obținându-se valori serice în intervalul 34,629 – 2346,857
µg/L, în concordanță cu literatura de specialitate.
4. Studiul clinic al pacienților internați în Clinica de Diabet, Nutriție și Boli Metabolice

din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași a abordat mai multe
direcții de cercetare toxicologică.
 Au fost prezentate două cazuri clinice în care terapia cu metformin a fost întreruptă,
ca o măsură de precauție – de ameliorare sau prevenire a efectelor adverse cauzate
de metformin (tulburări gastro-intestinale sau acidoza lactică).
 A fost evaluată influența tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de
vitamină B12.
o Au fost înrolați în studiu 103 pacienți, 72 dintre aceștia cu tratament cu
metformin, iar 31 au constituit grupul martor.
o Frecvența valorilor serice de vitamină B12 mai mici de 300 pg/mL a fost mai
ridicată la pacienții tratați cu metformin (în 66,66% din cazuri), față de cei
netratați cu metformin (32,25% din cazuri).
o Pacienții tratați cu metformin au prezentat un nivel seric al vitaminei B12
semnificativ mai mic decât pacienţii care nu au primit tratament cu
metformin.
o Nivelul vitaminei B12 serice nu este influențat de concentrația serică a
metforminului, durata tratamentului cu metformin sau durata diabetului
zaharat
o O ușoară scădere a mediilor concentrațiilor serice de vitamină B12 în funcție
de durata tratamentului a fost observată la perioade de peste 4 ani de terapie
cu metformin.
 A fost determinat riscul cardiovascular pentru următorii 10 ani, prin intermediul
programului UKPDS RE.
o S-a evaluat riscul pentru boala coronariană fatală și non-fatală, boala
coronariană fatală, accidentul vascular cerebral fatal și non-fatal și pentru
accidentul vascular cerebral fatal.
o Valorile medii obținute au fost mai ridicate pentru pacienții de sex masculin,
la toate cele patru categorii de risc analizate.
o Procentele de risc cele mai ridicate s-au obținut pentru boala coronariană
fatală și non-fatală (cu o valoare medie de 19,81%), atingând un maxim de
46,70%.
131
CONTRIBUȚII ORIGINALE
În cadrul tezei de doctorat “Studiul chimico- și clinico-toxicologic al unor medicamente

antidiabetice orale” s-au evidențiat următoarele contribuții originale:
 Interpretarea statistică a profilului de patologie și medicație pentru pacienții

diagnosticați cu diabet zaharat de tip 2, evidențiind prescrierea antidiabeticelor orale
la nivel teritorial.
 Abordarea unor metode moderne de analiză a antidiabeticelor orale, care reprezintă

instrumente de lucru performante pentru aplicații în domeniul toxicologic.
 Studiul clinic de investigare a efectelor adverse produse de antidiabetice orale, la

pacienții din cadrul Spitalului Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași.
PERSPECTIVE DE CERCETARE
Rezultatele obținute în cadrul tezei de doctorat oferă noi direcții de cercetare avansată:
 Aplicarea metodelor dezvoltate de analiză cantitativă a medicamentelor

antidiabetice orale în studii chimico-toxicologice sau în cazul intoxicațiilor
medicamentoase.
 Analiza corelațiilor dintre concentrațiile probelor biologice și profilul toxicologic al

antidiabeticelor orale studiate.
 Studiul privind caracterizarea toxicocinetică a metforminului și glimepiridului prin

analiza probelor biologice (sânge, urină) în momente diferite de la administrare.
 Studiul in vivo pe animale de experiență privind evaluarea unor reacții toxice ale
compușilor abordați.
 Realizarea unor studii clinice de monitorizare și evaluare a reacțiilor adverse pentru

medicamentele antidiabetice orale.
132
BIBLIOGRAFIE
1. Olokoba AB, Obateru OA, Olokoba LB. Type 2 Diabetes Mellitus: A Review of Current
Trends. Oman Med J 2012; 27(4): 269–273.
2. Cristea AN, Negreş S, Marineci CD. Tratat de farmacologie. Bucureşti, Editura Medicală,
2006, 761-772.
3. Katzung BG, Masters SB, Trevor AJ. Basic & clinical pharmacology. New York,
McGraw-Hill Medical, 2009, 727-752.
4. Siegel KR, Echouffo-Tcheugui JB, Ali MK et al. Societal correlates of diabetes
prevalence: An analysis across 94 countries. Diabetes Res Clin Pract 2012; 96(1): 76–83.
5. http://data.gov.ro/dataset/principalii-indicatori-unoasterii-starii-de-
sanatate/resource/88c9efbf-7e01-4f48-a7b4-af8d64dd7a44.
6. Giorgino F, Laviola L, Leonardini A. Pathophysiology of type 2 diabetes: Rationale for
different oral antidiabetic treatment strategies. Diabetes Res Clin Pract 2005; 68: S22–
S29.
7. Harvey R. Insulina și alte medicamente hipoglicemiante. In: Lippincott Farmacologie
Ilustrată, 5th ed. Editura Medicală Callisto; 301–316.
8. Kannan CR. Essential Endocrinology. Boston: Springer US, 1986, 425-448.
9. Bailes BK. Diabetes Mellitus and its Chronic Complications. AORN J 2002; 76(2): 265–
282.
10. Forbes JM, Cooper ME. Mechanisms of Diabetic Complications. Physiol Rev 2013; 93(1):
137–188.
11. http://tcf.bh.cornell.edu/imgs/ws1/r/Fabaceae_Galega_officinalis_26314.html.
12. Bailey C, Day C. Metformin: its botanical background. Pract Diabetes Int 2004; 21(3):
115–117.
13. Witters LA. The blooming of the French lilac. J Clin Invest 2001; 108(8): 1105–1107.
14. White JR. A Brief History of the Development of Diabetes Medications. Diabetes Spectr
2014; 27(2): 82–86.
15. Ahmed AM. History of diabetes mellitus. Saudi Med J 2002; 23(4): 373–378.
16. Wexler P, Anderson BD. Encyclopedia of toxicology, 2nd ed. Oxford: Elsevier, 2005.
17. Perrone J, Phillips C, Gaieski D. Occult metformin toxicity in three patients with profound
lactic acidosis. J Emerg Med 2011; 40(3): 271–275.
18. http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.3949.html?rid=486b5726-948d-483f-
8c61-464670ba6b8e.
19. Moffat AC, Osselton MD, Widdop B, Watts J. Clarke’s analysis of drugs and poisons: in
pharmaceuticals, body fluids and postmortem material, Fourth edition. London:
Pharmaceutical Press, 2011.
20. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/Metformin_hydrochloride.
21. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00331.
22. https://www.google.ro/imgres?imgurl=x-raw-
image%3A%2F%2F%2F63798bf79b7e6076b8d78436f1be095a9064b745fdd26673b3b9
11e4b9f39abe&imgrefurl=http%3A%2F%2Fanimatedproductlabel.com%2Fdemo%2Fd
ownload.ashx%3Ffile%3Ddownloads%2Fmetformin_storyboard.pdf&docid=2KO9GIA
KYNGEYM&tbnid=dmB-
m_eLeWOHEM%3A&w=532&h=410&bih=667&biw=1366&ved=0ahUKEwjx4YWljP
_NAhWKzRoKHX1tA2E4ZBAzCBMoEDAQ&iact=mrc&uact=8#h=410&w=532.
23. Goodarzi MO, Bryer-Ash M. Metformin revisited: re-evaluation of its properties and role
in the pharmacopoeia of modern antidiabetic agents. Diabetes Obes Metab 2005; 7(6):
654–665.
133
24. Lu WR, Defilippi J, Braun A. Unleash metformin: reconsideration of the contraindication

in patients with renal impairment. Ann Pharmacother 2013; 47(11): 1488–1497.
25. Chan JCN, Deerochanawong C, Shera AS et al. Role of metformin in the initiation of
pharmacotherapy for type 2 diabetes: An Asian-Pacific perspective. Diabetes Res Clin
Pract 2007; 75(3): 255–266.
26. Rizos CV, Elisaf MS. Metformin and cancer. Eur J Pharmacol 2013; 705(1–3): 96–108.
27. Cicero AFG, Tartagni E, Ertek S. Mini-Special Issue paper Management of diabetic
patients with hypoglycemic agents Metformin and its clinical use: new insights for an old
drug in clinical practice. Arch Med Sci 2012; 5:907–917.
28. Emami Riedmaier A, Fisel P, Nies AT et al. Metformin and cancer: from the old medicine
cabinet to pharmacological pitfalls and prospects. Trends Pharmacol Sci 2013; 34(2):
126–135.
29. Aljada A, Mousa SA. Metformin and neoplasia: Implications and indications. Pharmacol
Ther 2012; 133(1): 108–115.
30. Leikin JB, Paloucek FP. Poisoning and toxicology handbook, 4th ed. Boca Raton: CRC
Press/Taylor & Francis Group, 2008, 336-337, 445-446.
31. Bouchoucha M, Uzzan B, Cohen R. Metformin and digestive disorders. Diabetes Metab
2011; 37(2): 90–96.
32. Gong L, Goswami S, Giacomini KM et al. Metformin pathways: pharmacokinetics and
pharmacodynamics. Pharmacogenet Genomics 2012; 22(11): 820–827.
33. Duong JK, Roberts DM, Furlong TJ et al. Metformin therapy in patients with chronic
kidney disease. Diabetes Obes Metab 2012; 14(10): 963–965.
34. Tauşer RG, Lupaşcu D, Profire L. Aspecte chimico-farmaceutice în unele clase
terapeutice: curarizante şi medicamente indicate în afecţiuni cardiovasculare. Iaşi:
Junimea, 2006, 51.
35. Sweileh WM. Contraindications to metformin therapy among patients with type 2 diabetes
mellitus. Pharm World Sci 2007; 29(6): 587–592.
36. Stroescu V. Bazele farmacologice ale practicii medicale. Bucureşti: Editura Medicală,
1995, 191-221.
37. Svare A. A patient presenting with symptomatic hypomagnesemia caused by metformin-
induced diarrhoea: a case report. Cases J 2009; 2(1): 156.
38. Dell’Aglio DM, Perino LJ, Todino JD et al. Metformin overdose with a resultant serum
pH of 6.59: survival without sequalae. J Emerg Med 2010; 39(1): e77-e80.
39. Carrillo-Lopez H, Chavez H, Jarillo-Quijada A. Acid-Base Balance and Disorders. In:
Pediatric Critical Care, Philadelphia: Elsevier, 2011, 963–977.
40. Scheen AJ, Paquot N. Metformin revisited: a critical review of the benefit-risk balance in
at-risk patients with type 2 diabetes. Diabetes Metab 2013; 39(3): 179–190.
41. Lin YC, Lin LY, Wang HF, Lin HD. Fasting plasma lactate concentrations in ambulatory
elderly patients with type 2 diabetes receiving metformin therapy: a retrospective cross-
sectional study. J Chin Med Assoc 2010; 73(12): 617–622.
42. Dart RC. Medical toxicology, 3rd ed. Philadelphia: Lippincott, Williams & Wilkins, 2004.
43. Saidi H, Mani M. Severe metabolic acidosis secondary to coadministration of creatine and
metformin, a case report. Am J Emerg Med 2010; 28(3): 388.e5-e6.
44. Van Velzen A, van Riel A, de Vries I, Meulenbelt J. The dangers of metformin: Fatal lactic
acidosis with therapeutic use due to renal failure. Toxicol Lett 2008; 180: S142–S143.
45. Yang PW, Lin KH, Lo SH et al. Successful treatment of severe lactic acidosis caused by
a suicide attempt with a metformin overdose. Kaohsiung J Med Sci 2009; 25(2): 93–97.
46. Van Sloten TT, Pijpers E, Stehouwer CDA, Brouwers MCGJ. Metformin-associated lactic
acidosis in a patient with normal kidney function. Diabetes Res Clin Pract 2012; 96(3):
e57–e58.
134
47. Kreshak AA, Clark RF. Transient vision loss in a patient with metformin-associated lactic
acidosis. Am J Emerg Med 2010; 28(9): 1059.e5-1059.e7.
48. Akoglu H, Akan B, Piskinpasa S et al. Metformin-associated lactic acidosis treated with
prolonged hemodialysis. Am J Emerg Med 201; 29(5): 575.e3-575.e5.
49. Brouwers MCGJ, Schaper N, Keeris L. Does glucose infusion exacerbate metformin-
associated lactate acidosis? A case report. Diabetes Res Clin Pract 2009; 85(1): e1–e3.
50. Al-Makadma YS, Riad T. Successful management of high-dose metformin intoxication.
Role of vasopressin in the management of severe lactic acidosis. Middle East J
Anaesthesiol 2010; 20(6): 873–875.
51. Kim E, Choi S, Kim OJ, Kim KH. Treatment of lactic acidosis due to metformin overdose:
A case report. Abstr Lett 2008; 180S(A14): S32–S246.
52. Locatelli CA, Vecchio S, Bigi S et al. Metformin-related lactic acidosis: A case series.
Toxicol Lett 2010; 196: S89.
53. Dinu V, Truţia E, Popa-Cristea E, Popescu A. Biochimie medicală: mic tratat. Bucureşti:
Editura Medicală, 2006, 124-126.
54. Wiley TE, Arruda BC, Miller NA et al. Excited electronic states and internal conversion
in cyanocobalamin. Chin Chem Lett 2015; 26(4): 439–443.
55. Champe P, Harvey R, Ferrier D. Biochimie Ilustrată, Ediția a 4-a. București: Editura
Medicală Callisto, 2010, 375–377.
56. Mircea C. Enzime şi vitamine. Iaşi: Editura “Gr. T. Popa”, 2010, 216-223.
57. Kumar N. Neurologic aspects of cobalamin (B12) deficiency. In: Handbook of Clinical
Neurology, Elsevier, 2014, 915–926.
58. Andres E. Vitamin B12 (cobalamin) deficiency in elderly patients. Can Med Assoc J 2004;
171(3): 251–259.
59. Jen M, Yan AC. Syndromes associated with nutritional deficiency and excess. Clin
Dermatol 2010; 28(6): 669–685.
60. Greibe E, Trolle B, Bor M et al. Metformin Lowers Serum Cobalamin without Changing
Other Markers of Cobalamin Status: A Study on Women with Polycystic Ovary
Syndrome. Nutrients 2013; 5(7): 2475–2482.
61. Sato Y, Ouchi K, Funase Y et al. Relationship between metformin use, vitamin B12
deficiency, hyperhomocysteinemia and vascular complications in patients with type 2
diabetes. Endocr J 2013; 60(12): 1275–1280.
62. Mazokopakis EE, Starakis IK. Recommendations for diagnosis and management of
metformin-induced vitamin B12 (Cbl) deficiency. Diabetes Res Clin Pract 2012; 97(3):
359–367.
63. Samaras D, Samaras N, Lang PO et al. Effects of widely used drugs on micronutrients: a
story rarely told. Nutr Burbank Los Angel Cty Calif 2013; 29(4): 605–610.
64. Melgar A, Becerril B, Gil T, Olivares J. Déficit de vitamina B12 en paciente tratado con
metformina. Semergen 2008; 34(9): 463–464.
65. Lin HY, Chung CY, Chang CS et al. Hyperhomocysteinemia, Deep Vein Thrombosis and
Vitamin B12 Deficiency in a Metformin-treated Diabetic Patient. J Formos Med Assoc
2007; 106(9): 774–778.
66. Liu KW, Dai LK, Jean W. Metformin-related vitamin B12 deficiency. Age Ageing 2006;
35(2): 200–201.
67. *** The authority on the selection and use of medicines. Pharmaceutical Press 2013.
68. http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.16740595.html?rid=42da42ff-078f-
43b9-855c-ccba1d15c146.
69. Bonfilio R, de Araújo MB, Salgado HRN. A Review of Analytical Techniques for
Determination of Glimepiride: Present and Perspectives. Ther Drug Monit 2010; 32(5):
550–559.
135
70. http://www.caymaneurope.com/msdss/12090m.pdf.
71. http://www.drugbank.ca/drugs/DB00222.
72. http://emedicine.medscape.com/article/1010629-overview.
73. DeRuiter J. Overview of the antidiabetic agents. Spring, 2003.
74. Langtry HD, Balfour JA. Glimepiride. Drugs 2012; 55(4): 563–584.
75. Basit A, Riaz M, Fawwad A. Glimepiride: evidence-based facts, trends, and observations.
Vasc Health Risk Manag 2012; 8: 463–472.
76. Gurjar MK, Joshi RA, Chaudhuri SR et al. Total synthesis of cis and trans-
hydroxyglimepiride: active metabolite of glimepiride. Tetrahedron Lett 2003; 44(26):
4853–4855.
77. Ha WC, Oh SJ, Kim JH et al. Severe Hypoglycemia Is a Serious Complication and
Becoming an Economic Burden in Diabetes. Diabetes Metab J 2012; 36(4): 280.
78. Covvey J, Lewis D. Glimepiride-Induced Hypoglycemia With Ciprofloxacin,
Metronidazole, and Acute Kidney Injury. Hosp Pharm 2010; 45(12): 934–938.
79. Chounta A, Zouridakis S, Ellinas C et al. Cholestatic liver injury after glimepiride therapy.
J Hepatol 2005; 42(6): 944–946.
80. Omar H, Kolla J, Mangar D, Camporesi E. Glimepiride-induced cholestasis in a man with
diabetes mellitus: a case report. J Med Case Reports 2009; 3(1): 9257.
81. Pravinkumar I, Gokul T. Adverse effects of metformin in combination with glimepiride
and glibenclamide in patients with type 2 diabetes mellitus. Asian J Pharm Clin Res 2012;
5:108–110.
82. Yoshino T, Meguro S, Soeda Y et al. A case of hypoglycemic hemiparesis and literature
review. Ups J Med Sci 2012; 117(3): 347–351.
83. Baradol KM, Ladhad DA. Drug Induced Hypoglycemic Coma in a Nondiabetic with
Chronic Liver Disease: A Case Report of Drug Dispensing Error. J Evol Med Dent Sci
2014; 3(39): 9940–9943.
84. Abdel-Ghany MF, Abdel-Aziz O, Ayad MF, Tadros MM. Validation of different
spectrophotometric methods for determination of vildagliptin and metformin in binary
mixture. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 2014; 125: 175–182.
85. Hassan SS, Mahmoud WH, Elmosallamy MA, Othman AHM. Determination of
metformin in pharmaceutical preparations using potentiometry, spectrofluorimetry and
UV–visible spectrophotometry. Anal Chim Acta 1999; 378(1–3): 299–311.
86. Divya K, Narayana B. Metformin HCl : Visible Spectrophotometric Determination in Pure
and Dosage Form. J Single Mol Res 2014; 2(2): 14.
87. Pandit V, Pai RS, Singh G et al. Development and validation of the liquid chromatographic
method for simultaneous estimation of metformin, pioglitazone, and glimepiride in
pharmaceutical dosage forms. Pharm Methods 2012; 3(1): 9–13.
88. Huttunen KM, Rautio J, Leppänen J et al. Determination of metformin and its prodrugs in
human and rat blood by hydrophilic interaction liquid chromatography. J Pharm Biomed
Anal 2009; 50(3): 469–474.
89. Al-Rimawi F. Development and validation of an analytical method for metformin
hydrochloride and its related compound (1-cyanoguanidine) in tablet formulations by
HPLC-UV. Talanta 2009; 79(5): 1368–1371.
90. Mistri HN, Jangid AG, Shrivastav PS. Liquid chromatography tandem mass spectrometry
method for simultaneous determination of antidiabetic drugs metformin and glyburide in
human plasma. J Pharm Biomed Anal 2007; 45(1): 97–106.
91. Wu X, Zhu B, Lu L et al. Optimization of a solid phase extraction and hydrophilic
interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry method for the
determination of metformin in dietary supplements and herbal medicines. Food Chem
2012; 133(2): 482–488.
136
92. Discenza L, D’Arienzo C, Olah T, Jemal M. LC–MS/MS method using unbonded silica
column and aqueous/methanol mobile phase for the simultaneous quantification of a drug
candidate and co-administered metformin in rat plasma. J Chromatogr B 2010; 878(19):
1583–1589.
93. Liu A, Coleman SP. Determination of metformin in human plasma using hydrophilic
interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 2009;
877(29): 3695–3700.
94. Salim M, El-Enany N, Belal F et al. Simultaneous Determination of Sitagliptin and
Metformin in Pharmaceutical Preparations by Capillary Zone Electrophoresis and its
Application to Human Plasma Analysis. Anal Chem Insights 2012; 7: 31-46.
95. Lai E, Feng S. Solid phase extraction—Non-aqueous capillary electrophoresis for
determination of metformin, phenformin and glyburide in human plasma. J Chromatogr
B 2006; 843(1): 94–99.
96. Deng B, Shi A, Kang Y, Li L. Determination of metformin hydrochloride using precolumn
derivatization with acetaldehyde and capillary electrophoresis coupled with
electrochemiluminescence: Determination of metformin hydrochloride. Luminescence
2011; 26(6): 592–597.
97. Thomas AB, Patil SD, Nanda RK et al. Stability-indicating HPTLC method for
simultaneous determination of nateglinide and metformin hydrochloride in
pharmaceutical dosage form. Saudi Pharm J 2011; 19(4): 221–231.
98. Skrzypek S, Mirčeski V, Ciesielski W et al. Direct determination of metformin in urine by
adsorptive catalytic square-wave voltammetry. J Pharm Biomed Anal 2007; 45(2): 275–
281.
99. El-Bagary RI, Elkady EF, Ayoub BM. Liquid chromatographic determination of
sitagliptin either alone or in ternary mixture with metformin and sitagliptin degradation
product. Talanta 2011; 85(1): 673–680.
100. Chhetri HP, Thapa P, Van Schepdael A. Simple HPLC-UV method for the quantification
of metformin in human plasma with one step protein precipitation. Saudi Pharm J 2014;
22(5): 483–487.
101. Zhang L, Tian Y, Zhang Z, Chen Y. Simultaneous determination of metformin and
rosiglitazone in human plasma by liquid chromatography/tandem mass spectrometry with
electrospray ionization: Application to a pharmacokinetic study. J Chromatogr B 2007;
854(1–2): 91–98.
102. Brittain H. Analytical Profiles of Drug Substances and Excipients. New Jersey: Academic
Press, 1998, 261-291.
103. Mohamed AM, Mohamed FF, Ahmed S, Mohamed YAS. An efficient hydrophilic
interaction liquid chromatographic method for the simultaneous determination of
metformin and pioglitazone using high-purity silica column. J Chromatogr B 2015; 997:
16–22.
104. Koseki N, Kawashita H, Niina M et al. Development and validation for high selective
quantitative determination of metformin in human plasma by cation exchanging with
normal-phase LC/MS/MS. J Pharm Biomed Anal 2005; 36(5): 1063–1072.
105. Porta V, Schramm SG, Kano EK et al. HPLC-UV determination of metformin in human
plasma for application in pharmacokinetics and bioequivalence studies. J Pharm Biomed
Anal 2008; 46(1): 143–147.
106. Bonfilio R, de Araújo MB, Salgado HRN. Development and validation of an UV-
derivative spectrophotometric method for determination of glimepiride in tablets. J Braz
Chem Soc 2011; 22(2): 292–299.
107. Samala S, Tatipamula SR, Veeresham C. Determination of Glimepiride in Rat Serum by
Rp-Hplc Method. Am J Anal Chem 2011; 2(2): 152–157.
137
108. Qiu X, Wang H, Yuan Y et al. An UPLC–MS/MS method for the analysis of glimepiride
and fluoxetine in human plasma. J Chromatogr B 2015; 980: 16–19.
109. Kundlik ML, Zaware BH, Kuchekar SR. Rapid and Specific Approach for Direct
Measurement of Glimepiride in Human Plasma by LC-ESI-MS-MS Employing
Automated 96 Well Format: Application to a Bioequivalence Study. J Chromatogr Sci
2012; 50(1): 64–70.
110. Ni XJ, Wang ZZ, Shang DW et al. Simultaneous determination of glimepiride and
pioglitazone in human plasma by liquid chromatography–tandem mass spectrometry and
its application to pharmacokinetic study. J Chromatogr B 2014; 960: 247–252.
111. Salem I, Idrees J, Altamimi J. Determination of glimepiride in human plasma by liquid
chromatography–electrospray ionization tandem mass spectrometry. J Chromatogr B
2004; 799(1): 103–109.
112. Ho E, Yiu K, Wan T et al. Detection of anti-diabetics in equine plasma and urine by liquid
chromatography-tandem mass spectrometry. J Chromatogr B 2004; 811(1): 65–73.
113. Viana IM, Lima P, Soares CDV, Fernandes C. Simultaneous determination of oral
antidiabetic drugs in human plasma using microextraction by packed sorbent and high-
performance liquid chromatography. J Pharm Biomed Anal 2014; 96:241–248.
114. Sengupta P, Bhaumik U, Ghosh A et al. LC–MS–MS Development and Validation for
Simultaneous Quantitation of Metformin, Glimepiride and Pioglitazone in Human Plasma
and Its Application to a Bioequivalence Study. Chromatographia 2009; 69(11–12): 1243–
1250.
115. Siddiqui FA, Sher N, Zubair A et al. Analysis of metformin, glimepiride and pioglitazone
in human serum and its application to pharmacokinetics. Anal Methods 2013; 5(19): 5096.
116. Sultana N. An Ultra-Sensitive and Selective LC-UV Method for the Simultaneous
Determination of Metformin, Pioglitazone, Glibenclamide and Glimepride in API,
Pharmaceutical Formulations and Human Serum. J Anal Bioanal Tech 2014; 4(5): 1-6.
117. Polagani SR, Pilli NR, Gajula R, Gandu V. Simultaneous determination of atorvastatin,
metformin and glimepiride in human plasma by LC–MS/MS and its application to a
human pharmacokinetic study. J Pharm Anal 2013; 3(1): 9–19.
118. Arayne MS, Sultana N, Tabassum A. RP-LC simultaneous quantitation of co-administered
drugs for (non-insulin dependent) diabetic mellitus induced dyslipidemia in active
pharmaceutical ingredient, pharmaceutical formulations and human serum with UV-
detector. Clin Chim Acta 2013; 425: 54–61.
119. Patel K, Karkhanis V, Gajjar S. Development and validation of stability indicating HPTLC
method for estimation of glimepiride and metformin hydrochloride. IJPSR 2015; 6(3):
1222–1229.
120. Biswas A, Basu A. A Novel RP-HPLC Method for Simultaneous Estimation of Metformin
Hydrochloride & Glimepiride in Tablet Dosage Form. Int J Pharm Innov 2011; 1(4): 81–
87.
121. Lakshmi K, Rajesh T, Sharma S, Lakshmi S. Development and validation of liquid
chromatographic and UV derivative spectrophotometric methods for the determination of
Metformin, Pioglitazone and Glimepiride in pharmaceutical formulations. Der Pharma
Chemica 2009; 1(1): 238–246.
122. Arauz-Pacheco C, Parrott MA, Raskin P. American Diabetes Association. Treatment of
Hypertension in Adults With Diabetes. Diabetes Care 2013; 26(Suppl 1): S80–S82.
123. Ranetti MC, Ionescu M, Hinescu L et al. Validation of a HPLC Method for the
Simultaneous Analysis of Metformin and Gliclazide in Human Plasma. Farmacia 2009;
57(6): 728–735.
138
124. Georgiță C, Sora I, Albu F, Monciu CM. Comparison of a LC/MS Method with a LC/UV
Method for the Determination of Metformin in Plasma Samples. Farmacia 2010; 58(2):
158–169.
125. Funduc I. Note de curs Electroforeza capilară. Rev Rom Med Lab 2006; 2(1): 88–94.
126. *** ICH Harmonised Tripartite Guideline - Validation of Analytical Procedures: Text and
Methodology Q2(R1). International Conference on Harmonisation of Technical
Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 2005.
127. Bojiţă M, Roman L, Săndulescu RV, Oprean RN. Analiza și controlul medicamentelor.
Vol. 1. Bazele teoretice și practice. 2003.
128. Roman L, Bojiţă M, Săndulescu R, Muntean DL. Validarea metodelor analitice. București:
Editura Medicală; 2007.
129. https://www.researchgate.net/post/Separating_serum_from_plasma.
130. Tůma P. Large volume sample stacking for rapid and sensitive determination of
antidiabetic drug metformin in human urine and serum by capillary electrophoresis with
contactless conductivity detection. J Chromatogr A 2014; 1345: 207–211.
131. Znaleziona J, Maier V, Ranc V, Ševčík J. Determination of rosiglitazone and metformin
in human serum by CE-ESI-MS. J Sep Sci 2011; 34(10): 1167–1173.
132. Zhou Z, Zhang J, Zhang W et al. Rapid screening for synthetic antidiabetic drug
adulteration in herbal dietary supplements using direct analysis in real time mass
spectrometry. The Analyst 2011; 136(12): 2613.
133. Bojiţă M, Roman L, Săndulescu RV, Oprean RN. Analiza și controlul medicamentelor.
Vol. 2. Metode instrumentale în analiza și controlul medicamentelor. Deva: Editura
Intelcredo, 2003.
134. Chernushevich IV, Loboda AV, Thomson BA. An introduction to quadrupole-time-of-
flight mass spectrometry. J Mass Spectrom 2001; 36(8): 849–865.
135. https://investigacion.us.es/scisi/sgi/servicios/microanalisis/equipamiento.
136. http://www.drugbank.ca/spectra/ms_ms/1843.
137. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3252129/figure/BMR005F1/.
138. Lehr KH, Damm P. Simultaneous determination of the sulphonylurea glimepiride and its
metabolites in human serum and urine by high-performance liquid chromatography after
pre-column derivatization. J Chromatogr 1990; 526(2): 497–505.
139. Marques MAS, Soares A, Pinto OW et al. Simple and rapid method determination for
metformin in human plasma using high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry: Application to pharmacokinetic studies. J Chromatogr B 2007; 852(1–2):
308–316.
140. Mazokopakis EE, Starakis IK. Recommendations for diagnosis and management of
metformin-induced vitamin B12 (Cbl) deficiency. Diabetes Res Clin Pract 2012; 97(3):
359–367.
141. Beulens JWJ, Hart HE, Kuijs R et al. Influence of duration and dose of metformin on
cobalamin deficiency in type 2 diabetes patients using metformin. Acta Diabetol 2015;
52(1): 47–53.
142. Lin HY, Chung CY, Chang CS et al. Hyperhomocysteinemia, deep vein thrombosis and
vitamin B12 deficiency in a metformin-treated diabetic patient. J Formos Med Assoc
Taiwan Yi Zhi 2007; 106(9): 774–778.
143. Tung ML, Tan LK. Long term use of metformin leading to vitamin B 12 deficiency.
Diabetes Res Clin Pract 2014; 104(3): e75–e76.
144. Samaras D, Samaras N, Lang PO et al. Effects of widely used drugs on micronutrients: A
story rarely told. Nutrition 2013; 29(4): 605–610.
139
145. Mahajan R, Gupta K. Revisiting Metformin: Annual Vitamin B12 Supplementation may
become Mandatory with Long-Term Metformin Use. J Young Pharm 2010; 2(4): 428–
429.
146. Kocacfitci G, Aydogan U, Akbulut H et al. The effects of metformin and metformin plus
calcium treatments on serum vitamin B12 levels. Nobel Med 2013; 9(3): 58–63.
147. Obeid R, Jung J, Falk J et al. Serum vitamin B12 not reflecting vitamin B12 status in
patients with type 2 diabetes. Biochimie 2013; 95(5): 1056–1061.
148. Sahin M, Tutuncu NB, Ertugrul D et al. Effects of metformin or rosiglitazone on serum
concentrations of homocysteine, folate, and vitamin B12 in patients with type 2 diabetes
mellitus. J Diabetes Complications 2007; 21(2): 118–123.
149. Xu L, Huang Z, He X et al. Adverse effect of metformin therapy on serum vitamin B12
and folate: Short-term treatment causes disadvantages?. Med Hypotheses 2013; 81(2):
149–151.
150. De Groot-Kamphuis DM, van Dijk PR, Groenier KH et al. Vitamin B12 deficiency and
the lack of its consequences in type 2 diabetes patients using metformin. Neth J Med 2013;
71(7): 386–390.
151. Johnson RJ, Nakagawa T, Sanchez-Lozada LG et al. Sugar, Uric Acid, and the Etiology
of Diabetes and Obesity. Diabetes 2013; 62(10): 3307–3315.
152. Liu P, Jiang Y, Meng J. Relationship between serum uric acid, metabolic syndrome and
resting heart rate in Chinese elderly. Obes Res Clin Pract 2016; 10(2): 159–168.
153. Bartáková V, Kuricová K, Pácal L et al. Hyperuricemia contributes to the faster
progression of diabetic kidney disease in type 2 diabetes mellitus. J Diabetes
Complications 2016; 30(7): 1300–1307.
154. http://apps.who.int/iris/bitstream/10665/204871/1/9789241565257_eng.pdf?ua=1&ua=1.
155. http://www.dtu.ox.ac.uk/riskengine/.
156. Coleman R, Stevens R, Holman R. Undated UKPDS Risk Engine that estimates Primary
and Secondary Cardiovascular Disease Risk in People with Recently-Diagnosed or
Established Type 2 Diabetes. Diabetes 2012; 61(Suppl 1): A264.
140
ANEXE
Listă cu articole publicate
Lucrare publicată în reviste cotate ISI
Quantitative Determination of Metformin by Capillary electrophoresis with UV

Detection
Anca-Monica Strugaru, Cornelia Mircea, Luminița Agoroaei, Gina Botnariu, Ioana-
Cezara Grigoriu, Teodora Daniela Marti, Elena Butnaru
Rev. Chim. (Bucharest), 2015; 66(9): 1448-1451
Lucări publicate în reviste indexate BDI
Metformin Induced Lactic Acidosis – Particularities and Course

Anca-Monica Strugaru, Gina Botnariu, Luminița Agoroaei, Ioana-Cezara Grigoriu,
Elena Butnaru
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. (Iași), 2013; 117(4): 1035-1042
Low Levels of Serum Cyanocobalamin in a Metformin-Treated Patient. Case Report

and Comparison with Literature Data
Anca-Monica Strugaru, Gina Botnariu, Cristina Tuchiluș, Ecaterina Anisie, Luminița
Agoroaei, Ioana-Cezara Grigoriu, Elena Butnaru
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat. (Iași), 2016; 120(2): 464-468
141
Aviz Comisie de Etică a Cercetării
142
Consimțământ informat
CONSIMȚĂMÂNT
Titlul studiului: Determinarea concentrației serice de vitamina B12 la pacienții
tratați cu metformin
Studiul este efectuat de farm. drd. Anca-Monica Strugaru, coordonator științific Prof. Dr. Elena
Butnaru, Disciplina de Toxicologie, U.M.F. “Grigore T. Popa” Iași
Scopul și descrierea studiului

Sunteți invitat să luați parte la un studiu clinic care urmărește determinarea influenței
tratamentului cu metformin asupra nivelului seric de vitamina B12.
Scopul acestui consimțământ este de a explica în ce constă studiul și de a vă solicita permisiunea
pentru recoltarea probelor de sânge și pentru prelucrarea datelor dumneavoastră.
În urma acestui studiu se vor analiza efectele metforminului asupra cianocobalaminei și se va
putea stabili legătura între tratamentul cu metformin, concentrația în sânge a medicamentului și
nivelul seric al vitaminei B12.
La acest studiu vor putea participa pacienții diagnosticați cu diabet zaharat, care se află sub
tratament cu metformin, unul dintre cele mai frecvent utilizate medicamente antidiabetice, sau
care nu au avut niciodată tratament cu această substanță.
Ce va implica participarea la studiu

Dacă hotărâți să luați parte la acest studiu, în cadrul internării de zi din cadrul Clinicii de Diabet,
Nutriție și Boli Metabolice, Spitalul Clinic Județean de Urgențe “Sf. Spiridon” Iași, vi se va
recolta, cu ocazia analizelor de rutină, aproximativ 5 mL sânge în plus. Studiul presupune o
singură recoltare de sânge și nu implică revenirea la Clinica de Diabet, Nutriție și Boli
Metabolice sau în altă unitate medicală. Riscurile asociate sunt minime, fiind legate de
posibilele incidente asociate punctiei venoase: durere sau tumefiere la locul de injectare.
Participarea la acest studiu este voluntară. Puteți refuza acum sau puteți decide să participați și
apoi să vă retrageți din studiu. Dacă hotărâți să nu participați sau să vă retrageți comsimțământul
după începerea studiului, nu trebuie să oferiți un motiv.
Beneficiile studiului
Acest studiu ne va permite o mai bună urmărire a efectelor adverse ale tratamentului pe termen
lung cu medicamentul antidiabetic metformin.
143
Protejarea datelor și a confidențialității

În cadrul studiului, vor fi colectate informații medicale despre dvs. și vor fi analizate împreună
cu probele dvs. Aceste date, inclusiv consimțământul, vor fi păstrate într-un dosar separat, la
loc sigur. Probele dvs. vor fi utilizate numai în scopul menționat în acest consimțământ. Probele
vor fi stocate la loc sigur, fiind codificate (numerotare aleatorie) astfel încât cei care lucrează
cu aceste probe nu vor avea acces la numele sau alte detalii despre dvs. Singura persoană care
va deține toate datele, inclusiv codificările, este investigatorul principal, farm. Anca-Monica
Strugaru.
Rezultatele determinărilor vă vor putea fi comunicate, însă doar personal, fără utilizarea
intermediarilor.
Persoane de contact, ce vor fi disponibile pentru dvs. pe durata studiului: Dr. Gina Botnariu,
Farm. Anca-Monica Strugaru – Email: strugaru_monica@yahoo.co.uk.
Semnătura de mai jos indică faptul că

1. Am citit acest formular și mi s-a explicat conținutul.
2. Am putut discuta și pune întrebări despre studiu.
3. Mi s-a dat timp să mă gândesc dacă să particip sau nu la acest studiu.
4. Am decis de bună voie să particip la acest studiu.
5. Am primit un exemplar.
NUMELE PACIENTULUI: .........................................................................

SEMNĂTURA PACIENTULUI: ..................................................................
DATA: .........................................................................................................
NUMELE INVESTIGATORULUI:..............................................................
SEMNĂTURA INVESTIGATORULUI: ......................................................
DATA: .........................................................................................................
144

Teza Strugaru Anca Monica

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Teza Strugaru Anca Monica

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Digitally signed by

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

STUDIUL CHIMICO- ȘI CLINICO-

Domeniul major de intervenţie 1.5 „Programe doctorale și post-doctorale în sprijinul cercetării”

Contract nr.: POSDRU/159/1.5/S/136893

Beneficiar: Universitatea de Medicină şi Farmacie ”Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca

Partener P4 Universitatea de Medicină și Farmacie “Grigore T. Popa” Iași

A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

1. DIABETUL ZAHARAT. GENERALITĂȚI ................................................................................9

3.2. ACIDOZA LACTICĂ ..........................................................................................................27

6. MOTIVAȚIA ALEGERII TEMEI ȘI OBIECTIVELE PROPUSE ............................................49

9.2. PRINCIPII TEORETICE......................................................................................................74

10.1.2.2. Cazul 2 ................................................................................................................102

Aviz Comisie de Etică a Cercetării ............................................................................................142

HDL – High density lipoprotein

A. STADIUL ACTUAL AL CUNOAȘTERII

1. DIABETUL ZAHARAT. GENERALITĂȚI

Diabetul zaharat reprezintă o tulburare metabolică cronică, descrisă prin dezechilibre

1.1. DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2

1.1.1. Epidemiologia diabetului zaharat de tip 2

Potrivit datelor publicate pe www.data.gov.ro, prin compararea numărului pacienților

1.1.2. Cauzele diabetului zaharat de tip 2

Hiperglicemia pe nemâncate este cauzată de rezistența la insulină de la nivel hepatic, pe

1.1.3. Complicațiile cronice ale diabetului zaharat de tip 2

1.1.3.1. Nefropatia diabetic

1.1.3.2. Retinopatia diabetică

Reprezintă o altă complicație cronică a diabetului zaharat. Se caracterizează prin leziuni

1.1.3.3. Neuropatia diabetică

1.1.3.4. Bolile cardiovasculare

1.2. TERAPIA ORALĂ ÎN DIABETUL ZAHARAT DE TIP 2

Acești compuși sunt secretagogi non-sulfoniluree care acționează la nivelul canalului K

Tiazolidindionele sunt sensibilizatori pentru insulină, agoniști selectivi pe receptorul

Sunt inhibitori ai dipeptidil peptidazei 4, enzimă ce inactivează rapid atât GLP-1

1.2.6. Alte structuri

1.2.6.1. Inhibitori al alfaglucozidazei

Reprezentanți: acarboza, miglitol.

1.2.6.2. Inhibitori ai aldoreductazei

Reprezentanți: tolrestat, epalrestat.

2.1. SCURT ISTORIC

2.1.1. Originile naturale ale metforminului – Galega officinalis Linn

Fig. 1.1. Galega officinalis Linn (11)

Se consideră că G. officinalis a fost utilizată în medicina populară pentru a trata

2.1.2. Derivați biguanidici de sinteză

2.1.3. Istoricul metforminului

În anul 1929 au fost sintetizați mai mulți compuși biguanidici cu acțiune

Jean Sterne și contribuția sa în evoluția biguanidelor

Fig. 2.2. Jean Sterne și Spitalul Laennec din Paris (12)

2.2. CARACTERISTICI FIZICO-CHIMICE ALE METFORMINULUI

Fig. 2.3. Structura chimică a metforminului (18)

Clorhidratul de metformin se prezintă sub formă de pulbere albă, cristalină,

Tabel 2.I. Proprietăți fizice ale metforminului (18,21)

2.3. MECANISMUL DE ACȚIUNE AL METFORMINULUI ÎN TERAPIA

Mecanismul de acțiune al metforminului asupra metabolismului glucidic și lipidic se

Fig. 2.4. Acțiunea metforminului asupra metabolismului glucidic

În plus, metforminul acționează ca antidiabetic prin creșterea sensibilității la insulină la

Fig. 2.5. Conduita terapeutică în inițierea terapiei orale antidiabetice

2.4. ALTE ACȚIUNI TERAPEUTICE ALE METFORMINULUI

Pe lângă efectele terapeutice ale metforminului expuse în subcapitolul 3.3, această

Fig. 2.6. Mecanismul antidiabetic și antitumoral al metforminului

Sindromul ovarului polichistic este un sindrom complex, una dintre afecțiunile

Unele studii afirmă că efectele benefice ale metforminului în sindromul ovarului

2.5. PARTICULARITĂȚI TOXICOCINETICE ALE METFORMINULUI

Fig. 2.7. Cinetica metforminului (adaptat după Gong, 2012) (32)