Daniela Lucia MUNTEAN Marius BOJITA

CONTROLUL MEDICAMENTELOR

ar
(D O
2!
0)
r-
C:
m o
a 5>*

lgf O ^ »„
3 ft) ;.vS'.
t?a m
I J3
<D q o
to a o>
.«• 3 S
I Q)

ei
.'-"'*. "L. •* - '
OJ
o
Daniela Lucia MUNTEAN Marius BOJITA

MEDICAMENTELOR
Metode spectrale, cromatografice
si electroforetice de analiza

Editura Medicala Unversitara

,,!uliu Hatieganu"
Cluj-Napoca
 1.1. GENERALITATI ......................................................................................... ]
7.7.7. Spectre de absorbtie moleculara ___j
1.1.2. Spectre de absorbtie si emisie atomica ........ ........ 7
1.1.3. Utilizarea analitica a spectroscopiei ........... ... /O
1.2. SPECTROFOTOMETRIA IN ULTRAVIOLET si VIZIBIL ............................... ;.. 12
1.2.1. Analiza calitativa prin spectrofotometrie in UV-V1S 14
1.2.2. Analiza cantitativa prin spectrofotometrie UV-VIS ...25
1.2.3. Dozarea substantelor in probe cu mat multe componente ................ 30
1.2.4. Determinarea constantelor termodinamice $2
1.2.5. Aparatura folosita in spectrofotometria UV-VIS .............................. 55
1.2.6. Conditii optime ale masuratorilor spectrofotometrice ...57
1.3. SPECTROSCOPIA DE FLUORESCENTA. ASPECTS TEORETICE si PRACTICE .54
Fluorescenta si fosforescenta ........................................................... (,4
Orieinea fluorescentei si fosforescentei ............................................ <jj
Factori care influenteaza fluorescenta ....68
Aparatura uti/izata in spectroscopia de fluorescenta ....81
Polarizatia de fluorescenta .............................................................. 57
Aplicafii ale spectrofluorimetriei ...................................................... po
Exemple practice de determinate a componentelor active din forme
farmaceutice prin spectrofluorimetrie ........................................................... <JJ
1.4. SPECTROSCOPIA tN INFRAROSU ............................................................... 98.
1.4.1. Generalitati ............................................................. gfj
1.4.2. Aspecte tehnice ale spectrometriei in 1R ................ ...106
Toate drepturile apartin Editurii Medicale 1 .4.2. 1 Spectrometre si analizoare in IR ................ ....106
Universitare ,,iuliu Hatieganu". 1.4.2.2 Surse si detectori in IR .................................................................... UQ
1.4.2.3 Tehnici de examinare a probelor ...,113
1.4.3. Analiza calitativa in IR .................................................... ...118
Descrierea CiP a Bibliotecii Naiionale a Romaniei: 1.4.4. Analiza cantitativa in IR ]2]
Muntean, Daniela Lucia 1.4.5. Date spectrale privind identificarea unor compusi medicamentosi
ControlL'l medicamentelor matode spectrale, prin suectrometrie in IR si spectrofotometrie UV- VIS J25
cromatografice si electrcforetice de analiza/
1.5. SPECTROSCOPIA ATOMICA ..................................................... ...131
Generalitati.....................................................................................73;
Daniela Lucia Muntean, Marius Bojita - Cluj-Napoca:
Etape in analiza prin spectroscopie alomica .................................. ;jy
Editura Medicala Universitara Juliu Hatieganu", 2004
Analiza cantitativa in absorbtia atomica .133
Bibliogr. Analiza cantitativa in emisia atomica jjg
Prepararea probelor ...................................... 737
ISBN 973-693-041-6 Spectrometria de absorbtie atomica ............................................... 73$
.1 Principii ............................................................................................. 133
1.5.6.2 Apiicatii ............................................................................................ 143
I. Bojita, Marius 7.5.7. Spectrometria de emisie atomica .................................................... 144
1.5.7.1 Spectrele de emisie ......................... ....144
1.5.7.2 Spectrometria de ernisie in flacSra (flamfotometria') ...................... 145
1.5.7.3 Spectrometria de emisie tn plasmS ............................................. 143
1.5.7.4 Aplicafii ....149
 METODE CROMATOQRAFICE SI ELECTROFORETICE 150

2.1. ISTORIC -- 150

2.2. CLASIHICARF.A METODELOR CROMATOGRAFICE 152 Asigurorea calitatii medicamentului Tn conformitate cu
2.3. CROMATOGRAFLA PE COLOANA 153 exigenfele moderne, un deziderat devenit realitate Tn ultimul deceniu,
2,3. L Aspects generate 153
153 include ca parte integrants Controlul Medicamentelor Tn toate etapele
2.3.1.1 Procesul cromatoerafie
2.3.1.2 Cromatograma si importanta ei. 165 parcurse, de la producfie la utilizare.
2.3.1.3 Analiza calitativS si cantitativS in cromatografia pe coloana 178 Lucrarea de fata conceputa sub forma unui manual, cuprinde
2.3.1.4 Principalele tipuri de separare cromatoeraficS 184
Tntr-o forma condensata informatii esentiale privind metodele
2.3.2. Cromatografia de lichide de inalta performanta pe coloana 229
2.3.2.1 Principiu si tchnica 229 instrumentale cele mai utilizate m analiza chimica cantitativS (cu
2.3.2.2 Aleeerea unei metode HPLC 239 exceptia metodelor volumetrice):
2.3.2.3 Cateva considerente privind dezvoltarea iinei metode HPLC. 240
- metode spectrale : spectrofotometria UV, VIS, IR,
2.3.2.4 Aplica^ii ale cromatografiei de lichide de inalta performanta pe
coloana in domenml fannaceutic. 243 spectroscopia atomicd, spectrof luorimetria moleculara
2.3.3. Cromatozrafia in faza eazoasa 252 metode de separare si analiza cromatografica si
2.3.3.1 Aspecte ftenerale ..252 electroforetica
2.3.3.2 Tehnica cromatografiei de gaze. 253
2.3.3.3 Coloanele utilizate in eaz-cromatografie 264 Destinata Tn primul rand studentilor si rezidentilor facultatilor
2.3.3.4 Aplicatii ale cromatografiei de eazetn analiza medicamentelor 268 de f armacie, ea se adreseaza Tn egala masura |i celor ce Tsi desf asoara
2.4. CROMATOGRAFIA PLANARA. .271
activitatea Tn laboratoare de analiza farmaceutica, biochimicS,
2.4.1. Generalitati... .271
.271 agroalimentara etc.
2.4.2. Principiul si tehnica cromatosrafiei planare
2.4.3. Parametriide separare si retenfie .279 Metodele de analiza prezentate cupn'nd conceptele teoretice de
2.4.4. Aplicatii ale cromatosrafiei planare in domeniul analizei baza, principalele tehnici instrumentale corespunzatoare si o abundenfa
medicamentelor. . 281 de aplicatii practice menite sa orienteze cititorul Tntr-o abordare
2.5. ELECTROFOREZA CAPILARA ..283
corecta si competenta a problemelor privind nature, compozitia si
2.5.1. Princioii de baza m electroforeza capilara 283
2.5.2. Mobilitatea electroforetica si fluxul electro-osmotic 285 structure compusului studiat.
2.5.3. Aparatura utilizata in electroforeza capilara 290 Dedicam aceasta carte studentilor nostri cu speranta ca va
2.5.4. Tehnici electroforetice 292 constitui un ghid de aplicare a cunostintelor lor de chimie, fizica, chimie
2.5.5. Asvecte eenerale vrivind utilizarea tehnicilor electroforezei capilare analitica, chimie-fizica, etc.Tn controlul medicamentului.
in industria farmaceutica. 297
Adresam mulfumirile noastre respectuoase si alese ganduri
2.5.6. Aplicatii ale electroforezei capilare. 299
prietenilor dragi pentru entuziasmul si profesionalismul cu care au
3, BIBL1OGRAFIE. .301
contribuit la aparitia acestei lucrari, transformand visulTn realitate.
Multumim Tn egala masura colegilor care au citit manuscrisul Tn
parte sau integral si care ne-au fost de un real ajutor prin sugestiile sau
corecturile propuse.

Autorii
1. SPECTRALE DE ANAllZA

1.1. GENERALITATl

Diferite tipuri de energie radianta": undele radio, lumina

vizibila, radiatiile X, radiatiile y, aparent diferite poarta numele
generic de radiatii electromagnetice, au proprietati similare §i se
clasifica Tn functie de:
a. lungimea de undS A, (exprimata Tn (am, nm, A)
1 |im = 1 000 nm = 10 000 A
1
b. numarul de unda v (exprimat Tn cm" )
- 1
Y r= —
X
c. frecventa v (exprimata Tn hertz)

unde c este viteza lurninii.

Tn tabelul 1.1.1. sunt grupate principalele regiuni ale

spectrului electromagnetic.

Tabelul 1.1.1. Principalele regiuni ale spectrului electromagnetic

Regiunea Lungimi de Numere de i Frecvente

spectrala unda X, nm wnda v, cmr1' v; hertz
UV Tndepartat 10-200 10 6 -50- 103 30 .10 3 - 1500
UV apropiat 200-380 50000-26300 1500-787
VIS 380-780 26300-12800 787-385
IR apropiat 780-300 12800-3333 385-100
IR mediu 3000-30000 3333-333 100-10
IR Tndepartat 30000-300000 333-33,3 10-1
Microunde 300000-1 09 33-0,01 1-0,003
 Ciasificarea spectrelor - conditia Bohr
Se disting douS tipuri de spectre:
• Spectre de emisie
Cand atomii sau moleculele sunt supuse unor efecte
termice intense sau unor descarcari electrice, ei pot sa
absoarba energie trecand Tntr-o stare excitata.
Revenirea la starea fundamentals se realizeaza cu
emisia unei radiatii, aceasta emisie fiind rezultatul unei
tranzitii a atomului sau moleculei respective din starea
excitatS Tn starea fundamentals: atomii excitati produc
eel mai adesea spectre de linii iar moleculele excitate,
spectre de benzi.
• Spectre de absorbtie
Cand lumina continua traverseaza un compus
transparent, o parte a radiatiilor sale sunt absorbite si o
parte transmise.
Rela^ia dintre diferenta de energie a starilor excitata si
fundamentala a moleculelor sau atomului §i frecventa luminii
emise sau absorbite este data de conditia lui Bohr:
hv = Ef - Ei
unde h, constanta lui Planck, Ef, energia finals, Ej, energia
initial^.
Alte spectre
Exists spectre care se obtin fara un schimb de energie cum
sunt:
- spectrele de refractie (stau la baza refractometriei)
- spectre de dispersie - dispersia Rayleigh, Raman
- spectre de difractie (stau la baza difractometriei)
1.1.1. Spectre de absorbtie moleculara
Spectrele de absorbtie moleculara sunt grupate Tn:
- spectre de rotatie
- spectre de rotatie-vibratie
- spectre electronice
Spectre de rotatie
Spectrul de rotafie al unei molecule este asociat
schimbarilor de energie de rotatie fSra sa fie Tnsotite simultan
de variatii ale stSrilor electronice si vibrationale.
Diferentele de energie Ef- Ei Tntre starile rotationale sunt
mici, frecventa luminii care provoacS aceste schimbari de stare
este foarte scazuta si lungimea sa de unda foarte ridicata.
Spectrele sunt observate Tn IR Tndepartat si Tn domeniul
microundelor.
Spectre de rotatie-vibratie
Spectrele de rotatie-vibratie sunt asociate tranzitiilor Tn
care starile vibrationale ale moleculei sunt alterate §i pot fi
Tnsotite de schimbari ale starilor de rotatie.
Diferentele de energie Tntre starile vibrationale ale unei
molecule sunt mai mari decat cele Tntre starile rotationale,
absorbtia luminii manifestandu-se la frecvente ridicate si lungimi
de unda scazute. Este domeniul IR mediu.
Spectre electronice
Spectrele electronice provin din tranzitiile Tntre stSrile
electronice ale moleculei (specie!) Tnsotite de tranzitii simultane
Tntre starile de vibratie si rotatie.
Absorbtia se manifesta la frecvente ridicate si lungimi de
unda relativ scazute, deci corespund domeniului UV-VIS.
Relatiile Tntre diferitele tipuri de energie moleculara si
spectrele corespunzatoare sunt reprezentate Tn figura 1.1.1.
 Nivele vibrationale ale
ale prlmei stari electronice Aceasta expresie este o consecinta a principiului Born-
excitato
Oppenheimer care stipuleaza ca Tntr-o primS aproximatie, data
fiind masa mult mai mare a nucleelor Tn raport cu cea a
electronilor, se poate calcula energia electronica a moleculei
considerand nucleele fixe. Ee, Ev si Er au ordine de marime
Prima stare foarte diferite si variaza Tn modul:
electronics excitata

Ee » Ev » Er

Conform mecanicii cuantice nivelurile de energie

® electronica, vibrationala, rotationala sunt cuantificate.
Fenomenul de rotatie poate fi imaginat considerand
cazul simplu al unei molecule biatomice care la temperatura
obisnuita executa o miscare de rotatie Tn jurul unei axe
perpendiculare pe dreapta ce uneste centrele atomilor trecand
prin centrul de greutate al moleculei. Presupunand ca distanta
Tntre cele doua nuclee nu variaza, conform mecanicii cuantice
singurele valori permise pentru Er sunt date de relatia:

h2
E r =J(J
Starea electronica Nivela vibrationale ale Nivele rotatlonale pe diferite
fundamental starii electronice fundamentale nivele de vibratie
unde I este momentul de inertie al moleculei, J numarul cuantic
de rotatie.
Figura 1.1.1. Nivelele energetice ale unei molecule Singurele tranzitii posibile sunt acelea pentru care AJ =
±1, prin urmare energia de tranzitie este si ea cuantificata §i
Complexitatea spectrelor de benzi deriva din expresia poate varia numai prin salturile care corespund regulei de
energiei unei molecule: m timp ce pentru un atom, nivelu! tranzitie AJ = ± 1, motiv pentru care spectrul de rotatie pur
energetic depinde doar de structura electronica, in cazul apare sub forma de linii. Se Tntelege ca nivelele de energie de
moleculei trebuie sa se tina cont de faptui ca atomii constituent! rotatie nu sunt echidistante.
sunt supu§i unor miscari de rotatie si vibratie, fiecare De mentionat faptui ca nu toate moleculele diatomice
caracterizata printr-o anumita energie. dau spectre de rotatie, este necesar ca centrele de greutate a
Energia totala a moleculei este suma termenilor sarcinilor electrice pozitive (nuclee) si negative (electron!) sa fie
corespunzatori energiei eiectronice Ee, de vibratie Ev si de distincte.
rotatie Er: Spectrele de rotatie permit calculul distantelor
intramoleculare pe baza momentelor de inertie.
E = Ee Er

Fenomenul de vibratie poate fi Tnteles considerand
dreapta ce uneste centrele celor doi atomi care vibreaza de o
parte §i alta a pozijiilor lor medii pe dreapta.
Pentru miscari de vibratie de amploare redusa se poate
admite ca oscilatorii sunt armonice. In aceasta aproximare de
oscilator armonic dupa mecanica cuanticS, diversele nivele de
energie de vibratie sunt cuantificate si nu pot lua decat valori
date de relatia:
Ev = (v+1/2) hv
unde v este frecventa de vibratie si v numar cuantic de vibratie.
Se observa ca nivelele de energie de vibrate sunt
echidistante §i ca energia nu este nula pentru v = 0. In acelasi
timp se constata ca la 0 absolut, moleculele poseda o anumita
energie.
Energia totala a rotatorului rigid osciland armonic Ev+r va
fi:
Termenul hv este mult mai mare decat h2/(8rc2l), exista deci
pentru un singur nivel de vibrajie mai multe nivele de rotatie.
Pentru spectrele de rota|ie-vibratie, tranzitiile permise
sunt cele pentru care:
Av = ± 1 §i AJ = ± 1
Av = ± 1 si AJ = 0
Tranzitiile electronice pot fi usor explicate plecSnd de la
orbitalii moleculari, eel mai adesea implicati, fiind orbitalii a, a*,
n, TI* si orbitalii de nelegatura.
Tranzitiile electronice sunt deci de tipul:
cr —> a*, 7t ->• cr*. it -> n*, n -> n*, n -> CT*
G
Cateva reguli de selecjie care trebuie luate Tn
considerare:
- toate tranzitiile electronice sunt msotite de o varia^ie a
numerelor cuantice de rotate si vibrate
- variafla numarului cuantic de vibratie este aleatorie
- Tn cursu! unei tranzitii electronice AJ = ± 1 sau 0
Pentru o tranzifle electronic^ data, exista Tn general mai
multe benzi, prin urmare:
- o banda corespunde unei anume tranzitii electronice,
respectiv, de vibratie si mai multor tranzitii de rotatie diferite
(fiecare contribuind cu o radiatie Tn banda respectiva)
- un sistem de benzi corespunde unei tranzitji electronice, dar
mai multor tranzitii de vibratie (si rotatie)
1.1,2. Spectre de absorb!ie §i erreisie
In atomi, nivelele energetice nu depind decat de
structura electronica, respectiv de electronii care se gasesc Tn
straturile de valenta (electron! de valenta) dar Tn aceeasi
masura pot exista tranzitii care intereseaza electronii din
straturile profunde sj care conduc la spectroscopia de radiatii X.
Cazul atomilor si speciilor hidrogenoide
Atomii §i speciile hidrogenoide nu poseda decat un
electron - cazul hidrogenuiui, He+, Li2+, etc. - ecuatia lui
Schrodinger corespunzatoare putand fi rezolvata cu precizie,
solutiile conduc la nivele de energie discrete ale caror valori
sunt dependente de numarul cuantic principal numit numar
cuantic n (n = 1, n = 2, n = 3, etc.).
Tabelul 1.1.2. Numerele cuantice corespunzatoare straturilor §i
substraturiior
. A" .
»v
1

Rezolvarea ecuatiei lui Schrodinger conduce la aparitia
numerelor cuantice:
- numarul cuantic / (numar cuantic secundar) care poate
lua valorile / = 0, 1, ..., n-1 §i care defineste substraturile s (/ =
0), p (/ = 1), d (7 = 2), f (/ = 3). Astfel pentru un strat n exists un
numar de substraturi de la 0 la n - 1 (tabelul 1.1.2).
- numarul cuantic magnetic m. Fiecare substrat p, d, f
este la randul lui subdivizat in substraturi definite de valorile lui
m care pot fi m = -/, -7 + 1 0 7-1,7.
Exemplu: exista 3 substraturi p (/ = 1) carora le
corespund valorile numarului magnetic m = -1, 0, 1; 5
substraturi d, 7 substraturi f, etc.
Nivelele energetice si tranzitiile permise pentru speciile
hidrogenoide sunt prezentate in figura 1.1.2.
Energie
n=4
n=3
n =2
Regulile de selectie demonstreaza ca tranzitiile permise
Tn emisie si absorbtie sunt cele pentru care A/ = ± 1 si Am/ = 0,
±1. Exemplu: orbitalul 4s poate participa la o tranzitie cu toti
orbitalii p (exceptand 4 p cand AE = 0) Tn timp ce un electron p
poate participa la o tranzitie cu orbitalii s si d (exceptand cazul
Tn care numSrul cuantic principal este acelasi).
Cazul speciiior eu mai multi electron!
In acest caz ecuatia lui Schrodinger nu poate fi exact
rezolvata datorita interactiunilor interelectronice. Prezenta mai
multor electron! are drept consecinja dependenta energiei
substraturilor atat de valorile lui n cat si de cea a valorilor lui /.
Rezolvarea numerica a ecuatiei lui Schrodinger demonstreaza
ca energiile electronice se repartizeaza Tn grup (figura 1.1.3).
Un electron poate fi definit utilizand patru numere
cuantice:
- numar cuantic principal n
- numar cuantic secundar /
- numar cuantic magnetic m
- numar cuantic de spin s
-36
1.1.3. Rspartizarea energiilor electronics
9
 Numa'rul cuantic de spin poate avea doar doua valori: Tn continuare se vor trata metodele de analiza calitativS
+1/2 si -1/2. si cantitativa cele mai frecvent utilizate Tn domeniul controlului
Legatura Tntre numerele cuantice amintite este data de medicamentelor:
principal de excluziune al lui Pauli: doi electroni nu pot avea - pentru molecule
toate cele patru numere cuantice identice, daca au numerele n, spectrofotometria UV-VIS
I, m identice, spinul lor trebuie sa fie diferit (opus). spectrometria Tn IR
Existenta spinului electronic complica spectrele atomice spectrofluorimetria
si antreneaza o multiplicitate de radiatii suplimentare. - pentru atomi
absorbtia atomica
1.1.3. Utilizarea anaSitica a emisia atomica
spectroscopiei
Tabelul 1.1.3. Metode spectrale de analiza
Analizele prin spectroscopie sunt rapide, nu necesita o .Metode
aparatura complicata §i cantitati mari de substanta de analizat. Metode bazate bazate pe
!: Natura Mecanismu! . Domeniul
pe fenbmenul ; fenomenul de
Cele trei componente de baza ate unui spectrofotometru sunt: specie! de activare , spectral
de afasorbtie emisie §i
- o sursa de energie fluorescenta_
- un monocromator Tranzitia
Spectrometrie Fluorescent^ si
- un sistem de detectie electronilor de UV-VIS
UV-VIS fosforescenta
In functie de natura sursei de energie si a sistemului de valenta
Moteculara
detectie se disting mai multe tehnici: Tranztyi Spectrometrie
IR
Spectroscopia - excitare prin caldura (flacara) - cu detectie vibrationale IR
vizuala Fluorescenta
Spectrografia - excitare prin lumina sau caldura - detectie prin atomica
Tnregistrare pe o placa fotografica Tranzitia Spectrometrie Spectrometria
Spectrometria electronilor de UV-VIS de absorbtie de emisie
Colorimetria - excitare prin lumina, detectie vizuala valenta atomica atomic^ si
fotometria de
Fotometria - excitare prin lumina si selectarea unui
flacara
domeniu spectral cu ajutorul filtrelor - detectie /atomic^ Tranzitia
fotoelectricS electronilor din
Radiafii X
Spectrofotometria - excitare prin lumina, straturile
selectarea unei lungimi de unda cu ajutorul unui interne
monocromator si utilizarea unui detector (celula Tranzitia
starilor de spin Fluorescenta
fotoelectrica) Unde radio RMN
supuse unui de raze X
In tabelu! 1.1.3. sunt prezentate diferitele metode camp magnetic
spectrale utilizand radiatiile UV-VIS sau alte radiatii ale Inversia
spectrului electromagnetic, clasificate Tn functie de mecanismui spinului
Rezonanta
electronic Tn
de activare si de domeniul spectral. Etedronica Microunde paramagneticS
prezenta
electronica
campului
magnetic
10 II

1.2. SPECTROFOTOMETRSA IN
ULTRAVIOLET §I VIZIBIL
Spectrofotometria de absorbtie Tn ultraviolet §i vizibil
(UV-VIS) este considerate ca una din metodele clasice de
analiza a medicamentelor, desi importanta ei nu s-a diminuat Tn
timp. Mai mult chiar, prin cuplarea ei cu alte metode de analiza,
domeniile de aplicatii ale spectrofotometriei continua sa
creasca, popularitatea ei se explica Tn primul rand prin faptul ca
este o tehnica de analiza' simpla, rapida si relativ ieftina, iar
numarul impresionant de lucrari de specialitate din ultimii ani
demonstreazci interesul cercetatorilor Tn Tmbunatatirea
performantelor acestei tehnici. Specificitatea si sensibilitatea
scazuta a spectrofotometriei UV-VIS este uneori rezolvata prin:
• transformari chimice selective
• metoda adausului standard
• metode derivative
• metode matematice de investigare a sistemelor
multicomponent §i de rezolvare a problemelor liniei de
baza spectrale
Transformarile chimice selective presupun utilizarea unor
reactivi specific! suplimentari, elemente tehnice deosebite §i,
uneori, prelucrarea mai complicata a probelor, prin extractie
lichid - lichid, de exemplu.
Spectroscopia Tn domeniul radiatiilor ultraviolete si
vizibile implica absorbtia radiatiilor luminoase din acest
domeniu de catre moleculele substantelor organice, absorbtie
care are ca rezultat promovarea electronilor din orbitalii a, n sau
n de la o stare inferioara de energie (de obicei starea
fundamental^, cea mai populata la temperatura normala) la o
stare excitata, mai bogata din punct de vedere energetic.
Absorbtia luminii m UV-VIS are loc atunci cand energia
acesteia este suficienta pentru a produce o tranzitie electronica
12
care este asociatS cu schimbari ale starii vibrationale §i
rotationale ale moleculei. Spectrele obtinute prin absorbtia
acestor radiatii poarta numele de spectre electronice.
«ri
ddl fe
0 rfjflk
A tfri
tt>
Figura 1.2.1. Scaderea Tn infensitate a iuminii incidente I0 datorita
reflexiei pe fetele cuvei (razele 1-4), absorbtiei (raza 6) §i
Impra§tierii pe particule (raza 7)
Din punct de vedere practic, semnificative pentru analiza
structural^ organica sunt domeniul ultraviolet cuprins Tntre 180
§i 400 nm §i domeniul vizibil situat Tntre 380 si 780 nm Tn care
absorb substantele ce apar colorate ochiului uman.
Atunci cand lumina strabate un strat de lungime I (figura
1.2.1) ce contine o solutie de substanta cu concentratia c,
intensitatea acesteia scade exponential.
Cantitativ, absorbtia luminii este data de legea Beer -
Lambert:
Ax = log (lo/l-rK = a* I c
unde:
A - absorbanta
a - absorbtivitate sau coeficient de absorbtie ce depinde de
natura substantei
/ - lungimea cuvei Tn care se afla solu^ia
c - concentratia substantei
X - reprezinta lungimea de unda a radiatiei
13
 Tabelul 1.2.1. Caracteristlcile spectrale ale unor cromofori
Denumirea si valoarea lui a depind de unitatea de
concentrate. Daca c este concentrate molara, a se noteaza s
si se numeste absorbtivitate molara (coeficient molar de
1 Metan 125
absorbtie). Unitatea de masura a lui e este I mor cm In Etena C=C 185 8000
farmacopei se lucreaza cu absorbanta specifica: Acetona CO 188 900
279 15
Acetoxima ON- 190 5000
Acid acetic -COOH 204 40
care este absorbanta unei solutii cu concentrate 1 g/100 ml,
masurata Tn cuva de 1 cm. Unitatea de masura a absorbantei Absorbfia unei radiatii din domeniul UV-VIS are loc daca
specifice este dl g"1 cm"1. energia acesteia este suficienta pentru a produce tranzitii
Proportionalitatea stipulata de legea Beer - Lambert se eiectronice Tn molecula de interes (figura 1.2.2).
respecta pe anumite domenii de concentratii si de aceea este Spectroscopia UV-VIS lucreaza cu cateva notiuni
important ca Tn determinarile cantitative sa se demonstreze ca specifice:
pe domeniul de concentratii de lucru exista liniaritatea A ~ c. - grupare auxocroma - grupare saturata de atomi (de exemplu,
OH, NH2, -S-, -Cl, -N'Ha) care atasata unui cromofor modifica
lungimea de unda ^max la care are loc absorbtia §i intensitatea
1.2.1. Analiza calitativa prin maximului de absorbtie
spectrofotometrie Tn UV-VIS - deplasare batocroma (spre rosu) - deplasarea maximului de
absorbtie la lungimi de unda mai mari (energii de excita^ie mai
Absorbtia luminii Tn regiuniie ultraviolet si vizibil se mici)
datoreaza prezen^ei cromoforilor in molecule. Termenul - deplasare hipsocroma (spre albastru) - deplasarea maximului
,,cromofor" a fost utilizat prima data pentru legaturile nesaturate de absorbtie la lungimi de unda mai mici (energii de excitatie
Tntre grupe de atomi, esentiale pentru producerea culorii, dar Tn mai mari)
timp, studiile de absorbtie a radiatiilor s-au extins Tn regiunea - efect hipocrom - scaderea intensitatii absorbtiei
ultraviolet iar termenul s-a generalizat, incluzand toate gruparile - efect hipercrom - cresterea intensitatii absorbtiei
ce absorb Tn UV-VIS. Exista Tnsa cromofori ce absorb Tn regiuni Tn figura 1.2.3 sunt prezentate schematic deplasarile
inaccesibile spectrofotometrelor uzuale (tabelul 1.2.1) si de unei benzi eiectronice de absorbtie.
aceea analiza acestora este deseori imposjbila. Electronii implicati Tn absorbtia radiatiilor UV-VIS sunt:
CT* electronii a - sunt electronii implicati Tn legaturile simple,
I 1 . tn J h -»TI* cum ar fi legaturile C-C sau C-H din alcani, §i necesita
n*
n
71
t
1 n ->• -a*
T ^* energii mari pentru a trece Tntr-o stare superioara de energie
(ultraviolet de vid 100 - 200 nm)
a g-H>a* electronil n - sunt electronii neimplicati Tn legaturi chimice,
cum ar fi perechile de electron! neparticipanti ai O, N si S
(tranzitii n -> n*). De exemplu absorbtia de intensitate joasa
Figura 1 2.2. Tipuriic de transit!) eiectronice caracteristice a gruparii carbonil de la aproximativ 280 nm se datoreaza
spectroscopiei UV-VSS

1/1 15
 unei tranzitii n -» n*. Conjugarea cu electron! n (auxocromi)
determine intensificarea absorbtiei (tabelul 1.2.2).
electronii TI - sunt electronii mobili ai legaturilor multiple.
Sunt implicati Tn tranzitii n -» n* care au loc Tn regiunea 180
-200nm.
Efect hipercrom
O discutie calitativa interesanta se poate face Tn cazul
structurilor chimice cu nucleu benzenic. Benzenul are o banda
de absorbtie intensa la 200 nm §i o banda slabs la 255 nm cu
structura fina vibratjonala. Substituirea cu un rest alchil reduce
structura fina dar aceasta Tnca se manifests, ca exemple Tn
acest sens putand fi date urmatoarele substante
medicamentoase:

CH2-CH(NHR)CH3 CH(OH)CH(NHCH3)CH3

Efect batocrom Amfetamina R = H Efedrina

Metilamfetamina R = CH3

H3C-N
COOC2H5

Figura 1.2.',}. D asarea maximeior ds absorbtie in spectrele ilY- Petidina

VIS Daca se ata§eaza o grupare fenolica, are loc o
deplasare batocromica importanta la aproximativ 280 nm,
Tabelul 1.2.2. Cromofcri conjugati §i auxocromi dependents de pH-ul mediului. De exemplu, Tn morfina
clorhidrat, nalorfina bromhidrat, adrenalina, isoprenalina, etc.
Compus Cromofor ^max[niTl]
i; •' ''f'^max'-"'- '•••
-1 Grupa amino este un auxocrom puternic pentru benzen,
[M cm^] astfel anilina prezinta o banda de absorbtie intensa la 230 nm §i
Butadiena c=c-c=c 217 21000
una de intensitate joasa la 280 nm. Daca pe nucleu se
Crotonaldehida c=c-c=o 217 16000
ata§eaza si o grupare de conjugare, efectele se cumuleaza.
Sulfanilamida Tn HN-O2S-C6H4-NH2 251 16300
Astfel, Tn procainamida banda de la 200 nm se deplaseaza la
solutie alcalina
Sulfanilamida in HZN02S-C6H4-N+H3 218 12700 280 nm.
solutie de HCI 265 1080
CO-NH—
Corelarea absorbtiei Tn UV-VtS cu structura este mai Procainamida
mult empirica, foarte multi compusj avand spectre electronice
asemanatoare, de aceea, pentru identificarea complete a Acidul p-aminobenzoic are absorbtii similare (figura
structurii unui compus, masuratorile spectrofotometrice Tn UV- 1.2.4) cu procainamida §i procaina Tn mediu alcalin sau neutru,
VIS trebuie sa fie corelate cu alte tipuri de date spectrale si/sau dar Tn solutie acida, curba de absorbtie este asemanatoare
teste chimice.
acidului benzoic.
16
17
 COOH COOH Atunci cand un compus exista tn forme tautomere, se
poate obfine o absorbtie selective tn regiunea ultraviolet prin
alegerea adecvata a pH-ului. De exemplu, fenobarbitalul are o
absorbtie puternica tn mediu bazic (pH 13) la aproximativ 255
nm (figura 1 .2.5), datoritS sistemului cromoforic -C=N-C=O. La
pH 10 maximul de absorbtie se deplaseaza la 240-245 nm.
Bazele purinice, cafeina si teofilina, au absorb^!
caracteristice datorita sistemului cromoforic -CO-C=C-N=C.

N-CH3

CH3

Lungime de unda [nm] Cafeina

Figura 1.2.4. Spectreie de absorbfie ale aciduHui benzole tn apa Datorita naturii tautomerice a nitrozofenolilor, Tn mediu
{ }, acicfului p-amlnobenzoic in apa ( } f i ?n HCI 0,1 EVJ (-—} alcalin ace§ti compusi prezinta absorbtii puternice. Principiul
determinarii morfinei Tn tinctura de opiu camforata se bazeaza
tocmai pe aceasta intensificare a absorbtiei.

HO'

N=O N-OH

Spectroscopia de absorbtie UV/VIS este o metoda larg

folosita Tn analiza structurala a flavonoidelor (derivati de 2-
Lungime de unda [nm]
fenilbenzopirona):

Figura 1.2.5. Spectreie de absos-bfie ale fenobarbitalului in HC!

0,1 M (—), in apa (....) ?i NaOH 0,1 M { J
18 in
 Tabelul 1.2.3. Valorile Xmax caracteristice unor flavonoide
inregistrate Tn etanol

: tLAymmmfct - ';; i±^iEM§5jfJaM:MBS : ' \

Flavone 297 (4,20), 250 (4,06)
Izocvercetrina 360 (4,24), 246 (4,25)
Miricetina 360(4,32), 258(4,41)
Flavanone 378 (4,29)^ 255 (4,21|
Calcone 310(4,35), 230(3,91)
Izoflavone 307 (3,82)
atuurile majore ale acestei tehnici constand Tn: necesitatea 3 metoxiflavone 320, 299(4,21), 246(4,32)
unei cantitati mici de proba, cantitatea importanta de informatie
structural^ rezultata §i accesibilitatea acestei tehnici Banda I este considerata ca fiind corespunzatoare
instrumentale Tn majoritatea laboratoarelor de specialitate. absorbtiei provocata de ciclul B (radicalul cinamoil al structurii
In ultimii 20-30 de ani a aparut un numar imens de flavonoidice) pe cand Banda II corespunde absorbtiei
referinte spectrale cu privire la stuctura flavonoidelor (MABRY si provocata de ciclul A (radicalul benzoil):
colab. '1970, JURD 1962, HARBORNE 1975, CHIRIKDJIAN si
BLEIER 1971, JAY si colab. 1975, VOIRIN 1983).
Spectrele tipice pentru flavone §i flavonoli sunt
determinate Tn metanol sau mai putin satisfaca'tor ?n etanol la
lungimi de unda cuprinse Tn intervalul 210-500 nm.
Reactivii specific! adaugati independent sau Tn
combinajii Tn solutia de metanol au rolui de a induce schimbari
structural informative Tn spectru de absorbtie. ?n mod obisnuit
se utilizeaza Tn acest scop: NaOMe, NaOAc, HaBOs, AICI3 si
HCI (MARKHAM 1982, MABRY 1970). Benzoil-cinamoil
La identificarea flavonoidelor nu numai pozitia Xmax este
caracteristica, dar si intensitatea, care se poate exprima prin Oxidarea Tn ciclul B conduce la un efect batocrom,
valoarea coeficientului molar de absorbtie E sau Ig e (tabelul respectiv o deplasare a absorbtiei Tn Banda I catre lungimi de
1.2.3), care se calculeaza dupa relatia e = A / ! c unde A este unda mai mari, proces aditiv cu cre§terea numa'rului de grupari
absorbanta iar I, lungimea cuvei Tn care se face determinarea. -OH.
Nucleul flavonic prezinta o absorbtie caracteristica Tn In seriile de flavonoli, Banda I se deplaseaza de la 359
UV, Tn solutie metanolica, flavonele si flavonolii absorb de nm Tn absenta hidroxilarii inelului B, spre 367, 370 si 374 nm
regula Tn regiunea 240-400 nm. Ca o caracteristica, la aceasta odata cu cre§terea numarului de grupari HO Tn 4'; 3', 4'; 3', 4',
regiune se observa doua picuri denumite curent Banda I (300- 5'.
380 nm) si Banda II (240-280 nm). Astfel Tn flavonol Banda I este mereu la o lungime de
unda mai mare cu 20-30 nm decat Banda I Tn flavona
echivalentci.
21
20
 O-metilarea, O-glicozidarea si acilarea afecteaza de
asemenea pozitia benzii, prin faptul ca toate trei tind sa
produca schimbari la lungimi de unda mai mari. C-glicozidarea
produce efecte neglijabile In spectru.
Asa cum s-a subliniat anterior, spectrele electronice ale
flavonoidelor sunt influence de anumit/i reactivi, schimbarile
induse oferind informatii structurale importante. In figurile 1.2.6
si 1.2.7 se observa clar schimbarile Tn spectrele morinei si
quercitinei obtinute Tn metanol (MeOH) ?n prezenta metoxidului
de sodiu (NaOMe) si, respectiv, AICI3 si AlCls/HCI.
OH
OH
MORINA
200
500
Figura 1.2.6. Spectrele electronice ale nriosinei Tn diferite
conditii: 1. MeOH, 2. MeOH + NaOMe
Figura 1.2.7. Spectrele m UV ale quercitinei m diferite conditii: 1.
MeOH, 2. MeOH + A«CI3, 3. MeOH + AIC!3/HCI
22
In concluzie, cu ajutorul spectrelor UV-VIS se pot obtine
informatii cu privire la natura cromoforilor existenti Tn molecula
si la pozitfia lor Tn raport cu alte elemente structurale, se pot
trage concluzii cu privire la stereochimia moleculelor, la
existenta legaturilor de hidrogen, a rolului solventilor, a efectelor
de rezonanja si conjugare.
1.2.2. Anaiiza cantitativa prin
spectrofotometrie UV-VIS
Dozarile spectrofotometrice se pot realiza rapid
preparand o solutie Tntr-un solvent transparent si masurand
absorbanta acesteia la o lungime de unda adecvata. Lungimea
de unda este, Tn general, selectata la un maxim de absorbtie
(^max) deoarece astfel efectele erorilor de setare ale scalei
lungimilor de unda au un efect minim. Ideal, concentratia
trebuie sa fie ajustata a§a Tncat absorbanta solutiei sa fie
aproximativ 0,9, valoare Tn jurul careia acuratetea §i precizia
sunt optime. De obicei determinarile cantitative se fac
masurand o singura absorbanta la lungimea de unda a unuia
din maximele de absorbtie. Alternativ, absorbanta poate fi citita
din spectrul obtinut pe un anumit domeniu de lungimi de unda,
aceasta varianta fiind preferata1 Tn studiile calitative sau Tn
anumite situatii cand este nevoie sa se lucreze cu valori ale
absorbantei la mai multe lungimi de unda. Concentratia
substantei este apoi calculate Tn mai multe moduri:
A. Determinari cantitative pe baza absorbtivitatii
Este o cale simpla pentru determinarea concentratiei ce
se bazeaza pe folosirea directa a legii Beer - Lambert,
cunoscand coeficientul de absorbtie. Procedeul este adoptat
oficial Tn farmacopei pentru substantele stabile, ce au benzi de
absorbtie largi, putin afectate de variatia parametrilor
spectrofotometrului (deschiderea fantei, viteza de Tnregistrare,
etc.). Folosind absorbanta specifica A(1%,1cm) sau
absorbtivitatile molare e se evita realizarea unui pas
23
experimental suplimentar si anume prepararea unei solutii
standard din substanta de referinta in scopul determinarii
absorbtivitatii (utila atunci cand procurarea substantei de
referinta presupune costuri foarte mari). Pentru multe dintre
substance, valorile coeficientilor de absorbtie se gasesc Tn
literatura de specialitate.
Metoda prezinta dezavantajul ca de foarte multe ori
coeficientul de absorbtie variaza de la aparat la aparat sau
chiar pentru acelasi aparat, utilizat Tn perioade diferite, sau
valorile sunt date pentru solutii Tn alt! solvent! decat cei care
intereseaza.
Pe de alta parte, presupuna"nd ca se determine Tn
prealabil acest coeficient Tn conditiile experimentale dorite, nu
este sigur ca solutia proba are o concentratie care sa se
supuna legii Beer - Lambert. Prin urmare nu totdeauna
linearitatea descrisa de aceasta lege este aplicabila. La
concentratii mici, sub 0,01 M, legea functioneaza foarte bine
pentru cel'e mai multe dintre substante. Deviatii aparente de la
legea Beer - Lambert au loc la concentratii mari si se
datoreaza schimbarilor la nivelul speciilor absorbante sau ale
proprietatilor soluflei.
Se poate face o delimitare a naturii factorilor ce
cauzeaza deviatii de la linearitatea absorbanta" - concentratie Tn
factori chimici §i factori instrumental!. La concentratii mari, de
exemplu, va exista o diferenta Tntre indicii de refractie ai solutiei
§i solventului folosit ca rnartor. O situatie similara se Tntampla si
atunci cand proba este dizolvata Tntr-un amestec de. solvent!
organic! si apa si din aceasta cauza trebuie ca martorul fat,a de
care se apreciaza absorbanta probei sa con^ina aceiasi
solvent!, Tn aceeasi proportie ca si proba. Solventul poate, de
asemenea, sa afecteze absorbtivitatea analitului. Uneori, spec!!
neabsorbante pot interacjiona cu specii ce absorb Tn UV-VIS,
alterandu-se astfel absorbtivitatea aparenta a solutiei.
Absorbanja este, de asemenea, afectata prin folosirea
unor solven^i cu transmisie mica sau a unor soluti fluorescent!.
Cele mai Tntalnite cazuri de deviatii chimice sunt cele Tn care Tn
solutia proba se stabilesc echiiibre chimice. Cea mai buna cale
de a minimaliza acest tip de deviafii consta Tn utilizarea solutiilor
tampon, ajustarea tariei ionice, adSugarea unei cantitati mari de
24
agent complexant, etc. Daca substanta este un acid slab si cele
doua specii Tn echilibru absorb la lungimi de und§ diferite, atat
timp cat solutia este tamponata sau este foarte acida, raportul
Tntre forma acida si forma bazica ramane constant, indiferent de
concentratia totala. Utilizarea unei curbe de calibrare Tntr-un
domeniu de concentratii adecvat corecteaza cele mai multe din
aceste deviatii.
Exista Tntotdeauna o anumita eroare sau
nereproductibilitate Tn efectuarea unei masuratori
spectrofotometrice. Incertitudinea unei valor! de absorbanta
data de aparat depinde de un numa'r de factori instrumentali
precum si de domeniul de valori ale absorbantei Tn care se
lucreaza si, de aici, de domeniul de concentratii. Pentru a evita
erorile de citire instrumentala, pentru spectrofotometre cu
detector de tip fotomultiplicator sau fotodiode domeniul de lucru
este Tntre 0,1 si 1 ,5 uni'taji de absorbanta.
In continuare vor fi prezentate cateva aplicatii ale acestei
metode de evaluare cantitativa.
1. O solute a unei substante medicamentoase X ce confine 0,1200 g/l de
substan(a are absorbanta 0,126 la 257 nm In cuva de 1 cm. a) Sa se
calculeze absorbanta specifics Ar/01cm. b) Sa se deduca relatia Tntre E si
a) Din legea Beer- Lambert avem:
0,126 = coefx1 cm x 0,1200 g/l
A1%icm = coef x 1 x 1 ,000 g/0,1 I
Prin fmpartire membru la membru, rezulta ca:
A1fc1cm = 0,126/0,0120 =10,5
b) Se deduce ca:
e =coef - M = (A 1 % 1 c m /10)-M
2. Sa se calculeze concentratia de metiltestosteron Tntr-o solutie etanolica a
carei absorbanta in cuva de 1 cm la Xmax = 241 nm este 0,890. Absorbanta
specifics a metiltestosteronei A1%1cm = 540 la 241 nm.
Din legea Beer-Lambert: A = A1%lcml c de unde c = A/ (A1%1cm I) §j deci:
c = 0,890/(540x1) = 0,00165 %(m/V) = 0,00165 g/100 ml
3. Calculati concentratia Tn (.ig/ml a unei solutii de triptofan (cu masa
moleculara 204,2) Tn acid clorhidric 0,1 M, a carei absorbanta la A.max = 277
nm este 0,613 Tn cuva de 4 cm. Absorbtivitatea molara a triptofanului la 277
nm este 5432 M"1 cm"1.
25
Din legea Beer-Lambert:
c = A/(el)
de unde:
= 2,82x1 (T5moir1 = 2,82x1 0~5x204,2gr1 = 0,00576 g I"1
5432x4
= 5,76ugmr 1
4. Douazeci de comprimate de fenobarbital, sare sodica (M = 254,22),
cantarind 5,0421 g, sunt pulverizate Tntr-un mojar. O proba de 0,1325 g
pulbere se dizolva In 15 ml apa careia i se adauga 2 ml HC! concentrat, se
filtreaza si filtratul se introduce Tntr-o palnie de separare. Fenobarbitalul
eliberat din sare este extras de 4 ori cu cate 30 ml cloroform. Extractele
cloroformice reunite sunt aduse la 250 ml cu cloroform (solutia B). 5 ml din
solutia B este transferata Tntr-o capsula de portelan §i evaporata la sec pe
baia de apa. Reziduul solid se dizolva in 5 ml alcool si este transferal cu
tampon borat pH 9,6 Tntr-un balon cotat de 100 ml. Solutia este adusa la
semn cu tampon (solutia D). Se prepara o solutie standard S de fenobarbital
(M = 232,24) cu concentratia 10,00 ng/ml (cs) Tn acelasi solvent (tampon
borat Tn alcool 5% V/V, solutia E). Se masoara absorbantele Ax si As ale
solutiei proba D si solutiei standard S la 240 nm, Tn cuva de 1 cm, folosind
solutia E drept martor. a) Sa se deduca relatia dintre cantitate, Tn mg de
fenobarbital sodic luat Tn lucru, si cs, Ax si As. b) Daca Ax = 0,446 si As =
0,459, cate mg de fenobarbital sodic sunt Tntr-un comprimat §i care este
procentul fenobarbitalului sodic Tn proba de pulbere luata in lucru?
B. Determinari cantitative pe baza curbei de calibrare
Pornind de la legea Beer - Lambert, pentru un sistem cu
o singura specie absorbanta Tn regiunea de interes, absorbanta
este direct proportionala cu concentratia analitului. Prin urmare,
pentru o serie de solutii standard de analit (minim 4 solutii) se
masoara absorbanta acestora la lungimea de unda de lucru si
se traseaza o curba de calibrare A = f(c). Aceasta curba
aproximeaza eel mai bine variatia A = f(c) Tn sensul ca punctele
sunt uniform repartizate de-a lungul acesteia. Concentra^iile
solutiilor standard trebuie sa fie cuprinse Tntr-un domeniu ce
acopera concentratiile a§teptate Tn probe. Orice alta solutie de
analit Tn acelasi solvent, careia i se masoara absorbanta Tn
aceleasi conditii experimentale ca si la trasarea curbei de
calibrare, poate fi estimata cantitativ din curba de calibrare
(figura 1.2.8) prin interpolare graficS sau cu ajutorul ecuat,iei ce
descrie aceastS curba.

a) Deoarece:

atunci:
cx = (Ax/As)cs
De aici, concentrate de fenobarbital Tn solutia B este egala cu:
CX.B = cx,D(100 ml/5 ml) = 20,0 (Ax/A^)cs
de unde cantitatea de fenobarbital Tn 250 ml solutie B, in mg, este egala cu:
TF.mg = (250 ml)[20,0(Ax/As}cs ng/ml](10'3 mg/ng) = 5,00 (Ax/As)cs
Cantitatea Tp.mg a rezultat din extracjia fenobarbitalului sodic Tn solutia acida. Figura 1.2.8. (nterpoiare grafica
De aici cantitatea de fenobarbitai sodic prezent In 0,1325 g pulbere este:
TNaFmg = TF mg(254,22/232,24) = 5.00(Ax/As)cs x 1,0946 = 5,47 Curbele de calibrare sunt trasate prima data, considered
(Ax/As)c, directa proportionalitate A = f(c), si poarta numele de drepte de
b) Inlocuind datele experimentale Tn ecuatia anterioarS avem:
calibrare. Atunci cand absorbanta variaza neliniar pe domeniul
TNaF.mg = 5,47 (0,446/0,459) x 10,6 = 53,15 mg
Groutatea medie a comprimatelor este (5,0421/20) = 0,2521 g. Rezulta de concentratii considerat, se liniarizeaza computerizat datele
pentru fiecare comprimat: sau se atribuie o functie neliniara care fiteaza eel mai bine
(0,2521/0, 1325)(53, 15 mg} = 101,1 rng fenobarbital sodic punctele experimentale.
Procentul de fenobarbital sodic Tn proba este: Tratamentul statistic al datelor de calibrare, facilitate de
(53,15 mg)/(132,5 mg)100 =40,1%
microcomputere sau programe pe calculator, asigura un mod
26
:v
elegant si exact de determinare a relatiei dintre absorbanta si
concentratie comparativ cu constructia manuala a graficelor.
Daca absorbanta depinde direct proportional de concentratie,
parametrii dreptei de regresie y = a x + b pot fi estimati prin
metoda celor mai mici patrate. Metoda are la baza principiul ca
dreapta care aproximeaza eel mai bine punctele este aceea
pentru care suma tuturor patratelor deviatiilor de la aceasta
dreapta este minima. Suma este data de relatia:
Prin calcul diferential se obtin:
a =-
b =-
Pe baza valorilor calculate a si b, dreapta y = ax + b construita
da cea mai buna aproximare a linearitatii datelor.
Practic pentru orice serie de date se poate construi o
functie de corelare, de aceea este nevoie de stabilirea unor
criterii pe baza carora dreapta de regresie construita pentru o
metoda data este acceptabila sau nu, sau daca doua metode
sunt comparabile, etc.
Un criteriu este coeficientul de corelare Pearson, r.
Acesta este o masura a corelatiei liniare Tntre doua variabile, x
si y, si este dat de relatia:
r=
28
Coeficientul de corelare poate varia Tntre -1 §i +1. O
valoare pozitiva a lui r indica o corelare pozitiva Tntre doua
variabile (valori mari ale lui y corespund unor valori x mari).
Cand r = 0, nu exista nici o corelare Tntre x si y.
Coeficientul de corelare poate fi calculat pentru o
dreapta de calibrare ca o masura a gradului de corelare Tntre
valorile masurate y si variabilele independente x, ceea ce
Tnseamna cS se determina linearitatea curbei de calibrare. Ca
si regula, daca |r| > 0,99, aceasta indica o linearitate buna. O
valoare mai mare decat 0,999 poate fi otyinuta Tn conditiile
efectuarii experimentului cu mare atentie (valorile lui r se
exprima cu Tnca o zecimala dupa ultimul 9).
Exemplu de calcul. Valorile absorbantelor la 250 nm ale unor solutii
standard, unei solutii proba §i martorului sunt date Tn tabelul urmator.
Calculati, folosind analiza de regresie liniara, parametrii ecua{iei dreptei de
calibrare si concentratia probei.
o 0,002
10 0,168
20 0,329
30 0,508
40 0,660
50 0,846
Proba 0,611
Se calculeaza cu relatiile anterioare a si b, de unde ecuatia dreptei de
calibrare este:
y = 0,01679x - 0,0008 iar r = 0,9997
Concentrate probei este:
cx = (0,611+0,0008)/0,01679 = 36,5 ug/ml
C. Metoda standarduJui extern de evaluare cantitativa
Se utilizeaza o solutie standard din substanta de
referinta a carei concentratie cs trebuie sa fie aproape de
valoarea concentratiei Tn proba cproba- Determinarea cantitativS
propriu-zisa se bazeaza pe proportionalitatea A ~ c:
29

Aprobas
"proba
Unde Aproba ?i As sunt absorbantele probei §i, respectiv,
standardului.
Metoda se aplica atunci cand se verifica legea Beer -
Lambert si exista substanta de referinta cu puritate adecvata.
Este des aplicata Tn monografiile din farmacopei.
Daca pentru un sistem dat, reprezentarea grafica a legii
Beer - Lambert conduce la o dreapta cu o interceptie a
ordonatelor (pozitiva sau negativa) semnificativa, se utilizeaza
douci solutii standard, o solutie cu concentratia mai mare CSM §i
cea de a doua cu o concentrate mai mica csm decat
concentratia asteptata Tn proba. ConcentraVia probei va fi:
\Aproba
Asmj
•'proba
A eroare sistematica < 1% este Tn mod normal acceptabila. De
unde Aproba, ASM §i ASm sunt absorban^ele probei, standardului
mai concentrat si, respectiv, standardului mai diluat.
1.2.3. Dozarea substaoteior in probe
cu mai multe componente
Sistemele farmaceutice sunt rareori sisteme cu un singur
component ce absoarbe lumina, de aceea Tn timpul analizei
unui produs medicamentos, Tn solutia finala de analizat pot sa
existe substante care interfereaza dozarea analitului de interes.
Daca se cunoaste compozitia formei farmaceutice, atunci se
poate evalua gradul de interferenta. Nu acelasi lucru se poate
face cu interferentii de tipul impuritatilor datorate procesului de
fabricate sau al produsilor de descompunere. Astfel de produsj,
daca nu sunt eliminati, pot da absorbtii irelevante ce contribuie
la eroarea sistematica a metodei.
30
Exista cateva metode ce pot fi aplicate la determinari
cantitative din amestecuri, principiul determinarii bazandu-se pe
doua postulate:
- absorbanta unei solutii este suma absorbantelor
componentelor individuale;
- absorbanta ma'surata este diferent^a dintre absorbanta
totala a solutiei §i absorbanta solutiei de referinta.
A. Dozarea unui sinqur component
Concentratia unui singur component aflat Tntr-o proba ce
confine alte substante absorbante poate fi determinate facand o
singura masuratoare a probei daca exista o lungime de unda la
care analitul de interes absoarbe semnificativ iar ceilalti nu.
Aceasta conditie este satisfacuta daca nivelul concentratiilor
substantelor interferente §i/sau absorbitivitatile lor sunt suficient
de mici asa Tncat pot fi ignorate la lungimea de unda de lucru. O
exemplu, Tn cazul unei contributii de 0,01 la o absorbanta totala
de 1 si al lipsei interactiunilor chimice Tntre componente, proba
poate fi analizata printr-o singurS masuratoare la o lungime de
unda cu absorbtie semnificativa. Tn cazul unei dilutii mari a
probei, absorbanta interferentilor este neglijabiia.
B. Dozarea bazata pe corectarea absorbantei
Daca identitatea, concentratia §i absorbtivitatea
interferentilor sunt cunoscute, este posibil sa se calculeze
contributia lor la absorbanta totala a amestecului. Concentratia
analitului de interes este apoi calculata din absorbanta
corectata (absorbanta totala minus absorbanta speciilor
interferente) la lungimea de unda de lucru.
31
 depind de pH-ul celor doua medii: mediul apos si mediul
Exemplu: organic nemiscibil cu apa.
A, max a efedrinei clorhidrat si clorocrezolului sunt 257 nm si, respectiv, 279
nm iar valorile absorbantelor specifics A1%1cm Tn HCI 0,1 M sunt date In
Prin alegerea corecta a pH-ului se poate face separarea
tabelul urmator. completa a interferentilor de analit, a carui concentrate poate fi
apoi estimata printr-o simpla masuratoare de absorbanta.
Lungiinea deiunda - • ! A 1% ! :
Substanta > • •;•.. • • • • ! A1cm| :'
Dff JMt: ' ' ... " •
P. IVietoda sistemuiui de ecuatii
Efedrina clorhidrat 257 9,0
Efedrina clorhidrat 279 0
Clorocrezol 257 20,0 In cazul unui amestec format din componente diferite
Clorocrezol 279 105,0 care nu interactioneaza Tntre ele, absorbanta totala la o lungime
de unda data este suma absorbantelor fiecarei componente la
Calculati concentrayile efedrinei clorhidrat si clorocrezolului Tn solutia acea lungime de unda. Daca X, Y sunt componentele
injectabila de efedrina clorhidrat, daca diluata 1 la 25 cu apa are amestecului, se poate scrie relatia:
absorbantele A2/9 nm = 0,424 si A257 nm = 0,972 Tn cuva de 1 cm.

a) Efedrina nu absoarbe la 279 nm si atunci concentratia de Clorocrezol se A = AX + Ay

calculeaza la aceasta lungime de unda din legea Beer - Lambert:
0,424 = 105x1 xc Deoarece fiecare componenta se supune legii Beer - Lambert:
c = 0,00404 g/100 ml
Concentrate de Clorocrezol in solutia injectabila va fi:
= 0,00404 x 25 A = ex cxl + SY cyl
= 0,1010 g/100 ml
= 1,010 mg/ml unde £x, £y sunt coeficientii de absorbtie (aici, absorbtivitatile
b) Calculati absorbanta clorocrezolului la 257 nm Tn solutia injectabila
molare) iar cx, CY sunt concentratiile (molare) ale componentelor
diluata:
A = 2 0 x 1 x 0,00404 = 0,081 X §i Y iar / este dimensiunea celulei de absorbtie Tn care se
c) Calculati concentrate efedrinei clorhidrat din absorbanta corectata la 257 masoara probele.
nm: Daca se vor face determinari la un numar de lungimi de
Absorbanta corectata = 0,972 - 0,081 = 0,891 unda egal cu numarul componentelor, se poate obtine un
0,891 = 9,0 x 1 x c sistem de 2 ecuatii cu 2 necunoscute (cx §i CY) care se poate
c = 0,0990 g/100 ml
Concentrate efedrinei Tn solutia injectabila va fi: rezolva u§or. Mentionam ca Tn practica, determinari relativ
= 0,00990 x 25 = 2,475 g/100 ml rapide §i precise se pot face pentru amestecuri formate din 5
= 24,75 mg/ml sau 6 componente.
Determinant se vor face la lungimile de unda A-\ si /12
C. Dozare dupa extractia probei cu solvent (de obicei sunt A.max) pentru care se vor putea scrie relatiile:
Daca interferenta celorlalte componente este mare sau
l pentru A,i
contributia lor la absorbanta totala nu poate fi estimata, atunci
este nevoie de separarea interferentilor absorbanti printr-un
A (2) = ex(2) cx I + ex(2) CY I pentru ^2
procedeu de extractie cu solvent! Acesta este indicat pentru
substantele medicamentoase cu caracter slab acid sau bazic al
Daca se cunosc absorbtivitatile molare ale componentelor X si
caror grad de ionizare §i, deci, coeficientul lor de repartitie
Y la Ai si X2 deci £y(1), £y(1), £x(2) §i £y(2) si valoarea lungimii
33
32
 cuvei /, se pot calcula concentratiile componentelor
amestecului.
Lungime de unda
Figure 1.2.9. Spectral de absorbtie pentru un amestec de
doua componente X * Y
Absorbtivitatile molare se pot determina experimental
daca se masoara absorbanta unor serii de solutii cu
concentrate cunoscuta (etalonj din componentele X si Y, la
lungimile de unda AI si fa. Aplicand legea Beer, se calculeaza
pe r§nd la fiecare lungime de unda s pentru fiecare solutie dintr-
o serie §i se face media. O alta metoda este cea graficS. Un
exemplu de spectru pentru un amestec de doua componente X
si Y este prezentat Tn figura 1.2.9. Intr-o astfel de situatie o
lungime de unda corespunde maximului de absorbtie a
componentului X iar cea de a doua lungime de 'unda
corespunde celui de al doilea maxim de absorbjie al
componentului Y unde X absoarbe slab.
Precizia maxima se obtine daca cele doua lungimi de
unda A,max sunt suficient de separate asa meat sa se satisfaca
urmatoarele conditii:
e Y (2)/ 6Y (1)
Rapoartele: SI
8X(2)/8X(1)
s§ aiba valori Tn afara domeniului 0,1 - 2,0.
Este foarte important sa se demonstreze ca
absorbanteie sunt aditive si ca nu exista interactiuni chimice
Tntre substantele de determinat.
34
E. Metoda raportului de absorbante
Metoda raportului de absorbante este o modificare a
metodei de determinare simultana din amestecuri pe baza
sistemului de ecuatii. Se bazeaza pe faptul ca pentru o
substanta ce se sup'une legii Beer la toate lungimile de unda,
raportul'absorbantelor la oricare doua lungimi de unda este
constant, indiferent de concentratia substantei sau lungimea
cuvei Tn care se face masuratoarea.
>OJ_
Io
(fl
Lungime de unda
Figura 1.2.10. Spectrele de absorbtie a doua coocentratii
ale aceleia§i substante
De exemplu, pentru doua dilutii ale aceleia§i substante
(figura 1.2.10) raportul absorbantelor la cele doua lungimi de
unda AI / A2 = 2. Tn Farmacopeea Statelor Unite acest raport
este numit valoare Q. In Farmacopeea Britanica se utilizeaza,
de asemenea, raportul absorbantelor pentru testele de
identitate si puritate. Astfel pentru ciancobalamina care are trei
maxime de absorbtie la 278 nm, 361 nm §i 550 nm raportul
A36i/A55o trebuie sa fie 3,30 ± 0,15 §i A36i/A278 sa fie 1,79 ±
0,09.
Pentru determinarea cantitativa a doua componente
aflate Tn amestec prin metoda raportului de absorbante,
absorbanteie sunt masurate la doua lungimi de unda (figura
1.2.11) una fiind lmax a unuia dintre componente (k2) si cealalta
este lungimea de unda la care cele doua substante absorb egal
(A,-i), numita punct izoabsorbtiv (coeficientii de absorbtie a sunt
egali). Se pot scrie astfel doua ecuatii (axi = aYi la A.-I si I = 1
cm):
35
 A
1 = a X1 c x+ a X1 c Y
A a
2 _ X2 X+ Y2 Y c a
A a
1 X1 c X+ a X1 c Y
Aceasta ecuatie permite calcularea fractiei componentului X in
c termeni de rapoarte de absorbante. Deoarece acestea sunt
independente de concentrate, Qx, QY §i QAM se determine din
dilutiile lui X, Y §i amestecului.
Concentratia lui X se determina astfel:

c A-i = axi (cx + CY) la punctul izoabsorbtiv

CO
•eo
(fl de unde:
'"••-.....

cx + CY = Ai/aXi
Lungime de unda
Pornind de la expresia fractiei componentului X:
Figura 1.2.11. Lungimiie de unda de lucra aiese la dozarea
c
substanfelor X §i Y in annestec prin metoda rapoartelor de x
absorbanta
QX-QY
c
Se Tmparte fiecare membru cu (cx + Cy) §i se noteaza Fx = x
GX/(CX + CY) §i FY = CY/(CX + CY), unde Fx si FY sunt fractiile de X A 1 /a x1 QX-QY
§i Y ?n amestec: _GAM-QY A
1
C ^ — - --

A
QX-QY ax1
2 _ a X2 F X+ a Y2 F Y
A
1 A
X1FX+aX1FY Ultima ecuatie permite caicularea concentratiei
componentului X §i necesita dilutii ale solutiei proba pentru
Dar FY = 1 - F> determinarea cu acuratete a termenilor AI §i axi.
Metoda poate fi aplicata la determinarea trimetoprimului
^2 - FXaX2 ~ F X a Y2 + a Y2 §i sulfametoxazolului din comprimatele de Cotrimoxazol.
A a
1 X1
F. Metoda corecfiei geometrice
A F a F
2 ^ X X2 XgY2^
A
1 a
X1 aY1 aYi Exista un riumar important de proceduri matematice care
au fost dezvoltate pentru a reduce sau elimina absorbtia data"
Fie Qx = aX2/aXi, QY = aY2/aYi si QAM = AS/AT. Atunci: de matricele mai complexe aie unor probe de origine biologica.
Cea mai simpla procedura este metoda geometrica tn trei
QAM = FX(QX - QY) + QY puncte care se poate aplica daca absorbtia data de matrice
n.. _ Q A M - ( este liniara la cele trei lungimi de unda (absorbtie irelevanta
liniara). Se considera spectrul de absorbtie (figura 1.2.12) al
QX-G
unei substante Tntr-o solutie Tn care exista absorbtie data de
36
37
matricea solutiei, eel al substantei fara aceastS interferenta si
spectrul individual de absorbtie al matricei.
Fie y si z intervalele de lungimi de unda §i,
respectiv, (X,3 - X2). Atunci:
A2
Bi-B; y +z
triunghiuri asemenea
'SS.
e
B 2 -B 3 z
to
-S zB! = (y + z)B2 - yB3
o
in z(A1 - vD) = (y + z)B2 - yB3
z(Ai - vD) = (y + z)(A2 - D) - y(A3 - vD)
Lungime de unda
Lungime de unda De unde:
a) b)
D = y ( A 2 - A 3 ) + z(A 2 -A 1 )

co
-9
o
<n
Lungime de unda
c)
Figure 1.2.12. a) Spectrul individual de absorbtie as unei
substanfe medicamentoase in prezenfa unei absorbtii irs!evan£e
Hniare; b) spectra! individual al subsfantei medicamentoase; c)
spectrul individual ai afosorbfiei Irelevarste
Daca lungimile de unda de lucru sunt ^1, A,2 si 13,
absorbtia de fond 81, B2 si B3 este liniara §i atunci absorbantele
corectate D ale substantei medicamentoase pot fi calculate
pornind de la trei absorbante A-i, A2 si A3 la A/i, A,2 si A,3 dupa
cum urmeaza:
Fie vD si wD absorbantele substantei medicamentoase
singure la A,i si, respectiv, X$ unde v si w sunt rapoartele
absorbantelor la A,1 §i X2 §i, respectiv, la X3 si A,2. Atunci:
61 = A! - vD, B2 = A2 - D §i B3 = A3 - wD
38
Aceasta este o ecuatie generala care poate fi aplicata Tn
situatiile Tn care AI, A2 §i A3 pentru proba, intervalele y si z si
rapoartele v §i w se cunosc. Valorile v §i w se pot afla folosind o
singura solutie a substantei medicamentoase. Concentratia
substantei este calculata din absorbanta corectata D folosind
oricare din procedeele descrise la determinarea cantitativS Tn
solutii cu un singur component.
Daca lungimile de unda se aleg Tn a§a fel meat v = w = r,
atunci:
y ( A 2 - A 3 ) + z(A2-A 1 )
D=
Dupa cum se deduce, metoda geometrica cu trei puncte
este un procedeu algebric de determinare cantitativa.
G. Spectrofotometria de diferenta
Selectivitatea §i acuratetea unei analize
spectrofotometrice a unei probe ce confine specii interferente
pot fi Tmbunatatite prin spectrofotometria de diferenta. Esenta
acestui procedeu consta Tn faptui ca marimea masurata este
diferenta de absorbanta AA Tntre doua solutii echimoleculare
39
ale analitului Tn doua forme chimice diferite ce au amprenta
spectrala diferita.
Criteriile de aplicabilitate:
- in spectrul analitului pot fi induse schimbari reproductibile prin
adaugarea unuia sau mai multor reactivi
- absorbanta substantelor interferente nu este afectata de
ace§ti reactivi
Cel mai simplu mod de schimbare a proprietatilor
spectrale ale unei substante ionizabile consta Tn modificarea
pH-ului solut,iei proba. Si pentru a Tntelege aplicabilitatea
metodei, se considera cazul solutiei de fenilefrina Tn HCI 0,1 M
siNaOHO,1 M (figura 1.2.13).
lonizarea gruparii fenolice Tn mediu alcalin genereaza o
noua pereche de electron! neparticipanti care interactioneaza
cu electronii u fenilici §i determina o deplasare batocroma §i un
efect hipercrom. Spectrul de diferenta poate fi general
considerand drept referinta solutia acida, iar solutia alcalina
drept proba. Se constata din spectrele celor doua specii
prezenta punctelor isosbestice, §i anume lungimile de unda la
care absorbtivitatile celor doua specii sunt egale. In
determinarile cantitative bazate pe spectrul de diferenta, se
poate lucra cu AA la orice lungime de unda sau cu amplitudinea
dintre un maxim sj un minim adiacent, AAa la X.2, si AA-i = Aaicaiin
- Aacid la A.1, unde Aaicaiin §i Aacid sunt absorbantele individuale
ale substantei la A,i Tn mediu alcalin si, respectiv, acid. Daca
Aaicaiin §i Aadd respecta legea Beer - Lambert, atunci §i
diferenta:

AA = Aa I c
CH—CH 2 —N
OH CH, unde Aa este diferen{a dintre absorbtivitatile substantei la
lungimea de unda de lucru.
Daca una sau mai multe specii prezente Tn proba au
solujie acidS
AA absorbanta independents de pH §i egala cu Ax atunci prin
diferenta contributia sa este eliminata:
AA2
solutie alcalina AA = (Aaicaiin + Ax) - (Aacid + Ax) = Aa|ca|in - Aacid

Selectivitatea acestei metode depinde deci de alegerea

Lungime de unda [nm]
Figura 1.2.1,, Specirete soijtiiior echimolecuiare de ci
de fenilefrina n mediu scld §i aicaiie~i. Spectrui de direr-sofa AA,
mediu aiealtn - mediu add
corecta a valorilor de pH asa meat spectrele speciilor
interferente sa nu sufere modificari la aceste valori de pH.
O substanta al carei spectru nu se modifica cu pH-ul
poate fi determinata prin spectrofotometria de diferenta daca
poate fi transformata chimic Tntr-o specie cu un spectru diferit
de eel al substantei din care provine. Se aplica Tn general
substantelor medicamentoase cu structuri fenolice, aminice si
barbituricelor.

40 41
 sistem de picuri secundare ce creste Tn complexitate odata cu
cresterea ordinului.
H. Spectrofotometria derivata

Daca un spectru se considers ca fiind reprezentarea

grafica a absorbantei (A) Tn functie de lungimea de unda (A),
spectrele derivate ale acestuia sunt descrise de ecua{iile:
• Derivata de ordin 0 A = f(A,)

Derivata de ordin 1 — = f(

dA
dX
Derivata de ordin 2

In figura 1.2.14 sunt prezentate derivatele de diferite

ordine ale unei benzi de absorbtie de forma gaussiana.
Spectrele derivate sunt tntotdeauna mai complexe decat
spectrele initiale, denumite deseori spectre de ordin 0.
Prima derivata arata modul Tn care se schimba
absorbanta cu lungimea de unda. Ea Tncepe §t se termina la dl3 dX4
valoarea 0 si intersecteaza axa Ox la aceeasj lungime de unda
la care A este maxima Tn spectrul de ordin 0. Astfel, maximul
din spectru! initial devine 0 Tn derivata de ordinul 1, iar punctele
de inflexiune ale spectrului original sunt transformate Tn maxime
§i minime. Functiile bipolare de acest fel sunt caracteristice
tuturor derivatelor de ordin impar. Prima derivata e cea mai usor
de efectuat, dar are cea mai mica importanta practice. Lungime de unda [nm]

Derivatele cele mai des folosite Tn practice! sunt cele de

ordin 2 si 4. Cea mai importanta caracteristica a derivatei de
ordinul 2 este banda negativa cu minimul la aceeasi lungime de
unda Amax ca si maximul din spectrul de ordin 0. Aceasta
derivata prezinta §i doua benzi satelit de fiecare parte a benzii
principale.
Derivata de ordin 4 are o banda pozitiva cu maximul la
aceeasj lungime de unda cu a maximului din spectrul initial.
Derivatele de ordin par prezinta o banda pozitiva sau negativa,
cu maximul, respectiv minimul la lungimea de unda Amax a
absorbantei maxime Amax din banda de absorbtie, si contin un
42
Figura 1.2.14. Spectrele derivate ale unei benzi de absorfc ne de
forma gaussiana
Rezolutia Tnalta a spectrelor derivate cere o buna
reproductibilitate a lungimii de unda pentru spectrofotometrul
utilizat. Erori mici ale lungimii de unda pot conduce la erori mult
mai mari ale semnalului Tn cazul derivatei decat Tn cazul
spectrului de ordin 0.
Un dezavantaj al derivarii este descresterea raportului
semnal/zgomot (S/Z) odata cu cresterea ordinului derivatei si
43
acest efect negativ ridica pretentii asupra nivelului zgomotului
spectrofotometrului. Descresterea raportului semnal/zgomot se
datoreaza efectului de discriminare §i faptului ca zgomotul e
reprezentat Tntotdeauna de cele mai ascutite portiuni ale
spectrului. De exemplu, daca datele spectrale utilizate in
calculul derivatei sunt situate la interval de 2 nm, zgomotul are
o banda cu latimea de 2 nm. Daca analitul are o band§ cu
latimea de 20 nm, raportul S/Z Tn prima derivata se va Tnrautati
de 10 ori. Proprietatile de netezire ale tehnicii polinomiale pot fi
utilizate pentru a diminua descresterea raportului S/Z, dar
trebuie avut Tn vedere ca o crestere mare a gradului de netezire
va duce la distorsionarea spectrului derivat.
Spectrofotometria derivata a condus ia progrese Tn
spectroscopia UV-VIS Tn comparatie cu spectrofotometria
conventionala (denumita spectrofotometrie de ordin 0).
Spectrele derivate sunt folosite pentru a sesiza mai bine
diferentele dintre anumite spectre, pentru a rezolva cazul
benzilor suprapuse Tn analiza calitativa si, eel rnai important,
pentru a reduce efecteie interferentelor datorate Tmpra§tierii
luminii, absorbtiei matricei sau a altor compu§i Tn analiza
cantitativa.
Cum am mentionat deja spectrele derivate sunt mai
structurate decat spectrele de ordin 0 permitand amplificarea
celor mai mici diferente din spectrele initiate. Acest lucru e
valabil mai ales pentru substante command nuclee aromatice
izolate, ale caror spectre au o structura foarte fina. Doua
substante cu spectre foarte asemanatoare (diferenta dintre ele
fiind nesesizabila) pot fi deosebite §i identificate prin derivatele
de ordin 2, care desi se aseamana, variaza Tn intensitatea unor
maxime.
Indepartarea spectrelor de fond monotone in analiza
cantitativa
Una din cele mai importante aplicatii ale
spectrofotometriei derivate este corectia fonduiui. Din regulile
derivarii se poate demonstra ca fondul constant se elimina chiar
din prima derivata:
A = ct.
44
Daca fondul e o functie liniara de A, a doua derivata va fi 0:
A = a + bA, -=0
Pentru cea de a patra derivata curbele de fond
corespunzatoare unor functii de ordin mai mare pot fi §i ele
eliminate:
A = a + bA + dA, =0
dA
Aceasta posibilitate de eliminare a fonduiui poate fi
utilizata nu numai Tn cazul absorbtiei luminii ci §i Tn cazul
Tmprastierii acesteia. Un exemplu de eliminare a fonduiui Tl
reprezinta aplicarea spectrofotometriei derivate la analiza
calitativa si cantitativa a solutiilor opace.
Una din proprieta'tile importante ale spectrofotometriei
derivate este diferentierea pe care o fac derivatele Tntre benzile
de absorbtie largi §i cele Tnguste, ceea ce da posibilitatea
determinarii selective a unei substante (cu benzi Tnguste) Tn
prezenta unui interferent (cu benzi largi). Diferentierea rezulta
din proportionalitatea inversa ce exista Tntre amplitudinea (Dn)
unei benzi gaussiene Tn spectru! derivat de ordin n si latimea
benzii originals (W) ridicata la puterea n:
1
" Wn
Aceasta reiatie arata ca intensitatea benzilor largi Tn
spectrul initial descreste rapid cu cresterea ordinului derivatei,
Tn timp ce intensitatea benzilor Tnguste creste cu cre§terea
ordinului. De asemenea, relatia de mai sus ne arata ca
spectrofotometria derivata nu poate fi folosita pentru separarea
benzilor suprapuse care au aceleasi latimi sau ale caror latimi
difera foarte putin.
45
 Pentru doua benzi de aceeasi intensitate, dar cu latimi
influentele benzilor largi, datorate, de exemplu, excipientilor
diferite Tn spectrul initial, amplitudinea derivatei de ordin n e mai
lungimile de unda de lucru pot fi fixate cu acuratete.
mare Tn cazul benzii mai ascutite decat Tn cazul celei mai late.
Aceasta proprietate Tmbunatateste acuratetea
determinarilor si apare astfel oportunitatea analizei calitative si
cantitative a sistemelor complexe, Tn cazul cand o banda Pentoxifilina
Nicergolina
Tngusta sau un sistem de benzi Tnguste interfera cu o banda
larga. Prin efectuarea unor derivate de ordin adecvat, aceasta
banda larga este eliminata.
O alta aplicatie determinata de aceasta proprietate este
reducerea fenomenului de Tmprastiere a luminii. De obicei 0,5 -f
problemele analitice care intervin Tn spectrofotometrie nu se
Tntalnesc separat ca Tmprastiere, zgomot de fond sau
component.! nedoriti cu benzi de absorbtie largi, de cele mai
multe ori se Tntalneste o combinatie a doua sau mai multe din
aceste efecte. Spectroscopia derivata este o cale excelenta de
reducere sau eliminare a acestor surse de eroare greu de 200 250 300
caracterizat.

Analiza sistemelor bi si multicomponente prin dA/dl

spectrofotometrie derivata
Asa cum legea Beer - Lambert se aplica la spectrele de
ordin 0 §i Tn cazul derivatelor exists o relatie de linearitate Tntre 0,000 -\
concentrate si amplitudine:
-0,100 H
n
d"A de
Ic
-0,200 -\

la lungimea de unda A, unde A este absorbanta, e coeficientul

molar de extincfle, 1 lungimea stratului absorbant si c
concentratia molara a probei. 200 250 300
Dintre tehnicile care permit dozarea substantelor Tn
amestec faYa folosirea unor procedee de separare prealabilS a
acestora, spectrofotometria derivata are avantajul simplitatii, Figura 1.2.15. a. Spectrul pentoxifHinei §i rsicergolinei. b.
rapiditatii §i exactitatii rezultatelor. Spectrul derivat de ordinui I ai pentoxiflSirjei §i nicergolinei
In cazul amestecurilor de substante, prin derivare (de
obicei, se folosesc spectrele de ordin 2) sunt eliminate Spectrofotometria derivata are foarte multe aplicatii Tn
domeniu! analizei medicamentelor. Stabilitatea unui amestec de
pentoxifilina §i nicergolina Tn solutie perfuzabila a fost studiata
46
47
pe baza evaluarii semnalului derivatei de ordinal I (figura
1.2.15). Masurarea absorbantei Tn derivata de ordinul I la
lungimea de unda a maximului de absorbtie a pentoxifilinei
permite anularea semnalului dat de aceasta molecula
(dA/dA=0) si evaluarea nicergolinei §i, invers, determinarea la
lungimea de undS a maximului de absorbtie a nicergolinei
permite determinarea pentoxifilinei.

1. Derivatizarea chimica

Spectrofotometria indirecta se bazeaza pe conversia

analitului Tntr-o specie chimica cu proprietati spectrale diferite.
In general, prin conversie se Tncearca sa se ajunga la un
derivat cu o lungime de unda de absorbtie si o absorbtivitate
mai mari decat ale molecule! de la care s-a plecat.
Prin derivatizare se urmareste:
- determinarea cantitativa a unor analiti cu absorbtivitati
slabe
- eliminarea influentei absorbtiei de fond (irelevanta) prin
conversie la un analit ce absoarbe Tn vizibil, regiune Tn
care aceasta influenta nu se manifests
- TmbunStatirea selectivitatii determinant din amestecuri,
prin transformarea selectiva a unuia dintre analiti Tntr-un
compus ce absoarbe Tntr-o regiune spectrala Tn care
celelalte componente nu interfere
- scaderea costului analizei, prin efectuarea determinarilor
cu spectrofotometre Tn vizibil (numite uneori colorimetre)
care sunt mai ieftine decat spectrofotometrele UV-VIS
Exista un numar impresionant de lucrari stiintifice Tn care
sunt aplicate variate procedee de derivatizare: diazotare §i
cuplare cu amine aromatice primare, reactii de condensare
(carbonil -> oxime, hidrazone, semicarbazone, baze Schiff,
etc.), oxidari (alcool -» carbonil), complexari (cu Cd, Hg, Cu,
Pb, Zn, Fe, etc.), reactii cu formare de perechi de ioni (metoda
cu coloranti acizi ca albastru de bromotimol, metiloranj, etc.).
200 Lungime de unda [nm] 700
Figura 1.2.16. Spectrui acicluSui saiiciUc ?n apa (a) si a!
complexutui acestuia cu Fe3T (b)
Un exemplu de derivatizare Tl reprezinta complexarea
acidului salicilic cu Fe3+. lonul complex format prezint§ o banda
de absorbtie Tn VIS (figura 1.2.16) la aproximativ 500 nm, ceea
ce permite cuantificarea acidului salicilic aflat Tn amestec cu
compusi ce nu absorb Tn vizibil si nu formeaza complecsi cu
fier. Coloratii caracteristice a caror intensitate este dependents
de pH se obtin prin complexarea cu sulfat de Fe(ll) - citrat a
adrenalinei, principiu care sta la baza dozarii acesteia Tn
solutiile injectabile de procaina §i adrenalina:
2+
,O CHOH-CH2NHCH3 2-
Fc SO

Un alt exemplu este eel al condensarilor dintre o grupare

aminica si una carbonil:

48
49
 RV.
X=O + H2NR"'
R'" H20
R'"
Daca R'" = NH2 produsul de condensare se numeste hidrazona.
Un numar mare de hidrazine sau hidrazide se folosesc la
dozarea colorimetrica a steroizilor. Izoniazida (hidrazida
acidului izonicotinic) reactioneaza cu steroizii Tn solutii acide
pentru a forma derivati galbeni cu /\.max Tn jur de 400 nm:
N ,)—CONHNH2
Reactivul este folosit la dozarea decanoatului de nandrolona §i
a betametazonei Tn solutii injectabile.
Compusii aminici pot fi determinati cantitativ
spectrofotometric folosind, de exemplu, reactivul Ehrlich (4-
dimetilaminobenzaldehida). Procaina clorhidrat este
condensata Tn acest fel la o baza Schiff cu Xmax = 454 nm:
(CH3)2N CH=N COOCH2CH2N(C2H5)2
Diazotarea Tn mediu acid §i cuplarea aminelor aromatice
primare conduce la azoderivati:
Ar-NH2 + HNO2 -> Ar-NsNf + 2H2O
Ar-N=N]+ + Ar'-H -» Ar-N=N-Ar' + H+
Azoderivatii sunt colorati si Tn consecinta au maxime de
absorbtie Tn vizibil. Sensibilitatea si selectivitatea metodei
permit determinarea impuritatilor ce au structura de amina
primara aromatica. Farmacopeea Britanica prevede la controlul
impuritatilor cu structura aminica de la monografia Furosemid o
reactie de diazotare si cuplare. Substantele care pot fi
hidrolizate (de exemplu, clorotiazida, bendrofluazida) sau
reduse (de exemplu, cloramfenicolul) la derivafi ce contin
50
grupare aminica aromatica primara pot fi determinate
spectrofotometric prin diazotare §i cuplare cu derivati aminici.
Adaugarea unei amine sub forma ionizata la un colorant
acid ionizat, de exemplu metiloranj sau bromocrezol, conduce
la obtinerea unei perechi de ioni ce poate fi extrasa Tntr-un
solvent organic cum ar fi cloroformul sau diclormetanul.
Colorantul indicator se adauga Tn exces §i pH-ul solutiei apoase
este ajustat, daca este nevoie, la o valoare la care atat amina
cat si colorantu! sunt Tn forma ionizata. Perechea de ioni
formata este separata de indicatorul Tn exces prin extractie Tn
solvent organic iar absorbanta este masurata la o valoare
corespunzcitoare A,max a indicatorului Tn solvent. Absorbtivitatile
molare ale perechilor de ioni formate Tntre compusi cuaternari
de amoniu si metiloranj sau albastru de bromtimol sunt de
ordinul 2 x 104 - 4 x 104, deci metoda formarii de perechi de
ioni ofera o sensibilitate foarte mare pentru determinarea
anumitor amine sau compusi cuaternari de amoniu ce absorb
slab Tn domeniul ultraviolet. Tehnica se aplica pentru dozarea
anumitor substante medicamentoase din diverse preparate:
solutie injectabila cu lactat de biperidina, comprimate §i solutii
injectabile cu clorhidrat de clonidinS, etc.
Oxidarea la catena laterala a unor compusi cu absorbtie
slaba ce contin un rest fenilic conduce la un derivat carbonilic
ce are o absorbtivitate mai mare decat compusul parinte. De
exemplu, efedrina poate fi oxidata la benzaldehida ce absoarbe
intens la 240 nm. Dozarea efedrinei din solutii medicamentoase
implica extractia benzaldehidei Tn ciclohexan §i masurarea
absorbantei la Xmax=241 nm.
H
HONHCH3
icv /== I
C-CH3 c=o
H H
Efedrina Benzaldehida
51
 1.2.4. Determinarea constantelor
terrnodinamice =8

Spectrofotometria UV-VIS permite estimarea eleganta a

constantelor terrnodinamice, uneori apeland la simulare
informatics. Determinarea constantei de ionizare este eel mai
bun exemplu de aplicabilitate a acestei tehnici instrumentale.

Constanta de ionizare
O2-
Determinarea absorbantei totale la diferite valori de pH
permite determinarea pKa-ului.
Conform relatiei Henderson:
3lO 33O >>">" 35O 37O

Figura 1.2.17. Determinarea pKa-ului ynui acid slab. Spectrul

'formei moleculare (pH = 2), formei ionizate {pH -- 8) §i a!
Tn calcularea pKa-ului intervin concentratiile (activitatile) formei arnestecuiuii (pH ™ 5,5}
acide §i a celei bazice accesibile spectrcfotometriei UV-VIS.
Conditiile de realizare sunt urmatoarele:
Daca:
- tamponul nu trebuie sa absoarba Tn domeniul utilizat
- obtinerea spectrului formei moleculare pure si a formei d + CM = c
ionizate pure
- alegerea lungimii de unda care corespunde unei diferente c fiind concentratia totala a acidului slab HA, atunci fractiile
considerable Tntre absorbtiile celor doua forme speciilor sub forma' ionizata si moleculara sunt:
- studiul la aceasta lungime de unda a variatiilor absorbantei
solutiilor HA/A" la diferite valori de pH
A
Principiul metodei este urmatorul: la orice pH F,=-
absorbanta totala a solutiei este: [HA]

A = (E,C1+£MCM)I

unde ei §i EM sunt coeficienti de absorbtie molari ai formei

ionizate si, respectiv, moleculare. AsimilSnd activitatile §i concentratiile:

K C
rA-i a
L J +
[H ]+Ka
53
52
 (A-Aj
pKa = pH + log

Pentru ca c este foarte scazuta 10"4 mol/l, activitatile §i

Absorbanta solutiei la pH-ul la care cele doua forme concentratiile pot fi confundate si constanta de ionizare Ka
coexista este:
obtinuta este de fapt constanta termodinamica K°. Prezenta
A = eiFicI + sMFMcl tamponului antreneaza efecte de forta ionica, de aceea
constanta obtinuta trebuie considerata ca fiind dependents de
conditiile experimentale.
K, . rh -cl Aceste determinari necesita Tnregistrarea spectrelor a
M
[H+] + Ka doua specii ionizate si moleculare §i realizarea unei serii de
rnasuratori la diferite pH-uri, Tncadrand aproximativ pKa-u!
Tnmultind cu [hT] + Ka si regrupand termenii se obtine: determinat pe baza unor predeterminari:

= [H*](EMcl-A) pH = pKa + 0,2 + 0,4 + 0,6

A -€,01
pH = pKa - 0,2 - 0,4 - 0,6
A-£,Cl
£,,,,cl-A
1.2.5. Aparatura folosita in
unde spectrofotometria UV-VIS
- sicl este absorbanta solutiei substantei studiate la
aceea§i concentrate, m aceeasi cuva de lungime Spectrele de absorbtie se obtin cu ajutorul
I, aceeasi lungime de unda dar la un pH la care spectrofotometrelor. In figura 1.2.18 este prezentat schematic
este total ionizata un spectrofotometru de absorbtie cu monofascicul, format din
- SMC! este absorbanta solutiei substantei studiate Tn patru componente principale: sursa, monocromator, celula Tn
aceleasi conditii experimentale dar la un pH la care se introduce proba si detector.
care substanta este Tn totalitate neionizata
Lumlns emlsa de sursa Lumlna selectats Lumlna ramsss dupa
Pentru un acid HA: absorbtlt

pK a =pH .(A-A,)
' (A M -A)
inreglstrator
iar pentru un acid de tipul BH+: Sursa de
Monocromator cu prlsma cuva cu proba
kjmlna

Figura 1.2.18. Schema unui specfrofotometru de absorbtie

54 55
 • O sursa ideala ar trebui sa emita o radiatie continua,
cu intensitate uniforma pe un domeniu larg de lungimi
de undci.
• Elementele de dispersie au rolul de a descompune
radiatia Tn componentele sale si pot fi prisme, retele
de difractie sau interferometre. Un dispozitiv special
situat Tnaintea detectorului, Tntrerupe fasciculul
luminos si permite detectorului sa masoare diferenta
Tntre cele doua semnale. Exista aparate cu doi
detectori care mascara electronic diferenta.
« Celula (cuva) de absorbtie are ferestre ce permit
transmiterea radiatiilor fara sa absoarba nimic.
« Detectoru. irebuie sa fie sensibil la radiatia care cade
pe el sj sa fie capabil sa prezinte spectrul pe un
display sau un Tnregistrator. Spectrul poate fi
Tnregistrat ca absorbanta sau transmitanta
procentuala Tn functie de frecventa, numere de unda
sau lungime de unda.
Pentru domeniile UV apropiat si VIS sursele sunt lampa
cu filament de tungsten pentru vizibil §i lampa cu descarcare Tn
deuteriu, cu Tnvelis d^ cuart pentru ultravioletul apropiat. O
sursa foarte intensa pe'ntru ambele regiuni este lampa cu arc Tn
xenon la Tnalta presiune. Lampa produce radiatii pana la valori
mai mici de 200 nm. Ferestrele cuvelor pentru probe sunt din
sticla Pyrex pentru vizibil si din cuart topit pentru vizibil §i
ultraviolet apropiat. Elementele de dispersie pot fi prisme (din
sticla pentru vizibil si cuart pentru ultraviolet) sau retele de
difractie. Detectorii sunt fotomultiplicatori Tn care fotonii care
cad pe suprafata unui metal, cum este cesiu, due la emisia de
electroni (fotoelectroni). Acesti electron! sunt accelerati sub
tensiune si cad pe suprafata unui alt electrod, de unde Tn urma
ciocnirilor cu schimb de energie se emit un numar mai mare de
electroni secundari, procesul repetandu-se astfel Tncat se
obtine pe anod (uitimul electrod} un curent mare. Se mai pot
folosi placi fotografice sau detectori format din sjruri (barete) de
fotodiode, care prezinta avantajul de a putea detecta un
domeniu larg de lungimi de unda In acelasj timp.
56
fn dezvoltarea unei metode analitice este imperios
necesar sa se aleaga ceie rnai adecvate conditii instrurnentale
si experimentale pentru un sistem proba de analizat. Acuratetea
si precizia unei rnasuratori spectrofotometrice depind de
intensitatea radiatiei incidente si de conditionarea probei
(solvent, concentrate sJ lungimea stratului strabatut de
radiatie), precum si de parametrii instrumentali (lungime de
unda, deschiderea fantei §i viteza de Tnregistrare).
A. Caracteristicille probei
Solventui
Alegerea solventului depinde de solubilitatea substantei
de interes §i de lungimea de unda de absorbtie a analitului.
Pozitia §i forma maximelor de absorbtie, precum §i intensitatea
benziior Tn spectrele. UV si VIS sunt puternic influentate de
solventui utilizat §i de aceea toate datele experimentale trebuie
Tnsotite de specificarea solventului Tn care s-a efectuat
determinarea.
In genera! substantele polare sunt solubile Tn solventi
polar) curn ar fi etanolul sau apa. Apa este solventui ideal
deoarece practic nu abscarbe peste 180 nm, este ieftina si
poate fi usor purificata Tn laborator. Pe de alta parte, daca
analitul dizolvat Tn apa poate intra Tn reactii de echilibru (de
exempiu, un echilibru acido-bazic sau echilibru ceto-enolic) ce
depind de pH, atunci prin ajustarea pH-u!ui se poate mentine Tn
solutie doar una din speciile chimice.
Solventii organic! pot avea absorbtii caracteristice si din
aceasta cauza utiiizarea lor este restrictionata !a iungimi de
unda la care transparent lor este acceptabila. Compensarea
absorbtiilor siabe date de solvent se face prin utiiizarea unei
referinte, solventui pur, Tn timpul masuratorilor scazandu-se
automat contributia acestuia la absorbtia probei. Absorbtiile
57
puternice nu pot fi compensate ?n acest mod. Conform aspect iar Tncadrarea absorbantelor probelor Tntre aceste limite
prevederilor Farmacopeei Britanice, de exemplu, absorbanta se face fie prin ajustarea concentratiei, fie a dimensiunilor cuvei
referintei Tn cuva de 1 cm trebuie sa nu depaseasca 0,4 unitati Tn care este introdusa proba. La echipamentele mai vechi,
de absorbanta, de preferinta sub 0,2, la lungimea de unda de dotate cu detector fotoemisiv, eroarea relativa este minima la o
lucru. Tn acest caz se ia ca referinta cuva cu aer. In tabelul valoare a absorbantei de 0,434 iar domeniul de absorbante al
1.2.4. sunt prezentate lungimile de unda limita de utilizare a probelor trebuie sa fie cuprins Tntre 0,2 si 0,7.
solventilor (,,cut-off) ce reprezinta lungimea de unda la care
absorbanta solventului este 1 in cuva de 1 cm si sub aceasta B. Pararnetrii instrumental!
masurStorile spectrale sunt inadecvate.
Deschiderea fantei
Tabeiul 1.2.4. Lungimile de unda limita de utilizare ale catorva Multe spectrofotometre moderne ofera posibilitatea
solvent! organic! uzuali
modificarii deschiderii fantei ce lasa unda ce vine de la
monocromator catre cuva cu proba.
Solvent 'MwmJ_'" Solvent j ^fnm]
Etanol 205 Dietileter 220
Metanol 210 Cloroform 245 g
Acetonitril 210 Tetraclorura de 265 E Latimea benzii
carbon spectrale
TO
Hexan 210 Toluen 280 CD
Ciclohexan 210 Acetona 330 I

Concentratia substantei si distanta strabatuta de radiatie

Tn proba
Intensitatea luminii transmise de o specie absorbantS (IT)
prezinta o fluctuatie Tntamplatoare datorata variatiilor mici ale
intensitatii emise de sursa, detectorului, amplificatorului de Igura 1,2,19. Variatia intensitatii Suminii cu iungimnea de unda a
semnal, etc. Aceasta fluctuatie variaza cu absorbanta masurata rsdiatisi emergente fa feisirea din farsia monoeronrjatorufu!
si cu tipul de detector utilizat. In consecinta, fiecare valoare a
absorbantei este citita cu o anumita eroare. Eroarea relativa % "A
a unei astfei de citiri este diferenta Tntre concentratia adevarata
LStimea de banda
si cea calculata din absorbanta masurata (Ac) exprimata ca naturala
procent din concentratia adevarata (c):
Ac
%Eroarea relativa =—100
c
Pentru aparatele moderne echipate cu detector cu
fotomultiplicator, eroarea relativa este minima daca A = 0,869
(T = 13,5%). Prin urmare, acuratetea §i precizia sunt optime
daca A are o valoare Tn jur de 0,9. Totu§i Tn practica,
absorbante cuprinse Tntre 0,3 si 1,5 sunt acceptabile sub acest
Figyra 1.2.26, Banda de abso>rbfi& ideals:
58 59

Lumina ce vine de ia o prisma sau un monocromator cu
retea nu este absolut rrtonocromatica, fiind de fapt o suma de
radiatii cu lungimi de unda foarte apropiate. Radiatia centraia
este cea mai intensa iar lungimea de unda corespunzatoare
acesteia este atribuita Tntregului fascicul.
Monocromaticitatea sau puritatea spectrala a radiatiei ce
cade asupra unei probe este definita ca latimea benzii spectrale
care este latimea benzii (Tn nm) la Vz din intensitatea maxima
(figura 1.2.19).
Absorbanta observata
Absorbanta adevarata
Latimea de banda spectrala
Latimea de banda naturala
0,1 10
Figura 1.2.21. Efectu! cresterii latirnii de banda spectrala asupra
absorbantei masurate
Efectui pe care Tl are deschiderea fantei asupra
spectrului unei probe depinde de latimea benzii de absorbtie §i
de lungimea de unda la care se face masuratoarea, la un
maxim sau un minim de absorbtie.
Latimea benzii de absorbtie la 1/2 din Amax este definita
ca latimea de banda naturala {figura 1.2.20). Daca latimea de
banda spectrala excede cu o zecime fatimea de banda
naturala, absorbanta ia Xmax va fi mai mica decat valoarea
adevaratci (figura 1.2.21).
Acest lucru se datoreaza faptului ca la o deschidere mai
mare a fantei, Tn banda spectrala sunt inciuse tot mai multe
radiatii la care absorbtia substantei este mica. Mai mult, cu cat
absorbanta creste ca urmare a cresterii concentratiei substantei
sau a lungimii stratului strabatut de radiatir, eroarea relativa %
cre§te, avand ca rezultat deviatii negative de ia legea Beer -
60
Lambert. Pe de alta parte, daca banda spectrala este larga Tn
raport cu latimea de banda naturala, se vor observa absorbante
false mari la X,mm §i deviatii pozitive de la legea Beer - Lambert
(figura 1.2.22). Prin urmare, benzile de absorbtie Tnguste sunt
puternic afectate de varierea deschiderii fantei, comparativ cu
cele largi.
1 nm banda spectrala
A
2 nm banda spectrala
\\ * nm banda spectrala
X
Figura 1.2.22. Efectu! cre§terii lafimi! de banda spectrala asupra
unei benzi de absorbtie ioguste
Invers, daca deschiderea fantei este prea Tngusta,
energia incidenta este redusa si, Tn consecinta, scade raportul
semnal - zgomot si, deci, precizia masuratorii. Prin urmare
stabilirea optima a deschiderii fantei poate asigura fidelitatea
spectrala.
Viteza de Tnreqistrare (scanare)
Viteza de Tnregistrare poate produce deplasarea
maximelor de absorbtie si scaderea Tn intensitate a benzilor de
absorbtie. Optimul acesteia Tl reprezinta cea mai rapida viteza
de Tnregistrare ce mentine fidelitatea masuratorii.
Lumina de dispersie
Se datoreaza Tmprastierii si refractiei Tn interiorul
monocromatorului §i poate produce modificari spectrale (benzi
cu linie de zgomot) si deviatii ale legii Beer - Lambert.
61
 Printre factorii chimici care pot afecta legea Beer, se
numara: disocierea, asocierea, polimerizarea, formarea de
C. Deviatii de Ja ieqea Beer - Lambert
complecsi, etc., care au loc ca urmare a variatiei concentratiei.
DacS Tn urma acestor procese de echilibru rezulta specii
Exista situatii Tn care la reprezentarea grafica a
chimice cu absorbtivitati diferite, orice factor ce afecteaza
absorbantei Tn functie de concentrate, liniaritatea nu se mai
echilibrul (cum ar fi si concentratia), poate produce deviatii de la
respecta, curbele prezentand deviatii pozitive sau negative
proportionalitatea A ~ c.
(figura 1.2.23).

deviatii pozitive ,• Legea Beer-Lambert

deviatii negative

Figura 1.2.23. Deviatii positive g! negative de \?> legsa Beer -

Lam bed;

In mod natural, daca latimea benzii spectrale este mai

mica cu 1/10 din Ia1;imea benzii naturaie, legea Beer - Lambert
are reprezentari liniare, Tn absents luminii de dispersie. Daca
radiatia incidents nu este suficient de monocromatica, sau
banda spectrala este larga iar absorbtia substantei la limitele
benzii spectrale este mica, atunci au loc deviatii negative de la
legea absorbtiei luminii la concentratii mari. Daca
absorbtivitatea este mare la limitele benzii spectrale, se vor
obtine deviatii pozitive.
Daca absorbanta unei solutii se abate de la legea Beer
(A ~ c), pentru a stabili cauza acestei abateri se verifica legea
Lambert (A ~ I). Daca absorbanta unei solutii nu variaza direct
proportional cu lungimea cuvei, atunci abaterile de la legea
Beer sunt cauzate de factor! chimici si mai putin de lipsa de
monocromaticitate a luminii.
63
62

Multi compusi organic! sau mineraii, puri sau Tn solutie, ?n
stare lichida sau solida (cristale molecuiare sau ionice) emit
lumina cand sunt excitati de fotoni cu energia corespunzatoare
domeniului vizibil sau UV apropiat. Acest fenomen numit
fotoluminiscenta sta la originea fluorimetriei, o metoda de cele
mai muite ori selectiva si foarte sensibila permitand
determinarea cantitativa a numerosilor compusi organic! sau
anorganic!. Fluorescenta raportata la concentratia analitului,
descre§te extrem de rapid atunci cand excitatia Tnceteaza, Tn
opozitie cu fosforescenta unde descre§terea Tn timp este mult
mai lenta.
Aparatele de masurare ale intensitatii fluorescentei se
numesc fluorimetre, iar cele care masoara intensitatea
fluorescentei la lungimi de unda variabile ale emisiei
Tnregistrand un spectru de fluorescenta se nurnesc
spectrofluorimetre.
Compusji Tn solutie, atunci cand sunt excitati de radiatii
luminoase din domeniul vizibil sau UV apropiat, reemit energia
primita Tn totalitate sau partial sub forma de fascicule. Conform
legii lui Stokes maximul emisiei unui compus fluorescent este
situat la o lungime de unda mai mare decat cea
corespunzatoare maximului din banda de absorbtie.
intensitatea fluxului luminos descre§te atunci cand
excitatia este sistata, dupa o ecuatie exponential^.
Expresia care leaga intensitatea radiatiei emise lt §i
timpul scurs de la Tncetarea excitatiei are forma:
It = IQ exp [-kt]
64
Aceasta lege a descresjerii exponentiate se aplica atat
fluorescentei cat si fosforescentei, diferenta regasindu-se doar
Tn valoarea constantei k. Fluorescenta corespunde unei
descre§teri instantanee a lui lt, iar fosforescenta unei
descre§teri rnult mai lente.
Durata de viata a fluorescentei (sau fosforescentei) TO
este definita plecand de la constanta k prin termenul:
1
T0=-
In aceasta situatie, intensitatea lt ce corespunde valorii
36,8% din intensitatea radiatiei incidente I0 arata ca 63,2% din
speciile initials revin la un stadiu neemisiv. Valoarea lui TO fiind
de ordinul 'a catorva nanosecunde, aparatele utilizate Tn astfei
de masuratori iucreaza Tn regim stationar (rnentinand excitatia).
In fosforescenta unde TO depa§e§te adesea mai multe secunde,
masuratorile sunt facute dupa excitare. Sensibilitatea
fluorimetriei este de aproximativ 1000 de ori mai mare decat a
spectrometriei UV-ViS, dar Tn aceiasj timp utilizarea corecta a
acestor tehnici presupune o buna cunoa§tere a fenomenelor,
pentru evitarea numeroaseior surse de eroare.
Din punct de vedere fundamental, fluorescenta
compu§ilor molecular! provine din schimbul de energie a
orbitalilor periferici.
Moiecuieie au energie de vibratie. Deoarece moleculeie
au un numar mare de vibratii, fiecare dintre acestea produc o
serie de nivele de vibratii, aproximativ ega! distantate pentru
fiecare stare electronica.
Daca initial moleculeie se gasesc Tn starea electronica
fundamental^ So, dupa absorbtia instantanee vor trece pe
nivelu! cu frecventa de vibratie Vj a starii 81; foarte rapid (10~1 s)
prin procesui numit conversie interna, moleculeie revin fara sa
emita fotoni la frecventa de vibratie v0 a nivelului St.
65
 pentru a conduce la nivelul TI (triplet) putin mai stabil. Din
Daca acest nivel este compatibil cu nivelul fundamental, aceasta cauza revenirea ulterioara la stadiul fundamental este
sistemul poate trece din nou printr-o etapa fluorescenta (10~11- mai lenta decat Tn fluorescenta, ea implicand si o mifcare de
10"8s) in cursul careia moleculele pot emite fotoni. In cursul spin a electronului (uneori durata de viata poate depa§i cateva
fluorescentei care Tnsoteste revenirea la stadiul initial, molecula minute).
poate conserva o parte din energia primita sub forma de
energie vibrationala. Acest exces de energie de vibratie este
disipat prin ciocniri sau alte procese non-radiative numite
mecanisme de relaxare vibrationala, nefiind exclusa o emisie
de fotoni mai saraci in energie care stau la originea unei
fluorescente situate Tn IR mijlociu.
In timp ce figura 1.3.1 reprezinta diagrama energetica a
fluorescentei si fosforescentei, figura 1.3.2 ilustreaza Tn acela§i
grafic spectrul de absorbtie si eel de emisie pentru o molecula Fluoren
Difenil
oarecare fluorescenta.

Naftalina Anilina

OOH

TJtB

Figura 1.3.1. Diagrameie esiergetice comparative ale

fluorescentei §i fosforescentei
Fluoresceina 8-Hidroxichinolina
Fosforescenta corespunde unui mod de excitare mai
complex, dupa faza de absorbtie corespunzatoare transferului
Schema 1.3.1. Cornpusi fluorescent! aromatic!
unui electron Tn nivelul Si (singlet), se asista, daca relaxarea
vibrationala este lenta, la o miscare de spin a electronului
67
66
 T
235
335
Figora 1.3.2. Spectrele de excitare §i emlsle ale unei substanfe
fiuorescente
Fluorescenta este caracteristica moleculelor ciclice rigide
si care poseda legaturi n, fiind mai pronuntata in cazul prezentei
m molecula a gruparilor donatoare de electroni si diminuata de
prezenta gruparilor cu efect respingator de electroni (schema
1.3.1).
1.3.3. Factor! care infSuenteaza
A,._FJuorescenta si structure moleculara
In practica s-a constatat ca numai o proportie redusa a
compusilor organic! este fluorescenta §i se vor enumera in
continuare caracteristicile comune ale acestor compusi. Inainte
ca o molecula sa poata emite radiatii prin procesul de
fluorescenta, ea trebuie sa fie capabila sa absoarba radiatie,
dar nu toate moleculele care absorb Tn UV-VIS sunt
fiuorescente. Ca un prim pas s-a propus cuantificarea unei
marirni care sa aprecieze daca o molecula data poate fi
fluorescenta. Aceasta se realizeaza prin randameniul cuantic Of
care este definit ca fractia din radiatia incidenta reemisa ca
radiatie fluorescenta:
68
nr.de fotoni emisi intensitatea fluorescentei
nr.de fotoni absorbiti intensitatea absorbtiei
Valorile iui Of se situeaza Tntre 0 §i 1 §i sunt o proprietate
inerenta a molecule!, determinata Tn mare parte de structure sa.
O valoare ridicata a iui Of este ?n general asociata cu
moleculele ce poseda o structura relativ rigida (fluoresceina,
antracen, alte structuri organice cu inele condensate). Nu toate
moleculele rigide sunt insa fiuorescente pentru ca posibilitatea
schimbuiui intersistemic este interzisa. Revenirea la starea
fundamental^ devine posibila cand se ajunge la starea excitata
cea mai redusa care poate fi atinsa printr-o tranzitie n-rr* de la
starea fundamentals. Starea de excitare ca urmare a unei
tranzitii n-rr* ^are o durata de viata mai mare decat starea de
excitare TT-TT*, deci exista §anse mai mar! pentru un schimb
intersistemic. O data ce acesta are loc, reiaxarea vibrationala
coboara molecula spre nivelul vibrational eel mai scazut al starii
excitate unde este mentinuta destul de mult timp pentru a fi
dezactivata prin ciocniri sau alte mecanisme externe de
stingere.
Spre exemplificare s-au ales 6 cornpus.i organic! care au
fost analizati din punct de vedere ai fiuorescentei (schema
1.3.2).
9 A este un anion, fluoresceina, foarte fluorescent, datorita
sistemului planar conjugat extins. lonul contine de fapt
un grup ceto (inelul din dreapta este chinoid) dar Tn
aceasta structura starea de excitatie n-m* nu este la
nivelul eel mai redus.
• In B (cetona ciclica) starea de excitatie n->ir' este mai
redusa decat orice stare TT->TT* si deci nu este
fluorescent. Piridina (C) are si ea o stare redusa n-m*
ce include o singura pereche de electroni la azot si deci
nu este fluorescenta.
o Compusul D este triptofan, un aminoacid care este
fluorescent (majoritatea celorlalti nu absorb peste 210
nm).
69
 NaO • Bifenilul (E) este o hidrocarbura fara caracteristici
structurale complicate si este fluorescent; molecula
adopta o configuratie planara pentru a extinde
conjugarea peste cele doua inele.
• Acetatul de etil (F) nu este fluorescent pentru ca nu
COONa
absoarbe radiafii peste 200 nm, lungime de undS limita
in cazul aparatelor obisnuite.
« lodbenzenul (G) nu este fluorescent pentru ca Tn
prezenta atomului greu de iod se faciliteaza schimbul
intersistemic §i scade distribuirea starii de excitatie
B initiala Tnainte de a se putea emite un foton.

In concluzie moleculele cele mai fluorescente sunt cele

contin§nd unul sau mai multe nuclee aromatice (naftalina,
CH-CHCOOH
I antracen) si anumiti heterocicli (chinolinic, cumarinic, indolic).
NH, Gruparile electrodonoare: -NR > -NH > -OR > -OH sunt
considerate activatori de fiuorescenta.
Gruparile electroacceptoare: -COOH, -COOR, -CHO,
-COR, -NO2, -NO diminueaza intensitatea fiuorescentei.
D Structuriie rigide diminueaza viteza conversiei interne si
favorizeaza emisia fotonilor prin fiuorescenta (exemplu,
randarnentu! cuantic § = 0,2 Tn bifenil creste la 1 Tn fluorena
pentru ca puntea metilenica mareste rigiditatea moleculei).

CH3COOC2H5

Bifenil Fluorena

B. EfectuS solventului in spectroscopia de

fiuorescenta

Este foarte important de notat faptul ca, Tn practica,

vaioarea lui Of este afectata de factor! extern! §i Tn special de
70 solventul Tn care se dizolva moleculeie fluorescente. A§adar
71
 soiventul are un efect semnificativ asupra intensitatii benzilor
fluorescente, ca de altfel si asupra pozitiei si formei benzii ia o
anumita lungime de unda.
Desi tranzitia 0-0 da nastere unei benzi atat in spectrul
de excitare cat si de emisie, lungimea sa de unda s-ar putea sa
nu fie identica Tn ambele spectre, in spectrul de emisie se
observa in general o usoara depiasare a lungimii de unda
datorita interactiunii dintre moieculele solutuiui fluorescent §i
molecuiele soiventului.
Poiaritatea soiventului are un efect puternic asupra
aparitiei structurii fine Tn benzile de absorbtie Tn UV, dec!
aceasta proprietate este factorul major ce cauzeaza si
deplasarea Tn banda 0-0.
O alta probiema importanta ce trebuie observata in
spectroscopia analitica este aceea ca soiventu! poate avea
efect semnificativ asupra formei spectrului.
Tntr-o solutie, moieculele solventuiui se distribuie Tn jurul
moleculelor solutuiui Tntr-un mod ce conduce la starea cu cea
mai mare stabilitate pentru sistem, ca o lege fundamental^ a
naturii care se exprima Tn mod termodinamic Tn termeni de
energie a sistemului; cea mai mare stabilitate corespunde
minimuiui de energie.
Energia unui sistem soivent/substanta dizolvata este
determinata Tn mare masura de fortele electrostatice si deci
interactiunea este mai puternica cand avem un solut polar
dizolvat Tntr-un solvent polar. Aceasta conduce la o mai mare
diferenta Tntre configurable cele mai stabile si cele mai putin
stabile. Cand o molecula este supusa unei excitari electronice,
se produce o schimbare semnificativa a poiaritatii acesteia. Prin
urmare, distributia molecuielor unui solvent care da cea mai
stabila configuratie pentru starea fundamental^, nu va
minimaliza neaparat energia aceleia§i molecule Tn starea
excitata, Procesul de absorbtie este Tn mod virtual comparat
instantaneu cu mi§carea moleculara §i moleculeie soiventului
se vor adapta celei mai stabile configuratii Tn starea de excitare,
cu o u§oara reducere a energiei. Din aceasta stare, molecuia
se Tntoarce !a starea fundamentals unde energia sistemului
este din nou minima, intrucat distribuirea molecuieior
soiventului corespunde starii de excitare.
72
Pozitionarea ulterioara reduce energia la valoarea
initiala, rev'enindu-se la starea fundamentala. In consecinta
fotonul emis are o energie mai mica decat fotonul care excita
iar banda 0-0 apare la o lungime de unda mai mare Tn spectrul
de emisie.
C. Relatia fiijorescenta - concentrate
Cea mai importanta aplicatie a fluorescentei este analiza
cantitativa. Ca si Tn cazul altor metode instrumental de analiza,
anaiiza cantitativa se bazeaza pe masurarea fiuorescentei sub
forma unui "semnal analitic" care variaza Tn functie de
concentratia analitului. Odata anaiizat, semnalul obtinut pentru
proba este transformat Tn concentrate cu ajutoru! unor "grafice
de caiibrare" prin masurarea semnalelor pentru un numar de
soiutii standard ce contin cantitati cunoscute de anaiit.
In procesul fluorescentei parametrii echivalenti cu
absorbtivitatea din spectrofotometria de absorbtie definesc
eficienta fluorescentei. Intensitatea fluorescentei depinde de
cantitatea radiatiei absorbite si aceasta este determinata de
concentratia speciiior fluorescente. intensitatea fluorescentei
masurata' cu ajutorul unui detector adecvat corespunde
rezultantei fiuorescentelor voiumelor mici individuate prezente
Tn spatiul deiimitat de intrare si iesire:
Figuca 1.3.3. Intensitatea fluorescentei
73
 de aceea un calcul empiric al intensitatii fluorescentei If a probei
este dificil. a§adar:
Fenomenul de "stingere luminoasa" numit "filtru intern"
Kca
datorat recuperarii partiale a spectrelor de absorbtie si emisie f = Ol0(1-e--kcd\
)
este marii de transferurile de energie a speciilor excitate cu alte
molecule sau ioni strain! prin ciocnire sau complexare. De Aceasta expresie arata clar ca semnalul analitic este
mentionat ca prezenta oxigenului determine o supraestimare a proportional cu IQ §i ^f. Deoarece concentratia apare ca o
fluorescentei. functie exponentiala, procedeul standard de eliminare a
Pentru o solutie, asa cum s-a aratat anterior, functiilor exponentiaie consta Tn transformarea expresiei Tntr-o
randamentul cuantic de fluorescenta cpf (cuprins mtre 0 si 1) serie de puteri:
este egal cu numarul de fotoni emi§i raportati la numarui de
fotoni absorbiti, ceea ce poate fi echivalat cu raportul intensitatii x x x
fluorescentei si cei al absorbtiei: ex = — — ...efc
2! 3! 4!

Pentru e"x care implica schimbarea sumelor puterii vom avea:

. x 2 , x3 x"
Intensitatea fluorescent,ei este data de relajia: e ^x — 1 _ y
s\
^tr*
i * .wlO
2! 3! 4!
(termenii de la numitor = termeni factoriali)
If = Of - la
Pentru x foarte mic, putem ignora termenii x2, x3 si
unde la = I0 - lt
puterile mai man, si putem folosi substitutia simpla a lui e"x = 1-x
Prin Tnlocuire rezulta: de unde :

It = 0flokcd
Introducand definitia absorban|ei: Reintroducerea absorbtivitajii molare e conduce la expresia:

A = ecd It = 2,303 0>flo e c d

se obtine:

log = £cd Cantitatea If se refera la fluorescent.a totals §i reunind Tntr-un

't singur factor K, parametrii proprii compusului studiat si ai
aparatului, se poate scrie pentru solutiile foarte diluate (a caror
transformand Tn logaritmi natural!: A < 0,01):

In ~- = kcd sau exponential -L = e"kcd

74 75
 De la anumite valori, fluorescenta nu mai este proportionala cu « DIFUZIA RAYLEIGH - reprezinta reemisia unei mici
concentratia ca urmare a nelinearitatii legii lui Beer, relatia de fractiuni din lumina excitata, Tn toate directive,
proportionalitate, respectiv fluorescenta, sunt diminuate de intensitatea sa depinzand de polarizabilitatea
aparitia complecsilor, de asociatia Tntre molecuiele excitate si rnoleculelor de solvent.
cele ramase Tn stare fundamental^.
e DIFUZIA RAMAN - este determinate de transferul unei
Curba din figura 1.3.4 ilustreaza grafic expresia: parti din energia radiatiei incidente moleculelor de
solvent sub forma de energie de vibratie.
lf =0k!01(T(£|ll+£2l2)c(1-1Crdc) Comparativ cu difuzia Rayleigh, picul Tn cazul difuziei
Raman este deplasat spre lungimi de unda mai mari. Pentru
fiecare solvent diferenta de energie Tntre fotonii absorbiti §i cei
reemisj este constanta; modificand iungimea de unda a radiatiei
excitate, se va observa o deplasare a pozitiei picului Raman.

Intensitatea de
fluorescenta Difuzia Rayleigh

0 0,02 0,06 0,08 0,1 Difuzia Raman Fluorescenta A Lumina

concentrate (unit, arbit.) de difractie

Lungime de unda

Figure H.3,5. Componantale unui spfj

Reducerea interferentelor Raman Tn spectrele de

fluorescent^ se poate realiza prin:
• Schimbarea solventului cu unul ale carui benzi Raman
coincid cu maximul emisiei fiuorescente.
» Modificarea lungimii de unda excitante pentru a deplasa
benzile Raman fata de banda fluorescenta.
• Marirea latimii fantei. Intensitatea benzii fiuorescente va
0. Dtfuzia Raylelcjh sj difuzia Raman creste oda'ta cu patratul latimii benzii. Banda Raman mai
Tngusta va creste Tn intensitate doar liniar fata de latimea
Atunci cand lungimea de unda corespunzatoare benzii, ceea ce va favoriza observarea benzii
excitatiei si cea corespunzatoare emisiei sunt apropiate, fiuorescente.
fluorescenta probei nu trebuie confundata cu urmatoarele tipuri
deemisii (figura 1.3.5):

76 77
 Tabelul 1.3.1. Pozitia picurilor Raman, calculate pentru patru Aceste doua procese depind de concentratia elementelor
solvent! uzuali dupa excitare la 5 lunginni de unda (A,} de stingere, Q: Tn cazul mecanismului de ciocnire, cu cat
concentratia lui Q este mai mare, cu atat sansa de ciocnire
—,—.—.—^
Excitare 254 313 Deplasare dintre analit si elementul de stingere este mai rnare, deci
365 405 436
fern"1) sporeste si sansa de excitare a lui A*, iar Tn cazul formarii
Apa 278 350 416 469 511 3 380 complexului, avem un efect de actiune asupra masei care
Etanol 274 344 405 459 500 2 920 deplaseaza echilibrul spre dreapta (formarea lui AQ*), Tntrucat
Ciclohexan 274 344 408 458 499 2880 concentratia unuia dintre reactan^i creste.
CJoroform 275 '1AK
461 502 3020 In general este greu de prevazut daca fluorescenta unui
compus poate fi Tntarziata prin prezenta altui compus specific
E. Stinqerea fluorescentei cunoscut - daca nu se stie ca cele doua molecule vor reactiona
pentru a forma elemente noi fluorescente. Totusi, un principiu
Stingerea presupune transferu! energiei de pe o general care poate fi aplicat este acela ca moleculele ce
molecula excitata pe o alta molecula, de obicei ca rezultat al determina compusii fluorescenti excitati sa treaca prin starea de
ciocnirii. Acest lucru poate fi important Tntr-o analiza, deoarece triplet, de obicei ca rezultat al formarii unui complex, actioneaza
fluorecenta analitului poate fi stinsa de moleculele unui compus ca agenti de stingere. Compusii organici care afecteaza
prezent Tn proba - "efect de matrice" - Tntalnit Tn toate tipurile eficienta fluorescentei sunt acei compusi ce contin atomi grei,
de analiza. Daca se mentjne constants concentratia Tn special halogen! care actioneaza ca agenti de stingere,
elementelor de stingere, se poate face abstractie de ea, dar compusii care contin electroni nepereche pot actiona, de
problema devine mai acuta cand concentrajia acestora variaza asemenea, ca agenti de stingere.
Tn mod neasteptat.
Cel mai important compus de acest tip este oxigenul
Daca efectul de stingere nu este semnificativ, o posibila molecular care este cunoscut ca element paramagnetic
abordare ar fi sa se adauge un supliment de "substanta de universal prezent Tn solutiiie tuturor probelor. Oxigenul este
stingere" la toate probele §i standardele. foarte eficient Tn deplasarea energiei de la moleculele Tn stare
O molecula excitata ar putea transfera energia sa unei a de triplet §i este, prin urmare, o problema particulara Tn
doua molecule fara sa emita un foton prin doua mecanisme: fosforescenta si pentru moleculele cu durata mare de
primul este prin ciocnire 7n timpul caYeia energia este fluorescenta. In alte cazuri, efectele sale sunt de numai cateva
transferata direct iar procesul poate f reprezentat prin ecuatia: procente, dar sunt suficiente ca sa fie semnificative. In
consecinta cand se dezvolta o noua metoda analitica
A* + Q _>. A + Q* fluorimetrica va fi necesar sa se verifice daca oxigenul dizolvat
afecteaza intensitatea fluorescentei. Acest lucru se face prin
unde A este molecula analitului fluorescent, iar Q este deplasarea oxigenuiui, fie prin barbotare de azot Tn proba, fie
elementul de stingere, iar celalalt proces include formarea unui prin Tncalzirea probei, daca este posibil sub presiune redusa.
complex Tntre analit si elementul de stingere, care ar putea
degrada energia printr-un mecanism de conversie interns:

A* + Q o AQ* AQ

78
79
 F. Fotodescom.punerea 6. Unfiuenta pH-uiuj

Moclificarea pH~ului solutiei va avea efecte semnificative

Fotodescompunerea este privita ca un proces care
asupra fluorescentei unui compus daca spectrul de absorbtie a!
concureaza cu emisia fiuorescenta. Ea poate avea un efect
acestuia depinde si el de pH. Multi fenoli, de exemplu, sunt
semnificativ, fie prin cresterea, fie prin descre§terea intensitatii
fluorescenti atat Tn forma disociata cat si Tn cea nedisociata,
observate Tn timpul analizei unei probe.
spectrul de fiuorescenta prezentand doua picuri, unul datorat
O descrestere a intensitatii va fi observata daca
formei ionice, Tnlaturarea acestuia facandu-se Tn solutii acide.
elementele fiuorescente se descompun Tn produ§i
nefluorescenti. O creftere a intensitatii va fi observata daca
elementele fiuorescente ce se descompun dau produsi care H. Temperatura si yas.cQzjtat.ea
sunt mai fluorescenti decat elementele originare, Tn aceleasi
Variatiile de ternperatura §i vascozitate cauzeaza variatii
conditii de excitare. O alta posibilitate este aceea ca un alt
Tn frecventa ciocnirilor mtre molecule. Cresterea temperaturii
component prezent Tn proba, cum ar fi un reactiv fluorimetric, sa
sau descre§terea vascozitatii determina o scadere a
se descompuna pentru a da produ§i fluorescent!. Alte efecte pot
fluorescentei prin dezactivarea moieculelor. In mod similar
apare prin distrugerea sau formarea agentilor de stingere Tn
proba prin fotodescompunere. multe substante nefluorescente la ternperatura camerei devin
capabile sa emita lumina cand sunt excitate la o ternperatura
Primui semn al fotodescompunerii este acela ca
joasa sau se afla Tntr-un solvent vascos. Coeficientii de
intensitatea fluorescentei variaza Tn timp. Confirmarea se poate
obtine prin compararea spectrului de absorbtie Tnainte si dupa ternperatura ai fluoresceinei sunt de aproximativ 1% / grad de
iradiere. Daca elementele fiuorescente sau produsii crestere a temperaturii.
descompu§i sunt coiorati, se poate observa o schimbare vizibila
a probei. Daca se utilizeaza un spectrofiuorimetru se pot obtine
spectre de fiuorescenta care se schimba Tn timpul Tnregistrarii.
Pentru a putea diminua fotodescompunerea, se limiteaza S
durata expunerii probei la radiatia excitanta. Aparatele de
fiuorescenta sunt Tntotdeauna dotate cu o ciapeta de obturare
Tnainte de proba §i aceasta ar trebui sa fie Tnchisa pana cand In fiuorescenta, proba de dozat se comporta ca o sursa
se face rapid masuratoarea. Ea ajuta, de asemenea, sa se ce emite Tn toate directiile. Masurarea intensitatii luminoase se
utilizeze radiatia cu lungirnea de unda cat mai mare posibil si cu face prin intermediui unui fotomultiplicator sau al unei fotodiode,
intensitatea cat mai mica pentru a sensibiliza fiuorescenta, chiar Tn general lumina este captata Tntr-o directie perpendiculara pe
daca aceasta Tnseamna sa se opereze ia o sensibilitate redusa. directia sursei primare. Pentru solutiile puternic absorbante sau
O alta metoda de diminuare a fotodescompunerii este probele opace sau semiopace se recomanda o observare
deplasarea oxigenului dizoivat. Oxidarea muitor molecule frontala sub un unghi variabil. Schema generala a unui
organice cu oxigen molecular este amplificata de radiatia UV, spectrofiuorimetru este prezentata Tn figura 1.3.6.
deci deplasarea oxigenu!ui poate fi benefica In acest sens,
daca nu a fost deja deplasat pentru a evita fenomenul stingere.
La operare Tndelungata, substantele fiuorescente si
reactivii utilizati pentru inducerea fluorescentei trebuie sa fie
stabili la lungirnea de unda de lucru.
81
80

Sursa de radialie
Monocromalor
Figure 1.3.6. Schema de baza a
spectrofluorimetre
• fluorimetre
aPlicatiialefluoresSi.P
Surseje^adiatie
82
radiatiei ce trece prin proba si printr-o solutie martor (blanc)
cand este plasata Tn calea radiatiei. Marimea absolute a
intensitatilor nu este importanta decat daca ele sunt atat de
mari pentru a produce un semnal care sa fie mult deasupra
nivelului zgomotului detectorului. De fapt nu este de preferat o
sursa intensa pentru ca exista posibilitatea unei descompuneri
fotomoleculare si cauzeaza probleme de fluorescenta la un
aparat de absorbtie.
Intensitatea fluorescentei este direct proportjonala cu
intensitatea radiatiei incidente, deci este un castig folosirea unei
Monocromator
surse de mare putere, cu conditia, desigur, ca proba sa nu fie
fotodescompusa.
Arcul cu xenon este Tn prezent sursa cea mai folosita pentru
mSsurarea fluorescentei, functioneaza la presiune si 150 W.
Desi xenonul este un gaz monoatomic, normal ar trebui sS
emita un spectru de linii, darm conditiile unui arc, liniile atomice
Receptor
se largesc Tn asa masura meat se suprapun, din acest motiv
arcul cu xenon este considerat o sursa continua.
Lampile cu vapor de mercur. In mod practic, este mai u§or sa
se produca radiafie UV de mare intensitate din lampile ce contin
unui spectrofluorimetn,
vapori de metale, cum ar fi mercurul pentru ca aceste lampi
ii fluo
^centei exista doua produc linii spectrale. Banda cea mai intensa de mercur este
254 nm, dar intensitatea sa este uneori series redusa de
impuritatile din Tnvelisul de cuart. La presiuni Tnalte, cand se
opereaza cu puteri mari, impuritafile sunt practic absente,
datorita autoabsorbtiei. Mai exista si alte lungimi de unda utile
313, 365, 405, 436 si 546 nm, oricare dintre ele poate fi izolata
cu un filtru de interferenta adecvat care sa dea o radiatie de
excitare monocromatica. "Tubul fluorescent" folosit pentru
iluminat este de fapt o lampa cu mercur Tntr-un tub acoperit cu
pudra fluorescenta care emite lumina alba.
3nta
' adeCVat
" pentru
Geometria razei incidente
O alta diferenta majora Tntre aparatele de absorbtie si
cele de fluorescenta apare Tn zona unde se introduce proba.
Pentru masuratorile de absorbanta fasciculul traverseaza proba
si intereseaza intensitatea sa dupa ce a trecut prin proba. In
cazul fluorescentei trebuie observata emisia de fluorescenta
datorata unei radiatii de excitare mult mai puternice. Desi acest
83
lucru este posibil cu o geometric ?n linie dreapta fata de directia
radiatiei incidente (ia 180°), pentru ca radiatia incidenta si cea
emisa sunt de lungimi de unda diferite, radiatia incidenta
neabsorbita trece in monocromator si produce dispersia luminii.
O configuratie avantajoasa presupune observarea
fluorescentei la un unghi de 90° fata de directia radiatiei
incidente, lucru posibil Tntrucat fluorescenta este emisa Tn proba
Tn toate directiile.
Daca speciile fluorescente sunt de concentrate rnica,
dispersia Rayleigh devine problematica fiind Tnsotita de
dispersia Raman a solventului, iar Tn cazul Tn care proba
contine particule suspendate apare §i fenomenul de dispersie
Tyndall.
geometriela 180'
geometrie la 90'
iluminare frontala
Figura 1.3.7. Geometrii uiife ?n spectrofluorimetrie
Utilizarea iluminarii frontale (figura 1.3.7) Tn care radiatia
emisa se observa prin aceea§i fata a celulei prin care patrunde
radiatia de excitare, poate reduce problemele dispersiei din
probeie tulburi si/sau solide. Ea este, o'e asemenea, utiia pentru
probe puternic absorbante m care radiatia nu patrunde la mai
mult de 1 mm.
84
Configuratia de 90° este foarte importanta Tn
spectrofluorimetrie si asigura sensibilitatea ridicata a acestei
tehnici.
Cuyele_pentru fluorescenta
Un avantaj al geometriei de 90° este ca proba poate fi
examinata Tn celule de aceeasi forma §i marime ca si cele
folosite Tn studiul absorbtiei. Exista o diferenta fundamentaia
Tntre celulele de absorbtie si cele de fluorescenta, cuva de
absorbtie standard este de obicei de 1 cm si de 4-5 cm
Tnaltime, este din sticla sau cuart cu fatetele opuse lustruite,
celelalte avand o finisare mata. Pentru studiul fluorescentei cu
geometrie de 90°, evident este necesara existenta a 2 fatete
alaturate lustruite. In practica, cuvele fluorescente au de obicei
patru fete lustruite. Ca si Tn cazul cuveior de absorbtie ele sunt
de obicei din sticla sau cuart. In anumite scopuri pot fi utilizate
cuve de plastic pentru ca sunt mai ieftine decat cele din sticla
sau cuart, dar carora le iipseste stabilitatea dimensionala.
Este importanta calitatea materialelor din care sunt
confectionate cuvele. Ele trebuie sa aiba o fluorescenta
naturala cat mai redusa. De exemplu silicea sintetica topita este
fotosita Tn locul cuartului natural pentru ca nu contine impuritati
fluorescente.
Spectrofiuorimetre cu dona monocromatoare
Cel mai sofisticat §i deci eel mai scump aparat pentru
fluorescenta este spectrometrul cu doua monocromatoare.
Prezenta a doua monocromatoare cu retea ofera aparatului
posibilit'atea de a alege lungimea de unda atat pentru excitare
cat si pentru emisia probei.
Utilizarea unei surse de mare putere este benefica
pentru studiile de fluorescenta, Tntrucat rezulta o intensitate a
fiuorescentei mai mare, ceea ce face mai u§oara detectarea
concentratiiior scazute. O Tmbunatat.ire Tn acest sens se
realizeaza prin optimizarea coiectarii emisiei fluorescente a
probei. Foiosirea unui monocromator cu deschidere mare
conduce !a ameliorarea eficientei optice §i deci a sensibilitatii.
Aceasta metoda este preferabila utilizarii sistemelor cu ogiinzi
de optimizare a luminozitatii ce provine de la proba.
85
 Majoritatea aparatelor sunt cuplate cu Tnregistratoare,
obtinandu-se astfel Tnregistrarea pe hartie a intensitStii emisiei
Tn functje de lungimea de unda. Spectrul este de obicei
prezentat in functie de lungimea de unda crescanda de la
stanga la dreapta.
La aparatele moderne se folosesc microprocesoare
pentru a controla §i a prezenta rezultatele, Tn locul unui creion
de Tnregistrare, aceste aparate imprima rezultatele pe un printer
care nu numai ca schiteaza spectrul dar include axele si
adauga automat si scala lungimilor de unda.
SpectrofBuorimetru cu monocromator cu filtru
Un spectrofluorimetru mult mai ieftin este eel Tn care unul
dintre monocromatoare este Tnlocuit cu un filtru de banda.
Filtrele de interferenta au un "pic" de transmisie malt (60%) §i o
banda cornparabila cu cea a unui monocromator mic cu retea
(5 mm). Au un avantaj considerabii asupra monocromatoarelor
cu retea Tn ceea ce priveste luminozitatea si pot uneori Tntrece
ca performanta aparate mai scumpe atunci cand dorim sa
detectam semnale fluorescente foarte slabe.
Sursele de mercur emit radiatii cu intensitate mare doar
la un numar foarte mic de lungimi de unda. Filtrele de
interferenta pot fi facute pentru a avea picul de transmisie la
orice lungime de unda §i pot izola principalele linii de emisie ale
mercurului. Aparatele cu monocromator cu filtru prezinta
dezavantajul ca nu pot reda spectrul de excitare dar permit
Tnregistrarea spectruiui de emisie. In locul lampii cu mercur se
poate folosi lampa cu xenon.
Exista doua avantaje ce rezulta din Tnlocuirea unui
monocromator de excitare cu un filtru:
a). Este posibil sa se realizeze spectrul de excitare a probei
care are o utilitate mai mare decat spectrul de emisie pentru ca
acesta este identic cu spectrul de absorbtie Tn UV, de exemplu
poate fi folosit la identificarea unui compus cu concentrate
foarte redusa pentru a fi detectat pe baza unui spectru de
absorbtie obi§nuit.
b). Este posibil sa se masoare fluorescenta fara nici un filtru pe
partea emisiei, selectivitatea potrivita poate fi obtinuta printr-o
alegere adecvata a lungimii de unda de excitare.
86
Fiuoritnetru cu fiitru
In determinant analitice nu este necesar sa se obtina
simultan spectrul de excitare si eel de emisie. Intr-o analiza
cantitativa de rutina, atat lungimile de unda de excitare cat §i
cele de emisie raman fixate la valorile determinate apriori. In
aceasta situatie ambele monocromatoare pot fi miocuite cu filtre
de banda pentru a transmite lungimile de unda de interes.
Principalele dezavantaje ale fluorimetrelor cu filtre sunt:
- este nevoie de filtre specifice pentru fiecare analiza;
- nu se pot obtine spectre de excitare §i emisie. Acest
lucru nu permite operatorului sa verifice daca exista vreo
interferenta Tn timpul unei analize.
Principalele lor avantaje sunt:
- costul scazut;
- simplitatea;
- posibilitatea de a putea fi usor deplasate (au dimensiuni
mici).
1.3.5. Polarizatia de fluorescenta
Interpunand Tntre fasciculul luminos incident si cuva un
polarizer se obtine o lumina polarizata liniar care vibreaza Tntr-o
singura directie bine definita (figura 1.3.8).
a b
Figura 1.3.8. Schenneie de princtpiu ale a. luminii naturals fi b.
luivsinii poladzaie (secfiuni de-a lungu! axes de vsforafie)
Daca se excita molecuiele fluorescente cu lumina
polarizata si se masoara intensitatea luminii fluorescente Tn
87
 Se adauga Tn plasma o cantitate cunoscuta de anticorp
directia paralela In si perpendiculars IP Tn raport cu lumina anti-digoxina §i o cantitate cunoscuta de digoxina cuplata
incidenta se poate defini gradul de polarizare P: (marcata) cu umbeliferonS (7-hidroxicumarina). Cei doi antigeni
intra Tn competitie pentru a se fixa pe situsurile anticorp.
p=
I,, + lp Ag + Ac
Ag-F +
reactiv proba reactiv
Ecuatia Perrin arata ca P este legat direct de: (digoxina marcata) (plasma cu digoxina) (anticorp digoxina)
- volumul V al moieculei responsabile de fluorescenta
- temperatura
- vascozitatea mediului r\
- timpul de viata a starii excitate T Ac-Ag Ac-Ag-F Ag-F + Ag + Ac
dupa reiatia:
Daca concentratia plasmatica a digoxinei este mica
fl ll- proportia de complex Ac-Ag-F Tn amestecul final este ridicata.
IP 3 r,V Cea mai mare parte a substantei fiuorescente este sub forma
de complex cu greutate molecuiara mare, putin mobil Tn solutie
unde PO gradul de poiarizare initial, ceilaiti termeni avand si din acest motiv depolarizarea Iuminii ramane scazuta.
semnificatia obisnuita.

t •^r
Volumul moleculelor influen^eaza viteza lor de rotatie,
astfel o molecula mica cum este fluoresceina se roteste mult
mai repede comparativ cu o proteina cu greutate molecuiara
1 ,,
mare a carei miscare de rotatie este mult mai lenta. lumina
incidenta cuva depolarizare
Cand o substanta fluorescenta este iradiata cu o lumina polarizata
scazuta
polarizata, planu! de polarizare a fuminii incidente este
conservat daca moiecula ramane imobila (sau aproape imobila) Fsgura 1.3.9. Depolarizare scazuta
cum este cazul moleculelor cu greutate molecuiara mare.

i
Moleculele cu greutate molecuiara mica care se rotesc Tn
jurul propriei axe reemit o lumina polarizata In diferite planuri de
polarizare, rezultatul fiind o depolarizare a iuminii incidente cu o
diminuare a gradului de polarizare.
Acest procedeu este aplicat in dozarea plasmatica a lumina
anumitor medicarnente. incidenta cuva depolarizare
?n cazul digoxinei, de exemplu, dozarea se bazeaza pe o polarizata ridicata
reactie de competitie, fata de un anticorp, inire medicament
(antigen Ag) prezent fn plasma si un reactiv continand aceeasi Figure 1.3.19. Depoiarizare ridicata
substanta dar asociata unui marker de natura variabila (enzime,
atomi radioactivi, substante fiuorescente AgF).
89
88
 Daca concentratia plasmatica a digoxinei este ridicata,
proportia Ac-Ag-F este scazuta Tn raport cu cea de AgF §i
Tabelul 1.3.2. Compusi medicamentosi fluorescent!
depolarizarea luminii emise este importanta pentru ca molecula
marcata AgF se rote§te rapid Tn jurul axei proprii. :
~'Aex
-f;ff
^=TT^=5!=psr •-afl^ IK^T!
Corripus
Tn practica se urmcireste gradul de polarizare a luminii 1 295 335 OJ ng/ml
Adrenalins
emise Tn functie de concentratia Tn antigen (figura 1.3.11). Apa 14 265 410 accept.
Amobarbital
Carbazol DMFA 291 359 Buna
-
Clorpromazina 11 350 480 0,1 tig/ml
Apa
Cinconidina 1 315 445 accept.
Apa
Griseofulvina 7 295 450 Buna
Apa 7 285 350 Mica
Ergometrina 1 325 465 0,01jig/ml
Imipramina Apa 14 295 415 accent.
[Ag] 13 300 410 Buna
Apa
Menadiona Etanol 335 480 accept.
Figura 1.3.11. Variatia P Tn functie de concentratia in antigen Apa 7 285 350 Mica
Morfina
Norepinefrina Apa 7 285 325 Mica
Apa 13 265 440 Mica
Apa 11 275 345 accept.
1.3.6. Apficatii ale spectrofluorimetriei Streptomicina Apa 13 366 445 accept.
Tiopental Apa 13 315 530 Mica
Exista Tn literature de specialitate un numar mare de n-butanol 340 490 accept.
Vitamina A
referinte bibliografice Tn care sunt descrise metode de analiza snsibilitate: buna < 0,01 ppm; acceptabila < 0,01-0,1 ppm; mica <0,1
bazate pe fluorescenta nativa a unor substante. In tabelul 1.3.2.
*s«
ppni. DMFA-dimetilformamida.
sunt prezentate principalele elemente ale metodelor
spectrofluorimetrice aplicate Tn analiza catorva substante de In tabelu! 1.3.3. sunt prezentate cateva clase de compus.i
interes terapeutic. separati prin cromatografie de lichide sub presiune §i care pot fi
Detectia prin fluorescenta se foloseste pentru compusi detectati cu detectori de fluorescenta.
care prezinta fluorescenta naturala sau o fluorescenta obtinuta
Tn urma unor derivatizari chimice. Un detector de fluorescenta e Tabelul 1.3.3. Clase de compusi analizati prin cromatografie de
de 1000 de ori mai sensibil decat un detector Tn UV §i prezinta lichide de Tnalta performanfa §i detectie de fluorescenta
o selectivitate mai mare.
In ultimii ani mai des folosite au fost metodele " • • • ' . - " ." •HBHBpBHBHB |@9HBE9B^^K
cromatografice care pe langa separarea componentelor 1 Compu§i endogeni Adrenalins
presupun §i masuratori cantitative bazate pe determinari de 2 Enzime Triptofanhidrolaza
fluorescenta. 3 Determinari din alimente Cefalotoxine, etomabat
In determinarile de fluorescenta trebuie tinut cont si de 4 Antihelmintice Tiabendazol
faptul ca polaritatea solventului poate avea un efect foarte 5 Droguri ilicite LSD, opiacee
Neurotoxine Lolitren B
puternic si de aceea Tn metodele cromatografice care folosesc 6
7 Farmaceutice Propranolo!
o eluare cu gradient trebuie sa se estimeze reproductibilitatea Hidrocarburi aromatice
masuratorilor Tn functie de compozitia eluentului. 8 Poluanti polinucleare
90 9 Steroizi Estriol, estrogen

91
 determinarea alcaloizilor
Asa cum s-a mentionat si anterior spectroscopia de - ergotul de secara dupa tratare cu acid sulfuric
fluorescenta este frecvent utilizata ca metoda directa sau
chinidina, chinina, morfina, codeina (pentru
indirecta de determinare a compusilor organic! si anorganic!:
morfina si codeina analiza se realizeaza Tn acid
direct atunci cand compusul este fluorescent, indirect cand
sulfuric 0,1 N la pH 11 cand fluorescenta morfinei
acestuia i se induce fluorescenta prin reactie cu un agent
specific. Cei mai frecventi agenti sunt: morina, acid 2-hidroxi 3- este inhibata)
naftoic, 8-hidroxichinolina, diaminonaftalina, acid alizarinic, vitamina A (structura polienica conjugata, absoarbe la
semicarbazona salicilaldehidei, etc. 325 nm si emite la 510 nm)
Tn tabelul 1.3.4 sunt prezentate cateva substante ce pot vitaminele B (tiamina dupa oxidare Tn tiocrom,
fi transformate Tn compusi fluorescenti prin reactii chimice. riboflavina, piridoxina)
antibiotice
Tabelul 1.3.4. Compufi ce potfi transformafi chimic - streptomicina tratata cu naftochinona-4-sulfonat
in produsi fluorescenti' de sodiu (reactiv Folin)
~ .;..l.^-,.v • - - • > - ' ~ ^ .~.^.^..-'-, ^---.-.-
- tetraciclinele (fluorescenta tetraciclinei este
Adrenalins K3Fe(CN)6 sau I2 apoi 410 530 utilizata Tn chirurgie pentru reperarea tumorilor
NaOH osoase unde se fixeaza preferential)
Clordiazepoxid Fotooxidare dupa 380 480 corticosteroizi
hidroliza
Hidrocortizona
glicozide cardiotonice
70% H2SO4 Tn etanol 470 520
5-Hidroxitriptamina o-Ftalaldehida 365
adrenalina
495
Amine primare §i Fluorescamina 390 485 noradrenalina
aminoacizi fenotiazinele
Zinc Rodamina B 366 580 metotrexat
acid salicilic, etc.
Exista numeroase metode de determinare a unor
elemente anorganice prin transformare in compusi fluorescenti.
De exemplu, seleniul poate fi determinat prin masurarea 1.3.7. Exemple practice de
absorbantei complexului acestuia cu 3,3'-diaminobenzidina dar determinare a componenteBor
prin masurarea fluorescentei complexului poate f determinate o
cantitate de pana la 0,04 ug seieniu. Sensibilitatea metodei active din forme farmaceutice prin
poate creste la 0,002 ng seieniu daca se foloseste ca agent de spectrofluorimetne
complexare 2,3-diaminonaftalina.
Reactiile imunologice de recunoa§tere antigen-anticorp
cuplate cu fluorimetria constituie baza unor determinari Determinarea concentratiei de sulfat de chinina din
cantitative larg utilizate Tn biologia clinica sau Tn determinari ale siropul de fosfat feros cu stricnina si chinina
concentratiilor plasmatice ale medicamentelor (vezi
fluorescenta de polarizatie). Metoda:
Se dilueaza siropul (aproximativ 2 g) cu acid sulfuric 0,05 mol/litru
Printre aplicatiile spectrofluorimetrice din domeniul pana la 100 ml. Se dilueaza Tn continuare pana se obtine o concentrate de
farmaceutic se numara: sulfat de chinina In acid sulfuric 0,05 mol/litru de aproximativ 0,4 ug ml"1. Se
92 93

masoara fluorescent^ (Aex = 350 nm; Aem = 450 nm) acestei solutii precum si
fluorescenta unei serii de solujii standard de sulfat de chinina (0,0 pans la
0,5 ug ml ) Tn acid sulfuric 0,05 mol/litru. Se citeste concentratia sulfatului
de chininS de pe graficul de calibrare sau se calculeaza prin folosirea
analizei regresiei lineare. Se determina greutatea/ml de sirop §i se
calculeaza concentratia de chinina anhidrS din proba (Tn procente si Tn gA/).
Determinarea concentratiei de chinina din urina
Determinarea se poate aplica urinei cu urme de chinina (0,2 •*• 0,4
ug ml"1) sau unei probe de urina colectata dup§ 24 de ora de la consumarea
a 100 -s- 200 ml apa tonica. Cea de a doua proba s-ar putea sa necesite
modificarea metodei, de exemplu ar putea fi necesara o diluare suplimentara
asa Tncat semnalul sS se Tncadreze Tn intervalul de 0,2 •*• 0,5 ug ml"1. Metoda
se bazeaza pe procedeul Mule si Hushin (1971).
Metoda: Se transfers 5 ml de urina Tntr-un tub de centrifuga cu dop,
de 35 ml, se aduce la pH la 9 - 10 cu picSturi de solutie de hidroxid de
amoniu diluat si se extrage cu 10 ml de cloroform : 2-propanol (3:1 V/V ); se
lasa fazele sa se separe (la nevoie prin centrifugare). Se transfera 5 ml din
faza organica Tntr-un tub de centrifuga uscat, se extrage cu 5 ml de acid
sulfuric 0,05 mol/litru timp de 1 minut si se centrifugheaza. Se masoara
fluorescenta extractului acid, a solujiei standard de chinina (0,5 ug ml"1) si a
probei-martor obtjnuta printr-o procedure identica (Aex = 350 nm; Aem = 450
nm).
Stingerea fluorescentei
a) Efectul de filtru interior. Se dizolva 25 mg de sulfat de chinina Tntr-
o cantitate suficienta de acid sulfuric 0,05 mol/litru pentru a obtine 500 ml de
solutie. Prin diluare cu acid sulfuric 0,05 mol/litru, se preparS 2 serii de solutii
de sulfat de chinina astfel Tncat concentrate sa fie de (i) 0,1; 0,2; 0,3; 0,4;
0,5; §i (ii) 10; 20; 30; 40; 50 ug ml"1. Se masoara fluorescenta ( Ae x= 350 nm;
Aem = 450 nm) primei serii setand sensibilitatea la 0,5 ug ml" si respectiv 50
ug ml"1 pentru cea de-a doua serie. Se reprezinta grafic fluorescenta
masurata Tn functie de concentrate.
b) Stingerea fluorescentei prin ciocnire. Folosind 50 ug ml"1 solutie
standard de sulfat de chinina pregatita ca mai sus si o solutie de iodura de
potasiu 0,1 mol/litru, se prepare solutii de sulfat de chinina (0,5 ug ml"1) in
acid sulfuric 0,05 mol/litru continand 0; 0,0005; 0,001; 0,0015; 0,002; 0,0025;
0,005; 0,0075; 0,001 si 0,015'mol/litru iodura de potasiu. Se construieste un
grafic fluorescenta Tn functie de concentratia iodurii de potasiu.
Fluorescenta solutiilor diluate prezinta o relatie lineara cu
concentratia. Solutiile mai concentrate prezinta efecte de stingere mai
puternice datorate Tn acest caz efectului de filtru interior. Astfel este posibil
ca o anumita intensitate a fluorescentei sa corespunda la doua concentratii
ale substantei. Ca atare, Tn determinarile fluorimetrice se obisnuieste sa se
94
1
verifice si sa se evite aceasta sursa de eroare Tn felul urmator: se determina
continutul aparent de substan^a fluorescenta din comprimat, solutie sau
preparat si apoi se repeta determinarea dupa adaugarea unui continut
cunoscut din substan^a care trebuie determinate. Cresterea fluorescentei
trebuie sa corespunda cantitatii de substan^a adaugate. Daca nu se produce
acest fenomen atunci efectele de stingere sunt prezente, fie din cauza
substantei Tnsasi (datorata concentratiei mari), fie din cauza altor substance
din solutie. Acest ultim efect este observat Tn prezenta iodurii de potasiu
(experimentul b) unde valorile fluorescentei descresc pe masura cresterii
concentratiei de iodura ce determina ciocniri puternice si, deci, Stingerea
fluorescentei.
Determinarea concentratiei de proflavina in unguentul cu
proflavina (0,1 %g/g)
Metoda: se omogenizeaza unguentul §i se transfera 1 g (masurat cu
atentie) Tntr-un separator; se dilueaza cu eter (50 ml) si se extrage
amestecul cu acid clorhidric 0,1 mol/litru (4 x 20 ml). Se spala fiecare extract
cu eter (20 ml), se transfera Tntr-un balon volumetric de 500 ml si se umple
pana la semn cu acid clorhidric 0,1 mol/litru. Se dilueaza 10 ml din aceasta
solutie pana la 100 ml cu acid clorhidric 0,1 mol/litru. Se compara
fluorescen|a solutiei cu cea a solutiei standard de hemisulfat de proflavina
(0,2 ug ml'1 Tn acid clorhidric mol/litru) folosind monocromatori sau filtre de
transmisie pentru 440 si 510 nm pentru excitare, respectiv emisie.
Determinarea continutului de Czor-^O? 'in comprimatele
de etinilestradiol (E)
Metoda: Se cantaresc si se aduc Tn stadiul de pulbere 20 de
comprimate. Se introduce o cantitate precis cantarita de pulbere echivalenta
cu aproximativ 0,2 mg de E Tntr-un balon cotat de 50 ml (anterior clatit cu
metanol). Se adauga 2 ml de apa, se Tncalzeste usor si se adauga 20 ml de
metanol. Se agita timp de 5 minute si se dilueaza la volum cu metanol. Se
lasa sa se depuna si se masoarS fluorescenta pentru exact 2 ml de lichid
supernatant lirnpede (Aex aproximativ 290 nm; Aem aproximativ 320 nm). Se
adauga 0,2 ml de hidroxid de sodiu 1 mol/litru, se amesteca cu grija si se
masoara din nou fluorescenta. Se compara diferenta dintre cele douS valori
cu cea obtinuta prin masurarea Tn aceleasi conditii a fluorescentei unei
solutii standard de E pur (4 ug ml) Tn metanol, Tnainte si dupa adaugarea de
0,2 ml de hidroxid de sodiu de 1 mol/litru.
Aceasta determinare, care este un exemplu de spectrofluorimetrie
de diferenta, se bazeaza pe fluorescenta partii fenolice a molecule! iar
efectul pH-ului este acela de a spori specificitatea determinarii.
95
 Determinarea morfinei §i codeine! din amestecuri
Determinarea este influentata de faptul ca substanta codeina"
prezinta fluorescenta atat In mediu acid cat si in eel alcalin, Tn timp ce
morfina prezinta fluorescenta numai Tn mediu acid. Metoda a fost folosita de
Chalmers si Wadds (1970) pentru determinarea ambilor compusi din opium.
Ei si-au extins cercetarile si pentru determinarea papaverinei si a noscapinei
care se deosebesc una de cealalta prin efectul de protonare Tn solutii
cloroformice asupra spectrelor de fluorescenta.
Solutii standard: 5 ug ml"1 solutii de codeina si morfina Tn acid
clorhidric 0,1 mol/litru si hidroxid de sodiu 0,1 mol/litru.
MetodS: Se determine si se inregistreaza spectrele emisiei de
fluorescenta a ambelor solutii folosind solutiile martor corespunzStoare. Se
preparS o dilutie de Tncercare a solu^ei de morfina si codeina pentru a
realiza o citire pe Tntreaga scala a aparatului, Tn solutie acid3. Dupa aceasta
se realizeaza dilutii corespunzatoare Tn acid clorhidric 0,1 mol/litru si hidroxid
de sodiu 0,1 mol/litru si se Tnregistreaza spectrele de emisie ca si pentru
solutiile standard. Se calculeazS concentratia de morfina §i codeina.
Determinarea alcaloizilor total! din tinctura de
Ipecacuanhae (exprimap' in emetina)
Determinarea depinde de fluorescenta alcaloizilor din t-ra
Ipecacuanhae.
Metoda: Se dilueaza 1 ml de tincturS cu 200 ml apa Tntr-un balon
cotat. La 10 ml de dilutie se adauga 10 ml de acid sulfuric 0,05 mol/litru si se
dilueaza cu apa pana la 100 ml. Se compara fluorescenta la aproximativ 318
nm (excitare la aproximativ 283 nm) cu cea a unei solutii de emetina de 1 ug
ml"1 Tn acid sulfuric 0,005 moli. Se calculeaza procentul total de alcaloizi
(exprimati Tn emetinS) din formula:
%alcaloizi =
r
std 552,7
Nota: clorhidratul de emetinS contine 15 * 19 % apa (farmacopeea britanica)
§i 8 + 14 % apa (farmacopeea americana}. Ca atare, este preferabil sa se
usuce materialul sub vid la 100 °C Tnainte de folosire pentru a fi siguri ca
materialul are compozitia clar definite.
96
Determinarea 11-hidroxisteroizilordin plasma
Determinarea se bazeaza pe aparitia fluorescentei la tratarea
acestor steroizi cu acid sulfuric. Aceasta nu este o reactie specifica iar
Stenlake si colaboratorii (1970) au aratat ca esterii de colesterol si
colesterolul sunt unii dintre fluorogenii cu interferenta cea mai mare. Cu
toate acestea, determinant obisnuite facute Tn laboratoarele clinice se
bazeaza pe metoda Mattingly (1962).
Reactivi:
Diclormetan. Se purifica prin agitare cu acid sulfuric (a zecea parte
din volum, cinci extract,!!), se spala cu apa (1/10 din volum) pana la
neutralitate. Se adauga sulfat de sodiu anhidru, se agita bine si se
decanteaza Tntr-un aparat de distilare foarte curat. Se recupereazS
diclormetanul prin distilare.
Se va folosi apa distilata Tn aparate de distilare din sticla.
Reactiv de fluorescenta. Se adauga acid suifuric racit cu gheata (7
volume) la etanol (pentru spectroscopie, 3 volume) tncet si sub racire cu
gheata. Amestecul trebuie sa fie incolor si folosit Tn decurs de cateva zile.
Solute - stoc standard. Se dizolva 50 mg de hidrocortizon Tn 20 ml
de etanol §i se dilueaza 1 ml de solutie pana la 100 ml cu apa (concentrate
= 25 ug ml"1 ). Se pastreazS la 4 °C .
Standard de lucru. Se dilueaza 1 ml solutie-stoc standard pana la
100 ml cu apa.
Aparatura. Este obligatorie curatenia perfecta §i toate aparatele de
sticla trebuie spalate cu acid cromic urmata de spalarea cu solutie de
metabisulfit de sodiu, apa de robinet si apa purificata.
Extrac^ia din plasma. Se picura plasma cu pipeta (2 ml) Tntr-un tub
de centrifuga din sticla cu dop (20 ml) §i se adauga 15 ml de diclormetan. Se
umezeste dopul cu apa pentru a avea o etanseitate perfecta si a evita
pierderea solventului §i se agit§ u§or pe orizontala, timp de 2 minute. Se
lasa fazele sa se separe §i se Tndeparteaza plasma prin aspiratie. Se
trateaza Tn acelasi fel Tnca doua solut,ii - martor (2 ml apa) si standard (2 ml).
Metoda: Intr-un tub de sticla cu dop de 20 ml se introduc 10 ml
extract diclormetanic, se adauga 5 ml reactiv de fluorescent^ si se agita
puternic timp de 20 de secunde. Se repeta procedure cu soluble standard sj
martor la intervale de 1 minut. Se transfera stratul acid Tntr-o cuva
spectrofluorimetrica si se mascara intensitatea fluorescentei la 520 nm dupa
excitare la 470 nm la exact 12 minute de la amestecarea extractelor cu
reactivu! de fluorescenta. Se calculeaza concentratia de corticosteroizi din
plasma folosind formula:
ug /100 ml = - x 25
FS-FB
unde FT = intensitatea fluorescentei probei;
Fs = intensitatea fluorescentei standardului;
FB = intensitatea fluorescence! solut,iei martor.
97
 D - energia de disociere a legaturii
v - numar cuantic de vibratie
Din relatia anterioara reiese ca sistemul de vibratie nu
poate adopta decat anumite energii cuantificate. Molecula
1.4. SPECTROSCOPIA IN INFRARO§U iradiata cu radiatii IR absoarbe din aceasta numai cuantele care
au energia corespunzatoare diferentelor de energie (£1, E2, £3,
etc.) Tntre doua nivele vibrationale cuantificate (figura 1.4.1).
1.4.1. Generalitati
Infrarosul (IR) analitic grupeaza metode de identificare si
dozare (nedistructive) bazate pe absorbtia sau reflexia de catre
E2
proba a radiatiilor electromagnetice cuprinse intre 0,78 (im {780
nm) -1000 jam (1 mm) fiind subdivizat Tn IR apropiat, IR mijlociu
si IR Tndepartat.
Caracteristicile acestor regiuni (lungimi de unda, numar
de unda, frecvente) sunt redate Tn tabelul 1.4.1.

Tabelul 1.4.1. Regiunile spectrale IR

Figura 1.4,1. Miveieis energetics de vibrafle aie unei molecule

IR apropiat 0,78-2,5 12800-4000 3,8.1014-1,2.101
IR mediu 2,5-50 4000 - 200 1,2.10 -6.101 Prin absorbtie de energie, legatura Tsi creste nivelul
IR Tndepartat 50-1000 200-10
energetic vibrational. Moleculele probei vor absorb! energii din
Analitic 2,5-15 4000 - 670 1.2.1014-2.W
radiatia IR numai la anumite lungimi de unda (X-i, (X.2, (^-3,
corespunzand la E-I, £2, £3, ) dand nastere Tn spectrul IR unor
Regiunea fundamental^ situata Tntre 2,5 - 15 (am este
max/me de absorbtie. La lungimile de unda la care nu se
regiunea care furnizeaza cele mai multe informatii privind
absoarbe energie, Tnregistratorul spectrometrului va Tnscrie linia
structura moleculara, majoritatea spectrometrelor fiind limitate
de zero a spectrului. Maximele de absorbtie Tn IR se manifests
la masuratori Tn aceasta regiune.
Tn spectru ca benzi (§i nu ca linii) deoarece orice modificare
Spectrele de absorbtie Tn IR sunt spectre de vibratie ale
energetica vibrationala este Tnsotita de regula de modificari
moleculelor. Se stie ca atomii situati la cele doua extremitati ale
energetice rotationale, din acest motiv spectrele Tn IR se mai
unei legaturi sunt supu§i unei miscari de vibratie, unul Tn raport
cu celalalt. nurnesc si spectre de vibratie - rotatie ale moleculelor.
Fiecare maxim spectral este asociat unei vibratii
Energia de vibratie a unei legaturi este data de relatia:
corespunzatoare unei anumite legaturi din molecula probei,
Tnsa trebuie mentionat ca orice vibratie a molecule! da nastere
unui maxim de absorbtie Tntrucat regulile de selectie
fundamentaie aie mecanicii cuantice arata ca un maxim apare
numai daca vibratia corespunzatoare produce o modificare a
unde: k - constanta lui Planck (6,62.10"27 erg . s)
99
v - frecventa proprie de vibratie a legaturii
98
 distribute! de sarcina (a marimii sau directiei momentului de - de tip "rocking" - balansare Tn plan
dipol). _
- Tn afara planului y - de tip "twisting" - torsiune
In absenta momentului de dipol permanent, cum este - de tip "wagging" - balansare
cazul moleculelor 02, C\2, N2, simetrice, nu apar benzi de Tn afara planului
absorbtie Tn IR. Legatura C = C din acetilena nesubstituita nu se
manifests Tn IR. Tn aceste cazuri se spune ca legatura este
transparenta ?n IR mediu sau inactiva.
Pozitia unui maxim de absorbtie Tn spectrul IR, ca
lungime de unda sau ca numar de unda, este dependents Tn
primul rand de taria legaturii (k) si de masa redusa (n) a
sistemului de vibratie, de diferiti factor! intra si intermoleculari.
Frecventa benzilor Tn IR (exprimata ca numar de unda intindere simetrica intindere asimetrica
v, cm"1) se calculeaza cu ajutorul relatiei:

27tc"Vn

unde c - viteza luminii, Tn cm s"1

k - taria legaturii (constanta de forta), Tn N m"1
u, = m-i rri2 / (mi + m2) - masa redusa (m-i.ma, masele balansare in plan forfecare
"rocking" "scissoring"
absolute ale atomilor ce formeaza legatura respective,
exprimata Tn kg)
Aceasta relatie conduce la valori aproximative ale
frecventelor Tntrucat nu tine seama de interactiunile atomilor
sau ale grupelor de atomi din molecula si nici de cele
intermoleculare.
O legatura chimica dintr-o molecula poate avea doua
tipuri de miscare de vibratie:
1. vibratie de Tntindere, v, numita §i vibratie de balansare in afara planului torsiune
"wagging" "twisting"
valenta pentru ca are loc de-a lungul legaturii
2. vibratie de deformare e Tn care se deformeaza Figura 1.4.2. Tipuri de vibratii moleculare
unghiul valentelor
(+ deplasare catre privitor, - deplasare Tn sens opus privitorului)
Tn cazul grupelor triatomice de tipuf XY2 (ex. NHs,
COa etc) vibratiile de Tntindere pot fi (figura 1.4.2): Benzile spectrale corespunzand deformatiei unor legaturi
- simetrice vs
vor fi situate Tn spectrul IR la numere de unda mai mici decat
- asimetrice vas cele corespunzand Tntinderii acelorasi legaturi pentru ca, Tn
iar vibratiile de deformare pot fi: general, energia necesara pentru modificarea amplitudinii unei
- Tn plan 8 - de tip "scissoring" - forfecare
100
101
vibratii de deformare este mai mica decat cea necesara pentru
modificarea amplitudinii unei vibratii de Tntindere. benzi corespunzatoare vibratiilor de deformare ale
In tabelul 1.4.2. sunt prezentate frecventele de absorbtie diferitelor legaturi;
ale celor mai frecvent Tntalnite grupari functionate. c legaturile simple de tip C-C, C-O, C-N, care apar de
regula cumulate m cele mai multe molecule organice,
Tabelui nr. 1.4.2. se cupleaza puternic vibrationai Tntre ele dand
Do'rneniu) de ••'."••• ~ • .,-...-•
na§tere unei multitudini de benzi, asa zisele vibratii
Legatura f ipii!tiecorhpus Iritens'rtafea
frecygntaiCfrf!; de schelet ale intregii molecule. Pozitiile acestor
C-H alcani 2850-2970 benzi sunt puternic influentate de ambianta chimica
1340-1470 Puternica
C-H alchene 3010-3095 Medie existenta;
C-H alchine
675-995 Mare • zona cuprinsa Tntre 400 - 1500 cm"1 este de regula
3300 Mare
C-H 3010-3100 Medie o regiune foarte complexa a spectrului IR, ?n
Nucleu aromatic
690-900 Mare ansarnblul ei fiind deosebit de caracteristica pentru
Alcooli monornerici, fenoli
Legaturi de hidrogen, 3590-3650 Variabila substanta respectiva, motiv pentru care poarta
O-H alcooli, fenoli, acizi 3200-3600 Variabila (uneori slaba) numele de ,,zona amprentelor digitale".
carboxilici monomerici, 3500-3650 Medie
legaturi de hidrogen Tn acizi 2500-2700 Vaga
carboxilici Forma spectrelor Tn IR mediu este complexa (figura
N-H Amine, amide 3300-3500 Medie
C =C alchene 1610-1680 Variabila 1.4.3).
C =C Nuclee aromatice 1500-1600 Variabila
C =C alchine 2100-2260 Variabila
C-N Amine, amide 1180-1360 Mare
CsN nitrili 2210-2280 Mare
C-O Alcooli, eteri, acizi
carboxilici, esteri 1050-1300 Mare

C =O Aldehide, cetone, acizi

carboxilici, esteri 1690-1760 Mare

N02 Compuji nitro 1500-1570 Mare

1300-1370 mare

Observatje:
Foarte intensa (fi) 75 < A < 100 %
Intense (i) 50 < A < 75 %
Medii (m) 25 < A < 50 %
Slabe (s) 0< A< 25 % "02"

Analizand tabelul 1.4.2. se constata urmatoarele:

Wavenumber (cm-1)

« Tn zona frecventelor mici ale spectrului IR (400 -

1500 cm"1) apar atat benzi corespunzatoare vibratiilor Figura 1.4.3. SpectruS Tn IR aB benzaldehidei
de valenta ale legaturii simple C-C, C-O, C-N cat si

102
103
 Vibratiile pe care le executa o molecula Tn ansamblu, cu
pastrarea imobila a centrului sau de gravitatie, se numesc
vibratii normale sau fundamentale.
O molecuia nelineara cu n atomi va avea un numar de
3n-6 vibratii normale (3n - numarul total de grade de libertate
din care 6 nu apar Tn spectrele vibrationale, 3 fiind de translatie
si 3 de/otatie).
Tn cazul unei molecule liniare cu n atomi, aceasta va
avea 3n-5 vibratii normale.
Spectrul real poate contine un numar mai mare sau mai
mic de benzi comparativ cu eel rezultat din relatiile de mai sus.
Cresterea numarului de benzi fata de numarul teoretic se
datoreaza:
- armonicelor
- benzilor de combinare
- rezonatelor Fermi
Armonicele - benzi de intensitate mica, apar la un numar de
unda dublu fata de banda fundamentals
Benzile de combinare - benzi de intensitate mica, apar la
numere de unda egale cu suma sau diferenta numerelor de
unda a doua vibratii fundamentale
Rezonanta Fermi - scindarea unei benzi fundamentale
atunci cand Tn imediata ei apropiere se gaseste o armonica
sau o banda de combinare
Scaderea numarului real de benzi fata de eel teoretic se
datoreaza: ,
- vibratiilor care nu produc modificari ale
momentului de dipol al moleculei
- vibratiilor degenerate care dau benzi la acelasi
numar de unda
- vibratiilor situate Tn afara domeniului IR uzua!
Frecventele de qrup
Unele grupe de atomi, Tn special gruparile functionate din
chimia organica, prezinta Tn !R benzi de absorbtie
104
caracteristice, intense, situate la frecvente bine determinate
numite frecvente de grup sau caracteristice.
Grupele functional se comporta ca si cum ar fi izolate
de restul moleculei desj aceasta influenteaza Tntr-o masura
mica pozitia benzilor de grup. Aceste mici deplasari sunt
frecvent utilizate Tn studiul structurii compusjlor organic!.
Frecventele de grup sunt specifice, deoarece gruparile
functional prezinta fie o legatura Tntre doi atomi cu mase foarte
diferite Tntre ei, fie o legatura mult mai puternica decat cele
uzuale.
Intensitatea foarte mare uneori a benzilor de grup este
rezultatul polaritajii crescute a gruparilor functional respective.
Influenta factorilor externi si interni asupra benzilor
spectrale Tn IR
Factorii externi (intermoleculari) se refera la modul de
pregatire a probei. Pregatirea probelor Tn faza gazoasa este
cazul ideal pentru Tnregistrarea spectrelor Tn IR dar este dificil
de realizat pentru cele mai multe substante.
Probele Tn stare solida sunt utilizate Tn identiflcari
spectrale, spectrele avand Tn acest caz o zona a amprentelor
digitale clar definita.
Determinarile Tn solutie sunt des utilizate Tn practica IR -
se indica utilizarea de solutii diluate Tn solvent! nepolari (CS2,
CCU) cand nu apar efecte intermoleculare. Indiferent de
solventul utilizat, interpretarea spectrelor IR se va face Tn
zonele spectrale Tn care absorbtia solventilor este minima §i se
va tine cont de posibilele interactiuni intermoleculare. Natura
solventilor are o influenta importanta asupra pozitiei echilibrelor
(ex., tautomeria) care se pot studia cu ajutorul spectroscopiei
IR. Tipul de solvent influenteaza, de exemplu, Tn mod esential
banda VQH din acizii organic) (echilibrul monomer- dimer).
In IR probele se mai pot prepara Tn film lichid dar Tn acest
caz apar asocieri puternice la nivelul grupelor polare.
Dintre factorii interni (intramolecular!) care due la
modificari Tn spectrul IR se pot enumera:
scaderea ordinului de legatura la legaturile multiple
efectele inductive §i mezomere
conjugarea grupelor nesaturate
105
 Schema cuprinde componentele principale pentru:
asocierea prin legaturi de hidrogen intramoleculare a) analizor cu fasicul simpiu
tensiunea in cicluri b) spectrometru cu dublu fascicul de tip dispersiv
fenomenul de cuplare vibrationala si rezonanta Fermi c) spectrometru cu transformare Fourier (fascicul
simpiu)
1.4.2. Aspecte tehnice ale
spectrometriel m IR Ultima categorie se bazeaza pe utilizarea unui
interferometru de tip Michelson asociat cu un microprocesor
specializat pentru calculul spectrelor sub forma numerica, iar la
1.4.2.1 Spectrometre §i analizoare in IR celelalte categorii se utilizeaza filtre sau un monocromator
instalat Tn montaje Tn functie de domeniul spectral utilizat
Tn IR aparatura utilizata se subTmparte Tn :
Spectrometru cu transformare Fourier
- Spectrometre cu transformare Fourier
- analizoare specializate Componentele principale ale unui astfel de spectrometru
- Spectrometre de tip dispersiv - pentru
IR apropiat sunt redate Tn figura 1.4.4c.
Radiatiile provenite de la o sursa lovesc o interfata
Schematic cele trei tipuri de aparatura utilizata Tn IR sunt
redate Tn figura 1.4.4. constituita dintr-un film semitransparent de germaniu depus pe
o lama de KBr. Acest dispozitiv permite generarea a doua
fascicule, unui dirijat spre o oglinda fixa, celalalt spre o oglinda
(c) I Sursa mobila care permite modificarea distantei fata de interfata. Cele
doua fascicule recombinate pe aceeasj directie traverseaza
proba Tnainte de a ajunge la detectorul care masoara
Interferometru
intensitatea luminoasa globala.
Oglinda mobila Singura piesa mobila a interferometrului Michelson este
oglinda care oscileaza Tn timp Tntre doua pozitii extreme. Atunci
Monocromator Proba
cand pozitia oglinzii mobile este de asa maniera meat drumurile
celor doua fascicule au aceeasj lungime, compozitia luminii la
Detector Detector I intrarea §i iesirea din interferometru este identica.
In cazul Tn care oglinda mobila parase§te aceasta pozitie
II particulara, lumina are o compozitie variabila ca urmare a
[
Inregistrare defazajului Tntre cele doua cai: semnalul transmis Tn timp de
Inregislrare •. Inregistrare •
ex. T = 0,85 detector este tradus sub forma unei interferograme (intensitatea
(A = 0,07)
nrrrj totala = f (p), unde p reprezinta diferenta traiectului optic Tntre
cele doua cai - figura 1.4.5). Fiecare punct din interferograma
corespunde unei pozitii a oglinzii mobile §i reprezinta
Figura 1.4.4. Diagramele spectrometrelor Tn IR a. cu intensitatea globala care a traversal proba. Un microprocesor
fascicul simpiu, b. cu dublu fascicuf, c. cu transformare special prelucreaza Tntr-un timp extrem de scurt datele dupa un
Fourier 107
106
 algoritm particular transformarii Fourier pentru a conduce la
amplitudinile fiecarei lungimi de unda din banda spectrala
studiata.

a Interferometru Schema optica a unui spectrometru

cu transformata Fourier

Oglinda focalizare

Detector Compartiment proba

Figura 1.4.5. Montajul optic al unui spectrometru cu

transformata Fourier

Tinand cont de factorul de rezolutie impus de metoda de

calcul, se obtine reprezentarea clasica a spectrului I = f (A.) sau I
= f(v).

Spectru obtinut dupa raport (2) la (1)

Figura 1.4.6. Secventa de obtinere a unui spectru in IR cu un

aparat cu transformata Fourier

Pentru obtinerea spectrului probei, echivalent celui

obtinut cu un aparat cu dublu fascicul, se Tnregistreaza doua
spectre de intensitate transmisa: primul fara proba
108 109
(background) si al doilea - cu proba. Spectrul reprezentat Tn
mod obisnuit In procente de transmitanta % T rezulta din cele
doua spectre precedente (figura 1.4.6). Aceste surse alimentate !a o tensiune joasa, ajung la
Aceasta metoda de obtinere a spectrelor prezinta 1500 °C §i, m conditiile lipsei unui ?nveli§ protector, ele disipa o
numeroase avantaje:
putere de ordinul sutelor de watt, emitand Tntr-un domeniu larg
- fanta de intrare este Tnlocuita printr-un "IRIS" ceea ce cuprins Tntre vizibil §i IR termic, trecand printr-un maxim pentru
furnizeaza un semnal mai bun detectorului
A, = 3000/T (k, Tn |am, T, Tn K). Intensitatea radiatiilor variaza
- raportul semnal final / zgomot de fond este mult
superior celui din metoda secventionala pentru ca mult Tn functie de temperatura sursei.
poate fi ameliorat prin acumularea semnalelor de
baleaj succesive B. IVIateriaie optice
- lungimea de unda este calculata cu mare precizie,
Materialele optice utilizate Tn mod obisnuit Tn vizibil sau
ceea ce permite o foarte buna comparare a spectrelor
- rezolutia este mai buna si constanta pentru toate Tn IR apropiat sunt Tn IR mediu opace.
Prismele monocromatoarelor aparatelor secventiale
domeniile studiate
utilizate Tn trecut erau confectionate din clorura de sodiu
(utilizabile pana la 650 cm"1) sau bromura de potasiu (pana la
1.4.2.2 Surse ?/ detector! in IR 400 crn"1) §i au fost Tnlocuite Tn aparatele moderne de retele
metalice a caror suprafata asigura reflexia luminoasa.
A. Surse luminoase Pentru peretii celulelor sau ferestrelor detectorilor (figura
1.4.8) se aleg materiale cristalizate sau amorfe fiecare
In IR sursele se prezinta fie sub forma unor filamente acoperind o anumita plaja spectrala.
groase (figura 1.4.7), fie sub forma unor batoane subtiri cu Detector semiconductor
Detector piroelectric
lungimea de 3-4 cm formate dintr-un amestec de oxid de
zirconiu si pamanturi rare Tncalzite de o rezistenta interioara
sau de o bara de carbura de siliciu (modelul Globar, nume
comercial derivat de la ,,glowing-bar").

Figura 1.4.8. Detector! in IR

4000 3500 3000 2500 2000 1SOO 1000 500
Alaturi de NaCI, KBr, fragile §i solubile Tn apa, se
Figura 1.4.7. Spectru de grnisife tipic al iisiei surse de radiafif Tn SR folosesc iodura de cesiu (transparenta pana la 200 cm"1),
clorura de argint, diamantul si materialele dure §i insolubile.
110
111
 De semnalat utilizarea bromoiodurii de taliu (KRS-5) sau
a AMTIR (,,Amorphus Material Transmitting Infrared Radiation")
1.4.2.3 Tehnici de examiners a probe/or
care sunt sticle compuse din germaniu, arsen si seleniu. Datorita numeroaselor dispozitive adaptate sa raspunda
unui numar mare de aplicatii calitative si cantitative, astazi toate
C. Detectori
tipurile de probe pot face obiectul unor studii Tn IR mediu.
Tn functie de tipul de aplicajie §i/sau aparat se utilizeaza A. Procedeul prin transmisje
ca detector!:
- termistori Pentru gaze se utilizeaza celule Tn care traiectul optic
- termocupluri este de minim cativa cm (figura 1.4.10) dar care poate atinge
- alte dispozitive asociate caflva metri, printr-un joe de reflexie multipla pe oglinzile interne
ale celulei; volumul celulei devine astfel foarte important (0,2 I).

Suport de celula Fereastra KBr

Ferestre KBr
Distantier
Celula (Pyrex)

Proba de gaz
Fereastra KBr

Figura 1.4.9. RTiodelui unui anslizor de gaz cu fascicul simplu: 1.

sursa IR (906 K), 2. celuia de masura. 3, camera de receptie, 4.
camera de echilibrare, 5. sonda de micro-flux, 6. obturator. 7. Inchidere
ferestrs de KBr
Figura 1.4.10. Cuve pentru IR mediu
Pentru spectrometrele cu transformare Fourier
detectorul, care trebuie sa poata urm§ri modularea rapida a
Tehnica cuplarii GC-IR (gaz cromatograf - spectrometru
intensitajii luminoase, este un cristal piroelectric sau un
Tn IR) face apel la celule cu gaz filiform (Jight pipes") cu volume
semiconductor de tipul fotodiodei (figura 1.4.8).
de ordinul zecilor de jil (L = 10 cm, § < 1 mm) ai caror pereti
Detectorul cu efect piroelectric eel mai des utilizat este
un monocristal de sulfat de triglicerina deuterizata (DIGS) sau laterali sunt auriti pentru a fi reflectanti.
Studiul lichidelor este Tn general realizat cu celule cu
de tantalat de litiu (LiTaO3) plasat Tn sandwich Tntre doi
pereti demontabili. Pentru analizele calitative se pune o picatura
electrozi, dintre care unul semitransparent responsabil de
din proba Tntre doua discuri de NaCI sau KBr, pentru analizele
impactul cu fasciculul optic. Cristalul este polarizat proportional
cu radiatiile primite, se comporta ca un condensator, raspunde cantitative se utilizeaza cuve de cuart sau cuve de grosime
numai la variatiile de temperatura. variabila Tn care se controleaza periodic traiectul optic (Tn
general inferior valorii de 1 mm) (figura 1.4.10).
Detectorul de tip semiconductor este confectionat, pentru
Pentru solide exista posibilitatea alegerii Tntre mai multe
domeniul IR mijlociu, dintr-un aliaj de mercur-cadmiu-telur
(MCT) iar pentru IR apropiat, din sulfura de plumb sau aliaj tehnici:
indiu-galiu-arsen. Sensibilitatea este ameliorata atunci cand
detectorii sunt raciti la temperatura azotului lichid (17 K). 113
112
 1. Se disperseaza cateva mg de proba Tn ulei de parafina
(numit Nujol™) care nu prezinta decat 3 benzi principale B. Procedeui prin refiexie pentru probele solide
de absorbtie Tn afara carora spectrul probei poate fi
exploatat. Acest prim spectru poate fi completat cu un alt C§nd un fascicul luminos ajunge la interfata cu un al
spectru Tnregistrat Tn hexaclorbutadiena, transparenta Tn
doilea mediu al carui indice de refractie este diferit, el poate
domeniul Tn care parafina este opaca.
suferi modificarea unghiului de incidents si a sensului de
2. Se macina proba solida Tn prezenta de KBr uscata Tntr-
variatie a indicelui, fie printr-un proces de refiexie totala, fie
un mojar de agat. Acest amestec se comprima sub
printr-o refiexie atenuata Tnainte de patrunderea Tn eel de al
presiune de 5-8 torn/cm2 cu o presa hidraulica sau
manuala. Pastilele rezultate au aspect translucid §i doilea mediu.
corespund unei dispersii a probei Tntr-o matrice solida. a Polimetacrilat de metil PMMA
T CO2Me
De remarcat ca nu toate probele solide se preteaza
acestei tehnici de prelucrare.
3. Daca proba solida poate fi trecuta Tn solutie atunci
analiza decurge dupa modul descris pentru lichide,
determinate cantitative putandu-se realiza la lungimile
de unda corespunzatoare domeniului IR fn care solventul
nu absoarbe.
4. Tn cazul Tn care proba solida nu se preteaza prelucrarii Tn
nici unul din modurile descrise mai sus, se procedeaza la
detectie fotoacustica. Proba este supusa unor radiatii de
la sursa, modulate printr-un dispozitiv interferometric
(figura 1.4,11). Variatiile de temperatura din proba se
transmit instantaneu sub forma de variatii de presiune Tn
celula unde sunt detectate de un microfon (de aici si
denumirea de detectie fotoacustica). Interferograma
sonora obtinuta plecand de la undele de presiune este
convertita Tn spectru clasic.

Fereastra Radiatii IR Interferograma acustica

KBr.
I i / Microfon

Figura 1.4.11. Dispozilrv de detectie fotoacustica

2000
Numel'e de unda

114 Figura 1.4.12. Spectre Tn refiexie

115
 Compozitia spectrala a fasciculuiui reflectat depinde de Reflexia difuza
modul Tn care variaza indicele de refractie a compusului studiat Dispozitivui permite obtinerea, printr-o Tmbinare a unor
cu lungimea de unda (figura 1.4.12). oglinzi plane §i eliptice, a unei bune parti din lumina difuzata de
Reflexia speculara, reflexia difuza, reflexia totala proba m prealabil dispersata Tn KBr (figura 1.4.14),
atenuata se pot realiza utilizand diferite dispozitive atasate
spectrofotometrului cu transformare Fourier (FTIR), spectrele
obtinute Tn lumina reflectata difera de spectrele obtinute Tn Oginda elipsoidala
lumina transmisa, corectiile facandu-se cu ajutorul
calculatorului. Port-proba

Catre detector
Reflexia speculara Sursa !R
Acest accesoriu permite studiul reflectantei, adica a
luminii reflectate de proba, Tntr-o directie de observare simetrica
celei incidente (figura 1.4.13). Se aplica probelor ce reflects
slab lumina (filme de polimeri, lacuri, etc.).
Proba
Proba
Figura 1.4.14. Schema optica a unui dispozitiv pentru reflexie
difuza
IR IR
£'~ "•<•' I Prin compararea cu reflexia difuza corespunzatoare KBr
| Unghi de 30 grade Suport pure se obtine un rezultat apropiat unui spectru prin transmisie.

Figura 1.4.13. Dispozitiv pentru reflexie speculara

Lumina reflectata, care corespunde unei parti mici din

lumina incidenta partial absorbita, determina variatii ale indicelui
de refractie a compusului Tn functie de lungimea de unda.
Comparand, dupa Tnregistrare, pentru fiecare lungime de unda
reflexia speculara I a probei cu reflexia totala I0 obtinuta
plasand proba pe o oglinda de aluminiu, aparatul calculeaza
spectrul de reflectanta R = 1/l0=f(^.). Apficand acestui spectru o rr- L x d x h : 2 5 x 5 x 3 mm
Exemplu de cristal paralelipipedic
transformare matematica cunoscuta sub denumirea Kramers-
Kronig (K-K) se ajunge la un spectru in pseudo-absorbanta,
echivalent celui obtinut prin transmisie. Figura 1.4.15. Dispozitiv ATR

117
116
 abscisa considerate. Se ordoneaza cele j sume Sj In ordine
crescatoare, atribuindu-li-se un indice de corelare.

Reflexia totala atenuata (ATR) / proba

Consta Tn a produce asupra fasciculului luminos una sau
mai multe reflexii la interfata cu un material transparent in IR, H

paralelipipedic sau trapezoidal, cu indice de refractie n mare

(exemplu, germaniu are n = 4, ZnSe n = 2,4) pe care este In lipsa unor spectre de referint,a, interpretarea spectreior
depusa proba (figura 1.4.15). Tn IR urmareste punerea Tn evidenta a unor grupari functionate,
Daca unghiul de incidenja este superior unghiului critic, asocieri prin iegaturi de hidrogen inter- si intramoleculare,
profunzimea la care ajunge lumina Tn proba depinde de: configuratii sterice, etc., ca Tn cazul urmatoarelor exemple:
- lungimea de unda
- indicii de refractie ai cristalului si probei Acidul benzole
- unghiul de incidenta COOH
Succesiunea reflexiilor totale dar atenuate de acest tip
conduc la un traiect optic comparabil celui obtinut prin
transmisie. Acest procedeu este utilizat pentru pulberi, lichide si
microprobe.

1.4.3. AnaEiza calitativa In IR Spectrul Tn IR este prezentat Tn figura 1.4.16. Banda

Identificarea compusilor se poate realiza cu ajutorul
spectrotecilor generate sau a celor speciale (polimeri, solvent!,
adezivi, molecule organice clasificate pe functiuni) propuse de
societati sau edituri (Aldrich, Sigma, Sadtler, etc.). Pentru
realizarea comparatiilor, spectrele arhivate trebuie sa fie
obtinute plecand de la compusi aflati Tn aceea§i stare fizica cu
cei supusi identificarii. Tn general, Tn bibliotecile de date
spectrele sunt normalizate atribuind benzii celei mai intense o
absorbanta egala cu unitatea. Analiza calitativa consta Tn
compararea matematica a spectrului compusului necunoscut cu
toate cele care formeaza spectroteca considerata, Tn vederea
stabilirii unui clasament al spectrelor cele mai asemanatoare.
Analistul trebuie sa examineze cu atentie rezultatele si, Tn cazul
schimbarii algoritmului de comparare, acestea nu trebuie sa
difere.
Algoritmul diferentei absolute este eel mai simplu: pentru
fiecare din cele j spectre din spectroteca se calculeaza suma Sj
a diferentelor absolute Tntre absorbanta substantei necunoscute
si a celei din spectrul j al spectrotecii pentru n puncte de pe
larga de absorbtie de la 3000-2500 cm"1 indica asocierea prin
Iegaturi de hidrogen la nivelul gruparii O-H din COOH.
Clorhidratii bazelor organice dau absorbtii similare de aceea
punerea Tn evidenta a gruparii COOH se face pe baza gruparii
carbonil ce absoarbe puternic la 1690 cm"1. Confirmarea
suplimentara este data de existenta benzilor de la 1280 si 1310
cm"1 (-C-O-) si a benzii late de la 940 cm"1 datorate deformarii
legaturii O-H Tn acizii dimeri.
Nucleul aromatic are absorbtii caracteristice la 1600,
1500, 720 si 695 cm"1, ultimele benzi fiind caracteristice
benzenului monosubstituit.
119

118
 Acidul acetilsalicilic

COOH
OCOCH3

Spectrul Tn IR este prezentat ?n figura 1.4.17. Banda

larga de la 3000 - 2000 cm"1 este tipica mtinderii O-H Tn acizii
carboxilici dimeri. Benzile puternice de la 1690 §i 1300 cm"1
indica, de asemenea, gruparea COOH. Banda intensa de la
4000 3500 3000 2500 2000 " 1500 ' 1000 ' 500
1750 cm"1 confirma prezenta gruparii carbonil din ester
coroborata cu absorbtiile de la 1180 si 1220 cm"1.
Numere de unda [cm"']
Compusul este aromatic asa cum arata benzile de la
1600, 1490 si 850-700 cm"1. Absorbtia de la 1600 cm"1 este
foarte puternica pentru un compus aromatic dar este explicabila
Figure 1.4.16. Spectru! in IR al acidului benzole (in KBr)
datorita prezentei substituentilor polari.

1.4.4. Analiza cantitativa in IR

Precizia cu care se mascara absorbanta si posibilitatile
de repliere a spectrelor constituie avahtaje ale analizei
cantitative Tn IR. Metoda este frecvent utilizata, pe de o parte
datorita faptului ca Tn IR mediu gasirea Tntr-un spectru al unui
amestec a benzilor caracteristice compusului de dozat este
relativ u§oara, iar, pe de alta parte, exista la dispozitie metode
40- statistice de prelucrare a datelor.

20-
A. Analiza cantitativa Tn IR mediu

Tn cazul probelor solide, acestea sunt dispersate Tn

interiorul unui disc de KBr carora li se adauga un standard
4000 3500 3000 2500 2000 ' 1500 " 1000 ' 500
intern (carbonat de calciu, naftalina, etc.) Tn cantitati egale atat
Wavenumber [cm"1] pentru standard cat sj pentru proba.
Pentru lichide determinarea absorbantei se face Tn cuve
cu parcurs optic I mic pentru a minimaliza absorbtia proprie
Figura 1.4,17, Spactrul m !R ai acidului acetilsalicilic (Tn KBr} solventului Tn cazul Tn care solventul nu este transparent Tn
120 acest domeniu. Valoarea I este legata de fragilitatea
121
materiatului utilizat pentru ferestrele celulelor si de constructia
acestora, de aceea se impune etalonarea periodica a traiectului
optic. Masurarea exacta a traiectului optic Tn celule de grosime
mica se face printr-o metoda interferometrica. Se Tnregjstreaza
transmitanta celulei goale Tntre doua numere de unda vi §i V2
(figura 1.4.18).
81
1200 1100 1000 900 cm
Figura 1.4.18. Calculul la{imii unei cuvs prin metoda interference!
Se observa ca radiatia 82 sufera o dubla reflexie pe
peretii interni ai celulei astfel ca pentru o incidenta normala se
va obtine (daca 21 = kX) o suma de doua intensitati luminoase
(cele doua radiatii luminoase S-i si S2 sunt Tn faza). In functie de
lungimea de unda, se produce o modulare cu cateva procente a
fasciculului principal 81. Dupa calcule se obtine:
N de benzile de vibratie de tipul armonicelor si benzilor de
l(cm) =
2(v1-va.)
unde N reprezinta numarul de franje existente Tntre cele doua
lungimi de unda.
Trebuie, de asemenea, sa se ^ina seama Tn determinarile
cantitative de absorbtia de fond care se produce adesea pe o
buna parte a spectrului si care depinde Tn particular de modul Tn
care a fost preparata proba. Absorban^ele fiind aditive se va
scadea din absorbanta totala absorbanta care nu este data de
compusul de dozat. Aceasta se poate realiza apeland la
metoda tangentelor (figura 1.4.19).
122
1500 1000
Numere de unda
Figura 1.4.19. Corecfia fondului
B. Anaiiza cantitativa In IR apropiat
Aceasta metoda utilizeaza domeniul spectral situat Tntre
800 si 2700 nm (12500 - 3700 cm"1). Benzile observate Tn
acest domeniu sunt date nu numai de tranzitiile electronice ci si
combinare.
Intensitatea benzilor descreste cu ordinul armonicei.
Astfel pentru legaturile simple X-H (X = O, N, C) sunt
caracteristice Tn aceasta zona spectrala armonicele de ordinul II
(de exemplu, O-H absoarbe la 1420 nm, N-H la 1520 nm, C-H
la 1750nm).
Alte benzi utilizate corespund unor armonice de~ ordinul
III si IV cum este cazul benzii de la 2900 nm care corespunde
legaturii C-O.
Benzile armonice sunt mai putin intense decat cele
corespunzatoare vibratiilor fundamentale si de aceea se
lucreaza Tn cuve cu parcursul optic de 1 cm si pe probe
nediluate. Se !ucreaz§ Tn transmisie sau reflexie (de exemplu,
proteinele, amidonul sau celuloza se dozeaza prin reflectanta).
123
 Trecerea la spectrul derivat (figura 1.4.20) Tmbunatateste
precizia. Astazi se face apel la metode MLR (,,Multiple Linear
Regression") ce permit tratarea statistica a unui numar mare de
puncte de masurare pentru stabilirea unei ecuatii de etalonare.
Aceste metode chemometrice, care modeleaza ansambluri de
absorbante masurate la diferite lungimi de unda, sunt deseori
utilizate (PCA Partial Component Analysis, PLS Partial Least
Squares), Tn scopuri analitice.
1100 1300 1500 1700 1900 2100 2300 2500
Figura 1.4.20. Curb© derivafe. Compararea spectreSor derivale tie
ordinul il m IR apropiat ale apei pwe §i unui annsstec
echimolecular apa-meianol
Chiar daca metodele de dozare Tn IR apropiat nu sunt
sensibile, Tntotdeauna ele sunt usor de realizat.
124
1.4.5. Date spectrale privind
identificarea usior compu§i
medicamento§i prin spectrometrie
Tn IR §i spectrofotometrie UV-VSS
Complementare sub aspectul analizei structurale,
spectroscopia de absorbtie Tn UV-VIS si IR sunt considerate Tn
controlul de medicamente ca fiind metode de identificare si
apreciere a puritatii substantelor medicamentoase, bazate pe
compararea cu spectrele substantelor de referinta. Ele singure,
fara contributia majora a spectroscopiei de masa si a celei de
rezonanta magnetica nucleara, nu pot conduce cu certitudine la
stabilirea structurii unui compus nou sintetizat.
Detalii structurale pot fi, Tnsa, foarte bine evidentiate prin
aceste doua tipuri de spectroscopii, cum ar fi cele de
configurable, punerea Tn evidenta a legaturilor de hidrogen
intramoleculare, etc.
Tn continuare vor fi prezentate cateva exemple de
interpretare spectrala bazate Tn exclusivitate pe absorbtia Tn
UV-VIS §i IR a unor substante cu utilizare medicala.
1 . p-Hidroxibenzoatul de prop/7
OCH2CH2CH3
UV. Xmax (nm): Tn apa, la 253 (A1%1 cm = 380); Tn NaOH 0,1 M, la
294 (A1"70! cm = 1204)
IR. Spectrul de vibrajie obtinut Tn KCI are maxime puternice la
numerele de unda Vmax (cm"1): 3250 (i, banda lata), 1601 (i),
1670 (i), 1585 (i), 1505 (m), 1280 (i).
UV. Pornind de la structura substantei, deplasarea batocroma
si hipercroma cu cresterea pH-ului este explicate prin
125
 To":

intensificarea conjugarii Tn ionul fenolat fa{a de structura

fenolica.
IR. Banda Iat3 de la 3250 cm"1 este atribuita legaturilor de
hidrogen la nivelul gruparilor OH. Banda de vibratie atribuita
carbonilului C=O din gruparea esterica vibreaza intens la 1670
cm"1, valoare mai scazuta decat cea caracteristica esterilor B31

aromatici datorita conjugarii extinse ce scade ordinul legaturii:

=\ Co
OCH2CH2CH: =/ OCH2CH2CH3
ET

<rri
Benzile de la 1601, 1585 si 1505 cm"1 sunt datorate vibratiilor
de schelet ale nucleului aromatic. Absorbtia de la 1280 cm"1 rat
3000 2000
reflecta Tntinderea asimetrica a C-O din ester. Wavenumber (cm-1)

Figura 1.4.21. Spectral Tn !R al ibuprofenului (Tn KBr)

2. Ibuprofenul are structura:
3. Acidul etacrinic
OCH2COOH
XCH-CH2
H,CX COOH

Benzile intense Tn IR, vKCImax (cm"1): 3000 - 2600 (i, larga),

1720 (i), sunt puse Tn legatura cu vibratia OH-ului si, respectiv,
C=O din gruparea carboxil. C=CH2
CH2CH3

UV. Xmax°1MNaOH (nm): 227 (A1%1cm = 470), 280 (A1%1cm = 150)

IR vKCImax (cm"1): 3000 - 2500 cm"1 (m, banda larga dintata),
1710 (i), 1670 (i), 1658 (i), 1250 (i), 1080 (i)

Spectrul UV releva o structura benzoinica.

Banda dintata de ia 3000 - 2500 cm"1 este asociata cu

Intinderea iegaturii O-H din gruparea carboxil. Benzile de la
1710 si 1670 cm"1 sunt legate de vibratia C=O din gruparea
carboxil si gruparea 2-etilacriloil. Se observa la 1658 cm"
127
126
 Tntinderea legaturii C=C iar la 1250 si 1080 cm"1 Tntinderea
legaturii C-O din restul eteric. foarte mult influentata de substituenti, interpretarea spectrului
UV trebuie sa se faca avand la dispozitie cataloage cu spectre
4. Indometacinul cu ajutorul carora sa se poata pune in evidenta sistemul
cromoforic.
CH30 CH2COOH
Benzile de vibratie de la 3000 - 2500 cm'1 si banda de la 1717
cm'1 sunt identificate ca fiind datorate carboxilului, iar C=O din
amida ter^iara vibreaza la 1692 cm"1 (vibratie de Tntindere).

5. Carbimazol
O
,CH3
N

1
(nm): 208, 235, 325
IR. vKC'max (cm"1): 3000-2500 (m, benzi dintate), 1717 (i), 1692
(i), spectru IR foarte complex Tn zona amprentelor digitale o
OCH2CH3

UV. W'1M HCI (nm): 227 (e = 7600), 291 (e = 10360)

oTf IR. vmaxKCI (cm'1): 3190 (s), 3150 (s), 3120 (s), 2960 (s), 2940
(s), 1750(0, 1705(m)
oT;

ol Pornind de la structura de baza:

I
,CH3
N1
"03"

aceasta prezinta maxime de absorbtie la 210 nm §i 250 nm,

Wavenumber (cm-1)
Figura 1.4,22. Spectrul in IR al indometacinului (in KBr)
Spectrul Tn UV al compusilor heteroaromatici este greu de
interpretat. Nucleul indolic prezinta Tn ciclohexan 3 benzi de
absorbtie la 220, 280 si 288 nm. Deoarece pozitia benzilor este
128
banda de absorbtie de la lungimi de unda mari fiind mai
intensa. Legarea cromoforului -COOCHsCHs de acest nucleu
determina, asa cum este de asteptat, o deplasare batocroma a
benzilor de absorbtie caracteristice nucleului de baza.
Seria de benzi situate Tntre 3190 §i 2490 cm"1 este asociata cu
vibratiile de Tntindere C-H din gruparile metil si restul etenic.
Banda carbonil se observa la 1750 cm"1 iar Tntinderea legaturii
C=Cla 1705cm"1.
129
6. Clofibrat
CH3
O—C-COOCH2CH3
CH3
etano1
UV. ?.max (nm): 226 (e = 11700), 275 (e = 1700)
IR. VmaxKCI (cm'1): 2990 (i), 2960 (tn), 1740 (i), 1595 (m), 1580
(s), 1485 (i), 1290 (i), 1245 (i), 1185 (i), 1140 (i)
Compusul prezinta benzile de absorbtie in UV caracteristice
structurilor benzenoidice, cu banda de la lungimi de unda mici
intensa.
Benzile de la 2990 si 2960 cm"1 sunt datorate Tntinderii legaturii
C-H din gruparile metil geminate. Banda carbonil este situata la
1740 cm"1, valoare caracteristica unui ester alifatic. Vibra{iile
nucleului aromatic au loc la 1595, 1580 si 1485 cm"1. Cele 4
benzi din regiunea 1290-1140 cm"1 sunt Tntinderi simetrice si
asimetrice ale legaturii C-O din gruparile eter si ester.
130
1.5. SPECTROSCOPIA ATOMICA
1.5.1. Generaiitati
Spectrometriile de absorbtie si emisie atomica sunt
metode cantitative §i calitative aplicate Tn studiul substantelor
minerale. Se bazeaza pe absorbtia sau emisia radiapor
luminoase de catre o populatie de atomi Tn stare de vapori.
Imbunatatirea acestor tehnici prin dezvoltarea
spectrometriei de emisie Tn plasma §i utilizarea laserelor a
permis extinderea ariilor de aplicatie la un numar mare de
elemente existente Tn urme, posibilitatea automatizarii §i
posibilitatea studiilor speciilor de elemente. Metodele spectrale
atomice parcurg Tn mod obligatoriu doua etape:
• vaporizarea ionilor sau atomilor
« expunerea atomilor vaporizati la o sursa de energie
exterioara (caldura, lumina)
Studiul spectrelor obtinute permite caracterizarea
elementelor dupa lungimea de unda a radiaflei luminoase §i
dozarea lor dupa intensitatea acestor radiatii.
1.5.2. Etape in analiza prin
spectroscopse atomica
Metodele utilizate Tn analiza prin spectroscopie atomica
implica distrugerea completa a moleculelor continand elemente
de dozat pentru obtinerea atomilor liberi care trebuie adusj Tn
stare de vapori. Considerand, ca exemplu, clorura de sodiu,
etapele prin care aceasta trebuie sa treaca pentru a se obtine
cele doua elemente Na si Cl sub forma de vapori sunt redate Tn
schema de mai Jos:
131
 Acest raport variaza cu temperatura de lucru §i cu natura
NaCI Tn matrice elementelor, astfel:
•I mineralizare Na (A, = 589 nm), T = 2000 K, N*/N° = 1,305 • 10'5
Elemente Tn solutie sub forma de ioni Na+CI~ Cu (A. = 325 nm), T = 2000 K, N*/N° = 4,77 • 10'10
>hOO°C,Tncalzire Valorile acestor rapoarte arata ca atomii raman Tn marea lor
Evaporarea solventului, solutie suprasaturata majoritate Tn stare fundamentala, de aceea se prefers
I 800 °C, flacara sau cuptor spectroscopia de emisie.
Recristalizarea NaCI solida In general, Tn functie de raportul N*/N° se alege:
i 800 °C, flacara sau cuptor - N*/N° > 10'7 -> emisie' Tn flacara
Fuziune - N*/N° < 10'7 -> absorbtie atomica
T I V> W \S \~t

Vaporizarea sarii (NaCI gazoasa)

4- 1700-1800 °C 1.5.3. AnaSiza caotitativa Tn absorbtia
Disociere Na + Cl (gaz)
|2000°C
Atomi excitati Na + Cl (gaz)
4- emisie hv Determinarile cantitative Tn spectroscopia de absorbtie
Atomi Tn stare fundamentala Na + Cl (gaz) atomica se bazeaza pe o lege asemanatoare legii Beer-
Lambert:
Se constata ca flacara are un dublu rol:
- de vaporizare I = I0 exp-(k!N°)
- de excitare
Alegerea Tn cadrul spectroscopiei atomice Tntre absorbtie Daca N este numarul total de atomi prezenti Tn flacara:
si emisie se face Tn functie de raportul Tntre numarul de atomi
excitati si numarul de atomi ramasi Tn stare fundamentala, N = N° + N* + Nlon
raport dat de legea repartitiei a lui Maxwell-Boltzmann:
unde
Nl = qe-AE*T
N° N° = numaru! de atomi ramasi Tn stare fundamentala
N* = numarul de atomi excitati
N* - numarul de atomi Tn stare excitata N'on = humar de atomi ionizati
N° - numarul de atomi Tn stare fundamentala
T - temperatura absolute atunci N° reprezinta fractiunea a din N, a depinde de
g - raportul statistic al greutatilor Tntre starile fundamentala si temperatura flacarii.
excitata Pe de alta parte, atomii N prezenti Tn flacara nu
AE - saltul de energie Tntre nivelu! excitat considerat si nivelul reprezinta decat o fractiune p din totalu! NT atornilor nebulizati,
fundamental P depinde de conditiile de nebulizare. NT de atomi introdusi Tn
k - constanta lui Boltzmann 1,380658 • 10~23 J • K"1 sistemul de nebulizare pe unitatea de timp este fractiunea j a
132 133
 m

concentrate! solutiei studiate, y depinzand de sistemul de

aspirare. Rezulta ca N° = a (3 y c sau I = I0 exp(-k'c) sau A = log
I0/l = k'c. Aceasta lege de tip Beer - Lambert valabila in limite
restranse de concentratie sta la baza a trei tehnici utilizate in
spectroscopia atomica:
A. Caiibrare directa - absorbanta A = log I0/l este raportata
la concentratie prin intermediul curbei de etalonare A =
f(c). Metoda presupune o buna cunoastere a mediului de
analiza, obtinerea rezultatelor precise implica utilizarea
etaloanelor cu compozitie cat mai apropiata de cea a
matricei probelor pentru limitarea interferentelor.
B. Metoda adausului standard - se adauga probelor
cantitSti cunoscute si crescande din elementele de
dozat. Dreapta A / cantitate adaugata taie abscisa la o
distanta de origine egala cu concentratia cercetata. De
exemplu se iau 3 eprubete continand acelasi volum V din
Metoda standardului intern: se realizeaza o serie etaion,
se adauga o concentratie cunoscuta si fixa c' dintr-un alt
element convenabil ales atat Tn soluble din seria etaion
cat si a probei. Se traseaza curba de etalonare A/A' =
f(c/c') unde A este absorbanta etalonului, A' a etalonului
intern §i c si c' concentratia etalonului §i a etalonului
intern (figura 1.5.1).
Eprubete
Concentratia solutiilor
in etaion si etelonul Intern
C1

solutia de titrat. In volumul V sunt n0 moli de compus. Se

adauga Tn fiecare eprubeta cantitati cunoscute §i
crescande de compus n^ r\2, n$ §i volumele VL V2, vs de
solute titrata, se completeaza la acelasi volum V cu A/A'

solventul utilizat pentru prepararea solutiilor titrate.

Concentratiile Tn cele 3 eprubete vor fi:
ci = niA/ + n0A/
c2 = n2A/ + n0/v
c3 = na/V + no/V
Se masoara absorbantele AI, A2, As. Pentru ca ecuatia
dreptei este A = n/V + noA/ atunci cand A = 0 rezulta ca
-nA/ = no/V.
•- C/C'

A3
Proba

A2

Figura 1.5.1. Wietoda standardului intern

nA/

134 -nA/ n2A/ n3A/ 135


Precizia acestei metode va fi cu atat mai mare cu cat
elementul de referinta ales absoarbe la o lungime de
unda si are potential de ionizare c£t mai aproape de
proba.
Metoda standardului intern este dificil de utilizat Tn
absorbtia atomica unde sursa luminoasa ramane
specifica fiecarui element.
1.5.4. Analiza cantifativa Tn emisia
atomica
Presupunand ca elementele de dozat sunt Tn solutie,
este un fapt dovedit experimental ca intensitatea luminii emise
este proportionals cu concentratia elementului de dozat:
l = kc
Tn emisia atomica se utilizeaza aceleasj metode ca si Tn
absorbtie:
A. Calibrare cu standard extern
B. Metoda adausului standard
C. Metoda standardului intern
Atunci cand se cunoaste ordinul de marime al
concentratiei c0 a probei se poate proceda Tn felul urmator:
- se prepara doua solutii etalon cu concentratiile CT si 02 care
Tncadreaza concentratia probei c0. Daca se noteaza cu h, \z §i I0
intensita|ile corespunzatoare, ca urmare a proportionalitatii Tntre
intensitate si concentrate, se poate scrie:
'2-'l
pentru
136
1
1.5.5. Prepararea probelor
Prepararea probelor variaza Tn functie de natura matricei
§i a eluentului de dozat:
« descompunerea materiel organice Tn mediu acid (acid
azotic, acid sulfuric, acid clorhidric) §i tratare cu oxidanti
• mineralizarea - calcinarea probelor de natura organica la
temperatura de 450 °C urmata de tratarea cenusii cu un
volum mic de solutie acida.
• extractia Tn faza organica sub forma de chelat pentru
eliminarea substantelor interferente sj concentrarea
elementelor adesea prezente Tn urme.
Conditiile experimentale trebuie adaptate tipului de
analiza. Utilizarea acizilor face parte din toate protocoalele de
preparare a probelor, de aceea este necesara prepararea
etaloanelor Tn acelea§i conditii, ceea ce implica limitarea
cantitatii de acid consumata la mineralizare.
Limitele de detectie pentru cele mai cunoscute tehnici
de spectroscopie atomica sunt de ordinul:
1 mg/l -> Absorbtia Atomica Tn Flacara (FAAS)
1 ng/l -> Absorbtia Atomica Electrotermica
(ETAAS)
1 ng/l ->• Emisia Atomica Tn Plasma de Argon
Cuplata Inductiv (ICP-AES)
1 ng/l -» Emisia Atomica cuplata cu Spectrometru
de Masa (ICP-MS)
137
 - electrotermic
- prin vaporizare chimica
15.6. Spectrometria de absorbtie Flacara
Este utilizata Tn Spectrometria atomica Tn flacara (FAAS)
pentru anaiiza probelor Tn solute. Energia termica emisa
trebuie sa fie suficienta pentru atomizarea elementelor fara a le
1.5.6.1 Principii
excita sau ioniza.
Flacara este ob|inuta utilizand un arzator alimentat cu
diferite amestecuri combustibil/comburant (tabelul 1.5.1).
Spectrometria de absorbjie atomica este o metoda
oficinala Tn Farmacopeea Europeana (introdusa' Tn edty'a a 4-a) Tabeiul 1.5.1. Amestecuri combustibil/comburant
§i se utilizeaza pentru anaiiza cantitativa a numeroase "'r'Jt!;;'~ •"• ™- --—•,„,* w^^ima K ""
elemente chimice.
Principiul acestei metode este urmatorul: asupra unei
populatii de atomi ai elementului de dozat aflat Tn stare de
vapori se aplica o radiatie monocromatica emisa de o lampa si
corespunzatoare radiatiei de rezonanta a elementului cercetat.
Schema unui aparat de absorbtie atomica este
urmatoarea (figura 1.5.2.): Toate flacarile absorb la \ > 230 nm ceea ce ridica
probleme Tn cadrul dozarii arsenului (k = 193,7 nm) §i seleniului
(X= 196nm).
Atomizer — Monocromator — Detector
j -$&-
Atomizarea electrotermica
Lampa cu Dispersor Nebt. lizor Se utilizeaza Tn absorbtia atomica electrotermica
catod scobit
(ETAAS) §i folose§te un cuptor de grafit care consta practic
1 dintr-un tub de grafit unde proba este injectata cu ajutorul unei
Proba
seringi. Tubul este prevazut cu o cavitate longitudinals foarte
Figura 1.5.2. Schema unui aparat de absorbtie atomica fina strabatuta de radiatia luminoasa.
Tncalzirea cuptorului de grafit se face Tn patru etape,
1. Sistemul de nebulizare (pulverizare) are rolul de a transforma temperatura este marita treptat urmand etapele:
proba Tntr-un nebulizat fin si omogen prin doua tehnici mai -uscare 100°C
cunoscute: - descompunere 400 °C
-
nebulizare pneumatica, cu un randament mic - atomizare 2000 °C
(aproximativ 5%) - piroliza (proces de curatire) 2300 °C
- nebulizare ultrasonica, mult mai eficace decat cea
pneumatica
2. Atomizarea elementelor. Atomizarea analitilor se poate
realiza:
- Tn flacara 139
138
 argon

Solutie de NaBH4 Hidrura sub forma gazoasa

Gaz inert1
4cm

Model de lub de grafit (sectiune)

Fascicul luminos
2500
Program electrotenmic
2000 1. uscare 100 grade C
2. descompunere 400 grade C Figura 1.5.4 Sisiern de \faporizare chimiea
3. atomizare 2000 grade C
1500 4. piroliza 2300 grade C
Hidrogenul atomic, foarte reactiv va forma hidruri, acestea sunt
1000
antrenate de un gaz purtator Tntr-un tub de cuart la o
500 -I 0,5 temperatura de aproximativ 1000 °C unde sunt descompuse Tn
atomi.

Tn ceea ce priveste partea optica Tn spectrometrele de

Figura 1 .£3.3. Slsism ds atomizare electrotermica absorbtie atomica este de remarcat:
- utilizarea ca sursa luminoasa a lampii cu catod scobit
Tehnica electrotermica prezinta dezavantajul ca da - monocromatoarele sunt destinate sa elimine radiatiile
interferente legate de emisia proprie a grafitului Tncepand cu luminoase a caror lungime de unda nu corespunde celei
temperatura de 2500 °C §i de reactja carbonului cu anumite a elementelor (dorneniul spectral utilizat se situeaza Tntre
elemente supuse analizei cand se formeaza carburi 190-900nm)
responsabile de emisiile parazite. - intercalarea unui dispersor de radiate Tntre sursa
luminoasa §i detector cu scopul de a elimina radiatiile
Vaporizarea chimica parazite provenite fie de la atomii excitati, fie de la flacara
Este o tehnica ce se adreseaza elementelor mtr-o stare de fond
de oxidare superioara dificil de redus si vaporizat prin flacara
(arsen, bismut, mercur, seleniu, etc.). Procesul consta in Corectia zgomotuiui de fond
reducerea preaiabila a elementelor la stadiul de hidruri volatile Zgomotul de fond are la origine:
la temperatura mediului.
• interference spectrale sau nespecifice
Probele acidifiate sunt introduse Tntr-un vas de reactie: • interferente chimice sau de matrice
se barboteaza un gaz inert ce elimina oxigenul raspunzator de
« interferente fizice
descompunerea hia'rurilor si elementele sunt reduse cu o Interferentele spectrale provin din atomizor si se
solutie de borohidrura de sodiu (NaBhU) rezuitand hidrogenul
atomic. datoreaza:
• suprapunerii razelor
• absorbtiei moleculare, legata de prezenta unor molecule
NaBH4 + 3H20 + HCI NaCI + H3BO3 + 8 H provenind din matrice sau a unor produ§i de
140
141
 transformare. De exemplu, calciul formeaza radical!
CaOH' care perturba dozarea bariului
• difuziei luminii incidente - pe particulele solide sau
lichide rezultate din matrice sau prin descompunere
Interference chimice sau efectul de matrice se
datoreaza reactiilor chimice secundare (oxido-reducere,
ionizare sau asociatie) sau prezentei particulelor Tn suspensie
Tn sursa de atomizare.
Interferentele fizice sunt legate de vascozitatea probelor
care poate fi diferita de cea a etaloanelor si se Tntalnesc Tn
cazul probelor introduse sub forma de lichid Tntr-o flacara.
Corectia interferentelor spectrale se poate face prin:
- utilizarea unei lampi de deuteriu Tn locul celei cu catod
scobit
- aplicarea efectului Zeeman: Tn cazul unui
spectrofotometru AAS cu cuptor de grafit corectia se face
prin efect Zeeman care consta Tn aplicarea unui camp
magnetic cu intensitatea de aproximativ 1 Tesla [Joule /
(A x m2)] unei surse luminoase cand se produce o
scindare a acesteia Tn mai multe componente polarizate
(figura 1.5.5).
E,
In absenta campului magnetic
C 71
In prezenta campului magnelic
O
Figura 1.5,5, Corectie prin efect Zseman iiorraal
- Tn cazul flacarii: anumiti compu§i formeaza Tn timpu! vaporizarii
compu§i refractari a caror cinetica de vaporizare §i
descompunere devine foarte lenta. De exemplu:
3
3Ca2++ + 2PC-4'' -> Ca3(PO4)2
Ca3(PO4)2 -> Ca2P2O7 + CaO
Compus refractar
Limitarea acestor fenomene se poate realiza cu agen|i de
complexare (EDTA, de exemplu) sau agenti de precipitare
(lantan).
- Tn cazul cuptorului de grafit - condensarea pe peretii
cuptorului poate fi limitata utilizand Tncalzirea transversala sau
prin adaugarea unui amestec de paladiu §i Mg(NOa)2 ce
favorizeaza volatilizarea §i calcinarea compusjlor.
1.5.6.2 Aplicatii
Specificitatea, sensibilitatea §i limita de detectie foarte
ridicate constituie doar cateva din atuurile utilizarii acestei
metode Tn analiza farmaceutica calitativa §i cantitativa.
Cateva exemple extrase din Farmacopeea Europeana:
- dozarea zincului din preparatele cu insulina sau din oxidul de
zinc crema
- dozarea cobaltului din vitamina B12
E,+ m = + 1 - dozarea mercurului din antisepticele organo-mercuriale
E! m = 0
- dozarea oligoelementelor
- dozarea calciului din preparatele cu calciu
- determinarile serice de calciu §i magneziu
- determinarea tiomersalului (0,002%) sub forma de mercur din
solutiile pentru lentile de contact

Radiatia centrala sufera o polarizare Tn plan (radiatia n)

si celelalte sunt polarizate circular (radiatii a).
Corectia interferentelor chimice se face Tn modul
urmator:

142
143

1.5.7. Spectrometria de emisie
atomicS
1.5.7.1 Spectrelede emisie
Cand un corp solid este Tncalzit pana la incandescenta,
emite radiatii sub forma unui spectru continuu, adica un spectru
uniform fara aparitie de linii Tntunecate sau luminoase. Pe de
alta parte, excitarea materialului Tn stare de vapori sau
gazoasa, Tn forma atomica sau moleculara, duce la aparitia
unor spectre sub forma de banda sau lineare Tn functie de
lungimea de unda specifica, caracteristica materiel respective.
Energia necesara excitarii emisiei de linii spectrale variaza de la
un element la altul si, desi Tn teorie exista posibilitatea detectarii
tuturor elementelor pe aceastS cale, metodele bazate pe emisia
atomica sunt de obicei limitate Tn practica la detectarea si
determinarea metalelor, metaloizilor si a unor nemetale ca de
exemplu siliconul.
Energia degajata de o flacara aer-gaz naturala, care
ajunge la o temperatura de aproximativ 1600 - 1800 °C, este
capabila sa excite un numar foarte limitat de elemente pana la
nivelul Tn care sa apara fenomenul de emisie. La temperaturi
mai Tnalte, Tn flacara de oxigen - acetilena, (T = 3050 °C) fi Tn
arc electric direct (T = 4000 - 8000 °C ), numarul elementelor
care pot fi detectate create rapid pe masura cre§terii
temperaturii, astfel Tncat, Tn timp ce Tn oxiacetilena sunt numai
30 - 40 elemente care emit, Tn arcul electric se pot detecta mai
mult de 70 de elemente.
Probele sub forma de aerosoli sunt introduse Tn flacara
sau Tn plasma in scopul atomizarii si excitSrii atomilor liberi.
Intensitatea luminii emise de atomi la revenirea Tn stare
fundamentals permite cuantificarea probei prin doua tehnici mai
frecvent exploatate:
- spectrometria de emisie atomica Tn flacara sau fotometria de
flacara (flamfotometria) (FAES)
144
- spectrometria de emisie atomica Tn plasma cuplata inductiv
sau indusa prin frecventa Tnalta (ICP-AES)
1.5,7.2 Spectrometria de emisie in flacara
(flamfotometria)
Spectrometria de emisie Tn flacara reprezinta masurarea
intensitatji luminii emise cu o anumita lungime de unda de catre
atomii excitati termic Tn flacara. Excitarea termica a atomilor
metalici dintr-o proba este mai u§or de reprodus §i mai u§or de
controlat, Tn scopuri cantitative, atunci cand se face prin
intermediul flacarii decat prin intermediul descarcarii electrice.
Sensibilitatea primei metode este mai scazuta totu§i, din cauza
ca intensitatea emisiei atomice depinde de numarul de atomi
excitati termic, care depind Tn mare masura de temperatura.
Sensibilitatea spectrometriei Tn flacara Tn raport cu
diferitele elemente chimice depinde de diferenta de energie
(AE) dintre starea normala §i starea excitata. Tn general
elementele cu eel mai mic AE sunt cele mai usor excitabile la
flacara sj dau eel mai mare numar de atomi excitati termic fata
de elementele cu valori mai mari ale AE. In practica, numai
metalele alcaline §i alcalino-pamantoase care au AE mai mic
decat 3 eV (calciu, sodiu, potasiu, litiu §i bariu) produc un
numar suficient de atomi excitati termic la temperatura flacarii
de gaz-aer natural. Fotometrele de flacara, proiectate sa
masoare numai metalele alcaline sau alcalino-pamantoase,
folosesc o flacara cu temperatura relativ mica (de exemplu gaz-
aer natural sau aer-acetilena la 2300 °C) §i, ca urmare, sunt
emise numai liniile principale. Linia principala a elementului de
analizat este izolata prin intermediul unui filtru iar intensitatea
acesteia se masoara cu o fotocetula.
Elementele mai greu de excitat (cobalt, cupru, fier,
magneziu, mangan) pot fi excitate termic la intensitate
suficienta daca temperaturile sunt mai Tnalte §i sunt date de
flacara oxigen-acetilena sau flacara acetilena-NzO (3000 °C).
Pentru izolarea lungimii de unda dorite se va folosi o prisma
monocromatoare sau o re\ea Tn locul filtrului de culoare simplu,
iar intensitatea se va masura cu un tub fotomultiplicator Tn loc
de fotocelula simpla. Totu§i, aceste elemente se pot evalua cu
145
 mai multa acuratete, precizie, sensibilitate §i selectivitate prin
SAA care reprezinta metoda spectrometrica cea mai buna
pentru cele mai multe elemente metalice (altele decat metalele
alcaline §i alcalino-pamantoase).
?n evaluarea unui element pot sa apara interferente
atunci cand fn proba sunt prezente si alte substante. Aceste
interferente pot fi clasificate dupa cum urmeaza:
Interferente cationice
Aparatele cu filtre dau rezolufii adecvate ale principalelor
linii ale sodiului (589 nm), potasiului (767 nm) si litiului (671 nm)
si permit evaluarea fiecarui element fara ca acestea sa
interfereze unele cu celelalte. Totusi cand Tntr-o proba este
prezent atat calciul cat si sodiul avem de-a face cu fenomenul
interferentei ca rezultat al lungimilor de unda apropiate. Calciul
se poate combina cu produsele de combustie ale gazelor de
flacara si poate forma hidroxid de calciu care da o emisie
moleculara sub forma unei benzi mai largi, centrata la 554 nm.
Unele dintre aceste emisii se pot transmite printr-un filtru de
sodiu cu banda larga §i pot da citiri false, cu valori man pentru
sodiu. Apare si fenomenul invers, emisia de la 589 nm datorata
unor concentratii rnari de sodiu poate sa interfereze dozarea
calciului din proba atunci cand masurarea calciului se face la
lungimea de unda principala de la 626 nm, dar nu interfereaza
cand dozarea calciului se face la lungimea de unda
corespunzatoare emisiei slabe a calciului de la 423 nm.
Valoarea fiecarei interferente depinde de concentratia relativa
Tn metal si de latimea benzii filtrelor. Interferentele cationice
sunt eliminate prin folosirea unui monocromator eficient m locul
filtrelor.
Interferente anionice
Anionii nu emit lumina, dar unii anioni, mai ales cei
polivalenti, provoaca o scadere a emisiei unor cationi prin
formarea Tn flacara' a unor saruri mai putin volatile. De exemplu,
o solutie de calciu (10 pg ml"1 ) care contine sulfati sau fosfati
(10 ug ml"1) emite mai putin intens decat o solutie care contine
cloruri. Aceasta se datoreaza formarii de sulfat de calciu sau
fosfat de calciu mai putin volatil, care da mai putini atom! de
calciu liberi excitati decat o solutie echimolara de clorura de
calciu. Aceasta problema se poate evita prin adaugarea unei
146
cantitati mai mari de agent de emisie ca, de exemplu, clorura
de lantan, care elibereaza calciu prin complexarea competitive
a lantanului cu fosfat. Se poate folosi §i un agent de chelatare,
ca de exemplu EDTA, care complexeaza preferential calciul si
Tndeparteaza interferenta. Lipsa interferen|ei din cloruri permits
folosirea acidului clorhidric la o concentratie de pana la 1 mol I"1
ca si mediu de dizolvare.
Interferente fizice
Pentru a asigura rezultate clare si reproductibile, solutiile
standard trebuie aspirate Tn flacara cu aceeasi intensitate §i
trebuie sa dea picaturi cu marimi identice Tn camera de
nebulizare. Substantele care modifica proprietatile fizice ale
probei pot afecta intensitatea debitului sau marimea picaturilor
si pot duce .la rezultate eronate. De exemplu, substante ca
zaharurile, care cresc vascozitatea solutiei, reduc intensitatea
debitului si scad emisia elementelor. De asemenea, alcoolul Tn
concentratii mari duce la cre§terea emisiei. Acest lucru are loc
din cauza ca tensiunea superficiala scazuta a solutiei produce
picaturi de marimi mai mici si, ca atare, acestea au o eficienta
mai mare Tn excitarea termica a atomilor Tn flacara. Aceste
efecte sunt minimalizate prin pregatirea unor solutii standard
care sa contina aceea§i concentratie a interferentului ca si
solutia proba sau prin folosirea metodei adausului standard.
Schema unui spectrometru de emisie este redata Tn
figura 1.5.6.
Sistem dispereiv Detector
Sursa 1 80-800 nm | >
— >• ionizaretexcitare
Figure 1.5.6. Schema de principiu a unui spectromefaru de eraisie
atomica
147

1.5.7.3 Spectrometria de emlsie in plasma
Plasma este un mediu particular considerat ca a patra
stare a materiel, constituita din atomi izolati, Tn stare de
echilibru Tntre forma lor neutra si forma ionizata (1-2%) si
electroni (1018/cm3) care asigura neutralitatea acesteia.
Torta de plasma este un dispozitiv utilizat frecvent pentru
ca permite tratarea probelor Tn solutie apoasa. Comparativ cu
flacara din fotometria in flacara torta poate atinge temperaturi
de 8000 K (figura 1.5.7). Exista mai multe tipuri de plasma:
- plasma Tn curent continuu sau plasma de arc
obtinuta prin descarcari electrice Tntre doi electrozi
- plasma de microunde
- plasma indusa prin frecvente Tnalte sau plasma
cuplata inductiv
Zona analitica
O-«— Generator de radtofrecventa
O realiza utilizand tehnica ICP-AES. ICP-MS se utilizeaza Tn cazul
Zona de pre/ncalzire
Argon
Aerosol proba
Circuit de ratine
Figure. 1.5.7. Sacfsune f« torta de plasma
Aceasta tehnica se aplica la numeroase elemente si
prezinta avantajul de a fi mai rapida decat AAS. Pentru selectia
radiatiilor emise se pot utiliza:
148
» filtre optice
- filtre colorate (rezolutia = 60-100 nm)
- filtre interferentiale (rezolutia = 1-10 nm)
• monocromatoare
- prisme
- re^ele optice
Pentru detectia radiatiilor se utilizeaza:
- celule fotoelectrice
-fotomultiplicatoare
1.5.7.4 Aplicatii
Flamfotometria i§i gase§te largi aplicatii Tn domeniul
biologiei clinice - determinarea concentratiilor plasmatice §i
urinare ale sodiului, potasiului, litiului - dar §i Tn dozarea unor
elemente din preparate farmaceutice, ca de exemplu:
- determinarea sodiului si potasiului din solutiile de
dializa
- determinarea calciului din clorura de magneziu
pentru dializa (Farmacopeea Britanica)
ICP-AES §i ICP-MS sunt tehnici utilizate pentru dozarea
simultana a mai multor elemente. ICP-AES este o metoda mult
mai rapida decat absorbtia atomica sj se adreseaza Tn special
analizelor de rutina. Analiza borului sau arsenului se poate
Tn care probele au concentratii de ordinul ppb sau |ag/kg. O
aplica^ie a acestei metode consta Tn determinarea aluminiului
din apa pentru hemodializa.
149

JRARCE ft
2.1. ISTORSC
Datorita Tnaltei lor eficiente, metodele cromatografice
s-au impus pe scara foarte larga ca metode de separare si
analiza, atat Tn cercetare cat si Tn productie.
Ca metoda de separare, cromatografia se Tncadreaza Tn
grupul de procedee bazate pe migrarea diferentiatS a
componenfilor din amestecul de studiat mtre doua faze.
Pozitia privilegiata a cromatografiei se datoreaza faptului
ca la baza migrarii se gaseste o repetare a echilibrului de
repartitie mtre doua faze, o faza stationara si una mobila, care
pentru un singur proces se poate realiza extrem de rapid, deci
de foarte multe ori mtr-un interval de timp scurt.
Cromatografia de lichide (faza stationara - solida, faza
mobila - lichida) a cunoscut Tn timp o dezvoltare accentuata
datorita diversita'tii tipurilor de faze stationare, din ce Tn ce mai
specifice, tipurilor de detectori, caracteristicilor coloanelor
cromatografice, sistemelor cromatografice din ce Tn ce mai
performante, etc.
Primele Tncercari de separare s-au facut Tn domeniul
colorantilor vegetal! pe o coloana de alumina. Ele apartin lui
Tvet si au fost initiate in 1906. Tvet a elaborat o teorie pur
caJitativa si tehnica a numit-o cromatografie. In anul 1938
Reichstein si van Euw introduc conceptul de elutie
cromatografica.
Pasul hotarator a fost facut de Martin §i Synge Tn anul
1941, bazandu-se pe fenomenul deja cunoscut, ca Tn cazul
aminoacizilor, coeficientul de repartitie apa-solvent organic
nemiscibil cu apa are valori distincte pentru fiecare aminoacid
Tn parte. Ei au Tncercat separarea aminoacizilor folosind o
coloana umpluta cu silicagel saturat cu apa, iar ca faza mobila
cloroform amestecat cu adaosuri din ce Tn ce mai mari de alcool
150
n-butilic. In acest mod a luat na§tere cromatografia de repartitie
pe coloana.
Prin Tnlocuirea suportului de silicagel, respectiv a unei
coloane mchise, cu benzi de hartie, deci coloane deschise,
Consden, Gordon §i Martin pun bazele cromatografiei pe
hartie. Tehnica de lucru extrem de simpla, precum §i aparatura
accesibila a facut ca aceasta metoda sa se dezvolte §i sa se
aplice la separarea amestecurilor de substante organice §i
biologice §i ulterior la cele anorganice.
Cromatografia pe strat subtire este descrisa pentru prima
data de Izmailov §i Shraiber Tn 1938 si a fost standardizata §i
perfectionata de catre Stahl Tncepand cu anul 1956. Astazi
aceasta tehnica are o raspandire universal^, datorita costurilor
mici, vitezei mari de eluare si a unei bune rezolutii. In plus, Tn
anii 1980 s-a trecut mtr-o alta etapa de dezvoltare datorita
instrumentalizarii.
Cromatografia pe coloana Tn faza lichida sau
cromatografia de lichide s-a dezvoltat m timp gratie
perfectionarii detectorilor care au permis construirea unor
cromatografe de lichide performante. Cromatografia de lichide
de Tnalta performanta (High-performance liquid chromatography
- HPLC; 1968 - Giddings §i Kirkiand) presupune utilizarea
unor faze stationare cu particule foarte mici iar trecerea fazei
mobile este posibila doar daca aceasta este vehiculata sub
presiune. Rezultatul utilizarii particulelor foarte mici consta Tn
obtinerea unor separari excelente in timpi scurf/ de analiza.
In ceea ce priveste cromatografia Tn faza gazoasa
primele rezultate le-au obtinut Cremer si Prior (cromatografia
gaz-solid). A urmat apoi punerea bazelor cromatografiei gaz-
lichid de catre James §i Martin (1952) pentru ca Tn 1959 sa fie
introdusa cromatografia de gaze pe coloane capilare (Golay).
Tehnicile cromatografice au cunoscut diversificari
continue iar dezvoltarea cromatografiei cu fluide Tn stare
supercritica sj a electroforezei capilare completeaza acest
domeniu a! analizei instrumentale.
151
 2.2. ClASIFICAREA METODELOR
CROMATOGRAFICE 2.3. CROMATOGRAFIA PE COLOANA
Exista numeroase modalitati de clasificare a metodelor
cromatografice, ceea ce Tnseamna probabil ca nici una dintre 2.3.1. Aspecte generale
ele nu este satisfacatoare:
1. Clasificarea in functie de fenomenele fizico-chimice care stau 2.3.1.1 Procesul cromatografic
la baza separarii:
a. Cromatografia de repartitie Cromatografia este un proces Tn care amestecul proba
b. Cromatografia de adsorbtie este distribuit Tntre doua faze. Una dintre faze este stationara,
c. Cromatografia de schimb ionic Tn tirnp ce cealalta traverseaza patul Cromatografie. Faza
d. Cromatografia de excluziune stationara poate fi un solid, un material poros, o suprafata
e. Cromatografia cu formare de perechi de ioni activa sub forma unor particule mici sau un suport solid acoperit
f. Cromatografia de afinitate cu un film de lichid. Faza mobila este un gaz sau un lichid.
Daca faza mobila este un gaz, procesul se numes,te
2. Clasificarea Tn functie de starea fizica a celor doua faze: Cromatografie de gaze CG (Gas Chromatography, GC), iar
daca este un lichid, procesul include toate tipurile de
f^zastattonara Faza mobila Cromatografie de lichide, inclusiv Cromatografia planara.
Cromatografia gaz-lichid lien id az
Cromatografia gaz-solid solid A. Cromatoqrafie lineara si neiiniara
az
Cromatografia lichid-lichid jichid lichid
Cromatografia lichid-solid solid Daca se aplica solut,ia unui amestec de n componente
lichid
pe o coloana §i se developeaza cu un eluent adecvat, dupa
3. Clasificarea Tn functie de natura fazei mobile: Tncheierea separarii vor exista de-a lungul coloanei n zone,
a. Cromatografie lichida fiecare continand cate unul din componente. Compusii care tind
b. Cromatografie gazoasa sa ramana Tn faza mobila vor rnigra mai repede, deci se vor afla
c. Cromatografie Tn faza supercritica spre capatui de ie§ire fata de cei care au afinitate pentru faza
stationara.
4. Clasificarea Tn functie de modalitatea de imobilizare a fazei Afinitatea unui component X din amestecul de separat
stationare: pentru una din faze poate fi exprimata prin coeficientul de
a. Cromatografia pe coloana distribute K:
b. Cromatografia planara
is
Tratarea metodelor cromatografice se va face Tn principal C
tinand cont de ultima clasificare, Tntr-o abordare coroborata cu M
celelalte principii de clasificare, accentuand metodele cu
aplicabilitate curenta In controlul medicamentelor.
152
153
 unde GS este concentratia sau activitatea componentului X Tn
faza stationara si CM este concentratia sau activitatea lui X Tn
faza mobila.
Cromatografia este considerata lineara cand raportul
CS/CM sau Q/CM este constant, unde cs, concentratia substantei
Tn faza stationara, CM, concentratia Tn faza mobila, Q, cantitatea
de de substanja Tn faza stationara pe unitatea de suprafata.
Daca acest raport nu este constant vorbim de o cromatografie
neliniara.
Preferinta pentru una din faze mai poate fi exprimata prin
factorul de capacitate sau factoru! de retentie /c'(notat §i k):
"M
unde /?s este numarul de moli de component X Tn faza
stationara far HM este numarul de moli de Xm faza mobila.
B, Termodinamica procesului cromatografie
Fazele stationara si mobila trebuie sa fie Tn contact intim
una cu cealalta pentru a permite stabilirea unei balante de
echilibru. Relatiile din termodinamica se aplica echilibrelor de
distribute definite Tn cromatografie. Coeficientul de distributie K
este o constanta de echilibru si cunoscand temperatura la care
se efectueaza procesul cromatografic, se poate deduce variatia
energiei libere standard AG°:
AG° =-RTInK
Daca Tn CG se determine K pentru doua temperaturi, este
posibila calcularea (Tn acceptiunea ca entalpia si entropia
raman neschimbate) variatiilor de entalpie standard AH° si de
entropie standard AS0:
AG°=AH°-TAS°
154
Valorile celor 3 parametri sunt negativi, Tn acord cu
spontaneitatea transformarii. Se deduce ca entropia scade
cand compusii parasesc faza mobila pentru a se fixa Tn faza
stationara.
Ecuatia van't Hoff permite, Tntre altele, o aproximare
destul de riguroasa a efectuiui temperaturii asupra timpilor de
retentie a unui compus:
dlnK AH
dT
Este de retinut faptul ca Tn toate studiile complete
efectuate prin metode cromatografice se face apel la
cunosjintele de termodinamica clasica.
C. Separarea cromatografica si largirea zoneior
Componentele supuse procesului cromatografic trebuie
sa aiba coeficienti de distributie diferiti §i factori de capacitate,
de asemenea, diferiti pentru a putea fi separati. Se presupune
ca un amestec de trei componenti notati «, A §i • se aplica pe
o coloana (fig.2.3.1a). Componentul • are afinitate pentru faza
stationara iar componentele • §i A, pentru faza mobila, initial
stabilindu-se echilibrui reprezentat Tn figura 2.3. 1b. O noua
portiune de eluent determina stabilirea unui nou echilibru
(fig.2.3.1c), Tn acord cu coeficientii lor de distributie (unele
molecule initial adsorbite de faza stationara, tree Tn faza mobila
iar locul lor este luat de alte molecule neadsorbite initial).
Procesul se repeta de un numar mare de ori asa meat Tn final
cei trei componenti sunt separati (fig.2.3.1d). Componentii A si
• cu afinitate pentru faza mobila migreaza mult mai repede
decat cornponentul ® care tinde sa ramana Tn faza stationara.
Asa cum se vede Tn figura 2.3.1, echilibrui se stabileste
pe o anumita lungime a coloanei. Aceasta distanta corespunde
unui taler (platou) teoretic. Cu cat o coloana cromatografica
este mai mare, aceasta contine mai multe talere teoretice si
deci permite o separare mai buna a amestecului.
155
 celelalte, gasind un spatiu liniar de migrare printre particulele
fazei stationare, alte molecule sunt Tntarziate, avand o
traiectorie ondulata".

Figura 2.3.1. Reprezentarea procesuiui de separare

cromatografica

Tn conditiiie unei cromatografii ideale, echilibrul se Figura 2.3.2. Difuzia turbulenta intr-o coloana cromatografica
stabileste pe o lungime a coloanei infinit de mica dx numita §i
maltime echivalenta a unui taler teoretic H:
Faza mobila traverseaza Tntr-un flux laminar faza stationara
(fig,2.3.3). Viteza fazei mobile Tn centrul canalelor de curgere
H = dx
este mai mare decat Tn vecinatatea particulelor.
Tn practica este imposibil de realizat o astfel de coloana
si vorbim de fapt de o cromatografie neideala. Vector! viteza

Separarea cromatografica este partial afectata de

largirea benzilor de elutie. Zonele cu substante separate devin Particulele fazei
Faza mobila
mai largi cu cre§terea distantei de-a lungul coloanei §i a sta|ionare
timpului de retentie.
Cauzele ce determina largirea benzilor cromatografice
sunt numeroase. Printre cele mai importante motive se numara
difuzia turbulenta, variatia debitului eluentului, difuzia
moleculara Tn faza mobila §i transferul de masa Tntre faza
mobila, faza "mobila stagnant^" §i faza stationara. Figura 2.3.3. Distributia fluxului eluentului Tntr-un pat
cromatografie
Difuzia turbulenta (Eddy), reprezentata Tn figura 2.3.2, se
refera la faptul ca unele molecule Tnainteaza mai repede decat
156 157
 Difuzia turbulenta §i distributia fluxului pot fi reduse
folosind particule de marimi egale. O prima conditie pentru un
proces cromatografic bun presupune ca umplutura coloanei sa
fie formata din particule cu o distribute a marimilor cat mai mica
posibil, raportu! dintre diametrele particulelor sa nu fie mai mare
de 2, valoarea 1,5 fiind cea mai buna. Largirea benzilor
datorata difuziei turbulente si distributiei fluxului este afectata
Tntr-o mica masura si de viteza fazei mobile.
Moleculele probei se deplaseaza Tn solvent si fara o
influenta externa, fenomenul numindu-se difuzie. Acest efect
este important Tn cromatografia de gaze §i poate fi ignorat Tn
cromatografia de lichide, mai ales cand diametrul particulelor
implicate este mai mic decat 30 (am. Difuzia longitudinala are un
efect negativ daca particulele fazei stationare sunt mici (<10
(j.m), se lucreaza la viteze mici ale fazei mobile iar coeficientii
de difuzie ai componentelor sunt mari. In concluzie, o a dot/a
conditie pentru un proces cromatografic bun presupune
alegerea unei viteze a fazei mobile a§a meat difuzia
longitudinala sa aiba un efect minim. Acest lucru se mtampla
cand:
u >2Am/dp
unde u este viteza liniara a fazei mobile, Am coeficientul de
difuzie a probei Tn faza mobila si dp diametrul particulei.
Figura 2.3.4 prezinta diverse forme ale particulelor fazei
stationare ce pot avea structura sferica, regulata, sau
neregulata.
Figura 2.3.4 Forme ale particulelor fazei stationare
158
Porii acestor particule sunt umpluti cu faza mobila stagnanta
(figura 2.3.2). O molecula ce patrunde Tn por Tsi va schimba
pozitia numai pe baza difuziei. Exista doua posibilitafl:
• Molecula difuzeaza Tnapoi Tn faza mobila. Acest proces
necesita timp iar molecuiele care nu au fost retinute de pori
se mi§ca mai repede. Largirea benzilor rezultata este mica
daca porii sunt scurti sau daca particulele fazei stationare
sunt mici. In plus, viteza difuziei moleculelor probei Tn solvent
este mai mica Tn conditii de vascozitate scazuta (molecuiele
difuzeaza rapid atat Tn interiorul cat §i Tn afara porilor).
• Molecula interactioneaza cu faza stationara (adsorbant sau
film de lichid) §i este adsorbita; ramane blocata Tn faza
stationara iar apoi este eliberata, acest transfer de masa
necesitand o anumita perioadS de timp.
In ambele cazuri largirea benzii cre§te cu cresterea
vitezei fazei mobile: cu cat fluxul de solvent este mai rapid,
molecuiele probei ramase Tn solventul mobil migreaza mai
repede fat,a de molecuiele stagnante.
Pot fi mentionate alte trei conditii ce trebuie respectate
Tntr-o analiza cromatografica:
« faza stationara sa fie formata din particule mici sau sa fie o
suprafata poroasa subtire;
« sa se foloseasca solvent! cu vascozitate mica;
« o viteza mare de analiza afecteaza rezolutia dar acest efect
este putin pronuntat daca se lucreaza cu particule mai mici
ale fazei stationare.
D. Principaiele teorii care explica largirea picurilor
D. t.Teoria Wilson (1940)
Elaborate pentru a se aplica cromatografiei de adsorbtie,
aceasta teorie care exprima conservarea materiei Tn cazul unei
cromatografii ideale, s-a generalizat s.i se aplica Tn special
cromatografiei de repartitie.
Teoria demonstreaza ca:
• pentru o cromatografie ideala §i lineara, migrarea pe
coloana se produce fara largirea picului
159
 • pentru o cromatografie ideala §i neliniara migrarea este
Tnsotita de largirea §i deformarea zonei cu substanta de
analizat
La ie§irea din coloana picul este mai larg si mai deformat
ca la Tnceputul procesului (figura 2.3.5).
- acelasi volum de faza stationara dVs
- acelasi volum de faza mobila dV
aceasta inseamna ca:
- exista un schimb de materie orizontal Tntre cele doua
faze, stationara si mobila, pana ce se verifica conditia de
echilibru
Cs / CM = K

- nu exista schimb vertical (difuziunea longitudinala este

neglijabila)

Faza staj. S Faza mob. M

dVs —> dV
: H

Figura 2.3.5. Deformarea picurilor in tirnpul migrarii unsl

substanfe in coloana N-1

Fenomenul este legal de difuzia longitudinals a

componentilor amestecului din coloana.

D. 2. Teoria talerelor
Fsgura ?,3..o, Teoria falersloir
Aceasta teorie a fost elaborate de Martin §i Synge Tn Teoria talerelor se aplicS unei elutii realizate Tn maniera
1941 pentru interpretarea cromatografiei de repartitie lichid- discontinua adica faza mobila eluanta se introduce Tn fractiuni
lichid si apoi dezvoltata si aplicata si Tn cazul cromatografiei succesive egale si de volume dV mici, corespunzatoare
gaz-lichid.
volumului de faza mobila a fiecarui taler teoretic.
Se aplica unei cromatografii lineare si fenomenele de
difuziune longitudinala sunt neglijate.
Daca se considera o coloana ca fiind alcatuita din N
talere teoretice (figura 2.3.6):
- cu aceea§i Tnaltime H
160 161
 c=A.J<_.dI
2
[s]
LJ
n 1 + K Ds
Van Deemter a stabilit o relatie Tntre maltimea unui ^aler
teoretic H, in cm, si viteza liniara medie a fazei gazoase u, Tn unde
1
cm s" : K - coeficientui de repartitie al solutului
Ds - coeficientui de difuziune al solutului Tn faza
staflonara
H = A+-l+Cu
u
A, B, C sunt constante pentru o coioana, un analit si conditii
experimentale date:

• A - tine seama de faptul c& nu toate moleculele solutului

parcurg acelasi drum Tn coioana Minimum
H

A = 2 X dp [cm'1]
unde
^ - un numar farS dimensiuni care exprima
neregularitatile suportului
dp - diametrul mediu al particulelor suportului, Tn cm
u optima

Figura 2.3.7. Curba van Deemter (curfoa H / u):

• B - este un termen legat de difuziunea moleculara
longitudinala
B = 2 y D [cm2 s'1]
unde
y - termen de corectie fara dimensiuni care ia tn
considerare spatiul Tntre particulele suportului
D - coeficientui de difuzie al solutului
1. Componenta difuziei turbulente §i a distributiei fluxului.
2. Componenta difuziei longitudinale. Rata fluxului la care difuzia devine un
factor fara importanta se folose§te curent Tn cromatografia de lichide.
3. Componenta transferului de masS. Panta dreptei este mai mare pentru
particule de 50 jam decat pentru cele cu diametru de 5 urn.
4. Curba rezultanta van Deemter H / u.
Curba H = f( u ) este o hiperbola (figura 2.3,7) care are
ca asimptote dreptele:

• C - corespunde rezistenfei transferului de masa, lipsei H= A + C - u

de echilibru Tntre cefe doua faze datorat cineticii
transferului de la o faza la alta, procese ce nu sunt daca u -^ oo, H-»A
spontane
daca u->0,

162 163
 Curba trece printr-un minim ceea ce Tnseamna ca exista
o viteza medie optima u pentru care H este minima §i numarul B - termen de difuziune longitudinals, cmV
talerelor teoretice N este maxim, conditii necesare pentru o B = 2 a D, 2<B<4
eficacitate optima a separarii solutului: cu a, factor de proportionalitate, D, coeficient de
difuziune
dH . Cm, Cs, rezistenta la transferul de masa Tn faza mobila si,
du respectiv, stationara; Cs scade daca diametrui
particulelor, variaza Tntre 0,02 si 0,2 ajungand la valori
sau de 1 Tn cazu! schimbatorilor de ioni.
Spre deosebire de cromatografia Tn fazS gazoasa, Tn
cazui cromatografiei de lichide este posi'oiia cre§terea vitezei
-2 fazei mobile fara diminuarea eficacitatji.
u

Uoptim = - 2,3.1,2 Cfomatograma §i importanta ei

H • • -A_L DV
^ ^VB
Componentii separati sunt transportati de faza mobila Tn
"minim - A + —-===- + —-_ = A. + 2VBC
/
detector, acesta Tnregistreaza specific semnaiul dat de fiecare
component si cu ajutorul unui mregistrator, semnaiul primit de
daca la detector va apare sub forma unei curbe gaussiene (figure
2.3.8), Semnalele sunt cunoscute sub numeie de picuri iar
B / u este semnificativ
U optim totalitatea lor se numeste cromatograma.
B / u este neglijabi! Picurile dau informat,ii calitative si cantitative asupra
In cazul coloanelor capiiare, cu diametru foarte mic, A = amestecului de anaiizat.
0.

F. Teoria cinetjca a&llcat& ~m crpmatografia fn faz§

!if>hi«-i«

In cazul cromatografiei
rae Tnn faza
aza lichida ecuatia Van
Van
ter este Tnlocuita cu o ecu
Deemter ecuatie foarte asemanatoare,
ecuatia lluii Knox:

+Cs)u

unde
A - coeficient ce caracterizeaza neregularitatea
umpiuturii, (cm2s)1/3
164 165
 Calitativ: timpul de retentie a componentului este
Tntotdeauna constant Tn conditii cromatografice identice. Timpul
de retentie este perioada de timp de la injectarea probei si
momentul Tn care se Tnregistreaza maximul picului.
Dimensiunile coloanei, tipul fazei stationare si compozitia
acesteia, viteza eluentului, marimea probei si temperatura
reprezinta conditiile cromatografice. Deci, un pic poate fi
identificat injectand Tn acelea§i conditii substanta standard si
comparand timpul de retentie din cromatograma standard cu
eel din cromatograma proba.
Cantitaffv: aria picului (Tnaltimea) este direct
proportionals cu cantitatea de component injectat. Se folosesc
curbe de calibrare arie = f(concentratie), trasate cu ajutorul unor
serii de solutii etalon de concentratii foarte bine cunoscute.
A. Timpul de retentie
volume de retentie.
Figura 2., 9, Cromatogratna f i caracterisfieite ei
Cromatograma este caracterizata prin urmatoarele
marimi de retentie (figura 2.3.9):
166
• to - timp mort; timpul necesar trecerii fazei mobile prin
coloana; daca u este viteza acesteia, Tn cm/s, L,
lungimea coloanei, Tn cm, atunci
L(cm)_
to(cm/s)
t,R - timp brut de retentie §i este timpul scurs de la
introducerea probei Tn coloana §i momentul atingerii
concentratiei maxime Tn detector
t'R - timp de retentie corectat sau timp de retentie net
• Vo - semilatimea picului la TnSltimea punctelor de
inflexiune (60% din Tnaltime)
« w - latimea picului pe linia de baza,
w=4a
unde a este deviatia standard a picului gaussian
• WQ.S - latimea la jumatatea Tnaltimii picului cromatografic
w = 2,354 Vo
Cromatografierea mai poate fi caracterizata §i prin
Daca:
• D este debitul fazei mobile
• Vs, volumul fazei stationare Tn coloana
« K, coeficientul de repartitie
167
 atunci se definesc:
este prea scazuta, nivelul separarii este necorespunzator
(componentul traverseaza prea rapid coloana, nu
• VM - volumul mort; pentru D constant, este dat de interactioneaza cu faza stationara si, de aici, rezulta
expresia
imposibilitatea separarii cromatografice). Valori Tnaite ale lui k
Tnseamna timpi de analiza lungi.
VM = IM D k' depinde de coeficientu! de distribute K Tntre cele doua
faze a componentului de interes:
« VR - volumul necesar pentru eluarea solutilor la
concentratiile maxime dupa introducerea in coloana; se
mai numeste volum de retentie brut si, pentru D k' = K
V,M
constant, este:
unde Vs este volumul fazei stat/ionare §i VM este volumul fazei
mobile Tn coloana.
In acelasi timp: Factorul de capacitate k' este direct proportional cu
volumul ocupat de faza stationara si, mai corect, cu aria
suprafetei (m2g~1) In cazul adsorbantilor. O coloana cu
; VR = VM + K Vs umplutura formats din particule sferice cu suprafete poroase
determine valori k' scazute §i, de aici, timpi de analiza scurtj,
"R - volum de retentie redus fata de coloanele ce contin particule Tn totalitate poroase,
ot^-

celelalte conditii cromatografice ramanand constante. Silicea

(silicagel) cu pori Tngu§ti determine valori k' man, comparativ cu
V'R = t'R D
un material avand pori largi.
si, deci, V'R = VR - VM
C. Factor de separare
Timpii §i volumele de retentie brute §i reduse sunt Doi component! dintr-un amestec pot fi separati daca au
caracteristice unui solut pentru o coloana si faza mobila date. valori k' diferite. Aceasta diferenta se exprima prin retentia
relativa a, cunoscuta §i sub numele de factor de separare sau
B. Factory! de capacitate k' (sau k)
selectivitate:
Este definit ca:
a - l'R2 _ tR2 ~ tp =
k
'_2 _ 2_
K

*'RI *R1 ~ 4o k
'i ^1

cu k'z » k'i. Daca a =1, nu are loc separarea.

Daca se Sucreaza cu volume de retentie §i D este debitui
k' este independent de lungimea coloanei, viteza fazei mobile constant al fazei mobile:
(cu conditia ca u sa nu depaseasca valoarea de 5 cm s"1) si
reprezinta raportul molar al componentului Tn faza stationara §i Dt R2 -Dt Q = V R 2 -%
mobila. Se prefera valori ale lui k intre 1 si 5. Daca valoarea k ' DtR1 - Dt0 VR1 - VM
168 169
 = 0,8
dar

VR2 = VM + K2 Vs
VRI = VM + K! Vs
Av R =1

deci
K1

Factorul de separare este o masura a capacitatii R • 1,25

sistemului cromatografic de a separa doi component!, mai bine
spus o ma'surS a selectivitatii. Valoarea ei depinde de alegerea
fazei stationare si a fazei mobile §i nu depinde de parametrii
geometric! ai coloanei. Natura fazelor influenteaza separarea Figura 2.3.10. Rezolutia a doua picuri vecine
prin intermediul constantei termodinamice K.
Figura 2.3.10 prezinta forma cromatogramelor obtinute
D. RezoJutia pentru diferite valori ale rezolutiei R. Component nu sunt
complet separati la o rezolutie de 1, dar se observa clar ca
Rezolutia R reprezinta masura capacitatii efective de exista doi componenti. Tangentele in punctele de inflexiune se
separare a doua picuri vecine. Este definita ca raportul dintre afla Tn contact direct iar ariile picurilor se suprapun Tn proportie
diferenfa timpilor de retentie fa ale celor doua picuri si media de 2%. 0 rezolutie de 1,25 este suficienta pentru o analiza
aritmetica a latimii celor doua picuri w. cantitativa cu integrator. Rezolu^ii peste 1,5 necesita timpi de
analiza lungi si se justifica Tn cromatografia preparativa.
tR2
R= ~tR1
W
0.5,1 +W 0.5,2
E. NumaruS de talere teoretice
Cromatograma permite calcularea numarului talerelor
unde Wo.5 este latimea picului la jumatatea Tnal|imii.
teoretice N Tn coloana:

WQ.5

h-tR '

unde h este Tn§ltimea picului, A aria picului.

170 171

Toate ceie trei ecuatii sunt corecte numai Tn cazuf
picurilor gaussiene, Tn realitate cromatogramele fiind alcatuite
din picuri asimetrice. Valori aproximativ corecte sunt obtinute cu
ajutorul ecuatiei:
t
M =4 1 7 ( R / w o.i) 2
T + 1 .25
unde Wo.i este latimea picului la 10% din Tnaltime iar 7 este
asimetria picuiui (fig.2.3.11) definita ca:
Se poate dernonstra deci ca rezolutia R a doua picuri
depinde de retentia relativa a, de numarul de tatere teoretice N
si de factorui de capacitate k' conform relatiei:
R = (se!ectivitate)(eficienta)(re!entie)
unde:
172
Ultima expresie matematica a rezoiutiei arata ca din punct de
vedere teoretic, Tn dezvoltarea unei metode cromatografice,
Tmbunatatirea rezoiutiei se poate face modificand una din
variabile fara ca celelalte sa fie afectate.
F. Capacitatea de separare
Capacitatea de separare reprezinta numarul de soluti n
care pot fi separati pe o coioana Tn anumite conditii
experimentale. Este data de relatia:
n=
4R
unde
N - este numSrul de talere teoretice
R - rezolutia
k'i §i k'n - tactorii de capacitate ai primuiui §i, respectiv,
ultimului solut.
G. Influenta unor factor! asupra separariior
croma;
t-actorul de separare a este o masura a selectivitatii
cromatografice, VaSorile mari oglindesc interactiunea cu f'aza
mobiia si/sau faza stationara, tipurile de interactiuni fiind forte
de dispersie, interactiuni dipoi-dipol, legaturi de hidrogen,
interactiuni n - n, vaioarea pH-u!ui Tn cromatografia cu
schirnbator de ioni.
Numarul de talere teoretice A? caracterizeaza eficienta
coloanei. Numaru! de taiere teoretice cre§te cu gradul de
Tmpachetare a umpluturii coloanei, lungimea coloanei si
depinde de caracteristicile fazei mobile. O coioana cu un numar
mare de taiere poate separa arnestecuri Tn care componentele
au valori simiiare ale retentiei relative a. Daca a este mic, este
nevoie de un numar mare de talere teoretice (tabelul 2.3.1).
173

Tabelui 2.3.1. EfectuI numaruiui talerelor teoretice asupra
rezolutiei pentru diferite valori ale retentiei relative
Figura 2.3.12 ilustreaza efectul factorului de separare
(retentiei relative) si al numaruiui de talere asupra separarii a
doi component! Tnvecinati. Daca a este mare, se pot obtine
rezolutii satisfacatoare chiar daca N este mic (a). Daca a §\ N
au valori mari, rezolutia este buna, necesitand Tnsa timp lung de
analizS (b). Rezolutia scade foarte mult daca N este acelasi ca
§i in cazul (a) dar retentia relativa a este scazuta (c). O coloana
cu N mare si a scazuta garanteaza o rezolutie satisfacatoare si
un timp convenabil de analiza (d).
Figura 2.3.12. EfectuI retentiei relative §i al numaruiui
de talere feoretice asupra rezolufiei
174
Factorul de capacitate k' depinde numai de taria
eluentului, pentru un raport volumic constant Tntre faza mobila
si stationara. O faza mobila este puternica daca elueaza rapid
componentii §i este slaba daca procesul de elutie decurge lent.
A§a cum s-a amintit anterior, forma picurilor
cromatografice nu corespunde In realitate unei curbe gaussiene
(simetrice) (fig.2.3.13a). De cele mai multe ori picurile prezinta o
coada (fig.2.3.13b) sau portiunea ascendenta este mai putin
abrupta decat cea descendenta (fig.2.3.13c).
^-N.
a b e
Figura 2.3.13. Forma picuriSor cromatografice
Deviatiile mici de la forma gaussiana sunt
nesemnificative si sunt privite ca normale. In schimb, abaterile
mari indica faptul ca sistemul cromatografic ales nu este
corespunzator. Asimetria reduce numarul talerelor teoretice §i,
deci, rezolu|ia, de aceea este necesar ca factorii cauzatori ai
unei astfel de comportari sa fie eliminat,!.
Figura 2.3.14. Modificarea cromatogramei cu cre§terea marimii
probei: a) cate 2 mg injectate; fo) 2 |ig injectat© din fiecare
component
175
 Printre cauzele cele mai importante ale asimetriei H. Optimizarea rezolutiei
picurilorse numara:
• Tmpachetarea slaba a coloanei; Jinand cont de expresia rezolutiei R a doua picuri veclne
• valoarea mare a volumului mort; notate 1 §i 2:
• Tncarcarea coloanei;
• incompatibilitatea probei cu una sau ambele faze;
• capacitatea mare de adsorbtie a fazei stationare (Tn
cromatografia de adsorbtje).
O coloana nu este capabila sa separe orice cantitate de optimizarea rezolutiei se poate face prin:
substanta. Daca se injecteaza prea mult material, k' si latimea • cre§terea numarului de talere teoretice (folosirea unor
picului depind de marimea probei (figura 2.3.14). coloane rnai lungi, diminuarea Tnaltimii unui taler teoretic
prin modificarea marimii particulelor fazei stationare sau
(1/0/0) modificarea vitezei fazei mobile)
Solvent
acceptor de H" • cre§terea selectivity.
Selectivitatea optima poate fi obtinuta Tn cromatografia
de lichide dupa evaluarea cromatografierii probei folosind 7
faze mobile a caror compozitie este marcata Tn paranteze Tn
figura 2.3.15.
Considerable precedente sunt rezumare Tn schema
(0.5/0.5/0) urmatoare:
(0.5/0/0.5)
Selectivitate a

mica

(0/1/0) I
N mare N mic N mare

Solvent
donor de H* (0/0.5/0.5)
(0/0/1)

Solvent
I
separare buna
I
separare buna
I
separare buna
capabil de dar picuri late
interactiuni
dipol-dipol

176 177
 retentie corectat pentru substanja aleasa ca standard §i VR §i
2.3.1.3 Anallza calitativa §i cantitativa in t!R, ale componentului de identificat, atunci:
cromatografia pe coloana
r = VR/(V'R)S = t'R/(t'R)s

A. Anaiiza caiitativa r depinde de temperatura, faza stationara si faza mobila.

Identificarea se face prin compararea lui r Tntre compusii
Identificarea unui anumit component prezent Tntr-un etalon §i compu§ii probei de analizat.
amestec se poate face dupa cromatografiere prin mai multe
metode grupate in: Metode spectrale
• metode cromatografice;
Cromatograful de lichide poate fi Tn prezent cuplat cu
• metode spectrale.
toate tipurile de spectrometre: UV-VIS, IR cu transformata
Fourier, spectrometru de masa, spectrometru de rezonantS
Metode cromatografice
magnetica nucleara, etc.
Aceasta cuplare genereaza o cantitate enorma de date
Identificarea componentilor dupg marimile de retentie pe care analistul o poate utiliza Tn vederea identificarii
Prevede obligatoriu existenta substantelor etalon
(standarde) pentru compusii pe care dorim sa Ti identificam. compu§ilor separati (capitolul 1).
Metoda se bazeaza pe compararea parametrilor de retentie ai
standardului cu cei ai componentului de identificat. B. Anaiiza cantitativa
Reproductibilitatea timpilor de retentie joaca un rol Aplicabilitatea pe scara larga a cromatografiei Tn analiza
important Tn analiza calitativa la Identificarea componentilor. cantitativa se datoreaza prezentei ei Tn multe protocoale
Cea mai simpla metoda de identificare a unor component!
standard de dozare si a u§urintei cu care se realizeaza.
consta Tn compararea cromatogramei etaloanelor cu Analiza cantitativa se bazeaza pe corelatia care exista
cromatograma probei.
Tntre aria (Tnaltimea) picului §i concentratia componentului
Metoda adausului standard respectiv.
Metodele de determinare cantitativa constau Tn
Consta Tn compararea cromatogramei amestecului
necunoscut cu cromatogramele obtinute dupa ce s-au adaugat masurarea:
1. Ariei picului:
cantitSti cunoscute din componentul care se presupune ca este - metode manuale
prezent. Daca se observa cresterea ariei unuia dintre picuri, - metode electronice
atunci se confirma cu o anumita probabilitate existenta Tn
amestecul proba a componentului respectiv. 2. Concentrate! probei:
- metoda normarii ariilor
- calibrare cu standard extern
Metoda retentiei relative - metoda standardului intern
Retentia relativa r se defineste Tn functie de o substanta - metoda adausului standard
standard. Daca (V'R)S si (t'R)s sunt volumul, respectiv, timpul de

178 179
 B. 1. Determinarea ariei picului
Este important sa se stabileasca corect linia de baza,
Tnceputul §i sf&r§itul picului si numarul necesar de puncte luate
pentru integrare.
Metode.manuaje.de masurare a ariei picului:
• metoda produsului Tnaltimii cu latimea picului: aria picului
se calculeaza determina'nd Tnaltimea picului h §i latimea
lui masurata la jumatatea Tnaltimii Wi/a:
A = h • w-i/2
Se recomanda utilizarea acestei metode la picurile
simetrice. In cazul picurilor foarte ascutite este indicat sa
se masoare latimea lui la 1/4 sau chiar Ia1/10 din
Tnalfimea lui.
• metoda triunghiului: consta Tn trasarea tangentelor la pic
prin punctele de inflexiune iar masurarea lafimii picului la
baza Wb se face Tntre punctele de intersectie ale celor
doua tangente cu linia de zero. Daca Tnaltimea
triunghiului format de cele doua tangente cu linia de
baza este h, atunci:
A = h w b /2
Se recomanda aplicarea acestei metode Tn cazul
picurilor late cand h/w-i/2 = 1.
Metoda integrarii electronice:
• se utilizeaza un sistem de integrare cu achizitie de date,
estimarea ariei picului rea!izandu-se prin Tnsumarea
fa§iilor ce reprezinta aria semnal / timp de-a latul picului.
B. 2. Determinarea concentratiei probe!
Metoda normarii ariilgr
Metoda se aplica la determinarea concentratiei
procentuale a componentilor probei de analizat §i se utilizeaza
180
tn cazul Tn care toti component.! probei sunt separafi si
deteCt
doncentratia procentuala a componentu.ui i va fi data de
ecua^ia:
unde Ai, Aa, ..., An sunt ariile picurilor individuale sau Tnaltimile
respective.
In acest caz s-a presupus ca factorul de raspuns este
pentru fiecare component identic. Metoda este recomandata a fi
utilizata atunci cand sunt folositi detectori cu proprietate de
volum, cum ar fi detectorul de indice de refractie care da
raspunsuri similare pentru multi compu§i neTnrudi\i.
Ecuatia de mai sus se poate corecta cu ajutorul
factorului de raspuns:
aria(inaltimea) standard
concentratia standard
De unde:
n
c-, = A,f|/IAjfj /100%
J=1 )
Metoda normarii ariilor este frecvent utilizata la estimarea
cantitatilor relativ mici de impuritati sau compu§i de degradare
Tn proba de analizat.
Calibrare cu standard extern
Este o metoda generala pentru determinarea
concentratiei unui component din proba §i consta Tn elaborarea
unei drepte de calibrare folosind solutii standard ale
componentului. Pentru proba de concentrate necunoscuta,
dupa separarea si integrarea picului corespunzator, se ob|ine
181
 aria acestuia care va permite determinarea concentratiei cu
ajutorul curbei de calibrare.
O alta metodS pentru determinarea concentratiei consta
Tn utilizarea factorului de raspuns f al analitului de interes, numit
si factor de sensibilitate:
Cone, probei = Aria (Tnaltimea) picului componentului Tn proba / f
Daca f variaza cu concentratia, acesta se determina la nivelul
de concentrate asteptat Tn proba, folosind o solutie standard cu
concentratia corespunzatoare.
Metoda standardului intern
Consta Tn adaugarea unui compus numit standard intern
(SI) la proba de analizat. Standardul intern trebuie sa
Tndeplineasca urmatoarele conditii:
- sa fie bine separat de compusii de interes
- sa nu fie prezent Tn proba
- sa aiba un factor de retentie k similar cu al compusilor de
separat
- sa aiba puritate Tnalta
- sa fie stabil si sa nu reactioneze cu proba sau cu faza
mobila
- sa aiba un raspuns similar la detectie cu proba, pentru
concentratiile utilizate
Standardul intern este adaugat a§a meat sa realizeze o
concentrate fixa si cunoscuta Tn solutiile standard de calibrare
ale componentului de interes. Dupa obtinerea cromatogramelor
se va realiza curba de calibrare:
Metoda adausului standard
Se folose§te Tn cazul analizei de urme sau atunci cand
realizarea curbei de calibrare constituie o problema. Metoda
consta Tn adaugarea la proba initials a unor cantitafl cunoscute
din componentul a carui concentrate dorim sa o determinam.
Dupa efectuarea separarilor §i integrarea picurilor se va
construi un grafic pe baza caruia se poate determina
concentratia originala a componentului.
Din punct de vedere analitic se procedeaza astfel: pe
baza datelor experimentale se calculeaza dreapta cea mai
probabila:
yi = a + b x
unde yi reprezinta valorile ariilor picurilor pentru cantitatile
adaugate x. Se stabi!e§te apoi dreapta cafe trece prin origine §i
este paralela cu cea experimentala:
y2 = bx
b reprezinta panta celor doua drepte §i, respectiv, factorul de
raspuns f a componentului de determinat. Se pun conditiile:
de unde:
x0 = a/b = a/f = cone, originala

Aria componentului / Aria SI = f (cone, componentului / cone. SI)

i = f(Cc/CSl)

La solutia proba se adauga o cantitate de SI asa meat sa

se realizeze aceeasi concentrate de SI ca §i Tn solutiile
standard de calibrare. Dupa cromatografiere, se determina de
pe cromatograma raportul (Ac/Asi)x si apoi din curba de
calibrare, raportul CG/CSI §i cunoscand concentratia SI se
determina concentratia componentului de interes.
182 183
 sau K=
Ys
2.3.1.4 Principalele tipuri de separare
cromatografica
Fazele stationare si mobile sunt medii complexe cu forte
ionice mari §i eventual variabile Tn cursul aceleiasj determinari,
A. izoterme de distribotie de aceea K nu mai este constant pentru o temperatura data.
Daca se reprezinta grafic cs Tn functie de CM, curbele
obtinute, numite si izoterme, pot avea formele descrise Tn figura
Tn general, mecanismul care sta la baza procesului
cromatografic nu este unitar, fiind de obicei rezultatul actiunii 2.3.16:
a. izoterma liniara - for^a ionica nu variazS Tn cursul
mai multor fenomene fizico-chimice (adsorbtie, repaiiitie,
schimb ionic, etc.). experimentului iar K este constant
b. si c. izoterme neliniare - forta ionica variaza, K nu este
Dupa forma izotermei de distributie a procesului constant iar curbele obtinute sunt descrise de doua modele,
elementar care sta la baza separarii se disting, asa cum s-a
aratat si anterior: modelul Freundlich si, respectiv, modelul Langmuir
• cromatografia liniara; cs
cs
• cromatografia neliniara.
Izoterma de distributie este functia care descrie echilibrul b=1
existent Tntre proba sorbita (fixata) si nesorbita, la o
temperatura data, independent de mecanismul prin care s-a
produs fenomenul. Ea reflecta variatia concentratiei unui
component, Tntr-o anumita faza stationara, Tn functie de
concentratia aceluiasi component Tn faza mobila.
Coeficientul de repartitie K trebuie definit Tn raport cu
activitatile solutului as §i BM Tn cele doua faze, stationara si,
respectiv, mobila.
Daca se noteazS: cs

Ka = as / aM

acest raport este constant pentru o temperatura data, iar

activitafile Tn cele doua faze sunt:

aw = yiw CM
as = ys cs
Figura 2.3.16. Izoterme de distribute
unde y reprezinta coeficientui de activitate.
Deci:

184 185
 Izoterma Freundlich
Relatia Tntre cs §i CM este data de expresia:
unde b este o constants dependents de conditiile
experimentale (natura fazei si solutului). Daca b < 1 avem
izoterme convexe, daca b > 1 , izoterme concave.
Izoterma Lanprnuir
Se aplica solutiilor diluate:
c =
unde a-i, 82 sunt constante dependente
experimentale (natura fazelor)
cs
Consecinta nelinearitatii izotermelor este deformarea
curbei de elutie care se traduce prin deformarea picurilor
cromatografice (figura 2.3.17).
Izoterma convexa este tipica mai ales cromatografiei de
adsorb^ie, desi, Tn unele cazuri, izotermele neliniare au portiuni
liniare la concentrafii mici de proba.
Separarile Tn conditiile unor izoterme neliniare sunt
slabe, Tntrucat Tntinderea zonelor duce la scaderea rezolutiei;
de exemplu, Tn analiza cantitativa izoterma cu o convexitate
accentuate! (Tntalnita Tn cazul anumitor adsorbent!) duce la
imposibilitatea elutiei complete a zonelor de pe coloana.
Cele mai importante moduri de cromatografiere sunt
detaliate Tn continuare, jjnand cont de aplicabilitatea acestora Tn
cromatografia de lichide, iar alegerea procedeului de separare
de conditiile cromatografica depinde de structure, masa moleculara,
proprietatile fizico-chimice sau caracterul ionic al moleculelor de
separat.

B. Cromatoqrafia de adsorbtie

Principiul cromatografiei de adsorbtie sta la baza

cromatografiei de lichide clasica, Tn strat subtire §i pe coloana
clasica, §i a cromatografiei de adsorbtie gaz-solid.
Adsorbtia corespunde fixarii energice a unui gaz, lichid
sau solid pe o suprafata solida, procesul este reversibil iar
Semnal fortele responsabile de adsorbtie nu sunt specifice.
Timpul si volumul de retenfie a unui solut depind de
competitia Tntre moleculele solutului S §i cele ale fazei mobile M
raportate la locurile active ale adsorbantului. Procesul de
adsorbtie - desorbtie poate fi reprezentat schematic prin
echilibrul:

Timp
Figura 2.3.17. EfectuI tipului izotermei a. lineara, b. convexa,
c. concava asupra formei picurilor
SFM + MA ^ SA + MFM
unde FM - faza mobila, A - adsorbant.
In acest tip de cromatografie coeficientul de repartitie K
al solutului este dat de relatia:

186
187
 T p* - numar fara dimensiuni care masoara activitatea
unde cromatografica a adsorbantului (p*=0 pentru silice foarte
q - cantitatea de solut pe unitatea de masa de faza hidratata, (3*=1 conditii standard, silice anhidra)
stationara, Tn mol/g V A - volumul de faza mobilS adsorbitS pe unitate de
c - concentratia solutului Tn faza mobila, Tn mol / L masa de adsorbant
K depinde de: EO - are semnificatia fizica de entalpie libera de adsorbtie
temperature a moleculelor fazei mobile pe unitate de suprafata de
natura solutului solvent adsorbit AM Tn conditii de activitate standard
natura celor doua faze (P*=D
Relatia dintre q §i c este de tipul izotermei neliniare.
Factorul de capacitate k' fiind dat de relajia: 1
u
~ 2,3RT A M
k'=K-
Parametrii As §i E0 sunt asociati solutului, p*, VA §i e0
unde WA - masa de adsorbant din coloana §i VM volumul total sunt asociatj fazei stationare si mobile iar WA §i VM sunt asociati
de faza mobila din coloana, si, tinand cont de definitia geometriei coloanei.
coeficientului de repartitie, rezulta ca: Cunoasterea acestor parametri permite alegerea
judicioasa a conditiilor de cromatografiere.
, ,_ q _ cantit. solut din faza stationara Legaturile care stau la baza procesului de adsorbfle-
c VM cantit. solut din faza mobila desorbtie se clasifica Tn:
• legaturi de natura ionica - moleculele acide sau bazice
pot, Tn functie de pH si pKa, s3 se ionizeze si sa formeze
In cazul solventilor de elutie putin polari, Snyder a facut
legatura Tntre factorul de capacitate §i marimile termodinamice cu adsorbantul legaturi ionice; aceste legaturi sunt dificil
caracteristice procesului de adsorbtie: de rupt si e preferabil sa se evite formarea lor
• legaturi electrostatice - moleculele polare avand un
moment dipolar permanent sunt capabile de atractii
V
electrostatice responsabile de adsorbtie sau elufle; sunt
M
unde legaturi mai slabe decat legaturile ionice
• legaturile de hidrogen - solutii pot forma, Tn functie de
AS - suprafata ocupata pe adsorbant de un mol de solut
structura lor, legaturi de hidrogen cu faza mobila ceea ce
E0 - entalpia libera Tn conditii de activitate p* standard poate provoca uneori modificari neasteptate; un exemplu
(P*=1)
Tn acest sens Tl constituie separarea unui amestec de
P
0
- metaqualona §i paracetamol
2.3RT

188
189
 NHCOCH, benzen < naftalina < antracen

• pH-ul fazei mobile - pentru substantele acide sau

bazice, gradul de adsorbtie depinde de pKa-ul lor, de
natura acida sau bazica a adsorbantului si de pH-ul
OH solventului.

paracetamol Substantele adsorbante

Adsorbantii se aleg Tn functie de puterea de separare
Este cunoscut faptul ca factorul de selectivitate a raportata la amestecurile de substante, de inertia lor fata de
pentru cei doi compusi este puternic influentat de acestea si de solventul utilizat ca eluant.
natura alcoolului utilizat ca eluant; singurul care Exemple de adsorbanti: bentonite (silicati de aluminiu
formeaza legaturi de hidrogen cu eluantul hidratati), alumina (AlaOs nHsO), silice (SiC>2), oxidul de
(metanol) este paracetamolul, legaturile fiind cu magneziu.
atat mai puternice cu cat greutatea moleculara a
alcoolului este mai micS. Solvent! i.
Solvent!! trebuie sa fie inert! fata de adsorbant si
Adsorbtia unei substante depinde de: substanta adsorbita. Se Tntampla foarte rar ca un singur solvent
structura chimica a acesteia - structure solutului sa fie utilizat atat pentru adsorbtie cat si pentru elutie. In
influenteaza fenomenele de adsorbtie; diferente minore stau cromatografie se alege Tn general un solvent de fixare si unul
la baza separarii diastereoizomerilor; compusii polari si de elutie, Tn functie de natura substantelor de separat.
hidrocarburile lineare se adsorb mai usor decat structurile Cand adsorbantul este polar, solventul de fixare trebuie
cu ramificatii, puterea de adsorbtie variaza Tn ordinea: sa fie cat mai putin polar. Elufla se Tncepe cu solvent! putin
polari si se continua cu solvent! din ce Tn ce mai polari.
In cromatografia de adsorbtie puterea eluotropica a unui
hidrocarburi saturate < olefine < compusi aromatici «
solvent este definita prin parametrul EQ din ecuatia Snyder. In
compusi organic! halogenati < sulfuri < eteri < compusi nitro
tabelul urmator sunt date valorile acestui parametru pentru unii
< esteri » aldehide « cetone < alcooli « amine < sulfone <
sulfoxizi < amide < acizi carboxilici solvent! utilizati Tn cromatografia de adsorbtie.
Or*jt--3(-^i
Daca o molecula are mai multe grupari functional, atunci SJolvsnE •lofefitalii ;
proprietatile de retentie sunt determinate de gruparea cea m^m^—*^—m
hexan 0
mai polara. eter de petrol 0,01
tetraclorurS de carbon 0,18
benzen 0,32
• greutatea moleculara - Tn seriile analoage, cu cat greutatea 0,40
cloroform
moleculara este rnai mare cu atat adsorbtia este mai acetat de etil 0,58
puternica; pentru derivatii aromatici numarul de cicluri este piridinS 0,71 P

'
un factor important: metanol 0,95

190 191

Elemente privind elutia compusilor Tn cromatografia
de adsorbtie
Ca regula Tn cromatografia de adsorbtie, compusii polari
sunt eluati mai tarziu decat compu§ii nepolari (figura 2.3.18).
Semnaff
B
'- :->• Timp
variatia polaritatii A > B > C
Figura 2.3.18. Ordinea de elutie Tn cromatografia de adsorbtie
Luand cazul particular al silicagelului (silice) ca faza
stationara, structure acestuia este saturata cu grupari silanol,
gruparile OH fiind distribute statistic pe Tntreaga suprafatS
(figura 2.3.19).
Figura 2.3.19. Suprafata silicagelului
Gruparile silanol reprezinta centre active Tn faza
stationara si formeaza legaturi slabe cu moleculele aflate Tn
vecinatate: dipol-dipol indus; dipol-dipol; legaturi de hidrogen;
legaturi datorate electronilor jr. Aceste legaturi devin importante
cand molecula are unul sau mai multi atomi cu perechi de
electron! n (cazul interactiunii prin electron! n), cu alte cuvinte
cand molecula este nesaturata (alcanii nu pot interactional
192
Cromatografia de adsorbtie comports cateva aspecte:
Silicagelul este Tnconjurat Tn patul cromatografic de faza
mobila care ocupa toate centrele active Tn diferite proportii §i
deci molecula probei poate sa fie adsorbita daca
interactioneaza mult mai puternic cu adsorbantul dec§t faza
mobilS.
Toate moleculele probei sau ale solventului sunt aranjate pe
suprafata silicagelului asa meat gruparea lor functional "se
Tnchide" pe grup5rile silanol (figura 2.3.20).
Rest alchil
Grupare functional
Figura 2.3.20. Orientarea molecuielor adsorbite
Resturile hidrocarbonate sunt orientate Tn afara suprafetei.
Adsorbantul nu poate deosebi si deci nu poate separa
molecule care au aceeasi grupare functional^ iar restul
alchilic al molecule! este diferit. De exemplu, un amestec de
butanol, pentanol §i octanol nu poate fi separat satisfacator
prin cromatografie de adsorbtie.
• Taria interactiunii depinde nu numai de gruparile functional
ale probei dar si de factor! sterici. Molecule cu structuri
sterice diferite (izomeri) pot fi separate foarte bine prin
cromatografie de adsorbtie.
In tehnica cromatografiei de adsorbtie, utilizarea seriei
eluotropice devine esentiala. Trebuie sa se tina cont si de faptul
ca alegerea tariei fazei mobile poate afecta uneori selectivitatea
cromatografierii. Separarea poate fi optimizata Tn acest caz,
folosind o faza mobila de tarie simiiara dar care sa
interactioneze diferit.
193
 Deoarece Tn timpul cromatografierii pe silicagel sau gel
de alumina, echilibrul se stabileste Tncet, la schimbarea fazei
mobile trebuie sa se ia o serie de masuri:
- Toti solvent!! folositi trebuie sa fie saturati 50% cu apa
(sau 25% Tn cazul aluminei), cu exceptia pentanului,
hexanului §i heptanului care se amesteca cu 0.05%
acetonitril.
- Trecerea de la o extrema la cealalta a seriei eluotropice
afecteaza stabilitatea echilibrului. Astfel daca
tetrahidrofuranul este Tnlocuit direct cu n-pentan, este
nevoie de cateva ore pentru a se stabili un nou echilibru.
- Injectarea repetata a amestecului test se face pentru a
verifica echilibrarea coloanei, considerand ca s-a ajuns
la echilibru atunci cand valoarea /('este reproductible.
Separarea produsilor acizi sau bazici prin cromatografie
de adsorbtie poate Tntampina dificultati. Silicagelul este tratat cu
o solutie tampon cu un pH adecvat (tampon acid pentru probe
acide, tampon bazic pentru solutii bazice). Compusii care ridica
probleme deosebite pot fi eluati folosind faze mobile nepolare.
C. Cromatografi'a de repartstie
Sub aceasta denumire se reunesc cromatografia de
repartitie lichid-lichid si cromatografia cu faze legate.
Prima experienta privind cromatografia de repartitie
dateaza din 1941 cand Martin si Synge au realizat separarea
unor aminoacizi (fenilalanina si alanina) dificil de separat prin
cromatografie de adsorbtie, plecand de la coeficientii de
repartitie foarte diferiti ai derivator acetilati:
acetilfenilalanina K - Cstat/Cmob = 4
acetilalanina K = 216
C1. Cromatografia de repartitie fichid-lichid
In cromatografia de repartitie lichid-lichid, componentele
probei sunt distribuite Tntre doua faze lichide nemiscibile, unu!
dintre lichide este faza mobila iar celalalt este un film subtire ce
194
acopera suprafata granulelor (granulele reprezinta suportul, ele
neparticipand la procesul cromatografie).
Cromatografia de repartitie realizata la Tnceput numai Tn
acest mod, s-a Tnlocuit treptat cu cromatografia de repartitie cu
faze legate datorita numeroaselor dezavantaje ale sistemelor
lichid-lichid:
• faza mobila trebuie sa fie saturate cu faza stationara, altfel
va fi afectat filmul de pe suport;
• faza stationara nu trebuie sa absoarba lumina la lungimea de
unda de lucru;
• viteza fazei mobile nu trebuie sa fie mare pentru a nu se
produce eroziunea fazei stationare;
• se recomanda folosirea unor precoloane pentru prevenirea
TncaYcarii coloanei cromatografice;
• proba trebuie sa fie dizolvata Tn faza mobila saturata si nu Tn
solventul pur;
• este necesara termostatarea sistemului, solubilitatea fazelor
fiind dependents de temperatura;
• faza stationara dizolvata Tn eluent creste zgomotul
detectorului;
• Tn analiza preparativa fractiunile colectate sunt contaminate
cu faza stationara, preferandu-se din aceasta cauza o faza
stationara cu volatilitate mare;
• nu se poate folosi elutia cu gradient deoarece creste riscul
eluarii fazei stationare.
C.2. Cromatografia de repartitie cu faze legate
In acest tip de cromatografie faza stationara este formata
dintr-un suport solid de care sunt legate prin legaturi chimice
resturi hidrocarbonate sau grupari functionale.
Suportii
Sunt substante solide fin divizate cu proprietati
adsorbante §i inerte Tn raport cu faza stationara si mobila.
Printre cele mai cunoscute substante utilizate ca supoi-|i
Tn cromatografia de repartitie sunt:
• celuloza
« kieselgur
195
 - silicagel (silice)
- polimeri sintetici
Diametrul particulelor variaza in domeniul 3 - 15 j^m iar
dimensiunile porilor Tn domeniul 80 - 300 urn.
Fazele statSonare
Fazele stationare sunt grefate adica sunt faze Tn care se
stabilesc legaturi chimice Tntre faza stationara §i suport. Cele
mai utilizate sunt lanturile alifatice de lungime si polaritate
diferita grefate pe suporturi solide de tip silicagel.
Se disting astfel doua moduri de cromatografie cu faze
legate:
- cromatografia in faza normala unde faza stationara este
de natura hidrofila avand grefate pe silice grupari de
tipul:
- amino sau amino-propil -Si-(CH2)3-NH2
- nitro sau nitril -Si-(CH2)3-C=N
- dialcool -Si-(CH2)3-O-CH2-CHOH-CH2-OH
far faza mobila este lipofila
- cromatografia in faza inversa cand faza stationara este
lipofila (lanturi alchil C* - Cao, propil, fenil) si faza mobila
este de hidrofila; daca fazele stationare Cw sunt foarte
des utilizate -Si-(CH2)i7-CH3, coloanele cu faze
stationare C< se Tntalnesc Tn analiza peptidelor §i
proteinelor iar cu faze C3o, la separarea carotenoidelor si
flavonoidelor.
- cromatografia cu faze stationare chirale - pe faza
stationara este grefat un selector chiral; se disting faze
stationare chirale;
- sintetice - selectorul chiral (fenilglicina,
dinitrobenzoilfenilglicina, polisiloxan) este fixat
printr-o legatura ionica sau covalenta de silice;
- pe baza de ciclodextrine - lanturi de 6 - 12
molecule de glucoza unite prin legaturi 1- 4
formeaza un con cu diametrul interior proportional
cu numarul moleculelor din structura; interiorul
structurii este hidrofob, toate gruparile -OH fiind
orientate spre exterior; Tn functie de numarul
moleculelor de glucoza se diferentiaza 3 tipuri de
196
ciclodextrine, a, p si y, si aceste faze stationare
sunt utilizate la separarea moleculelor
farmacologice chirale care prezinta adesea un pol
hidrofob si grupe polare;
1,53nm
-Q*
^J\Lo * c^-
V^W
wf>
*° 77T77///.
Figura 2.3.21. Structura de ciclodextrina
- pe baza de celulozS - Tnlantuiri de molecule de
glucoza cu structura helicoidala'; acestea sunt mai
putin utilizate datorita sensibilitatii lor Tn medii
acide, bazice sau Tn solvent! clorati;
- proteice - constituite din subunitati chirale; cele
mai utilizate subunitSti sunt acidul a-1-glicoproteic,
albumina series umana si de bovina.
Fazele stafionare pe baza de silice prezinta unele
dezavantaje dintre care mai importanta este instabilitatea la pH
alcalin si Tn faze mobile cu polaritate ridicata.
Acest inconvenient este astazi eliminat prin utilizarea de
faze stationare noi cum sunt:
faze alchil - cu grupari poiare (amide, eter,
carbamat) Tncorporate ..embedded polar linked"
care permit analiza substantelor polare prin
utilizarea de faze mobile foarte hidrofile si analiza
197
 substantelor alcaline, interactiunile cu gruparile
silanol din suport fiind foarte slabe;
silice acoperita la suprafatS cu grupari metil stabile
la pH = 11,5 si care fac posibila utilizarea unei
faze mobile de hidroxid de amoniu sau sodiu,
necesara atunci cand cromatograful este cuplat
cu un spectrometru de masa;
silice fluorurata;
zirconiu grefat, rezistent la pH = 13.
Fazeie mobile
Trebuie sa fie caracterizate prin putere eluotropica §i
inertie chimica fafa de probele de analizat.
Cel mai adesea fazele mobile sunt constituite din
amestecuri de solvent! (eel mai frecvent sunt amestecuri de apa
sau solutii tampon si un solvent organic) a caror proportie poate
varia Tn cursul procesului cromatografic.
Pentru cromatografie, Tn general, eel mai puternic mediu
de elutie a fost considerat apa, acest lucru fiind adevarat numai
Tn cazul proceselor de adsorbtie. Apa poate interactiona
puternic cu centrele active din silicagel si gel de aluminiu, deci
adsorbtia moleculelor devine restrictive si acestea sunt rapid
eluate. In cromatografia de repartitie Tn faza inversa apa nu
poate uda gruparile alchil nepolare (hidrofobe) si nu
interactioneaza cu acestea. Din aceasta cauza apa este cea
mai slaba faza mobila si da vitezele de elutie cele mai scazute
Tn cromatografia cu faza inversata'. Cre§terea cantitatii de apa
In faza mobila cre§te timpul de retentie.
Cei mai utilizati solventi Tn cromatografia Tn faza inversa
sunt urmatorii:
metanol
acetonitril
etanol
isopropanol Scaderea polaritcitii
dimetilformamida Cresterea puterii de elutie
n-propanol
dioxan
tetrahidrofuran
198
Considlerente privind separarea prin cromatografie
de lichide in faza inversa
Un amestec de compu§i se separa cu atat mai bine prin
cromatografie de lichide Tn faza inversa cu cat este mai putin
solubil m apa. Retentia scade Tn ordinea: alifatic > dipol indus
(ex. CCU) > dipol permanent (ex. CHCIs) > baze Lewis slabe
(eteri, aldehide, cetone) > baze Lewis tari (amine) > acizi Lewis
slabi (alcooli, fenoli) > acizi Lewis puternici (acizi carboxilici). De
asemenea, timpul de retentie cre§te cu cre§terea numarului de
atomi de carbon.
Elutia cu gradient de concentrate (schimbarea
compozitiei fazei mobile Tn timpul elutiei) este des folosita Tn
acest tip de cromatografie, cu conditia ca solventii folositi sa fie
extrem de puri. Exista teste speciale de verificare a puritatii
eluentilor organic) sau a apei.
Apa pentru HPLC este destul de scumpa si inaccesibila.
Apa obtinuta prin coloane schimbatoare de ioni nu este Tn
general suficient de pura sj distilarea dubla poate creste
continutul organic. Prin trecerea apei printr-o coloana cu faza
inversata speciala aceasta devine suficient de bine purificata.
Dezvoltarea bacteriilor poate fi prevenita prin adaugarea, de
exemplu, a azidei de sodiu.
Metanolul are dezavantajul de a produce un amestec
relativ vascos, necesitand presiuni mai mari de lucru decat alte
faze mobile. La amestecarea metanolului cu apa are loc o
contractie de volum apreciabila, de aceea este necesara o
cantarire separata sau o masurare separata a volumelor celor
doua componente.
Acetonitriiul este foarte scump si, Tn acela§i timp, foarte
toxic (poate contine acid cianhidric liber). Vascozitatea poate
produce unele probleme. Solutia apoasa poate fi detoxificata
prin adaugare de hidroxid de sodiu sau peroxid de hidrogen,
cand au loc reactiile:
CH3 -CN -> CH3-CO-NH2 -» CH3-COOH
Probele cu compu§i ionici pot fi analizate Tn faza inversa
daca exista numai acizi §i baze slabe, alaturi de compu§i
nepolari. Faza mobila, de exemplu, se aciduleaza mai Tntai,
199
 apoi devine alcalina, asa Tnc£t compusji sa ajunga Tn forma
nedisociata. Daca acest mod de lucru nu este posibil, se
adauga un compus adecvat fazei mobile, de cele mai multe ori
acetat de amoniu.
Aplicatiile cromatografiei de lichide Tn faza inversa sunt
numeroase §i includ analiza fluidelor biologice, a formelor
farmaceutice, alimentelor, etc., acest lucru datorand-se §i
faptului ca apa fiind un eluent slab Tn acest caz, pot fi injectate
direct solutii apose.
D. Cromatografie de schimb ionic
Acest tip de cromatografie consta Tn utilizarea unei faze
stationare constituita din macromolecule cu structure poroasa,
insolubile Tn apa si solvent! organic!, cu proprietatea de a
schimba ioni cu faza mobila.
Schimbatorii de ioni. Aspects generate
Un schimbator de ioni este format dintr-o matrice, un
polimer cu structura reticulata, pe care sunt grefate grupe cu
caracter slab acid (-COOH, -PO(OH)2, -OH fenolic) sau puternic
acid (-SO3H), slab bazic (-NH2), cu bazicitate medie (amine
secundare, terfiare) sau puternic bazice (bazele cuaternare de
amoniu).
Se pot utiliza ca schimbatori de ioni produ§i natural/
(organici sau anorganici):
• Zeolifi sau aluminosilicati alcalini sau alcalino-
pamantosj (schimbatori de cationi)
Na2 • AI2O3 • 4 SiO2 2 H2O + 2 KCI (Tn solutie)
I prin urmare, cre§terea eficacitatii cromatografice. In
K2 • AI2O3 • 4 SiO2 2 H2O2 + 2 NaCI (Tn solutie)
Utilizarea acestora este limitata datorita sensibilitatii
crescute la schimbarile de pH.
200
• Celuloza prin oxidare formeaza dextranul. Prin
polimerizarea dextranului cu glicerina rezulta
Sephadex-ul care dup£ grefare constituie un material
de baza Tn cromatografia de schimb ionic sau Tn cea
de excluziune.
« Silicea grefata prezinta proprietati mecanice
superioare dar are dezavantajul degradarii Tn cazul
unei valori de pH al fazei mobile > 8.
O alta categorie de schimbatori de ioni o constituie
copolimerii de sinteza sau ra§inile. Se prezinta sub forma de
sfere mici cu diametrul de 0,5 mm sj sunt clasificate Tn functie
de structura lor chimica §i de marimea particulelor exprimate Tn
mesh. De exemplu, domeniul de la 20 la 50 mesh este
echivalent domeniului 0,3 - 0,85 mm. In principal se disting 2
tipuri de polimeri:
• Copolimeri reticulati polistiren/divinilbenzen. Grefarea
pe ace§ti copolimeri permite fixarea de grupe cu
caracter acid sau bazic, deci schimbatori de cationi
sau anioni. Prezinta avantajul de a fi stabili pe un
domeniu larg de pH Tnsa au o capacitate mica de
schimb ionic.
• Ra§inile filmogene. Un exemplu de rasjna filmogena
Tl constituie latexul depus sub forma unei pelicule
continue cu grosimea de 1 - 2 jam pe un suport
impermeabil format din microsfere de silice, sticla
sau polistiren cu diametrul de 25 - 30 (im. Gruparile
functionale sunt fixate pe particulele de latex.
Configura^ia filmogena permite concentrarea pe o
suprafata minimS a schimbatorului de ioni, reducand
fenomenul de difuziune, accelercind schimbarea §i,
plus acest tip de schimbator ionic este stabil pe un
domeniu larg de pH,
Grupe schimbatoare de ioni
Schimbatorii anionici (referitor la grupele fixate pe suport)
sunt schimbatori de cationi (referitor la ionii susceptibili de a se
201
 schimbator) §i schimbatorii cationici, de anioni (tabe.ul
Capacitatea de schimb ionic a unei rasini
Fie echilibrul:
Tabelu! 2.3.2. Exemple de raf ini schimbatoare de ioni
Rh h
Acid tare schimbator de Acid sulfonic
cationi R-SO3'H+ AmberlitelR-120 Este evident faptul ca numarul de ioni schimbati de o rasina
Acid slab schimbator de Acid carboxilic Dowex SOW data este limitat sau altfel spus cantitatea de ioni fixata li nu
cationi RCOO'Na* poate depa§i numarul locurilor disponibile pe ra§inS.
Baza tare schimbStoare Amoniu cuaternar Capacitatea de schimb reprezinta numarul de ioni-gram
de anioni - -- - ^ ce pot fi schimbati la saturatie, raportat la unitatea de masa de
Dowex 1 ra§ina uscata. In mod obi§nuit se exprima Tn mEq/gram
Baz3 slaba ' Amina tertiara
"Amberiite
[RaNHT " Dowex 3 schimbator.
Este important de mentionat faptul ca pentru o ra§ina
Schimbatori de cationi sulfonica (cu Capacitatea de schimb ~ 5 • 10"3 Eq/g) sau de
amoniu cuaternar capacitatea de schimb nu depinde de pH,
Se disting 3 tipuri de schimbatori: rasina fiind complet ionizata independent de pH. Nu acelasi
lucru este valabil pentru o rasina de tip acid sau bazS slaba.
a. acizi tari ce contin resturi de acizi sulfonici aromatici; rezultS Intr-un mediu puternic acid, o rasinci carboxilica nu are
prin sulfonarea copolimerului stiren-divinilbenzen la nivelul capacitate de schimb, grupele -COOH nefiind ionizate. Printr-
nucleelor aromatice un ra^ionament identic, Tntr-un mediu puternic bazic, rasinile de
b. acizi slabi ce contin grupe carboxilice putin disociate pana la tip amine primare, secundare sj tertiare nu sunt ionizate.
pH 4; se prepara prin copolimerizarea acidului metacrilic cu Pentru determinarea capacitatii de schimb a unei rasjni
bis-metacrilatul de glicol se poate proceda astfel:
c. acizi foarte slabi cu grupari fenolice
- o cantitate cunoscuta de rasina Tn forma sa acida se
Schimbatori de anioni trateaza cu clorura de sodiu Tn exces cand are loc schimbul:

Se disting:
RSO3-H+ + Na+ RS03-Na+ + H+
rasina solutie rasina solutie
a. baze tari de tipul hidroxizilor de amoniu cuaternari; rezulta
prin clorometilarea copolimerului stiren-divinilbenzen la
nivelul nucleelor aromatice iar ionii H* eliberati sunt titrati cu solutie de hidroxid de sodiu
b. baze slabe de tipul polialchilaminelor a caror sarcina
- o cantitate de ra§ina Tn forma sa bazica se trateaza cu
depinde de pH; aceste rasini sunt comercializate sub forma
acida si bazica dar si sub forma de sare de sodiu sau un exces de NaCI
clorhidrat
R3N+HO" + Cr- R3N+CI" + HO'
rasina solutie rasina solutie
202 203
 iar ionii HO" sunt titrati cu solutie de acid sulfuric. ce contine un ion cu sarcina de acela§i semn ca §i ionul din
interiorul rSsinii:
Prin aceste determinari se poate estima rapid cantitatea
de rasina utilizata si apoi capacitatea de schimb (Eq/g). Rasina RSO3"H+ Rasina R3N+Cr
si si
Mecanisme de retentie
In prezenta unei solutii apoase saline, la nivelul Solut Na+Cr Solut Na+HO'
schimbatorului de ioni au loc o serie de fenomene succesive:
• adsorbtia ionilor din solutie pe suprafata rSsinii
• umflarea rasinii prin formarea unui gel
• reactia de schimb ionic propriu-zisa
schimb H+/Na+ schimb CIVHO'
• transferul solutilor ionici sau neionici in porii rasinii prin
echilibru Donnan
Se considera echilibrul:
Adsorbtia
Necesita un timp numit timp de latent^ si este evidentiata
prin scaderea conductivitatii electrice a fazei apoase. Ionii de
schimb b se adsorb pe suprafata solida iar ionii initiali h sunt Acest schimb este un echilibru chimic caracterizat de
Tnca retinuti Tn rasina astfel Tncat nu pot fi pusi Tn evidenta Tn constante termodinamice. Aplicand legea actiunii maselor Tn
solutie prin reactii analitice uzuale.
termeni de activitate se obtine:
Formarea gelului- umflarea ra§inii
Rasina fiind constituita dintr-o retea macromoleculara
poroasa permits patrunderea apei ceea ce determina umflarea
granulelor. Moleculele de apa solvateaza sau ionizeaza grupele
functionate. unde K°H/Na este constanta termodinamicS, R §i S se refera la
Cantitatea de apa absorbita de ra§ina depinde de rasjna sj, respectiv, solutie.
numerosi factori: In realitatea nu se poate aprecia activitatea decat Tn
- porozitatea acesteia solu^ii foarte diluate.
- natura ionilor gruparilor functionale; cu cat rasina are mai multi __ Sa^ ' CHtS
K
ioni susceptibili de a fi hidratati, cu atat umflarea este mai C
H+R ' CNa"S
important^
- capacitatea de schimb a rasinii
In cazul schimbatorilor de ioni unde solutia interna este
eel mai adesea concentrata (aproximativ 5 M) se recurge la
Reactia de schimb ionic
utilizarea constantei de echilibru aparenta.
Schimbul ionic are loc ori de cate ori o ra§ina Aceasta constanta este uneori numita factor de separare
schimbatoare de ioni se afla Tn prezenta unei solutii de electrolit tntre doi ioni sau coeficient de selectivitate a ra§inii.
204
205
 Caracterizarea repartitiei unuia dintre ioni la echilibru se
poate face pe baza coeficientului de repartee (aparent):
Deplasarea echilibrelor
Echilibrul de schimb ionic este un fenomen complex ce
include reacfli chimice care au loc atat Tn interiorul ra§inii cat §i
Tn solute.
In cazul general al schimbului Tntre 2 ioni notat,i A si B: Deplasarea echilibrelor prin schimburi acido-bazice:

a) echilibrului din rasjna i se asociaza §i un echilibru din solutia

apoasa
b) un echilibru suplimentar poate avea loc Tn rasina propriu-zisa

Daca valoarea constantei K difera semnificativ de 1, a) Se considera o solutie ce contine ioni Li+ ce se afla Tn contact
Tnseamna ca diferentele de afinitate ale rasinii pentru cei doi cu o rasjna H+:
ioni sunt mari.
Printre factorii care influenteaza valoarea constatei KR
aparente se numara:
- compozitia ionica a rasinii Lis+ + HR+ c^±r LiR+ + HS+
- concentratia ionului de separat
- forta ionica a solutiei Acest echilibru este deplasat spre stanga Tn cazul unei rasini
- porozitatea rasinii sulfonice deoarece ionul Li+ are o afinitate mai mica pentru
- capacitatea de schimb a rasinii aceasta comparativ cu ionul H+. Aceasta afirmatie nu este
- temperatura valabila daca solutia contine o baza slaba de tipul acetatului de
litiu, ionul CH3COO" gasiiidu-se subformS de CH3COOH:
Constanta de echilibru permite defmirea afinitatii relative
a ionilor, pentru un tip de rasina data, astfel:
- influenta sarcinii - ionii sunt cu atat mai bine retinufi cu cat Ka
sarcina lor este mai mare CH3COO- + H CH3COOH

Na + <Ca 2+ <AI 3+ Echilibrul global este:

Cr < SO42- < Fe(CN)63'
K'R
- influenta naturii ionului - afinitatea ionilor pentru rasin§ creste Lis+ + CH3COOs"+HR+ LiR+ + CH3COOHS
Tn ordinea crescatoare a numarului atomic Tn grupa
cu
F' < cr < Bf < I'
Be2+ < Mg2* < Ca2+ < Sr2" < Ba2+ [Li+]R[CH3COOHSs ^ [H+]s[CH3COOH]s[Li+]R
Li+ < Na+ < K+ K'R = +
[Li ]s[CH3COO-ls[H ]R+
[Li+]s[H+]stCH3COO-]s[H+]R

206 "K
_ K,-, 10 4.7

207

lonul Li* se fixeaza total pe rasina.
b) Aceasta influenta se explica prin afinitatea mare a ionului
carboxilat pentru protoni, restul -COO" fiind o baz3 foarte tare,
astfel ca pentru o rasina poliacrilat ordinea de afinitate variaza
Tn modul urmator:
Na+ < Li+ < N+H4 < H+
iar pentru o rasina sulfonata':
Li+ < H+ < Na+ < N+H4 < K+ < Cs+ < Ag+
Deplasarea echilibrelor prin formare de complec§i
Formarea complec§ilor poate avea loc:
a) Tn solutie
b) pe rasina
a) Formarea complecsilor Tn solutie conduce la scaderea
concentratiei ionului liber care poate fi fixat de rasina. Afinitatea
acestuia pentru rasina este aparent diminuata astfel:
Fes3+ 3K Fe 3+
Daca ionilor de complexat Fe3+ li se adauga, de
exemplu, ioni F, concentratia Fes3+ scade, echilibrul
deplasandu-se spre stanga. Tn mod normal Fe3+ schimbS K+ Tn
rasina. Tn prezenfa F", Fe de pe rasina poate fi Tnlocuit de K+,
existSnd posibilitatea unei separaYi foarte selective. Se poate
ajunge p§na la formarea de complecsi anionici. Cationul nu mai
poate fi fixat de ra§ina pentru ca el este sub forma anionica Tn
complex dar poate fi fixat de un schimbcitor de anioni.
lonul Fe3* poate fi fixat de EDTA sub forma de chelat
FeV unde
208
-OOC-CH2x N-CH2COO-
Y-
b) In acest caz rSsjna are capacitate de complexare ceea ce
duce la o cre§tere considerable a afinitatii pentru un ion sau
altul. Aceste ra§ini sunt numite si ra§ini chelatante §i afinitatea
pentru un anumit ion depinde Tn principal de natura gruparii
chelatante grefate. Cea mai frecvent Tntalnita grupare de acest
gen este gruparea iminodiacetica:
CH2COOH
-N
CH2COOH
Gruparea este grefata, de obicei, pe rasjna de tipul
polistirendivinilbenzen §i fixeaza preferential ioni de cupru, fier
§i de metale grele.
Transfer prin echilibru Donnan
In cazul Tn care ionii din rasjna §i cei din solutie sunt
identic! sau solutul nu este ionizat, schimbul ionic nu are loc. Au
loc, Tnsa, fenomene de repartitie a solutului Tntre cele doua
faze, fenomene ce definesc echilibrul Donnan.
a) Solut ionic
Luand ca exemplu o rasina sulfonica sub forma H+, umflata Tn
apa pura §i plasata Tn contact cu o solutie de HCI, se constata
ca nu se produce un schimb de cationi pentru ca ionii de
schimb sunt identic! dar se constata ca HCI trece Tn interiorul
rasjnii pana la stabilirea unui echilibru de repartitie:
(H* + cr)s ^ (H Cr)R
caracterizat de constanta de echilibru:
209
 ,^,-
CIR Tabelul 2.3.3. Concentratia acidului clorhidric In ra§ina sulfonica
u+
H
s
' C«i-
Cls
§i in solutie la echilibru

unde KHCI este constanta de repartitie aparenta a acidului

clorhidric.
Acidul clorhidric este complet disociat Tn apa §i se admite
ca Tn ra§ina exista aceea§i situatie. Prin urmare:

?l C
Cr R = C HCL
Se observa ca pentru o solutie exterioara diluata, transferul prin
echilibru Donnan a solutilor ionici Tn ra§ini ionizate de
Dar: capacitate mare este neglijabil. In acela§i timp, ionii de acela§i
semn cu gruparea functionala (Tn cazul considerat ionul este CI"
iar gruparea functionala este SOs2") sunt practic exclusi din
rasing.
deoarece trebuie sa se tina" cont de ionii H+ ce provin din rasinS
b) Solut neionic
si, deci, concentratia corespunde capacitatii de schimb CE- Fie M solutui neionic care se repartizeaza conform echilibrului:
Se poate scrie:

de unde: atunci:

)-cHC|R KM =•

HCIc
Daca solutia in ra§ina este deja foarte Tncarcata Tn ioni, o
§i anumita cantitate de solut M patrunde Tn sistem pana la
echilibru (potentialul chimic al solutului Tn cele 2 faze sa fie
acelasi). Tn acest caz curba CR Tn functie de c$ este o dreapta
fara abater! cauzate de forta ionica.
Printre moleculele eel mai frecvent repartizate Tn acest
r °H int-ereseaz§ este CHCKR) care variazS Tn functie mod se numara complecsii moleculari de tipul HgCI2, CdCb sau
de
CHCKS) dupa o ecuatie de gradul 2 (tabelul 2.3.3). acizii slabi neionizati.
Intre analitii ionizati §i cei neionizati nu exista
Tntotdeauna o diferenta neta. Un exemplu Tn acest sens Tl
reprezinta acizii §i bazele slabe care sunt mai rnult sau mai
putin ionizati Tn functie de pH si pKa. Daca pH > pKa + 2 un
acid RCOOH poate fi considerat Tn totalitate ionizat.
210
211
 Considerente practice privind cromatografia cu In cromatografia cu schimbatori de ioni se prefera
schimbatori de ioni microparticule cu capacitate mare de schimb, rezistente la
Intr-o analiza pe coloana cu schimbator de ioni trebuie presiune Tnalta, variatii de pH si de concentrate a ionilor.
sa se asigure conditii optime de cromatografiere prin alegerea Capacitatea de schimb poate fi variata prin modificarea
adecvata a schimbatorului de ioni, a pH-ului fazei mobile, tariei pH-ului eluentului (figura 2.3.22). Un schimbator de cationi slab
ionice a fazei mobile, tipului de ioni de schimb. Nu exists reguli nu disociaza la pH sub 4 daca gruparile ionice sunt acizi slabi
de selectie, combinarea tuturor acestor factor! facandu-se (protonul este puternic legat), Tn schimb la pH peste 8, toate
empiric asa Tnca"t rezultatul sS fie obtinerea unei separari §i gruparile sunt ionizate; Tntre pH 4 sj 8 exista o ionizare partiala
eiutii optime. a gruparilor. Un schimbator de anioni prezinta, de asemenea,
Capacitate domenii de pH optime.
Schimbator de cationi puternic
Tn practice se prefera schimbatori de ioni cu domeniu de
pH optim mai Tntins, deoarece uneori se lucreaza cu probe ce
contin acizi sau baze tari ce sunt complet disociate pe un
Schimbator de anioni puternic
domeniu larg de pH.
Este important de amintit faptul ca schitnbatorii de ioni
pe baza de silicagel se dizolva la pH < 1 sau pH > 9. Daca se
lucreaza la pH < 2 sau pH > 10 pot fi catalizate reactii
secundare ce altereaza proba (hidroliza esterilor, peptidelor,
7
14 reactii Cannizzaro).
pH Pe de alta parte cresterea concentrate! contraionilor
reduce timpul de retentie iar o cre§tere a valorii pH-ului scade
retentia Tn cromatografia cu schimbator de cationi si creste Tn
Capacitate Schimb. de cationi slab cea de anioni.
In cazul schimbatorilor de cationi, timpul de retentie
creste daca se Tnlocuieste contraionul cu un altul Tn ordinea
urmatoare: Ba2+ , Pb2+ , Sr*+ , Ca2+ , Ni2+ , Cd2+ , Cu2+ , Co2+
2+ + + + + +
2n2+ , Mg2+ , , UO2 , Te , Ag ,, Cs , Rb , K ,
Na , H* , Li . Tn practica se prefers K , NH4 , Na* §i H+ .
+ + + +

In cazul schimbatorilor de anioni, timpul de retentie

cre§te daca se Tnlocuie§te contraionul cu un altul Tn ordinea
urmatoare: citrat, sulfat, oxalat, tartrat, iodura, borat, nitrat,
fosfat, cromat, bromura, cianura, nitrit, clorurS, formiat, acetat,
fluorura, hidroxid, perclorat. Cei mai utilizati anioni sunt fosfat,
borat, azotat, perclorat.

Aplicatii ale cromatografiei prin schimb Ionic

14
• Demineralizarea apei
Figura 2.3.22. Capacitatea schimbatorilor de ioni Tn functie de pH Considerand o solutie de NaCI Tn contact cu o rSsina
sulfonica sub forma de acid, Tn exces, se produce un
212 213
 schimb Tntre H+R si Na+s, afinitatea rasinii pentru cei doi
ioni fiind foarte apropiata iar reactia nu este completa.
Echilibrul care se stabileste este:
Utilizand o rasina de amoniu cuaternar sub forma de
hidroxid, are loc echilibrul:
Nici una din cele doua reactii nu este cantitativa pentru o
extractie cu un randament bun.
Daca Tnsa se folosesc simultan cele doua rasini Tn
prezenta solutiei de NaCI, echilibrele de mai sus sunt
complet depiasate spre dreapta datorita reactiei
suplimentare care are loc Tn solutie:
Se obtine astfel o apa foarte pura.
Tn domeniul farmaceutic cromatografia prin schimb ionic
are largi aplicatii Tn operable de purificare a
medicamentelor obtinute din sange sau prin tehnologie
recombinata (exemplu, factorul VIII recombinat).
In toxicologie schimbatorii de ioni sunt utilizati pentru
extractia bismutului din sangele total Tn prezenta acidului
clorhidric concentrat cand se formeaza cpmplecsi de tipul
BiCI"4, BiCI2"5 fixati pe rasini schimbatoare de anioni de
tipul IRACG400. Aceasta tehnica permite concentrarea
urmelor.
In terapeutica cromatografia cu schimbatori de ioni este o
tehnica exploatata deoarece colestiramina, rasina sintetica
bazica, se caracterizeaza printr-o afinitate crescuta pentru
acizii biliari pe care-i fixeaza sub forma de compusi
instabili.
214
E. Cromatografia cu perechi de ioni
Acest tip de cromatografie reprezinta o alternativa a
cromatografiei cu schimbatori de ioni. Multe dintre probleme pot
fi rezolvate combinand cele doua metode de cromatografiere,
cromatografia Tn faza inversS si cromatografia cu schimbatori
de ioni, dar cromatografia cu schimbatori de ioni nu este
eficienta pentru separarea amestecurilor acide, bazice sau
neutre fara asigurarea unor conditii speciale de lucru.
Probele ionice pot fi separate prin cromatografie Tn faza
inversa numai daca sunt formate din compusi neutri si pot
contine acizi sau baze slabe Tn forma1 nedisociata. Asigurarea
formei neionizate printr-un pH corespunzator poarta numele de
supresie de ioni. Cromatografia cu perechi de ioni este o
extindere a acestui principiu si consta Tn adaugarea unei
substante ionice la faza mobila ce formeaza o pereche de ioni
cu un component al probei de sarcina opusa:
Proba+ + Contraion" -> Perechea [ Proba+ Contraion" ]
Proba" + Contraion"" -» Perechea [ Proba" Contraion" ]
Perechea formats se comporta cromatografie ca o
molecula organica neionica si se poate folosi Tn acest caz
cromatografia cu faza inversa.
Mecanisme de separare
Sunt propuse doua mecanisme:
• repartitia perechilor de ioni Tntre doua faze lichide
nemiscibile (metoda neutilizata astazi)
• cromatografia de perechi de ioni pe faza sta|ionara
nepolara - Tn acest caz pentru explicarea mecanismului
fiind propuse mai multe modele:
215
 1. Modelul cu schimbator de ioni pe suprafata
Contraionul avand unul sau mai multe centre hidrofobe
este adsorbit de lanturile alchil ale fazei stationare devenind
echivalentu! unui schimbator de ion.
Solut
e ce ionii de semn contrar sunt atrasi.
Contraion Solut
Lanturi alchil
Figura 2.3.23. Model de schimb ionic in suprafata
Aproximativ 30% din lanturile alchil sunt blocate cu
contraion, restui sunt libere §i pot reactiona cu compu§ii neionici
din proba.
2. Modelul formarii perechilor de ioni fn faza mobila
Este cazul perechilor de ioni suficient de stabile pentru a
se fixa pe resturile alchil ale fazei stafionare.
Exemple:
- pentru acizi la pH > 7,5
RCOCr + A* ^RCOO'A*
- pentru aminele alifatice la pH < 6
216
3. Modelul formarii unui strat dublu electric la interfata
solid/lichid
Este modelul Gouy - Chapman - Ster, eel mai apropiat
de mecanismul real.
Adsorbtia contraionului pe faza stationara determma
aparitia unei diferente de potential Tntre suprafata solidului si
solutie.
Compozitja stratului lichid ionic Tn vecmatatea suprafetei
solide este perturbata, zona numindu-se strat difuz; ionii de
acelasi semn cu contraionii sunt respinsi de stratul difuz Tn timp
Aspects practice
Tn practice se adauga un alchilsulfonat Tn probe cationice
si fosfat de tetrabutilamoniu Tn probe anionice. O proba ce
contine componente anionice si cationice are unul din ioni
mascat de un contraion iar celalalt este supresat prin pH.
Avantajele cromatografiei cu perechi de ioni:
« se pot folosi sisteme cu faza inversa;
. pot fi separate amestecuri acide, bazice, neutre sau soiutii ce
contin molecule amfoterice;
• sele'ctivitatea este uneori influenza de contraion.
In continuare sunt mentionate cateva aspecte privind
practica Tn cromatografia cu perechi de ioni:
• Tehnica se folose§te atunci cand metodele cu faza inversa
sau cu supresie de ioni nu se pot aplica sau cand proba
contine atat componente anionice cat §i cationice.
• Ca faza mobila se folose§te un amestec de metanol - apa
care sa reduca problemele legate de solubilitatea
contraionului. Cand selectivitatea este mica se prefera
acetonitrilul.
. Este importanta alegerea corecta a contraionului,
preferandu-se specii cu catene scurte §i diferente structurale
217

mici. lonii cu catene lungi se folosesc cand este necesara o
retentie mare.
• Cand se lucreaza cu gradient trebuie verificata solubilitatea
contraionului pentru toate raporturile fazei mobile.
® pH-ul fazei mobile trebuie ales asa meat sa asigure o
ionizare maxima a probei. In acest caz trebuie sa se ia Tn
considerare stabilitatea silicagelului la pH-ul folosit.
« In cromatografia cu faza inversa se prefera pentru un test
initial monomerii C-ia sau Ca.
• Faza mobila sa fie degazata Tnainte de adaugarea
contraionului pentru a preveni spumarea.
® Concentratia ionului sa fie inifial 0,01 M pentru cei cu catena
scurta si 0,005 M pentru cei cu catene lungi. In cazul elutiei
cu gradient, daca este necesara folosirea unui tampon,
acesta se adauga Tn cantitati egale Tn apa si metanol
(aproximativ 0,001 - 0,0005 M).
• Pentru a preveni precipitarea sarurilor, este necesar ca !a
Tncheierea lucrului sa se spele coloana §i tuburile de legatura
iar daca aparatul functioneaza peste noapte, debitui poate fi
redus la 3-5 ml/h.
« Trebuie sa se verifice absorbtia Tn ultraviolet ( UV ) a
contraionului.
• Cresterea temperaturii scade factorul de capacitate k'. La
temperaturi mai mari de 60 °C contraionii de tip +N(C4H9)4
prezinta riscul degradarii.
• Influenta fortei ionice: cresterea fortei ionice a eluantului
diminueaza factorul de capacitate k' a solutului printr-un
proces de competitie Tntre contraion si ionii prezenti Tn faza
mobila (de exemplu, ionii fosfat utilizati pentru ajustarea pH-
ului), ceea ce scade eficacitatea separarii.
Aplicatii
Multe medicamente pot fi analizate pe coloana de silice
grefata C18 prin cromatografie cu formare de perechi de ioni
utilizand o faza eluanta pe baza de rnetanol. Pot fi
cromatografiate astfel numeroase substante medicamentoase:
- acizi tari sau slabi Tn prezenta de tetrabutilamoniu; exemple:
acid acetilsalicilic, indometacin, acid folic, metotrexat, etc.
218
^m
- baze tari sau slabe Tn prezenta de alchilsulfonati; exernple:
codeina, morfina, clorfeniramina, efedrina, clorura de
benzalconiu, metadonS.
F. Cromatografia de ion'i
Cu cateva excepfii ionii anorganici pot fi analizati prin
cromatografie de lichide. in prezent exista numeroase metode
de separare §i detectie a ionilor anorganici, printre acestea
numarandu-se §i cromatografiile cu:
« detectie conductometrica §i supresie chimica ( cromatografie
cu coloana dubla);
• detectie conductometrica §i supresie electronica;
«B detectie UV indirecta.
Se mai folosesc detectia Tn UV si detectia prin indice de
refractie.
Prin aceste tipuri de cromatografii pot fi studiati numeros. i
ioni:
• cloruri, nitrati, sulfa|i, carbohidrati din bauturi §i ape;
• nitrati Tn alimente;
« fluoruri Tn pasta de dinti;
e ionul amoniu, potasiu, nitrat §i fosfat Tn sol §i Tngra§aminte;
« sodiu §i potasiu Tn fluidele biologice §i solutiile perfuzabile.
Cromatografia de ioni nu este Tnsa restrictiva, putandu-
se detecta, de exemplu, si acizii organici din sucurile de fructe.
Acest tip de separare a devenit astfel o metoda importanta de
studiu, reprezentand de fapt un caz special de cromatografie cu
schirnbator de ioni dar echipamentul folosit este diferit. in figura
2.3.24. este schitat un sistem cromatografic cu coloana dubla.
Coloana de supresie reduce drastic conductivitatea fazei ce
vine din coloana de separare inversand sarcina eluentului ( de
exemplu bicarbonatul este transformat Tn acid carbonic).
219
 Separarea Separarea
cationllor anlonilor
Ednslfill
Cromatografiaprin excluziune sterica se bazeaza pe un
proces de repartitie lichid-lichid Tn care moleculele
Tampon
HCI, HNOj 1CPM NaHC03.Na2C03, NaOH componen^ilor de separat sunt retinute Tn functie de forma si
marimea lor.
Ca suport se utilizeaza o serie de substante granulare,
microporoase, care permit difuzia moleculelor Tn porii acestora.
Cu cat moleculele sunt mai mici, ele difuzeaza mai u§or Tn porii
gelului si sunt retinute un timp mai Tndelungat pe coloana, Tn
timp ce moleculele mai mari raman Tn majoritatea timpului Tn
metale alcaline, metale anioni anorganic!, acizi
alcalino-pamantoase,
Proba
organici, fosfati organic!
spatiile interstitiale dintre particulele de gel, fiind eluate primele.
amoniu, amirie Desi materialele suport cu proprieta|i care permit
separarea substantelor pe aceste principii (geluri de amidon, de
agar, de poliacrilamida, etc.) au fost cunoscute de multa vreme,
Tn cazul acestora peste efectui de sita moleculara se suprapun
Tntotdeauna §i alte fenomene, ca adsorbtia, repartitia si
Schimbator de
Coioana schimbul ionic.
cation!
de Schimbator de anioni
(capacitate scSzuta)
Descoperirea a doua clase principale de materiale
separare
(capacitate scazuta) cromatografice, Tn care separarea are loc Tn mare masura si
uneori exclusiv pe baza marimii moleculei, a dus la dezvoltarea
cromatografiei prin excluziune sterica. Acestea sunt materiale
de tip Sephadex - geluri dextranice reticulate care se umfla Tn
mediul apos, si geluri polistirenice cu grad Tnalt de reticulare,
Schimbator de anioni Schimbator de cationi folosite Tn special Tn solven^i organici. Ulterior s-au descoperit
(capacitate mare)
Ccloana (capacitate'mare) alte materiaie, Tnsa trebuie remarcat faptul ca toate gelurile de
Ra§ina-OH~-H-rcr-» de Ra§ina-H' + Na*CO3"
Ra§ina-CI" + H2O
supresie —> natura organica sunt sensibile la temperatura ridicata, la uscare
Ra?in5-Na* + H2C03 si la o presiune ridicata pe coloana. Dupa schimbarea presiunii
sau temperaturii este necesara, de obicei, o recalibrare.
Mecanismul prin care are loc separarea Tn Cromatografia
prin excluziune sterica nu este suficient elucidat. Daca se
considera un material poros ce umple coloana cromatografica,
moleculele ce nu pot patrunde Tn pori se pot deplasa Tn spatiul
dintre particule si devin excluse, ele fiind eluate primele. Pe de
alta parte, daca moleculele sunt suficient de mici, ele
Figura 2.3.24. Cromatografia de ioni cu coloana de supresie penetreaza porii fazei stationare. In pori exista Tnsa faza mobila
stagnanta, particulele putand parasi aceste zone numai prin
difuzie si, ca rezultat, se vor deplasa mult mai Tncet decat
221
220
 T-l
moleculele excluse. La detector ajung mai Tntai moleculele
excluse §i la sfarsit moleculele retinute de pori (figura 2.3.25). Cu cat o molecula este mai mica, cu atat creste volumul
Semnal de por accesibil si, deci, timpul petrecutm coloana:
— >r ~ Molecula nujaatrunde Primul pic
Timpul de aparitie a picului
V este o funcfie de raza depinde de marimea
Tmolec ^ Tpor molecule! molecule!
V este egal cu volumul Picui final
rmolec fpor porului

Ca importanta, acest tip de cromatografie permite

Volumul de soh/ent
Ffgura 2.3.25. Ordinea de elutie in cromatografia de exciuziune
sterica: 1. molecula exclusa, 2. rno!ecu!a de marime mica, 3.
solvent
separarea unor cantitaVi mari de proba deoarece procesul
cromatografie nu presupune stabilirea unui echilibru. Este Tnsa
limitata, doua molecule putand fi separate daca exista o
diferenta de 10% Tntre masele moleculare.

Daca se considera ca porul este de forma cilindrica cu Caracteristici ale fazei stationare
raza rpor', atunci volumul de por accesibil V pentru o molecula - Diametrul porilor - este Tn functie de gradul de reticulare
cu raza rmo/gc este dat de relatia: a gelului care corespunde proportiei de substrat Tn
ansamblul fazei stationare. Marimea porilor
o conditioneaza volumul fazei stationare si domeniul de
= r
* ( por ~ rmolec) ' u ' 0 ~ rmolec) aplicare a metodei.
- Capacitatea de umflare - este cantitatea de solvent
unde I este lungimea porului (figura 2.3.26). absorbita pe gram de gel uscat.
Exemple:
Sephadex G10 -> 1 g gel uscat absoarbe 1 ml apa
Sephadex G 200 -»1 g absoarbe 20 ml apa
- Forma sj marimea particulelor substratului - particulele
substratului trebuie sa fie mici, de forma sferica, cu o
granulometrie care variaza de la 40 la 300 u,m Tn
cromatografia clasica si de la 20 la 80 (am Tn cea de
Tnalta performanta.
- Consistenta - variaza Tn functie de natura si gradul de
reticulare a gelurilor. Se disting:
- xerogeluri - sunt geluri semirigide
- aerogeluri - sunt geiuri rigide, utilizate Tn special
cand se lucreaza la debit mare si
Figura 2.3.28. SVIodekil porului de forma cilindrica Tn sub presiune
cromatografia prin exciuziune sterica (V - volumul ramas liber)
222 223

L
 - Gradul de reticulare - gelurile nu trebuie sa reactioneze
cu faza dispersanta.
Xerogeluri
Potfi:
« geluri moi
• geluri semirigide
Tn functie gradul de reticulare.
Gelurile moi sunt utilizate eel mai frecvent cu solutii
apoase (cu exceptia polistirenilor care sunt hidrofobi). Aceste
geluri se utilizeaza la presiuni (< 2 bari) si debite mici.
Gelurile semirigide au un grad ridicat de reticulare ceea
ce le confera proprietati diferite de ale gelurilor moi, putand fi
utilizate la debite mari pentru ca suporta presiuni ridicate.
Natura aromatica hidrofoba a acestor geluri permite
lucrul cu faze mobile de solvent! organic! - permeabilitate pe
gel.
Exemple:
1. Geluri de dextran = Sephadex
Au structure de poliozida formata din 90% molecule de
glucoza legate 1,6 si 10% molecule de glucoza legate 1,3. Sunt
insolubile Tn apa dar sunt hidrofile, ele se umfla Tn mediu apos
si Tn mediu de solventi de tipul dimetilsulfoxidului.
Prin acetilarea sau alchilarea gruparilor hidroxilice se pot
obtine geluri gonflabile Tn mediu organic (hidroxipropil-
Sephadex). Permit separarea substantelor cu masa moleculara
M = 700 000 - 800 000 daltoni.
2. Geluri de poliacrilamida sau biogeluri
Se prezinta sub forma de perle de forma regulata,
rezistente Tn medii acide sau bazice. Permit separarea
moleculelor cu M = 200 000 - 400 000 daltoni.
3. Geluri de agaroza sau sefaroza
Agar-agarul sau geloza este o poiizaharida extrasa din
alge care are proprietatea de a se dizolva Tn apa calda §i de a
forma geluri prin racire. Confine:
- agaropectina - cu proprietati de schimbator de
ioni sau adsorbtive (datorita prezentei gruparilor carboxilice sau
sulfurice)
224
- agaroza - substanta neionica, poiizaharida
lineara formata din D-galctoza §i 3,6-anhidro-L-galactoza legate
prin legaturi de hidrogen
Acest tip de gel permite separarea moleculelor cu masa
moleculara M = 10 000 - 150 • 106 daltoni.
4. Geluri de polivinil (fractogel)
Matricea acestor geluri este constituita din polimeri
vinilici hidrofili §i se caracterizeaza printr-un grad malt de
stabilitate chimica §i mecanica. Masa moleculara a
substanteior ce pot fi separate utilizand aceste geluri
corespunde intervalului 102 - 5 • 107 daltoni.
Aerogeluri
Sunt materiale rigide formate din sticla sau silice
poroasa, eventual dezactivata prin silanizarea gruparilor OH
pentru eliminarea fenomenului de adsorbfie.
Aerogelurile au o utilizare practica Tn HPLC, ele nu se
umfla Tn contact cu faza dispersanta, domeniul de utilizare fiind
3 - 1 0 4 < M < 2 - 1 0 7 daltoni. Permit obtinerea unor rezolu^ii mai
mari decat Tn cazul gelurilor descrise anterior.
Aspecte practice
Alegerea faze/ stajionare
Se face Tn functie de masa molecular^ a substantelor
supuse separarii.
Alegerea faze/ mobile
Faza mobila trebuie sa Tndepiineasca anumite conditii:
- dizolvarea probei
- impregnarea §i gonflarea geluiui
- compatibilitatea cu sistemul de detectie
- sa nu distruga faza stationara
Tehnicile de cromatografiere prin excluziune
- cromatografie pe strat. subtire
- cromatografie de elutie pe coloana
- cromatografie cu reciciare
225
 !og(M)i
1. etalonarea directa a coloanei cromatografice cu
etaloane de masa molara cunoscuta;
2. etalonarea indirecta plecand de la determinarea
volumului hidrodinamic.
In acest caz se pleaca de la definirea vascozita^ii
intrinseci a unei solutii de polimer:

r I _ lim "^solvent
W-c->(

[TI] pentru un polimer linear, Tntr-un solvent dat, se define§te

conform relatiei Mark-Houwink:

Volum de elutie
unde k' §i a sunt constante pentru un polimer, un solvent §i o
temperatura data.
Figura 2.3.27. Aiegerea fazei stationare Aceasta metoda de etalonare se bazeaza pe principiul
conform caruia moleculele se separa Tn functie de volumul lor
hidrodinamic care este produsul dintre masa molara M si
Apiicatii vascozitatea intrinseca [TI].
Cromatografia prin excluziune Tsi gaseste largi aplicatii Tn Reprezentand grafic log M[TI] Tn functie de volumul de
procesele de separare a polimerilor sau a macromolecuielor: retentie VR se obfine curba universala de etalonare. De pe
- Separarea moleculeior mici de macromolecuie. aceasta curba, avand VR experimental si cunoscand T\ se poate
Exemplu: purificarea proteinelor dupa marcare cu !131. deduce M.
- Analiza unui amestec de macromolecuie. In domeniul farmaceutic aceasta Tsi gaseste
Exemple: aplicabilitatea la determinarea masei molare a
« purificarea fractiunilor plasmatice pentru prepararea de imunoglobulinelor IgG existente sub diverse forme farmaceutice
medicamente sau reactivi de diagnostic; (Tn presupunerea ca aproximativ 90% din IgG sunt prezente
« analiza si studiul stabilitatii materialelor plastice sub forma de monomeri si numai 10% sub forma de dimeri).
(ambalaje).
- Separarea celulelor (limfocite izolate de monocite prin H. Cromatografia de afinitate
cromatografie pe gel de dextran).
- Fractionarea moleculeior mici: La baza procesului de afinitate stau interactiuni de
© analiza peptidelor; natura biochimica:
© analiza colorantilor Tn industria alimentara. « antigen-anticorp;
- Deterrninarea masei moieculare - se poate realiza Tn doua • enzime-inhibitor sau substrat;
moduri: • hormon-transportor sau receptor.
227
226

matrice ligand liganci Imobilteat
ligand imobilizat proba complex
Figura 2.3.28. Principiu! cromatografiei de afinitate
Caracteristica cea mai importanta a acesteia consta Tn
faptul ca este nevoie sa existe, pe langa interactiuni
electrostatice, o orientare spatiala favorabila. Ligandul,
componenta legata pe suport, leaga reversibil componenta din
solutie (figura 2.3.28). Daca Tn solutie mai exista componente
care nu se potrivesc ligandului, acestea nu vorfi adsorbite.
Dupa ce s-a produs fixarea probei, elutia acesteia se
face cu o solutie ce contine un produs cu o afinitate mai mare
pentru iigand. Procesui de afinitate fiind de natura biochimica
se produce Tntr-un mediu specific si, deci, va fi afectat de
utilizarea unui gradient de concentratie sau pH. Ca liganzi se
folosesc anti-imunoglobulina G, lectine, Cibacrom Blue, etc.
Apiicatii
Cromatografia de afinitate este larg utilizata in procesele
de purificare a medicamentelor de origine biotehnologica sau a
celor derivate din sange.
228
2.3.2. Grama
2.3.2.1 Principiu §i tehnica
Interesul crescut manifestat Tncepand cu anii '80 ai
secolului trecut pentru Cromatografia de lichide se datoreaza
nevoiior tot mai mari de a se analiza cornpus.! cu masa
moleculara mare, instabili termic, sau compu§i biologici, fara
efectuarea unor reactii auxiliare.
Principalele progrese au fost realizate Tn domeniul
materialelor folosite ca umpluturi si sisternelor de transport al
eluentului sub presiune.
In Cromatografia de lichide de Tnaita performanta pe
coloana sunt necesare presiuni mari pentru a vehicula cu debite
corespunzatoare faza mobila iichida prin faza stationara a caret
granuiatie este mica (3-10 urn).
Tn principiu un cromatograf de lichide este format din
(figura 2.3.29):
• pom pa
® injector
« coloana cromatografica cu sau fara termostat
« detector
* sistern de achizitie si prelucrare B datelor (computer)
Toate eiernentele sistemului cromatografic pot fi
actionate prin intermediu! computerului. Daca se face
cromatografie preparativa, se utilizeaza un colector de fractiuni
iar Tn unele cazuri, din motive economice, faza mobila se
recircula. Acest iucru nu afecteaza analiza urmatoare deoarece,
detectoru! compenseaza !a Tnceputul analizei semnalul dat de
faza mobila.
229
 coloana detector interfata ete
comunicare
sistem comanda
HPLC §i prelucrare
date
,1,1 1*—?
1 general, simple si ieftine si se folosesc cSnd pemneabilitatea
I f aza mobila (eluent)
Figura 2.3,20. Schema w.r»ul cromatograf de lichide
A. Pompele
Pompele utilizate Tn cromatografia de lichide de Tnalta
performanta sunt capabile sa produca presiuni Tnalte deoarece
faza mobila este fortata sa treaca prin patul cromatografic
alcatuit din particule mici ce opun o rezistenta mare la curgere.
Pentru accelerarea transportului se utilizau la Tnceput
trompa de vid sau pompele peristaltice. Pompele moderne sunt
dispozitive extrem de pretentioase, atat din punct de vedere al
confectionarii cat §i al utilizarii. Exista douS tipuri principale de
pompe:
• cu presiune constants
e cu debit constant care pot fi:
1. pompe cu presiune aplicata prin intermediul unei
membrane sau ai unui amplificator de presiune.
2. pompe cu piston cu o singura cursa (tip seringa).
3. pompe aspiratoare-respingatoare cu piston.
4. pompe cu piston cu bataie scurta.
230
Pompe de presiune constants
Pompele ce functioneaza cu presiune constants sunt, Tn
coloanei, temperature §i vascozitatea eluentului sunt
mentinute constante. Sunt lipsite de pulsatii si debitul poate
fi variat cu usurinta, dar prezinta dezavantajul ca prin
aplicarea directa a presiunii gazului inert are loc si
dizolvarea acestuia Tn eluent. Pe masurS ce presiunea din
coloana scade, buiele de gaz dizolvate se vor degaja sub
forma de bule Tn interiorul coioanei sau Tn detector. Aceste
pornpe lucreaza la presiuni mici si nu pot fi apiicate
gradiente de elutie.
Pompe cu debit constant
1. Un piston este deplasat rapid cu ajutorul unui disc excentric,
determinand Tmpingerea unui ulei hidraulic spre o
membrana. Compresia membrane! mic§oreaza volumul din
spatiui de trecere a eiuentului, fortandu-l sa Tnainteze.
Membrana este confectionata din otei. Regimul de
functionare a pompei este discontinuu dar pompele moderne
au Tncorporate un regulator de debit ce amelioreaza pulsafia
eluentuiui.
2. Aceste pompe sunt folosite, de asemenea, Tn multe
cromatografe de lichide, avantajul lor constand Tn faptul ca
pot livra un debit constant fara pulsatii. Un exemplu este
pornpa Varian de 350 atm care are o capacitate de 250 ml si
un debit reglabil Tntre 0-200 ml/h. Pompa asigura transportul
eluentuiui cu o precizie de de ±1% iar reproductibilitatea
vitezei de curgere este de ±0.1%. Fluctuatiile prin pulsatie
sau alte deviatii sunt mai mici de ±0.1% si sunt nedetectabile
chiar de detectorii cei mai sensibili la debit. Pompele din
aceasta categorie sunt Tnsa scumpe dar sunt foarte indicate
Tn cazul utilizarii gradientilor.
3. Pompeie aspiratoare-respingatoare cu piston sau diafragma
desi prezinta avantaj fata de pompele cu presiune
231

constanta, in sensul ca furnizeaza un debit constant si
reproductibil, introduc pulsatii care sunt simtite de detectorii
sensibili cu volurn mic. De aceea utilizarea lor este
conditionatS de foiosirea unui dispozitiv de atenuare a
pulsatiilor.
4. In comparable cu pompele cu membrana, pompele cu piston
si bataie scurta deplaseaza direct solventul, fara ajutorul
unui lichid sau membrana. Pistonul trebuie sa fie
confectionat din safir si sa fie rezistent la coroziune chirnica
sau rnecanica. Bataia scurta a acestor pompe este asigurata
de rotatia asimetrica a unei came. Profilul debitului obtinut
cu o astfel de pompa este redat Tn figura 2.3.30.
Debit
Timp
0.2s
Figura 2.3.30. Profilul debitului obtinut cu o pompa cu bataie
scurta
Elutia se poate face Tn regim:
« izocratic - compozitia sj debitu! fazei mobile sunt mentinute
constante pe tot timpul Tnregistrarii cromatogramei
• cu gradient - compozitia si/sau debitu! (mai rar) fazei mobile
variaza Tn timpul Tnregistrarii cromatogramei; Tn acest caz
trebuie sa se asigure, Tnainte de o noua injectare, un interval
de tirnp necesar reechiiibrarii coloanei ia compozitia initiala;
pompele reaiizeaza elutia cu gradient prin amestecarea
componenteior fazei mobile la presiune joasa (se folose§te o
232
singura pompa ce asigura si amesteca proportiile necesare
din fiecare solvent aflat m rezervoare diferite) sau la
presiune Tnalta (este nevoie de eel putin 2 pompe si un
mixer ce reaiizeaza amestecarea sub presiune)
B.jn'iectorul
Importanta calitatilor acestei componente a sistemului
cromatografic rezulta din constatarile experimentale potrivit
carora se poate obtine o separare necorespunzatoare, chiar §i
cu o coioana foarte buna, daca injectarea nu s-a facut corect. O
injectare corecta se face atunci cand nu se introduce aer Tn
spatiul de injectare.
Exista diferite tipuri de injectoare:
» injector cu sept;
• sistem de injectie fara sept;
« injector cu bucla - proba este introdusa mai Tntai Tntr-un
capiiar de unde este preluata de faza mobila;
» autoinjector ~ injectarea probelor se face programat; fiecare
proba este introdusa dintr-o fiola specials asezata Tntr-un
suport special.
C. Termostatul coloanei
De foarte multe ori este necesara menVmerea unei
temperaturi Tn coioana cromatografica diferita de temperatura
ambianta, temperatura care este asigurata cu ajutorul unui
termostat Tn care pot fi introduse simultan mai multe coloane.
DJDetectorui
Detectoru! reprezinta acea parte a cromatografului
capabila sa recunoasca substanta ce ajunge la nivelul ei,
Schirnbarea Tn compozitia fazei mobile este transformata Tn
semnal electric ce este transmis la sistemul de prelucrare a
datelor.
Un detector idea! trebuie:
• sa aiba aceeasi sensibilitate pentru toate componentele;
233
 sa nu fie influentat de variatia temperaturii sau de
schimbarile Tn compozitia fazei mobile;
sa detecteze cantitati foarte mici de proba;
sa aiba un raspuns rapid pentru a asigura Tnregistrarea
componentelor ce tree rapid prin celula;
sa fie usor de manipulat §i robust.
Un detector este caracterizat de mai multi parametri:
Seiectsvitatea descrie acea caracteristica a detectorilor de a
sesiza orice schimbare Tn proprietatile eluentului ce ajunge
la detector.
Specificitatea detectoruiui se refera la capacitatea de a
sesiza discriminant analitii din proba de analizat, capacitate
bazata pe anumite proprietafi fizico-chimice ale acestora (de
exemplu, absorbtia radiatiei cu o anumita Iungime de unda).
SensibiMtatea de concentrate §1 sensibiiifafea mas lea
Detectorii sensibili fa concentrate produc un semnal S
proportional cu concentratia c a analitului Tn eluent:
S » c [g/ml]
Detector!f sensibiii la variatia fluxuSui de masa produc un
semnal S proportional cu fluxul de masa (numarul de moli n
de substanta ce ajung Tn detector Tn unitatea de timp At):
At s
Cu exceptia detectorilor electrochimic, de conductivitate si
fotoconductivitate, toti ceilalti sunt caracterizati de
sensibiHtatea de concentratie.
Sensibilitatea unui detector nu trebuie sa fie confundata cu
Simita de detectie.
ZgornotuS este variatia liniei de baza atunci cand prin
detector trece nurnai faza mobila. Ceie mai importante
cauze ale cresterii nedorite a acestei variatii sunt fiuctuatia
temperaturii, existenta bulelor de gaz dizolvate Tn faza
mobila, etc.
234
Limita de detectie a unui detector este cea mai mica
cantitate de analit care da un semnal egal cu de 2-3 ori
semnalul zgomotului de fond.
Liniaritatea. Un detector ideal prezinta o dependenta liniara
semnal-concentrafie (figura 2.3.31). Domeniul de liniaritate
pentru un detector UV este 1:10000 (de exemplu, daca
limita superioara' de concentrate este 5x10"* g/ml, limita
inferioara corespunzatoare este 5x10"8 g/ml).
ideal
Semnal
limita de detectie
zgomot
Concentratie
Figura 2.3,31. Domaniul de liniaritate a! detectoruiui
Constanta de timp T masoara cat de rapid poate Tnregistra
detectorul un pic. Constanta de timp poate fi definite ca
timpul minim necesar unui sistem de a Tnregistra 63% din
marimea picului (adesea acest procent este dat ca fiind
98%). Constanta de timp nu trebuie sa fie mai mare de 0,3 s
pentru detectarea picurilor foarte ascutite §i nu trebuie sa
depa§easca 0,1 s pentru cromatografia de lichide foarte
rapid a.
Volumul celuiei detectoruiui trebuie sa aiba o influenta
minima asupra iatimii picuiui. Volumui standard este de 8 p.l.
Se recomanda, de asemenea, ca Tn cazul utilizarii unor
substante foarte polare, ferestrele celuiei sa fie tratate Tn
prealabil cu acestea.
235
 umpluturiior cu granulatie fina se explica prin aceea ca distanta
Tipuri de detectori foiositi: pe care se produce o amestecare radiala este mica. Exista ia
• detectori de absorbtie in UV-VIS, IR; ora actuala coioane cu diametre cuprinse Tntre 50 si 75 nm ale
® detector de fiuorescenta; caror eficienta le fac candidatele viitorului Tn HPLC (consum mic
• detector electrochimic; de solvent!, necesita volume mici de proba, cre§terea numarului
e spectrometru de masa; de talere teoretice, etc.)
• detector de indice de refractie;
« detector de conductivitate; Lungimea coloanelor
• detector de radioactivitate; Variaza Tntre 5 §i 25 cm la coloaneie HPLC uzuale,
• de dicroism circular diametrul granuielor fazei stationare fiind mai mic de 10 j.im.
• de rezonanta rnagnetica nucieara etc.
Precoloanele sau coloaneie de garda
Cei mai des utilizati detectori Tn sistemele cromatografice
HPLC sunt detectorii UV-VIS (la lungime de unda fixa, variabila Sunt destinate protectiei coioanei de constituent!!
sau cu bareta de diode), de fiuorescenta, spectrometre de probelor ce se retin puternic §i se introduc de obicei Tntre
masa si detectorul electrochimic. injector si coloana. Au dimensiuni reduse §i se Tnlocuiesc atunci
cand performanta separarii este afectata. Umpiutura unor astfel
E. Coioane si faze stationare ?n_HP_LC de coioane este, Tn general, similara umpluturii coloanei
Cele mai multe coioane Tn HPLC sunt confectionate din anaiitice.
otel cu crom-nichel-molibden, rezistent la presiunile de lucru din
sistemie HPLC §i inert chimic. Exista si coioane din stida dar si raze/e stationare
din alte materiale cum ar fi polietilena sau tantaiui. La capetele Dintre urnpluturi cea mai utilizata este silicageiul:
tuburilor, materialul de umplere a coloanei esie iimitat de doua
opritoare identice sau diferite care au rolul de a evita
modificarea coloanei Tn timpul operarii prin antrenarea Tn \ .OH n
_
Si
exterior a granuielor de umpiutura. In HPLC se folosesc ca \ .0, ,0-Si n—Si
Si si O
opritoare foite metalice sau din material plastic (Tn genera! 7x 9 •' / n
teflon sau polietilena), de porozitate mai mica sau egala cu a HO o- o-su±o-sr° ,
granuielor de umpiutura. OH
OH
V/ I i

Diametral coloanelor Figura 2,3,32. Structure ehimiea a silicageiulu:

Desi pot fi utilizate si coioane cu diametre similare celor
din cromatografia ciasica, s-a dovedit ca cele mai bune
rez.ultate se obtin atunci cand se folosesc coioane cu diametre
de 2-5 rnm (ce! mai adesea 4 si 4,6 mrn). Coloaneie cu
diametru! mai mare se foiosesc Tn scop preparativ. Eficienta
marita a coloaneior capilare (diametrul < 1 mm) Tn cazui
236
Se obtine prin hidroliza totaia a siiicatuiui de sodiu,
tetraalcoxisiianuiui, urmata de condensare pentru a obtine acid
poiisiiicic si deshidratare. Acest tip de silicagel are forma
neregulata.
237
 Silicagelul de forma sferica se obtine, de exemplu, din 2.3.2.2 Alegerea unei metode HPLC
tetraetoxisilan prin transformare Tn polietoxisilan lichid si acesta
este apoi emulsionat Tn amestec etanol-apa. Alegerea unei metode HPLC se face tinand cont de
Gruparile OH de pe suprafata pot fi modificate chimic, masa moleculara sj solubilitatea analitului, urmand schema
a§a cum s-a aratat Tn capitolele anterioare, pentru a da faze
urmatoare:
stationare cu proprietati specifice. Figura 2.3.33 ilustreaza
cateva tipuri de modificari ale suprafetelor de silicagel.
r—
Solubil in
Q-Si-OH + HO-R --> Q-Si-OR + H2O (la 150-250°C, 3-8 h)
D-Si-OH + SOCI2 -> D-Si-CI + SO2 + HCI
I hexan

Solubil in Solubil Tn
D-Si-CI + H2N-R -> D-Si-NH-R + HCI solvent! metanol,
organic! ! metanol/ Faza Inversa Faze legate C18, C8,
mediu (legata) fenil, C4, CN
apa
anhidru i 4 Umplutura hidrofoba cu
1 Solubil Tn Molecule mici prin
D-Si-OH + CI-Si(CH3)2-R D-Si-0-Si(CH3)2-R tetrahidro- GPC* pori mici
AnaHtcu | furan
mediu
anhidru
M<2000 Solubil
tetrahidra-
Tn
cia c8
Molecule mici prin Umplutura hidrofoba cu

**™[igjs ' '

GPC* pori mici
D-Si-OH + CI-SiRz-CI D-Si-O-SiR2 -Cl + HCI 1 1 furan
. f
Neionic
H2O

;
Solubil Tn
apa
1-—
?**?*, xTS'-a
(control .omzare) '(^'n'trol|onizare)'
Q-Si-O-SiR2 -OH + HCI Ionic FazS inversa cu Faze legate C18, C8,
aerechi de ioni fenil, C4, CN, NHZ
Schimbatori de ioni
H20 i J
Faze chirale
Q-Si-0-SiR2 -OH + CI-SiR'a -Cl -> D-Si-O-SiR2 -O-(SiR'2 -O)n -H Analit chiral Chiral
Solubil in Umplutura polimericS
solvent! GPC* j macroporosa
inici Umplutura hidrofila cu
Filtrare pe gel domeniu de fract,ionare
Fazele modificate chimic se folosesc §i Tn cromatografia ' adecvat

de afinitate, cu schimbator de ioni sau cromatografia chiraia. Analit cu Schimb ionic I %™££ ™ «"
M > 2000 Solubil in
Alte tipuri de umpluturi:
apa
• stiren-divinilbenzen; ^
legata — S«..N5S
mari)
• alumina; Hir.. I Faze legate fenil, C5,
"_ I C4, C3, C5OH
« silicat de magneziu; hydrophobic chromatography
*GPC - gel-permeation chromatography, "HIC
« gelul de hidroximetacrilat;
• hidroxilapatita;
• agaroza;
e grafit poros.

239
238

2.3.2.3 Catena considerente privind dezvoltarea
unei metode HPLC
In dezvoltarea unei metode cromatografice de analiza,
este esenfial studiul bibliografic ai unor metode de separare a
compu§ilor cu structure similara cu cea a substantelor luate Tn
lucru, daca substantele nu au mai fost caracterizate
cromatografic sau daca publicatiile ce se refera direct la
compusii de interes, necesita o dbtare tehnica neaccesibila la
momentul respectiv. Informatia primita este utila pentru
alegerea sistemului de detectie si a metodei de pregatire a
probei pentru analiza. Pe de alts parte, o metoda HPLC
publicata se dovedeste deseori nereproductibila Tn practica, fie
datorita imposibilitatii realizarii aceiorasi conditii tehnice, fie a
diferenteior ce pot sa existe Tntre coloanele cromatografice cu
aceeasi umplutura sj aceleasi dimensiuni, chiar daca provin de
la aceeasi firma. Este de preferat, deci, sa se Tncerce punerea
la punct a unei metode noi, pornind de la cateva principii de
baza Tn cromatografia de lichide Tn faza inversata.
In acest sens, un prim pas consta Tn cunoasterea
structurii chimice sau a naturii componentilor ce urmeaza a fi
separati din proba. Informatiile legate de proba sunt utile pentru
a putea alege corect modu! de prelucrare a acesteia §i sistemul
de detectie si a evita eventualele probleme care pot sa apara Tn
timpul punerii la punct a metodei. in uneie cazuri este posibil sa
se faca optimizarea separarii cromatografice a unor substante
prin modelare pe calculator daca sistemul cromatografic este
automatizat si daca elementele experimental sunt alese cu
atentie. Pentru cele mai multe probe, Tnsa, aceasta posibilitate
este practic imposibila.
Dintre principiile care pot sta la baza punerii la punct a
unei separari Tn cromatografia de iichide putem aminti:
• modificarea acelor conditii experimentale care pot schimba
Tn mod apreciabil seiectivitatea
® evitarea acelor probleme care afecteaza robustefea metodei
« reducerea numarului de verificari printr-o gandire
practica sau simulare pe calculator
240
« selectarea acelor conditii experimentale care pot fi valabile
pentru orice proba "normala"
• evitarea alegerii unor conditii experimentale neeconomice
sau dificile (schimbarea coioanei, utilizarea unor amestecuri
complicate de solvent!, etc.)
In general, atunci cand se doreste utilizarea metodei
HPLC Tn faza inversa se porneste de la cateva conditii initiate
care sunt grupate Tn tabelul 2.3.4.
Tabeiul 2.3.4. Conditii initiate de la care se poate porni Tn
dezvoltarea unei metode HPLC in faza inversa
Umplutura coioanei C8 sau C18
Dimensiunile 150 x 4,6 mm, particule de 5 sau 75 x 4,6
coioanei mm, particule de 3,5 ^m
Debitui fazei mobile 2,0 ml/min
acetonitril - apa, pentru probe neutre, sau
acetonitril - tampon, pentru probe ionice; ca
tampon 25 - 50 mM fosfat de potasiu la pH 2 -
Faza rnobila 3 (este de preferat un pH mai scazut, daca
coloana este stabila); se recomanda pentru
tatonari o elutie cu un gradient de 5 - 10%
acetonitri! Tn 60 de minute.
Temperatura 35 sau 40°C
IVlarimea probei <50 nl; 50-100
Modui de manipulare a variabilelor experimentale
depinde de abilitatea, pregatirea §i experienta celui care
realizeaza experimentul, conditiile tehnice de care dispune si,
nu Tn ultimul rand, de scopul determinarilor.
In figura urmatoare este schematizata separarea
amestecurilor de substante cu compozijie necunoscuta prin
HPLC Tn faza inversa.
' Probele normals sunt probe ce contin substante organice cu mase rnoieculare obifnuite.
Probe speciale sunt cele care contin ioni anorganici, izomeri de separat, biomolecule, polimeri,
carbohidrati.
241
 2.3.2.4 Aplicatii ale cromatografiei de lichide de
r,.
g Q)
C c 0>
x OJ ^ C >CO 2 •<£
malta performanta pe coloana in domeniul
o
Iffi ta;F=2coaj:=
3 co
farmaceutic
Ha
o
S g » .1 T .i 1 1 JL = 1
V) - 'aS'wOc'io^ictoS?^
Q 3 f ^ J £ N ^ -| N | 'g*
f"
izu

3 - §l7rol'7€'ft7n7 Din 1975 cromatografia de lichide de Tnalta performanta

O
© pe coloana (HPLC) este descrisa Tn Farmacopeea Statelor
e
3! i s ^ u = 2
-. tD
Unite §i de atunci dezvoltarea §i extinderea aplicabilitatii acestei
S3 " tehnici au fost continue astfel ca Tn prezent este cea mai
°N populara metoda de analiza instrumental Tn laboratoarele de
o •sll-jl^feglgS
a. *&s§g^S3«^
analiza §i control din domeniul farmaceutic.
o
o - :'. 3«.' . /N : , ' . ' • •
UJ • •
A. Dozarea substantelor medicamentoase din forme
o :s_^ i farmaceutice
o
o co o 3 ^ co
1 E
- "*
N g -°
8.0. < N
S
Exists numeroase date bibliografice Tn care sunt
re
'4=-^ "O '-5 prezentate diferite metode HPLC utile Tn analiza de rutina a
'3 formelor farmaceutice. Se apeleaza Tn acest scop la coloane cu
faza inversa, de obicei, eiu^ie izocratica sau cu gradient, Tn
a Z)
functie de rezolutia dorita, iar detectia se face, Tn general, Tn
0)
ultraviolet dar §i electrochimic sau prin fiuorescenta.
In forma cea mai simpla o dozare a unei substante
^
E medicamentoase Tn diferite forme farmaceutice prin HPLC
IOZ=

o- 3 '«• 'N presupune urmatoarele etape:

N I
a) ° "8*1 .Ki.
*-cs o c • recoltarea probelor din lotul de analizat
i*«. E tDgioS Ero
<E -^ "3" o ro
^
UJ .N 8 TO « O 1)
"^ ^" • pregatirea solutiei proba
O (D
• pregatirea unei solutii standard de analit cu o concentrate
'5 03 Q) "D
nJ
e. i 3 2 ? '-g
foarte apropiata de concentratia asteptata Tn proba
» analiza prin HPLC a solutiilor standard, respectiv, proba
.E =>
Z
• sillli
8 3ra
° '1 i
• masurarea Tnaltimii sau ariei picurilor corespunzatoare
a, , analitului Tn cromatograma etalon si, respectiv, proba
lllil-E-E
"™ 5 3 .9 « o S .S
« calcularea concentratiei analitului Tn solutia proba, calcul
^,
3:|. bazat pe faptul ca inaltimea (aria) picului unei substante Tntr-
a,
o cromatograma este proportionala cu concentratia acesteia
CO 'S 1 3
Ki o. < 13 •• z Tn solutia de analizat
.yp Q bO '~
E .
Schem

CO • raportarea concentrate! gasite Tn solutia proba la unitatea de

- -> --i% < g
.ml-
'3"'g.N
S i 0.
forma farmaceutica analizata

243
242
 T
Numarul referintelor bibliografice este impresionant
Exemplu pentru orice medicament luat Tn considerare. lata Tn continuare
Dozarea teofilinei ?n comprimatele sau supozitoarele de numai cateva informatii extrase din literatura de specialitate
Aminofilina legate de ondansetron, Tncercand astfel sa se arate ca printr-o
informare cat mai completa se pot reduce considerabil costurile
Conditii cromatograficQ §i timpul afectat unui studiu dat.
Coloana: Hypersil ODS (faza" stationara iegata C18) 5 urn, 10 cm x 4,6 mm
In tabelu! 2.3.5. sunt prezentate conditiile cromatografice
Faza mobila: metanol:tampon acetat pH 4,8 (15:85)
Debitul fazei mobile: 1,5 ml/min utilizate la determinarea cantitativa a unor principii active din
Detecfle: la 254 nm sau 272 nm forme farmaceutice.
Volum de injectare: 20 |il
Solutii standard'. Se prepare o serie de solutii standard te teofilina Tn faza Tabeiul 2.3.5. Exempie de conditii cromatografice utilizate ia
mobila cu concentratiile 50,100,150, 200 si 250 ng/ml. dozarea unor principji active din forme farmaceutice
Solufia proba: Se cantaresc si se pulverizeaza 20 comprimate de
aminofilina. Se adauga 80 ml tampon fosfat pH 9 la o cantitate exact
;/i
lplsMfena:£T_| . Jfiliptf^pllfo-
.SMiilifi
cantarita de pulbere de comprimate ce contine 80 mg teofilina si se agita Spherisorb CN NaH2PO4 pH 5,4 - 216 nm
mecanic 30 de minute. Se dilueazS la 100 ml cu apa, se agita si se filtreaza 5 nm acetonitril (50:50)
prin hartie de filtru Whatman Nr. 1. De dilueaza 5 ml filtrat la 20 ml cu faza Acetonitril -
Ondansetron Silice 5 |im CH3COONa 0,025 302 nm Teza
mobila rezultand astfel o solute cu concentratia de aproximativ 200 ng/m! doctoral
clorhidrat M (pH 4,2) (50:50)
teofilinS, 0,02 M NaH2PO4
La extractia din supozitoare, se disperseaza o cantitate de supozitoare Spherisorb CN pH 5,4 - 216 nm
echivalenta la aproximativ 80 mg teofilinS Tn 20 ml cloroform. Se extrage cu 5 nm
3 portyuni a cate 25 ml de tampon cu pH 9, combinand apoi extractele sj acetonitril (50:50)
diluand la 100 mi cu apa. Se dilueaza 5 ml faza apoasa la 20 ml cu faza Metanol - azotat Pye
Alcaloizi de Partisil 10 de amoniu 1 M 254 nm Unicam
mobila. opi'J (80:20)
Tampon acetat pH 4,8: Se amesteca 2 ml acid acetic glacial cu apa (70 ml),
se aduce la pH 4,8 cu hidroxid de sodiu 1 M (necesita aproximativ 17 ml) si Cpr. cu
Hewlett
aspirina, ODS 3 nm, Hypersil Gradient 240 nm
se dilueaza la 100 m! cu apa. Packard
Tampon fosfat pH 9: Se dizolva 2,84 g fosfat acid disodic Tn apa (600 ml), se cofeina,
aduce la pH 9 cu hidroxid de sodiu 1 M si se dilueaza la 1 I cu apS. Apa - metanol
Experiment: Se cromatografiaza soiutiile etalon si se confirma Supelcosil LC18 220 nm Supelco
Barbiturice (50:501
proportionalitatea existenta Tntre Tnaltimea sau aria picurilor si concentrate
Cloroform -
(pe baza coeficientului de corelare). Dupa cromatografierea solutiei proba,
Clomifen metanol - 254 nm BP
se raporteaza Tnaltimea sau aria picului teofilinei Tn cromatograma proba la Silice 10 nm
(izomeri EZ) trietanolaminci
curba de calibrare A = f(c) obtinuta cu soiutiile standard stabilindu-se astfel
(98:2:0,051
concentratia teofilinei. Se calculeaza apoi cantitatea de teofilina
Acetonitrihapa: Teza de
corespunzatoare unitatji farmaceutice. Se verifies apoi daca valoarea 280 nm
Omeprazol Zorbax extend C1 8 Trietilamina 1%- doctorat
concentratiei per unitate farmaceutica se Tncadreaza Tn limitele prevazute de
gradient
farmacopee.

Oricare ar fi substanta medicamentoasa cercetata, Stabilitatea medicamentelor este iarasi un domeniu

studierea datelor din literatura constituie un prim pas important
Tn dezvoltarea unei metode proprii de dozare prin HPLC a
acesteia, apoi m functie de dotarea proprie §i de scopul urmarit
se aleg acele variabile experimentale initiale care sa conduca la
rezultatul dorit.
244
extrem de important Tn evaluarea potentialuiui farmaceutic a!
unui produs medicamentos. In acest caz, pe langa dozarea
substantei active, sunt imperios necesare identificarea si
cuantificarea impuritatilor (figura 2.3.34).
245
 Substance asociate Wetoda |~":.:.\::v./;,i{ilR0?ultate.v-:
Instabilitate In ambalaj de
Lorazepam HPLC
polipropilena.
Sulfat de morfina Vizuala Stabilitate 7 zile la 32°C, 31 de
Clorhidrat de hidromorfona HPLC zile la 22°C Tn ser fiziologic.
Stabilitate pana la 4 h. Cone,
Ranitidina HPLC (mg/ml)- 0,03 sau 0,1 sau 0,3 :
0,5 sau 2,0.
Stabilitate 4 h Tn ambalaj de
Vizuala
Paclitaxel sticla. Cone, (mg/ml) - 0,03
HPLC
sau 0,3 : 0,3 sau 1,2.
Stabilitate 4 h la temperatura
camerei. Cone, (mg/ml) -
Fluconazol, Aztreonam
HPLC 0,015 sau 0,15 : 1, 0,015 sau
Ceftazidima, Cefazolina
0,15:20, 0,015 sau 0,15 : 20,
respectiv, 0,01 5 etc.
Stabilitate 4 zile la 23-25°C, 8
Vizuala zile la 4°C. Conc.(mg/ml) -
Ciclofosfamida
HPLC 0,05 : 0,3, Tn ser fiziologic; 0,4
15min; : 2, Tn solutie 5% dextroza.
Stabilitate 24 h la 2-8°C si 168
h la 30°C, Tn ambalaj de
Vizuala clorura de polivinil.
Cisplatin
Figura 2.3.34, Cromaiograma omeprazoiului §\ impur!ta$ilor sale HPLC Stabilitate 168 h la 2-8°C §i 24
h la 30°C, Tn ambalaj de
Studierea stabilitatii unei substante medicamentoase se poliizopren. Cone. 0,480 : 0,2.
Stabilitate 31 de zile la 4,
face Tn variate conditii experimentale (tabelul 2.3.6). Masurarea
turbiditajii 22°C, 7 zile la 32°C.
Petidina
HPLC Conc.(mg/ml) - 0,1 sau 1 : 4,
Tabelul 2 3 6 . Date bibliografice privind stabilitatea ambalaj de clorura de polivinil.
ondansetronului clorhidrat Tn asociere cu alte medicamente Stabilitate 48 h, exceptie
dacarbazina. Cone. (mg/ml) -
Citarabina, Dacarbazina
Vizuala 0,03 sau 0,3 : 0,2 sau 40; 0,03
Doxorubicina, Etopozid
HPLC sau 0,3 : 1 sau 3; 0,03 sau 0,3
Metotrexat
Aciclovir sodic, Aminofilina, : 0,1 sau 2; 0,03 sau 0,3 : 0,1
Amfotericina B, Ampicilina Examinare sau 0,4; respectiv, 0,03 etc.
Incompatibilitate Separare cromatografica cu
sodica, Amsacrina, vizuala
Fluorouracil detectie Tn UV, coioana fenil.
Furosemid Propofol HPLC Linearitate 2,5 - 37,5 ng-ml,
Stabilitate 1 h Tn solutie de acuratete 0,4 - 2,4 %, precizie
dextroza5% si solutie de NaCI 0,2 - 0,6%.
9%, ambalaj de sticla sau Neostigmina, Naloxona,
HPLC polipropilena, temperatura Separare cromatografica,
Dexametazona Droperidol, Midazolam
HPLC detectie UV, coioana de silice
camerei. Stabilitate 30 de zile Ranitidina, Fentanil,
sau fenil.
Ja2-6°C, ambalaj de poliester. Alfentanil

247
246
 Stabilitate la amestecare 1:1 Tabelul 2.3.7. Strategii Tn studiul cromatografie al granisetronului
Tntr-un tub de testare. Tn (G) Tn medii biologice
Ciclosporina Vizuala dispozitiv de perfuzare Coioana . • Eiusnt Detectie Obseryatii
Aplicatie
Clorhidrat de dopamina acetonitril-
rezultate neconcludente. Validarea unui
studiu prin acetat de
HPLC a farma- Spheri-5 silica sodiu 305 nm
Din analiza datelor tabelare se constata ca studiile de stabilitate cocineticii G- 10 cm x4,6 mm 0.025M pH
se bazeaza de foarte muite ori pe dozari prin cromatografie de ului la animale 4,2
lichide de Tnalta performanta pe coloana, situatie Tntalnita la mici (40 : 60)
Validarea unei
majoritatea medicamentelor.
metode de
detectie a G- acetonitril calibrare cu
B. Studii de biofarmacie si farmacocinetica Spherisorb CN tampon Xex=305nm standard
ului Tn plasma 10).im
umana fosfat pH 4,5 Xem=365nm intern
25 cm x 4,6mm (15:85)
Biodisponibilitatea unei substante medicamentoase dintr- aplicabila Tn
un produs farmaceutic trebuie sa fie cunoscuta si reproductibila. studii de
Aceasta cerinta se pune §i Tn cazul Tn care un produs farmacocinetica
acetat de
farmaceutic se mlocuieste cu altul. Noul produs farmaceutic se Determinarea amoniu 0,1
spune ca trebuie sa fie bioechivalent cu produsul pe care Tl simultana a G- Develosil M pH 4,7 cu calibrare cu
Tnlocuie§te, aceasta apreciere bazandu-se pe compararea ului alaturi de 1 % hidroxid Xex=310 nm standard
ODS-5 5|im de tetra-M- Xem=420nm intern
statistics a profilurilor concentratiilor substantei metabolitul sau 25 cm x 4,6 mm
principal 7-OH- butil-amoniu
medicamentoase din fluide biologice dupa administrare la §\ metanol
G
voluntari sanatosj. Studiile de bioechivalenta se bazeaza Tn (7:3)
majoritatea cazurilor pe cuantificarea prin HPLC pe coloana a acetat 0,1 M
analitului din fluidul biologic. pH 4,7 cu 0,15V
In tabelul urmator sunt prezentate cumulat cateva date Determinarea 10mM 0,35V
G-ului §i 7-OH- Zorbax RXC8 hexan-
bibliografice privind studierea prin HPLC a farmacocineticii XBX=305 nm
G din plasma 15 cm x 2,1 mm sulfonat de
granisetronului, un potent antiemetic blocant al receptorilor 5- sodiu -
Xem=360nm
umana Qf)
ou o
0
C
s- serotoninergici. acetonitril
(405:95)
acetat de
Determinarea amoniu
G-ului si 7-OH- C8 0.05M pH SM
G din plasma 5 cm x4,6 mm 5,0-
prin HPLC-SM acetonitri!
(3:27)
metanol -
acetat de
Spherisorb CN sodiu 0,05 M XeX=305 nm
Studiu de „.
5(im Xern=360nm
bioechivalenta 25 cm x 4,6 mm pH 6 0,25 %
trietilamina
(70:30)
249
248
 DeteG^lMPSiBH
Un aspect deosebit de important a! dezvoltarii unei Specificitatea 30%metanol calibrare "I
metode cromatografice aplicabile Tn studii de farmacocinetica si Supelcosil cu
determinarii IVi 9%tetrahidrofuran 273 nm
LC8DB standard
bioechivalenta Tl reprezinta asigurarea specificitatii Tn raport cu din ser Tn 0,01 M KH2PO4
intern
substantele endogene §i produsji de metabolizare. Stabilirea Tampon fosfat calibrare
limitei de cuantificare (cea mai mica concentrate ce poate fi Validarea unei
Cianopropil 15mMpH6,8- cu
metode de 280 nm
cuantificata, cu metoda respectiva, Tn conditii acceptabile de dozare din ser
-silan meianol - standard
acuratete §i precizie) si a intervalului de cuantificare ale metodei acetonitril intern
reprezinta deseori o etapa dificila Tntrucat ele trebuie sa permita Cres.terea calibrare
sensibilitatii 1 0% acetonitril Tn
Spherisorb cu
obtinerea unor profiluri de concentrate Tn plasma care sa detectiei din CN 0,01 5 M acid +0.77V
standard
acopere 80% din doza administrate. fosforic pH 4,4
plasma intern
Cresterea
C. Studii de metabolism al medicamenteSor sensibilitatii calibrare
detectiei din Perclorat de
Spherisorb cu
amoniu 254 nm
plasma, alaturi S5W standard
Metabolizarea fi influenta metabolizarii medicamentelor de alte
10 mM, pH6,7 +1.2V
intern
sunt elemente de baza ale cercetarii fundamental a unui medicamente
medicament. Datele sunt numeroase si, practic, aceasta Utilizarea
cercetare este continua pentru un medicament dat. fluorescentei T, calibrare
^-ex
lata cateva exemple de astfel de studii realizate Tn cazu! native a M la Supelcosil 0.03M acid acetic- cu
determinari din LC18DB 307nm
acetonitril (75:25) -i standard
rnetoclopramidului, observandu-se si Tn acest caz apiicabiiitatea urina sj plasma f^em
intern
metodei HPLC. prin HPLC 380nm

Tabelu! 2.3.8, Date cromatografice privind analiza 50ml/l acetonitri!

metoclopramidului (M) din fiuide biologice Generalizarea 500ml/l acetonitril
De la
unei metode de in tampon fosfat
Hypersil 210
extractie Tn faz§ 0,05M pH3,0
. :,[ ••;'•,, ,x. " .! solida
C18
375mg/l octilsulfat
la 350
35%acetonitril calibrare
Studiu de de sodiu, 3 ml / 1
1%SDSTnO,61 M cu
metabolizare CN 275 nm trietilamina
acetat de sodiu standard
Plasma, urina pH5,0 intern
10mltrietilamina+
Determinare 760ml apa, pH6,8 caiibrare D. Dozarea principillor active din piante
simultan§ cu alte LiChrosorb cu acid cu
230 nm
medicamente Tn RP8 acetic,+160 ml standard Deoarece aceasta tehnica ofera un grad Tnalt de
plasma acetonitriH-SOm! intern
rezolutie, o sensibiiitate mare (< 50 ,ug), respectiv o
metanol
Analiza din 82%acid acetic Tnregistrare cantitativa a fiecarui component separat, ea este
piasrna Nucleosil 1% astazi o rnetoda indispensabila cercetarilor chemotaxonomice
273 nm
Optimizarea C18 68% acetonitrii- §i este capabila sa ofere "amprenta chimica" a piantei (VAN
extractiei metanol (3:7) SUMERE §i colab. 1985).
Analiza din Lichrosorb Dietilamina- standard
309 nm intern
plasma 5Si60' metanol-CH2CI2
250 251
 lichida (cromatografie gaz-lichid, CGL) sau solida
Tipurile de coloane cele mai des utilizate Tn separarea (cromatografie gaz-solid, CGS).
flavonelor, flavonolilor §i glicozidelor lor, cele mai des studiate In CGL faza stationara este un suport solid inert, ce
principii active din plante prin HPLC, sunt cele cu faze inverse poate fi chiar peretele coloanei cromatografice, impregnat cu un
Cs ,Cis iar sistemele de solvent! sunt: metanol - apa - acid lichid. Cromatografia gaz-solid se realizeaza cu faze stationare
acetic; metanol - apa - acid formic; acetonitril - apa - acid solide poroase de tipul carbon - grafit, silicagel sau alumina.
acetic, Tn sistem isocratic sau cu gradient de concentrate. In
aceste conditii, vor fi eluati Tn primul rand produsii mai polari.
Astfel diglicozidele preced monoglicozidele care la randul lor 2.3.3.2 Tehnica cromatografiei de gaze
preced agliconii.
Tntr-o separare tipica a unei serii de flavonodiglicozide
se folosesc doi solvent! A (1% acid acetic) sj B (metanol) Tn Un gaz-cromatograf cuprinde schematic (figura 2.3.35)
proportii care variaza Tn timpul procesului cromatografic, trei module specifice:
Tncepand de la 20% solvent B Tn solvent A pana la 80% B Tn A » un injector
iar detectorul de absorbtie Tn UV se fixeaza la 270 §i 330nm. « coloana
Alte asemenea combinatii au fost raporiate Tn iiteratura • un detector
de specialitate de catre KINGSTON (1989) iar VANDE CASTEELE Faza mobila care antreneaza proba Tn coloana este un
§i colab. (1982) au descris analiza prin HPLC a 141 agliconi si gaz numit gaz vector. Debitul controlat cu precizie permite o
O-glicozide iar LARDY §i colab. (1984) au analizat un grup de mare repetabilitate a timpilor de reten^ie.
flavon-C-glicozide cu bune rezultate utilizand tehnica HPLC.

2.3.3. Cromatografia Tn faza gazoasa

2.3.3.1 Aspecte generate

Cromatografia Tn faza gazoasa (CG) este o tehnica

foarte raspandita, primele ei aplicatii datand de la Tnceputul
anilor 1940, cu aplicabilitate Tn separarea fractiunilor usoare Tn
rafinariile petroliere. Dezvoltarea sa uiterioara s-a datorat unor
avantaje pe care le prezinta:
• sensibilitate mare
• aplicabilitate pe scara larga Figura 2.3,35. Schema unui gaz eroraatograf
«» elaborarea rapida a unei proceduri analitice
® posibiiitatea automatizarii procesului analitic Analiza Tncepe Tn momentul Tn care o cantitate foarte
CG este o varianta a cromatografiei pe coloana Tn care mica din proba de analizat este introdusa sub forma lichida sau
separarea componentelor dintr-un amestec complex se gazoasa Tn injector care are un rol dublu: transformarea probei
realizeaza Tntre o faza mobila gazoasa §i o faza stationara
253
252
Tn vapori §i antrenarea acesteia spre coloana cromatografica.
Coloana este plasata Tntr-o incinta cu temperatura reglabila.
Moleculele compcnente ale probei, ajungand Tn contact cu faza
statjonara din coloana, vor interac^iona Tn functie de taria
fortelor ce se stabilesc Tntre componente §i adsorbanti (CGS)
sau Tn functie de repartitia lor Tntre faza mobila §i lichidul
stationar (CGL).
Viteza de deplasare a componentelor de-a lungul
coloanei este diferita, fapt care duce !a separarea §i eluarea lor
din coloana Tntr-o anumita ordine. La ie§irea din coloana
componentele eluate succesiv de gazu! vector sunt decelate de
un detector care va sesiza proprietatile ce deosebesc
componentele de gazul vector si produc un semnal care se
Tnregistreaza si care este apoi transformat Tn cromatograma.
Varful cromatografic sau ,,picur corespunde componentului
separat Tn coloana §i trecut prin detector iar Tnaltimea lui este
proportionals cu concentra|ia acestuia Tn faza gazoasa,
Tntocmai ca la cromatografia de lichide pe coloana.
in gaz-cromatografie se defineste, de asemenea, Jinia
de baza a cromatogramei", linia trasata la baza ei atunci cand,
Tn conditii stabilite de lucru, din coloana iese numai gazul
vector.Jara componente.
In cromatografia Tn faza gazoasa, exista patru parametri
operational pentru o faza stationara data:
• lungimea coloanei L
• viteza fazei mobile u (care conditioneaza numarul de
talere teoretice)
» temperatura Tn coloana T
« raportul fazelor ft (care conditioneaza k")
Aparatul permite reglarea temperaturii §i a vitezei fazei
mobile, putandu-se ac^iona astfel asupra eficacitatii si a
factorilor de retentie.
A-JgazuTvectgr
Se utilizeaza ca faza mobila, eel mai adesea, unul din
gazele vectoare: heliu (He), azot (N2), hidrogen (Hz), fie
provenind din cilindri sub presiune, fie obtinute pe loc pornind
254
de la un generator de gaz (N2, H2) care are si avantajul de a
furniza un gaz foarte pur. Mai rar se utilizeaza Ar, Ne.
Gazul vector trebuie sa fie lipsit de urme de hidrocarburi,
de vapori de apa sau de oxigen, prezenta acestora reducand
sensibilitatea unor detectori. Daca gazul vector are provenienta
industriala, este indicata atasarea unui flltru dublu (deshidratant
§i reducator) la intrarea acestuia Tn injector.
Natura gazului vector nu modifica Tntr-o maniera
semnificativa valorile coeficientilor de distributee a compu§ilor
analizati datorita absentei interactiunilor Tntre gaz §i solut,
temperatura este singurul factor de modificare important.
Vascozitatea §i viteza gazului Tntr-o coloana influent,eaza
dispersia compu§ilor Tn faza stationara si difuzia acestora Tn
faza mobila (vezi curba van Deemter), prin urmare actioneaza
asupra parametrilor de eficacitate N §i asupra sensibilitatii
detectiei (figura 2.3.36). Curbele tipice van Deemter
demonstreaza ca dintre cele 3 gaze studiate, hidrogenul este
eel care permite separarea cea mai rapida. Se constata, de
asemenea, o crestere a vascozitatii cu temperatura, heliul fiind
mai vascos decat azotul la aceeasi temperatura.
vascozitate
= L/to H
X ,. - H
H
H
t°c
Figura 2.3.36, Influenza vitezei §i vascozitafii gazului asupra
eiutiei
255
 tn cromatografia de gaze, faza mobiia fiind compresibila,
debitul masurat la ie§irea din coloana trebuie corectat prin
factorul de corectie de compresie J care tine cont de
suprapresiunea Tn partea de sus a coloanei.
Daca pe cromatograma apare un pic datorat unui
compus neretinut, este posibila calcularea vitezei medii de
Tnaintare a gazului vector Tn coloana, u. Pe de alta parte
adaptand un debitmetru cu bula de sapun la ie§irea din
coloana, cunoscandu-i diametrul se poate deduce viteza
gazului vector u0 la iesirea din aparat, la presiunea atmosferica
p0. Raportul Tntre cele doua viteze este egal cu J, factorul de
compresie, raportat la presiunea relative p/po (p presiunea Tn
capul coloanei):
_
u 2
o (P/P 0 ) 3 -1
B. introducerea probei si camera de injectare
Proba sub forma de solutie, de un volum foarte mic (de
exemplu, 0,5 |oJ), este introdusa Tn aparat cu ajutorul unei
microseringi existente sub forma a numeroase modele adaptate
diverselor injectoare si coloane. Pentru probele gazoase se
utilizeaza injectoare cu bucle asemanatoare celor din
cromatografia de lichide.
Injectorul este poarta de intrare a probei Tn cromatograf,
avand Tn acelasi timp §i alte functii: vaporizeaza si antreneaza
amestecul proba - gaz vector Tn capul coloanei. Caracteristicile
injectoarelor ca §i modul de injectare difera Tn functie de
coloanele cu care sunt asociate. Calitatea separarilor depinde
raport de divizare =
de aceasta faza a analizei.
• Injectorul cu vaporizare directs este un tub metalic
captusit cu sticla (insert) strabatut de gazul vector si
Tncalzit la temperatura medie de fierbere a compusilor
cromatografiati. Acul microseringii continand proba
traverseaza una din extremitatile injectorului obturata de
un dop de elastomer siliconat (septum), cealalta
extremitate fiind racordata la coloana Tncalzita. Proba
256
introdusa este imediat vaporizata si injectatS Tn coloana
Tn cateva secunde (figura 2.3.37).
secilune isepi injoelor
i
deiatiu ac BeiingS in
Injeetof
Figura 2.3.37. Schema unui injector cu vaporfears directa
Injector cu sau fara divizare (split sau splitless) se
utilizeaza pentru coloanele capilare. Gazul vector este
introdus cu un debit mare Tn camera de vaporizare unde
se amesteca cu proba injectata. O supapa de scurgere
reglata curent la 50-100 ml/min, divizeaza acest debit
Tn doua fractiuni dintre care cea mai importanta este
eliminate din corpul injectorului antrenand cea rnai mare
parte a probei introduse. Raportul de divizare poate varia
Tntre 20 si 500. Cea mai mica fractiune patrunde Tn
coloana; ea contine fractiunea de proba egala cu raportul
de divizare:
debit deiesire din divizor + debit de iesire coloana
debit de iesire coloana
Acest tip de injector poate functiona si Tn modul fara
divizare pentru solutiiie diluate. Se injecteaza continutul
microseringii lasand supapa Tn pozitie Tnchisa (figura
2.3.38) timp de 0,5 - 1 min cu scopul de a concentra
compu§ii vaporizati §i solventul Tn primii decimetri ai
coloanei. Acest mod de injectare cere experienta si se
257
 face la o temperatura joasa de plecare astfel meat
sept
solventu! sa preceada compusji Tn coloana.
intrare gaz

extremitstea
setingii rScire

aer ete
ie^ire divizor racire

i,_ coloana capilara

Figura 2.3.33. Schema unui injector cu sau fara divizare

Tn analiza cantitativa injectoru! cu divizor poate conduce

la erori de concentrate datorate unor mari diferente Tntre
compusji cu volatilitati diferite. Este recomandata
evitarea acestui tip de injector atunci cand se utilizeaza
metoda standardului extern.
• Injector cu temperatura programata (Programmed
Temperature Vaporizer - PTV) este de constructie
asemanatoare celui cu divizare, permitand prograrnarea
temperaturii Tn camera de injectare de la 20 la 300 °C Tn
cateva zeci de secunde (figura 2.3.39).
Acest tip de injector prezinta urmatoarele avantaje:
- diferentele datorate acului seringii sunt eliminate
- se pot utiliza seringi clasice
- permite un volum mai mare de injectare
- permite eliminarea solventilor sau compu§ilor cu
puncte de fierbere joase
coloana
Figura 2.3.39. Schema unui injector cu temperature
programata
Functioneaza Tn trei moduri:
- injectare la rece Tn modul divizare
- injectare la rece Tn modul fara divizare
- injectare cu eliminarea solventului
• Injector la rece m coloana. Acest procedeu (Cold on
Column - COC) consta Tn injectarea directa a probei Tn
coloana capilara, vaporizarea facandu-se dupa
depunere. Se utilizeaza o microseringa a carui ac cu un
diametru de aproximativ 0,15 mm penetreaza coloana.
C. incinta termostatata

Gaz-cromatograful este dotat cu o incinta Tncalzita,

termostatabila, cu dimensiuni adecvate pentru instalarea
injectorului, coloanei si detectorului.

258 259
 Catarometrul se compune din doua termistoare identice
D. Detectoril plasate Tn doua cavitati rnici ale unui bloc metalic termostatat la
o temperatura superioara celei din coloana (figura 2.3.40).
Se subimpart Tn doua clase:
- universal! - sensibili practic la toate componentele eluate
- specific! - sensibili numai la un tip particular de molecule,
grupari functional sau legaturi chimice
La baza detectiei sta, Tn principiu, orice proprietate care
deosebeste componenta de detectat de eluent, raspunsu!
depinzand de concentratia molara sau masica a solutului Tn •*• -Golector de ioni

gazul vector.
Dupa modul Tn care Tnregistreaza raspunsul se disting:
• Inregsitrator
detector! diferentiali - indica concentratia compusului Tn Eleotrozi
eluent Tn momentul intrarii acestuia Tn detector
detector! integral! - indica concentratia compusului Tn eluent aer sau-exigen

la momentul tR

Detector de conductibilitate termica hidrogen

Detectorul de conductibilitate termica sau catarometru

este un detector universal care se bazeaza pe masurarea
diferentei de conductibilitate termica Tntre eluentul care contine
component!! de analizat si eluentul pur (Ha, N2, He). Este un
detector cu sensibilitate medie.
gaz vector azot

Figura 2.8,41. Defector tie ionizairs Tn flacara

cuva de referinta

Detector de ionizare m flacara

Detectorul de ionizare Tn flacara (Flame lonization

cuva de masura detector - FID) este considerat practic un detector universal
pentru compusii organic!. Curentul gazos iesit din coloana
patrunde Tn flacara unui mic arzator alimentat cu un amestec de
aer si hidrogen. Acest detector distruge proba a carei combustis
produce ioni si particule Tncarcate, responsabile de trecerea
unui curent ionic de intensitate foarte mica (10~12 A) Tntre doi
electrozi (100 - 300 V). Semnalul este amplificat cu ajutorul
Figura 2.3,40. Detector de conductibilitate tenmica
260 261
unui electrometru (figura 2.3.41). Intensitatea semnatului 'in
issire
cazul compusjlor organic! este sensibila la debitul masic a!
probei iar prezenta unor heteroelemente cum sunt halogenii,
pot modifica considerabil semnalul.

Detectorul termoionic
electrozi
Detectorul termoionic este un detector foarte sensibil §i
specific compu§ilor azotati §i fosfatj (NPD). Este constituit dintr-
un mic cilindru din ceramica dopat cu sare alcalina (ex. RbSO4)
Tn care se aplica o tensiune electrica pentru Tntretinerea starii
de plasma (800 °C), alimentata de un amestec aer / hidrogen.
Compusii continand azot sj fosfor dau Tntr-un mod specific
fragmente de descompunere transformate Tn ioni negativi.
Ace§ti ioni sunt captati pe un electrod colector (S = 10~10 g
pentru N §i P, azotul din aer este inactiv).

Detectorul cu captura de electron! gaz vector

Detectorul cu captura de electron! (Electron-Capture Figura 2.3.42. Detector cu captura de electron

Detector - ECD) este un detector selectiv foarte sensibil pentru
derivatii hidrocarbonati cu aplicabilitate Tn cazul analizei
pestici'delor clorurate. Un curent de azot ionizat cu ajutorul unui
flux de electron! generati de o sursa radioactive |3~ de energie
mica, circula Tntre doi electrozi supusj unei diferen|e de
tensiune de 50 - 100 V (figura 2.3.42).
Apare un curent de baza lo datorat electronilor liber!
foarte mobili. Daca moleculele M continand halogeni (F, CI, Br)
traverseaza spatiui dintre cei doi electrozi, ele capteaza o parte
din electron!, formand ioni grei cu mobilitate scazuta.
intensitatea rezultata urmeaza o lege exponential^ de tipu! I = lo
• e"kc, unde lo este intensitatea curentului numai Tn prezenta
gazului vector, I intensitatea curentului Tn prezenta probei Tn
gazu! vector:
262
De retinut: detectoarele de ionizare Tn flacara, detectorul
termoionic §i eel cu captura de electroni trebuie alimentate cu
un debit gazos de minim 20 m!/min, superior debitului real din
coloanele capilare, pentru a da un raspuns corect §i pentru
cre§terea sensibilitatii acestora.
Detectorul cu fotoionizare
Detectorui cu fotoionizare (Photoionization Detector -
PID) este foarte selectiv dar pu|in raspandit, indicat Tn studiui
hidrocarburilor §i al derivator continand S §i P. Principiul
consta Tn iradierea compu§ilor eluati cu fotoni cu energie de 8,4
- 11,8 eV emisj de o lampa UV.
Fotoionizarea se produce atunci cand energia fotonului
este superioara energiei de ionizare a compusului. De exemplu,
un foton cu energia 9,6 eV poate ioniza benzenul (P^ = 9,2 eV)
dar nu si izopropanolul (Ph = 10,2 eV) care va fi prin urmare
foarte putin vizibil pe cromatograma.
263

Detector/ ce conduc la date structural
Detectorii prezentati pana acum nu dau informa|ii asupra
naturii compusilor eluati chiar daca sunt selectivi. Prezenta pe
cromatograma a picurilor asemanatoare poate duce la confuzii
Tn ceea ce prive§te identificarea compu§ilor eluati.
Pentru remedierea acestui neajuns se asociaza mai
multe detectoare complementare sau se utilizeaza detectori ce
permit obtinerea de informatii spectrale Tn legatura directa cu
structure compusului:
a. Detector cu emisie atomica - fiecare atom prezent Tn soiutul
eluat va emite radiatii caracteristice ce vor permite
identificarea lui.
b. Alti detectori - Spectrometrul de masa cuplat la un gaz-
cromatograf (gas-chromatography - mass spectrometry -
GC-MS) ofera posibilitatea detectarii unui numar mare de
compusi dintr-un amestec complex, fiecare compus fiind
identificat prin spectrul sau de masa obtinut prin
introducerea eluatelor direct Tn camera de ionizare a
spectrometrului de masa.
c. Este posibila, de asemenea, utilizarea unui detector Tn 1R
sau UV cand se obtin spectrele caracteristice ale compusjlor
eluati.
2.3.3,3 Co/oane/e utilizate in gaz-cromatografie
Se utilizeaza doua tipuri de coloane:
• coloane cu umpiutura
* coloane capilare
Coloane cu umplutura
Aceste coloane au un diametru de 3,18 sau 6,35 mrn sj o
lungime de 1 pana ia 3 m. Sunt confectionate din tuburi de otel
sau sticla al caror perete intern este tratat pentru evitarea unor
eventuale efecte catalitice asupra probei. Suporta un debit de
gaz vector de 10-40 ml/min. Contin un suport poros §i inert.
264
Este vorba de substante solide cu suprafata specifica de 2- 8
m2/g care se prezinta sub forma de granule sferice cu un
diametru de ~ 0,2 mm. Aceste materiale de umplutura se obtin
pornind de la diatomite, silicati al caror schelet este chimic
comparabil cu eel al silicei, si un liant. Cel mai cunoscut din
aceasta categorie este Chromosorbul. Spherosilul este un
material constituit din granule de silice.
Prezenta numeroaselor grupari silanol confera acestor
suporturi o reactivitate chimica comparabila cu cea a
silicagelului. Aceste suporturi permit grefarea sau impregnarea
fazei stationare Tntr-un procent ce variaza Tntre 3 si 25 %.
Coloanele de acest tip sunt utilizate Tn analizele de
rutina, sunt usor de fabricat dar n-au fost Tnca adaptate pentru
analizele foarte pretentioase.
Coloanele capilare
Sunt Tn general confectionate din silice topita, de o
puritate foarte avansata, obtinuta prin combustia
tetraclorsilanului (SiCI4) Tn atmosfera de oxigen.
Diametrul interior al tuburilor ce servesc la obtinerea
coloanelor capilare variaza Tntre 100 - 530 fim. Capilarele au
grosimea de ~ 50 jam si o lungime de 12 pana la 100 m.
Fragilitatea acestor coloane capilare este redusa prin
acoperirea cu un strat exterior dintr-un polimer termostabil
(poliamida, tmax = 370 °C) care permite Tn acelasi timp rularea
pe un suport metalic circular a acestor capilare.
Exista, de asemenea, tuburi capilare confectionate din
metal (aluminiu, nichel, otel) care, Tn functie de faza stationara,
permit operarea la temperaturi de pana la 450 °C.
Peretele intern al capilarelor sufera diverse tratamente
pentru fixarea adecvata a fazei stationare, faza ce Tl acopera
Tntr-un strat de grosime controlabila 0,05 - 0,5 jxm. Faza
stationara este depusa sau grefata prin legaturi covalente,
eventual urmate de reticularea polimerului pe peretele intern
prin evaporarea unei solutii concentrate sau prin polimerizarea
"in situ" Tn contact cu peretele.
Cele mai cunoscute coloane capilare sunt:
• WCOT - Wall Coated Open Tubular
265
 PLOT - Porous Layer Open Tubular
Schematic o coloana capilara este redata Tn figura
2.3.43.
fazci stationara Inveli? polimeric
sticla de silice
Figura 2.3.43. Sectiune printr-o coloana capilara
Faza stationara
Tn cazul coloanelor cu umplutura, iehnica de impregnare
perrnite folosirea pentru faza stationara a unui numar mare de
compusi organic! putin volatili, ceea ce nu se Tntampla Tn cazul
coloanelor capilare.
Tn prezent exista doua categorii principale de compu§i
utilizati pentru faza stationara, polisiloxanii §i polieiilenglicoiji,
fiecare categorie permitand modificari structural minore. Tn
cazuri particulare (studiul compusiior optic activi, de exempiu)
se utilizeaza faze stationare pe baza de ciclodextrine.
Toate aceste faze functioneaza Tntre doua temperaturi,
una minima, situata sub temperatura la care se realizeaza
echilibrele de concentrate, §i una maxima care define§te limita
de utilizare fara degradare §i care depinde de natura si
grosimea stratului depus.
a. Polisiloxanii
Polisiloxanii cunoscuti §i sub numele de uleiuri sau gume
siliconate sau simplu siliconi constau Tn repetarea prin atomi de
siliciu a unei structuri de baza (monomer) ce comporta doua
lanturi carbonice (R-i, Rz):
R1
O-;Si
O crescuta. Coloanele cu faza de grafit sunt utilizate Tn particular
R2
266
Cele mai mari firme comercializeaza diverse compozitii
cu lanturi alchil sau aril (metil sau fenil) substituite sau nu cu
alte grupari functional (cianopropil, trifluoropropil etc.).
Monomerii combinati Tn diverse proportii permit modelarea
proprietatilor fazei stafionare (polaritate si domeniu de
stabilitate, 50 °C - 300/325 °C pentru dimetilpolisiloxani, Tn
functie de tipul de coloana). Datorita gamei de temperatura
foarte extinse, acestea sunt fazele stationare cele mai utilizate
Tn cazul coloanelor capilare.
b. Polietilenglicolii (PEG)
Reprezentantii cei mai cunoscuti ai acestei clase sunt
tipurile de CARBOWAX® - polimeri polari (M = 1500 - 20000
pentru CARBOWAX 20 M) care pot fi utilizati prin depunere,
impregnare sau grefare pe coloana (40 < T < 240/260 °C Tn
functie de coloana):
c. Faze stationare chirale
Sunt Tn general polisiloxani continand 1 0 - 2 0 % p-
ciclodextrine incluse Tn polimerul de baza. Se utilizeaza Tn
cazurile Tn care intereseaza puritatea optica a analitilor. Daca
se analizeaza un compus organic cu carbon asimetric,
enantiomerii sai nu vor avea aceeasi afinitate pentru faza
stationara Tncarcata cu ciclodextrine, ceea ce se va traduce prin
timpi de retentie diferiti; Tn consecinta daca un compus chimic
pur Tn faza de racemic va da doua picuri egale, fiecare din
aceste picuri corespunde unuia din enantiomeri.
d. Faze stationare solide
Aceste faze sunt constituite din diverse materiale
adsorbante: silice sau alumina dezactivata cu saruri minerale,
sticla, polimeri poro§i, grafit (exempiu, CHROMOSORB®100,
PORAPAK®). Tn cazul coloanelor capilare cu strat poros
(PLOT), aceste materiale se depun Tntr-un strat subtire, sub
forma de particule fine pe peretele intern a! coloanei, servind la
separarea compusilor gazo§i sau a acelora cu volatilitate foarte
267
pentru separarea de N2, CO, CO2 §i a hidrocarburilor foarte
usoare. controlul materiilor prime:
Pentru a putea compara sau prevedea comportamentul o cercetarea impuritatilor, Tn special a solventilor
coloanelor capilare este util sa se calculeze raportui fazelor p = reziduali utilizati Tn etapele de purificare a
VMA/S. Daca se noteaza cu dc diametrul intern al coloanei si cu materiilor prime
6f grosimea filmului depus, un calcul aproximativ duce la o cercetarea intermediarilor de sinteza sau a
substantelor Tnrudite; un exemplu Tl constituie
concluzia ca p = dc/4et (figura 2.3.44).
controlul dimetilanilinei Tn ampicilina sau
amoxicilina dupa protocolul din Farmacopeea
Europeans, editia a IV-a, utilizand ca standard
silice intern naftalina, gaz vector azot si detector de
ionizare Tn flacara; faza stationara este o coloana
Tnveli§ poliamidic cu lungimea de 2 m si diametrul 2 mm umpluta cu
pamanturi silanizate impregnate 3% cu
polimetilfenilsiloxan
Figura 2.3.44. Sectiune printr-o coloana capilara
Semnal
Daca substantele de separat sunt volatile, se alege o coloana detector
cu p < 100 si, invers, pentru compusii cu volatilitate scazuta se
alege o coloana cu p > 100.
(+) mento! (-) mentol
2.3.3.4 Aplicatii ale cromatografiei de gaze In
analiza medicamentelor
Cromatografia Tn faza gazoasa este o rnetoda de
Timp
analiza:
• calitativa prin tp, VR, indicii de retentie de tipul celor
Kowats sau prin studiul spectrelor de masa comparativ
cu cele preTnregistrate Tntr-o biblioteca de spectre Figura 2.3,45, Separarea izomerilor optics ai mentolului prin gaz.-
cromatografie
o cantitativa prin explorarea suprafetei picurilor
Volumele mici de injectare impun utilizarea indiscutabila
a unui etalon intern. Se poate utiliza ca standard intern aceeasi controlul preoaratelor farmaceutice sau a produselor
specie chimica ca cea dozata dar marcata cu izotopi stabili. finite:
Aceasta tehnica creste precizia si acuratetea rezultatelor. o identificarea si dozarea principiilor active (uleiuri
Dintre aplicatiile CG cele mai importante pentru domeniul esentiale, barbiturice, etc.); CG permite, de
farmaceutic se pot aminti: exemplu, separarea si controlul izomerilor
mentolului din uleiul de menta prin cromatografie

269
268
 pe coloana chirala impregnate cu p-ciclodextrine
(figura 2.3.45)
• studii de stabilitete pentru materii prime si produse finite
cu posibilitatea identificarii produsilor de degradare
e studii farmacocinetice: CG este utilizata Tn efectuarea
studiilor de biodisponibilitate si repartitie a principiilor
active medicamentoase Tn organism. Metoda este
frecvent folosita Tn urmarirea terapeutica a unui pacient
prin determinarea concentrafiilor plasmatice de
substanta activa. Aceste studii sunt necesare atunci
cand intervalul. Tntre doza terapeutica si cea toxica este
foarte Tngust
• dozarile hormonale din biochimie fac, de asemenea, apel
la CG (ex. hormonii estrogen!)
270
2.4.1. Generalstati
Cromatografia planara cu cele doua variante ale sale,
cromatografie pe strat subtire (CSS; TLC - Thin Layer
Chromatography) si cromatografia pe hartie (CH; paper
chromatography), este o tehnica complementara a
cromatografiei de lichide de Tnalta performanta pe coloana
avand Tnsa propriul sau specific. Principiul de separare §i natura
fazelor raman comune dar tehnicile difera.
CSS, cea mai raspandita cromatografie planara, este o
metoda sensibila, cu posibilitatea automatizarii procesului cu un
pret de cost scazut ceea ce conduce ia utilizarea ei pe scara
!arga Tn analiza cantitativa. Aparatura moderna permite
controlul celor trei etape esen^iale, depunerea probelor,
migrarea pe placa si masurarea concentratiilor, iar existenta
aplicatoarelor §i a densitometrelor automatizate a facut posibiia
dezvoltarea unei noi tehnici, nanocromatografia planara, o
tehnica foarte sensibila care poate fi cuplata cu spectrometria
de masa.
2A2. PrincspiuS f i tehnica
cromatografiei planare
Introdusa de Consden, Gordon si Martin Tn 1944 pentru
analiza unor cantitati mici de amestecuri, cromatografia pe
hartie are la baza un mecanism de repartitie lichid-lichid Tn care
hartia serveste ca suport pentru faza lichida stationara, Tn
general apoasa. In principiu, apa se ieaga de moieculele de
celuloza din componenta hartiei si formeaza un gel care
constituie adevarata faza stationara. Repartitia substantei
supuse cromatografierii se face Tntre faza mobila §i acesi gel.
Unii autori atribuie cromatografiei de hartie un mecanism de
adsorbtie sau, Tn orice caz, un amestec Tntre cele doua tipuri,
271

adsorbtie si repartitie. S-a dezvoltat, de asemenea, §i
cromatografia pe hartie cu schimbatori de ioni. Cromatografia
pe hartie este o metoda calitativa, oficinala Tn Farmacopeea
Europeana editia a 4-a.
, Separarea componentelor unei probe prin cromatografie
pe strat subtire se realizeaza pe un strat fin (100 - 200 ^im) de
faza stationara, Tn general, silicagel depus pe o placa
rectangulara de sticla, plastic sau aluminiu. Fixarea fazei
stationare pe suport este asigurata printr-un liant organic sau
mineral introdus Tn procesul fabricarii. Principiul separarii Tntre
faze este asemanator celui din HPLC dar mersul procesului
este altul, constand Tn trei etape distincte ce vor fi detaliate Tn
continuare. Este o tehnica cromatografica cantitativa, oficinala
Tn Farmacopeea Europeana editia a 4-a.
A. Depunerea probelor
Este prima etapa Tn cromatografia planara si consta Tn
depunerea unui volum cuprins Tntre 10"9 - 10~6 I din solutia
diluata a probei sub forma unui spot cu diametrul de 1 - 3 mm
la o distanta de 1 cm de partea inferioara a cromatoplacii.
Aceasta operatie se poate realiza, Tn functie de scopul urmarit
(determinari cantitative sau semicantitative) prin:
« capilaritate - depuneri manuale si mecanice
» prin vaporizare - depuneri automate
B. JVHigrarea
CrpmatoQrafia pe hartie
Se utilizeaza hartie speciala cu porii perfect omogeni.
Dupa depunerea probeior, hartia se introduce Tn cuve speciale
ce sunt niste incinte Tnchise pentru mentinerea unei atmosfere
saturate Tn apa sau Tn solvent organic. Presiunea de vapori
variaza cu temperatura care trebuie mentinuta constanta.
Developarea se poate face vertical (ascendent sau
descendent) sau circular. In cazuri speciale se poate face si
cromatografierea bidimensionaia, mergand Tntr-un sens cu un
272
solvent si cu alt solvent, dupa rotirea la 90 de grade a hartiei (Tn
cazul utilizarii unei hartii de forma dreptunghiulara).
Cromatografia pe strat subtire
Placa cromatografica este introdusa Tntr-o cuva
prevazuta cu capac unde se afla o cantitate mica de faza
mobila ce serveste drept eluent. Depunerea probelor trebuie
astfel facuta meat sa ramana deasupra eluentului Tn cuva
(figura 2.4.1). In cazul Tn care eluentul confine si apa (pentru o
placa cu faza stationara inversa) este utila adaugarea unei sari
(clorura de litiu) pentru limitarea fenomenelor de difuziune si
cresterea rezolutiei. Faza mobila migreaza prin capilaritate
antrenand cu viteze diferite component^ de separat.
camera inchisa ce asig
saturarea atmosferei
interioare cu vapori
component! separsti .
frontul solventului
punct de aplicare a probei J
faza mobila
Figura 2.4.1, Croniaioplaca in procesul de developare
Timpul de migrare depinde de diversi parametri. Cand
frontul solventului a parcurs o distanta considerata suficienta,
se scoate placa din cuva, se noteaza pozitia limits atinsa de
faza mobila si apoi se lasa sa se evapore solventul.
Placile cromatografice pot fi developate prin capilaritate
sau Tn flux fortat:
a. prin capilaritate:
• Tn cuve clasice - vertical sau orizontal
• Tn cuve automate pentru care Tn prealabil se
definesc:
273
 - timpii de saturare cu faza mobila a cuvei Utilizarea unei p\ac\ de forma patrata permite efectuarea
- distanta de migrare unei cromatografii bidimensionale, procedand la doua elutii
- timpul §i temperatura de uscare succesive cu doi eluenti diferiti (figura 2.4.2).
- posibilitatea realizarii gradientilor de
elutie C. Revelarea post-cromatoarafica

b. metoda prin flux fortat: Detectia dupa migrare poate fi:

e stratul subtire este presurizat: solventul este - vizuala
introdus sub presiune (< 50 bari) Tn faza - instrumentala
stationara; metoda este utilizata Tn HPTLC
(cromatografie Tn strat subtire de Tnalta a. Detectia vizuala
performanta) deoarece granulometria scazuta a.1. detectie chimica
diminueaza viteza fazei mobile §i limiteaza - directa pentru compusii colorati
folosirea procedeelor prin capilaritate - dupa pulverizarea unui reactiv capabil s§
e cromatografia planara circuiara si anticirculara - reactioneze cu moleculele separate pentru
tehnica utilizeaza forta centrifuga §i este a da substante colorate sau fluorescente
recomandata atunci cand Tn conditii normale se Revelarea se realizeaza prin imersarea cromatoplacii
obtin valori ale lui Rf apropiate de 0 Tntr-un reactiv comun (acid fosfomolibdenic) sau specific
(ninhidrina Tn solutie alcoolica pentru aminoacizi, de exemplu):

a c*
b4
b Si
a
f

a
I1 I"
elufial

u> X=< rotalia cu 90°a placi

s
X
. \
_«.-».«- !
I a b c
a bc « \
depunere soiventull
1 Figura 2.4.3. Revelarea cu reactivi
c ft
; d
b « S

i•
» 1
a G
a.2. detectie fizica Tn lumina UV-VIS
j
- la 254 nm pe o faza stationara impregnata
1ekjfe2
t 1
cu un indicator de fluorescenta la aceasta
e
>[ «
c
lungime de unda
1 ...t,X.^ 4 «-*-*- la 366 nm pe o faza stationara fara
la b c ia b c
indicator de fluorescenta; moleculele
natural fluorescente sau cele devenite
Figura 2.4.2. Cromatografiere bidirnensionala fluorescente printr-o reactie chimica de
derivatizare sunt detectabile prin
fluorescenta directa
274 275
 In cazul compu§ilor incolori este necesara revelarea
acestora pe placa cromatografica, pentru facilitarea acestui
proces majoritatea placilor continand o sare de zinc
fluorescenta Tn compozitia fazei stationare. Placa este
vizuaiizata cu o lampa de vapori de mercur (Tn lumina WOOD)
cand component!! probei se identified dupa petele Tntunecate
sau colorate pe un fond fluorescent (figura 2.4.4).
Figure 2.4.4. Vizualizarea in lumina UV
a.3. detectie biologica - se bazeaza pe inducerea unei
reac^ii de tip antigen - anticorp
b. Detectia instrumentala permite identificarea §i cuantificarea
mai precisa decat detectia vizuala. Se utilizeaza:
b.1. detector! densitometrici: fotodensitometre - scanner
care permit masurarea lungimii absorbite sau reflectate atunci
cand petele sunt vizualizate Tn lumina din domeniul vizibil sau
ultraviolet; o tehnica recenta consta Tn folosirea unui
videodensirnetru care achizitioneaza imaginile ce sunt apoi
transformate Tn cromatograme cu ajutorul unui computer, dar
aceasta metoda nu este decat semicantitativa datorita faptului
ca nu este reproductibila
276
b.2. detectori prin spectrometrie de masa dupa trecerea
Tn solutie a petelor
b.3. detectori captatori de radio-izotopi
D. Fazele stationare
Alegerea fazei stationare Tn CSS trebuie sa ia Tn
considerare o serie de factori si parametri fizico-chimici:
® marimea granulelor
e suprafata specifics a acestora
• volumul porilor
« diametrul §i repartitia granulometrica a porilor
Caracterul hidrofil mai mult sau mai putin pronuntat al
fazei stationare este dat de raportul Tntre numarul gruparilor
silanol si siloxan. Ca §i Tn cromatografia de lichide de Tnalta
performanta pe coloana exista posibilitatea grefarii pe siliciu,
prin legaturi covalente a unor lanturi cu structuri diferite, legaturi
realizate cu functiile silanol de pe suprafata acestuia. Unele
faze stationare contin resturi alchilice grefate (C2, C8, C18),
altele functiuni organice (nitril, amino, alcool), a§a meat exista
posibilitatea realizarii de sisteme faza stationara - amestec de
solvent! foarte variate.
In CSS se mai utilizeaza suporturi pe baza de ceiuloza
sub forma de fibra sau pulbere microcristalina care suporta
diferite tratamente chimice Tn functie de scopul urmarit. Cea mai
cunoscuta este dietilaminoetilceluloza (DEAE-celuloza) cu
caracter bazic. Fazele polare cu proprietati de schimb ionic si
caracter hidrofil sunt utilizate la separarea amfolitilor.
Prin urmare putem clasifica fazele stationare §i procesele
care stau la baza repartitiei astfel:
a. Faze stationare polare
- silice - adsorbtie §i repartitie
- alumina - adsorbtie - repartitie
- pudra de ceiuloza - repartitie
- kieselgur- adsorbtie - repartitie
- dimetilarninoetilceluloza - schimbatori de ioni
- poliamida - repartitie
277

b. Faze stationare putin polare
- silice grefata: - alchil (62, C8l C-ie) - repartitie
- difenil - repartitie
- faze stationare chirale: silice grefata C-IB impregnate cu
selector! chirali sau silice impregnate cu ciclodextrine
cloroform/dietilamina/acetona 50/10/40
hexan/dietilamina/etanol 75/8/16
stratul subtire fiind Tn prealabil impregnat cu apa. Gradul de
umiditate a stratului subtire trebuie controlat.

Caracteristicile tehnice ale fazelor stationare depind de

2.4.3. Parametrii de separare §s
tipul de cromatografie pe strat subtire: obi§nuita (CSS) sau de retentse
Tnalta performanta:
Fiecare compus este definit prin Rf ("retardation factor"
Tabelu! 2.4.1. Caracteristicile fazelor stationare Tn CSS sau factor de retentie) care corespunde migrarii sale relative Tn
raport cu solventul:
m
distanta parcursa de solut x
Diametrul mediu al 10-30 distanta parcursa de frontul solventului Xn
porilor
Grosimea stratului 100-200 urn
250 Pentru un compus cu distanta de migrare x si diametrul spotului
activ
distributie larga a distributie Tngusta a w, eficacitatea N a placii, respectiv, Tnaltimea unui taler teoretic,
Omogenitatea porilor diametrului porilor diametrului porilor se definesc prin relatiile:
Distanta maxima de 12-15 cm 5-7 cm
migrare pe placa Y
si -
w N
E. Faza mobila
Factorul de capacitate a unui compus k' sau rezolutia R
Cromatografia pe hartie Tntre doi compusi se pot calcula daca se recurge la o
Faza mobila este constituita din douS faze: corespondenta Tntre distantele de migrare pe placa
- apa saturate cu solvent organic cromatografica §i timpii de migrare cititi pe o cromatograma.
- solutie organica saturate cu apa Admitand ca raportul vitezelor de migrare u §i u0 sunt acelea§i
Formula cea mai cunoscuta este cea a lui Partridge: pe placa §i Tn coloana atunci:
n-butanol acid acetic apa distilata
4 : 1 : 5
Amestecul, bine agitat, este mentinut Tn repaus 24 h. sau k'=—--1 lar
x0 u0 t Rf
Stratul inferior constituie faza fixa, stratul superior, faza mobila.

Cromatoqrafia pe strat subtire w

Se utilizeaza amestecuri monofazice de numerosi
solvent! cu polaritati diferite §i compozitie foarte variabila, de
exemplu:
279
278
 In CSS fenomenele fizico-chimice sunt mai complexe
decat Tn cromatografia de lichide de Tnalta performantS pe
coloana:
• constituie un sistem unde sunt prezente trei faze distincte: o
faza stationara solida, o faza mobila lichida §i o faza Tn stare
de vapori Tn echilibru 2.4.4. ApHcatii ale cromatografiei
• faza stationara nu este decat partial Tn echilibru cu faza
lichida, Tnainte de trecerea compu§ilor
planare ?n domeniul analizei
« puterea de adsorbtie a suprafetei este considerabil medicamentelor
diminuata atunci cand o parte a locurilor adsorbante sunt
ocupate, ceea ce se manifesta prin alungirea spoturilor, Rr Cromatografia planara permite:
ul unui compus pur sau prezent Tntr-un amestec este astfel
u§or diferit « identificarea materiilor prime §i a principiilor active din
• CSS nu permits variable debitului fazei mobile pentru formele farmaceutice (tabelul 2.4.2)
ameliorarea eficacitStii separarii
• viteza de progresie a frontului solventului nu este constants, Tabelul 2.4.2. Exemple de analize prin CSS ale unor
medicamente (Farmacopeea Europeana, editia a 4-a)
aceasta fiind o funcfie complexa unde intervine, Tntre altele,
dimensiunea particulelor fazei stationare; ea se supune unei
ecuatii patratice de tipul x2 = k t unde x - Tnaltimea frontului,
t - timpul, k - constanta; rezulta, deci, ca rezolutia Tntre eter de petrol 50
doua spoturi depinde foarte mult de Rf-ul compusului, ea ml + dietilamina 1
atingand valoarea maxima pentru un Rf Tn jur de 0,3: Fenotiazine Kieselgur ml amestec UV la 365 nm
saturat Tn
fenoxietanol
DexametazonS silice metanol/clorura
UV la 254 nm
de metilen (1:9)
revelare cu
Propranolol silice amoniac/metano!
(1:99) aldehida
anisica

cercetarea impuritatilor sau a substantelor Tnrudite cu

principiul activ din materii prime (tabelul 2.4.3)
rezolutia

controlul preparatelor radiofarmaceutice - detectia

Figura 2.4.5, Variatia rezolutiei In functie de factorul de retentie
Eficacitatea N a unei placi cromatografice este foarte
variabila, Tnaltimea echivalenta a unui platou teoretic trece
printr-o valoare optima la fel ca §i la HPLC.
substantelor se face prin masurarea radioactivitatii dupa:
- decuparea suporiului cromatografic §i introducerea
acestuia Tntr-un flacon continand un lichid scintilant
pentru detectia radioactivitatii prin scintilatie Tn
mediu lichid

280
281
 - prin utilizarea unui cromatograf de tip scanner care
permite citirea intensitatii radiatiilor radioactive direct
pe placa

evaluarea interactiunilor ambalaj - continut Electroforeza capilara (EC) este o metoda separative de
analiza care s-a dezvoltat datorita experientei dobSndite Tn
Tabelul 2.4.3. Example de analize prin CSS ale substantelor
inrudite Tn cazul unor medicamente oficinale HPLC si procedeelor mai vechi de electroforeza. Ea permite
Tn Farmacopeea Europeana, editia a 4-a separarea atat a biomoleculelor pentru care HPLC este mai
pufin performanta cat §i a compusilor cu mase moleculare mici,
dificil de studiat prin procedeele clasice de electromigrare pe
suport.
amoniac/ Electroforeza capilara de Tnalta performanta (HPCE) si-a
cloroform/ UVIa benzofenona facut debutul Tn iaboratoarele de biochimie la Tnceputul anilor
Fenitoina silice izopropanol 254 nm 1990 alaturi de o alta metoda, electrocromatografia capilara,
10:45:45 care s-a dezvoltat rapid §i care corespunde unei metode hibride
acid acetic/ UV la 254 ce domina avantajele proprii cromatografiei de lichide de Tnalta
2-piridilamma
toluen nm performanta cu cele ale electroforezei capilare de Tnalta
10:90 performanta.
acid formic/
apa/metanol
/acetat de pulv. cu dilutiiior
etil Kl/ (0,2%) 2.5.1. Principis de baza ?rs eSectroforeza
2:5:10:85 amidon capilara
acid acetic/
acetona/ UV la 254
clorura de nm Electroforeza capilara corespunde unei adaptari
metilen particulare a metodei generale de electroforeza. Aceasta
10:20:70 metoda separativa se bazeaza pe migrarea speciilor purtatoare
de sarcini electrice globale din proba aflata Tn solutie sub efectui
unui c9mp electric si Tn contact cu un suport corespunzator.
Tn tehnica clasica obisnuita, larg utilizata Tn domeniul
bioanalitic, se utilizeaza benzi din material plastic acoperite cu o
substanta poroasa impregnata cu un electrolit. Capetele sunt
imersate Tn doua rezervoare independente, continand acelasi
electrolit si cuplate la electrozii unui generator de tensiune
continua.

283
282
 T

puterea disipata ramane inferioara valorii de 3 W. Pentru

evitarea mcalzirii capilarului este preferabila plasarea !ui Tntr-un
recipient termostatat.

Figura 2,5.2. Schema unei instalatii de electroforeza capilara

It ( I II i « l I I II.
I t I 11 11 I 111 11 Semnalul obtinut de la un detector plasat la distanfa I de
extremitatea superioara a capiiarului, Tn apropierea catodului,
sta la baza obtinerii electroforegramei care confine inforrnatiile
despre compozifia probei cercetate. Sunt detectate numai
Figura 2.5.1. Electroforeza de zona: principiul unel instalatii
speciile care se orienteaza spre catod.
Proba este depusa sub forma unui strat subtire
transversal pe banda, eventual presata Tntre doua placi
izolante. Speciile hidratate prezente migreaza Tntr-un timp 2.5.2. Mobifitatea electroforetica §i
variabil cuprins Tntre cateva secunde pana la cateva ore spre fluxuS electro-osirsotic
una din extremitatile benzii. Fiecare compus se diferentiaza prin
mobilitatea sa, dar absenta unui front de solvent masurabil ne
obliga sa utilizam un standard intern. Detectia speciilor prezente Particulele aflate Tn suspensie Tntr-un lichid la fei ca §i
dupa migrare se efectueaza Tn general prin transferul acestora moleculele solvatate pot fi Tncarcate cu o sarcina electrica a
printr-un procedeu prin contact pe o membrana unde sunt carei marime §i semn depind de natura lor si a electrolitului §i Tn
revelate cu ajutorul unor reactivi specifici. Prelucrarea datelor particular de pH.
se face ca §i Tn CSS.
In electroforeza capilara (figura 2.5.2) suportul plan din
tehnica clasica este Tnlocuit de un tub capilar deschis la ambele
capete, din sticla de siliciu cu diametrul cj> variind Tntre 15 si 150
(am. Acest capilar cu lungimea L = 20-80 crn este umplut cu un
electrolit tampon.
Diferenta de potential aplicata poate atinge 600 V/crn dar
intensitatea curentului nu poate depasj 100 jaA astfel ca
285
284

catod
anod
©
© cu o viteza vef care depinde de conditiile experimentale si de
Figura 2.5.3. Ecuatia lui Huckel: infiuenta sarcinii nets, campului
electric, rnarimii particuiei §i vascozita{ii mediului asupra vitezei
de migrare a unui electrolit in camp electric
Aceasta sarcina provine din fixarea pe suprafata lor a
ionilor continuti de electrolitul tampon. Sub efectul diverselor
fenomene (agitare, temperatura, vascozitate, diferenta de
potential) aceste particule vor avea viteze de migrare cu atat
mai mari cu cat ele sunt mai mici si au sarcina mai mare.
Pentru fiecare ion de raza r, viteza limita de migrare vet
este rezuitatul echilibrului Tntre forta electrica F care se exercita
Tntr-un camp electric E cu particule de sarcina q §i fortele de
frecare care decurg din vascozitatea r\ a mediului.
Separarea depinde de asemenea de raportul volum /
sarcina a ionului hidratat. Speciile neutre se separa greu, este
necesara adaugarea unui agent ionic Tn electrolit care sa se
asocieze cu acesta §i sa provoace o antrenare diferentiata a lor.
Huckel (figura 2.5.3) a propus, tinand cont de infiuenta factorilor
de mai sus, o ecuatie pentru viteza electroforetica vef:
Speciile prezente Tn proba sunt supuse la doua
fenomene principale care se manifesta atat pentru ioni cat si
pentru molecule sau micele: este vorba, pe de o parte, de
mobilitatea electroforetica proprie lor iar, pe de alta, de fluxul
electroosmotic.
286
A. Mobititatea eiectroforetica - eiectromigratia
Toti compu§ii Tncarcati electric se deplaseaza Tn electrolit
mobilitatea lor electroforetica j^ef. Acest parametru este definit
plecand de la viteza de migrare electroforetica a compusului §i
de la campul electric E:
v
ef
unde
L = lungimea totala a capilaruiui ^
V = diferenta de potential aplicata la capetele capilaruiui
Mobilitatea electroforetica:
u ef (cm 2 V-V)
poate fi pozitiva, negative Tn functie de natura cationica sau
anionica a speciilor studiate sau nula pentru moleculele neutre.
Mobilitatea electroforetica se poate obtine plecand de la
eiectroforegrama, calculand viteza electroforetica a compusului
Tntr-un camp E si tinand cont de viteza electroiitului.
B. Mobiiitatea eiectroosmotica si electroosmoza
Al doilea factor care controleaza migrarea solutiilor este
curgerea electroiitului numit flux electro-osmotic caracterizat
prin mobilitatea electro-osmotica
'v ; '_'']••
unde VEOS este viteza eiectroosmotica iar L §i V au aceeasi
semnificatie ca mai sus.
Pentru a calcula IU.FOS trebuie determinate viteza
eiectroosmotica:
287
 perete de siliciu

• ' • • • . 'E O S ,

•
[Q ?
+JL- It
&
catod anod

ca fiind raportul Tntre lungimea capilarului parcursa de un

marker neutru Tn timpul t. Se utilizeaza ca marker o molecula Cj molecula de apa

organica nepolara la pH-ul electrolitului folosit si care este usor

detectabila prin absorbtia Tn UV apropiat (acetona, alcool
benzilic, etc.).
Fluxul electro-osmotic aflat la originea deplasarii tuturor
speciilor prezente Tntr-o proba, depinde de natura peretelui
Figura 2.5,5. Efectul unui surfactant cationic asupra peretului de
intern at tubului capilar foarte Tngust. silice
Acest perete de silice este captusit de grupari silanice
care se ionizeaza daca pH-ul este mai mare de 3, formand o
In general o suprafata a peretelui capilar negativa
suprafatS cu pozitii anionice fixe ce creeaza un potential negativ
provoaca un flux electro-osmotic dirijat spre catod si invers, o
(potential Zeta) alaturi de un strat cationic. suprafata pozitiva provoaca o dirijare a acestuia spre anod.
Cunoasterea fluxului electro-osmotic este esentiala pentru
practica EC pentru obtinerea de rezultate reproductibile.
perete de siliciu

C. MobJIitatea aparenta

Fiecare ion se caracterizeaza printr-o viteza aparenta de

migratie vap care depinde de viteza electroforetica vef si de
viteza fluxului electroosmotic

ap Vef

Figura 2.5.4. Aparitia unui flux electroosmotic intr-un electrolit Tn vap se poate calcula utilizand electroforegrama plecand de la I,
functie de natura peretului intern a! capilarului lungimea utila a capilarului Tntre punctul de injectie si eel de
detec|ie §i tm timpul de migrare. Este data de relatia:
In interiorul solutiei, campul electrolitic provoaca
migrarea cationilor spre catod. Acesti ioni sunt solvata^i §i v
I
antreneaza moleculele de apa din electrolit dirijandu-le spre ap =
m
catod. Anionii se deplaseaza Tntr-o maniera contra-
electroosmotica. Daca se trateaza peretele capilar cu un Mobilitatea electroforetica aparenta este definita printr-o
surfactant de tipul tetraalchilamoniu, polaritatea se inverseaza, relatie analoaga:
ceea ce conduce la o inversare a fluxului electroosmotic.

289
288
 extremitatile capilarului pentru crearea unei diferente de
'ap IL
= v ap sau Hap ='
polaritate.
Hap V Acest mod de injectare determina o diferentiere a
compusilor prezenti, ceea ce conduce la o analiza
Combinand fluxul electro-osmotic al electroiitului cu fractionata.
mobilitatea aparenta este posibil calculul mobilitatii
electroforetice reale a speciilor Tncarcate electric: d) Injectarea prin gravitatie - bazata pe diferenta de Tnaltime
Tntre capetele capilarului.

B. Met ode de detectie

Mef = a) Detectia UV / VIS - se mascara intensitatea luminii care

Separarea anionilor este frecvent jealizata prin
electroforeza capilara de Tnaita performanta. In general se
inverseaza polii de alimentare, detectorul plasandu-se Tn partea
anodica, fluxul electro-osmotic este, de asemenea, inversat. Pot
fi detectafi anionii a caror (ief este superioara mobilitatii electro-
osmotice.
traverseaza capilarul Tntr-o zona unde acoperirea totala a
fost eliminata, utilizand o lungime de unda 200 -230 nm.
Masuratorile sunt dificile datorita matricelor care sunt Tn
general absorbante. Pentru ionii anorganic! care absorb
putin se alege un electrolit care confine cromat sau ftalat
ce determina cresterea absorbantei. Tn aceste conditii
cand un ion din proba ajunge la nivelul detectorului se
produce o diminuare a absorbtiei, obtinandu-se picuri
negative (detectie inversa).

2,5.3. Aparatura utsSizata In b) Detectia prin fluorescenta - este foarte sensibila §i

electroforeza eapiSara utilizeaza o sursa laser foarte intensS, fiind adesea
asociata cu un procedeu de pre sau post derivare a
A. Modul de iniectare analitilor pentru a deveni purtatori de fluorofori.

Pentru introducerea unui microvolum de proba, care nu
trebuie sa depaseasca 1% din lungimea utila a capilarului,
pentru a nu diminua rezolutia, se utilizeaza procedeele:
a) Injectare hidrodinamica - consta Tn aplicarea unei diferente
de potential Tntre cele doua extremitati ale capilarului.
Procedeu!' poate fi ameliorat prin crearea unei presiuni de
circa 50 mbar Tn solatia proba.
c) Cuplarea cu un spectrometru de masa - este un
procedeu de detectie larg utilizat. Debitul slab din capilar
permite ionizarea la presiune atmosferica ceea ce face
posibil studiul componentilor biologici.
d) Detectare electrochimica - consta Tn introducerea unor
microelectrozi Tn capilar.

b) Injectare electrocinetica - se utilizeaza Tn electroforeza pe

gel si consta Tn aplicarea unei diferente de potential Tntre

290 291

2.5.4. Tehnsci electroforetice
A. Electroforeza capiiara de zona (CZE)
Se mai numeste §i electroforeza Tn solutie libera si este
procedeul electroforetic eel mai frecvent utilizat. In acest
procedeu capilarul este parcurs de electrolit Tntr-un mediu
tampon fie acid (fosfat sau citrat) fie bazic (borat) sau amfolit
(molecule posedand o functie acida §i una bazica). Fluxul
electro-osmotic creste cu pH-ul fazei iichide sau poate ramane
neutru.
Prin aceasta tehnica cationii sunt separati primii, apoi
ansamblul neutru §i la sfarfit anionii. Tehnica nu permite
separarea speciilor neutre unele de altele.
B. Electroforeza capilara micelara
Electroforeza capilara micelara numita §i cromatografie
capilara electrocinetica micelara MECC (Micellar Electrokinetic
Capillary Chromatography).
In aceasta varianta, fazei mobile i se adauga un cornpus
cationic sau anionic ca, de exemplu, dodecilsulfat de sodiu
pentru formarea de miceie Tncarcate electric.
Micelele care nu sunt miscibile cu solutia, absorb
compu§ii neutri mai mult sau mai putin eficace printr-o afinitate
de tip hidrofil / hidrofob.
Acest tip de electroforeza se aplica molecuielor care au
tendinta de a migra fara separare iar pentru o mai buna
rezolutie a metodei se pot adauga electrolitului ciclodextrine
cand se formeaza complecsi de incluziune cu stabilitate diferita.
292
mobilitate electroforelica Cola dietetica
cafeina, aspartam, acid ben?oic
<—a'et b"
a" + b" + c timp o
Ftgura 2.5.6. Separarea electrocinetica a trei specii a, b, c:
cafeina, aspartam §i acid benzoic
C. Electroforeza capilara pe gel
GFCE - Gel Filled Capillary Electrophoresis - consta Tn
transpunerea electroforezei pe gel de poliacrilamida sau
agaroza. Capilarul este umplut cu un electrolit continand un gel
care produce efect de filtrare ce retine moleculele mari si
reduce fenomenul de convectie sau difuziune. Metoda se
preteaza la separarea a trei clase mari de biomolecule:
- polipetide
- oligonucleotide (fragmente de ADN si ARN)
- mono si polizaharide,
separarea fiind Tmbunataiita prin suprapunerea fenomenului de
filtrare peste procesele electrice.
Capiiarele umplute cu un gel continand o faza chirala
(ciclodextrine) pot servi la separarea diastereoizomerilor.
D. Eiectroforeza prin izofocaiizare
Aceasta tehnica cunoscuta Tn egala masura ca
electroforeza pe suport consta Tn crearea unui gradient de pH
liniar Tntr-un capilar cu peretele tratat cu un amfolit. Capilarul
este introdus Tn H3PO4 la anod §i Tn NaOH la catod, fiecare
compus migreaza §i se focalizeaza la pH-u! care are aceea§i
valoare cu potentialul lui izoelectric.
Deplasarea speciilor separate spre detector se
realizeaza mentinand campul electric, sub efectu! unei presiuni
293
 r
hidrostatice. Rezolutia Tnalta obtinuta cu acest procedeu permite Absorbanta
separarea peptidelor al caror punct izoelectric nu difera decat cu 0,0020 - -
0,02 unitati de pH.
0.0015 - -
E. Electrocromatoqrafia capilara (CEC)
2,0010 - •
Acest tip de separare asociaza electromigrarea ionilor,
proprie electroforezei si procesele de repartitie Tntre faze
prezente Tn cromatografie. 0.0005 - •
Tehnica consta Tn utilizarea unui capilar umplut cu o faza
stationara alcatuita din particule cu diametru foarte mic ( 1 - 3 0 --
45 50 min
35
urn) si cu rol dublu: faza stationara se comporta ca un material
selectiv (RP - 18) si care Tn plus trebuie sa participe la migrarea Figura 2.5.7. Separarea izotopilor cloruiui
electrolitului. Pe suprafata externS a particulelor trebuie sa
existe suficiente grupari silanol pentru producerea fluxului Parametrii de separare: eficacitate, factor de capacitate,
electro-osmotic. selectivitate, rezolutie sunt accesibili plecand de la
Factorul de separare prin aceasta metoda este foarte electroforegrame si utilizand fie aceleasi formule cunoscute din
mare dar intervin o serie de probleme cum ar fi efectul cromatografie, fie formule specifice electroforezei capilare de
compusilor organic! asupra fluxului electro-osmotic si controlul Tnalta performanta (HPCE).
precis al volumului de proba introdus Tn capilar. Expresia clasica, bazata pe difuziune, care da
Tn concluzie, electroforeza capilara este comparabila cu eficacitatea N a unei coloane (capilar) poate atinge 106 platouri
cromatografia de lichide, completand Tn mod util separarea / metru de capilar si permite calculul coeficientului de difuziune
biomoleculelor. D (cmV1) a solutiei cercetate. Acest parametru este dependent
Sensibilitatea metodei este mare, cantitatile de proba de dispersia a §i iimpul de migrare tm, dependents descrisa de
mici, consumurile de reactivi si solvenfi, neglijabi'le. In acelasi legea lui Einstein:
timp reproductibilitatea analizei este buna. Cand eficacitatea de
separare N este suficient de mare, devine posibilS separarea a2 = 2 D tm
izomerilor aceluiasj element.
Utilizand relatiile pentru timpul de migrare si mobilitatea
aparenta se obtine:

sau D
2Nt m

relatie care demonstreaza ca eficacitatea cre§te cu diferenta de

potential V apiicata.
Tn HPCE rezolutia R Tntre doua picuri se calculeaza cu
ajutorul eficacitatii N, a diferentei Tntre viteza de migrare a celor
doua solutii §i viteza medie de migrare:
294
295

Av
" 4"' v
Macromoleculele ai caror factor! de difuziune sunt mult
mai mici decat ai moleculelor obisnuite sunt mai usor separate
prin electroforeza capilara de Tnalta performanta decat prin
cromatografie lichida de Tnalta performanta.
electroforeza capilara cromatografie de lichide
tub deschis, diam. 50 -150 |jm coloana cu umplutura, diam. 2 - 4 mm
Figura 2.5.8. Compararea efectelor cosijisgate: difuziunea §i
migrarea fazei iichide Tn HPLC §i HPCE
F. Izotacoforeza
Izotacoforeza vine de la grecescul iso (egal) si tachos
(viteza) si se traduce prin faptul ca moleculele migreaza' cu
aceea§i viteza. Mobilitatea electroforetica ja a moleculelor este
Tnsa diferita ceea ce Tnseamna ca trebuie aplicat un gradient de
camp electric:
V =
Obtinerea gradientului de camp se poate realiza prin
utilizarea a doua tampoane diferite; de exemplu, Tn cazul
aplicarii izotacoforezei pentru analiza anionilor se utilizeaza un
electrolit a carui mobilitate electroforetica este superioara
anionilor din proba si un electrolit cu mobilitate electroforetica
inferioara anionilor din proba. Diferentele de mobilitate
electroforetica vor crea un gradient de camp electric, proba de
cercetat fiind plasata la interfata celor doi electroliti.
296
2.5.5. Aspecte generate privind
ufilizarea tehnlcilor electroforezel
capilare in industria farmaceutica
Companiile farmaceutice se confrunta cu noi provocari Tn
acest mileniu, dar descoperirea de noi medicamente ramane
dezideratul major al acestora, Electroforeza capilara Tsi are
locul si rolul important Tn analiza moderna cu aplicabilitate Tn
industria farmaceutica.
Studiile de caracterizare fizico-chimica a medicamentului
Tncep de la descoperire sj continua pSna la obtinerea produsului
finit.
Cerintele stringente ale agentiilor de reglementare includ
o buna caracterizare a substantelor medicamentoase, formelor
izomere, proceselor de degradare, excipientilor, impuritatilor,
agentilor de contaminare §i posibile interacjiuni
micromoleculare ale componentelor Tn produsele farmaceutice
finite.
Mai mult, testele de stabilitat^ obligatorii sunt facute pe
sute de mostre sj impun teste analitice de Tncredere, rapide §i
care sunt cruciale Tn controlul si Tn cercetarea de laborator
pentru a Tntruni normele cerute.
O comparatie Tntre timpii de analiza §i costuri utilizand
variate tehnici analitice este prezentata Tn tabelele 2.5.1 §i
2.5.2.
Anali§tii se bazeaza pe analize fizico-chimice de la
dezvoltare pana la testele de stabilitate ale medicamentului
aprobat. Multi ani cromatografia de gaz (GC) si cromatografia
de lichide de Tnalta performanta pe coloana (HPLC) au fost
metode de electie pentru testele analitice facute Tn mod obisnuit
Tn laboratoarele farmaceutice.
Desi HPLC este metoda unanim acceptata Tn
laboratoarele de analiza si control de medicamente.
electroforeza capilara castigS popularitate Tn aceste
laboratoare, fiind o tehnica moderna de separare a
componentelor din matrici simple §i complexe. Se utilizeaza:
electroforeza de zona, electroforeza Tn gel, isotacoforeza
capilara §i cromatografia electrocinetica micelara.
297
 Tabelul 2.5.1. Analiza comparativa a timpului §i costuius
are si unele dezavantaje care sunt intens investigate Tn vederea
analizei unui medicament prin HPLC §i CE diminuarii lor.
De exemplu, doua importante neajunsuri ale
electroforezei capilare frecvent abordate de cercetatori sunt
limita joasa a concentratiei detectabile (limita de detectie, LD) si
loloana 150-450 10-100 lipsa detectorilor ce pot oferi informatii structurale.
Cost pe analiza
Numar de probe 100-500 40-200 Imbunatatirea LD a fost realizata prin:
USD
Solvent! si reactanti 40-200 40-50
0,5-10 a. folosirea unor metode de preconcentrare, prin microextractie
Dispunere solvent 3-400
2.0-5.0 0,5-1,0 Tn faza solida sau microreactoare pentru concentrarea
Cost total .
Pregatirea
analitilor;
30-60 15-45
Timp de analizS echipamentului b. folosirea unor detectoare chimic-selective (spectrometre de
Preparare mostra 10-30 10-30 masa, detectoare de fluorescenta, LASSER indus sunt
Min.
Desfasurare 15-30 10-60 disponibile de mai bine de un deceniu)
Total 55-120 30-120
Electroforeza capilara are cateva avantaje comparativ cu
HPLC, care sunt evidente §i Tn industria farmaceutica si se
Tabelul 2.5.2. Comparatia timpului de analiza f i costului pentru refera la:
caracterizarea unui analit folosind tehnici variate de separare
- dezvoltarea si optimizarea rapida a metodei
- timp de analizare mai scurt
- folosirea de volume mici de reactivi scumpi
Pana la 50 >2,0 - reducerea generarii de resturi organice toxice
Pana la 50 >2,0 - cost relativ scazut pe analiza
>1000 < 0,025
<5000 < 0,005

2.5.6. Aplicatii ale eiectroforezei

Principalul avantaj al electroforezei capilare moderne
asupra tehnicilor cromatografice traditionale sau conventional
capilare
este eficienta, relative simplitate, automatizarea §i costul redus
Aplicafiile electroforezei capilare sunt numeroase §i
pe proba. Recent, electroforeza capilara a beneficiat de cateva
cuprind multe domenii, Tn eel farmaceutic acestea referindu-se
importante Tmbunatatiri, astfel aparatura utilizata a fost la:
dezvoltata prin procedeul procesarii paralele Tn multiplex.
Multiple/area este procedeul prin care probe multiple sunt « punerea Tn evidenta a impuritatilor si produfilor de
degradare din materiile prime
analizate Tntr-un singur lot. Aparatul cu un singur capilar este
extins la un instrument cu mai multe capilare, acest lucru • dozarea principiilor active (figura 2.5.9)
permitand cresterea eficientei. Solutiile transporter sau « controlul puritatii enantiomerice (figura 2.5.10)
electrolitii de transport pot fi Tmbogatite cu o mare varietate de • dozarea medicamentelor Tn cazul stabilirii dozelor
aditivt, permitand separarea substantelor strans Tnrudite. Aceste terapeutice individuale (fenitoina, acid valproic, fenobarbitai,
Tmbunatatiri au condus la o precizie mai mare, selectivitate §i digoxina)
acurate|e ale determinarilor substantelor analizate. De§i tehnica » determinari toxicologice (barbiturice, amfetamine,
electroforezei capilare are multe avantaje ca metoda de analiza, paracetamol, salicilati)
298 299
 Semnal

-i.

1. Adamovics J.A. Chromatographic Analysis of

Pharmaceuticals, second edition, Marcel Dekker, 1997.
2. Atkins P. Tratat de Chimie Fizica, Editura Tehnica
(traducere), 1996.
3. Balaban A., Banciu M., Pogany I. Aplicatii ale metodelor
Timp fizice Tn chimia organica. Editura Stiintifica si Enciclopedica
Bucuresti, 1983.
Figura 2.5.9. Separarea unui amestec etalon de antidepressve 4. Baloescu C., Curea M. Controlul Medicamentelor. Editura
triciclice cu inversarea sensului fiuxului de electroendoosmoza §tiintifica si Enciclopedica Bucuresti. 1983.
(1. impuritate, 2. doxepina, 3. nordoxepina, 4. impipramina, 5. desimipramina, 6. amitriptilina, 7. 5. Beckett A.M., Stenlake J.B. Practical Pharmaceutical
nortriptilina, 8. protriptilina; conditii experimentale: tampon 50 mM Bis-Trispropan, coloana 30/37
cm, potential 18,5 kV, UV 214 nm) Chemistry. Part two, 4th Edition, Athlone Press, Great
Britain, 1988.
6. Bojita M., Roman L, Sandulescu R., Oprean R. Analiza si
Abs. controlul medicamentelor. Volumul 2. Metode instrumentale
Tn analiza si controlul medicamentelor. Editura Intelcredo
Deva, 2003.
7. Bosch Ojeda C., Sanchez Rojas F., Cano Pavon J.-M.
Recents developments in derivative ultraviolet/visible
absorption spectrophotometry, Talanta, 1995, 42, 1195-
1214.
8. Burgot G., Burgot J.L. Methodes Instrumentaies d'Analyse
Chimique et Applications. Methodes chromatographiques,
electrophoreses et methodes spectrales. Editions Medicales
Timp
Internationales, 2002.
9. Dean J.A. Analytical Chemistry Handbook. McGraw-Hill,
Figura 2.5.10 Separarea ceior doi enantiomeri ai amfetamines in 1995.
prezenta de y-ciclodextrina suifatata 10. Drews J. Drug discovery today - and tomorrow. Drug Discov
Today, 5(2), 2000.
• determinarea constantelor fizico-chimice: pKa, constante H.Fagarasan E., Imre S. Aplicatii practice de Chimie Fizica.
cinetice, punct izoelectric Editura SRIMA Cluj-Napoca, 2000.
12. Florence AT., Attwood D. Physicochemical Principles of
Pharmacy. 2nd edition, MacMillan Press UK, 1988.
13. Gocan S. Cromatografia de Tnalta performanta, partea a l-a:
Cromatografia de gaze. Editura Dacia, Cluj-Napoca, 1998.
300 301
 Saunders Golden Sunburst series, Saunders College
14.Gocan S. Cromatografia de Tnalta performanta, partea a ll-a:
Publishing, 1996.
Cromatografia de lichide pe coloane. Editura Risoprint, Cluj-
29.Pradeau D. L'Analyse Pratique du Medicament. Editions
Napoca, 2002. Medicales Internationales, 1992.
15.Hamon M., Pellerin F., Guernet M., Mahuzier G. Chimie
30. Rendell D., Mowthorpe D. Fluorescence and
Analitique. Tome 3. Methodes spectrales et analyse
Phosphorescence Spectroscopy, John Wiley & Sons, 1987.
organique. Masson, Paris, 1990. 31. Roman L., Sandulescu R. Chimie Analitica. Vol. 3. Metode
16. Harris D.C. Quantitative Chemical Analysis. Freeman, New
de separare si analiza instrumental^. Editura Didactica si
York, 1995. Pedagogica Bucuresti, 1998.
17. Hesse M., Meier H., Zeeh B. Spectroscopic Methods in
32. Rouessac F., Rouessac A. Analyse chimique. Methodes et
Organic Chemistry. Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1997.
techniques instrumentales modernes. 5e Edition, Dunod,
18.lmre S. Studiu fizico-chimic Tn clasa antiemeticelor. Teza de Paris, 2000.
doctorat, Universitatea de Medicina §i Farmacie ,,luliu
33.Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L. Practical HPLC
Hatieganu" Cluj-Napoca, 2003. Method Development, 2nd Edition, John Wiley and Sons,
19.luga C.A. Studii analitice si de stabilitate ale inhibitorilor
Inc., 1997.
pompei de protoni. Omeprazolul. Teza de doctorat,
34.Van Sumere C.F., Lea P.J. The Biochemistry of Plant
Universitatea de Medicina §i Farmacie Juliu Hatieganu"
Phenolics. Methods in Plant Biochemistry. Vol. 1. Plant
Cluj-Napoca, 2003. Phenolics. Academic Press, London, 1985.
20. Jack D.B. Drug Analysis by Gas Chromatography. Academic
35.***British Pharmacopeea, 2002 (format electronic).
Press, Orlando USA, 1984. 36.***Farmacopeea Romana, editia a X-a, 1993.
21. Kingston D.G.I. Solvents and the Improvement of Spot 37.***United States Pharmacopeea XXV, 2002.
Resolution. Journal of Natural Products, 1979, 42, 237. 38.***Pharmacopee Europeenne, editia a 4-a, 1997.
22. Lough W.J., Wainer I.W. High-Performance Liquid
Chromatography. Fundamental Principles and Practice.
Blackie Academic & Proffesional, Chapman and Hall, 1996.
23.Mager S. Analiza structural^ organica. Editura Stiinpca §i
Enciclopedica Bucuresti, 1979.
24. Mahuzier G., Hamon M., Ferrier D., Prognon P. Abrege de
Chimie Analytique, tome 2, Masson, Paris, 3e edition, 1999.
25.Muntean D.L. Contributii la studiul fizico-chimic §i fitochimic
al unor polifenoli vegetali. Teza de doctorat, Universitatea de
Medicina si Farmacie Tg. Mures., 2000.
26.Nyiredi S. Planar Chromatography a retrospective view for
the third Millenium. Springer Scientific Publisher, Budapest,
2001.
27.Ohannesian L., Streeter A.J. Drugs and the Pharmaceutical
Sciences. Vol. 117. Handbook of Pharmaceutical Analysis.
Marcel Dekker Inc., 2002.
28.Pavia D.L., Lampman G.M., Kriz G.S. Introduction to
Spectroscopy. A Guide for Students of Organic Chemistry.
303
302