UNIVERSITATEA “BABEȘ-BOLYAI” DIN CLUJ-NAPOCA

Aplicații ale biotehnologiilor animale în medicină și medicină legală

Popa Andrada-Ioana
Secția: Biotehnologii industriale, grupa II
Anul III

Cluj-Napoca
2023
 Cuprins

Introducere…………………………………………………………………...3
1. Aplicații ale biotehnologiilor animale în medicină………….……...4
1.1. Status quo………………………………………………………..…...4
2.2. Patologii………………………………………………………….5
2.2.1. Cercetarea și investigarea patologiilor………………………………..5
2.2.2. Modele animale……………………………………………………….5
2.2.2.1. Novel mice - șoareci knockout pentru studiul sindromului Sanfillipo
2.2.2.2. Novel mice – șoareci Wistar și Sprague-Dawley pentru studiul leziunilor
spinale
2.2.2.3. Modele aviare – CAM assay pentru studiul cancerului
2.2.2.4. Modele entomologice – Drosophila melanogaster pentru extensia vieții
2.3. Targeted therapy delivery – exosomii……………………………….……10
2.4. Culturi tridimensionale și organoizi………………………………...….11
2.5. Limitări……………………………………………………………………12
3. Aplicații ale biotehnologiilor animale în medicină legală…….…...……12
3.1. Status quo……………………………………………………………...…12
3.2. Secvențierea și analiza diferitelor probe biologice………………....…..13
3.3. Molecular animal forensics………………………………………………13
3.3.1. Genotiparea ADN-ului mitocondrial
3.3.2. Genotiparea microsateliților
3.4. Markeri genetici…………………………………………………………14
3.4.1. Markeri nucleari
3.4.2. Markeri mitocondriali
3.4.3. SNP –Single Nucleotide Polymorphisms
3.5. Limitări………………………………………………………………..…15
4. Perspective de viitor ale biotehnologiilor animale în diverse ramuri ale
medicinei…………………………………………………………………………………16
4.1. Xenotransplant
4.2. Bioprinting
4.3. Organ-on-a-chip . Dispozitive microfluidice.
Concluzii…………………………………………………………………………17
Bibliografie…………………………...………………………………………….18

2
 Introducere

Biotehnologiile animale sunt parte din domeniul biotehnologiilor, un subdomeniu, în

care, sunt utilizate tehnici de biologie moleculară pentru a modifica genetic animalele, în scopul
îmbunătățirii performanței lor pentru a aplicații din industriile medicală, farmaceutică,
agricultură, ori alte ramuri conexe. Biotehnologiile animale au fost implementate pentru
obținerea animalelor modificate genetic, ce sunt capabile de a sintetiza proteine terapeutice sau
alți compuși cu importanță terapeutică, pentru un randament mai mare în domeniul agro-
alimentar, dar și pentru conservarea unor genotipuri valoroase, periclitate de un număr vast de
factori.
Lucrarea de față are ca scop evidențierea aplicațiilor biotehnologiilor animale în
medicină și medicină legală, fără intenția de a desconsidera importanța acestora în alte domenii,
fie din cadrul cercetărilor în agricultură sau zootehnie, fie din cadrul altor industrii, ce nu au o
importanță medicală.
De asemenea, această lucrare este divizată în trei secțiuni: prima parte se concentrează
pe aplicațiile din domeniul medicinei, a doua parte pe aplicațiile din medicina legală, iar în a
treia parte se dorește aducerea în vedere a perspectivelor de viitor, care ar putea fi aplicate în
diverse ramuri medicale.
Prima parte, care va aborda aplicațiile biotehnologiilor animale în medicină, descrie
status quo al acestor aplicații, alături de exemplificarea acestora, dar și a limitărilor.
Aplicabilitatea în studiul patologiilor umane și modelele animale in vivo pentru
observarea progresiei anumitor boli, este un câmp în continuă dezvoltare, de la utilizarea
șoarecilor knockout pentru cercetarea unor bolii lizosomale severe, mucopolizaharidoza de tip
IIIC (sindromul Sanfillipo), alături de implicațiile neurologice și somatice degenerative, a
deficienței de HGSNAT ( heparan α-glucozaminid N-acetiltransferază), la testul CAM (chick
chorioallantoic membrane) pentru cercetarea cancerului, la administrarea eritropoietină umană
recombinantă (rhEPO) în diferite rozătoare pentru investigarea remedierii leziunilor inervațiilor
din coloana vertebrală.
Totodată, vor fi abordate mecanisme de livrare țintită a terapiilor (exosomii), dar și
obținerea de compuși cu importanță terapeutică. Pe lângă modele animale și compuși, vor fi
discutate domeniile emergente ale culturilor celulare tridimensionale, potențialul organoizilor,
alături de xenografturi în comparație cu grafturile alogeneice.
A doua parte are ca subiect central aplicațiile din medicina legală, începând cu status
quo , apoi ilustrarea secvențierii ADN, urmată de detaliere domeniului conex biotehnologiilor
3
animale – molecular animal forensics – concentrându-se în mod special pe analiza ADNmt și
a polimorfismelor, ce constituie un mijloc de mare acuratețe pentru rezolvarea dilemelor legale
și criminalistice.
Pe lângă aceste subiecte, vor fi discutate în detaliu modalități de analiză și comparație a
probelor biologice, cu ajutorul biomarkerilor. Nu în ultimul rând vor fi aduse-aminte limitările
acestor metode.
În a treia parte, vor fi aduse în vedere anumite posibilități, tehnici state-of-the-art, care,
aduc perspective potențiale pentru viitorul biotehnologiilor animale în diverse ramuri ale
medicinei și cercetării: xenotransplantul și limitările sale, alături de posibile realizări, dar și
tehnologia emergentă a bioprinting-ului. În ultimul rând, va fi abordată îmbinarea
biotehnologiilor animale cu ingineria dispozitivelor microfluidice pentru a rezolva problema
lipsei vascularizației țesuturilor bioprinted, dar și a comunicării intra- și intercelulare,
conducând la conceptul de organ-on-a-chip.

1. Aplicații ale biotehnologiilor animale în medicină

1.1. Status quo
În ultimele decenii, tehnologia celulelor stem a revoluționat domeniul biomedical,
datorită capacității lor nelimitate de regenerare, alături de abilitatea lor de a se diferenția, pentru
a genera celule, mai apoi țesuturi, din întregul corp uman.
În prezent, un număr vast de companii biotehnologice și institute de cercetare se
concentrează pentru a optimiza și obține terapii state-of-the-art pentru ameliorarea, ori chiar
vindecarea anumitor maladii. Un punct de interes major în domeniul cercetării celulelor stem,
este reprezentat de celulele stem pluripotente induse (iPSC), care prezintă anumite avantaje față
de celulele stem adulte (ASC) și celulele stem embrionare (ESC), atât din punctul de vedere al
obținerii (dificultate în recoltare, dar și în metodele de purificare), cât și din punctul de vedere
al problemelor de bioetică. (Duelen și colab., 2019)
De asemenea, iPSC sunt de o importanță deosebită în dezvoltarea modelelor animale
specifice, care ilustrează fenotipuri specifice maladiei de interes, cauzate de mutații mono- sau
poligenice. (Duelen și colab., 2019)
Cu toate acestea, în câmpul biotehnologiilor animale, există un număr enorm de
aplicații, care au ca punct de pornire cercetările realizate în domeniul celulelor stem. Notabil,
pe lângă dezvoltarea modelelor animale și cercetarea diferitelor patologii, trebuie menționate
descoperirile legate de modalități de livrare a medicamentelor – targeted therapy delivery, dar
și de obținere a compușilor cu importanță medicală, respectiv farmaceutică. (Jӓnne și colab.,
1992).
4
 Totodată, tranziția de la culturile celulare bidimensionale la cele tridimensionale,
constituie un pilon în domeniul emergent al organoizilor, reprezentând o alternativă
promițătoare a testării pe animale, creând un micromediu mai apropiat de fiziologia și procesele
metabolice ale organismului de interes. (Eisenstein, 2018)

2.1. Patologii
2.1.1. Cercetarea și studiul patologiilor
Studiile și cercetările patologiilor constituie punctul-cheie pentru tranziția de la modele
in vitro și constrângerile cauzate de absența unui mediu relevant din punct de vedere fiziologic.
Așadar, progresele determinate de cercetări au determinat necesitatea migrației la modele in
vivo sau in silico, pentru obținerea datelor relevante pentru cercetarea și dezvoltarea terapiilor,
dar și pentru creșterea specificității. Modelele in vivo permit o extrapolare mult mai facilă a
datelor experimentale, obținute pe diverse animale-model, la un organism uman. (Moretti și
colab, 2010)

2.1.2. Modelele animale

Aplicabilitatea în studiul patologiilor umane și modelele animale in vivo pentru
observarea progresiei anumitor boli, este un câmp în continuă dezvoltare, de la analiza
afecțiunilor neurodegenerative și somatice, până la extinderea cancerului până la metastază
(Lokman și colab., 2020), dar și a îmbunătățirea calității și extensia vieții.
2.1.2.1. Novel mice – șoarecii knockout pentru studiul sindromului Sanfillipo
Șoarecii knockout reprezintă un model animal de interes în observarea și studiul
progresiei pentru multe patologii cu relevanță umană. Una dintre cele mai studiate afecțiuni, cu
efecte devastatoare atât la nivel neuronal, cât și la nivel somatic, este reprezentată de
mucopolizaharidoza de tip IIIC (sindromul Sanfillipo). Acesta este un sindrom ce afectează
depozitarea lizosomală, cauzată de deficiența în activitatea unei enzime transmembranare,
heparan α-glucozaminid N-acetiltransferaza (HGSNAT), ce catalizează N-acetilarea resturilor
alfa-glucozaminice ale heparan sulfatului. Deficiența acestei enzime cauzează o acumulare
anormală de substrat în lizosomi, conducând la neurodegenerare severă, afecțiuni somatice și
moarte prematură. (Marco și colab., 2016)

5
 Fig. 1. Generațiile de șoareci knock out Hgsnat. (A) Analiza a fost realizată prin PCR,
utilizând ADN genomic. Benzile de 395 și 329 bp corespund alelelor WT și mutante, respectiv.
(B) Northern blot pentru ARN-ul în total extras din rinichi, pentru masculi homozigoți și
heterozigoți, hibridizați cu un marker specific pentru Hgsnat. (C) Analiza prin qRT-PCR la
probe din creier și ficat, expresia Hgsnat fiind redată prin unități arbitrare pentru ușurința
interpretării. (D) Activitatea HGSNAT în creier pentru același grup analizat. (Marco și colab.,
2016)
Studiul condus de Marco și colab. a constat in utilizarea unor șoareci knockout (Hgsnat-
/Hgsnat-) Hgsnat, care au exprimat activitate redusă a enzimei. Șoarecii heterozigoți
(Hgsnat+/Hgsnat-) au avut de asemenea activitate redusă a enzimei, dar s-au încadrat în
parametrii optimi pentru conținutul de glicozaminoglicani (GAG) în țesuturi. (Marco și colab.,
2016)
Șoarecii cu deficiență de HGSNAT au avut o creștere progresivă a acumulării de GAG
în creier, dar mai puțin la diferite regiuni ale creierului, comparativ cu alte animal utilizate in
studiul MPZ. Totusi, au avut un conținut semnificativ de GAG la nivel hepatic, fapt evidențiat
de microscopia electronică (EM), ce a captat această creștere majoră de GAG, distensia
lizosomilor si perturbații în homeostazia lizosomală în organele somatice, începând chiar de la
2 luni. De asemenea, din punct de vedere comportamental șoarecii au fost hipoactivi.
Rezultatele obținute au fost similare cu alte modele animale pentru MPZ, dar s-au recuperat
detalii relevante despre progresia bolii, ilustrând în detaliu patologia deficienței de HGSNAT
legat de acumularea de GAG si alte simptome vizibile.

6
 Fig. 2. Patologia lizosomală somatică în șoarecii cu deficiența enzimatică. Ilustrarea
acumulării de GAG progresivă cu vârsta în organe somatice. Imunocolorația indică distensia
compartimentelor lizosomale în șoarecii afectați. (Marco și colab., 2016)

Protocolul experimental, prin intermediul EM a analizat acumularea de GAG, la nivelul

mai multor organe, alături de modificarea concentrațiilor anumitor metaboliți. (Marco et al,
2016)

2.1.2.2. Novel mice – șoareci Wistar și Sprague-Dawley pentru studiul leziunilor spinale
Studiul realizat de Gorio și colab. (2002), evidențiază la nivel experimental, cu ajutorul
modelelor animale (șoareci Wistar și Sprague-Dawley), potențialele efecte terapeutice ale
administrării de eritropoietină umană recombinantă (rhEPO), legate recuperarea în urma
accidentelor la nivelul coloanei vertebrale. Din punct de vedere celular și molecular, este
analizată relația dintre EPO și receptorul proteic aferent de către neuronii motori si axonii
mielinizați.

7
 Studiul de față se concentrează pe administrarea sistemică de rhEPO, dar și de efectele
terapeutice ale unei singure doze – notabil, având efecte semnificative în cazul administrării
imediate după leziune. (Gorio și colab., 2002)
S-au utilizat 2 modele animale: pentru anevrism – femele de șoareci Wistar, iar pentru
contuzie – femele de șoareci Sprague-Dawley. In cazul anevrismului, administrarea de rhEPO
a adus îmbunătățiri semnificative legat de funcțiile motorii, alături de o reducere drastică a
cavitației, la nivelul inervațiilor coloanei vertebrale. În paralel, pentru modelul contuziei, s-au
observat rezultate similare a îmbunătățirii funcției motorii. (Gorio și colab., 2002)

Fig. 3. Colorație HE a corzii spinale secționate la nivelul leziunii. Jos – tratament cu

soluție salină. Sus – tratament cu rhEPO timp de 7 zile. În grupul tratat cu rhEPO, se poate
observa preservarea
z materiei albe. În contrast, se poate observa cavitația în centru, la grupul
tratat cu soluție salină, înconjurată de axoni fragmentați și inflamați. (Gorio și colab., 2002)

8
 Fig. 4. Progresia funcției motorii într-un test de înot (Gorio și colab., 2002)

2.1.2.3. Modele aviare - CAM assay

Testul CAM are un număr vast de aplicații în cercetarea cancerului. Acest model in vivo
a fost utilizat pentru studiul diferitelor aspecte ale biologiei tumorale, de la angiogeneză,
creștere tumorală, invazie, metastază și evaluarea unor medicamente anticancer. CAM assay se
bazează pe utilizarea membranei corioalantoice a embrionului de găină, fiind o structură foarte
vascularizată, este ideală pentru evaluarea angiogenezei tumorale și a compușilor ce inhibă
aceasta. (Lokman și colab., 2020)

Fig. 5. Invazia celulelor canceroase în stratul CAM. (A) Structura stratului CAM. (B) Invazia
celulelor din cancerul ovarian (OV-90) din implantul de matrigel a rezultat în distrugerea
ectodermului și invazia mezodermului. (Lokman și colab., 2020)

Unul dintre avantajele testului CAM, este reprezentat de abilitatea acestuia de a servi
drept o platformă pentru xenografturile derivate de la pacient (PdX) în faza preclinică. Acest
lucru face posibilitatea transplantării specimenelor tumorale umane pe CAM și a testa potențiale
intervenții terapeutice. Pe lângă diferite tipuri de cancer(carcinom, sarcom etc.) CAM assay
este utilizat pentru investigarea unor factori moleculari specifici, precum ARNmi sau
metiltransferaze histonice, în cercetarea cancerului. De asemenea, acest model in vivo nu este

9
eficient doar din punct de vedere al costurilor, cat si din punct de vedere al reproducerii
rezultatelor. (Lokman și colab., 2020)

2.1.2.4. Modele entomologice - Drosophila melanogaster pentru extensia vieții

Pe lângă importanța sa în studiile genetice ale populațiilor, Drosophila melanogaster
(musculița de oțet) s-a dovedit un model animal inedit pentru extrapolarea unor experimente,
cu relevanță pentru contextul îmbătrânirii și a extinderii speranței de viață. În special, s-a
observat inducerea supraexprimării enzimei peptid metionin sulfoxid reductază A (MRSA).
Activitatea MRSA scade odată cu înaintarea în vârstă, dar s-a observat și o scădere
accelerată și semnificativă a indivizilor afectați de Alzheimer, sugerând o posibilă corelație
dintre activitatea enzimatică și bolile neurodegenerative. Aminoacidul esențial,,
metionină(Met), este susceptibil la oxidarea în metionin sulfoxid, o specie reactivă de oxigen
(ROS), de oxidanți fiziologici (stresul oxidativ), procesul fiind reversat de MRSA. De
asemenea, s-a sesizat faptul că, supraexprimarea MRSA repară resturile de Met din proteine și
ar putea limita efectele adverse ale ROS, extinzând speranța de viață. (Ruan și colab., 2001)

2.2. Livrarea țintită de terapii (targeted therapy delivery )– exosomii

O aplicație recentă a celulelor stem adulte (ASC) este în producerea exosomilor.
Exosomii sunt vesicule extracelulare, originate din invaginarea membranelor, urmate de
formarea unor corpi multivesiculari. Când aceștia fuzionează cu membrana plasmatică,
exosomii sunt eliberați. Exosomii sunt secretați de un număr de celule, plachete, celule
tumorale, celule stem. Sunt caracterizați de un diametru mic, de 30-150 μm. Un aspect foarte
important, este constituit de faptul că, aceștia sunt îmbogățiți cu diverși acizi nucleici, ARN
micro și alți ARN necodificatori, dar și ARNm. Exosomii sunt extrem de importanți deoarece
au un rol major în comunicarea intercelulară și modularea proceselor celulare. Pe lângă therapy
delivery cu o specificitate ridicată, s-a descoperit si faptul că, exosomii derivați din anumite
celule stem, mai specific celule stem adulte mezenchimale (MSC) pot repara leziuni la nivel
tisular, dar au și rol cardioprotector. (Duelen și colab., 2020)

10
 Fig. 6. Mecanismul de livrare a terapiilor mediat de exosomii (Duelen și colab., 2020)

2.3. Culturi tridimensionale și organoizi

În aceiași tematică cu celulele stem și cercetarea patologiilor, trebuie menționat
potențialul iPSC pentru generarea culturilor tridimensionale, spre exemplu organoizii și
himerele om-rozător, care reprezintă cu o acuratețe mai mare diversitatea ecosistemelor celulare
complexe, în scopul întelegerii patologiilor, în contexte relevante din punct de vedere fiziologic.
Culturile 3D nu sunt studiate doar pentru înțelegere patologiilor, ci și pentru deficiența majoră
în numărul de organe disponibile pentru transplantare. (Duelen și colab., 2020)

Fig. 7. Reprezentare schematică a obținerii organoizilor derivați din celule prelevate de

la un pacient. (Duelen și colab., 2020)
Recent, emergența tehnologiei organoizilor a revoluționat culturile tridimensionale,
dovedindu-se drept modele alternative sofisticate – organ-in-a-dish – în schimbul testării pe
animale.
11
 Organoizii sunt structuri in vitro, care din punct de vedere al funcției și organizării
spațiale reprezintă un organ de interes într-o formă simplificată. Sub condiții de mediu optime,
factori de creștere, chemokine sau alte molecule mici, ce activează sau inactivează anumite căi
de semnalizare, reprezintă un model mult mai fidel fiziologiei umane. (Zhao și colab., 2021)
Au fost obținute sisteme organoidice pentru diferite organe de la ficat, la inimă, intestin,
plămâni și creier. Aceste structuri sunt utilizate în cercetare în vaste domenii precum, screening-
ul medicamentelor, evaluarea toxicității, medicină regenerativă. Totodată, acestea permit
standardizarea protocoalelor experimentale, așadar obținerea de rezultate relevante ce pot fi
utilizate. (Duelen și colab., 2020)

2.4. Limitări
Precum în majoritatea domeniilor conexe medicinei, majoritatea aplicațiilor aflate în
cercetare, state-of-the-art, ori deja utilizate, prezintă anumite limitări, dar și riscuri. În primul
rând, deși nu este un factor care poate fi controlat de cercetători, este constituit de costurile
majore, pe care le implică realizarea protocoalelor experimentale, nu doar in vivo, cât și in vitro
sau in silico , consumabile, aparatură, dar și obținerea organismelor model. (Duelen și colab.,
2020).
Colectiv, manipularea animalelor trebuie realizată cu de oameni cu expertiză,
sacrificarea ulterioară după inducerea mutațiilor sau testarea unor compuși, nu trebuie să aducă
mai multă suferință decât este necesar, așadar trebuie utilizate tehnici eficiente. (Lokman și
colab., 2020). De asemenea există un număr ridicat de constrângeri bioetice, pentru trecerea de
la stadiul de cercetare, la implementarea terapiilor pe subiecți umani (Marco și colab, 2016;
Duelen și colab., 2020).
În cazul structurilor celulare tridimensionale, apare problema vascularizației, nu din
absența sa, ci din punctul limitat al funcționalității sale – acumularea de reziduuri metabolice,
necesitatea constantă de oxigenare și complexitatea mediilor de cultură, alături de dificultatea
de comunicarea intercelulară intre diferite tipuri de țesuturi, chiar dacă coculturile atenuează
unele dintre provocări. (Zhao și colab., 2021).

3. Aplicații ale biotehnologiilor animale în medicina legală

3.1. Status quo
Medicina legală constituie un domeniu multidisciplinar, în care diferite ramuri ale
științei și tehnologiei, sunt implementate, pentru a investiga și stabili verdicte în dispute civile
sau criminale. O mare parte din aceasta constă în analiza probelor fizice de diverse origini,
organice sau anorganice. Acest câmp cuprinde, din punctul de vedere al expertizei de laborator,
12
analizarea ADN-ului, amprentare, tehnici de autopsie, forensic engineering, patologie, biologie,
entomologie și toxicologie, unele dintre acestea fiind tehnici specifice biotehnologiilor animale.
(Minkashi și colab., 2013).
De la procesarea probelor biologice, precum salivă, sânge, urină, materie fecală, pentru
extragerea ADN și analize ulterioare, Molecular animal forensics deservește un rol crucial,
deoarece categorizeză animalele ca victime, martori și evidență la anumite crime, tehnicile
moleculare fiind extrapolate la identificarea persoanelor. Unelte genetice, precum secvențierea
ADN, SNP, PCR, analiza microsatelitilor pentru identificarea speciei, fie umane sau animale,
caracterizarea probelor de la locul crimei, sunt indispensabile. De asemenea, markerii genetici,
incluzând cei mitocondriali și nucleari, pentru identificarea speciilor, alături de alte tehnici
pentru identificarea specifica a indivizilor, identificarea sexului și analize parentale, precum
genotiparea microsatelitilor, secvențiere ADN, sunt frecvent implementate (Minkashi și colab.,
2013).
3.2. Secvențierea materialului genetic
O varietate de probe sunt supuse secvențierii și analizei, de la probe anorganice, la cele
organice precum fluide biologice (salivă, sânge, urină, etc) sau diferite țesuturi.

3.3. Molecular animal forensics

3.3.1. Genotiparea ADN-ului mitocondrial

Genotiparea ADNmt este o tehnică utilizată pentru analizarea materialului genetic
regăsit în mitocondrii. Ce este diferit față de ADN-ul nuclear, care este moștenit de la ambii
genitori, ADNmt se transmite pe cale maternală, de la femele la progenitori. Procesul
genotipării ADNmt constă în secvențierea unor regiuni specifice ale genomului mitocondrial,
de obicei regiunile hipervariabile HV1 și HV2. Aceste regiuni conțin secvențe nucleotidice care
variază între indivizi, foarte utile deoarece acestea identifică profiluri genetice unice. (Brettel,
2005)
Acest protocol constă în: colectarea materialului biologic ( fluide, precum sânge, urină,
salivă sau țesuturi) de la anumiți indivizi, ori probe de la locul invetigației, extragerea și
purificarea ADN-ului, amplificarea selectivă prin PCR a secvențelor HV1 și HV2 – acest pas
este foarte important pentru obținerea unei cantități suficiente, secvențierea și compararea
secvenței de interes cu o bază de date pentru a realiza profilul genetic al fiecărui individ. În
final, urmează interpretarea datelor pentru identificarea individului și stabilirea relațiilor
familiale. Față de ADN-ul nuclear, care în majoritatea cazurilor este degradat sau insuficient,
genotiparea ADNmt este crucială. (Brettel, 2005)
13
 Deși constituie un ajutor major în realizarea investigațiilor, în cazul probelor biologice
degradate sau foarte vechi, un dezavantaj îl constituie puterea scăzută de discriminarea în
comparație cu ADN nuclear, alături de incapacitatea de a distinge între indivizi relatați
maternal, cu același profil ADNmt. (Brettel, 2005)

3.3.2. Genotiparea microsateliților

Microsateliții sunt markeri hipervariabili, cunoscuți și ca short tandem repeats (STR)
sau simple sequence repeats (SSR). Microsateliții sunt secvențe scurte de 2-4 nucleotide, ce pot
fi repetate între 3-100 ori. Au o rată mutațională ridicată, datorită alunecării polimerazei în
replicarea ADN. Cu cât sunt mai mari locii, cu atât creste posibilitatea de polymerase slippage.
(Markashi și colab., 2013)
Microsateliții sunt comuni în genomul uman, dar și în alte genomuri, apărând odată la
câteva mii de perechi de baze. Funcționează ca markeri codominanți, prezentând mai multe
alele la același locus în indivizi, dar și în populații. Aceste alele, moștenite de la ambii genitori,
sunt amplificate prin diferite tehnici PCR și vizualizate în gel de poliacrilamidă. Homozigoții
prezintă secvențe STR identice, iar în cazul heterozigoților există variații semnificative. O
resursă valoroasă și pentru determinarea paternității datorită naturii polimorfe. Profiluri diferite
implică indivizi diferiți, iar profiluri identice sugerează o proveniență ridicată a probei de la
același individ. Cu toate acestea, datele trebuie să fie interpretate statistic, pentru a fi relevante.(
Cardinali și colab., 2013)

3.4. Markeri genetici

3.4.1. Markeri nucleari

Un număr extrem de mare de markeri nucleari contribuie la DNA fingerprinting, precum
RAPD–random amplified polymorphic DNA, AFLP–amplified fragment length polymorphism,
alături de microsateliti. Cu toate acestea, de cele mai multe ori se utilizează o combinație de
markeri nucleari și mitocondriali pentru acuratețe. (Markashi și colab., 2013)

3.4.2. Markeri mitocondriali

Deși pot fi utilizați și în studii umane, cel mai frecvent markerii mitocondriali sunt
utilizați pentru studiile animale, în special citocromul b și gena pentru subunitatea citocrom
oxidaza I (COI). Rata lor mutațională se aliniază cu rata de speciație, așadar abundența lor le
face utilizarea facilă. Față de ADN nuclear, ADNmt se regăsește în mai multe copii în celulă,

14
așadar, și cu material biologic limitat se pot realiza analize. Totuși, nu trebuie uitată mențiunea
anterioară legată de stabilirea relațiilor matriliniale și utilizarea pentru studii umane.
Citocrombul b (Cyb) este o genă mitocondrială care are un rol important în transportul
de electroni în fosforilarea oxitativă, dar mai relevant prezintă variabilitate între indivizi fiind
un marker mitocondrial important. COI este o genă mitocondrială, ce codifică subunitatea
enzimei aferente, în lanțul de transport al electronilor. Notabil, în forensics entomology este
utilizată pentru identificarea speciilor de insecte din jurul probelor umane sau a rămășițelor,
fiind un ajutor indispensabil în estimarea intervalului postmortem. (Brettel 2005)

3.4.3. SNP – Single Nucleotide Polymorphisms

SNP (Single Nucleotide Polymorphisms) sunt un tip de variație genetică, care are loc la
poziția unei singure nucleotide în secvența ADN. Datorită abundenței și stabilității transmiterii
la descendenți, acestea sunt frecvent utilizate în tehnologiile de genotipare. Așadar genotiparea
SNP-urilor are o specificitate mare în secvența nucleotidică, fiind mult mai ușoară diferențierea
indivizilor din aceiași specie sau din specii diferite.
De asemenea, un alt aspect important este reprezentat de eliminarea necesității unor
fragmente lungi și calitative de ADN, care sunt greu de obținut. Cu toate acestea, datorită
dimensiunilor reduse, se obțin mult mai puține informații genetice, față de o secvențiere ADN
standard. Acest fapt trebuie luat în considerare în design-ul assay-urilor și a probelor ce vor fi
procesate. (Markashi și colab., 2013)
3.5. Limitări
Principalele limitări ale acestor aplicații și tehnici sunt legate de costul aparaturii, dar și
de condiția materialului biologic prelevat. Totodată, aceste tehnici prezintă limitările
tehnologiilor ADN în medicină legală și criminalistică, în afara laboratorului, prin faptul că o
potrivire a probei analizate sugerează doar prezența unui individ la locul crimei, nu și implicarea
în situația respectivă. (Loftus, 2005)

4.1. Perspective de viitor ale biotehnologiilor animale în diverse ramuri

ale medicinei
4.1.1. Bioprinting
Încă din anii ‘80, imprimarea tridimensionala a evoluat, la început pentru realizarea
prototipurilor, cu ajutorul unor tehnologii-cheie, precum stereolitografia, printarea asistată laser
și electron beam sintering. Recent, s-a realizat o tranziție către bioprinting, combinația dintre
imprimarea 3D cu biomateriale precum celule, biomolecule, pentru designul țesuturilor. Scopul

15
final al acestei tehnologii emergente este printarea organelor umane, un ideal pentru medicina
regenerativă. Organoizii sunt piesele fundamentale în aceasta tehnologie. Cele doua abordări
pentru 3D bioprinting, constă în utilizarea organoizilor pentru printarea organelor și obținerea
de structuri complexe cu o densitate celulară ridicată, cu proprietăți funcționale din punct de
vedere fiziologic. (Duelen și colab., 2020)

Fig. 8. Bioprintring al organelor 3D pentru dezvoltarea terapiilor și pentru medicina

regenerativă. Celulele umane pluripotente (hPSC) diferențiate in vitro în linii de țesuturi
specifice pentru formarea organoizilor. Organoizii sunt încapsulați în bioink sau hydrogel, ce
conțin substanțe care promovează maturația organoizilor, urmând printarea tridimensională
prin metode adecvate. (Duelen și colab., 2020)

4.1.2. Xenotransplant
Xenotransplantarea, utilizarea celulelor, țesuturilor și a organelor animale pentru
transplantare, este considerată drept o soluție promițătoare pentru prevalenta criză a organelor
necesare pentru transplant. Porcul domestic este unul dintre cei mai potriviți candidați pentru a
fi donor, datorită similarităților anatomice și fiziologice cu oamenii. Cu toate acestea,
transplantul xenogeneic de la porc la om prezinta o mare incompatilitate imunologică și un
proces complex de rejecție. (Hryhorowicz și colab., 2017)
Una dintre strategiile promițătoare, pentru prevenirea sau ameliorarea rejecției
hiperacute (HAR) , constă în inactivarea unei enzime α-1,3 galactoziltransferază (GGTA1),
care este responsabilă de formarea complexelor anticorp-xenoantigen, fiind una dintre cauzele
cauză principale a respingerii imediate. Totuși, deși promițătoare, riscul de la trecerea in vitro
la in vivo este încă semnificativ. (Zeyland și colab., 2014)

16
 4.1.3. Organ-on-a-chip
În esență, termenul de organ-on-a-chip, se referă la îmbinarea tehnologiilor
microfluidice cu bioprinting-ul și culturile tridimensionale. Platformele organ-on-a-chip
integrează tehnici de microproiectare, pentru a crea canale microfluidice, alături de cultura unor
celule specifice, derivate din anumite organe de interes. (Zhao și colab., 2023)
Aceste chip-uri simulează aspecte-cheie din arhitectura și funcția unui organ, precum
fluxul sanguin, forțe mecanice, alături de interacțiuni celulare, pentru a forma un sistem relevant
din punct de vedere fiziologic. Prin introducerea unor stimuli, medicamente sau toxine,
cercetătorii pot observa în timp real răspunsurile la acei stimuli, fiind resurse valoroase pentru
înțelegerea proceselor biologice complexe, modelarea patologiilor și studiul interacțiunilor
dintre compuși. Deși este un câmp în dezvoltare cu perspective promițătoare, încă nu reprezintă
un substituent ideal pentru înlocuirea modelelor animale. (Duelen et al 2020)

Concluzii

Contribuțiile aduse de implementarea biotehnologiilor animale în medicină și medicină

legală, au condus la implementarea unor tehnologii inevaluabile, pentru studiul și înțelegerea
patologiilor, al interacțiunilor farmacodinamice, dar și pentru proiectarea unor structuri
complexe, în scopul obținerii rezultare relevante din punct de vedere al fiziologiei umane.
În cadrul diferitelor ramuri medicale, modelele animale au adus un progres enorm pentru
tranziția de la studii in vitro, la cele in vivo pentru un număr vast de afecțiuni – de la boli
neurodegenerative și somatice, la cancer și tulburări metabolice. De asemenea, obținerea de
compuși derivați din animale transgenice, emergentul câmp al organoizilor și al culturilor
tridimensionale, au facilitat un salt exponențial în cercetările biomedicale.
Pentru medicina legală și studiile criminalistice, tehnicile de secvențiere și genotipare,
frecvent utilizate în biotehnologiile animale, au deschis o nouă perspectivă în investigații –
începând de la identificarea indivizilor cu acuratețe prin analiza probelor biologice prelevate,
la identificarea unor markeri biologici, până la identificarea intervalului postmortem.
Nu în ultimul rând, aplicațiile biotehnologiilor animale în diferite ramuri medicale aduc
perspective de viitor promițătoare – de la implementarea bioprinting-ului la organs-on-a-chip,
până la depășirea barierelor imunologice de respingere în xenotransplantare și ameliorarea
crizei actuale de organe pentru transplantare.

17
 Bibliografie

1. Brettell, TA, Butler, JM, Almirall, JR, 2005, Forensic science. Analytical Chem
Journal, 77, 3839-3860;

2. Cardinali, I, Tancredi, D, Lancioni, H, 2023, The Revolution of Animal Genomics in

Forensic Sciences. International Journal of Molecular Sciences, 24, 8821;

3. Duelen, R, Corvelyn, M, Tortorella, I, Leonardi, L, Chai, YC, Sampaolesi, M, 2020,

Medicinal Biotechnology for Disease Modeling, Clinical Therapy, and Drug
Discovery and Development;

4. Eisenstein, M, 2018, Organoids: the body builders. Nature Methods, 15, 19-22;

5. Gorio, A, Gokmen, N, Erbayraktar, S, Yilmaz, O, Madaschi, L, Cichetti, C, Di

Giulio, AM, Vardar, E, Cerami, A, Brines, M, 2002, Recombinant human
erythropoietin counteracts secondary injury and markedly enhances neurological
recovery from experimental spinal cord trauma, 99, 9450-9455;

6. Hryhorowicz, M, Zeyland, J, Słomski, R, Lipiński, D, 2017, Genetically Modified

Pigs as Organ Donors for Xenotransplantation, 59, 435-444;

7. Jänne, J, Hyttinen, JM, Peura, T, Tolvanen, M, Alhonen, L, Halmekytö, M, 1992,

Transgenic Animals as Bioproducers of Therapeutic Proteins, Annals of Medicine,
24, 273-280;

8. Loftus, R, 2005, Traceability of biotech-derived animals: application of DNA

technology , 24, 231-242;

9. Lokman, NA, Ricciardelli, C, Oehler, MK, 2020, Chick chorioallantoic membrane

assay: a 3D animal model for cancer invasion and metastasis, Animal
Biotechnology (Second Edition), 221-231;

10. Marco S, Pujol, A, Roca, C, Motas, S, Ribera, A, Garcia, M, Molas, M, Villacampa,

P, Melia, CS, Sánchez, V, Sánchez, X, Bertolin, J, Ruberte, J, Haurigot, V, Bosch,
F, 2016, Progressive neurologic and somatic disease in a novel mouse model of
human mucopolysaccharidosis type IIIC, 9, 999-1013;

11. Moretti, M, Leonardi, L, Piro, F, Pannaioli, V, Bellezza, E, Marsili, R, Angeli, G,

Bucci, A, Rossi, G, 2015, Additive manufacturing and advanced testing techniques
applied to bone reconstructive sciences in animals;

12. Minakshi, P , Gupta, M, Alisha, K, Ranjan, K, Pawan, B, Anshul, B, Singh, R,

Brar, B, Supriya, A, Prasad, G, 2013, Animal Forensics and Applications, 265-287;
18
13. Ruan, H, Tang, XD, Chen, ML, Joiner, ML, Sun, G, Brot, N, Weissbach, H,
Heinemann, SH, Iverson, L, Wu, CF, Hoshi, T, 2002, High-quality life extension by
the enzyme peptide methionine sulfoxide reductase, 99, 2478-2483;

14. Zeyland, J, Lipiński, D, Słomski, R, 2015, The current state of xenotransplantation,

56, 211-217;

15. Zhao, X, Xu, Z, Xiao, L, Shi, T, Xiao, H, Wang, Y, Li, Y, Xue, F, Zeng, W, 2021,
Review on the Vascularization of Organoids and Organoids-on-a-Chip, 9.

19