Compendiu Microbiol

Boris Nedbaliuc
Compendiu de microbiologie
general
Chiinu 2013
CZU 579.2(075.8)
N 35
Boris Nedbaliuc
Recenzeni:
E. Iurcu - confereniar universitar, doctor n tiine agricole, Universitatea de Stat
din Tiraspol, Catedra Biologie vegetal;
E. Coropceanu confereniar universitar, doctor n tiine chimice, Universitatea
de Stat din Tiraspol, Catedra Chimie.
Descrierea CIP a Camerei Naionale a Crii
Compendiu de microbiologie general / Boris Nedbaliuc;
Universitatea de Stat din Tiraspol. Catedra Biologie vegetal, Chiinu:
Centrul ed. al UST, 2013. 88 p.
Bibliogr. p. 87-88 (29 tit.). 100 ex.
ISBN 978-9975-76-107-9
579.2(075.8)
N 35
Universitatea de Stat din Tiraspol, Chiinu, str. G. Iablocichin 5
ISBN 978-9975-76-107-9
CUPRINS
Prefa.........................................................................................................................4
Obiectul i subdiviziunile microbiologiei.................................................................5
Istoricul microbiologiei..............................................................................................7
Lucrare de laborator nr. 1. Microbiologia. Obiectul de studiu. Laboratorul
microbiologic. Microscopia optic i variaiile ei. Microscopul cu imersie...............11
Lucrare de laborator nr. 2. Bazele clasificrii i morfologia microorganismelor.
Metode de pregtire a frotiului. Metoda simpl de colorare a microorganismelor.....19
Lucrare de laborator nr. 3. Structura celulei bacteriene. Metodele de studiere.
Coloraia Gram i Ziehl-Neelsen................................................................................26
Lucrare de laborator nr. 4. Structura celulei bacteriene. Metodele de studiere.
Metode compuse de colorare a microorganismelor. Coloraia Ojeco, Omeleanski,
Burry-Hinss, Pecov, Loeffler i Neisser....................................................................32
Lucrare de laborator nr. 5. Aciunea factorilor mediului nconjurtor asupra
microorganismelor. Metode i tehnici de sterilizare...................................................36
Lucrare de laborator nr. 6. Fiziologia microorganismelor. Mediile de cultur.
Cultivarea....................................................................................................................42
Lucrare de laborator nr. 7. Cultivarea microorganismelor aerobe i anaerobe.
Izolarea n culturi pure i identificarea microorganismelor........................................48
Lucrare de laborator nr. 8. Ecologia microorganismelor. Metodele de analiz
cantitativ i calitativ a microflorei solului, apei, aerului ........................................57
Lucrare de laborator nr. 9. Microorganismele solului i circuitul substanelor n
natur..........................................................................................................................62
Lucrare de laborator nr. 10. Transformarea compuilor carbonului n natur de
ctre microorganisme. Fermentaiile..........................................................................72
Lucrare de laborator nr. 11. Relaiile dintre microorganisme. Antagonismul
microbian. Antibioticele.............................................................................................79
Reete de pregtire a unor colorani, reactive i soluii.........................................84
Bibliografie.................................................................................................................87
Prefa
Microbiologia este o disciplin de specializare, cunoaterea creia este
necesar pentru formarea unei concepii materialiste despre coeziunea i integritatea
lumii organice. Este o tiin, care studiaz morfologia, structura, sistematica,
fiziologia, biochimia, variabilitatea, ereditatea, rspndirea, ecologia i nsemntatea
practic a microorganismelor.
Compendiul prezentat este destinat studenilor, care i fac studiile la
specialiti cu profilul Biologie. Este alctuit n corespundere cu programele
universitare i cuprinde indicaii metodice privind efectuarea a 11 lucrri de laborator.
Pe parcursul studierii disciplinei microbiologia, studenii trebuie s nsueasc
metodele de baz ale lucrului experimental: crearea mediilor de cultur, cultivarea i
izolarea n culturi pure a microbilor aerobi i anaerobi, studierea caracterelor
culturale, morfologice, tinctoriale i biochimice ale microorganismelor, tehnicile de
colorare, metodele de sterilizare, metodele de analiz cantitativ i calitativ a
microflorei solului, apei i aerului, studierea relaiilor dintre microorganisme,
sensibilitatea la antibiotice etc.
Fiecare lucrare de laborator ncepe cu expunerea succint a materialului
teoretic la tema dat, ceea ce contribuie la o recapitulare mai profund a cursului de
microbiologie. La prima etap a lucrrii se face reactualizarea cunotinelor
studenilor la subiectul studiat, apoi se aplic n practic cunotinele teoretice. La
etapa a treia studenii fac concluziile de finisare.
Majoritatea lucrrilor sunt prevzute pentru 2 ore. Lucrrile de laborator la
temele Cultivarea microorganismelor aerobe i anaerobe. Izolarea n culturi pure i
identificarea microorganismelor, Microorganismele solului i circuitul substanelor
n natur, i Transformarea compuilor carbonului n natur de ctre
microorganisme, fermentaiile, necesit cte 4 ore, deoarece studenii la primele 2
ore fac nsmnrile respective, iar peste cteva zile analizeaz rezultatele obinute i
fac desenele i notiele explicative.
Obiectul i subdiviziunile microbiologiei

Microbiologia este o tiin complex care studiaz numeroase grupe de
microorganisme: bacterii, virusuri, ciuperci inferioare, alge unicelulare, protozoare, i
modul cum intervin acestea n diferite procese de fermentaie, de descompunere sau
de sintez n natur sau modul cum determin diferite infecii la om, animale i
plante. Aceste organisme, din cauza dimensiunilor lor foarte mici nu pot fi vzute sau
examinate cu ochiul liber, ci numai cu ajutorul microscopului.
n natur microorganismele sunt prezente pretutindeni: n aer, n ap, n sol, n
alimente, i n organismul omului, animalelor i plantelor. Cele mai multe sunt
inofensive pentru organismul uman, unele specii sunt utile i sunt folosite n mod
dirijat de ctre om pentru diferite scopuri practice. Un numr redus de
microorganisme sunt patogene (cca. 1200 de specii), determinnd infecii la om i
animale, uneori deosebit de grave.
n prezent, microbiologia i-a mbogit i i-a lrgit considerabil coninutul
prin crearea unor noi tiine ca: imunologia, virusologia, biochimia bacterian,
citologia i genetica microbian ceea ce a permis studii fundamentale valoroase n
ceea ce privete fenomenul de ereditate i variabilitate a microorganismelor cu
importante aplicaii n practica medical, de exemplu preparare de noi vaccinuri.
Noile industrii biotehnologice, bazate pe procese fermentative, n special
acelea care urmresc producerea prin biosintez de: antibiotice, stimulatori de
cretere, vitamine i alte substane biologic active de origine microbiana, sunt
deosebit de importante.
Microbiologia general este o tiin biologic fundamental, care studiaz
particularitile organizrii structurale i funcionale ale celulei bacteriene, biologia i
sistematica bacteriilor, rspndirea lor n natur, relaiile lor ecologice cu alte
microorganisme sau cu macroorganismele, originea i evoluia lor, fenomenele de
ereditate i variabilitate microbian. Este o tiin de sintez i se bazeaz pe date din
domeniile aplicative ale microbiologiei.
Cunoaterea principiilor fundamentale ale microbiologiei generale este o
necesitate pentru orice biolog, indiferent de domeniul su de activitate.
Microbiologia medical se ocup cu studiul microorganismelor care
determin la om infecii locale sau generale (boli infecioase transmisibile). Ea este o
tiin complex care cuprinde urmtoarele subdiviziuni: bacteriologia (studiul
bacteriilor), virologia (studiul virusurilor), micologia (studiul ciupercilor inferioare),
protozoologia (studiul protozoarelor), etc.
Microbiologia veterinar cuprinde aceleai subdiviziuni, ocupndu-se n
special de microorganismele patogene pentru diverse specii de animale domestice sau
slbatice.
5
Microbiologia vegetal se ocup cu microorganismele patogene pentru plante,

fiind o ramur a fitopatologiei.
Microbiologia mediului extern se ocup cu studiul microorganismelor
adaptate condiiilor particulare n care triesc: microbiologia apei, microbiologia
aerului, microbiologia solului, microbiologia alimentelor.
Microbiologia industrial studiaz n general bacteriile utile, folosite de om
n scopuri practice:
- n industria alimentar, anumite specii de bacterii sau levuri sunt utilizate
pentru prepararea brnzeturilor i altor preparate lactate ca de exemplu: iaurt, chefir
etc., iar alte specii de microorganisme sunt utilizate pentru fabricarea pinii, berii,
oetului, vinului etc.;
- n industria textil, microorganismele sunt folosite pentru prelucrarea inului,
cnepei, iutei etc.;
- n industria pielriei, anumite specii microbiene sunt utilizate pentru tbcitul
pieilor;
- n industria farmaceutic cea mai larg i important utilizare o au
microorganismele n acest domeniu pentru producerea prin biosintez a numeroase
produse ca de exemplu: alcooli, acizi, vitamine, hormoni, aminoacizi, alcaloizi,
antibiotice etc.
Istoricul microbiologiei
Dei microbiologia ca tiin s-a manifestat abia n a doua jumtate a secolului
XIX, aciunea bacteriilor a fost intuit nc din antichitate, prin bolile contagioase pe
care le determinau i prin epidemiile care nimiceau mii i milioane de oameni. nc
Hippocrat (400 .e.n), considerat printele medicinii, a emis ipoteza transmiterii
bolilor contagioase prin miasme morbide (aer contaminat) sau ape poluate. Bazat
pe fapte de observaie, istoricul antic grec Thucidide, a fost primul care a artat c
persoanele care au trecut printr-o boal infecioas devin rezistente la aceasta i pot
ngriji, fr pericol de contaminare, bolnavii din timpul epidemiei respective. Chiar
din antichitate s-au instituit primele reguli elementare de igien individual i
colectiv, la unele popoare (chinezi, indieni, turci etc.) de asepsie i antisepsie era
cunoscut variolarizarea, metoda de vaccinare n variol, cu material patologic uman.
n evul mediu, boli grave ca: holera, piesta, variola, evoluau sub forma unor
epidemii imense, producnd mari pagube materiale i nenumrate pierderi de viei
omeneti. n acea perioad msurile sanitare erau complet insuficiente i de aceea
evul mediu a fost denumit istoria marilor epidemii. n aceast perioad,
Fracastorius a emis ipoteza c bolile infecioase s-ar datora unor germeni vii i
invizibili care pot trece de la un organism infectat la unul sntos. Dei aceast
ipotez a fost just, ea nu a putut fi confirmat dect o dat cu descoperirea i
descrierea microbilor. Acest lucru a fost posibil odat cu progresele din domeniul
fizicii i inventarea microscopului.
Primele studii asupra microbilor au fost fcute ntre anii 1674-1676 de ctre
Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723), negustor olandez, care avnd pasiunea
lefuirii lentilelor i-a construit un microscop propriu cu putere de mrire de
aproximativ 150 de ori. Cu ajutorul acestor lentile el a studiat: apa de ru, infuzia de
fn, urina, tartrul interdentar, n care a observat microorganisme de diferite forme
(sferice, bastonae, spirile) care se micau, creteau i se nmuleau, i pe care le-a
denumit animalicula. Dei rezultatele studiilor sale au fost comunicate Societii
Regale de tiin din Londra, n scopul de a servi progresului tiinific, ele au fost
urmate de o aprig polemic asupra originii acestor microorganisme. Unii cercettori
i reprezentanii Bisericii susineau c aceste fiine ca i insectele i animalele de talie
mic, iau natere spontan din materie inanimat.
Ali cercettori considerau c microorganismele, ca orice organism viu se nasc
din materie organic vie, deci din alt organism viu. Astfel, susintorii primei ipoteze,
denumit i teoria generaiei spontanee, considerau c viaa poate aprea oriunde, n
mod spontan, de la sine. Ca exemplu, filozoful englez Ross, considera c mutele se
nasc din carne stricat iar oarecii din rufele murdare. Aceast ipotez complet
greit a fost combtut de Lazzaro Spallanzani, naturalist italian, care a demonstrat
7
experimental, c un lichid supus fierberii i nchis ermetic se conserv indefinit, fr

a permite dezvoltarea vreunui microorganism viu.
ntemeietorul microbiologiei ca tiin este considerat Louis Pasteur (18221895). Chimist de profesie, el a fost solicitat de industriaii francezi s studieze
procesul tehnologic al industriei berii i vinului, care evolua uneori defectuos. La
nceput, fermentaia a fost considerat ca un simplu proces chimic: prin fermentaie
alcoolic, zahrul se transforma n cantiti aproximativ egale de alcool i bioxid de
carbon.
Lavoisier, n anul 1789, a recunoscut importana levurii n declanarea
fenomenului chimic al fermentaiei. Rolul esenial al levurii n procesul fermentativ a
fost ns demonstrat i studiat mai amplu de ctre Cagniard Latour (1777-1859), care
considera levurile organisme vii, de origine vegetal, fiind lipsite de mobilitate.
n aceeai perioad, Louis Pasteur a fcut numeroase i aprofundate studii
asupra fermentaiei lactice, butirice, acetice, alcoolice. El a artat c fiecare tip de
fermentaie este determinat de un anumit tip de microorganism care este specific
pentru fermentaia respectiv i c modificarea randamentului sau a calitii vinului a
fost cauzat de ptrunderea unor microorganisme strine, nedorite, n procesul
fermentativ. El a demonstrat astfel, natura biologic i nespecific a defectelor de
fermentaie. Prin experienele sale din anii 1850, prin care a artat eficiena sterilizrii
pentru bacterii i fungi, forme vegetative i spori, el a combtut definitiv teoria
generaiei spontanee. Studiind bolile viermilor de mtase i apoi unele boli epidemice
la om i la animale, el a ajuns la concluzia c toate sunt determinate de microbi.
Demonstrarea acestui adevr a avut drept urmare o dezvoltare vertiginoas a
microbiologiei n a doua jumtate a secolului XIX, descoperindu-se i studiindu-se
numeroase bacterii, ageni etiologici ai celor mai variate boli contagioase. Astfel
Pateur a descoperit streptococul, microbul febrei puerperale (1879), apoi stafilococul
(1880), Clostridium septicum (1887), iar mai trziu agentul cauzator al holerei aviare.
Puin mai trziu se descoper i alte bacterii: gonococul (Neisser, 1879),
bacilul tific (Eberth, 1880), bacilul coli (Escherich, 1882), bacilul pestei (Yersin,
1894), Treponema pallidum (Schaudin, 1905) etc.
Tot n aceast perioad Louis Pasteur a observat c cultura microbian care
provoac holera aviar, prin nvechire era inapt s mai produc boala, i pasrile
inoculate cu aceast cultur deveneau rezistente, imune la o nou infecie. Prin
aceast mare descoperire, Pasteur a pus bazele tiinifice ale vaccinrii, demonstrnd
totodat c proprietile biologice ale microbilor nu sunt fixe, ele putnd fi modificate
sub influena unor factori din mediul extern: cldur, uscciune etc., bacteriile
devenind inofensive i chiar folositoare pentru om. Pe baza acestei descoperiri el
8
prepar vaccinurile: crbunos, rabic, holera aviar, punnd astfel n practic metoda
imunizrii prin vaccinuri vii i atenuate, principiu deosebit de actual i n prezent.
Robert Koch, medic german (1843-1910), alturi de Pasteur, a iniiat infecia
experimental i a artat condiiile necesare pentru reproducerea infeciei la
animalul sensibil. Koch a descoperit bacilul tuberculozei (1882) fcnd totodat
studii valoroase asupra infeciei tuberculoase. n anul 1883 a descoperit vibrionul
holeric. Practicnd metoda cultivrii pe medii solide (ser de bovine coagulat) el a
obinut pentru prima oar culturi microbiene n stare pur.
Cunoscnd studiile lui Pasteur asupra bacteriilor, Joseph Lister (1827-1912)
chirurg englez, aplic pentru prima dat n chirurgie, un antiseptic, apa fenolat
(fenol 1-5%), pentru a preveni contaminarea post-operatorie a plgilor chirurgicale.
Acest lucru a constituit un deosebit progres deoarece n acea perioad infeciile
nsoeau inevitabil orice act operator: amputaiile i interveniile pe abdomen erau
practic imposibile, iar n materniti, mortalitatea femeilor prin infecii puerperale era
de circa 25%.
n 1892 Dimitrie Ivanovski (1867-1920) a demonstrat o alt form a materiei
vii, aceea a virusurilor filtrabile, pe care le pune n evident la mozaicul tutunului,
punnd astfel bazele virusologiei.
Ilia Mecinikov (1845-1916), cercettor rus, a descoperit rolul fagocitelor n
procesul de aprare natural antiinfecioas a organismului, crend astfel primele
noiuni de imunologie (imunitate celular).
Roux i Yersin n anul 1888 au pus n eviden la unele bacterii prezena
exotoxinelor iar n 1890 Behring i Kitasato au demonstrat valoarea serului imun
(seruri terapeutice) n tratamentul infeciilor toxigene: tetanos, difterie etc.
Savanii Bordet, Pfeiffer i Isaeff, Ehrlich, Durham, Grabar i alii au artat
rolul factorilor umorali n imunitate; s-au elaborat primele teorii asupra formrii
anticorpilor i s-au studiat reaciile antigen-anticorp.
Twort (1915) i dHerelle (1917) au descoperit bacteriofagii, virusuri care
paraziteaz n mod specific bacteriile i care au aplicare n studiile de epidemiologie.
Dup ce n anul 1909 Ehrlich a preparat primii compui arsenicali utilizai cu
succes n tratamentul sifilisului, n 1935, Gerhard Domagk a sintetizat o sulfamid
(crisoidin-sulfamida sau prontozilul rou), primul chimioterapic valoros cu aciune
antimicrobian selectiv.
n anul 1928 Alexander Fleming a descoperit penicilina, primul antibiotic de
biosintez (natural), care a fost experimentat i purificat de ctre Florey i Chain,
fiind pus n practic abia n anul 1941, cu rezultate excelente. Descoperirea
penicilinei, produs netoxic i cu activitate selectiv asupra bacteriilor, a modificat
9
mult evoluia i terapeutica bolilor infecto-contagioase, deschiznd era descoperirii

unor noi antibiotice.
n epoca contemporan s-au fcut cercetri aprofundate asupra structurii celulei
bacteriene cu ajutorul microscopiei electronice, apoi studii detailate de biochimie i
genetica bacterian, care au elucidat unele mecanisme ale aciunii antibioticelor
asupra bacteriilor.
Victor Babe (1854-1926) este fondatorul microbiologiei romneti. mpreuna
cu Victor Cornil a scris primul tratat de bacteriologie din lume. El a descoperit
peste 40 de microorganisme patogene (babeii). A studiat antagonismul bacterian i
antibioza, fiind primul cercettor dup Pasteur, care a intuit importana acestui
antagonism pentru terapeutica medical i a prevzut posibilitatea preparrii cu
ajutorul microorganismelor a unor substane cu aciune antimicrobian, antibioticele.
Babe a fost primul care a studiat posibilitatea imunizrii pasive, cu ser provenit de
la animale vaccinate, introducnd pentru prima oar n Romnia, seroterapia n
difterie. A avut o contribuie mare n studiul rabiei.
Ion Cantacuzino (1863-1934) este ntemeietorul colii romneti de
microbiologie i tot el a nfiinat Institutul de Seruri i Vaccinuri de la Bucureti
dup modelul Institutului Pasteur din Paris (actualul Institut Naional de CercetareDezvoltare pentru Microbiologie i Imunologie Cantacuzino, care face parte din
reeaua Institutelor Pasteur). El a studiat holera, febra tifoid, scarlatina i
tuberculoza, Romnia fiind a doua ar din lume, care, la ndemnul lui a folosit
vaccinul BCG, n profilaxia tuberculozei.
Constantin Levaditi (1874-1953), elev al lui Babe i Mecinikov, are peste 750
de lucrri de bacteriologie, imunologie, chimioterapie i virologie.
Dimitrie Combiescu (1887-1961) i Constantin Ionescu-Miheti (18831962) au adus contribuii valoroase la studiul diferitelor infecii: rickettsioze,
poliomielita, tuberculoza. Mihai Ciuca (1883-1968), are lucrri importante n
domeniul bacteriofagiei, salmonelozelor, difteriei i al malariei.
Academicianul Valeriu Rudic este fondatorul Laboratorului Interdepartamental
de cercetri tiinifice fotomicrobiologice, director al Institutului de Microbiologie al
AM. Prin cercetrile sale V. Rudic a marcat o nou direcie n biotehnologia
modern: sinteza orientat a substanelor bioactive i obinerea unor produse
microbiene preioase pentru medicin, agricultur i alte domenii ale economiei.
10
Lucrare de laborator nr. 1

Tema: Microbiologia. Obiectul de studiu. Laboratorul microbiologic.
Microscopia optic i variaiile ei. Microscopul cu imersie.
I. Reactualizarea cunotinelor studenilor la subiectul studiat:
1. Etapele istorice de dezvoltare a microbiologiei.
2. Rolul savanilor A.Leeuwenhoek, L.Pasteur, R.Koch, I.Mecinicov n
dezvoltarea microbiologiei.
3. Laboratorul microbiologic i dotarea lui.
4. Tipurile de laboratoare microbiologice i predestinarea lor:
a) bacteriologice (de lucrri practice, de cercetri tiinifice, de producere, de
studii i altele);
b) algologice (de lucrri practice, de cercetri tiinifice, de producere);
c) micologice (de lucrri practice, de cercetri tiinifice, de producere);
d) virusologice.
5. Reguli de comportare i de lucru n laboratoarele microbiologice:
a) pregtirea laboratorului pentru lucru;
b) locul de lucru al studentului i utilajul necesar;
c) regulile de lucru cu culturile microbiene;
d) obligaiile studenilor n timpul lucrului practic.
6. Metodele cercetrilor microbiologice: de analiz microscopic,
bacteriologic, serologic.
7. Microscopul i metodele microscopice de cercetare. Microscopul optic cu
imersie, utilizarea lui.
8. Sistemul de transmisie optic, sistemul de iluminare i sistemul de reglare a
imaginii din microscop. Avantajul microscopiei cu imersie.
9. Microscopia cu contrast de faz, cu fond obscur, cu luminescen
(fluorescen) i microscopia electronic.
10. Regulile de lucru cu microscopul. ntreinerea microscopului.
II. Aplicarea n practic a cunotinelor teoretice:
1. A face cunotin cu laboratorul microbiologic, mobilierul i aparatajul lui.
2. nsuirea diferitelor procedee de utilizare a echipamentului de laborator i a
aparatajului necesare pentru cercetri microbiologice.
3. nsuirea de ctre studeni a metodelor i tehnicilor de lucru cu microscopul.
Studierea preparatelor microbiologice cu microscopul Biolam.
III. Concluzii de finisare.
11
Laboratorul de microbiologie
n laboratorul de microbiologie, lucrrile de baz const n transferul de
microorganisme dintr-un recipient n altul, lucrri ce se execut n zona steril de
protecie din jurul flcrii becului de gaz.
Vesela mai des utilizat n laboratorul de microbiologie const n eprubete de
diferite dimensiuni, baloane Erlenmeyer, cutii Petri, pipete Pasteur i pipete gradate.
n ultimul timp sunt din ce n ce mai mult utilizate recipientele i pipetele din plastic,
de unic folosin. Pentru prelevarea i inocularea culturilor se utilizeaz ansa sau
firul metalic, fabricate din nicrom. Ustensilele de etalare permit repartizarea uniform
a inoculului pe suprafaa mediilor solidificate i pot fi fabricate prin ndoirea unui tub
sau a unei baghete din sticl. n afara acestor ustensile curente de lucru, mai pot fi
ntrebuinate o serie de alte instrumente, n funcie de lucrarea efectuat.
Laboratorul de microbiologie trebuie s aib n dotare urmtoarele aparate i
echipamente: robinet cu ap cald i rece (de preferin acionat cu piciorul); hot cu
flux laminar sau ni sterilizabil, indispensabil lucrrilor de microbiologie; bec de
gaz tip Bunsen pentru lucrul n zona steril din jurul flcrii cu con albastru i pentru
sterilizarea ansei; etuv pentru sterilizarea veselei de laborator; termostat
bacteriologic pentru incubarea culturilor; autoclav pentru sterilizarea mediilor de
cultur i pentru decontaminarea obiectelor; baie de ap termostatat; frigidere pentru
conservarea mediilor i a culturilor; balane; pH-metru; microscoape etc.
Obligaiile studenilor i ale studentului de serviciu n timpul lucrrii de
laborator
n laboratorul de microbiologie trebuie respectate o serie de reguli de igien,
fr de care nu pot fi aplicate metodele de lucru specifice acestei discipline, existnd
totodat pericolul contaminrii propriei persoane, a celor din jur, precum i a
materialelor care se manipuleaz.
Studentul de serviciu primete materialele necesare pentru efectuarea lucrului
practic i le repartizeaz colegilor de grup.
n timpul lucrului este necesar:
- ndeprtarea de pe mesele de lucru i din ncpere a tuturor obiectelor inutile;
- ntreinerea n perfect stare de curenie a aparaturii, mobilierului i meselor
de lucru;
- tergerea meselor de lucru cu un dezinfectant nainte de nceperea lucrului;
- evitarea formrii curenilor de aer n ncperile de lucru;
- iradierea cu raze ultraviolete a atmosferei i suprafeelor de lucru nainte de
nceperea activitii;
- ntreinerea n perfect stare de curenie a minilor, mbrcmintei i
nclmintei;
12
- de mbrcat un halat de laborator dintr-un material neinflamabil;

- a lsa hainele n vestiar sau n spaiul special amenajat;
- comportarea atent cu microscopul, vesela, diferite instrumente i cu alte
obiecte din inventarul de laborator;
- manifestarea unei atenii maxime la ndeplinirea tuturor etapelor de lucru cu
culturile microbiene;
- n timpul nsmnrii nu se admit convorbirile cu colegii i micrile n plus;
- toate eprubetele i cutiile Petri cu culturi microbiene se semneaz (denumirea
tulpinii, experienei, locul de lucru, data);
- n cazul impurificrii cu materialul cercetat a mesei de lucru i a altor obiecte
(de asemenea faa, minile) se comunic imediat profesorului;
- vesela folosit, pipetele, lamelele .a. se introduc n borcane cu soluie
dezinfectant, care se afl pa fiecare mas de lucru.
Obligaiile studenilor i ale studentului de serviciu dup terminarea lucrrii de
laborator
1. A aduce n ordine locul de lucru.
2. Lamele port-obiect folosite n lucru se introduc n soluia dezinfectant.
3. Eprubetele i cutiile Petri nsmnate se transmit studentului de serviciu
pentru termostatare.
4. Materialele folosite se transmit studentului de serviciu pentru sterilizare.
5. Se aduc n ordinea cuvenit microscoapele.
6. nainte de a iei din laborator studenii i spal minile cu ap cald i
spun.
7. Studentul de serviciu:
- nregistreaz eprubetele i cutiile nsmnate de studeni n Agenda
evidenei culturilor i apoi le introduce n termostat;
- nregistreaz materialele folosite n Agenda evidenei culturilor i le
transmite laborantului pentru sterilizare;
- controleaz starea microscoapelor i le pune n dulap;
- controleaz starea locurilor de lucru ale studenilor;
- stinge lumin i aerisete ncperea.
Structura microscopului fotonic Nikon YS 100, Ergoval, Biolam i MBR-1
Microscopul fotonic reprezint un aparat optic cu ajutorul cruia se poate
obine o imagine mult mrit i virtual a obiectului cercetat. El permite studierea
celor mai mici detalii structurale care se afl departe de puterea de rezoluie a
ochiului omului.
Baza microscopului poate fi n form de potcoav sau dreptunghiular.
Suportul tubului, sau mnerul este vertical ori curbat. Msua poate fi rotund sau
13
ptrat, prevzut n partea central cu un orificiu, prin care ptrunde fasciculul de

lumin spre obiectul de studiu. Tubul microscopului este un cilindru metalic n care
se introduce (n partea lui de sus) ocularul. Acest tub este legat mobil cu suportul care
se fixeaz printr-un urub ntr-o anumit poziie. n revolver se monteaz obiectivele
microscopului. Prin rotirea acestuia, obiectivele sunt aduse succesiv n poziie
perpendicular fa de msu i n dreptul orificiului ei.
Pentru micarea tubului n sus i n jos, sau pe vertical se folosesc viza
macrometric (urubul macrometric) i viza micrometric (urubul micrometric).
Pregtirea microscopului pentru lucru, examinarea prealabil a obiectului, precum i
obinerea primei lui imagini se efectueaz cu ajutorul vizei macrometrice.
urubul micrometric servete pentru o micare minim a tubului, care se
msoar n micrometri (m). 1 m = 0,001 mm. La o rotire deplin a urubului
micrometric, tubul se deplaseaz (se apropie sau se ndeprteaz) cu 100 m sau 0,1
mm, pe cnd la rotirea doar cu o diviziune a tamburului (cadranului), tubul se
deplaseaz numai cu 2 m. De aceea, el este utilizat numai la aplicarea obiectivelor
cu o mrire mare (40x, 60x, 90x, 100x). Pentru a nu defecta urubul micrometric, se
admite efectuarea numai a unei jumti de rotire, ntr-o singur direcie. Micarea
trebuie s fie efectuat lent, fr forri fizice.
Pe msua microscopului se instaleaz preparatul cu obiectul de cercetare.
Preparatul poate fi fixat cu ajutorul a dou clame. Suportul mpreun cu condensorul
poate fi ridicat cu ajutorul mnerului pn la msu sau poate fi cobort pn la
oglind (dup necesitate).
Partea optic a microscopului cuprinde doua sisteme: de iluminare i de
observare.
Sistemul de iluminare este alctuit din urmtoarele dispozitive: oglind,
condensor, diafragm, complex de filtre, lentil suplimentar, surs de lumin.
Sistemul de observare include obiectivele i ocularele (fig. 1).
Sursa de lumin poate fi natural sau artificial. Microscoapele examinate n
aceast lucrare sunt prevzute pentru utilizarea luminii solare, sau electrice, produs
de un iluminator special. La microscoapele de tip mai nou (Nikon YS 100) se
folosete lumina artificial care, spre deosebire de cea natural, este constant i
permite o iluminare mai puternic. La astfel de microscoape sistemul de iluminat este
inclus n baza sau piciorul microscopului i este alctuit dintr-un bec electric fixat, un
sistem de lentile care concentreaz i intensific lumina, precum i din diafragma de
cmp, care evideniaz cmpul de observaie i egaleaz apertura acestuia cu apertura
condensorului i a obiectivului.
14
Fig. 1. Microscoape optice: A MBR 1; B Biolam:

1 ocular; 2 tubul microscopic; 3 stativul metalic (mnerul); 4 viz macrometric
(urubul macrometric); 5 - viz micrometric (urubul micrometric); 6 piciorul
microscopului; 7 oglinda; 8 condensor cu diafragm iris; 9 mas port-obiect; 10
revolver cu obiective; 11 cporul optic.
Oglinda servete la orientarea luminii prin condensor i orificiul msuei spre

obiectul de cercetare. Ea este mobil n toate direciile i are dou pri: concav i
plan. Partea concav concentreaz un numr mai mare de raze de lumin i este
folosit, de regul, la o lumin mai slab, iar partea plan n cazul luminii mai
puternice.
Condensorul este alctuit din 2-3 lentile montate ntr-un cilindru metalic. Odat
cu ridicarea sau coborrea lui, cu ajutorul urubului corespunztor, are loc n mod
respectiv condensarea sau difuzarea luminii orientat de oglind spre obiect.
ntre oglind i condensor se afl diafragma iris, alctuit din mai multe lame
subiri de oel. Cu ajutorul manetei (mnerului), ele pot s se desfac, acoperind
complet lentila de jos a condensorului sau s se ngusteze, mrind fluxul de lumin,
deci ea servete pentru reglarea diametrului fluxului de lumin orientat de oglind
prin condensor spre obiect, n corespundere, cu diametrul lentilei frontale a
obiectivului folosit.
Sub diafragm, la unele microscoape se monteaz o lentil auxiliar mobil. Ea
se folosete la examinarea obiectului cu obiective de mrire mic.
La multe modele de microscoape, sub diafragm se instaleaz un inel cu filtre
de lumin, mobile n direcie orizontal. Filtrul din sticl mat se utilizeaz pentru a
ilumina mai uniform cmpul de vedere i obiectul. Celelalte filtre se folosesc pentru a
spori calitatea imaginii obiectului sau pentru a spori puterea de rezoluie.
15
Sistemul de observare, alctuit din obiective i oculare, este sistemul principal

al microscopului, care creeaz o imagine mrit a obiectului. Fiecare microscop este
nzestrat cu un set de obiective i oculare cu mrire diferit.
Obiectivul este constituit dintr-un cilindru metalic n care sunt montate cteva
lentile, puterea de mrire a obiectivelor fiind direct proporional cu numrul de
lentile montate. Obiectivele mari conin 8-10 lentile. Prima lentil dinspre obiect se
numete frontal. Obiectivele i ocularele sunt notate cu cifre, care indic puterea de
mrire a fiecruia.
La leciile de laborator de obicei se folosesc obiectivele care mresc de 8, 20,
40, 90 i 100 de ori. Calitatea obiectivelor ntr-o mare msur depinde de puterea lor
de rezoluie sau de distana minim dintre dou puncte care se pot deosebi separat.
Puterea de rezoluie a ochiului omului este de 0,15 mm sau 150 m. Cu ct mai mare
este puterea de rezoluie a obiectivului, cu att mai multe detalii ale obiectului
cercetat pot fi observate. Puterea de rezoluie pentru obiectivul 8x este 1,68 m,
pentru obiectivul 40x - 0,52 m, pentru cel de 90x - 0,27 m. Aceste cifre sunt
indicate pe obiectivele respective.
O mare nsemntate n utilizarea obiectivelor are distana lor de lucru, adic
deprtarea de la lentila frontal a obiectivului pn la lamela preparatului
microscopic. Cu ct obiectivul este mai mare, cu att distana de lucru este mai mic.
Spre exemplu, pentru obiectivul 8x ea este egal cu 13,8 mm, iar pentru obiectivul
90x cu 0,12 mm. Cu ajutorul obiectivului se poate obine imaginea mrit i
inversat a obiectului cercetat n care se evideniaz detalii fine de structur.
Ocularul are o structur mai simpl dect obiectivul. El este alctuit din 2-3
lentile montate ntr-un cilindru metalic. Valoarea ocularelor este marcat
corespunztor cu cifrele 7x; 10x; 15x. Spre deosebire de obiective, ocularele nu
identific detalii noi n structur, ci numai mresc imaginile obiectelor obinute de
ctre obiective. nmulind, cifra de pe ocular cu cea de pe obiectiv putem determina
mrimea imaginii obiectului examinat, adic grosismentul combinaiei respective de
lentile. Bunoar, dac pe obiectiv e imprimat cifra 8x, iar pe ocular 7x, nseamn c
imaginea obiectului examinat va fi mrit de 56 ori. Obiectivul 90x i ocularul 15x
vor forma o imagine mrit de 1350 ori.
16
Oculare
7x
10x
15x
20x
30x
Grosismentele dintre diferite oculare i obiective

Obiective
10x
20x
40x
Imersie 90x
70
100
150
200
300
140
200
300
400
600
280
400
600
800
1200
630
900
1350
1800
2700
Imersie
120x
840
1200
1800:
2400
3600
Reguli de utilizare a microscopului i consecutivitatea examinrii preparatului la

microscop
1) La microscop se lucreaz numai eznd comod pe un scaun potrivit lng
mas n aa fel nct s putem privi liber n microscop, fr a ne ntinde sau ghemui i
fr a ne sfora.
2) Microscopul se pune pe mas n dreptul umrului stng, cu baza de 2 cm de
la marginea mesei. Odat pregtit pentru lucru, microscopul nu se mai mic din loc
pn la sfritul lucrrii. n partea dreapt se vor afla caietul de desen i toate
materialele necesare.
3) n continuare vom efectua urmtoarele operaii:
a) rotim revolverul n aa fel nct cel mai mic obiectiv 8x s fie
perpendicular fa de msu i orientat spre orificiul ei;
b) cu ajutorul cremalierei (vizei macrometrice), instalm tubul cu obiectivul 8x
i 10x la aproximativ 1 cm de la suprafaa msuei;
c) ridicm condensorul pn la refuz i deschidem complet diafragma iris;
d) privind n microscop cu ochiul stng (fr a-l nchide pe cel drept), micm
oglinda, n diferite planuri, pn cnd cmpul de vedere al microscopului este
iluminat puternic i uniform.
Dup ce ne ncredinm c cmpul de vedere este iluminat optimal, aezm
preparatul pe msu, n dreptul orificiului, astfel nct lama s se afle deasupra
lentilei frontale a condensorului, obiectul fiind iluminat de fasciculul de lumin din
condensor.
Cu ajutorul cremalierei coborm obiectivul 8x pn la 5-7 mm de la suprafaa
preparatului. Privind n ocular, rotim cremaliera spre sine (odat cu aceasta se ridica
i obiectivul) pn apare imaginea obiectului cercetat.
Pentru a examina obiectul cu un obiectiv mai mare, trebuie s fixm preparatul
cu cleme i, rotind revolverul, n loc de obiectivul 8x instalm obiectivul urmtor
dup mrime 20x, 40x sau 90x. Dup ce schimbm obiectivele, n microscop de
obicei apare imaginea neclar a obiectului. De aceea, rotind urubul micrometric spre
17
sine sau de la sine (nu mai mult de 1/2 sau 3/4 dintr-o rotaie deplin), obinem
claritatea dorit.
Dup examinarea preparatului, fixm din nou obiectivul 8x i numai apoi se ia
preparatul de pe msu. Nu se recomand s lum preparatul de sub obiectivul 40x
sau 90x pentru a evita deformarea lentilelor.
Pstrarea microscopului
Respectarea regulilor de exploatare garanteaz funcionarea ndelungat a
microscopului. Pentru aceasta este necesar s inem seama de urmtoarele cerine:
1) microscopul este transportat de la locul de pstrare la locul de lucru i napoi
cu ambele mini: cu o mn l inem de suportul tubului, iar cu alta de baz;
2) dac ntmpinm greuti n utilizarea revolverului, vizei macrometrice sau
a altor piese ale microscopului, nu trebuie s aplicm fora, ci ne adresm
profesorului;
3) ndeosebi trebuie s meninem n stare curat sistemul optic al
microscopului (obiectivele, ocularele, i aparatul iluminator), s evitm posibilele
lovituri mecanice, zgrieturi, contactul cu substane chimice (acizi, baze alcaline,
gaze otrvitoare etc.);
4) praful de pe sistemul optic se nltur mai nti cu ajutorul unei periue, apoi
cu o batist moale din bumbac care se pstreaz ntr-o cutie special. Lentilele se
cur cu tifon mbibat cu xylol i nu cu alcool etilic. Se interzice categoric atingerea
lentilelor cu degetele, tergerea lor cu hrtie sau cu o batist aspr;
5) microscopul se pstreaz pe mas sau n dulap, la loc uscat, ntr-o cutie sau
teac.
Examinarea preparatului folosind obiectivul de imersie
Preparatul microbiologic se aeaz pe msua microscopului, se fixeaz cu
clemele i se studiaz mai nti cu obiective mai mici, apoi cu obiectivul de imersie.
n acest scop la mijlocul lamelei sau direct pe frotiu se picur ulei de imersie i
privind din poziie lateral, se coboar n jos tubul microscopului, pn cnd
obiectivul se apropie de ulei fr a se atinge de lamel sau preparat, evitnd totodat
plesnirea lamelei sau apariia zgrieturilor pe lentila frontal a obiectivului. Apoi,
privind prin ocular, se ridic tubul, rotind spre sine urubul macrometric pn la
apariia obiectului n cmpul de vedere (se gsesc locurile mai reuite). Studierea
ulterioar a preparatului se bazeaz pe folosirea urubul micrometric.
18

Tema: Bazele clasificrii i morfologia microorganismelor. Metode de
pregtire a frotiului. Metoda simpl de colorare a microorganismelor.
1. Poziia microorganismelor n sistemele de clasificare a lumii vii.
a) sistemul tradiional.
b) sistemul lui Hogg i Haeckel.
c) sistemul lui Copeland.
d) sistemul lui Whittaker.
2. Grupele principale de microorganisme (bacterii, micoplasme, spirochete,
rickettsii, virusuri). Caracteristica morfologic a lor.
3. Forma i dimensiunile bacteriilor.
4. Criteriile de evaluare a diversitii bacteriilor. Tipuri morfologice de bacterii.
5. Morfologia cocilor. Particularitile aranjrii n spaiu a cocilor.
6. Morfologia bacililor. Particularitile aranjrii n spaiu a bacililor.
7. Morfologia bacteriilor ncovoiate.
8. Metode de pregtire a frotiului. Uscarea i fixarea frotiului.
a) Pregtirea frotiului din cultura microbian crescut pe mediul lichid.
b) Pregtirea frotiului din culturile crescute pe medii compacte de cultur.
9. Reete de pregtire a principalilor colorani folosii n microbiologie.
10. Metoda simpl de colorare a microbilor.
1. Examinarea preparatelor n stare proaspt cu obiectivele 10x, 20x, 40x.
a) studiul microscopic al culturilor de drojdii Saccharomyces cerevisiae.
b) studiul microscopic al culturilor de mucegai Aspergillus niger i Penicillium
notatum.
c) studiul microscopic al culturilor de Bacillus subtilis i Lactobacillus sp.
2. Pregtirea frotiului din culturile de bacterii (coci i bacili) crescute pe medii
agarizate.
3. Pregtirea frotiului din culturile de bacterii (coci i bacili) crescute pe medii
lichide.
4. Studierea microscopic a frotiului cu bacterii ncurbate.
n album se execut desenele i notiele explicative.
19
Poziia microorganismelor n sistemele de clasificare a lumii vii

n sistemul vechi de clasificare al lui Aristotel, lumea vie era mprit n doua
regnuri: Plantae i Animalia. Odat cu descoperirea altor grupe de organisme, aceast
clasificare a devenit nesatisfctoare. Pe msura ce se acumulau date despre
microorganisme a devenit evident c ele nu pot fi clasificate n nici unul din cele
dou regnuri tradiionale i c exist grupuri ntregi cu caractere intermediare
revendicate n egal msur i de botaniti i de zoologi (de ex., Euglena,
Chlamydomonas, Volvox etc.).
Hogg (1860) i Haeckel (1866) au propus un nou regn Protista, pe care
ulterior Hogg l-a denumit Protoctista, alturi de Plantae i Animalia.
Acest sistem de clasificare a fost ameliorat de R. Stanier, prin diviziunea
regnului Protista n dou subregnuri:
- protiste inferioare, n care include microorganismele cu organizare de tip
procariot (bacterii i cianobacterii);
- protiste superioare, corespunznd microorganismelor eucariote i care
cuprind algele, fungii i protozoarele.
n aceast clasificare, regnul Protista include toate microorganismele eucariote
i procariote, dar i un numr de macroorganisme pluricelulare nedifereniate (alge
marine, bazidiomicete etc.).
Copeland (1938) a propus sistemul celor patru regnuri de clasificare a lumii
vii:
1. Regnul Monera, n care sunt incluse bacteriile i cianobacteriile.
2. Regnul Protoctista, cuprinznd organismele eucariote inferioare, cu
organizare, n esen, unicelular, sinciial sau pluricelular, fr difereniere
celular avansat (alge, fungi, mixomicete i protozoare).
3. Regnul Plantae cuprinde plantele terestre i acvatice.
4. Regnul Animalia.
Whittaker (1969) a propus un nou sistem de clasificare, care mparte lumea vie
n 5 regnuri: Monera, Protoctista, Plantae, Fungi, Animalia.
Bergey a schimbat denumirea regnului Monera, n cel de Procaryota.
Criteriile de grupare ale sistemului se bazeaz pe trei niveluri de organizare:
procariot, eucariot unicelular i pluricelular, precum i pe existena a trei modaliti
principale de nutriie: fotosintetic i secundar absorbtiv caracteristic plantelor,
ingestiv, tipic pentru majoritatea animalelor i absorbtiv, caracteristic fungilor.
n acord cu aceste principii, sistemul de clasificare a celor 5 regnuri are
urmtoarea structur:
1. Regnul Monera include organisme unicelulare, cu organizare de tip
procariot: bacterii, cianobacterii, actinobacterii. Toate sunt unicelulare sau unicelular20
coloniale, cu excepia actinomicetelor, care au o organizare de tip micelial. Modul de

nutriie este absorbtiv, iar metabolismul este de tip foto- sau chimiosintetizant.
2. Regnul Protoctista cuprinde microorganismele eucariote: algele
microscopice, fungii acvatici flagelai i protozoarele. Termenul de Protoctista este
preferat celui de Protista, deoarece, pe lng protozoare sunt incluse i organisme
pluricelulare (alge marine, fungi inferiori), dar datorit absenei diferenierii tisulare
sunt mai apropiate de organismele unicelulare. Metabolismul este foto- sau
chimiosintetizant, iar nutriia este absorbtiv sau ingestiv.
3. Regnul Plantae este mprit n dou grupe: plante nevasculare i plante
vasculare. Ultimele au esuturi conductoare (xilem i floem). Plantele se dezvolt
din embrioni diploizi. Spre deosebire de animale (formate n cea mai mare parte din
celule diploide) i de fungi (care sunt organisme haploide sau dicariontice), la plante
alterneaz n ciclul vital generaiile haploid i diploid. Generaia haploid se
numete gametofit, iar cea diploid se numete sporofit.
4. Regnul Fungi cuprinde organisme eucariote imobile ce formeaz spori. Din
spori, prin germinare se formeaz hifele. O aglomerare de hife formeaz miceliul.
Prezint cicluri reproductive tipice, incluznd procese sexuate i asexuate. Miceliul
mai frecvent haploid la formele inferioare i dicarionic la multe forme superioare.
Sunt heterotrofi. Nutriia este de tip absorbtiv.
5. Regnul Animalia cuprinde organisme pluricelulare, cu nutriie de tip
ingestiv. Celulele sunt diploide i se dezvolt din doi gamei haploizi: ovulul i
spermatozoidul. Dup fecundare rezult zigotul.
Tipuri morfologice de bacterii
Se disting urmtoarele forme fundamentale de bacterii: coci, bacili, cocobacili,
vibrioni, spirili, spirochete i forme filamentoase (fig. 2).
Dup modul de grupare al celulelor n urma diviziunii, cocii se mpart n:
monococi - celulele rezultate din diviziune rmn independente (ex. Micrococcus
ureae); diplococi - cnd diviziunea se face ntr-un singur plan i nu se mai separ
ntre ele, au aspect de doua boabe de cafea (ex. Diplococcus pneumoniae);
streptococi - n urma unor diviziuni repetate n acelai plan celulele nu se separ i
formeaz un lan (ex. Streptococcus lactis); tetracoci - cnd celulele sunt dispuse n
grmezi de 4 celule (ex. Gafkia tetragena); sarcine - celulele se grupeaz sub form
de cuburi (ex. Sarcina lutea); stafilococi - celulele sunt aranjate n grupuri neregulate,
deseori sub form de strugure (ex. Staphylococccus aureus).
Bacteriile cilindrice cu form de bastona se numesc bacili. Lungimea
celulelor depete limea de 1,5 i mai multe ori. Unele bacterii cilindrice pot avea
un aspect filamentos, iar altele sferice (cocobacili). Bacilii sunt drepi, uneori uor
curbai la mijloc sau la un capt. Forma extremitilor este o caracteristic important
21
pentru taxonomie. La unele bastonae extremitile sunt rotunjite (ex. Escherichia

coli), pe cnd la altele extremitile pot fi retezate drept (ex. Bacillus antracis),
umflate (ex. Corinebacterium diphtheriae), ascuite (ex. Fusiobacterium fusiforme).
Ca i bacteriile sferice unii bacili sunt izolai (monobacili), alii sunt dispui sub
form de litere V, X, Y (ex. Corinebacterium diphtheriae). Pot fi grupai cte doi
(diplobacili), n lan (streptobacili), sub form de rozet, stea sau dispui n palisad.
Fig. 2. Formele principale de bacterii: 1 monococi; 2 diplococi; 3 tetracoci; 4

streptococi; 5 sarcine; 6 stafilococi; 7 bastonae asporogene; 8 ,9 bastonae
sporogene; 10 spirile; 11 vibrioni; 12 spirochete.
Bacteriile spiralate se mpart n: vibrioni - bacterii cu form de virgul (ex.

Vibrio cholerae); spirili - bacterii cu form de spiral cu mai multe spire rigide (ex.
Spirillum volutans); spirochete - bacterii cu mai multe spire flexibile (ex. Treponema
pallidum).
Exist i alte forme de bacterii: bacterii pedunculate din familia
Caulobacteriaceae, care au un peduncul cu ajutorul cruia se fixeaz pe alte bacterii
(ex. Bacillus subtilis); bacterii filamentoase neramificate (ex. Thioploca mixta);
bacterii filamentoase cu ramificaii false (ex. Spherotilus natans) .a.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: cultura
Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus niger, Penicillium notatum, cultur bacterian
crescut n cutii Petri, genian violet, soluie Lugol, alcool, fuxin, ulei de imersie,
lame de sticl, lamele, pipete, ans, microscop.
Evidenierea caracterelor morfologice ale drojdiilor
Cu ansa se recolteaz o poriune din cultura de drojdie care se amestec ntr-o
eprubet cu civa ml ap. Din suspensia de celule se depune pe lama microscopic o
pictur cu diametrul de circa 0,7 cm2, n zona central, cu ajutorul unei pipete. Se
22
acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se

examineaz la microscop cu obiectivele de 8x, 20x i 40x, reinndu-se forma celulei,
prezena nucleelor, prezena celulelor nmugurite (fig. 3).
Evidenierea caracterelor morfologice ale culturilor de mucegai
Se efectueaz un preparat umed ntre lam i lamel, n felul urmtor: din
cultura din cutii Petri se recolteaz cu ajutorul ansei, din partea marginal a coloniei
i fr a deranja structura iniial a miceliului, o mic poriune, care se desprinde uor
ntr-o pictur de ap steril de pe lama microscopic. Se aeaz lamela evitnd
formarea n preparat a bulelor de gaz i se face studiul cu obiectivele 8x, 20x i 40x.
La cele dou tulpini de ciuperci de mucegai se observ forma hifelor, prezena
septurilor hifale, prezena conidioforilor cu organele de fructificaie specifice
genurilor Aspergillus i Penicillium (fig. 4).
Fig. 3. Saccharomyces cerevisiae: 1 pseudomiceliu; 2 celul separat; 3,4 - nmugurirea

celulei
Fig. 4. Morfologia talului i stadiul conidial la ciupercile de mucegai: A aspect

microscopic la Aspergillus; B aspect microscopic la Penicillium: 1 miceliu; 2
conidiofor; 3 sterigme; 4 conidii.
23
Metodica de pregtire a frotiului i metoda simpl de colorare

Pregtirea frotiului. Lama portobiect preventiv se degreseaz i se sterilizeaz
la flacra spirtierei. n cazul dac frotiul se pregtete din culturi microbiene, crescute
pe medii solide, atunci cu ajutorul ansei bacteriologice sterile pe lama rcit se
depune o pictur de ap. Ulterior eprubeta cu cultura cercetat se ia cu degetul mare
i arttor al minii stngi. Ansa se sterilizeaz la flacra spirtierei fig. 5). Dopul se
fixeaz cu degetul mic al minii drepte, se scoate din eprubet i se las n aceast
poziie. Marginea eprubetei se sterilizeaz la flacra spirtierei, dup ce n eprubet
prin flacr se introduce ansa. Rcind ansa de peretele intern al eprubetei, se atinge
mediul nutritiv la limita lui cu eprubeta (dac ansa este rcit insuficient, atunci ea
topete mediul). Cu ansa rcit se atinge cultura microbian pe suprafaa mediului.
Ansa se extrage, se sterilizeaz rapid marginea eprubetei i se astup cu dopul, trecut
prin flacr. Apoi eprubeta se pune n stativ, iar ansa cu cultura cercetat se introduce
n pictura de ap situat pe lam. Materialul se repartizeaz uniform, efectund
micri circulare pe o suprafa de 1-2 cm2, dup aceea ansa se sterilizeaz.
n cazul pregtirii frotiului din cultura crescut pe mediu lichid, la mijlocul
lamei se depune o pictur din cultura studiat, folosind n acest scop pipeta Pasteur
(ulterior pipeta se introduce n soluia dezinfectant). Pictura se repartizeaz uniform
pe lam cu ansa bacteriologic. Pe partea stng a lamei cu frotiu se semneaz
numrul analizei sau numrul culturii cercetate. Frotiul bine pregtit cu celule
microbiene uniform repartizate are o form circular sau oval i se usuc repede.
Fig. 5. Etapele pregtirii frotiului

24
Uscarea frotiului. Frotiurile subiri se usuc repede la temperatura camerei,

cele mai groase se usuc nclzindu-se puin la flacra spirtierei. n acest caz lama cu
frotiul orientat n sus se ine de margini cu degetul mare i cel arttor, iar degetul
mic se ine sub lam pentru a regla gradul de nclzire a frotiului i a nu admite
coagularea proteinei microbiene i deformarea celulelor microbiene.
Fixarea frotiului. Fixarea frotiului asigur alipirea celulelor microbiene de
sticl, astfel prentmpinnd dezlipirea frotiului de splare; face preparatul
microbiologic mai sensibil la colorare, deoarece celulele moarte se coloreaz cu
coloranii anilinici mai bine dect cele vii; asigur ulterior securitatea lucrului cu
frotiul, ndeosebi n cazul cnd se studiaz microorganisme patogene.
Cea mai rspndit metod de fixare este fixarea frotiului la flacra spirtierei.
Lama portobiect cu frotiul orientat n sus se ia de margini cu penseta sau cu degetul
mare i cel arttor al minii drepte i se trece de trei ori prin partea cea mai fierbinte
a flcrii, descriind un cerc cu diametrul de circa 15 cm. Fixarea prin aceast metod
dureaz 5-6 secunde, iar aciunea flcrii 2 secunde. Frotiurile pregtite din snge,
preparatele-amprent i n unele cazuri frotiurile pregtite din unele culturi
microbiene, care se deformeaz la temperaturi nalte, se trateaz cu substane
speciale. La ele se refer: 1) alcoolul metilic (fixeaz timp de 5 minute); 2) alcoolul
etilic (fixeaz timp de 10-15 minute); 3) amestecul Nikiforov volume egale de
etanol i eter (fixeaz timp de 10-15 minute); 4) acetona (fixeaz timp de 5 minute);
5) vaporii acidului osmic i formolul (fixeaz timp de cteva secunde) .a.
Tehnica metodei simple de colorare
n cazul coloraiei simple se folosete un singur colorant. De exemplu, fuxina
Pfeiffer coloreaz microorganismele timp de 1-2 minute, albastru de metilen (soluia
ap-alcool sau Loeffler) coloreaz 3-5 minute. Preparatul fixat se aeaz cu frotiul
orientat n sus pe suport. Pe frotiu cu ajutorul pipetei se depune o pictur de colorant
astfel ca tot frotiul s fie acoperit. Dup expirarea termenului corespunztor
colorantul se nltur, frotiul sa spal cu ap i se usuc, folosind hrtia da filtru. Pe
frotiul uscat se depune o pictur de ulei de imersie, apoi el este supus examenului
microscopic.
Metodica de pregtire a preparatului amprent
Preparatul amprent este folosit pentru studierea repartizrii naturale a
celulelor n coloniile microbiene i mal des pentru studierea formei sporilor i a
sporangilor la actinomicete i ciuperci. Pregtirea preparatului amprent se
efectueaz n felul urmtor. Din mediul solid, pe care microorganismele studiate cresc
n form de colonii izolate sau n gazon compact, se taie cu bisturiul un cub mic de
geloz i se trece pe lama portobiect astfel, ca suprafaa cu microorganisme s fie
orientat n sus. Ulterior, de asupra gazonului sau a coloniilor izolate se aeaz o
lamel steril, se apas puin cu penseta sau cu ansa i imediat se nltur. Preparatulamprent obinut pe lamel se introduce ntr-o pictur de ap sau ntr-o pictur de
albastru de metilen, soluie, ap-alcool, pe lama portobiect. Amprenta poate fi
obinut i nemijlocit pe lam, atingnd cu ea suprafaa coloniilor sau a gazonului.
25

Tema: Structura celulei bacteriene. Metodele de studiere. Coloraia Gram
i Ziehl-Neelsen.
1. Metode moderne de studiere a structurii celulei microbiene.
2. Structura celulei bacteriene. Elementele permanente (obligatorii) i
nepermanente (neobligatorii) de structur.
3. Peretele celular bacterian, funciile. Particularitile de structur ale peretelui
celular al bacteriilor grampozitive i gramnegative. Coloraia Gram. Exemple de
bacterii grampozitive i gramnegative.
4. Tehnica coloraiei Gram i mecanismul de colorare.
5. Particularitile de structura i compoziia chimic a peretelui celular al
bacteriilor acidorezistente. Coloraia Ziehl-Neelsen. Exemple de bacterii
acidorezistente.
6. Tehnica coloraiei Ziehl-Neelsen i mecanismul de colorare.
7. Protoplatii, sferoplatii i formele-L la bacterii.
8. Membrana citoplasmatic. Structura, compoziia chimic i funciile
biologice. Metodele de evideniere.
9. Citoplasma. Compoziia chimic. Metodele de evideniere.
10. Aparatul nuclear al bacteriilor. Compoziia chimic i funciile biologice.
Metodele de evideniere. Plasmidele bacteriene, tipurile i funciile lor.
1. Etapele i tehnica de pregtire a frotiurilor din culturile bacteriene crescute
pe medii solide i lichide.
2. Studierea microscopic a frotiului colorat dup metoda Gram. Evidenierea
bacteriilor grampozitive i gramnegative.
3. Pregtirea frotiului din cultura de bacterii acidorezistente. Coloraia ZiehlNeelsen. Componentele, tehnica i mecanismul de colorare.
Structura celulei bacteriene
n cercetarea structurii celulei bacteriene paralel cu microscopia optic se
aplic microscopia electronic i cercetrile microchimice, care permit determinarea
ultrastructurii celulei bacteriene.
Bacteriile au celula de tip procariot, mai simplificat dect celula eucariot.
Principalele diferene constau n faptul c celula are un singur cromozom amplasat
ntr-un nucleoid lipsit de membran nuclear i nu conine un ir de organite, care se
afl n celulele eucariotelor (mitocondriile, plastidele, complexul Golgi, lizozomii,
26
microcorpii, centrul celular). La bacteriile fotoautotrofe aparatul fotosintetic este

reprezentat prin structuri membranare de diferit form: tilacoizi, tubuoare, vezicule.
n aceste membrane sunt localizai pigmenii fotosintetici (bacterioclorofilii a, b, c, d
i carotinoizi), care din punct de vedere chimic se deosebesc de pigmenii algelor i
cei ai plantelor superioare. La cianobacterii n afar de ficocianin (pigmentul
predominant) se mai afl ficoeritrina de culoare roie, clorofila a, iar clorofila b
lipsete. Celula la bacterii este alctuit din componente obligatorii i componente
facultative.
Componentele obligatorii sunt prezente la toate speciile bacteriene i sunt
reprezentate de perete celular, membrana citoplasmatic, citoplasm, nucleoid,
ribozomi i mezozomi.
Componentele facultative se gsesc doar la unele specii bacteriene i sunt
reprezentate de cili sau flageli, fimbrii i capsul (fig. 6).
Peretele celular reprezint unul din elementele structurale principale ale
celulei. El asigur forma i delimiteaz celula de mediul exterior. O proprietate
important a peretelui celular este permeabilitatea lui selectiv, care asigur
ptrunderea n celul a substanelor nutritive necesare (aminoacizi, glucide .a.) i
evacuarea din celul a produselor metabolice. Peretele celular pstreaz n interiorul
celulei presiunea osmotic constant.
Fig. 6. Prezentarea schematic a structurii celulei bacteriene: 1 peretele celular; 2

membrana citoplasmatic; 3 cavitatea nucleotidului; 4 fixarea flagelilor; 5 flageli; 6
nucleotidul; 7 citoplasma; 8 ribozomii; 9 - granule de acid poli--oxibutiric; 10
picturi de grsime; 11 incluziuni de sulf; 12 gruncioare de polizaharide; 13
gruncioare de polifosfai; 14 lamele; 15 invaginri ale membranei citoplasmatice; 16
vacuole gazoase; 17 mezozoma; 18 tilacoizi tubulari; 19 tilacoizi plai; 20
cromatofori; 21 capsul mucozitar.
27
La toate speciile bacteriene, n structura peretelui intr un component

macromolecular, denumit mureina. Din punct de vedere chimic, mureina este un
polimer glicopeptidic. Peretele bacterian mai conine: acizi teichoici, complexe
lipopolizaharidice, diferite ceride, fosfolipide, glucide i polialcooli.
n anul 1884 Christian Gram a constatat c bacteriile reacioneaz diferit atunci
cnd se aplic aceeai tehnic de colorare i pune baza metodei difereniale de
colorare ce i poart numele, prin care bacteriile sunt mprite n dou mari grupe:
bacterii grampozitive i bacterii gramnegative.
Peretele bacteriilor grampozitive este mai gros, cu structura dens i compact.
La unele specii, mureina ajunge pn la 80-90% din greutatea uscata a componentelor
parietale. Mai conine proteine, lipide aezate spre suprafaa peretelui i legate
covalent de murein.
Peretele bacteriilor gramnegative este mai subire i mai puin rigid. Are doar
5-20% murein din totalul componentelor parietale. Conine mari cantiti de
lipopolizaharide, lipoproteine i fosfolipide, avnd o structura mai complexa.
Bacteriile, la care completamente lipsete peretele celular, poart denumirea de
protoplati. Protoplatii pstreaz capacitile de respiraie, reproducere, sinteza
fermenilor, acioneaz la factorii mediului exterior (leziuni mecanice, presiunea
osmotic, aerarea .a.). Pstrarea protoplatilor este posibil doar n soluii
hipertonice.
Bacteriile cu peretele celular parial lezat poart denumirea de sferoplati. La
inhibarea procesului de sintez a peretelui celular cu ajutorul penicilinei se formeaz
aa numitele forme-L (descoperite la institutul Lister). Pot fi reversibile sau
ireversibile.
Membrana citoplasmatic se alipete compact de partea interna a peretelui
celular. Ea este foarte fin (8-10 nm) i const din proteine i fosfolipide. Ea
reprezint un strat semitransparent extern, prin intermediul cruia are loc nutriia
celulei. n componena membranei citoplasmatice se afl fermenii, numii permeaze,
care efectueaz transportul activ de substane, precum i fermenii ce particip n
procesele de respiraie. Membrana citoplasmatic genereaz mezozomi, care
particip la procesele de diviziune celular. La transferarea celulei n soluie
hipertonica membrana citoplasmatic se poate despri de peretele celular.
Citoplasma este coninutul intern al celulei bacteriene. Ea reprezint un sistem
coloidal alctuit din ap, proteine, glucide, lipide, diverse sruri minerale.
Componena chimic i consistena citoplasmei se schimb n dependen de vrsta
celulei i condiiile mediului exterior. n citoplasm se situeaz substana nuclear,
ribozomii i diverse incluziuni.
28
Nucleoidul sau substana nuclear a celulei reprezint aparatul ereditar al ei.

Substana nuclear la organismele procariote, spre deosebire de cele eucariote, nu are
membran nuclear. Nucleoidul unei celule mature reprezint un fir dublu de ADN,
rsucit n inel. n molecula de ADN este codificat informaia genetic a celulei.
Plasmidele reprezint uniti genetice extracromozomiale, care nu sunt legate
structural de cromozom. O plasmid reprezint circa 1 % din mrimea cromozomului
bacterian, este o molecul de ADN dublu-catenar, elicoidal, circular. n plasmide
este concentrat informaia genetic accesorie, reprezentat de gene care pot conferi
celulei bacteriene proprieti noi: capacitatea sporit de adaptare, rezistena la
anumite antibiotice etc.
Ribozomii sunt dispui n citoplasma celulei i execut funcia de sintez a
proteinei. Ribozomii sunt alctuii din 60% ARN i 40% de proteine. Celulele tinere
de bacterii au n citoplasm 1500 pn la 100000 de ribozomi. Ribozomii prezeni n
celulele procariote au constanta de sedimentare 70S i sunt alctuii din dou
subuniti.
Incluziunile se gsesc n citoplasm i reprezint granule, care conin diferite
substane nutritive de rezerv: glicogen, lipide, volutin, amidon, poli-hidroxibutirat, cianoficin etc. Incluziunile sunt situate n citoplasm.
Vacuolele sunt structuri intracitoplasmatice sferice, conin ap i substane
dizolvate, avnd rol n reglarea presiunii osmotice i n etapa premergtoare a
formrii incluziunilor, de depozit a substanelor de rezerv. Bacteriile acvatice au
vacuole cu gaze numite aerozomi cu rol n flotaie.
Pe parcursul activitii vitale celulele bacteriene genereaz structuri cu funcie
de protecie capsule i spori.
Capsula reprezint stratul mucozitar compact alipit de peretele celular. Ea
servete n calitate de organ protector, care apare la unele specii de bacterii, odat cu
ptrunderea lor n organismul uman i animal. Capsula protejeaz microorganismele
de factorii protectori ai organismelor superioare (ex. agenii pneumoniei i
antraxului). Unele microorganisme snt nzestrate cu capsule permanente (ex.
Klebsiella).
Sporii se ntlnesc doar la bacteriile baciliforme. Ei se formeaz la nimerirea
microorganismelor n condiii nefavorabile (temperaturi nalte, uscciune, schimbarea
pH, reducerea cantitii de substane nutritive n mediu .a.). Sporii se afl n
interiorul celulei bacteriene i reprezint un sector compact de citoplasm mpreun
cu nucleoidul nvelit n anvelopa compact a sporului. Dup compoziia chimic ei se
deosebesc de celulele vegetative prin coninut redus de ap, cantitatea mrit de
lipide i sruri de calciu, ce le condiioneaz o rezistena sporit. Sporogeneza are loc
pe parcursul a 18-20 de ore. La nimerirea sporilor n condiii optime, ei germineaz n
29
decurs de 4-5 ore, transformndu-se n celule vegetative. ntr-o celul bacterian se

formeaz doar un singur spor. Astfel, sporii nu reprezint organe de nmulire a
bacteriilor, ci servesc n calitate de mod de supravieuire n condiiile nefavorabile ale
mediului.
Flagelii reprezint organe de micare i sunt caracteristici bacteriilor
baciliforme. Ei reprezint fibrile filamentoase fine, care constau din proteina numit
flagelina. Prezena flagelilor poate fi demonstrat indirect dup micarea celulelor n
cmpul de vedere al microscopului n mediul semilichid de cultur sau n mod direct
la aplicarea metodelor speciale de colorare. n funcie de numrul flagelilor bacteriile
sunt clasificate astfel: monotrihe (un singur flagel), amfitrihe (cu doi flageli
poziionai diametral opus), lofotrihe (cu un mnunchi de flageli la un capt al
celulei), peritrihe (cu numeroi flageli distribuii pe toat suprafaa celulei).
Viteza deplasrii bacteriilor depinde de numrul i dispoziia flagelilor (cei mai
activi sunt monotrihii), de vrsta bacteriilor i de condiiile mediului exterior.
Fimbriile (pilii) sunt structuri filamentoase drepte i rigide, numeroase de
ordinul sutelor (100-400) prezente pe suprafaa unor bacterii imobile sau mobile,
gramnegative, recent izolate din natur, se consider c au rol n mrirea suprafeei de
absorbie a substanelor nutritive sau determin ataarea intercelular sau de substrat.
Bacteriile patogene care dispun de fimbrii manifest o virulen mai mare fa de cele
fr fimbrii, datorit atarii mai eficiente de celulele gazdei. Au rol de canal de
conjugare prin care se face transferul de material generic de la celula masculin (F+)
la celula feminin (F-).
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: cultur
bacterian crescut n cutii Petri, genian violet, soluie Lugol, alcool, albastru de
metilen, fuxina Pfeiffer, fuxina Ziehl, acid sulfuric, ulei de imersie, lame de sticl,
lamele, pipete, ans, microscop.
Colorata Gram
Colorarea microorganismelor dup metoda Gram, propus n anul 1884, nu i-a
pierdut importana practic pn n prezent. Toate microorganismele, n dependen
de comportarea lor fa de aceast coloraie, se mpart n microorganisme
grampozitive i gramnegative.
Tehnica colorrii
1. Pe frotiul fixat se aplic soluia apoas de metilviolet cu expoziia de 1-2
minute (conform modificaiei propuse de Siniov, frotiul se acoper cu o fie de
hrtie de filtru mbibat preventiv cu genianviolet i uscat; pe hrtia indicat se
depun 2-3 picturi de ap). Ulterior, dup expirarea timpului indicat, colorantul se
nltur.
30
2. Frotiul se trateaz cu soluia Lugol 1 min. Nesplnd frotiul, soluia se

nltur.
3. Frotiul se trateaz cu etanol 0,5-1 min., pn la dispariia striurilor violetecenuii ale colorantului. Preparatul se spal bine cu ap.
4. Pe frotiu se aplic fuxina Pfeiffer 1-2 min., apoi colorantul se nltur.
Frotiul se spal cu ap, se usuc cu hrtia de filtru i se supune examenului
microscopic, folosind obiectivul de imersie. Microorganismele grampozitive se
coloreaz ntr-o culoare violet, iar cele gramnegative n roz-rou.
Pentru controlul soluiilor coloranilor anilinici recent pregtite sau n cazul
colorrii microbilor necunoscui este necesar ca pe aceeai lam, alturi de frotiul
studiat, de pregtit un frotiu de control din culturi mixte de microbi gramnegativi i
grampozitivi.
Coloraia Ziehl-Neelsen
Colorarea microorganismelor dup metoda Ziehl-Neelsen sa practic pentru a
diferenia microbii acidoiezisteni de alte culturi microbiene. Microorganismele
acidorezistente se coloreaz slab cu soluiile diluate ale coloranilor anilinici. n
scopul mririi permeabilitii acestor culturi se folosete fuxina Ziehl paralel cu
nclzirea frotiului la flacra spirtierei. Acidorezistena microbian sa explic prin
prezena n celulele microbiene a unor cantiti relativ mari de lipide, cear i a
oxiacizilor.
Tehnica colorrii
1. Frotiul fixat se acoper cu o fie de hrtie de filtru i se aplic fuxina Ziehl
(poate fi folosit hrtia de filtru preventiv mbibat cu fuxin fenolic i uscat).
Frotiul se nclzete la flacra spirtierei pn la apariia vaporilor, apoi se las pentru
rcire i se adaug o poriune suplimentar de colorant. Acest procedeu se repet de
2-3 ori. Dup rcire se nltur hrtia de filtru i preparatul se spal cu ap.
2. Frotiul se decoloreaz, tratndu-l 20-30 de secunde cu soluie de 5% de acid
sulfuric, apoi se spal bine cu ap.
3. Frotiul se coloreaz 3-5 min. cu albastru de metilen, soluie ap-alcool, se
spal i se usuc.
La examinarea microscopic microbii acidorezisteni se determin dup
culoarea lor roie intens, n timp ce microflora acidonerezistent se coloreaz n
albastru deschis.
31

Tema: Structura celulei bacteriene. Metodele de studiere. Metode compuse
de colorare a microorganismelor. Coloraia Ojeco, Omeleanski, Burry-Hinss,
Pecov, Loeffler i Neisser.
1. Structura celulei bacteriene. Elementele permanente (obligatorii) i
nepermanente (neobligatorii) de structur.
2. Incluziunile citoplasmatice. Metodele de evideniere.
3. Sporul bacterian. Compoziia chimic i funciile biologice. Etapele
sporogenezei. Amplasarea sporului n celul. Metodele de evideniere a sporilor.
Coloraia Ojeco.
4. Capsula bacteriilor. Compoziia chimic i funciile biologice. Metodele
pozitive i negative de colorare a capsulei. Coloraia Burry-Hinss. Exemple de
bacterii capsulate.
5. Flagelii. Structura i compoziia chimic. Clasificarea bacteriilor dup
amplasarea i numrul flagelilor. Metodele directe de studiere i evideniere a
flagelilor. Coloraia Loeffler. Pilii bacterieni, tipurile.
6. Metodele indirecte de evideniere a flagelilor bacterieni. Metodele de
examinare. Principiul microscopiei cu fond negru i contrast de faz.
7. Granulaiile de volutin. Compoziia chimic i funciile biologice. Metodele
de evideniere. Coloraia Loeffler i Neisser. Mecanismul i tehnica de colorare.
Exemple de bacterii cu granulaii de volutin.
8. Morfologia i ultrastructura spirochetelor. Metodele de studiere.
Clasificarea. Speciile patogene.
9. Morfologia i ultrastructura micoplasmelor i chlamidiilor. Metodele de
studiere. Speciile patogene.
10. Morfologia i particularitile de structur a ciupercilor microscopice i
actinomicetelor. Metode de studiere. Preparate native i colorate.
1. Pregtirea i examinarea microscopic a frotiului pentru evidenierea
granulaiilor de volutin la bacterii. Colorarea frotiului cu metilviolet acetic, prin
metoda Loeffler i Neisser i metoda Omeleanski.
capsulei la bacterii. Metoda Burri i Hinss.
sporilor la bacterii. Metoda Ojeco i Pecov.
flagelilor la bacterii. Metoda Loeffler.
32
5. Studierea microorganismelor n stare vie metoda picturii strivite i

metoda picturii suspendate.
bacterian crescut n cutii Petri, metilviolet acetic, soluia Lugol, vezuvin, albastru
de metilen, fuxina Pfeiffer, fuxina Ziehl, acid sulfuric, acid clorhidric, tu, etanol,
soluie de 0,5% de rou neutral, mordant, pipete Pasteur, vazelin, lame de sticl,
lamele, lam cu adncitur n centru, pipete, ans, microscop.
Evidenierea granulaiilor de volutin
1. Colorarea cu metilviolet acetic
Frotiul fixat se trateaz 5-10 min. cu metilviolet acetic. Frotiul se spal cu ap
i se usuc.
La examinarea microscopic citoplasm bacteriilor se coloreaz n liliachiudeschis, iar granulaiile de volutin n violet-nchis.
2. Metoda Neisser
1. Frotiul fixat se coloreaz cu metilviolet acetic 1 min. Colorantul se nltur
i frotiul se spal cu ap.
2. Se aplic soluia Lugol 20-30 sec., care apoi se nltur.
3. Frotiul se trateaz cu vezuvin 10-15 min. Colorantul se nltur, iar frotiul
se spal cu ap i se usuc.
La examinarea microscopic celulele microbiene colorate dup metoda Neisser
au o culoare galben, iar granulaiile de volutin albastr-nchis (neagr).
3. Metoda Omelianski
Evidenierea granulaiilor de volutin dup metoda Omelianski este bazat pe
solubilitatea slab a volutinei n soluii de acizi.
1. Frotiul fixat se trateaz 0,5-1 min. cu fuxina Ziehl. Colorantul se nltur, iar
frotiul se spal cu ap.
2. Frotiul se trateaz 20-30 sec. cu o soluie de 1% de acid sulfuric. Acidul se
nltur, iar frotiul se spal bine cu ap.
3. Frotiul se coloreaz suplimentar 20-30 sec. cu albastru de metilen, soluie
ap-alcool. Colorantul se nltur. Frotiul se spal cu ap i se usuc.
La examinarea microscopic granulaiile de volutin au o culoare roie i se
evideniaz bine pe fonul albastru al citoplasmei.
Evidenierea capsulei
1. Metoda Burri
33
ntr-o pictur de tu, diluat de 10 ori cu ap distilat, pe lama portobiect se

suspendeaz cu ansa cultura cercetat. Ulterior, folosind ansa sau marginea unei
lame, amestecul cptat se repartizeaz uniform pe lam. Frotiul se usuc la
temperatura camerei. Soluia de tu poate fi nlocuit cu nigrozin sau cu congo-rou.
La examinarea microscopic pe fonul negru se evideniaz capsule incolore.
2. Metoda Hins
Frotiul pregtit dup metoda Burri se fixeaz (se picur 2-3 picturi de etanol
pe frotiu i se arde). Ulterior pe frotiul rcit se aplic pentru 3-5 minute fuxina
Pfeiffer. Colorantul se nltur, frotiul se spal cu ap i se usuc.
La examinarea microscopic pe fonul negru se evideniaz capsulele incolore
i citoplasmele roii ale bacteriilor (fig. 7). Este necesar de menionat, c n cazul
unei fixri sau uscri greite, uneori n jurul bacteriilor lipsite de capsule, se disting
nite zone mici incolore, care amintesc capsulele (capsule false).
Evidenierea sporilor
1. Metoda Ojeco
1. Din cultura studiat se pregtete un frotiu dens pe marginea lamei i se
usuc la temperatura camerei.
2. Frotiul nefixat se trateaz cu o soluie de 0,5% de acid clorhidric i se
nclzete la flacra spirtierei pn la apariia vaporilor. Ulterior preparatul se spal
cu ap, se usuc i se fixeaz n flacra spirtierei.
3. Frotiul pregtit dup metoda indicat mai sus se coloreaz dup metoda
Ziehl-Neelsen.
La examinarea microscopic sporii sunt de o culoare roz-roie, iar celulele
microbiene albastre (fig. 8).
Fig. 7. Celule de bacterii cu

capsule
Fig. 8. Formarea sporilor la

Bacillus mesentericus
34
2. Metoda Pecov
1. Frotiul fixat se trateaz cu albastru de metilen bazic (dup Loeffler) i se nclzete
la flacra spirtierei pn la fierbere (15-20 sec.), fr a admite uscarea colorantului.
2. Preparatul se rcete, se spal cu ap i se coloreaz suplimentar 50 de sec. cu o
soluie de 0,5% de rou neutral. Colorantul se nltur, frotiul se spal i se usuc.
La examinarea microscopic sporii au o culoare albastr deschis, iar bacilii roz.
Evidenierea flagelilor
Metoda Loeffler n modificaia lui Pecov
Pentru pregtirea frotiului i colorarea microorganismelor mobile este necesar
respectarea urmtoarelor cerine:
1. Suspensia de microorganisme se pregtete preventiv: cu ajutorul ansei
bacteriologice se ia cultura cercetat, situat n apropierea apei de condensare
(cultivat 15-18 ore pe mediu solid), i se introduce atent ntr-o eprubet cu ap de
robinet steril, preventiv nclzit pn la temperatura la care a fost crescut cultura.
2. Cu pipeta Pasteur se picur cteva picturi de suspensie pe lama portobiect
bine degresat, clit la flacra spirtierei i rcit, i se usuc la temperatura camerei.
3. Preparatul se trateaz 15 minute cu un mordant i se nclzete pn la
apariia vaporilor. Dup rcire mordantul se nltur, iar frotiul se spal cu ap.
4. Frotiul se coloreaz cu fuxin Ziehl 5 minute. Colorantul se nltura, frotiul
se spal bine cu ap de robinet i se usuc la temperatura camerei.
Studierea microorganismelor n stare vie
1. Metoda picturii strivite (ntre lam i lamel)
Pe lama portobiect se depune o pictur din materialul cercetat. Pictura se
acoper cu o lamel steril astfel, ca s nu apar bule de aer. Lichidul trebuie s
ocupe tot spaiul dintre lam i lamel i s nu ias dup marginile ultimei. Neajunsul
acestei metode const n faptul c pictura cercetat se usuc repede.
2. Metoda picturii suspendate
Pentru pregtirea acestui preparat se folosesc lame speciale cu o adncitur n
centru. O pictur mic din materialul cercetat se depune cu pipeta Pasteur n
mijlocul unei lamele sterile. Lama portobiect, cu marginile adnciturii preventiv unse
cu vazelin, se depune pe lamel astfel ca pictura s se afle n centrul adnciturii.
Apoi lama ncet se ntoarce cu lamela orientat n sus i pictura cercetat rmne
suspendat ntr-un spaiu nchis ermetic, fiind astfel protejat de uscare (fig. 9).
Fig. 9. Preparatul pictur suspendat
35

Tema:
Aciunea
factorilor
mediului
nconjurtor
asupra
microorganismelor. Metode i tehnici de sterilizare.
1. Aciunea factorilor fizici asupra microorganismelor (temperatura,
uscciunea, radiaia, ultrasunetul, presiunea nalt .a.).
2. Aciunea factorilor chimici asupra microorganismelor (substanele
dezinfectante i antiseptice).
3. Aciunea factorilor biologici asupra microorganismelor (antibioticele,
bacteriofagii).
4. Sterilizarea. Metode de sterilizare.
5. Metode fizice de sterilizare.
a) sterilizarea prin flambare.
b) construcia i regimul de lucru al cuptorului Pasteur. Tehnica de sterilizare
cu aer fierbinte.
c) sterilizarea prin fierbere.
d) sterilizarea cu vapori saturai sub presiune (autoclavizarea). Tehnica
autoclavrii.
e) sterilizarea cu vapori fluizi (fracionar) n aparatul Koch. Tehnica de
sterilizare.
f) tyndalizarea i pasteurizarea.
g) sterilizarea mecanic. Tipurile de filtre bacteriene i tehnica utilizrii lor.
h) sterilizarea cu raze ultraviolete i cu ultrasunete.
6. Metode chimice de sterilizare.
7. Metode biologice de sterilizare.
8. Metodele de control a sterilizrii.
1. Studierea utilajului necesar pentru sterilizare.
2. Pregtirea pentru sterilizare a veselei de laborator (cutii Petri, pipete gradate,
pipete Pasteur, eprubete, colbe i flacoane).
3. Demonstrarea metodei de sterilizare prin filtrare.
4. Studierea construciei i modul de sterilizare a cuptorului Pasteur.
5. Studierea construciei i modul de sterilizare a aparatului Koch i autoclavei.
36
Metode de sterilizare utilizate n microbiologie

Sterilizarea reprezint eliberarea complet a obiectelor mediului exterior de
microorganisme. Sterilizarea se efectueaz prin mai multe metode: fizice (aciunea
temperaturii nalte, razelor ultraviolete, aplicarea filtrelor bacteriene); chimice
(folosirea diferiilor dezinfectani, antiseptice); biologice (aplicarea antibioticelor).
n practica de laborator, mai frecvent, se folosesc metodele fizice de sterilizare.
Posibilitatea i raionalitatea folosirii unei sau altei metode de sterilizare e
determinat de particularitile materialului supus sterilizrii, de proprietile lui
fizice i chimice.
Sterilizarea prin cldur
Autoclavarea este sterilizarea cu vapori de ap sub presiune (fig. 10). n aceste
condiii toate bacteriile (inclusiv formele sporulate) sunt omorte dup 20 minute la
121C. Este cea mai eficient metoda de sterilizare. Autoclavul permite:
- pregtirea materialului (medii de cultur, diferite obiecte) n vederea utilizrii
lui n laborator, prin distrugerea microorganismelor;
- decontaminarea materialelor dup folosirea n laborator (cel puin 30 minute
la 121C). La 2 atmosfere temperatura n autoclav constituie 134C.
Temperatura i expoziia autoclavrii mediilor de cultur sunt determinate de
compoziia lor, indicat n reetele de pregtire a mediilor de cultur. Astfel, mediile
simple (geloza peptonat, bulionul peptonat) se sterilizeaz 20 minute la 121C (1
atm). La aceast temperatur ns nu se admite sterilizarea mediilor, care conin
proteine native, glucide i alte substane, care i schimb uor structura la nclzire.
Mediile cu glucide se sterilizeaz fracionar la temperatura de 100C sau n autoclav
la 110C (0,5 atm) timp de 15-20 min. Diferite soluii, aparataj cu tuburi din gum,
dopuri, filtre i luminri bacteriene se sterilizeaz 20 de min. la 121C (1 atm).
Tabelul 1. Regimul de lucru al autoclavei
Materialul sterilizat
Temperatura Presiunea
Timp
o
( C)
(atm)
(minute)
Sticlrie curat
121
1
20
Ap, ser fiziologic
121
1
20
Parafin
121
1
20
Sruri minerale
121
1
20
Medii curente (bulion
121
1
15-20
nutritiv, geloz nutritiv)
Lapte degresat
115
0,7
15
Medii coninnd substane
110
0,5
20
termolabile (ex. glucide)
Glucoz n soluie
110
0,5
20
37
Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul

unor indicatori de sterilizare cum sunt hrtiile indicatoare: sunt comercializate benzi
de hrtie special imprimate pentru a vira culoarea dac au fost ndeplinite condiiile
de sterilizare.
Pasteurizarea reprezint o sterilizare incomplet, deoarece sunt distruse numai
formele vegetative, dar nu i sporii. Este folosit la stilizarea laptelui i a berii. Se
face prin nclzirea produsului la 56-90C timp de 30 minute. nclzirea se face pe
baie de ap. Produsele astfel sterilizate se pstreaz ambalate ermetic la 4C pn la
momentul folosirii pentru a preveni germinarea sporilor.
Tindalizarea este o pasteurizare repetat de 3 ori la intervale de 24 de ore la o
temperatur de 60-90oC. Se face la sterilizarea mediilor de cultur care conin diferite
substane organice: glucide, gelatin, ser sanguin care se degradeaz la temperaturi
mai mari. n intervalul dintre sterilizri materialul se plaseaz n termostat la 31-37C
pentru ca sporii rmai nedistrui s germineze n forme vegetative care vor fi
distruse la viitoarea nclzire. Tindalizarea este o sterilizare complet i se efectueaz
n coagulatorul Koch.
Fierberea const n sterilizarea instrumentelor de laborator, seringilor la 100C
timp de 20-30 minute. Fierberea nu este o metod complet, deoarece sporii nu sunt
distrui. Se face n fierbtoare electrice sau cu gaze i se recomand s se foloseasc
ap distilat pentru a evita depunerea srurilor. Se recomand adugarea a 4-5%
carbonat de sodiu sau borax care ridic cu cteva grade punctul de fierbere i
mpiedec ruginirea.
Clirea la flacr este folosit pentru ansele bacteriologice care sunt
meninute n flacra arztorului pn la rou. Ansa se sterilizeaz obligatoriu nainte
i dup utilizare.
Flambarea const n trecerea prin flacra arztorului de cteva ori a obiectului
care se sterilizeaz lame de sticl, pipete gradate, pipete Pasteur, gura eprubetelor i
baloanelor nainte i dup utilizare.
Sterilizarea cu aer cald este cea mai eficient msur de sterilizare cu cldur
uscat. Se execut n etuve la 180C timp de o or (fig. 11). Este o metod de
sterilizare complet: se sterilizeaz vesela i instrumentarul de laborator.
Sterilizarea prin filtrare
Filtrarea const n trecerea unui produs lichid printr-un material poros sau o
membran care reine bacteriile (fig. 12). Se pot utiliza filtre de porelan
(Chamberland), de sticl poroas sau membrane tip Millipore, filtre Berkefeld din
pmnt, filtre Seitz din plac de azbest i celuloz etc., care au pori de diferite
dimensiuni.
38
Fig. 10. Autoclav orizontal automat, model SA-300H
Fig. 11. Cuptor-etuv pentru sterilizare
Fig. 12. Dispozitive pentru sterilizarea prin filtrare
39
Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor

Radiaiile ultraviolete sunt bactericide, dar nu distrug sporii bacterieni. Acest
tip de radiaii acioneaz n mod direct i au putere de penetraie sczut (civa
milimetri). Lmpile al cror efect se bazeaz pe aciunea radiaiilor UV cu lungimea
de und de 254 nm sunt utilizate: pentru sterilizarea ncperilor, boxelor, hotelor,
slilor de operaii, meselor de laborator, etc.
Radiaiile gamma fac parte din categoria radiaiilor ionizante i au un efect
puternic microbicid. Sunt dificil de produs i de utilizat i foarte periculoase datorit
efectelor pe care le au asupra organismelor vii. Acest tip de radiaii poate fi utilizat n
sterilizarea materialului medical i microbiologic de folosin unic sau pentru
sterilizarea unor deeuri.
Metodele chimice de sterilizare
Metodele chimice de sterilizare se aplic limitat i servesc, n special, pentru
prevenirea polurii bacteriene a mediilor de cultur i a preparatelor imunobiologice
(vaccinuri, seruri).
Cel mai frecvent la mediile de cultur se adaug cloroform, toluol, eter. La
necesitatea de a elibera mediile de cultur de aceti conservani, ele se nclzesc n
baia de ap la temperatura de 50C (conservanii se vaporizeaz). Pentru conservarea
vaccinurilor serurilor se folosete mertiolatul, acidul boric, formolul .a.
Antisepticele substane care mpiedec multiplicarea microorganismelor.
Aceste substane au n general, aciune bacteriostatic, acioneaz n concentraii mici
i pentru timp scurt pot fi aplicate pe esuturi vii. De ex. alcoolul etilic de 70%,
KMnO4 0,1%, tinctura de iod, acidul boric, H2O2, detergenii cationici de tip
bromocet 0,1% etc.
Dezinfectanii sunt substane care au n general, aciune bactericid, care
distrug microbii de pe diferite obiecte inanimate. De ex. formol, fenol, cloramina .a.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: pipete, cutii
Petri, eprubete, baloane Erlenmeyer, colbe, vat hidrofob, tifon, hrtie ambalaj, ans
bacteriologic, etuv.
Pregtirea i sterilizarea sticlriei n laboratorul de microbiologie
Pregtirea i sterilizarea materialului n vederea utilizrii n laboratorul de
microbiologie este o procedur deosebit de important deoarece exactitatea
rezultatelor precum i reuita desfurrii proceselor microbiologice depind n mare
msur de rigurozitatea cu care se efectueaz.
Principalele operaii de pregtire a sticlriei de laborator sunt: splarea;
uscarea; executarea dopurilor i ambalarea lor. Recipientele pot fi pregtite cu dop
40
din vat hidrofob pentru a nu pstra umezeala dup autoclavare. Mai frecvent
folosite sunt dopurile din celuloz comprimat, sterilizabile pan la 200C.
Sterilizarea se efectueaz la etuv, iar materialele supuse acestei operaii
trebuie s fie curate i mpachetate n hrtie sau aezate n conteinere metalice
nchise. Sterilizarea uscat se poate aplica pentru articole din sticl (plci Petri,
baloane, pipete, eprubete), obiecte din porelan, instrumentar metalic fr suduri n
cositor, pulberi uscate etc. n practic se procedeaz la alegerea unei temperaturi de
sterilizare de 180C i a unei durate de o or.
Mod de lucru: Se execut dopuri de vat hidrofob pentru eprubete, astfel
nct s poat fi extrase uor n timpul inoculrii, iar densitatea materialului s
asigure sterilitatea. Eprubetele se introduc n coul de srm i se acoper cu hrtie.
Pipetele se astup la partea opus vrfului, cu un dop subire de vat care s
rein microorganismele ce ar putea ptrunde n pipet pe la partea superioar.
Pipetele se ambaleaz ntr-o fie de hrtie care se rsucete n jurul tubului de sticl,
ncepnd de la vrf.
Cutiile Petri se ambaleaz n hrtie de ambalaj, n funcie de numrul necesar.
Baloanele Erlenmeyer pentru medii de cultur se astup cu dop de vat
nfurat n tifon.
Toat sticlria se sterilizeaz 1 or la 180C la etuv, timp socotit din
momentul atingerii temperaturii. Dup aceast perioad etuva se oprete i se ateapt
rcirea materialului.
41

Tema: Fiziologia microorganismelor. Mediile de cultur. Cultivarea.
1. Particularitile metabolismului microbian.
2. Necesitile microorganismelor n substane nutritive. Noiune de
microorganisme saprotrofe i parazite.
3. Clasificarea microorganismelor dup tipul de respiraie. Clasificarea
microorganismelor dup sursele de carbon.
4. Tipurile de nutriie la microorganisme:
a) bacteriile fotolitoautotrofe;
b) bacteriile fotoorganoheterotrofe;
c) bacteriile chimiolitoautotrofe;
d) bacteriile chimioorganoheterotrofe.
5. Enzimele microbiene. nsuirile i clasificarea lor.
6. Creterea i multiplicarea microbilor. Fazele multiplicrii bacteriilor n
culturi periodice (discontinue) de bacterii.
7. Mediile de cultura. Principiile de clasificare. Cerinele fa de mediile de
cultur.
8. Principiul de pregtire a bulionului peptonat i a gelozei peptonate.
9. Mediile de cultur selective i diferenial-diagnostice. Principiul de pregtire
a lor.
10. Tehnica de nsmnare a materialului cercetat pe geloza peptonat cu
ajutorul ansei bacteriologice i cu spatula Drigalski.
11. Tehnica de nsmnare a materialului cercetat n medii de cultur lichide.
1. Familiarizarea studenilor cu diverse medii de cultur:
a) lichide - n eprubete, colbe;
b) solide - n cutii Petri, eprubete.
2. Prepararea gelozei peptonate, bulionului peptonat. Turnarea mediilor de
cultur n eprubete cu efectuarea ulterioar a sterilizrii lor.
3. Prepararea din mediile uscate de cultur mediul Endo, Ploskirev. Turnarea
mediilor de cultur n cutiile Petri i sterilizrii lor.
4. nsmnarea materialului cercetat (probe de sol) pe geloza peptonat n
cutiile Petri.
5. Incubarea n termostat a cutiilor Petri nsmnate.
Prepararea i sterilizarea mediilor de cultur
42
Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie

s asigure microorganismelor cantitatea necesar de ap, sursa de carbon, de azot,
sruri minerale, factori de cretere, deci care s le furnizeze substanele i energia
necesare n procesele de cretere, reproducere i ntreinerea funciilor vitale.
Mediul de cultur trebuie s ndeplineasc urmtoarele condiii:
- s corespund din punct de vedere nutritiv;
- s aib o anumit concentraie a substanelor nutritive;
- s nu conin substane toxice;
- s aib un anumit pH;
- s fie steril.
Mediile de cultur se folosesc n practica de laborator sau n practica
industrial i sunt foarte difereniate n funcie de scopul urmrit. n tehnica de
laborator mediile se folosesc pentru izolarea din mediul natural a diferitelor
microorganisme, pentru obinerea de culturi pure, pentru ntreinerea culturilor
selecionate. n scopuri industriale, mediile de cultur sunt utilizate pentru obinere de
biomas sau a unor compui de natur microbian.
Din punct de vedere al compoziiei chimice, mediile de cultur se mpart n 3
categorii:
- medii naturale de origine animal sau vegetal, cu o compoziie chimic
nedeterminat;
- medii sintetice - soluii de substane chimice cu o compoziie perfect
determinat;
- medii semisintetice - constituite din produse chimice bine definite, dar i din
produse de origine natural (cu compoziie cunoscut).
Constituenii principali ai mediilor de cultur sunt:
1. Extracte de carne i macerate
Aceste produse, comercializate n form concentrat sub denumirea de
extracte de carne, conin n principal proteine puin hidrolizate, glucide, sruri
minerale, vitamine hidrosolubile. Compoziia lor variaz n funcie de carnea utilizat
pentru preparare.
2. Extracte de drojdie
Aceste extracte, comercializate sub form deshidratat, sunt preparate din
drojdia de bere, fiind utilizate ca surs de aminoacizi i de vitamine hidrosolubile.
3. Peptone i hidrolizate
Peptonele reprezint un amestec de compui solubili n ap care provin n urma
aciunii enzimelor asupra materialului proteic. Pot fi: pepton pepsic din carne,
pepton tripsic din cazein, pepton pancreatic de cazein, pepton tripsic de
carne, pepton papainic de soia, peptone compuse.
43
Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici

asupra proteinelor (de ex. acid clorhidric). Cel mai des ntrebuinat este hidrolizatul
acid de cazein, coninnd aminoacizii constitutivi ai cazeinei din lapte.
4. Agar-agarul sau geloza
Agar-agarul denumit i geloz este un extract de alge roii din genul Gelidium
i Gracilaria, recoltate n mrile Japoniei sau ale Noii Zeelande. Se dizolv n ap la
o temperatur n jur de 90C i se solidific sub 45C, fiind utilizat pentru
solidificarea mediilor de cultur.
Dup consisten mediile de cultur pot fi lichide, compacte i semilichide.
Mediile compacte i cele semilichide se pregtesc din mediile lichide, la care pentru
obinerea mediului cu consistena necesar, de regul, se adaug geloz (agar-agar)
sau gelatin.
Cel mai utilizat agent de solidificare este agar-agarul (geloza) - un polizaharid
format din agaroz i agaropectin, izolat sau obinut din alge (genul Gelidium).
Agarul are proprieti absorbante. Pstrat n ap, nu se solubilizeaz. Prin absorbia
apei i mrete volumul de 16-17 ori. Se topete la temperaturi mai mari de 100C n
ap i se transform n gel prin rcire la temperatura de 45C. Pentru solidificarea
mediilor se adaug 1,5-2 g la 100 ml mediu lichid.
Mediile solidificate cu agar se folosesc pentru cultivarea i numrarea
microorganismelor deoarece pe medii solidificate celulele formeaz colonii
caracteristice distincte.
Gelatina, din punct de vedere chimic, este o protein cu structura asemntoare
colagenului obinut din piele de porc, cartilagii i oase. n apa rece i mrete
volumul de 3-6 ori i se fluidific n apa cald uor, iar transformarea n gel are loc
foarte lent la temperaturi sub 30C.
Pentru solidificarea mediului de cultur cu gelatin se adaug 12-15 g la 100
ml. La temperaturi ridicate de sterilizare (mai mari de 110C), i pierde proprietile
de gelifiere. Gelatina se folosete pentru medii destinate cultivrii drojdiilor, pentru
identificarea activitii proteolitice a microorganismelor.
n tehnica microbiologic se folosesc medii gata preparate obinute de firme
autorizate, care pot fi livrate n diferite forme (mai frecvent sub form de praf sau
pulbere). Pe sticl se menioneaz compoziia mediului i cantitatea de pulbere care
trebuie dozat la 1 litru de ap pentru obinerea mediului de cultur. Dup dizolvare
se face sterilizarea mediului.
44

bacterian crescut n cutii Petri, etanol, pipete, ans, spatula Drigalski, balan cu
precizie de 0,1 g, pahare Berzelius, eprubete sterile cu dop, baloane Erlenmeyer, bec
de gaz sau spirtier, autoclav, bulion peptonat, geloz peptonat.
Prepararea mediilor de cultur din cele pulverulente i turnarea lor n eprubete
Conform indicaiilor de pe flacoanele coninnd mediile de cultur
pulverulente, se vor cntri cantitile necesare pentru a obine cte 1 litru din fiecare
tip de mediu de cultur pentru eprubete i cte 300 ml mediu pentru baloanele
Erlenmeyer.
Mediul de cultur se aduce la fierbere n paharele Berzelius de 1 litru, pn la
dizolvarea agarului, apoi se repartizeaz cte 10 ml n eprubete sterile, prevzute cu
dop de vat, care se aeaz n couri de srm i se acoper cu hrtie. n mediu se
determin pH-ul i, dac este necesar, se ajusteaz la valoarea dorit. Mediile cu agar
nu trebuie s fie aduse la un pH mai mic de 6, deoarece agarul este parial hidrolizat
n timpul sterilizrii la pH acid i nu se mai solidific la rcire. Cnd sunt necesare
astfel de medii, pH-ul trebuie ajustat dup sterilizare.
Baloanele Erlenmeyer se astup cu dop de vat nvelit n tifon, se leag la gur
cu hrtie i sfoar. Courile i baloanele Erlenmeyer se introduc n autoclav i
sterilizarea se face conform instruciunilor.
n general, mediile de cultur trebuie s ofere o suprafa de dezvoltare
suficient pentru microorganisme. De aceea, dup sterilizare eprubetele cu mediu se
nclin pentru ca s rmn cu o suprafa mare de cretere. nclinarea se face prin
sprijinirea eprubetelor pe o baghet, innd seama ca mediul negelificat s nu ude
dopul de vat, ci s se opreasc la 2-3 cm de acesta (fig. 13). Prin rcire, vaporii ce
ies din mediul cald, se condenseaz pe pereii mai reci ai eprubetelor i cad sub form
de picturi pe mediu, adunndu-se pe fundul eprubetei. Din aceast cauz, eprubetele
cu mediul rcit nu se aeaz n poziie orizontal, ci vertical, n couri de srm.
Acestea se acoper apoi cu o hrtie i se leag cu sfoar.
Pentru evitarea uscrii se recomand pstrarea mediilor nutritive n frigider.
Fig. 13. Eprubete cu mediul de cultur (geloz peptonat) nclinat
Metodica de pregtire a bulionului peptonat i a gelozei peptonate

45
n cazul n care nu exist medii de cultur pulverulente deshidratate, procurate

de la firme specializate, mediile se vor prepara din componeni naturali de origine
animal sau vegetal. Astfel, pentru pregtirea bulionului peptonat i a gelozei
peptonate este necesar extractul de carne, care se pregtete n felul urmtor:
1. 500 g de carne proaspt de vit, fr oase, grsime i tendoane, se trece prin
maina de tocat carne, apoi la masa obinut se adaug un litru de ap de robinet, se
amestec bine i se las pentru 24 ore la rece sau se termostateaz la 37C 2 ore.
2. Extractul de carne se stoarce prin tifon, se fierbe 5 minute pentru coagularea
proteinei, se rcete i se filtreaz printr-un filtru de vat, adugnd ulterior ap de
robinet pn la volumul iniial.
3. Extractul da carne se repartizeaz n flacoane, se sterilizeaz 20-30 min. la 1
atm. i se pstreaz la ntuneric. El are aspectul unui lichid galben-strveziu, cu o
reacie slab acid (pH-ul 6,2-6,4) lipsit de proteine.
1. Bulionul peptonat
1. ntr-un litru de extract de came se dizolv la o temperatur moderat i
agitare 10 g de pepton i 5 g de NaCl. Se stabilete pH-ul mediului n limitele 7,67,8, apoi se fierbe 30-45 min. pn la apariia precipitatului.
2. Bulionul se rcete, se filtreaz prin filtrul de hrtie, se adaug ap pn la
volumul iniial i se controleaz pH-ul.
3. Ulterior bulionul peptonat se repartizeaz n eprubete, flacoane i se
sterilizeaz 15-20 min. la 1 atm.
2. Geloza peptonat
1. La bulionul peptonat se adaug 1,5-2,0% de geloz (agar-agar).
2. Amestecul cptat se agit pn la topirea gelozei.
3. Se controleaz i se corecteaz pH-ul mediului i dup apariia precipitatului
se filtreaz prin filtru de vat-tifon.
4. Geloza peptonat lichid se repartizeaz n eprubete i flacoane i se
sterilizeaz 15-20 min. la 1 atm.
Metode de nsmnare a microorganismelor
nsmnarea cu spatula (metoda Drigalski)
O pictur din materialul cercetat se depune cu pipeta pe geloz n centrul
cutiei Petri i se repartizeaz cu spatula pe o poriune mic, apoi, efectund micri
circulare, materialul se repartizeaz pe toat suprafaa gelozei. Pe parcursul
nsmnrii capacul cutiei Petri se ridic puin cu mna stng, deschiznd astfel
cutia. Ulterior spatula cu resturi ale materialului cercetat din prima cutie se trece n
cutia a doua, apoi n a treia, repartiznd uniform materialul pe suprafaa gelozei.
Dup terminarea nsmnrii spatula se introduce n borcanul cu soluie
dezinfectant. Cutiile se semneaz i se termostateaz.
46
nsmnarea cu ansa bacteriologic

Cutia Petri cu geloz se aeaz pe mas cu capacul n sus, se ia i se ine cu
mna stng vertical, puin ntredeschis. Materialul cercetat se ia i se repartizeaz
cu ansa, care se ine liber cu degetul mare i arttor al minii drepte. Efectund
micri uoare, abia atingnd suprafaa gelozei, materialul se nsmneaz n form
de striuri paralele la o distan de circa 5 mm unul de altul (fig. 14). Cutiile Petri cu
geloz nsmnate se termostateaz.
Fig. 14. nsmnarea mediilor solide repartizate n cutii Petri: 1 spatula Drigalski; 2
nsmnarea culturii de microorganisme cu spatula; 3 colonii de bacterii dup 24-48 ore
de termostatare; 4 schema de nsmnare a culturii de microorganisme cu ansa
bacteriologic.
47

Tema: Cultivarea microorganismelor aerobe i anaerobe. Izolarea n
culturi pure i identificarea microorganismelor.
1. Cultur pur i cultur mixt de microorganisme, tulpin microbian, clon.
2. Metodele de cultivare a microorganismelor aerobe.
3. Cultivarea superficial pe suprafaa mediilor de cultur lichide i solide.
4. Cultivarea profund n mediile de cultur lichide:
a) pe balansoare;
b) prin pomparea aerului sterilizat.
5. Metodele de cultivare a microorganismelor anaerobe:
a) cultivarea profund n mediul de cultur agarizat;
b) fierberea mediului de cultur;
c) utilizarea anaerostatului;
d) absorbia chimic;
e) metoda biologic Fortner.
6. Etapele de izolare n culturi pure a microbilor aerobi.
7. Studierea caracterelor de cultur ale microbilor cultivai pe geloz peptonat
i n bulion peptonat.
8. Etapele de izolare n culturi pure a microbilor anaerobi.
9. Studierea macro- i microscopic a coloniilor de microbi anaerobi cultivai
pe suprafaa mediilor solide i n tuburile Weinberg (eprubete nalte, tuburile Burri).
10. Controlul puritii culturilor microbiene.
11. Metodele de studiere a caracterelor biochimice (fermentative) ale
microbilor.
1. Examinarea nsmnrilor pe geloz, efectuate pe parcursul lucrrii de
laborator precedente. Studierea macro- i microscopic a coloniilor.
2. Controlul puritii culturii (coloniei) de microbi. Pregtirea frotiului i
colorarea lui dup metoda Gram.
3. Rensmnarea coloniei cercetate pe geloz nclinat i pe mediul Hiss.
4. nsmnarea suspensiei de sol n mediul lichid regenerat pentru mbogirea
anaerobilor.
5. Rensmnarea culturii cercetate de pe mediul de mbogire n cutiile Petri
(metoda Zeissler).
6. Rensmnarea culturii cercetate de pe mediul de mbogire n tuburile
Weinberg (eprubete nalte).
7. Obinerea culturii elective a bacteriei fnului.
48
8. Scindarea glucidelor de ctre microorganisme n mediul Hiss.

Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: fn proaspt,
cret, cultur bacterian crescut n cutii Petri, etanol, pipete, ans, spatula Drigalski,
eprubete sterile cu dop, baloane Erlenmeyer, tuburi Weinberg, bec de gaz sau
spirtier, exicator, termostat, parafin, pirogalol, amestec de pirogalol i Na 2CO3,
hidrosulfat de sodiu, acid oxalic, hrtie de turnesol, acetat de plumb, bulion peptonat,
geloz peptonat, mediul Hiss, lame, colorani, microscop.
Cultivarea microorganismelor aerobe i anaerobe.
Cultivarea aerobilor. Ptrunderea oxigenului, necesar pentru cultivarea
aerobilor i anaerobilor facultativi, se efectueaz n timpul aerrii pasive i active.
Aerarea pasiv se efectueaz la cultivarea pe mediile lichide i solide n
diferite vase nchise, cu dopuri de vat, de vat i tifon sau n cutiile Petri. La acest
tip de cultivare microorganismele folosesc oxigenul dizolvat n mediu, dispus n vas
deasupra mediului i care ptrunde prin dopurile de acoperire. Culturile aerate pasiv
pot fi crescute pe suprafaa mediului sau ntr-un strat subire al lui, unde ptrunde
oxigenul aerului.
Aerarea activ se aplic la cultivarea microorganismelor n profunzime, cnd
ele sunt cultivate n volume mari de mediu. Pentru asigurarea suficient a acestor
culturi cu oxigen, se aplic amestecarea lor permanent, care duce la contactul
culturii cu aerul. La cultivarea microorganismelor n volume de lichide, care ating
zeci i sute de litri, efectuat n aparate speciale, numite reactoare sau fermentatoare,
aerul se pompeaz prin cultur cu ajutorul unor instalaii speciale.
n practica de laborator se mai aplic frecvent cultivarea profund a
microorganismelor aerobe pe agitatoare rotative. Astfel, baloanele sau eprubetele cu
cultura microorganismelor aerobe se plaseaz pe agitatoare ce se rotesc cu viteza de
100-200 rotaii pe minut.
Cultivarea anaerobilor este mult mai dificil dect a aerobilor, deoarece
acetia trebuie s fie lipsii de accesul oxigenului liber al aerului. Pentru aceasta
eliminarea aerului din mediul de cultur se efectueaz prin diferite metode:
- cultivarea profund n mediul de cultur agarizat;
- fierberea mediului de cultur;
- nlturarea oxigenului pe cale mecanic;
- absorbia chimica a oxigenului;
- metoda biologic.
n eprubetele cu mediul nutritiv solid, nclzit pn la 50C, se introduce
cultura microorganismelor anaerobe. Mediul nutritiv se toarn n eprubete aproape
49
pn la dop. Suprafaa mediului se acopere cu parafin. Coloniile apar n adncul

mediului agarizat (fig. 15). La folosirea cutiilor Petri mediul cu cultura
microorganismelor anaerobe se toarn n capac. Dup solidificare, pe mediul agarizat
se aeaz fundul cutiei astfel, ca ntre el i mediul nutritiv s nu ptrund aer. n
spaiul dintre pereii fundului i capacului se toarn parafin sterilizat (fig. 16).
Fig. 15. Tuburi Weinberg: 1 tuburi sterile pregtite pentru nsmnarea

microorganismelor anaerobe; 2 colonii de microorganisme anaerobe n profunzimea
substratului nutritiv.
Fig. 16. Cultivarea microorganismelor anaerobe n cutii Petri:

1 mediul agarizat; 2 parafin sterilizat.
nlturarea oxigenului pe cale mecanic se efectueaz n anaerostate aparate

nchise ermetic cu instalaii de evacuare a aerului.
Absorbia chimica se bazeaz pe folosirea substanelor chimice (pirogalol,
amestec de pirogalol i Na2CO3, hidrosulfat de sodiu etc.). Sorbenii chimici se
plaseaz la fundul eprubetei biologice. n ea se introduce un suport special, pe care se
aeaz eprubeta cu un diametru mai mic, n care se afl mediul nutritiv i cultura de
microorganisme anaerobe. Eprubeta biologic se astup cu dop de gum (fig. 17).
Fig. 17. Eprubete pentru cultivarea microorganismelor anaerobe:

1 cultura microorganismelor; 2 sorbenii chimici.
50
Pot fi folosite i exicatoare, n care se plaseaz cutiile Petri cu cultura

microorganismelor i sorbenii chimici (fig. 18). Plenitudinea absorbiei oxigenului
din mediu se controleaz cu ajutorul indicatorilor.
Fig. 18. Exicator.
Metoda biologic se bazeaz pe cultivarea microorganismelor anaerobe

mpreun cu cele aerobe. Microorganismele aerobe absorb oxigenul din aerul ce
contacteaz cu suprafaa mediului nutritiv i nu permit ptrunderea lui n straturile
mai adnci, crend astfel condiii anaerobe. Din acest moment ncep s se dezvolte
microorganismele anaerobe.
Izolarea n culturi pure i identificarea microorganismelor.
Cultura pur reprezint acumularea microorganismelor dintr-o singur specie,
crescute pe mediul de cultur solid sau lichid.
n dependen de proprietile materialului de cercetat i scopurile
investigaiilor, se folosesc mai multe metode de separare n cultur pur a
microorganismelor. De regul, culturile pure se obin din anumite colonii, care
reprezint acumulri izolate de microorganisme crescute pe mediile solide de cultur.
Se consider c colonia se dezvolt dintr-o singur celul bacteriana, adic reprezint
o cultur pur a acestui microorganism.
Etapele de obinere a culturii pure. n prima zi se obin coloniile izolate. O
pictur de material, cu ajutorul ansei, pipetei sau bastonaului de sticl, se aplic pe
suprafaa gelozei din cutia Petri. Cu ajutorul spatulei materialul se repartizeaz pe
suprafaa mediului. Fr a flamba i fr a ntoarce spatula, se efectueaz
nsmnarea n cutia a doua, iar apoi i n cutia a treia. La un asemenea tip de
nsmnare n prima cutie se va obine creterea continu, n cutia a doua vor fi
nregistrate mai puine colonii, iar n a treia colonii izolate.
51
Colonii izolate pot fi obinute la nsmnarea microorganismelor cu ajutorul

ansei bacteriene. Pentru aceasta materialul de cercetat se emulg n bulion n soluia
izotonic de clorur de natriu.
n ziua a doua se cerceteaz creterea microorganismelor n cutiile Petri. n
prima cutie, de regul, se nregistreaz creterea nentrerupt, aici eliminarea
coloniilor izolate devine imposibil. Pe suprafaa gelozei din cutiile a doua i a treia
se nregistreaz i colonii izolate.
Coloniile separate se cerceteaz cu ochiul nenarmat, cu ajutorul lupei, la
mrirea mic a microscopului. Coloniile necesare se noteaz la fundul cutiei i se
rensmneaz pe geloza nclinat. Culturile nsmnate se amplaseaz n termostat.
n ziua a treia se cerceteaz caracterul creterii pe geloza nclinat. Se
pregtete frotiul, se coloreaz i, ncredinndu-ne c cultura e pur, se ncepe
cercetarea ei. La aceast etap evidenierea culturii pure se termin. Cultura separat
dintr-o anumit surs i cercetat multilateral poart denumirea de su.
Pentru separarea culturii pure se aplic pe larg mediile elective de cultur.
nsmnarea culturilor pure pe geloza nclinat
1. Eprubeta cu cultura microbiana pur i eprubeta cu mediul steril se iau cu
mna stng n poziie nclinat astfel, ca eprubeta cu cultura cercetat s fie fa de
cercettor prima, iar marginile ambelor eprubete s se gseasc la acelai nivel (fig.
19).
Fig. 19. Schema de nsmnare a culturii de microorganisme cu ansa bacteriologic dintr-o

eprubet n alt eprubet.
52
2. Ansa bacteriologic se ia n mna dreapt i n poziie vertical se flambeaz

la flacra spirtierei.
3. Dopurile din ambele eprubete se scot concomitent, se strng ntre degetul
mic i palm i se in n aa poziie pe tot parcursul nsmnrii. Marginile
eprubetelor se flambeaz la flacra spirtierei.
4. Ansa flambat se introduce n eprubeta cu cultur, se rcete i se atinge de
suprafaa culturii microbiene. Apoi ansa cu cultura se introduce n eprubeta cu geloz
nclinat steril i, neatingnd apa de condensare, cultura cercetat se repartizeaz pe
suprafaa gelozei n form de striuri nentrerupte.
5. Ansa se scoate, marginile eprubetelor se sterilizeaz i se pun dopurile,
trecute prin flacr. Ulterior se flambeaz ansa, eprubetele se semneaz i se pun n
stativ.
nsmnarea culturilor pure n mediul lichid
nsmnarea n mediul lichid nu se deosebete de metodica de nsmnare a
materialului cercetat pe geloz nclinat cu excepia, c materialul luat cu ansa se
introduce n eprubeta cu mediul lichid i se repartizeaz pe peretele eprubetei, agitind
ulterior puin lichidul, celulele microbiene nimeresc n mediul nutritiv.
nsmnarea culturii pure n profunzimea gelozei (prin injectare)
La nsmnarea culturilor pure prin injectare, eprubeta cu geloz, turnat sub
form de coloan, se ine la fel ca i eprubeta cu geloza nclinat. Cultura cercetat sa
ia cu ajutorul acului bacteriologic i se nsmneaz strpungnd geloza pn la
fundul eprubetei.
nsmnarea materialului cercetat n profunzimea gelozei
(metoda diluiilor succesive Weinberg)
Aceast metod se practic pentru izolarea n culturi pure a microbilor
anaerobi din diferite obiecte ale mediului exterior. n acest scop materialul cercetat se
ia cu pipeta Pasteur i se introduce consecutiv n trei eprubete cu soluie fiziologic
steril (cte 10 ml). Apoi se continu diluarea materialului cercetat, folosind trei
eprubete (pregtite din sticl subire cu diametrul de 8 mm i nlimea de 180 mm)
cu geloz topit i rcit pn la 50C. Dup solidificarea gelozei eprubetele se
termostateaz. Coloniile microbilor anaerobi obinute astfel sunt supuse apoi
examenului macroscopic.
nsmnarea materialului cercetat cu pipeta
Pipeta steril sa trece prin flacr, se introduce n vasul cu materialul de
cercetat i picurnd un anumit volum se trece apoi n vasul cu mediul nutritiv lichid
pentru nsmnare. Finisnd nsmnarea, pipeta se introduce n soluia
dezinfectant.
Obinerea culturii elective a bacteriei fnului
53
n balonul conic de 500 ml se introduc 25 g de fn mrunit, se adaug 200 ml

de ap din robinet i puin cret pentru neutralizarea mediului. Coninutul din balon
se fierbe 30 minute. Celulele vegetative ale bacteriilor pier, rmn viabili sporii
bacteriei fnului, ei suport temperatura fierberii n decurs de pn la 3 ore. Infuzia
din fn se toarn n baloane conice ntr-un strat cu grosimea de 1-2 cm, se astup cu
dop de vat i tifon i se incubeaz n termostat la temperatura de 30oC. Peste 24-48
ore de la incubare din infuzie i pelicula superficial se pregtete preparatul
pictura suspendat i se studiaz n microscop cu sistemul de imersie. n preparat
se observ bastonae mobile (fig. 20).
Fig. 20. Bacteria fnului (Bacillus subtilis)
n culturi de 4 zile apar spori. Pentru evidenierea lor frotiul se coloreaz cu

fuxin timp de 5-6 minute, nclzindu-l la flacr pn la apariia vaporilor. Pe
msura uscrii frotiului, periodic se adaug colorant proaspt. Sporii i celulele
vegetative se coloreaz n rou. La tratarea frotiului cu H 2SO4 de 1-2% celulele
vegetative se decoloreaz, iar sporii rmn colorai. Dup aceasta frotiul se spal i se
coloreaz cu albastru de metilen. Preparatul se spal, se usuc i se examineaz n
microscop cu sistemul de imersie. Celulele vegetative de Bacillus subtilis se
coloreaz n albastru, iar sporii culoare roie.
Metodica studierii caracterelor de cultura ale microbilor
1. Studierea macroscopic a coloniilor n razele de lumin trectoare si reflectate
Pentru studierea macroscopic a coloniilor n razele de lumin trectoare, cutia
Petri se ntoarce spre cercettor, perpendicular luminii i cercetnd coloniile se indic
urmtoarele:
1. dimensiunile coloniilor (mari 4-5 mm i mai mult n diametru, mijlocii
2-4 mm, mici 1-2 mm, punctiforme mai puin de un mm);
2. configuraia (forma) coloniilor (circular regulat sau iregulat, amiboid,
rizoid .a.);
3. nsuirile optice (transparente, semitransparente, intransparente).
n razele de lumin reflectate coloniile se privesc din partea capacului,
nedeschiznd cutia, i se indic urmtoarele:
a) culoarea coloniei (incolor, pigmentat culoarea pigmentului);
54
b) caracterul suprafeei (neted, lucid, umed sau rugoas, opac, uscat);

c) situarea coloniilor pe geloz (de asupra gelozei, la nivelul mediului, n
profunzimea gelozei);
d) profilul coloniei (plat, bombat, sub form de crater, con .a.) (fig. 21).
Fig. 21. Caracteristica coloniilor

Forma: 1 sferic; 2 neregulat; 3 amiboid; 4 rizoid; 5 filamentoas.
Profilul: 1 plat; 2 bombat; 3 form de crater; conic.
Marginea: 1 dreapt; 2 ondulat; 3 lobat; 4 filamentoas.
Structura: 1 omogen; 2 fin granulat; 3 grosier granulat; 4 form de
uvie; 5 fibrilar.
2. Studierea microscopic a coloniilor

Cutia Petri se instaleaz cu fundul n sus pe msua microscopului i se
coboar condensorul. Folosind obiectivul 8x, se studiaz structura i marginea
coloniei:
a) marginea coloniei (regulat, vluroas, zimat .a.);
b) structura coloniei (omogen sau amorf, granular, fibrilar).
Metodele de studiere a caracterelor biochimice (fermentative) ale microbilor
1. Determinarea activitii zaharolitice
Cultura cercetat se nsmneaz ntr-o serie de eprubete, cu mediul Hiss (cte
4-5 ml) care conin diferite glucide (glucoz, zaharoz, maltoz .a.). Eprubetele cu
mediile nsmnate se termostateaz 18-24 ore la temperatura optim pentru, cultura
dat. Evidena rezultatelor se efectueaz n dependen de gradul de schimbare a
culorii indicatorului de pH n mediu i prin prezena sau lipsa formrii de gaze.
2. Determinarea activitii proteolitice
55
Cultura cercetat se nsmneaz cu ansa n coloana de gelatin, neajungnd

fundul eprubetei. nsmnrile se menin la temperatura camerei 2-3 zile, indicnd
ulterior prezena scindrii gelatinei i caracterul acestei scindri. Scindarea gelatinei
poate fi stratificat sub form de cui, ciorap, brdule cu vrful n jos .a.
3. Determinarea activitii peptolitice
Cultura cercetat se nsmneaz cu ansa ntr-o eprubet cu bulion peptonat.
Pentru evidenierea produselor activitii peptolitice ale microbilor (indol, amoniac,
hidrogen sulfurat) se folosesc fii de hrtie de filtru mbibate cu indicatori respectivi
i uscate. Hrtiuele indicatoare se aeaz ntre pereii eprubetei i dop astfel, ca s nu
contacteze cu mediul nutritiv nsmnat. Eprubetele cu bulion peptonat nsmnate
se termostateaz 2-3 zile. Evidena rezultatelor se efectueaz dup schimbarea culorii
indicatorului respectiv.
Proba pentru indol
Prezena indolului se pune n eviden prin colorarea hrtiei de filtru cu acid
oxalic n roz-rou.
Proba pentru amoniac
Prezena amoniacului se pune n eviden cu hrtia de turnesol care se
coloreaz n albastru.
Proba pentru hidrogenul sulfurat
Prezena hidrogenului sulfurat se pune n eviden prin nnegrirea hrtiei de
filtru cu acetat de plumb.
56

Tema: Ecologia microorganismelor. Metodele de analiz cantitativ i
calitativ a microflorei solului, apei, aerului.
1. Rspndirea microorganismelor n natur.
2. Microflora solului. Caracteristica general.
3. Dinamica microflorei solului n funcie de tipul de sol, profil, anotimp.
4. Determinarea cantitii de microorganisme n sol.
5. Microflora apei. Caracteristica general.
6. Determinarea cantitii de microorganisme n ap.
7. Determinarea microorganismelor coliforme din apa investigat.
8. Rolul microorganismelor n procesele de productivitate i autoepurare a
apei.
9. Microflora aerului. Caracteristica general.
10. Metode de studiere a microflorei aerului.
1. Determinarea valorii numerice microbiene n probele de sol i ap prin
metoda diluiilor succesive n geloz.
2. Determinarea microorganismelor coliforme n apa de ru.
3. Determinarea impurificrii microbiene a aerului din diferite ncperi ale
blocului de studii prin metoda de sedimentare.
a) studierea coloniilor microbiene aprute pe mediul de cultur agarizat din
cutiile Petri.
b) determinarea numrului de microorganisme la 1 m3 de aer.
Microflora solului. Solul reprezint cel mai favorabil mediu de via pentru
dezvoltarea microorganismelor. El conine substane organice i minerale necesare,
cantitate suficient de umezeal, protejeaz microorganismele de aciunea duntoare
a razelor solare. Cantitatea de microorganisme din sol este influenat de mai muli
factori: de natura solului; de proveniena i de structura mineral a solului; de
intervenia unor aciuni externe, cum sunt volumul precipitaiilor i variaia lor
sezonier, agrotehnica, inclusiv adaosul de ngrminte chimice sau biologice. Din
microorganismele solului cele mai numeroase sunt bacteriile, apoi urmeaz
actinomicetele, algele, protozoarele .a. n sol microorganismele sunt repartizate
neuniform. Cea mai mare cantitate de microorganisme se conine la adncimea de 520 cm.
57
Microflora i microfauna solului sunt variabile i ca numr de populaie,

putnd ajunge n unele cazuri pn la cteva miliarde de indivizi la 1 g de sol arabil,
ceea ce reprezint pe 1 ha ntre 3 i 10 tone de microorganisme. Acestea joac un rol
colosal n procesul de formare a solului i n sporirea fertilitii lui. Ele particip la
mineralizarea substanelor organice din resturile vegetale i animale, asigur plantele
cu substane uor asimilabile, contribuie la formarea humusului, descompun
substanele toxice etc.
Microflora apei. Apa constituie cel de-al doilea mediu natural, dup sol,
pentru dezvoltarea microorganismelor, datorit prezenei substanelor nutritive. Sunt
mai numeroase microorganismele la adncimea de pn la 20 m. Apele subterane i
de izvor sunt mai srace n bacterii, din cauza lipsei de substane nutritive.
Gradul de poluare a apei cu microorganisme se exprim prin saprobitate. Se
deosebesc trei zone de saprobitate:
- polisaprob sau puternic poluat. Apa este foarte bogat n resturi organice,
deeuri menajere i industriale. n asemenea condiii intens decurg procese
de descompunere a substanelor organice n condiii de anaerobioz.
Predomin bacteriile din genul Clostridium. ntr-un mililitru de ap se
conin pn la 1 000 000 celule microbiene.
- mezosaprob sau moderat poluat. n aceste ape continu procesul de
mineralizare a substanelor organice efectuat preponderent de
microorganisme aerobe. ntr-un mililitru de ap se conin pn la 100 000
celule microbiene.
- oligosaprob reprezint apa curat. Predomin procesele de oxidare a
nitrailor i nitriilor a compuilor fierului i sulfului .a. Lipsete
colibacilul. ntr-un mililitru de ap se conin pn la 1000 celule
microbiene.
Microflora aerului. Aerul reprezint un mediu nefavorabil pentru dezvoltarea
microorganismelor, deoarece n el lipsesc substanele nutritive necesare. Cu toate c
aerul nu ofer condiii pentru dezvoltare, el conine numeroase microorganisme.
Acestea sunt reprezentate de bacterii, actinomicete, ciuperci, rikettsii i virusuri.
Microflora aerului este de origine uman, animal i a solului.
Oamenii i animalele elimin microorganisme att pe cale respiratorie, ct i
prin secreii i dejecii, care, n urma uscrii, devin surs de praf cu coninut bogat de
microorganisme.
Gradul de contaminare microbian a aerului i suprafeelor reflect un risc
potenial de mbolnvire, care crete proporional cu densitatea bacteriilor i cu
prezena speciilor condiionat patogene sau patogene.
58
Cantitatea de microorganisme depinde de temperatur, umiditate, de gradul de

poluare a aerului cu suspensii minerale i organice i alte condiii.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: anse, lame,
cutii Petri, baloane Erlenmeyer, pipete, eprubete cu cte 9 ml ap steril, eprubete
care au n interior tuburi Durham, stativ pentru eprubete, etanol, eritrozin, medii de
cultur (agar nutritiv, EMB (eozin i albastru de metilen), b.b.l.v.b. (bulion, bil
lactoz, verde briliant), geloz amidono-amoniacal), probe de ap din diferite surse,
probe de sol de grdin, baie de ap, bec de gaz sau spirtier, dispozitiv de numrat
coloniile.
Studierea microflorei solului dup metoda propus de N.G. Holodni
n sol se face o seciune cu un cuit steril i paralel, pe suprafaa solului, se
plaseaz lame port-obiect. Suprafaa lamelor se stropete cu soluie a solului, n care
se gsesc diverse microorganisme, apoi se acoper cu sol umed. Dup modificarea
propus de A. V. Rbalco lamele port-obiect se acoper cu un strat fin de geloz
amidono-amoniacal, ce asigur dezvoltarea rapid i abundent a
microorganismelor. Cu un cuit steril se face n sol o seciune vertical de 3-5 cm
adncime, n care se introduc lamele port-obiect, alipindu-le cu suprafaa acoperit cu
mediul nutritiv de sol.
Peste 3-4 zile sau 2 sptmni lamele se scot atent din sol, se cur de
particulele solide, se usuc, se fixeaz la flacra spirtierei, apoi se introduc n paharul
cu ap pentru nlturarea rmielor de sol. Frotiurile obinute se usuc, apoi se
coloreaz cu eritrozin timp de 30-40 minute, se spal, se usuc cu fia de hrtie de
filtru i se examineaz n microscop cu sistemul de imersie.
Studenii fac concluzii despre grupele fiziologice, formele dominante i
cantitatea de microorganisme.
Determinarea valorii numerice totale a microorganismelor n sol i ap prin
metoda diluiilor succesive n geloz
Materialul cercetat (probe de ap sau sol) este supus unei diluii succesive,
folosind 5-6 eprubete, care conin cte 9 ml de ap de robinet steril. n acest scop 1
ml de material cercetat se introduce cu o pipet steril n prima eprubet i amestecul
cptat se agit bine. Apoi un ml din prima eprubet se trece n eprubeta a doua, din
eprubeta a doua n a treia .a.m.d. Astfel se obine o diluie succesiv a materialului
de cercetat de la 1:10 pn la 1:1000000. n continuare din fiecare diluie se
efectueaz nsmnarea n geloz (fig. 22). Pentru aceasta 1 ml sau 0,1 ml (n
dependen de gradul de impurificare a materialului cercetat) din fiecare diluie se
introduce separat n cutiile Petri sterile. Apoi n aceste cutii se toarn cte 10-15 ml
de geloz topit i rcit pn la 45C i se agit bine, efectund micri circulare.
Dup solidificarea gelozei cutiile se ntorc cu fundul n sus i se termostateaz 24 de
ore la temperatura de 37C i apoi se menin nc 48 de ore la temperatura camerei.
59
Ulterior se efectueaz evidena coloniilor crescute pe geloz i, innd cont de gradul

de diluie, se determin valoarea numeric total a microorganismelor ntr-un ml de
material cercetat.
Fig. 22. Schema pregtirii diluiilor succesive cu nsmnarea microorganismelor n geloz.
Determinarea microorganismelor coliforme din apa investigat

Sursa cea mai important de poluare bacterian a apei o constituie reziduurile,
excrementele umane i animale, care pot conine germeni patogeni, de aceea n
analiza apei se urmrete detectarea polurii fecale folosind indicatorii coliformi.
Metoda pentru determinarea bacteriilor coliforme include teste prezumtive, de
confirmare, bazate n primul rnd pe capacitatea bacteriilor de a fermenta lactoza cu
producere de acid lactic, CO2, H2, n timp de 48 ore la 35C.
a) Testul de prezumie const n nsmnarea apei de cercetat n tuburi cu
bulion lactozat, cu incubarea 48 de ore la 37C i evidenierea tuburilor n care s-au
produs acidifierea mediului i fermentarea lactozei cu producere de gaz. nsmnarea
apei se face n eprubete care au n interior tuburi Durham ce servesc pentru colectarea
gazului rezultat din fermentaie.
Dup nsmnare, tuburile se incubeaz la 37C. Dup 48 ore, tuburile
pozitive (care dispun de o cantitate oarecare de gaz) vor fi reinute pentru testul de
confirmare.
b) Testul de confirmare. ntruct fermentarea lactozei cu producerea de gaz
poate fi datorat prezenei i altor germeni sau asociaii de germeni (diferite specii ale
genurilor Lactobacillus, Aeromonas, unele drojdii etc.), este necesar executarea
acestui test pentru a confirma c germenii care au fermentat lactoza sunt bacterii
coliforme.
Pentru testul de confirmare se folosesc medii speciale solide (EMB cu eozin i
albastru de metilen) sau lichide (bulion, bil lactoz, verde briliant b.b.l.v.b.). Testul
de confirmare const n trecerea, cu ajutorul ansei, a unei picturi din fiecare tub
pozitiv la testul prezumtiv, pe un sector dintr-o cutie Petri cu mediu EMB, sau dintrun tub cu mediul lichid b.b.l.v.b. Se incubeaz 24 ore la 37C i se urmrete apariia
coloniilor caracteristic mediului solid sau prezena gazului n mediul lichid. innd
cont de eprubetele confirmate, se face aprecierea cantitativ a numrului probabil de
bacterii coliforme la litru de ap, folosind pentru calcul tabelele.
60
Rezultatele obinute se raporteaz la normele indicate n standardul de ap

potabil. Acestea sunt: 0 coliformi/l pentru apa furnizat de instalaiile centrale
urbane i rurale cu ap dezinfectat; sub 3 coliformi/l pentru apa furnizat de
instalaiile centrale cu ap nedezinfectat; sub 10 coliformi/l pentru apa furnizat din
surse locale (fntni, izvoare etc.).
c) Testul de identificare a coliformilor fecali reprezint o analiz
complementar ce se execut pentru identificarea celulelor de Escherichia coli. El se
execut n examene mai detaliate ale controlului bacteriologic al apei potabile sau n
diferite situaii de impurificare biologic. Testul const n evidenierea proprietilor
caracteristice speciei de E. coli.
Cel mai frecvent i mai simplu se procedeaz la nsmnarea culturii de mediu
b.b.l.v.b. i incubarea n termostat la 44C, temperatur la care se dezvolt E. coli i
nu se dezvolt ceilali coliformi. Complementar se mai pot determina i alte
proprieti biochimice ale E. coli, cum sunt: producerea de idol, testul de utilizare a
citratului etc.
Determinarea impurificrii microbiene a aerului prin metoda de sedimentare
Cutiile Petri cu geloz peptonat se las deschise timp de 5 minute pentru
sedimentarea n ele a microorganismelor din aer. Apoi cutiile se nchid i se
termostateaz 24 de ore la temperatura de 37C i apoi se menin nc 24 de ore la
temperatura camerei, n continuare se calculeaz numrul coloniilor crescute pe
geloz n cutii i se determin numrul microorganismelor, ce se conin ntr-un metru
cub (1000 l) de aer, folosind n acest scop principiul de calcul propus de V. L.
Omelianski. Conform datelor obinute de V. L. Omelianski, pe o suprafa de 100 cm
se sedimenteaz timp de 5 minute un aa numr de microbi, care se conin n 10 l de
aer.
Determinarea valorii numerice totale de microorganisme ntr-un metru cub de
aer se efectueaz astfel:
a) se determin suprafaa cutiei Petri;
b) se calculeaz numrul coloniilor, ce au crescut pe geloz n cutia Petri i se
determin numrul de microorganisme ce s-au sedimentat timp de 5 min. pe 1 cm 2.
Ulterior acest numr se nmulete la 100, obinnd astfel valoarea numeric a
microbilor ce se conin n 10 l de aer;
c) pentru a determina valoarea numeric total a microbilor n 1 m3 de aer
numrul obinut se nmulete la 100 (1 m3 = 1000 l).
61

Tema: Microorganismele solului i circuitul substanelor n natur.
1. Noiune de grupe fiziologice de microorganisme i rolul lor n circuitul
substanelor n natur.
2. Rolul microorganismelor n circuitul azotului n natur. Etapele principale.
3. Amonificarea proteinelor, acizilor nucleici, ureei. Agenii cauzali i
caracteristica lor.
4. Nitrificarea. Fazele nitrificrii. Agenii cauzali i caracteristica lor.
5. Denitrificarea. Tipurile de denitrificare. Agenii cauzali i caracteristica lor.
6. Fixarea biologic a azotului molecular. Caracteristica bacteriilor
azotfixtoare libere.
7. Bacteriile de nodoziti, relaiile lor cu plantele superioare.
8. Transformarea compuilor organici i anorganici ai fosforului n natur de
ctre microorganisme. Procesul de mobilizare a fosforului n sol.
9. Transformarea compuilor organici i anorganici ai sulfului n natur de
ctre microorganisme. Procesul de sulfoficare i desulfoficare.
10. Transformarea compuilor organici i anorganici ai fierului n natur de
ctre microorganisme. Caracteristica ferobacteriilor.
1. Studierea amonificrii substanelor proteice de ctre microorganismele
amonificatoare. Demonstrarea experienei.
2. Determinarea nitrificatoare a solului. Demonstrarea experienei.
3. Studierea bacteriilor azotfixatoare libere.
4. Studierea bacteriilor de nodoziti.
5. Studierea ferobacteriilor. Demonstrarea experienei.
Rolul microorganismelor n formarea i evoluia materiei organice.
Materia organic este reprezentat din resturile vegetale, care se mineralizeaz de
ctre microorganisme, dar mai ales de humus, care este un complex de substane
amorfe n stare coloidal, rezultat din transformri biochimice descompuneri i
sinteze ale resturilor organice vegetale i animale sub aciunea microflorei solului.
Substanele organice vegetale i animale ajunse n sol dup moartea
organismelor, nu sunt n ntregime supuse degradrii complete pn la compuii finali
(CO2, H2O, NH3). O parte din ele sunt transformate n produi noi, mai mult sau mai
puin rezisteni la descompunerea de ctre microorganisme substanele humice.
62
Acestea se acumuleaz n cantiti mari ca rezerve, condiionnd proprietatea cea mai

important a solului fertilitatea. n felul acesta, pe lng aciunea lor de
descompunere a substanelor organice vegetale i animale, microorganismele
contribuie la formarea unor tipuri noi de substane organice. Datorit acestui
fenomen, paralel cu dezagregarea enzimatic a substanelor organice,
microorganismele din sol efectueaz sinteza unor compui noi care se acumuleaz
temporar n sol, formnd rezerve de C, N, P, S, K, etc.
Microorganismele solului particip nu numai la formarea substanelor humice
de rezerv, ci contribuie i la descompunerea lor lent, prin care asigur plantele cu
elemente indispensabile pentru noile sinteze organice.
Circuitul azotului n natur. Azotul este un element esenial pentru existena
vieii n biosfer, deoarece este inclus n structura tuturor proteinelor i a acizilor
nucleici. Dei azotul este prezent n natur n cantiti foarte mari, o bun parte din el
se gsete n forme inaccesibile plantelor (azotul molecular din atmosfer i cel din
componena substanelor organice azotate). El devine accesibil numai n rezultatul
transformrii acestora procese nfptuite de numeroase grupe de microorganisme.
Circuitul azotului n natur se desfoar pe parcursul a mai multor etape care
implic desfurarea unor multiple activiti biochimice, unele au loc n anaerobioz
iar altele n prezena oxigenului. Aceste etape sunt: fixarea N 2, amonificarea,
nitrificarea, denitrificarea.
Fixarea azotului molecular se poate realiza pe cale abiotic i biotic.
Pe cale abiotic fixarea se realizeaz prin iradieri, descrcri electrice i prin
intermediul precipitaiilor.
Pe cale biotic fixarea azotului molecular este un proces lent i continuu prin
care, sub aciunea a peste 100 genuri de diferite microorganisme, azotul gazos
atmosferic este transformat n forme fixe (NH4-, NO3-, NO2-), care sunt folosite de
plante i introduse n forme organice utiliznd energia obinut prin fotosintez.
Bacteriile care particip la aceast fixare au fost grupate astfel:
1. Bacterii fixatoare de N2 libere aerobe Azotobacter vinelandii, A. insigne,
A. macrocytogenes, A. mobile, A. fluminensis, Beijerinckia indica, Derxia gummosa,
Rhodospirillum sp., Rhodopseudomonas sp. etc., specii de cianobacerii din genurile
Nostoc, Anabaena .a.;
2. Bacterii fixatoare de N2 libere anaerobe - Clostridium pasteurianum,
Desulfovibrio desulfuricans, Desulfatomaculum sp., Methanobacillus sp. etc.;
3. Bacterii fixatoare de N2 care triesc n asociaie cu plantele. O important
mare o au speciile de bacterii ale genurilor Azospirillum, Bacillus, Klebsiella care
triesc n asociaie cu rdcinile unor graminee, actinomicete cu diverse plante
63
neleguminoase, precum i bacteriile de nodoziti din genul Rhizobium, care

formeaz simbioza cu plantele din familia Fabaceae.
Amonificarea const n mineralizarea azotului din substanele organice cu
eliminarea NH3. Substanele organice azotate reprezint peste 90% din rezervele
totale de N2 din sol.
Procesul de amonificare este precedat de descompunerea moleculelor proteice
prin hidroliz, cu ajutorul proteazelor extracelulare eliberate de numeroasele specii de
microorganisme aerobe i anaerobe dup schema:
Aminoacizii rezultai din aceast degradare ptrund n interiorul celulelor

bacteriene, unde sufer un proces de dezaminare, din care rezult NH 3 i acidul
organic corespunztor.
La nceputul procesului intervin bacterii aerobe obligate cum sunt: Bacillus
cereus var. mycoides, B. subtilis, B. thermoproteolyticus, Serratia marcescens,
Arthrobacter sp. etc. i specii facultativ anaerobe: Proteus vulgaris, Pseudomonas
fluorescens, Escherichia coli, Sarcina lutea etc.
Dup cteva zile intr n aciune specii anaerobe obligate: Clostridium
putrefaciens, C. perfringens i unele actinomicete Streptomyces violaceus i
Micromonospora chaleea, care ncep s predomine i fac ca degajarea de NH3 s fie
maxim.
Hidroliza ureei este realizat de un grup numeros de microorganisme capabile
s produc enzima ureaza: Achromobacter sp., Bacillus sp., Clostridium sp.,
Corynebacterium sp., Pseudomonas sp., Bacillus pasteuri, Micrococcus ureae,
Planosarcina ureae, unele actinomicete i ciuperci de mucegai.
Nitrificarea este un proces de oxidare a NH3 i a altor forme reduse ale N2
anorganic eliberate n sol n cursul procesului de amonificare, n nitrai care
reprezint forma cea mai uor asimilabil pentru majoritatea plantelor verzi.
Procesul de nitrificare se desfoar n dou faze: 1) Nitritarea, 2) Nitratarea.
n prima faz amoniacul este oxidat pn la acid azotos de ctre bacteriile din
genurile Nitrosomonas, Nitrosolobus, Nitrosococcus. Aceste bacterii sunt aerobe
stricte rspndite practic n toate tipurile de sol, dup tipul de nutriie sunt
chimiolitoautotrofe i n activitatea vital folosesc energia ce se elimin de la
oxidarea NH3.
n faza a doua acidul azotos acumulat este oxidat de ctre bacteriile din
genurile Nitrobacter, Bactoderma .a. pn la acid azotic.
64
Nitrificarea care reprezint a 3-a faz a circuitului azotului n natur, este un

proces de importan excepional, deoarece transform substanele azotate n forma
cea mai uor asimilabil de ctre plante.
n general numrul microorganismelor nitrificatoare este proporional cu
fertilitatea solului, putnd ajunge, n solurile fertile, pn la un milion de bacterii la
un gram de sol. Numrul mare de nitrificatori din solurile fertile, comparativ cu
solurile nelenite, se datoreaz i faptului c primele sunt lucrate i, respectiv, bine
aerate.
Denitrificarea. Nitraii acumulai n sol, ca rezultat al procesului de nitrificare,
sunt consumai de plantele superioare, iar o cantitate variabil este splat de apele de
precipitaii. O parte din nitrai sunt redui pn la azot molecular de ctre unele
microorganisme. Procesul reducerii nitrailor i nitriilor pn la azot molecular se
numete denitrificare.
Se deosebete denitrificare direct i indirect. Denitrificarea direct sau
biologic este provocat de bacteriile denitrificatoare Pseudomonas stutzeri, P.
denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Bacillus megaterium etc.
Denitrificarea reprezint un proces care nchide circuitul prin ntoarcerea N 2
molecular n natur. Reducerea nitrailor pn la azot gazos reprezint pentru solul
respectiv o pierdere real care poate ajunge pn la 120 kg N 2/ha/an. Denitrificarea
decurge intens n solurile tasate i cu exces de umezeal. n prezena O 2 bacteriile
denitrificatoare efectueaz procesul de respiraie. Pentru a preveni denitrificarea se
recomand a efectua desecarea solurilor mltinoase i afnarea la timp a celor tasate.
Circuitul sulfului n natur. Sulful este, de asemenea, un element important
din punct de vedere biologic. El intr n componena aminoacizilor metionina i
cisteina, a unor vitamine, glicozide, polizaharide, alcaloizi, etc. Transformarea
microbiologic a sulfului n sol decurge n trei faze principale:
1. Mineralizarea sulfului organic, ce se petrece paralel cu mineralizarea N i P
organic sub aciunea unor microorganisme ca: bacteriile Proteus vulgaris, Serratia
marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Clostridium sporogenes ce
activeaz n condiii anaerobe i de ctre unele ciuperci ca Scopulariopsis brevicaulis
i Aspergillus niger.
n cursul mineralizrii, S se elibereaz sub form de H 2S, CH3-SH
(metilmercaptan) sau de sulfat (SO42-).
2. Sulfoficarea, este procesul de oxidare a H 2S, S, S2O32- (tiosulfailor), SO32(sulfiilor) pn la acid sulfuric, respectiv sulfai. Aceast faz este produs de
sulfobacterii chimiolitoautotrofe din genurile Thiobacillus, Sulfolobus, Beggiatoa.
Mai este provocat de bacteriile purpurii din genul Chromatium i bacteriile verzi din
genul Chlorobium.
65
Sulful se acumuleaz n celulele microbiene sub form de incluziuni. n lips

de H2S, bacteriile oxideaz S din aceste incluziuni pn la H2SO4.
3. Desulfoficarea este procesul de reducere dezasimilatorie a sulfailor pn la
H2S. Acest proces are loc n condiii anaerobe i se datoreaz n primul rnd speciei
de bacterii Desulfovibrio desulfuricans.
Circuitul fierului n natur. Fierul n cantiti mici este necesar tuturor
organismelor vii. El intr n compoziia hemienzimelor, a hemoglobinei,
leghemoglobinei, reacioneaz cu unele substane organice i formeaz compui
compleci, numii chelai.
Mineralizarea fierului organic, decurge n paralel cu celelalte substane
organice. Fe se elibereaz sub form mineral bi- sau trivalent. Microorganismele
implicate n acest proces sunt bacterii din genurile Pseudomonas, Bacillus,
Corynebacterium, Mycobacterium etc., actinomicete din genurile Nocardia sau
Streptomyces, precum i ciuperci de mucegai.
Migrarea fierului n sol depinde de valoarea pH. n mediul alcalin neutru i
condiii aerobe oxidul de fier (II) este oxidat de oxigenul molecular n oxid de fier
(III). n mediul acid (pH mai mic de 4,5) oxidarea Fe 2+ este provocat de
ferobacteriile acidofile. Reprezentantul tipic al ferobacteriilor este Thiobacillus
ferrooxidans, care oxideaz practic toate mineralele sulfide. Oxidarea Fe 2+ n Fe3+
poate decurge i la reacionarea Fe2+ cu peroxidul de hidrogen eliminat de celulele
ferobacteriilor filamentoase i monocelulare din genurile Leptothrix, Siderocapsa,
Seliberia, Crenothrix .a. Ele neutralizeaz H2O2 i depoziteaz Fe3+ n capsul i pe
suprafaa celulelor.
Reducerea fierului trivalent se datoreaz unor bacterii facultativ sau obligat
anaerobe ca B. circulans, B. polymyxa, Enterobacter aerogenes, Clostridium
butyricum etc. Acestea n prezena substanelor organice ca glucoza reduc Fe3+ n
Fe2+, Fe3+ servind ca acceptor de electroni.
Circuitul fosforului n natur. Fosforul este un element absolut necesar
vieuitoarelor i intr n compoziia acizilor nucleici, a unor proteine, a unor compui
macroergici (ATP), a fosfolipidelor, a fosfozaharidelor, a fitinei, etc. Compuii
organici ai fosforului constituie pn la 85% din cantitatea total de fosfor din diferite
soluri.
Mineralizarea fosforului organic se desfoar n paralel cu mineralizarea
compuilor organici ai azotului (amonificarea) sub aciunea acelorai
microorganisme. Unul dintre microorganismele foarte active n mineralizarea
fosforului organic este Bacillus megaterium var. phosphaticus.
n urma mineralizrii compuilor organici fosforul se elibereaz sub form de
ortofosfat solubil, asimilabil de ctre plante i microorganisme. Totodat, ortofosfatul
66
solubil poate trece n ortofosfai de Ca, Fe, Al, Mg, Cu i Ni care sunt insolubili.
Aceti compui insolubili sunt mobilizai de ctre acizii produi de microorganisme i
de cei excretai de rdcinile plantelor. Aa de exemplu, acidul azotos i azotic
produi de microorganismele nitrificatoare, acidul sulfuric produs de
microorganismele sulfoficatoare, acidul carbonic i acizii organici produi de alte
microorganisme.
Transformarea meta-, piro- i polifosfailor este realizat sub aciunea unor
bacterii ca Pseudomonas fluorescens, Sporocytophaga cauliformis i a unor ciuperci
ca Aspergillus i Penicillium.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: baloane
Erlenmeyer, cutii Petri, anse, spatula Drigalschi, vase cilindrice de sticl, medii de
cultur (Vinogradski, Ashby, Beijerinck, bulion peptonat), hrtie de turnesol, hrtie de
filtru, difinilamin, colorani, etanol, exponate de plante fabacee cu nodoziti,
briceag, lame, reactive (Nessler, Griess, zinc-iod-amidon, hidroxid de fier, soluie de
acetat de plumb, H2SO4, K4(FeCN)6), ml, fn, bec de gaz sau spirtier, microscop.
Amonificarea substanelor proteice.
Obinerea culturii elective a bacteriilor amonificatoare
n baloanele Erlenmeyer de 100 ml se toarn cte 30-50 ml bulion peptonat, se
infecteaz cu sol sau gunoi de grajd, se astup cu un dop din vat nvelit cu tifon.
ntre gura balonului i dop se ntrete o fie de hrtie de turnesol, de culoare roie i
o fie de hrtie de filtru, muiat n soluie de acetat de plumb astfel, ca s nu se
ating de mediul nutritiv. Baloanele se incubeaz n termostat la temperatura de 30 oC.
Peste 3-5 zile de la incubare se identific produii intermediari i finali ai
amonificrii.
Studenii constat, c fia de hrtie de turnesol la degajarea amoniacului,
capt culoarea albastr, iar fia de hrtie de filtru, muiat n soluie de acetat de
plumb, la degajarea hidrogenului sulfurat devine neagr, ca rezultat al formrii
sulfurii de plumb.
Amoniacul degajat poate fi identificat cu reactivul Nessler. n mediul nutritiv
din baloanele Erlenmeyer se adaug cteva picturi de reactiv. n dependen de
concentraia amoniacului apare culoarea galben, oranj, sau roie-brun. Indolul
poate fi identificat dup mirosul neplcut.
Pentru separarea bacteriilor amonificatoare, n cutia Petri se toarn 10-15 ml de
mediu nutritiv solid, nclzit pn la 50 oC. Dup solidificare, se toarn 1 ml de mediu
lichid din balon, agitndu-l n prealabil pentru suspendarea microorganismelor.
Cutiile se incubeaz n termostat la temperatura de 25-30oC. Peste 3-4 zile pe
67
suprafaa mediului nutritiv din cutia Petri apar diferite colonii ale bacteriilor
amonificatoare.
La Bacillus mesentericus coloniile sunt fine, uscate, rugoase, uor se separ de
la substrat. Bacteria fnului (Bacillus subtilis) formeaz colonii uscate, fin rugoase,
catifelate, incolore sau roze, concrescute cu mediul de cultur (fig. 23). Bacillus
cereus formeaz colonii plate, rizoidale. La Achromobacter prodigiosum coloniile
sunt glabre sau granulate, roii-aprinse cu luciu metalic.
Studenii pregtesc frotiuri, le coloreaz cu fuxin i le studiaz n microscop
cu sistemul de imersie.
Obinerea culturii elective a bacteriilor nitrifiante
La separarea culturii pure a bacteriilor nitrifiante servete mediul nutritiv
Vinogradski, ce conine (g/l ap):
Pentru I faz (nitritarea): (NH4)2SO4 2,0; K2HPO4 1,0; MgSO4 0,5; NaCl
2,0; FeSO4 0,4; CaCO3 5,0.
Pentru II faz (nitratarea): NaNO2 1,0; Na2CO3 1,0; NaCl 0,5; K2HPO4
0,5; MgSO4 0,5; FeSO4 0,4.
Mediile se sterilizeaz n autoclav timp de 20 de minute la presiunea de 1
atm., apoi se toarn n baloanele Erlenmeyer, cte 40-50 ml i se infecteaz cu sol.
Baloanele se astup cu dopuri din vat nvelite cu tifon i se incubeaz n termostat la
temperatura de 30oC timp de 2-3 sptmni. Periodic mediul nutritiv se supune
analizei pentru identificarea nitriilor i nitrailor.
n faza I se determin prezena amoniacului cu reactivul Nessler i a acidului
azotos cu reactivul Griess sau zinc-iod-amidon.
Identificarea acidului azotos. n eprubet se ia 1-2 ml de mediu nutritiv pentru I
faz, se adaug reactivul Griess, se agit i se nclzete pn la fierbere. Reactivul
Griess este foarte sensibil fa de nitrii. n prezena acidului azotos la nclzire apare
culoarea roie. La adugarea reactivului zinc-iod-amidon n prezena acidului azotos
apare culoarea albastr-nchis.
Identificarea acidului azotic. n piulia de porelan se plaseaz cteva cristale
de difinilamin, se adaug H2SO4 concentrat. Cu bagheta de sticl se agit pn la
dizolvarea complet a difinilaminei, apoi se adaug mediu nutritiv pentru faza II. n
prezena acidului azotic apare culoarea albastr-nchis.
Despre concentraia nitriilor i nitrailor din mediul analizat studenii fac
concluzii reieind din intensitatea colorrii: (+) slab; (++) medie; (+++)
intens; (++++) foarte intens.
Varianta
Prezena
Prezena
Prezena
amoniacului
acidului
acidului
azotos
azotic
68
Faza I
nensemnat
+++
Faza II
++++
Morfologia bacteriilor nitrifiante se studiaz n preparate colorate cu fuxin n
sistemul de imersie al microscopului. n cmpul de vedere se observ celule ovale i
bacili scuri (fig. 24).
Fig. 23. Bacillus subtilis Colonii pe

geloza peptonat
Fig. 24. Bacterii nitrifiante:

1 Nitrosomonas;
2 Nitrobacter
Studierea bacteriilor azotfixatoare libere.

Pentru obinerea culturii elective a azotobacterului pot fi utilizate medii
nutritive artificiale neazotate: mediul agarizat Ashby, mediul de cultur Beijerinck
.a. Azotobacterul crete bine pe mediul Beijerinck ce conine (g/l ap): manit sau
glucoz 20; K2HPO4 0,2; CaCO3 5,0. Pentru a intensifica creterea
azotobacterului, la mediul nutritiv se mai adaug amestec de microelemente: H 2BO3
5g; (NH4)2MoO4 5g; KI 0,5g; NaBr 0,5g; ZnSO 4 0,2g; Al2(SO4)3 0,3g la 1 l
de ap.
Mediul de cultur se toarn cte 30 ml n baloane de sticl, apoi se infecteaz
cu sol. Baloanele se astup cu dopuri de vat i se incubeaz n termostat la
temperatura de 25-30oC timp de 7-10 zile. Pe suprafaa mediului apare o pelicul
alb-surie, care mai trziu devine brun.
Studenii pregtesc (din pelicula superficial) frotiuri colorate cu fuxin i le
studiaz n microscop cu sistemul de imersie. n preparat predomin diplococi,
nconjurai de capsula mucilaginoas (fig. 25).
69
Fig. 25. Azotobacter
Studierea bacteriilor de nodoziti

Studenii studiaz nodozitile diferitor plante fabacee pe exponate sau plane
i le deseneaz n caiete (fig. 26).
Fig. 26.Nodozitti pe rdcinile plantelor fabacee:

1 lupin; 2 lucern; 3 fasole; 4 mzriche
Pentru studierea bacteriilor de nodoziti mai potrivite sunt plantele: lupin,

fasole, trifoi. Cu briceagul se pregtesc seciuni fine din nodoziti, se plaseaz pe
lama port-obiect n pictura de ap, se acoper cu lamela i se studiaz n microscop
cu obiectivul 40x.
Pentru pregtirea frotiului, din nodozitile tiate se scobete cu acul de
preparare esutul bacteroid, se repartizeaz pe lam n pictura de ap, apoi se fixeaz
la flacra spirtierei i se coloreaz cu fuxin. n preparat se evideniaz bacili de
diferite dimensiuni (fig. 27).
Fig. 27. Bacterii de nodoziti (Rhizobium)
Separarea culturii pure a bacteriilor de nodoziti

Nodozitile se spal de sol cu ap distilat, se trateaz cu alcool etilic de 96%
i iari se spal. Dup dezinfectare una din nodozitile mai mari se trece n cutia
Petri i se strivete cu penseta n cteva picturi de ap steril. O pictur de
suspensie, cu bacterii de nodoziti, se trece n cutia Petri cu mediul de cultur solid i
cu spatula Drigalschi se repartizeaz uniform consecutiv n 3-4 cutii.
Pentru obinerea culturii elective a bacteriilor de nodoziti se folosete mediul
nutritiv, ce conine (g/l ap): extract de leguminoase 1000 ml; zaharoz 10g;
K2HPO4 1,0; MgSO4 0,3; agar-agar 15g.
70
Dup nsmnare cutiile Petri se incubeaz n termostat la temperatura de

o
30 C.
Din nodozitile de la mazre i trifoi coloniile bacteriilor apar n a 4-5 zi, din
cele colectate de la soia i lupin n a 9-10 zi. Ele sunt incolore, transparente, se
dezvolt la suprafaa i n interiorul mediului de cultur.
Studierea ferobacteriilor
n vase cilindrice de sticl se toarn ap, se adaug hidroxid de fier, puin ml
i puin fn (n prealabil fiert, ntr-o cantitate mare de ap). Vasele se las la
temperatura camerei. Peste cteva zile pe pereii acestora apar pete ruginii, care
treptat se extind, formnd un sediment compact, constituit din filamente ale
ferobacteriilor.
La ferobacteriile filamentoase ca Leptothrix ochracea, celulele individuale sunt
incluse ntr-o teac organic comun, n care se acumuleaz Fe(OH) 3. Pentru a
observa aceste celule asupra frotiului se acioneaz cu 1-2 picturi de H 2SO4 de 10%.
La tratarea cu o pictur de ferocianur de potasiu K4(FeCN)6 se formeaz sediment
albastru-nchis.
Din sediment se pregtesc frotiuri, care se coloreaz cu violet de genian i se
studiaz n sistemul de imersie al microscopului. Predomin bacteria Leptothrix
ochracea (fig. 28).
Fig. 28. Ferobacterii:

1 - Leptothrix ochracea; 2 Crenothrix polyspora; 3 - Gallionella ferruginea.
71

Tema: Transformarea compuilor carbonului n natur de ctre
microorganisme. Fermentaiile.
1. Rolul microorganismelor n circuitul carbonului n natur.
2. Caracteristica general a proceselor fermentative.
3. Esena i tipurile de fermentaie.
4. Fermentaia alcoolic. Chimismul fermentaiei alcoolice. Agenii cauzali i
caracteristica lor.
5. Fermentaia lactic. Chimismul fermentaiei lactice. Agenii cauzali i
caracteristica lor. Fermentaia lactic homofermentativ i heterofermentativ.
6. Fermentaia propionic. Chimismul fermentaiei propionice.
7. Fermentaia butiric. Chimismul fermentaiei butirice.
8. Fermentaia celulozic. Bacteriile celulozice mezo- i termofile.
9. Fermentaia acetic. Chimismul fermentaiei acetice. Caracteristica morfobiologic a bacteriilor acetice.
10. Fermentaia substanelor pectice. Agenii cauzali i caracteristica lor.
1. Studierea fermentaiei alcoolice. Efectuarea experienei.
2. Studierea fermentaiei lactice. Efectuarea experienei.
3. Studierea fermentaiei acetice. Efectuarea experienei.
Circuitul carbonului n natur. Carbonul reprezint unul din elementele
organogene mai importante. El intr n componena tuturor substanelor organice. Ca
surs primar de carbon pentru plantele verzi servete CO 2 din aer, coninutul cruia
constituie 0,03% din volumul total al gazelor i reprezint o mrime aproape
constant.
n circuitul carbonului se deosebesc 2 procese, legate de asimilarea i
eliminarea CO2:
1) fixarea CO2 de ctre plantele verzi i unele microorganisme i sinteza
substanelor organice. n calitate de surs energetic pentru ele servete lumina solar
(fotoautotrofe) sau energia reaciilor chimice (chimioautotrofe). n procesul de
fotosintez pe Terra se produc anual 33x1011 tone de substane organice;
2) mineralizarea complet a substanelor organice pn la produi finali cu
eliminarea CO2.
72
Degradarea glucidelor simple. Glucidele solubile sunt uor scindate de ctre

microorganisme pn la produii finali: CO2 i H2O. Etapele intermediare sunt
diferite n funcie de umiditate, prezena sau lipsa O 2, temperatura mediului i alte
condiii.
Astfel, n condiii de aerobioz, bacteriile formeaz acizii piruvic, lactic, acetic,
precum i acetaldehida, iar ca produi finali CO2 i H2O. n cazul interveniei
ciupercilor aerobe se produc acizii gluconic, citric, oxalic, fumaric, succinic, etc.
n anaerobioz bacteriile formeaz acidul lactic, hidrogenul, metanul i CO 2. n
urma aciunii fungilor anaerobi se produce acid fumaric i alcool.
Degradarea hemicelulozelor. Dintre hemiceluloze, mai rezistente la aciunea
microbian sunt galactanele, n timp ce xilanele i mananele sunt mai uor
metabolizate, fiind descompuse de ctre o microflor nespecific.
Microorganismele care descompun hemiceluloza se succed ntr-o anumit
ordine ncepnd cu specii nesporulate i sporulate ale genului Bacillus, cu cocobacili
i numeroase actinomicete. Dintre ciuperci n acest proces sunt implicate specii din
genurile Zygorhynchus, Cunninghamella, Rhizopus, Trichoderma, Humicola i
Aspergillus.
Descompun hemicelulozele i unele bacterii polifage: Alcaligenes sp.,
Pseudomonas sp., Bacillus circulans i Sporocytofaga myxococcoides.
Degradarea amidonului. n funcie de natura solului, de umiditate i de
temperatur, procesul de amiloliz se desfoar n mod diferit. Astfel, n solurile
aerate i semisaturate n umezeal, la temperatura de 18-20C intervin n degradarea
amidonului unele bacterii aerobe i facultativ anaerobe din genul Bacillus (B.
macerans, B. subtilis, B. cereus) i specii de ciuperci din genurile Aspergillus,
Fusarium, Rhizopus.
n aceleai condiii dar la o temperatur mai sporit pn la 33C intervin
bacteriile anaerobe din genul Clostridium cu speciile Cl. butyricum, Cl. perfringens i
Cl. pasteurianum.
Degradarea pectinei. La descompunerea substanelor pectice particip unele
bacterii, actinomicete i ciuperci, bacteriile anaerobe fiind agenii principali de
descompunere.
Bacteriile pectinolitice anaerobe sunt reprezentate prin speciile genului
Clostridium (Cl. aurantibutyricum Cl. felsineum). Dintre speciile aerobe de bacterii n
acest proces se ncadreaz Bacillus polymyxa, B. macerans i reprezentani ai
genurilor Pseudomonas, Arthrobacter i Corynebacterium. Actinomicetele
pectinolitice aparin genurilor Streptomyces i Micromonospora.
Dintre ciupercile pectinolitice mai active sunt speciile din genurile Aspergillus,
Fusarium, Alternaria, Botrytis, Monilinia etc.
73
Descompunerea celulozei. Celuloza constituie 45-80% din greutatea uscat a

resturilor vegetale i reprezint cea mai important parte a substanelor organice care
se ntorc n sol. Ea este foarte rezistent la degradare.
Bacteriile celulozolitice sunt reprezentate de Cytophaga hutchinsonii,
Sporocytophaga
myxococcoides,
Sorangium
compositum,
Polyanginum
celullosarum, Cellvibrio ochracea, Bacillus vagans, B. soli, precum i specii din
genul Cellulomonas.
Dintre actinomicetele celulozolitice mai frecvente sunt speciile Streptomyces
cellulosae, S. violaceus, Micromonospora chalcea i Nocardia cellulans.
Ciupercile celulozolitice sunt ageni activi ai descompunerii celulozei i mai
ales a celulozei din materialul lemnos. Dintre cele mai rspndite sunt speciile din
genurile Chaetomium, Aspergillus, Penicillium, Myrothecium i Trichoderma.
Degradarea anaerob a celulozei se realizeaz n special n zonele umede, mai
profunde ale solului, cnd resturile vegetale sunt n mase compacte, dense, neaerate.
Hidroliza celulozei decurge sub aciunea celulazelor i a celobiazei microbiene, cu
formare de glucoz, din descompunerea creia rezult acizi volatili ca formic,
butirici, acetic, acizi nevolatili ca succinic i lactic, precum i alcool etilic i gaze
(CO2, H2 i metan).
Bacteriile celulozolitice anaerobe din sol sunt reprezentate prin Bacillus
cellulosae hydrogenicus i Methylomonas methanica care formeaz metanul.
Descompunerea ligninei. Descompunerea ligninei are importan deosebit
pentru circulaia carbonului, ntruct ea reprezint cea de a doua surs a acestui
element n natur (25-30% din corpul plantelor lemnoase i 15-20% din cel al
plantelor ierboase). Lignina reprezint un complex vegetal rezistent i din aceast
cauz se acumuleaz n sol, lund parte la formarea humusului.
Agenii principali ai descompunerii ligninei sunt ciupercile din ord.
Agaricales, mai ales acelea ce produc putregaiul lemnului, care pot descompune i
celuloza.
Lignina se descompune mai repede n condiii aerobe, n care acioneaz
ciupercile i mai lent n anaerobioz cnd acioneaz mai mult bacteriile.
Caracteristica general a proceselor fermentative. Fermentaie se numete
procesul de descompunere anaerob a substanelor organice, provocat de diferite
microorganisme sau fermenii lor, n rezultatul cruia se acumuleaz produi ai
scindrii incomplete sau pariale. n rezultatul acestui proces microorganismele obin
energia necesar pentru activitatea vital.
n funcie de natura produilor acumulai se deosebesc diferite tipuri de
fermentare. Intensitatea proceselor fermentative depinde de particularitile
74
microorganismelor i condiiile de fermentare (aeraie, pH, temperatur, substrat

nutritiv).
Fermentaie alcoolic se numete procesul de descompunere anaerob a
glucidelor de ctre drojdii i fermenii lor pn la alcool etilic i CO 2 conform
ecuaiei sumare:
C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP
Produsul rezultat conine alcool n concentraie de 10-15%, precum i diveri
produi secundari aldehida acetic, glicerina, acizi organici i alcooli superiori. n
rezultatul distilrii se obine alcoolul brut n concentraie de pn la 96%.
Fermentaia alcoolic decurge activ n mediul slab acid (pH = 4-5), la
temperatura de 4-30oC i condiii anaerobe. n prezena O 2 randamentul alcoolului
scade cu circa 30%. Drojdiile rezist la concentraia etanolului de 12-15%. n mediul
alcalin se acumuleaz glicerina.
Fermentaia alcoolic poate fi spontan, produs de drojdiile slbatice,
prezente n natur, sau dirijat prin introducerea n materialul de fermentat a unor
tulpini de drojdii selecionate, ce au capacitate superioar de fermentaie. Aceste
tulpini de drojdii au capacitatea de a suporta concentraii mari de alcool (16-18%) i
de a consuma cantiti mari de glucide pentru sintezele lor proprii.
Drojdiile fermentaiei de suprafa Saccharomyces cerevisiae se dezvolt la
temperatura de 18-30oC. Ele provoac fermentarea zgomotoas, nsoit de degajare
de CO2 i formarea spumei abundente, fapt ce asigur meninerea lor ndelungat n
stare suspendat. Drojdiile S .ellipsoideus provoac fermentaia alcoolic la
temperaturi mai joase (4-15oC), din care cauz se menin n straturile inferioare ale
vaselor.
Fermentaie lactic se numete procesul descompunerii anaerobe a glucidelor
de ctre bacteriile lactice cu formarea acidului lactic conform ecuaiei:
C6H12O6 2C3H6O3 + 2ATP
Dup caracterul fermentrii bacteriile lactice se mpart n homofermentative
sau tipice (fermenteaz glucidele cu formarea unui singur produs acidul lactic
Streptococcus lactis, S. cremoris, Lactobacillus bulgaricus, L. acidophilus .a.) i
heterofermentative sau netipice, care, pe lng acidul lactic mai formeaz i ali
compui (acid acetic, etanol, glicerin, CO2 Lactobacillus brevis, L. fermentum,
Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacerium bifidum .a.).
Bacteriile lactice sunt imobile, grampozitive, asporogene, variate dup aspectul
lor morfologic. Se conin n lapte i produsele lactate, pe suprafaa plantelor, n sol,
tractul digestiv al omului i animalelor. n calitate de surs de carbon ele folosesc
mono- i dizaharidele (lactoza, maltoza, zaharoza). Sunt foarte pretenioase fa de
75
sursa de azot. Pentru dezvoltare necesit vitamine (din grupul B), aminoacizi, baze
azotate, sruri minerale.
Fermentaia acetic const n oxidarea alcoolului etilic n acid acetic sub
aciunea bacteriilor acetice:
C2H5OH + O2 CH3COOH + H2O + 117 calorii
Bacteriile acetice sunt mai puin sensibile la produsul activitii lor vitale
acidul acetic, dect alte organisme, i suport pn la 6-10 % acid acetic n lichidul de
fermentaie. n aceast fermentaie nu are loc o descompunere, ci o oxidare a
alcoolului etilic. De aceea, fermentaia acetic are loc n prezena aerului i n aceast
privin se aseamn cu respiraia. Spre deosebire de respiraie ns, produsele de
oxidare nu sunt CO2 i H2O, ci acidul acetic.
Bacteriile acetice aparin genurilor Acetobacter i Granulibacter, au aspect de
bacili, sunt asporogene, mobile sau imobile, chimioorganoheterotrofe, aerobe
obligate. Pe medii de cultur lichide formeaz pelicule superficiale netede, rugoase,
compacte sau fine. Sunt foarte pretenioase fa de vitamine, mai cu seam B5.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: baloane
Erlenmeyer, cutii Petri, tuburi de sticl, piuli de porelan, eprubete, anse, lame,
soluie zaharoz, cultura de drojdii, lapte proaspt, chefir, acidofilin, moare de varz,
bere sau vin acidulat, ap de var, hidroxid de bariu, H 2SO4 concentrat, K2Cr2O7,
amestec de alcool i eter, albastru de metilen, fuxina Pfeiffer, soluie saturat de
CuSO4, soluie alcoolic de tiofen, soluie Lugol, NaOH 0,1N, spirtier, microscop.
Studierea fermentaiei alcoolice.
n baloanele Erlenmeyer de 250 ml se toarn 50 ml de soluie de zaharoz de
15% i 1 g de drojdii. Cu o or pn la lecii drojdiile presate se piseaz n piulia de
porelan, apoi se adaug treptat soluie de zaharoz. Balonul se astup cu dop de
cauciuc perforat, prin care trece un tub de sticl ndoit (forma literei U), captul
cruia se introduce n eprubeta cu ap de var sau hidroxid de bariu.
Odat cu finisarea montrii instalaiei, procesul de fermentaie ncepe. Pentru
grbirea ei, se menine temperatura balonului Erlenmeyer la 30-35 oC, improviznd n
jurul acestuia o baie de ap nclzit sub un control termic permanent. Dup 30
minute ncepe s se degaj CO 2, iar la captul tubului ncepe s ias un ir uniform de
bule de gaz, care trec prin hidroxidul de bariu i l tulbur, formnd BaCO3.
Alcoolul elaborat n urma fermentaiei poate fi identificat prin reacia cu
K2Cr2O7. n soluia fermentat (din balonul Erlenmeyer) se pun cteva cristale de
K2Cr2O7 i se adaug cteva picturi de H2SO4 concentrat. Apare o culoare verde, ca
urmare a reducerii cromului formndu-se i aldehida acetic, decelabil dup miros,
conform reaciei:
K2Cr2O7+4H2SO4+3C2H5OHK2Cr2(SO4)4+3CH3CHO+7H2O
76
Alcoolul etilic poate fi pus n eviden prin distilare. Balonul cu soluia

fermentat se astup cu dop de cauciuc perforat, prin care trece un tub de sticl
ndreptat n sus cu lungimea de 40-50 cm i se nclzete pn la ferbere. La
apropierea surcelei mocninde de captul tubului vaporii se aprind i ard.
Studierea fermentaiei lactice.
n baloanele Erlenmeyer de 120 ml se toarn cte 50-100 ml de lapte proaspt,
se astup cu dop de vat i se incubeaz n termostat la temperatura de 30-35oC.
Rezultate bune se obin la nsmnarea laptelui cu cultura pur de bacterii lactice.
Peste 10-12 ore laptele se ncrete.
Pentru a pregti preparatul microbiologic, balonul Erlenmeyer se nclin, i din
zerul care se prelinge pe lng perete, se ia cu ansa o pictur, din care se face un
frotiu pe lama portobiect.
Dup ce s-a uscat frotiul la aer, se execut fixarea, turnnd pe lam un amestec
de alcool i eter n pri egale. Fixatorul se ine pe lam 1 minut. n acest timp, pe
lng fixarea cu alcool, se petrece i degresarea preparatului cu eter, proces
important, deoarece existena picturilor de grsime mpiedic observarea
microscopic. Colorarea microorganismelor se face cu albastru de metilen 1% sau
fuxin Pfeiffer. Se mai pregtesc frotiuri din chefir, acidofilin, moare de varz sau
castravei etc. (fig. 29, 30, 31).
Fig. 29. Microflora chefirului

Streptococcus lactis
Lactobacillus bulgaricus
Fig. 30. Microflora acidofilinei

Lactobacillus acidophilus
Streptococcus lactis
Pentru identificarea acidului lactic se efectueaz reacia cu tiofen.

ntr-o eprubet cu 1-2 ml de filtrat de lapte fermentat se adaug 5 ml H 2SO4
concentrat i 10 picturi de CuSO4 soluie saturat. Se nclzete la baia de ap 5
minute la 100oC i dup rcire se mai adaug 0,5-1 ml soluie alcoolic de tiofen de
0,2%. n prezena acidului lactic se obine o culoare roie-viinie. Reacia este
sensibil i specific.
Studierea fermentaiei acetice
77
n baloane Erlenmeyer se toarn cte un strat de bere sau vin acidulat cu acid
acetic de cel mult 0,5 cm grosime i se adaug putin zaharoz. Baloanele se astup
cu dopuri din vat i se incubeaz n termostat la temperatura de 30 oC. Peste cteva
zile la suprafaa mediului lichid apar pelicule membranoase superficiale formate din
bacterii acetice.
Dup aspectul acestor membrane i reacia lor cu soluia Lugol se pot
determina speciile care au provocat fermentaia. Astfel, pelicula uscat, rugoas, se
coloreaz n albastru la tratarea cu soluia Lugol, indic prezena speciei Acetobacter
pasteurianus. Dac pelicula este glabr, mucilaginoas i n contact cu iodul devine
galben, aceasta indic prezena bacteriei A. aceti (fig. 32). Prezena peliculei glabre,
mucilaginoase ce se ridic pe pereii vasului, iar la tratarea cu soluia Lugol devine
albastr indic bacteria Bacterium kutzingianum.
Din aceste pelicule superficiale se pregtesc frotiuri, care se coloreaz dup
metoda Gram. Bacteriile acetice sunt gramnegative, se coloreaz n zmeuriu.
Pentru identificarea acidului acetic ntr-o eprubet se toarn 5 ml de bere
acidulat, se adaug 1-2 ml de NaOH 0,1N i 1-2 ml de alcool etilic. n rezultatul
reaciei se formeaz esterul acetoetilic cu miros de par.
Fig. 31. Microorganisme

din moarea de varz
Lactobacillus fermentum
Fig. 32. Bacterii acetice

Acetobacter aceti
78

dintre microorganisme. Antagonismul
Tema: Relaiile
microbian.
Antibioticele.
1. Tipurile de relaii dintre microorganisme.
2. Relaiile simbiotice la microorganisme (metabioza, simbioza, comensalizm).
3. Relaiile concurente dintre microorganisme (antagonism, antibioz,
parazitism).
4. Antagonismul microbian. Metodele de studiere. Aplicarea practic.
5. Antibioticele. Clasificarea dup producent, spectrul i efectul de aciune
asupra celulei bacteriene.
6. Mecanismele de aciune a antibioticelor.
7. Antibioticele obinute din ciuperci.
8. Antibioticele sintetizate de actinomicete.
9. Antibioticele sintetizate de bacterii.
10. Substane antibiotice obinute din plante superioare.
11. Rezistena microbilor la antibiotice i cauzele apariiei ei.
12. Determinarea sensibilitii microorganismelor la antibiotice.
1. Studierea creterii microbilor antagoniti pe mediile de cultur solide n
cutiile Petri.
2. Determinarea sensibilitii microbilor la antibiotice prin metoda rondelelor.
Tipurile de relaii dintre microorganisme. Antibioticele
n mediul natural de trai sol, ap, n organismul omului sau plantelor,
microorganismele se dezvolt n comuniti microbiene complicate microbocenoze,
constituite din diferite specii, ntre care se stabilesc relaii determinate.
Coexistena mai multor specii de organisme, care n rezultatul dezvoltrii lor
evolutive au creat complexe poart denumire de simbioz. Relaiile dintre
organismele coexistente poart denumirea de relaii simbiotice. Acestea la rndul lor
pot fi clasificate n mai multe categorii (relaii interspecifice i intraspecifice; relaii
asociative i relaii concurente).
ntre populaiile ce coexist ntr-o microbocenoz se stabilesc conexiuni (relaii
interspecifice) ce determin att structura, ct i funciile biocenozei ca suprasistem
integrator. Cu ct conexiunile sunt mai diverse i variate, cu att va fi i biocenoza
79
mai complex i mai stabil. Relaiile intraspecifice sunt relaiile intrapopulaionale,

dintre indivizii aceleiai populaii.
Relaii asociative n natur printre microorganisme se ntlnesc destul de
frecvent. Din acest grup de relaii fac parte metabioza, simbioza i comensalizmul.
Metabioza reprezint relaii dintre dou specii de microorganisme, n care una
din specii creeaz condiii pentru dezvoltarea celeilalte, care este indiferent n raport
cu prima. A doua specie, de regul, continu procesul nceput de prima. De exemplu,
bacteriile amonificatoare particip n procesul de mineralizare a azotului din
substanele organice cu eliminarea NH3, astfel crend condiii favorabile pentru
dezvoltarea bacteriilor nitrifiante.
Simbioza reprezint relaii asociative, care stimuleaz i menin dezvoltarea
normal a microorganismelor. De exemplu, bacteriile lactice (Streptococcus lactis i
Lactobacillus caucasicus) i specia de drojdii Saccharomyces kefiri din componenta
gruncioarelor de chefir. Bacteriile lactice aciduleaz mediul, crend condiii
favorabile pentru dezvoltarea drojdiilor, iar ultimele sintetizeaz vitamine i
aminoacizi necesari bacteriilor lactice.
Comensalizmul reprezint o convieuire a indivizilor din diferite specii, n
cadrul creia nu este exprimat clar nici folosul i nici daunele aduse unele altora. De
exemplu, flora microbian din intestinul gros la om i animale.
n natur destul de frecvente sunt i relaiile concurente, cnd unele
microorganisme exercit o aciune defavorabila asupra altora.
Antagonism microbian reprezint relaie dintre microorganisme caracterizat
prin oprimarea activitii vitale a unei specii de ctre alt specie. Antagonismul s-a
format pe parcursul unei perioade ndelungate de evoluie n lupta continu pentru
sursa de nutriie i locul de existen a lor.
Antagonismul microbian se caracterizeaz prin sinteza i elaborarea de ctre
microbii antagoniti a unor substane chimice biologic active (acizi organici, alcooli,
enzime, H2O2, NH3) cu aciune antimicrobian selectiv fa de anumite specii.
Astfel, microflora normal din cavitatea bucal, nazofaringian, intestinal, precum i
de pe pielea omului posed o aciune antagonist fa de speciile patogene de microbi
(stafilococi, streptococi, ciuperci, bacteriile dizenteriei, febrei tifoide etc.).
Parazitismul relaii antagoniste extreme ntre dou microorganisme n care
agresorul crete i se multiplic utiliznd constituenii celulari ai victimei. Acest tip
de relaie de regul finalizeaz cu moartea victimei. Aa de exemplu relaia dintre
Bdellovibrio bacteriovorus i bacteriile gramnegative. B. bacteriovorus se ntlnete
n sol i n apele de canalizare. Este un endoparazit bacteriolitic, care cu ajutorul unor
metabolii ptrunde n interiorul celulei-gazd, unde dezorganizeaz structurile
80
celulare, digereaz coninutul ei intern pe care-l utilizeaz ca substrat nutritiv, crete

i se multiplic.
Antibioza are la baz producerea de ctre anumite microorganisme a unor
compui chimici specifici, care n concentraii mici au efect inhibitor sau letal asupra
altor microorganisme. Asemenea substane sunt antibioticele.
Antibioticele (de la grec. anti mpotriva, bios via) reprezint produse ale
activitii vitale a organismelor vii, care distrug sau inhib n mod selectiv creterea
microorganismelor.
Antibioticele pot aciona asupra microorganismelor bactericid sau
bacteriostatic. Aciunea bactericida a antibioticelor condiioneaz moartea
microorganismelor, iar cea bacteriostatic reine sau inhib nmulirea lor. Caracterul
aciunii depinde att de tipul antibioticului, ct i de concentraia lui.
Antibioticele se clasific dup indicii urmtori: sursele de obinere, structura
chimic, mecanismul i spectrul de aciune antimicrobiana, modul de producere.
Mecanismele activitii antimicrobiene a antibioticelor sunt foarte diverse:
unele deregleaz sinteza pereilor celulari bacterieni (penicilina, cefalosporinele),
altele frneaz procesele de sintez a proteinelor n celul (streptomicina, tetraciclina,
levomicetina), iar a treia categorie inhib sinteza acizilor nucleici n celule bacteriene
(rifampicina .a.).
Produceni de antibiotice sunt unele ciuperci de mucegai, actinomicete i
bacterii: Penicillium chrysogenum, P. notatum penicilina; P. griseofulvum
griseofulvina; Cephalosporium acremonium cefalosporina; Streptomyces nodosus
amfotericina B; S. erythreus eritromicina; S. fradiae neomicina; S. griseus
streptomicina; S. rimosus tetraciclina; S. orientalis vancomicina; S. mediterranei
rifamicina; Micromonospora purpurea gentamicina; Bacillus subtilis
bacitracina; B. polymyxa - polimixina B.
Substane antibiotice obinute din plante superioare. Este cunoscut c multe
plante superioare sintetizeaz substane volatile cu aciune antibiotic, numite
fitoncide. Ele protejeaz plantele de microorganismele fitopatogene. Fitoncidele
reprezint uleiuri eterice volatile, care sunt foarte instabile, ceea ce creeaz mari
dificulti n obinerea preparatelor de fitoncide n stare pur.
Fitoncidele au fost obinute din sucul de ceap, usturoi, frunze de eucalipt,
plantele de pojarni, obligean, din sucul de hrean, ridichea-de-lun, aloe etc.
Rezistena microorganismelor la antibiotice. n timpul tratrii cu antibiotice,
deseori se nregistreaz transformarea microorganismelor sensibile la antibiotice n
forme rezistente.
n majoritatea cazurilor rezistena bacteriilor este legat de capacitatea
bacteriilor de a sintetiza fermeni, care descompun unele substane antibiotice. De
81
exemplu, rezistena stafilococilor la penicilin se explic prin capacitatea lor de a

sintetiza fermentul penicilinaza, care descompune antibioticul. n acelai timp pentru
bacilul coli, proteu i alte bacterii din familia Enterobacteriaceae penicilinaza
reprezint un ferment constitutiv (permanent) i determin rezistena lor natural la
penicilin.
Eficiena terapiei cu antibiotice se determin, n special, prin gradul
sensibilitii bacteriilor la preparatul aplicat. Din aceast cauz se verific
sensibilitatea culturilor de microorganisme, eliminate de la bolnavi, la diferite
antibiotice, care se folosesc pentru tratament.
n procesul aciunii antibioticelor sunt posibile modificri ale proprietilor
morfologice, culturale i biologice ale bacteriilor; pot aprea forme-L ale bacteriilor.
Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: cutii Petri,
geloz peptonat, rondele mbibate cu antibiotice, cultura Bacillus subtilis B. cereus,
Sarcina lutea.
Studierea antagonismului microbian
n cutiile Petri se toarn 10-15 ml de mediu de cultur solid (geloz peptonat)
nclzit pn la temperatura de 45oC. Dup solidificare pe suprafaa mediului, pe o
fie lat se nsmneaz cu ansa bacteriologic cultura Bacillus subtilis (bacilul
fnului), iar perpendicular cu ea cultura B. cereus i Sarcina lutea. Cutiile se
incubeaz n termostat la temperatura de 25-28oC. La lecia urmtoare studenii
analizeaz rezultatele experienei. Ei constat, c bacilul fnului posed proprieti
antagoniste fa de celelalte dou specii, deoarece reine creterea lor n apropierea
acestor colonii. Creterea normal a lor se observ la o anumit distan de la
coloniile de Bacillus subtilis (fig. 33).
Determinarea sensibilitii microorganismelor la antibiotice prin metoda
rondelelor
Pe suprafaa gelozei peptonate n cutia Petri cu spatula sau cu ansa se
nsmneaz dens cultura cercetat. Apoi pe suprafaa nsmnat se fixeaz cu
penseta steril 5-6 rondele (la distana de 2-2,5 cm de la centrul cutiei i una de alta),
ce conin diferite antibiotice. Cutiile se ntorc cu fundul n sus i se termostateaz 1820 ore la temperatura de 37oC. Gradul de sensibilitate a culturii cercetate la
antibioticele folosite se determin dup mrimea diametrului zonelor sterile din jurul
rondelelor (fig. 34).
Diametrul zonei sterile
Gradul de sensibilitate
Zona steril n jurul rondelei lipsete tulpin rezistent
0-15 mm
tulpin slab sensibil
82
16-25 mm
mai mult de 25 mm
tulpin sensibil
tulpin foarte sensibil
Fig. 33. Antagonismul

microbian
Fig. 34. Determinarea sensibilitii

bacteriilor la antibiotice
83
REETE DE PREGTIRE A UNOR COLORANI, REACTIVE I SOLUII.

Albastru de metilen, soluie alcoolic saturat
Albastru de metilen
3g
Etanol de 96%
100 ml
Soluia este lsat 2-3 zile, apoi se agit bine de cteva ori i se filtreaz.
Albastru de metilen, soluie ap-alcool
Albastru de metilen, soluie alcoolic saturat 10 ml
Ap distilat
100 ml
Albastru de metilen, soluie alcalin (dup Loeffler)
Albastru de metilen, soluie alcoolic saturat 30 ml
Ap distilat
100 ml
KOH, soluie de 1%
1 ml
Albastru de metilen acetic (dup Neisser)
Albastru de metilen
0,1 g
Etanol 96%
2 ml
Acid acetic (glacial)
5 ml
Ap distilat
100 ml
Fuxin bazic, soluie alcoolic saturat
Fuxin bazic
10 g
Etanol
100 ml
Fuxin fenolic (fuxina Ziehl)
Fuxin bazic
1g
Etanol 96%
10 ml
Fenol cristalic 5 g
Glicerin cteva picturi
Ap distilat
100 ml
Fuxina, cristalele da fenol i cteva picaturi de glicerin se piseaz n piuli
pn se obine o mas omogen, adugnd n doze mici etanol. Apoi, continund
amestecarea, se adaug treptat ap distilat. Dup 2 zile, fiind inut la temperatura
camerei, colorantul se filtreaz. Timpul pstrrii este nelimitat.
Fuxina Pfeiffer
Fuxin fenolic
1 ml
Ap distilat
9 ml
Pentru lucru se recomand soluii proaspt pregtite.
Violet de genian fenolic
Soluia 1. Violet de genian
1g
Etanol
10 ml
Soluia 2. Fenol, soluia de 5% 100 ml
84
Dup dizolvarea complet a violetului de genian n etanol, soluiile se

amestec.
Violet de genian dup Siniov
Violet de genian
1g
Etanol
100 ml
Glicerin
5 ml
Colorantul este stabil i poate fi folosit timp ndelungat.
Conform metodei lui Siniov, cu colorantul pregtit, conform reetei indicate, se
mbib o fie de hrtie de filtru, care ulterior se usuc, se taie dup mrimea lamelei
i se pstreaz ntr-un borcan de culoare ntunecat i nchis cu capac.
Metilviolet, soluie apoas
Metilviolet
0,2 g
Ap distilat
100 ml
Vezuvin, soluie ap-alcool
Vezuvin
2g
Etanol 96%
60 ml
Ap distilat
40 ml
Amestecul componenilor se fierbe i dup rcire se filtreaz.
Eritrozin fenolic
Eritrozin
3g
Ap distilat 100 ml
Fenol cristalic 5 g
Dup dizolvarea eritrozinei i a fenolului n ap, amestecul, se las s se
limpezeasc i apoi colorantul este gata pentru lucru.
Mordantul. 12 g de tanin se dizolv la temperatura camerei n 48 ml de ap
distilat. La soluia obinut se adaug 30 ml de soluie saturat de sulfat da fier i 6
ml de fuxin (soluie alcoolic saturat). Reactivul obinut se filtreaz i se pstreaz
n borcane nchise ermetic Mordantul este gata dup 2-3 zile i poate fi folosit timp
da cteva luni. Se folosete pentru evidenierea flagelilor.
Soluia Lugol
Iod cristalic
1g
KI
2g
Ap distilat 300 ml
ntr-o piuli se introduc cristale de iod i KI, se piseaz, se adaug 1 ml de ap
distilat i, continund frmiarea cristalelor, se mai adaug 5 ml de ap. Soluia
obinut se trece ntr-un vas i se adaug ap pn la volumul total da 300 ml. Durata
pstrrii soluiei Lugol este de 30 de zile. Se pstreaz n vase ntunecate i nvelite
cu hrtie neagr.
85
Soluie de tu
Tuul lichid este diluat cu ap de robinet 1:10, apoi, fiind turnat n eprubete, se
sterilizeaz n autoclav la presiunea de 0,5 atm. Soluia se las pentru sedimentare
timp da 2 sptmni, dup care tuul este bun pentru ntrebuinare. Se folosete la
studierea microorganismelor capsulate.
Rou neutru
Se pregtete soluia apoas de rou neutru de 1-5%. Se pstreaz ntr-un vas
ntunecat i se folosete la colorarea microorganismelor vii. Nu se pstreaz timp
ndelungat.
Zinc-iod-amidon
4 grame de amidon se piseaz n piuli ntr-o cantitate mic de ap i se
nclzete pn la fierbere, apoi se adaug 20 g de ZnCl 2 i 100 ml de ap. Amestecul
se fierbe pn la dizolvarea amidonului, se adaug 2 g de ZnI 2 i ap pn la volumul
de 1 l. Soluia se pstreaz n vase de sticl ntunecat.
86
Bibliografie
1. Anghel I., Voica C., Toma N., Cojocaru I. Biologia i tehnologia drojdiilor.
Ed.Tehnic, Bucureti, 1998.
2. Buiuc D., Negut M. Tratat de microbiologie clinica, ed. II. Editura Medicala,
Bucuresti, 2008.
3. Cerkes F., Bogoiavlescaia L., Belskaia N. Microbiologia. Chiinu, tiina,
1994.
4. Baraculina N., Caraeva E. Microbiologia. Chiinu, Lumina, 1983.
5. Dicusar M. Practicum la microbiologie. Tiraspol, CEP al USCN, 1994.
6. Eliade Gh., Ghinea L., tefanic Gh. Bazele biologice ale fertilitii solului. Ed.
CERES, Bucureti, 1983.
7. Galechi P., Buiuc D., Plugaru . Ghid practic de microbiologie medical.
Chiinu, tiina, 1997.
8. Grati V. Citologie general partea I-a. Chiinu, Prut Internaional, 2006.
9. Grati V., Pulbere E., Chiriac E., Grama O. Citologie general. Compendiu de
lucrri practice. Chiinu, Prut Internaional, 2007.
10.Hatman M. Microbiologie. Lucrri practice. Universitatea Agronomic Iai.
Centrul de multiplicare, Iai, 1990.
11.Hatman M., Ulea E. Microbiologie. Curs. Universitatea Agronomic Iai.
Centrul de multiplicare, Iai, 1993.
12.Mihescu Gh., Gavril L. Biologia microorganismelor fixatoare de azot. Ed.
CERES, Bucureti, 1989.
13.Piatkin Gh., Krivoein Iu. Microbiologie cu virusologie i imunobiologie.
Chiinu, Lumina, 1993.
14.Rudic V. Indicaii metodice pentru lucrri de laborator la microbiologie.
Chiinu, USM, 1991.
15.Zarnea Gh. Tratat de microbiologie general. Ed. Academiei Romne,
Bucureti, Vol. I - 1983, Vol. II - 1984, Vol. III - 1986, Vol. IV - 1990,Vol.V 1994.
16. .., - .., ..
. , -: ,
1984.
17. .. , , .
, -: . 2005.
18. .., .. . 4- . , ,
2003.
19. .. ; . , , 2003.
87
20. .., .. . : -
, 1999.
21. .. . .
, 1987.
22. .. : .
. , , 2007.
23. .., .. .
.
, , 2002.
24. .., .., ..
. , , 2005.
25., .. . ,
. 2008.
26. .., .. . ,
-, 2001.
27. .., .. ,
:
. --, , 2002.
28. ( .
.., 3- ). , - , 1995.
29. .., .., ..
. - , , 2001.
88

Compendiu Microbiol

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Compendiu Microbiol

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Boris Nedbaliuc

Universitatea de Stat din Tiraspol, Chiinu, str. G. Iablocichin 5

Obiectul i subdiviziunile microbiologiei

Microbiologia vegetal se ocup cu microorganismele patogene pentru plante,

experimental, c un lichid supus fierberii i nchis ermetic se conserv indefinit, fr

mult evoluia i terapeutica bolilor infecto-contagioase, deschiznd era descoperirii

Lucrare de laborator nr. 1

- de mbrcat un halat de laborator dintr-un material neinflamabil;

ptrat, prevzut n partea central cu un orificiu, prin care ptrunde fasciculul de

Fig. 1. Microscoape optice: A MBR 1; B Biolam:

Oglinda servete la orientarea luminii prin condensor i orificiul msuei spre

Sistemul de observare, alctuit din obiective i oculare, este sistemul principal

Grosismentele dintre diferite oculare i obiective

Reguli de utilizare a microscopului i consecutivitatea examinrii preparatului la

Lucrare de laborator nr. 2

Poziia microorganismelor n sistemele de clasificare a lumii vii

coloniale, cu excepia actinomicetelor, care au o organizare de tip micelial. Modul de

pentru taxonomie. La unele bastonae extremitile sunt rotunjite (ex. Escherichia

Fig. 2. Formele principale de bacterii: 1 monococi; 2 diplococi; 3 tetracoci; 4

Bacteriile spiralate se mpart n: vibrioni - bacterii cu form de virgul (ex.

acoper preparatul cu o lamel curat, evitndu-se formarea de bule de aer. Se

Fig. 3. Saccharomyces cerevisiae: 1 pseudomiceliu; 2 celul separat; 3,4 - nmugurirea

Fig. 4. Morfologia talului i stadiul conidial la ciupercile de mucegai: A aspect

Metodica de pregtire a frotiului i metoda simpl de colorare

Fig. 5. Etapele pregtirii frotiului

Uscarea frotiului. Frotiurile subiri se usuc repede la temperatura camerei,

Lucrare de laborator nr. 3

microcorpii, centrul celular). La bacteriile fotoautotrofe aparatul fotosintetic este

Fig. 6. Prezentarea schematic a structurii celulei bacteriene: 1 peretele celular; 2

La toate speciile bacteriene, n structura peretelui intr un component

Nucleoidul sau substana nuclear a celulei reprezint aparatul ereditar al ei.

decurs de 4-5 ore, transformndu-se n celule vegetative. ntr-o celul bacterian se

2. Frotiul se trateaz cu soluia Lugol 1 min. Nesplnd frotiul, soluia se

Lucrare de laborator nr. 4

5. Studierea microorganismelor n stare vie metoda picturii strivite i

ntr-o pictur de tu, diluat de 10 ori cu ap distilat, pe lama portobiect se

Fig. 7. Celule de bacterii cu

Fig. 8. Formarea sporilor la

Fig. 9. Preparatul pictur suspendat

Lucrare de laborator nr. 5

Metode de sterilizare utilizate n microbiologie

Controlul eficienei sterilizrii prin autoclavare este realizat adesea cu ajutorul

Fig. 10. Autoclav orizontal automat, model SA-300H

Fig. 11. Cuptor-etuv pentru sterilizare

Fig. 12. Dispozitive pentru sterilizarea prin filtrare

Sterilizarea cu ajutorul radiaiilor

Lucrare de laborator nr. 6

Un mediu de cultur reprezint un substrat nutritiv complex, steril, care trebuie

Hidrolizatele sunt peptone obinute n urma aciunii compuilor anorganici

Materiale necesare pentru efectuarea lucrrii de laborator: cultur

Fig. 13. Eprubete cu mediul de cultur (geloz peptonat) nclinat

Metodica de pregtire a bulionului peptonat i a gelozei peptonate

n cazul n care nu exist medii de cultur pulverulente deshidratate, procurate

nsmnarea cu ansa bacteriologic

Lucrare de laborator nr. 7

8. Scindarea glucidelor de ctre microorganisme n mediul Hiss.

pn la dop. Suprafaa mediului se acopere cu parafin. Coloniile apar n adncul

Fig. 15. Tuburi Weinberg: 1 tuburi sterile pregtite pentru nsmnarea

Fig. 16. Cultivarea microorganismelor anaerobe n cutii Petri:

nlturarea oxigenului pe cale mecanic se efectueaz n anaerostate aparate

Fig. 17. Eprubete pentru cultivarea microorganismelor anaerobe:

Pot fi folosite i exicatoare, n care se plaseaz cutiile Petri cu cultura

Fig. 18. Exicator.