ncadrarea n clasa de compui i structura clorofilei [1] Clorofila, hidrocarbura aromatic policiclic cu nuclee condensate, este un pigment specific

vegetalelor verzi, care ndeplinete un rol esenial n fotosintez. Are structura semntoare hemului, dar conine magneziu n loc de fier. Clorofila prezint patru nuclee pirolice (I, II, III, IV) unite n centru printr-un ion de magneziu, prin 2 valene i prin 2 legturi fizice. Toate acestea formeaz mpreun un nucleu porfirinic. n macromolecul apare i un homociclu pentanonic acid (V). Cu cifre arabe, de la 1 la 8, se noteaz, n sensul acelor de ceasornic, punctele externe ale celor 4 inele pirolice.

Structura general a clorofilei Nucleul porfirinic mpreun cu homociclul pentanonic formeaz doar o parte a clorofilei, care poart numele acid clorofilinic sau clorofilin. n punctul 7, de fapt, clorofila se continu printr-o prelungire molecular monocatenar numit fitol. Fitolul este monoalcoolul unei hidrocarburi superioare.

Componentele structurale (acidul clorofilinic i fitolul)

Ca i n cazul hemului, clorofila nu se afl liber, ci se combin cu o protein numit plastina, mpreun cu care realizeaz cloroplastina, un compus asemntor ca structur cu hemoglobina.

Structura clorofilei a

Structura clorofilei b

Structura clorofilei d

Structura clorofilei c1

Structura clorofilei c2

Tabel 1. Structura chimic a clorofilei [2]

Clorofila a Formula molecular Radicalul C2 Radicalul C3 Radicalul C7 Radicalul C8 Clorofila b Clorofila c1 Clorofila c2 Clorofila d Clorofila f

C55H72O5N4M C55H70O6N4Mg C35H30O5N4Mg g -CH3 -CH=CH2 -CH3 -CH2CH3 -CH3 -CH=CH2 -CHO -CH2CH3 -CH3 -CH=CH2 -CH3 -CH2CH3

C35H28O5N4Mg

C54H70O6N4Mg

C55H70O6N4Mg

-CH3 -CH=CH2 -CH3 -CH=CH2

-CH3 -CHO -CH3 -CH2CH3

-CHO -CH=CH2 -CH3 -CH2CH3

Radicalul C17

-CH2CH2COOCH2CH2COO -CH=CHCOOH Phytyl -Phytyl SImpl Simpl Dubl

-CH=CHCOOH

-CH2CH2COOPhytyl

-CH2CH2COOPhytyl

Legtura C17C18 Rspndire

Dubl

Simpl

Simpl

Universal

Majoritatea plantelor

Diferite specii de Diferite specii de Cianobacterii alge alge

Cianobacterii

Surse de clorofil Clorofila se gsete n toate plantele verzi, de exemplu n plantele cu frunze verzi care se gsesc n grdin (salat, ptrunjel, broccoli etc.), n alge i n numeroase alte plante verzi ( lucern, urzic etc.). Concentraiile tipice ale clorofilei sunt cuprinse mtre 0,1 i 0.3% din greutatea proaspt a frunzelor. [3] Tabel 2.Distribuia clorofilelor la diverse organisme [3] Grupul Alge: Cyanophyta Rhodophita Pyrrophyta Baxxillariophyta Phaeophyta Chrysophyta Xanthophyta Euglenophyta Chlorophyta Cryptophyta Plante vasculare Briofite clorofila a b + + + + + + + + + + + + c d

+ + + + + + + +

Rolul clorofilei n fotosintez Clorofila este una dintre substanele fundamentale ale Terrei, prezena sa n celulele plantelor i algelor, la nivelul cloroplastelor energetic i respiratorie aproape tuturor celorlalte organisme de pe Terra. Graie clorofilei, plantele verzi sunt organisme autotrofe, iar fotosinteza este cel mai important proces biochimic de pe Pmnt. Orice organism de pe Terra (cu excepia unor bacterii chemosintetizante) care nu este capabil s-i produc singur substane organice din substane minerale, triete, direct sau indirect din sintezele clorofilei, deci pe seama ei. Practic, viaa tuturor animalelor i oamenilor atrn de aceast molecul. Fotosinteza reprezint procesul de utilizare a energiei solare pentru activarea reaciei chimice ntre dioxid de carbon i hidrogenul din componena apei, pentru sinteza compuilor organici i eliberarea oxigenului.

Utilizrile clorofilei n tratarea bolilor [4] Clorofila prezint efecte i asupra organismului uman. Extern, acioneaz ca dezodorizant, dezinfectant i tonic cutanat iar intern, stimuleaz respiraia, ajut la epurarea reziduurilor i contribuie la combaterea anemiei. 1. Anemia Buturile bogate n clorofil reprezint unul dintre cele mai bune stimulente pentru refacerea globulelor roii. Datorit compoziiei foarte asemntoare cu aceea a hemoglobinei, precum i prin faptul c aceste buturi se absorb cu extrem de mare uurin n organism, un tratament de 1-2 luni cu elixir verde poate modifica radical n bine starea celor care sufer de anemie. Se mai recomand consumul de frunze de elin, curele cu verdeuri de 2-3 sptmni, butura din mldie de gru sau ovz, frunzele de ptrunjel i salat consumate ca atare sau sub form de macerat. 2. Intoxicaiile lente datorate alimentaiei greite, colita de putrefacie Mncarea gtit, precum i alimentele moderne (conservate, cu conservani sau colorani sintetici) se descompun (mai plastic spus se stric) n intestin mai repede dect vegetalele naturale. n intestin, carnea putrezete i se degradeaz mai repede dect orice alt aliment. Pentru cei mai muli dintre oameni, dup cteva zeci de ani de via colonul este deja mult ncrcat cu sedimente ce nu pot fi eliminate, constituind o continu surs de toxicitate a corpului. Verdeurile, germenii, legumele i fructele proaspete, precum i buturile verzi, care sunt adevrate concentrate de clorofil, prin aciunea lor drenoare i prin efectele antiseptice i antiputride stopeaz i elimin problemele generate de o astfel de alimentaie. 3. Afeciunile ficatului (hepatita cronic i acut, ciroza hepatic) Se recomand extractele lichide (realizate prin metoda prezentat mai sus) din urzic i ppdie. Coninutul n fier i potasiu al acestora, precum i valenele lor regenerante vor

determina efecte notabile n cazurile unor sechele post-hepatice. Alte plante bogate n clorofil indicate n aceste boli sunt: brusturele, sparanghelul, frunzele de elin. 4. Mirosurile corporale neplcute Sunt eliminate cu rapiditate prin programul rapid de purificare a organismului. Dintre cele mai eficiente surse de clorofil sunt mldiele proaspete de cereale, n special cele de gru i ovz. Acestea se recolteaz atunci cnd au dimensiunea de 10-15 cm i se prepar n modul prezentat mai sus. 5. Tulburrile de ciclu menstrual, eczeme care apar pe fondul dezechilibrelor endocrine, acneea n toate formele n special ciclul menstrual lung i dureros, hemoragiile uterine i tulburrile gonadelor i cortico-suprarenalelor care au tendina de a reveni i de a rezista tratamentelor clasice, pot fi mult ameliorate prin consumarea zilnic a unei cantiti de 1-1,5 litri de macerat vegetal proaspt timp de minim 3 sptmni. Ca o alternativ, se recomand realizarea unei cure pe baz de sucuri i cruditi, cur ce trebuie s dureze o perioad de minim 2-3 luni de zile. 6. Gastrita, ulcerul gastric i alte afeciuni ale stomacului Studii recente realizate n Germania pe zeci de pacieni suferinzi de ulcer gastric au evideniat faptul c extractele cu clorofil pot accelera foarte mult procesul de regenerare i nsntoire. Diminuarea considerabil a durerilor s-a produs ntr-un interval cuprins ntre 24 i 72 de ore de la administrarea extractelor, iar la 78% dintre pacienii ce au participat la experiment, ulcerele s-au vindecat complet ntr-o perioad cuprins ntre 2 i 7 sptmni de la nceperea tratamentului intensiv. 7. Rnile i infeciile cu vindecare dificil nc din anii 50, numeroase laboratoare testau capacitatea clorofilei de a distruge prompt germenii nedorii, constatnd c bacteriile nu pot supravieui n contact cu clorofila. Sa remarcat c folosirea extractelor cu clorofil, inclusiv n uz extern conduce la reducerea durerii, diminuarea inflamaiilor i eliminarea mirosurilor neplcute cauzate de unele infecii (mai ales cele dentare). Cercetrile n aceast direcie au evideniat efecte notabile n ameliorarea infeciilor vaginale, rectale, n tratarea sinuzitelor cronice i acute i chiar n infeciile unor esuturi din vecintatea inimii. Buturile verzi, chiar dac nu sunt recomandate ca remediu unic, pot ajuta la refacerea mai rapid a esuturilor i pot accelera mult vindecarea lor. Rezultate notabile au fost obinute cu frunzele proaspete de ptrunjel, elin, varz de Bruxelles, sucul de orz verde (preparat din plant atunci cnd aceasta atinge nlimea de 20-30 de cm). n 1980, dr. Chiu Nan Lai, de la Universitatea din Texas meniona ntr-un raport faptul c att clorofila, ct i ali nutrieni care se gsesc n alimentele verzi reprezint veritabile bariere de protecie mpotriva chimicalelor toxice i radiaiilor. El a constatat c extractele realizate din mldie de gru i alte vegetale de culoare verde, stopeaz efectele mutagene i generatoare de cancer ale mai multor substane chimice recunoscute ca fiind carcinogene. n plus, cercetri mai recente realizate n mai multe laboratoare din lume au evideniat faptul c vegetalele verzi (proaspete) i extractele naturale bogate n clorofil reprezint adevrai

ageni anti-oxidani care diminueaz ntr-o msur considerabil efectele agresiunilor produse asupra organismului de ctre poluare, fumul de igar, alimente prjite excesiv, etc. A. Extracia i determinarea clorofilei [5] n funcie de cantitatea de esuturi din plant care necesit a fi extrase, se poate alege extracia "macro" (> 150 mg greutate n stare proaspt) sau "micro" (diametru disc frunze de 1.0 cm). Extracia macro Funzele se taie n buci pentru a obine un eantion reprezentativ i pentru a determina greutatea ( 150 mg) i zona ( 8 cm2) ct mai rapid posibil, apoi se pun ntr-un mojar ce n prealabil a fost pus n ghea. Se adaug n mojar nisip de cuartz, civa ml de aceton 80% i metanol (nu mai mult de 10 ml), care au fost rcite nainte n frigider sau n ghea. Acestea se piseaz pn la formarea unei suspensii omogene. Suspensia se pune ntrun tub de centrifugare mare unde se centrifugheaz timp de aproximativ 5 minute la viteza maxim (4500 rpm - 2649 g) pentru ca apoi produsul s fie decantat ntr-un balon cotat de 25 ml. Produsul se extrage cu 5 ml aceton 80% i metanol i se centrifugheaz din nou la 3000 rpm (1250g), timp de 5 minute. Procedeul se repet pn cnd culoarea verde al extractului dispare (nu trebuie s se adauge mai mult de 25 ml aceton i metanol, altfel balonul cotat este prea mic). Probele se pregtesc i se las s se inclzeasc uor dup ce au fost scoase din ghea, se pstreaz la ntuneric. Supranantul se pune n balonul cotat i se aduce la semnul de 25 ml folosind aceton 80% i metanol. Extractul de clorofil este pregtit pentru a fi msurat n spectrofotometru. Extracia micro Se calculeaz zona exact a frunzei ce urmeaz a fi tiat pentru realizarea experimentului i se decuperaz cu atenie in forma de cerc ( aria cercului= r2). ntr-un mojar se pune materialul peste care se adaug mai puin de 5 ml de aceton 80% i metanol i se mojareaz folosind pistilul pn se formeaz o suspensie omogen. Aceasta se pune ntr-un tub de centrifugare cu mai puin de 10 ml de aceton 80% i metanol. Se centrifugheaz aproximativ 5 minute (4500 rpm 2649 g) i se decanteaz supranatantul ntr-un balon cotat de 10 ml. Supranantul se aduce la semnul de 10 ml cu aceton 80% i metanol. Balonul se pune ntr-o cutie special impenetrabil de lumin. Extractul de clorofil este pregtit pentru a fi msurat n spectrofotometru. Determinarea absorbiei de aceton 80% a extractului Absorbia extractului se msoar cu un spectrofotometru la lungimile de und 663, 646 i 710 nm. Absorbia 0 se determin la fiecare lungime de und. Lungimea de unde de 710 nm este folosit pentru a determina posibila absorbie a compuilor care ar putea interveni n msurarea clorofilei. Pentru a afla coninutul total de clorofil din prob este suficient absorbia la 652 nm.

Determinarea absorbiei de metanol a extractului Absorbia extractului se msoar cu spectrofotomentru prin luarea spectrului ntre undele de frecven 750 nm i 640 nm. Dup ce se ia spectrul unui eantion se afl maxima pentru clorofila a prin setarea spectrofotometrului, acesta fiind aproximativ 665.2 nm. Pentru a calcula lungimea de und necesar aflri clorofilei b se scade din ultima lungime de und citit 13.2 nm. Se utilizeaz din nou opiunile din meniu pentru a ajunge la punctul pentru a se calcula absorbia. Calcule Extract cu aceton 80% Concentraia n extract (mg l -1) [Chl a ] = 12.21 * (A 663 - A 710 ) - 2.81 * (A 646 - A 710 ) [Chl b ] = 20.13 * (A 646 - A 710 ) - 5.03 * (A 663 - A 710 ) [Chl a+b ] = 7.18 * (A 663 - A 710 ) + 17.32 * (A 646 - A 710 ) sau [Chl a+b ] = 27.80 * (A 652 - A 710 ) Concentraia n frunze: [Frunze] = ((C * extras Vol extract) / DW frunze)

Extractul cu metanol Concentraia n extract (mol l -1 ) Chl a = 18.22 * A peak Chla - 9.55 * A peak Chla - 13.2nm Chl b = 33.78 * A peak Chla - 13.2 nm - 14.96 * A peak Chla Chl a+b = 24.23 * A peak Chla + 13.2nm + 3.26 * A peak Chla Concentraia n extract (mg l -1 ) Chl a = 16.29 * A peak Chla - 8.54 * A peak Chla - 13.2nm Chl b = 30.66 * A peak Chla - 13.2 nm - 13.58 * A peak Chla Chl a+b = 22.12 * A peak Chla - 13.2 nm - 2.71 * A peak Chla

B. Extracia i purificarea clorofilei a din Spirulina maxima [6] Procedura de extracie ntr-un balon Erlenmeyer de 250 ml se adaug 5 g de Spirulina maxima, apoi se amestec cu atenie cu 50 ml de CH2Cl2 la temperatura camerei. Suspensia se agit timp de 20

min apoi se filtreaz prin hrtie de filtru dubl pstrnd filtratul. Reziduurile solide se mai supun de 3 ori aceleai operaii cu CH2Cl2 i se combin cu primul filtrat. Produsul obinut se pune n evaporatorul rotativ i se concentreaz pn la un volum final de aproximativ 5 ml. n acest caz pe lng clorofil mai sunt extrai i ali pigmeni, cum ar fii -caroten i xantofile. Pentru comparaia cu urmtorii produi ce urmeaz s fie purificai n continuare se face o analiz UV a extractului, dilund o pictur de extract n 4 ml de CH2Cl2 (Figura 1).

Figura 1. Spectrele de absorbie ale pigmenilor din cloroplaste n diferite radiaii ale luminii [7] Purificarea extractului i analiza produsului Purificarea extractului se realizeaz pe o coloan de gel de siliciu (200-400 ochiuri, diametru de 2 cm, nltime de 15 cm) umplut cu toluen ntr-o capel de epuizare. Prezena luminii n mediul n care se realizeaz cromatografia poate induce degradarea parial a clorofilei a, cu toate acestea, timpul necesar procesului (4 h) este relativ scurt i nu implic pierderi mari. Se recomand a nu se utiliza nici un fel de iluminare intern a capelei de epuizare pe parcursul elurii. Eluarea se realizeaz cu acelai eluent pe coloan (toluen) pentru a elimina benzile galben i portocaliu, beta-caroten i xantofil, aceast etap avnd nevoie de puin mai mult de 150 ml de toluen. Apoi se elueaz cu CH2Cl2 pentru a se obine o fraciune verde/albastru corespunztoate clorofilei a. (Figura 2). Aceast fraciune bogat n clorofila a (C55H72N4O5Mg) se caracterizeaz prin UV n CH2Cl2 (Figura 2, (nm): 413, 506, 539, 610 i 668) prin diluarea a 1-2 picturi din fraciunea colectat n 4 ml CH2Cl2. n continuare toat fraciunea este supus concentrrii prin eliminarea cu solvent sub presiune redus, iar proba astfel obinut este depozitat n ntuneric pentru a preveni procesele de auto-oxidarea. De asemenea, se realizezeaz analiza prin spectrofotometrie n UV a fraciunii eluate n toluen (bogate n caroten i xantofite). Suprapunerea spectrelor n UV a extractului

brut, a carotenoizilor i a clorofilei a este o bun modalitate de a indica compoziia extractului.

Figura 2. Procesul de purificare al clorofilei a pentru cromatografia pe coloan [6] Aa cum se poate observa n Figura 1 se poate observa ca profilul spectrului Uv=V al extractului este egal cu cel al clorofilei a izolate, artnd c marea parte a extractului este format din acest pigment. Se remarc faptul c coeficienii molari de absorbie ai clorofilei i a carotenoizilor sunt de acelai ordin de mrime (1 - 1.5 x 10 5 L mol -1 cm -1)6 , fapt ce confirm c prezena de carotenoizi din compus este foarte mic, dar poate fi identificat n spectrul UV al extractului brut i evideniaz dou date importante pentru identificarea clorofilei. Prima este prezena pe banda principal de absorbie a unui derivat de tip porfirin/clorin, ce se gsete de obicei ntre 400-420 nm. Al doilea aspect este faptul c banda principal este identificat la 668 nm, este relativ intens, tipic derivailor de clorofil (banda Q este mai intens). Aceste dou date se utilizeaz pentru caracterizarea acestui experiment. Randamentul final de clorofil este de 1.0% (50 mg), avnd n vedere c masa de Spirulina maxima este de 5 g.

Clorofila a poate fi, de asemenea, stocat n forma sa liber (fr Mg2+) care evit fotodegradarea. Pentru aceasta, clorofila se trateaz cu 5 ml de soluie de etanol (~1%) i acid acetic timp de 2 ore. Solventul se evapor sub presiune redus, iar reziduul se dilueaz cu 50 ml de CH2Cl2 . Amestecul se extrage de dou ori cu 50 ml de ap distilat folosind o plnie de decantare, dup care se separ faza organic, se usuc folosind aproximativ 5 g de sulfat de sodiu anhidru, se fitreaz iar solventul este ndeprtat sub presiune redus (evaporator rotativ), obinndu-se un produs numit feofitin, care se recristalizeaz folosind 1 ml de metanol. Formula molecular- C55H74N4O5 , caracteristicile spectrale ale UV (nm) sunt: 412 (band Soret), 507, 540, 610, 667. Prin implicarea proceselor de baz a extraciei de produse naturale, a tehnicii de separare cromatografic i de identificare a compuilor heterociclici aromatici, ca pigmenii de fotosintez, aceast metod este eficint deoarece implic un cost redus iar rezultate finale sunt uor de interpretat.

Note: 1.http://www.bioterapi.ro/aprofundat/index_aprofundat_index_enciclopedic_substanteClorofil a.html 2. http://en.wikipedia.org/wiki/Chlorophyll 3. N. Slgeanu, L. Atanasiu, 1981, Fotosinteza, Editura Academiei Republicii Romnia, Bucureti, pag. 72 4. http://liviugheorghe.wordpress.com/2010/07/30/remedii-pentru-viata-episodul-6/ 5. Lichtenthaler, HK & Wellburn, AA, 1983, Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extracts in different solvents, Biochem. Soc. Trans Ac. 603 : 591-592. 6. http://www.scielo.br/pdf/qn/v32n6/54.pdf 7. N. Slgeanu, L. Atanasiu, 1981, Fotosinteza, Editura Academiei Republicii Romnia, Bucureti, pag. 99