Epigenetica i mbtrnirea

Adelina-tefania Niculae
Adriana Oprea
Andreea-Simona Manea

Facultatea de Biologie, Master GAB, anul II

mbtrnirea
- este un proces biologic complex, multifactorial, care afecteaz toate
organisemele vii;
- se manifest printr-o scdere gradual a funciilor fiziologice ntr-o
manier dependent de timp;
- are o importan semnificativ deoarece determin creterea
susceptibilitii fa de multe boli, precum: cancer, tulburri
metabolice, diabet, boli cardiovasculare i neurodegenerative
(A. Brunet i S. L. Berger, 2014).

Epigenetica

- un mecanism ereditar reversibil, care

nu determin alterarea secvenei ADN.

Modificrile

epigenetice

sunt

mecanisme

cruciale

implicate n deteriorrile funciilor celulare, observate n

timpul procesului de mbtrnire i n apariia bolilor
asociate cu mbtrnirea (A. D. Goldberg i colab., 2007).
Metilarea ADN;
remodelarea cromatinei;
modificri post-translaionale ale histonelor;
transcrierea ARNnc.

La fel ca toate structurile biologice din interiorul celulelor, epigenomul sufer modificri
progresive n configuraia lui, pe parcursul naintrii n vrst. Acestea conduc la schimbri majore
n arhitectura cromozomal, integritatea genomic i modelul de expresie genic (R. J. OSullivan i
J. Karlseder, 2012).
Odat cu mbtrnirea, informaia epigenetic se modific ca raspuns la diferii factori
(endogeni+exogeni). Starea anormal a cromatinei este caracterizat de metilarea aberant a ADN, de
modificri aberante ale histonelor, de ncorporarea diferitelor variante histonice.
Aceast stare modificat a cromatinei n celulele btrne determin alterarea patternurilor de
transcriere i inserarea n genom a elementelor transpozabile, ceea ce conduce la instabilitate genomic
i la apariia mutaiilor (Sangita Pal iJessica K. Tyler., 2016).

Exist un ceas epigenetic care determin

rata mbtrnirii?
Disfunciile fiziologice care apar odat cu naintarea n vrst afecteaz n mod special organele vitale,
precum inima i rinichii.
Stuart Kim de la Stanford University a cercetat modul n care reelele transcripionale se altereaz n
timpul mbtrnirii, utiliznd ca model experimental C. elegans i rinichiul uman pentru studiul disfunciei
renale corelat cu mbtrnirea (Lund J i colab., 2002).
Odat cu apariia tehnologiei de secveniere ultra-high troughput, Kim a putut identifica principalii
factori de transcripie implicai n modificrile transcripionale asociate cu vrsta naintat. Un exemplu
este familia de factori transcripionali GATA a cror expresie scade odat cu vrsta (Van Nostrand EL i
colab., 2013)

Resetnd aceti factori transcripionali prin supraexprimarea lor , se ntinerete transcriptomul

i se poate crete durata de via a viermilor;

n rinichi, unii dintre aceti FT sunt implicai n inflamaie i n alterarea funciei fiziologice care
apare odat cu mbtrnirea;

n urma experimentelor s-au identificat noi circuite transcipionale care nsoesc procesele de
mbtrnire la C.elegans si la nivelul rinichiului uman;

Inversarea modificrilor corelate cu vrsta ale acestor factori de transcripie ar putea ajuta la
ntinerirea transcriptomului celulelor sau esuturilor (Anne Brunet i Shelley L. Berger, 2014).

Alzheimer boal asociat cu mbtrnirea i

hipometilarea ADN
-

este o boal neurodegenerativ, progresiv, caracterizat de prezena plcilor amiloide la nivelul SNC
(Hardy i Selkoe, 2002);

biogeneza i acumularea plcilor amiloide care constau n reziduuri de peptide beta-amiloide (A40 i
A42) derivate din proteina precursor amiloid APP este mediat de BACE1 (-secretaz) i - secretaz
(Verdile i colab., 2007);

hipometilarea ADN n creier n procesul mbtrnirii poate avea semnificaie n patologia bolii. Aceast
sugestie este susinut de constatri ale hipometilrii genei APP n creierul unui pacient cu AD, precum
i demetilarea promotorului APP dependent de vrsta naintat n cortex. (Tohgi et al.1999);

frecvena metilrii resturilor de citozin n poziiile -207, -204, -200, -182, n promotorul genei APP la
subiecii sub 70 ani, a fost semnificativ crescut (55%) comparativ cu subiecii de peste 70 ani (5%).
(Tohgi i colab., 1999)

 hipometilarea dependent de vrst a promotorului APP produce

supraexpresia genei APP, conducnd la creterea nivelului de
protein APP.
hipometilarea i supraxprimarea genei PS1 induce activitatea secretazei i stimuleaz scindarea proteolitic a proteinei APP, ceaa
ce conduce la acumularea de A40 i A42 (Fuso i colab., 2007).

Proteoliza

APP

determinat

de

hipometilarea

ADN

Experiment

Corelaia dintre nivelul de protein APP i 4 stadii diferite de dezvoltare la Mus musculus

Scopul experimentului este de a urmri:

-

modificarea nivelului proteinei APP n celulele din esutul nervos la Mus musculus, pe
msura naintrii n vrst;

modificarea nivelului de expresie al genei APP, corelat cu modificarea gradului de metilare

al genei.

Materiale i metode
I. Izolarea proteinelor din esut nervos de Mus musculus
20-40 zile
10
subieci
180-200
zile
(~6 luni)
10 subieci

520-550
zile
(~ 1 an, 6
luni)
10 subieci
720-750
zile
(~2 ani)
10 subieci

II. Western blotting (Imunoblotting) metod de investigare a proteinelor

1. Amestecul de proteine care conine i proteina de interes APP este separat cu
ajutorul SDS-PAGE.
2. Transferul proteinelor de pe gel pe o membran, pentru a face proteinele
mai accesibile identificrii.
Membrana: nitroceluloz sau polifluorur de viniliden (PVDF).
Transfer:
- Electroblotting: metod frecvent utilizat, care folose te curentul electric
pentru a transfera proteinele din gel pe membran, astfel nct proteinele i
menin aezarea pe care au avut-o n gel.

Transfer umed:
sandwich-ul (-) hrtie de filtru/ gel/ membran/ hrtie de filtru (+) se monteaz ntrun tanc de transfer care conine o soluie tampon de transfer.

Verificarea eficientei transferului (opional):

- colorarea gelului cu Coomassie BB. Dac transferul a fost eficient, o mare parte din
proteine au disprut de pe gel.

3. Blocarea legrii nespecifice la membran a anticorpului primar.

Pentru a preveni legarea nespecific la membran a anticorpului primar ce urmeaz a fi
adugat, membrana este incubat cu o soluie diluat de protein ce se va ata a la membran
n toate locurile n care nu sunt legate proteinele transferate.
Blocarea se face cu:
-5% soluie de lapte degresat;
-5% soluie cu albumin seric bovin.
4. Adugarea anticorpului primar monoclonal care recunoate proteina APP de la
oarece, produs n iepure.

5. Splarea membranei pentru a nltura anticorpul primar care nu s-a legat.

6. Adugarea anticorpului secundar.
- Acesta este un anticorp anti specia n care a fost produs primul anticorp, n cazul nostru
anti-iepure.
- Mai muli anticorpi secundari vor fi lega i de un anticorp primar, crescndu-i astfel
semnalul.
- Anticorpul secundar este cuplat cu o enzima reporter: fosfataza alcalina.

7. Splarea membranei pentru a nltura anticorpul secundar care nu s-a legat.

8. Analiza benzilor de interes.

Detecia colorimetric (cromogen)
Cu ajutorul unui substrat ce reacioneaz cu enzima reporter cuplat cu anticorpul
secundar.
Substratele fosfatazei alcaline (AP):

NBT (nitroblue tetrazolium )

BCIP (5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfat)

- Enzima convertete substratul dintr-o form solubil ntr-o form insolubil de culoare
diferit -> coloreaz specific membrana.

Reacia este stopat prin spalare, blotul este developat iar

nivelul de protein APP este evaluat prin densitometrie (ct de
intens este banda corespunztoare proteinei de interes).

Rezultate. Discuii. Concluzii.

Proteina APP

Metilarea APP
20-40 zile

180-200 zile

520-550 zile

720-750 zile

20-40 zile

Vrsta oriceilor

Pe msur ce oriceii mbtrnesc, ne ateptm ca:

- Nivelul metilrii genei APP s scad;
- Nivelul expresiei APP s creasc;
- Cantitatea de APP din celule s creasc.

180-200 zile

520-550 zile

Vrsta oriceilor

720-750 zile

Bibliografie
Wade N (2008-06-04). "New Hints Seen That Red Wine May Slow Aging". NYTimes.com. Retrieved 2008-11-30.
Wade N (2011-08-18). "Longer Lives for Obese Mice, With Hope for Humans of All Sizes". NYTimes.com. Retrieved 2012-05-13.
Ahuja N.& Issa JP. Aging, methylation and cancer. Histol Histopathol. 2000;15:835842.
Peters I. Vaske B. Albrecht K. Kuczyk MA. Jonas U. Serth J. Adiposity and age are statistically related to enhanced RASSF1A tumor suppressor gene promoter methylation
in normal autopsy kidney tissue. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2007;16:25262532.
Euhus DM. Bu D. Milchgrub S. Xie XJ. Bian A. Leitch AM. Lewis CM. DNA methylation in benign breast epithelium in relation to age and breast cancer risk. Cancer
Epidemiol Biomarkers Prev. 2008;17:10511059.
Adiv A. Johnson, Kemal Akman, Stuart R.G. Calimport, Daniel Wuttke, Alexandra Stolzing and Joo Pedro de Magalhes . The Role of DNA Methylation in Aging,
Rejuvenation, and Age-Related Disease.Rejuvenation Res. 2012 Oct; 15(5): 483494.
Post WS. Goldschmidt-Clermont PJ. Wilhide CC. Heldman AW. Sussman MS. Ouyang P. Milliken EE. Issa JP. Methylation of the estrogen receptor gene is associated with
aging and atherosclerosis in the cardiovascular system. Cardiovasc Res. 1999;43:985991
Li LC. Shiina H. Deguchi M. Zhao H. Okino ST. Kane CJ. Carroll PR. Igawa M. Dahiya R. Age-dependent methylation of ESR1 gene in prostate cancer. Biochem Biophys
Res Commun. 2004;321:455461.
Tra J., Kondo T., Lu Q., Kuick R., Hanash S., Richardson B. 2002. Infrequent occurrence of agedependent
changes in CpG island methylation as detected by restriction landmark genome scanning.. Mech Ageing Dev 123: 14871503.
A. Brunet, S. L. Berger, Epigenetics of aging and aging-related disease. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 69 (Suppl. 1), S17S20 (2014).
A. D. Goldberg, C. D. Allis, E. Bernstein, Epigenetics: A landscape takes shape. Cell 128, 635638 (2007).
R. J. OSullivan, J. Karlseder, The great unravelling: Chromatin as a modulator of the aging process. Trends Biochem. Sci. 37, 466476 (2012).
Sangita Pal and Jessica K. Tyler. Epigenetics and aging. Sci.Adv., 2016
Haigis MC, Sinclair DA. Mammalian sirtuins: biological insights and disease relevance. Annu Rev Pathol. 2010;5:253295. doi:10.1146/ annurev.pathol.4.110807.092250
Howitz KT, Bitterman KJ, Cohen HY, et al. Small molecule activators of sirtuins extend Saccharomyces cerevisiae lifespan. Nature. 2003;425:191196.
doi:10.1038/nature01960
. Baur JA, Pearson KJ, Price NL, et al. Resveratrol improves health and survival of mice on a high-calorie diet. Nature. 2006;444:337342. doi:10.1038/nature05354
Lund J, Tedesco P, Duke K, Wang J, Kim SK, Johnson TE. Transcriptional profile of aging in C. elegans. Curr Biol. 2002;12:15661573. doi:S0960982202011466 .
Van Nostrand EL, Snchez-Blanco A, Wu B, Nguyen A, Kim SK. Roles of the developmental regulator unc-62/homothorax in limiting longevity in Caenorhabditis elegans.
PLoS Genet. 2013;9:e1003325. doi:10.1371/journal.pgen.1003325
Anne Brunet and Shelley L. Berger. Epigenetics of Aging and Aging-related Disease. J Gerontol A Biol Sci Med Sci 2014 June;69(S1):S17S20

Hardy, J., and Selkoe, D.J. 2002. The amyloid hypothesis of Alzheimers disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297:353356.

Tohgi, H., Utsugisawa, K., Nagane, Y., Yoshimura, M., Genda, Y., and Ukitsu, M. 1999. Reduction with age in methylcytosine in the promoter region -224
approximately -101 of the amyloid precursor protein gene in autopsy human cortex. Brain Res. Mol. Brain Res. 70:288292.

Verdile, G., Gandy, S.E., andMartins, R.N. 2007. The role of presenilin and its interacting proteins in the biogenesis of Alzheimers beta amyloid. Neurochem. Res.
32:609623.

Fuso, A., Cavallaro, R.A., Zampelli, A., DAnselmi, F., Piscopo, P., Confaloni, A., and Scarpa, S. 2007. gamma-Secretase is differentially modulated by alterations of
homocysteine cycle in neuroblastoma and glioblastoma cells. J. Alzheimers Dis. 11:275290.

http://cpgislands.usc.edu

https://en.wikipedia.org/wiki/Sirtuin

V mulumim pentru atenia

acordat!