LP 10

1. Enzime de restricţie.
2. Hărţi de restricţie.
3. Hibridarea unei sonde.
4. Marcarea ADN.
5. Descrierea unui plasmid şi a unui fagemid.
6. Descrierea unui bacteriofag şi a unui cosmid.
7. Descrierea YAC
Enzime de restricţie
 Enzimele de restrictie sunt endonucleaze care recunosc
secventa specifica de baza si rup sau restrictioneaza AND in
coloana fosfodiesterică.

 Acestea participă la fenomenul de restricţie, adică un sistem de

apărare al bacteriilor faţă de bacteriofagi.

 Unele tulpini sau suşe bacteriene conţin enzime din familia

endonucleaze şi decupează ADN la nivelul secvenţei
recunoscută specific.

 Dacă o colonie bacteriană infectată de un bacteriofag
sintetizează această enzimă, şi dacă bacteriofagul posedă în
genom secvenţa recunoscută de enzimele de restricţie a
bacteriilor, acesta va fi incapabil să se multiplice şi să lizeze
bacteria.
Enzime de restrictie de tip 1
 Enzime de restrictie de tipul 1 cu activitate de
nuclează si metilază intr-o singura enzima.
 Ele se leagă de perechile de baze 4-6 ale
ADN-ului gazda.
 Locatia clivajului substratului de ADN poate fi
realizata la o distanta de 1000 bp (perechi
de baze) de locatia alipirii enzimei.
 Un exemplu al tipului 1 este enzima EcoK
intalnit la E.coli K12.
Tipul III de enzime de restrictie
 Tipul III de enzime de restrictie se aseamana cu
cele de Tip 1 in capacitatea lor de a metila si de a
restrictiona (de a taia) ADN-ul.
 Asemenea tipului I, acestea sunt enzime complexe
cu doua subunitati.
 Situsurile de recunoastere ale acestor enzime sunt
asimetrice iar clivajul substratului de ADN apare de
la perechile de baze 24 – 26 spre capatul 3’.
 Un exemplu al tipului III de enzime este HINFIII al
H. influenzae.
 Enzimele de restrictie de tip II
 Enzimele de restrictie de tip II sunt cele mai folosite in
condiii de laborator.
 Ele se unesc ca dimeri simpli cu situsuri palindromice.
 Enzimele de restrictie tip II cliveaza ADN-ul in locatiile de
interactiune, producand fragmente de dimensiuni diferite.

 Tipul II de enzime de restrictie a fost identificat in aproape

toate procariotele, dar nici una nu a fost identificata pana
acum la eucariote.

 Specificitatea actiunilor lor si sutele de enzime disponibile

ce recunosc numeroase locatii sunt factori cheie in
abilitatea de efectua recombinari de ADN in vitro.
Frgmente de ADN rezultate în
urma restricţiei
 Enzime utilizate pentru marcarea sondelor moleculare
Exonucleazele
 In opozitie cu endonucleazele, exonucleazele
degradeaza ADN-ul terminal capetele libere hidroxil
3’ sau fosfat 5’.
 In consecinta acestea enzime nu vor functiona in ADN-
ul circular inchis.
 Aceste enzime sunt folosite ptr supraveghere in
maniplarea ADN-ului in vitro
 pentru a sterge treptat ADN-ul liniar sau pentru a
modifica portiunile terminale ale ADN-ului dupa
taierea cu enzimele de restrictie.
 Exonuclazele au diferite cerinte pentru substraturi deci
vor degrada specific capete de ADN.
 ADN polimeraza
 ADN polimeraza catalizează 3 tipuri de reacţii:

 -activitatea de ADNpol propriu-zisă necesită matrice ADN care este

copiată prin extensie unei amorse. Polimeraza încorporează nucleotide
începând la nivelul 3'OH a amorsei.

 -activitate exonucleazei 3'-5' in vitro este o activitate de reacţie care

are ca scop eliminarea tuturor bazelor adăugate eronat în cursul sintezei
lanţului de ADN.

 - activitatea exonucleazei 5'-3', enzimele elimină nucleotidele de la 5' a

ADN dublu catenar. Această activitate este utilizată în tehnica de marcaj
prin translaţia secţiunii.

 Eliminarea bazelor eronate este urmată de încorporarea bazei

corecte cu ajutorul ADN polimerazei. Această activitate se exercită pe
ADN simplu sau dublu catenar.
ADN pol I
 Activitatea exonucleazică 5'-3' a ADN pol I poate
fi exercitată şi pe un hibrid ARN/ADN , ea are o
activitate de RNază H intrinsecă care constă în
eliminarea unui lanţ de ARN prin activitatea
exonucleazei 5'-3'.
 Această proprietate a fost exploatată în reacţia de
reverstranscripţie pentru eliberarea primului lanţ
de ADN sintetizat şi va permite sinteza unuia
secundar.
 În activitatea exonucleazei 5'-3' a ADN pol
I are loc eliminarea unui grup fosfat în 5',
care duce la imposibilitatea reacţiei de
elongaţie.

 În consecinţă domeniul de aplicaţie al acestei

enzime este de a limita marcajul sondei
prin translaţia secţiunii, aplicaţie în care ea
este utilizată în strânsă legătură cu DNaza I.
 Fragmentul Klenow
 Fragmentul Klenow se realizează printr-o proteoliză limitată a
ADNpol I de la E.coli

 a pierdut activitatea exonucleazică 5'-3' dar conservă

activitatea exonucleazică 3'-5' şi cea de ADNpolimerază.

 Aplicaţiile fragmentului Klenow:

 secvenţierea după metoda Sanger
 sinteza unui lanţ de ADN complementar
 marcare izotopică (32PdNTP) a extremităţii 3' a ADN prin
reacţia de schimbare a nucleotidelor reci contra nucleotidelor
marcate, catalizată prin activitate exonucleazică.
ADN polimeraza bacteriofagului T4
şi T7
 ADN polimeraza bacteriofagului T4 şi T7 catalizează transferul
fosforului radioactiv γ32P pe ATP.

 Astfel ATP este marcat cu 32P pe a treia grupare a fosfatului de

pe extremitatea 5 a fragmentului de ADN.

 Tehnica este aplicată pentru obţinerea oligonucleotidelor

marcate care vor fi utilizate ca sonde pentru criblajul băncilor.

 ADN pol T4 şi are o activitate exonucleazică 3'-5' foarte eficace

pe ADN monocatenar şi este de 200 de ori mai activă decât
fragmentului Klenow de la E.coli
T7 ADN polimeraza

 Ea posedă în acelaşi timp o activitate exonucleazică

3'-5' puternic exprimată, de aproximativ de 1000 de
ori mai mare decât a fragmentului Klenow.
Această activitate importantă exonucleazică explică
fidelitatea mare a T7 ADN pol.
 Aplicaţii principale:
 marcarea ADN în 3'
 mutageneza dirijată
Hărţi de restricţie
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
 Marcarea sondelor
 Sonda este o secvenţă nucleotidică
complementară unei secvenţe nucleotidice:
foarte adesea aceasta poate fi o genă sau un
fragment de genă.
 Marcarea ADN se face prin 3 tehnici:
 a) o tehnică de înlocuire a nucleotidelor
nemarcate prin nucleotide marcate (tehnica de
reînlocuire) – translaţia secţiunii
 b) două tehnici de sinteză a ADN marcat:
 - randomizat sau întâmplător
 - sinteza sondelor prin PCR
 c) marcarea oligonucleotidelor.
 Translaţia secţiunii
 Sunt utilizate 2 enzime:
 -DNaza I –endonuclează specifică ADN dublu
catenar care hidrolizează legăturile
fosfodiesterice ale lanţurilor ADN.
 Are loc secţionarea (nick) unei singure catene,
DNaza I exercită deci o acţiune independentă pe
fiecare lanţ.
 Cantitatea (numărul) de secţiuni pe ADN depinde
de concentraţia DNazei I utilizate.
 - ADN polimeraza I posedă 3 activităţi
 - o activitate 5'-3' polimerazică
 - o activitate 3'-5 'exonucleazică (o activitate
de corectare a erorilor)
 - o activitate 5'-3' exonucleazică.
 Prezenţa grupului 5' fosfat la nivelul fiecărei
secţiuni efectuate prin DNaza I declanşează
acţiunea celei de-a II-a enzime.
 Activitatea 5'-3' exonucleazică îndepărtează
progresiv deoxinucleotidele.
 Ele sunt deci deplasate progresiv de la
secţiune din 5' către 3' de unde denumirea de
translaţia secţiunii.
 Activitatea 5'-3' polimerazică, va completa
adăugând la extremitatea 3'OH de
deoxinucleotide marcate prin anumiţi markeri
fie cu izotopi 32P, fie prin haptene de exemplu
digoxigenină.
 Sonda obţinută va fi dublu catenară şi va fi
denaturată înainte de utilizare. Imprimare
întâmplătoare (random priting)
 Klenow polimeraza este utilizată pentru această
tehnică.
 Această enzimă este o ADN polimerază
modificată (fragmentul Klenow rezultă prin
clivarea proteolitică a ADN polimeraza I de E.
coli prin subtilizină).
 Ea posedă 2 proprietăţi după cum urmează:
 Activitate de ADN polimerază 5'-3'
 activitatea de corectare a erorilor exonucleazică
3'-5'.
 Principiul acestei tehnici este următorul:
 ADN dublu catenar este denaturat prin căldură,
apoi monocatenele sunt puse în gheaţă (pentru
stabilizarea acestora).
 Un amestec de hexanucleotide conţinând toate
combinaţiile posibile (întâmplătoare, random)
sunt adăugate (ceea ce reprezintă un amestec
de 46 hexanucleotide diferite).
Fixarea aleatorie a unei
amorse
 Markarea sondelor prin PCR
 Două lanţuri de ADN sunt markate prin
activitatea Taq polimerazei care este o
ADN polimerază, fie prin încorporarea de
deoxinucleotide radioactive fie
deoxinucleotide modificate prin fixarea
unor haptene (de exemplu, DIG-dUTP
raportul optim dTTP/DIG-dUTP este 2/1).
 Marcarea olinucleotidelor
 Oligonucleotidele (20-30 pb şi mai puţin) sunt
marcate prin transferaza terminală.
 Aceste enzime catalizează adaosul a mai
multor didezoxinucleotide la extremitatea
3' terminală a ADN.
 S-a descoperit ca plasmidele sunt sursa
fenotipurilor rezistente ale bacteriilor la
antibiotice
 Plasmidele se pot replica in celula gazda
dar nu pot supravietui in afara acesteia
asemenea virusurilor
 Dupa liza celulara materialul tinta este
purificat , ca apoi concentratia si puritatea
mostrei sa poata fi determinata.
 Comparat cu fragmentele de ADN, plasmidele sunt
vehicole mult mai eficiente pentru transferul genelor
de la o gena la alta.
 In timpul lizei celulare, plasmidele superspiralate pot
intra in alte celule mult mai eficient.
 Plasmidele au fost folosite extensiv in tehnologia
ADN-ului recombinat pentru introducerea unor
trasaturi specifice.
 Prin manipularea plasmidelor in vitro, pot fi
introduse gene specifice in celule pentru a produce
noi fenotipuri sau organisme recombinante.
 Abilitatea de a exprima trasaturi genetice de la
plasmide fac posibila manipularea fenotipului in
moduri specifice.
Plasmidele
 Un plasmid este o moleculă de ADN dublu
catenară circulară, extracromozomială,
capabilă de a se replica, independent de
cromozomul bacterian, într-o celulă şi de
a fi transferată la o altă celulă la alta.
Plasmidele
 Aceste plasmide sunt molecule mici de 3-10 Kb.
 Plasmidele utilizate în ingineria genetică au fost
modificate.
 Conţin o regiune de replicare (regiunea principală),
una sau mai multe gene de rezistenţă (la
antibiotice de exp. care permit selectarea
bacteriilor care au integrat acest plasmid) şi un situs
de policlonaj.
 Situsul de policlonaj este o secvenţă de ADN
constituită dintr-o succesiune de secvenţe
recunoscute şi secţionate de diferite enzime de
restricţie.
 Aceste situsuri sunt unice (nu apar decât
în acelaşi loc în toată secvenţa
plasmidului) şi sunt utilizate în tehnicile
de clonaj.

 Moleculele de ADN exogene de ordinul a 3

Kb pot fi uşor integrate în aceşti vectori
plasmidici, dar nu şi moleculele mai mari (fig.
102).
Vectori folosiţi în biologia
moleculară
 Fagemidele sunt molecule hibride dintre un
plasmid şi un fag.
 Sunt molecule de ADN bicatenar circulare care pot
fi obţinute sub formă monocatenară în anumite
condiţii.
 Ele posedă origine a replicării, cel puţin o genă de
rezistenţă la antibiotice, un sit de policlonaj şi
o secvenţă provenită de la fagul M13 care
permite obţinerea formei monocanare.
 În general, promotorii de ARN polimerază au fost
introduşi în amonte sau în aval de situsul de
policlonaj pentru a produce ARNm prin transcrpţie
in vitro.
 Fragmentele de ADN de câteva Kb până la 10 Kb
pot fi introduse în aceşti vectori.
Bacteriofagul
 Bacteriofagul este un virus cu tropism
bacterian.
 Cel mai utilizat este bacteriofagul λ care are
50 Kb ADN bicatenar, dar liniar, prezintă
extremităţi coezive (secvenţe cos) care-i
permit să se circularizeze în caz de
infecţie.
Bacteriofagul λ (A); fagul T4
(B)
C lo n in g in 
1 P r e p a r e fo r e ig n D N A
2 P re p a re v e c to r D N A
3 L ig a tio n r e a c tio n
4 In v itr o p a c k a g in g
5 In fe c t h o s t E . c o li
(p la te o n ‘la w n ’)
6 S c r e e n p la q u e s
7 P la q u e p u r ific a tio n
8 S u b c lo n e fr a g m e n t
in to p la s m id

• a m p lify c lo n e d p h a g e
• p u r ify p h a g e D N A
• e x c is e in s e r t
• lig a te in to p la s m id
 Cosmidele sunt vectori hibrizi de talie mică
având caracteristicile plasmidului (originile
replicării, gena de selecţie) şi a unui
bacteriofag λ (secvenţa cos necesară
încapsidării ADN-ului în particulele fagice).
 Fragmentele de ADN exogen introduse în
cosmid între două situsuri cos trebuie să aibă
dimensiunea de 35-50 Kb.
 Odată pătruns în bacterie cosmidul se replică ca un
plasmid deoarece nu posedă genele fagului pentru
producerea de noi particule fagice.
 Cosmidele sunt vectori utilizaţi pentru construirea băncilor
de ADN genomic.
 Aceste bănci sunt mai greu de construit şi de menţinut
decât cele de bacteriofagi.
 Băncile de cosmide sunt utilizate când mărimea genei de
cercetat este foarte mare peste 20 Kb.
 ADN-ul fagic este învelit într-un strat proteic. În cazul
infectării unei bacterii, particula fagică se fixează la
exteriorul acesteea şi eliberează molecula de ADN în
interiorul celulei bacteriene.
 Echipamentul enzimatic al bacteriei este folosit pentru
transcripţia şi transducţia proteinelor codificate de ADN
fagului λ, îndeosebi a proteinelor care constituie învelişul
proteic sau capsida.
 ADN fagic se va replica totodată de un număr
mare de ori.
 Moleculele de ADN nou sintetizate vor fi
încapsulate în noi învelişuri de capside fagice
sintetizate în interiorul celulei bacteriene. În acest
caz se numesc virioni.
 Celula bacteriană se va liza şi va elibera mii de
particule fagice identice cu fagul care a infectat
bacteria.
 Aceşti noi fagi la rândul lor vor infecta bacteriile
vecine.
 Avantajul unui vector fagic faţă de unul plasmidic
este că ADN-ul său acceptă un fragment mai mare
de ADN exogen (în medie 20 Kb faţă de 4 Kb
pentru un plasmid).
 Totuşi din cauza mărimii, este mai grea
manipularea in vitro a vectorilor fagici
 În practică fagii sunt utilizaţi ca vectori pentru
construirea băncilor de ADN complementar sau
genomic.
 Dacă genele de cercetat de ADN exogen au fost
reperate ele vor fi decupate de enzimele de
restricţie şi fragmentele obţinute sunt integrate
într-un vector plasmidic şi fenomenul se numeşte
subclonaj.
 Descrierea unui Yac

 Yac şi BAC sunt vectori care acceptă fragmente mari de

ADN. Cuvântul Yac provine de la Yeast Artificial
Cromozom sau cromozomul artificial de drojdie.

 Yac-urile sunt vectori construiţi din secvenţe de ADN
cromozomial al levurilor (drojdiilor).

 Ei posedă o origine de replicare (ARS), un sit

centromeric (CEN) şi secvenţe telomerice (TEL), care
le permit ca să se comporte ca un cromozom atunci
când sunt introduse sub formă liniară într-o levură (fig.
103).
 De asemenea prezintă:
 -mai multe gene de selecţie care codifică
enzimele ce permit selectarea levurilor care au
încorporat un vector viabil (TRP1, URA3);
 -un sit de clonaj unic, situat pe gena SUP4, care
permite introducerea ADN străin. Aceasta permite
detectarea unui vector recombinat. Aceşti vectori
sunt introduşi în levură.
 Fragmentele foarte mari de ADN exogen 150-1000
Kb pot fi introduse în Yac.
 La ora actuală cele mai mari inserţii clonate au
mărimea de 2900 Kb. Aceşti vectori sunt
instrumente de alegere pentru analiza genomurilor
complexe în particular a celui uman, dar şi pentru
cartagrafierea genelor.
 Pentru clonajul fragmentelor mari de ADN se mai
folosesc Bac (Bacterial Artificial Cromozome)
sau fagul P1.
 Aceşti vectori sunt capabili ca şi Yac să
încorporeze fragmente mari de ADN. Ei se
comportă ca şi plasmidele de mărime foarte mare,
dar se manipulează ca bacteriofagi de tip I.
 BAC sunt frecvent utilizate. În clonajul ADN sunt
cele mai sigure şi eficace în E.coli decât în levuri.
Mărimea fragmentelor integrate nu depăşeşte 300
Kb.
 Clonajul molecular
 Clonajul constă în inserţia unui fragment de ADN exogen
într-un vector (plasmid, fagemid, bacteriofag, cosmid,
YAC, BAC).
 Principiul metodei
 Vectorii de clonaj (de exemplu plasmidele) sunt decupaţi
prin enzime de restricţie recunoscute de un situs unic (în
general situat în situsul de policlonaj).
 Vectorul după secţionare este liniarizat şi posedă la
fiecare extremitate o parte din secvenţa de ADN
recunoscută de enzima de restricţie.
 ADN exogen organismului donator, este digerat de
aceeaşi enzimă de restricţie ca şi cea utilizată pentru
liniarizarea vectorului; diferitele fragmente obţinute posedă
deci la cele două extremităţi în mod egal o parte din
secvenţa de ADN recunoscută de enzima de restricţie.
 Atunci când plasmidul linearizat şi fragmentele de
ADN donator sunt confruntate, se realizează
hibridizarea extremităţilor coezive complementare
(formându-se legături de H), următoarele fiind
adăugate pe bază de complementaritate (AT, GC).
 Se adaugă o enzimă care permite formarea unor
legături covalente între aceste fragmente de ADN
hibridizat.
 Aceasta este o ADN ligază, care realizează
legături fosfodiesterice între extremităţile coezive
ale fragmentului ADN exogen şi ale plasmidului
(5P şi 3OH) devenite adiacente.
 Plasmidul obţinut este din nou circular, este recombinant
pentru că a integrat o inserţie.
 Dacă ADN plasmidic şi inserţia sunt digerate printr-o
singură enzimă de restricţie, inserţia poate să se integreze
cu două orientări întâmplătoare, fie cu 3 fie cu 5. Va
trebui determinat sensul de inserţie.
 Inserţia se poate integra în două sensuri întâmplătoare, fie
3 fie cu 5. Va trebui determinat sensul de inserţie a
fragmentului secvenţializând plasmidul recombinant.
 În clonajul realizat după secţionarea cu o singură enzimă
de restricţie se pot produce două tipuri de legări: legarea
la plasmid a moleculei de inserat sau recircularizarea
plasmidului pe el însăşi fără inserţie.
 Această ultimă posibilitate este frecventă de aceea se
urmăreşte dirijarea legării inserţiei.
 În scopul favorizării inserţiei fragmentului de ADN
străin şi deci de îmbogăţire a populaţiei cu
plasmidele recombinate, recircularizarea vectorului
pe el însăşi este împiedicată prin tratamentul cu
fosfataza alcalină.
 Grupurile fosfat prezente la extremitata 5P din
vectorul liniarizat sunt eliminate de fosfataza
alcalină.
 Ligaza nu poate să catalizeze formarea de
legături fosfodiesterice între două extremităţi
defosforilate ale plasmidului.
 Ea poate să catalizeze legătura între o extremitate
defosforilată a plasmidului şi o extremitate
fosforilată a inserţiei.
 Cazurile mai puţin favorabile se pot întâlni atunci când
plasmidul şi fragmentul de ADN străin sunt secţionate prin
enzime de restricţie, generând capete drepte.
 Principiul este acelaşi, dar eficacitatea legăturii este
redusă. Totuşi avantajul acestei metode este de a permite
legarea oricărei extremităţi chiar dacă ea nu posedă
secvenţe complementare.
 Acesta este cazul pentru clonarea în plasmide a
fragmentelor de ADN obţinute prin PCR.
 În cazul unui clonaj realizat prin capete drepte, inserţia
unui fragment de ADN exogen poate avea loc cu două
orientări la întâmplare.
 Va trebui determinat sensul inserţiei fragmentului în
secvenţializare, de exemplu a plasmidelor recombinante.
 Dacă vectorul, în situsul de policlonaj şi ADN-ul exogen,
nu a fost digerat de aceeaşi enzimă de restricţie şi nu
posedă extremităţile drepte sau compatibile, este
indispensabil de a se crea extremităţile drepte pentru
a insera ADN exogen în vector.
 Acest lucru se realizează prin acţiunea unei ADN
polimeraze care completează, prin adăugarea
nucleotidelor la extremităţile 5P a protuberanţei. Prin
activitatea enzimei 3-5 exonuclează se realizează
ajustarea extremităţii 3 protuberante.
 În unele cazuri fragmentul ADN de digerat şi plasmidul
sunt digerate fiecare prin 2 enzime de restricţie diferite. În
acest caz, clonajul este direcţionat deoarece integrarea
inserţiei se realizează într-un singur sens.