Metode Experimentale Avansate

Editori
Mihaela Aluaş Simion Simon
Metode experimentale avansate

pentru studiul şi analiza bio-nano-sistemelor
1
2
Editori
Mihaela Aluaş Simion Simon
METODE EXPERIMENTALE AVANSATE

PENTRU
STUDIUL ŞI ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR
Casa Cărţii de Ştiinţă

Cluj-Napoca, 2012
3
Coperta: Patricia Puşcaş
Editură acreditată CNCSIS (24)
© Universitatea „Babeş-Bolyai”, 2012
Material editat în cadrul proiectului „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane
înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, ID 36154
Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

Metode experimentale avansate pentru studiul şi analiza bio-nano-
sistemelor / ed.: Mihaela Aluaş, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa
Cărţii de Ştiinţă, 2012
Bibliogr.
ISBN 978-606-17-0115-5
I. Aluaş, Mihaela (ed.)
II. Simon, Simion (ed.)
53
4
Prefaţă
În calitate de director al proiectului cu titlul „Program doctoral performant

pentru formarea resursei umane înalt calificate în cercetarea ştiinţifică
interdisciplinară”, cod contract” POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc să
mulţumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza şi pro-
fesionalismul lor la realizarea acestui volum şi, implicit, la dezvoltarea pro-
gramului doctoral.
Mulţumirile mele se îndreaptă de asemenea către echipa de management a

proiectului, în următoarea componenţă:
Prof. dr. Simion Simon, coordonator ştiinţific program doctoral

Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator ştiinţific relaţii internaţionale
Cristina Dominic, asistent manager
Andra Ghira, responsabil logistic şi asistent manager
Jr. Alexandru Braşoveanu, consilier juridic
Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar
Ing. Carmen Ciplea, expert IT
Ec. István Püsök, expert contabil
Am convingerea că informaţia cuprinsă în această lucrare va sprijini gene-

raţiile prezente şi viitoare de conducători de doctorat în activitatea lor de
cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor în lumea minu-
nată a ştiinţei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de
cercetător o vocaţie.
Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane

înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară”, cod contract
POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanţat din Fondul Social European prin
Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013.
C.S.III. dr. Mihaela ALUAŞ
5
6
Cuvânt înainte
Institutul de Cercetări Interdisciplinare a fost înfiinţat prin Hotărârea Sena-

tului Universităţii Babeş-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare
şi transfer tehnologic, având ca obiectiv de activitate atât realizarea de studii şi
cercetări interdisciplinare în domeniile biologie moleculară, biomateriale şi
sisteme biologice, materiale avansate şi mediu ambiant, sisteme
nanostructurate natural şi artificial, cât şi transferul rezultatelor obţinute către
beneficiari locali, naţionali sau internaţionali. Institutul beneficiază de o clădire
proprie, cu o suprafaţă desfăşurată de peste 3000 mp, modernizată la nivelul
standardelor internaţionale din punct de vedere al dotărilor conexe şi având
laboratoare de cercetare structurate în acord cu nevoile cercetărilor interdisci-
plinare menţionate. Între timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au
decis să-şi dedice energia şi cunoştinţele cercetărilor la interfaţa Bio-Nano-
Sistemelor, a devenit Institutul de Cercetări Interdisciplinare în Bio-Nano-
Ştiinţe (ICI-BNS). În cadrul acestuia îşi desfăşoară activitatea în prezent 12
profesori universitari (dintre care 10 conducători de doctorat), 25 alte cadre
didactice şi cercetători şi peste 40 de doctoranzi cu frecvenţă. Aceştia aparţin
domeniilor Fizică, Chimie, Biologie, Informatică, Ştiinţa mediului şi Psihologie.
Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane
înalt calificate în cercetarea ştiinţifică interdisciplinară” a oferit posibilitatea
de a mobiliza un set de cercetători valoroşi, cu experienţă deosebită în tehnicile
experimentale frecvent utilizate în cercetările interdisciplinare din domeniul
Bio-Nano-Ştiinţelor.
Marea majoritate a experţilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoc-
torale în prestigioase laboratoare din lume unde au dobândit o bogată experi-
enţă în utilizarea echipamentelor de înaltă performanţă de care dispune Insti-
tutul nostru.
Studenţii doctoranzi, dar şi specialişti din domenii ca: fizică, chimie, biologie,
geologie sau ştiinţa mediului interesaţi în studii experimentale interdisciplinare
vor găsi în materialele incluse în prezentul volum date teoretice dar mai ales prac-
tice, despre tehnici experimentale avansate prezentate într-o formă accesibilă, cu
exemple semnificative, menite a facilita înţelegerea fenomenelor studiate şi a con-
tribui la creşterea aportului fiecărui cercetător la dezvoltarea domeniului în care îşi
va desfăşura activitatea ştiinţifică.
Prof. Dr. Simion SIMON
Director ICI-BNS
7
8
CUPRINS
I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13

Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională pentru obţinerea de
proteine.......................................................................................................................... 13
Asist. univ. dr. Iulia Lupan
Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii interdisciplinare ........... 36
II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64

Culturi celulare ........................................................................................................... 64
Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac
Culturi celulare – partea a II-a .................................................................................... 82
III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101

Microspectroscopia Raman....................................................................................... 101
Conf. dr. Monica Maria Baia
Microspectroscopia Raman – partea a II-a................................................................ 121
IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134

Spectroscopia de absorbţie în infraroşu .................................................................. 134
Lect. dr. Nicolae Leopold
Tendinţe moderne în spectroscopia de absorbţie IR ............................................. 147
V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160

Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160
Conf. dr. Dana Maniu
Spectrofluorimetria - aplicaţii ................................................................................... 172
VI. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ MAGNETICĂ NUCLEARĂ ......... 191

Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) .................. 191
C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş
Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide (RMN-S) – Implemen-
tarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaţii pe sisteme moleculare organi-
ce în faza solidă .......................................................................................................... 216
C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Aluaş
9
Rezonanţa magnetică nucleară pe sisteme lichide ................................................ 246
Lect. dr. Mihai Vasilescu
VII. MĂSURĂTORI TERMICE .................................................................................. 266

Analiză termică diferenţială. Analiză calorimetrică diferenţială......................... 266
Conf. dr. Raluca Ciceo-Lucăcel
Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termică diferenţială si analiză calori-
metrică diferenţială. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG
şi DSC........................................................................................................................... 275
VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286

Difracţie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286
C.S.I. dr. Gheorghe Borodi
Determinarea structurii cristaline prin difracţie de raze X................................... 305
IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ ŞI DE TRANSMISIE ........... 327

Microscopia electronică ............................................................................................. 327
şef lucrări dr. Lucian Barbu-Tudoran
Microscopia electronică - partea a II-a .................................................................... 347
X. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ ............................................................ 365

Microscopia de forţă atomică ................................................................................... 365
Conf. dr. Ioan Burda
Microscopia de forţă atomică – partea a II-a ........................................................... 378
XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X ŞI

ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394
Spectroscopia fotoelectronică ................................................................................... 394
C.S.III. dr. Maria Teodora Radu
Studiul prin spectroscopie fotoelectronică de raze X a suprafeţelor
diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424
C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga
XII. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ ELECTRONICĂ DE SPIN .......... 437

Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin ................................................... 437
C.S. dr. Milica Todea
Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin – partea a II- a ............................ 452
10
XIII. METODE ELECTROCHIMICE ......................................................................... 467
Elaborarea, testarea şi verificarea protocoalelor de practică experimentală
pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice ........................ 467
Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean
Electrochimia unei substanţe cu potenţial biologic activ. Studiu de caz ............ 490
XIV. SISTEME DE ANALIZĂ A SUPRAFEŢEI SPECIFICE ŞI

A DIMENSIUNII PARTICULELOR .......................................................................... 509
Sisteme de analiză a suprafeţei specifice şi a dimensiunii particulelor ............. 509
Lect. dr. ing. Réka Barabás

11

12
I. ANALIZE GENETICE
Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională

pentru obţinerea de proteine
Cuprins
1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem

procariot ................................................................................................................. 13
2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recombinate în studii
interdisciplinare ..................................................................................................... 31
3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Moleculară ................... 33
4. Bibliografie ............................................................................................................. 34
1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a

genelor în sistem procariot
ADN în sine are doar 2 funcţii importante şi anume păstrarea informa-
ţiei genetice şi furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Păstrarea in-
clude transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaţie la
alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN şi împărţirea egală a celor
două copii în timpul diviziunii celulare. A doua funcţie este legată de desci-
frarea informaţiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaţiei între
ADN şi proteine este ARN, care este sintetizat în procesul de transcriere a
ADN de către o enzimă numită ARN polimerază. ARNm rezultat serveşte
ca matriţă în procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc
în ribozomi. Practic ARN este cărăuşul informaţiei din nucleu în citoplasmă
unde are loc sinteza proteinelor. Dogma centrală a biologiei presupune
transmiterea unidirecţională a informaţiei de la ADN la proteine prin in-
termediul ARN (Figura 1). Informaţia genetică nu poate fi transmisă invers,
de la proteine la ADN. Informaţia genetică poate fi transmisă de la ARN la
ADN în cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exis-
tă cazuri de transmitere a informaţiei de la ADN direct la proteine.
13
Clonarea genelor constă în izolarea unei
gene dintr-un genom şi introducerea ei în alte
celule gazdă pentru multiplicare şi în unele
cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea
celulelor cu genele clonate se pot obţine mili-
oane de copii ale unei singure gene. Sumar,
procesul clonării constă din următoarele etape:
• amplificarea genei de interes
• introducerea genei de interes
într-un vector de clonare
• introducerea moleculelor recombi-
nate în celule gazdă
• selecţia celulelor transformate (pur-
tătoare ale moleculei recombinate)
Figura 1. Dogma centrală a biologiei.
• verificarea moleculelor recombinate
Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment

de ADN care se transcrie într-o moleculă de ARN. Moleculele de ARN re-
zultate în urma transcrierii pot fi împărţite în 2 categorii:
• ARN funcţional
• ARN informaţional
ARN funcţional este ARN care nu se traduce, îndeplineşte anumite
funcţii în celulă (în cea mai mare parte participă la procesul de traducere) şi
ocupă cea mai mare parte din ARN total din celulă: ARN ribosomal (ARNr)
şi ARN de transport (ARNt).
ARN informaţional este ARN mesager (ARNm) care codifică un
polipeptid şi serveşte ca matriţă în procesul de traducere (sinteză a proteine-
lor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonării codifică
un polipeptid. În alte cazuri scopul clonării nu este obligatoriu o genă, ci un
fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de
molecule apropiate ca mărime. Din această cauză în continuare se va utiliza
doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile.
Deoarece fragmentul ADN de interes sau ţintă se află într-un genom
este necesară extragerea acestuia. Există 2 modalităţi de a obţine fragmentul
dorit, fie prin tăierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tăierea
fragmentului din genom este mai dificilă deoarece necesită prezenţa unor
situsuri (secvenţe specifice) la capetele fragmentului, care necesită apoi o
izolare din amestecul de fragmente generate, iar numărul moleculelor deci
şi cantitatea de ADN este mică.
A doua opţiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des
14
utilizată. În acest scop se utilizează tehnica PCR (Polymerase Chain
Reaction). Această tehnică poate fi considerată un adevărat copiator de
gene. Tehnica este pe larg utilizată, este rapidă şi sensibilă deoarece necesi-
tă cantităţi foarte mici de ADN matriţă. O condiţie obligatorie pentru o am-
plificare reuşită este cunoaşterea secvenţei ţintă, în special la capetele aces-
teia. Dacă secvenţa este necunoscută, atunci se vor analiza cel puţin secven-
ţe ADN omoloage de la alte specii sau secvenţa de aminoacizi a proteinei
dacă este vorba despre o genă. Principiul tehnicii PCR este o imitaţie a pro-
cesului de replicare a ADN care are loc în celule. Dacă în celule pentru re-
plicare se foloseşte o întreagă serie de proteine, aici rolul unora dintre ele
este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN.
Denaturarea ADN presupune separarea celor două catene. Procesul este
reversibil, catenele complementare formând molecula dublu catenară după
înlăturarea agentului de denaturare. Reacţia de amplificare este una ciclică,
fiecare ciclu fiind alcătuit din 3 etape:
• denaturarea ADN
• alinierea amorselor
• sinteza catenei complementare de către ADN polimerază
După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează, iar după

35-40 de cicluri se obţin milioane de copii ale fragmentului ţintă pornind de
la o singură copie.
Denaturarea ADN este necesară pentru separarea celor 2 catene. Ca agent
denaturant se utilizează temperaturi înalte de 94-98ºC. Denaturarea din primul
ciclu durează câteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de
ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de
denaturare după primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec.
Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite şi oligonucleotide,
sunt secvenţe scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complemen-
tare cu extremităţile secvenţei ţintă şi formează cu acestea porţiuni scurte
dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenţele complementare,
temperatura este coborâtă la 40-60ºC timp de câteva zeci de secunde. Această
etapă este numită de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se sta-
bileşte la câteva grade (2-5ºC) mai puţin decât temperatura de topire (Tm) a
amorsei. Temperatura de topire se calculează în dependenţă de lungimea
amorsei şi de compoziţia ei. Există mai multe formule de calcul, cea mai sim-
plă formulă de calcul pentru o amorsă de până în 25 de nucleotide este:
Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)
15
Unde G, C, A şi T sunt numărul de nucleotide ce conţin aceste baze
azotate. Numărul de G şi C se înmulţeşte dublu faţă de A şi T deoarece
între acestea există 3 legături de hidrogen, în consecinţă moleculele bogate
în G şi C au o temperatură mai mare de topire.
Există câteva reguli pentru construirea amorselor şi anume:
• numărul de nucleotide este de 15-35
• temperatura de topire a amorselor trebuie să fie între 40 şi
70ºC
• conţinutul de G şi C nu trebuie să depăşească 50-55%
• la capătul 3' al amorsei este de dorit să fie o G sau C, deoare-
ce oferă o stabilitate mai mare
• amorsele nu trebuie să prezinte complementaritate internă,
în caz contrar amorsa poate forma secvenţe interne dublu ca-
tenare care au aspect de stem sau buclă
• cele două amorse sens (forward) şi antisens (reverse) nu tre-
buie sa fie complementare între ele, altfel se vor forma porţi-
uni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se
vor amplifica porţiunile scurte rămase monocatenare.
De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi

amorsa ADN, polimeraza poate iniţia sinteza catenei complementare. ADN
polimeraza catalizează sinteza catenei complementare în direcţia 5'→3' (Fi-
gura 2). Amorsele servesc în primul rând la delimitarea fragmentului am-
plificat, dar şi ca punct start pentru ADN polimerază, care nu poate porni
sinteza de la zero şi are nevoie de un capăt liber 3'.
Iniţial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolată de la
bacteria Escherichia coli, care are activitatea optimă de sinteză la 37°C. Cel
mai mare dezavantaj al utilizării acestei enzime era inactivarea termică în
timpul denaturării ADN. În acest fel tuburile de reacţie trebuiau schimbate
de la o temperatură la alta şi după fiecare ciclu era nevoie de un surplus de
ADN polimerază. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte
costisitoare. Salvarea acestei metode a venit după descoperirea şi descrierea
ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluţionară în acest
sens, pe larg utilizată şi astăzi este Taq polimeraza. Această enzimă este o
ADN polimerază, izolată de la o bacterie termofilă Thermococcus aquaticus
(de unde şi denumirea ei), care sintetizează polimerizarea nucleotidelor
trifosfat într-un lanţ polinucleotidic în direcţia 5′→3′. Taq polimeraza are
activitatea optimă la 72°C şi nu se denaturează la temperaturi ridicate de
peste 90°C foarte repede, astfel după câteva ore la 95°C pierderea de activi-
tate este nesemnificativă. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de
16
aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongării necesare sinte-
zei va fi în dependenţă de mărimea fragmentului ţintă. Pentru un fragment
de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000
de nucleotide – 2minute.
Etapa iniţială
de denaturare
5' 3'
ADN genomic cu
fragmentul ţintă
3' 5'
5' 3'
Alinierea amorse- 3 5'
lor la capetele
fragmentului ţintă 5' 3
'
Ciclu I
3' 5'
5' 3'
Etapa de elongare sau
sinteză a catenei
complementare de
către ADN polimerază 3' 5'
5' 3'
Sfârşitul
primului ciclu
3' 5'
5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'
5' 3' 5' 3'
Ciclu
3' 3' 5'
II
5' 3' 5' 3'
3' 3' 5'
17
5' 3' 5' 3'
3' 5' 3' 5'
5' 3' 5' 3'

3' 3'
Ciclu III
5' 3' 5' 3'

3' 5' 3' 5'
5' 3' 5' 3'

3' 5' 3'
Taq polimeraza
amorsă
amorsă ce indică direcţia de sinteză
Figura 2. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.
Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă.

Acest tip este asemănător PCR obişnuit, doar că foloseşte o matriţă de ARN
pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabilă de această sinteză este
transcriptaza inversă, care este de fapt o ADN polimerază
ARN-dependentă. Taq polimeraza este o ADN polimerază deoarece sinteti-
zează ADN şi este ADN dependentă deoarece utilizează o matriţă ADN
pentru sinteză. Transcriptaza inversă a fost izolată de la virusurile care au
material genetic ARN şi în momentul intrării în celulă necesită sinteza unei
copii a materialului său genetic. RT-PCR se utilizează pentru obţinerea co-
piilor de gene eucariote care nu conţin introni şi analiza exprimării de gene.
În ambele cazuri se porneşte de la ARNm (ARN informaţional care codifică
proteine).
Enzime de restricţie
Enzimele de restricţie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule
monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele
pot fi numite cu alte cuvinte adevărate foarfece de ADN. Restrictazele re-
cunosc doar anumite secvenţe scurte numite situsuri specifice de recunoaş-
tere, se fixează de acestea şi taie legăturile fosfoesterice între nucleotide.
Aceste enzime au fost descoperite la bacterii şi se presupune că funcţia
lor este de apărare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). În mo-
18
mentul intrării ADN fagic în bacterii, enzimele de restricţie digeră aceste
molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restric-
ţie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricţie, în general, nu
taie ADN metilat. Până acum au fost descrise 4000 de enzime de restricţie
de la câteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se împart în 3
clase: I, II şi III. Această clasificare este în dependenţă de cofactorul utilizat
şi de secvenţa de recunoaştere. Enzimele cele mai utilizate în tehnicile mo-
leculare sunt cele de tip II, care au secvenţa de recunoaştere un palindrom
şi utilizează ioni de Mg2+ ca şi cofactor. Secvenţa palindrom este alcătuită
din 4-6 nucleotide şi citită pe ambele catene în direcţia 5′→3′ este identică.
Nomenclatura enzimelor de restricţie porneşte de la denumirea bacte-
riei de la care a fost izolată. Astfel, HindIII este izolată de Heamophilus
influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13.
A B
EcoRI SmaI
5′ GAATTC 3′ 5′ GGGCCC 3′
CTTAAG CCCGGG
3′ 5′ 3′ 5′
5′ G AATTC 3′ 5′ GGG CCC 3′

CTTAA G CCC GGG
3′ 5′ 3′ 5′
Figura 3. Secvenţele de recunoaştere pentru enzimele EcoRI (A) şi SmaI (B) şi capetele libere după
tăiere. Locurile de tăiere sunt indicate cu săgeţi.
Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2

feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI şi EcoRI generează capete coezive
după tăiere, iar enzimele SmaI şi EcoRV generează capete drepte sau netede
(Figura 3).
Cu ajutorul unor programe speciale se pot alcătui hărţi de restricţie ca-
re reprezintă situsurile de recunoaştere pentru diferite restrictaze într-o
secvenţă (Figura 4).
19
B amH I (533)
H infI (7 5) E coRI (605)
E coRV (5 8) H infI (616) B amH I (7 7 3)
H infI (32) H infI (461) E coRI (633) NcoI (7 7 7 ) H infI (942
Y LR3 7 7 C
1047 bp
Figura 4. Harta de restricţie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre în paranteze
sunt indicate situsurile enzimelor de restricţie.
Ligarea fragmentelor de ADN

Deşi moleculele de ADN pot fi asemănate cu nişte fire, acestea nu pot fi
legate prin creare de noduri sau nu există nici un lipici special. Pentru lega-
rea fragmentelor de ADN se utilizează o enzimă numită ADN ligază.
Această enzimă reface legăturile fosfoesterice între gruparea hidroxil a unui
nucleotid (capătul 3′) şi gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment
(capătul 5′) (Figura 5). Funcţia ligazei în celule vii este legarea fragmentelor
în timpul replicării, recombinării şi după repararea ADN. Cea mai des uti-
lizată este ADN ligaza T4 izolată de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4
utilizează ATP ca şi cofactor.
Figura 5. Reprezentarea schematică de legare de către ADN ligază a două fragmente ADN care au
capete netede.
Vectori de clonare
Prin vectori de clonare subînţelegem molecule de ADN transportatoare
ale fragmentului de ADN străin în celulele gazdă. Vectorii sunt de mai
multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide şi vectori artificiali. Aceşti
vectori sunt utilizaţi în dependenţă de scopul clonării. Cele mai pe larg uti-
lizate sunt plasmidele. Un plasmid este o moleculă dublu catenară de
ADN, care este circulară, închisă şi capabilă de replicare autonomă în celule
20
gazdă. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izola-
te de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nişte secvenţe speci-
fice necesare replicării, clonării, selecţiei şi uneori exprimării genelor. Pen-
tru replicarea autonomă în celule gazdă plasmidele conţin secvenţa ori, care
este originea de replicare. Nicio moleculă de ADN nu poate fi replicată fără
o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de
ADN de unde poate începe replicarea şi care este recunoscută de anumite
proteine care iniţiază replicarea.
O regiune foarte importantă într-un vector de clonare este Situsul Mul-
tiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). În această
regiune se introduce fragmentul ţintă de ADN cu ajutorul enzimelor de
restricţie şi a ligazei. Atât vectorul cât şi fragmentul ADN sunt tăiate cu
aceleaşi enzime de restricţie şi legate împreună cu ajutorul ligazei. SMC
conţine secvenţele de recunoaştere pentru mai multe enzime de restricţie
care nu se conţin în altă regiune a vectorului.
O altă componentă foarte importantă a plasmidelor sunt markerii de
selecţie care sunt de obicei nişte gene, a căror produs (enzimă) fac posibilă
selectarea celulelor cu plasmid de cele fără plasmid care sunt mai numeroa-
se. Cei mai frecvenţi markeri utilizaţi sunt genele ce conferă rezistenţă la
antibiotice, mai corect spus produsul genei conferă rezistenţă. Spre exem-
plu, β-lactamaza conferă rezistenţă la ampicilină. Plasmidele care conţin
gena pentru această enzimă vor proteja celulele bacteriene de efectul anti-
bioticului. Astfel dacă un amestec de celule transformate cu plasmide care
vor conţine atât celule cu, cât şi fără plasmid, se însămânţează pe un mediu
cu ampicilină, vor supravieţui doar celulele care conţin plasmidul.
Un alt fel de selecţie este selecţia celulelor transformate cu plasmid re-
combinat adică cu insert de cele cu plasmid fără insert. Insert se referă la
fragmentul de ADN ţintă clonat. În acest scop situsul multiplu de clonare
se află într-o genă ce codifică o enzimă. Dacă în SMC nu a fost introdus
niciun fragment ADN atunci gena este intactă, produsul ei este o proteină
activă. Dacă în SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este
modificată şi produsul ei este inactiv. Spre exemplu dacă SMC se află în
gena lacZ′ care codifică subunitatea α a enzimei β-galactozidază, atunci
produsul acestei gene împreună cu subunităţile codificate din genomul
celulei gazdă bacteriene vor forma o enzimă activă capabilă să metabolize-
ze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil
galactopiranozid) care este adăugat în mediu şi este incolor. Dacă
β-galactozidaza este activă atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul
format în urma reacţiei va avea o culoare albastră. În acest fel coloniile re-
21
zultate după transformare care conţin vectorul fără insert vor fi albastre, iar
cele ce conţin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzimă
activă capabilă de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecţie
utilizează o enzimă toxică pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu
plasmid fără insert au gena funcţională care va provoca moartea celulelor.
Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncţională
şi vor supraveţui.
Vectorii de clonare au de obicei mărime mică, doar de câteva mii de pb
şi în care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb până la 2000-3000
pb (Figura 6: A, B). O caracteristică importantă pentru plasmide este numă-
rul de copii per celulă. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un număr
mai mare de copii per celulă. Acest fapt permite obţinerea unei cantităţi
mari de ADN plasmidic dintr-o cultură mică de bacterii (din 3-5 ml de cul-
tură se pot obţine câteva μg de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari
numărul copiilor per celulă este mai mic, în consecinţă şi pentru a obţine o
cantitate mai mare de ADN este necesară o cantitate mai mare de cultură.
Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofe-
ră în plus posibilitatea exprimării genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de
exprimare trebuie să mai conţină câteva elemente în plus faţă de vectorii de
clonare. Aceste elemente sunt cele care se găsesc şi în genom şi fac parte
dintr-o genă: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START
şi STOP care delimitează cadrul deschis de citire (termenul englezesc este
Open Reading Frame). Promotorul este o secvenţă care se află în amonte de
genă şi este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixează la nivelul
promotorului şi iniţiază transcrierea. Numai în prezenţa promotorului ex-
primarea va fi foarte scăzută, de aceea situsul de legare al ribozomilor
(termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secvenţă care se
transcrie dar care nu se traduce şi care este recunoscută de ribosomi.
Ribosomii se leagă la acest situs şi se deplasează de-a lungul ARNm până
întâlnesc primul codon START de unde începe traducerea. Codonul START
la procariote este în cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei
inclus în situsul multiplu de clonare, în caz contrar acesta se poate introdu-
ce în fragmentul ţintă cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus şi el
de obicei în situsul de clonare. În unele cazuri acesta este prezent după re-
giuni care codifică anumite aşa-zise etichete. Etichetele facilitează purifica-
rea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des
utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza
(GST) şi proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este
termenul în engleză). Aceste etichete vor fi parte integrantă a proteinelor la
22
capătul ei C-terminal sau N-terminal dacă secvenţa ce codifică eticheta este
prezentă după sau înainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor
conferi proteinelor recombinate afinitate faţă de anumite răşini cromatogra-
fice.
A ClaI (25)
B LacZ
Eco RI (4360) HindIII (30)
EcoRI
Sca I (3847) Eco RV (188)
PvuI (3737) BamHI (376)

Sac I (6
AP r SphI (567) bla(AmR) Kpn I (6

Pst I (3612) SalI (652)
Xba I (6
TC r pTZ57R
Bam HI
2886 bp
pBR322 MCS
4361 bp
Apa I (6
SalI (6
Pst I (6
Hin dI
ORI T7 p
Bst Z17I (2247)
T7 terminator Ori
His tag
C XhoI (159)
Not I (167)
HindIII (174)
f1 origin SalI (180)
Sac I (191)
M CS
Eco RI (193)
bla (Ap) BamHI (199
NdeI (239
T7 prom
pET-21a
BglII (34
5443 bp
lacI
ColE1 pBR322 origin
Figura 6. Hărţile unor vectori plasmidici. A – harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezistenţă
la antibiotice: Apr conferă rezistenţă la ampicilină, iar TCr rezistenţă la tetraciclină, situsul multiplu
de clonare îl poate constitui oricare dintre cele două gene de rezistenţă, în dependenţă de gena selecta-
tă pentru inserare, rezistenţa la antibioticul respectiv se va pierde . B – harta plasmidului de clonare
pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezistenţă la ampicilină, iar situsul multi-
plu de clonare se află în gena lacZ' care oferă selecţia alb-albastră a clonelor pozitive. C – harta vector
de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care conferă rezistenţă la ampicilină,
situsul multiplu de clonare care conţine un codon START şi un codon STOP după eticheta de 6
histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.
23
Introducerea moleculelor recombinate în celule gazdă
Introducerea plasmidelor recombinate în celule gazdă se numeşte
transformare dacă sunt utilizate celule bacteriene sau transfecţie dacă sunt
celule eucariote. În continuare se va detalia doar transformarea celulelor
procariote, acestea având cea mai mare aplicabilitate şi simplitate în scopul
obţinerii clonelor şi proteinelor recombinate. Există două tipuri de trans-
formare a celulelor bacteriene pe larg utilizate în laboratoarele de biologie
moleculară:
• transformarea chimică
• transformare sub influenţa câmpului electric.
Ambele tipuri de transformare necesită inducerea unei competenţe de
transformare, deoarece E. coli nu are proprietăţi de transformare naturală.
Această competenţă în cazul transformării chimice este indusă cu
CaCl2. În acest scop se realizează o cultură de E. coli şi prin tratarea celule-
lor cu clorură de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bac-
teriene (Figura 7 A). Celulele sunt şocate termic foarte scurt, timp de ma-
xim 2 minute, la 42°C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor
recombinate în celulele bacteriene.
Transformarea în câmp electric este mai eficientă decât transformarea
chimică. Prepararea celulelor competente presupune doar creşterea lor pâ-
nă în faza logaritmică (D=600nm = 0,6-0,8) şi înlăturarea prin spălări repe-
tate a mediului de cultură. Aceste spălări repetate vor asigura eliminarea
ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este
necesar un aparat numit electroporator, care va crea câmpul electric între
doi electrozi. Amestecul de celule competente şi plasmide recombinate vor
fi depuse într-o cuvă specială de electroporare, ai cărei pereţi laterali sunt
electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de
câteva msec (Figura 7 B). După transformare celulele şocate sunt preluate
în mediu de cultură şi apoi însămânţate pe mediu selectiv cu antibiotice.
Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte din-
tre ele fiind netransformate, adică fără plasmid. Eficienţa de transformare a
celulelor se poate măsura efectuând o transformare cu o cantitate de 1 ng
de ADN plasmidic şi apoi numărând coloniile rezultate. Numărul de colo-
nii va corespunde numărului de celulele transformate deoarece fiecare co-
lonie ia naştere dintr-o singură celulă. Numărul obţinut de la transformarea
a 1 ng de ADN plasmidic se raportează la 1 μg de ADN (înmulţind valoa-
rea la 1000). O eficienţă bună de transformare este 106, ceea ce înseamnă ca
la transformarea unui μg de plasmid s-ar obţine 1 milion de colonii, o va-
loare foarte mare ţinând cont de faptul că avem nevoie de o singură colonie
24
sau de câteva când avem un amestec eterogen de molecule ţintă. Desigur în
amestecul de ligare numărul de molecule recombinate este mic şi din aceas-
tă cauză este recomandată o eficienţă cât mai mare a celulelor competente.
Fiecare dintre cele două metode de transformare prezintă avantaje şi
dezavantaje legate de eficienţa de transformare şi de costuri. Transformarea
chimică este mai puţin eficientă decât electroporarea, dar mai ieftină deoa-
rece nu necesită aparatură şi cuve costisitoare.
A
2 min
CaCl2
42ºC
Însămânţarea celule-
Celule de Celule transformate lor transformate pe
B E.coli de E.coli mediu selectiv
Spălarea celulelor
bacteriene 1800 V
5 msec
Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A – transformarea chimică cu

CaCl2; B – electroporarea celulelor bacteriene.
Electroforeza acizilor nucleici

Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcină într-un
câmp electric. Migrarea moleculelor se realizează printr-o matrice specifică.
Metoda este aplicată pentru analiza proteinelor şi a acizilor nucleici. Pentru
proteine se aplică cel mai des electroforeza proteinelor în condiţii denatu-
rante în gel de poliacrilamidă (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacril-
amida se poate utiliza ca matrice şi pentru electroforeza acizilor nucleici
care oferă o rezoluţie foarte bună a separării fragmentelor de ADN, mai
ales în cazul fragmentelor mici. Această matrice este folosită mai rar în la-
boratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioasă. Primul loc în
utilizarea vizualizării acizilor nucleici aparţine electroforezei în gel de
agaroză. Deşi metoda oferă o rezoluţie inferioară celei din poliacrilamidă,
ea este utilizată cu succes deoarece este mai simplă.
Moleculele de acizi nucleici sunt încărcate negativ datorită grupărilor
fosfat. Această sarcină face posibilă migrarea moleculelor de ADN şi ARN
25
într-un câmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va
deplasa în câmp electric cu aceeaşi viteză. Moleculele mici se vor deplasa mai
repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel sepa-
rarea moleculelor va fi în dependenţă de masa lor moleculară. Pentru estima-
rea aproximativă a mărimii fragmentelor în acelaşi gel, dar în godeu separat
se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunos-
cute. Acest amestec de molecule se numeşte marker molecular ADN.
Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roşii. Gelurile de
agaroză se realizează prin încălzirea agarozei într-un tampon specific. Con-
centraţia agarozei în gel poate fi între 1 şi 3% în dependenţă de scopul ur-
mărit. Cu cât concentraţia agarozei este mai mare, cu atât mărimea porilor
va fi mai mică. La concentraţii mai mici de agaroză, porii vor fi mai mari şi
migrarea moleculelor mai rapidă. În concluzie concentraţii mai mici se folo-
sesc pentru fragmente mari (câteva mii de pb), iar concentraţii mari pentru
fragmente mici. Gelurile de agaroză de 1% sunt cel mai des utilizate, ofe-
rind separarea moleculelor între 0,1 şi 10 kpb. Gelurile de agaroză sunt pla-
sate între cei doi electrozi în cuve speciale care conţin tampon de migrare.
Acest tampon este acelaşi folosit şi pentru realizarea gelului. Cele mai folo-
site tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) şi TBE (Tris/Borat/EDTA).
Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesară utili-
zarea unui colorant. Cel mai des folosită în acest scop este bromura de etidiu,
care fixată de ADN în lumină ultravioletă devine fluorescentă şi are o culoare
portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercalează între bazele azotate
din molecula dublu catenară de ADN. Lungimea de undă a luminii ultravio-
lete la care este expus gelul trebuie să fie cuprinsă între 260 şi 300 nm.
A B
Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză.

A – imaginea gelului la expunerea în UV; B – fotografia aceluiaşi gel.
Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi pu-

rificarea ADN. Vizualizarea ne oferă informaţii despre integritatea ADN
26
(ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, es-
timarea cantităţii de ADN obţinută în reacţiile PCR sau de extracţie. ADN
poate fi purificat din gel de agaroză după migrare prin excizarea fragmen-
tului ţintă şi purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de
purificări.
Verificarea moleculelor recombinate

Rezultatul ligării şi transformării se poate vedea doar după 12-18 ore
de la transformare când apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariţia
coloniilor nu indică neapărat şi o reuşită deplină a clonării, deoarece aces-
tea pot conţine un amestec de colonii pozitive şi colonii cu plasmid fără
insert. Chiar dacă se foloseşte un sistem alb-albastru de selecţie a coloniilor
pozitive, acestea necesită totuşi o dovadă în plus a prezenţei plasmidului
recombinat. În acest scop se va efectua o cultură lichidă de 3-5 ml de mediu
cu antibiotic care se va însămânţa cu o singură colonie. Cultura se va incu-
ba peste noapte cu agitare la 37°C. Ziua următoare din bacteriile rezultate
se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajuto-
rul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmează a fi analizat iniţial prin
digestie enzimatică şi apoi prin secvenţializare. Digestia ADN plasmidic se
va realiza cu enzimele de restricţie cu care acesta a fost introdus în vector
sau care se află la extremele situsului multiplu de clonare. Această digestie
va confirma prezenţa insertului în plasmid şi aproximativ mărimea acestu-
ia, dar nu va furniza nicio informaţie despre secvenţa fragmentului clonat.
Secvenţializarea fragmentului ţintă este verificarea definitivă a clonării.
Această verificare este necesară deoarece ADN polimeraza utilizată pentru
amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sinteză. Pentru a
evita erorile în produşii PCR se poate utiliza o ADN polimerază care are
proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt
Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza ş. a. Taq polimeraza nu are
activitate de corectare a erorilor, dar asigură de obicei randamente de sinte-
ză mai mari. În unele cazuri se utilizează un amestec de 2 polimeraze (3
părţi de Taq polimerază şi o parte Pfu polimerază) pentru a combina un
randament mai mare cu o fidelitate crescută.
În cadrul Centrului de Biologie Moleculară există 2 secvenţiatoare:
Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu de-
tecţie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ™ 8800 Genetic Analysis
System (laser cu detecţie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizează
principiul Sanger de secvenţiere. Acest principiu presupune utilizarea unei
variante de PCR pentru secvenţiere. Matriţa ADN ce urmează a fi
secvenţiată este denaturată, apoi la unul din capetele sale are loc ataşarea
27
unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei comple-
mentare. Amestecul PCR conţine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar
şi di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conţin gruparea OH în
poziţia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupări va face imposibilă continua-
rea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate adăuga următorul
nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece
se foloseşte o singură amorsă) de diferite mărimi. Numărul de cicluri este
de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc în toate
punctele matriţei de ADN. Pentru detecţia fragmentelor, fiecare ddNTP
este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt sepa-
rate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capi-
lar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de câţiva micro-
litri vor fi separaţi în gelul din capilar. Migrarea fragmentelor în gel este în
dependenţă de mărimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele
mai mari. În ultima parte a capilarului există o fereastră transparentă prin
care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescenţa emisă va fi
captată şi prezentată sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electrofo-
regramele sunt apoi analizate şi comparate cu secvenţa existentă în bazele
de date. Mărimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenţializate variază
între 600 şi 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matriţe dificile
(cu secvenţe repetitive) este necesară utilzarea unor kituri speciale.
Figura 9. Electroforegrama unei secvenţe obţinută cu ajutorul analizorului ABI Prism 310.
Exprimarea genelor în sistem procariot

Clonarea genelor vizează în principal două obiective posibile: multipli-
carea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea în scopul
multiplicării fragmentului este utilizată atunci când ADN supus analizei
este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul
electroforezei şi la care se urmăreşte cunoaşterea secvenţei. În acest scop
amestecul de fragmente se clonează într-un vector de clonare, iar clonele
pozitive sunt apoi secvenţializate.
28
Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg în obţinerea de proteine recombi-
nate. Ele pot fi numite adevărate fabrici de proteine la comandă, care însă câ-
teodată „refuză” să sintetizeze proteinele comandate şi de ce cele mai dese ori
străine celulei bacteriene. Clonarea în scopul exprimării genei şi obţinerii de
proteină recombinată include câteva aspecte care sunt importante pentru ex-
primare. Gena codificatoare poate fi clonată direct în vectorul de exprimare.
Plasmidele de exprimare conţin neapărat un promotor recunoscut de ARN
polimeraza celulei gazdă, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon
START şi unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte impor-
tant în acest caz este păstrarea cadrului deschis de citire, adică împărţirea exac-
tă pe codoni a genei de la primul codon tradus până la ultimul. Promotorii din
aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor
este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre
exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigură de obicei o
supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conţine promotorul de la
fagul T7, situsul de recunoaştere a ribosomilor, codonul START în situsul mul-
tiplu de clonare şi codonul STOP după o etichetă de 6 histidine. Dacă se optea-
ză pentru prezenţa unei etichete 6×His la capătul C-terminal a proteinei pentru
facilitarea purificării, atunci din genă se va înlătura codonul STOP. Dacă aceas-
tă etichetă nu este necesară, atunci în genă se va păstra codonul STOP şi tradu-
cerea se va opri înainte de etichetă. Promotorul T7 nu este recunoscut de către
ARN polimeraza de la E. coli şi simpla prezenţă a plasmidului în celulele bac-
teriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesită tulpini de E. coli
care conţin gena pentru ARN polimerază de la fagul T7. Această genă se află
sub controlul promotorului lac UV5 şi a operatorului lac (Figura 10).
Figura 10. Inhibiţia exprimării genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 şi a genei ţintă în celule-
le gazdă de E. coli în lipsa inductorului.
29
Operatorul lac este o secvenţă recunoscută de către o proteină numită
represorul lac. Atunci când în mediu nu există lactoză (sau analogi ai lacto-
zei) represorul lac se fixează la operatorul lac şi împiedică transcrierea genei
pe care o reglează, care în acest caz este gena pentru T7 ARN polimerază. În
absenţa T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei ţintă din
plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se află atât în genomul
bacteriei gazdă cât şi în plasmidul de exprimare. Agentul care induce expri-
marea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixează de
represorul lac şi cauzează disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel pro-
motorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va tran-
scrie gena pentru T7 ARN polimerază. Aceasta din urmă va recunoaşte pro-
motorul T7 din plamsid şi va transcrie gena ţintă. Acest sistem de exprimare
este unul foarte puternic şi care poate asigura o producţie de proteină care va
alcătui până la 50% din proteinele totale bacteriene.
Purificarea proteinelor recombinate

Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice.
Pentru o purificare cât mai bună din amestecul total de proteine este nece-
sară purificarea în cel puţin 2 etape prin metode cromatografice diferite.
Ataşarea unor etichete la proteinele recombinate asigură purificarea protei-
nelor într-o singură etapă, ceea ce reduce timpul necesar şi asigură randa-
mente de purificare mai mari (Figura 11). Dacă eticheta deranjează în anali-
za ulterioară a proteinei, atunci se poate recurge la înlăturarea acesteia prin
digestie cu peptidaze. În acest scop pentru clonare şi exprimare se va alege
un plasmid care conţine situsul pentru peptidază, cum este spre exemplu
situsul pentru trombină în cazul plasmidului pET28.
A B C
Figura 11. Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie de

afinitate. A – încărcarea amestecului total de proteine pe coloana cu răşină; B – spălarea coloanei cu
tampon şi fixarea proteinei ţintă de răşină; C – eluarea proteinei ţintă de pe coloană.
30
2. Utilizarea clonării de gene şi exprimării de proteine recom-
binate în studii interdisciplinare
Clonarea genelor în ultimii ani a devenit o tehnică indispensabilă în la-
boratoarele de biologie moleculară. Una dintre aplicaţiile acestei tehnici,
importante nu numai pentru biologie, dar şi pentru studii interdisciplinare
este utilizarea ei în scopul obţinerii de proteine recombinate. Clonarea ge-
nelor şi exprimarea lor în celule gazdă reprezintă o sursă foarte preţioasă
de proteine. În cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele
în care aceasta se exprimă în mod firesc natural prezintă mai multe dificul-
tăţi:
• cantitatea de proteine în ţesuturi este foarte mică, spre exemplu
pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesară o can-
titate de zeci de litri de cultură bacteriană, iar rezultatul purifi-
cărilor în câteva etape pot fi sub 100 mg de proteină;
• obţinerea unei cantităţi mari de ţesut pentru purificare este
aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe
care nu putem să le cultivăm în condiţii de laborator;
• obţinerea materialului pentru purificare implică probleme etice,
cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obţinerea de
proteine din celule umane ar fi imposibilă;
• purificarea se face în mai multe etape care necesită timp, con-
sumabile şi are randamente mai mici.
Aceste dezavantaje ale purificării direct din material biologic sunt eli-
minate în cazul exprimării genelor în celule gazdă. Un mare avantaj al aces-
tei metode este posibilitatea introducerii de mutaţii care pot dezvălui rolul
unor domenii sau aminoacizi particulari în activitatea proteinei. Prin in-
termediul tehnicilor de mutageneză pot fi introduse mai multe tipuri de
mutaţii:
• mutaţii missens care schimbă un aminoacid cu altul;
• deleţii în care porţiuni întregi din lanţul polipeptidic pot fi înlă-
turate;
• inserţii care constau în introducerea de fragmente noi în gena
codificatoare şi respectiv în proteina recombinată;
• fuzionării, se pot fuziona proteine între ele sau regiuni ale unei
proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea
N-terminală a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu
capătul C-terminal al aceleiaşi proteine de la o specie înrudită;
• proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate
31
cu anumite molecule care sunt introduse în proteine în procesul
lor de sinteză sau pot fi fuziuni. Un exemplu în acest sens este
marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, în mod
specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor
prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi facilitează
detecţia lor.
Clonarea genelor şi exprimarea lor în sistem procariot este tehnica la

care se apelează cel mai des, deoarece este mai rapidă şi mai puţin costisi-
toare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o
proteină are structură: primară, secundară, terţiară şi cuaternară. Exprima-
rea genelor şi sinteza proteinelor în celulele procariote asigură doar struc-
tura primară exactă a polipeptidului sintetizat. În unele cazuri proteinele
adoptă structura secundară independent după sinteză, în alte cazuri este
nevoie de condiţii speciale şi alte proteine care contribuie la adoptarea con-
formaţiei proteinei active. Unele proteine atât de la eucariote cât şi de la
procariote sintetizate în celule gazdă de E. coli nu reuşesc să adopte o struc-
tură secundară corectă, iar ca rezultat polipeptidele acumulate în citoplas-
mă formează corpi de incluziune. Există cazuri când acumularea proteinei
sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune oferă
posibilitatea unei purificări printr-o singură etapă în condiţii denaturante.
Proteinele denaturate purificate în acest mod pot fi utilizate pentru imuni-
zarea de animale în scopul producerii de anticorpi. Cel mai important as-
pect pentru imunizare este secvenţa de aminoacizi a proteinei şi nu structu-
ra ei secundară sau terţiară. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de
incluziune nu poate fi prezisă pe baza apartenenţei genei sau pe baza anali-
zei structurii primare. O altă problemă care poate apărea este neexprimarea
genei. Cauzele neexprimării pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor
gazdă. Un alt dezavantaj (deşi în unele cazuri este un avantaj) este lipsa
modificărilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate în celule bacterie-
ne. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesită nu numai adaptări con-
formaţionale dar şi modificări post-traducere cum ar fi fosforilări,
glicozilări ş. a. Dacă prezenţa acestor modificări este absolut necesară,
atunci se va recurge la clonarea genei în sistem procariot şi exprimarea ei în
celule gazdă eucariote. Lipsa modificărilor post-traducere este un avantaj
atunci când este cunoscută funcţia proteinei active şi se doreşte să se cu-
noască rolul grupărilor care sunt adăugate după sinteză. În acest fel protei-
na recombinată nu va fi modificată şi se va putea deduce rolul acestor gru-
pări în activitatea proteinei.
32
3. Infrastructura existentă în cadrul Centrului de Biologie Mo-
leculară
Denumire echipament Caracteristici
Instalaţie de preluare şi prelu-
Achiziţia şi interpretarea imaginilor de pe geluri de
crare a imaginilor Ced Limited,
poliacrilamidă sau geluri de agaroză
Marea Britanie
Instalaţie de apă ultrapură,
Purificarea apei până la o rezistivitate de 18,2 MΩ/cm
Elga-Lab Water, Marea Brita-
(apa MilliQ)
nie
Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum
Centrifugă cu răcire Sigma
28000xg, răcire de la temperatura camerei la 0°C, rotor
3K18 (4 rotoare), Sigma, Ger-
Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml şi rotor
mania
4x250ml
Centrifugă de masă Sigma
Fără răcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg)
1-13, Sigma, Germania
Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de
“Thermocycler”, Eppendorf,
0,2ml, 0,5ml şi placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de
Germania
temperatură în tub
Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR în tuburi de
“Thermocycler”, Corbett
0,2ml şi plăci ELISA cu 96 de godeuri; gradient de tempe-
Research, Australia
ratură
Electroporator Eppendorf, Transformarea celulelor electrocompetente – bacterii şi
Germania drojdii
Spectrofotometru UV-Vis
monofascicul M301, CamSpec, Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm
Marea Britanie
Spectrofotometru Jasco V-530
Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluţie 1 nm, cu
dublu-fascicul cu termostatare,
termostatare, pentru cinetică enzimatică
Jasco, Japonia
Patru instalaţii electroforeză Electroforeză verticală în gel de poliacrilamidă, max. 32
proteine, Consort, Belgia probe
Şase instalaţii electroforeza
Electroforeza orizontală în gel de agaroză, max. 48 probe
acizi nucleici, Consort, Belgia
pH-metru P901 (două bucăţi), Masurarea pH-ului, electrod combinat prevăzut cu senzor
Consort, Belgia de temperatură
Congelator temperaturi foarte
Congelare probe biologice la -82ºC
scăzute, 70 litri, Sanyo, Japonia
Congelator temperaturi foarte
scăzute, 100 litri, Snijders Congelare probe biologice la -82ºC
Scientific, Olanda
Două balanţe analitice, Scaltec, Domeniul de măsurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare,
Germania interfaţă pentru calculator şi imprimantă
Două incubatoare bacteriologi- Incubarea culturilor bacteriene şi a probelor moleculare
ce, Memmert, Germania de la temperatura camerei la 70ºC
Doua bai de apa cu agitare,
Incubarea probelor biologice pana la 100ºC, (3%)
Memmert, Germania
33
Analizor Genetic ABI Prism
310, Applied Biosystems, SUA
laser cu detecţie pentru 5 Secvenţierea fragmentelor de ADN, identificare umană şi
fluorocromi determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza
Analizor Genetic CEQ™ 8800 capilară la 15kV; soft-uri speciale pentru secvenţiere şi
Genetic Analysis System laser genotipare;
cu detecţie pentru 4
fluorocromi
Instalaţie Real Time PCR, Amplificarea ADN-ului în timp real; detecţia simultană a
Corbett Research, Australia 4 fluorocromi
Separarea probelor prin cromatografie de înaltă perfor-
Instalaţie HPLC, Jasco, Japonia manţă; gradient binar de înaltă presiune şi gradient cua-
ternar de joasă presiune
Microscop inversat NIKON
Studiul preparatelor celulare şi tisulare în lumina norma-
Eclipse TE2000S, Nikon, Japo-
lă, contrast de fază şi fluorescenţă
nia
Autoclav 80l, Selecta, Spania
Sterilizarea umedă sau uscată a mediilor de cultură, mate-
Autoclav AE-75-DRY Raypa,
rialelor şi instrumentelor
Spania
Ultrasonicator cu patru sonde, Dezintegrarea celulelor bacteriene, ţesuturilor animale şi
Sonics & Materials vegetale în volume de la 1ml până la 1 litru
Hota PCR cu flux laminar Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, ilumina-
steril, Telstar, Spania re, preparare probe PCR (4%
Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3
Hota flux laminar biohazard
µm 99,97%), prefiltru reciclabil (3-30 µm); flux de aer
100, Coreea de Sud
reglabil în 9 trepte (0,35-0,5 m/s);
4.Bibliografie
1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecu-
lar Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science.
2. Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York:
W. H. Freeman Company.
3. Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition,
Wiley-Blackwell Publishing.
4. Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant
DNA, 2nd Edition, Academic Press.
5. Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles
and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press.
6. Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression
Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press.
7. Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic
Analysis, New York: W. H. Freeman Company.
8. Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An
Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company.
9. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Mo-
lecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company.
34
10. McPherson M.J., and. Mǿller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench,
1st edition, Springer-Verlag Telos.
11. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1
edition, Taylor & Francis.
12. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor în geluri de poliacrilamidă, Editura Teh-
nică, Bucureşti.
13. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA:
Genes and Genomes - A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.
35
Aplicaţii ale tehnicilor de biologie moleculară în studii
interdisciplinare
Cuprins
1. Metoda enzimatică de sinteză a acizilor aminaţi.................................................... 36

2. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor ............................................... 57
3. Bibliografie ............................................................................................................. 60
1. Metoda enzimatică de sinteză a acizilor aminaţi

Un număr mare de aminoacizi se pot obţine prin sinteză enzimatică,
care nu se aplică la scară industrială la fel ca în fermentarea directă, din
cauza costurilor prea mari a substratelor. Această metodă capătă o amploa-
re mai mare pe an ce trece datorită cererii mari de aminoacizi, care nu se
găsesc în natură, şi de derivaţi ai acizilor aminaţi. Totuşi metoda enzimatică
prezintă unele avantaje faţă de alte metode, deoarece:
• izomerii optici ai aminoacizilor se pot obţine direct din
substratele corespunzătoare;
• se pot sintetiza D-izomeri, care nu se pot obţine prin fermentare
directă sau prin extracţie;
• se pot obţine derivaţi ai aminoacizilor sau aminoacizi rari;
• sintezele sunt uşor de manipulat;
• cantităţile produse şi concentraţiile sunt mai mari;
• necesită condiţii blânde de temperatură, pH, presiune.
La început, pentru producerea acizilor aminaţi pe cale enzimatică, se fo-
loseau enzime nerecombinate produse de microorganisme, fiind stimulată
sinteza lor prin diverse metode. Pentru a reduce costul sintezelor, enzimele
nu se purificau şi se folosea lizatul celular ce conţinea enzime specifice.
Imobilizarea enzimelor în sintezele enzimatice prezintă două avantaje
importante şi anume reutilizarea multiplă a enzimelor costisitoare şi recu-
perarea substratelor rămase, folosite în exces.
Sinteza enzimatică continuă prin imobilizarea enzimelor a fost aplicată
în producerea L-tirozinei cu β-tirozinază şi a triptofanului cu triptofanază,
pornind de la indol, piruvat şi săruri de amoniu. O sursă de triptofanază
36
poate fi lizatul brut de E .coli, la care s-a indus sinteza acestei enzime. Sinte-
za continuă a fost realizată prin încorporarea enzimelor în gel de
poliacrilamidă. Imobilizarea asigură sinteza continuă a aminoacizilor şi
reciclarea amoniului şi piruvatului neutilizate, folosite în exces
[Deconttignies-Le Maréchal şi colab., 1979; Fukui şi colab., 1974].
Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost uti-
lizate în sinteza acidului aspartic [Fusee şi colab., 1981; Tosa şi colab., 1973].
Aceeaşi metodă de imobilizare a fost folosită şi în sinteza alaninei cu celule
de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat
β-carboxilazei [Fusee şi Weber, 1984].
Utilizarea de cofactori (NADH, NADPH), costisitori în sintezele enzi-
matice, nu permite extinderea sintezelor la scară industrială. Acest impe-
diment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate, în care se utilizea-
ză enzime pentru regenerarea cofactorilor. Astfel, 3-fluoroalanina s-a obţi-
nut din 3-fluoropiruvat, reacţie catalizată de alanin dehidrogenază într-un
sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. Mediul
de sinteză mai conţine formiat de amoniu, ionul de amoniu fiind necesar în
reacţia de sinteză a aminoacidului, iar ionul formiat pentru reacţia de rege-
nerare a NADH [Oshima şi colab., 1988].
Producerea continuă de L-valină folosind valin dehidrogenaza şi glu-
cozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiată detailat
[Monot şi colab., 1988; Honorat-Pascal şi colab., 1990]. Honorat şi col. [1990]
au sintetizat L-alanina şi L-valina folosind sistemul cuplat de alanin
dehidrogenază, respectiv valin dehidrogenază, cu glucozo dehidrogenază
pentru regenerarea NADH. În strategia de sinteză s-au utilizat enzime pro-
venite de la un singur microorganism şi anume Bacillus megaterium. S-a tes-
tat eficienţa sintezelor în cazul folosirii lizatelor şi a enzimelor purificate.
Numai în cazul sintezei alaninei s-a evidenţiat o creştere a randamentului
sintezei de la 80%, în cazul folosirii lizatului brut până la 92%, în cazul folo-
sirii fracţiunilor purificate.
Sistemul multienzimatic a fost utilizat şi în sinteza L-leucinei din
α-cetoisocaproat, utilizând leucin dehidrogenază de la Bacillus
stearothermophilus [Oshima şi colab., 1985] şi formiat dehidrogenaza de la
Candida boidinii, pentru regenerarea NADH [Schütte şi colab., 1976]. Utili-
zarea enzimelor de la microorganismele termofile prezintă avantajul că au
o stabilitate mai mare.
Producerea acidului aspartic la scară industrială s-a realizat enzimatic
pornind de la fumarat şi săruri de amoniu şi utilizând aspartaza ca şi cata-
lizator [Chibata şi colab., 1976].
37
Aminoacid dehidrogenaze
Aminoacid dehidrogenazele (EC 1.4.1.X) sunt enzime care fac parte din
familia oxidoreductazelor. Aceste enzime catalizează eliminarea grupării
amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunzători, în prezenţă
de NAD(P)+.
Aminoacid + NAD+ + H2O ↔ α-cetoacid + NADH + H+ + NH3
Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru
α-aminoacizi, dar există şi câteva enzime care reacţionează şi cu aminoaci-
zii β. Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au
importanţă industrială (fenilalanin-, leucin-, alanin-, valin- şi glutamat
dehidrogenaza).
Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate în vederea utilizării
lor în diverse ramuri industriale. Ele au fost folosite la construirea biosen-
zorilor, care pot să monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma
sanguină, caracteristic în unele patologii. Aceste enzime au întrebuinţare şi
în sinteza industrială de aminoacizi. Deoarece ele acţionează stereospecific,
enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri, această caracte-
ristică fiind foarte importantă pentru industria farmaceutică.
Alanin dehidrogenaza
Aminarea reductivă a cetoacizilor la L-aminoacizi în procese
NAD(P)H-dependente este catalizată de o suprafamilie de enzime omoloa-
ge de aminoacid dehidrogenaze, care include fenilalanin dehidrogenaza
(PheDH), leucin dehidrogenaza (LeuDH), valin dehidrogenaza (ValDH) şi
glutamat dehidrogenaza (GluDH). Nu există asemănări semnificative între
secvenţele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) şi membrii acestei familii de
aminoacid dehidrogenaze, cu excepţia domeniului de legare a cofactorului,
care este comun pentru toate aceste enzime. Deşi realizează unul şi acelaşi
proces biologic, alanin dehidrogenazele şi suprafamilia de aminoacid
dehidrogenaze au evoluat separat [Baker şi colab., 1998].
Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductază NAD+ dependentă,
1.4.1.1) catalizează reversibil reacţia de dezaminare a L-alaninei cu formare
de piruvat.
L-alanina + NAD+ + H2O ↔ piruvat + NADH + H+ + NH3
Alanin dehidrogenaza a fost descrisă de către Wiame şi Piérard în 1955
[Norbert şi colab., 1994]. Această enzimă a fost purificată şi studiată în
principal la mai multe specii din genul Bacillus. Enzima are un rol impor-
tant în furnizarea energiei necesare germinării sporilor. S-a demonstrat că
în lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificultăţi [Siranosian şi colab.,
38
1993]. Alanin dehidrogenaza este o enzimă oligomerică. Majoritatea enzi-
melor studiate sunt hexameri, cum ar fi cele de la B. subtilis, B. cereus, B.
sphaericus, B. stearothermophilus, Mycobacterium, Thermus, Anabaena. Alanin
dehidrogenaza este o enzimă NAD+ dependentă. Mecanismele cinetice ale
AlaDH au fost studiate la mai multe specii. NAD+ se leagă înaintea
piruvatului în reacţia de dezaminare oxidativă, iar NADH în reacţia de
aminare. AlaDH poate utiliza ca substrate în reacţia de aminare atât
piruvatul, cât şi 3-hidroxipiruvatul, cu ultimul reacţia fiind mult mai lentă.
Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus
sp DSPM730 care reacţionează în egală măsură cu ambele substrate. Aceas-
tă enzimă poate fi foarte utilă în sinteza de L-serină din 3-hidroxipiruvat
[Nagata şi colab., 1989]. Lizina din poziţia 74 din secvenţa de aminoacizi a
AlaDH de la B. subtilis este esenţială în cataliză şi este conservată şi la alte
alanin dehidrogenaze. Aminoacizii din vecinătatea acestei lizine prezintă o
regiune conservată, dar care nu este specifică altor aminoacid
dehidrogenaze. [Delforge şi colab., 1997].
Leucin dehidrogenaza
Leucin dehidrogenaza (EC 1.4.1.9) (LeuDH) este o oxidoreductază
NAD+-dependentă, care catalizează reversibil dezaminarea L-leucinei şi a
unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunzători.
Leucina + NAD+ + H2O ↔ α-cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+
Echilbrul reacţiei este deplasat spre formarea aminoacidului.
Ca şi majoritatea aminoacid dehidrogenazelor, LeuDH intervine în ca-
tabolismul unor aminoacizi. Leucin dehidrogenazele studiate provin în
mare parte de la genul Bacillus precum şi de la Thermoactinomyces [Ohshima
şi colab., 1994], Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh şi colab., 2003].
O mare atenţie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la mi-
croorganisme mezotermofile, deoarece sunt mai stabile. Una din aceste
enzime este cea de la B. stearothermophilus, a cărei genă codificatoare a fost
clonată, iar proteina exprimată în celule de E. coli. [Nagata şi colab., 1988].
Diferenţele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. coli şi proteina
recombinată de LeuDH permit purificarea acesteia într-o singură etapă,
prin denaturare termică. Enzima nu-şi pierde activitatea după incubare
timp de 30 min la 70ºC [Oka şi colab., 1989]. Enzimele termostabile nu pre-
zintă numai avantajul termostabilităţii, fiind, în general, stabile şi la alţi
factori care afectează proteinele, cum ar fi enzime proteolitice, solvenţi or-
ganici, detergenţi, mediu acid sau alcalin.
Aspartat amoniu-liaza
L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4.3.1.1) catalizează
reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat şi NH4+. Această
39
enzimă joacă un rol important în metabolsimul azotului la bacterii. Majori-
tatea aspartazelor studiate au masa moleculară în jur de 200 kDa şi sunt
alcătuite din patru monomeri identici, de circa 50 kDa. Enzima este activată
în prezenţă de ioni de Mg2+ la un pH alcalin; la pH mai mic ea nu necesită
ioni de metal [Karsten şi Viola, 1991].
Metode
Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze
Genele ce codifică leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus,
alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la
Bacillus subtilis şi aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin
metoda PCR utilizând amorse specifice. În secvenţa amorselor au fost in-
cluse situsurile pentru enzime de restricţie necesare inserării genei în vecto-
rul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codifică leucin dehidrogenaza,
alanin dehidrogenaza şi aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare
pET21b (Novagen). Acest vector oferă posibilitatea exprimării genelor la
inducere cu IPTG. Produşii PCR au fost purificaţi din gel şi digeraţi cu en-
zimele de restricţie corespunzătoare (Tabel 1). Vectorii de exprimare au fost
digeraţi cu aceleaşi enzime de restricţie. Produşii de digestie (produşii PCR
şi vectorii) au fost separaţi cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză.
Tabelul 1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor.
Enzime
Vector
Enzima Amorsele utilizate Organism sursă de
utilizat
restricţie
5΄-GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3΄
AlaDH BamHI
Bacillus subtilis pET21b
Q08352 5΄-GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3΄ XhoI
5΄-GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3’
LeuDH Bacillus BamHI
pET21b
P13154 5΄-TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3΄ stearothermophilus XhoI
5' –GGTAGGATCCGATGTCAAACAACATTCGTATCG– 3'
ALL NdeI
Escherichia coli pET21b
(P0AC38) 5' –GCTACTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA– 3' BamHI
5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3'
GalM NdeI
Escherichia coli pET24a
(P0A9C3) 5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3' BamHI
5΄-GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3΄
GlucDH NdeI
Bacillus subtilis pET24a
P12310 5΄-CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3΄ BamHI
Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroză. Pentru inse-

rarea genelor în vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a
40
reface legăturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate după ligare
(vector + gena) au fost introduse prin transformare în tulpina de Escherchia
coli DH5α. Secvenţele genelor clonate au fost verificate prin secvenţializare
cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utilizând kitul de secvenţiali-
zare BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems).
Producerea de proteine recombinate

Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au fost in-
troduse prin transformare în tulpina de Escherichia coli BL21(DE3). Pentru
obţinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0,5-1L).
După ce densitatea optică (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1, s-a indus
exprimarea genelor cu izopropil-β D-tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM.
După câteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate şi
păstrate la -80°C până la utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu
extracte celulare bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar im-
plica costuri şi timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu atât
mai valoros cu cât implică mai puţine costuri. Celulele bacteriene au fost
preluate în tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereţii celulelor bacteriene au
fost distruse prin sonicare. După sonicare extractul bacterian a fost centri-
fugat (20 min la 21 000 ×g la 4°C), iar supernatantul cu proteinele solubile a
fost utilizat pentru măsurarea activităţii enzimatice. Analiza exprimării
genelor şi sintezei de proteine recombinate în celulele de E. coli a fost urmă-
rită cu ajutorul electroforezei în gel de poliacrilamidă în condiţii denaturan-
te în prezenţă de SDS (Figura 1).
AlaDH LeuDH AAL
1 2 3 1 2 3 1 2
94→
94 → 67→
← 94
← 67 67 → ←54
43→
← 43
42→ 43 → ← 42
30→
← 30
30 →
← 20,1 20,1→
← 14,4 20,1 →
14,4→
Figura 1. Sinteza de proteine recombinate în celulele gazdă de E. coli.

Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum şi masele
moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate
raportată la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene.
41
Măsurarea activităţii enzimatice a enzimelor
Măsurătorile de activitate enzimatică a dehidrogenazelor s-au efectuat
la 30ºC cu un spectrofotometru Jasco V-530 urmărindu-se scăderea
absorbanţei NADH (reacţia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestu-
ia (reacţia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La această lungime de
undă NADH prezintă maximul de absorbanţă şi are un coeficient molar de
extincţie de 6,22 ·103 ·M-1 ·cm-1. Activitatea enzimatică s-a calculat după
formula:
A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l
DO/min – variaţia densităţii optice pe minut la 340 nm
Vr – volumul reacţiei
Vp – volumul probei
FD – factorul de diluţie
O unitate enzimatică (1U) corespunde formării unui µmol de produs
într-un minut. Mediile de reacţie pentru enzime au fost următoarele:
a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH 0,15 mM,
NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare; L-leucină 10 mM,
NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de dezaminare
b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15 mM,
NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 în reacţia de aminare; L-alanină 10
mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 în reacţia de dezaminare
c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM, Tris
HCl 50 mM pH 8,0
d) GalM (galacto mutarotaza): glucoză 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50
mM pH 8,0, GDH 1 U
e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM, Tris
HCl 50 mM pH 8,0
f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris HCl 50
mM pH8,5, MgCl2 6 mM
Pentru măsurarea activităţii enzimatice a aspartzei s-a urmărit forma-
rea acidului fumaric la 240 nm, care are un coeficient molar de extincţie la
aceasă lungime de undă egal cu 2,54 ·103 ·M-1 ·cm-1.
Pentru măsurarea activităţii enzimatice s-au folosit câţiva µl de enzimă
purificată sau extract brut bacterian, astfel încât valorile DO/min să fie cu-
prinse între 0,05 şi 0,3. S-a ales porţiunea dreptei cu activitatea cea mai mare.
Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N

Mediul de reacţie pentru sintezele de aminoacizi marcaţi cu 15N a con-
ţinut:
42
• cetoacid 100 mM
• 15NH4Cl 100 mM
• NADH 1 mM
• glucoză 670 mM
Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacţia s-a de-
clanşat prin adăugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcaţi au fost
efectuate la 30ºC cu urmărirea pH-lui şi agitare. Pe parcursul sintezei s-a
urmărit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Această metodă constă
în formarea unui compus de culoare, la interacţiunea ionului de amoniu, a
fenolnitroprusiatului şi a cloraminei. Probele s-au preparat după următoa-
rea procedură: 10 µl de probă diluată de 20 ori, 200 µl de fenolnitroprusiat,
200 µl de hipoclorit de sodiu şi 590 µl apă. Developarea culorii s-a făcut
prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100ºC. S-a măsurat absorbanţa
la 623 nm. Înainte de declanşarea sintezelor s-a preluat o probă care a servit
la alcătuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sinteză fără
clorură de amoniu (din care cauză se adăuga la sfârşit). În Figura 2 este
prezentată curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionină. Pe baza curbelor
etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rămas în mediul de sinteză.
Sintezele au fost oprite prin denaturarea termică a enzimelor, timp de 15
min la 85ºC.
y = 0.068852 + 0.013334x R= 0.99935
1.4
1.2
1
623nm
0.8
DO
0.6
0.4
0.2
0
0 20 40 60 80 100 120
NH Cl (% )
4
Figura 2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionină.
Purificarea aminoacizilor sintetizaţi

Aminoacizii sintetizaţi au fost purificaţi pe o coloană cu răşină schim-
bătoare de ioni Dowex 50W x 8, în forma H+. Activarea umpluturii s-a făcut
prin tratare cu HCl 2N, după care s-a spălat până la un pH neutru. Ameste-
cul de sinteză filtrat s-a încărcat pe coloană şi apoi s-a spălat cu apă (10 vo-
lume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH 1M. Controlul eluării s-a făcut cu
ninhidrină pentru aminoacizi. Fracţiunea cu aminoacid s-a concentrat pe
43
baia de apă, după care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lăsat
peste noapte, iar precipitatul obţinut s-a filtrat şi uscat. În continuare, ami-
noacizii astfel obţinuţi au fost supuşi determinării structurii, purităţii şi
concentraţiei izotopice.
Analiza aminoacizilor sintetizaţi prin spectrometrie de masă

Pentru analiza calitativă prin metoda spectrometriei de masă a aminoa-
cizilor este necesară o derivatizare a produsului de reacţie. Derivatizarea,
care trebuie facută la ambele funcţiuni polare ale moleculei de aminoacid, la
carboxil şi amină, s-a facut prin sililare, utilizând metoda Das Neves şi
Vasconcelos, care introduce la fiecare funcţiune polară din moleculă câte o
grupare terţ-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avanta-
jul că, datorită substituentului terţ-butil voluminos, la amină se introduce o
singură grupare silil, şi nu una sau două în mod statistic, cum se întâmplă în
cazul derivatizării cu grupări trimetilsilil. Derivatizarea s-a făcut utilizând ca
reactiv N-metil-N-(terţ-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) în
calitate de donor al grupării silil, reactivul având şi un conţinut de 1%
terţ-butil-dimetil-clorsilan, în calitate de catalizator. Derivatizarea s-a făcut
pe cantitaţi de probă de ordinul 0.5-1 mg de probă, cu 150 µl de acetonitril ca
solvent şi 50 µl reactiv MTBSTFA, la 120ºC timp de 20 minute.
Separarea gaz-cromatografică a produşilor de sinteză sub formă de
TBDMS-derivaţi s-a făcut pe o coloană capilară cu fază staţionară DB5 de
30 m lungime, cu hidrogen ca şi gaz purtător şi cu temperatură programată
între 55 şi 250ºC. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub formă
de TBDMS-derivaţi se produc în cea mai mare parte sub formă de ioni prin
fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fie-
cărui aminoacid. Prin ruperea în diferite poziţii din gruparea tert-butil-
dimetilsilil se formează ioni cu masele M-43, M-57 şi M-85, iar prin ruperea
legăturii dintre carboxil şi atomul de carbon alfa, adiacent, ia naştere un
fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze
Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au înregistrat cu un spectrometru
de masă cuadrupolar HP 5985.
Sinteza de aminoacizi marcaţi cu 15N

Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze
chimice şi enzimatice. În primele etape de marcare a acizilor aminaţi cu
izotopi stabili s-au folosit metode de sinteză chimică. Aceste metode pre-
zintă un şir întreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantităţi mari
de amoniac, randamente scăzute datorită mai multor etape de sinteză, ob-
ţinerea racemicului.
44
Folosirea enzimelor în sinteze de aminoacizi marcaţi cu izotopi stabili
prezintă mai multe avantaje faţă de metodele chimice, datorită faptului că
decurg stereoselectiv şi au randamente superioare. O metodă relativ simplă
şi mai utilizată pentru obţinerea de aminoacizi marcaţi cu 15N este sinteza
enzimatică pornind de la cetoacizi şi săruri de amoniu (15N). Reacţiile de
sinteză sunt cuplate cu reacţii de regenerare a cofactorilor costisitori.
Majoritatea enzimelor utilizate în sinteza diverşilor compuşi necesită
coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preţului mare a acestora utiliza-
rea lor în cantităţi stoichiometrice nu este eficientă. Pentru a evita acest fe-
nomen există câteva căi de regenerare continuă a coenzimelor pe parcursul
sintezelor:
• regenerarea în vivo, cu utilizare de celule în creştere. Această
metodă prezintă dezavantajul manipulării laborioase a celulelor
şi caracterul enantioselectiv scăzut al reacţiei;
• regenerarea enzimatică în vitro, cele mai utilizate enzime pentru
regenerarea coenzimelor în sinteze fiind alcool dehidrogenaza
şi formiat dehidrogenaza (Hummel şi Kula, 1989);
• regenerarea electrochimică, care constă în oxidarea unui media-
tor şi transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al me-
todei îl prezintă specificitatea şi viteza de regenerare reduse.
Modalitatea cea mai eficientă pentru regenerarea coenzimelor rămâne
metoda enzimatică. Sursele enzimelor utilizate în regenerarea coenzimelor
sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la bacterii. Piridin
nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizată în
regenerarea atât a NAD cât şi a NADP pentru producerea de hidromorfonă
[Boonstra şi colab., 2000].
Schema de sinteză a aminocizilor marcaţi cu 15N utilizată în prezenta
lucrare este reprezentată în Figura 3.
15NH4Cl
Acid gluconic
Cetoacid NADH
AADH GDH
GalM
L-(15N)- NAD+ β-glucoză -glucoză
aminoacid
Figura 3. Schema de sinteză a acizilor aminaţi cu 15N. AADH – aminoacid dehidrogenză
Aminoacid dehidrogenazele catalizează reacţia de formare a aminoaci-

zilor pornind de la 15NH4Cl şi cetoacizii corespunzători. Sinteza de aminoa-
45
cizi a fost cuplată cu reacţia catalizată de glucozo-dehidrogenaza (GlucDH)
de la B. subtilis. GlucDH a servit la regenerarea NADH, utilizând ca sub-
strat glucoza cu formare de acid gluconic. În unele sinteze s-a folosit galac-
tozo-mutarotaza pentru transformarea α-glucozei în β-glucoză. Enzimele
utilizate în sintezele de aminoacizi marcaţi nu au fost purificate. Enzimele
recombinate, exprimate în celule de E. coli, reprezintă aproximativ 50% din
proteinele totale existente în lizatul bacterian. Purificarea acestora este o
etapă suplimentară care, în general, nu conduce la mărirea randamentului
reacţiei. Honorat şi colab. [1990] au testat sinteza de L-alanină şi L-valină cu
enzime (alanin dehidrogenază şi valin dehidrogenază) purificate şi în lizat
bacterian. Acest fapt nu a influenţat randamentul sintezelor.
Sinteza de [15N] L-Ala

Amestecul de sinteză a fost ajustat la pH 8,0. Reacţia s-a declanşat la
adăugarea enzimelor (115 U de leucin dehidrogenază şi 60 U de gluco-
zo-dehidrogenază). Pe tot parcursul sintezei alaninei s-a urmărit consuma-
rea clorurii de amoniu prin metoda Berthelot (Figura 4 A) care este o meto-
dă colorimetrică foarte sensibilă de dozare a amoniacului. După purificarea
aminoacidului randamentul sintezei a fost de 60%.
Figura 4. Sinteza de [15N]-alanină. (A) Consumul. 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-alanină.

Sinteza de L-alanină marcată cu 15N s-a realizat pentru o cantitate de 8 mmol. Mediul de reacţie
utilizat a conţinut: piruvat de Na 150 mM, 15NH4Cl 130 mM, NADH 1 mM, glucoză 670 mM. (B)
Spectrul de masă al [15N]-Alaninei. DMTBS derivat, M = 318, cca 97 atom % 15N
NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte

de adăugarea enzimelor.
Activitatea alanin dehidrogenazei din B. subtilis este inhibată de
piruvat, constanta de inhibiţie calculată de noi Ki=4,25 mM. Astfel, la con-
centraţii mari de substrat activitatea enzimei este redusă. O soluţie în acest
46
caz ar fi declanşarea reacţiei de sinteză cu cantităţi mai mari de enzimă. O
altă soluţie poate fi adăugarea piruvatului în mai multe etape. În ambele
cazuri este necesară o urmărire minuţioasă a consumului clorurii de amo-
niu. Masa moleculară a alaninei fără marcare izotopică este 317. Masele
fragmentelor ion ale alaninei cu conţinut izotopic natural sunt m/z 274,
260, 232 şi 158. Analiza spectrelor de masă a arătat prezenţa fragmentelor
ion cu o unitate mai mult decât cele menţionate mai sus, ceea ce demon-
strează marcarea alaninei nu 15N (Figura 4 B).
Sinteza de [15N]-L-Leu
Leucin dehidrogenazele au specificitate pentru un număr mai mare de
cetoacizi. Enzima are cea mai mare specificitate de substrat pentru acidul
α-cetoisovaleric. Specificităţile de substrat ale leucin dehidrogenazei native
din B. stearothermophilus sunt prezentate în Tabelul 2.
Tabelul 2. Activitatea specifică (U/mg de proteină) a LeuDH din

B. stearothermophilus în prezenţa diferiţilor α-cetoacizi
α-cetoacid LeuDH429
Acid α-cetoisovaleric 168 (100)
Acid α ceto-β-metilvaleric 46,5 (28)
Acid α-cetoizocaproic 36,8 (22)
Acid α-cetocaproic 17,4 (10)
Acid α-ceto-γ-metiltiobutiric 7,8 (4,6)
Acid α-cetobutiric 4,7 (2,8)
Activitatea enzimatică a fost determinată la 30°C în tampon Tris-HCl 50 mM, α-cetoacid 10
mM, NH4Cl 1M şi NADH 0,15 mM, pH 8,0. Între paranteze este exprimată activitatea pro-
centuală considerând rezultatul obţinut cu acid α-cetoisovaleric ca 100%.
De aceste valori ale activităţii enzimatice s-a ţinut cont în sintezele de

aminoacizi marcaţi cu izotopul stabil al 15N. În sintezele de aminoacizi la
care enzima are o specificitate mai mică pentru precursorul acestora, a fost
necesară o cantitate mai mare de enzimă.
Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-leucină s-a realizat cu reacti-
vii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Pe tot par-
cursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 5 A).
În cazul leucinei derivatizate cu două grupări silil, masa moleculară
exactă pentru leucină fără marcare izotopică la azot este M=359. Masele
caracteristice ale ionilor fragment ale leucinei cu conţinut izotopic natural
au valorile m/z 316, 302, 274, şi respectiv 200. În cazul aminoacizilor mar-
47
caţi cu 15N, atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o
unitate de masă (Figura 5 B).
Figura 5. Sinteza de [15N]-leucină (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-leucină.

(B) Spectrul de masă al [15N]-Leucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N. NH4Cl 100%
s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte de adăugarea enzimelor. Din fiecare reac-
tant s-a utilizat o cantitate de 8,2 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 205 U de leucin dehidrogenază şi
110 U de glucozo dehidrogenază.
Sinteza de [15N]-L-Val
Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-valină s-a realizat cu reactivii
la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Pe tot parcur-
sul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).
Figura 6. Sinteza de [15N]-valină. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-valină.

(B) Spectrul de masă al [15N]-valinei. DMTBS derivat, M = 346, cca 97 atom % 15N
NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte

de adăugarea enzimelor. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto
isovaleric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate
de 8,0 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 200 U de leucin dehidrogenază şi 125
U de glucozo-dehidrogenază. S-au realizat câteva sinteze, raportul reactan-
48
ţilor şi randamentele sintezelor sunt prezentate în Tabelul 3. Cel mai mare
randament s-a constatat în cazul sintezei de 12 mmol.
Tabelul 3. Sinteze de [15N]-L-valină

Reactanţi (mmol) Randamentul sintezei
Acid cetoisovaleric 15NH
4Cl (%)
3,0 3,0 79
8,0 8,0 86
12,0 12,0 92
Viteza de reacţie este, şi deci şi consumul de clorură de amoniu este

foarte mare în primele minute de sinteză. Astfel, după 10 min s-a consumat
50% clorură de amoniu. În continuare viteza reacţiei a scăzut. Scăderea vi-
tezei de reacţie se poate explica prin scăderea concentraţiei substratelor,
viteza reacţiei fiind direct proporţională cu concentraţia de substrat până la
anumite valori; acumularea de produşi de sinteză care pot inhiba activita-
tea enzimelor. În cazul valinei derivatizate cu două grupări silil, masa mo-
leculară exactă pentru valina fără marcare izotopică la azot este M=345 .
Masele caracteristice ale ionilor fragment a valinei cu conţinut izotopic na-
tural au valorile m/z 302, 288, 260 şi respective 186, iar în cazul valinei
marcate cu 15N, atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu
o unitate de masă. Spectrul de masă al valinei marcate isotopic este prezen-
tat în Figura 6 B. Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe de-
plin prezenţa valinei marcate cu 15N în produsul reacţiei enzimatice.
Sinteza de [15N]-L-Met
Mediul de reacţie pentru sinteza de 15N-metionină s-a realizat cu reac-
tivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Pe tot
parcursul sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 7 A).
Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul
α-ceto-γ-metiltiobutiric este aproximativ 8 U/mg proteină. Din această cau-
ză a fost nevoie de o cantitate mai mare de proteină. Viteza reacţiei a scăzut
foarte mult după primele 10 min când s-au consumat 50% din substrate
(Figura 7 A). Viteza a scăzut mult după încă 10 min (în primele 20 min ale
sintezei s-au consumat 80% clorură de amoniu). Pentru consumarea celor-
lalte 20% NH4Cl au fost necesare 100 min. După purificarea aminoacidului
s-a constatat un randament al sintezei de 94%. Masa moleculară a metioni-
nei derivatizată cu două grupări silil este de 377. Masele caracteristice ale
ionilor fragment ale metioninei fără marcare izotopică au valorile m/z 320,
292, şi 218. În cazul metioninei marcate cu 15N, atât masa moleculară cât şi
49
masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă. Spectrul de masă al
metioninei marcate isotopic este prezentat în Figura 7 B. Datele spectrome-
trice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa metioninei marcate cu
15N în produsul sintezei enzimatice.
Figura 7. Sinteza de [15N]-metionină. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de

[15N]-metionină. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte de adăuga-
rea enzimelor. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto-γ-metiltiobutiric:15NH4Cl )a fost de 1:1.
Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5,8 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 200 U de leucin
dehidrogenază şi 125 U de glucozo dehidrogenază. (B) Spectrul de masă al [15N]-metioninei. DMTBS
derivat, M = 378, cca 97 atom % 15N
Sinteza de [15N]-L-NorLeu
Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-norleucină s-a realizat cu
reactivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode.
100 201
100 A 73
B
90
80
80
70
60
NH Cl (%)
I, %
60 50
4
40
275 303
15
40 30 75 147
57
20
133
10
20
0 346
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
0 5 10 20 30 70 90 120 m/z
min
Figura 8. Sinteza de [15N]-norleucină. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de

[15N]-norleucină. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte de adăuga-
rea enzimelor. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto caproic:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare
reactant s-a utilizat o cantitate de 4,7 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 106 U de leucin dehidrogenază
şi 86 U de glucozo dehidrogenază şi 39 U de galacto mutarotază. (B) Spectrul de masă al
[15N]-norleucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N
50
Activitatea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul
cetocaproic este relativ mică (17,4 U/mg proteină). Pe tot parcursul sintezei
s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 8 A).
Raportul reactanţilor şi randamentele sintezelor sunt prezentate în Ta-

belul 4.
Tabelul 4. Sinteze de [15N]-L-norleucină
Reactanţi (mmol)
Randamentul sintezei (%)
Acid cetocaproic 15NH
4Cl
2,0 2,0 78
4,7 4,7 78
Masa moleculară a norleucinei fără marcare izotopică este 359. Masele

fragmentelor ion ale norleucinei cu conţinut izotopic natural sunt sunt m/z
316, 302, 274 şi 200. Analiza spectrelor de masă a arătat prezenţa fragmente-
lor ion cu o unitate mai mult decât cele mai menţionate mai sus, ceea ce
demonstrează marcarea norleucinei nu 15N (Figura 8 B).
Sinteza de [15N]-L-Norval
Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-norvalină s-a realizat cu reac-
tivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Activita-
tea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul cetobutiric este
cea mai mică dintre substratele analizate (4,7 U/mg proteină, ceea ce con-
stituie 2,8% din activitatea pentru acidul cetoisovaleric). Pe tot parcursul
sintezei s-a urmărit consumul de NH4Cl (Figura 9 A).
100 187
100
A 90 B
80 73
80
70
60
NH4Cl (%)
60 261
I, %
50
40 289
147
15
40 30
57
20 133
20 10
0 303 331
0 50 100 150 200 250 300 350
0
0 5 15 30 60 90 120 m/z
min
Figura 9. Sinteza de [15N]-norvalină. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de

[15N]-norvalină. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte de adăuga-
rea enzimelor. Raportul molar al reactanţilor (acid α-ceto butiric:15NH4Cl)a fost de 1:1. Din fiecare
reactant s-a utilizat o cantitate de 8,03 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 310 U de leucin dehidrogenază
şi 204 U de glucozo dehidrogenază. (B) Spectrul de masă al [15N]-norvalinei. DMTBS derivat,
M = 346, cca 97 atom % 15N
51
În cazul norvalinei derivatizate cu două grupări silil, masa moleculară
exactă pentru norvalină fără marcare izotopică la azot, este M=345. Masele
caracteristice ale ionilor fragment ale valinei cu conţinut izotopic natural au
valorile m/z 302, 288, 260 şi 186, iar în cazul norvalinei marcate cu 15N , atât
masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu o unitate de masă.
Datele spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa valinei
marcate cu 15N în produsul reacţiei enzimatice. Spectrul de masă al
norvalinei marcate isotopic este prezentat în Figura 9 B.
Sinteza de [15N]-L-Ile
Mediul de reacţie pentru sinteza de [15N]-izoleucină s-a realizat cu reac-
tivii la concentraţiile descrise la capitolul de materiale şi metode. Activita-
tea specifică relativă a leucin dehidrogenazei pentru acidul
α-ceto-β-metilvaleric (46,5 U/mg proteină) este mai mare decât pentru aci-
dul cetoisocaproic (36,8 U/mg proteină). Pe tot parcursul sintezei s-a urmă-
rit consumul de NH4Cl (Figura 10).
A B
100 201
100
90
80 73
80
70
NH Cl (%)
60
60
I, %
50
4
40 303
15
40 30
57 75 275
20 147
133
20 10
0 345
0 50 100 150 200 250 300 350 400
0
0 5 10 20 40 60 90 120 m/z
min
Figura 10. Sinteza de [15N]-isoleucină. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de

[15N]-isoleucină. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorură la timpul zero, înainte de adăuga-
rea enzimelor. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 5,27 mmol. Sinteza s-a declanşat cu 290
U de leucin dehidrogenază şi 221 U de glucozo dehidrogenază. (B) Spectrul de masă al
[15N]-izoleucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N
În cazul izoleucinei derivatizate cu două grupări silil, masa moleculară

exactă pentru izoleucină fără marcare izotopică la azot este M=359. Masele
caracteristice ale ionilor fragment ale izoleucinei cu conţinut izotopic natu-
ral au valorile m/z 316, 302, 274, şi respectiv 200. În cazul aminoacizilor
marcaţi cu 15N, atât masa moleculară cât şi masele ionilor fragment cresc cu
o unitate de masă. Masele fragmentelor ion obţinute prin spectrometrie de
masă sunt mai mari cu o unitate, ceea ce demonstrează marcarea
izoleucinei cu 15N (Figura 10 B).
52
Sinteza de acid L-aspartic
Aspartaza este folosită cu succes în sinteza de acid aspartic din acid
fumaric şi clorură de amoniu, metoda fiind foarte eficientă şi simplă, iar
acidul aspartic având o cerere mare pe piaţa de aminoacizi.
Producerea acidului aspartic la scară industrială s-a realizat enzimatic
din fumarat şi săruri de amoniu utilizând aspartaza ca şi catalizator
[Chibata şi colab., 1976]. Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a
aspartazei au fost utilizate în sinteza acidului aspartic [Fusee şi colab., 1981;
Tosa şi colab., 1973].
Reacţia de formare a acidului aspartic din fumarat este reversibilă.
Acid L-aspartic ↔ Acid fumaric + NH4+
După o anumită perioadă de timp, între cei doi reactanţi (fumarat şi
acid aspartic) se stabileşte un echilibru, care este deplasat spre formarea de
acid aspartic. În cazul reacţiilor reversibile nu se consumă tot substratul şi
ca rezultat randamentul sintezelor scade.
Tabelul 5. Determinarea constantei de echilibru (Keq = [NH3] [acid fumaric] /

[acid aspartic]) a reacţiei catalizate de aspartaza din E. coli
Concentraţia iniţială (mM) Concentraţia de echilibru (mM) Keq
L- Asp NH4Cl Fumarat L- Asp NH4Cl Fumarat (mM)
1,0 10,0 0 0,749 10,251 0,251 3,43
2,0 10,0 0 1,523 10,477 0,477 3,28
2,0 20,0 0 1,648 20,352 0,352 4,35
4,0 40,0 0 3,566 30,434 0,432 3,70
Mediul de reacţie conţine la un volum de 1 ml următorii reactivi: tampon Tris-HCl 50 mM (pH 8,5),
MgCl2 6mM, diverse concentraţii de acid aspartic şi NH4Cl, indicate în partea stângă a tabelului. Se
adaugă apoi 1 U de aspartază recombinată, iar la diferite intervale de timp se citeşte extincţia la 240
nm, care este proporţională cu concentraţia de acid fumaric format (εmM = 2,53). La echilibru nu se
mai observă nici o variaţie de extincţie. Concentraţiile la echilibru de L-Asp şi NH4Cl se calculează
din concentraţiile lor iniţiale şi concentraţia la echilibru de acid fumaric.
Pentru a determina concentraţiile reactanţilor la care se stabileşte

echilibrul reacţiei am făcut mai multe determinări ale constantei de echili-
bru. Rezultatele şi condiţiile acestor determinări sunt prezentate în Tabelul
5.Media celor 4 măsurători au indicat o valoare a Keq = 3,69 mM (sau 3,69 x
10 –3 M).
Sinteza de acid aspartic s-a realizat la temperatura camerei. Dozarea
activităţii enzimatice a aspartazei s-a făcut de asemenea la temperatura
camerei. Pe tot parcursul sintezei s-a urmărit consumul de acid fumaric
prin citirea absorbanţei la 240 nm (Figura 11 A). Reacţia de sinteză s-a oprit
prin denaturarea termică a enzimei.
53
Fumarat mM
Aspartat mM 100 73
1000
90
80
800 70
Fumarat/Aspartat (mM)
60
I, %
600 50
40
400 30
20 75 302 418
147
10 316
200 202 244 390
0 460
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
0
0 50 100 150 200 250 300 350 m/z
min
Figura 11. Sinteza de acid aspartic. (A) Consumul de acid fumaric şi formarea de acid aspartic în
cursul reacţiei de sinteză a acidului aspartic, catalizată de aspartaza recombinată din E. coli. Compo-
nenţa mediului de sinteză a fost: acid fumaric 1 M, NH4Cl 0,8 M, pH s-a ajustat la valoarea de 8,5 cu
NaOH. Reacţia s-a declanşat cu aspartază 2 U/ml. (B) Spectrul de masă al acidului aspartic. DMTBS
derivat, M = 457, fără marcare cu 15N.
După purificare s-a constat un randament de 70%.

Masa moleculară a acidului aspartic derivatizat cu trei grupări silil este
de 457. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale acidului aspartic fără
marcare izotopică au valorile m/z 432, 418, 390 şi 316. Spectrul de masă al
acidului aspartic fără marcare izotopică este prezentat în Figura 11 B. Date-
le spectrometrice de masă obţinute confirmă pe deplin prezenţa acidului
aspartic în produsul sintezei enzimatice.
Sinteza de acid α-cetoisocaproic

Sinteza chimică a cetoacizilor este dificil de realizat, fapt care explică şi
costurile mari a acestora. Până acum nu a fost descrisă o metodă enzimatică
eficientă de producere a cetoacizilor.
Aminoacid dehidrogenazele (AADH) catalizează dezaminarea
L-aminoacizilor cu formare de cetoacizi corespunzători. Reacţiile sunt re-
versibile, iar echilibrul este deplasat spre formarea de aminoacid. Acesta
reprezintă cel mai mare impediment în utilizarea AADH în sinteza enzima-
tică a cetoacizilor.
Leucin dehidrogenaza de la B. stearothermophilus cu 9 aminoacizi lipsă
la capătul C-terminal are o activitate specifică în reacţia de dezaminare a
L-leucinei, aproape de două ori mai mare decât enzima nativă. Acest fapt
ne-a determinat să testăm o sinteză de acid cetoisocaproic (Figura 12).
Pentru sinteză am utilizat şi aspartază recombinată de la E. coli.
Aspartaza a servit la înlăturarea ionului de amoniu format în urma reacţiei
54
Lactat
L-leucină NAD+
LeuDH358 LDH
Acid α- NADH Piruvat
cetoisoca-
proic
NH4+
+
Fumarat
AAL
Acid aspartic
Figura 12. Schema de sinteză a acidului cetoisocaproic.
de dezaminare a L-leucinei. Reacţia catalizată de aspartază este şi ea rever-

sibilă, dar în acest caz echilibrul reacţiei este deplasat spre formarea de acid
aspartic, deci spre consumarea de NH4+. Pentru regenerarea coenzimei am
utilizat lactat dehidrogenaza din muşchi de bovine.
Un impediment care poate apărea pe parcursul sintezelor de acest gen
(cu mai multe enzime) este reacţionarea enzimelor secundare cu produsul
sintezei. Este cunoscută specificitatea strictă a aspartazei pentru acid aspar-
tic, de aceea am testat numai activitatea LDH cu diferiţi cetoacizi (Tabelul
6). Surprinzător este faptul că, totuşi, unii cetoacizi sunt substrate pentru
LDH. Pentru sinteza cetoacizilor ce servesc ca substrate şi pentru LDH tre-
buie căutate alte enzime pentru regenerarea coenzimei.
Tabelul 6. Activitatea LDH din muşchi de bovine (Boehringer) în prezenţa diferiţi-

lor α-cetoacizi în raport cu substratul fiziologic (acid piruvic)
α cetoacid Activitate
U/mg proteină %
Acid piruvic 140 100
Acid hidroxipiruvic 69 49
Acid fluoropiruvic 38 27
Acid α cetobutiric 10 7,1
Acid α cetocaproic 0,38 0,27
Acid α cetovaleric 0,13, 0,093
Acid α ceto γ metiltiobutiric 0,02 0,014
Acid α cetoizocaproic 0,00 0,00
Acid α ceto β metilvaleric 0,00 0,00
Mediul de reacţie conţine în volumul final de 1 ml: tampon Tris–HCl 50 mM (pH 8,5), MgCl2
6 mM, NADH 0,15 mM, α-cetoacid 1 mM.
55
Sinteza de acid isocaproic s-a realizat pentru o cantitate de 5 mmol.
Temperatura la care a fost efectuată sinteza a fost de 35ºC. Reacţiile au fost
oprite prin denaturarea termică a enzimelor (15 min la 85ºC). Formarea
acidului cetosiocaproic s-a urmărit prin consumarea piruvatului (Figura
13).
Piruvat mM
cetoisocaproat mM
120
100
Piruvat/cetoisocaproat (mM)
80
60
40
20
0
0 50 100 150 200 250
min
Figura 13. Consumul de acid piruvic şi formarea de acid α-cetoisocaproic în cursul reacţiei de sinteză
a acidului α-cetoisocaproic în sistemul cuplat LeuDH/AAL/LDH. Componenţa mediului de sinteză a
fost: acid fumaric 150 mM, acid piruvic 120 mM, L-leucină 100 mM, NAD 1 mM, pH-ul s-a ajustat
la valoarea de 8,5 cu NaOH. Reacţia s-a declanşat cu 2 U/ml aspartază, lactat dehidrogenază şi leucin
dehidrogenază (LeuDH358).
Din amestecul de sinteză s-a purificat leucina rămasă după sinteză.

Cantitatea de leucină recuperată a servit la calcularea randamentului sinte-
zei, care a fost de 30%. Deşi randamentul este mic, sinteza este rentabilă din
punctul de vedere al preţului reactanţilor, cei folosiţi sunt mai ieftini decât
produsul final.
În concluzie, tehnicile care utilizează ADN recombinat au aplicaţiile

cele mai diverse în biotehnologie. Aplicarea lor cere însă expertize variate
cum sunt: - calcularea randamentelor de reacţie pe baza echilibrelor termo-
dinamice şi a parametrilor cinetici a enzimelor implicate, - utilizarea unor
procedee rapide de purificare prin cristalizare sau cromatografie, dar nu în
ultimul rând şi cunoaşterea pieţei internaţionale privind cererea şi oferta
produselor. Piaţa moleculelor marcate cu 15N este redusă dar interesantă,
considerând valoarea ridicată a acestor compuşi. Pentru comparaţie, 1 kg
56
de acid L-glutamic valorează în prezent ~1 €, în timp ce 1 g acid
[15N]-L-glutamic valorează ~150 €
2. Tendinţe actuale în aplicarea bionanotehnologiilor

Bionanotehnologiile moderne se inspiră din organizarea celulară a lu-
mii vii. Astfel, structurile nano la fel ca şi structurile vii, sunt alcătuite din
componente de natură organică şi anorganică. Aceste structuri sunt speran-
ţa pentru tratarea a numeroase cancere, existând în prezent deja aplicaţii
ale nanoparticulelor în tratamentul unor cancere. Nanoparticulele sunt o
speranţă nu numai pentru tratamentul numeroaselor boli, dar şi pentru
stabilirea unor diagnostice. Utilizarea nanoparticulelor în medicină este axa
prioritară în aplicarea bionanotehnologiilor.
Limitările bionanotehnologiilor sunt: incapacitatea de a sintetiza parti-
cule de aceleaşi dimensiuni cu aceeaşi suprafaţă, controlul organizării lor.
Ţesuturile tari, cum ar fi ţesutul osos, cochiliile la moluşte, conţin una sau
mai multe componente organice de natură proteică care controlează orga-
nizarea structurală .
Aplicaţii ale bionanotehnologiilor

Nanoparticulele de aur (NP-Au) sunt o adevărată speranţă în diagnos-
ticul şi tratamentul cancerelor.
Au a fost utilzat timp de câteva decenii în diverse aplicaţii în medicină
(implanturi dentare) datorită caractersticilor sale neutre. Nanoparticulele
de Au au început să fie din ce în ce mai des utilizate în depistarea şi chiar
tratamentul unor celule canceroase datorită faptului că acestea sunt inerte,
non-toxice, au stabilitate mare, dimensiuni mici şi capacitate de legare ma-
re. NP-Au sunt capabile de a acţiona asupra unor anumite tipuri de celule
chiar în absenţa oricăror grupe funcţionalizate. NP-Au induc moartea celu-
lară liniei de celule de carcinom pulmonar A549 de la om, dar nu au nici un
efect asupra altor linii de celule HepG2 (carcinom hepatic hepatocelular
uman) şi BHK21 (celule juvenile din rinichi de hamster) (Patra şi col., 2007).
Diagnostic
Diagnosticul nanomolecular al cancerului poate asigura depistarea ce-
lulelor canceroase în faze incipiente ale bolii. Nanoparticule de aur
derivatizate cu nucleotide tiolate au fost utilizate pentru depistarea celule-
lor canceroase (Conde şi col., 2010). NP-Au la care s-au ataşat
oligonucleotide de ADN au fost utilizate pentru diagnosticul timpuriu al
leucemiilor mieloide acute. Oligonucleotidele ADN utilizate în acest scop
57
reprezentau un fragment din joncţiunea care rezultă în urma translocaţiiei
t(9;22)(q34;q11). Un fragment dintr-un cromozom este translocat la un alt
cromozom, în acest caz fragmentul de la cromozomul 9 este transferat pe
cromozomul 22, cromozomul find cunoscut sub denumirea de cromozom
Philadelphia. Această translocaţie este cauza leucemiilor mieloide cronice şi
care sunt cauzate de fuziunea a 2 gene BCR(22)-Abl(9) (Figura 14).
Figura 14. Formarea cromozomului Philadelphia – translocaţia reciprocă între cromozomul 9 şi 22.
Produsul acestei gene este o proteină himeră cu activitate

tirozin-kinazică. Metoda de detecţie cu ajutorul nanoparticulelor se bazează
pe formarea de porţiuni hibride ADN:ARN (ADN sonda: ARNm din celu-
lele canceroase) dublu catenare, care vor împiedica agregarea nano-
particulelor de Au odată cu creşterea concentraţiei de săruri. Metoda
nanosondelor pentru diagnosticul acestui tip particular de cancer oferă
avantaje faţă de metodele utilizate actual în diagnostic (FISH, transcrierea
inversă a ARNm şi amplificarea prin PCR) prin faptul că este mai ieftină şi
mai rapidă (~30 min) şi necesită cantităţi mici de ARNm (10 ng/μl). Dia-
gnosticul timpuriu în asemenea cazuri este foarte important, în fazele ulte-
rioare celulele canceroase devenind rezistente la chemoterapice.
Nanoparticulele de argint (NP-Ag) au devenit atractive în domeniul
bionanotehnologic după descoperirea efectului lor antibactericid (Sondi şi
Salopek-Sondi, 2004). Acest efect este unul de importanţă majoră datorită
faptului că bacteriile capătă din ce în ce mai multă rezistenţă la antibiotice.
Nanoparticulele de argint par a avea o influenţă nu numai asupra bacterii-
lor, dar şi asupra virusurilor. Astfel NP-Ag la concentraţii non-toxice pen-
tru celule inhibă replicarea virală (sinteza materialului genetic ai virusului)
58
atunci când nanoparticulele sunt administrate înainte de infectare sau ime-
diat după (2-4 ore) aceasta (Speshock şi col., 2010).
Unele substanţe chimice s-au dovedit a avea un efect inhibitor asupra
proliferării celulare, angiogenezei şi rol antiinflamator. Un astfel de exem-
plu este colorantul DCPIP (2,6-diclorofenol-indofenol) care induce
apoptoza (moartea celulară) în celule umane de melanom A375 şi G361
(Cabello şi col., 2009). DCPIP s-a dovedit a avea acţiune antiangiogeneză şi
antiinflamatoare asupra celulelor canceroase umane de colon HCT116.
Efectul acestuia este mai intens dacă este încapsulat în particule de polia-
cizi (lactic şi glicolic). Concentraţiile de ≥6 μg/ml de colorant (DCPIP) in-
duc moartea celulară prin apoptoză (Mondalek şi col., 2010).
Nanobiotehnologiile urmăresc nu numai crearea de nano-vehicule pen-
tru transportarea diferitor substanţe, dar şi crearea şi manipularea unor
adevărate nano-motoare, utile în nanomanipulare celulară. F1-ATP-aza este
un veritabil nano-motor rotativ, a cărei mişcări pot fi controlate cu ajutorul
unor stimuli optici şi chimici (Ristic şi col., 2009).
Sisteme particulare capabile de transport ţintit şi eficient a diferitor
substanţe, cu puţine efecte adverse, se datorează probabil endocitozei
transportorilor. Nanoparticule cationice formate din lipide cationice şi
polielectroliţi s-au dovedit a fi cărăuşi excelenţi pentru transportul
amfotericinei B – un antifungicid pentru Candida albicans (Vieira şi
Carmona-Ribeiro, 2008).
Nanodiscurile de HDL (High Density Lipoprotein) sunt un strat

bifosfolipidic cu aspect de disc (ND-HDL). Este cunoscut faptul că HDL
este numit “colesterolul bun” deoarece este implicat în transportul molecu-
lelor hidrofobe (colesterol) în fluxul sangvin care este un mediu hidrofil.
Structura HDL (liporoteine cu densitate mare) este una simplă, fiind alcătu-
it din fosfolipide şi apolipoproteină (apo). Cea mai abundentă formă de
lipoproteină din plasma sanguină umană este apoA-I, care este alcătuită
din 243 de aminoacizi, este bine caracterizată şi la incubarea cu vezicule de
fosfolipide în vitro formează HDL revers, capabil de transportul molecule-
lor hidrofobe (Ryan, 2010). Fosfolipidele cele mai frecvent utilizate pentru
asamblarea veziculelor sunt DMPC (dimirisstoil-fosfatidil colina) şi DMPG
(dimirisstoil-fosfatidil glicerol). Incubarea acestor vezicule cu apoA-I se
autoasamblează ND-HDL. Aceste nano-discuri se pot autoasambla chiar
dacă nu este utilizată enzima integrală, ci numai fragmente de
apolipoproteine (Weers şi col., 2001). ND-HDL reprezintă astfel un mediu
favorabil pentru studierea proteinelor transmembranare, transportul unor
substanţe hidrofobe.
59
Stratul bilipidic este un mediu natural pentru proteinele
transmembranare care îşi păstrează proprietăţile sale conformaţionale şi
activitatea. Suprafaţa unui nanodisc cu diametrul de 20nm este de ~300
nm2, o suprafaţă suficientă pentru integrarea câtorva molecule proteice.
Avantajul utilizării acestor structuri comparativ cu miceliile de detergenţi,
este că asigură un mediu natural apropiat, fără prezenţa detergenţilor care
pot schimba conformaţiile proteinelor. ND-HDL au fost utilizate în studie-
rea a numeroase proteine transmembranare cum ar fi bacteriorodopsina
(Bayburt ţi col., 2006; Blanchette şi col., 2008), citoromul p450 3A4 (Baas şi
col., 2004), toxina antraxului (Katayama şi col., 2010), hidrogenaze enzime
de membrană produse de Pyrococcus furiosus care pot sintetiza H2 (Baker şi
col., 2009). ND-HDL au fost testate în utilizarea lor pentru transportul dife-
ritor substanţe hidrofobe, care sunt insolubile în mediu sangvin hidrofil.
Un exemplu în acest sens este transportul de către ND-HDL a amfotericinei
B un potenţial antifungicid care inhibă creşterea Saccharomyces cerevisiae şi a
altor fungi patogene, care administrat sub această formă nu mai este toxic
la anumite concentraţii (Oda şi col., 2006). ND-HDL ce conţineau
cucurmină (un polifenol hidrofob natural obţinut din Curcuma longa) au
inhibat creşterea liniei celulare hepatice HepG2 comparativ cu administra-
rea curcuminei libere (Ghosh şi col., 2010). O altă aplicaţie a nanodiscurilor
de HDL a fost încorporarea de lipide cu ioni bivalenţi de Ni2+, care au capa-
citatea de a fixa proteinele cu etichetă de 6-His (histidine). Proteina din în-
velişul virusului West Nile (Fischer şi col., 2010)
3. Bibliografie
1. Baas B. J., Denisov I. G., Sligar S. G., (2004). Homotropic cooperativity of
monomeric cytochrome P450 3A4 în a nanoscale native bilayer environment,
Archives of Biochemistry and Biophysics, 430(2), 218-28.
2. Baker S. E., Hopkins R. C., Blanchette C. D., Walsworth V. L., Sumbad R., Fischer
N. O., Kuhn E. A., Coleman M., Chromy B. A., Letant S. E., Hoeprich P. D., Adams
M. W., Henderson P. T., (2009). Hydrogen production by a hyperthermophilic
membrane-bound hydrogenase în water-soluble nanolipoprotein particles, Journal
of the American Chemical Society, 131(22), 7508-7509.
3. Baker P., Sawa Y., Shibata H., Sedelnikova S., Rice D., (1998). Analysis of the
structure and substrate binding of Phormidium lapideum alanine dehydrogenase.
Nature Structural Biology, 5, 561-67.
4. Bayburt T. H., Grinkova Y. V., Sligar S. G., (2006). Assembly of single
bacteriorhodopsin trimers în bilayer nanodiscs, Archives of Biochemistry and
Biophysics, 450(2), 215-22.
5. Blanchette C. D., Cappuccio J. A., Kuhn E. A., Segelke B. W., Benner W. H., Chromy
B. A., Coleman M. A., Bench G., Hoeprich P. D., Sulchek T. A., (2008). Atomic force
microscopy differentiates discrete size distributions between membrane protein
60
containing and empty nanolipoprotein particles, Biochimica et Biophysica Acta,
1788(3), 724-31.
6. Boonstra B., Rathborne D. A., French C. E., Walker E. H., Bruce N. C., (2000).
Cofactor regeneration by a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase for
biological production of hydromorphone. Applied Enviromental Microbiology, 66,
5161-66.
7. Cabello C. M., Warner B. Bair W. B., Bause A. S., Wondrak G. T., (2009).
Antimelanoma activity of the redox dye DCPIP (2,6-Dichlorophenolindophenol) is
antagonized by NQO1, Biochemical Pharmacology, 78(4), 344-54.
8. Chibata I., Tosa T., Sato T., (1976). Production of L-aspartic acid by microbial cells
entrapped în polyacrylamide gels. Methods în Enzymology, 44, 739-746.
9. Conde J., de la Fuente J. M., Baptista P. V., (2010). RNA quantification using gold
nanoprobes - application to cancer diagnostics, Journal of Nanobiotechnology, 8:5.
10. Deconttignies-Le Maréchal P., Calderon-Seguin R., Vandecasteele J.,P., Azerad R.,
(1979). Synthesis of L-tryptophan by immobilized Escherichia coli cells. European
Jornal of Applied Microbiology and Biotechnology, 7, 33-44.
11. Delforge D., Devreese B., Dieu M., Delaivre E., Beeumen J., Remacle J., (1997).
Identification of lysine 74 în pyruvate bineding of alanine dehydrogenase from
Bacillus subtilis. Journal of Biological Chemistry, 272, 2276-84.
12. Ghosh M., Singh A. T., Xu W., Sulchek T., Gordon L. I., Ryan R. O., (2010).
Curcumin nanodisks: formulation and characterization, Nanomedicine:
Nanotechnology, Biology and Medicine,
13. Honorat A., Monot F., Ballerini D., (1990). Synthesis of L-alanine and L-valine by
enzyme system from Bacillus megaterium. Enzyme and Microbial Technology, 12, 515-20.
14. Honorat-Pascal A., Monot F., Ballerini D., (1990). Coparative stady of the enzymatic
synthesis of L-valine by purified enzymes, crude extract or permeabilized cells
from Bacillus megaterium. Applied Microbiology and Biotechnology, 34, 236-41.
15. Hummel W., Kula M-R., (1989). Dehydrogenases for the synthesis of chiral
compounds. European Journal of Biochemistry, 184, 1-13.
16. Fischer N.O., Infante E., Ishikawa T., Blanchette C.D., Bourne N., Hoeprich P.D.,
Mason P.W., (2010). Conjugation to nickel-chelating nanolipoprotein particles
increases the potency and efficacy of subunit vaccines to prevent West Nile
encephalitis, Bioconjugate Chemistry, 21(6), 1018-22.
17. Fukui S., Ikeda S., Fujimura M., Yamada H., Kumagai H., (1974). Production of
L-tryptophan, L-tyrosine and their analogues by immobilized tryptophanase and
immobilized β-tyrosinase. European Journal of Applied Microbiology, 1, 25-39.
18. Fusee M., Swann W., Calton G., (1981). Immobilization of Escherichia coli cells
containing aspartase activity with polyurethane and its application for L-aspartic
acid production. Applied Enviromental Microbiology, 42, 672-76.
19. Fusee M., Weber J., (1984). Immobilization by polyurethane of Pseudomonas
dacunhae cells containing L-aspartat β-decarboxylase activity and application to
L-alanine production. Applied Enviromental Microbiology, 48, 694-98.
20. Karsten W.E., Viola R.E., (1991). Kinetic studies of L-aspartase from Escherichia coli:
pH-dependent activity changes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 287, 60-67.
21. Katayama H., Wang J., Tama F., Chollet L., Gogol E. P., Collier R. J., Fisher M. T.,
(2010). Three-dimensional structure of the anthrax toxin pore inserted into lipid
nanodiscs and lipid vesicles, Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA, 107(8), 3453-57.
61
22. Katoh R., Nagata S., Ozawa A., Ohshima T., Kamekura M., Misono H., (2003).
Purification and characterization of leucine dehydrogenase from an alkaliphilic
halophile, Natronobacterium magadii MS-3. Journal of Molecular Catalysis, 23, 231-38.
23. Mondalek F. G., Ponnurangam S., Govind J., Houchen C., Anant S., Pantazis P., Rama P
Ramanujam R. P., (2010). Inhibition of angiogenesis- and inflammation-inducing factors
în human colon cancer cells în vitro and în ovo by free and nanoparticle-encapsulated
redox dye, DCPIP, Journal of Nanobiotechnology, 8:17, 1-9.
24. Monot F., Benoit Y., Lemal J., Honorat A., Ballerini D., (1988). Simultaneous
production of amino acid dehydrogenase and glucose dehydrogenase by Bacillus
megaterium and their utilization for L-valine synthesis with NADH regeneration.
Biocatalysis, 2, 161-74.
25. Nagata S., Misono H., Nagasaki S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989).
Thermostable alanine dehydrogenase of Bacillus sp.DSM730: gene cloning,
purification, and characterization. Biochemistry, 71, 559-63.
26. Nagata S., Tanizawa K., Esaki N., Sakamoto Y., Ohshima T., Tanaka H., Soda K.,
(1988). Gene cloning and sequence determination of leucine dehydrogenase from
Bacillus stearothermophilus and structural comparison with other
NAD(P)+-dependent dehydrogenases. Biochemistry, 27, 9056-62.
27. Norbert M., Brunhuber W., Blanchard J.S., (1994). The biochemistry and
enzymology of amino acids dehydrogenases. Critical Reviews în Biochemistry and
Molecular Biology, 29, 415-67.
28. Oda M. N., Hargreaves P. L., Beckstead J. A., Redmond K. A., van Antwerpen R.,
Ryan R. O., (2006). Reconstituted high density lipoprotein enriched with the
polyene antibiotic amphotericin B, Journal of Lipid Research, 47(2), 260-67.
29. Ohshima T., Nishida N., Bakthavatsalam S., Kataoka K., Takada H., Yoshimura T.,
Esaki N., Soda K., (1994). The purification, characterization, cloning and
sequencing of the gene for a halostable and thermostable leucine dehydrogenase
from Thermoactinomyces intermedius. European Journal of Biochemistry, 222, 305-12.
30. Ohshima T., Wandrey C., Conrad D., (1988). Continous production of 3-fluoro-L-alanine
with alanine dehydrogenase. Biotechnology and Bioengineering, 34, 394-97.
31. Ohshima T., Wandrey C., Kula M-R., Soda K., (1985). Impovement for L-leucine
production în a continously operated enzyme membrane reactor. Biotechnology and
Bioengineering, 26, 1616-18.
32. Oka M., Yang Y.S., Nagata S., Esaki N., Tanaka H., Soda K., (1989). Overproduction
of thermostable leucine dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus and its
one-step purification from recombinant cells of Escherichia coli. Biotchnology and
Applied Biochemestry, 11, 307-11.
33. Patra H.K., Banerjee S., Chaudhuri U., Lahiri P., Dasgupta A., (2007). Cell selective
response to gold nanoparticles, Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine,
3, 111–19
34. Ristic Z., Vitali M., Duci A., Goetze C., Kemnitz K., Zuschratter W., LillH., Bald D.,
(2009). Two-stimuli manipulation of a biological motor, Journal of
Nanobiotechnology, 7:3.
35. Ryan R. O., (2010). Nanobiotechnology applications of reconstituted high density
lipoprotein, Journal of Nanobiotechnology, 8:28.
36. Schütte H., Flossdorf J., Sahm H., Kul, M. R., (1976). Purification and properties of
formaldehyde dehydrogenase and fromate dehydrogenase from Candida boidinii.
European Journal of Biochemistry, 62, 151.
62
37. Siranosian J.K., Ireton, K., Grossamn D.A., (1993). Alanine dehydrogenase (ald) is
required for normal sporulation în Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology. 175,
6789-96.
38. Sondi I., and Salopek-Sondi B., (2004). Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a
case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria, Journal of Colloid and
Interface Science, 275, 177–82.
39. Speshock J. L., Murdock R. C., Braydich-Stolle L. K., Schrand A. M., Hussain S. M.,
(2010). Interaction of silver nanoparticles with Tacaribe virus, Journal of
40. Tosa T., Sato T., Mori T., Chibata I., (1974). Basic studies for continous production
of L-aspartic acid by immobilized Escherichia coli Cells. Applied Microbiology, 27,
886-89.
41. Vieira D. B., and Carmona-Ribeiro A. M., (2008) Cationic nanoparticles for delivery
of amphotericin B: preparation, characterization and activity în vitro, Journal of
42. Weers P. M., Narayanaswami V., Ryan R. O., (2001). Modulation of the lipid
binding properties of the N-terminal domain of human apolipoprotein E3, Euro-
pean Journal of Biochemistry, 268, 3728-35.
63
II. CULTURI CELULARE
Culturi celulare
Cuprins
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale .................................................... 64

2. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu ............. 67
3. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de
funcţionare pentru diverse tipuri de experimente .................................................. 71
3.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare ..................................................... 71
3.2. Strategii de lucru ............................................................................................ 74
3.3. Instruirea personalului ................................................................................... 75
3.4. Cultivarea celulelor ......................................................................................... 78
3.5. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi stabilirea
viabilităţii acestora .......................................................................................... 78
3.6. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor .................................................................. 79
3.7. Subclonarea; tripsinizarea............................................................................... 81
4. Bibliografie ............................................................................................................. 81
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale

Multe dintre tehnicile introduse la un moment dat în diferite ştiinţe au re-
voluţionat felul în care acea ştiinţă a fost percepută ulterior. Culturile celulare
sunt un asemenea exemplu în biologie. Introducerea acestei tehnici în urmă cu
aproximativ 100 de ani a permis practic importul naturii în laborator, ceea ce a
dus la standardizarea tehnicilor şi generalizarea strategiilor de studiu între
cercetătorii din diverse instituţii, urmată de o explozie informaţională în lumea
biologică. Avansarea cunoaşterii bio-medicale din ultimele decenii nu ar fi fost
posibilă fără dezvoltarea printre altele a metodelor de lucru cu celulele. Cerce-
tarea bio-medicală actuală foloseşte tehnicile de lucru cu celulele pentru inves-
tigarea unor probleme din domenii ca: biofizica, biochimie, biologie celulară şi
moleculară, genetica, biologia dezvoltării organismelor, evolutionism, medici-
na moleculară, farmacologia, bio-nano-tehnologia, inteligent drug design etc.
64
Este practic de neimaginat desfăşurarea activităţii într-un centru de cercetare
bio-medical lipsit de laboratorul de culturi celulare. Aplicaţii curente sunt lega-
te de: folosirea culturilor celulare pentru elaborarea vaccinurilor, producţia
glico-proteinelor recombinante (cytokine, hormoni, anticorpi monoclonali fo-
losiţi în cercetare şi clinica medicală, interferoni, eritropoietina), testarea agenţi-
lor anticanceroşi, studii de genomică, metabolism, apoptoză. Într-un sens mai
larg, cultura celulară poate cuprinde cultura ţesuturilor şi organelor. Pe de altă
parte, celulele pot fi folosite ca şi model pentru studiul răspunsurilor fiziologi-
ce la diferiţi factori de stres din mediu. Avansarea cercetării din domeniul celu-
lelor stem şi lucrul cu celulele embrionare face posibilă, deocamdată teoretic,
cultivarea organelor şi ţesuturilor cu aplicaţii în bolile cronice degenerative,
cancere şi altele.
Din punct de vedere al tipului de cultură se poate vorbi despre:

- cultura de organe - presupune prelevarea şi cultivarea unui organ în
totalitate. Aceasta include şi cultivarea unor embrioni întregi;
- cultura de ţesuturi - presupune prelevarea unor fragmente de ţesuturi
şi cultivarea lor;
- cultura de celule - presupune prelevarea unor ţesuturi şi digestia lor
pentru obţinerea unei suspensii unicelulare care este apoi cultivată mai
departe.
Dacă ne referim la cultura de celule, există trei tipuri de celule animale

care sunt cultivate în laborator: primare, secundare şi imortalizate (tabel 1).
Tabel 1. Caracteristicile celulelor primare, secundare şi imortale/canceroase

Proprietăţi primare secundare imortale/canceroase
Inhibiţia de contact1 da da unele/nu
Fenotipul faţă de situaţia in identic asemănător asemănător/rotunde
vivo
Genotipul faţă de situaţia in identic identic asemănător/diferit
vivo
Necesarul factorilor de creştere crescut crescut crescut/limitat
Diferenţiate da da da/nediferenţiate
Număr de diviziuni 2-3 <100 nelimitat
Timp necesar cultivării crescut scăzut scăzut
Reproductibilitatea rezultate- scăzută crescută crescută
lor
1 în mod normal, celulele cresc în vasul de cultură până când stabilesc contact cu vecinele
lor, moment în care îşi opresc creşterea. Celulele canceroase pierd această caracteristică feno-
tipică şi după ce ajung să fie confluente încep să crească una peste cealaltă formând ghemuri
de celule uşor de distins la microscopul optic.
65
Culturi primare
Majoritatea celulelor din culturile primare necesită ancoraj. Cultivarea
celulelor provenite din piele (keratinocite, fibroblaste) se face prin
biopsierea ţesutului şi formarea unei suspensii unicelulare. Aceste celule
vor creşte aderente de suprafaţa vasului de cultură. Pentru a le separa de
acesta şi pentru separarea celulelor unele de altele se folosesc de obicei en-
zime proteolitice (tripsina). Pe de altă parte, cultivarea celulelor prelevate
din sângele periferic se face într-o manieră care nu necesită ancorarea aces-
tora de pereţii vasului de cultură. Este posibil ca celulele să formeze ade-
renţe între ele dar de obicei acestea sunt de o mică intensitate. Diferite sub-
stanţe (factori de creştere ai diferitelor populaţii leucocitare şi/sau mitogeni
– substanţe care stimulează mitoza) pot fi utilizate pentru diferenţierea şi
înmulţirea celulelor în cultură.
Culturi secundare
Prin subcultivarea celulelor dintr-o cultură primară se pot obţine
aşa-numitele culturi secundare. Celulele dintr-o cultură secundară pot par-
curge până la 100 de diviziuni înainte de a-şi pierde potenţialul proliferativ.
Deşi nu prezintă alterări ale setului de cromozomi (karyotipului), aceste
celule acumulează anumite caracteristici fenotipice care le fac să devină o
linie celulară distinctă. Pe lângă derivarea culturilor secundare, subcultura
are ca scop menţinerea celulelor în faza logaritmică de creştere, evitarea
confluenţei care poate avea ca rezultat inhibarea creşterii, îndepărtarea ce-
lulelor moarte şi a produşilor de metabolism celular şi adăugarea substanţe-
lor nutritive.
Culturi de celule imortalizate

Este posibil ca unele celule din culturile secundare să sufere anumite
transformări care le conferă caracterul de imortalitate adică posibilitatea de
a se divide la nesfârşit. Aceste celule pot apărea ca urmare a unor modifi-
cări (transformări) la nivelul cromozomului prin factori chimici, fizici (radi-
aţii) sau biologici (virusurile oncogene). Unele dintre aceste celule imortale
(transformate) pot avea caracter oncogenic; cu alte cuvinte transplantarea
lor la animalele de laborator este urmată de apariţia tumorilor la acestea.
După cum se poate observa din tabelul 1, celulele canceroase au unele
proprietăţi care le diferenţiază de celelalte celule imortale necancreoase: nu
mai prezintă inhibiţia de contact; pot creşte cu mai puţini nutrienţi etc.
66
2. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sis-
teme de studiu
Aplicaţiile culturilor celulare îşi găsesc utilitatea în producerea: vacci-
nurilor (antirubeolic, antiparotidita epidemică, antivaricela, antirabic);
hormonilor şi factorilor de creştere (insulina, eritropoietina), factorilor de
coagulare, enzimelor, anticorpilor monoclonali şi altor substanţe
imunomodulatoare (interferoni, interleukine), agenţilor anticanceroşi etc.
Mai mult, dezvoltarea în ultimii ani a cunoştinţelor şi tehnologiei de lucru
cu celulele stem constituie una dintre temele cele mai actuale în domeniul
biomedical. Este de aşteptat ca acest domeniu să revoluţioneze tratamentul
diferitelor afecţiuni. În plus, celulele animale sunt deosebit de utile în testa-
rea citotoxicităţii diferitelor substanţe incluzând noile terapii anticanceroa-
se. Nu în ultimul rând, prin folosirea tehnologiei AND-ului recombinat este
posibilă crearea celulelor transgene care constituie per se un model de stu-
diu pentru investigarea metabolismului energetic, traficului de membrană,
ciclului celular, diferenţierii, îmbătrânirii şi apoptozei.
Anticorpii monoclonali
Una dintre aplicaţtiile culturilor celulare cu cel mai mare impact pentru
societate la ora actuală este reprezentată de tehnologia de obţinere a anti-
corpilor monoclonali prin folosirea hibridoamelor. Această tehnologie a
fost pusă la punct de către Milstein şi Koehler în urma cu aproape patru
decenii. În 1975 cei doi cercetători au publicat rezultatele prin care pot fi
obtinuţi anticorpii monoclonali. Pe scurt tehnica presupune imunizarea
unui animal de experienţă cu un antigen şi recoltarea celulelor B (cele care
produc anticorpii) la un anumit interval de timp după imunizare (figura 1).
Aceste celule sunt fuzionate apoi în prezenţa poli-etilen-glicolului (PEG) cu
o linie celulară canceroasă de mielom (cancer al plasmocitelor). În urma
acestei fuziuni, se formează celule hibrid (de unde şi numele de
hibridoame) dintre care unele produc anticorpii cu specificitatea dorită (ca-
racter dobândit de la celula B a animalului imunizat) într-o manieră conti-
nuă (dobândind caracterul imortal de la celulele de mielom). Prin diferite
metode de screening se pot găsi aceste celule care sunt ulterior subclonate
dând naştere astfel unor linii celulare pure şi stabile are produc anticorpii
monoclonali.
Datorită specificităţii deosebit de mari (se consideră că un anticorp poate

distinge antigenul pereche între 108 molecule), anticorpii monoclonali şi-au
găsit foarte rapid aplicaţii în domenii variate cum ar fi: diagnosticul şi trata-
67
mentul clinic, cercetare fundamentală şi aplicată (metode de izolare a diferi-
telor substanţe recunoscute), catalizatori ai reacţiilor chimice (abzymes).
Folosirea terapeutică a anticorpilor monoclonali în diferite afecţiuni
umane urmează două direcţii: markeri diagnostici care pot identifica diferi-
te tipuri de antigene din populaţii celulare in vivo şi terapia ţintită a diferite-
lor afecţiuni în care anticorpului monoclonal îi sunt ataşate substanţe chi-
mice toxice sau radioactive.
antigen
PEG
HAT
Screening
Subclonare
Linie celulară produca-

toare de anticorp mono-
clonal
Figura 1 Producerea anticorpilor monoclonali
Splina este izolată la câteva saptămâni (timp necesar pentru îmbogăţi-

rea repertoriului de celule B specifice) după imunizarea animalului cu anti-
genul faţă de care se doreşte producerea anticorpilor monoclonali. Celulele
B sunt izolate şi combinate cu mieloamele (partea stângă) în prezenţa PEG
care mediază fuziunea celulelor. Celulele hibrid sunt singurele care vor
supravieţui în mediul suplimentat cu Hypoxanthine Aminopterin
Thymidine (HAT). Screeningul face posibilă identificarea coloniilor care
produc anticorpi faţă de antigenul dorit. Urmează apoi subclonarea realiza-
tă prin diluarea celulelor din coloniile producătoare în aşa fel încât fiecare
68
recipient să conţină teoretic o singură celulă. Se obţin în acest fel colonii în
care toate celule provin dintr-o singură celulă mamă şi deci vor produce
acelaşi anticorp ca şi aceasta.
Această abordare a permis medicilor oncologi să obţină rezultate spec-
taculoase în diferite forme de cancere. Se poate vorbi la ora actuală de can-
cere tratate cu anticorpi monoclonali în care pacienţii supravieţuiesc fără
recidivă la 30 de ani de la administrarea terapiei.
Deşi nu sunt toxici, anticorpii monoclonali produşi în şoarece prezintă

neajunsul de a fi străini organismului uman. Ajunşi în organism aceşti anti-
corpi ca orice altă substanţă străină iniţiază un răspuns imun din partea gaz-
dei care se poate manifesta prin secreţia de anticorpi umani anti-anticorpi
monoclonali de şoarece. Cu timpul anticorpii umani pot neutraliza şi distru-
ge anticorpii monoclonali injectaţi anulându-le efectele terapeutice. Din acest
motiv, în ultimii ani, anticorpii de şoarece au fost umanizaţi. Tehnologia
ADN-ului recombinat a făcut posibilă ataşarea părţii specifice (cea care recu-
noaşte antigenul) derivată de la şoarece cu un braţ constant (care consituie
cea mai mare parte) de la om. Există la ora actuală şi peste 30 de anticorpi
monoclonali folosiţi ca şi agenti terapeutici în diferite afecţiuni umane; numă-
rul celor aflaţi în diferite stadii de testare depăşeşte 100.
Celule stem
Următorul pas în revoluţia din domeniul biomedical a fost reprezentat

de posibilitatea cultivării celulelor stem în laborator. Prin definiţie celulele
stem sunt acele celule care prin diviziune dau naştere unei celule fiică iden-
tică şi unei alte celule care poate fi diferită. După sursa de provenienţă exis-
tă două tipuri de celule stem: celule stem embrionare şi celule stem adulte.
După numărul de precursori ai liniilor diferenţiate pe care le poate produ-
ce, celule stem pot fi clasificate în: totipotente, pluripotente, multipotente,
oligopotente. După cum implică numele, celulele totipotente sunt capabile
să formeze un organism în totalitate. Aceste celule sunt reprezentate de
către ovulul fertilizat şi celulele obţinute din primele diviziuni ale acestuia.
O schiţă a diferenţierii celulare se găseşte în figura 2. Cele mai bine studiate
celule stem sunt cele derivate din măduva osoasă şi care constituie precur-
sorii tuturor celulelor din sânge. Interesul major pentru biologia celulelor
stem este explicat de potenţialul de diferenţiere al acestora în orice tip de
ţesuturi şi organele dintr-un organism. Deşi cercetarea în acest domeniu
este relativ la început, cercetătorii au reuşit să izoleze şi cultive cu succes
69
anumite celule stem din diferite surse unele dintre ele fiind apoi diferenţia-
te în numeroase celule finale. Pe lângă potenţialul terapeutic enorm, celule-
le stem prezintă şi aplicaţii diagnostice. Este posibil ca una dintre cele opt
celule ale embrionului rezultat în urma fertilizării in vitro a unui ovul să fie
îndepărtată şi analizată din punct de vedere genetic (celula este dispensabi-
lă deoarece restul celulelor rămase refac embrionul). În urma analizelor
care pot să depisteze diferite defecte genetice se poate decide
neimplantarea embrionului în uterul viitoarei mame.
Folosirea acestor celule face posibilă şi obţinerea animalelor modificate

genetic prin introducerea unor gene în embrionul tânăr. Se pot produce
astfel animale „chimera” care exprimă genele implantate în diferite organe.
Dacă aceste organe sunt chiar gonadele, atunci urmaşii unei împerecheri
dintre doi astfel de şoareci chimera pot produce un knock-out/knock-in
pentru acea genă. Deşi deosebit de atractivă, tehnologia cultivării celulelor
stem embrionare este puternic îngrădită de normele actuale ale eticii cerce-
tării.
Celula stem
Pluripotentă
Celula stem
Multipotentă
Celula stem cu
potenţial limitat
Celula diferen-
ţiată
Parţial
Celula diferen-
ţiată final,
postmitotică
Figura 2 Celulele stem pot da nastere unui numar mare de celule diferentiate final
70
Disputele asupra aspectelor etice ale lucrului cu celule stem embrionare
au încurajat dezvoltarea tehnicilor de lucru cu celulele stem adulte. Rămâ-
ne de văzut dacă potenţialul unor astfel de celule stem adulte este la fel de
nelimitat ca şi al celor embrionare. Recent au fost descrise şi celule stem
canceroase. Această nouă descoperire pune sub semnul întrebării principii-
le actuale care stau la baza tratamentului cancerului. Existenţa acestor celu-
le canceroase stem poate explica apariţia recidivelor prin participarea unui
număr redus de celule care nu pot fi distinse/distruse prin tehnicile actua-
le. Experimental s-a dovedit că un număr de doar 200 de celule considerate
ca fiind celule stem canceroase este suficient pentru a transfera cancerul de
la un animal la un altul în timp ce un număr de câteva sute de ori mai mare
de celule canceroase care nu prezintă caracteristicile celulelor stem sunt
incapabile să transfere boala.
Succesul în lucrul cu celule depinde de factori variaţi cum ar fi: utilarea

laboratorului, calitatea celulelor şi a reactivilor, tehnica asepteică (prezenta-
te în cele ce urmează) şi experienţa personală a operatorului care contribuie
decisiv la primele trei.
3. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor

optimi de funcţionare pentru diverse tipuri de experimente
3.1. Echiparea laboratorului de culturi celulare
Organizarea generală a laboratorului de culturi celulare include urmă-
toarele echipamente de bază (figura 3):
a. Hota cu flux laminar
• Serveşte lucrului efectiv cu celulele; aranjarea spaţiului de lucru este
descrisă în figura 4;
• este prevazută în mod obligatoriu cu o lampă de UV care va fi por-
nită 5-10 minute înainte de începerea lucrului şi repornită pentru
5-10 minute după încheierea lucrului;
• tipul de hotă folosită pe scară largă în cultura celulelor animale este
hota cu flux de aer vertical care oferă o protecţie bună atât pentru
celule cât şi pentru operator.
b. Incubator cu sursa de CO2
• creşterea celulelor; în funcţie de tipul de celulp, concentraţia de CO2
este în general ajustată între 5% şi 7% pentru a obţine un sistem
tampon optimal în combinaţie cu substanţele din mediul de cultură;
71
• responsabil pentru menţinerea unei atmosfere sterile (filtre HEPA,
high efficiency particulate air), umede şi cu temperatura constantă.
c. Microscop optic inversat cu contrast de fază (opţional aparat foto)
• serveşte la observarea celulelor;
• deoarece în cultura de celule animale, celulele sunt în general situa-
te pe suprafaţa bazei recipientului se foloseşte microscopul inversat;
• contrastul de fază îmbunătăţeşte vizualizarea specimenelor transpa-
rente (celulelor).
d. Centrifuga de masă cu răcire
• centrifugarea suspensiilor de celule în diverse scopuri.
e. Recipient cu azot lichid
• stocarea celulelor pe termen lung; de obicei se găseşte într-o incintă
anexată;
• o precauţie deosebită trebuie acordată faptului că recipientul este
extrem de rece (-196 grade Celsisus) şi azotul poate produce arsuri
în urma contactului cu pielea sau mucoasele; de aceea este necesară
utilizarea echipamentului de protecţie (ochelari/mască facială,
manuşi, halat).
f. Frigider/congelator
• stocarea reactivilor (medii cultură, stocuri de antibiotice,
L-glutamina etc.)
Alte componente
• Baie de apă
o păstrarea mediilor şi altor reactivi la temperatura de 37 gra-
de Celsius;
o o alternativă este înlocuirea apei cu perle metalice care pre-
zintă următoarele avantaje: reducerea contaminării reactivi-
lor cu care vin în contact, igienizare uşoară, economisirea
consumului de energie, stabilitate în timp.
• Autoclav şi sterilzor cu aer uscat
o Folosite pentru sterilizarea diferitelor soluţii şi recipiente fo-
losite.
• Pompa de vid şi sisteme de sterilfiltrare
o pentru lichidele instabile la autoclavare (de ex. DMSO) se
poate folosi şi ca sistem de aspirare a mediilor folosite.
72
Figura 3. Organizarea laboratorului de culturi celulare
Consumabile
• pipete serologice, pot fi din plastic (de unică folosinţă) sau din sticlă
(refolosibile după sterilizare);
• vase de cultură - codate în funcţie de aria utilă de cultivare şi de vo-
lumul maxim de mediu care poate fi conţinut;
• medii de cultură (multe celule pot fi cultivate în DMEM/RPMI+10%FBS
la care se adaugă diferite concentraţii de L-glutamina şi antibiotice);
73
Conologic se poate vorbi de existenţa a două categorii de medii; cele na-
turale care includ serul sanguin şi alte secreţii de origine animală şi me-
dii sintetice în care componentele de bază sunt produse separat şi apoi
amestecate de obicei de către firme specializate. Chiar dacă este vorba
de un mediu sintetic, cu unele excepţii serul este considerat un compo-
nent de bază. La ora actuală, serul provine de la animale mari, în gene-
ral de la vacă - de unde şi numele de fetal bovine serum (FBS). Mediile de
cultură sunt soluţii saline tamponate. Compoziţia mediilor de cultură
este complexă incluzând: aminoacizi, acizi graşi, carbohidraţi, săruri,
microelemente, vitamine, hormoni, factori de creştere şi alte componen-
te. Cele mai multe medii conţin şi phenol red, un indicator al pH-ului
care trebuie să rămână între 7 şi 7,4. Dacă acesta virează spre galben in-
dicând un mediu acid este cazul ca mediul să fie schimbat.
• suplimente pentru mediile de cultură: antibiotice – uzual se foloseşte
un ameste de penicilină/streptomicină, L-glutamină, Na-pyruvat, bi-
carbonat, glucoză şi altele în funcţie de particularităţile experimentului.
3.2.Strategii de lucru
Din punct de vedere tehnic, există câteva principii de bază ale lucrului
cu celulele:
• culturile celulare vor fi făcute într-o cameră dedicată acestui scop.
Este de dorit ca această încapere să fie oarecum izolată faţă de restul
laboratoarelor pentru a limita riscul de contaminare. Tot din acest
motiv, accesul personalului în această cameră va fi restricţionat pe
cât posibil; de aceea se va permite doar accesul celor care sunt direct
implicaţi în procesul de lucru cu celulule;
• personalul care urmează să lucreze cu celulele va fi instruit cores-
punzător (vezi mai jos);
• acele încăperi care sunt dedicate lucrului cu celule prezintă risc in-
fecţios pentru cei implicaţi; de aceea încăperile vor fi semnalizate co-
respunzător;
• toate mediile şi suplimentele care urmează a fi folosite în cultura ce-
lulară trebuie să fie certificate pentru lucrul pe culturi de celule (in-
dicaţia cell culture certified/approved trebuie să apară pe amba-
laj/descrierea produsului); toate acestea trebuie adaptate liniilor ce-
lulare cu care urmează a se lucra în laborator;
• spre deosebire de celulele vegetale şi bacterii, celulele animale sunt
pretenţioase în ceea ce priveşte condiţiile în care pot sa crească; exis-
tă riscul contaminării cu diferite microorganisme care datorită ratei
74
de creştere mult superioară celulelor animale vor deveni majoritare
în scurt timp; în plus factori ca spre exemplu temperatura (37 de
grade Celsius pentru celule mamifere), pH-ul, osmolaritatea
(290-310mOsm), şi o concentraţie a CO2 între 5 şi 7% condiţionează
clutura celulelor animale (sistemul de tampon cel mai frecvent utili-
zat este cel cu bicarbonat de sodiu sau potasiu din mediul de cultu-
ră + CO2 din incubatorul folosit);
• celulele animale sunt limitate în ceea ce priveşte numărul de genera-
ţii pe care le produc. Chiar şi în condiţii optime, celulele animale se
vor opri din creştere după un număr de generaţii care depinde de
sursa primară a celulelor;
• creşterea celulelor animale urmează o curbă cu trei faze:
o faza de echilibrare (primele 24h) în care celulele se acomo-
dează cu noul mediu în care sunt introduse;
o faza de creştere exponenţială care durează în jur de 7-10 zile;
o faza de inhibare a creşterii datorită inhibiţiei de contact, creş-
terii densităţii peste un nivel critic, scăderii potenţialului de
metabolizare a mediului;
• substanţele pot fi preîncălzite fie la 22, fie la 37 grade Celsius (10-20
min e suficient; se poate porni un cronometru pentru a evita „uita-
rea” mediilor pentru un timp îndelungat şi degradarea lor
(L-glutamina, tripsina).;
• lucrul bine organizat şi desfăşurat fără grabă este esenţial pentru o
eficienţă maximă:
o mişcările vor fi măsurate şi sigure;
o imediat după adăugarea suplimentelor în mediile de cultură
se notează acest fapt pe recipientul respectiv;
o nimic din ceea ce vine în contact direct cu celulele nu se des-
chide în afara hotei sterile; înainte de scoaterea din hotă se
verifică etanşeitatea închiderii.
3.3. Instruirea personalului

Cultivarea celulelor este un lucru care se poate învaţa repede. Cu alte
cuvinte, oricine poate învaţa să menţină culturile de celule după doar câte-
va zile petrecute în laborator dacă respectă protocoalele şi are la dispoziţie
echipamentul necesar. Singurul lucru care este şi mai uşor şi nici măcar nu
necesită învatare este să contaminezi celulele. De aceea desfăşurarea activi-
tăţii în linişte este esenţială în laboratorul de culturi celulare. Odată aparută,
contaminarea se poate propaga din aproape în aproape şi duce în final la
compromiterea nu doar a celulelor la care contaminarea a fost iniţial sem-
75
nalată ci a întregului stoc de celule. Pe lângă considerentele financiare, con-
taminarea recipientelor cu conţinut original (celule produse în laborator şi
care nu pot fi achiziţionate de la companiile specializate sau transferate de
la alţi investigatori) reprezintă cel mai neplăcut aspect care poate afecta un
laborator de culturi celulare. Toţi cei care urmează să lucreze cu celule vor
fi în prealabil instruiţi teoretic înainte de a pătrunde pentru prima dată în
laborator. Practic, ei vor începe prin a observa manoperele de lucru şi a le
discuta cu un coleg familiarizat deja cu tehnicile. Doar după această peri-
oadă este permis lucrul direct, mai întâi sub supravegherea directă a celor
familiarizaţi şi mai apoi în mod independent. Chiar şi după câştigarea in-
dependenţei în lucru, cel proaspăt iniţiat va fi supravegheat din umbră de
către un coleg cu experienţă care ar putea observa anumite manopere exe-
cutate neconform cu normele curente.
Asigurarea asepsiei şi antisepsiei

Există anumite măsuri care asigură igiena în lucrul cu celulele:
• Utilizarea echipamentului de protecţie - pentru evitarea contamină-
rii celulelor şi operatorului:
o halat cu mâneci lungi
o pantofi închişi
o mănuşi de unică folosinţă
• Spălatul pe mâini înainte şi după lucrul cu celulele;
• O soluţie antimicrobiană1 de ethanol 70% trebuie să fie în permaneţă
la îndemână;
• Instrumentele de lucru trebuie igienizate la intervale regulate. Orice
obiect (pipeta, recipient etc.) care urmează să fie introdus în hota pentru
lucrul steril trebuie dezinfectat înainte sau imediat după introducere;
• Orice pipetă trebuie folosită o singură dată2; nu este permisă păstra-
rea pipetei în mediu sau folosirea unei pipete pentru a transfera
mediu de la un recipient la altul;
• Orice mediu sau obiect contaminat din greşeală va fi aruncat3;
• Orice lichid care ajunge în contact cu suprafaţa de lucru sterilă va fi
îndepărtat imediat cu ajutorul unui prosop de hârtie îmbibat în
ethanol 70%;
1 În categoria substanţelor cu efect antimicrobian sunt incluse alături de antisepticele aplicate pe
ţesuturi vii, antibioticele care acţionează în interiorul organismului şi de asemenea dezinfectante-

le care distrug microorganismele aflate pe suprafeţele neaparţinând fiinţelor vii.
2 Excepţie fac pipetele de sticlă care pot fi spălate şi sterilizate.
3 Este vorba despre acele medii/suplimente/alte substanţe care nu mai pot fi sterilizate (fie
prin sterilfiltrare fie prin autoclavare) şi respectiv obiecte care nu mai pot fi sterilizate.
76
• Este necesară investigarea stării de sănătate a celulelor în fiecare zi.
Se pot astfel observa caracteristicile normale sau abateri de la aces-
tea. Se pot de asemenea observa contaminări cu alte celule sau mi-
croorganisme. Se pot lua probe care sunt analizate pentru stabilirea
prin diferite tehnici a gradului de puritate/contaminare.
Organizarea spaţiului pentru lucrul steril

Pentru reducerea la maxim a pericolului de contaminare este esenţială
aranjarea locului de muncă sub hotă într-un mod care să evite încrucişarea
mâinilor deasupra vaselor de cultură/mediilor. Pentru organizarea eficien-
tă a „mesei” de lucru se poate consulta figura 4. Trebuie evitată supraîncăr-
carea spaţiului de lucru care poate duce pe de o parte la blocarea fluxului
de aer şi pe de altă parte la accidente nedorite care pot produce contamina-
rea celulelor sau reactivilor.
WASTE
Figura 4 . Organizarea spaţiului de lucru steril
Figura prezintă organizarea de bază a spaţiului, aşa cum este ea

întalnită în mod frecvent în majoritatea laboratoarelor. Figura nu este la
scală. Figura corespunde pentru persoanele care folosesc cu precădere mâ-
na dreaptă.
Linia din faţă:

Dreapta – pipeta/pompa aspirare medii prevazută la capăt cu pipetă
de unică folosinţă
Centru – recipientul cu celule
În plan posterior:
Stânga – vasele cu resturi lichide şi respeciv solide etichetate cores-
punzător
77
Dreapta – mediile de cultură
Centru- suport pentru tuburi
În afara hotei la îndemană - pipete serologice de diferite mărimi; flacon
cu ethanol 70%.
3.4. Cultivarea celulelor

• după felul în care cresc în flacoanele de cultură, celulele eucariote
pot fi împarţite în două mari categorii: cele care cresc aderent pe va-
sul de cultură şi cele care cresc în suspensie. Modul de lucru este
asemănător pentru toate celulele dar există anumite particularităţi
de care trebuie ţinut cont în cazul fiecărei grupe;
• evaluarea celulelor se face în mod normal în fiecare zi prin vizuali-
zarea lor sub microscopul optic; celulele care cresc aderent trebuie
să apară distribuite pe suprafaţa de contact cu vasul în care cresc şi
de cele mai multe ori capătă o formă poligonală, iar celulele care
cresc în suspensie rămân rotunde şi uneori (în funcţie de linia culti-
vată) pot forma aglomerări de celule (asemănător cu o ciorchină de
struguri); starea de sănătate a celulelor este confirmată şi de creşte-
rea numărului de la o zi la alta; o evaluare de primă instanţă a celu-
lelor se realizează prin vizualizarea macroscopică a culorii mediului
din sticlele de cultură;
• culoarea standard a mediilor este roşu-orange; o culoare care virea-
ză spre galben indică necesitatea schimbării mediului;
• subcultivarea celulelor: deoarece aglomerarea celulară poate influ-
enţa negativ vitalitatea celulelor (a se vedea mai sus), se recomandă
ca celulele să fie subcultivate; această procedură care se aplică în fa-
za logaritmică de creştere a celulelor permite obţinerea unor canti-
tăţi crescute de celule prin împărţirea/transferul acestora dintr-un
recipient de cultură în mai multe recipiente fiecare reprezentând o
nouă sursă de celule; există anumite formule de calcul care permit
aflarea cu precizie a combinaţiilor optime; de asemenea se pot plani-
fica în acest fel anumite experimente pentru anumite date; în anu-
mite situaţii este nevoie de utilizarea unor soluţii de tripsina/EDTA
pentru crearea suspensiilor unicelulare (vezi Tripsinizarea).
3.5. Separarea prin centrifugare a celulelor din mediul de cultură şi

stabilirea viabilităţii acestora
Pentru a subcultiva celulele/folosi celulele într-un anumit protocol este
nevoie de stabilirea numărului de celule pe unitatea de volum. Mediul de
78
cultură conţinând celulele este transferat unor tuburi în care se centrifu-
ghează (centrifuga trebuie echilibrată în prealabil - dacă avem un singur
tub cu celule va trebui să folosim un al doilea tub cu aceeaşi greutate care
poate să conţină apă distilată sau orice alt lichid cu densitate asemănătoa-
re). Pentru o separare bună este nevoie de 10 minute la 200-250g/min
(într-o centrifugă de masă cu rotor standard 1000rpm). Celulele vor sedi-
menta ca şi în figura 5. După centrifugare celulele se resuspendă în mediu
proaspăt şi apoi 10 microlitri sunt combinaţi cu 10 microlitri de soluţie
Trypan blue 0,5% şi pipetate în camera de numărat. Sub microscopul optic,
leucocitele apar ca şi celule gălbui/transparente cu o membrană brună.
Soluţia de trypan blue va pătrunde în celulele moarte care apar albastre. În
funcţie de tipul camerei de numărăt, există formule de calcul după care
putem să aflăm numărul total de celule. O viabilitate de peste 90-95% este
în general acceptată pentru toate manipulările ulterioare.
Figura 5 . Aspectul celulelor în tub după centrifugare
3.6. Îngheţarea şi dezgheţarea celuluor

Doi paşi critici ai lucrului cu celulele sunt constituiţi de către îngheţarea
şi dezgheţarea celulelor. Îngheţarea este indispensabilă din următoarele
considerente:
• Celulele sunt supuse în permanenţă variaţiilor în compoziţia cro-
mozomilor. De aceea cea mai sigură metodă de prezervare a liniilor
celulare este cryoprezervarea care opreşte procesele metabolice ne-
lăsând astfel loc modificărilor genotipului.
• În plus, cryoconservarea este o metodă practică din punct de vedere
economic: este mult mai simplu să păstrezi un tub cu celule îngheţa-
te care nu au nevoie decât de o completare periodică a rezervei de
azot decât să cultivi în mod repetat celulele în laborator; de aseme-
79
nea transportul între laboratoare este mai uşor dacă celulele sunt
îngheţate.
• Nu în ultimul rând, metoda face posibilă revenirea la celule cu un
număr mai mic de pasaje.
Este esenţial ca înainte de începerea procedurii respective să notăm
următoarele detalii pe fiecare tub: tipul de celulă, numărul de celule, numă-
rul de pasaj şi data la care a fost creat stocul.
Îngheţarea4 va fi lentă şi constantă pentru a minimaliza efectele adver-
se asupra viabilităţii celulelor. Mediul de îngheţare5 cel mai frecvent folosit
conţine mediul de cultură recomandat pentru linia celulară + 20% FCS +
5-10% cryoprotector -Dimethyl sulfoxid (DMSO) sau 10-15% glycerol care
are rolul de a scădea temperatura de îngheţ permiţând apei să iasă din celu-
lă şi împiedicând astfel formarea cristalelor de gheaţă care ar putea distruge
membrana. După centrifugarea şi verificarea vitalităţii (se recomandă folo-
sirea celulelor vitale în proporţie de >90-95% la colorarea cu trypan blue),
celulele vor fi resuspendate direct în mediul de îngheţare răcit în prealabil
la 4 grade la o concentraţie de 1x106-1x107/ml6 şi transferate imediat7 la -20
de grade C pentru 1-2 ore. Urmează apoi transferul peste noapte la -80 de
grade Celsius şi apoi stocarea de lungă durată în azot lichid.
Dezgheţarea celulelor trebuie făcută extrem de rapid (ideal în mai pu-
ţin de un minut) prin transferul acestora din recipientul cu azot, pe gheaţa
uscată, direct în baia de apă la 37 de grade Celsius. Odată ce dezgheţarea
permite pipetarea suspensiei (>75% dezgheţată) aceasta se transferă într-un
tub de 15ml peste care se adaugă picătură cu picătură8 o cantitate de mediu
preîncălzit echivalentă cu de două-trei ori cantitatea suspensiei, după care
se poate adăuga mai rapid mediu până la 10ml. Se centrifughează în gene-
ral la 200rpm timp de 2-5 min pentru a elimina urmele mediului de înghe-
ţare. Se resuspendă în 10 ml de mediu şi se transfera în sticlele de culturp
etichetate. Prin mişcări fine se distribuie celulele. După câteva ore (cel târ-
ziu a doua zi dimineaţa) se verifică starea celulelor prin vizualizarea la mi-
croscop. Mediul va fi schimbat pentru a înlătura celulele moarte şi resturile
de cryoprotector (DMSO – sterilfiltrat sau glycelor - autoclavat).
4 Există dispozitive speciale care permit coborarea temperaturii cu un grad pe minut.

5 Există linii celulare la care se preferă folosirea altor substanţe în locul DMSO.
6 Numărul de celule/aliquot variază În funcţie de tipul de celule; este important să avem o
suspensie omogenă unicelulară.

7 DMOS este toxic pentru celuele la temperatura camerei. De aceea trebuie limitat contactul
acestuia cu celulele.
8 Pentru a preveni socul osmotic; la îngheţare apa iese din celule unde presiunea osmotică
va creşte.
80
3.7. Subclonarea; tripsinizarea
Celulele formează aderenţe între ele şi suprafaţa vasului de cultură (ce-
lule aderente) şi/sau între ele (celulele aderente, unele celule care cresc în
suspensie). Pentru cele mai multe protocoale/manopere este necesară obţi-
nerea unei suspensii unicelulare. Cea mai frecventă combinaţie folosită în
acest scop este tripsina/EDTA.
Dacă este vorba de celule aderente protocolul de lucru presupune înde-
părtarea mediului, spălarea cu o soluţie salină tampon fără9 calciu şi magneziu
şi adăugarea unei cantităţi de trispină/EDTA care să acopere stratul de celule.
Celulele nu trebuie lăsate neacoperite timp îndelungat. Pentru a ajuta separa-
rea este posibilă uşoara bătaie a sticlei de podul palmei. Urmărind sub micro-
scop separarea celulelor (durează câteva minute) se poate evita efectul nociv al
unei incubări prea îndelungate. Celulele devin rotunde odată ce pierd aderen-
ţele. Imediat, acţiunea trispinei este antagonizată prin adăugarea de ser urmată
de transferul într-un tub adecvat şi centrifugarea. După centrifugare celulele
sunt resuspendate în mediu pentru a obţine o suspensie unicelulară şi apoi
numărate/investigate la microscop prin colorarea cu trypan blue (proporţia
celulelor moarte). Dacă tripsinizarea s-a făcut în cadrul protocolului de
subcultivare, celulele sunt apoi transferate vaselor noi de cultură şi incubate
până a doua zi. A doua zi se recomandă schimbarea mediului care permite
înlăturarea celulelor moarte şi a resturilor de tripsină/EDTA. Dacă manopera
s-a făcut în alt scop, se urmează paşii din protocolul respectiv.
La celulele neaderente nu se face tripsinizarea; celule pot fi direct nu-
mărate iar densitatea lor este ajustată prin adăugarea mediului proaspăt. La
fiecare 2-4 săptămâni se centrifughează şi resuspendă celulele neaderente în
mediu proaspăt.
4.Bibliografie
1. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique; Freshney RI, John Wiley &
Sons 5th Edition 2005
2. Molecular Biology of the Cell – 4th ed., Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Ro-
berts K, Walter P - Garland Science, 2002
3. Short Protocols în Cell Biology – 1st ed., Bonifacino JS, Dasso M, Harford JB,
Lippincott-Schwartz J, Yamada KM, John Wiley & Sons 2004
4. Zell- und Gewebekultur – 4. Auflage, Lindl T, Spektrum Akademischer Verlag 2000
5. www.protocol-online.org
6. www.invitrogen.com
9 Acesti ioni pot scadea eficienţa tripsinei/EDTA
81
Culturi celulare
– partea a II-a
Cuprins
1. Studiul de literatură privind cercetări exploratorii recente ................................... 82

1.1. Producerea proteinelor recombinate în celule mamifere.................................. 88
1.2. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi ............................................ 88
2. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale platformei ................... 93
3. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimente şi metodologii ......... 94
4. Bibliografie ............................................................................................................. 99
1. Studiul de literatură privind cercetări exploratorii recente

Culturile celulare reprezintă una dintre cele mai puternice tehnolo-
gii/metodologii utilizate de către comunitatea ştiinţifică internaţională din
domenii ca: biofizică, biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetică,
biologia dezvoltării organismelor, evoluţionism, medicina moleculară, far-
macologia, bio-nano-tehnologia, inteligent drug design etc. De asemenea
dezvoltarea industriei farmaceutice a profitat din plin de avansarea tehnici-
lor de lucru cu celulele. În acest context, culturile celulare sunt folosite fie
ca mini-bioreactoare pentru producerea diverselor produse biotehnologice
fie ca şi model organismic pentru testarea efectelor/toxicităţii noilor medi-
camente. Dintre aplicaţiile moderne ale culturilor celulare, vom discuta în
cele ce urmează folosirea celulelor ca şi entităţi de producţie a proteinelor
recombinate cu aplicaţii în autoimunitate şi producerea şi caracterizarea
anticorpilor monoclonali bio-nano-funcţionalizaţi cu aplicaţii în cancere şi
boli autoimune.
Imunologia este ştiinţa care se ocupă cu studiul sistemului imun. Aces-

ta este reprezentat de către totalitatea celulelor, ţesuturilor şi proceselor
biochimice care au funcţia de a ne proteja faţă de efectele nedorite ale agen-
ţilor patogeni din mediu şi/sau acţiunii dăunătoare a structurilor proprii
82
alterate (cum ar fi celulele tumorale). Din punct de vedere didactic, răspun-
sul imun poate cuprinde două variante:
• răspunsul înnăscut care reprezintă o primă barieră întâmpinată de
către agenţii patogeni veniţi din afară (acest tip de răspuns apare pe
scara evolutivă încă de la bacterii şi plante şi este păstrat şi la mami-
ferele superioare inclusiv la om);
• răspunsul adaptativ numit şi specific care este iniţiat atunci când
răspunsurile înnăscute nu reuşesc să producă efectul dorit. Răspun-
surile adaptative apar pentru prima dată pe scara evolutivă la peştii
cartilaginoşi ca o completare a sistemului imun înnăscut.
Se poate vorbi în acest context despre o împărţire judicioasă a sarcinilor
în sistemul imun al mamiferelor. Există aşa-numitele celule, cum ar fi gra-
nulocitele, celulele natural killer etc. care aparţin sistemului imun înnăscut
şi alte celule cum sunt limfocitele care aparţin sistemului adaptativ. Deoa-
rece sistemul imun adapatativ nu apare în urma unui salt brusc de la siste-
mul imun înnăscut, există diferite structuri care asigură trecerea lină de la
un sistem la altul asigurând astfel o continuitate între cele două sisteme.
Celulele ca şi macrofagele, celulele dendritice, celulele B1, NKT sunt consi-
derate a fi cele care prin diverşi receptori şi căi de semnalizare celulară fac
posibilă comunicarea între sistemul adaptativ şi cel înnăscut. Datorită di-
versităţii extraordinare pe care mediul o oferă, există diverse mecanisme
care au evoulat cu timpul pentru a satisface cu eficienţă maximă rezolvarea
fiecărei situaţii ivite. Se vorbeşte despre un sistem imun cu componente
umorale adică cel în care produşii celulelor imune circulă prin sânge sau
secreţii (lacrimi, sudoare etc.) într-o formă finită, de sine stătătoare şi cel cu
componente celulare în care celulele sunt cele care îndeplinesc funcţia ma-
joră de apărare (Figura 1, Tabel 1).
După cum menţionam anterior, funcţia sistemului imun este să ne pro-
tejeze faţă de patogenii din mediu şi faţă de structurile proprii modificate.
În ciuda specificităţii remarcabile a răspunsurilor imune, recunoaşterea
structurilor străine se face într-un mod indirect. Acest fapt permite apariţia
unor erori care au ca şi rezultat declanşarea unor reacţii împotriva proprii-
lor structuri, fenomen caracteristic bolilor autoimune. Deşi mecanismul
apariţiei acestor boli nu este pe deplin înţeles, există din ce în ce mai multe
date care au permis elaborarea unor teorii şi modele experimentale care
s-au dovedit utile în caracterizarea acestor boli. Se consideră că bolile auto-
imune constituie un grup heterogen de afecţiuni care apar la aproximativ
5% din populaţie. Ele pot fi clasificate în boli specifice pentru anumite or-
gane aşa cum este spre exemplul pemfigusul vulgar care interesează pielea
83
Th
Imunitate înnăscută
Imunitate adaptativă
Granulocyte,
celule natural
killer, mac-
rofage, sistem Tc
complement
B (Ig)
Figura 1 Organizarea ierarhică a sistemului imun al mamiferelor. La mamifere, sistemul imun este
organizat ierarhic în sensul ca există o unitate de control care integreaza informatiile primite de la
toate celelalte componente şi pe baza lor stabileşte care este cea mai bună soluţie de urmat. Acest
centru de control şi decizie este reprezentat de către celula (limfocitul) T helper (Th). Acesta primeşte
informaţii de la sistemul imun înnăscut, coordoneaza activarea sistemului imun adaptativ şi
controleaza mecanismele efectoare ale sistemului innascut inchizand astfel circuitul. Exista totodata
schimburi directe intre sistemul innascut şi cel adaptativ care au loc cel mai adesea prin intermediul
citokinelor, produsi de secretie ai celulelor imune care mijlocesc schimbul de informatii intre acestea
(sageata cu doua sensuri).
Tabel 1 Componente ale sistemului imun al mamiferelor

Linia de apărare Imunitate celulară Imunitate umorală
Primară = imunitatea înnăscută Granulocite, Sistemul complement,
NK, 1 Peptide antimicrobiene
Secundară = imunitatea dobân- Limfocitele B şi Anticorpii (imunoglobulinele)
dită (adaptativă sau specifică) limfocitele T
1 celulele dendritice şi monocitele/macrofagele aparţin didactic imunităţii înnăscute dar se

găsesc din punct de vedere funcţional la graniţa dintre acesta şi sistemul adaptativ în sensul
că fac legătura dintre antigen şi centrul de comandă reprezentat de limfocite.
şi mucoasele, diabetul zaharat de tip I care afectează celule beta ale pancre-
asului sau tiroidita Hashimoto care apare la glanda tiroida, şi boli
autoimnune generalizate care interesează mai multe organe sau ţesuturi aşa
cum este spre exemplu lupusul sistemic eritematos în care unul dintre au-
84
toantigenele ţintă este reprezentat de cromatina [1]. Deoarece cromatina se
găseşte practic în toate celulele nucleate, bolile din grupa celor generalizate
au tendinţa de a se croniciza, adică răspunsul autoimun este întreţinut în
permanenţă de existenţa unui anumit nivel rezidual al autoantigenului. Fie
că este vorba despre boli specifice de organ fie că este vorba despre cele
generalizate, lipsa unei înţelegeri depline a mecanismelor care iniţiază şi
mai apoi întreţin distrucţia ţesuturilor proprii se repercută nefavorabil asu-
pra prognosticului şi totodată calităţii vieţii celor afectaţi. La ora actuală,
majoritatea pacienţilor sunt tratati cu ajutorul cortizonului şi derivaţilor
acestuia, substanţe care produc deprimarea sistemului imun ca mijloc de
aparare împotriva celulelor hiperreactive care întreţin distrucţia tisulară.
Dezavantajul major al acestui tip de tratament se manifestă prin apariţtia
multiplelor „atacuri” din partea microorganismelor patogene din mediu
care găsesc un teren propice pentru dezvoltare într-un organism în care
sistemul imun este deprimat. Necesitatea înţelegerii mecanismelor patoge-
netice la nivel molecular este esenţială nu doar din punctul de vedere al
tratamentului dar şi din perspectiva unei depistări precoce sau chiar a po-
sibilelor mijloace de prevenţie a unor asemenea afecţiuni.
O grupă de boli autoimune care se manifestă la nivelul pielii şi mucoa-

selor este caracterizată de prezenţa autoanticorpilor şi celulelor T
autoreactive îndreptate faţă de autoantigenele de la nivelul pielii şi mucoa-
selor. Bolile din această grupă, printre care se numară epidermoliza buloasă
dobândită şi pemfigoidul bulos/pemfigoidul cicatricial sunt caracterizate
de prezenţa anticorpilor circulanţi şi a anticorpilor legaţi la nivelul joncţiu-
nii dermo-epidermale care fixează complementul in situ. Din punct de ve-
dere clinic aceste boli se caracterizează prin prezenţa bulelor la nivelul pie-
lii şi mucoaselor, bule care se sparg lasând în urmă eroziuni acoperite par-
ţial de cruste. Paraclinic, autoanticorpii prezintă reactivitate cu forme re-
combinate ale autoantigenelor ţintă atât în ELISA cât şi în imunoblot. De
asemenea, serurile majorităţii pacienţilor recunosc fomele native ale
autantigenelor ţintă atât în imunoblot cât şi pe secţiuni de piele îngheţată.
Cercetările din ultimii ani au reuşit să precizeze o parte dintre mecanismele
efectoare responsabile de patologia observată. Scenariul fazei efectoare
propune o succesiune de evenimente care debutează cu legarea autoanti-
corpilor la nivelul autoantigenelor ţintă urmată de fixarea componentelor
sistemului complement. Anticorpii recrutează şi activează fie direct fie prin
intermediul complementului granulocitele in situ. Aceste celule odată acti-
vate produc şi eliberează specii reactive de oxigen care activează enzime
85
proteolitice prezente în veziculele granulocitare fie direct fie indirect, prin
degradarea inhibitorilor acestor enzime. Odată eliberate aceste enzime di-
geră structurile proteice responsabile de asigurarea joncţiunii
derm-epiderm [2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12] (Figura 2).
Figura 2. Reprezentare schematică a implicării speciilor reactive de oxigen în patogeneza bolilor

subepidermale.
Într-un model experimental ex vivo, criosecţiuni de piele umană sunt

incubate cu anticorpi de la (a-c) pacienţi cu boli autoimune subepidermale
şi apoi cu granulocite amestecate sau nu cu diferite substanţe capabile să
influenţeze nivelul producţiei de specii reactive de oxigen în granulocite. (a)
Secţiunile incubate cu granulocite în lipsa altor substanţe rezultă în apariţia
bulei experimentale. Folosirea unui amestec de granulocite cu (b)
superoxid dismutază sau (c) catalază, două enzime care sunt responsabile
pentru conversia superoxidului în peroxid de hidrogen şi respectiv a celui
din urmă în apă şi oxigen nu rezultă în inhibarea producerii separării der-
mo-epidermale. (d) Controlul nostru negativ, în care am folosit un ser de la
un donator sănătos în loc de ser de la bolnavi, arată lipsa separării dintre
derm şi epiderm. (e) Diagrama prezintă lanţul de reacţii care produce speci-
ile reactive de oxigen cu enzimele implicate (fundal roz şi albastru) şi res-
pectiv inhibitori ai acestora (pe fundal verde) a-d, mărire 200x (după [13]).
Deşi deosebit de utilă în precizarea posibilelor ţinte terapeutice specifi-
ce lipsite de efectele adverse ale terapiilor actuale, caracterizarea exclusivă
a fazei efectuare a răspunsului autoimun nu generează nici o indicaţie asu-
86
pra cauzelor care declanşează reacţia autoimună. De aceea eforturile din
ultima perioadă urmăresc reproducerea bolii prin imunizarea activă a ani-
malelor cu proteine recombinate. Pentru aceste modele active de boală,
proteinele sunt produse prin tehnologia ADN-ului recombinat şi exprimate
apoi în celulele mamifere care oferă un sistem de expresie superpozabil cu
cel întâlnit in vivo. În cele ce urmează vor fi descrise anumite caracteristici şi
metode utile pentru înţelegerea acestor tehnologii. De asemenea tehnologia
producerii, caracterizării şi utilizării anticorpilor (Figura 3) monoclonali ca
mijloace moderne de combatere a diverselor afecţiuni mergând de la cancer
la boli autoimune sau boli degenerative va fi descrisă în cele ce urmează.
-COOH
Fab
Fc
-NH2
Figura 3. Prezentare schematică a unei imunoglobuline.
Imunoglobulinele sunt glicoproteine heterogene alcătuite din două lan-

ţuri grele (cu masa moleculară mai mare, situate spre interior în această
figură) şi două lanţuri uşoare (situate înspre exterior în partea de sus). Lan-
ţurile grele sunt identice între ele la fel cum lanţurile uşoare sunt identice
între ele. Din punct de vedere funcţional, imunoglobulina (numită şi anti-
corp când se gaseşte sub formă circulantă în sânge/secreţii) are două porţi-
uni: zona superioară (N-terminală) Fab are rolul de a recunoaşte specific
antigenul iar zona inferioară (C-terminală) Fc are rolul de a îndeplini func-
ţiile efectoare, interacţiunea cu diverse componente ale sistemului imun
(cum ar fi complementul, receptorii pentru porţiunea Fc de pe fagocite, sau
cu receptorii de pe celulele placentei – permit trecerea anticorpilor de la
87
mamă la făt). Ataşat de aceste cozi Fc, se găsesc reziduuri de glucide care
au rol în modularea interacţiunii dintre Fc şi receptorii sistemului imun
(vezi text).
1.1. Producerea proteinelor recombinate în celule mamifere

Tehnica de bază pentru producerea acestor proteine implică mai multe
etape care sunt menţionate în tabelul 3. După întocmirea strategiei de lucru,
fragmentele de interes sunt amplificate prin tehnica PCR. Pe scurt, ţesutul
care conţine antigenul ţintă este prelevat de la sursa de interes după care
ARN-ul mesager obţinut în urma extracţiei este folosit ca şi matriţă pentru
sinteza ADN-ului complementar [14,15]. Cu ajutorul amorselor specifice,
folosind acest ADN complementar pot fi amplificate secvenţele de interes
prin reacţia de PCR. După clonarea acestor fragmente în celule, urmează
exprimarea proteinelor codate şi purificarea acestora [14,15]. Apoi în func-
ţie de aplicaţia dorită, acestea vor fi utilizate fie la imunizarea pentru mode-
lul activ de boală fie pentru cel pasiv.
1.2. Anticorpii monoclonali bio-nano-functionalizaţi

Terapia biologică cu ajutorul anticorpilor este considerată la ora actuală
ca fiind cea mai activă branşă a industriei farmaceutice[16].
Din punct de vedere istoric, prevenţia/terapia cu ajutorul anticorpilor
este o procedură folosită de câteva mii de ani. Chinezii şi indienii sunt cei
cărora li se atribuie folosirea terapeutică a serurilor (fracţiunea sângelui în
care se găsesc anticorpii alături de alte proteine) încă înaintea erei noastre.
În urmă cu câteva secole, este semnalată folosirea serurilor pentru proteja-
rea persoanelor în Turcia şi apoi odată cu experimentele doctorului Edward
Jenner de la sfârşitul secolului al XVIII şi în Anglia. Totusi folosirea pe scară
mai largă a anticorpilor în scop terapeutic a început să fie practicată înce-
pând cu secolul XX. În ciuda efectelor terapeutice extraordinare, folosirea
anticorpilor a fost însă limitată de anumite aspecte dintre care cele mai ne-
convenabile au fost:
• lipsa unei surse constante de anticorpi omogeni;
• anumite aspecte adverse (apriţia unui răspuns imun faţă de însuşi
anticorpii) datorită utilizării anticorpilor de la alte specii;
• dificultăţilor tehnice în izolarea/producerea lor şi
• necunoaşterea posibilelor ţinte terapeutice esenţiale pentru diferite
afecţiuni.
88
Descoperirea antibioticelor în anii 30-40 ai secolului trecut alături de ce-
lelalte inconveniente amintite au dus la intrarea anticorpilor într-un con de
umbră. Începând cu 1975 situaţia avea însă să se schimbe. Într-o lucrare de
referinţă pentru literatura biomedicală, doi cercetători anunţă în revista
Nature [17] o metodă prin care se pot obţine cantităţi teoretic nelimitate de
anticorpi cu specificitatea dorită. Diferenţa între anticorpii policlonali (cei
care erau la acea oră în uz medical) şi noii anticorpi (numiţi monoclonali)
poate fi comparată, chiar şi numai pentru a face lucrurile mai uşor de înţe-
les, cu diferenţa dintre două persoane, prima purtând haine de diferite mă-
rimi, forme şi culori şi a doua purtând haine personalizate de către un croi-
tor profesionist, începând de la lenjerie şi până la ultimul nasture al palto-
nului. Chiar dacă uşor exagerată şi poate nu cea mai potrivită din punct de
vedere bio-medical, folosirea acesteia are un substrat uşor de înţeles şi
anume în literatura de specialitate de limba engleză termenii „tailor made
antibodies” sunt folosiţi pentru a descrie producerea de anticorpi
monoclonali specifici pentru diferite situaţii [18]. Dezvoltarea acestei noi
tehnici, a dus la înlăturarea primului din cele două mari dezavantaje ale
folosirii anticorpilor policlonali, şi anume lipsa unei surse constante de an-
ticorpi cu caracteristici omogene; de asemenea, cu timpul, noua tehnologie
a premis obţinerea lor prin tehnici relativ simple şi cu costuri substanţial
diminuate înlăturând astfel cel de-al treilea dintre dezavantajele amintite
anterior. Anticorpii monoclonali produşi iniţial au păstrat neajunsul de a fi
produşi în alte specii ducând la declanşarea unui răspuns imun masiv din
partea primitorului (cel de-al doilea neajuns). Cel mai probabil din acest
motiv, lumea bio-medicală şi industria farmaceutică a fost în prima instanţă
rezervată la posibila utilizare a acestora pe scară largă. Această temere a
fost dublată şi de avansarea tehnicilor industriale de producere a molecule-
lor cu masă moleculară mică care păreau să fi rezolvat în sfârşit problema
inexistenţei unor medicamente perfecte. În ciuda acestor piedici, entuziaştii
au continuat însă lucrul la producerea anticorpilor monoclonali ducând la
aprobarea utilizării primului anticorp produs în acest fel nu însă mai repe-
de de un deceniu de la publicarea metodologiei de către Koehler şi Milstein
[16]. Totuşi în anii care au urmat, potenţialul imens al noii tehnologii a inci-
tat atât curiozitatea comunităţii ştiinţifice (interesată în definirea noilor
aplicaţii pentru care anticorpii monoclonali reprezentau unealta
mult-căutată, cel de-al patrulea neajuns amintit mai sus) cât şi de către
pragmatismul industriei farmaceutice (care găsea o nouă mină de aur în
comercializarea noilor „gloanţe magice” aşa cum le numea Paul Ehrlich,
89
părintele hematologiei şi chemoterapiei (acesta din urmă fiind un termen
pe care l-a introdus chiar el), cu mai bine de un secol în urmă) [19]. După
unii, dezvoltarea tehnologiei producerii anticorpilor monoclonali reprezin-
tă inovaţia secolului trecut în ceea ce priveste importanţa terapeutică, dia-
gnostică şi preventivă a îmbolnăvirilor umane [16]. Dacă în anul 2000, în
topul primelor zece produse folosite în tratamentul diverselor afecţiuni
existau, cu o singură excepţie, doar substanţe cu greutate moleculară mică,
se estimează că cinci din cele zece substanţe vor fi reprezentate de anticorpi
în 2014 [16]. Desigur această turnură a fost posibilă prin îmbunătăţirea
permanentă a protocoalelor de lucru şi obţinerea unor anticorpi modificaţi
prin tehnologia ADN recombinat, tehnici care au cunoscut o dezvoltare
extraordinară în ultimele două – trei decenii. La ora actuală, anticorpii sunt
în aproape toate situaţiile luaţi în calcul la stabilirea strategiei terapeutice
alternative sau câteodată constituie chiar terapia de primă alegere. Dintre
cei peste 25 de anticorpi monoclonali aflaţi la ora actuală pe lista medica-
mentelor aprobate pentru tratamentul afecţiunilor umane, majoritatea sunt
destinaţi tratării cancerelor. De asemenea dintr-un total de 1500 de studii
clinice în care sunt testaţi noi anticorpi monoclonali peste75% sunt axate pe
folosirea acestora în tratarea cancerelor. Majoritatea sunt folosiţi ca atare
(neconjugati), urmaţi de cei conjugaţi cu material radioactiv şi o mică pro-
porţie sunt reprezentaţi de cei conjugaţi cu toxine. Aceste date au menirea
de a sublinia interesul major al comunităţii bio-medicale şi al guvernelor
statelor industrializate (din moment ce majoritatea studiilor sunt finanţate
din bani publici) pentru găsirea unor strategii terapeutice specifice pentru
tratarea acestei maladii.
După cum aminteam anterior la 11 ani de la publicarea lucrării lui
Koehler şi Milstein, în 1986 este aprobată utilizarea primului anticorp
monoclonal pentru prevenirea rejetului de transplant. Folosirea pe scară
largă a Orthoclone OKT3 (muronomab CD3) a fost însă limitată de faptul că
acest anticorp de origine murină (produs în celule de şoarece care diferă
suficient de celulele umane) induce un răspuns imun amplu în organismul
uman [20]. Mai mult, administrarea acestui anticorp a dus la apariţia sin-
dromului eliberării sistemice de cytokine [21] datorită interacţiunii OKT3
cu receptorii pentru porţiunea Fc a IgG. Datorită eşecului relativ al utiliză-
rii acestui medicament şi datorită timpului îndelungat necesar dezvoltării
unui nou medicament, timpul scurs până la aprobarea celui de-al doilea
anticorp monoclonal a fost de încă opt ani de la aprobarea OKT3. În 1997,
rituxan (rituximab), un anticorp monoclonal împotriva CD20 de pe celulele
90
B devine cel de-al treilea medicament admis pe piaţa din SUA pentru tu-
mori ale celulelor B. Între timp acest medicament este folosit şi în tratamen-
tul unor boli autoimune cum ar fi artrita reumatoidă, bolile buloase (pemfi-
gusul, pemfigoidul), diabetul zaharat de tip I, anemia hemolitică autoimu-
nă, vasculita autoimună etc. Acest anticorp chimer (combinaţie între uman
şi murin) are multiple mecanisme de acţiune dintre care merită amintite:
inducerea toxicităţii celulare indusă de anticorpi (ADCC) şi citotoxicitatea
mediată de complement (CDC), alături de un mecanism de inducere a
apoptozei celulelor care exprimă CD20 pe suprafaţă. În general, anticorpii
sunt substanţe care interacţionează cu structuri extracelulare sau de pe su-
prafaţa celulelor. Mare parte dintre eforturile actuale au menirea de a creşte
penetranţa acestor glicoproteine pentru ţinte din interiorul celulelor. În plus
dacă anticorpii iniţiali aparţineau clasei IgG1, investigaţii actuale sunt con-
centrate asupra diversificării activităţii prin schimbarea clasei şi deci a pale-
tei de efecte posibile. Mai mult, există câteva direcţii prin care se urmăreşte
creşterea posibilelor interacţiuni terapeutice. Dintre acestea amintim:
o modificarea porţiunii Fc a anticorpilor pentru:
- îmbunătăţirea interacţiunii cu receptorii Fc sau Fc de tip
neonatal (FcRn) de pe celulele efectoare;
- îmbunătăţirea proprietăţilor efectoare prin optimizarea in-
teracţiunii cu sistemul complement;
o prelungirea duratei de injumătăţire cu efecte favorabile datorate
reducerii dozajului fie prin PEG-ylarea fragmentelor (scFv, Fab)
fie prin fuzionarea lor pe domenii de Ig;
o multispecificitatea, adică adăugarea unei alte specificităţi în zo-
na de recunoaştere a Fab.
Utilitatea acestei modificări poate fi exemplificată ca şi în figura 4. Pe
scurt, anticorpul păstrează specificitatea pentru care a fost creat pe unul din-
tre fragmentele Fab cu care se va lega de ţinta dorită urmând ca pe celalalt
fragment Fab să lege un receptor de pe o celulă efectoare (spre exemplu CD3
de pe celula T) care are proprietatea de a distruge celula recunoscută specific.
91
A B
Celula Celula
tumorala tumorala
Celula
imun
Celula
imun
C D
Celula Celula
tumorală tumorală
Celula Celula
imun imun
nano
nano
+
Figura 4. Modul de acţiune al anticorpilor bispecifici.
(A) Clasic, anticorpul monoclonal recunoaşte antigenul specific, în acest caz

de pe celula tumorală, de care se leagă. Existenţa a două fragmante Fab
duce la legarea unui anticorp de două antigene invecinate. Celula imună
figurată cu linie punctată ramasă la distanţă nu este capabilă să distrugaă
celula tumorală. (B) Modificarea unuia dintre fragmentele Fab poate fi fă-
cută în aşa fel încât acesta să nu mai recunoască ţinta iniţială ci un receptor
de pe o celulă imună efectoare aducând-o în imediata vecinătate a celulei
tumorale. Puntea creată are ca efect reducerea dramatică a spaţiului dintre
cele două celule permiţând celulei imune să distrugă celula canceroasă în
condiţii optime. (C) Alternativ porţiunea Fc poate fi modificată
(funcţionalizată) prin ataşarea unei nanosfere care poate avea ca atare un
efect toxic asupra celulei tumorale. (D) Este de asemenea posibil ca
nanosfera să conţină un material radioactiv, o toxină, o enzimă sau chiar o
cytokină care să crească puterea distructivă a anticorpului fie direct, fie, în
cazul cytokinei prin recrutarea altor celule imune în zona respectivă.
92
2. Adaptarea/importul acestora la tematicile de cercetare ale
platformei
Este de dorit ca în viitor, caracterizarea precisă a mecanismelor patoge-
netice implicate în distrucţia tisulară din bolile autoimune sa permită o
prevenţie, un diagnostic precoce şi un tratament specific al acestor afecţiuni.
În vederea atingerii acestui obiectiv, implementarea metodologiei şi tehnici-
lor moderne este un deziderat al activităţii prezente şi viitoare a grupului
de cercetare. Într-o primă fază, utilizând tehnicile şi aparatura specifică
culturilor celulare vor fi produse diverse fragmente recombinate ale unor
proteine cu rol cheie în asigurarea adeziunii dintre derm şi epiderm. Odată
produse aceste fragmente vor fi caracterizate din punct de vedere
bio-chimic şi folosite apoi fie separat fie în diferite combinaţii pentru pro-
ducerea de anticorpi şi/sau pentru reproducerea bolii umane în animalele
de experienţă. Tehnicile de lucru cu celulele mamifere sunt puse la punct în
laborator. De asemenea protocoale specifice a căror necesitate poate să apa-
ră pe parcursul desfăşurării experimentelor pot fi obtinute de la colaborato-
rii din afara Institutului. De altfel, la ora actuală, grupul de cercetare inclu-
de în preocupările sale problematica legată de caracterizarea răspunsului
autoimun în diferite modele de boală. Desigur importul premanent de
know-how relevant pe plan internaţional este esenţial pentru consolidarea
cercetării locale şi recunoaşterea validităţii datelor obţinute de către comu-
nitatea ştiinţifică internaţională. De asemenea instruirea personalului şi
co-interesarea şi implicarea cercetătorilor externi în tematicile de cercetare
ale platformei este esenţială pentru întărirea resursei umane cu expertiză în
domeniu. Este de aşteptat ca o caracterizare precisă a mecanismelor pato-
genetice să necesite o perioadă relativ lungă de timp. De aceea, în paralel
este de dorit abordarea acestei problematici din punct de vedere terapeutic.
În acest context, un deziderat este reprezentat de funcţionalizarea anticorpi-
lor îndreptaţi faţă de molecule de pe celulele B, celule cu rol cheie în pato-
geneza autoimună a acestor boli. Într-un set de experimente menite să ca-
racterizeze potenţialul anticorpilor specifici faţă de diferiţi receptori de pe
suprafaţa celulelor B de a determina distrugerea acestora, vor fi luaţi în
calcul anticorpi consacraţi cum ar fi anti-human CD20 alături de alţi anti-
corpi a căror ţintă se află tot pe celulele B dar a căror eficienţă în distrugerea
acestor celule este încă necunoscută. Potenţialul acestor anticorpi va fi stu-
diat fie în preparaţii care conţin doar anticorpul pur fie în alte instanţe cu
anticorpul funcţionalizat (Tabelul 2).
93
Tabel 2. Strategiile de lucru abordate pentru atingerea celor două obiective
majore.
Obiective Model de studiu Strategie
Stablilirea dozei 50%1 Culturi celulare ex Anticorp pur
vivo Anticorp funcţionalizat cu
nanosfere
Anticorp funcţionalizat cu
nanosfere + Rx/toxic
Stabilirea potenţialului Model animal în Anticorp pur

preventiv/curativ al vivo Anticorp funcţionalizat cu
anticorpilor nanosfere
funcţionalizaţi Anticorp funcţionalizat cu
nanosfere + Rx/toxic
1 Este vorba despre doza care provoacă moartea a 50% dintre celule.
3. Recomandări pentru abordarea de noi tipuri de experimen-

te şi metodologii
Una dintre direcţiile de cercetare care vor fi abordate în viitor se va
concentra pe producerea de fragmente recombinate ale diferitelor protei-
ne autoantigen cu ajutorul culturilor celulare eucariote. Atenţia va fi con-
centrată pe producerea acelor autoantigene a cpror patogenitate este încă
incomplet elucidată, contribuind astfel într-un mod inovativ la definirea
naturii autoimune a diferitelor entităţi clinice. Un exemplu în acest sens îl
constituie clonarea fragmentelor de integrine. Integrinele sunt o clasă
heterogenă de proteine implicate în diverse procese de la asigurarea contac-
telor dintre celule şi mediul înconjurător, la funcţii de recrutare şi
transducerea semnalului. Un interes primar pentru preocupările noastre îl
constituie producerea fragmentelor recombinate ale proteinelor care asigu-
ră adeziunea keratinocitelor de stratul dermal. Defecte ale acestor integrine
sunt considerate a fi implicate în patogeneza bolilor autoimune. Nu este
deocamdată clar în ce fel şi în ce masură autoanticorpii faţă de aceste mole-
cule sunt implicaţi în patogeneza autoimună. De aceea, odată produse aces-
te fragmente ar putea fi folosite în diferite combinaţii pentru a reproduce
caracteristicile bolii umane în animalele de experienţă. Ca şi metodologie de
lucru, producerea unui model de boală şi modularea acestuia în scop pre-
ventiv/terapeutic implică mai multe etape (Tabelul 3).
94
Tabel 3. Etape recomandate pentru modelare în scop preventiv/terapeutic a unei
boli autoimune în animalele de experienţă
Denumire etapă Activităţi
Obţinerea fragmentelor Stabilirea planului de clonare
recombinate ale autoanti- Designul şi producerea de amorse specifice
genului Izolarea ARN-ului mesager
RT-PCR
Clonarea produşilor obtinuţi prin PCR
Exprimarea proteinelor recombinate
Producerea modelului Imunizarea animalelor de experienţă cu diferite

activ de boală combinaţii de proteine recombinate
Evaluarea clinică şi paraclinică a inducerii bolii
Dezvoltarea unor strategii de prevenţie, diagnostic şi
tratament a bolii induse:
- folosirea diverselor căi de administrare,
adjuvanţi, cantităţi variabile de autoanitgen,
folosirea autoantigilor modificaţi
- folosirea anticorpilor monoclonali cruzi sau
funcţionalizaţi cu nanosfere
- folosirea nanosferelor direcţionate specific
împotriva celulelor imune autoreactive
Producerea modelului Imunizarea unor animale intermediare cu diferite

pasiv de boală combinaţii de proteine recombinate şi izolarea anti-
corpilor specifici produşi
Transferul pasiv al acestor anticorpi în şoarecii de
laborator
Dezvoltarea strategiilor de prevenţie, diagnostic şi
tratament:
- folosirea anticorpilor din diferite surse şi
evaluarea mecanismelor patogenetice
specifice fiecăruia (sistem complement,
granulocite prin FcR etc.)
- izolarea claselor şi subclaselor din sursa de
anticorpi policlonali şi investigarea meca-
nismelor efectoare prin care aceştia produc
boala
- modificarea anticorpilor prin tehnica
ADN-ului recombinat (se urmăreşte în acest
fel modularea interacţiunii cu diferite
mecanisme efectoare prin modificarea spre
exemplu a porţiunii Fc a anticorpului)
95
În ultimii ani, un accent deosebit a fost pus pe studierea interacţiunilor
dintre porţiunea Fc a anticorpilor şi alte proteine efectoare din sistemul
imun (receptorii pentru Fc de la nivelul celulelor imunităţi înnăscute, sis-
temul complement). Cercetări recente au arătat că există diferenţe esenţiale
între acţiunea diverşilor anticorpi care la prima vedere sunt identici. Expli-
caţia propusă a fost că diferenţa este datorată unor modificări
postranslaţionale apărute în porţiunea Fc a anticorpilor. Este vorba despre
adăugarea diferitelor lanţuri glucidice care fac anticorpii entităţi
glicoproteice. Deşi acest lucru era cunoscut de mai multă vreme, semnifica-
ţia funcţională a acestui detaliu structural a rămas un mister până de cu-
rând. S-a dovedit recent că o scădere a syalilarii lanţului glucidic din aceas-
tă porţiune duce la creşterea activării celulelor efectoare cu receptror
Fcgamma. De asemenea structura primară a lanţului polipeptidic care for-
mează porţiunea Fc a anticorpilor este implicată în reactivităţile diferite
observate la folosirea diverselor preparaţii de anticorpi. De altfel interesul
tot mai mare în explicarea la nivel molecular a susceptibilităţii la anumite
afecţiuni a dus din ce în ce mai frecvent la obţinerea secvenţelor de
nucleotide care codează pentru anticorpi. S-a dovedit astfel existenţa unei
concordanţe între aceste secvenţe şi capacitatea lanţurilor codate de a activa
anumite mecanisme efectoare. Tendinţa actuală este de a grupa aceste po-
limorfisme de la nivelul ADN în funcţie de capacitatea anticorpilor de a
activa/inhiba o anumită clasă de celule efectoare cu implicare în terapia
afecţiunilor autoimune şi cancerelor. Astfel, interesul extraordinar în găsi-
rea combinaţiilor optime de anticorpi care să identifice celulele tumorale
ţintă şi în acelaşi timp să angajeze un răspuns prin modificare celui de-al
doilea fragment Fab a început să fie balansată de interesul pentru modifica-
rea porţiunii Fc în vederea creşterii efectivităţii. Ideea de bază este că un
sistem imun „acordat” perfect reuşeşte să distrugă celulele nedorite prin
implicarea la timpul şi momentul potrivit a potenţialului uriaş pe care celu-
lele imunităţii il posedă. Se vorbeşte în acest sens despre anticorpi
trispecifici/multispecifici în care pe lângă specificitatea porţiunii Fab pen-
tru ţinta dorită, cea de-a doua porţiune Fab poartă specificitatea agentului
terapeutic (nanosfera radioactivă sau toxina; specificitate pentru un alt re-
ceptor de pe o celulă citotoxică spre exemplu), iar o a treia, patra etc. speci-
ficitate este adusă de către modificarea/modificările din porţiunea Fc astfel
încât acestea să poată activa cu succes diverse mecanisme imune (Figura 5).
Pe lângă specificitatea pentru celula tumorală ţintă şi cea pentru
nanoparticule, anticorpii multispecifici posedă şi alte specificităţi care să le
crească capacitatea funcţională benefică. Spre exemplu, prin modificarea
96
Celula Celula tu-
imună morală/
autoimună 5,6…
4
Celula
imună
3 2
nano-r
x/tox ROS, proteaze
CDC
Figura 5. Mecanisme de acţiune ale anticorpilor multispecifici.
porţiunii Fc pe partea stângă a figurii, anticorpul capătă proprietăţi sporite

de activare a sistemului complement care fie direct (2) fie indirect (3) duce
la distrugerea celulei canceroase/autoimune. În plus, folosirea unei duble
specificităţi a porţiunii variabile a fragmentului Fab face posibilă recrutarea
în vecinătatea tumorii a celulelor T citotoxice (4). De asemenea, prin „per-
sonalizarea” interacţiunii fragmentului Fc cu celulele care poartă receptori
pentru acesta (partea dreapta jos) sunt transduse semnale puternice care
pot avea ca rezultat o activare crescută a acestor celule cu producerea speci-
ilor reactive de oxigen şi eliberarea proteazelor efectoare (5,6…).
În prezent se urmăreşte lărgirea paletei de experimente şi metodologii
care pot fi oferite la nivelul laboratorului. Numeroşi membri ai acestuia se
află în prezent în diverse laboratoare partenere unde deprind metode şi
tehnici noi pe care dorim să le implementăm odată cu reintegrarea acestora
în laboratorul de origine.
Dintre avantajele folosirii anticorpilor ca şi agenţi biologici în trata-
mentul cancerului amintim:
- timpul de înjumătăţire crescut faţă de moleculele cu greutate mole-
culară mică ceea ce face posibilă scăderea dozei utilizate
- specificitatea şi afinitatea mare
97
- multiple mecanisme de acţiune care pot fi combinate (vezi anticorpi
multispecifici pentru ADCC şi CDC)
- posibilitatea folosirii acestora ca şi terapie complementa-
ră/alternativă oricărei forme de terapie anti-canceroasă tradiţională
- utilizarea lor ca şi vehicul specific pentru transportul diverselor
substanţe anticanceroase spre diverse destinaţii (vezi anticorpi
bispecifici)
- utilizarea lor ca şi markeri de diagnostic/prognostic pentru diferite
afecţiuni
- în anumite cazuri anticorpii pot per se să controleze creşterea tumo-
rii prin interferarea cu căile de semnalizare celulară, fie prin induce-
rea apoptozei fie prin antagonizarea efectelor factorilor de creştere
[22].
Tabel 4. Diferite mecanisme de acţiune ale anticorpilor monoclonali

Mecanism de acţiune propus Reprezentant Referinţa bibli-
ografică
ADCC1 Anti-CD20 [23,24]

CDC Anti-CD20 [22]
Inducerea apoptozei Anti-CD20 [25]
Blocarea interacţiunii factorilor de creştere Anti-EGFR [26]

cu receptorii specifici
Blocarea fizică a dimerizării receptorilor Anti-EGFR [26]

pentru factorii de creştere [27]
Anti-Her2/neu
Inhibarea neoformării vaselor sangvine Anti-EGFR [28,29]

Anti-VEGF-A
Blocarea factorilor de creştere în forma Anti-

solubilă
Funcţionalizarea/conjugarea cu radioizo- Diverşi [22]

topi, toxine, enzime sau cytokine
1Majoritatea anticorpilor monoclonali utilizaţi acţionează asupra ţintelor specifice prin acest
mecanism; legarea concomitentă a Fv (partea a Fab) de antigenul ţintă şi a Fc de o celulă
cum ar fi macrofagul sau celula NK care posedă receptori pentru această porţiune duce la
activarea celulei imune urmată de distrugerea celulei ţintită specific. Cercetări recente au
arătat că ADCC este mai eficientă la acei indivizi care prezintă anumite polimorfisme în
porţiunea Fc (respondenţi cu grad înalt) [23,24].
98
4.Bibliografie
1. Murphy KM, Travers P, Walport M (2007) Janeway's Immunobiology. New York
and London: Garland.
2. Sitaru C, Zillikens D (2005) Mechanisms of blister induction by autoantibodies. Exp
Dermatol 14: 861-875.
3. Chiriac MT, Roesler J, Sindrilaru A, Scharffetter-Kochanek K, Zillikens D, et al.
(2007) NADPH oxidase is required for neutrophil-dependent
autoantibody-induced tissue damage. J Pathol 212: 56-65.
4. Ujiie H, Shibaki A, Nishie W, Sawamura D, Wang G, et al. (2010) A novel active
mouse model for bullous pemphigoid targeting humanized pathogenic antigen. J
Immunol 184: 2166-2174.
5. Ujiie H, Shibaki A, Nishie W, Shimizu H (2010) What's new în bullous pemphigoid.
J Dermatol 37: 194-204.
6. Liu Z, Sui W, Zhao M, Li Z, Li N, et al. (2008) Subepidermal blistering induced by
human autoantibodies to BP180 requires innate immune players în a humanized
bullous pemphigoid mouse model. J Autoimmun 31: 331-338.
7. Nishie W, Sawamura D, Goto M, Ito K, Shibaki A, et al. (2007) Humanization of au-
toantigen. Nat Med 13: 378-383.
8. Nishie W, Sawamura D, Natsuga K, Shinkuma S, Goto M, et al. (2009) A novel
humanized neonatal autoimmune blistering skin disease model induced by
maternally transferred antibodies. J Immunol 183: 4088-4093.
9. Recke A, Sitaru C, Vidarsson G, Evensen M, Chiriac MT, et al. (2009) Pathogenicity
of IgG subclass autoantibodies to type VII collagen: Induction of dermal-epidermal
separation. J Autoimmun.
10. Mihai S, Chiriac MT, Takahashi K, Thurman JM, Holers VM, et al. (2007) The alter-
native pathway of complement activation is critical for blister induction în experi-
mental epidermolysis bullosa acquisita. J Immunol 178: 6514-6521.
11. Mihai S, Chiriac MT, Herrero-Gonzalez JE, Goodall M, Jefferis R, et al. (2007) IgG4
autoantibodies induce dermal-epidermal separation. J Cell Mol Med 11: 1117-1128.
12. Mihai S, Sitaru C (2007) Immunopathology and molecular diagnosis of
autoimmune bullous diseases. J Cell Mol Med 11: 462-481.
13. Chiriac MT (2007) Inflammatory Mechanisms of Tissue Damage Induced by
Antibodies. Cluj-Napoca: Babes-Bolyai University. 120 p.
14. Sitaru C, Mihai S, Otto C, Chiriac MT, Haußer I, et al. (2005) Induction of
dermal-epidermal separation în mice by passive transfer of antibodies to type VII
collagen. J Clin Invest 115: 870-878.
15. Csorba K, Sesarman A, Oswald E, Feldrihan V, Fritsch A, et al. (2010)
Cross-reactivity of autoantibodies from patients with epidermolysis bullosa
acquisita with murine collagen VII. Cell Mol Life Sci 67: 1343-1351.
16. Zhiqiang A (2009) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic. In:
Zhiqiang A, editor. 1st ed. New Jersey: Wiley.
17. Kohler G, Milstein C (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of
predefined specificity. Nature 256: 495-497.
18. Chowdhury PS, Wu H (2005) Tailor-made antibody therapeutics. Methods 36:
11-24.
19. Schwartz RS (2004) Paul Ehrlich's magic bullets. N Engl J Med 350: 1079-1080.
20. Kimball JA, Norman DJ, Shield CF, Schroeder TJ, Lisi P, et al. (1995) The OKT3
99
Antibody Response Study: a multicentre study of human anti-mouse antibody
(HAMA) production following OKT3 use în solid organ transplantation. Transpl
Immunol 3: 212-221.
21. Chatenoud L, Ferran C, Legendre C, Thouard I, Merite S, et al. (1990) în vivo cell
activation following OKT3 administration. Systemic cytokine release and
modulation by corticosteroids. Transplantation 49: 697-702.
22. Zafir-Lavie I, Michaeli Y, Reiter Y (2007) Novel antibodies as anticancer agents. On-
cogene 26: 3714-3733.
23. Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal-Celigny P, Bardos P, et al. (2002) Therapeutic
activity of humanized anti-CD20 monoclonal antibody and polymorphism în IgG
Fc receptor FcgammaRIIIa gene. Blood 99: 754-758.
24. Weng WK, Levy R (2003) Two immunoglobulin G fragment C receptor
polymorphisms independently predict response to rituximab în patients with
follicular lymphoma. J Clin Oncol 21: 3940-3947.
25. Shan D, Ledbetter JA, Press OW (2000) Signaling events involved în
anti-CD20-induced apoptosis of malignant human B cells. Cancer Immunol
Immunother 48: 673-683.
26. Ferguson KM (2004) Active and inactive conformations of the epidermal growth
factor receptor. Biochem Soc Trans 32: 742-745.
27. Albanell J, Codony J, Rovira A, Mellado B, Gascon P (2003) Mechanism of action of
anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and 2C4. Adv
Exp Med Biol 532: 253-268.
28. Kim KJ, Li B, Winer J, Armanini M, Gillett N, et al. (1993) Inhibition of vascular
endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumour growth în
vivo. Nature 362: 841-844.
29. Ferrara N, Hillan KJ, Gerber HP, Novotny W (2004) Discovery and development of
bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3:
391-400.
100
III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN
Microspectroscopia Raman
Cuprins
1. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman .......................................................... 102

1.1. Efectul Raman ............................................................................................... 102
1.2. Efectul Raman rezonant................................................................................ 103
1.3. Spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă ............................................. 104
1.4. Microspectroscopia Raman confocală ........................................................... 105
2. Aplicaţii ale microspectroscopiei Raman.............................................................. 107
2.1. Aplicaţii bio-medicale .................................................................................... 107
2.1.1. Analiza medicamentelor anticanceroase .............................................. 107
2.1.2. Cipuri ADN ........................................................................................ 108
2.1.3. Localizarea şi identificarea unor bacterii ............................................. 108
2.2. Aplicaţii în ştiinţa materialelor ..................................................................... 109
2.2.1. Identificarea fazelor cristaline şi a tranziţiilor de fază......................... 109
2.2.2. Analiza domeniilor amorfe .................................................................. 109
2.2.3. Structuri alotrope de carbon ................................................................ 110
2.3. Aplicaţii în stiinta mediului.......................................................................... 111
2.3.1. Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic .............. 111
2.3.2. Detecţia poluanţilor din apă................................................................ 111
3. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec CRM 200
şi a parametrilor optimi de funcţionare pentru diverse aplicaţii .......................... 112
3.1. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală WITec
CRM 200 ...................................................................................................... 112
3.2. Parametrii optimi de funcţionare .................................................................. 113
3.2.1. Înregistrarea spectrelor Raman confocale ........................................... 113
3.2.2. Imagistica Raman confocală................................................................ 115
3.3. Accesorii ....................................................................................................... 117
3.3.1. Modul de microscopie de forţă atomică model alpha 300 .................... 117
3.3.2. Celula Linkam ..................................................................................... 119
4. Bibliografie ........................................................................................................... 119
101
1. Aspecte generale ale spectroscopiei Raman
1.1. Efectul Raman
O rază de lumină incidentă pe o probă (de exemplu o celulă biologică,
un micro-organism, un material, etc.) interacţionează cu atomii sau molecu-
lele constituiente şi poate fi absorbită sau împrăştiată [1, 2].
Dacă o cuantă de lumină hν 0 nu este absorbită de o moleculă ea poate
să sufere fie un proces de împrăştiere elastică, în urma căruia rezultă o
cuantă a cărei energie rămâne neschimbată, hν 0 , şi care poartă numele de
împrăştiere Rayleigh, fie un proces de împrăştiere inelastică care este cunos-
cut sub denumirea de împrăştiere Raman şi în urma căruia sunt emise cuante
de energie hν 0 ∓ hν s (Fig. 1).
Nivel electronic excitat

Energie
hν0 hν0 - hνs hν0 hν0 + hνs
hν0 hν0 hν0 hν0
v=1
v=0
Imprastiere Imprastiere Imprastiere Imprastiere
Rayleigh Raman Rayleigh Raman
(Stokes) (anti-Stokes)
Figura 1. Diagrama tranziţiilor care au loc între diferite nivele energetice vibraţionale şi care cores-
pund proceselor de împrăştiere Rayleigh şi Raman
La temperatura mediului ambiant cea mai mare parte a electronilor se

află pe nivelele vibraţionale ale stării electronice fundamentale cu energiile
cele mai mici, aşa încât, în conformitate cu legea de distribuţie a lui Bol-
tzmann, pe nivelele vibraţionale ale stării fundamentale cu energii mai
mari se va găsi un număr mult mai mic de electroni. De aceea, procesul
Raman, în urma căruia este eliberată o cuantă de energie hν 0 − hν s (linii
Stokes), are o probabilitate de apariţie mult mai mare decât cel în urma
căruia se eliberează o cuantă de energie hν 0 + hν s (linii anti-Stokes). Linii-
le Raman denumite Stokes şi anti-Stokes se găsesc simetric, de o parte şi de
cealaltă a liniei Rayleigh [1, 2].
102
Intensitatea benzilor Raman este în general de 3 ÷ 5 ordine de mărime
mai mică decât intensitatea liniei Rayleigh, care la rândul său reprezintă
aproximativ 10-4 - 10-3 din intensitatea radiaţiei incidente excitatoare, deci
doar 10-6- 10-8 din fotonii incidenţi sunt transformaţi în fotoni Raman, ceea ce
limitează detecţia unor molecule aflate în concentraţie mică. În unele cazuri
observarea efectului Raman este impiedicată de apariţia fluorescenţei, care
este mai intensă cu câteva ordine de mărime decât semnalul Raman şi care
apare mai ales la investigarea biomoleculelor şi a sistemelor biologice.
Aceste neajunsuri pot fi înlăturate prin utilizarea unei surse de excitare
(laser) cu lungimea de undă situată în domeniul infraroşu-apropiat (NIR)
sau prin utilizarea unor tehnici speciale cum ar fi cea bazată pe efectul
Raman rezonant sau spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă
(surface-enhanced Raman spectroscopy SERS) [1-4].
1.2. Efectul Raman rezonant

În spectroscopia Raman se folosesc în mod curent ca surse de excitare
lasere cu lungimi de undă situate în domeniul vizibil (verde şi rosu) şi in-
fraroşu-apropiat care nu au energie suficientă pentru a produce prima
tranziţie electronică a majorităţii moleculelor, evitându-se astfel excitarea
fluorescenţei [1, 3]. Totuşi există substanţe care au capacitatea de a împrăş-
tia radiaţia laser cu o intensitate de până la 106 ori mai mare decât cea a
semnalului Raman normal, dacă energia laserului este apropiată de valoa-
rea energiei necesare unei tranziţii electronice (efect Raman rezonant). Se
face distincţie între două tipuri de efecte Raman rezonant: efectul
pre-rezonant şi efectul rezonant (vezi Fig. 2).
hν0 hν0 - hνs hν0 hν0 - hνs
hν0 hν0 - hνs
(a) (b) (c)
Figura. 2. Diagrama tranziţiilor care au loc între diferite nivele energetice în cazul (a) efectului
Raman convenţional; (b) efectului Raman pre-rezonant; (c) efectului Raman rezonant.
În cele mai multe cazuri, cu cât energia de excitare este mai apropiată
de energia necesară tranziţiei electronice cu atât este mai mare intensitatea
103
benzilor observate. În plus, se modifică regulile de selecţie şi vor fi amplifi-
cate doar anumite tranziţii vibraţionale Raman. Tranziţiile de ordin superi-
or, care de obicei nu se observă într-un spectru Raman convenţional, sunt
deseori observabile într-un spectru Raman rezonant. Astfel, apar benzi noi
din analiza cărora se pot obţine informaţii structurale suplimentare.
Spectroscopia Raman rezonantă se foloseşte mai ales la investigarea
moleculelor poliatomice mari, cum sunt cele biologice, unde absorbţia este
localizată într-o anumită zonă a moleculei, la aşa numiţii cromofori. Ampli-
ficarea Raman rezonantă permite izolarea benzilor Raman datorate acestor
cromofori şi a unităţilor structurale situate în vecinătatea lor facilitând ast-
fel analizarea zonei cromoforice care este de obicei zona activă, în lipsa
unor semnale spectrale datorate mediului înconjurător (ex. proteine).
Modificarea regulilor de selecţie precum şi amplificarea tranziţiilor
vibraţionale specifice de până la 106 ori permit utilizarea spectroscopiei
Raman pre-rezonantă cât şi rezonanţa la un număr mare de aplicaţii din
fizicp, chimie, biochimie şi biologie. Pentru folosirea efectului Raman rezo-
nant nu este necesar un echipament special, se folosesc doar lasere cu lun-
gime de undă variabilă care să permită ajustarea energiei de excitare la va-
loarea necesară unei absorbţii electronice.
1.3. Spectroscopia Raman amplificată de suprafaţă

Efectul amplificării semnificative a semnalului Raman al moleculelor
adsorbite pe suprafaţa rugoasă a unui electrod de argint a fost descoperit
de Fleischman şi colab. săi în 1974 [5]. Amplificarea semnalului Raman (de
106-108 ori) este explicată cu ajutorul a două mecanisme principale de am-
plificare [1, 4, 5]: electromagnetic (amplificare a semnalului Raman de
104÷106 ori) şi chimic (amplificare a semnalului Raman de 10÷102 ori). O
contribuţie majoră la amplificarea electromagnetică este datorată plasmoni-
lor de suprafaţă, care sunt asociaţi oscilaţiilor colective ale electronilor de
conducţie de pe suprafaţa particulelor metalice. Amplificarea semnalului
Raman rezultă din excitarea acestor plasmoni de suprafaţă de către radiaţia
incidentă. Câmpurile locale rezultate amplifică intensitatea radiaţiei Raman
emise, care este proporţională cu pătratul amplitudinii câmpului electric
incident pe moleculă. O amplificare suplimentară apare datorită excitării
plasmonilor de suprafaţă de către radiaţia Raman emisă de molecule. Efec-
tul chimic al amplificării este asociat suprapunerii funcţiilor de undă ale
metalului şi adsorbatului, care duce la procese de transfer de sarcină între
nivelele fundamentale şi cele excitate ale moleculelor adsorbite [6]. Ionul
negativ obţinut are configuraţii geometrice de echilibru diferite faţă de cele
104
ale moleculei neutre neadsorbite. De aceea, transferul de sarcină duce la
apariţia unei molecule neutre excitată vibraţional şi la emisia unui foton
Raman.
Regulile de selecţie ale spectroscopiei Raman amplificată de suprafaţă
(SERS surface-enhanced Raman spectroscopy) sunt în principiu aceleaşi ca
şi în cazul spectroscopiei Raman convenţionale [7, 8]. În particular, deoare-
ce intensitatea câmpului electromagnetic local este maximă pe direcţia per-
pendiculară la suprafaţă, modurile de vibraţie care rezultă dintr-o modifi-
care a polarizabilităţii perpendicular pe suprafaţă vor fi amplificate. Acest
lucru combinat cu faptul că intensitatea câmpului electromagnetic scade cu
creşterea distanţei faţă de suprafaţă permite determinarea orientării specii-
lor adsorbite în raport cu suprafaţa.
Pentru realizarea unui experiment SERS se foloseşte în principiu acelaşi
echipament ca şi în cazul realizării unui experiment Raman convenţional.
Pentru a optimiza amplificarea electromagnetică frecvenţa laserului trebuie
să coincidă cu frecvenţa de rezonanţă plasmonică. Deoarece amplificarea
depinde de proprietăţile substratului, sunt utilizate mai multe tipuri de
substrate active SERS. Cele mai des folosite sunt electrozii de Au, Ag, Cu,
suspensiile coloidale de Au şi Ag, filmele metalice de Au şi Ag, etc.
Datorită sensibilităţii de detecţie remarcabile şi a flexibilităţii sale de
aplicare tehnică SERS este utilizată în mod frecvent pentru a soluţiona o
mare varietate de probleme cu caracter analitic, biomedical, de mediu, şi de
securitate globală şi naţională [9]. SERS poate fi exploatată la identificarea
selectivă a unor specii moleculare precum şi la detecţia unei singure mole-
cule [10]. Recent, SERS a fost utilizată ca un mecanism de transpunere a
semnalului în senzori chimici. Astfel de exemple sunt analiza unor cantităţi
reduse de pesticide [11], antrax [12], a unor antigene specifice prostatei [13],
glucoza [14] şi a unor reziduuri nucleare [15].
1.4.Microspectroscopia Raman confocală

În urmă cu aproximativ două decenii au fost efectuate primele măsură-
tori Raman cu ajutorul unui microscop. Îmbunătăţirea majoră era dată de
folosirea unui obiectiv de microscop prin intermediul căruia se realiza atât
iluminarea probei cât şi colectarea luminii împrăştiate. Pentru a întelege
mai bine raţiunile care au stat la baza evoluţiei spectroscopiei micro-Raman
este foarte importantă cunoaşterea tuturor factorilor care contribuie la mo-
dificarea intensităţii semnalului (S ) „livrat” de detectorul unui spectrome-
tru în cazul unei linii Raman înregistrată la o lungime de undă λ . Astfel,
105
S ∝ I L ⋅ σ λ ⋅ N m ⋅ Ω ⋅ Tλ ⋅ s λ , unde I L este intensitatea radiaţiei laser inci-
dentă pe probă (W⋅cm-2), σ λ este secţiunea specifică de împrăştiere Raman
(cm2⋅sterad-1⋅molecula-1), N m reprezintă numărul de molecule din volumul
de probă investigat V P , Ω este unghiul solid din care se face colectarea
luminii împrăştiate Raman, iar Tλ and s λ reprezintă capacitatea de înregis-
trare a instrumentului şi respectiv sensibilitatea detectorului la lungimea de
undă λ . Se poate observa că atunci cand se doreşte examinarea unui vo-
lum V P foarte mic dintr-o probă, doar câţiva parametrii pot fi modificaţi
astfel încât să se compenseze reducerea numărului de molecule N m . Aceş-
tia sunt intensitatea radiaţiei laser incidentă pe proba I L şi unghiul solid
Ω din care se face colectarea luminii împrăştiate Raman. Astfel, utilizarea
unei linii laser, a cărei putere poate fi reglată într-un domeniu relativ larg,
şi a unui obiectiv de microscop, care focalizează radiaţia laser şi culege lu-
mina împrăştiată sub un unghi solid mare, duce atât la obţinerea unui spec-
tru Raman mai bun din punct de vedere calitativ cât şi la localizarea unei
anumite zone de interes comparativ cu cazul în care acesta este înregistrat
fără obiectiv de microscop [16].
Eficienţa de colectare a luminii este aproape în totalitate influenţată de
apertura numerică NA a obiectivului de microscop care este definită de
relaţia NA = n sin θ max în care n este indicele de refracţie al mediului dintre
obiectiv şi probă iar θ max este unghiul maxim de colectare al obiectivului.
Se poate observa că în cazul unor măsurători efectuate cu un obiectiv de
microscop imersat într-un mediu al cărui indice de refracţie este apropiat
de cel al probei investigate (nu există o modificare a drumului razelor de
lumină la trecerea într-un mediu cu indice de refracţie diferit) apare o îm-
bunătăţire a eficienţei de colectare şi a rezoluţiei spaţiale. Utilizarea unui
astfel de mediu (apă, ulei, etc.) impune utilizarea unor obiective speciale
care posedă caracteristici diferite pentru fiecare mediu, specificate foarte
exact de către producător. Important în astfel de situaţii ramâne faptul ca
mediul în care se face imersarea să nu influenţeze structura şi proprietăţile
probei investigate.
În numeroase studii micro-Raman apare un neajuns deoarece informa-
ţia spectrală obţinută nu este culeasă dintr-un volum suficient de mic (refe-
rirea se face în termeni de rezoluţie spaţială perpendiculară la axa optică
sau rezoluţie laterală, şi rezoluţie spaţială paralelă la axa optică sau rezolu-
ţie axială). În microscopul convenţional întregul câmp vizual este uniform
106
iluminat şi observat. Spre deosebire de acesta, microscopul confocal utili-
zează o diafragmă (pinhol) care izolează radiaţia luminoasă care provine
din zona marginală a volumului în care a fost focalizat fascicolul laser (zo-
na din afara focarului). Astfel, prin prezenţa pinholului se realizează o fil-
trare spaţială a radiaţiei, la detector ajungând doar radiaţia din volumul în
care a fost focalizat laserul [17]. Confocalitatea poate fi de asemenea obţinu-
tă şi prin restrângerea ariei de pe detector unde intensitatea radiaţiei
Raman este mare (realizarea unei ”aperturi electronice”). Utilizarea primei
metode de obţinere a confocalităţii necesită în general folosirea unor obiec-
tive de microscop cu apertură numerică mare (NA = 0.9 – 0.95) şi poate
conduce la obţinerea de informaţie spectrală dintr-un tub focal cu un dia-
metru de 1.22λ/NA şi o adâncime de 4λ/NA2 [17].
2. Aplicaţii ale microspectroscopiei Raman

Spectroscopia Raman este o tehnică care pe lângă faptul că permite ob-
ţinerea de informaţii extrem de rapide despre structura, modificările struc-
turale şi morfologice care apar în diferite tipuri de probe poate oferi şi unele
avantaje unice în comparaţie cu alte tehnici. Astfel, această tehnică spectro-
scopică poate fi considerată, în funcţie de tipul aplicaţiei, ca fiind
neinvazivă, nedistructivă şi extrem de puţin sensibilă la prezenţa apei. În
plus, în cele mai multe cazuri aplicarea ei nu necesită prepararea prealabilă
a probei. În paragrafele următoare sunt prezentate succint principalele in-
formaţii care se pot obţine în urma aplicării microspectroscopiei Raman pe
diferite sisteme de studiu.
2.1. Aplicaţii bio-medicale

2.1.1. Analiza medicamentelor anticanceroase
Producerea unor structuri moleculare capabile să se ataşeze de diferite
secvenţe ale unui lanţ de ADN reprezintă un domeniu de cercetare intens
datorită importanţei pe care o are acest subiect în obţinerea unor compuşi
noi cu potenţial terapeutic. Spectroscopia Raman poate fi utilizată pentru a
examina interacţiunile dintre molecule mici şi ADN. Astfel, în cazul unor
medicamente anticanceroase care nu prezintă fluorescenţă, spectroscopia
Raman poate fi singura metodă care să permită detecţia lor în interiorul
celulelor în absenţa unor marcări fluorescenţi.
Experimentele iniţiale constă în înregistrarea spectrelor medicamente-
lor în soluţie în vederea realizării unei caracterizări Raman fundamentale.
107
Următorul pas constă în efectuarea de studii Raman ale medicamentelor
ataşate de anumite secvenţe ale unor oligonucleotide pentru a obţine in-
formaţii de bază care vor fi mai apoi utilizate când se studiază in vitro aces-
te procese [18]. În cele din urmă, microscopia Raman se poate utiliza pentru
a studia medicamentele în interiorul celulelor şi a furniza informaţii despre:
(a) interacţiunea dintre compus şi mediul celular, (b) localizarea sa într-o
anumită regiune sub-celulară (de ex. nucleu sau citoplasmă), (c) forma
chimică a compusului în interiorul celulei (de ex. dacă sunt posibile formele
protonate sau neprotonate) [18].
2.1.2. Cipuri ADN

Biocipurile revoluţionează diagnosticarea clinică modernă şi tehnicile
farmaceutice datorită rapidităţii de testare a probelor şi de livrare a rezulta-
telor. Tehnica SERS poate fi utilizată în semnalarea unirii unui lanţ de ADN
cu lanţul complementar şi formarea structurii dublu elicoidale. Acest fe-
nomen este cunoscut sub denumirea de hibridizare şi stă la baza tehnologi-
ei de obţinere a cipurilor ADN, în care diagnosticarea pe baza hibridizării
este utilizată în mod eficient pentru a obţine informaţii despre secvenţele
de ADN. Astfel, dacă există o secvenţă cunoscută de ADN fixată într-o
anumită zonă a suprafeţei cipului şi dacă apare procesul de hibridizare al
unui lanţ de ADN în acea poziţie, se poate determina secvenţa de ADN din
acel lanţ [18].
Metoda standard de detecţie a procesului de hibridizare foloseşte mar-
cări fluorescenţi. Prin înregistrarea spectrului Raman este posibilă diferen-
ţierea marcărilor fluorescenţi care dau benzi Raman specifice, fapt care face
posibilă testarea diferitelor secvenţe care există într-o zonă a cipului. În
plus, pentru a detecta cantităţi extrem de reduse ale unui anumit lanţ de
ADN existent într-o probă se foloseşte tehnica SERS [18]. În aceste experi-
mente, suprafaţa cipului se foloseşte atât ca imobilizator al lanţului de
ADN cât şi ca substrat activ SERS pentru lanţul de ADN marcat care va fi
adus în vecinătate datorită procesului de hibridizare cu lanţul imobilizat.
Astfel, dacă în spectrul SERS se observă benzile moleculei folosite ca mar-
ker înseamnă că s-a produs hibridizarea ADN-ului.
2.1.3. Localizarea şi identificarea unor bacterii

Cercetările din medicină şi biologie se confruntă cu necesitatea identifi-
cării precise a unor micro-organisme, ca de ex. bacterii sau viruşi. Majorita-
108
tea metodelor de identificare folosesc o evaluare morfologică combinată cu
teste specifice în care se urmăreşte dezvoltarea micro-organismelor în dife-
rite medii şi care durează până la 72 de ore. Spectroscopia Raman confocală
oferă posibilitatea identificării unor bacterii individuale. De exemplu, s-a
reuşit identificarea unor bacterii care conţin un cromofor (β-carotina,
sarcinaxantin) în citoplasma membranei. Pentru aceasta au fost cultivate
mai multe bacterii Rhodotorula rubra şi Micrococcus luteus, apoi au fost ames-
tecate şi o mostră de analiză a fost investigată cu ajutorul unui echipament
Raman confocal. După înregistrarea spectrelor Raman şi analizarea benzi-
lor date de β-carotina, care este prezentă în Rhodotorula rubra şi a benzilor
date de sarcinaxantin, existent în Micrococcus luteus, s-a reuşit identificarea
celor două bacterii. Trebuie menţionat faptul că prin folosirea laserului care
excită rezonant cromoforii se obţin doar benzile acestora, contribuţiile ce-
lorlalte componente nefiind prezente în spectru [3].
2.2. Aplicaţii în ştiinţa materialelor

2.2.1. Identificarea fazelor cristaline şi a tranziţiilor de fază
Spectrul Raman a diverse nanostructuri este asemănător spectrului
unui monocristal, ceea ce facilitează identificarea directă a fazelor cristaline
[19]. Cunoaşterea spectrelor Raman ale diferitelor faze cristaline permite
caracterizarea tranziţiilor de fază care apar la modificarea temperaturii sau
a presiunii prin analiza comparativă a modificărilor care apar în cazul mo-
durilor de vibraţie. În plus, observarea unor moduri vibraţionale interzise
în spectrele Raman reprezintă o dovadă a distorşilor care apar la nivelul
reţelei cristaline [19]. Existenţa unei diferenţe în energia de suprafaţă ca
urmare a modificării dimensiunii nanoparticulelor, care uneori este în
strânsă corelare cu tranziţiile de fază, poate fi de asemenea evidenţiată prin
spectroscopia Raman. S-a arătat faptul că structura cristalină a clusterilor
nanometrici de TiO2, obţinuţi prin depunere din faza gazoasă, suferă o
tranziţie de la faza de rutil la anatas atunci când dimensiunile lor depăşesc
5 nm [20]. Un alt studiu a dovedit că temperatura la care are loc tranziţia de
fază ortorombic-tetragonal a structurii ceramice de BaTiO3 depinde de mă-
rimea grăunţilor [21].
2.2.2. Analiza domeniilor amorfe

Informaţiile obţinute prin aplicarea spectroscopiei micro-Raman sunt
uneori mult mai utile decât cele determinate din analiza de raze X. Este
cazul structurilor preponderent amorfe. Atât studiile cristalografice cât şi
109
cele de spectroscopie Raman se bazează pe a interpreta măsura dezordinii
în termeni de lărgime a benzii. În timp ce în cazul difracţiei de raze X apari-
ţia lărgimii benzii este asociată cu abaterile de la periodicitate a reţelei cris-
taline pentru un număr însemnat de atomi, în cazul spectroscopiei Raman
doar modurile de vibraţie ale reţelei şi cele de libraţie (care se găsesc la nu-
mere mici de undă) sunt afectate de dezordinea la mare distanţă. Lărgimea
celorlalte benzi Raman este în principal afectată atunci când au loc modifi-
cări ale câmpului cristalin local, mai exact atunci când apar modificări
structurale în ordinea la mică distanţă, în prima sferă de coordinare (0.1-0.5
nm) şi respectiv în cea de a doua (0.5-5 nm) [19]. Dacă se ţine seama de de-
scrierea moleculară a vibraţiilor, modurile Raman de deformare sunt influ-
enţate de dezordinea geometriei locale, în timp ce modurile de intindere
sunt afectate de dezordinea vecinătăţilor, care sunt reprezentate de anumiţi
atomi ai altor subreţele sau de defecte care apar ca urmare a substituţiei de
atomi sau a prezenţei vacanţelor.
Din datele obţinute în urma analizei de difracţie de raze X se poate evi-
denţia faptul că există domenii cu structura periodică şi dezordonată, cu
precădere în cazul structurilor dominate de legături covalente puternice,
dar nu poate fi facută o separare spaţială a acestora [22]. Aplicarea spectro-
scopiei micro-Raman la studiul materialelor şi în special al polimerilor poa-
te face uneori distincţie între domeniile conformaţionale submicrometrice
cristaline şi amorfe. Cel mai rapid mod de a obţine componenta amorfă şi
cea cristalină este de a deconvoluţiona modurile Raman situate la numere
de undă mici în vecinătatea liniei Rayleigh care conţin cele două compo-
nente [23]. Raportul ariilor celor două benzi oferă o bună estimare a gradu-
lui de cristalinitate al probei. Separarea fazelor poate fi de asemenea studia-
tă în cazul sticlelor unde valoarea numărului de undă la care apare semna-
lul Raman este strâns legată de conectivitatea unităţilor structurale polie-
drice constitutive [24]. Atribuirea benzilor în aceste cazuri se face pe baza
comparaţiei cu spectrele experimentale obţinute pe faze cristaline similare
compoziţional structurii sticlelor sau vitroceramicilor investigate, sau cu
cele obţinute prin simulări teoretice [25, 26].
2.2.3. Structuri alotrope de carbon

Microspectroscopia Raman a fost des utilizată la studiul structurilor
alotrope ale carbonului (diamant, grafit, fulerene, nanotuburi, etc.). Este
una dintre puţinele tehnici sensibile la modificările structurale care apar în
aceste tipuri de materiale, de la structuri cu grad de cristalinitate extrem de
ridicat la structuri amorfe. Astfel, în spectrele Raman ale acestor structuri
110
apar clar definite benzi datorate vibraţiilor date de structuri grafitice (nota-
te G) şi de structuri dezordonate (notate D şi D’). Extrem de important este
faptul că în cazul nanotuburilor de carbon apar, în regiunea numerelor mici
de undă (< 200 cm-1), benzile datorate modurilor de respiraţie radială (Ra-
dial Breathing Mode) cu ajutorul cărora se poate determina diametrul
nanotubului (relaţie de inversă proporţionalitate cu valoarea frecvenţei
Raman) [19].
2.3. Aplicaţii în ştiinţa mediului

2.3.1. Studii structurale ale componentelor solului: Acidul humic
Caracterizarea structurală a acidului humic precum şi determinarea
comportamentului lui de complexare sunt extrem de importante în ştiinţa
mediului. Acidul humic apare în sol şi în apele subterane şi este implicat în
numeroase procese chimice şi biologice care au loc în mediul terestru şi
acvatic. Cunoaşterea proprietăţilor chimice este esenţială pentru dezvolta-
rea unor modele ecologice folosite pentru remedierea şi detoxificarea de
compuşi antropogenici sau chiar de reziduuri nucleare [3]. Studiile SERS
ale acidului humic au condus la obţinerea unor informaţii legate de meca-
nismele de legare şi/sau configuraţiile de complexare ale acidului humic.
2.3.2. Detecţia poluanţilor din apă

Prezenţa poluanţilor organici în apă a devenit o problemă de actualita-
te pentru comunitatea internaţională. Compuşi chimici precum hidrocarbu-
rile aromatice, derivaţii toxici de azot, fenolii sau derivaţii naftalinei sunt
prezenţi în mediile acvatice datorită utilizării lor ca pesticide sau în proce-
sele industriale. Persistenţa precum şi efectele toxicologice ale acestor com-
puşi şi ale produşilor lor intermediari sunt semnale de alarmă pentru agen-
ţiile de resort din lume. Acestea au stabilit o concentraţie maximă permisă a
acestor compuşi în apa potabilă de < 1 μg/l. Pentru a detecta aceste concen-
traţii mici este necesară folosirea unor tehnici instrumentale extrem de sen-
sibile. Tehnica SERS datorită sensibilităţii sale este capabilă să detecteze
concentraţii extrem de scăzute ale acestor substanţe. Cu ajutorul acestei
tehnici este posibilă determinarea orientării şi a modului de adsorbţie al
acestor molecule pe suprafaţa substratului activ SERS [27]. Determinarea
substratului SERS cel mai potrivit pentru fiecare tip de poluant reprezintă
un prim pas în dezvoltarea unui senzor bazat pe metoda SERS.
111
3. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală
WITec CRM 200 şi a parametrilor optimi de funcţionare pen-
tru diverse aplicaţii
3.1. Prezentarea echipamentului de microscopie Raman confocală
WITec CRM 200
Echipamentul de microscopie Raman confocală CRM 200 cu scaner este
dotat cu un microscop optic care este echipat cu 4 obiective plan acromati-
zate de apertura numerică (NA) 0.3, 0.45, 0.8 şi 1.25 şi mărire 10X, 20X, 50X
şi respectiv 100X (uscat şi în ulei de imersie), incluzând de asemenenea un
obiectiv (cu cantilever ataşat) pentru analiza AFM în lichide şi o cameră
video color. Echipamentul mai conţine un sistem de focalizare motorizat cu
posibilitate de deplasare pe o distanţă de 30 mm şi o rezoluţie de 50 nm (un
pas) şi o platformă de scanare prin acţionare piezo-electrică cu următoarele
caracteristici: suprafaţa de scanare de 200 μm x 200 μm x 20 μm, acurateţe
de poziţionare pe direcţiile x şi y sub 4 nm iar pe direcţia z sub 1 nm, posi-
bilitate de poziţionare a probei în planul x-y într-o regiune de 20 mm x 20
mm cu o rezoluţie mai mică de 1 μm.
Sistemul de microscopie Raman confocală lucrează în următoarele mo-
duri de operare:
- achiziţie de spectre din arii selectate (confocal micro-Raman)
- achiziţie de spectru/pixel (scanare)
- imagistica spectrală Raman la lungimi de undă fixe, pe direcţiile x-y, x-z şi
y-z (pănă la 1024 x 1024 pixeli)
- microscopie confocală în reflexie
- microscopie de câmp întunecat cu obiectiv EC Epiplan-Neofluar 100X/0.9
HDDIC, reflector de câmp intunecat
- imagistica de fluorescenţă confocală (prin montare de filtre adecvate)
Sistemul dispune în prezent de 2 lasere, un YAG 532 nm şi un He-Ne
633 nm, domeniul lungimilor de undă de excitaţie 442-785 nm, detecţie
Raman între 150-3500 cm-1, spectrometru UHTS 300, cuplaj cu fibră optică
standard SMA, fibre optice multimod (100, 50 şi 25 μm), conectori, două
reţele de difracţie cu 600 şi respectiv 1800 linii/mm, detector CCD cu răcire
Peltier (1340 x 100 pixeli) şi iluminare prin spate tip Marconi. Drumul raze-
lor în interiorul echipamentului CRM 200 este prezentat în schema de mai
jos (Fig. 3) [28].
Rezoluţia optică laterală la linia laserului de 532 nm este de 250 nm.
Dimensiunea maximă a probelor care pot fi măsurate este de 120 mm în
diametru şi 20 mm înălţime.
112
01. laserul
02. fibra optică standard
03. obiectivul
04. platforma de scanare
05. fibra optică multimod
06. spectrometru UHTS 300
07. lampa cu lumină albă pentru
iluminare
08. sistem de focalizare
motorizat pe axa z
09. camera video
Figura. 3. Drumul razelor în microscopul Raman WITec CRM 200.
3.2. Parametrii optimi de funcţionare

3.2.1. Înregistrarea spectrelor Raman confocale
În echipamentul CRM 200 radiaţia laser ajunge în microscop printr-o
fibră optică standard iar radiaţia Raman împrăştiată, colectată cu ajutorul
obiectivului de microscop, este transmisă spectrometrului echipat cu o ca-
meră CCD prin intermediul unei fibre optice multimod. Diametrul acestei
fibre joacă rolul pinholului cu ajutorul căruia se realizează confocalitatea
[29]. Fibra este montată în planul imagine al microscopului şi poate fi
ajustataă astfel încât să se obţină eficienţa maximă de colectare. Echipamen-
tul CRM 200 are în dotarea standard trei fibre multimod cu diametre de
100, 50 şi 25 μm.
Relaţia care trebuie îndeplinită în cazul măsurătorilor Raman confocal
M πd 0
este ≥ , unde M este mărirea obiectivului, d0 diametrul
NA v P max λ
pinholului, NA apertura numerică a obiectivului de microscop, λ lungimea
de undă, iar vPmax este un parametru variabil a cărui valoare trebuie stabilită
în funcţie de tipul de informaţie spectrală care se doreşte a fi obţinută (ex.
pentru a obţine cea mai mare rezoluţie laterală vPmax ≤ 0.5, iar pentru vPmax ≤
4 nu se modifică semnificativ rezoluţia axială). Partea stângă a ecuaţiei este
legată doar de parametrii obiectivului de microscop.
113
Tabelul 1. Raportul M/NA pentru diferite tipuri de obiective de microscop.
Obiectiv 10 / 20 / 40 / 60 / 100 / 100 / 100 /
microscop 0,25 0,4 0,6 0,8 0,9 1,25 1,4
M/NA 53 50 67 75 111 80 71
Tabelul 2. Raportul πd0/2,5λ pentru diferite lungimi de undă şi diametre ale

pinholului.
Lungime de undă [nm] 440 488 532 633 785
d0 = 10 μm 29 26 24 20 16
d0 = 25 μm 71 64 59 50 40
d0 = 50 μm 142 129 118 99 80
d0 = 100 μm 286 258 236 199 160
d0 = 200 μm 571 515 472 397 320
Cu ajutorul celor două tabele poate fi determinată mărimea corectă a

pinholului în măsurătorile Raman confocal efectuate cu echipamentul CRM
200. Astfel, pentru măsurători în care este utilizat un laser cu lungimea de
undă de 532 nm, un obiectiv de microscop cu mărire de 100 şi o apertură
numerică de 0,9, cea mai mare rezoluţie axială s-ar obţine pentru un diame-
tru optim al pinholului de 50 μm, în timp ce cea mai mare rezoluţie laterală
s-ar obţine pentru un diametru optim al pinholului de 10 μm.
Înaintea efectuării măsurătorilor propriu-zise, în vederea stabilirii pa-
rametrilor optimi, se parcurg următoarele etape:
- se lucrează cu fibra de 100 şi cu obiectivul de 20X sau 50X. Dacă sem-
nalul Raman obţinut este bun, se schimbă obiectivul de 100X. În anumite
situaţii se poate schimba şi fibra (vezi detaliile despre confocalitate prezen-
tate mai sus)
- pentru a stabili puterea laserului, se foloseşte intensitatea liniei
Rayleigh (ar fi bine să nu depăşească 400 ccd cts, fiind indicat să fie chiar
mai mică de 200 ccd cts; în cazul în care nu se obţine semnal Raman se creş-
te puterea laserului). Puterea laserului trebuie aleasă astfel încât să nu in-
ducă transformări probei (fotodegradare, etc.), iar spectrele obţinute să aibă
un raport semnal/zgomot multumitor. De exemplu, în experimente SERS
pe molecule biologice se foloseşte o putere a laserului sub 1 mW. În caz
contrar, apare riscul de a obţine semnal de la contaminanţi sau se poate
degrada molecula. Dacă proba de interes nu este predispusă la transformări
din cauza laserului, se pot utiliza puteri mai mari (≤ 3 mW).
- stabilirea timpului de înregistrare se face în funcţie de intensitatea
semnalului Raman obţinut (se poate alege de ordinul milisecundelor sau de
ordinul minutelor)
114
Exemplu: Spectrul SERS al adeninei înregistrat pe substrat solid obţinut
prin picurarea soluţiei coloidale de argint cu adenină pe o sticlă de micro-
scop.
35000
30000
25000
Intensity [ccd cts]
20000
15000
10000
5000
0
400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800
-1
Raman shift [cm ]
Parametrii folosiţi:
• fibra multimode de 100 μm
• obiectivul 100X aer
• linia laser 632.8 nm
• puterea laserului 640 μW
• timp de integrare/măsurare 60 s
3.2.2. Imagistica Raman confocală

Pentru imagistică este indicată utilizarea obiectivului de 100X (în aer
sau cu imersie în ulei). Înaintea efectuării unei scanări se stabilesc parame-
trii optimi de înregistrare (puterea laserului şi timpul de integrare) prin
măsurarea spectrelor individuale şi time series. Referitor la timpul de inte-
grare, ideal este să fie cât mai mic cu puţinţă (între 0,1 s şi 1 s), iar stabilirea
lui depinde de tipul probei, de puterea laserului şi de aria scanată. În ceea
ce priveşte stabilirea numărului de linii şi de puncte pentru suprafaţa pe
care dorim s-o scanpm, în general pentru o arie de 10 μm x 10 μm se
utilizeazp minim 75 linii şi 75 de puncte pentru fiecare linie (la un număr
prea mic de linii şi de puncte imaginea este de proastă calitate).
Exemplu. Harta spectrală a intensităţii benzii Raman de la 737 cm-1 din

spectrul SERS al adeninei înregistrat pe substrat solid obţinut prin picura-
rea soluţiei coloidale de argint cu adenina pe o sticlă de microscop.
115
500 737
400
Intensity [ccd cts]

300
200
100
0
500 1000 1500
-1
Raman shift [cm ]
În spectrul selectat din imaginea scanată se poate observa semnalul “curat”

de la adenină.
• fibra optică multimod 100 μm
• obiectivul 100X (aer)
• linia laser 632.8 nm
• puterea laserului: 640 μW
• suprafaţa scanată: 10 μm x 10 μm
• 75 linii; 75 puncte/linie
• timp de integrare 0.5 s/punct (softul calculează timpul de integrare
pentru o linie – în acest caz 37,5 s (trace) şi 0.075 s (retrace)
Exemplu. Imagistica Raman pe o secţiune dintr-un dinte, la interfaţa dintre

dinte şi plombă
116
• fibra optică multimod 100 μm
• obiectivul 100X (aer)
• linia laser 532 nm
• putere laser 3 mW.
• suprafaţa scanată 10 μm x 10 μm
• nr. de linii 150, puncte 150/linie
• timp de integrare 0.2 s/punct
3.3. Accesorii
3.3.1. Modul de microscopie de forţă atomică model alpha 300
Echipamentul de microscopie Raman confocală CRM 200 cu scaner este
combinat cu un modul de microscopie de forţă atomică (AFM) model alpha
300.
01. camera video

02. unitatea de deflexie a razelor
03. lampa cu lumină albă pentru
iluminare
04. obiectivul AFM cu cantilever
05. platforma de scanare
06. masa antivibraţie
Figura 4. Drumul razelor în microscopul de forţă atomică alpha300.
Microscopul AFM alpha 300 lucrează în următoarele moduri: contact

mod, forţă laterală, acustic (tapping) mod, contact mod intermitent cu ima-
gistica în fază şi amplitudine cu o rezoluţie de 16 bit, digitizare 5 MHz, şi
frecvenţa 10-500 KHz.
Sistemul dispune de un laser de deflexie 980 nm, o unitate de detecţie a
deflexiei, masa antivibraţie 0.7 – 1000 Hz, > 1000 Hz pasivă. Aria de scanare
este de 100 μm x 100 μm x 20 μm. Drumul razelor în interiorul microscopu-
lui de forţă atomică alpha 300 este prezentat în schema de mai sus (Fig. 4)
[30].
117
Parametrii optimi de funcţionare
1. Modul acustic (AFM AC-Mode)
• Este modul de operare uzual, utilizat mai ales în cazul probelor moi
(probe biologice).
• Se folosesc tip-uri de Si3N4 fixate pe cantilever-uri cu frecvenţa de
rezonanţă mare (200 – 300 kHz).
• În vederea realizării alinierii se efectuează următorii paşi:
• Se determină frecvenţa liberă de oscilaţie a cantileverului aplicând o
tensiune de 0.05 –0.1 V
• Se ajustează amplitudinea oscilaţiilor libere ale cantilever-ului până
la o tensiune de 2 V
• Se setează un setpoint de 1.5 V
• Se setează P-gain (proportional gain) la 5.0 şi I-gain (integral gain) la
5.0.
• Valorile tipice ale parametrilor pentru scanare sunt:
• Număr puncte pe linie: 256
• Număr linii pe imagine: 256
• Timpul scanare pe linie: 0.5 – 2 s
• În timpul scanării se ajustează P-gain şi I-gain astfel încât drumul
înainte şi drumul înapoi să coincidă.
• Apropierea tip-ului de substrat se face automat.
Imagine topografică AFM Imagine fază AFM
2. Modul contact (AFM contact mode)

- Permite înregistrarea de imagini, scanarea de-a lungul unei singure linii
sau înregistrarea curbelor de forţă.
- în vederea realizării alinierii se efectuează următorii paşi:
- Se utilizează tip-ul de AFM dorit.
118
- Se setează P-gain (proportional gain) la 5.0 şi I-gain (integral
gain) la 5.0.
- Apropierea tip-ului de substrat se face automat.
- Valori tipice ale parametrilor pentru scanare:
- Număr puncte pe linie: 256
- Număr linii pe imagine: 256
- Timpul scanare pe linie: 0.5 – 2 s
3.3.2. Celula Linkam pentru efectuarea unor măsurători la diferite tem-

peraturi.
• Domeniul de temperatură: -196 - 600 °C.
• Stabilitate < 0.1 °C.
• Rata de încălzire: max 150 °C/min.
• Senzor din platină 100 Ω.
• Sistem de răcire a corpului celulei cu apă pentru temperaturi >
300 °C.
4.Bibliografie
1. I. R. Lewis, H. G.M. Edwards (Eds.), Handbook of Raman Spectroscopy, Marcel
Dekker Inc. New York, 2001.
2. S. Astilean, Metode şi tehnici moderne de spectroscopie optica, Spectroscopia IR şi
Raman, Editura Casa Cartii de Stiinta, Cluj-Napoca, 2002.
3. R. Petry, M. Schmitt, J. Popp, Raman Spectroscopy–A Prospective Tool în the Life
Sciences, ChemPhysChem, 4, 14, 2003.
4. S. Schluecker, (Ed.), Surface Enhanced Raman Spectroscopy: Analytical,
Biophysical and Life Science Applications, Wiley VCH, 2010.
5. M. Fleischmann, P. J. Hendra, A. J. McQuillan, Raman spectra of pyridine adsorbed
at a silver electrode, Chem. Phys. Lett., 26, 163, 1974.
6. T. Vo-Dinh, SERS chemical sensors and biosensors: new tools for environmental
and biological analysis, Sensors and Actuators B, 29, 183, 1995.
7. J. A. Creighton în Spectroscopy of Surfaces, Vol. 21 (Eds.: R. J. H. Clark, R. E.
Hester), John Wiley & Sons, New York, 1988.
8. D. A. Weitz, M. Moskovits, J. A. Creighton în Surface-Enhanced Raman
Spectroscopy with Emphasis on Liquid - Solid Interfaces, Vol. 2 (Eds.: R. B. Hall, A.
B. Ellis),VCH, Deer field Beach, FL, pp. 197- 243, 1986.
9. G. A. Baker, D. S. Moore, Progress în plasmonic engineering of surface-enhanced
Raman-scattering substrates toward ultra-trace analysis, Anal. Bioanal. Chem. 382,
1751, 2005.
10. K. Kneipp, H. Kneipp, P. Corio, S. D. M. Brown, K. Shafer, J. Motz, L. T. Perelman,
E. B. Hanlon, A. Marucci, G. Dresselhaus, M. S. Dresselhaus, Surface-Enhanced and
Normal Stokes and Anti-Stokes Raman Spectroscopy of Single-Walled Carbon
Nanotubes, Phys. Rev. Let. 84, 3470, 2000.
11. N. Weissenbacher, B. Lendl, J. Frank, H. D. Wanzenboeck, B. Mizaikoff, R. Kellner,
Continuous Surface Enhanced Raman Spectroscopy for the Detection of Trace Or-
ganic Pollutants în Aqueous Systems, J. Mol. Struct. 539, 410, 1997.
119
12. X. Zhang, M. A. Young, O. Lyandres, R. P. Van Duyne, Rapid Detection of an
Anthrax Biomarker by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy, J. Am. Chem. Soc.
127, 4484, 2005
13. D. S. Grubisha, R. J. Lipert, H. Y. Park, J. Driskell, M. D. Porter, Femtomolar
detection of prostate-specific antigen: an immunoassay based on surface-enhanced
Raman scattering and immunogold labels, Anal. Chem., 75, 5936, 2003.
14. K. E. Shafer-Peltier, C. L. Haynes, M. R. Glucksberg, R. P. Van Duyne, Toward a
Glucose Biosensor Based on Surface-Enhanced Raman Scattering, J. Am. Chem.
Soc., 125, 588, 2003; C. R. Yonzon, C. L. Haynes, X. Zhang, J. T. Jr. Walsh, R. P. Van.
Duyne, A glucose biosensor based on surface-enhanced Raman scattering:
improved partition layer, temporal stability, reversibility, and resistance to serum
protein interference, Anal. Chem. 76, 78, 2004.
15. L. Bao, S. M. Mahurin, R. G. Haire, S. Dai, Silver-doped sol-gel film as a
surface-enhanced Raman scattering substrate for detection of uranyl and neptunyl
ions, Anal. Chem. 75, 6614, 2003.
16. J. M. Chalmers and P. R. Griffiths, (Eds.), Handbook of Vibrational Spectroscopy,
John Wiley and Sons, Chichester, pp. 1419-1428, 2002.
17. N. J., Everall, Depth Profiling with Confocal Raman Microscopy, Part II,
Spectroscopy 19, 16, 2004.
18. C. G. Coates, J. J. McGarvey, On the Pulse: Andor tehchnology, 1(8), 2001.
19. G. Gouadec, P. Colomban, Raman Spectroscopy of nanomaterials: How spectra
relate to disorder, particle size and mechanical properties, Progress în Crystal
Growth and Characterization of Materials 53, 1, 2007.
20. E. Barborini, I. N. Kholmanov, P. Piseri, C. Ducati, C.E. Bottani, P. Milani, Enginee-
ring the nanocrystalline structure of TiO2 films by aerodynamically filtered cluster
deposition, Appl. Phys. Lett. 81, 3052, 2002.
21. M. H. Frey, D. A. Payne, Grain-size effect on structure and phase transformations
for barium titanate, Phys. Rev. B, 54, 3158, 1996.
22. A. Guinier, Théorie et Technique de la Radiocristallographie, Dunod, Paris, 1956.
23. M. F. Cerqueira, L. Rebouta, M. Andritschky, J.A. Ferreira, M. F. Da-Silva,
Microcrystalline silicon thin films prepared by RF reactive magnetron sputter
deposition, Vacuum 46, 1385, 1995.
24. D. G. Georgiev, M. Mitkova, P. Boolchand, G. Brunklaus, H. Eckert, M. Micoulaut,
Molecular structure, glass transition temperature variation, agglomeration theory,
and network connectivity of binary P-Se glasses, Phys. Rev. B, 64, 134204, 2001.
25. D. G. Georgiev, P. Boolchand, K.A. Jackson, Intrinsic nanoscale phase separation of
bulk As2S3 glass, Phil. Mag., 83, 2941, 2003.
26. Y. Wang, J. Wells, D. G. Georgiev, P. Boolchand, K. Jackson, M. Micoulaut, Sharp
Rigid to Floppy Transition Induced by Dangling Ends în a Network Glass, Phys.
Rev. Lett., 87, 185503, 2001.
27. E. A. Carrasco, M. Campos-Vallette, P. Leyton, G. Diaz, R. E. Clavijo, J. V.
Garcıa-Ramos, N. Inostroza, C. Domingo, S. Sanchez-Cortes, R. Koch, Study of the
Interaction of Pollutant Nitro Polycyclic Aromatic Hydrocarbons with Different
Metallic Surfaces by Surface-Enhanced Vibrational Spectroscopy (SERS and SEIR),
J. Phys. Chem. A, 107, 9611, 2003.
28. http://www.witec.de/en/company/witecnews/19/crm200flyer.pdf
29. Manual WITec CRM200.
30. www.witec.de/en/download/AFM/alpha300Aflyer.pdf
120
Microspectroscopia Raman
– partea a II-a
Cuprins
1. Stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectroscopie Raman................... 121

1.1. Substrate SERS ............................................................................................. 122
1.2. Identificarea unor bacterii ............................................................................. 122
1.3. Caracterizarea celulelor ................................................................................. 123
1.4. Diagnosticarea unor boli ............................................................................... 124
1.5. Aplicaţii în domeniul farmaceutic................................................................. 125
1.6. Aplicaţii în domeniul alimentar .................................................................... 125
1.7. Nanotuburi de carbon ................................................................................... 126
2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman confocală din
cadrul platformei ICI-BNS................................................................................... 126
3. Tematici de cercetare posibil de implementat în cadrul laboratorului de
microscopie Raman confocală al platformei ICI-BNS .......................................... 128
4. Bibliografie ........................................................................................................... 130
1. Stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectroscopie

Raman
În ultima perioadă, odată cu dezvoltarea tehnologică a aparaturii afe-
rente care permite înregistrarea rapidă a spectrelor Raman folosind diferite
linii de excitare laser precum şi vizualizarea zonelor cu ajutorul microsco-
piei de forţă atomică sau a celei electronice de baleiaj, microspectroscopia
Raman este din ce în ce mai mult aplicată în diverse domenii cum ar fi: me-
dicină, biologie, studiul materialelor, geologie şi mineralogie, arta, ştiinţa
mediului, controlul calităţii alimentelor, etc. [1].
Datele bibliometrice furnizate de Thomson Reuters ISI Web of Science
confirmă faptul că în perioada 2001-2009 numărul publicaţiilor referitoare
la spectroscopia Raman şi aplicaţiile ei s-a dublat de la 1931 înregistrate în
2001 la 4078 apărute în 2009 [1]. Această creştere a numărului de publicaţii
este datorată, în principiu, următoarelor motive: (a) dezvoltării continue a
metodei SERS; (2) progresului extraordinar înregistrat în domeniul fabrică-
rii controlate a nanomaterialelor şi a nanostructurilor; (3) creşterii eficienţei
în imagistica biomedicală şi de diagnosticare a bolilor; (4) numărului tot
121
mai mare de aplicaţii în afara laboratorului (artă, arheologie, criminalistică,
farmaceutice), (5) designului tot mai sofisticat şi controlat al pulsurilor laser
ultrarapide utilizate în aplicaţii care exploatează efectele Raman neliniare.
Din domeniul vast de aplicabilitate al spectroscopiei Raman se remarcă
cu precădere aplicaţiile biomedicale, axate pe diagnosticarea unor boli, de
identificare a unor bacterii, de investigare a unor celule vii, cele din dome-
niul nanoparticulelor şi nanomaterialelor, precum şi cele din domeniul artei
şi arheologiei, farmaceutic şi alimentar. Astfel, în continuare vom face o
trecere în revistă a principalelor domenii de aplicabilitate, făcând o referire
concretă la cele mai recente cercetări.
1.1. Substrate SERS

În ultimii ani, metoda SERS s-a dezvoltat considerabil datorită obţinerii
unor substrate SERS capabile să producă o amplificare importantă a semna-
lului Raman al speciilor adsorbite, reproductibilă şi stabilă în timp. Uni-
formitatea răspunsului SERS al substratelor depinde de morfologia lor.
Astfel, s-a dovedit că gradul de amplificare poate fi controlat prin utilizarea
unor metode de nanofabricare a structurii suprafeţei în termeni de mărime,
formă şi distanţa dintre formaţiunile de pe suprafaţă, pe care adsorb specii-
le moleculare. Astfel, în ultima perioadă pe lângă substratele SERS obţinute
prin litografie cu fascicul de electroni, litografie cu nanosfere de polistiren
[2-4] au fost preparate şi substrate constând din nanoparticule anizotrope
de forme diferite [5, 6]. De asemenea, au fost realizate noi substrate con-
stând din nanotuburi de TiO2 pe care a fost depus Ag, sau nanofire de ZnO
pe care a fost depus Au [7, 8] toate manifestând o activitate SERS remarca-
bilă.
1.2. Identificarea unor bacterii

Identificarea rapidă şi precisă a micro-organismelor a devenit o cerinţă
importantă nu numai pentru analizele clinice, sau cele ale unor materiale
frauduloase, ci şi în diferite aplicaţii cum ar fi producţia de medicamente
sau tehnologia de procesare a mâncării. În toate aceste aplicaţii este de dorit
ca timpul de cultivare a micro-organismelor să fie minimizat pentru a pre-
scrie pacienţilor în timp util tratamentul corespunzător sau pentru a reduce
timpul în care unităţile de producţie sunt închise din cauza unor disfuncţi-
onalităţi. Majoritatea metodelor convenţionale de identificare a bacteriilor
se bazează pe efectuarea unor teste chimice după cultivarea micro-
organismelor în diferite medii şi necesită timp îndelungat. Dintre tehnicile
122
care permit identificarea rapidă a micro-organismelor spectrosopia Raman
a devenit una dintre cele mai promiţătoare metode [9] .
Procedura de caracterizare a unei celule bacteriene cu ajutorul spectro-
scopiei Raman constă în patru etape: colectarea micro-organismelor, loca-
lizarea moleculelor biologice cu ajutorul unor markeri fluorescenţi, înregis-
trarea spectrelor Raman şi compararea lor cu alte spectre existente în baze
de date în scopul identificării bacteriilor. Combinând rezultatele Raman cu
o metodă de clasificare bazată pe chemometrie s-a reuşit identificarea sub-
speciei unor bacterii cu o probabilitate de 98% [10].
O altă modalitate de identificare a bacteriilor şi/sau a sporilor este cu
ajutorul metodei SERS. În acest caz, se detectează prezenţa unui compus
chimic, cunoscut ca biomarker al sporilor sau al bacteriei [11]. Relativ re-
cent, a fost dezvoltată o metodă de identificare a unor bacterii pe un cip
microfluidic [12]. Prin aplicarea unui câmp electric pe un electrod de aur
s-a reuşit sortarea bacteriilor, concentrarea lor şi apoi, prin înregistrarea
specrelor SERS în cip, cercetătorii au fost capabili să identifice fiecare bacte-
rie pe baza semnăturii sale spectrale. Testele au fost efectuate pentru două
tipuri de bacterii Gram positive (Staphylococcus aureus) şi Gram negative
(Pseudomonas aeruginosa). Cu ajutorul acestei metode se îmbunătăţeste
semnificativ timpul şi efortul necesar identificării diferitelor bacterii din
mâncare sau altă materie organică.
1.3. Caracterizarea celulelor

Spectroscopia Raman este o metodă sensibilă pentru studiul biochimic
al celulei fiind capabilă să pună în evidenţă modificări care apar în urma
interacţiunii cu diferiţi agenţi [13]. Pe de altă parte, microscopia de forţă
atomică oferă informaţii despre topografia suprafeţei, adeziunea şi elastici-
tatea celulară a unei celule. Prin utilizarea combinată a celor două metode
pot fi investigate proprietăţile biomecanice şi biochimice ale celulelor vii în
diferite condiţii fiziologice [14].
Spectrele Raman ale celulelor vii constă din benzi corespunzătoare
biopolimerilor existenţi în celule (lipide, proteine, ADN, ARN). Cu ajutorul
spectrelor Raman este posibilă discriminarea celulelor vii de cele moarte.
Acest lucru este extrem de important în realizarea unui biosenzor. De ase-
menea, cu ajutorul spectroscopiei Raman este posibilă monitorizarea în
timp a interacţiunii dintre celule şi diverse medicamente, precum şi diferite
elemente toxice folosite în bioterorism, în vederea stabilirii efectelor acestei
interacţiuni.
123
1.4. Diagnosticarea unor boli
După introducerea spectroscopiei Raman în studiul pielii de către Wil-
liams et all în 1992 [15] utilizarea ei în acest domeniu a devenit tot mai frec-
ventă. În prezent, spectrele Raman înregistrate pe piele sunt bine analizate
şi pe baza diferenţelor s-a pus în evidenţă existenta unor boli [16, 17]. Deoa-
rece intensitatea semnalului Raman este scăzută, timpii de achiziţie sunt
extrem de lungi şi din această cauză aplicaţiile clinice sunt reduse.
Relativ recent, s-a reuşit implemetarea spectroscopiei Raman în aplica-
ţii clinice prin intermediul unui sistem capabil să înregistreze şi să analize-
ze în timp real spectre Raman in vivo [18]. Cu ajutorul acestui sistem s-a
reuşit efectuarea unei evaluări a pielii unor voluntari precum şi diagnosti-
carea unor boli ale pielii. S-a constatat că există regiuni spectrale care pre-
zintă benzi specifice pentru piele provenită din diferite regiuni ale corpului.
De asemenea, s-a constatat că semnăturile spectrale specifice ale pielii dife-
ră de la un individ la altul. Astfel, prin evaluarea raportului dintre conţinu-
tul de lipide şi proteine se poate face o evaluare a pielii precum şi o dia-
gnosticare cu ajutorul spectroscopiei Raman [19]. De asemenea spectrosco-
pia Raman permite identificarea şi monitorizarea melaninei, un pigment
natural care acţionează ca un scut împotriva radiaţiei solare, înlătură specii-
le chimice active şi produce radicali activi care afectează ADN-ul.
Cancerul este o boală complexă indusă de o instabilitate genetică şi o
acumulare a unor alternări moleculare multiple [20]. Deoarece diagnostica-
rea timpurie implică o rată de supravieţuire ridicată, un interes deosebit l-a
avut dezvoltarea unor metode de detecţie moleculară care să permită vizu-
alizarea unor biomarkeri sau a unor evenimente celulare şi să indice starea
de fapt a cancerului.
Spectroscopia Raman este o metodă utilă în diagnosticarea cancerului
datorită sensibilităţii sale de a detecta modificări moleculare extrem de mici
care sunt asociate cu cancerul, cum ar fi o creştere a raportului dintre nu-
cleu şi citoplasmă, existenţa cromatinei dezordonate, o activitate metabolică
crescută şi modificări ale cantităţilor de lipide şi proteine [21]. În principal
spectroscopia Raman a fost aplicată la diagnosticarea cancerului de piele,
de sân, de tract gastrointestinal şi cervical sau de col uterin [21]. Senzorii
optici bazaţi pe metoda SERS au fost în ultima perioadă destul de des folo-
siţi pentru diagnosticarea in vitro şi in vivo a cancerului [22]. Ei sunt capa-
bili să ofere informaţii moleculare specifice despre moleculele ţintă de inte-
res, fără o marcare prealabilă a acestora.
124
1.5. Aplicaţii în domeniul farmaceutic
Spectroscopia Raman a devenit o metodă rapidă, directă şi nedistructi-
vă în analizele farmaceutice, odată cu dezvoltarea aparatelor şi a metodelor
chemometrice de analiză. Majoritatea studiilor se bazează pe investigarea
ingredientului farmaceutic activ şi în consecinţă, bazele de date existente
conţin informaţii referitoare la aceste ingrediente. Reletiv recent [23] a fost
publicată o bază de date cu spectre Raman ale mediului excipient în care
este înglobat ingredientul farmaceutic activ, astfel încât se pot realiza anali-
ze complete ale produselor farmaceutice.
În ultima perioadă, creşterea cantităţii de medicamente contrafăcute pe
piaţă pune în pericol sănătatea cetăţenilor şi ridică un semnal de alarmă.
Aceste produse pot fi dăunătoare sănătăţii deoarece conţin impurităţi ino-
dore, pot fi inactive şi/sau să aibă o absorbabilitate scăzută sau chiar inexis-
tentă. De asemenea, aceste medicamente pot conţine alte ingrediente decât
cele dorite, cantităţi incorecte ale agenţilor farmaceutici activi sau ambalaje
necorespunzătoare. Cu ajutorul spectroscopiei Raman se pot obţine infor-
maţii specifice legate de identificarea ingredientului farmaceutic activ, a
mediului excipient, precum şi informaţii utile legate de identificarea ele-
mentelor necunoscute [24].
1.6. Aplicaţii în domeniul alimentar

Melamina este un ingredient folosit la obţinerea plasticului, dar este
frecvent adăugat în mod abuziv şi în mâncare, pentru a crea impresia falsă
a unui conţinut ridicat de proteine, deoarece această moleculă conţine un
număr mare de atomi de azot. În anul 2007, aproximativ 1700 de câini şi
pisici din SUA au murit ca urmare a consumului de mâncare contaminată
cu melamină [25]. În ţesuturile şi urina animalelor moarte au fost detectate,
pe lângă melamină, şi cantităţi reduse de acid cianuric, amelina şi amelida,
care au rezultat cel mai probabil din descompunerea unor derivaţi ai me-
laminei [26]. În anul 2008, 54000 de copii au fost intoxicaţi iar 5 au murit ca
urmare a consumului de lapte contaminat, produs în China. Mai târziu s-a
aflat că melamina a fost introdusă intenţionat în multe alte produse lactate
produse în China şi destinate exportului [25].
Spectroscopia Raman a fost utilizată în analizarea melaminei din glu-
ten, hrana pentru pui, prăjituri şi tăiţei [27]. A fost de asemenea identificată
melamina din făina contaminată, gluten din porumb, hrana pe bază de so-
ia, lapte praf şi a fost stabilit un algoritm de analiză calitativă şi cantitativă a
melaminei din amestecuri [26]. În plus, spectroscopia Raman împreună cu
125
imagistica Raman au fost utilizate pentru o testare rapidă a hranei în vede-
rea detecţiei melaminei pentru a creşte siguranţa şi securitatea publică. În
toate aceste studii s-a urmărit banda caracteristică a melaminei de la 676
cm-1. Limita de detecţie a melaminei a fost de 1%.
Spectroscopia micro-Raman confocală a fost utilizată şi la stabilirea
compoziţiei unor sucuri de fructe [28]. S-a determinat existenţa a trei com-
ponente importante ale sucurilor de fructe şi anume pectina, fructoza şi
β-carotenul. Acest fapt ar permite utilizarea acestei metode pentru monito-
rizarea on-line a conţinutului acestor substanţe în sucurile aflate în diferite
stagii de producţie. Astfel, microspectroscopia Raman poate fi o metodă de
analiză complementară sau alternativă măsurătorilor de turbiditate care
sunt de obicei utilizate în industria alimentară în producţia berii, monitori-
zarea apei, etc. În plus, pe lângă faptul că ar detecta particule nedorite,
această metodă ar putea oferi informaţii şi despre caracteristicile lor bio-
chimice. Prin utilizarea combinată a spectroscopiei Raman cu alte tehnici de
analiză se pot obtine informaţii cantitative referitoare la particulele nedorite
prezente în sucurile de fructe [29].
1.7. Nanotuburi de carbon

Spectroscopia Raman este o metodă consacrată pentru caracterizarea
nanotuburilor de carbon, în general şi a celor funcţionalizate, în special [30].
Heise şi colaboratorii săi [31] au caracterizat materiale pe bază de carbon
utilizând spectroscopia Raman prin compararea spectrelor înregistrate pe
filtre cu nanotuburi de carbon, nanotuburi de carbon cu un perete sau cu
mai mulţi pereţi, carbon poros grafitizat şi grafit. Spectroscopia Raman a
fost de asemenea aplicată la investigarea nanomaterialelor încapsulate în
nanotuburi de carbon pentru a determina procesul de umplere a
nanotuburilor cu C60, C59N şi antracena. S-a demonstrat modul în care des-
chiderea sau închiderea reversibilă a nanotuburilor poate fi utilizată pentru
a monitoriza cu succes procesul de umplere [32].
2. Tematici de cercetare ale laboratorului de microscopie Raman

confocală din cadrul platformei ICI-BNS
În prezent, printre tematicile de cercetare ale platformei se regăsesc
multe dintre cele prezentate anterior. Astfel, în cadrul grupului care utili-
zează echipamentul de microscopie Raman confocală WITec CRM 200
combinat cu un modul de microscopie de forţă atomică (AFM) model alpha
300, se desfăşoară cercetări interdisciplinare axate pe fabricarea şi
biofuncţionalizarea unor nanoparticule de metal nobil, precum şi a unor
126
nanostructuri hibride, cu scopul de a permite dezvoltarea unor noi aplicaţii
spectroscopice şi plasmonice. O mare parte a activităţii de cercetare este
concentrată pe obţinerea de noi substrate SERS, ordonate şi dezordonate,
folosind metode de auto-asamblare. Astfel, în cazul substratelor ordonate
s-au folosit nanosfere de polistiren peste care au fost depuse filme metalice
[33-36], iar în cazul celor dezordonate au fost obţinute diferite tipuri de
nanoparticule metalice care au fost asamblate pe substrate solide
funcţionalizate/nefuncţionalizate anterior [37-45]. În figura de mai jos (Fig.
1) este prezentată o selecţie a tipurilor de substrate SERS ordonate obţinute
(Fig. 1a) şi a nanoparticulelor sintetizate şi testate din punct de vedere a
capacităţii lor de amplificare a semnalului Raman al unor specii moleculare
adsorbite pe suprafaţa lor (Fig. 1b).
(a) (b)
Figura. 1. Selecţie de imagini a substratelor SERS ordonate (a) şi a nanoparticulelor de metal nobil
sintetizate (b).
În cadrul unui studiu, s-a reuşit corelarea activităţii SERS cu topologia

substratului cu ajutorul imagisticii Raman [35]. Prin combinarea imagisticii
AFM cu imaginile SERS înregistrate prin microspectroscopie Raman
confocală s-a reusit evidenţierea implicării mecanismului plasmonic de
amplificare la semnalul de bază SERS [36]. Toate aceste studii contribuie la
înţelegerea mecanismelor care stau la baza amplificării SERS. O parte a
substratelor SERS obţinute, mai ales cele constând din nanoparticule de
metal nobil, s-a dovedit a avea proprietăţi multifuncţionale atât ca senzor
SERS cât şi ca senzor LSPR [33, 41, 42]. S-a studiat interacţiunea diferitelor
biomolecule (triptofan, glutation etc.), proteine şi biopolimeri relevanţi
(PEG, chitosan, albumină, etc.) cu nanoparticule metalice de forme şi di-
mensiuni diferite [39-41, 43, 44].
Câteva dintre nanoparticulele obţinute au fost utilizate în aplicaţii bio-
medicale cu impact în nanomedicină bazate pe proprietăţile optice, chimice
127
şi termice ale nanoparticulelor de aur în detecţia şi tratamentul la nivel ce-
lular al cancerului (hipertermie locală indusă laser) sau în evaluarea profi-
lului de toxicitate a nanopartirculelor în medii celulare. Astfel, s-a demon-
strat că o serie de nanobastonaşe de aur sau alte nanoparticule de metal
nobil anizotrope, de obicei învelite într-un strat polimeric biocompatibil,
pot fi utilizate în terapia fototermică a cancerului [40]. Au fost de asemenea
efectuate studii de detecţie SERS intracelulare utilizând nanoparticule de
aur PEGylate şi marcate cu coloranţi [44] Rezultatele obţinute demonstrea-
ză faptul că nanoparticulele prezintă stabilitate, conservându-şi identitatea
Raman in vitro, caracteristici care conferă acestui tip de markeri SERS apli-
cabilitate ca şi agenţi imagistici în interiorul organismelor vii [44].
În cadrul unui alt studiu s-a dovedit că o serie de nanoparticule de ar-
gint de formă triunghiulară invelite în chitosan posedă activitate
bactericidală, fiind capabile să distrugă Staphylococcus aureus [45]. În majori-
tatea studiilor spectroscopia Raman a fost acompaniată de imagistica
Raman sau AFM.
3. Tematici de cercetare posibil de implementat în cadrul la-

boratorului de microscopie Raman confocală al platformei
ICI-BNS
Având în vedere stadiul actual al cercetărilor exploratorii prin spectro-
scopie Raman precum şi dotările existente în cadrul platformei, în grupul de
cercetare care utilizează echipamentul de microscopie Raman confocală
WITec CRM 200 combinat cu modulul de microscopie de forţă atomică
(AFM) model alpha 300, s-ar putea aborda noi tipuri de experimente
bio-medicale de diagnosticare a unor boli cum ar fi cele ale sistemului osos
sau arteroscleroza, realizându-se şi studii complementare de absorbţie în IR.
Există numeroase studii în literatură referitoare la utilizarea metodelor
spectroscopice complementare Raman şi de absorbţie în IR în analizarea
osului şi a cartilajelor. Au fost efectuate numeroase investigaţii cu scopul
înţelegerii spectrelor, şi corelării caracteristicilor spectrale cu modificările
care apar datorită vârstei sau a diverselor boli, la animale şi în câteva cazuri
şi la oameni. Doar în ultimii ani, cercetătorii au considerat spectroscopia
vibraţională ca o metodă capabilă să furnizeze informaţii legate de diagnos-
ticarea bolilor care apar la nivelul ţesuturilor muscularo-scheletale [46, 47].
Au fost investigate două dintre cele mai importante boli ale oaselor şi
anume osteoporoza, o boală metabolică, şi osteogeneza imperfectă, care
constă dintr-o serie de defecte genetice care afectează scheletul. Se ştie că
128
un os afectat de osteoporoză are un grad de cristalinitate crescut şi un do-
meniu mai îngust de cristalinitate decât osul sănătos. Aceste modificări ale
structurii sunt reflectate în spectrele Raman şi IR ale probelor [46, 47]. Oste-
ogeneza imperfectă este o maladie genetică al cărei principal semn clinic
este fragilitatea osoasă crescută, manifestată în special prin fracturi la nive-
lul oaselor lungi. Această boala apare ca urmare a mutaţiilor de la nivelul
genelor care codifică producerea de colagen tip I. Metodele spectroscopice
vibraţionale sunt capabile să identifice ţesuturile anormale afectate de
această boală [48]. În prezent, maladia se tratează medical cu
aminobisfosfonaţi iar spectroscopia poate juca un rol important în urmări-
rea progresului tratamentului. S-a constatat că în principiu metodele spec-
troscopice vibraţionale pot fi atât un instrument de diagnosticare cât şi o
metodă care să monitorizeze progresul tratamentului asupra bolii.
Arteroscleroza stă la baza apariţiei majorităţii bolilor cardiovasculare
(angina pectorală, cardiopatie ischemică, infarct miocardic, accident vascu-
lar cerebral, arteriopatie obliterantă etc.). Ea se datorează prezenţei
aşa-numitelor plăci ateromatoase pe pereţii arterelor. Aceste plăci se formea-
ză datorită colesterolului şi grăsimilor prezente în cantităţi excesive în sân-
ge (datorită greşelilor de alimentaţie) care se "infiltrează" în pereţii artere-
lor. În timp, prin depunerea de calciu se formează plăcile ateromatoase. Ele
stânjenesc din ce în ce mai mult circulaţia liberă a sângelui prin artera afec-
tată: din laminară şi fluentă, ea devine turbulentă şi inegală.
Metodele spectroscopice complementare Raman şi de absorbţie în IR
sunt capabile să coreleze informaţiile histopatalogice ale unei aorte afectate
de arteroscleroză cu compoziţia chimică a unei aorte sănătoase [49-51]. Se
pot monitoriza benzile caracteristice proteinelor (colagen, elastina, actina,
etc.) şi lipidelor, şi se pot localiza plăcile ateromatoase prin prezenţa benzilor
caracteristice carbonatului de calciu [49-51].
În ultima perioadă, spectroscopia Raman s-a dovedit a fi o metodă fe-
zabilă în studiul materialelor nanostructurate. În cadrul unui studiu a fost
analizată dependenţa deplasării benzilor Raman în funcţie de dimensiunea
unor nanocristale [52]. De asemenea au fost investigate prin spectroscopie
Raman efectele de confinare a fononilor optici în materialele
nanostructurate [53]. Această confinare duce la modificări ale spectrului de
vibraţie al materialelor nanostructurate în comparaţie cu cel al materialului
bulk, deoarece absenţa periodicităţii la dimesiuni sub cele ale particulei
relaxează regulile de selecţie ale fononilor optici în regiunea centrală a zo-
nei Brillouin şi prin urmare, în spectrul Raman, vor exista contribuţii ale
fotonilor din afara acestei zone. Studii efectuate pe nanostructuri poroase
129
semiconductoare au dovedit faptul că în cazul unor unităţi structurale de
câţiva nanometri, aşa cum au fost observate în cazul şi sau Ge poros, efecte-
le de confinare pot fi utilizate pentru a determina dimensiunea acestora
[54]. Studii Raman ale nanofirelor sau nanoconurilor de GaP au dovedit
faptul că există o dependenţă între intensitatea spectrală şi caracterul spaţi-
al al radiaţiei Raman împrăştiate şi dimensiunea, forma şi compoziţia
nanofirelor [55].
Pe de altă parte, spectroscopia Raman, acompaniată în ultimii ani de
microscopie şi de tehnica SERS, a devenit o metodă de investigare extrem
de utilă în domeniul patrimoniului cultural. Cu ajutorul acestei metode se
obţin informaţii despre compuşii moleculari aflaţi în probele supuse anali-
zei. Metoda este prezentă în departamentele de conservare şi restaurare a
celor mai recunoscute muzee şi librării din lume şi este utilizată pentru
identificarea unor materiale, de la pigmenţi anorganici la biomateriale, uti-
lizate în artifacte ca de exemple manuscrise, picturi, textile, ceramici, sticle,
sculpturi, monumente de piatră [56]. De exemplu, un număr de cinci pic-
turi în miniatură achiziţionate de Muzeul Victoria şi Albert în 2008, presu-
puse a fi lucrări medievale autentice, s-au dovedit a fi pictate la sfârşitul
secolului al 19-lea sau începutul secolului 20. Acest lucru a fost confirmat
cu ajutorul microspectroscopiei Raman [57]. Li şi colaboratorii săi [58] au
realizat analiza decoraţiunilor şi au identificat pigmenţii folosiţi la decora-
rea unui covor chinezesc din secolul al 5-lea cu ajutorul tehnicilor comple-
mentare micro-Raman şi FT-IR. În acest mod, pot fi diferenţiate operele de
artă veritabile de cele contrafăcute sau falsificate.
Astfel, având în vedere aceste considerente şi ţinând seama de echipa-
mentele existente în cadrul platformei, printre tematicile de cercetare care
ar putea fi abordate în viitor s-ar putea regăsi atât studiul unor materiale
nanostructurate de tipul nanofirelor şi a filmelor nanostructurate cât şi al
unor obiecte din patrimoniul cultural.
4.Bibliografie
1. L. A. Nafie, Recent advances în linear and nonlinear Raman spectroscopy. Part IV,
J. Raman Spectrosc. 41, 1566, 2010.
2. L. A. Dick, A. D. McFarland, C. L. Haynes, R. P Van Duyne, Metal Film over
Nanosphere (MFON) Electrodes for Surface-Enhanced Raman Spectroscopy
(SERS): Improvements în Surface Nanostructure Stability and Suppression of
Irreversible Loss, J. Phys. Chem. B 106, 853, 2002.
3. L. Baia, M. Baia, J. Popp, S. Astilean, Gold Films Deposited over Regular Arrays of
Polystyrene Nanospheres as Highly Effective SERS Substrates from Visible to NIR,
J. Phys. Chem. B 110, 23982, 2006.
4. M. Sackmann, S. Bom, T. Balster, A. Materny, Nanostructured Gold Surfaces as
130
Reproducible Substrates for Surface Enhanced Raman Spectroscopy, J. Raman
Spectrosc. 38, 277, 2007.
5. E. N. Esenturk, A. R. HightWalker, Surface-enhanced Raman scattering
spectroscopy via gold nanostars, J. Raman Spectrosc., 40, 86, 2009.
6. A. C. Sant’Ana, T. C. R. Rocha, P. S. Santos, D. Zanchet, M. L. A. Temperini,
Size-dependent SERS enhancement of colloidal silver nanoplates: the case of
2-amino-5-nitropyridine, J. Raman Spectrosc., 40, 183, 2009.
7. A. Roguska, A. Kudelski, M. Pisarek, M. Lewandowska, M. Dolata, M.
Janik-Czachor, Raman investigations of TiO2 nanotube substrates covered with
thin Ag or Cu deposits, J. Raman Spectrosc., 40, 1652, 2009.
8. M. A. Khan, T. P. Hogan, B. Shanker, Gold-coated zinc oxide nanowire-based substrate
for surface-enhanced Raman spectroscopy, J. Raman Spectrosc., 40, 1539, 2009.
9. J. Popp, Identification of micro-organisms by Raman spectroscopy, SPIE
Proceeding, 10.1117/2.1200708.0856.
10. P. Roesch, M. Harz, M. Krause, R. Petry, K.-D. Peschke, O. Ronneberger, H.
Burkhardt, A. Schuele, G. Schmautz, R. Riesenberg, A.Wuttig, M. Lankers, S. Hofer,
H. Thiele, H.-W. Motzkus, J. Popp, Biophotonics: Vision for a better Health Care,
ch. Online monitoring and identification of bioaerosols (OMIB), pp. 89–165,
Wiley-VCH,Weinheim, 2006.
11. H.-W. Cheng, S.-Y. Huan, H.-L. Wu, G.-L. Shen, R.-Q. Yu, Surface-enhanced Raman
spectroscopic detection of a bacteria biomarker using gold nanoparticle
immobilized substrates, Anal. Chem., 81, 9902, 2009.
12. I-F. Cheng, C.-C. Lin, D.-Y. Lin, H.-C. Chang, A dielectrophoretic chip with a
roughened metal surface for on-chip surface-enhanced Raman scattering analysis
of bacteria, Biomicrofluidics 4, 034104, 2010.
13. I. Notingher, Raman Spectroscopy Cell-based Biosensors, Sensors, 7, 1343, 2007.
14. A. H. Zhou, G. D. McEwen, Y. Z. Wu, Combined AFM/Raman microspectroscopy
for characterization of living cells în near physiological conditions, Microscopy:
Science, Technology, Applications and Education A. Méndez-Vilas and J. Díaz
(Eds.), FORMATEX 2010, pp. 515-522.
15. A. Williams, H. Edwards, B. Barry, Fourier transform Raman spectroscopy a novel
application for examining human stratum corneum, Int. J. Pharm. 81, R11, 1992.
16. P. Caspers, G. Lucassen, G. Puppels, Combined în Vivo Confocal Raman
Spectroscopy and Confocal Microscopy of Human Skin, Biophys. J., 85, 572, 2003.
17. C. Lieber, S. Majumder, D. Ellis, D. Billheimder, A. Mahadevan-Jansen, în vivo
nonmelanoma skin cancer diagnosis using Raman microspectroscopy, Lasers în
Surgery and Medicine, 40, 461, 2008.
18. J. Zhao, H. Lui, D. I. McLean, H. Zeng, New Developments în Biomedical Enginee-
ring, Ed. Domenico Campolo, InTech, 2010, pp. 455-474.
19. J. Zhao, H. Lui, D. I. McLean, H. Zeng, Integrated real time Raman system for
clinical în vivo skin analysis, Skin Res. And Tech, 14, 484, 2008.
20. D. Hanahan, R.A. Weinberg, The Hallmarks of Cancer, Cell 100, 57, 2000.
21. A. Mahadevan-Jansen, în Biomedical Photonics Handbook, T. Vo-Dinh, Ed. (CRC
Press, Washington DC, 2003), pp. 30:1–30:27.
22. X. M. Qian, S. M. Nie, Single-molecule and single-nanoparticle SERS: from funda-
mental mechanisms to biomedical applications, Chem Soc Rev, 37, 912, 2008.
23. M. de Veij, P. Vandenabeele, T. De Beer, J. P. Remon, L. Moens, Reference database
of Raman spectra of pharmaceutical excipients, J. Raman Spectrosc., 40, 297, 2009.
24. M. R. Witkowski, The use of Raman spectroscopy în the detection of counterfeit
131
and adulterated pharmaceutical products, American Pharmaceutical Review,
January/February 2005.
25. E. Y. Y. Chan, S. M. Griffiths, C. W. Chen, Public-health risks of melamine în milk
products, Lancet, 372, 1444, 2008.
26. Y. Liu, K. Chao, M. S. Kim, D. Tuschel, O. Olkhovyk, R. J. Priore, Potential of
Raman spectroscopy and imaging methods for rapid and routine screening of the
presence of melamine în animal feed and foods, Appl. Spectrosc. 63, 477, 2009.
27. M. Lin, L. He, J. Awika, L. Yang, D. R. Ledoux, H. Li, A. Mustapha, Detection of
Melamine în Gluten, Chicken Feed, and Processed Foods Using Surface Enhanced
Raman Spectroscopy and HPLC, J Food Sci, 73, T129, 2008.
28. C. Camerlingo, F. Zenone, I. Delfino, N. Diano, D. G. Mita, M. Lepore, Investigation
on Clarified fruit juice composition by using visible light micro-Raman
spectroscopy, Sensors, 7, 2049, 2007.
29. H. Martens, T. Noes, Multivariate Calibration, Wiley: New York, 1993.
30. R. Graupner, Raman spectroscopy of covalently functionalized single-wall carbon
nanotubes, J. Raman Spectrosc. 38, 673, 2007.
31. H. M. Heise, R. Kuckuk, A. K. Ojha, A. Srivastava, V. Srivastava, B. P. Asthana,
Characterisation of carbonaceous materials using Raman spectroscopy: a
comparison of carbon nanotube filters, single- and multi-walled nanotubes,
graphitised porous carbon and graphite, J. Raman Spectrosc., 40, 344, 2009.
32. H. Kuzmany, W. Plank, Ch. Schaman, R. Pfeiffer, F. Hasi, F. Simon, G. Rotas, G.
Pagona, N. Tagmatarchis. Raman scattering from nanomaterials encapsulated into
single wall carbon nanotubes, J. Raman Spectrosc.; 38, 704, 2007.
33. V. Canpean, S. Astilean, Multifunctional plasmonic sensors on low-cost
subwavelength metallic nanoholes arrays, Lab Chip 9, 3574, 2009.
34. C. Farcau, S. Astilean, Silver half-shell arrays with controlled plasmonic response
for fluorescence enhancement optimization, Appl. Phys. Lett. 95, 193110, 2009.
35. C. Farcau, S. Astilean, Mapping the SERS Efficiency and Hot-Spots Localization on
Gold Film over Nanospheres Substrates, J. Phys. Chem C 114, 11717, 2010.
36. S. Astilean, C. Farcau, Evidence of a surface plasmon-mediated mechanism în the
generation of the SERS background, Chem. Commun. 47, 3861, 2011.
37. S. Boca, C. Farcau , S. Astilean, The study of Raman enhancement efficiency as
function of nanoparticle size and shape, Nucl. Instrum. Methods Phys. Res., Sect. B
267, 406, 2009.
38. M. Baia, F. Toderas, L. Baia, D. Maniu, S. Astilean, Multilayer Structures of
Self-Assembled Gold Nanoparticles as a Unique SERS and SEIRA Substrate,
ChemPhysChem 10, 1106, 2009.
39. M. Iosin, P. Baldeck, S. Astilean, Study of tryptophan assisted synthesis of gold
nanoparticles by combining UV–Vis, fluorescence, and SERS spectroscopyJ.
Nanopart. Res. 12, 2843, 2010.
40. S. Boca, S. Astilean, Detoxification of gold nanorods by conjugation with thiolated
poly(ethylene glycol) and their assessment as SERS-active carriers of Raman tags,
Nanotechnology 21, 235601, 2010.
41. M. Potara, A. Gabudean, S. Astilean, Solution-phase, dual LSPR-SERS plasmonic
sensors of high sensitivity and stability based on chitosan coated anisotropic silver
nanoparticles, J. Mater. Chem. 21, 3625, 2011.
42. A. Gabudean, D. Biro, S. Astilean, Localized surface plasmon resonance (LSPR) and
surface-enhanced Raman scattering (SERS) studies of 4-aminothiophenol
adsorption on gold nanorods, J. Mol. Struct. 993, 420, 2011.
43. M. Focsan (Iosin), A. M. Gabudean, V. Canpean, D. Maniu, S. Astilean, Formation
132
of size and shape tunable gold nanoparticles în solution by bio-assisted synthesis
with bovine serum albumin în native and denaturated state, Mat. Chem. Phys. 129,
939, 2011.
44. S. Boca, D. Rugina, A. Pintea, L. Barbu-Tudoran, S. Astilean, Flower-shaped gold
nanoparticles: synthesis, characterization and their application as SERS-active tags
inside living cells, Nanotechnology 22, 055702, 2011.
45. M. Potara, E. Jakab, A. Damert, O. Popescu, V. Canpean, S. Astilean, Synergistic
Antibacterial Activity of Chitosan–Silver Nanocomposites on Staphylococcus Aureus,
Nanotechnology 22, 135101, 2011.
46. M. V. Schulmerich, K A. Dooley, M. D. Morris, T. M. Vanasse, S. A. Goldstein,
Transcutaneous fiber optic Raman spectroscopy of bone using annular illumination
and a circular array of collection fibers, J. Biomed. Optics, 11, 060502, 2006.
47. P. Matousek, Inverse Spatially Offset Raman Spectroscopy for Deep Noninvasive
Probing of Turbid Media, Applied Spectroscopy, 60, 1341, 2006.
48. K. A. Dehring, N. Crane, A. R. Smukler, J. B. McHugh, B. J. Roessler, M. D. Morris,
Identifying chemical changes în subchondral bone taken from murine knee joints
using Raman spectroscopy, Appl. Spectrosc., 60, 1134, 2006.
49. F. Adar, L. Jelicks, C. Naudin, D. Rousseau, S. Yeh, Elucidation of the
atherosclerostic disease process în apo E and wild type mice by vibrational
spectroscopy.SPIE 2004, V. 7 5321A-11 (p.1 of 9).
50. G. V. Nogueira, L. Silveira, Jr. , A. A. Martin, R. A. Zângaro, M. T. T. Pacheco, M. C.
Chavantes, C. A. Pasqualucci, Raman spectroscopy study of atherosclerosis în
human carotid artery, J. Biomed. Opt. 10, 031117, 2005.
51. S. W. E. van de Poll, T. C. Bakker Schut, A. van der Laarse, G. J. Puppels, în situ
investigation of the chemical composition of ceroid în human atherosclerosis by
Raman spectroscopy, J. Raman Spectroscopy, 33, 544, 2002.
52. M. Salis, P. C. Ricci, A. Anedda, An analytical form for the Raman shift dependence
on size of nanocrystals, J. Raman Spectrosc., 40, 64, 2009.
53. A. K. Arora, M. Rajalakshmi, T. R. Ravindran, V. Sivasubramanian, Raman
spectroscopy of optical phonon confinement în nanostructuredmaterials, J. Raman
Spectrosc.; 38, 604, 2007.
54. G. Irmer. Raman scattering of nanoporous semiconductors, J. Raman Spectrosc.; 38,
634, 2007.
55. L. Cao, L. Laim, P. D. Valenzuela, B. Nabet, J. E. Spanier. On the Raman scattering
from semiconductor nanowires, J. Raman Spectrosc.; 38, 697, 2007.
56. H.G.M. Edwards, “Raman Spectroscopy în Art and Archaeology: A New Light on
Historical Mysteries” în Frontiers of Molecular Spectroscopy, J. Laane Ed., Elsevier
2009, pp.133-173.
57. L. Burgio, R. J. H. Clark, R. R. Hark, Spectroscopic investigation of modern
pigments on purportedly medieval miniatures by the "Spanish Forger", J. Raman
Spectrosc., 40, 2031, 2009.
58. T. Li, Y.-F. Xie, Y.-M. Yang, C.-S. Wang, X.-Y. Fang, J.-L. Shi, Q.-J. He, Pigment
identification and decoration analysis of a 5th century Chinese lacquer painting
screen: a micro-Raman and FTIR study, J. Raman Spectrosc., 40, 1911, 2009.
133
IV. SPECTROMETRUL IR
Spectroscopia de absorbţie în infraroşu

Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 134

2. Moduri de vibraţie ................................................................................................ 135
3. Oscilatorul armonic ............................................................................................. 137
4. Reguli de selecţie pentru spectroscopia IR ........................................................... 138
5. Legea Lambert-Beer .............................................................................................. 139
6. Instrumentaţia şi metodologia obţinerii spectrelor IR .......................................... 141
7. Bibliografie ........................................................................................................... 146
1. Introducere
Materia este formată din electroni, nuclee, ioni pozitivi şi negativi. Fie-
care subdiviziune a materiei, cum ar fi un atom, o moleculă, sau un solid
prezintă o distribuţie de sarcină specifică. Aceste sarcini nu sunt doar sar-
cini izolate (monopoli), ci sunt sarcini pozitive şi negative ce formează di-
poli şi multipoli electrici. În interacţiunea luminii cu materia, câmpul elec-
tric (şi într-o măsură mai mică şi cel magnetic) al undei electromagnetice
poate să modifice distribuţia de sarcină şi în acest fel să inducă un moment
de dipol.
În unda de lumină, câmpul electric oscilează cu o frecvenţă de aproxima-
tiv 1015 Hz, ceea ce înseamnă că modificarea distribuţiei de sarcină va avea loc
134
cu aceeaşi frecvenţă în materie. Pe de altă parte, modificări (oscilaţii) ale distri-
buţiei de sarcină, precum un dipol oscilator poate genera, la rându-i, un câmp
electric. Aceste procese, ce apar la interacţiunea luminii cu materia, sunt în
tratarea clasică procesele de bază ale fiecărei metode spectroscopice.
De vreme ce distribuţia de sarcină este specifică pentru un anumit tip
de materie, molecula unei anumite substanţe de exemplu, schimbul de
energie între unda electromagnetică şi materie este de asemenea specifică,
oferind informaţii unice despre materie.
În teoria cuantică, procesele sunt descrise de anihilarea unui foton, ur-
mate de tranziţia în stări de energie mai mari, sau generarea unui foton
când sistemul trece de la o stare energetică ridicată la una joasă. Probabili-
tatea specifică, ca fotonii să interacţioneze cu materia este descrisă de aşa
numita “secţiune eficace “ a efectului spectroscopic.
2. Moduri de vibraţie
Spectroscopia de absorbţie în infraroşu, pe scurt spectroscopia IR, pre-
cum şi spectroscopia Raman oferă informaţii despre modurile vibraţionale
şi vibraţional-rotaţionale ale moleculelor. Benzile vibraţional-rotaţionale
sunt observate doar când proba se află în stare de gaz, unde moleculele se
pot roti liber. În fazele condensate (lichidă sau solidă), pot fi observate doar
frecvenţele de vibraţie ale probei.
În funcţie de simetria moleculei, cele două tehnici, IR şi Raman, pot fi
privite ca fiind complementare. O vibraţie va fi activă IR dacă are loc o va-
riaţie a momentului de dipol în timpul vibraţiei. În schimb, acele vibraţii
care duc la o modificare a polarizabilităţii moleculare vor fi active Raman.
Astfel, activitatea unui mod vibraţional depinde de simetria lui şi de sime-
tria moleculei. O regulă simplă de simetrie este aşa numita “regula
excuziunii mutuale”. Conform acesteia, în cazul moleculelor cu centru de
simetrie, vibraţiile active Raman nu sunt active IR, şi invers.
Numărul modurilor de vibraţie posibile al unei molecule poate fi de-
terminat din numărul atomilor N din moleculă şi geometria moleculară.
Geometria moleculară este specificată de coordonatele carteziene ale fiecă-
rui atom. Molecula are aşadar 3N grade de libertate, trei dintre aceste grade
fiind folosite pentru specificarea mişcării de translaţie a moleculei în spaţiu,
şi alte două (molecule liniare) sau trei (molecule neliniare) grade sunt nece-
sare pentru a specifica mişcarea de rotaţie. Gradele de libertate rămase co-
respund numărului modurilor de vibraţie:
3N-5 pentru molecule liniare, şi
3N-6 pentru moleculele neliniare.
135
De exemplu, vibraţiile fundamentale ale moleculei de apă, H2O, sunt
prezentate în Figura 1. Apa, fiind o moleculă neliniară prezintă trei vibraţii
fundamentale:
întindere simetrică întindere asimetrică deformare (forfecare)

Figura 1. Moduri de vibraţie de întindere şi deformare ale H2O.
Dioxidul de carbon, CO2, este o moleculă liniară, astfel că va prezenta

patru vibraţii fundamentale (Figura 2). Vibraţia de întindere asimetrică a
CO2 generează o bandă intensă în spectrul IR la 2350 cm-1. De menţionat
este că această bandă se observă de regulă în spectrul IR al back-
ground-ului, datorită prezenţei CO2 în atmosferă.
întindere asimetrică deformare (forfecare) perpendiculară pe

planului foii
întindere simetrică deformare (forfecare) în planul foii
Figura 2. Moduri de vibraţie de întindere şi deformare ale CO2.
Cele două vibraţii de deformare (forfecare) sunt echivalente, vibraţia

acestora având loc la aceeaşi frecvenţă, fiind astfel numite degenerate, şi
apar în spectrul IR la 666 cm-1. Vibraţia de întindere simetrică a CO2 este
inactivă IR deoarece această vibraţie nu produce modificare în momentul
de dipol al moleculei.
136
3. Oscilatorul armonic
Cel mai simplu model pentru vibraţia unei molecule diatomice este os-
cilatorul armonic. În acest model se consideră cei doi atomi de mase m1 şi
m2 ai moleculei legaţi printr-un resort elastic. Descrierea matematică a miş-
cării de vibraţie a acestor două corpuri cu masele m1 şi m2 poate fi simplifi-
cată prin considerarea unui singur corp cu masa redusă
µ=m1*m2/(m1+m2), ce oscilează în jurul centrului de masă al moleculei
biatomice, într-un câmp potenţial de tipul kx2/2.
Figura 3. Modelul oscilatorului armonic pentru molecula diatomică. Variaţia energiei potenţiale cu
distanţa internucleară.
Din punct de vedere fizic, aşa cum se poate deduce din Figura 3, o
energie mai mare a oscilatorului armonic corespunde unei amplitudini mai
mari a oscilaţiei, frecvenţa fiind aceeaşi pentru toate nivelele de energie.
Energiile vibraţionale cuantificate se obţin în urma rezolvării ecuaţiei
Schrödinger pentru oscilatorul armonic:
1
Ev=hν(v+ ) , v=0,1,2…. (1.1)
2
unde v este numărul cuantic de vibraţie, ν este frecvenţa de vibraţie şi h este
constanta lui Planck. Frecvenţa de vibraţie a oscilatorului armonic depinde
de puterea legăturii (constanta de forţă a legăturii k) şi masa redusă µ:
1 k
ν= (1.2)
2π μ
137
Nivelele de energie vibraţionale sunt la distanţe egale (echidistante) în
modelul oscilatorului armonic, diferenţa între două nivelele de energie adi-
acente E fiind:
ΔE=hν=ћ k (1.3)
μ
4. Reguli de selecţie pentru spectroscopia IR

O moleculă diatomică va absoarbe radiaţie IR numai dacă momentul ei
de dipol se modifică în urma variaţiei distanţei internucleare. Probabilitatea
de tranziţie depinde de diferenţa de populaţie ΔN dintre două stări cuanti-
ce şi pătratul momentului de dipol al tranziţiei, M:
probabilitatea de tranziţie ~ ΔN M 2 (1.4)
unde, pentru o moleculă aflată într-o stare electronică dată, momentul de

dipol al tranziţiei pentru o tranziţie vibraţională este dat de:
∫
M= Ψν " μ 0( e) Ψν ' d τ
*
(1.5)
Funcţiile de undă ψ ν " şi ψ ν ' reprezintă stările vibraţionale finală şi respec-

tiv iniţială, iar μ 0( e) este momentul de dipol electric permanent în această
stare electronică. Pentru vibraţia unei molecule diatomice, momentul de
dipol electric permanent poate fi extins într-o serie Taylor după distanţa
internucleară de echilibru re :
μ 0(e) =µe+ ⎛⎜ ∂μ ⎞⎟ q +
1 ⎛ ∂ 2 μ ⎞ q2+ …
⎜⎜ 2 ⎟⎟ (1.6)
⎝ ∂r ⎠ re 2 ⎝ ∂r ⎠ re
Aici q=r-re, iar r este distanţa internucleară la un moment dat, şi µe este mo-
mentul de dipol când legatura se află în poziţia de echilibru. Probabilitatea
apariţiei unei tranziţii vibraţionale într-o moleculă diatomică poate fi obţi-
nută substituind forma extinsă a momentului de dipol electric permanent
în ecuaţia momentului de dipol pentru tranziţia vibraţională:
∫ Ψν μ 0(e) Ψν d τ =
*
' '
⎛ ∂μ ⎞ 1
∫
µe Ψν " Ψν ' d τ + ⎜ ⎟ ∫ Ψν ' q Ψν d τ + ⎛ ∂2μ ⎞
∫ Ψν q2 Ψν ' d τ + …
* * *
' ⎜⎜ 2 ⎟⎟ "
⎝ ∂r ⎠ re 2 ⎝ ∂r ⎠ re
(1.7)
138
Primul termen din această ecuaţie este egal cu zero de vreme ce funcţiile de
undă vibraţionale ψ ν " şi ψ ν ' sunt ortogonale. Al doilea termen este diferit
de zero doar dacă momentul de dipol depinde de distanţa internucleară r
⎛ ∂μ ⎞
⎜ ⎟ ≠0 (1.8)
⎝ ∂r ⎠
De aceea, moleculele biatomice prezintă absorbţie vibraţională în spec-
trul IR doar atunci când există o modificare a momentului de dipol în ca-
drul mişcării de vibraţie. Moleculele diatomice homonucleare au momente-
le de dipol zero pentru toate lungimile legăturilor, astfel nu prezintă spec-
tru de absorbţie vibraţional.
Astfel, teoria mecanicii cuantice specifică faptul că absorbţia luminii in-
fraroşii va apărea doar dacă un mod vibraţional implică o modificare a
momentului de dipol şi că nivelele de energie vibraţionale în moleculă sunt
cuantificate. Teoria ne spune de asemenea şi faptul că tranziţiile pot avea
loc doar între nivele de energie adiacente, deoarece integrala din cel de-al
doilea termen pentru polinoamele Hermite care descrie funcţia de undă a
oscilatorului armonic, este diferită de zero doar dacă Δv= ± 1.
5. Legea Lambert-Beer
Domeniul spectral IR al radiaţiei electromagnetice este poziţionat între
domeniul vizibil şi cel al microundelor. Prin convenţie, domeniul spectral
IR este subdivizat în domeniul IR apropiat (Near Infrared Region - NIR), IR
mijlociu (Mid Infrared Region - MIR) şi IR îndepărtat (Far Infrared Region -
FIR) (Figura 4). Spectrele IR discutate în această lucrare sunt toate din do-
meniul spectral MIR.
Figura 4. Domeniile spectrului electromagnetic şi subdiviziunile domeniului IR.
139
Spectrul IR se obţine prin înregistrarea intensităţii radiaţiei în lipsa pro-
bei de analiză (spectrul background) şi a intensităţii radiaţiei IR după ce
aceasta trece prin probă. În urma trecerii prin probă, intensitatea fasciculu-
lui se va atenua datorită absorbţiei de radiaţie de către analit, precum şi a
împrăştierii radiaţiei la interfaţa şi în interiorul probei (Figura 5a). Astfel,
spectrul IR reprezentat va fi dat de mărimea:
T= Is/IR
unde, T este transmitanţa, Is intensitatea radiaţiei IR după, iar IR înainte de a
traversa radiaţia proba. Valorile transmitanţei sunt între 0 şi 1, sau 0–100%
pentru transmitanţa exprimată în procente.
Între transmitanţă şi concentraţia unui compus relaţia este logaritmică.
De aceea, pentru o reprezentare mai convenientă, în majoritatea cazurilor,
în locul transmitanţei se foloseşte o altă mărime, absorbanţa A:
1
A = lg = − lg T
T
Relaţia dintre transmitanţă şi absorbanţă în funcţie de concentraţie este
reprezentată în Figura 5b
Figura 5. (a) Atenuarea unui fascicul de radiaţie la refelexia interfeţei probei, împrăştierea de către
particule şi absorbţia analitului. (b) Relaţia dintre transmitanţă, T, şi absorbanţă, A, în funcţie de
concentraţia unui compus ipotetic.
În mod independent, Bouguer în 1729 şi Lambert în 1760, au stabilit că

la concentraţie constantă, absorbanţa este direct proporţională cu grosimea
probei, iar Beer în 1852 a observat că dacă grosimea probei este constantă,
absorbanţa este proporţională cu concentraţia. Combinarea acestor observa-
ţii a dus la legea Lambert-Beer, ce exprimă absorbanţa:
140
A = a⋅d ⋅c (I.2)
unde a este absorbtivitatea – o constantă de proporţionalitate a moleculei la
o lungime de undă specifică, d este lungimea drumului optic prin probă, iar
c reprezintă cocentraţia substanţei analizate.
Concluzionând, spectroscopia IR oferă atât informaţii moleculare cali-
tative, prin modurile de vibraţie specifice fiecărei molecule, cât şi informaţii
cantitative, aşa cum rezultă din legea Lambert-Beer.
6. Instrumentaţia şi metodologia obţinerii spectrelor IR

Odată cu introducerea spectroscopiei transformată Fourier (FTIR) prin-
cipalele dezavantaje ale spectroscopiei ”clasice” dispersive IR au putut fi
înlăturate. Pe scurt, spectroscopia FTIR nu mai înregistrează intensitatea la
fiecare lungime de undă, în mod secvenţial, la o lungime de undă după
alta, şi de asemenea, spre deosebire de spectrometrele dispersive nu necesi-
tă prismă sau reţea de difracţie monocromatoare, unde apar pierderi majore
în energia emisă de sursa IR la trecerea prin diferite fante de intrare şi ieşi-
re.
În spectroscopia FTIR, se aplică modularea interferometrică a radiaţiei
(Figura 6). Pentru aceasta, un divizor de undă, de regulă din KBr acoperit
cu un film de germaniu, împarte radiaţia în două fascicule, un fascicul fiind
direcţionat către o oglindă fixă, iar celălalt fascicul către o oglindă mobilă
(Figura 6). Aceste două fascicule sunt reflectate înapoi pe divizorul de un-
dă, după care se recombină, intensitatea fasciculului variind în timp, datori-
tă alternării interferenţei constructive şi destructive în funcţie de diferenţa
de drum optic dintre cele două oglinzi, la fiecare moment de timp. Astfel,
fiecare parcurs al oglinzii mobile este caracterizat de o interferogramă în
funcţie de timp.
Diferenţa de drum δ este proporţională cu timpul t, deoarece oglinda
mobilă se deplasează cu viteză constantă v, astfel că δ = 2vt. Prin folosirea
unui algoritm de transformată Fourier rapidă (Fast Fourier Transform - FFT
algorithm), interferograma în funcţie de timp, I(δ), este convertită într-o
interferogramă în funcţie de frecvenţă, I( v ), folosind următoarea relaţie:
I (δ ) = 0.5 H (v ) I (v ) cos 2πvδ I (δ )
unde H( v ) este un factor de corecţie dependent de numărul de undă şi de
caracteristicile spectrometrului. Interferograma convertită în domeniul
frecvenţelor se numeşte spectru de tip single-beam.
141
IR-light source
Figura 6. Spectrometrul FTIR. (a) Schema bloc a componentelor de bază ale unui spectrometru IR.
(b) Principiul de funcţionare a unui interferometru Michelson format din sursă de lumină, divizor de
undă, oglindă fixă, oglindă mobilă, detector şi probă (panel sus). Oglinda mobilă a interferometrului
(panel sus) produce un semnal sinusoidal la detector pentru fiecare frecvenţă modulată (panel cen-
tral). Pentru sursa IR, cu domeniu spectral de frecvenţe larg, semnalele modulate se suprapun şi
formează o interferogramă complexă (panel jos).
Spectrometrele FTIR prezintă mai multe avantaje faţă de instrumentele

convenţionale IR dispersive, incluzând o îmbunătăţire dramatică a raportu-
lui semnal-zgomot (S/N), obţinută prin multiplexare (detectarea simultană
a tuturor frecvenţelor), reducerea timpului de scanare, precum şi un câştig
mai mare în energia radiativă. Un alt avantaj important este reproductibili-
tatea excelentă în lungimea de undă a spectrometrelor FTIR, datorită utili-
zării unui laser de referinţă intern (de regulă HeNe, 632.8 nm ), ceea ce
permite manipularea datelor spectrale, cum ar fi scăderea, adunarea sau
scalarea spectrelor cu un grad foarte ridicat de acurateţe. De asemenea,
progresul spectroscopiei FTIR a fost facilitat şi de dezvoltarea calculatoare-
lor personale, ce permit utilizarea de programe soft complexe, pentru apli-
caţii calitative şi cantitative.
Pentru partea practică a acestei lucrări, spectrele au fost înregistrate cu
un spectrometru Jasco FTIR-6200 cuplat cu un microscop IR Jasco IRT-5000
(Figura 7).
142
Figura 7. Aparatura IR Jasco: spectrometrul FTIR-6200 şi microscopul IRT-5000.
Principalele părţi componente ale spectrometrului FTIR sunt sursa de

emisie, interferometrul şi detectorul.
Sursa de emisie IR este componenta cea mai simplă a instrumentului,
constând într-un filament incadescent (10000C).
Interferometrul este de tip Michelson, iar parcursul maxim al oglinzii
mobile determină rezoluţia spectrală a spectrometrului.
Alegerea detectorului este legată de aplicaţiile abordate. Astfel dacă se
urmăreşte de exemplu cinetica unei reacţii chimice, este absolut necesară
folosirea unui detector de tip MCT (Mercury Cadmium Telluride). Acestea
sunt de două tipuri:
MCT A, detector de foarte înaltă sensibilitate în domeniul spectral
650-7800 cm-1 ce permite înregistrarea rapidă a spectrelor (până la ns), şi
MCT B, detector de înaltă sensibilitate în domeniul spectral 400-7800
cm-1, de asemena pentru înregistrări rapide. De menţionat că detectoarele
MCT necesită răcirea cu azot lichid.
Detectoarele de tip DTGS (Deuterated L-Alanine doped Triglycene
Sulphate) lucrează la temperatura camerei într-un domeniu spectral larg
10-7800 cm-1, însă sensibilitatea acestora este de până la două ordine de
mărime mai mică faţă de detectoarele MCT.
De menţionat însă că domeniul spectral de detecţie al spectrometrului
este limitat de fereastra din faţa detectorului (de regulă KBr) precum şi de
divizorul de undă (beamsplitter, de regulă din KBr acoperit cu un strat de
Ge), astfel că spectrometrele IR uzuale nu permit înregistrarea spectrelor
sub 400 cm-1.
Spectrometrul FTIR-6200 permite înregistrarea spectrelor IR în modul
transmisie, pentru acest mod fiind necesară prepararea în prealabil a probe-
143
lor sub formă de dispersie în pastile KBr. Tot pentru măsurători IR în
transmisie se poate presa proba între două discuri/ferestre dintr-un mate-
rial ce nu absoarbe (este transparent) în domeniul IR mijlociu, de exemplu
ZnSe, Si, Ge, KBr etc.
Microscopul IRT-5000 este dotat cu un obiectiv tip Cassegrain şi unul
de tip ATR (Attenuated Total Reflectance). Obiectivul de tip Cassegrain se
pretează doar pentru probe plane (filme, suprafeţe lucioase etc.). În preala-
bil, la folosirea obiectivului Cassegrain, se înregistrează spectrul back-
ground prin focalizarea pe oglinda de aur, un accesoriu din dotare.
Modul de analiză ATR (Attenuated Total Reflection) este utilizat pen-
tru investigarea probelor lichide şi solide. De asemenea, modul ATR se pre-
tează pentru caracterizarea materialelor care sunt fie prea groase sau prea
puternic absorbante pentru a fi analizate prin spectroscopie în transmisie.
În modul de analiză ATR, radiaţia IR trece printr-un cristal transparent
în infraroşu, cu un indice de refracţie ridicat, astfel că fasciculul IR va efec-
tua reflexii interne succesive în cristalul ATR, aşa cum este prezentat sche-
matic în Figura 8.
Figura 8. Prezentare schematică a tehnicii de analiză ATR-IR.
În vederea analizei, suprafaţa probei este presată astfel încât să fie în

contact optic cu suprafaţa superioară a cristalului ATR. La reflexia internă a
fasciculului, aşa numita undă evanescentă IR pătrunde în afara cristalului
ATR, astfel că o mică parte din radiaţie penetrează proba.
În modul de analiză ATR nu este necesară o preparare în prealabil a
probei în vederea analizei. Dezavantajul constă în limitarea spectrală dato-
rită cristalului ATR, de exemplu pentru un cristal ATR din ZnSe spectrele
se pot înregistra începând de la 650 cm-1.
De regulă, în prealabil, la folosirea modului ATR, se înregistrează spec-
trul background al atmosferei, cristalul ATR fiind în aer.
Folosind microscopul IRT-5000 în modul de analiză ATR, au fost înre-
gistrate spectrele FTIR/ATR a următoarelor substanţe de interes farmaco-
144
logic: aspirina, paracetamol şi deferoxamina. Structurile moleculare ale
acestora sunt prezentate mai jos.
Aspirina Paracetamol
Deferoxamina
Tabloul spectral din Figura 9 prezintă spectrele de absorbţie în IR ale

celor trei substanţe analizate.
Figura 9 Spectrele FTIR/ATR ale substan-

ţelor de interes farmacologic: aspirina, para-
cetamol şi deferoxamina.
145
Spectrele din Figura 9 sunt caracteristice structurilor moleculare corespun-
zătoare, pentru fiecare substanţă putându-se identifica o amprentă spectra-
lă caracteristică. Atribuirea benzilor de vibraţie se poate face pe baza litera-
turii de specialitate comparând spectrele cu cele ale compuşilor asemănă-
tori sau prin calcularea teoretică a spectrelor IR folosind programe dedicate
de chimie cuantică.
7. Bibliografie
1. O. Cozar, Teoria Grupurilor în Fizica Atomului şi Moleculei. 1986, Litografia Universi-
tăţii Babeş-Bolyai, Cluj-Napoca.
2. Chiş, O. Cozar, L. David, Simetrie Moleculară. 2007, Napoca Star, Cluj-Napoca.
3. Chiş, V. Simon, N. Leopold, Probleme de Fizica Moleculei. 2001, Litografia
Universitatii Babes-Bolyai, Cluj-Napoca.
4. T. Iliescu, Spectroscopie Optică Moleculară. 2000, Casa Cărţii de Ştiinţă, Cluj-Napoca.
5. T. Iliescu, S. Cîntă-Pînzaru, D. Maniu, R. Grecu, S. Aştilean, Aplicaţii ale spectroscopi-
ei vibraţionale. 2002, Casa Cărţii de Ştiinţă, Cluj-Napoca.
6. S. Aştilean, Spectroscopia IR şi Raman. Metode şi tehnici moderne de spectroscopie optică.
Vol. I. 2002, Casa Cărţii de Ştiinţă, Cluj-Napoca.
7. N. Leopold, Surface-Enhanced Raman Spectroscopy. Selected Applications. 2009, Napo-
ca Star, Cluj-Napoca.
8. W.E. Smith and G. Dent, Modern Raman Spectroscopy – A Practical Approach. 2005,
Wiley, Chichester, UK.
9. B. Schrader, Ed. Infrared and Raman Spectroscopy - Methods and Applications. 1998,
VCH, Weinheim, Germany.
10. F. Engelke, Aufbau der Moleküle. 1992, Teubner, Stuttgart, Germany.
11. J.M. Hollas, Modern Spectroscopy. 2004, Wiley, Chichester, UK.
146
Tendinţe moderne în spectroscopia de absorbţie IR
Cuprins
1. Introducere ........................................................................................................... 147

2. Aplicaţii analitice ale spectroscopieie IR .............................................................. 148
2.1. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR ......................................... 149
2.1.1. Îmbunăţiri tehnice recente în cuplajul LC-IR..................................... 150
2.2. Cuplajul on-line electroforeza capilară (CE)-IR ........................................... 150
3. Aplicaţii biomedicale ale spectroscopiei IR ........................................................... 151
4. Spectroscopia IR în calitatea şi siguranţa alimentelor ......................................... 154
5. Aplicaţii ale spectroscopiei IR în geoştiinţe.......................................................... 155
6. Bibliografie ........................................................................................................... 157
1. Introducere
Spectroscopia de absorbţie în infraroşu (IR) reprezintă o metodă anali-
tică de investigaţie moleculară utilizată într-un număr vast de domenii.
Publicaţiile din ultimii 5 ani cu tematica legată de spectroscopia de absorb-
ţie IR pot fi clasificate pe domenii ştiinţifice după cum este prezentat în Fi-
gura 1.
147
Figura 1. Clasificarea pe domenii a numărului de publicaţii din ultimii 5 ani cu tematica legată de
spectroscopia de absorbţie IR (www.scopus.com)
Este evident din numărul mare al publicaţiilor în domeniile chimiei şi a

fizicii că spectroscopia de absorbţie IR este în continuare o metodă experi-
mentală de bază în cercetarea fundamentală.
2. Aplicaţii analitice ale spectroscopieie IR

Aplicaţiile analitice ale spectroscopiei IR sunt extrem de diversificate,
astfel că pot fi foarte greu cuprinse într-o prezentare unitară. De aceea s-a
ales în mod reprezentativ cuplarea on-line a detecţiei IR în metodele de
separare cromatografie de lichide (LC) şi electroforeza capilară (CE).
148
Metodele de separare cromatografice şi electroforetice sunt tehnici stan-
dard în laboratoare analitice privind siguranţa şi autenticitatea alimentelor,
detecţia substanţelor interzise, laboratoare medicale, sau laboratoare pentru
studii farmacologice. De regulă, aceste metode de separare sunt cuplate cu
metode de detecţie ca, absorbţia UV-VIS sau spectrometria de masă. Desigur,
aceste metode prezintă avantaje şi dezavantaje în funcţie de analizele efectua-
te. Cert este faptul că în ultimii ani sunt depuse eforturi pentru a cupla cu
spectrometria de masă şi alte metode de detecţie cum ar fi spectroscopia
Raman sau spectroscopia de absorbţie IR.
2.1. Cuplajul on-line cromatografia de lichide (lc)-IR

Cromatografia de lichide este cea mai uzuală metodă instrumentală folo-
sită în laboratoarele analitice pentru separarea amestecurilor fizice, identifi-
care şi cuantificare. Utilitatea spectroscopiei de absorbţie IR, în mod special a
celei cu transformată Fourier (FTIR) ca şi mijloc de detecţie on-line în urma
separării cromatografice a fost demonstrată în mod repetat în ultimii ani
[1-3]. Cuplarea cromatografiei de lichide cu un sistem de detecţie IR se poate
realiza fie în modul off-line după înlăturarea solventului, fie on-line folosind
celule de curgere (flow-through cells) transparente pentru radiaţia infraroşie.
În dectecţia off-line folosirea interfeţelor de înlăturare a solventului duce la
îmbunătăţirea senzitivităţii. Totuşi, abordarea on-line este de preferat datori-
tă unor avantaje majore, incluzând o rezoluţie cromatografică îmbunătăţită,
furnizarea de informaţii în timp real, precum şi posibilitatea de a utiliza solu-
ţii tampon nevolatile [3-4]. Cuplarea on-line permite totodată înregistrarea de
spectre IR pentru analiţi fără o anumită orientare, cristalizare sau degradare
oxidativă, aspecte ce pot interveni la înlăturarea solvenţilor.
Detecţia on-line LC-FTIR a fost limitată în trecut de un anumit număr
de restricţii privind aplicabilitatea în problemele analitice de tip real-life,
fiind pusă la îndoială în mod frecvent viabilitatea acestui cuplaj. Două din-
tre cele mai citate dezavantaje ale cuplajului LC-FTIR sunt următoarele:
i) dificultatea de a corecta absorbţia de fond a solvenţilor şi a
aditivilor folosiţi pentru prepararea fazei mobile, şi
ii) senzitivitatea redusă datorată utilizării unui drum optic re-
dus al celulor pentru a evita saturarea semnalului ce intervi-
ne datorită absorbţiei eluentului.
Cele două subiecte sunt strâns corelate, iar atunci când sunt ambele lu-
ate în considerare este uşor de înţeles numărul limitat de referinţe cu privi-
re la cuplarea on-line a spectroscopiei de absorţie IR cu cromatografia de
lichide.
149
2.1.1. Îmbunăţiri tehnice recente în cuplajul LC-IR
Pentru a creşte senzitivitatea cuplajului LC-FTIR şi pentru a obţine astfel o
limită de detecţie mai bună s-a realizat interfaţarea unui sistem de cromatogra-
fie capilară pentru lichide cu spectrometrul FTIR, [5] folosind o micro-celulă de
curgere [6] cu ferestre transparente în IR mijlociu din CaF2, cu un volum intern
al celulei de 7.5 nL, care a fost plasat pe un condensor al fasciculului optic ata-
şat spectrometrului. Au fost puşi în mişcare gradienţi liniari în limitele
50:50-35:65 [apă(0.05% TFA-acid trifluoroacetic):acetonitril] timp de 15 min
pentru separarea soluţiilor standard de nitrofenoli, obţinându-se astfel on-line,
pe coloană, limite de detecţie între 35-94 ng. Folosind tehnica gradienţilor s-au
putut obţine spectre de înaltă calitate ale analiţilor în urma aplicării unei corec-
ţii ale fondului (semnal background) la datele înregistrate. Acest lucru a fost
evidenţiat de coeficienţii de corelare cuprinşi între 89-96% (în regiunea spectra-
lă 1700-1050 cm-1) şi utilizaţi pentru compararea spectrelor de referinţă cu cele
obţinute în urma injectării în sistemul cromatografic a unei cantităţi între
230-270 ng din analiţi.
Un alt factor de limitare pentru detecţia IR cuplată cu cromatografia de
lichide este legată de absorbţia puternică a apei în domeniul spectral MIR.
Dezvoltarea din ultimii ani a unei noi tehnologii laser pentru surse IR, QCL
- quantum-cascade laser, duce la o nouă abordare a detecţiei IR on-line
[7-10] folosind noi dispozitive [11]. Avantajul surselor IR de tip QCL constă
în posibilitatea reglării lungimii de undă a laserului prin reglarea tempera-
turii de funcţionare [12]. Prin reducerea dimensiunii şi a costurilor aparatu-
rii se conturează o direcţie clară în ceea ce priveşte detecţia on-line IR dedi-
cată cromatografiei de lichide, facilitând o serie de noi aplicaţii. Urmând
studii anterioare [7], Kuligowski et al. [12] au folosit două lasere QCL pen-
tru detecţia on-line în cromatografia de lichide de înaltă performanţă. Un
set-up optic bazat pe trei oglinzi de aur şi un separator de fascicule din
ZnSe a fost folosit pentru a direcţiona lumina emisă de laser printr-o celulă
fluidică cu un drum optic de 52 µm către un detector MCT
(mercury-cadmium-telluride). Sistemul a fost utilizat pentru separarea a
opt constituenţi ai vinului şi ai sucului de struguri.
2.2. Cuplajul on-line electroforeza capilară (CE)-IR

Electroforeza capilară (CE) a devenit o tehnică de separare importantă,
mai ales în analizele bio-chimice din cauza eficienţei mari a separării cât şi
consumului redus de substanţă [13-15]. Separarea apare în urma aplicării
unei tensiuni înalte, fapt care duce la o curgere electro-osmotică în capilar.
150
De obicei, detecţia în CE este dificilă, din cauza concentraţiei mici de sub-
stanţă disponibilă pentru detecţie, iar în cazul detecţiei UV-Vis
sensitivitatea este limitată de diametrul mic al capilarului.
Pentru detecţia prin spectroscopia infraroşie mijlocie s-au raportat mă-
surători atât off-line cât şi on-line. Recent însă, tot mai multe studii arată că
detecţia on-line FTIR este utilizată cu succes.
În măsurători de transmisie folosind celule transparente manufacturate
special pentru IR o parte din spectru este blocat din cauza absorbţiei puter-
nice a fazei lichide. Detecţia on-line bazată pe tehnica reflexiei totale atenu-
ate ocoleşte această problemă prin reducerea eficientă a drumului optic.
Utilitatea detecţiei FTIR on-line a fost demonstrată prin separarea şi cuanti-
ficarea adenosinei, guaninei şi a adenosinei-5’ monofosfat în domeniul ng
folosind electroforeza capilară convenţională [16]. Un alt studiu prezintă
separarea şi detecţia IR a 5 analiţi, rezultatele fiind foarte bune din punct de
vedere calitativ şi cantitativ [17]. Maturitatea cuplajului CE-FTIR on-line
este considerată prin separarea şi cuantificarea cu succes a glucidelor din
băuturi răcoritoare [18].
Informaţia moleculară specifică livrată de spectrul IR poate fi interpre-
tată în mod avantajos, aşa cum s-a arătat la discriminarea on-line de
enantiomeri în timpul separării chirale într-un mediu neapos. Interacţiunea
moleculelor analit cu selectorul chiral a produs diastereomeri cu un spectru
IR clar, distinct, permiţând discriminarea moleculelo analit [19].
Un alt domeniu în care spectrometria IR poate furniza informaţii im-
portante este analiza proteinelor. Aplicaţiile principale în acest domeniu
sunt cele privind dinamica proteinelor şi elucidarea structurii secundare.
Acest ultim aspect este cel care face spectroscopia FTIR o metodă de analiză
biomoleculară foarte atrăgătoare [20]. Acest articol raportează prima sepa-
rare a unor proteine în electroforeza capilară cu detecţia FTIR on-line.
3. Aplicaţii biomedicale ale spectroscopiei IR

Analiza FTIR este folosită într-o serie largă de studii biologice cuprin-
zând măsurători pe diverse ţesuturi ca: piele [21-25], col uterin [26-34],
plămân [35-37], sân [38-42], gastrointestinal [43-46], creier [47-49], bucal
[50], limfoid [51], limfocite [52], limfon non-Hodgkin’s [53], prostată
[54-55], colon [56-59], fibroblast [60], os [61] sau ţesut tumoral [62]. Alte
studii relevante au fost efectuate pe bacterii [63-64] ADN [65], medicamente
anti-cancer [66], sau pentru monitorizarea glucozei [67].
Wood et al. [26] au evidenţiat potenţialul spectroscopiei FTIR ca in-
strument de biodiagnostic în cancerul de col uterin. Spectrele înregistrate
151
pe celule epiteliale normale prezintă benzi intense ale glicogenului la 1022
cm-1 şi 1150 cm-1, şi totodată o pronunţată bandă atribuită întinderii sime-
trice a grupării fosfat la 1078 cm-1. Caracteristicile spectrale care sugerează
transformări de malignitate sunt în principal modurile de vibraţie simetrice
şi antisimetrice ale grupării fosfat precum şi reducerea în intensitate a ben-
zii atribuite glicogenului. Acest studiu a demonstrat potenţialul de aplicabi-
litate a tehnologiei automatizate FTIR în monitorizarea cancerului de col
uterin în mediul clinic. Privind aceeaşi afecţiune, Wood et al. [28] au inves-
tigat cu microspectroscopia FTIR tipurile de celule şi potenţialele variabile
care ar duce la confuzii în diagnosticarea malignităţii acestui ţesut. Scopul
acestui studiu a fost determinarea eficienţei spectroscopiei IR în diagnosti-
care şi în acest sens s-a descoperit că leucocitele, respectiv limfocitele au o
caracteristică spectrală în zona legăturii fosfodiester (1300-900 cm-1), suge-
rând prin aceasta modificări spre malignitate.
Studiul iniţiat de Mordechai et al. [30] pe melanom fixat cu formalină şi
pe celule canceroase de col uterin bazat pe microspectroscopia FTIR a ur-
mărit detecţia unor biomarkeri comuni care apar în cele două afecţiuni,
încercând astfel diferenţierea ţesutului canceros de cel normal. Spectrele
înregistrate au fost analizate privind posibilele modificări în ceea ce priveş-
te nivelul biomoleculelor: ADN, ARN, fosfaţi şi carbohidraţi. Nivelul aces-
tora din urmă s-a dovedit a fi un bun indicator în diagnosticarea şi detecţia
cancerului de col uterin.
Wang et al. [35] s-au concentrat asupra studiilor microscopice FTIR ale
celulelor canceroase din fluidul pleural. Rezultatele lor demonstrează că
sunt diferenţe semnificative între celulele normale din plămân şi cele tumo-
rale. Diferenţa considerabilă este reprezentată de raportul benzilor de la
1030 şi 1080 cm-1, atribuită glicogenului şi grupării fosfat din acizii nucleici.
Un avantaj major al acestei metode îl reprezintă posibilitatea de a obţine
rezultate determinante foarte rapid.
Într-un alt studiu, Yano et al. [36] se bazează pe posibilitatea de achizi-
ţie directă de pe ţesut de plămân canceros sau normal prin microscopia
FTIR, în vederea implementării acesteia ca şi tehnică medicală în acest do-
meniu. Pentru evaluarea cantitativă a malignităţii s-au ales intensităţile
benzilor de la 1045 şi 1465 cm-1, atribuite glicogenului şi colesterolului.
Acestea reprezintă un factor discriminant privind ţesutul de plămân cance-
ros şi cel normal.
Zona de interes a studiilor comparative de spectroscopie IR pentru Fa-
bian et al. [38] a fost reprezentată de cancerul la sân, a culturilor celulare şi
a xenogrefelor de acest tip. La nivel macroscopic, probele păreau să fie
152
omogene din punct de vedere al ţesutului conjunctiv care a fost ales ca şi
amprentă spectrală. Ulterior s-au detectat modificări în conţinutul de cola-
gen şi a depozitării celulelor lipidice. S-a concluzionat că un studiu de spec-
troscopie IR poate deveni foarte util în interpretarea corectă şi înţelegerea
pe deplin a patologiei acestui ţesut.
Lucassen et al. [23] a utilizat spectroscopia ATR-FTIR (spectroscopia IR
cu tranformată Fourier în reflexie totală atenuată) pentru a măsura gradul
de hidratare al corneei. Se presupune că pentru această apreciere este nece-
sară obţinerea de informaţii fundamentale privind pătrunderea şi pierderea
lichidului apos de la nivelul corneei. Astfel, urmărind vibraţia de deforma-
re a apei în combinaţie cu cea de întindere a legăturii OH în cazul unei su-
prafeţe normal hidratată de cornee şi a uneia nehidratate suficient din cau-
za unor ocluzii, s-a reuşit determinarea cantitativă a apei în fiecare caz.
Fujioka et al. [43] au raportat diferenţierea spectroscopică între ţesutul
gastric normal şi cel tumoral. Utilizând spectroscopia FTIR s-a realizat
această discriminare cu o acurateţe de 88.6%. Weng et al. [44] au studiat
tumori de stomac, intestin subţire, colon, rect, ficat şi a altor părţi ale siste-
mului digestiv cu ajutorul fibrei optice FTIR şi a spectroscopiei FT-Raman,
achiziţia de informaţii având loc la contactul cu o sondă ATR. Rezultatele
au indicat faptul că banda atribuită întinderii C=O a adipozei poate fi iden-
tificată în spectrele probelor de ţesut normal, însă foarte rar în cele de ţesut
tumoral, urmărindu-se raportul benzilor de la 1460 şi 1400 cm-1. Li et al.
[46] au realizat o investigare a biopsiilor cu spectroscopia ATR-FTIR pri-
vind afecţiuni ca şi: gastrită superficială, cancer de stomac şi gastrită croni-
că prin comparare cu ţesut normal şi a obţinut o acurateţe în diagnostic de
90%, 74%, 66%, respectiv 90%.
Choo et al. [47] au aplicat spectroscopia IR în diagnosticarea afecţiunii
Alzheimer investigând spectre achiziţionate pe ţesut uman de sistem ner-
vos central. Prin utilizarea mai multor metode multivariate au arătat că este
posibil să se clasifice datele spectroscopice non-subiectiv, respectiv să dife-
renţieze materia albă de cea cenuşie cu acurateţe de 90%.
Fukuyama et al. [50] au folosit spectroscopia FTIR pentru a studia dife-
renţele între celule canceroase gingivale şi celulele epiteliale gingivale nor-
male. Prin comparare cu spectre ale cheratinei pure şi ale colagenului s-au
obţinut rezultate care să susţină introducerea acestor investigaţii în clinici.
Andrus şi Strickland [51] au monitorizat gradual tumori limfoide cu
ajutorul spectroscopiei FTIR, urmărind absorbţia atribuită colagenului.
Dovbeshko et al. [62] au ales un studiu de reflexie FTIR prin absorpţie am-
plificată la suprafaţă a acizilor nucleici din celulele tumorale, dar acest stu-
153
diu a ridicat anumite probleme, respectiv apariţia prin interpretarea spec-
trelor a unor configuraţii “ciudate” de baze şi zaharuri.
În concluzie, spectroscopia de absorbţie IR reprezintă o metodă senziti-
vă în ceea ce priveşte analiza malignităţii ţesuturilor cu potenţial real pen-
tru aplicaţii clinice în detecţia şi diagnosticarea a diverse afecţiuni.
4.Spectroscopia IR în calitatea şi siguranţa alimentelor

Spectroscopia FTIR este o tehnologie promiţătoare pentru industria
agroalimentară deoarece permite măsurători simple, rapide şi nedistructive
ale compuşilor chimici. Progresul în instrumentaţia FTIR combinat cu dez-
voltarea unor metode statistice multivariate de analiză a datelor fac această
tehnologie ideală pentru monitorizare rapidă cât şi caracterizarea compuşi-
lor din alimente la nivel de urme, până la părţi pe milliard (ppb). Datorită
utilizării tehnicii FTIR în aplicaţii de control a calităţii şi a procesării, indus-
tria agroalimentară este deja familiarizată cu această tehnologie şi cu poten-
ţialul ei de implementare în monitorizarea alimentelor.
Spectroscopia MIR a fost folosită în autentificarea sucurilor cu ingredi-
ente de înaltă calitate contrafăcute din surse inferioare. Rodiile sunt foarte
apreciate pentru activitatea lor antioxidantă cât şi pentru potenţialele efecte
chemopreventive împotriva cancerului de prostată [68]. Spectre MIR au
fost folosite pentru a diferenţia sucurile concentrate pure din rodii de cele
contrafăcute cu suc de struguri concentrat (2%-14% v/v) folosind analiza
de componente principale (PCA) în regiunea IR 1780-1685 cm-1, atribuită în
principal întinderii C=O [68].
În mod similar, spectroscopia MIR a fost de mare succes în diferenţie-
rea varietăţilor de fructe şi a originilor geografice. Un parametru important
în monitorizarea autenticităţii piureurilor, preparatelor şi a gemurilor de
fructe este procentul care desemnează conţinutul de fructe, iar pentru fieca-
re produs s-au stabilit limite inferioare ale acestuia. Regresia de tip parţial
least-squares (PLS) ce corelează conţinutul de fructe şi spectrele FTIR cen-
trate pe o bandă la 1729 cm-1 a asigurat o bună calibrare statistică la analiza-
rea gemului de căpşuni [69]. He et al. [70] au analizat afine, struguri Con-
cord, merişor, nectar de prune şi sucuri de mere de la diferiţi producători.
Spectre înregistrate după extracţia fazei solide din sucuri a îmbunătăţit pu-
terea de modelare pentru compararea cu sucul pur şi a recunoaşterii prin
folosirea unui tipar (soft independent analysis of class analogy (SIMCA)) şi
a permis diferenţierea sucurilor de origini diferite. Extracţia fazei solide a
minimizat interferenţa zahărului cu spectrele şi a izolat componentele feno-
lice care au oferit o amprentă unică în autentificarea sucurilor. Autorii au
154
atras atenţia asupra limitărilor acestei metode, inclusiv în procesul de ex-
tracţie şi asupra nevoii unui spectru larg de probe pentru a îmbunătăţi repe-
tabilitatea acestui model, dar au subliniat că această metodă este o îmbună-
tăţire reală comparativ cu încercărilor anterioare [70]. Metodele tradiţionale
pentru autentificarea sucurilor de fructe includ cromatografia sau analiza
raportului izotopilor de carbon, niciuna dintre ele fiind foarte practică pen-
tru că sunt costisitoare din punct de vedere al timpului necesar efectuării
lor şi al setărilor pentru controlul de calitate, folosesc solvenţi dăunători şi
monitorizează doar un parametru la un moment dat.
Consumatorii sunt tot mai interesaţi de produse organice şi sunt dis-
puşi să plătească un preţ mai mare pentru aceste produse. Industria de vi-
nuri a recunoscut acest trend şi astfel în multe podgorii se pune accentul pe
vinuri organice. Până în 2009 nu a fost o metodă standardizată în industria
viticolă care să permită determinarea eficientă a compoziţiei şi autenticităţii
vinurilor organice [71]. Cozzolino et al. [71] au fost primii care au folosit
tehnologia IR pentru a clasifica vinuri comerciale provenite de la sisteme de
producţie organică şi anorganică. Aproape 200 de soiuri de vinuri roşii şi
albe din 13 regiuni din Australia au fost analizate folosind spectroscopia
MIR combinată cu PCA, regresia PLS discriminantă (DPLS), şi analiza dis-
criminantă liniară (LDA). DPLS a clasificat corect 85% din vinurile organi-
ce, iar LDA a reuşit să clasifice 75%. În general, rezultatul analizei PCA a
separat vinurile organice de cele anorganice, dar a existat o uşoară supra-
punere [71]. Autorii aduc la cunoştinţă că spectroscopia MIR combinată cu
tehnici chemometrice au permis o discriminare bună între probele produse
în sisteme de producţie organică şi anorganică. Explorarea rezultatelor ana-
lizei PLS nu a desemnat un parametru chimic individual care să fi explicat
diferenţierea vinurilor, ci mai degrabă mai mulţi compuşi chimici, inclu-
zând compuşi fenolici volatili şi nevolatili, care ar contribui la discrimina-
rea vinurilor.
5. Aplicaţii ale spectroscopiei IR în geoştiinţe

Concentraţia şi distribuţia apei în rocile vulcanice din Sumisu Caldera
şi Vulcanul Torishima din arcul Izu-Bonin (Japonia) au fost studiate de
Wysoczanski şi Tani [72]. Rezultatele au fost comparabile cu cele obţinute
prin metoda convenţională bazată pe micro-FTIR, rezultând o precizie si-
milară şi o rezoluţie spaţială chiar mai bună, estimată la circa 5µm [72]. Ma-
sa brută a dacitelor din Sumisu Caldera conţine între 1.2-1.4 % (wt) H2O, iar
pentru obsidian 0.2 % (wt) H2O, valori corespunzătoare cu saturarea apei la
presiunile de erupţie.
155
Este bine cunoscut faptul că mineralele anhidride nominale formate în
condiţii de înaltă presiune conţin urme de specii hidride [73-74]. Numeroa-
se studii recente au arătat că specii volatile ca şi CO2 şi specii hidride ca şi
OH şi H2O pot fi de asemenea încorporate în circumstanţe speciale în majo-
ritatea mineralelor din crustă [75-77]. Astfel se susţine ideea că o analiză
amănunţită a speciilor volatile din minerale poate oferi informaţii cantitati-
ve şi calitative privind activitatea apei şi a CO2, fugacitatea oxigenului şi
compoziţia fluidelor în sistemele minerale, aceste studii fiind folositoare în
determinarea genezei şi a evoluţiei sistemelor magmatice [78].
Analiza apei în minerale [79] şi roci [80] cu ajutorul spectroscopiei FTIR
este aproape o tehnică de rutină, analiza spectroscopică a CO2 fiind comună
în studiul rocilor, dar teste efectuate pe incluziunile de fluide din minerale
sunt rare [81]. Della Ventura et al. [76] au studiat un set de cristale leucite
transparente atent selecţionate provenind din vulcanul Alban Hills (Roma,
Italia). O microanaliză preliminară a acestor probe a dezvăluit o absorpţie
în regiunea 3000-4000 cm-1 datorată vibraţiilor de întindere a apei, fiind 3
peak-uri bine definite la 3604 cm-1, la 3500 cm-1 şi la 3245 cm-1. Concluzia lui
Della Ventura et al. a fost că imagistica FTIR a distribuţiei apei în leucite
reprezintă un instrument valoros în monitorizarea evoluţiei sistemelor
magmatice.
Pe lângă caracterizarea cristalo-chimică, studiul speciilor volatile în
minerale are aplicaţii şi în alte domenii. De fapt, mineralele au o largă răs-
pândire în istoria rocilor ornamentale sau a pigmenţilor utilizaţi în operele
de artă, de aceea aceste materiale merită ca toată atenţia, în special privind
studiile arheologice şi problemele de conservare. În acest context, conţinu-
tul de CO2 din lazurite a fost propus ca şi indicator al sursei naturale
ultramarine de pigmenţi. Aplicând fluorescenţa de raze X, colecţia de ima-
gini obţinute prin scanare a arătat, precum era de aşteptat, faptul că acel
conţinut de CO2 depinde puternic de faza mineralului [82].
Studiile care tratează incluziunile de fluide sunt foarte utile în definirea
rolului fluidelor în geneza, procesele de deformare cât şi a unui “geoter-
mometru” privind rocile din crusta terestră [83]. Aceste incluziuni deter-
mină totodată şi dezvoltarea modelelor restrictive în geneza depozitării
minereurilor şi oferă informaţii pentru exploatarea geotermală şi petrolieră
în producţia la nivel industrial.
Mulţumiri pentru suportul acordat de Drd. Nicoleta E. Mircescu şi Mast.

Krisztian Herman la redactarea acestui material.
156
6. Bibliografie
1. G. W. Somsen, C. Gooijer and U. A. T. Brinkman, Journal of Chromatography A 856
(1999) 213-242;
2. M. Gallignani and M. D. Brunetto, Talanta 64 (2004) 1127-1146;
3. M. Kolhed, B. Lendl and B. Karlberg, Analyst 128 (2003) 2-6;
4. I. Surowiec, J. R. Baena, J. Frank, T. Laurell, J. Nilsson, M. Trojanowicz and B.
Lendl, Journal of Chromatography A 1080 (2005) 132-139;
5. G. Quintas, J. Kuligowski and B. Lendl, Analytical Chemistry 81 (2009) 3746-3753;
6. P. Svasek, E. Svasek, B. Lendl and M. Vellekoop, Sensors and Actuators a-Physical 115
(2004) 591-599;
7. A. Edelmann, C. Ruzicka, J. Frank, B. Lendl, W. Schrenk, E. Gornik and G. Strasser,
Journal of Chromatography A 934 (2001) 123-128;
8. S. Schaden, M. Haberkorn, J. Frank, J. R. Baena and B. Lendl, Applied Spectroscopy 58
(2004) 667-670;
9. B. Lendl, J. Frank, R. Schindler, A. Muller, M. Beck and J. Faist, Analytical Chemistry
72 (2000) 1645-1648;
10. http://www.quantared.com Vienna, Austria
11. http://daylightsolutions.com
12. J. Kuligowski, G. Quintas and B. Lendl, Applied Physics B-Lasers and Optics 99 (2010)
833-840;
13. N. Anastos, N. W. Barnett and S. W. Lewis, Talanta 67 (2005) 269-279;
14. P. G. Righetti, Journal of Chromatography A 1079 (2005) 24-40;
15. M. Lammerhofer, Journal of Chromatography A 1068 (2005) 3-30;
16. M. Kolhed, P. Hinsmann, P. Svasek, J. Frank, B. Karlberg and B. Lendl, Analytical
Chemistry 74 (2002) 3843-3848;
17. M. Kolhed, P. Hinsmann, B. Lendl and B. Karlberg, Electrophoresis 24 (2003) 687-692;
18. M. Kolhed and B. Karlberg, Analyst 130 (2005) 772-778;
19. P. Hinsmann, L. Arce, P. Svasek, M. Lammerhofer and B. Lendl, Applied
Spectroscopy 58 (2004) 662-666;
20. A. Barth and C. Zscherp, Quarterly Reviews of Biophysics 35 (2002) 369-430;
21. P. T. T. Wong, S. M. Goldstein, R. C. Grekin, T. A. Godwin, C. Pivik and B. Rigas,
Cancer Research 53 (1993) 762-765;
22. S. Sukuta and R. Bruch, Lasers în Surgery and Medicine 24 (1999) 382-388;
23. G. W. Lucassen, G. N. V. Veen and J. A. Jansen, Journal of Biomedical Optics 3 (1998)
267-280;
24. L. M. McIntosh, M. Jackson, H. H. Mantsch, M. F. Stranc, D. Pilavdzic and A. N.
Crowson, Journal of Investigative Dermatology 112 (1999) 951-956;
25. B. W. Barry, H. G. M. Edwards and A. C. Williams, Journal of Raman Spectroscopy 23
(1992) 641-645;
26. B. R. Wood, M. A. Quinn, F. R. Burden and D. McNaughton, Biospectroscopy 2
(1996) 143-153;
27. L. Chiriboga, P. Xie, H. Yee, V. Vigorita, D. Zarou, D. Zakim and M. Diem,
Biospectroscopy 4 (1998) 47-53;
28. B. R. Wood, M. A. Quinn, B. Tait, M. Ashdown, T. Hislop, M. Romeo and D.
McNaughton, Biospectroscopy 4 (1998) 75-91;
29. R. Sindhuphak, S. Issaravanich, V. Udomprasertgul, P. Srisookho, S. Warakamin, S.
Sindhuphak, R. Boonbundarlchai and N. Dusitsin, Gynecologic Oncology 90 (2003) 10-14;
30. S. Mordechai, R. K. Sahu, Z. Hammody, S. Mark, K. Kantarovich, H. Guterman, A.
Podshyvalov, J. Goldstein and S. Argov, Journal of Microscopy-Oxford 215 (2004) 86-91;
157
31. L. Chiriboga, P. Xie, V. Vigorita, D. Zarou, D. Zakim and M. Diem, Biospectroscopy 4
(1998) 55-59;
32. P. T. T. Wong, S. Lacelle, M. F. K. Fung, M. Senterman and N. Z. Mikhael,
33. M. F. K. Fung, M. K. Senterman, N. Z. Mikhael, S. Lacelle and P. T. T. Wong,
34. U. Utzinger, D. L. Heintzelman, A. Mahadevan-Jansen, A. Malpica, M. Follen and
R. Richards-Kortum, Applied Spectroscopy 55 (2001) 955-959;
35. H. P. Wang, H. C. Wang and Y. J. Huang, Science of the Total Environment 204 (1997)
283-287;
36. K. Yano, S. Ohoshima, Y. Gotou, K. Kumaido, T. Moriguchi and H. Katayama,
Analytical Biochemistry 287 (2000) 218-225;
37. Y. Yang, J. Sule-Suso, G. D. Sockalingum, G. Kegelaer, M. Manfait and A. J. El Haj,
Biopolymers 78 (2005) 311-317;
38. H. Fabian, M. Jackson, L. Murphy, P. H. Watson, I. Fichtner and H. H. Mantsch,
39. R. Eckel, H. Huo, H. W. Guan, X. Hu, X. Che and W. D. Huang, Vibrational
Spectroscopy 27 (2001) 165-173;
40. N. J. Kline and P. J. Treado, Journal of Raman Spectroscopy 28 (1997) 119-&;
41. K. E. Shafer-Peltier, A. S. Haka, M. Fitzmaurice, J. Crowe, J. Myles, R. R. Dasari and
M. S. Feld, Journal of Raman Spectroscopy 33 (2002) 552-563;
42. C. J. Frank, R. L. McCreery and D. C. B. Redd, Analytical Chemistry 67 (1995)
777-783;
43. N. Fujioka, Y. Morimoto, T. Arai and M. Kikuchi, Cancer Detection and Prevention 28
(2004) 32-36;
44. S. F. Weng, X. F. Ling, Y. Y. Song, Y. Z. Xu, W. H. Li, X. Zhang, L. Yang, W. Sun, X.
Zhou and J. Wu, American Clinical Laboratory 19 (2000) 20;
45. S. Mordechai, A. O. Salman, S. Argov, B. Cohen, V. Erukhimovitch, J. Goldstein, O.
Chaims and Z. Hammody, Proceedings of the SPIE 3918 (2000) 66-77;
46. Q. B. Li, X. J. Sun, Y. Z. Xu, L. M. Yang, Y. F. Zhang, S. F. Weng, J. S. Shi and J. G.
Wu, Clinical Chemistry 51 (2005) 346-350;
47. L. P. Choo, J. R. Mansfield, N. Pizzi, R. I. Somorjai, M. Jackson, W. C. Halliday and
H. H. Mantsch, Biospectroscopy 1 (1995) 141-148;
48. G. I. Dovbeshko, N. Y. Gridina, E. B. Kruglova and O. P. Pashchuk, Talanta 53
(2000) 233-246;
49. S. Yoshida, M. Miyazaki, K. Sakai, M. Takeshita, S. Yuasa, A. Sato, T. Kobayashi, S.
Watanabe and H. Okuyama, Biospectroscopy 3 (1997) 281-290;
50. Y. Fukuyama, S. Yoshida, S. Yanagisawa and M. Shimizu, Biospectroscopy 5 (1999)
117-126;
51. P. G. L. Andrus and R. D. Strickland, Biospectroscopy 4 (1998) 37-46;
52. S. Mordechai, J. Mordehai, J. Ramesh, C. Levi, M. Huleihel, V. Erukhimovitch, A.
Moser and J. Kapelushnik C. Nguyen, Application of FTIR microspectroscopy for
the follow-up of childhood leukemia chemotherapy 4491 (2001) 243-250;
53. P. G. Andrus, Technology în Cancer Research & Treatment 5 (2006) 157-167;
54. E. Gazi, J. Dwyer, P. Gardner, A. Ghanbari-Siahkali, A. P. Wade, J. Miyan, N. P.
Lockyer, J. C. Vickerman, N. W. Clarke, J. H. Shanks, L. J. Scott, C. A. Hart and M.
Brown, Journal of Pathology 201 (2003) 99-108;
55. C. Paluszkiewicz and W. M. Kwiatek, Journal of Molecular Structure 565 (2001)
329-334;
56. S. Argov, R. K. Sahu, E. Bernshtain, A. Salman, G. Shohat, U. Zelig and S.
Mordechai, Biopolymers 75 (2004) 384-392;
158
57. T. Richter, G. Steiner, M. H. Abu-Id, R. Salzer, R. Bergmann, H. Rodig and B. Jo-
hannsen, Vibrational Spectroscopy 28 (2002) 103-110;
58. B. Rigas and P. T. T. Wong, Cancer Research 52 (1992) 84-88;
59. B. Rigas, S. Morgello, I. S. Goldman and P. T. T. Wong, Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 87 (1990) 8140-8144;
60. M. Huleihel, A. Salman, V. Erukhimovich, J. Ramesh, Z. Hammody and S.
Mordechai, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 50 (2002) 111-121;
61. R. Smith and I. Rehman, Journal of Materials Science-Materials în Medicine 5 (1994)
775-778;
62. G. I. Dovbeshko, V. I. Chegel, N. Y. Gridina, O. P. Repnytska, Y. M. Shirshov, V. P.
Tryndiak, I. M. Todor and C. I. Solyanik, Biopolymers 67 (2002) 470-486;
63. M. M. Mossoba, S. F. Al-Khaldi, J. Kirkwood, F. S. Fry, J. Sedman and A. A. Ismail,
Vibrational Spectroscopy 38 (2005) 229-235;
64. D. Naumann H. H. J. M. K. A. Mantsch, Infrared and NIR raman spectroscopy în
medical microbiology 3257 (1998) 245-257;
65. K. J. Jalkanen, V. W. Jurgensen, A. Claussen, A. Rahim, G. M. Jensen, R. C. Wade, F.
Nardi, C. Jung, I. M. Degtyarenko, R. M. Nieminen, F. Herrmann, M.
Knapp-Mohammady, T. A. Niehaus, K. Frimand and S. Suhai, International Journal
of Quantum Chemistry 106 (2006) 1160-1198;
66. J. Binoy, J. P. Abraham, I. H. Joe, V. S. Jayakumar, G. R. Pettit and O. F. Nielsen, Jo-
urnal of Raman Spectroscopy 35 (2004) 939-946;
67. M. Tarumi, M. Shimada, T. Murakami, M. Tamura, H. Arimoto and Y. Yamada,
Physics în Medicine and Biology 48 (2003) 2373-2390;
68. H. Vardin, A. Tay, B. Ozen and L. Mauer, Food Chemistry 108 (2008) 742-748;
69. R. Fugel, R. Carle and A. Schieber, Trends în Food Science & Technology 16 (2005)
433-441;
70. J. He, L. E. Rodriguez-Saona and M. M. Giusti, Journal of Agricultural and Food
Chemistry 55 (2007) 4443-4452;
71. D. Cozzolino, M. Holdstock, R. G. Dambergs, W. U. Cynkar and P. A. Smith, Food
Chemistry 116 (2009) 761-765;
72. R. Wysoczanski and K. Tani, Journal of Volcanology and Geothermal Research 156
(2006) 302-314;
73. H. Skogby, Water în Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 155-167;
74. A. Beran and E. Libowitzky H. S. J. R. Keppler, Water în natural mantle minerals II:
Olivine, garnet and accessory minerals 62 (2006) 169-191;
75. E. A. Johnson, Water în Nominally Anhydrous Minerals 62 (2006) 117-154;
76. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, American Mineralogist 93 (2008)
1538-1544;
77. F. Bellatreccia, G. Della Ventura, M. Piccinini, A. Cavallo and M. Brilli, Mineral.
Mag. 73 (2009) 399-413;
78. B. De Vivo, A. Lima and J. D. Webster, Elements 1 (2005) 19-24;
79. E. Libowitzky and G. R. Rossman, Physics and Chemistry of Minerals 23 (1996)
319-327;
80. P. D. Ihinger, R. L. Hervig and P. F. McMillan, Volatiles în Magmas 30 (1994) 67-121;
81. R. L. Linnen, H. Keppler and S. M. Sterner, Canadian Mineralogist 42 (2004)
1275-1282;
82. G. Della Ventura, F. Bellatreccia and M. Piccinini, Rendiconti Lincei-Scienze Fisiche E
Naturali 19 (2008) 141-159;
83. T. Andersen, M. L. Frezzotti and E. A. J. Burke, Lithos 55 (2001) IX-XI;
159
V. SPECTROFLUORIMETRUL
Spectrofluorimetria
Cuprins
1. Consideraţii teoretice............................................................................................ 160
2. Tehnica experimentală ......................................................................................... 164
3. Avantajele spectrofluorimetriei ............................................................................ 166
4. Aplicaţii ale spectrofluorimetriei .......................................................................... 166
5. Aparatura disponibilă .......................................................................................... 169
6. Bibliografie ........................................................................................................... 171
1. Consideraţii teoretice
Fluorescenţa este un fenomen de fotoluminiscenţă (procesul prin care
substanţele absorb lumină şi după aceea reemit lumină cu o lungime de
undă diferită). Din aceeaşi clasă fac parte şi fosforescenţa şi fosforescenţa
întârziată. Prin absorbţie de radiaţie luminoasă moleculele pot fi excitate
prin trecerea unui electron de pe nivelul fundamental pe un nivel excitat.
Energia stării excitate nu poate fi menţinută decât o perioadă foarte scurtă,
molecula dezexcitându-se. Dacă molecula se dezexcită (electronul trece din
starea excitată în starea fundamentală) prin emisie de lumină, procesul se
numeşte fluorescenţă.
Moleculele care au această proprietate, se numesc molecule fluorescente
sau fluorofori. În starea electronică fundamentală moleculele fluorescente se
află într-o configuraţie stabilă, deci nu emit radiaţie de fluorescenţă. Atunci
când radiaţia luminoasă ajunge pe o moleculă fluorescentă, aceasta poate
trece într-o stare electronică excitată (cu energie mai mare) în urma absorbţiei
de energie de la radiaţia luminoasă. Există o mulţime de nivele vibraţionale
ale stării electronice excitate pe care se poate afla o moleculă fluorescentă.
Energia acestor nivele depinde de energia (lungimea de undă) radiaţiei lu-
minoase care produce excitarea. Moleculele fluorescente sunt instabile atunci
când se află pe un nivel vibraţional al stării electronice excitate. De aceea ele
160
trec în cea mai joasă stare electronică excitată, care este semi-stabilă, pierde-
rea de energie este neradiativă, făcându-se prin ciocnirea cu alte molecule.
Intervalul de timp în care o moleculă fluorescentă se află în stare excitată se
numeşte “timp de viaţă“ şi are o valoare foarte mică (între 10-15 şi 10-9 s). Du-
pă acest interval, moleculele fluorescente trec din stare electronică excitată în
stare electronică fundamentală, excesul de energie dintre cele două stări
regăsindu-se în energia radiaţiei luminoase emise în procesul de dezexcitare.
Radiaţia luminoasă de fluorescenţă are energie mai mică decât radiaţia
luminoasă absorbită de moleculă. Deci lungimea de undă a radiaţiei emise
este totdeauna mai mare decât lungimea de undă a radiaţiei absorbite dato-
rită energiei pierdute de moleculă în timpul trecerii pe cea mai joasă stare
electronică excitată.
Molecula fluorescentă poate absorbi energie luminoasă din nou, deci
procesul descris mai sus poate fi repetat. De fapt, procesul de fluorescenţă
este ciclic şi are loc atâta timp cât există o radiaţie luminoasă, care să excite
molecula. Acest fapt este deosebit de util, deoarece înseamnă că o moleculă
poate emite radiaţie de fluorescenţă de mai multe ori. Această proprietate
face ca fluorescenţa să fie o tehnică foarte senzitivă (chiar şi o mică cantitate
de substanţă poate fi detectată).
În realitate, moleculele fluorescente sunt instabile structural în intervalul
de timp cât se află în stare de excitaţie (timpul de viaţă), ceea ce face posibilă
degradarea ei. O radiaţie luminoasă de mare intensitate poate provoca modifi-
carea structurii moleculei fluorescente, astfel încât aceasta să nu mai emită
radiaţie de fluorescenţă. Acest proces este numit “photobleaching“.
În urma absorbţiei unui foton de către o moleculă, sunt posibile urmă-
toarele procese (ilustrate în figura 1):
- conversia internă (IC) - moleculele aflate pe diferite nivele vibraţionale
se relaxează pe nivelul fundamental al stării electronice respective; relaxa-
rea vibraţională se face prin pierderea de energie în urma ciocnirilor dintre
molecule (10-14 - 10-11 s).
- intersystem crossing (ISC) - unele molecule aflate în prima stare elec-
tronică excitată, stare de singlet (S1), pot trece în prima stare de triplet (T1).
Acest proces se poate observa la atomii grei (Br, I) sau la metale.
- fosforescenţa - moleculele aflate în starea de triplet pot să se dezexcite
prin emisia unui foton. O tranziţie triplet-singlet este mult mai puţin pro-
babilă decât o tranziţie singlet-singlet. Timpul de viaţă a unei stări excitate
de triplet poate ajunge până la 10 s, deci emisia de fosforescenţă poate con-
tinua şi după încetarea iradierii iniţiale. De obicei fosforescenţa apare doar
la temperaturi scăzute sau în medii cu vâscozitate mare (dezexcitatea nive-
lului T1 se poate face şi prin conversie internă sau alte procese neradiative).
161
Figura 1. Diagrama Perrin-Jablonski.
- fluorescenţa, este proprietatea moleculelor de a emite radiaţie electro-

magnetică la trecerea de pe prima stare excitată de singlet S1 pe un nivel
vibraţional al stării electronice fundamentale S0. Fluorescenţa poate să apa-
ră doar în timpul absorbţiei (timpul de viaţă a unei stări excitate de singlet
este între 10-9 şi 10-15 s). Majoritatea moleculelor nu sunt fluorescente deoa-
rece starea excitată S1 se suprapune cu nivelele vibraţionale ale stării fun-
damentale S0. În acest caz relaxarea vibraţională este mai rapidă decât rela-
xarea prin fluorescenţă.
Fluorescenţa se poate măsura cu ajutorul eficienţei cuantice Q (randa-
ment cuantic):
Q = (numărul de fotoni emişi) / (numărul de fotoni absorbiţi)
Q are o valoare fixă pentru fiecare moleculă (pentru aceleaşi condiţii),
valoarea maximă fiind 1. De aceea, moleculele fluorescente au spectre de
absorbţie şi de fluorescenţă caracteristice.
Fluorescenţa observată cu ajutorul spectrofluorimetrelor este cunoscută
ca Fluorescenţa de tip Stokes. Fluorescenţa de tip Stokes reprezintă emisia
de fotoni cu lungime de undă mai mare (frecvenţă mai mică) de către o
moleculă ce a absorbit fotoni cu o lungime de undă mai mică (frecvenţă mai
mare). Atât absorbţia cât şi emisia de fluorescenţă sunt unice pentru fiecare
moleculă. Lumina emisă are totdeauna lungime de undă mai mare decât
lumina absorbită (figura 2).
162
Figura 2. Spectru de fluorescenţă
(emisie) şi de absorbţie (excitaţie)
caracteristic.
Intensitatea radiaţiei fluorescente este proporţională cu intensitatea ra-

diaţiei absorbită de o moleculă fluorescentă:
F = K'(I0-I)
unde I0 este intensitatea radiaţiei incidente pe probă, I este intenstitatea
radiaţiei după ce a traversat un strat de substanţă de lungime b, iar K' este
o constantă ce depinde de condiţiile experimentale şi de eficienţa cuantică a
fluorescenţei.
Dacă ţinem cont de legea Beer:
I/I0 = 10-εbc ,
unde A = bcε este absorbanţa, atunci printr-o simplă înlocuire se obţine
legea fluorescenţei:
F = K' I0 (1 - 10-εbc)
Figura 3. Curba de calibrare
163
Spre deosebire de legea Beer, intensitatea radiaţiei de fluorescenţă nu de-
pinde liniar de concentraţie. Dacă folosim o descompunere în serie Taylor,
avem:
⎡
F = K ' I 0 ⎢2,3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c −
(2,3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c)2 + (2,3 ⋅ ε ⋅ b ⋅ c)3 − ....⎤
⎥
⎣ 2! 2! ⎦
Dacă εbc are o valoare suficient de mică (< 0.05) termenii de ordin superior
pot fi consideraţi nuli, deci putem scrie:
F = 2,3·K'·ε·b·c·I0
Relaţia de mai sus ne arată ca pentru concentraţii suficient de mici intensi-
tatea de fluorescentă este proporţională cu concentraţia şi cu intensitatea
radiaţiei excitatoare la frecvenţa de absorbţie.
Pentru o concentraţie mai mare decât c1 curba de calibrare nu mai este lini-
ară.
2. Tehnica experimentală
Pentru a măsura fluorescenţa există două tipuri de instrumente: fluo-
rimetre şi spectrofluorimetre.
Un fluorimetru măsoară abilitatea unei probe de a absorbi lumină la o
anumită lungime de undă şi de a emite lumină la o lungime de undă mai
mare. Fluorimetrele se folosesc pentru măsurători cantitative pentru com-
puşi specifici (măsurători de rutină).
Spectrofluorimetrele folosesc două monocromatoare, unul pentru lu-
mina excitatoare şi unul pentru radiaţia de fluorescenţă emisă. Avantajul
spectrofluorimetrelor este faptul că permit variaţia controlată a lungimii de
undă a radiaţiei excitatoare. Astfel, proprietăţile fluorescente ale probei pot
fi scanate pentru un domeniu larg de lungimi de undă ale radiaţiei excita-
toare (200-1000 nm).
Părţile principale ale unui spectrofluorimetru sunt: sursa, monocroma-
tor a radiaţiei excitatoare, camera probei, monocromator al radiaţiei emise,
detector (figura 4). Bineînţeles, orice spectrofluorimetru modern este inter-
faţat cu un computer cu ajutorul căruia se setează parametrii de măsurare,
se înregistrează şi se prelucrează datele. Primul monocromator analizează
lungimea de undă a radiaţiei excitatoare, iar celalalt analizează lungimea
de undă a radiaţiei de fluorescenţă (emise). Semnalul detectat poate fi re-
prezentat în funcţie de cele două lungimi de undă sau numai în funcţie de
una din cele două lungimi de undă. Radiaţia emisă este colectată la un
164
unghi de 90° faţă de radiaţia excitatoare pentru a preveni orice interferenţă
între radiaţia excitatoare şi cea emisă.
sursă
monocromator
detector
probă
monocromator
Figura 4. Schema bloc pentru un spectrofluorimetru
Sursa unui spectrofluorimetru emite în domeniul UV şi vizibil (de obi-

cei se folosesc lămpi cu Xenon). Lumina emisă de sursă este focalizată pe
fanta de intrare a primului monocromator cu ajutorul unei oglinzi sferice
sau eliptice.
Fanta de intrare este ajustabilă continuu (cu ajutorul soft-ului) pentru a
se asigura maximul de rezoluţie şi reproductibilitate.
Primul monocromator descompune radiaţia excitatoare în culorile com-
ponente. Prin fanta de ieşire a monocromatorului radiaţiei excitatoare iese
lumină cu lungimea de undă dorită. Astfel radiaţia luminoasă incidentă pe
probă poate să aibă lungime de undă fixă pentru tot timpul măsurătorii, sau
poate să se modifice continuu pe tot domeniul de emisie al sursei.
Atât intensitatea luminoasă a radiaţiei incidente, cât şi lungimea de
undă a acesteia este monitorizată şi controlată cu ajutorul unui fotodetector
suplimentar situat între monocromator şi camera probei.
Camera probei este de obicei destul de spaţioasă, pentru a permite in-
stalarea diferitelor accesorii pentru probe solide, lichide şi gazoase, sau
pentru controlarea temperaturii probei.
Lumina emisă de probă este focalizată pe fanta de intrare al celui de-al
doilea monocromator. Acesta descompune radiaţia de fluorescenţă emisă
de probă în culorile componente. Deoarece radiaţia de fluorescenţă are tot-
deauna lungime de undă mai mare decât radiaţia excitatoare, elementul
dispersiv al celui de-al doilea monocromator este astfel conceput încât să
aibă maximul de eficienţă în domeniul vizibil. Detectorul este poziţionat la
ieşirea din cel de-al doilea monocromator.
165
Toate spectrofluorimetrele moderne sunt controlate de computer. Ast-
fel, prin intermediul computerului se pot seta toţi parametri necesari deru-
lării diferitelor tipuri de măsurători. Datele obţinute în urma măsurătorilor
efectuate se pot prelucra cu ajutorul programelor speciale.
3. Avantajele spectrofluorimetriei
Senzitivitatea: Limitele de detecţie depind în mare măsură de proprietă-
ţile probei de măsurat. Pentru multe substanţe fluorescente este obişnuită o
limită de detecţie de părţi/miliard sau chiar părţi/triliard. Această extraor-
dinară senzitivitate permite detecţia sigură a substanţelor fluorescente (clo-
rofilă, hidrocarburi aromatice, etc.) folosind probe foarte mici. De aseme-
nea, studiile pot fi efectuate în soluţii apoase fără a fi nevoie ca probele să
fie tratate. Spectrofluorimetrele au limite de detecţie mult mai bune decât
spectrofotometrele.
Specificitatea: Spectrofotometrele măsoară doar lumina absorbită. Teh-
nicile spectrofotometrice au probleme de interferenţă deoarece multe mate-
riale absorb lumina, ceea ce face dificil izolarea semnalului de la materialul
de analizat din matricea în care se află. Spectrofluorometrele au o
specificiate ridicată şi apar mult mai puţine probleme de interferenţă deoa-
rece substanţele fluorescente pot fi incluse în solvenţi sau matrici care nu
sunt fluorescente, sau chiar dacă au fluorescentă este puţin probabil ca do-
uă substanţe să absoarbă şi să emită radiaţie de fluorescenţă în acelaşi do-
meniu.
Domeniu de concentraţie: Intensitatea semnalului de fluorescenţă este di-
rect proporţional cu concentraţia substanţei fuorescente pe un domeniu
larg. Fluorimetria poate fi folosită pe un domeniu mare de concentraţii fără
a fi nevoie de diluţia eşantioanelor sau de modificarea celulei în care se
pune eşantionul.
Viteză şi simplitate: spectrofluorimetria este o tehnică analitică relativ
simplă. Senzitivitatea şi specificitatea mare a acestei tehnici reduce sau chi-
ar elimină procedurile de preparare a probelor.
4. Aplicaţii ale spectrofluorimetriei

Medicină şi farmacologie
Sensitivitatea deosebită a spectroscopiei de fluorescenţă, face ca această
tehnică să fie folosită atât pentru cercetări avansate cât şi pentru analize de
rutină sau controlul calităţii în domeniile farmaciei şi medicinii. Fluorescen-
ţa oferă informaţii asupra dinamicii, rigidităţii şi structurii proteinelor, vi-
166
ruşilor, AND-ului, etc. Cu ajutorul fluorescenţei se poate identifica prezen-
ţa unui număr foarte mare de analiţi chiar dacă aceştia sunt în cantităţi
foarte mici (sub picomolar), fapt ce are deosebite aplicaţii în imunologie.
Mediul înconjurător
Cu ajutorul fluorescenţei se poate monitoriza calitatea aerului, a apei şi
a solului prin detectarea urmelor de substanţe organice sau inorganice,
toxine, mutageni sau substanţe canceroase. Deoarece probele preluate din
mediul înconjurător sunt deosebit de complexe, pentru detectarea diferite-
lor substanţe sunt necesare tehnici de mare senzitivitate şi selectivitate care
să evite multiplele surse de interferenţă. Spectrele de fluorescenţă 3D pot fi
folosite ca o amprentă unică care duce la identificarea calitativă a compuşi-
lor. De asemenea măsurătorile de fluorescenţă 3D sunt folosite pentru de-
terminarea surselor geologice a diferitelor eşantioane de petrol.
Chimia analitică
În chimia analitică se studiază spectrele de luminescenţă precum şi efi-
cienţa cuantică a speciilor flourescente în funcţie de matriţa în care sunt
puse. După ce sunt determinate caracteristicile de bază (excitaţie, emisie,
randament cuantic) ale unei substanţe fluorescente, pot fi elaborate metode
şi teste de rutină pentru analizele de laboratoar. Prin determinări de fluo-
rescenţă pot fi determinate:
- efectul general de solvent
- timpul de viaţă şi randamentul cuantic
- momentul de dipol al stării excitate
- efectul prezenţei atomilor grei
- efectul temperaturii
- reacţia la diferite suprafeţe
Industria alimentară şi agricultura

În industria alimentară este importantă îmbunătăţirea calităţii nutriţio-
nale a alimentelor, creşterea termenului de garanţie precum şi a calităţii
ambalajelor. Culturile de bacterii ce pot să apară pe alimente sunt distructi-
ve şi periculoase datorită potenţialului de contaminare şi îmbolnăvire pe
care îl au. Pentru a asigura calitatea produselor alimentare, producătorii
trebuie să identifice contaminanţi, microorganisme, mucegaiuri, şi chiar
pesticide utilizate în mod normal pentru a preveni răspândirea unor boli.
Calitatea ambalajelor este de asemenea importantă atât ca membrană pro-
tectoare împotriva oxidării alimentelor cât şi datorită faptului că sunt o
posibilă sursă de contaminare cu urme de plastic sau de polimeri. Fluores-
167
cenţa poate fi folosită şi în determinarea randamentului şi calităţii anumitor
culturi în urma aplicării fertilizatorilor.
Industrie
Producătorii folosesc fluorescenţa pentru a monitoriza calitatea vopse-
lelor, a plascticelor, a polimerilor, înălbitorilor optici şi suprafeţelor fosfo-
rescente. De asemenea, fluorescenţa este folosită ca instrument de cercetare
în domeniul biotehnologiilor, pentru analiza medicamentelor, hormonilor,
proteinelor, vitaminelor, şi a altor substanţe biologice. Fabricanţii de in-
strumentar medical şi clinic studiază sistemele invazive pe bază de fibre
optice (ce pot fi introduse în interiorul arterelor sau a altor orificii). Com-
paniile de cosmetice şi produse pentru îngrijirea sănătăţii evaluează efica-
citatea unor noi produse cum ar fi loţiunile pentru protecţie solară, emoli-
entele pe bază de lipide şi cremele anti-rid.
Fotochimie
Mecanismul absorbţiei luminii precum şi proprietăţile fotofizice ale
unei substanţe determină rolul său în procesele biologice şi chimice. Aplica-
ţiile fotochimice ale fluorescenţei includ:
- mecanismul molecular de transfer prin membrana de proteină a
bacteriorhodopsinei (o membrană integrală de proteină care acţionează ca o
pompă de protoni - capturează energie luminoasă şi o foloseşte pentru a
transfera protoni în exteriorul celulei);
- terapia fotodinamică - o tehnică pentru localizarea, identificarea şi contro-
lul tumorilor;
- conversia biologică de energie în fotosinteza plantelor verzi;
- folosirea "quantum dots"-urilor ca probe biologice în diagnosticarea can-
cerului şi studierea ţesuturilor;
- caracterizarea substanţelor fotoreceptoare (flavine, carotenoide, etc).
Biologie celulară
În studiul proceselor biologice sunt implicaţi o largă varietate de
markeri fluorescenţi. Aceştia pot fi caracterizaţi cu ajutorul spectrelor de
fluorescenţă de excitaţie şi de emisie. Una din tehnicile cele mai folosite în
acest domeniu este determinarea raportului dintre intensităţile semnalului
de fluorescenţă emis de markerul folosit la diferite lungimi de undă, tehni-
că mai avantajoasă decât cea clasică în care se măsoară intensitatea absolută
de fluorescenţă la o singură lungime de undă.
168
5. Aparatura disponibilă
Spectrofluorimetru Jasco FP 6500
Spectrofluorimetrul Jasco 6500 are următoarele caracteristici:
Sursa este o lampă cu xenon de
150 W dotată cu un fotomultiplicator
ce monitorizează şi compensează orice
variaţie în intensitate asigurându-se
astfel maximul de stabilitate.
Cele două monocromatoare sunt
echipate cu reţele de difracţie hologra-
fice concave (1500 trăsături/mm) cu
unghi de "blaze" optimizat, ceea ce
asigură maxim de senzitivitate pe în-
tregul domeniu de lungimi de undă (200-850 nm).
Spectrofluorimetrul este echipat cu accesorii pentru modificarea con-
trolată a temperaturi probei şi pentru polarizarea luminii incidente, precum
şi cu suporturi pentru diferite tipuri de probe (solide, lichide şi gazoase).
Fantele monocromatoarelor au dimensiuni reglabile, atât ca lăţime cât
şi ca înălţime.
Alte caracteristici ale spectrofluorimetrului Jasco FP 6500 sunt:
- rezoluţia monocromatoarelor este de 1 nm;
- raportul semnal - zgomot este 200:1 sau mai mare;
- viteza de scanare este între 20 şi 10.000 nm/ min pentru ambele
monocromatoare;
- acurateţea lungimii de undă este ±2 nm pentru ambele monocro-
matoare.
Calibrarea spectrofluorimetrului se face cu ajutorul kit-ului inclus ce
utilizează ca probă standard Rodamina B.
Cu ajutorul spectrofluorimetrului Jasco 6500 pot fi efectuate următoare-
le tipuri de măsurători:
- determinarea concentraţiei de substanţă fluorescentă (analiză cantita-
tivă),
- determinarea spectrului de fluorescenţă a unei probe,
- determinarea stabilităţii intensităţii de fluorescenţă în timp,
- măsurători de cinetică,
- măsurători la lungimi de undă fixă,
- măsurători 3D de fluorescenţă,
- determinarea spectrului de fosforescenţă a unei probe,
- determinarea timpului de viaţă în cazul probelor fosforescente.
169
Controlul acestor măsurători se face folosind programul "Spectra manager"
Modul "Quantitative analysis": pentru a efectua o analiză cantitativă
trebuie trasată o curbă de calibrare. Această acţiune presupune măsurarea
soluţiilor etalon, construirea şi stocarea curbei de calibrare. Rezultatele mă-
surătorilor probelor de concentraţie necunoscută vor fi date în unitatea de
măsură de concentraţie în care a fost construită curba de calibrare.
Modul "Spectrum measurement" permite măsurarea fluorescenţei pro-

belor prin scanare de spectru. Astfel, se pot face spectre pe tot domeniul
sau pe un domeniu selectat de utilizator. Se pot face spectre de excitaţie sau
de emisie, la viteze diferite de scanare.
Modul "3D Fluorescence measurements" permite măsurarea în acelaşi
timp a (i) spectrului de fluorescenţă a unei probe în timp ce se modifică
lungimea de undă a radiaţiei excitatoare şi (ii) măsurarea spectrului de ex-
citaţie în timp ce se modifică lungimea de undă de emisie. Se obţin spectre
tridimensionale (pe o axă este reprezentată intensitatea semnalului de fluo-
rescenţă şi pe celelalte două axe avem lungimea de undă de excitaţie, res-
pectiv de emisie.) Analiza acestor spectre permite determinarea poziţiei
maximului de excitaţie şi de emisie, fapt deosebit de util pentru probe ne-
cunoscute.
Modul "Time course measurement" permite verificarea stabilităţii în
timp a intensităţii fluorescenţei soluţiilor. Se face citirea la o lungime de
undă selectabilă într-un interval de timp selectabil.
Modul "Fixed wavelength measurement" permite efectuarea măsurării
fluorescenţei probelor la maxim 4 lungimi de undă simultan, selectabile fie
pe excitaţie, fie pe emisie.
170
Modul "Phospho. spectrum measurement" permite măsurarea spectru-
lui de fosforescenţă al probelor.
6. Bibliografie
1. Bernard Valeur, Molecular Fluorescence: Principles and Applications, Ed. Wiley-VCH;
2002
2. Joseph Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, Ed. Springer; 2006
3. http://www.jascoinc.com/Products/Spectroscopy/FP-6000-Series-Spectrophotom
eters.aspx
171
Spectrofluorimetria - aplicaţii
Cuprins
1. Fluorescenţa în timp real ..................................................................................... 172
2. Microscopia de fluorescenţă avansată .................................................................. 174
2.1. Microscopia confocală de fluorescenţă ........................................................... 175
2.2. Microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi fotoni (two-photon
excitation fluorescence microscopy) ............................................................... 176
2.3. Microscopia de fluorescenţă prin scanare optică în câmp apropiat (NSOM) ..... 178
3. Exemple de aplicaţii ale spectrofluorimetriei ........................................................ 180
3.1. Determinarea interacţiunii dintre albumina bovină şi nanoparticule
de aur ............................................................................................................ 180
3.2. Evaluarea modificărilor conformaţionale induse în albumina bovină
adsorbită la suprafaţa nanoparticulelor de aur, în urma modificărilor de tem-
peratură şi pH. .............................................................................................. 184
3.3. Monitorizarea denaturării termice a albuminei bovine la diferite valori ale
pH-ului ......................................................................................................... 187
4. Bibliografie ........................................................................................................... 190
1. Fluorescenţa în timp real

Deşi măsurătorile normale de fluorescenţă pot fi folosite ca o sondă
non-invazivă extrem de selectivă şi sensibilă, pentru a obţine informaţii chi-
mice mai amănunţite trebuie determinată variaţia în timp a fluorescenţei.
Fluorescenţa în timp real furnizează mai multe informaţii despre mole-
culele ce se află în imediata vecinătate a fluoroforului. Deoarece timpul de
viaţă de fluorescenţă a unei molecule este foarte sensibil la vecinătatea sa
moleculară, determinarea acestui timp de viaţă este deosebit de util în de-
terminarea stării fluoroforului. Multe evenimente macromoleculare, cum ar
fi difuzia rotaţională, transferul rezonant de energie şi stingerea dinamică,
apar pe aceeaşi scară temporală cu emisia de fluorescenţă. Astfel, spectro-
scopia de fluorescenţă în timp real poate fi utilizată pentru a investiga aces-
te procese şi a obţine informaţii despre vecinătatea chimică a fluoroforului.
Este important să ne amintim că timpul de viaţă de fluorescenţă este
timpul mediu pentru ca o moleculă să rămână în stare excitată înainte de a
emite un foton. Fiecare moleculă individuală emite aleatoriu după excitaţie.
Unele molecule excitate vor emite radiaţie de fluorescenţă înainte de durata
172
medie de viaţă, iar alte molecule excitate vor emite radiaţie de fluorescenţă
mult timp după durata medie de viaţă. Timpii de viaţă de fluorescenţă
sunt, în general, de ordinul 1-10 ns, deşi în unele cazuri pot avea ordinul
sutelor de nanosecunde sau să fie mai mici decat 1 ns (sute de
femtosecunde). Din această cauză este foarte important ca aparatura expe-
rimentală folosită pentru acest tip de masurători să aibă rezoluţie tempora-
lă foarte bună. În figura 1 este prezentat un montaj experimental folosit
pentru determinări de fluorescenţă în timp real.
O sursă laser emite un puls ultra scurt (de ordinul femtosecundelor) cu
lungimea de undă λ1 corespunzătoare frecvenţei ω1. Armonica a doua a
acestui puls (frecvenţa ω2) este generat într-un cristal neliniar, fiind separat
de fundamentală cu ajutorul unui divizor de undă dicroic. Pulsul de frec-
venţă ω1 trece printr-un dispozitiv optic ce produce o întârziere de fază
(optical delay line), iar pulsul de frecvenţă ω2 este focalizat pe probă (flow
cell). Emisia de fluorescenţă incoerentă emisă de probă este colectată şi mi-
xată cu pulsul de frecvenţă ω1 într-un cristal neliniar. Această mixare
("fluorescence up-conversion") generează lumină cu frecvenţa ωsum = ω1 +
ωfl , ceea ce ne demonstrează că există o coincidenţă temporală şi spaţială
între ω1 şi ωfl. Cu cât este mai mare decalajul temporar dintre pulsul ω1 şi
emisia de fluorescenţă ωfl, cu atât intensitatea de fluorescenţă este mai mică.
Intensitatea Isum a pulsului cu frecvenţa ωsum pentru un anumit decalaj
temporar între pulsul de frecvenţă ω1 şi emisia de fluorescenţă de frecvenţă
ωfl este proporţională cu funcţia de corelaţie dintre intensitatea de fluores-
cenţă Ifl şi intensitatea I1 a pulsului de frecvenţă ω1:
∞
I sum (τ ) ≈ ∫ I fl (t ) I1 (t − τ )dt
−∞
În acest fel se poate determina dependenţa intensităţii de fluorescenţă

de timp prin modificarea timpului de întârziere (prin intermediul dispozi-
tivului "optical delay line").
De obicei, cristalele neliniare sunt confecţionate din pota-
siu-dihidrogen-fosfat (KDP) sau borat de bariu (BBO). Cristalele din borat
de bariu au avantajul transparenţei în UV şi eficienţei cuantice mai mare
(cu un factor de 4-6). Pentru o poziţie dată a cristalului, numai pentru un
domeniu îngust din spectrul de fluorescenţă apare coincidenţa temporală şi
spaţială cu pulsul de frecvenţă. Deci dacă interesează întreg domeniu de
fluorescenţă, cristalul trebuie rotit la diferite unghiuri.
173
Figura 1. Set-up experimental pentru fluorescenţă în timp real (Mialocq and Gustavsson, 2001).
(DM - oglindă dicroică; HW - placă semi-undă; GG420 - filtru; CCD - cameră video; BBO -cristal
neliniar; M - monochromator; PM - fotomultiplicator; lockin - numărător)
Măsurătorile de fluorescenţă în timp real sunt foarte potrivite pentru

investigarea proceselor intramoleculare fotoinduse (charge transfer, proton
transfer etc.) şi a proceselor intermoleculare (elctron transfer etc.). De ase-
menea, fluorescenţa în timp real a fost folosită cu succes în studii ale proce-
selor biologice care au loc în prezenţa luminii (proteina galbenă fotoactivă,
proteina albastră fluorescentă, proteina verde fotoactivă etc.).
2. Microscopia de fluorescenţă avansată

Microscopia de fluorescenţă convenţională este folosită, în principal,
pentru a investiga celulele şi ţesuturile vii, dar este de asemenea folosită pen-
tru a studia diferite sisteme chimice cum ar fi coloizi, cristale lichide, mixturi
polimerice, fotodegradarea polimerilor naturali, colorarea fibrelor etc.
Un microscop de fluorescenţă convenţional diferă de un microscop stan-
dard prin faptul că este folosită o sursă de lumină (lampă cu mercur sau oxi-
gen) ce emite şi în domeniu UV. Lungimea de undă de excitaţie este selectată
cu ajutorul unui filtru de interferenţă sau a unui monocromator. Observarea
emisiei de fluorescenţă poate fi efectuată cu ajutorul ochiului observatorului,
a unui film fotografic sau a unei camere cu detector CCD (charge- coupled
device). Profunzimea de câmp a unui microscop convenţional cu fluorescen-
ţă este 2-3 µm, iar rezoluţia maximă este aproximativ egală cu jumatatea lun-
gimii de undă a radiaţiei folosite la excitare.
174
În cazul în care proba este mai subţire decît valoarea profunzimii de
câmp, imaginea este neclară datorită defocalizării. În acest caz imaginea se
poate îmbunătăţi cu ajutorul computerului, dar, de obicei, este de preferat
folosirea altor tehnici, cum ar fi microscopia confocală (confocal
microscopy) sau microscopia prin excitaţia cu doi fotoni (two-photon
excitation microscopy). De asemenea, prin folosirea microscopiei optice în
câmp apropiat (near-field scanning optical microscopy (NSOM)) se poate
lucra dincolo de limita de difracţie optică.
2.1. Microscopia confocală de fluorescenţă

În cazul unui microscop confocal, fasciculul de lumină este focalizat pe
probă. Emisia de fluorescenţă este separată de lumina excitatoare cu ajuto-
rul unei oglinzi dicroice şi este focalizată cu ajutorul lentilelor obiectivului
pe fanta unui fotomultiplicator. Emisia de fluorescentă produsă de proba
situată în afara planului de focalizare nu va trece prin fanta multiplicatoru-
lui deoarece se va lovi de tubul ocularului (figura 2).
Figura 2. Principiul microscopiei confocale (stânga) comparativ cu microscopia convenţională

(dreapta).
Una din caracteristicile microscopiei confocale de fluorescenţă este faptul

că se pot obţine imaginile unor straturi cu o grosime bine definită. Astfel,
folosind o lentilă cu apertură numerică mare, grosimea secţiunilor confocale
poate atinge limita teoretică de aproximativ 0,5 µm, deci prin deplasarea
probei pe verticală se obţine imaginea tridimensională a acesteia.
Deoarece în microscopia confocală de fluorescenţă se colectează numai
175
o parte din fasciculul de fluorescenţă emis, energia de excitare necesară
trebuie să fie mai mare decât în microscopia de fluorescenţă convenţională.
Creşterea energiei fasciculului de excitare duce la descompunere fotochi-
mică a fluoroforului, fenomen numit photobleaching. Reducerea efectelor
nedorite datorate fenomenului de photobleaching se face prin utilizarea de
fluorofori stabili şi prin folosirea unui microscop confocal echipat cu detec-
tor cu sensibilitate mare şi obiectiv cu apertură numerică mare, pentru a
putea folosi unui fascicul excitator cu putere mai mică.
Microscopia confocală de fluorescenţă este o tehnică utilizată pe scară
largă în biologia celulară (vizualizarea celulelor, determinarea distribuţiei
potenţialului electric, imagistica pH, imagistica Ca2+, etc.). De asemenea,
microscopia confocală de fluorescenţă a fost folosită în studii din domeniul
coloizilor, a cristalelor lichide şi a amestecurilor de polimeri.
Microscopia confocală de fluorescenţă poate fi combinată cu tehnicile
domeniu-timp şi frecvenţă-timp (time-domain, frequency-domain) pentru a
se obţine imagini din perioada numită timp de viaţă al fluoroforului
(lifetime imaging).
2.2. Microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi fotoni

(two-photon excitation fluorescence microscopy)
În spectroscopia de fluorescenţă convenţională, fluoroforul este excitat
prin absorbţia unui foton a cărui energie corespunde cu diferenţa de energie
dintre starea electronică fundamentală şi starea electronică excitată. Excitaţia
fluoroforului este, de asemenea, posibilă prin absorbţia simultană a doi fo-
toni de energie mai mică (lungime de undă mai mare) prin intermediul unei
stări virtuale cu timp de viaţă foarte scurt (Figura 3). De exemplu, absorbţia a
doi fotoni din domeniul roşu poate excita o moleculă care absoarbe în dome-
niul UV. Excitaţia cu doi fotoni este un proces neliniar, absorbţia depinde de
pătratul intensităţii luminii folosite la excitaţie.
Dacă este folosit un singur laser, cei doi fotoni absorbiţi sunt identici,
iar tehnica se numeşte microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu doi
fotoni (two-photon excitation fluorescence microscopy). Dacă se folosesc
două lasere, atunci fotonii sunt diferiţi (1/λe = 1/λ1 + 1/λ2), iar tehnica se
numeşte microscopia de fluorescenţă folosind excitaţia cu două culori
(two-color excitation fluorescence microscopy).
Probabilitatea absorbţiei a doi fotoni depinde de coincidenţa temporală
şi spaţială a fotonilor incidenţi (diferenţa dintre timpul în care cei doi fotoni
ajung la fluorofor trebuie să fie sub 10-18 s). Secţiunea eficace a procesului
de absorbţie a doi fotoni este foarte mică (10-50 cm4·s/foton·moleculă pentu
rodamina B). În consecinţă, vor fi excitaţi numai fluoroforii situaţi într-o
176
regiune unde fluxul de fotoni este foarte mare, deci trebuie folosiţi laseri cu
putere mare şi funcţionare în impulsuri, cum ar fi laserul cu Ti-safir.
Figura 3. Comparaţie între excitaţia cu doi fotoni şi excitaţia cu un foton.

(Linia punctată reprezintă starea virtuală care mediază absorbţia a doi fotoni.)
Deoarece intensitatea fasciculului de excitare variază cu pătratul dis-

tanţei de la planul focal, probabilitatea de absorbţie a doi fotoni în afara
regiunii focale scade cu puterea a patra a distanţei. Deci, excitarea cu doi
fotoni a fluoroforului poate avea loc doar în focar. Folosind un obiectiv cu o
apertură numerică de 1,25 şi un fascicul de excitare având 780 nm, peste
80% din intensitatea totală de fluorescenţă va fi emisă dintr-o zonă situată
la 1 mm în jurul focarului. Volumul de excitaţie este de ordinul a 0,1-1
femptolitri. Comparativ cu fluorometrele convenţionale, acesta reprezintă o
reducere a volumului de excitare de 1010 ori.
Excitarea cu doi fotoni permite obţinerea unei rezoluţii tridimensională
deosebită în microscopia de fluorescenţă. Deşi efectul secţionării 3-D este
comparabil cu cel din microscopia confocală, în cazul excitării cu doi fotoni
avem următoarele avantaje: (i) deoarece fasciculul de excitare este concen-
trat atât în timp cât şi în spaţiu nu apare fenomenul de photobleaching în
afara focarului şi (ii) fasciculul excitator nu este atenuat de abosorbţia din
afara focarului, ceea ce duce la creşterea adâncimii de penetrare a fasciculu-
lui excitator.
Excitarea cu două culori se foloseşte atunci când se doreşte observarea
unor obiecte microscopice situate în medii puternic difuzante. Deşi, în am-
bele tipuri de excitari (cu doi fotoni sau cu două culori), fenomenul de di-
fuzie duce la scăderea intensităţii fasciculului de fluorescenţă emis din fo-
car, în cazul excitarii cu două culori nu apare decât o creştere minimală a
background-ului de fluorescenţă, nedorit, ceea ce duce la obţinerea unui
contrast mai bun pentru obiecte de mici dimensiuni.
177
2.3. Microscopia de fluorescenţă prin scanare optică în câmp apro-
piat (NSOM)
Rezoluţia unui microcop convenţional este limitată datorită fenomene-
lor de interferenţă şi difracţie. Limita de rezoluţie este de aproximativ λ/2,
unde λ este lungimea de undă a sursei de luminii. Această limită poate fi
depăşită prin utilizarea unei surse de lumină cu lungime de undă mai mică
şi prin plasarea probei foarte aproape de această sursă (în câmp apropiat).
Figura 4. Principiul scanării în câmp apropiat (conform ideii lui Synge)
Ideea de optică în "câmp apropiat" este atribuită cercetătorului E. H.

Synge (figura 4). Radiaţia luminoasă incidentă trece printr-o fantă cu di-
mensiuni sub-lungime de undă. Suprafaţa probei este poziţionată în imedi-
ata apropiere a fantei, astfel încât fasciculul emergent este forţat să interac-
ţioneze cu proba. Fanta acţionează ca o sondă luminoasă de dimensiune
sub-lungime de undă care poate fi folosită pentru a lumina suprafaţa pro-
bei înainte ca lumina să fie difractată. Această tehnică are o rezoluţie spaţia-
lă foarte mare (de ordinal sub-micrometrilor) şi o sensibilitate foarte bună.
Majoritatea instrumentelor NSOM sunt construite în jurul unui micro-
scop cu fluorescenţă inversat, care oferă avantajul de a furniza imagini
normale şi permite ca regiunea de studiat să fie localizată cu rezoluţie ma-
re, de tip NSOM (Figura 5). Fasciculul laser trece printr-o fibră optică
uni-modală la ataşată de un vârf special pentru determinările în câmp
apropiat (vârf NSOM). Vârful este montat într-un cap piezo, care permite
deplasarea pe verticală - axa Oz). Proba se află pe un suport piezo, care
permite deplasarea ei în planul xy. Lumina din vârful NSOM ataşat fibrei
optice excită proba, iar emisia de fluorescenţă este colectată de obiectivul cu
apertură numerică mare, montat sub suportul pe care se află proba şi detec-
178
tată printr-un filtru (pentru a elimina lumina reziduală de la laserul folosit
pentru excitare) şi un detector. Acest mod este numit modul iluminare.
Alternativ, în modul colectare, proba este iluminată de la un câmp îndepăr-
tat şi emisia de fluorescenţă este colectată de către un vârf NSOM. Sisteme-
le care scanează piezo şi înregistrează imaginile sunt similare cu cele utili-
zate în microscopia de forţă atomică.
Figura 5. Instrument NSOM construit în jurul unui microscop de fluorescenta inversat - mod ilu-
minare.
Pentru a obţine imagini de înaltă rezoluţie este necesară poziţionarea

precisă a vârfului NSOM (de ordinul nm) faţă de suprafaţa probei. Acest
lucru poate fi realizat cu ajutorul feedback-ului bazat în general pe metoda
de forţă-forfecare: vârful este intercalat lateral la una dintre frecvenţele sale
de rezonanţă cu o amplitudine de aproximativ 2-5 nm. Când vârful NSOM
interacţionează cu câmpul de forţe Van der Waals a probei, forţele de forfe-
care atenueză amplitudinea vibraţiilor acestuia. Această amplitudine poate
fi monitorizată şi folosită pentru a genera un semnal de feedback cu ajuto-
rul căruia se controlează distanţa dintre probă şi vârf în timpul scanării.
Tehnica NSOM este remarcabilă pentru analiza filmelor subtiri, (poli-
meri electroluminiscenţi, cristale lichide, etc.). Microscopia de fluorescenţă
prin scanare optică în câmp apropiat poate oferi noi perspective în studiul
sistemelor biologice complexe din cauza rezoluţiei mai mari decât în micro-
scopia confocală, a capacităţii de cartografiere a topografiei suprafeţei şi da-
torită faptului că fenomenul de photobleaching este redus. Cu ajutorul tehni-
cii NSOM au fost investigate cu succes sisteme fotosintetice, localizarea pro-
teinelor, cartografierea cromozomilor şi microstructura membranelor.
179
3. Exemple de aplicaţii ale spectrofluorimetriei
3.1. Determinarea interacţiunii dintre albumina bovină şi
nanoparticule de aur
Iosin şi colaboratorii [4] au demonstrat interacţiunea directă dintre
nanoparticulele de aur şi albumina bovină.
Cunoaşterea efectelor biologice ale nanoparticulelor de aur necesită de-
terminarea legăturilor ce apar între nanoparticule şi proteinele cu care interac-
ţionează. Nanoparticulele de aur (GNP) sunt sonde ideale pentru investigarea
proceselor biologice datorită biocompatibilităţii lor, ce le permite conjugarea
uşoară cu diferite biomolecule. Deoarece interacţiunea dintre proteine şi
nanoparticulele de aur este foarte sensibilă la starea conformaţională a protei-
nei şi la chimia suprafeţei nanoparticulelor, este foarte importantă determina-
rea modificărilor conformaţionale pe care le suferă proteina în urma adsorbţiei
la suprafaţa nanoparticulei. În unele cazuri interacţiunea dintre proteină şi
suprafaţa nanoparticulelor de aur poate determina modificări de structură ce
duc la alterarea proprietăţilor proteinei. Pe de altă parte conjugarea dintre pro-
teină şi nanoparticulele de aur nu are ca efect doar stabilizarea sistemului pro-
teină-nanoparticulă, ci determină biocompatibilizarea (funcţionalizarea) aces-
tor nanoparticule pentru alte interacţiuni sau cuplaje cu mediul biologic.
Albumina bovina (Bovine Serum Albumin) este o proteină globulară, cu
formă aproximativ elipsoidală (4nm×4nm×14nm), folosită des în aplicaţii din
domeniul bio-nanotehnologiilor. Structura nativă a albuminei bovine (BSA)
este caracterizată de un singur lanţ polipeptidic compus din 583 reziduri de
aminoacizi, structura terţiară cuprinde trei domenii omoloage (I, II şi III),
fiecare domeniu fiind format din şase elice, stabilizate de o reţea internă de
17 legături disulfide. Albumina bovină (BSA) se găseşte în cantităţi mari în
plasmă, şi joacă un rol important în procesele fiziologice. Albumina bovină
(BSA) este utilizată ca proteină model în studiile biologice deoarece are o
structură bine cunoscută şi posedă proprietăţi de fluorescenţă specifice, dato-
rită prezenţei celor două reziduuri de triptofan din structura ei.
Iosin şi colaboratorii [4] au înregistrat spectrele de fluorescenţă ale
bioconjugatelor BSA-nanoparticule de aur cu ajutorul unui Spectrofluorimetru
Jasco LP-6500 cuplat cu un dispozitiv pentru controlarea temperaturii
(ADP-303T), cu ajutorul căruia temperatura poate fi modificată controlat de la
−10 °C la +110 °C. Semnalul de fluorescenţă al albuminei (BSA) a fost obţinut
la 337 nm prin excitarea reziduului de triptofan cu o radiaţie având lungimea
de undă 280 nm. Soluţia de bioconjugate (nanoparticule de aur şi BSA) a fost
pusă într-o cuvă de cuarţ având dimensiunea de 10 mm.
180
Din spectrele de fluorescenţă se pot obţine informaţii importante (con-
stanta de legătură şi numărul ”siturilor” de legătură) referitoare la modul
de legare a proteinelor de suprafaţa nanoparticulelor de aur.
Albumina bovină (BSA) conţine trei cromofori: triptofan, tirosina şi
fenilalanina a căror emisie de fluorescenţă poate fi stinsă. În realitate, fluo-
rescenţa intrinsecă a BSA-ului este dată în principal de reziduurile de trip-
tofan, deoarece fenilalanina are un randament cuantic foarte mic, iar fluo-
rescenţa tirosinei este aproape stinsă dacă este ionizată sau dacă este
aproape de un grup amino, carboxyl sau triptofan. Triptofanul este deose-
bit de senzitiv la modificarea vecinătăţii locale, de aceea studiul emisiei de
fluorescenţă a acestuia este deosebit de utilă în determinarea modificărilor
conformaţionale ale proteinei şi adsorbţia la nanoparticule.
Spectrele de fluorescenţă ale unor soluţii având diferite concentraţii de
nanoparticule de aur şi albumină bovină (BSA) au fost monitorizare în do-
meniul 290-450 nm, regiune ce coincide cu banda de emisie a triptofanului.
Măsurătorile de fluorescenţă au fost efectuate cu o radiaţie excitatoare de
280 nm, lungime de undă ce este departe de banda plasmonică de rezonan-
ţă a nanoparticulelor de aur. Soluţia apoasă de BSA are o bandă puternică
de fluorescenţă cu maximul situat la 336 nm, bandă ce este datorată emisiei
reziduurilor de triptofan, iar nanoparticulele de aur nu prezintă emisie de
fluorescenţă. După cum se poate observa în figura 6, Iosin şi colaboratorii
[4], au monitorizat stingerea semnalului de fluorescenţă prin creşterea con-
centraţiei nanoparticulelor de aur de formă sferică. Pe langă efectul evident
Figura 6. Spectrele de fluorescenţă ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraţii ale
nanosferelor de aur: (a) 0, (b) 0,55×10-11 M, (c) 1,1×10-11 M, (d) 1,65×10-11 M, (e) 2,2×10-11 M;
F0 – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei apoase de BSA, Fsat – intensitatea de fluorescenţă
relativă a soluţiei de BSA saturată cu nanosfere de aur, F – concentraţii intermediare.
181
de stingere a fluorescenţei, autorii au observant şi o deplasare spre roşu a
maximului benzii de fluorescenţă cu 4 nm (de la 336 nm la 340 nm), depla-
sare ce indică o modificare a polarităţii din jurul reziduului de triptofan.
În figura 7 sunt prezentate spectrele de fluorescenţă ale complexului
BSA-nanobastonaşe de aur, pentru diferite concentraţii. Se observă că intensi-
tatea benzii de fluorescenţă descreşte odată cu creşterea concentraţiei de
nanobastonaşe de aur. În cazul complexului BSA-nanobastonaşe nu se ob-
servă nici o deplasare a maximului benzii de fluorescenţă odată cu modifica-
rea concentraţiei. în ambele cazuri, intensitatea emisiei de fluorescenţă rămâ-
ne constantă după atingerea unui nivel de concentratie a nanoparticulelor de
aur. Această comportare se datorează unui efect de saturaţie (când toate mo-
leculele de BSA sunt legate de nanoparticulele de aur, adaugarea în continu-
are a nanoparticulelor nu duce la apariţia de noi legături BSA-nanoparticule).
Figura 7. Spectrele de fluorescenţă ale reziduului de triptofan din BSA pentru diferite concentraţii de
nanobastonaşe de aur: (a) 0, (b) 1,06×10-14 M, (c) 2,12×10-14 M, (d) 3,18×10-14 M, (e) 4,24×10-14
M; F0 – intensitatea de fluorescenţă relativă a soluţiei apoase de BSA, Fsat – intensitatea de fluores-
cenţă relativă a soluţiei de BSA saturată cu nanobastonaşe de aur, F – concentraţii intermediare.
Din spectrele de fluorescenţă de mai sus autorii au determinat constanta

de legătură (Kb) precum şi numărul siturilor de legătură dintre
nanoparticulele de aur şi BSA, folosind metoda descrisă de Tedesco et al. [6]:
(F0 – Fsat)/(F – Fsat) = ([M]/Kdiss)n
unde F0, Fsat şi F sunt intensităţile de fluorescenţă datorate reziduurilor de
triptofan din BSA:
182
F0 este intensitatea de fluorescenţă a soluţiei apoase de BSA pur,
Fsat este intensitatea de fluorescenţă a soluţiei de BSA saturată cu
nanoparticule de aur,
F este F intensitatea de fluorescenţă a soluţiilor de BSA având concen-
traţii intermediare;
[M] reprezintă concentraţia nanoparticulelor de aur,
n reprezintă numărul ”siturilor” de legătură dintre nanoparticulele de
aur şi BSA
Kdiss este valoarea reciprocă a constantei de legătură Kb.
Concentraţia nanoparticulelor de aur a fost estimată cu ajutorul relaţiei

A = [M]dε
unde: A este absorbanţa soluţiei,
[M] este concentraţia particulelor (în moli),
d este grosimea cuvei folosită pentru înregistrarea spectrelor.
e reprezintă coeficientul de extincţie molară
Pentru a calcula parametrii ‘‘n” şi ‘‘Kb” autorii au reprezentat grafic
log[(F0 - F)/(F - Fsat)] în funcţie de log([M]). Din panta graficului au calculat
numărul siturilor de legătură ‘‘n”, iar din valoarea lui log[M] pentru care
log[(F0 - F)/ (F - Fsat)] = 0 au obţinut constanta de disociere (Kdiss). Valorile
astfel calculate se găsesc în tabelul 1.
Tabelul 1. Constanta de legătură (Kb) şi numărul siturilor de legatură (n) pentru

complexul BSA-nanoparticule de aur.
Kb n
nanosfere de aur 2.34 × 1011 1,37
nanobastonaşe de aur 0.5 × 105 0,38
Valoarea mai mare a constantei de legatură în cazul nanosferelor este

datorată faptului că cele două tipuri de nanoparticule au sarcinii electrice şi
o chimie a suprafeţei diferite: nanobastonaşele au sarcină electrică pozitivă,
iar nanosferele au sarcină electrică negativă. În plus nanobastonaşele sunt
stabilizate cu citrat de sodiu pe când nanosferele sunt stabilizate cu CTAB.
În concluzie, interacţiunea locală dintre nanoparticulele de aur şi albu-
mina bovină a fost investigată cu ajutorul spectroscopiei de fluorescenţă,
folosind efectul de stingere a emisiei de fluorescenţă a triptofanului din
BSA, indus de suprafaţa metalică a nanoparticulei comjugată.
183
3.2. Evaluarea modificărilor conformaţionale induse în albumina
bovină adsorbită la suprafaţa nanoparticulelor de aur, în urma mo-
dificărilor de temperatură şi pH.
M. Iosin şi colaboratorii [5] au monitorizat mecanismul de interactiune
între albumina bovină (BSA) şi nanoparticulele de aur cu ajutorul spectro-
scopiei de fluorescenţă. Spectrele înregistrate sugerează faptul că
nanoparticulele de aur inhibă emisia de fluorescenţă a reziduurilor de trip-
tofan din BSA, în principal printr-un mecanism static (constanta de
legatură Kb este dependentă de valoarea pH-ului).
Modificări conformaţionale ale proteinelor pot fi induse de variaţii ale
temperaturii şi ale pH-ului. Aceste modificări ale structurii proteinelor pot
duce la apariţia cancerului, a diabetului şi a afecţiunilor cardiovasculare,
având o influenţă majoră asupra interfeţei dintre nanoparticule şi substan-
ţele biologice.
Structura albuminei bovine este puternic dependentă de pH şi tempe-
ratură, fiecare stare conformaţională având formă şi dimensiune proprie.
Spectroscopia de fluorescenţă, datorită senzitivităţii mari, poate fi folosită
pentru a obţine informaţii legate de modificările coinformaţionale ale pro-
teinelor induse de interacţiunea cu nanoparticulele de aur la diferite valori
ale pH-ului şi la diferite temperaturi.
Valoarea pH-ului afectează atât structura albuminei bovine cât şi sarci-
na grupării funcţionale a proteinei, determinând, în consecinţă, atracţia sau
respingerea nanoparticulelor de aur, în soluţie. Sarcina netă a albuminei
bovine este puternic dependentă de pH-ul soluţiei, fiind pozitivă pentru
pH< pI, neutră pentru pH= pI şi negativă pentru pH> pI, unde pI reprezin-
tă punctul izoelectric [6]. În cazul albuminei bovine, punctul izoelectric este
4.7 [7]. Nanoparticulele de aur folosite sunt încărcate negativ la suprafaţă
datorită faptului că sunt acoperite cu citrat pentru a prevenii agregarea lor.
Proprietăţile fluorescente ale albuminei bovine (BSA) sunt datorate,
după cum am mai amintit, grupărilor de triptofan ce sunt localizate pe su-
prafaţa proteinei (în domeniul I: Trp-134, grupare expusă mai puternic
influenţei vecinătăţii hidrofilice) şi în interiorul proteinei (în domeniul II:
Trp-213, grupare aflată într-o poziţie hidrofobică).
După cum se observă în figura 8, spectrul de fluorescenţă al soluţiei
pure de BSA (pH = 6, spectrul c) are maximul benzii de emisie la 337 nm,
iar spectrele de fluorescenţă ale soluţiilor de BSA cu valori ale pH-ului 2
(spectrul a), 5 (spectrul b) şi 9 (spectrul d) au maximul benzii de emisie la
324 nm, 336 nm respectiv 339 nm. Deplasarea maximul benzii de emisie
indică faptul că modificarea pH-ului soluţiei duce la obţinerea de stări con-
184
formaţionale diferite ale albuminei. Deplasarea maximului benzii de emisie
spre lungimi de undă mai mici indică faptul că triptofanul din albumina
bovină are o vecinătate mai hidrofobică (se modifică structura terţiară), iar
deplasarea maximului benzii de emisie spre lungimi de undă mari ne indi-
că faptul că triptofanul este mai expus solventului. Astfel, la pH neutru
albumina bovină are o formă nativă (‘N-form’), în timp ce la pH = 2 şi pH =
9 albumina bovină are formă extinsă (‘E-form’) respectiv bazică (‘B- form’).
Emisia de fluorescenţă a albuminei bovine de tipul ‘E-form’ are maximul
deplasat spre albastru, în comparaţie cu emisia albuminei bovine de tipul
‘N-form’, datorită creşterii separaţiei inter-domeniu şi schimbării configu-
raţiei proteinei astfel încât gruparea triptofan are o vecinătate mai hidrofo-
bică.
Figura 8. Spectre de fluorescenţă ale albuminei bovine la pH 2 (a), pH 5 (b), pH 6 (c) şi pH 9 (d).
Pentru a obţine informaţii legate de emisia de fluorescenţă a

triptofanului din albumina bovină la diferite valori ale pH-ului în prezenţa
nanoparticulelor de aur, Iosin şi colaboratorii [5] au folosit o concentraţie
fixă de BSA titrată în cantităţi diferite de soluţie de nanoparticule de aur.
Spectrele de fluorescenţă înregistrate (figura 9) demonstrează scăderea
drastică a emisiei de fluorescenţă (quenching) a triptofanului din albumina
bovină la pH = 2 odată cu creşterea concentraţiei nanoparticulelor de aur
(de la 0,55×10−11 M la 2,75×10−11 M). Din spectrele de fluorescenţă, autorii
au calculat constanta de stingere a fluorescenţei (KSV) folosind ecuaţia
Stern–Volmer:
F0/F = 1 + Kqτ0[GNPs] = 1 + KSV[GNPs]
unde: F0 şi F sunt intensităţile relative de flkuorescenţă ale triptofanului în
absenţa şi în prezenţa nanoparticulelor de aur,
185
Kq este constanta de stingere bimoleculară,
τ0 = 5×10−9 s este timpul de viaţă mediu al albuminei bovine în absenţa
nanoparticulelor de aur,
[GNPs] reprezintă concentraţia nanoparticulelor de aur,
KSV este constanta de stingere Stern–Volmer, ce indică senzitivitatea
fluoroforului la molecula ce determină stingerea fluorescenţei (quencher).
Figura 9. Spectre de fluorescenţă ale grupării triptofan din BSA la pH = 2 pentru diferite concentra-
ţii ale nanoparticulelor de aur: (a) 0, (b) 0,55×10−11 M, (c) 1,1×10−11 M, (d) 1,65×10−11 M, (e)
2,2×10−11 M şi (f) 2,75×10−11 M. Graficul inserat reprezintă curba Stern–Volmer.
Prin fitare liniară s-a obţinut KSV = 1,11×109 M−1. În mod similar au fost
calculate constantele de stingere Stern–Volmer pentru pH = 6 şi pH = 9,
obţinându-se valorile KSV = 1,7×109 M−1 pentru pH = 6 şi KSV = 1,6×109 M−1
pentru pH = 9. Astfel, constanta de stingere bimoleculară Kq a fost calcula-
tă, obţinându-se valorile: Kq = 0,22×1018 M−1 s−1 pentru bioconjugatele BSA–
GNPs la pH = 2, Kq = 0,34×1018 M−1 s−1 la pH = 6, respectiv Kq = 0,32×1018
M−1 s−1 la pH = 9. Valoarea obţinută pentru constanta de stingere bimolecu-
lară Kq este mai mare decât valoarea obţinută (2,0×1010 M−1 s−1) în cazul
stingerii emisiei de fluorescenţă a macromoleculelor biologice datorită me-
canismului de ciocnire. Deci, în cazul bioconjugatelor BSA–GNPs stingerea
emisiei de fluorescenţă nu este iniţiată de ciocniri dinamice ci de formarea
unui complex nefluorescent în urma unui mecanism de stingere static.
Iosin şi colaboratorii [5] au determinat constanta de legătură la echili-
bru Kb (indică echilibrul dintre speciile adsorbante şi cele resorbante), pre-
cum şi numărul siturilor de legătură (n) dintre nanoparticule şi BSA con-
form relaţiilor din pargraful anterior. În urma calculelor s-au obţinut urmă-
toarele valori pentru numărul siturilor de legătură (n): 1,77 la pH 2, 1,97 la
186
pH 6 şi 1,76 la pH 9, respectiv pentru constanta de legătură Kb: 2,6×109 M−1
la pH 2, 1,81×109 M−1 la pH 6 şi 2,03×109 M−1 la pH 9. De menţionat că valo-
rile mai mari ale constantei de legătură indică o atracţie mai puternică între
cele două specii.
Pentru a mima o vecinătate biologică reală, autorii au studiat formarea
bioconjugatelor la pH = 5. Constanta de stingere Stern–Volmer şi constanta
de stingere bimoleculară obţinute pentru această valoare a pH-ului sunt:
KSV = 1,74×109 M−1 şi Kq = 0,348×1018 M−1 s−1. Numărul siturilor de legătură
şi constanta de legătură pentru pH = 5 este: n = 1,85 şi Kb = 2,82×109 M−1,
valori ce indică faptul că adsorbţia maximă a moleculelor de albumină la
suprafaţa nanoparticulelor de aur apare pentru o valoare a pH-ului apropi-
ată de punctul izoelectric (pI) al BSA-ului.
3.3. Monitorizarea denaturării termice a albuminei bovine la diferi-

te valori ale pH-ului
Denaturarea termică a proteinelor este un proces intrinsec, deci deter-
minarea condiţiilor în care are loc acest proces este foarte importantă pen-
tru înţelegerea stabilităţii proteinelor. De fapt, prin creşterea temperaturii
forma nativă a proteinei devine mai flexibilă. Ca urmare a acestui fapt,
grupările –SH libere, sau regiunile hidrofobice devin predispuse la interac-
ţiuni intermoleculare noi. Iosin şi colaboratorii [5] au studiat modificările
structurale ce apar în cazul denaturării termice a albuminei bovine, înainte
şi după absorbţia la suprafaţa nanoparticulelor de aur, analizând emisia de
fluorescenţă a triptofanuluui din BSA. În acest scop, au fost monitorizate
modificările emisiei de fluorescenţă a triptofanului din BSA pentru tempe-
raturi cuprinse între 22 ºC şi 85 ºC (domeniu în care apare o modificare im-
portantă a structurii terţiare a albuminei).
La temperatura camerei, soluţia apoasă pură de BSA are o emisie de
fluorescenţă puternică, cerntrată la 337 nm. Odată cu creşterea temperatu-
rii, maximul benzii de fluorescenţă datorată triptofanului se deplasează
spre numere de undă mai mici, ajungând până la 330 nm (figura 10). Grafi-
cul inserat (denaturation curve) indică o relaţie neliniară între deplasarea
maximului benzii de absorbţie şi temperatură. După cum observă şi autorii,
curba de denaturare a albuminei bovine pure sugerează existenţa a două
temperaturi de tranziţie: una la 43 ºC, iar cealaltă la 65 ºC. La aceste tempe-
raturi apare o modificare a vecinătăţii triptofanului din albumină, deci creş-
terea temperaturii duce la apariţia de modificări structurale ale proteinei.
Platoul curbei de denaturare indică faptul că albumina îşi menţine starea
nativă pînă la aproximativ 42 ºC, prima temperatură de tranziţie apărând în
187
jurul pragului maxim admis al febrei ce apare în condiţii de boală (42 ºC).
Între 43 ºC şi 65 ºC se observă o deplasare spre albastru a maximului emisi-
ei de fluorescenţă a albuminei bovine, deplasare ce sugerează tranziţia al-
buminei de la starea nativă (compactă) la o stare cu o structură mai deschi-
să. Denaturarea completă a proteinei se face după 65 ºC, valoare la care
apare un al doilea platou în curba de denaturare.
Figura 10. Dependenţa de temperatură a emisiei de fluorescenţă a grupărilor de triptofan din albu-
mina bovină, la pH 6. Inserat: curba de denaturare termică (variaţia maximului benzii de fluorescenţă
în funcţie de temperatură - la creşterea şi descreşterea temperaturii).
O dată cu creşterea temperaturii, pe lângă denaturarea proteinei, apare

şi scăderea în intensitate a emisiei de fluorescenţă a triptofanului. Astfel,
creşterea temperaturii de la 22 ºC la 85 ºC determină descreşterea cu 72% a
emisiei de fluorescenţă, datorită expunerii triptofanului la moleculele de
solvent. Prin măsurarea emisiei de fluorescenţă a triptofanului din albumi-
nă în procesul de răcire, s-a determinat faptul că procesul de denaturare
termică a albuminei bovine este ireversibil.
Autorii au studiat efectul combinat al pH-ului şi al temperaturii înainte
şi după conjugarea albuminei bovine cu nanoparticulele de aur, prin com-
pararea denaturării termice (între 22 ºC şi 85 ºC) a proteinei în soluţie pen-
tru diferite valori ale pH-ului (2 - 9). În urma măsurătorilor efectuate s-a
observat o dependenţă accentuată de valoarea pH-ului a temperaturii de
tranziţie la care proteina îşi modifică conformaţia. Astfel, în mediu alcalin
(pH mare) temperatura de tranziţie este mult mai scăzută (32 °C) decât în
mediu neutru (pH = 6) ceea ce indică o denaturare termică mult mai rapidă
în mediu bazic. În mod contrar, în mediu acid (pH mic) proteina este mai
stabilă termic, temperatura de tranziţie la care începe denaturarea termică
este mai mare (46 °C) decât în mediu neutru. După cum se observă în figu-
188
ra 11, bioconjugarea albuminei bovine cu nanoparticule de aur, modifică
forma curbei de denaturare, deci modifică comportarea termică a proteinei.
După cum se observă şi din figura 11, prezenţa nanoparticulelor induce o
deplasare, a emisiei de fluorescenţă, spre numere de undă mari, rezultând
creşterea temperaturii de tranziţie indiferent de valoarea pH-ului. De
exemplu, pentru pH = 6 temperatura de tranziţie creşte de la 42 °C la 47 °C.
Deci, prezenţa nanoparticulelor de aur îmbunătăţeşte stabilitatea termică a
proteinei.
Figura 11. Variaţia maximului emisiei de fluorescenţă a triptofanului din BSA, respectiv din
bioconjugatul BSA-nanoparticule, în funcţie de temperatură pentru diferite valori ale pH-ului.
Pentru a investiga efectul temperaturii asupra fenomenului de stingere

a fluorescenţei albuminei bovine de către nanoparticulele de aur a fost cal-
culată constanta de stingere KSV pentru diferite temperaturi.
Figura 12. Curbele Stern–Volmer pentru stin gerea fluorescenţei BSA-ului de către nanoparticule de
aur (pH = 6). Inserat: dependenţa constantei de stingere Stern–Volmer de temperatură.
189
Graficul Stern-Volmer ce caracterizează stingerea emisie de fluorescen-
ţă a triptofanului din albumina bovină de către nanoparticulele de aur, la
pH 6 pentru diferite temperaturi (295, 318, 338, 358 K) ne indică faptul că
constanta de stingere KSV scade odată cu creşterea temperaturii (figura 12).
Tabelul 2. Constanta de stingere KSV şi parametrii termodinamici pentru

complexul BSA-nanoparticule de aur.
(SD - deviaţia standard pentru valorile coeficientului KSV, R - coeficientul de corelaţie)
pH T (K) KSV (L/mol) SD R ΔH(kJ/mol) ΔS(J/mol K) ΔG(kJ/mol)
6 295 1,70x109 0,0651 0,9994 -48,29
318 1,41x109 0,0782 0,9988 -28,96 81,35 -54,70
338 9,60x109 0,0683 0,9980 -64,32
2 295 1,11x109 0,0601 0,9983 51,11
318 6,88x109 0,0721 0,9982 10,79 132,87 53,59
338 5,05x109 0,0700 0,9975 55,22
Proporţionalitatea inversă dintre constanta de stingere KSV şi tempera-

tură (tabelul 2), confirmă faptul că mecanismul de stingere a fluorescenţei
triptofanului din albumina bovină de către nanoparticulele de aur este ini-
ţiat de formarea unui complex ne-fluorescent prin adiţia moleculelor de
albumină bovină la nanoparticulele de aur.
4. Bibliografie
1. Bernard Valeur, “Molecular Fluorescence: Principles and Applications”, Ed.
Wiley-VCH; (2002).
2. Joseph Lakowicz, “Principles of Fluorescence Spectroscopy”, Ed. Springer; (2006).
3. J.-C. Mialocq and T. Gustavsson, Investigation of femtosecond chemical reactivity
by means of fluorescence up-conversion, Fluorescence Spectroscopy: New Trends
în Fluorescence Spectroscopy, Eds B. Valeur, J.-C. Brochon, Springer Verlag, Berlin
(2001).
4. M. Iosin, F. Toderas, P. Baldeck, S. Astilean, Study of protein-gold nanoparticle
conjugates by fluorescence and surface-enhanced Raman scattering, J. Mol. Struct.
924–926 (2009) 196–200.
5. M. Iosin, V. Canpean, S. Astilean, Spectroscopic studies on pH- and thermally
induced conformational changes of Bovine Serum Albumin adsorbed onto gold
nanoparticles, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, 217,
(2011), 395-401.
6. R.E. Georgescu, E.G. Alexov, M.R. Gunner, Combining conformational flexibility
and continuum electrostatics for calculating pKas în proteins, Biophys. J. 83 (2002)
1731–1748.
7. P.A. Zunszain, J. Ghuman, T. Komatsu, E. Tsuchida, S. Curry, Crystal structural
analysis of human serum albumin complexed with hemin and fatty acid, BMC
Struct. Biol. 3 (2003) 1–9.
190
VI. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ
MAGNETICĂ NUCLEARĂ
Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide

(RMN-S)
C.S.I. dr. Claudiu Filip
C.S.III. dr. Mihaela Aluaş
Cuprins
1. Principiul metodei............................................................................................................... 191
2. Infrastructura existentă la UBB Cluj pentru exprimente RMN-S ..................................... 196
3. Tehnici experimentale de bază pentru aplicaţii RMN-S în sisteme moleculare organice ....... 202
4. Bibliografie .......................................................................................................................... 215
1. Principiul metodei
Generarea semnalului RMN
Spectroscopia RMN se bazează pe fenomenul de rezonanţă magnetică
aplicat asupra momentelor magnetice nucleare μi = γiS, unde S este numă-
rul cuantic de spin, iar γ i reprezintă factorul giromagnetic, asociate speciei
nucleare i. Plasarea probei care conţine momente magnetice nucleare
într-un camp magnetic extern intens, B0 ~ 7-23 T (generat cu ajutorul unei
bobine supraconductoare), are două efecte majore: (i) axa polarizării de
spin efectuează o mişcare de precesie cu frecventa Larmor, ω0,i = - γiB0, în
jurul direcţiei câmpului magnetic static (direcţia z), şi (ii) polarizările spini-
lor, distribuite izotrop în momentul aplicării lui B0, se vor reorienta sub
acţiunea câmpurilor magnetice locale fluctuante uşor datorită mişcării ter-
mice, astfel încât după o perioadă de ordinul aşa numitului timp de relaxare
longitudinal, T1, proba va fi caracterizată de o magnetizare macroscopică
orientată de-a lungul direcţiei câmpului magnetic extern. Principalele pro-
prietăţi ale câtorva nuclee active RMN, cu relevanţă în special pentru sis-
teme moleculare organice, sunt prezentate în tabelul de mai jos:
191
γ iγ ν0,i [MHz]
Specia Abundenţa
S [ 107 rad
nucleară, i naturală [%] B0 = 11.7 T B0 = 21 T
s-1T-1]
1H 1/2 26.8 99.98 500 900
2H 1 4.1 0.02 76.5 137.7
13C 1/2 6.7 1.1 125 225
14N 1 1.9 99.6 35.5 63.9
15N 1/2 -2.7 0.37 50 90
Deoarece magnetizarea longitudinală nu poate genera un semnal RMN,

este necesară mai întâi rotirea polarizării de spin în planul transversal, xy.
Acest lucru se realizează prin aplicarea unui câmp magnetic oscilant cu frec-
venţa ωrf, şi amplitudinea B1, perpendicular pe câmpul magnetic extern: el
este generat de curentul aplicat asupra unei bobine de transmisie în interio-
rul căreia este plasată proba. Deşi în practică B1 << B0, câmpul oscilant (nu-
mit şi câmp de radiofrecvenţă, rf) va determina o mişcare de precesie cu frec-
venţa ω1,i = γiB1 a polarizării spinilor i în jurul direcţiei lui B1 dacă ωrf satisface
condiţia de rezonanţă, ωrf = ω0,i, sau este apropiată de aceasta: în literatura
RMN această precesie este deseori denumită nutaţie. Pentru valori tipice ale
lui B1 utilizate în spectroscopia RMN-S, frecvenţa de nutatie ν1,i = ω1,i /2π este
de ordinul zecilor de kHz, astfel încât rotirea magnetizării în plan transversal
(ω1,i tp = π/2) necesită aplicarea câmpului rf pe durata tp de ordinul câtorva µs,
adică sub forma unui puls. După încetarea acţiunii pulsului rf magnetizarea
Figura 1
192
transversală va precesa liber în jurul lui B0. Această mişcare induce un curent
electric oscilant pe bobina de detecţie (aceeaşi cu bobina de transmisie) ce
poartă numele de semnal RMN, sau FID (free-induction decay). FID-ul este în-
registrat în intervalul de timp t2, numit timp de achiziţie, pe durata căruia se
produce defazarea polarizării transversale, astfel încât amplitudinea lui se
apropie de zero. După o perioadă de aproximativ t0 ~ 5T1 polarizarea de spin
se reconstruieşte de-a lungul direcţiei z şi experimentul poate fi repetat. De-
scrierea de mai sus se referă la aşa-numitul experiment RMN de “un puls”, şi
este ilustrat schematic în Fig. 1.
Detecţia semnalului RMN

Aplicând transformata Fourier asupra FID-ului se obţine reprezentarea
acestuia în domeniul de frecvenţă, adică spectrul RMN. Atât semnalul în
domeniul temporal, cât şi cel în domeniul de frecvenţă, conţin o parte reală
şi una imaginară, corespunzător modului de detecţie în cuadratură. Cu ajuto-
rul experimentului din Fig. 1 se obţine un spectru RMN 1D (uni-
dimensional) ale cărui proprietăţi (poziţii, forme şi intensităţi de linie) de-
pind în mod esenţial de interacţiunile la care sunt supuşi spinii nucleari pe
durata t2. Considerând doar interacţiunea cu câmpul static extern, B0, spec-
trul asociat speciei nucleare i ar conţine o singură linie la poziţia frecvenţei
Larmor asociate, ω0,i, iar conţinutul lui de informaţii ar fi extrem de sărac. În
realitate, prezenţa aşa-numitor interacţiuni de spin interne conduce la valori
ale câmpului magnetic local la poziţiile diferitor spini i uşor diferite de B0,
şi deci implicit la apariţia mai multor linii în spectrul RMN 1D. Parametrii
spectrali, de exemplu deplasările (faţă de ω0,i), despicările şi/sau lărgirile
liniilor individuale sunt în directă conexiune cu elemente de structură chi-
mică/spaţială bine determinate, şi constituie astfel baza multiplelor aplica-
ţii ale spectroscopiei RMN în (bio)chimie, ştiinţa materialelor, etc. Frecven-
ţele asociate interacţiunilor de spin interne sunt mult mai mici decât frec-
venţele Larmor, ceea ce face ca pentru fiecare specie nucleară i, să existe o
fereastră spectrală de lărgime limitată, ΔΩi << ω0,i, în jurul lui ω0,i care conţine
întregul spectru RMN-1D al speciei nucleare respective. În acest context,
soluţia practică utilizată în spectroscopia RMN modernă corespunde
aşa-numitului mod de lucru pe canale rf distincte, adică înregistrarea de
spectre RMN distincte pentru fiecare specie nucleară în parte, precum este
cel ilustrat în Fig. 2 în cazul nucleelor 13C:
193
Figura 2
Interacţiunile de spin cu relevanţă în aplicaţiile spectroscopiei RMN-S

pe probe organice, sunt interacţiunea dipolară (homo- şi heteronucleara),
interacţiunea de ecranare chimică, şi interacţiunea scalară (cuplajul J). Pri-
mele două sunt dominante în cazul nucleelor cu spin ½ (având constante
de cuplaj de la câţiva kHz până la aproximativ 100 kHz) şi au un caracter
anizotrop. Ele produc în general spectre cu linii foarte largi caracterizate
prin suprapuneri severe ce fac imposibilă extragerea de informaţii utile. În
consecinţă, au fost dezvoltate o serie de tehnici speciale numite de decupla-
re: ele acţionează în sensul atenuării efectului produs de anizotropia inter-
acţiunilor de spin şi conduc la spectre RMN-S de înaltă rezoluţie, cu linii
suficient de înguste încât să permită identificarea componentelor izotrope
ale acestora. De exemplu, poziţiile liniilor în spectrul 13C din Fig. 2 sunt
determinate de valorile izotrope ale ecranării chimice, aşa-numitele depla-
sări chimice. Deplasările chimice reflectă deplasările frecvenţei de precesie
la diferite poziţii ale nucleelor 13C în sistemul molecular investigat faţă de
valoarea ω0,C ca urmare a diferenţelor în intensitatea câmpului magnetic
local indus de distribuţia electronică din vecinătate, şi sunt prin urmare
reprezentative pentru gruparea chimică din care nuceele respective fac par-
te. În acest mod, spectre RMN 1D precum cel ilustrat în Fig. 2 sunt utile
pentru determinarea structurii chimice, prin identificarea grupărilor chimi-
ce distincte din moleculă în funcţie de regiunea spectrală specifică în care se
plasează liniile RMN.
194
Noţiunile introductive vor fi completate în final cu câteva precizări uti-
le, menite să asigure legătura între baza conceptual-teoretică prezentată
mai sus şi elementele concrete cu caracter aplicativ, privind implementarea
lor concretă în practica curentă:
• Un spectrometru RMN este caracterizat în mod tradiţional prin va-
loarea frecvenţei Larmor a spinilor 1H în câmpul magnetic al acestu-
ia (de exemplu un spectrometru cu un criomagnet care produce un
câmp B0 = 11.7 T va fi denumit spectrometru de 500 MHz)
• Pentru a obţine un spectru RMN de calitate (cu raport semnal/zgomot
cât mai mic) este în general nevoie de înregistrarea unui număr N de
FID-uri, cu un timp de repetiţie determinat de valoarea lui t0 (conform
Fig. 1), care vor fi adunate pentru a genera semnalul RMN final. Valoa-
rea optimă a lui N (denumit număr de scanuri în terminologia de spe-
cialitate) depinde pentru fiecare specie nucleară de sensibilitatea asoci-
ată. Aceasta din urmă este dată în principal de cantitatea de probă,
câmpul magnetic static, factorul giromagnetic, abundenţa izotopică şi
numărul de poziţii chimice distincte în sistemul studiat. Pentru exem-
plificare, spectrul RMN-S 13C a unui compus în faza policristalină cu
izotopul 13C în abundenţă naturală şi cu un număr de până la 10 poziţii
chimice distincte a carbonilor din moleculă necesită acumularea unui
număr de ordinul miilor de scanuri pentru a obţine un raport sem-
nal/zgomot acceptabil (> 30), în timp ce pentru un spectru 1H de cali-
tate este suficientă înregistrarea unui singur scan.
• Poziţiile liniilor într-un spectru RMN sunt date fie în unităţi absolu-
te de frecvenţă (Hz), ca şi deplasare faţă de o linie de referinţă carac-
teristică fiecărei specii nucleare, fie în unităţi relative numite părţi
pe milion (ppm) care reprezintă raportul dintre această deplasare
faţă de frecvenţa de referinţă şi frecvenţa Larmor a speciei respecti-
ve. Cel de-al doilea mod este de obicei preferat pentru că poziţiile
liniilor într-un compus dat vor fi aceleaşi indiferent de valoarea
câmpului magnetic .
• Un puls rf se caracterizează prin trei parametri distincţi: (i) unghiul
α de rotire a magnetizării faţă de direcţia z – aşa-numitul unghi de
tilt (de exemplu α = π/2, π, etc.); (ii) faza pulsului, care reprezintă
unghiul φ pe care îl face B1 faţă de axa Ox; şi (iii) frecvenţa de offset,
Δωi = ωrf - ω0,i, în cazul în care ωrf nu este exact în rezonanţă cu frec-
venţa de precesie Larmor a speciei nucleare i.
• Fiecare specie nucleară distinctă este caracterizată de o aşa-numită
fereastră spectrală de lărgime limitată în interiorul căreia se plasea-
ză toate liniile RMN posibile: de exemplu lărgimile tipice ale acestei
195
ferestre spectrale sunt de aproximativ 20 ppm (pentru 1H), 300 ppm
(pentru 13C), şi 500 ppm (pentru 15N).
• Achiziţionarea directă a semnalului RMN (pe durata lui t2 în Fig. 1)
se realizează în mod discret (digital) cu un timp de eşantionare nu-
mit dwell time. În consecinţă, transformarea Fourier se va aplica asu-
pra acestui semnal digitizat, şi se realizează utilizând aşa-numitul
algoritm FFT (fast Fourier transform).
• Exemplul prezentat în Fig. 1 prezintă cel mai simplu experiment
posibil în spectroscopia RMN. De-a lungul timpului a fost dezvolta-
tă o diversitate foarte mare de tehnici RMN complexe care presu-
pun aplicarea de secvenţe multi-puls extrem de sofisticate, simultan
pe mai multe canale rf, şi permit extragerea selectivă a informaţiilor
dorite. Referinţe detaliate cu privire la fundamentarea teoretică a
acestor tehnici moderne, precum şi la implementarea lor experimen-
tală, pot fi găsite în literatura de specialitate.
2. Infrastructura existentă la UBB Cluj pentru experimente

RMN-S
Descrierea componentelor hardware
Laboratoarele Centrului Naţional de Rezonanţă Magnetică (CNRM) sunt
dotate cu două spectrometre Bruker, achiziţionate în anii 2002 şi 2009.
Magnetul acestora este autoecranat, această tehnologie fiind introdusă chi-
ar de firma Bruker în 1996, iar câmpul generat de acesta este de 9,4 Tesla,
respectiv 14,1 Tesla cu frecvenţa de rezonanţă pentru nucleii de hidrogen
de 400 MHz şi 600MHz.
Spectrometrul Bruker DRX 400 din dotarea CNRM
196
Spectrometrele Bruker DRX 400 şi Bruker DRX 600 sunt complet digitale iar
controlul acestora se face în totalitate prin intermediul unui calculator de tip
PC. Ambele sisteme pot analiza atât probe în stare condensată cât şi probe în
stare lichidă. Pentru studiul probelor solide există în dotare mai multe capete
de sondă care permit efectuarea experimentelor la temperaturi între -80 °C şi
200 °C, iar rotirea mecanică a probei se poate face la o frecvenţă de rotatie de
până la 35 kHz. Pot fi efectuate măsurători spectroscopice de rezonanţă magne-
tică nucleară pe o gamă foarte largă de nuclee: 1H, 13C, 15N, 57Fe, 27Al, 69Ga etc.
Magnetul spectrometrului Bruker DRX 600 din dotarea CNRM
Unitatea MAS folosită

pentru controlul au-
tomat sau manual al
rotirii probelor solide
la unghiul magic
197
Capul de probă folosit pentru măsurăto-
rile pe probe solide introdus în câmpul
magnetic static. Se pot observa conectă-
rile acestui cap de probă la surse de aer
necesar atât pentru rotirea probei la un-
ghiul magic cât şi pentru controlul
temperatuii probei. Se mai poate observa
şi conexiunea cablului care serveşte la
detectarea, prin intermediul fibrei optice,
a vitezei de rotaţie a probei.
În imaginea de mai sus se poate observa rotorul şi instrumentaţia specifi-

că, necesară introducerii şi tasării substanţei de măsurat precum şi scoate-
rii acesteia din rotor.
Descrierea componentelor software

Pentru comanda modulelor electronice ale unui spectrometru RMN
există pachete software specializate prin intermediul cărora elementele dis-
tincte ale unui experiment RMN sunt transpuse în comenzi specifice. În
cazul spectrometrelor Bruker, soft-ul de comandă se numeşte XWin NMR
(până la generaţia Avance II), şi respectiv TopSpin, începând cu generaţia de
spectrometre Avance III. Corespunzător echipamentelor existente la UBB
Cluj, primul este instalat pe spectrometrul Bruker DRX 400, iar programul
TopSpin comandă spectrometrul Bruker DRX 600. Cele două versiuni ale
soft-ului de comandă Bruker diferă prin interfaţa grafică şi prin numărul
198
sporit de scripturi pentru calibrarea parametrilor experimentali existente în
TopSpin dar, în rest, ele sunt echivalente la nivel conceptual. De aceea, în
continuare vom face o foarte scurtă prezentare axată pe evidenţierea
principiior fundamentale, comune ambelor programe:
• Comanda unui experiment RMN se realizează prin intermediul aşa
numitului program de pulsuri (pulse program) care specifică acţiuni-
le aplicate în cadrul experimentului, durata fiecăruia dintre acestea
şi, în funcţie de tipul acţiunii, o serie de proprietăţi specifice
• Primul tip de acţiuni corespunde elementelor standard ale unui ex-
periment RMN (precum cel ilustrat în Fig. 1), respectiv: pulsuri rf,
perioade de evoluţie liberă şi perioada de achiziţie directă. Ele au
asociate următoarele comenzi specifice în programul de pulsuri: pn
(p – puls, n = 0 ... 31 – indicele asociat), dn (d – delay, n = 0 ... 31 – in-
dicele asociat), şi go=n (go – este un script care transmite comenzi
specifice receptorului pentru achiziţionarea digitală a semnalului
RMN, iar n este eticheta liniei de comandă care va fi efectuată după
încheierea achiziţiei)
• În programul de pulsuri prezentat mai jos (care implementează ex-
perimentul RMN de un puls în Fig. 1), comanda referitoare la apli-
carea pulsului rf este p1:f1 ph1. Ea specifică durata acestuia, p1, pre-
cum şi faptul caă este aplicat pe canalul f1, cu faza ph1. Valorile lui
p1 şi f1 sunt introduse explicit de către utilizator în aşa numita tabe-
la de achiziţie (acquisition table), prin intermediul unor variabile care
poartă acelaşi nume. Faza ph1 este în schimb explicitată la sfârşitul
programului de pulsuri (valorile corespund convenţiei Bruker în ca-
re 0, 1, 2 şi 3, reprezintă fazele 0, 90, 180 şi respectiv 2700, iar în re-
prezentarea modelului vectorial, x, y, -x şi –y). Pentru o privire
completă a modului de lucru cu fazele, incluzând cazul general în
care acestea nu sunt multipli de 900, se recomandă consultarea ma-
nualului de utilizare Bruker.
• Sensibilitatea spectrală maximă se obţine pentru o valoare α = 900 a
unghiului de tilt pentru pulsul p1 (asa-numitul puls de 900). În prac-
tică, calibrarea acestui puls se realizează prin fixarea duratei lui p1,
de exemplu la 2.5 μs, după care se ajustează puterea la ieşire a
transmiţătorului astfel încât curentul transmis pe bobină să producă
o intensitate B1 a câmpului rf care să corespundă unui puls de 900
(în cazul exemplificat, ν1 trebuie să fie 100 kHz, conform relaţiei
2πν1tp = π/2). În mod similar se procedează şi în cazul în care se cali-
brează un puls cu orice altă valoare a unghiului de tilt, α, necesar în
experimentul considerat.
199
• Nivelul de putere al unui puls rf este cel specificat în programul de
pulsuri anterior comenzii de aplicare a pulsului respectiv, în exem-
plul nostru, pl1, iar valoarea lui este introdusă explicit în tabela de
achiziţie. În convenţia Bruker, valorile pln sunt date în decibeli (dB),
şi corespund atenuării care trebuie aplicată la ieşirea transmiţătoru-
lui pentru a obţine valoarea dorită a câmpului rf pe bobina.
• Linia de comandă 2 d1 din programul de pulsuri de mai jos repre-
zintă o perioadă de durată d1 (a cărei valoare este introdusă explicit
în tabela de achiziţie) în care intensitatea câmpului rf trans-
mis/receptat este zero. Ea reprezintă aşa numitul delay, iar în exem-
plul nostru concret d1 corespunde unei valori rezervate, respectiv
recycle delay, adică timpul necesar reconstruirii magnetizării longi-
tudinale după detecţia sa. Din acest motiv, linia de comandă are în
faţă indicele 2, ce reprezintă punctul de unde experimentul RMN se
repetă, pentru a achiziţiona un nou scan: acest fapt este explicitat în
linia de comandă asociată achiziţiei semnalului RMN, go=2 ph31,
unde ph31 este faza receptorului). În experimente multi-puls mai
complexe, în afară de recycle delay vor exista mai multe perioade de
evoluţie liberă a sistemului, de exemplu între pulsuri rf consecutive,
care vor fi specificate prin comenzi de tipul dn.
• Al doilea tip de acţiuni specificate într-un program de pulsuri nu au
echivalent în schema standard a unui experiment RMN. Ele cores-
pund în general unor comenzi care se aplică asupra modulelor elec-
tronice, cu scopul comutării lor între diferite regimuri de funcţiona-
re, şi sunt necesare pentru implementarea practică a elementelor
componente în experimentul RMN dat (de exemplu comutarea
frecvenţelor de offset, a fazelor, a nivelurilor de putere la ieşirea
transmiţătorului, scrierea datelor achiziţionate etc.) şi au asociat un
timp (ideal cât mai scurt) pe durata căruia comutarea se poate reali-
za din punct de vedere fizic. În exemplul de mai jos, aceste tipuri de
acţiuni sunt reprezentate de comenzile: 1 ze (efectuează resetarea
tuturor modulelor electronice la valorile lor iniţiale), 2us pl1:f1 (pe
durata unui delay fixat la 2 μs se setează atenuatorii la ieşirea
transmiterului la valoarea specificată prin parametrul de achiziţie
pl1, astfel încât orice comandă pn care apare după aceasta linie va
aplica un puls rf de durata pn şi cu un nivel de putere pl1), wr #0
(scrie în memorie datele achiziţionate, adică semnalul RMN digiti-
zat), şi exit (comanda de încheiere a experimentului).
200
• Liniile care încep cu ; reprezintă linii de comentarii: ele sunt necesa-
re (în special în cazul experimentelor multi-puls mai complexe) pen-
tru a explicita semnificaţia parametrilor incluşi în programul de
pulsuri asociat.
• După cum s-a precizat mai sus, valorile numerice ale parametrilor
incluşi în programul de pulsuri sunt specificate în tabela de achiziţie.
În afară de aceştia, tabela de achiziţie va mai conţine în mod obliga-
toriu şi alţi parametri caracteristici experimentelor RMN, care oferă
informaţii cu privire la: tipul de experiment (1D, 2D, etc.); numele
programului de pulsuri utilizat în experimentul considerat
(pulprog); tipul nucleului asociat cu canalele rf utilizate în experi-
mentul dat ( f1, f2, etc.); numărul de scanuri (ns) – numărul de sem-
nale RMN achiziţionate direct şi adunate între ele în scopul reduce-
rii nivelului de zgomot la un nivel acceptabil; dewll time (dw) – du-
rata de eşantionare a semnaluilui RMN digitizat, adică durata între
două puncte consecutive; tipul de achiziţie directă (qsim – în cuadra-
tură, colectând simultan puncte în partea reală şi imaginară a sem-
nalului RMN, qseq – în cuadratură, dar colectând altenativ puncte în
partea reală şi imaginară a semnalului RMN, etc.); domeniul tempo-
ral (td) – numărul de puncte achiziţionate, exprimate de obicei în
multiplii de 16; frecvenţele de offset pe canalele pe care se lucrează
(o1, pe canalul f1, o2, pe canalul f2, etc.) – se exprimă în Hz sau ppm,
şi reprezintă devierea (cu + sau -) faţă de frecvenţa de bază pe cana-
lul respectiv (sf1, sf2, etc. : pentru fiecare nucleu aceasta este fixată în
momentul configurării spectrometrului). Aceştia sunt parametri cei
mai importanţi în cadrul unui experiment RMN tipic, însă reprezin-
tă doar o mică parte din numărul total de parametri posibili (câţi
anume dintre aceştia sunt utilizaţi efectiv într-un experiment dat
depinde de complexitatea lui). Pentru o descriere detaliată, se reco-
mandă consultarea manualelor Bruker.
• După achiziţionarea semnalului RMN, acesta trebuie supus trans-
formării Fourier pentru a genera spectrul RMN. Parametri specifici
acestui proces sunt incluşi în aşa numita tabelă de procesare, iar tipul
şi numărul acestor parametri depinde de complexitatea experimen-
tului avut în vedere. Pentru detalii, de asemenea, se recomandă
consultarea manualelor Bruker.
201
# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/zg"
;1D sequence
# 1 "C:/Bruker/XWIN-NMR/exp/stan/nmr/lists/pp/Avance.incl" 1
;Avance2.incl
1 ze
2us pl1:f1
2 d1
p1:f1 ph1
go=2 ph31
wr #0
exit
ph1=0 2 2 0 1 3 3 1
ph31=0 2 2 0 1 3 3 1
;pl1 : f1 channel - power level for pulse (default)

;p1 : f1 channel - high power pulse
;d1 : relaxation delay; 1-5 * T1
3. Tehnici experimentale de bază pentru aplicaţii RMN-S în

sisteme moleculare organice
Tehnici specifice de înaltă rezoluţie în solide: rotirea în jurul unghiului
magic (MAS – Magic Angle Spinning), decuplarea homonucleară, şi decu-
plarea heteronucleară
Aspectul liniilor de rezonanţă dintr-un spectru RMN 1D, obţinut spre
exemplu cu ajutorul experimentului de un puls ilustrat în Fig. 1 diferă fun-
damental în funcţie de starea de agregare a probei, respectiv lichidă sau
solidă. Spectrele compuşilor în soluţie sunt caracterizate de o rezoluţie foar-
te bună, datorată mişcării moleculare rapide: prin aceasta, efectul compo-
nentelor anizotrope ale interacţiunilor de spin prezente în sistem este me-
diat la zero, păstrându-se doar partea lor izotropă. În stare solidă mişcarea
rapidă de reorientare moleculară este absentă, fapt care duce la menţinerea
caracterului anizotrop al interacţiunilor de spin şi, implicit, la lărgirea linii-
lor de rezonanţă. Anizotropia interacţiunilor prezintă pe de o parte deza-
vantajul de a conduce la pierderea rezoluţiei prin suprapunerea liniilor
RMN: în Fig. 3 este ilustrată comparaţia dintre un spectru 1H RMN tipic al
unui compus organic în soluţie, caracterizat de rezoluţie înaltă, adică un
spectru cu linii de rezonanţă înguste şi bine separate în funcţie de deplasă-
rile chimice izotrope, şi spectrul aceluiaşi compus aflat în stare solidă, în
202
care se observă cu usurinţă pierderea completă a rezoluţiei prin suprapu-
nerea severă a liniilor RMN.
Figura 3 Comparaţie între spectrul 1H RMN

static al unui compus organic tipic în stare
solidă (a) şi în stare lichidă (b)
Pe de altă parte, manifestarea caracterului anizotrop al interacţiunilor de

spin în probe solide prezintă şi avantaje de ordin practic, deoarece compo-
nentele anizotrope conţin informaţii importante cu privire la structura şi di-
namica din sistem. În mod explicit, anizotropia ecranării chimice furnizează
informaţii despre structura electronică (prin tipul orbitalilor moleculari) şi
legăturile dintre atomi, iar anizotropia cuplajului dipolar conţine informaţii
despre distanţele internucleare. Având în vedere toate aceste considerente,
rezultă necesitatea dezvoltării de metode specifice ale spectroscopiei RMN-S
care să conducă în cadrul aceluiaşi experiment la două efecte distincte: (i) pe
durata anumitor perioade ale experimentului să se obţină medierea compo-
nentelor anizotrope ale interacţiunilor de spin, care să conducă la separarea
liniilor RMN-S în funcţie de deplasările chimice izotrope ale diferitelor gru-
pări chimice din sistemul molecular investigat, adică la rezoluţie spectrală
înaltă şi (ii) reintroducerea selectivă pe durata celorlate perioade ale
exeprimentului a unor componente anizotrope ale interacţiunilor de spin
(care să afecteze mărimi spectrale altele decât lărgimile de linie), pentru a
codifica în spectrul obţinut şi informaţii specifice cu privire la structura
şi/sau dinamica moleculară din sistem – în acest scop sunt aplicate aşa nu-
mitele metode de recuplare, care vor fi introduse în raportul următor.
Pentru a diminua efectul negativ al anizotropiei interacţiunilor de spin
în spectroscopia RMN-S, la mijlocul anilor ’50 a fost introdusă tehnica MAS
203
(Magic Angle Spinnining) în cadrul căreia proba este rotită în jurul unei axe
înclinate la un unghi, numit “unghiul magic”, în raport cu direcţia câmpu-
lui magnetic static. Această metodă, ilustrată schematic în Fig. 4, mediază
efectul anizotropiei interacţiunilor de spin prin faptul că rotaţia mecanică a
probei determină oscilaţia în timp a termenilor anizotropi şi prin aceasta
micşorează efectul lor de lărgire asupra liniilor RMN.
Figura 4
Majoritatea metodelor RMN-S moderne de înaltă rezoluţie sunt aplica-

te în condiţii de rotaţie a probei în jurul unghiului magic. Conform descrie-
rii teoretice de mai sus, mecanismul de îngustare prin MAS a liniilor RMN
în solide se bazează pe manipularea părţii spaţiale a hamiltonianului de
interacţiune: termenii anizotropi ai acestuia în proba rotită se descompun
într-o componentă statică, care devine zero când axa de rotaţie este înclina-
tă la unghiul magic în raport cu direcţia câmpului magnetic static, şi două
componente dependente de timp ce corespund unei modulări periodice cu
frecvenţele υR, şi respectiv 2υR. După cum se va prezenta în continuare,
efectul termenilor modulaţi devine din ce în ce mai mic cu creşterea
frecvenţtei de rotaţie a probei: în perioada scursă de la introducerea meto-
dei MAS şi până în prezent tehnologia în domeniu a avansat extrem de
mult, permiţând rotaţii de până la 70 kHz ale probei în jurul unghiului ma-
gic. De asemenea, trebuie menţionat că, în funcţie de forma explicită a
hamiltonienilor asociaţi acestor interacţiuni, efectul lor asupra dinamicii de
spin, şi implicit asupra lărgirii liniilor RMN, va fi diferit. Din acest punct de
vedere, se pot evidenţia două cazuri distincte: (i) interacţiuni neomogene
(deplasarea chimică şi interacţiunea dipolară heteronucleară pentru care
[ H (t1 ), H (t2 )] = 0, ∀ t1 , t2 şi (ii) interacţiuni omogene (interacţiunea dipola-
204
ră homonucleară în sisteme multi-spin) pentru care
[ H (t1 ), H (t2 )] ≠ 0, ∀ t1 , t2 .
Pentru a ilustra efectul interacţiunilor omogene asupra formei şi lărgimii
liniilor de rezonanţă, în Fig. 5 sunt prezentate spectrele 1H RMN pentru dife-
rite frecvenţe de rotaţie υR în cazul a doi compuşi organici, caracterizaţi prin
dinamica moleculară complet diferită, respectiv adamantanul şi
policarbonatul. În aceste două cazuri, se consideră acţiunea Hamiltonienilor
de tip omogen, datoraţi interacţiunii dipolare homonucleare în sisteme
multi-spin. Evoluţia lărgimii liniilor RMN, pornind de la cazul static până la
domeniul de frecvenţe înalte (35 kHz), exemplifică modalitatea prin care
frecvenţa de rotaţie acţionează asupra caracterului omogen al interacţiunilor
de spin din sistem. Astfel, în cazul static se obţine doar un spectru foarte larg,
fără rezoluţie, iar pentru υR ~ 3 kHz, încep să se contureze atât linia centrală
de rezonanţă, precum şi benzile de rotaţie laterale, care apar la multiplii în-
tregi ai frecvenţei de rotaţie. Mergând spre limita superioară a frecvenţei de
rotaţie, forma spectrelor se apropie de cea întalnită în cazul în care predomi-
nă interacţiunile neomogene.
Figura 5 Spectele 1H RMN-MAS ale adamantanului (a), respectiv ale policarbonatului (b), pentru
frecvenţe de rotatie în intervalul 0 – 35 kHz
Un pas foarte important în îmbunătăţirea rezoluţiei spectrale pentru

sisteme de tip multi-spin, în care datorită numărului mare de protoni inter-
205
acţiunea dipolară homonucleară, de tip omogen, este predominantă, constă
în combinarea tehnicii MAS cu metode de decuplare homonucleară. Aces-
tea presupun aplicarea pe canalul 1H (care este şi canalul de detecţie) a
unor secvenţe de pulsuri adecvate care să conducă la medierea efectului
produs de interacţiunile dipolare homonucleare. De exemplu, una dintre
secvenţele intens utilizate în prezent, deoarece este aplicabilă în cazul rotirii
probei cu frecvenţe înalte de ordinul a 65 – 70 kHz, se numeşte DUMBO. În
Fig. 6 este prezentat spectrul 1H al dipeptidei β-L-Asp-L-Ala obţinut rotind
proba cu υR= 65 kHz (a), iar apoi prin aplicarea celor două tehnici - MAS şi
decuplare homonucleră cu ajutorul secvenţei DUMBO (b). Comparând
spectrele obţinute se observă o creştere apreciabilă a rezoluţiei spectrale în
cazul decuplării homonucleare, astfel încât lărgimea liniei grupării metil
scade de la 1.1 ppm în cazul (a), la 0.32 ppm în cazul (b).
Figura 6
În clasa metodelor de decuplare homonucleră, pe lângă mai sus amintita me-

todă DUMBO, mai pot fi enumerate şi FSLG, PMLG, precum şi RNnυ şi SAM
(Smooth Amplitude Modulation), ultimele două metode fiind aplicate în tim-
pul perioadei de evoluţie indirectă a experimentelor de tip bidimensional.
În cazul sistemelor de spini cu factor giromagnetic mic (de exemplu 13C
sau 15N) în abundenţă naturală (adică separaţi prin distanţe mari) cuplajele
dipolare devin neglijabile, astfel încât interacţiunea dominantă din sistem ră-
mâne ecranarea chimică (cu componentele ei izotropa, respectiv anizotropa).
206
În acest caz, este de aşteptat în principiu ca odată cu creşterea frecvenţei de
rotaţie a probei să se obţină spectre cu rezoluţie şi sensibilitatea spectrală din ce
în ce mai înalte. Din punct de vedere teoretic, evoluţia cu frecvenţa de rotaţie a
liniilor într-un spectru RMN 1D într-un sistem de trei spini 13C care nu interac-
ţionează dipolar dar sunt supuşi ecranării chimice este prezentată în Fig. 7.
Spectrul static al L-Alaninei prezintă

caracteristicile tipice întâlnite în cazul unui
sistem de spini izolaţi, în care se consideră
doar efectul ecranării chimice, liniile de
rezonaţă fiind largi, centrate la valori ale
deplasării chimice izotrope asociate fiecărei
grupări chimice. Forma liniilor este dată de
valoarea parametrului de asimetrie, adică
η =1 în cazul grupării COO-, 0.5 pentru
CH2, respectiv 0.3 pentru CH3. La o frec-
venţă de rotaţie mică, υR= 1 kHz, liniile
celor trei grupări se descompun într-o serie
de benzi de rotaţie laterale, situate la mul-
tiplii întregi ai frecvenţei de rotaţie. Odată
cu creşterea lui υR până la valori mari, in-
tensităţile benzilor rotaţionale se reduc
semnificativ astfel încât un spectru MAS de
înaltă rezoluţie va conţine cu o bună apro-
ximaţie doar linii poziţionate la valori ale
deplasărilor chimice izotrope corespunză-
toare grupărilor chimice din probă.
Situaţia prezentată în Fig. 7 corespun-
de unui model teoretic idealizat, care ilus-
trează comportarea în condiţii de MAS a
unor interacţiuni de spin de tip pur neo-
mogen: în realitate, nucleele 13C (15N) sunt
Figura 7 Evoluţia cu frecvenţa de înconjurate în compuşii organici de un
rotaţie a liniilor de rezonanţă din număr mare de protoni, astfel încât efectul
spectrul RMN 13C al L-alaninei, în
prezenţa ecranării chimice interacţiunilor suplimentare datorate aces-
tora nu poate fi neglijat în practică. Chiar şi
în cazul frecvenţelor de rotaţie mari se vor obţine linii de rezonanţă ale 13C
(15N) cu lărgimi reziduale mari dacă se foloseşte doar tehnica MAS. Pentru
a creşte rezoluţia spectrală în aceste cazuri este nevoie de combinarea teh-
207
nicii MAS cu o tehnică suplimentară numită decuplare heteronucleară în
scopul de a se limita efectul de lărgire produs de protonii din vecinătate. În
esenţă, această tehnică constă în aplicarea pe canalul 1H a unui câmp rf
intens, sub formă continuă sau de pulsuri cu modulaţie în fază, în timpul
achiziţionării semnalului RMN pe canalul 13C (15N).
Figura 8
După cum se observă în Fig. 8 pentru cazul spectrului RMN pe 13C al

L-alaninei măsurat la o frecvenţă de rotaţie de 10 kHz, utilizarea decuplării
heteronucleare în condiţii de MAS conduce la linii de rezonanţă înguste,
bine separate, poziţionate la valori ale deplasării chimice izotrope caracte-
ristice fiecărei grupări structurale, asemănătoare celor simulate pentru ca-
zul idealizat al interacţiunilor pur neomogene (Fig. 7). Lărgimile liniilor
pentru toate cele trei grupări sunt în intervalul 20 – 50 Hz, cu o diferenţă de
un ordin de mărime faţă de valorile întâlnite în mod uzual în cazul compu-
şilor în stare lichidă.
Calibrarea parametrilor pe canalul 1H cu ajutorul experimentului de un

puls
Pentru calibrarea nivelului de putere (sau echivalent, valoarea B1 a
câmpului rf exprimat în kHz) generat de transmiter pe canalul 1H în funcţie
de valoarea atenuării (in dB) se utilizează experimentul simplu de un puls
din Fig. 1, al cărui program de pulsuri este listat la finalul Secţiunii 2. Din
punct de vedere practic, procedura constă în următoarele:
• Se utilizează adamantanul drept probă standard pentru calibrarea
nivelurilor de putere pe canalul protonilor deoarece spectrul
208
RMN-S 1H al acestui compus constă dintr-o singură linie, cu lărgime
mai mică decât a altor compuşi organici în fază solidă (sub 1 kHz
pentru frecvenţe de rotaţie a probei mai mari decât 10 kHz). Aceste
proprietăţi favorabile conduc la o sensitivitate şi o rezoluţie foarte
bună care permit calibrarea rapidă şi precisă a pulsului de 1800 (du-
pă cum se va descrie mai jos), şi se datorează faptului că molecula
de adamantan nu este rigidă în reţeaua cristalină ci efectuează miş-
cări rapide de rotaţie simultan în jurul a trei axe de simetrie, ceea ce
reduce foarte mult tăria cuplajelor dipolare 1H-1H
• După plasarea probei în magnet, şi stabilizarea rotaţiei la frecvenţa
aleasă, se procedează la operaţiunile preliminare standard de acor-
dare a frecvenţei de rezonanţă şi a impedanţelor (aşa numitele
tuning şi matching). În funcţie de capul de probă folosit, se recoman-
dă utilizarea unor frecvenţe de rotaţie cuprinse între 10 şi 30 kHz
• Se începe apoi procedura de calibrare a puterilor pe canalul protoni-
lor prin rularea repetată a experimentului de un puls (programul de
pulsuri redat mai sus, şi se utilizează comanda zg), în cadrul căruia
se modifică durata pulsului (p1) şi nivelul de putere asocial (pl1) şi
se înregistrează spectrul RMN-S 1H al adamantanului. Modificarea
acestor parametri se poate face înscriind valorile dorite în tabela de
achiziţie, sau direct prin comenzile p1 <valoare> (in us), şi respectiv
pl1 <valoare> (in dB)
• Mai întâi se fixează durata pulsului p1 astfel încât aceasta să cores-
pundă unui puls de 1800 pentru un set de valori dorite ale câmpu-
lui rf pe canalul 1H (de exemplu, p1 = 5, 6.67, şi 10 us, pentru câm-
puri de 100, 75 şi 50 kHz). Pentru fiecare dintre aceste valori fixe se
baleiează parametrul pl1 până când intensitatea liniei din spectrul
RMN-S înregistrat devine zero. Se recomandă calibrarea în ordinea
descrescătoare a câmpului rf , caz în care se va putea începe cu o va-
loare de strat pl1 = 2-0 dB care va fi scăzută în paşi mai mari la în-
ceput (de exemplu 0.5 dB) până se constată anularea (sau inversa-
rea) liniei RMN-S. În cazul inversării, se scanează pl1 cu paşi mai
mici (0.1 dB) în jurul valorii pentru care acesta s-a obţinut, şi se de-
termină în final valoarea exactă a pl1 pentru care intensitatea liniei
se anulază complet: această valoare va corespunde deci pulsului de
1800 pentru câmpul rf considerat.
• Se repetă apoi în mod identic procedura de baleiere a nivelurilor de
putere pl1 descrisă mai sus pentru toate valorile câmpului rf (impli-
cit, p1) considerate. Trebuie avut însă în vedere că scăzând câmpul
209
rf valoarea de start a parametrului pl1 creşte în mod corespunzător,
pentru a se evita de exemplu să se pornească cu o valoare care deja
corespunde unui puls > 1800.
• În practică se preferă calibrarea prin intermediul pulsului de 1800 şi
nu 900, deoarece monitorizarea rezultatului prin intermediul unui
semnal care se anulează este mai sensibilă decât dacă s-ar urmări
valoarea maximă a acestuia.
Calibrarea parametrilor pe canalul 13C cu ajutorul experimentului CP-MAS

Secvenţa de pulsuri asociată experimentului de Cross-Polarizare în
condiţii MAS (CP-MAS) este ilustrată în Fig. 9 utilizând reprezentarea
schematică convenţională din RMN, descrisă în Fig. 9. Pentru a face mai
uşoară o comparaţie directă între aceasta reprezentare schematică, şi im-
plementarea ei pe spectrometrul Bruker, în figură sunt menţionaţi explicit
parametrii de timp (pulsuri, pn, şi delay-uri, dn, sau <valoare> us), de pute-
re, pln, şi respectiv de fază, phn, incluşi în programul de pulsuri cp-const
asociat acestei secvenţe, şi listat mai jos.
Figura 9
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-const"
;cp (TopSpin 2.0)
;basic cp experiment
1 ze
2 d1 do:f2
210
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u pl12:f2
;go=2 ph31 cw:f2 ;pl12 is used here with cw
go=2 ph31 cpd2:f2 ;pl12 is used here with tppm, and p30 the pulse
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
CP-MAS este un experiment de dublă rezonanţă, deoarece presupune

aplicarea de câmpuri rf (pulsuri) simultan pe două canale distincte (f1: 13C
şi f2: 1H în cazul particular ilustrat mai sus). El este un experiment standard
în spectroscopia RMN-S care se utilizează atât pentru înregistrarea spectre-
lor 1D convenţionale ale nucleelor cu factor giromagnetic mic, precum 13C
sau 15N, cât şi ca parte componentă în experimente multi-dimensionale mai
complexe. În cadrul prezentului raport, se va considera în detaliu doar
primul aspect, şi vom începe prin a explica de ce se preferă în practică ex-
perimentul CP-MAS pentru a înregistra spectre RMN-S 1D ale 13C(15N) în
locul experimentului mult mai simplu de un puls.
Procesul de transfer de polarizare 1H <-> 13C(15N) prin aşa-numitul me-
canism de polarizare încrucişată (cross-polarization, CP) este un proces coe-
rent generat de interacţiunile dipolare heteronucleare 1H- 13C(15N) şi se desfă-
şoară în condiţiile iradierii simultane cu câmpuri rf pe canalele asociate (aşa
numitele pulsuri de contact: Fig. 9). Procesul de transfer prezintă maxime de
eficienţă dacă amplitudinile celor două câmpuri rf de contact satisfac
aşa-numita condiţie Hartmann-Hahn de matching, ν1H = ν13C +(-) nνR, unde
n=1,2. În general se lucrează cu valori ale câmpului în jur de 50 kHz pe cana-
lul protonilor, la condiţia de matching n =1: aceasta înseamnă că valoarea
câmpului pe canalul 13C(15N) va fi astfel calibrată încât să fie mai mare (sau
mai mică) cu valoarea frecvenţei de rotaţie a probei. De exemplu, pentru o
rotaţie cu νR = 15 kHz (o valoare uzuală pentru înregistrarea spectrelor 13C) a
probei în jurul unghiului magic, este necesară calibrarea unui câmp rf pe
canalul carbonului de 35 sau 65 kHz pentru a asigura un transfer maxim de
211
polarizare 1H -> 13C. De asemenea, valorile optime pentru durata pulsului de
contact (p15) în cazul nucleelor de 13C este cuprinsă între câteva sute de μs,
până la 1-2 ms: această durată depinde direct de tăria medie a cuplajelor di-
polare dintre fiecare spin 13C din probă şi protonii cei mai apropiaţi. Deoare-
ce, cuplajul dipolar 1H- 13C este de aproximativ 2.5 ori mai mare decât cupla-
jul 1H- 15N la aceeaşi distanţă internucleară, şi valoarea optimă a pulsului de
contact va creşte corespunzător (în acest caz se obţine un transfer maxim de
polarizare la valori ale p15 cuprinse între 3-7 ms).
Avantajele principale ale unui experiment CP-MAS rezultă din faptul că
polarizarea iniţială care conduce la formarea semnalului RMN-S este cea
transferată de la spinii 1H, şi nu polarizarea asociată nucleelor 13C(15N). Deoa-
rece la echilibru termic raportul dintre aceste polarizări este proporţional cu
raportul factorilor giromagnetici corespunzători, rezultă o amplificare de
aproximativ patru ori în intensitatea semnalului RMN-S 13C, şi respectiv de
zece ori în cazul spinilor 15N, comparativ cu intensitatea care s-ar obţine
printr-un experiment de un puls. În realitate aceşti factori teoretici sunt rare-
ori obţinuţi în practică datorită proceselor de relaxare care se desfăşoară pe
durata pulsului de contact, însă şi în aceste condiţii câştigul în intensitate al
semnalului RMN este semnificativ. Utilizarea polarizării transferate de la
protoni mai are încă un avantaj important care este determinat de valorile
mult mai mici ale timpului de relaxare longitudinal T1 în cazul nucleelor 1H
în comparaţie cu cei asociaţi 13C(15N): deoarece aceşti timpi practic guvernea-
ză valoarea duratei de repetiţie a experimentului (aşa-numita recycle delay, d1,
în Fig. 9), rezultă că într-un anumit interval dat se pot acumula mult mai
multe scanuri cu ajutorul CP/MAS decât ar fi posibile în cazul utilizării ex-
perimentului simplu de un puls. Ambele mecanisme conduc la creşterea
substanţială a sensibilităţii spectrale în cazul utilizării metodei CP/MAS.
Plecând de la secvenţa de pulsuri ilustrată schematic în Fig. 9, şi respec-
tiv programul de pulsuri asociat, un experiment CP/MAS standard (sau
convenţional) se derulează în modul următor: mai întâi se aduce polariza-
rea longitudinală a spinilor nucleari 1H în planul transversal (de exemplu
de-a lungul direcţiei x, prin aplicarea pulsului p3 de 900 cu faza y pe canalul
f2 asociat protonilor). Această polarizare este apoi „blocată” – aşa-numitul
„spin locking” – cu ajutorul pulsului de contact p15 aplicat pe canalul f2 cu
faza x (deoarece direcţia câmpului rf asociat şi direcţia polarizării trebuie să
coincidă). Simultan se aplică pulsul de contact de aceeaşi durată p15 şi pe
canalul carbonului cu un nivel de putere corespunzător unui transfer ma-
xim de polarizare 1H->13C (adică să satisfacă una dintre condiţiile de
matching Hartmann-Hahn descrise mai sus). Polarizarea transferată pe
212
durata lui p15 se construieşte de-a lungul direcţiei câmpului de contact
aplicat pe canalul f1: aceasta reprezintă în fapt o polarizare transversală a
spinilor 13C astfel că, în momentul încetării acţiunii pulsului de contact, ea
evoluează liber şi poate fi achiziţionată ca şi semnal RMN (FID). În mod
uzual un experiment CP/MAS se efectuează cu un phase cycling de 8 paşi,
care conţine două subcicluri suprapuse: (i) alternarea cu 1800 a fazei pulsu-
lui p3, respectiv ph3 = 90 şi 2700, pentru a elimina contribuţia polarizării
iniţiale a spinilor 13C la semnalul detectat, şi (ii) alternarea în paşi de 900,
respectiv 0, 90, 180 şi 2700, a fazei receptorului în sincronie cu faza ph1 a
pulsului de contact pe canalul f1 (aşa-numitul Cyclops phase cycling) pentru
a elimina eventualele imperfecţiuni ale circuitelor de detecţie în cuadratură.
În final trebuie menţionat că detecţia FID-ului se face în condiţii de de-
cuplare heteronucleară, adică prin utlizarea unor tehnici speciale care au
drept scop minimalizarea efectelor produse de interacţiuniile dipolare
1H-13C şi 1H-1H (în special efectul de lărgire a liniilor spectrale) pe durata
achiziţionării semnalului RMN 13C. În principiu, toate tehnicile de decuplare

heteronucleară constau în aplicarea unui câmp rf pe canalul protonilor de-a
lungul întregii durate de achiziţie a semnalului RMN, câmp ce trebuie să
satisfacă anumite cerinţe în funcţie de condiţiile experimentale concrete: în
cadrul celei mai simple metode, numite Continuous Wave – CW, câmpul se
aplică în mod continuu cu faza arbitrară, iar în cadrul unei metode mai re-
cente, cu performanţe îmbunătăţite, numita TPPM (Two Pulse Phase
Modulation) câmpul se aplică sub formă de trenuri de două pulsuri cu faze
alternante, φ = φ + Δφ, cu Δφ având valori cuprinse în general între 15 şi 300.
TPPM este tehnica de decuplare heteronucleară cel mai des utilizată pentru
înregistrarea de spectre 13C RMN-S pe compuşi organici cristalini, însă şi
metoda CW este preferată uneori, de exemplu în scopul calibrării experimen-
tului CP/MAS, sau la înregistrarea de spectre 15N RMN-S, adică în cazurile
în care nu este necesar aplicarea unor câmpuri rf de decuplare foarte intense.
Pentru a obţine spectre RMN-S 13C de calitate ale compusului studiat,
parametrii caracteristici ai experimentului CP/MAS trebuie mai întâi cali-
braţi cu ajutorul unor compuşi de referinţă (standard). Compuşii standard
cel mai des utilizaţi în acest scop sunt adamantanul (calibrarea nivelelor de
putere pe canalul carbonului) şi glicina (ajustarea valorii unghiului magic).
Ca şi în cazul calibrării puterilor pe canalul 1H, adamantanul prezintă avan-
tajul că se obţin linii 13C RMN-S relativ înguste (2-3 Hz), ceea ce conduce la
o sensibilitate spectrală foarte bună, respectiv la un timp de acumulare
scurt, de ordinul zecilor de secunde, pentru un experiment CP/MAS: în
acest fel, adamantanul este considerat un compus ideal pentru procesul de
calibrare a experimentului CP/MAS, deoarece acesta necesită în general
213
achiziţionarea unui număr mare de spectre până când sunt determinate
valorile optime ale tuturor parametrilor de interes. În cazul fiecărui para-
metru optimizarea se face prin maximizarea intensităţii liniilor RMN în
spectrul achiziţionat (în cazul particular al adamantanului avem două linii
poziţionale la 29.5 şi 38.5 ppm, determinate de grupările CH şi CH2 din
moleculă). Conform schemei experimentale din Fig. 9, intensitatea spectrală
obţinută este maximă dacă sunt îndeplinite simultan următoarele trei con-
diţii: (i) pulsul p3 pe canalul protonilor este un puls 900, (ii) nivelurile de
putere ale pulsurilor de contact p15 pe cele două canale sunt astfel ajustate
încât să îndeplinească condiţia Hartmann-Hahn de matching descrisă mai
sus, şi (iii) tehnica de decuplare utilizată să conducă la îngustarea maximă
posibilă pentru compusul dat. Corespunzător acestor elemente, trebuie deci
calibrate puterile pl3, pl1, pl2 şi pl12 (în condiţiile în care se consideră fixate
valorile pulsurilor p3 şi p15, iar metoda de decuplare utilizată pentru
adamantan este CW). Plecând de la aceste considerente, procedura de cali-
brare a experimentului CP/MAS poate fi descrisă pe scurt în felul următor:
• Pentru valorarea fixată a lui p3 se setează puterea pl3 (determinată
anterior în procesul de calibrare a puteriolor pe canalul protonului)
astfel încât aceasta să corespundă unui puls de 900.
• Se setează valorile pl2 şi pl12, pentru pulsul de contact pe canalul
protonului, şi respectiv câmpul de decuplare prin CW, astfel încât
acestea să corespundă unei valori a câmpului rf de 50 kHz: şi în
acest caz se utilizează rezultatele anterioare ale calibrării puterilor
pe canalul 1H. Pentru a evita posibile efecte de offset, frecvenţa de
iradiere pe canalul f2 va fi cea corespunzătoare frecvenţei de rezo-
nanţă a liniei adamantanului din spectrul 1H RMN-S.
• Se ajustează valoarea puterii pl1 a câmpului de contact pe canalul
carbonului până când se obţine o intensitate maximă a liniilor RMN
în spectrul CP/MAS achiziţionat. Aceasta este etapa cea mai labori-
oasă din cadrul procedurii. În particular, se porneşte de la valori
mari ale lui pl1 (de exemplu, 5 dB) şi se scanează acest parametru în
paşi de 0.1 dB mergând înspre valori mici. Setul de spectre obţinut
astfel furnizează aşa-numită curba de matching Hartmann-Hahn,
respectiv dependenţa puterii pe canalul 13C a intensităţii spectrale,
respectiv a eficienţei procesului de transfer de polarizare prin CP.
Curba de matching Hartmann-Hahn prezintă cinci maxime cores-
punzătoare celor cinci condiţii menţionate anterior. Valorile particu-
lare ale parametrului pl1 pentru care se obţin aceste maxime se
transformă în valori ale câmpului rf asociat utilizând relaţia ν13C =
50 kHz +(-) nνR, cu n = 0, 1, 2.
214
• În final, pentru o ajustare mai fină a pulsului iniţial de 900 pe cana-
lul protonului se revine la primul pas, prin modificarea uşoară a pu-
terii pl3 în jurul valorii fixate iniţial, şi se reţine acea valoare pentru
care intensitatea spectrală atinge un maxim absolut. Această etapă
este necesară deoarece valorile câmpului rf pe canalul 1H în general
sunt determinate cu un grad de eroare mai mare prin experimentul
de un puls decât cu ajutorul experimentului CP/MAS.
Experimentul CP/MAS cu parametri calibraţi pe adamantan din punct

de vedere al nivelurilor de putere, se utilizează în continuare pe glicină
pentru ajustarea valoarii unghiului magic şi pentru optimizarea pulsurilor
p31 asociate decuplării prin metoda TPPM. Alegerea acestui compus stan-
dard este motivată de faptul că el are un spectru RMN-S simplu care conţi-
ne doar două linii (deci sensibilitate spectrală mare) dintre care una cores-
punde grupării carbonil a cărei lărgime este foarte sensibilă la deplasări
mici ale înclinării axei de rotaţie a probei faţă de valoarea unghiului magic:
acest efect se datorează anizotropiei mari a deplasării chimice. În practică,
se modificăa uşor înclinarea axei rotorului până ce se obţine un spectru 13C
RMN-S a glicinei în care linia carbonilului (de la 176.5 ppm) are lărgime
minimă (implicit, amplitudine maximă). După acest pas este trecut se pro-
cedează în continuare la ajustarea pulsului p31 în secvenţa de decuplare
heteronucleară prin TPPM pentru a se obţine în final îngustarea maximă
posibilă a liniilor spectrale. Datorită faptului că glicina este o moleculă rela-
tiv rigidă în reţeaua cristalină (aşa cum sunt majoritatea compuşilor orga-
nici) decuplarea prin CW la câmpuri mici, de ordinul a 50 kHz, nu mai poa-
te produce o rezoluţie spectrală satisfăcătoare, astfel încât se preferă meto-
da TPPM la câmpuri intense (ideal pl12 ar trebui să corespundă unor câm-
puri de cel puţin 100 kHz). Pentru valoarea setată a lui pl12, durata optimă
a pulsului p15 se apropie în general de cea a unui puls de 1800, astfel încât
calibrarea lui p31 se face pornind de la această valoare de referinţă.
4.Bibliografie
1. R.R. Ernst, G. Bodenhousen, A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance
în One and Two Dimensions, Oxford University Press, Oxford 1987
2. M.H. Levitt, Spin Dynamics: Basics of Nuclear Magnetic Resonance, Wiley 2008
3. J. Keeler, Understanding NMR Spectroscopy, Wiley 2010
4. T. Gullion, Introduction to High-Resolution Solid-State NMR, Elsevier Science 2007
5. H. Guenther, NMR Spectroscopy, Wiley 2001
6. Bruker Biospin Group, TOPSPIN User Manual, 2008
215
Spectroscopie de rezonanţă magnetică nucleară pe solide
(RMN-S)
– Implementarea de metode avansate RMN-S pentru
aplicaţii pe sisteme moleculare organice în faza solidă
C.S.I. dr. Claudiu Filip
C.S.III. dr. Mihaela Aluaş
Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................216
2. Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea dinamicii transferului de
polarizare 1H-13C .................................................................................................................219
3. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C ..............................................................................226
4. Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) – SQ (Single Quantum) ............237
5. Bibliografie ..........................................................................................................................245
1. Introducere
În acest raport se vor prezenta în mod detaliat o serie de experimente
RMN-S avansate, cu aplicaţii în investigarea structurii sistemelor moleculare
organice cristaline, metode ce au fost până în prezent implementate şi testate
experimental pe infrastructura existentă la UBB Cluj. Accentul va fi pus pe ex-
perimente RMN-S de dublă rezonanţă pe 13C. Vor fi ilustrate de asemenea teh-
nici bazate pe detecţia 1H, însă doar în cazul acelor compuşi unde se obţine o
rezoluţie spectrală satisfăcătoare în condiţiile tehnice date. Drept urmare, nu
vor putea fi prezentate o serie de metode RMN-S intensiv utilizate în domeniu,
de exemplu cele care implică lucrul simultan pe trei canale rf [1] (metode de
triplă rezonanţă), sau metode de înaltă rezoluţie pe 1H, care necesită o electroni-
că adaptată secvenţelor de decuplare homonucleară [2] şi/sau capuri de probă
de tip „ultra-fast MAS”, care să permită rotaţii ale probei până la 70 kHz. Deoa-
rece acestea sunt considerate ca făcând parte din „arsenalul de bază” al meto-
dologiei moderne RMN-S pe sisteme moleculare organice, recomandăm stu-
denţilor aprofundarea lor cel puţin la nivel teoretic (consultând bibliografia
indicată mai sus), chiar dacă nu pot fi utilizate în practică la UBB Cluj.
Introducerea metodelor se va face progresiv, în ordinea creşterii com-
plexităţii lor: se vor descriere mai întâi experimente care necesită înregistra-
rea de seturi de date bidimensionale (2D), dar care nu necesită transforma-
rea lor în spectre 2D, şi vom ajunge în final la prezentarea de metode care
216
furnizează informaţii structurale pe bază de spectre RMN-S 2D de corelaţie.
În fiecare caz, se presupune că mai întâi au fost parcurşi paşii prezentaţi în
raportul anterior, respectiv că toţi parametri experimentali relevanţi, şi în
special nivelurile de putere pe fiecare canal rf, au fost calibrate corespunză-
tor. De asemenea, este de menţionat că, pentru fiecare tehnică RMN-S avu-
tă în vedere, în afară de aspecte pur practice se va face şi o scurtă prezenta-
re a fundamentelor teoretice pe care aceasta se bazează.
Spre deosebire de varianta unidimensională, unde spectrul RMN se ob-
ţine prin transformarea Fourier a FID-ului, în spectroscopia RMN bidimen-
sională (2D), semnalul RMN este descris de o funcţie care depinde de două
variabile de timp, t1 (corespunzător dimensiunii indirecte F1) şi t2 (corespun-
zător dimensiunii directe F2). Pentru a se obţine spectrul în frecvenţă, în acest
caz transformata Fourier trebuie aplicată de două ori. Schema generală
pentru un experiment RMN bidimensional este redată în Fig. 1.
Figura 1: Schema de principiu a unui experiment RMN bidimensiuonal (2D)
În prima perioadă, cea de preparare, se aplică unul sau mai multe pul-
suri rf, în urma cărora se generează o mărime fizică asociată sistemului de
spini (de ex. polarizare transversală, coerente de mai multe cuante, etc.)
care va evolua pe durata t1. Următoarea perioadă – perioada de mixing,
constă în aplicarea celui de-al doilea puls (sau pulsuri) de radiofrecvenţă.
Secvenţa de mixing are rolul cel mai important într-un experiment 2D, de-
oarece ea defineşte corelaţiile care se stabilesc între mărimile care evoluează
în t1 şi polarizarea transversală asociată fiecărui spin care se detectează în
mod direct, prin intermediul semnalul RMN, pe durata lui t2. Această suc-
cesiune de perioade poartă denumirea de secvenţă de pulsuri 2D, iar infor-
maţia care se regăseşte în spectrul RMN depinde concret de tipul interacţi-
unii care a fost selectată în perioadele de preparare şi de mixing.
Un spectru RMN 2D se obţine în următorul mod: se aplică secvenţa de
pulsuri pentru t1 = 0, se înregistrează şi se stochează FID-ul corespunzător
acestei valori. Apoi se repetă aceeaşi procedură pentru t1 egal cu multiplii
întregi ai perioadei de sampling Δt1 (adica Δt1, 2Δt1, 3Δt1…nΔt1, unde n este
de obicei cuprins între câteva zeci şi câteva sute). În consecinţă, semnalul
RMN bidimensional constă dintr-un set de n FID-uri, şi va depinde explicit
de ambele variabile temporale, t1 şi t2.
217
Figura 2: Exemple de spectre RMN 2D şi modalitatea în care apar peakurile diagonale,
respectiv cross-peakurile
Modul de apariţie a peak-urilor în spectre RMN bidimensionale şi inter-

pretarea acestora vor fi descrise pe scurt în cele ce urmează. Astfel, dacă
într-un spectru 2D va apărea un peak poziţionat la ωA în dimensiunea F1 şi la
ωB în dimensiunea F2 (aşa numitele cross-peakuri), atunci pe durata perioadei
de preparare s-a format un semnal care a evoluat cu frecvenţa ωA de-a lungul
lui t1, iar pe durata perioadei de mixing acelaşi semnal a fost transformat cu
ajutorul unei anumite secvenţe de pulsuri într-un alt semnal care evoluează
cu frecvenţa ωB pe durata t2. Un alt tip de peak-uri care se pot obţine într-un
spectru RMN 2D, numite peak-uri diagonale, corespund cazului în care frec-
venţa de rezonanţă a unui semnal generat în timpul perioadei de preparare
va rămâne neafectată de pulsul (sau pulsurile) care alcătuieşte perioada de
mixing. Multe dintre tehnicile RMN 2D utilizate în mod curent, generează
spectre care conţin ambele tipuri de peak-uri, de exemplu Fig. 2(c).
În practică, în funcţie de succesiunea de pulsuri aleasă, se pot obţine do-
uă tipuri distincte de spectre RMN 2D: de separare, şi respectiv de corelare [3].
În cazul spectrelor bidimensionale de separare, în dimensiunea F2 se obţine spec-
trul izotrop al compusului studiat, iar în dimensiunea indirectă, F1, se obţine
spectrul anizotrop al interacţiunii recuplate, separat, pentru fiecare linie izo-
tropă. Conform schemei generale a unui experiment 2D, ilustrată în Fig. 1, o
secvenţă de pulsuri specifică spectroscopiei RMN 2D de separare corespun-
de cazului particular în care domeniul temporal indirect, t1, şi perioada de
mixing coincid. Spre deosebire de spectrele RMN 2D de separare, în cazul
spectrelor de corelare ambele dimensiuni codifică deplasările chimice izotro-
pe, iar interacţiunea recuplată va genera peakuri de corelatie (cross-peakuri) în-
tre nucleele diferitelor grupări chimice dintr-un anumit compus. În funcţie
de tipul de experiment RMN de corelare utilizat, vor exista diferenţe în ceea
ce priveşte (i) mărimea fizică asociată sistemului de spini (de exemplu coe-
rente de una sau mai multe cuante), care va evolua în dimensiunea indirectă
F1, şi (ii) interacţiunea de spin recuplată pe durata perioadei de mixing. De
218
asemenea, experimentele bidimensionale pot fi clasificate şi în funcţie de
tipul de nuclee implicate, şi anume experimente de corelare homonucleare
sau heteronucleare.
2. Metode RMN-S 2D de separare pentru pe investigarea di-

namicii transferului de polarizare 1H-13C
Metoda RMN-S 2D bazată pe secvenţa CP-MAS clasică
Exemplul cel mai ilustrativ al unei metode RMN-S 2D de separare este
reprezentat de experimentul de recuplare a interacţiunii dipolare
heteronucleare C – H cu ajutorul secvenţei clasice CP-MAS ce are drept efect
un transfer de polarizare între protoni şi nucleele 13C din vecinătate, cu efici-
enţe care depind de distanţele dintre spinii nucleari implicaţi. Secvenţa de
pulsuri asociată acestui experiment este redată mai jos în Fig. 3, utilizând
reprezentarea schematică convenţională din RMN, descrisă în raportul ante-
rior. Pentru a face mai uşoară o comparaţie directă între această reprezentare
schematică, şi implementarea ei pe un spectrometru Bruker, în figură sunt
mentionaţi explicit parametrii de timp (pulsuri, pn, şi delay-uri, dn, sau <va-
loare> us), de putere, pln, şi respectiv de fază, phn, incluşi în programul de
pulsuri cp-var asociat acestei secvenţe, şi listat mai jos. Referitor la notaţiile
atât în reprezentarea schematică, cât şi în programul de pulsuri, se foloseşte
aceeaşi convenţie ca şi în raportul anterior, şi anume, variabilele notate cu
albastru, roşu şi verde reprezintă durate, niveluri de putere ale pulsurilor rf,
şi respectiv faze asociate acestor pulsuri. Toate celelalte elemente (comenzi,
parametri adimensionali, etc.) sunt reprezentate cu negru.
Figura 3: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D de investigare a transferului de

polarizare 1H-13C prin intermediul secvenţei CP-MAS clasice
219
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/cp-var"
;cp (TopSpin 2.0)
;basic cp experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(vp ph1):f1 (vp ph2):f2
1u pl12:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m ivp
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
În esenţă, experimentul descris în Fig. 3 presupune înregistrarea unui

set de date 2D, care constă dintr-un număr N de semnale RMN 13C distinc-
te, achiziţionate prin intermediul secvenţei CP-MAS clasice: la fiecare din-
tre cele N repetiţii ale experimentului, secvenţele CP-MAS efectiv utilizate
diferă între ele prin durata pulsului de contact. Valorile acestor pulsuri sunt
stocate într-o aşa-numită listă de pulsuri (variable pulse list) care este apelată
în cadrul programului de pulsuri prin comanda vp (variable pulse). Lista
este cuprinsă în fişierul care este specificat în tabela parametrilor de achizi-
ţie. În programul de pulsuri, modul de achiziţie 2D este specificat prin co-
menzile de incrementare şi de repetiţie (loop) specifice: if (increment file –
trece la un nou fişier unde va fi stocat următorul FID din cadrul setului de
date 2D); ivp (increment variable pulse – trece la următoarea valoare a pulsu-
lui de contact specificată în lista de pulsuri); lo to 2 times td1 (loop la linia 2,
de un număr de ori specificat prin parametrul de achiziţie td1) – repetă ex-
perimentul de N ori (N = td1) pentru a acumula toate datele prevăzute în
experimentul 2D. După achiziţionarea celor N semnale RMN distincte, ur-
mează procesarea datelor: concret, se aplică transformata Fourier de-a lun-
gul dimensiunii directe (F2) prin intermediul comenzii xf2, şi se obţine astfel
220
setul de date 2D. Acesta este format din N spectre 13C CP-MAS, aşezate în
ordinea crescătoare a duratei pulsurilor de contact p15 utilizate. Pentru
fiecare dintre liniile RMN din spectru, se reprezintă grafic evoluţia intensi-
tăţii de linie în funcţie de durata lui p15, obţinându-se în final aşa-numitele
curbe CP-MAS; proprietăţile caracteristice ale unei asemenea curbe descriu,
pentru fiecare poziţie chimică distinctă a atomilor de carbon din sistemul
molecular investigat, dinamica procesului de transfer de polarizare de la
protonii învecinaţi (în principiu, contribuţii însemnate vor avea cei situaţi
până la o distanţă de 2.5-3 Å).
În practică, ţinând cont de caracteristicile procesului de transfer de po-
larizare 1H -> 13C, pentru durate ale pulsului de contact p15 cuprinse în
intervalul 0 – 200 μs e preferabilă utilizarea unei eşantionări în paşi egali
(de exemplul, 5 – 10 μs), deoarece în interiorul acestui domeniu temporal
caracterul coerent al procesului de transfer este dominant, şi se manifestă
prin apariţia aşa-numitelor oscilaţii dipolare în curbele CP-MAS corespun-
zătoare. Peste această valoare a lui p15 se pot utiliza creşteri cu paşi din ce
în ce mai mari, astfel încât numărul de N de repetiţii ale experimentului,
care coincide cu numărul de puncte ce definesc curbele CP-MAS înregistra-
te, să fie menţinut la o valoare rezonabilă, 30-50. Pentru a putea caracteriza
şi parametrii relaxării spin-reţea în sistemul rotitor, care afectează dinamica
procesului de transfer de polarizare 1H -> 13C la durate de ordinul milise-
cundelor, se recomandă de asemenea înregistrarea curbei până la valori ale
pulsului de contact de 3 – 5 ms.
În Fig. 4 este prezentat un set de date bidimensional înregistrat utilizând
tehnica descrisă mai sus în cazul particular al L-Alaninei. Transformata Fou-
rier s-a aplicat doar în dimensiunea directă, obţinându-se spectrul izotrop al
compusului, cu cele trei linii de rezonanţă caracteristice grupărilor CH, CH3,
respectiv COOH. Considerând variaţia intensităţilor de linie cu poziţia spec-
trului CP-MAS din setul de date 2D, în dimensiunea indirectă se obţin curbe-
le de transfer de polarizare (CP) corespunzătoare fiecărei grupări chimice:
forma specifică a fiecărei dintre aceste curbe reflectă tăria cuplajelor dipolare
heteronucleare recuplate. Astfel, cu cât rata de creştere a unei astfel de curbe
CP este mai mare şi oscilaţiile dipolare mai pronunţate (vezi curba CP cores-
punzătoare grupării CH comparativ cu cele pentru CH3, respectiv COOH),
cu atât cuplajul dipolar heteronuclear asociat este mai puternic. Dacă trans-
formata Fourier se aplică şi de-a lungul lui t1, în locul curbelor CP se vor ob-
ţine aşa-numitele spectre dipolare: cele două modalităţi de a extrage informaţii
despre parametrii interacţiunii dipolare sunt însă echivalente. Procedura
descrisă mai sus face parte dintr-o clasă mai largă de metode RMN-S numite
221
de tip SLF (Separated Local Field Spectroscopy): în cadrul acestora, tehnica
CP-MAS de recuplare a interacţiunii dipolare heteronucleare este în general
înlocuită cu tehnici mai sofisticate [4, 5], care să ţină cont de detaliile structu-
rale dorite, şi de prezenţa sau nu a ordonării în probele investigate. În gene-
ral, prin combinarea tehnicii de recuplare heteronucleară CP cu metode de
decuplare homonucleară a protonilor, cum ar fi metodele LG (Lee-Goldburg)
sau FSLG (Frequency-Switched Lee-Goldburg), se obţine o recuplare eficien-
tă a interacţiunii dipolare heteronucleare, în condiţii de rotire a probei la
unghi magic.
Figura 4: Set de date 2D obţinut în cazul compusului L-alanina. În dimensiunea directă se aplică
transformata Fourier şi se obţin liniile de rezonanţă ale grupărilor chimice din compus, iar în dimen-
siunea indirectă sunt ilustrate curbele CP corespunzătoare acestor grupări. Aceste curbe au fost
înregistrate după ce în prealabil puterile pe cele două canale rf au fost calibrate la condiţia n = -1 de
matching Hartmann-Hahn.
Metoda Remote Protons CP-MAS

O nouă metodă RMN-S 2D de separare este bazată pe experimentul an-
terior, însă extinde domeniul acesteia de aplicabilitate prin încorporarea
unei noi secvenţe în perioada de preparare; această secvenţă numită CPPI
(Cross-Polarization Polarization-Inversion) are drept scop generarea unei
222
stări iniţiale diferită de polarizarea uniformă 1H, cum este cazul experimen-
tului CP-MAS clasic. Noua stare iniţială constă într-o distribuie neuniformă
a polarizării protonilor, care poate fi creată cu ajutorul configuraţiei expe-
rimentale formată din cele două blocuri CP ale secvenţei CPPI de durate
bine determinate, p15 şi p16, iar faza celui de-al doilea bloc este inversată în
raport cu faza primului.
Figura 5: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D „Remote Protons CP-MAS” de

investigare a transferului de polarizare 1H-13C de la protonii nelegaţi chimic de catonii din probă
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/rem_prot_cp"
;cp (TopSpin 2.0)
;remote protons CP-MAS experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
(p16 ph1):f1 (p16 ph6):f2
(vp ph1):f1 (vp ph8):f2
1u pl12:f2
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m ivp
223
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3
ph1= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph2= 0
ph4= 2
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
Alternând fazele celor două pulsuri CP care formează secvenţa CPPI se

creează o stare iniţială de polarizare egală cu zero atât pentru nucleul 13C, cât şi
pentru protonii direct legaţi chimic de acesta. Ca o condiţie necesară pentru ca
în curbele de transfer de polarizare să fie cuantificat doar procesul de transfer
de la protonii îndepărtaţi, secvenţa CPPI trebuie să aducă simultan la zero po-
larizarea spinului central 13C şi a protonilor direct ataşaţi, în timp ce polariza-
rea protonilor îndepărtaţi este menţinută la o valoare cât mai mare. Pentru a
verifica în ce măsură această condiţie este îndeplinită, am efectuat simulări
numerice utilizând programul Spinevolution. În acest scop, sistemul de spini
ales este format dintr-un nucleu 13C înconjurat de 7 protoni, care aparţin mole-
culei de L-Alanina. Pentru cazul grupării CH rezultatele analizei sunt prezen-
tate în Fig. 6: în aceste grafice este ilustrată evoluţia polarizării pentru fiecare
spin din sistem în funcţie de creşterea timpului de inversie, p17, şi pentru trei
valori diferite ale frecvenţei de rotaţie, νR = 5; 8, respectiv 15 kHz.
Pentru sistemul de spini utilizat, primul bloc CP are o durata fixă,
p16 = 70 μs, corespunzătoare transferului maxim de polarizare de la proto-
nul legat chimic de spinul central 13C. Dependenţa curbelor de polarizare
Figura 6: Simulări ale dependenţei polarizării de spin de timpul de inversie τ2 din secvenţa de pul-
suri CPPI pentru υR = 5; 8 respectiv 15 kHz, în cazul grupării CH din L-Alanina. Prin linie conti-
nuă sunt reprezentate curbele de inversie ale polarizării pentru spinul 13C (cu negru), respectiv a
protonului legat chimic de acesta (cu roşu). Cu linie punctată este reprezentată polarizarea remanentă
pe protonii îndepărtaţi, care aparţin grupării CH3 (albastru), respectiv NH3 (verde) din sistemul de
spini considerat.
224
din Fig. 6 arată că polarizările din cadrul grupării CH (adică nucleului 13C
şi a protonul sau direct ataşat) pot fi aduse simultan la zero pentru frecven-
ţe de rotaţie a probei mai mari decât 5 kHz, iar valoarea efectivă a duratei
pulsului p17 pentru care această condiţie este îndeplinită depinde în mod
explicit de valoarea frecvenţei de rotaţie: de exemplu pentru νR = 8 kHz se
obţine un puls de contact p17 cu o durată de 42 μs.
În măsura în care starea iniţială dorită poate fi generată cu ajutorul sec-
venţei CPPI, curbele de transfer de polarizare înregistrate experimental
prin incrementarea duratei celui de-al treilea bloc CP din Fig. 5 se consideră
ca reflectă doar contribuţia protonilor îndepărtaţi. Pentru a verifica acest
lucru, predicţiile teoretice referitoare la procesul de transfer de polarizare
de la protonii îndepărtaţi realizat prin noua metodă Remote Protons
CP-MAS, au fost testate experimental [6]. În acest scop, am extins configu-
raţia utilizată în simulări numerice la un sistem de 10 spini (9 protoni şi un
nucleu 13C) din L-Alanina, iar curbele CP simulate au fost comparate cu
cele experimentale. Molecula de L-Alanina a fost alesă deoarece poziţiile
protonilor, şi implicit distanţele H-H şi C-H, sunt determinate precis, prin
difracţie de neutroni (cu precizie de ±0.003 Å). Simulările numerice au fost
efectuate considerând două cazuri distincte şi anume: în primul caz se con-
sideră gruparea NH3 ca fiind rigidă, iar în cel de-al doilea caz aceeaşi gru-
pare se consideră în regim de rotaţie rapidă în jurul axei sale. În ambele
situaţii gruparea CH3 este considerată a efectua o mişcare de rotaţie rapidă.
Prin compararea curbelor CP-MAS simulate cu cele experimentale (Fig. 7)
Figura 7: Comparaţia între curbele CP/MAS teoretice şi experimentale corespunzătoare nucleului

13C din gruparea CH din L-Alanina, obţinute prin utilizarea secvenţei CP clasice (curbele roşii),
respectiv a secvenţei de transfer de la protonii nelegaţi (curbele cu albastru). Curbele experimentale
sunt reprezentate prin cercuri, iar cele simulate prin linie punctată (pe un sistem format din 8 spini),
respectiv linie continuă (sistem format din 10 spini). Gruparea CH3 se consideră a efectua o mişcare
de rotaţie rapidă în ambele cazuri, iar gruparea NH3 se consideră în aproximaţie rigidă în (a), respec-
tiv în regim de rotaţie rapidă în (b).
225
se observă o foarte bună concordanţă în cazul în care gruparea NH3 este
considerată quasi-rigidă. Totuşi, există unele mici diferenţe între curba cal-
culată şi cea măsurată, diferenţe care cel mai probabil se datorează faptului
că gruparea NH3 efectuează în realitate o mişcare de rotaţie lentă (la scală
de timp a procesului de transfer de polarizare, de ordinul µs). Cea mai
importantă concluzie care rezultă în urma comparării efectuate este sensibi-
litatea crescută a curbei Remote CP-MAS la dinamica moleculară prezentă
în sistemul molecular studiat, în timp ce curba CP clasică nu este atât de
sensibilă la detalii ale mişcării moleculare caracteristice grupării NH3.
3. Metode RMN-S 2D de corelare 13C-13C

Metoda Proton Driven Spin-Diffusion
Metoda RMN-S 2D numită Proton Driven Spin Diffusion (PDSD) este o
metodă de corelare: după cum se observă din schema experimentală asociată
acestui experiment (Fig. 8), pe durata ambelor perioade de evoluţie indirectă
şi directă, t1 şi t2, magnetizarea transversală 13C evoluează în condiţii de de-
cuplare heteronucleară prin TPPM aplicată pe canalul protonilor şi rotaţie a
probei în jurul unghiului magic, astfel încât ambele dimensiuni spectrale în
spectrul RMN 2D vor codifica preponderent informaţii cu privire la deplasă-
rile chimice izotrope ale carbonilor din sistemul molecular investigat (cu o
lărgire reziduală determinată de imperfecţiunea metodei de decuplare). Pe
durata perioadei de mixing, se generează o stare de polarizare longitudinală
Figura 8: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D „Proton Driven Spin-Diffusion”

(PDSD) de investigare a transferului de polarizare 13C-13C mediat de interacţiunea dipolară cu
protonii
226
diferenţială, care va fi transferată între spinii 13C între care există cuplaje di-
polare suficient de puternice. Din această cauză, în afară de peakurile diago-
nale, în spectrul RMN 2D obţinut prin metoda PDSD apar şi cross-peakuri de
corelaţie între oricare două poziţii chimice distincte între care se stabileşte
transfer de polarizare (spin diffusion), cu intensităţi care depind de distanţa
la care se află nucleele 13C corespunzătoare.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/sp-diff"
;cp (TopSpin 2.0)
;13C-13C spin diffusion experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u cpd2:f2
1u pl12:f2
d0 pl4:f1
1u do:f2
(p1 ph4):f1
d5 ; tau mix
(p1 ph5):f1
1u pl12:f1
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3
ph1= (4) 0 0 2 2
ph2= 0
ph4= 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 2 2
ph5= 1 1 1 1 3 3 3 3
ph31= 0 2 2 0 1 3 3 1
Transferul de polarizare 13C-13C în experimentul PDSD este iniţiat de

interacţiunile dipolare homonucleare între spinii nucleari corespunzători,
însă el se produce prin intermediul protonilor situaţi între aceşti carboni.
Deoarece aceste cuplaje dipolare C-C sunt în general slabe, durata perioa-
dei de mixing, d5 – în secvenţa de pulsuri ilustrată mai sus, trebuie să fie
227
relativ mare, între câteva sute de µs până la 10-100 ms, pentru a avea un
transfer eficient în domeniul de distante 2-5 Å. Din această cauză, metoda
este preponderent utilizată pe probe marcate uniform cu 13C: cu toate aces-
tea, există şi câteva cazuri în care PDSD a fost demonstrat şi pe probe cu 13C
în abundenţă naturală, însă în aceste cazuri este nevoie de durate de mixing
de ordinul secundelor pentru a identifica cross-peakuri cu intensităţi măsu-
rabile.
Cu privire la implementarea practică a unui experiment RMN 2D, in-
troduse prin acest exemplu, trebuie menţionate următoarele aspecte: (i)
sintaxa ph1= (4) 0 0 2 2 utilizată în programul de pulsuri asociat secvenţei
PDSD pentru faza pulsului de contact p15 pe canalul 13C specifică procedu-
ra numită TPPI (Time Proportional Phase Incrementation) aplicată pentru
înregistarea semnalului în cuadratură pe dimensiunea indirectă – în practi-
că înseamnă că la fiecare experiment nou în dimensiunea indirectă fazele
vor fi incrementate cu 3600/4 = 900 faţă de experimentul anterior (adică
dacă pentru primul FID din setul de date 2D se utilizează fazele 0 0 2 2 pen-
tru pulsul p15, al doilea FID va avea fazele 1 1 3 3, şi aşa mai departe; (ii)
pasul temporal în dimensiunea indirecta este denumit in0 (increment delay
0), iar durata totală de achiziţie indirectă este notată cu aq1, şi se calculează
înmulţind incrementul in0 cu numărul de puncte al semnalului înregistrat
în dimensiunea indirectă, respectiv td1.
Figura 9: Spectru 13C CP-MAS pe L-Tirozina HCl, şi o reprezentare schematica a atribuirii liniilor
pentru cele 7 poziţii chimice distincte ale carbonilor din molecula
228
În final vom ilustra utilizarea metodei PDSD cu rezultatele experimen-
tale obţinute în cazul particular al compusului L-Tirozina HCl, marcată
uniform cu 13C. Mai întâi prezentăm în Fig. 9 spectrul 13C RMN-S 1D obţi-
nut prin CP-MAS la o frecvenţă de rotaţie a probei de 10 kHz. Atribuirea
liniilor spectrale corespunde indexării poziţiilor de carbon din reprezenta-
rea schematică a moleculei de L-Tirozina inclusă în aceeaşi figură. Am ales
acest caz particular pentru că ne permite comportaţii în cadrul unor dome-
nii de distanţe internucleare 13C-13C scurte (1.5 Å – între carboni direct le-
gaţi chimic), medii (3-4 Å, de exemplu între carbonii alifatici şi cei de pe
inelul benzenic), şi respectiv lungi (4-5.5 Å, între C1 şi C7 sau C8).
Posibilitatea de a estima astfel de distante C-C din spectre PDSD de co-
relaţie 13C-13C este ilustrată în continuare prin exemplele prezentate în Fig.
10. Primul corespunde unei durate de mixing scurte, de 300 µs, şi evidenţi-
ază faptul că la această scală de timp transferul de polarizare este eficient
doar pe distanţe scurte, între carbonii direct legaţi chimic. Utilitatea practi-
că a unui asemenea spectru este evidentă, respectiv identificarea conectivi-
tăţilor chimice în cazul unui compus nou, şi pe această cale este un instru-
ment extrem de util în procesul de atribuire spectrală.
Figura 10: Spectre RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina aplicând metoda PDSD;
ele ilustrează dinamica procesului de transfer de polarizare la durate de mixing scurte (300 μs), şi
respectiv lungi (5 ms)
Cel de-al doilea spectru PDSD ilustrat în Fig. 10 corespunde unei perioade
de mixing mult mai mari, de 5 ms, şi este reprezentativ pentru situaţia în
care transferul de polarizare se reduce pe distanţe mult mai mari, până la 5
Å, după cum se poate observa din prezenţa peakului de corelaţie C1-C7.
Astfel de spectre sunt utile pentru a extrage constrângeri structurale utile
pentru investigarea conformaţiei moleculare în sistemul investigat.
229
Metoda CHHC
Metoda CHHC pe care o vom discuta în continuare permite determina-
rea distanţelor 1H-1H, cu rezoluţie înaltă datorită implementării în cadrul
spectroscopiei RMN-S 2D de corelaţie 13C-13C. Metoda este demonstrată
efectiv pe L-Tirozina·HCl sintetizată sub formă poli-cristalină şi marcată
uniform cu 13C. L-Tirozina·HCl a fost aleasă drept sistem model deoarece
spectrul 13C RMN-S 1D prezintă o rezoluţie suficient de bună pentru a pu-
tea separa liniile corespunzătoare tuturor grupărilor chimice din molecula
(Fig. 9), iar structura sa cristalină este bine caracterizată.
În Fig. 11 este ilustrată secvenţa de pulsuri asociată metodei CHHC.
Experimentul începe cu prepararea unei stări iniţiale prin transfer de pola-
rizare prin CP de la 1H la 13C. Polarizarea transversală astfel creată evoluea-
ză sub influenţa deplasărilor chimice izotrope al carbonilor pe durata peri-
oadei de evoluţie indirectă, t1, în condiţii de decuplare heteronucleară prin
TPPM pe canalul 1H. Polarizarea 13C care a evoluat cu deplasările chimice
izotrope corespunzătoare fiecărei poziţii distincte din moleculă este apoi
transferată prin intermediul unei perioade scurte (65 μs) de cross-polarizare
(CP) a protonilor direct conectaţi chimic. Polarizarea transversală astfel
obţinută este apoi adusă de-a lungul direcţiei z (este transformată în polari-
zare longitudinală) prin aplicarea unui puls π/2 asupra spinilor 1H. Deoa-
rece polarizările 1H astfel obţinute nu au aceeaşi valoare la toţi protonii, pe
durata perioadei de mixing, tmix, se va realiza o redistribuire a acestora prin
intermediul aşa-numitului proces de schimb de magnetizare, şi se generea-
ză astfel cross-peakuri a căror intensitate este proporţională cu cantitatea de
Figura 11: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D CHHC de investigare a transferu-

lui de polarizare 1H-1H codificat în spectre de corelaţie 2D 13C-13C
230
polarizare schimbată de protonii corelaţi. Deoarece schimbul de magnetiza-
re se datorează interacţiunilor dipolare 1H-1H, intensitatea fiecărui
cross-peak obţinut codifică informaţii cu privire la tăria cuplajului dipolar
dintre protonii implicaţi si, implicit, cu privire la distanţele internucleare
dintre aceştia.
După parcurgerea etapei de mixing urmează transformarea polarizării
longitudinale în polarizare 1H transversală (prin aplicarea a incă unui puls
π/2 pe canalul 1H), iar aceasta apoi transferată către nucleele 13C direct co-
nectaţi chimic (prin intermediul unei perioade scurte de CP, similară celei
prin care s-a realizat transferul 13C->1H iniţial). În final, polarizarea trans-
versală 13C este detectată sub formă de semnal RMN pe durata perioadei
de evoluţie directă, t2. Detecţia semnalului se face de asemenea în condiţii
de înaltă rezoluţie, adică se urmăreşte evoluţia polarizării transversale 13C
sub acţiunea deplasărilor chimice izotrope asociate carbonilor din probă, în
condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM.
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chhc"
;cp (TopSpin 2.0)
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u cpd2:f2
1u pl12:f2
d0
1u do:f2
1u pl2:f2
(p16 ph5):f1 (p16 ph4):f2
1u pl3:f2
p3:f2 ph8
d5 ; tau mix
p3:f2 ph9
1u pl2:f2
(p16 ph7):f1 (p16 ph6):f2
1u pl12:f1
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
231
lo to 2 times td1
exit
ph3= 0 0 2 2 1 1 3 3
ph1= (4) 1
ph2= 3 3 3 3 0 0 0 0
ph4= 3 1
ph5= 1
ph6= 1
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph8= 0
ph9= 2
ph31= 3 1 3 1 0 2 0 2
Un spectru CHHC tipic este ilustrat în Fig. 12, unde este considerat cazul
particular al spectrului 2D de corelaţie 13C-13C înregistrat la o valoare tmix de 50
μs, utilizând o fereastră spectrală care se limitează la carbonii protonaţi (inde-
xaţi conform schemei din Fig. 9). Corelaţiile care se stabilesc între protonii aso-
ciaţi diferitelor poziţii de carbon din moleculă sunt identificate în spectrul
CHHC prin apariţia cross-peakurilor care conectează poziţiile chimice cores-
punzătoare. Deoarece mecanismul de stabilire a corelaţiilor în spectre CHHC
se bazează pe schimbul de magnetizare longitudinală 1H-1H determinat de
interacţiunea dipolară, amplitudinea fiecărui cross-peak va fi o măsură a tăriei
acestui cuplaj şi, implicit, a distanţei internucleare dintre protonii asociaţi pozi-
ţiilor de carbon corelate. Acest mecanism este exemplificat în Fig. 12 cu corela-
ţii ale carbonului A (a se vedea liniile punctate). În particular, se observă apari-
ţia unui cross-peak intens între A şi carbonul C, însă este de remarcat de ase-
menea lipsa uni peak de corelaţie similar cu carbonul din poziţia B. Din punct
de vedere calitativ, acest rezultat este în perfectă concordanţă cu distanţele
intra-moleculare dintre protonii conectaţi chimic de aceştia, şi anume: 3.2 Å
între protonii cei mai apropiaţi de carbonii A şi C, şi respectiv de 4.8 Å pentru
ceilalţi doi protoni prezentaţi în exemplul din Fig. 12.
O analiză cu caracter cantitativ relevantă pentru determinarea de distanţe
1H-1H cu ajutorul metodei CHHC trebuie însă să ia în considerare şi alte efecte
care influenţează intensităţile cross-peakurilor din spectru: pentru aceasta am

elaborat un model teoretic al dinamicii de spin în condiţii specifice experimen-
tului CHHC [7]. Rezultatele modelării ne-au permis îmbunătăţirea procesului
de analiză a datelor experimentale, prin introducerea de corecţii adecvate pen-
tru o serie de procese perturbative, şi anume: (i) caracterul neselectiv al trans-
ferului de polarizare 1H<->13C pe durata blocurilor CP care “flanchează” peri-
oada de transfer de magnetizate (tmix în Fig. 11), (ii) efectul protonilor care nu
contribuie direct la semnalul RMN-S detectat (protonii care nu sunt legaţi chi-
mic de carbon, şi respectiv protonii din molecule nemarcate izotopic cu 13C), şi
232
Figura 12: Spectru RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina marcată uniform cu 13C
aplicând metoda CHHC; spectrul a fost obţinut pentru o durată de mixing de 50 µs şi ilustrează modul
în care dinamica procesului de transfer de polarizare 1H-1H (si implicit distanţa dintre protonii impli-
caţi) este codificată prin intensitatea cross-peakurilor corespunzătoare din spectrul de corelaţie 2D.
Figura 13: Curbe CHHC reprezentative pentru protoni cu contacte intermoleculare scurte (de exem-
plu protonul legat de C5 de pe inelul aromatic), şi respectiv lungi (protonii ataşaţi lui C2) în urma
împachetării moleculelor de L-Tirozina în reţeaua cristalină (figura din dreapta)
233
(iii), efectul multiplicităţii protonice pentru diferite grupări chimice din sistem
(CH, CH2, CH3). Corecţiile introduse conduc la creşterea semnificativă a gradul
de precizie cu care sunt estimate distanţele proton-proton din spectre RMN-S
de tip CHHC, în particular prin intermediul aşa-numitelor curbe CHHC extra-
se dintr-un set de astfel de spectre înregistrate pentru diferite valori ale timpu-
lui de mixing (Fig. 13). În această figură ilustrăm comportamentul observat
pentru transferul de polarizare în care sunt implicaţi protonii ataşaţi poziţiilor
de carbon C2, şi respectiv C5 din molecula de L-Tirozină.
Metoda CHCC
Având în vedere rezoluţia spectrală limitată a protonilor în experimente
RMN-S 2D de tip HETCOR, care sunt utilizate în mod tradiţional pentru in-
vestigaţii structurale bazate pe determinarea de distante C-H, am proiectat şi
implementat practic un nou tip de experiment de corelare 13C-13C, numit
CHCC: acesta prezintă avantajul de a cuantifica pe ambele dimensiuni spectra-
le deplasări chimice ale nucleelor 13C, adică spectre de înaltă rezoluţie. Infor-
maţia codificată în acest tip de spectre se referă tot la cuplajele dipolare 1H-13C,
iar procesul care stă la baza experimentului CHCC este şi în acest caz transfe-
rul de polarizare proton-carbon. În mod similar cu metoda CHHC, unde trans-
ferul de polarizare este utilizat pentru a codifica cuplajele dipolare 1H-1H, me-
toda CHCC se aplică în cazul compuşilor uniform marcaţi cu 13C.
Figura 14: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D CHCC de investigare a transferului

de polarizare 1H-13C codificat în spectre de corelaţie 2D 13C-13C
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/chcc"
;cp (TopSpin 2.0)
234
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u cpd2:f2
1u pl12:f2
d0
1u do:f2
1u pl2:f2
(p16 ph5):f1 (p16 ph4):f1
(p17 ph7):f1 (p17 ph6):f2
1u pl12:f1
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 3 1 3 1 3 1 3
ph1= (4) 0
ph2= 0
ph4= 1
ph5= 0
ph6= 1
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2
Secvenţa de pulsuri corespunzătoare metodei CHCC (Fig. 14) constă în

trei blocuri CP distincte, dintre care ultimele două formează perioada de
mixing a experimentului. Pentru a obţine rezoluţie înaltă, astfel încât liniile
de rezonanţă specifice fiecărei grupări chimice să fie separate, atât în di-
mensiunea directă, cât şi în cea indirectă, polarizarea de spin va evolua în
condiţii de decuplare heteronucleară prin TPPM. Informaţii cu privire la
eficienţa procesului de transfer de polarizare de la nuclee individuale 1H la
toate nucleele 13C aflate în vecinătate sunt codificate în perioada de mixing.
Primul bloc CP din perioada de mixing este unul de durată scurtă, astfel
încât polarizarea fiecărui 13C este transferată în mod selectiv doar către pro-
tonul (protonii) direct legaţi. Pe durata celui de-al doilea bloc CP din sec-
venţa de mixing transferul de polarizare 1H-13C se realizează în mod clasic,
235
către toate nucleele de carbon aflate în vecinătate, în funcţie de distanţele
carbon-proton individuale. Deoarece selectivitatea metodei CHCC poate fi
afectată de influenţa polarizării iniţiale a carbonului, Sz, şi de polarizarea
rămasă pe canalul carbonilor după pulsul CP scurt (din cauza că această
polarizare nu se transferă în întregime protonilor direct legaţi) se impune ca
asupra secvenţei CHCC să se aplice procedeul de ”phase cycling”, conform
programului de pulsuri asociat schemei experimentale din Figura 14.
Ca şi în cazul celorlalte două metode de corelare prezentate mai sus, in-
formaţiile extrase în urma aplicării schemei experimentale CHCC sunt codi-
ficate în spectre 2D de corelaţie 13C-13C, Fig. 15. Cross-peakurile CHCC sunt
generate conform următoarei scheme: (i) primul pas este format dintr-un
bloc CP standard, urmat de evoluţia pe durata t1 a polarizării 13C sub acţiu-
nea interacţiunii de ecranare chimică şi în condiţii de decuplare heteronucleră
prin TPPM; (ii) aplicarea unui bloc CP de durată scurtă, aleasă astfel încât
polarizarea de spin să fie transferată de la nucleele de 13C doar la protonii
direct legaţi; (iii) incrementând durata ultimului puls CP (tmix) polarizarea 1H
Figura 15: Spectru RMN 2D de corelaţie 13C-13C obţinute pe L-Tirozina marcata uniform cu 13C
aplicând metoda CHCC pentru valori ale ultimului puls de contact (p17) de 0.5 ms (a), şi respectiv 1
ms (b); spectrele 1D de mai jos reprezintă felii de-a lungul dimensiunii directe ce corespund poziţiilor
de carbon C2 şi C8, iar prin asterisk este marcat în fiecare caz evoluţia cross-peakului specificat.
236
se transferă atât nucleelor 13C direct legate de protonii polarizaţi, cât şi celor
aflate în vecinătate, rata de transfer fiind proporţională cu 1/r3, unde r este
disţanta 1Hi - 13Cj. Eficienţa transferului de polarizare către nuclee 13C indivi-
duale este reflectată în intensitatea cross-peakurilor obţinute.
Spectrele bidimensionale CHCC ale L-Tyrozinei·HCl uniform marcate
cu C pentru timpi de mixing de 0.5 ms, respectiv 1 ms sunt prezentate în
13
Fig. 5.6(a), respectiv (b). Distanţele intra-moleculare 1H-13C acoperă un in-

terval larg de valori, de la 2.13 Å (H7-C8), la 5.65 Å (H3-C8). Discuţia rezul-
tatelor experimentale se va concentra doar pe distanţe intermoleculare pro-
ton-carbon mai mici de 6 Å. La o analiză atentă a spectrelor CHCC se poate
observa că cross-peakurile cele mai intense (C7-C8, C3-C5, C2-C4) cores-
pund celor mai mici distanţe internucleare 1H-13C, situate în intervalul 2.15
– 2.20 Å. Acest lucru arată că pentru timpii de mixing aleşi (tmix = 0.5, res-
pectiv 1 ms) spectrele codifică informaţii structurale despre contactele in-
tramoleculare scurte, fiind în bună concordanţă cu datele teoretice (Figura
5.6 b). Totuşi, cross-peakurile datorate corelaţiilor între spini aflaţi la dis-
tanţe mai mari sunt şi ele bine conturate, spre exemplu C7-C5(C4) (pentru
distanţa C7-H5(H4) de 2.7 Å), C3-C4 (3.9 Å), şi C2-C7 (4.68 Å).
4. Metode RMN-S 2D de corelare DQ (Double Quantum) –

SQ (Single Quantum)
Metoda INADEQUATE
Metoda numită INADEQUATE (Incredible Natural Abundance Double
Quantum Transfer Experiment) este o metodă RMN-S 2D de corelatie
13C-13C în cadrul căreia în perioada de preparare se generează coerente de
două cuante (DQ – Double Quantum), utilizând cuplajul J dintre diferite

poziţii chimice în molecula investigată. Secvenţa de pulsuri asociată expe-
rimentului INADEQUATE este redată în Fig. 16. Experimentul generează
polarizare transversală a spinilor 13C prin secvenţa CP-MAS: cu ajutorul
pulsului de 900 aplicat după pulsul de contact pe canalul carbonului, aceas-
ta este transformată în polarizare longitudinală care apoi este utilizată pe
durata aplicării secvenţei INADEQUATE (Fig. 16b) pentru a genera coeren-
ţele DQ. Secvenţa INADEQUATE constă în două pulsuri de 900 separate de
o evoluţie liberă pe durata perioadei de mixing, tmix, iar la jumătatea acestei
perioade se aplică un puls de 1800, pentru a refocaliza evoluţia cu deplasa-
rea chimică 13C la sfârşitul procesului de generare a coerenţelor DQ. În di-
mensiunea indirectă, aceste coerenţe evoluează cu o frecvenţă egală cu su-
ma deplasărilor chimice asociată spinilor corelaţi, ω1+ω2, iar în dimensiunea
directă ele dau naştere semnalelor izotrope corespunzătoare ambilor spini,
adică ω1 şi ω2. În prealabil, se mai aplică o dată secvenţa INADEQUATE
care va reconverti coerenţele DQ care au evoluat pe durata lui t1 în coerenţe
237
de tip Single Quantum (SQ). În cazul nucleelor 13C, cuplajul J are valori
semnificative pentru a produce coerente DQ în general între poziţii direct
conectate prin legături chimice: din aceasta cauză, în exemplul de spectru
INADEQUATE prezentat în Fig. 17 nu va apărea cross-peakul corespunză-
tor coerentei ω1+ω3, adică între nucleele C1 şi C3.
Figura 16: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D INADEQUATE utilizat pentru

investigarea eficienţei procesului de generare a coerenţelor Double Quantum (DQ) 13C-13, codificat
în spectre de corelaţie 2D 13C-13C
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/inadequate"
;cp (TopSpin 2.0)
;13C-13C INADEQUATE experiment
1 ze
2 d1 do:f2
1u pl3:f2
(p3 ph3):f2
(1u pl1:f1) (1u pl2 f2)
(p15 ph1):f1 (p15 ph2):f2
1u (pl12:f2) (pl4:f1)
(p1 ph4):f1
1u cpd2:f2
(p1 ph5):f1
d5
(2p1 ph6):f1
d5
(p1 ph7):f1
238
d0
(p1 ph8):f1
d5
(2p1 ph9):f1
d5
(p1 ph10):f1
1m do:f2
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph3= 1 1 1 1 3 3 3 3
ph1= 0
ph2= 0
ph4= 3 3 3 3 1 1 1 1
ph5= (8) 0 2 4 6
ph6= (8) 0 2 4 6
ph7= (8) 4 6 0 2
ph8= 1
ph9= 1
ph10= 3
ph31= 0 2 0 2 2 0 2 0
Figura 17: Exemplu ilustrativ de spectru RMN 2D INADEQUATE: peakurile de corelaţie între
două poziţii chimice, ωi şi ωj, corespund formării unei coerenţe DQ care evoluează în dimensiunea
indirectă cu frecvenţa ωi + ωj şi indică conectivitatea chimică directă între carbonii corespunzători
239
Datorită particularităţilor sale, metoda INADEQUATE este intens utili-
zată în investigaţiile structurale din chimia organică, în scopul stabilirii
conectivităţilor chimice dintre diferitele grupări prezente în molecula investi-
gată. Un exemplu relevant pentru acest tip de aplicaţii practice ilustrat în
Fig. 18 corespunde spectrului 13C INADEQUATE înregistrat pe acetatul de
colesteril (C29H48O2), în abundenţă naturală. În stare solidă, această molecu-
lă prezintă o structură cristalină puternic ordonată, care conţine două mole-
cule în unitatea asimetrică. Datorită acestui fapt, spectrul 13C unidimensio-
nal conţine 58 de linii RMN (fiecărei poziţii individuale a unui nucleu 13C ii
va aparţine o linie de rezonanţă dublată), majoritatea situate în regiunea
spectrală 10 – 60 ppm. În urma analizei spectrului 2D INADEQUATE s-au
determinat toate corelaţiile posibile între nucleele de carbon din moleculă,
concluzionându-se asupra acurateţei metodei INADEQUATE în caracteri-
zarea conectivităţilor chimice în sisteme moleculare complexe, în abunden-
ţă naturală [8].
Figura 18: Spectrul RMN 2D de corelare corespunzător acetatului de colesteril în abundenţă natu-
rală (2 molecule pe unitatea asimetrică) obţinut cu ajutorul secvenţei de pulsuri INADEQUATE
240
Metoda 1H-1H DQ-MAS
Metodele bazate pe excitarea coerentelor DQ se pot aplica şi în cazul
protonilor, unde rezoluţia spectrală este asigurată prin rotaţia rapidă în
jurul unghiului magic. Spre deosebire de experimentul INADEQUATE
prezentat anterior, în cazul metodelor 1H-1H DQ-MAS coerenţele de două
cuante se generează interacţiunile dipolare homonucleare 1H-1H recuplate
pe durata perioadei de excitare şi reconversie cu ajutorul unor secvenţe de
pulsuri specifice. Drept urmare, schema generală a experimentului 1H-1H
DQ-MAS (Fig. 19) este aceeaşi ca şi în cazul INADEQUATE, singura deose-
bire fiind secvenţa de pulsuri aplicată pentru a genera coerenţe DQ, şi res-
pectiv de a le reconverti la coerenţe SQ, detectabile direct.
În practică, au fost dezvoltate numeroase metode de excitare DQ pen-
tru protoni, unele implicând acţiunea continuă a câmpurilor rf, iar altele
aplicarea de pulsuri rf intense: toate au însă în comun sincronizarea duratei
secvenţei de excitare DQ cu perioada de rotaţie a probei în jurul unghiului
magic, condiţie necesară pentru a realiza o recuplare eficientă a interacţiu-
nilor dipolare 1H-1H. În prezentul raport vom considera aşa-numita secven-
ţă BABA (Back to Back) [9], şi respectiv o versiune perfecţionată a ei, BA-
BA2, care conţine două cicluri BABA cu fazele relative astfel proiectate în-
cât să minimizeze efectul evoluţiei sub acţiunea deplasărilor chimice 1H pe
Figura 19: Reprezentarea schematică a experimentului RMN 2D 1H-1H DQ-MAS utilizat pentru
investigarea eficienţei procesului de generare a coerenţelor Double Quantum (DQ) 1H-1H , codificat
în spectre de corelaţie 2D 1H-1H; pentru excitarea coerenţelor ilizează secvenţa numita BABA2
241
durata perioadei de excitare/reconversie. Fiecare ciclu BABA conţine două
perechi de pulsuri de 900 alipite între ele, având o separare între ele egală
cu o jumătate de perioadă de rotaţie, astfel încât duratele implicate în Fig.
19 sunt tmix = 2tBABA = 2τR
# 1 "C:/Bruker/TOPSPIN/exp/stan/nmr/lists/pp/user/dq-baba"
;cp (TopSpin 2.0)
;1H-1H DQ-MAS experiment
1 ze
2 d1
1u pl1:f1
(p1 ph1):f1
d1
(p1 ph1):f1
1u
(p1 ph2):f1
d1
(p1 ph3):f1
1u
(p1 ph1):f1
d1
(p1 ph1):f1
1u
(p1 ph3):f1
d1
(p1 ph2):f1
d0
1u
(p1 ph4):f1
d1
(p1 ph4):f1
1u
(p1 ph5):f1
d1
(p1 ph6):f1
1u
(p1 ph4):f1
d1
(p1 ph4):f1
1u
(p1 ph6):f1
d1
242
(p1 ph5):f1
go=2 ph31
wr #0
HaltAcqu, 1m
1m if
1m in0
lo to 2 times td1
exit
ph1= (4) 0 2 4 6
ph2= (4) 2 4 6 0
ph3= (4) 4 6 0 2
ph4= 0
ph5= 1
ph6= 3
ph7= 1 1 3 3 2 2 0 0
ph31= 1 3 3 1 2 0 0 2
Aplicaţiile practice ale metodei 1H-1H DQ-MAS vor fi ilustrate în continua-

re, considerând cazul relativ simplu al spectrului de corelaţie 1H-1H înregis-
trat pe L-alanina (Fig. 20), unde am utilizat secvenţa BABA2, la o frecvenţă
de rotaţie a probei în jurul unghiului magic de νR = 30 kHz. Eficienţa ma-
ximă s-a obţinut pentru o singură secvenţă BABA2. Analizând spectrul se
constată şi similarităţi cu un spectru tipic INADEQUATE, dar şi deosebiri.
Concret, asemănările sunt legate de faptul că liniile de rezonanţă corespun-
zătoare spinilor 1H corelaţi, de exemplu ωi şi ωj în dimensiunea directă, evo-
luează cu o frecvenţă egală cu suma deplasărilor chimice asociată spinilor,
ωi+ωj, în dimensiunea indirectă (DQ). În spectrul DQ-MAS al L-alaninei
acesta este cazul pakurilor de corelaţie (ω1,ω2), (ω1,ω3) şi (ω2,ω3) corespunză-
toare coerenţelor DQ care se generează între protoni aparţinând grupărilor
(CH3, CH), (CH3, NH3), şi respectiv (CH, NH3). Deosebirile sunt legate de
faptul că în spectre 1H-1H DQ-MAS pot apărea şi peakuri diagonale, datori-
tă multiplicităţii protonilor dintr-o anumită grupare chimică, cum este ca-
zul grupărilor CH3 (ω1) şi NH3 (ω3) în spectrul din Fig. 20, dar şi din cauza
tăriei mari a cuplajelor dipolare 1H-1H care permit evidenţierea corelaţiilor
dintre protonii CH (ω2) aparţinând la două molecule vecine (corelaţii in-
termoleculare): în cazul peakurilor diagonale ωj, frecvenţa de evoluţie în
dimensiunea DQ va fi de 2ωj.
243
Figura 20: Spectrul RMN 2D de corelare 1H-1H DQ-MAS achiziţionat utilizând secvenţa BABA2
pe L-Alanina.
Informaţii mai cantitative cu privire la distanţele internucleare dintre

protonii din probă se pot obţine din analiza spectrelor 1H-1H DQ-MAS
comparând intensităţile relative ale peakurilor de corelaţie. De exemplu,
peakului diagonal (2ω1, ω1) a cărui intensitate în unităţi arbitrare este de 20
u.a., corespunde unor distanţe intranucleare mici, de ~1.7 Å, între protonii
grupării CH3, care formează o reţea compactă de spini. Pentru
cross-peakurile (ω1+ ω2, ω2) şi (ω3+ ω2, ω2), intensităţile sunt comparabile, şi
anume 19 u.a. În primul caz, pentru coerenţele de două cuante generate
între grupările CH-CH3, care implică o distanţă intramoleculară de ~2.3 Å,
şi respectiv de 18.5 u.a în cazul grupărilor CH-NH3 cu distanţa intramole-
culara de ~2.6 Å. Prin comparaţie, intensitatea de ~ 4 u.a. obţinută pentru
peakul diagonal (ω2, ω2), reflectă o distanţă semnificativ mai mare de ~2.3 Å
între protonii grupării CH aparţinând la două molecule vecine din reţeaua
cristalină a L-Alaninei. În consecinţă, o analiză riguroasă a intensităţilor
relative ale peakurilor din spectrul 2D 1H-1H DQ-MAS ne poate conduce la
244
cuantificarea tuturor proximităţilor proton-proton din proba investigată,
rezultând caracterul aplicativ al acestei metode în caracterizarea structurală
a compuşilor moleculari în fază solidă.
5. Bibliografie
1. T. Gullion, Introduction to High-Resolution Solid-State NMR, Elsevier Science 2007
2. P. K. Madhu, SolidSate Nuclear Magnetic Resonance 35 (2009) 2-11
3. R.R. Ernst, G. Bodenhousen, A. Wokaun, Principles of Nuclear Magnetic Resonance
în One and Two Dimensions, Oxford University Press, Oxford 1987
4. C.H. Wu, A. Ramamoothy, S.J. Opella, J. Magn. Reson A 109 (1994) 270-272;
5. D.K. Lee, T. Narasimhaswami, A. Ramamoorthy, Chem. Phys. Lett. 408 (2005)
118-122;
6. C. Tripon, M. Aluas, X. Filip, C. Filip, J. Magn. Reson., 183 (2006) 68;
7. M. Aluas, C. Tripon, J.M. Griffin, X. Filip, V. Ladizhansky, R.G. Griffin, S. P. Brown,
C. Filip, J. Magn. Reson., 199 (2009) 173;
8. G. De Paepe, A. Lesage, S. Steuernagel, L. Emsley, ChemPhysChem 5 (2004) 869-875;
9. M. Feike, D.E. Demco, R. Graf, S. Hafner, H.W. Spiess, J. Magn. Reson., A 122 (1996)
214;
245
Rezonanţa magnetică nucleară pe sisteme lichide
Lect. dr. Mihai Vasilescu
Cuprins
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale .................................................................246

2. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sisteme de studiu ...........................253
3. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare
pentru diverse tipuri de experimente ..................................................................................264
4. Bibliografie ..........................................................................................................................265
În dotarea Facultăţii de Fizică a Universităţii Babeş-Bolyai din

Cluj-Napoca se află două spectrometre de rezonanţă magnetică nucleară
(RMN) performante şi anume:
- spectrometrul Bruker Avance 400 cu câmp central de 9.4 Tesla şi
posibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a celor solide
- spectrometrul Bruker Avance 600 cu câmp central de 14 Tesla şi po-
sibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a celor solide
Utilizarea acestor spectrometre de către studenţii Facultăţii de Fizică
presupune o stăpânire temeinică a noţiunilor şi principiilor de bază din
RMN, cunoaşterea părţilor componente ale unui spectrometru, precum şi
înţelegerea modului în care acestea funcţionează şi a rolului fiecărei părţi.
În scopul facilitării activităţilor de practică experimentală pentru utili-
zarea acestor echipamente de ultimă generaţie, prezentăm mai jos protoco-
lul de lucru pentru aceste echipamente.
1. Prezentarea principiului tehnicii experimentale

Rezonanţa magnetică nucleară este un fenomen ce apare atunci când
nucleele de un anumit tip se găsesc într-un câmp magnetic static şi sunt
expuse la un al doilea câmp magnetic, oscilant.
Spectroscopia de rezonanţă magnetică nucleară are loc în regiunea un-
delor radio şi este asociată cu tranziţiile energetice ale spinilor nucleari.
O particularitate importantă asociată cu tehnica RMN este sensibilitatea
sa la mediul chimic. Deoarece legăturile chimice sunt asociate cu valenţa
ionilor şi structura moleculară, doar acele spectroscopii care au scala lun-
gimilor apropiată frecvenţelor de rezonanţă caracteristice, vor răspunde
acestor efecte.
246
Spectroscopia RMN dă date despre toate nucleele rezonante din sistem;
tipic, ele vor fi multe de acest fel, în diverse medii chimice.
Spectroscopia RMN este o metodă foarte utilă pentru studiul structurii
locale şi a dinamicii constituenţilor compuşilor. Toate nucleele cu moment
magnetic sunt capabile să ofere informaţii detaliate despre ordinea locală.
Astfel se pot obţine date despre unghiurile dintre legături şi lungimea legă-
turilor, despre atomii învecinaţi (din prima şi a doua sferă de coordinare),
simetria locală şi numerele de coordinare, precum şi despre procesele di-
namice.
Pe lângă câmpul magnetic static, câmpul efectiv din zona nucleului es-
te influenţat şi de câmpurile locale interne, care conţin informaţii specifice
structurii locale. Cele mai importante interacţii sunt interacţia de deplasare
chimică pentru toate nucleele şi interacţia cuadrupolară pentru nucleele cu
I>1/2.
De obicei, în experimentele de RMN, câmpul magnetic este în domeni-
ul 2.3-14 T. Pentru proton aceasta corespunde unor frecvenţe de rezonanţă
între 100-600MHz. Domeniul corespunzător pentru C13 este 25-150MHz.
Aceste diferenţe mari ale frecvenţelor de rezonanţă (unele exemple sunt
date în Tabelul 1) fac posibilă observarea nucleelor diferitelor elemente
relativ independent unele de altele. Într-un spectru RMN pot fi înregistrate
semnale de la un singur tip de nuclee, alte posibile nuclee rezonante fiind
excluse prin reglarea spectrometrului pe domeniul de frecvenţe de interes.
Tabel 1. Proprietăţi RMN ale unor nuclee într-un câmp de 9.395 T:

Izotop Frecvenţa RMN (MHz) Abundenţa naturală (%)
1H 400 99.98
2H 61 0.015
13C 100 1.108
14N 29 99.63
15N 40 0.37
17O 54 0.037
31P 161 100
35Cl 39 75.53
37Cl 32 24.47
43Ca 27 0.145
Rezonanţa magnetică nucleară, ca orice metodă spectroscopică, presu-

pune reprezentarea grafică a unui bilanţ energetic. Valorile frecvenţelor cu
care se lucrează în RMN fac însă folosirea lor foarte anevoioasă. Pentru
247
simplificare s-a ales ca primă soluţie folosirea unor etaloane, substanţe de
referinţă, a căror frecvenţă de rezonanţă să fie considerată nivelul zero al
scalei energetice. Ulterior s-a recurs la un artificiu, acum reprezentându-se
în loc de scală energetică propriu-zisă, o scală a deplasărilor chimice date
de formula:
ν −ν 0
δ =
ν0
Unitatea de măsură pentru deplasările chimice este "partea per milion"
sau "ppm". Deplasările chimice întâlnite în RMN sunt, de obicei, de ordinul
zecilor sau sutelor de ppm.
Îngustimea extraordinară a liniilor RMN este cea care face ca efectele
deplasărilor chimice mici să fie măsurabile şi utile, ea fiind rezultatul ener-
giei foarte joase implicate în experimentele RMN.
Îngustimea liniilor în cazul lichidelor se datorează mişcării moleculare
rapide [1].
Baza experimentului de rezonanţă magnetică este plasarea probei

într-un câmp magnetic uniform intens şi asigurarea iradierii ei cu un câmp
electromagnetic printr-un sistem potrivit de emisie şi recepţie a frecvenţe-
lor radio sau de microunde. De obicei, pentru rezonanţa magnetică nuclea-
ră, acesta va fi un sistem de bobine acordate. Pentru a observa semnalele
pot fi urmate două strategii. Prima este similară ca şi concepţie cu alte for-
me dispersive de spectroscopii şi implică o analiză (“sweep”) spectrală în
care fiecare condiţie de rezonanţă posibilă (echivalentă absorbţiei) este cău-
tată secvenţial. De obicei, aceasta nu se face prin parcurgerea domeniului
de frecvenţe, ci prin iradierea cu un câmp electromagnetic slab, de frecven-
ţă fixată, şi modificând câmpul magnetic principal. Această abordare este
mai uşoară din punct de vedere tehnic şi are la bază ecuaţia:
ω0 = -γB0
echivalentă cu parcurgerea frecvenţelor. Această abordare este adesea utili-

zată în RES, dar a devenit rară în spectroscopia RMN.
A doua abordare demonstrează chiar mai clar distincţia dintre rezonan-
ţa magnetică nucleară şi alte spectroscopii şi exemplifică folosirea descrierii
clasice a câmpului de radiaţie. Pentru a urmări experimentul este necesar să
folosim un sistem de coordonate care se roteşte cu frecvenţa Larmor ω0.
Acesta este cunoscut ca sistemul rotativ (“the rotating frame”). În aceste
248
condiţii magnetizarea nucleară poate fi descrisă de un vector paralel cu
direcţia z, care este direcţia câmpului magnetic principal. Radiaţia electro-
magnetică este descrisă de componenta sa magnetică ca un vector la un
anumit unghi faţă de direcţia câmpului. Dacă radiaţia electromagnetică este
de aceeaşi frecvenţă cu frecvenţa Larmor, atunci va părea statică în sistemul
de coordonate astfel ales. Situaţia este ilustrată în figura 1(a) [2]. În sistemul
rotativ, B0 poate fi ignorat şi este necesar doar să considerăm efectele câm-
pului de radiaţie, B1. Când aplicăm B1 magnetizarea răspunde precesând în
jurul lui B1 cu o frecvenţă ω1 dată de:
ω1 = - γ B1
Unghiul la care se mişcă magnetizarea este θ, dat de:

θ = ω1 t = - γ B1 t
aşa că magnetizarea poate fi înclinată la orice unghi doar prin simpla apli-
care a unui puls electromagnetic de putere şi durată cunoscute. Figura 1(b)
ilustrează acest proces pentru un unghi de 1800.
Figura 1. (a) Magnetizarea (M0) în sistemul rotativ în prezenta câmpului de radiofrecvenţa (B1); (b)
Magnetizarea după un puls de 1800; (c) Magnetizarea după un puls de 900.
După un “puls de 180” sensul magnetizării se inversează complet. Aceasta

corespunde unei inversii a populaţiei nivelelor energetice şi este, în mod
clar, o situaţie de non-echilibru. Revenirea la echilibru este caracterizată de
un timp, T1, cunoscut ca timp de relaxare spin-reţea sau timp de relaxare
longitudinală.
Dacă, în loc să aplicăm un puls de 180, aplicăm un puls cu durata jumă-
tate, atunci magnetizarea se roteşte cu 90 de grade în planul x’y’, cunoscut
ca plan transversal (fig 1c). În această situaţie fiecare vector nuclear indivi-
dual (vectori care sunt însumaţi pentru a da magnetizarea macroscopică)
249
este forţat de câmpul de radiaţie să se rotească coerent cu frecvenţa Larmor
ω0. Imediat după ce aplicarea pulsului încetează, sistemul începe să se rela-
xeze. Efectele de câmp aleatoare, dependente de timp, vor produce variaţii
aleatoare ale frecvenţei Larmor, care vor face ca vectorii nucleari individu-
ali să se mişte cu viteze diferite faţă de viteza sistemului rotativ. Cum aces-
te câmpuri sunt aleatoare, vom avea tot atâtea nuclee ce se mişcă mai rapid
ca şi numărul celor ce se mişcă mai lent. Pe măsura trecerii timpului suma
vectorilor se va reduce la zero. Acest proces, numit relaxare spin-spin sau
transversală, este ilustrat în figura 2. În lichide, această relaxare poate fi
adesea caracterizată ca un proces exponenţial cu constanta de timp T2, nu-
mit timp de relaxare spin-spin sau timp de relaxare transversală.
Figura 2. Relaxarea transversală – fiecare săgeată reprezintă un vector magnetizare nucleară. (a), (b),
(c) şi (d) arată evoluţia în timp după un puls de 900.
Când apar deplasarea chimică (“chemical shift”) sau rezonanţele cuplate

scalar, atunci setul de spini nucleari, corespunzând liniilor deplasate, oscilea-
ză cu o frecvenţa egală cu diferenţa dintre frecvenţa de referinţă şi frecvenţa
de rezonanţă a semnalelor deplasate. Acolo unde avem un număr de rezo-
nanţe deplasate se obţine un semnal oscilator complicat al relaxării. Semnalul
obţinut prin relaxare se referă de obicei la relaxarea liberă a magnetizării
(free induction decay, FID) şi poate fi transformat într-un spectru printr-un
proces matematic cunoscut sub numele de transformare Fourier. Acest pro-
ces este ilustrat în figura 3. Există o relaţie importantă între relaxarea trans-
versală şi lărgimea liniei. Pentru o descreştere exponenţiala spre echilibru, T2
este legat de lărgimea liniei la jumătatea înălţimii peak-ului, ν½ , prin:
250
ν½ = 1/(πT2)
de aceea, cu cât relaxarea se produce mai rapid, cu atât linia observată este
mai largă. În multe cazuri, din cauza lărgimii liniei deplasarea chimică sau
informaţiile privind cuplajul sunt obscure sau chiar pierdute.
intensitate
(a)
timp
(b)
frecventa
Figura 3. Transformarea Fourier a unui FID (a) într-un spectru (b)
Tehnica transformării Fourier, care este acum metoda aleasă în cele mai
multe experimente RMN, este un exemplu de metodă multiplex. Principiul
unei astfel de metode este ca, respectând condiţia ca pulsul excitaţiei să
acopere o lărgime de bandă potrivită, toate frecvenţele sunt excitate în mod
251
egal şi toate contribuie la toate punctele din FID. Dimpotrivă, în metoda
undelor continue (continous wave, CW) frecvenţele sunt excitate secvenţial.
Ca rezultat al acestei metode, CW tinde să fie mult mai lentă decât metoda
transformatei Fourier. În cazuri ideale, avantajul semnal/zgomot al meto-
dei transformatei Fourier asupra metodei CW pentru acelaşi timp de achi-
ziţie este N unde N este numărul de frecvenţe. Deoarece N este de obicei
mii sau zeci de mii, acest avantaj este foarte consistent.
Metoda transformatei Fourier nu este însă lipsită de probleme. Prima es-
te durata FID-ului. Dacă aceasta este foarte scurtă, atunci liniile spectrale
sunt foarte largi şi digitizarea devine o problemă, iar partea iniţială a semna-
lului este distorsionată de revenirea sistemului de recepţie după pulsul de
radiaţie. În cazul RES, aceasta limitează metoda transformatei Fourier la doar
un grup restrâns de sisteme, cu linii foarte înguste. În RMN pot apare dificul-
tăţi cu semnalele solidelor. A doua problemă este direct legată de avantajul
multiplexului. Cum toate frecvenţele contribuie la fiecare punct, un semnal
foarte intens în anumite părţi ale spectrului va creşte intensitatea tuturor
punctelor din FID. Ca o consecinţă, pot apărea probleme cu digitizarea sem-
nalului, deoarece semnalele mici, de interes, vor avea doar o mică contribuţie
la FID. Dacă nu avem o rezoluţie suficientă în convertorul analog – digital,
atunci contribuţia semnalelor mici poate fi pierdută cu totul. Aceasta poate fi
o problemă importantă în spectrele RMN pentru protoni, atunci când se fac
analize pe alimente, de exemplu, unde apa este adesea componentul majori-
tar şi poate domina spectrul. În aceste condiţii s-ar putea să fie avantajoasă
folosirea metodei CW cuplată cu tehnici de scanare rapidă.
Figura 4. Vedere generala asupra spectrometrului
252
Magnetul
• cea mai scumpă parte a spectrometrului
• electromagnet din fire supraconductoare
• câţiva km de fir
• solenoid, bobina, bobine helmholtz
• heliu lichid (T = 4.2 K)
• straturi termoizolante şi ecranante
• azot lichid (T = 77.4 K)
• straturi termoizolante şi ecranante
• orificiu central vertical (îngust sau larg)
Figura 5. Secţiune schematică printr-un magnet RMN
2. Prezentarea informaţiilor care se pot obţine pe diferite sis-

teme de studiu
Cel mai adesea analizele probelor lichide se concentrează pe studiul
spectrului RMN corespunzător nucleelor de hidrogen sau carbon, anume a
izotopilor 1H şi 13C. Interpretarea acestor spectre ne permite identificarea
structurii probelor analizate.
Analizele se fac utilizând recipienţi speciali pentru analize RMN, epru-
bete de quartz de 5 mm diametru.
Dizolvarea probelor se face în solvenţi deuteraţi, spectrometrul reali-
zând fixarea câmpului cu ajutorul nucleelor de deuteriu.
253
În acelaşi timp, solvenţii au şi rol de referinţă. Astfel:
• CDCl3 (cloroform deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 7.26 ppm
pentru 1H, respectiv triplet la 77.01 ppm pentru 13C;
• D2O (apa deuterată) are frecvenţa de rezonanţă de 4.78 ppm pentru 1H;
• C6D6 (benzen deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 7.156 ppm
pentru 1H, respectiv 128.032 ppm pentru 13C;
• DMSO (dimetilsulfoxid deuterat) are frecvenţa de rezonanţă de
2.512 ppm pentru 1H, respectiv 39.47 ppm pentru 13C;
• TMS (tetrametilsilandeuterat) are frecvenţa de rezonanţă de 0 ppm
pentru 1H, respectiv 0 ppm pentru 13C şi 0 ppm pentru 29Si;
• C3D6O (acetona deuterata) are frecvenţa de rezonanţă de 2.16 ppm
pentru 1H, respectiv 30 ppm şi 206 ppm pentru 13C.
Redăm mai jos şi câteva exemple de analize 1H NMR pe probe relativ

simple [3]:
Figura 6. Proba: ciclohexan (C6H12) ; Solvent: CDCl3
Figura 7. Proba: benzen (C6H6); Solvent: CDCl3
254
Figura 8. Proba: toluen (C6H5CH3); Solvent: CDCl3
Figura 9. Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3); Solvent: CDCl3
Figura 10. Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) ; Solvent: CDCl3
255
Figura 11. Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent: CDCl3
Figura 12. Proba: apa (H2O) ; Solvent: D2O
Figura 13. Proba: etanol (CH3CH2OH) ; Solvent: CDCl3
256
Figura 14. Proba: etanol (CH3CH2OH); Solvent: D2O
Figura 15. Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH); Solvent: CDCl3
Figura 16. Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH); Solvent: CDCl3
257
Figura 17. Proba: t-butanol ((CH3 )3COH); Solvent: CDCl3
Figura 18. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ); Solvent: CDCl3
Figura 19. Proba: piridina (C5H5N); Solvent: CDCl3
258
Pentru aceste exemple identificarea corespondenţei între semnalele de
rezonanţă şi poziţia protonilor în moleculă se face relativ simplu. Informaţii
suplimentare se obţin dacă calculăm integralele liniilor de rezonanţă, aces-
tea reprezentând de fapt intensitatea relativă a semnalelor şi fiind, în gene-
ral, proporţionale cu numărul de nuclee care produc semnalele respective,
aşa cum se vede în figura 20:
Figura 20. Integrarea semnalelor pentru proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent:
CDCl3
Raportul relativ al celor trei integrale este 2:3:3, corespunzător număru-

lui de protoni legaţi de fiecare dintre nucleele de carbon. Pentru a identifica
semnalele celor doua grupări CH3 vom ţine cont de faptul că protonii gru-
pării legate de C=O dau semnal simplu (singlet), în timp ce protonii grupă-
rii legate de CH2 dau semnal despicat (n+1), deci triplet. Astfel, identifica-
rea corespondenţei celor trei semnale de rezonanţă este completă.
Senzitivitatea spectrometrului RMN este o măsură a numărului minim
de spini detectabili. Cum semnalul RMN creşte odată cu creşterea diferen-
ţei de populaţie dintre nivelele energetice, senzitivitatea este îmbunătăţită
de creşterea câmpului magnetic utilizat [5]. De asemenea, diferenţa de po-
pulaţie poate fi crescută prin scăderea temperaturii probei. Analizele de tip
13C NMR vor utiliza diferite metode ce conduc la îmbunătăţirea semnalului
RMN.
Redăm mai jos şi câteva exemple de analize 13C NMR pe probe relativ
simple:
259
Figura 21. Proba: ciclohexan (C6H12) ; Solvent: CDCl3
Figura 22. Proba: benzen (C6H6); Solvent: CDCl3
Figura 23. Proba: toluen (C6H5CH3); Solvent: CDCl3
260
Figura 24. Proba: etil benzen (C6H5CH2CH3); Solvent: CDCl3
Figura 25. Proba: acetona (CH3(C=O)CH3) ; Solvent: CDCl3
Fiurag 26. Proba: metil etil cetona (CH3(C=O)CH2CH3); Solvent: CDCl3
261
Figura 27. Proba: etanol (CH3CH2OH) ; Solvent: CDCl3
Figura 28. Proba: etanol (CH3CH2OH); Solvent: D2O
Figura 29. Proba: 1-propanol (CH3CH2CH2OH); Solvent: CDCl3
262
Figura 30. Proba: 2-propanol ((CH3 )2CHOH); Solvent: CDCl3
Figura 31. Proba: t-butanol ((CH3 )3COH); Solvent: CDCl3
Figura 32. Proba: 2-butanol (CH3CH2CH(OH)CH3 ); Solvent: CDCl3
263
Figura 33. Proba: piridina (C5H5N); Solvent: CDCl3
În toate spectrele de mai sus, acolo unde s-a utilizat ca solvent CDCl3,
se observă şi semnalul corespunzător solventului la 77.01 ppm, semnal
foarte util şi pentru a calibra spectrul în funcţie de referinţă.

În dotarea Facultăţii de Fizică a Universităţii Babeş-Bolyai din
Cluj-Napoca, utilizabil pentru analiza probelor lichide, se află spectrome-
trul de rezonanţă magnetică nucleară (RMN) Bruker Avance 400 cu câmp
central de 9.4Tesla şi posibilităţi de analiză atât a probelor lichide cât şi a
celor solide.
Etapele înregistrării spectrului RMN pe probe lichide la spectrometrul
Bruker Avance 400 din dotarea laboratorului:
• se ia o eprubeta de 5 mm diametru, specială pentru analize RMN,
curată
• se pune proba în eprubetă (circa 0.1-0.4 grame proba);
• se pune solventul în eprubetă, peste probă, până
când coloana de lichid are aproximativ 4 cm înălţi-
me (circa 0.5 ml solvent);
• se agită pentru dizolvarea probei; la nevoie se încăl-
zeşte uşor eprubeta pentru a facilita dizolvarea;
• se pune eprubeta în suportul special:
• se aşează eprubeta cu suportul în dispozitivul speci-
al de reglaj al distanţei şi se aşează eprubeta astfel încât ulterior
proba să fie în centrul câmpului magnetic;
• se dă comanda „lift on” de la BSMS pentru a crea perna de aer pen-
tru eprubeta;
264
• se aşează eprubeta pe perna de aer;
• se dă comanda „lift off” şi proba coboară în magnet;
• se centrează semnalul de „lock” în fereastra de control a BSMS-ului;
• se dă comanda „lock” şi se alege solventul potrivit; spectrometrul
va intra în modul „lock”, deci câmpul va fi fixat şi stabilizat,
făcându-se automat corecţiile variaţiilor externe;
• se realizează reglajele de „shimm” făcând corecţiile necesare de la
BSMS, modificând în principal câmpurile Z1 şi Z2; la nevoie se mo-
difică şi Z3, Z4, X sau Y.
• se alege programul de pulsuri dorit şi nucleul pe care se doreşte rea-
lizarea analizei RMN;
• se dă comanda „wobb” şi din şuruburile speciale ale capului de
sondă se reglează frecvenţa de rezonanţă pentru nucleul studiat;
• se setează parametrii de achiziţie;
• se realizează măsurătoarea efectivă alegând un număr de achiziţii
potrivit pentru obţinerea unui raport semnal/zgomot suficient de
bun;
• se dă comanda „efp” pentru a trece din semnal timp (FID) în semnal
frecvenţa (spectru);
• se fazează corespunzător;
• se calibrează spectrul în funcţie de referinţa aleasă;
• se analizează spectrul, marcând peak-urile de rezonanţă, măsurând
integrala lor şi atribuind în final semnalele nucleelor, funcţie de
structura moleculară.
Anterior înregistrării unui spectru este posibil ca parametrii de achizi-
ţie să necesite o optimizare. Aceasta se realizează cu comanda „popt” şi se
referă în general la setarea duratei pulsului de excitare (p1) şi respectiv a
timpului de relaxare dintre două achiziţii consecutive (d1).
4. Bibliografie
1. P.S. Belton, Annual Reports on NMR Spectroscopy, Vol. 31, p. 1-18, Academic
Press, (1995);
2. R. Grimmer and B. Blumich, NMR Basic Principles and Progress, Vol. 30, p. 1-60,
(1994);
3. Joseph P. Hornak; http://www.cis.rit.edu/htbooks/nmr/
4. Mihai Vasilescu, Teza de doctorat, 2007
5. Carrington, A.D. McLachlan, Introduction to Magnetic Resonance, Chapman and
Hall, London (1967)
265
VII. MĂSURĂTORI TERMICE
Analiză termică diferenţială.

Analiză calorimetrică diferenţială
Analiza termică a materialelor acoperă o categorie largă de metode prin

care sunt determinate proprietăţile fizice şi chimice ale acestora, în funcţie
de temperatură sau timp pe baza efectelor termice care însoţesc transfor-
mările din probă în timpul supunerii acesteia la procese de încălzire, răcire,
tratamente izoterme, etc.
Fenomenele fizice şi chimice, constantele de material detectabile sau
măsurabile prin analiza termică sunt:
• comportarea materialelor la topire, cristalizare, fierbere,
sublimare, de-vitrificare etc.;
• temperaturile caracteristice ale transformărilor de fază;
• căldurile de topire, cristalizare, de reacţie etc.;
• cinetica reacţiilor şi a formării fazelor;
• oxidarea, reducerea, descompunerea, hidratarea – dehidra-
tarea etc.;
• coroziunea metalelor în diferite atmosfere;
• puritatea şi compatibilitatea materialelor;
• tranziţii vitroase ale solidelor ne-cristaline;
• capacităţi calorice, călduri specifice;
• re-cristalizarea sticlelor metalice etc.
Metodele de analiză termică diferenţială reprezintă varianta modernă a

metodelor clasice de investigare a efectelor termice induse de variaţia tem-
peraturii unui corp fiind pentru prima dată folosite de către W.C.Robert
Austin în anul 1899. Termenul de “metoda diferenţială” provine de la fap-
266
tul că aceste tehnici permit determinarea diferenţelor dintre variaţiile unor
mărimi fizice ale probei în raport cu cele ale unui etalon. [1]
Concret, metoda constă în încălzirea sau/şi răcirea în condiţii identice a
unei probe şi a unui material de referinţă inert din punct de vedere termic,
concomitent înregistrându-se continuu temperatura cuptorului T şi dife-
renţa de temperatură ΔT (la metodele DTA) sau de flux termic
Δ (dQ / dτ ) (la metodele DSC) care apare între probă şi materialul de referin-
ţă. Graficele obţinute în urma determinărilor se numesc curbe de analiză
termică sau termograme.
Analiza termică diferenţială (DTA) este suficient de sensibilă pentru a
determina variaţii foarte mici de temperatură şi este capabilă să sesizeze
transformările lente ce se produc în intervale largi de temperatură. De ace-
ea, DTA poate fi folosită si pentru a studia proprietăţile termice şi trans-
formările de faze care nu se produc cu modificarea entalpiei materialului.
Linia de bază a unei înregistrări DTA prezintă astfel discontinuităţi la tem-
peraturile de tranziţie, iar panta curbei în orice punct va depinde de micro-
structura probei la temperatura respectivă. Suprafaţa de sub aria curbei
este proporţională cu modificarea entalpiei şi nu depinde de capacitatea
calorică a probei.[2]
Figura. 1. Principalele componente ale unui sistem termic diferenţial
Principalele componente ale unui sistem termic diferenţial (Fig. 1) sunt:

1. Suportul pentru probe conţinând termocuplurile şi containerele pen-
tru probe plasate într-un bloc ceramic sau metalic.
2. Cuptorul.
3. Programatorul de temperatură.
267
4. Sistemul de înregistrare.
5. Sistemul de furnizare a gazelor, în scopul menţinerii unei atmosfere
inerte în cuptor (pentru inhibarea oxidării probei, eliminarea volatilelor şi
asigurarea unui transfer termic cât mai bun).
Orice proces endoterm sau exoterm (cum ar fi topirea sau cristalizarea)
care are loc în probă la încălzire este înregistrat ca un peak în direcţia nega-
tivă, respectiv pozitivă a axei X, pe care este reprezentată diferenţa de tem-
peratură (semnalul DTA) (Fig. 2).
Figura. 2 Schema idealizată a unei curbe DTA
Calorimetria dinamică diferenţială (DSC) este o tehnică în care dife-

renţa de energie dintre o substanţă (şi/sau produşii de reacţie) şi un mate-
rial de referinţă este măsurată ca funcţie de temperatură (sau timp) în timp
ce substanţa şi materialul de referinţă sunt supuse unui program de tempe-
ratură controlat - conform IUPAC (International Union of Pure and Applied
Chemistry).
Termenul calorimetrie se referă exclusiv la măsurarea căldurii. Căldura
poate fi o cantitate de energie schimbată sub forma unui flux de căldură
între două corpuri într-un interval de timp. Calorimetrele cu baleiaj dife-
renţial sunt tehnici îmbunătăţite ale DTA (analiza termică diferenţială) în
sensul că ele au fost calibrate pentru măsurători de energie calorică, nu de
temperatură.
Efectul termic care se produce în cazul unei tranziţii termice sau a unui
proces fizico-chimic este înregistrat ca diferenţă de flux caloric între probă
şi referinţă şi la rândul lui este tradus în semnal electronic, amplificat şi
268
apoi prelucrat de componenta software a instrumentului. Înregistrarea se
redă sub forma unei curbe numită termogramă DSC care reprezintă o de-
pendenţă a fluxului caloric măsurat funcţie de temperatură (analiză în re-
gim dinamic) sau timp (analiză în regim izotermal).
Semnalul măsurat redat în termograma DSC este direct proporţional cu
capacitatea calorică a probei, astfel că orice diferenţă ce apare în capacitatea
calorică a probei conduce la modificarea termogramei DSC. Dacă proba de
analizat nu suferă o transformare fizico-chimică sau o tranziţie termică,
atunci semnalul DSC va arăta ca o linie dreaptă. Faţă de această linie se vor
măsura intensitatea şi temperatura la care se manifestă procesele termice
din probă, drept pentru care linia serveşte ca şi referinţă şi este numită linie
de bază. Schematic este prezentată o termogramă DSC în care linia de bază
prezintă multiple modificări datorate proceselor şi tranziţiilor termice din
probă (fig. 3).
Figura. 3 Tipuri de procese care pot apărea într-o înregistrare DSC
Există două tipuri de tehnici DSC utilizate în analizele termice:

• calorimetre DSC cu flux de căldură („heat flux” DSC),
• calorimetre DSC cu compensarea puterii calorice („power
compensated” DSC).
Deşi în ambele tipuri semnalul măsurat reprezintă diferenţa de tempe-
ratură generată de senzori, fluxul diferenţial de căldură de la cuptor spre
probă şi referinţă este măsurat pe căi complet diferite. Sistemul „heat flux”
DSC înregistrează diferenţa de temperatură între probă şi referinţă care
apare în cursul unei transformări fizico-chimice, iar „power compensated”
DSC transformă această diferenţă de temperatură în puterea calorică nece-
sară restabilirii echilibrului termic dintre probă şi referinţă. În continuare
vom prezenta pe scurt câteva detalii pentru fiecare tehnică in parte.
269
Heat flux DSC – măsoară diferenţa de temperatură dintre probă şi etalon,
care este convertită în flux de căldură printr-o construcţie specială (Fig. 4).
Căldura transportată la probă şi referinţă printr-un platan din argint sau
constantan, care este şi parte integrantă a sistemului de înregistrare a tem-
peraturii, este controlată în timp ce se înregistrează diferenţa de temperatu-
ră dintre cele două. Semnalul măsurat este folosit ulterior la măsurarea
diferenţei de flux de căldură. Dacă în cuptor fluxul de căldură este echili-
brat, diferenţa de temperatură este zero, iar graficul înregistrează
aşa-numita linie de bază în funcţie de timp sau temperatură. Dacă în probă
au loc transformări de fază sau alte procese care se produc la o anumită
temperatură, se modifică gradientul de temperatură al probei faţă de eta-
lon, iar în grafic apare o deviere de la linia de bază sub forma unor peak -
uri endoterme sau exoterme, în funcţie de tipul procesului.
Figura. 4. Schema de principiu a metodei heat flux DSC
Power compensated DSC (Fig. 5) – măsoară diferenţa de flux termic

proba-etalon indirect, prin diferenţa de putere electrică introdusă în
rezistenţele de încălzire aşezate în imediata vecinătate a probei şi
etalonului, pentru a menţine diferenţa de temperatură zero. Proba şi
referinţa sunt menţinute la aceeaşi temperatură printr-un sistem electric
format din două rezistenţe de încălzire.
270
Figura. 5. Schema de principiu a metodei power compensated DSC
Dacă în probă are loc un proces (exo- sau endoterm), pentru ca

temperatura probei să nu difere de cea a referinţei se cuplează sau
decuplează rezistenţa de încălzire a acesteia până la egalizarea
temperaturilor. Semnalul electric dat de diferenţa de putere dintre cele 2
rezistenţe este proporţional cu diferenţa de flux termic şi este înregistrat sub
forma curbei de analiză termică.
Din punct de vedere experimental, există o serie de factori care influen-

ţează în mod direct efectele termice analizate şi implicit forma termograme-
lor. Principalii astfel de factori de influenţă sunt [3]:
1. Viteza de creştere sau descreştere a temperaturii în cuptor: viteza de încăl-
zire afectează înălţimea şi lăţimea efectelor termice înregistrate de curbele
DTA şi DTG. Influenţa vitezei de încălzire asupra curbelor se explică prin
aceea că odată cu creşterea ei creşte şi cantitatea de produşi sub formă de
gaz care generează o diferenţă de temperatură mai mare între probă şi cup-
tor. La o viteză mai mică efectele termice au loc la temperatură mai joasă,
dar peak-urile înregistrate sunt mai largi. La viteze de încălzire mai mari
efectele termice sunt evidenţiate mai bine, cu peak-uri mai înguste, însă pot
apărea suprapuneri de peak-uri.
2. Rolul formei şi al materialului din care este format locaşul pentru probe
Materialele folosite la construcţia locaşelor sunt de două categorii: me-
talice sau ceramice. Metalele cele mai frecvente utilizate le temperaturi înal-
te sunt nichelul, oţelul inoxidabil la temperaturi înalte, metalele nobile şi
seminobile. Materialele ceramice utilizate la confecţionarea locaşurilor sunt
271
alumină cu adaus de silice, argilă arse, sticle rezistente la temperatură şi, de
multe ori, grafitul.
Locaşurile metalice, care sunt mai frecvent utilizate, au avantajul că pot
fi mult mai uşor de confecţionat, nu sunt poroase şi dau mici deviaţii ale
fluxului de căldură, deci ale liniei de bază a curbei DTA. Dar dezavantajul
lor este că intensitatea efectelor termice tinde să fie mică, din cauză că
transferul de căldură care are loc se face rapid prin pereţii lor şi între aceşti
pereţi şi masa probei.
Locaşurile ceramice, pe de altă parte, dau efecte termice cu intensităţi
mari, pentru aceeaşi cantitate de material reactant ca şi în cazul celor meta-
lice, din cauză că transferul de căldură are loc încet prin pereţii lor. Dar au
şi acestea dezavantajele lor . Cum ar fi, aşezarea lor în cuptor este dificilă
din cauza faptului că au o slabă conductibilitate termică iar atunci trebuie
foarte bine centrate. Un alt dezavantaj este acela că datorită structurilor
poroase, ele pot influenţa forma efectelor termice sau să se impurifice, în
cazul când în probă se află un compus care se topeşte.
În ceea se priveşte forma locaşelor pentru probe, în decursul timpului,
s-au impus două tendinţe: utilizarea locaşurilor în formă de blocuri şi utili-
zarea locaşurilor în formă de creuzet.
3. Rolul acoperirii sau descoperirii probei
Acoperirea probei poate să ajute, în anumite cazuri, la obţinerea unei
linii de bază a curbei DTA sub forma unei linii drepte sau prin acoperirea
probei se protejează unele reacţii violente ca de exemplu: fierberile sau des-
compunerile în urma cărora ar ieşi o cantitate de probă afară din locaş, în
timpul procesului termic. Cu toate acestea este bine să se lucreze, pe cât
posibil, cu probele descoperite. Această precauţie de a se lucra cu proba
descoperită se ia pentru a nu influenţa admisia şi emisia gazelor şi a vapori-
lor de apă care însoţesc reacţiile termice şi care dacă ar fi într-un sistem
închis ar duce la suprimarea unor reacţii, fapt ce denaturează foarte mult
forma curbelor termice.
4. Influenţa gradului de mojarare a probei: cu cât granulaţia probei este mai
mică cu atât temperaturile de descompunere sunt mai joase, iar suprafeţele
efectelor termice sunt mai mici (cu excepţia oxidărilor).
5. Densitatea sau gradul de tasare a probei în locaş: diferenţele în densitatea
sau gradul de tasare a probei în locaş sunt cauzele cele mai obişnuite ale
devierilor de la linia de bază a curbei DTA.
6. Cantitatea de probă luată în lucru: greutatea probei luată în lucru poate
să varieze între 0.2 şi 1g, fără ca această variaţie să aibă prea mare influenţă
asupra rezultatelor. Cantitatea de probă ce trebuie luată în lucru este de
272
obicei determinată de sensibilitatea aparaturii şi de intensitatea proceselor
termice care au loc în substanţa cercetată.
7. Substanţa termică inertă. În analiza termică se foloseşte o substanţă
termică inertă în vederea determinărilor fenomenelor care au loc la încălzi-
rea unui produs solid, comparativ cu această substanţă termică inertă. Ale-
gerea substanţei termice inerte este foarte importantă. Cele mai bune mate-
riale inerte sunt acelea care au aceeaşi conductivitate termică ca şi materia-
lul de cercetat, dar, oricare ar fi materialul folosit, el trebuie să aibă aceeaşi
mărime granulară şi să se ia aceeaşi cantitate în lucru ca şi proba de cerce-
tat.
8. Acţiunea atmosferei din cuptor asupra desfăşurării reacţiilor: oricare ar fi
procedeul experimental de reglare a presiunii din cuptor, presiunea trebuie
menţinută constantă pe tot parcursul determinărilor.
9. Natura şi proprietăţile termocuplelor: un termocuplu este format din doi
conductori de compoziţie diferită, sudaţi la un capăt între ei şi care au pro-
prietatea ca prin încălzire la locul sudurii să dea naştere unui curent electric
proporţional cu cantitatea de căldură aplicată. Termocuplele ideale sunt
cele constituite din metale nobile, care sunt rezistente la atacul termic şi au
o durată de utilizare lungă în comparaţie cu cele confecţionate din metale
inferioare. Pentru temperaturi cuprinse între 100-2200˚C se folosesc
termocuple confecţionate dintr-un fir de Pt şi celălalt dintr-un aliaj de Pt cu
rodiu; între 100-800˚C se pot folosi termocuple confecţionate din aliaje spe-
ciale de Ni şi Cr.
Institutului de Cercetări Experimentale In-

terdisciplinare în Bio-Nano-Ştiinţe deţine două
aparate performante destinate analizelor termi-
ce. Măsurătorile de analiză termică diferenţia-
lă se realizează cu un derivatograf termic
Shimadzu tip DTG-60/60H. Materialul de refe-
rinţă şi probele de analizat sunt puse în celule
standard din alumină (având dimensiunile Ø:
5.8 mm x h: 2.5 mm). Se lucrează în atmosferă
de azot şi aer la un flux de 70 ml/min. fiecare,
cu o rată de încălzire a cuptorului de
5-10ºC/min (uzual) în domeniul maxim de temperatură de la 23 ºC (sau
temperatura camerei) până la 1600 ºC. Măsurătorile de analiză calorimetri-
că se realizează pe un calorimetru diferenţial Shimadzu tip DSC-60. Mate-
rialul de referinţă şi probele de analizat sunt puse în celule standard din
273
aluminiu Se lucrează în atmosferă de azot şi
aer la un flux de 70 ml/min fiecare (având di-
mensiunile Ø: 5.8 mm x h: 1.5 mm). Rata de
încălzire a cuptorului este de 5-10ºC/min
(uzual), în domeniul maxim de temperatură
23ºC (sau temp. camerei) până la 600ºC. O baie
de azot lichid permite determinări la tempera-
turi scăzute (de la -150ºC).
Accesul la aceste aparate este deschis tutu-
ror studenţilor, masteranzilor, doctoranzilor,
cadrelor didactice, cercetătorilor din UBB sau
din Universităţi, Centre de Cercetare partenere. Informaţii importante pri-
vind proprietăţile termice ale unor materiale, obţinute prin măsurători efec-
tuate la ICIBNS se regăsesc în o serie de lucrări de licenţă, dizertaţie , teze
de doctorat si lucrări ştiinţifice cotate ISI (anexa I).
Bibliografie
1. Michael E. Brown, Introduction to thermal analysis: techniques and applications, Second
edition, Kluwer Academic Publishers, 2001.
2. Todor D.N., Analiza termică a mineralelor, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1972.
3. V.Pop, I. Chicinaş, N. Jumate, Fizica Materialelor.Metode Experimentale, Ed. Presa Univ.
Clujeană, Cluj Napoca, 2001.
274
Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termică
diferenţială si analiză calorimetrică diferenţială.
Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG si DSC
Cuprins
1. Ghid de utilizare a aparatelor de analiză termică diferenţială şi analiză

calorimetrică diferenţială..................................................................................... 275
2. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC ...................................... 279
3. Bibliografie ........................................................................................................... 285
1. Ghid de utilizare a aparatelor de analiză termică diferenţia-

lă şi analiză calorimetrică diferenţială
Metodele termice diferenţiale constau, ca principiu, în încălzirea sau/şi
răcirea în condiţii identice a unei probe şi a unui material de referinţă inert
din punct de vedere termic, concomitent înregistrându-se continuu tempe-
ratura cuptorului T şi diferenţa de temperatură ΔT (la metodele DTA) sau
de flux termic Δ (dQ / dτ ) (la metodele DSC) care apare între probă şi mate-
rialul de referinţă. Graficele obţinute în urma determinărilor se numesc
curbe de analiză termică sau termograme, care prezintă pe abscisă timpul
sau temperatura iar pe ordonată diferenţa de temperatura probă-referinţă
(la DTA) sau diferenţa de flux termic (la DSC). În cele ce urmează sunt pre-
zentaţi paşii necesari efectuării măsurătorilor DTA/TG şi DSC, raportat la
cele două aparate de măsura existente în cadrul Institutului de Cercetări
Interdisciplinare în Bio-Nano-Ştiinţe, Cluj Napoca.
Analiza termică diferenţială simultan cu termogravimetria

(DTA/TG) – aparat Shimadzu tip DTG-60/60H
Specificaţii aparat:
• Intervalul de temperatură pe care se pot face măsurători: temp.
camerei – 1500ºC
• Acurateţea balanţei: ± 1%
• Detectorii: termocuplu de Pt plus 10% Pt/Rh
275
• Interval măsurabil semnal DTA: ± 1 la ± 1000 µV
• Nivel de zgomot: < 1µV
• Materialul de referinţă (α-alumina) şi proba de analizat se pun în
cellule standard din alumină (având dimensiunile Ø 5.8 mm x h
2.5 mm);
• Se lucrează în atmosferă de aer şi azot la un flux de ~ 50-70 ml/min;

• Rata de încălzire a cuptorului: 0,1÷50,0ºC/min pe un domeniu de
temperatură de la temperatura camerei (minim) până la 1500 ºC
(maxim);
• Cantitatea de probă folosită: max. 1 g
Paşi în efectuarea unei măsurători DTA:

1. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura atmosfera în cuptor.
2. Se deschid aparatele şi se aşteaptă 30 min pentru a permite gazelor să
formeze o atmosferă inertă în cuptor.
3. Se pregătesc două creuzete curate: unul pentru proba de referinţă
(α-alumina) altul pentru proba de analizat.
4. Se deschide cuptorul apăsând pe tasta [OPEN/CLOSE] de pe afişajul
digital al aparatului.
5. Se pune creuzetul cu materialul de referinţă pe suportul din partea
stângă, iar creuzetul gol pe suportul din partea dreaptă.
6. Se apasă tasta [OPEN/CLOSE] de pe afişajul digital al aparatului pen-
tru a închide cuptorul.
7. Se apasă o dată pe tasta [DISPLAY] când ecranul digital al aparatului
afişajează valoarea masei. Se aşteaptă un timp pentru stabilizarea sem-
nalului, apoi se apasă tasta [ZERO] pentru aducerea la valoarea zero a
balanţei.
8. Se deschide cuptorul apăsând tasta [OPEN/CLOSE], se ia creuzetul
276
gol de pe suport şi se pune în el o cantitate optimă de probă, apoi se
pune din nou creuzetul pe suportul de probă.
9. Se închide cuptorul. Valoarea afişată după stabilizarea semnalului TG
reprezintă masa de probă.
10. Se apasă de două ori pe tasta [DISPLAY]; ecranul digital al aparatului
afişează valoarea semnalului DTA, care se aduce la zero prin apăsarea
tastei [ZERO].
11. Se deschide programul de analiză al aparatului, TA-60WS Collection
Monitor şi se introduc valorile parametrilor de analiză (programul de
temperatură şi informaţii despre fişier) în fereastra [Measure] – [Setting
Parameters].
12. Pornirea măsurătorii se face cu butonul [Start], unde se poate alege
numele fişierului şi directorul unde va fi salvat, ca şi greutatea probei.
13. Oprirea măsurătorii se face în condiţii normale, fişierul de analiză fiind
salvat automat în directorul specificat. Dacă se doreşte oprirea măsură-
torii înainte de finalizarea programului stabilit se apasă butonul
[STOP], existând posibilitatea salvării datelor înregistrate până în acel
moment.
Analiza datelor (pierderi de masă, identificare temperaturi evenimente
termice etc.) se poate face din programul de analiză TA60 care permite
asemenea prelucrări ale termogramelor ca şi convertirea şi salvarea datelor
în format text pentru prelucrări ulterioare în alte tipuri de programe de
prelucrare date.
Aparatul este conectat la un sistem de purjare a unui gaz inert (în cazul
de faţă azotul) care asigură o atmosferă inertă pentru protejarea probelor la
oxidare, dar şi la un sistem de gaz care asigură evacuarea elementelor vola-
tile, asistarea transferului de căldură şi protejarea detectorilor (în cazul de
fază aerul).
Analiza calorimetrică (DSC) – calorimetru diferenţial Shimadzu tip DSC-60.

Specificaţii aparat:
• Intervalul de temperatură pe care se pot face măsurători: temp. ca-
merei – 500ºC sau minus 150ºC – 500ºC când se foloseşte baia de
azot lichid.
• Interval măsurabil semnal DSC: ± 40 mW
• Nivel de zgomot flux de căldură: < 1µW
277
• Materialul de referinţă (α-alumina) şi proba de analizat se pun în celule
standard din aluminiu (având dimensiunile Ø 5.8 mm x h 1.5 mm);
• Se lucrează în atmosferă de aer şi azot la un flux de ~ 50-70 ml/min;
• Rata de încălzire a cuptorului: 1 ÷ 50 ºC/min;
• Proba: substanţe în formă solidă sau lichidă la temperatura camerei.
Şi acest aparat este conectat la sistemul de purjare a unui gaz inert (în
cazul de faţă azotul) care asigură o atmosferă inertă pentru protejarea pro-
belor la oxidare, şi la sistemul de gaz care asigură evacuarea elementelor
volatile, asistarea transferului de căldură şi protejarea detectorilor (în cazul
de fază aerul).
Paşi în efectuarea unei măsurători DSC:

1. Se deschid recipientele de gaze pentru a asigura formarea atmosferei în
cuptor.
2. Se deschid aparatele şi se aşteaptă 30 min pentru a permite gazelor să
formeze o atmosferă inertă în cuptor.
3. Se pregătesc două creuzete curate. Într-un creuzet se pune o cantitate
de referinţă (α-alumina), iar în celălalt creuzet se pune proba, cântărită
în prealabil pe o balanţă digitală.
4. Se pune creuzetul cu materialul de referinţă pe suportul din partea
stângă, iar creuzetul gol pe suportul din partea dreaptă.
5. Se apasă o dată pe tasta [DISPLAY]; ecranul digital al aparatului afi-
şează valoarea semnalului DSC. Se apasă tasta [ZERO] pentru aduce-
rea la valoarea zero a semnalului.
6. Se deschide programul de analiză al aparatului, TA-60WS Collection
Monitor şi se introduc valorile parametrilor de analiză (programul de
temperatură şi informaţii despre fişier) în fereastra [Measure] – [Setting
Parameters].
278
7. Pornirea măsurătorii se face cu butonul [Start], unde se poate alege
numele fişierului şi directorul unde va fi salvat, ca şi greutatea probei.
8. Oprirea măsurătorii se face în condiţii normale, fişierul de analiză fiind
salvat automat în directorul specificat. Dacă se doreşte oprirea măsură-
torii înainte de finalizarea programului stabilit se apasă butonul
[STOP], existând posibilitatea salvării datelor înregistrate până în acel
moment.
În mod identic cu datele obţinute de la analiza DTATG, datele salvate
într-o măsurătoare DSC pot fi analizate cu programul TA60.
2. Ghid de interpretare a măsurătorilor DTA/TG şi DSC

La modul general, fenomenele fizice şi chimice, constantele de material
detectabile sau măsurabile prin analiza termică sunt:
• comportarea materialelor la topire, cristalizare, fierbere,
sublimare, de-vitrificare etc.;
• temperaturile caracteristice ale transformărilor de fază;
• căldurile de topire, cristalizare, de reacţie etc.;
• cinetica reacţiilor şi a formării fazelor;
• oxidarea, reducerea, descompunerea, hidratarea-dehidra-
tarea etc.;
• coroziunea metalelor în diferite atmosfere;
• puritatea şi compatibilitatea materialelor;
• tranziţii vitroase ale solidelor ne-cristaline;
• capacităţi calorice, călduri specifice;
• cristalizarea sticlelor metalice etc.
Când probele cristalizează, rearanjarea atomic este un proces exotermic,
iar proba eliberează mai multă căldură decât în referinţa. Modificări subtile
ale semnalului DTA pot indica prezenţa unui peak exotermic asociat cu o
separare de faze.
În cadrul laboratorului de analize termice de la Institutul de Cercetare

Interdisciplinară în Bio-Nano-Ştiinţe au fost abordate o parte din aceste
tipuri de măsurători, mai jos fiind prezentate câteva exemple semnificative
cu scopul de a oferi o imagine cât mai exactă a modului de intepretare a
datelor furnizate de metodele termice diferenţiale:
279
1. Analiza DTA/TG a unui sistem aluminosilicatic cu
Fe60SiO2·20Al2O3·20Fe2O3 preparată prin metoda sol-gel la pH 8.5
TGA DTA
mg uV
12.00
-1.382%
-1.38%
20.00
Weight Loss -52%
-52.094 %
274.4
274.37 C
10.00
10.00
0.00
8.00 132 169.7

57.8
-10.00
6.00
-20.00
260
100 200 300
Temp [C]
Semnalul DTA prezintă patru peak-uri endoterme:

• Tendo = 58ºC; pierdere de masă în TG ~ 1,38% → dehidratarea probei
prin pierderea apei adsorbite pe suprafaţa probei;
• Tendo = 132ºC; fără pierdere de masă → transformare structurală a
NH4NO3 format în probă din precursorii azotaţi şi hidroxidul de
amoniu introdus pentru cataliza bazică a hidrolizei din procesul
sol-gel
• Tendo = 169.7ºC; fără pierdere de masă → topirea NH4NO3
• Tendo = 260ºC; pierdere de masă de ~ 52%→ suprapunerea unor eve-
nimente termice cum ar fi: descompunerea NH4NO3, eliminarea al-
tor reziduuri volatile din probă.
• Texo = 274.4ºC; fără pierdere de masă → începutul procesului de cris-
talizare a fazelor magnetit şi hematit, identificate prin analiza XRD
după un tratament termic la 500ºC.
280
2. Analiza DSC a unor sisteme aluminosilicatice cu
Fe(80-x)[SiO2]· 20Al2O3· x[Fe2O3], x = 0, 15, 20, prin metoda sol-gel, la pH 8.5.
DSC
mW
x=0
129
x=15
230
93 x=20
55
128.6 169.7
93.4 221
56
129 171
241.6
0 100 200 300 400 500
Temp [C]
Semnalele DSC ale probelor prezintă cinci peak-uri endoterme:

• Tendo = 54ºC şi 56ºC → dehidratarea probei prin pierderea apei ad-
sorbite pe suprafaţa probei;
• Tendo = 93.4ºC → eliminarea apei rezultate din reacţia hidroxidului
de amoniu (introdus în soluţie pentru obţinerea unui pH de 8.5) cu
acidul azotic, HNO3, rezultat din precursorul folosit pentru Al
[Al(NO3)3·9H2O]:
• NH4OH + HNO3 → NH4NO3 + H2O
• Tendo = 128ºC şi 129ºC → transformare structurală a NH4NO3
• Tendo = 169.7ºC şi 171ºC → topirea NH4NO3
• Tendo = 221ºC şi 241ºC → suprapunerea unor evenimente termice
cum ar fi: descompunerea NH4NO3, eliminarea altor reziduuri vola-
tile din probă.
Linia semnalului DSC pentru cele 2 probe ce conţin Fe este aceeaşi, di-
ferind doar temperaturile la care au loc evenimentele (în special cele două
evenimente care indică descompunerea, respectiv topirea NH4NO3), cele
pentru 20% Fe fiind deplasate mai sus cu câteva grade, indicând faptul că
prezenţa în matrice a unei cantităţi mai mari de Fe influenţează schimburile
energetice şi cauzează întârzierea producerii anumitor evenimente termice
în probă.
281
3. Analiza DTA/TG a unei argile minerale cu structură majoritară de caolinit
TGA DTA
mg uV
8.00
-0.353% -14.765%
993.4
10.00
1046
7.50
0.00
7.00 -10.00
505
-0.542%
-20.00
6.50
0 500 1000
Temp [C]
• Pierderea iniţială de masă de ~0.3% în intervalul de temperatură

30-109ºC corespunde dehidratării probei prin pierderea apei ad-
sorbite la suprafaţa probei.
• În intervalul de temperatură 354–660ºC se observă un peak endo-
term foarte larg, care corespunde unui proces tipic de dehidratare
prin dehidroxilarea caolinitului cu producerea fazei dezordonate
metakaolinit, Al2Si2O7, având un maxim la 505ºC şi însoţit de o
pierdere de masă de ~14 % din totalul masei probei. Dar pierderi
continue de hidroxil sunt observate până la 900°C (~0.5%) şi pot fi
atribuite deprotonării graduale prin oxolare a metakaolinitului.
• În intervalul 977 ºC – 1007 ºC, semnalul DTA etalează un peak exo-
term (cu maximul la 993.4ºC), fără pierdere de masă în TG, corespun-
zător unei tranziţii structurale de stare solidă, o conversie structurală
a metakaolinitului în altă stare polimorfă aluminosilicatică.
Faza dezordonată de metakaolin, Al2Si2O7, se transformă la temperatu-
ra la 995.5 ºC (unde apare peak-ul exoterm îngust) într-o fază alumi-
niu-siliciu spinel, Si3Al4O12, care este considerată o structură tip γ-alumină
[1]: 2 Al2Si2O7 –> Si3Al4O12 + SiO2
282
4. Analiza DTA/TG a două probe de hidroxiapatită (cu 30%Fe şi 50%Fe)
– tratate termic la 450º C
TGA DTA
mg uV
-12.786%
20.00
20.00
10.00
-12.026%
15.00 0.00
491
491.18C
HA+50%Fe - t
83.5 HA+30%Fe-t
-10.00
10.00
-20.00
-8.907% -13.554% 507
507.68C
-30.00
5.00 100
200.00 400.00 600.00
Temp [C]
Semnalul DTA prezintă două peak-uri endotermice clare:

• la 83.ºC şi 100ºC, cu pierderi de masă în TG – dehidroxilare
• la 491 ºC şi la 507 ºC, cu pierdere de masă – descompunerea termică
propriu-zisă în TCP (fosfat tricalcic) şi TTCP ( fosfat tetracalcic):
Ca 10 ( PO 4 ) 6 ( OH ) 2 → 2 Ca 3 ( PO 4 ) 2 + Ca 4 P2 O 9 + H 2 O gas
5. Analiza DTA/TG a unei probe de corn de cerb deproteinată
TGA DTA
mg uV
371
371.32C
9.00
-6.838%
50.00
-22.530%
8.00
445.94C
445
7.00
0.00
6.00 85
84.90C
-13.417%
5.00
-50.00
4.00
0.00 200.00 400.00 600.00 800.00 1000.00
Temp [C]
283
Procedeul de deproteinare a probei a constat în degresare în acetonă
timp de 48 h şi cu eter etilic timp de 30 min, apoi uscare în cuptor la 40ºC
până la îndepărtarea completă a solventului.
Semnalul DTA etalează trei evenimente termice:
• un peak endoterm având maximul la 85ºC, asociat cu o scădere a
masei probei în curba TG (pe intervalul 50ºC–150ºC), eveniment ca-
re ar corespunde denaturării structurii triplu helix a colagenului din
matricea osoasă, eveniment dependent şi de gradul de hidratare al
materialului, dar şi eliminării apei libere ataşate în matricea de
hidroxiapatită.
• un eveniment exoterm de intensitate mare în intervalul de tempera-
tură 350–500ºC, format din două peak-uri cu maximele la 371ºC şi la
446ºC, însoţite de pierderi de masă considerabile. Aceste evenimen-
te pot corespunde degradării şi respectiv arderii matricii organice a
osului însoţită de volatilizarea compuşilor gazoşi rezultaţi din acest
proces.[2,3,4]
6. Analiza DTA/TG a unor materiale compozite polimer-sticle[5]
Semnalele TG prezintă patru trepte de pierdere de masă:

• I – intervalul de temperatură 20-400°C – volatilizarea apei de
pe suprafaţa probelor
284
• II – intervalul de temperatură 400-500°C – însoţită în DTA de
un peak exoterm cu maximul la ~T = 450ºC – o reacţie de
dehidroxilare aferentă restructurării reţelei polimerice a com-
pozitelor. Pe de altă parte, intensitatea acestor peak-uri poate
fi legată de efectul interacţiunii mutuale dintre produşii de
hidratare cu polimerul utilizat în sinteză.
• III – intervalul de temperatură 500-800°C curba DTA prezintă
la T ~ 740 °C un peak endotermic pronunţat care poate fi atri-
buit unui proces de disociere fără pierdere de masă
• IV – la aproximativ 810-830 °C apare un peak exotermic mic,
acompaniat de o pierdere de masă. Acesta este, cel mai proba-
bil datorat formării unei faze cristaline în structura compozite-
lor.
Menţionăm că toate aceste măsurători au fost publicate şi/sau prezen-

tate în cadrul unor conferinţe naţionale/internaţionale de specialitate.
3.Bibliografie
1. Bellotto, M., Gualtieri, A., Artioli, G., and Clark, S.M., Kinetic study of the
kaolinite-mullite reaction sequence. Part I: kaolinite dehydroxylation, Phys. Chem.
Minerals 22, 207-214 , 1995.
2. M. Tămăşan, M. Băciuţ, V. Coman, V. Simon, Thermal kinetics analysis of bone
tissue organic phase, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 11, No. 4
(2009), 479-483.
3. L.F. Lozano, M.A. Pena-Rico, A. Heredia, J. Ocotlan-Flores, A. Gomez-Cortes, R.
Velazquez, I.A. Belio, L. Bucio, Thermal Analysis study of human bone, Journal of
Materials Science 38 (2003) 4777-4782
4. M.E. Bahrololoom, M. Javidi, S. Javadpour, J. Ma, Characterisation of natural
hydroxyapatite extracted from bovine cortical bone ash, Journal of Ceramic
Processing Research, vol. 10, no. 2 (2009), 129-138.
5. T. Radu, S. Simon, C. Prejmerean, V. Simon, A. Colceriu, C. Tamas, L. Si-
laghi-Dumitrescu, Thermoanalytical characterisation of new dental ionomer
biocomposites, Journal of Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 10, No. 4
(2008), 958-960.
285
VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X
Difracţie de raze X pe pulberi
Cuprins
1. Principiul metodei ...............................................................................................................286
2. Informaţiile care se obţin din difracţia de raze X pe pulberi ................................................289
2.1. Analiza calitativă de faze cristaline ..............................................................................289
2.2. Analiza cantitativă de faze ...........................................................................................290
2.2.1. Metode bazate pe utilizarea de standarde ...........................................................290
2.2.2. Metoda bazată pe analiza Rietveld .....................................................................292
2.3. Analiza microstructurală.............................................................................................292
2.3.1. Metoda Scherrer .................................................................................................292
2.3.2. Metoda Warren-Averbach..................................................................................293
2.3.3. Metode bazate pe analiza Rietveld .....................................................................294
2.4. Determinarea structurii cristaline din pulberi ............................................................294
2.4.1. Indexarea Difractogramelor ...............................................................................295
2.4.2. Rafinarea Pawley sau Le Bail .............................................................................296
2.4.3.1. Metoda de căutare în spaţiul direct...........................................................297
2.4.3.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ...................299
2.4.4. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld ......................................300
3. Prezentarea aparaturii disponibile şi stabilirea parametrilor optimi de funcţionare pentru di-
verse tipuri de experimente .................................................................................................302
4. Bibliografie ..........................................................................................................................303
1. Principiul metodei
Difracţia de raze X este una dintre metodele cele mai utilizate pentru
investigarea compuşilor în faza solidă cristalină. Principiul de funcţionare a
unui difractometru de raze X este următorul: Cu ajutorul unui generator de
înaltă tensiune se obţine tensiune de ordinul zecilor de kV. Această tensiu-
ne se aplică între catodul şi anodul tubului de raze X.
286
Catodul tubului de raze X este alcătuit
dintr-un filament care este de asemenea
alimentat la o sursă de joasă tensiune şi
care face ca filamentul să emită electroni.
Electronii respectivi sunt acceleraţi între
catodul şi anodul tubului. Electronii care
lovesc anodul fac să se emită radiaţii X sub
forma unui spectru continuu şi a unui spectru caracteristic. Spectrul conti-
nuu nu depinde de natura anodului în schimb spectru caracteristic depinde
de anodul folosit. Anozii tuburilor de raze sunt din următoarele materiale:
Cu, Co, Fe, Cr, Mo, Ag etc. Liniile caracteristice pentru elementele grele
cum sunt Mo şi Ag au lungimi de undă mică, iar liniile caracteristice pentru
Cr si Co au lungimi de undă mari. Cu are lungimea de undă intermediară
şi este cel mai utilizat. Dintre lungimile de undă emise de un tub de raze X
cea mai intensă este radiaţia K α . Pentru aplicaţiile practice de difracţie pe
pulberi este necesar să folosim o radiaţie cât mai monocromatică.
Monocromatizarea radiaţiei X se face cu ajutorul filtrelor de raze X sau cu
ajutorul monocromatoarelor de raze X.
Radiaţia X emisă de tubul de raze X intră într-un goniometru, trece
printr-un sistem de fante care sunt montate pe goniometru după care radia-
ţiile X ajung la detector unde este înregistrată. Proba este aşezată pe un su-
port plan, unghiul dintre radiaţia incidentă şi probă este egal cu unghiul
dintre radiaţia difractată şi planul probei. În timp ce proba se roteşte cu un
anumit unghi, detectorul se roteşte cu un unghi dublu în aşa fel încât tot
timpul unghiul de incidenţă este egal cu unghiul de reflexie. Acest lucru se
realizează în cazul montajului θ , 2 θ , dar există şi alte tipuri de montaje
experimentale.
Difracţia razelor X se poate explica în mai multe feluri. Cea mai uzuală
interpretare este difracţia Bragg pe planele cristalografice. Orice compus
cristalin cristalizează într-un anumit sistem cristalografic cu parametrii de
reţea bine precizaţi, un anumit grup spaţial şi un mod de aranjare a atomi-
lor în celula elementară. În celula elementară se pot construi diverse seturi
de plane cristalografice fiecare set fiind caracterizat prin indicii Miller co-
respunzători. Astfel, un set de plane cristalografice echidistante are indicii
Miller (h, k, l) dacă cel mai apropiat plan cristalografic faţă de origine inter-
sectează axele cristalografice la distanţele: a/h, b/k, c/l.
Se poate considera difracţia pe astfel de plane cristalografice după cum

este arătat în figura următoare:
287
Condiţia de difracţie este dată de relaţia:
2dsin θ = λ (1)
unde d este distanţa interplanară, θ unghiul de difracţie, iar λ lungimea de
undă. De aici se observă că fiecare set de plane cristalografice corespunde
unui anumit unghi de difracţie. Distanţa interplanară este determinată de
sistemul cristalografic, de parametrii celulei elementare şi de indicii Miller.
De exemplu, pentru sistemul ortorombic avem 1/d2 = h2/a2 + k2/b2 + l2/c2.
Pentru alte sisteme cristalografice avem alte formule de calcul a distanţelor
interplanare. De aici rezultă că poziţiile maximelor de difracţie depind exclu-
siv de tipul reţelei cristaline şi de parametrii celulei elementare.
Să vedem în continuare de cine depind intensităţile de difracţie. Radia-
ţia X constă din unde electromagnetice în care componenta vectorului
câmp electric şi magnetic oscilează perpendicular pe direcţia de propagare
a undei. Vibraţiile vectorului câmpului electric produc oscilaţii ale electro-
nilor atomilor. Dar orice sarcină care oscilează produce la rândul ei unde
electromagnetice, iar în cazul acesta, radiaţii X. Intensitatea radiaţiei X îm-
prăştiate de către un singur atom este caracterizată prin factorul de împrăş-
tiere atomic. Factorii de împrăştiere atomici depind de numărul de elec-
troni din componenta atomului dat. Factorii de împrăştiere atomici scad cu
unghiul de împrăştiere. Dependenţa intensităţii factorilor de împrăştiere de
sin θ / λ este dată în tabelele internaţionale sub forma unor relaţii empiri-
ce.
Dacă radiaţia X cade pe probă, atunci fiecare atom din celula elementa-
ră împrăştie radiaţiile incidente. Aceste unde electromagnetice produse de
atomii din celula elementară se suprapun şi se compun, iar rezultanta este
dată de factorul de structură. Expresia factorului de structură este dată de
relaţia:
Fhkl= ∑
fj exp π
2 i(hxj+kj+lzj) (2)
Intensităţile de difracţie sunt proporţionale cu pătratul factorilor de
structură. Prin urmare, intensităţile de difracţie vor depinde de natura şi
288
poziţia atomilor în celula elementară. În concluzie, poziţiile maximelor de
difracţie depind de celula elementară, iar intensităţile de difracţie de poziţi-
ile atomilor în celula elementară. Intensităţile de difracţie depind şi de alţi
factori. Astfel se demonstrează că intensitatea radiaţiei difractate de către
un mic monocristal care se roteşte cu viteza unghiulară ω este dată de rela-
ţia [1] :
Ihkl = ( λ 3/ ω V2).(e2/mc2)2·Vcr·I0·Lp·A·T·I·FhklI2 (3)

unde
λ este lungimea de undă
ω viteza unghiulară cu care se roteşte monocristalul
V volumul celulei elementare
I0 intensitatea fasciculului incident
Lp este factorul Lorentz-polarizare
A factorul de absorbţie
T factorul de temperatură, iar
Fhkl este factorul de structură.
Pulberile constau din foarte multe cristalite mici de ordinul zecilor pâ-
nă la ordinul miilor de Å orientate haotic unele în raport cu altele. Probele
se pun de obicei pe suporturi plane. Vom obţine difracţie numai de la pla-
nele cristalografice care sunt paralele cu suprafaţa suportului de probă. De
aceea, numărul de cristalite care participă la difracţie este foarte mic. Deoa-
rece în general λ , ω , V, Vcr, I0 sunt constante pentru un experiment de di-
fracţie, iar (e2/mc2) sunt constante universale, e fiind sarcina electronului, m
masa acestuia, iar c viteza luminii, toate acestea se pot grupa împreună sub
forma unei constante notată cu K. În felul acesta intensitatea de difracţie
corespunzătoare unui set de plane cristalografice este dată de relaţia:
Ihkl=K·m·Lp·A·T·I·Fhkl·I2 (4)
În această relaţie s-a introdus şi m care este factorul de multiplicitate.
Acesta rezultă din aceea că pot să existe mai multe plane cristalografice
care să producă difracţie la acelaşi unghi θ .
2. Informaţiile care se obţin din difracţia de raze X pe pulberi

2.1. Analiza calitativă de faze cristaline
Analiza cantitativă de compuşi chimici în faza solidă se poate face prin
metode chimice, dar acestea necesită o abordare mai laborioasă şi timp mai
mult.
289
În prezent, analiza calitativă de produşi chimici cristalini se face în cea
mai mare măsură prin difracţie de raze X pe pulberi. Se ştie că acelaşi com-
pus chimic poate să se prezinte în diferite forme polimorfice sau, cum se
mai spune, în diferite faze cristaline. Difracţia de raze X pe pulberi deose-
beşte cu uşurinţă diferite forme polimorfice ale unui anumit compus.
Analiza de faze cristaline se bazează pe compararea difractogramei de
raze X experimentală cu difractogramele care se găsesc în bazele de date.
Deci, din analiza de faze putem să identificăm o anumită fază numai
dacă aceasta a fost catalogată în prealabil.
Identificarea fazelor cristaline se bazează pe următoarele considerente:
fiecare fază cristalină aparţine unui anumit sistem cristalografic, are para-
metrii de reţea bine determinaţi sau care variază într-un interval relativ
mic, aparţine unui anumit grup spaţial, iar atomii compusului se plasează
în anumite poziţii în celula elementară. Aceasta face ca fiecare fază cristali-
nă să aibă intensităţile de difracţie şi unghiurile la care apar aceste intensi-
tăţi bine determinate.
Compararea difractogramei experimentale cu cele din catalog se face
utilizând bazele de date, în special PDF-2, PDF-4. Dacă avem la dispoziţie
baza de date CSD sau o altă bază de date, care ne dă datele cristalografice
complete pentru compuşii care ne interesează, atunci putem să simulăm
difractograma acelui compus şi să o comparăm cu difractograma experi-
mentală.
2.2. Analiza cantitativă de faze

În foarte multe cazuri, când avem un amestec de faze cristaline, ne inte-
resează compoziţia procentuală a fiecărei faze din amestec, deoarece pro-
prietăţile fizico-chimice depind de compoziţia procentuală. Obţinerea com-
ponentei procentuale a fazelor dintr-un amestec se poate face atât prin me-
tode chimice, cât şi prin difracţie de raze X. În anumite cazuri difracţia de
raze X pe pulberi cristaline poate să fie o metodă rapidă şi eficientă. Anali-
za cantitativă de faze se bazează pe faptul că fiecare fază cristalină produce
propria difractogramă, iar dacă avem mai multe faze, difractograma rezul-
tată va fi o suprapunere a difractogramelor individuale, cu luarea în consi-
derare a coeficienţilor de absorbţie a fazelor componente.
2.2.1. Metode bazate pe utilizarea de standarde

Între intensităţile de difracţie şi fracţia în greutate Wα, pentru o anumită
fază α există relaţia:
290
Wα
I iα = C i α (5)
ρ α μ mx
unde Ciα este o constantă pentru reflexie (sau un grup de reflexii) i a fazei α,
ρα este densitatea fazei α, iar μ m este coeficientul de absorbţie masic pentru
x
întreaga probă [2].

Pentru aplicarea acestei relaţii este necesară (i) determinarea constantei
Ciα prin prepararea de standarde cu compoziţie procentuală a fazei α bine
determinată şi estimarea coeficientului de absorbţie masic μ mx a probelor
standard (ii), măsurarea lui Iiα şi estimarea lui μ mx pentru probe necunoscute.
O altă metodă este aceea a standardului intern care presupune include-
rea unui standard intern în proba de compoziţie procentuală cunoscută Ws.
Intensitatea de reflexie Ijs este dată de relaţia:
Ws
I js = C js (6)
ρ s μ mx
Împărţind cele două relaţii rezultă:
I iα
Wα = K αissWs (7)
I js
C js ρα
unde K αijs =
Ciα ρ s
K αijs poate fi determinat făcând un amestec cunoscut de fază standard şi
fază de analizat.
O altă metodă este aceea a raportului intensităţii de referinţă (RIR)
(Reference Intensity Ratio).
Ca standard extern se alege în general corundum.
I isWs
Se defineşte RIRαs = .
I jsWd
Fracţia Wα pentru faza necunoscută se determină în funcţie de fracţia
Ws pentru proba standard, şi de raportul dintre intensitatea liniei i a probei
de analizat şi intensitatea liniei j a probei standard după relaţia:
I iα W s
Wα = (8)
I js RIRαs
291
2.2.2. Metoda bazată pe analiza Rietveld
Analiza cantitativă de faze se poate face şi cu analiza Rietveld [3]. Se fil-
trează toţi parametrii de care depinde intensitatea de difracţie, inclusiv
procentul de fază necunoscută. Astfel, din analiza Rietveld rezultă fracţia
de faze din probă.
Factorii care limitează precizia analizei de fază sunt: dimensiunea dife-
rită pentru particulele aparţinând la diferite faze de analizat, orientarea
preferenţială a cristalitelor, microabsorbţia. Intensităţile de reflexie pentru
probele cu coeficient mai mare de absorbţie vor fi mai intense.
Erorile sunt cu atât mai mici cu cât dimensiunea particulelor este mai
mică şi cu cât coeficienţii de absorbţie vor fi mai mici.
Reducerea coeficienţilor de absorbţie se poate face prin utilizarea tubu-
rilor de raze X cu lungime de undă mai mică.
2.3. Analiza microstructurală

Analiza microstructurală include determinarea dimensiunilor
microcristalitelor şi eventual distribuţia acestora după dimensiune, a de-
formării reţelei cristaline şi a probabilităţilor de defecte.
Se ştie că pulberile cristaline sunt formate din mici monocristale, numi-
te cristalite, distribuite haotic unele în raport cu altele. Dimensiunile acestor
cristalite sunt de ordinul zecilor până la ordinul miilor de Å. Dacă dimen-
siunile cristalitelor sunt sub 20 Å, se consideră că compusul respectiv este
sub formă amorfă. Cu cât dimensiunile cristalitelor sunt mai mici cu atât
liniile de difracţie sunt mai largi. Dar la lărgimea liniilor de difracţie contri-
buie şi deformările reţelei cristaline şi probabilităţile de defecte. Dacă re-
ţeaua este mai deformată sau dacă avem mai multe defecte, liniile de di-
fracţie de asemenea se lărgesc.
Trebuie menţionat că dimensiunile particulelor sunt diferite de dimen-
siunile cristalitelor. Într-o particulă pot să existe mai multe cristalite (mono-
cristale) orientate diferit între ele.
2.3.1. Metoda Scherrer

Scherrer a arătat pentru prima dată că dimensiunile cristalitelor sunt le-
gate de lărgimea de difracţie prin relaţia [2]:
Kλ
D= (9)
β cos θ
D este dimensiunea microcristalitelor, β este lărgimea liniilor de difracţie
292
corectată de lărgimea instrumentală, iar θ este unghiul de difracţie. K este o
constantă care depinde de modul cum se defineşte dimensiunea D, dacă
aceasta se defineşte ca fiind dimensiunea liniară sau rădăcina de ordinul 3
din volum, precum şi de alţi factori. Cea mai utilizată valoare a lui K = 0,89.
Lărgimea instrumentală se obţine din lărgimea de difracţie experimen-
tală astfel:
β = B-b, dacă profilul de difracţie este o funcţie de tip Lorentz şi
β2 = B2 –b2, dacă profilul de difracţie este o funcţie de tip Gauss.
În această relaţie B este lărgimea de difracţie măsurată, iar b este lărgi-
mea de difracţie instrumentală. Pentru a obţine b, se foloseşte o probă foar-
te bine cristalizată şi se măsoară lărgimea maximelor de difracţie pentru
unghiurile de difracţie apropiate cu cele ale probei de măsurat. Lărgimea
liniilor de difracţie creşte cu unghiul.
Ca măsură a lărgimii liniilor de difracţie se consideră lărgimea la semi-
înălţime.
Unii autori iau ca lărgime a liniilor de difracţie lărgimea integrală, care
se defineşte ca fiind aria maximului de difracţie împărţită la intensitatea
maximă pentru maximul respectiv.
Precizia legată de determinarea dimensiunilor cristalitelor scade odată
cu creşterea acestora, deoarece cu cât dimensiunile sunt mai mari lărgimea
liniilor de difracţie se apropie de lărgimea instrumentală şi depinde foarte
mult cât de corect am ales lărgimea instrumentală. Domeniul pe care preci-
zia determinării dimensiunilor cristalitelor se consideră acceptabilă este de
la aproximativ 20Å, până la 1000Ǻ.
2.3.2. Metoda Warren-Averbach

Am amintit că lărgimea liniilor de difracţie scade atât cu scăderea cris-
talitelor cât şi cu creşterea deformaţiilor reţelei cristaline. Dependenţa de
unghiul θ a lărgimii liniilor de difracţie datorată dimensiunilor cristalitelor
este diferită de dependenţa de unghiul θ a lărgimii liniilor de difracţie da-
torată deformării reţelei cristaline.
Astfel avem relaţia:
0,9λ
β cosθ = + 4ε sinθ (10)
D
în cazul în care profilul liniei de difracţie este de tip Lorentz, unde ε este un
parametru care reflectă deformaţia reţelei cristaline şi reprezintă deplasarea
medie a atomilor faţă de poziţia de echilibru.
293
Reprezentând grafic βcosθ în funcţie de sinθ, ar trebui să obţinem o
dreaptă, dacă considerăm diferite linii de difracţie.
0,9λ
Ordonată la origine pentru această dreaptă reprezintă , iar panta
D
dreptei reprezintă 4ε. De aici putem să determinăm ε şi D.
Dacă profilul liniilor de difracţie este de tip Gauss, atunci avem relaţia:
λ2
β 2 cos 2 θ = + 16ε 2 sin 2 θ (11)
D2
Din reprezentarea grafică a lui β2cos2θ, în funcţie de sin2θ, rezultă di-
mensiunile cristalitelor şi deformările reţelei.
2.3.3. Metode bazate pe analiza Rietveld

O altă modalitate de determinare a dimensiunilor cristalitelor şi a de-
formării reţelei cristaline se poate face prin analiza [4] Rietveld. Conform
formulei lui Caglioti, lărgimea la semiînălţime depinde de unghiul θ, astfel:
X
ΓL = + Y tgθ (12)
cosθ
pentru un profil de tip Lorentz, unde ΓL este lărgimea la semiînălţime, iar X
si Y parametrii de fit.
Pentru un profil de tip Gauss avem:
P
ΓG = Utg 2θ + Vtgθ + W + (13)
cosθ
Din fitarea Rietveld rezulta X, Y, U, V, W si P.
În continuare dimensiunile cristalitelor şi deformaţiile reţelei se calcu-
lează în funcţie de aceşti parametrii. Dimensiunile cristalitelor se mai pot
determina şi din analiza Fourier a liniilor de difracţie.
2.4. Determinarea structurii cristaline din pulberi

Determinarea structurii cristaline se face în general din datele de difrac-
ţie obţinute din monocristale. Numărul intensităţilor de difracţie care se pot
obţine din difracţia pe monocristale este de ordinul zecilor de mii. Numărul
intensităţilor de difracţie care se pot obţine din pulberi cristaline este de
ordinul zecilor, dar poate ajunge şi până la 200. Se obţin mai puţine intensi-
tăţi de difracţie deoarece liniile de difracţie pot să se suprapună şi de ase-
294
menea unele intensităţi de difracţie sunt foarte slabe şi nu se pot observa.
Deoarece numărul de intensităţi de difracţie care se pot colecta din
difractograma pe pulberi este mult mai mic decât pentru monocristale, de-
terminarea structurii cristaline este mult mai dificilă pentru pulberi decât
pentru monocristale. Dar există situaţii când anumiţi compuşi nu se pot
cristaliza şi totuşi ne interesează structura lor cristalină. În acest caz se ape-
lează la determinarea structurii cristaline din pulberi.
Determinarea structurii cristaline pentru un anumit compus înseamnă
determinarea sistemului cristalografic, a parametrilor celulei elementare, a
grupului spaţial şi a poziţiilor atomilor în celula elementară.
Etapele principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi
sunt:
2.4.1 Indexarea Difractogramelor

A indexa o difractogramă înseamnă a determina sistemul cristalografic
în care cristalizează compusul, a determina parametrii celulei elementare şi
a atribui fiecărui maxim de difracţie indicii Miller corespunzători. Din re-
flexiile interzise se pot atribui grupurile spaţiale cele mai probabile.
După cum se ştie, difracţia razelor X poate fi privită ca difracţia de pe
planele cristalografice. Orice compus este caracterizat de o anumită celulă
elementară care este un paralelipiped cu muchiile a, b, c şi unghiurile din-
tre ele α, β, γ. Parametrii care caracterizează celula elementară se numesc
parametrii celulei elementare. În funcţie de a, b, c, α, β, γ, avem şapte siste-
me cristalografice. Pentru o anumită celulă elementară putem să definim
planele cristalografice. Un plan cristalografic de indicii Miller h, k, l este un
plan care intersectează axele cristalografice la distanţele a/h, b/c si c/l de
origine. Se ştie că difracţia razelor X pe atomi poate fi privită ca difracţie pe
planele cristalografice.
Se obţin maxime de difracţie dacă este îndeplinită condiţia lui Bragg:
Maximele de difracţie au intensităţi mai mari sau mai mici în funcţie de
modul de distribuţie a atomilor în celula elementară. Numărul de maxime
de difracţie în cazul pulberilor care se observă este foarte mic comparativ
cu numărul de maxime de difracţie observate pentru monocristal. De ase-
menea, unele maxime de difracţie se suprapun în cazul pulberilor. Numă-
rul mai mic de maxime de difracţie observat în cazul pulberilor precum şi
suprapunerea unor maxime provenite de la plane cristalografice diferite
este motivul pentru care este mult mai dificil de determinat structura crista-
lină din pulberi faţă de monocristale.
Concordanţa dintre poziţiile maximelor de difracţie calculate şi obser-
295
vate se caracterizează şi prin aşa numite figuri de merit. Există mai multe
moduri de definire ale figurilor de merit sau gradului de încredere în inde-
xarea respectivă. Una dintre figurile de merit se datorează lui P.M. de Wo-
olf [5]:
Q 20
M 20 = (14)
2 < Q > N 20
Q20 este valoarea lui Q pentru a 20-a linie de difracţie, N20 este numărul de
linii diferite calculate până la linia corespunzătoare lui Q20, iar <Q> este
abaterea medie dintre liniile de difracţie calculate şi observate.
Dacă avem M20 > 10, indexarea este probabil corectă.
Un alt factor de încredere datorat lui Smith si Snyder [6] se defineşte
astfel:
N
FN= (15)
< Δ 2θ > .N (θg )
unde N( θg ) este numărul de linii de difracţie calculate până la θ g, care
este valoarea în θ pentru limita superioară selectată, < Δ 2 θ > este abaterea
medie dintre liniile de difracţie calculate şi observate.
Cea mai utilizată figură de merit este M20.
Există mai multe metode de indexare dintre care cele mai importante
sunt: Metoda Ito[7], metoda Dicvol [8] X-Cel [9] si metoda Treor [10].
2.4.2. Rafinarea Pawley sau Le Bail

Rafinarea Pawley sau Le Bail este utilizată pentru extragerea intensită-
ţilor de difracţie, rafinarea celulei elementare şi atribuirea grupului spaţial
cel mai probabil.
Au fost dezvoltate două metode de extragere a intensităţilor de difrac-
ţie din pulberi, şi anume: Metoda Le Bail şi metoda propusă de Pawley.
Există o suprapunere sistematică a intensităţilor de difracţie şi o suprapu-
nere accidentală. Suprapunerea exactă a intensităţilor de difracţie are loc
mai ales pentru sistemele cristalografice de înaltă simetrie. De exemplu,
reflexiile 333 şi 511 pentru sistemul cubic sau 43l şi 50l pentru sistemul te-
tragonal. Suprapunerea accidentală are loc atât pentru sisteme cu simetrie
ridicată, dar mai ales pentru sisteme cristalografice cu simetrie joasă şi se
datoreşte creşterii numărului de reflexii independente.
Suprapunerea reflexiilor este cu atât mai probabilă cu cât celula ele-
mentară are volumul mai mare. Metoda Le Bail [11] de extragere a intensi-
296
tăţilor de difracţie este inspirată din metoda Rietveld. Rietveld a propus un
algoritm simplu de evaluare a factorilor de structură observaţi pentru o
suprapunere parţială sau totală a maximelor de difracţie.
Rezultatele intensităţilor de difracţie extrase nu depind de valoarea in-
tensităţilor iniţiale. Ca intensităţi de pornire se pot considera valorile calcu-
late ale intensităţilor de difracţie. Deşi metoda este în general robustă, exis-
tă şi cazuri când prezintă instabilităţi, mai ales atunci când fondul de di-
fracţie este supraestimat. Dar cel mai important aspect care a contribuit la
creşterea popularităţii metodei Le Bail este că aceasta poate să fie uşor în-
corporată în tehnica Rietveld de rafinare. Pawley [12] a elaborat o metodă
pentru determinarea intensităţilor de difracţie din difractograma de raze X
fără a avea un model structural. Aceasta este o metodă de analiză prin cele
mai mici pătrate, în care mărimile care trebuie determinate sunt intensităţi-
le de difracţie.
În timp ce metoda Le Bail este o metodă iterativă, metoda Pawley re-
zolvă problema de extragere a intensităţilor de difracţie printr-o tehnică
matricială. Mărimea matricei nu este o problemă deoarece matricea este
cvasidiagonală, termenii nediagonali diferiţi de zero provin de la suprapu-
nerea maximelor de difracţie vecine.
Deşi procesul de rafinare este în general stabil, maxime de difracţie
foarte apropiate pot duce uneori la apariţia de maxime de difracţie negati-
ve. Experienţa arată că aceasta are loc când poziţiile a două maxime de di-
fracţie sunt mai apropiate unele de altele cu 0.5 dintr-un pas de înregistrare
a difractogramei. Unii autori [13,14] au căutat să elimine maximele negative
prin rafinarea mărimii factorilor de structură în schimbul intensităţilor de
difracţie.
2.4.3. Obţinerea unui model structural

2.4.3.1. Metoda de căutare în spaţiul direct
Metoda de căutare în spaţiul direct sau metoda grid search este o me-
todă de localizare a unităţilor structurale în celula elementară, astfel ca
difractograma calculată să se suprapună cât mai bine cu difractograma ex-
perimentală. Această metodă nu cere extragerea factorilor de structură din
difractogramă.
Tipul unităţilor structurale care trebuie să fie localizate în celula ele-
mentară depinde de natura compusului. Putem să avem atomi, grupe de
atomi aranjaţi într-o anumită configuraţie, molecule, fragmente din molecu-
le. Pentru compuşii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjaţi sub
diverse forme, ca de exemplu, tetraedrii, octaedrii etc.
297
Pentru moleculele organice ca unităţi structurale putem să considerăm
întreaga moleculă ca fiind rigidă sau fragmente rigide din molecula care se
mişcă unele în raport cu altele, modificându-şi configuraţia prin modifica-
rea unghiurilor de torsiune, eventual a unghiurilor de valenţă şi a distanţe-
lor dintre atomi. Astfel pentru fiecare compus avem un număr de grade de
libertate care trebuie să fie modificate până când difractograma calculată se
suprapune cât mai bine peste difractograma experimentală. Pentru molecu-
lele organice, în celula elementară putem avea o moleculă sau mai multe în
unitatea asimetrică, celelalte molecule fiind generate prin operaţiile de si-
metrie ale grupului spaţial care caracterizează compusul respectiv.
Există diverse tehnici Monte Carlo de căutare a configuraţiei optime,
dintre care amintim:
Răcire simulată (simulated annealing), o variantă a acesteia numită Parallel
tempering şi Tehnica algoritmilor genetici. În cazul metodei de răcire simulată
se generează configuraţii întâmplătoare în spaţiul parametrilor de căutare,
se testează potrivirea dintre difractograma calculată şi cea experimentală.
Ca o măsură a potrivirii dintre difractograma calculată şi cea experimenta-
lă, se consideră funcţia de cost CF. Funcţia de cost CF se poate alege în di-
verse moduri. Una dintre posibilităţi este să se aleagă ca fiind rezidiul R,
definit în felul următor:
obd calc
Σ i wi ( y − y )2
i i
Rwp=[ Σ i wi ( y ) 2
obs ]1/2 (16)
i
Dacă funcţia de cost CF este mai mică decât cea precedentă, atunci se
reţine noua configuraţie. Dacă CF este mai mare decât cea precedentă,
atunci se reţine noua configuraţie cu probabilitatea exp(- Δ CF/T). Probabi-
litatea relativă a celor două configuraţii de încercare respectă legea lui
Boltzman: P1/P2 = exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuţiei.
În timpul procesului de căutare temperatura se scade treptat. Astfel, în
faza iniţială a procesului de căutare a configuraţiei optime se poate uşor
trece de la un minim local la un alt minim în scopul determinării minimului
absolut, dar în faza finală, când T este foarte mic, probabilitatea de a găsi
un alt minim este de asemenea mică. Există mai multe programe de calcul
care au implementat această modalitate de determinare a minimului global,
dintre care amintim Powder Solve [15], Fox [16,17].
Totuşi, pentru a evita să cădem într-un minim local, un alt algoritm a
fost dezvoltat, şi anume Parallel Tempering (PT) [18]. În schimbul utilizării
unui singur lanţ de configuraţii, cu descreşterea temperaturii se aleg de la
298
început mai multe configuraţii (un număr mic de configuraţii), fiecare con-
figuraţie porneşte cu o anumită temperatură care scade treptat. Periodic se
testează configuraţiile paralele şi se alege configuraţia optimă prin aceeaşi
schemă ca în cadrul unui singur proces. În felul acesta, posibilitatea de a se
obţine minime locale este mai mică.
2.4.3.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi

După extragerea intensităţilor de difracţie prin metoda Le Bail sau
Pawley, pentru obţinerea modelului structural se poate urma procedeul
care se foloseşte pentru monocristale. Dificultatea adaptării procedeului de
calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea că metodele de cal-
cul sunt metode statistice şi necesită un număr mare de intensităţi de di-
fracţie. În timp ce pentru monocristale se pot colecta câteva mii de intensi-
tăţi, numărul de intensităţi care se pot obţine pentru pulberi este de ordinul
zecilor, până la 3 sau 4 sute. Cu toate acestea, în unele cazuri s-au obţinut
rezultate bune. Paşii care trebuie urmaţi sunt:
- corectarea intensităţilor de difracţie de diverşi factori, dintre ca-
re amintim: Factorul Lorentz, factorul de polarizare, factorul de
absorbţie, factorul de extincţie. Aceste corecţii pot să fie făcute
şi în cadrul extragerii intensităţilor de difracţie.
- Determinarea factorului de scală şi a factorului global de tempe-
ratură. Datorită faptului că atomi oscilează în jurul poziţiilor de
echilibru, intensităţile acestora se reduc cu un factor de tempera-
tură. Deoarece intensităţile de difracţie se măsoară în unităţi ar-
bitrare, intervine un factor de scală K care trebuie determinat.
- Determinarea fazei factorilor de structură [19,20]. Dacă se fac co-
recţiile intensităţilor de difracţie, se determină factorul de scală
şi de temperatură, se obţine modulul factorilor de structură. Dar
factorii de structură sunt numere complexe, faza acestor numere
complexe este arbitrară pentru structuri necentrosimetrice şi are
valoarea 0 sau π pentru structuri centrosimetrice, deci în acest
caz factorii de structură sunt numere reale pozitive sau negative.
Determinarea fazei factorilor de structură când se cunoaşte mo-
dulul factorilor de structură este cea mai complexă problemă în
procesul de determinare a structurilor cristaline pentru mono-
cristale. Metodele de determinare a fazei factorilor de structură
se numesc în cristalografie metode directe şi se bazează pe me-
tode statistice aplicate invarianţilor şi semiinvarianţilor.
- Sinteza Fourier şi sinteza Patterson. Cunoscând factorii de struc-
299
tură, putem să determinăm densitatea electronică de sarcină în
celula elementară cu ajutorul următoarei relaţii:
1
ρ ( x, y , z ) =
V
∑F
hkl
hkl exp( −2πi ( hx + ky + lz )) (17)
Densitatea electronică de sarcină se exprimă direct în unităţi electronice

astfel încât, unde densitatea electronică este mai mare, există o probabilitate
mai mare să avem atomi şi ne indică aproximativ şi numărul de atomi Z
pentru maximul de densitate electronică respectivă. Pe baza densităţii elec-
tronice se poate construi un model structural aproximativ. Dacă nu s-au
determinat fazele factorilor de structură şi avem numai modulul acestora,
atunci putem face sinteza Patterson, după relaţia:
1
∑F
2
P(u,v,w)= h , k ,l cos( 2π ( hx + ky + lz )) (18)
V h , k ,l
Cu ajutorul acestei relaţii putem să determinăm distanţe dintre atomi şi

mai ales distanţele dintre atomii grei. Cu ajutorul sintezei Patterson putem
localiza poziţiile atomilor grei din celula elementară dacă aceştia există.
- Rafinarea modelului structural prin metoda celor mai mici pă-
trate.
2.4.4. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld

După obţinerea unui model structural este necesară rafinarea parametrilor
de care depinde difractograma experimentală în aşa fel încât difractograma
calculată să se suprapună cât mai bine peste difractograma experimentală [21].
Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma experimentală se face
prin metoda celor mai mici pătrate. În cazul obţinerii modelului structural s-a
făcut o căutare globală potrivindu-se parametrii de structură astfel încât
difractograma calculată să concorde cât mai bine cu difractograma observată.
Dintre programele de calcul cel mai utilizat este GSAS [22]. În cazul metodei
Rietveld de rafinare se presupune că suntem în apropierea unui minim, de
aceea este posibilă ajustarea parametrilor prin metoda celor mai mici pătrate,
deoarece nu sunt necesare variaţii mari ale acestor parametrii.
Funcţia ce trebuie minimizată este:
S y = ∑ wi ( y i − y ci ) 2 (19)
i
unde:
wi - factorul de pondere şi este wi=1/yi,
300
yi - intensitatea observată la pasul i,
yci - intensitatea calculată la pasul i.
Forma funcţiei de profil a liniilor de difracţie depinde şi de
semilărgimea la semiînălţime a liniei de difracţie respective. Lărgimea la
semiînălţime se notează cu FWHM (full width half maximum) şi are următoa-
rea dependenţă unghiulară, exprimată prin funcţia lui Caglioti [23]:
H 2 = U tan 2 θ + V tanθ + W (20)

unde, H este lărgimea la semiînălţime şi U, V, W sunt parametri care se pot
rafina.
Calitatea rafinării se apreciază pe baza unor indici de rezidiu, care iau
în considerare concordanţa dintre modelul calculat şi cel experimental şi
care se definesc în felul următor:
RP =
∑| y − y
i ci |
(21)
∑y i
⎧⎪ ∑ wi ( y i − y ci ) 2 ⎫⎪
1/ 2
RWP =⎨ ⎬ (22)
⎪⎩ ∑ wi ( y i )
2
⎪⎭
unde wi=1/yi şi se numesc factori de pondere.
Pentru o reuşită în rafinarea Rietveld trebuie adoptată o anumită stra-
tegie referitoare la ordinea în care se rafinează diferiţi parametrii de care
depinde difractograma[24].
Din literatură şi din experienţă proprie am constatat că este necesar să se
adopte următoarea strategie. La început se rafinează factorul de scală, factorul
de temperatură şi coeficienţii polinomului care descriu fondul. În general, fon-
dul difractogramei se descrie cu un polinom a cărui grad poate fi între 10 şi 40.
Urmează rafinarea deplasării punctului de zero pentru difractogramă. Pentru
o difractogramă oricât de perfectă maximele de difracţie calculate sunt uşor
deplasate faţă de cele experimentale. În continuare se rafinează parametrii de
reţea după care urmează parametrii care descriu profilul liniilor de difracţie,
factorul care descrie absorbţia razelor X, şi factorul de polarizare. Profilul linii-
lor de difracţie depinde de parametrii ce caracterizează dimensiunile cristalite-
lor, deformaţiile de reţea, factorii care descriu asimetria liniilor de difracţie etc.
În ultimele etape, se rafinează poziţiile atomilor în celula elementară şi eventu-
al factorii de ocupare pentru atomi.
În ceea ce priveşte rafinarea poziţiilor atomilor în celula elementară, în
general trebuie impuse constrângeri, mai ales dacă avem un număr mare
301
de atomi pe celula elementară. Există două tipuri de constrângeri: con-
strângeri slabe sau “soft restrain” [25] şi “rigid body“ [26]. Constrângerile
slabe este necesar să fie impuse asupra distanţelor dintre atomi deoarece
există distanţe standard dintre atomi, de exemplu C–C, C–O pentru legă-
turi simple sau duble. Totuşi, aceste distanţe pot să varieze între anumite
limite. La fel se pot impune constrângeri slabe pentru unghiurile de legătu-
ră şi pentru unităţile structurale care sunt planare. De exemplu, pentru ci-
clu benzenic se impun constrângeri slabe referitoare la planeitatea acestui
ciclu [27].
Constrângerile puternice sau “rigid body” se aplică atunci când urmărim
ca o grupare de atomi să se mişte împreună sau să se modifice distanţele
dintre atomi, dar forma ansamblului să nu se schimbe. Acest fel de con-
strângeri urmăreşte să se reducă numărul parametrilor ce trebuie rafinaţi şi
obţinerea unui model de structură realist. De exemplu, în procesul de rafina-
re a complecşilor de incluziune, fiecare din cele şapte unităţi glicozidice care
intră în componenţa ciclodextrinei împreună cu atomii de oxigen secundari
au fost considerate ca “rigid body”, permiţând translaţia şi rotaţia acestora.
Unităţile glicozidice au fost legate între ele prin constrângeri slabe.

Aparatura de difracţie disponibilă este un difractometru Shimadzu
XRD–600 prevăzut cu un monocromator pentru fasciculul difractat. Difrac-
tometru este prevăzut cu o bază de date pentru efectuarea de analize calita-
tive şi cu software pentru determinarea raportului cristalin-amorf. Suporţii
de probă aduşi de firmă nu au permis analiza unor cantităţi mici de probă,
de aceea, au fost adaptaţi alţi suporţi de probă care să permită difracţie
pentru cantităţi foarte mici de probă.
Este recomandat ca difractometrul să fie aliniat în fiecare dimineaţă
înainte de a începe experimentele.
Pe lângă aceasta, mai este necesară o calibrare mai complectă la fiecare
lună. Modul de aliniere şi calibrarea lunară se găsesc în documentaţia de
folosire a difractometrului. Pentru o mai mare siguranţă referitoare la punc-
tul de zero al difractometrului, este necesar ridicarea unei difractograme
pentru un etalon de siliciu. Aceasta ar trebui făcută săptămânal.
Timpul de înregistrare pentru difractograme şi fantele folosite depind
de tipul de măsurători efectuate.
Pentru analiza calitativă, timpul de înregistrare este suficient să fie
2 /minut. În cazul în care se fac măsurători pentru compuşi anorganici cu
0
302
celula elementară mică, măsurătorile trebuie să se facă aproximativ între 10
si 800, iar pentru compuşi organici care au celula elementară mai mare între
3 si 450.
Pentru analiza cantitativă de faze este indicat să se lucreze cu metoda
standardului intern, care poate fi chiar proba cântărită din etalonul de Si.
În cazul în care se încearcă determinarea structurii pentru un nou com-
pus, timpul de înregistrare trebuie să fie mare, eventual să se lase aparatul
să funcţioneze şi peste noapte, adică timpul de înregistrare să fie în jur de
20 ore. În acest caz, fantele trebuie să fie cât mai înguste.
Pentru indexarea compuşilor şi determinarea parametrilor de reţea este
indicat să se folosească şi standard intern deoarece în acest caz se poate
evalua mai precis punctul de zero al difractometrului şi se pot determina
mai exact poziţiile liniilor de difracţie.
Pentru analiza microstructurală nu este necesară înregistrarea
difractogramei pe întreg domeniul, ci doar înregistrarea maximelor de di-
fracţie care trebuie să se facă cât mai precis.
Dacă se lucrează cu probe care conţin Fe sau Mn este de dorit să se fo-
losească tub de Cr care există în dotarea laboratorului. Tubul de Cu dă flu-
orescenţă pentru probele care conţin Fe sau Mn.
De asemenea, adâncimea de pătrundere a razelor X este mult mai mică
în cazul utilizării tubului de Cr, de aceea, când dorim să vedem efectele
structurale de suprafaţă sau când avem probă puţină, este avantajos utiliza-
rea tubului de Cr.
Din punct de vedere tehnic, este indicat să se controleze filtrele pentru
apă odată la 3 luni şi, dacă este cazul, să fie curăţate.
Nu este indicată achiziţionarea de tuburi de raze X care să nu se utili-
zeze deoarece tuburile de raze X se deteriorează în timp, chiar dacă acestea
nu funcţionează.
4. Bibliografie
1. Fundamentals of crystallography, Ed. C. Giacovazzo, Oxford University Press
2002.
2. H.P. Klug and L.E. Alexander X-Ray Diffraction Procedures J. Willey& Sons, Inc
1974.
3. Eds D.L.Bish and J.E. Post, Powder Diffraction Reviews in Mineralogy Vol 20 1989.
4. Ed. R.E. Dinnebier and S.J.L. Billinge, Powder diffraction, R.S.C Publishing 2008.
5. P.M. de Woolff. J. Appl. Cryst. 1, 108-113 (1968).
6. G.S. Smith and R.L. Snyder J. Appl. Cryst. 10, 252-255 (1977).
7. J.W. Visser J. Appl. Cryst. 2, 89 (1969).
8. A. Boultif, D.Louer J. Appl. Cryst. 24, 987-993 (1991).
9. M. Neumann J. Appl. Cryst. 36, 356-365 (2003).
303
10. P.E. Werner, L.Eriksson, M. Westdahl J. Appl. Cryst. 18, 367-370 (1985).
11. A. Le Bail, H. Duroy, J.L. Fourquet Mater. Res. Bull. 23, 447-452 (1988).
12. G.S. Pawley J. Appl. Crystallogr. 14, 357-361 (1981).
13. G.E. Engel, S. Wike, O. Konig, K.D.M. Harris, F. Leuse. J. Appl. Crystallogr. 32,
1169-1179 (1999).
14. Coelho J. Appl. Crystallogr. 33, 899-908 (2000).
15. G.E.Engel, S.Wilke, O. Koning, K.D.Harris, F.J. Leusen J. Appl. Cryst. 32, 1169
(1999).
16. V. Favre-Nicolin and R. Cerny J. Appl. Cryst. 35, 734-743 (2002).
17. V. Favre-Nicolin and R. Cerny Z. Kristallogr. 219, 847-856 (2004).
18. M. Falcioni, M.W. Deem J. Chem. Phys. 110, 1754-1766 (1999).
19. Fundamentals of crystallography, Ed. C. Giacovazzo, Oxford University Press
2002.
20. C. Giacovazzo, Direct phasing in crystallography, Oxford Science Publications
1999.
21. H.M Rietveld J. Appl. Cryst. 2, 65-71 (1969).
22. A.C. Larson & R.B. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Report
LAUR 86-748. Los Alamos National Laboratory, NM, 87545, USA.
23. The Rietveld Method, Ed. R.A. Young Oxford University Press (1993).
24. L.B. McCusker, R.B. Von Dreele, D.E. Cox, D. Louer and P.Scardi J. Appl. Cryst. 32,
36-50 (1999).
25. H. Nowell, J.P. Attfield and J.C. Cole Acta Cryst. B B58, 835-840 (2002).
26. R.E. Dinnebier Powder Diffraction 14, 84-92 (1999).
27. D. Mentzafos, I.M. Mavridis, G. Le Bas, G. Tsoucaris Acta. Cryst. B47, 746-757
(1991).
304
Determinarea structurii cristaline prin difracţie de raze X
Cuprins
1. Indexarea difractogramelor ................................................................................................. 306

1.1. Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească o difractogramă pentru a putea fi
indexată corect ............................................................................................................. 307
1.2. Algoritmi de indexare .................................................................................................. 307
1.3. Câteva metode uzuale de idexare ................................................................................. 309
2. Obţinerea modelului structural .......................................................................................... 311
2.1. Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi ........................................................ 311
2.1.1. Extragerea intensităţilor de difracţie.................................................................. 311
2.1.2. Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi ............................ 312
2.2. Metoda de căutare în spaţiul direct ............................................................................. 314
3. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld ....................................................... 316
4. Exemple privind determinarea structurii cristaline din pulberi ......................................... 319
4.1. Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluziune
Atenolol + β ciclodextrina. ........................................................................................ 319
4.2. Structura cristalină pentru N-(5-etil-[1,3,4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida........ 322
5. Bibliografie .......................................................................................................................... 325
Determinarea structurii cristaline este foarte importantă, atât în diferi-

tele ramuri ale ştiinţei, cât şi în industrie şi tehnologie, deoarece proprietăţi-
le materialelor în stare solidă depind de structura cristalină şi moleculară a
acestora. Pentru orice compus nou preparat într-un anumit fel este de dorit
să se determine structura cristalină. A determina structura cristalină pentru
un anumit compus înseamnă determinarea sistemului cristalografic în care
acesta cristalizează, a parametrilor celulei elementare, a grupului spaţial şi
a poziţiilor atomilor în celula elementară. Determinarea structurii cristaline
se face în principal prin difracţie de raze X, dar de foarte mare ajutor sunt
metodele spectroscopice şi de modelare moleculară care pot să furnizeze
informaţii structurale deosebit de utile. În general, structura cristalină se
determină din monocristale. În cazul în care nu se pot obţine monocristale
se încearcă determinarea structurii cristaline din pulberi. Determinarea
structurii cristaline din pulberi este mai dificilă deoarece, în timp ce la mo-
nocristale se pot colecta mii de intensităţi de difracţie, în cazul pulberilor, se
obţin doar câteva zeci. Pe lângă aceasta, foarte multe intensităţi de difracţie
se suprapun, iar extragerea acestora este dificilă şi afectată de erori. Totuşi,
305
în ultimul timp, datorită creşterii puterii de calcul şi rezoluţiei difractome-
trelor, foarte multe structuri cristaline au fost determinate din pulberi. De-
oarece în cadrul ICE există difractometru pentru pulberi ne vom ocupa
doar de determinarea structurii cristaline din pulberi cristaline. Etapele
principale pentru determinarea structurii cristaline din pulberi sunt: inde-
xarea difractogramelor, obţinerea modelului structural şi rafinarea Rietveld
a modelului obţinut. Vom descrie aceste etape, iar la final se vor da câteva
exemple de determinare a structurii cristaline din pulberi.
1. Indexarea difractogramelor
A indexa o difractogramă înseamnă a determina sistemul cristalografic,
parametrii celulei elementare şi atribuirea fiecărei linii de difracţie a indici-
lor Miller corespunzători.
Celula elementară este un paralelipiped în interiorul căruia se găsesc
atomii sau moleculele şi dacă acesta se translatează după cele 3 direcţii,
atunci se obţin poziţiile tuturor atomilor din celula elementară. În general,
o celulă elementară se poate defini în mai multe moduri, dar se alege acea
celulă care are volumul cât mai mic şi simetria cât mai mare. Indexarea
difractogramelor este primul pas în determinarea structurii cristaline, dacă
aceasta nu este făcută corect, nu se poate determina structura cristalină.
Dificultatea indexării provine din faptul că, în cazul pulberilor, datele expe-
rimentale sunt proiecţia unidimensională a reţelei reciproce care este tridi-
mensională. Astfel, din difractogramele pe pulberi se determină unghiurile
de difracţie din care rezultă modulul unui număr limitat de vectori din re-
ţeaua reciprocă din care se doreşte să se reconstituie întreaga reţea recipro-
că. Aceasta este total diferită faţă de cazul determinării structurii cristaline
din monocristale, unde se determină atât modulul, cât şi direcţia pentru un
număr foarte mare de vectori din reţeaua reciprocă. Astfel, în timp ce în
cazul difracţiei pe monocristale se obţin mii de vectori din reţeaua recipro-
că, la difracţia pe pulberi se obţin doar câteva zeci de unghiuri de difracţie
din care se determină modulul vectorilor corespunzători din reţeaua reci-
procă. Dificultăţile în indexarea difractogramelor provin din erorile legate
de determinarea poziţiilor maximelor de difracţie, dacă poziţiile maximelor
de difracţie ar fi determinate exact, indexarea ar fi imediată. De asemenea,
trebuie menţionat că indexarea este cu atât mai dificilă cu cât simetria este
mai scăzută. Astfel, cel mai uşor se indexează compuşii care cristalizează în
sistemul cubic şi, cel mai dificil, compuşii care cristalizează în sistemul tri-
clinic. Aceasta deoarece, cu cât sistemul cristalografic are simetrie mai joa-
să, cu atât are mai multe linii de difracţie, dintre care unele se suprapun
306
parţial, ceea ce face ca să nu se poată determina precis poziţiile maximelor
de difracţie.
1.1 Condiţiile pe care trebuie să le îndeplinească o difractogramă

pentru a putea fi indexată corect sunt:
a) Să existe linii de difracţie observabile la unghiuri cât mai mici.
Aceasta deoarece la unghiuri mici peak-urile de difracţie sunt mai rare şi
şansele de a se suprapune sunt mai mici.
b) Numărul de extincţii pentru maximele de difracţie la unghiuri mici
să nu fie foarte mare. Dacă, de exemplu, unul dintre indicii Miller este tot
timpul par din cauza reflexiilor interzise, atunci la indexare s-ar putea să
avem o celulă cu o constantă de reţea dublă faţă de cea reală.
c) Să avem o precizie mare pentru determinarea poziţiilor de difracţie.
Erorile sistematice sunt mai nefavorabile pentru indexare decât erorile în-
tâmplătoare. Cele mai importante erori sistematice sunt poziţia de zero a
difractometrului şi deplasarea probei. Erorile sistematice pot să fie minimi-
zate prin alinierea difractometrului. Pentru corectarea erorilor sistematice
se poate folosi atât standard extern, cât şi standard intern. Cea mai precisă
corecţie se face prin utilizarea de standard intern. Aceasta presupune in-
troducerea în proba de analizat a unui compus pentru care se ştiu exact
poziţiile maximelor de difracţie.
d) Să nu existe impurităţi în proba de analizat. Acest lucru este foarte
important deoarece nu se poate distinge între liniile de difracţie ale compu-
sului şi liniile de difracţie ale impurităţii. În general, dacă avem impurităţi,
obţinem o celulă elementară incorectă. În programele de calcul elaborate în
ultimul timp se poate face indexarea chiar când există un număr mic de
reflexii care aparţin impurităţilor şi acestea sunt excluse dacă celelalte linii
de difracţie se potrivesc cu celula elementară găsită. Indexarea este cu atât
mai dificilă cu cât simetria reţelei cristaline este mai joasă. Astfel, definirea
celulei elementare pentru sistemul cubic depinde de un singur parametru,
pentru sistemul ortorombic depinde de trei parametrii, iar pentru sistemul
triclinic depinde de şase parametrii. Indexarea difractogramelor se face în
mod automat folosind diferiţi algoritmi de calcul[1].
1.2 Algoritmi de indexare

Există două abordări pentru algoritmii de indexare şi anume căutarea
în spaţiul direct şi în spaţiul reciproc. În cazul căutării în spaţiul direct, se
variază parametrii celulei elementare într-un anumit mod şi se aleg acele
307
valori pentru care poziţiile maximelor de difracţie calculate se potrivesc cât
mai bine cu cele observate. La căutarea în spaţiul reciproc se caută să se
găsească vectorii elementari ai celulei reciproce folosind unghiurile de di-
fracţie. Vectorii reţelei reciproce sunt legaţi de unghiurile de difracţie prin
relaţia (2sin θ )/ λ =1/d. Deci se cunosc un număr limitat de vectori ai reţe-
lei reciproce şi se urmăreşte să se găsească vectorii elementari ai reţelei re-
ciproce care să genereze întreaga reţea reciprocă. Din vectorii elementari ai
reţelei reciproce rezultă imediat vectorii elementari ai reţelei directe. Tim-
pul de calcul, dacă se lucrează în spaţiul direct, este mult mai mare decât în
spaţiul reciproc.
În cazul indexării, utilizând spaţiul direct, se variază parametrii celulei
elementare a,b,c cu aproximativ 0.01 Å şi unghiurile α, β , γ cu 0.10 şi se
caută cea mai bună potrivire dintre poziţiile calculate şi observate ale un-
ghiurilor de difracţie. Această metodă este metoda directă de căutare în
spaţiul direct.
O altă posibilitate de căutare este utilizarea metodei Monte Carlo. Exis-
tă şi posibilitatea utilizării algoritmilor genetici pentru indexarea
difractogramelor. Aceasta este tot o variantă a metodei Monte Carlo.
Dintre programele de calcul care utilizează căutarea în spaţiul direct,
merită menţionate următoarele: Autox [2], McMaille [3] şi SVDIndex [4]
care se bazează pe metode de căutare de tip Monte Carlo. O altă tehnică de
indexare foarte puternică şi care este implementată în programul de calcul
de către firma Bruker Topas, este o metodă iterativă şi Monte Carlo ce utili-
zează poziţiile liniilor de difracţie pe baza descompunerii difractogramei şi
extragere a intensităţilor de difracţie LSI (Least Square Indexing) and
LP-Search [5]. Metodele de indexare care utilizează spaţiul reciproc sunt
mai eficiente decât cele de căutare în spaţiul direct, mai ales în cazul com-
puşilor cu simetrie scăzută. Căutarea în spaţiul reciproc poate fi implemen-
tat în două variante, şi anume: metoda de încercare şi eroare şi metoda de
căutare pe zone. Prima este mai eficientă pentru sisteme cu simetrie ridicată
de la cubic la ortorombic, iar a doua variantă este mai eficientă pentru sis-
teme cu simetrie joasă, în special pentru sistemul triclinic şi monoclinic.
Metoda de încercare şi eroare se bazează pe atribuirea de indici Miller la un
număr minim de peak-uri de difracţie, care se numeşte setul de bază şi care
sunt liniile de difracţie cu cele mai mici unghiuri. Numărul unghiurilor de
difracţie din setul de bază este egal cu numărul parametrilor ce caracteri-
zează celula elementară. Astfel, pentru sistemul cubic numărul unghiurilor
din setul de bază este 1 pentru sistemul tetragonal, este 2 şi aşa mai depar-
te, pentru sistemul triclinic fiind 6. Valoarea indicilor Miller variază între 0
308
şi valori maxime preselectate pentru h,k, l notate cu hm, km, lm. Aceste
valori sunt între 2 şi 4. Pentru fiecare permutare a indicilor se determină
parametrii celulei elementare, se generează unghiurile de difracţie şi se
verifică dacă unghiurile calculate se potrivesc cu cele experimentale. Se
reţin acei parametrii de reţea pentru care unghiurile calculate se potrivesc
cel mai bine cu unghiurile experimentale şi care indexează toate sau aproa-
pe toate unghiurile experimentale. Se testează toate sistemele cristalografice
începând de la sistemul cubic până la sistemul triclinic.
Metoda căutării pe zone începe prin căutarea zonelor unidimensionale,
adică de tipul h,0,0; 0,h,0; 0,0,l şi bidimensionale, adică de tipul h,k,0; h,0,l;
0,k,l şi construirea zonelor tridimensionale utilizând liniile comune din
zonele bidimensionale. Când o zonă tridimensională (reţeaua) a fost con-
struită, se încearcă atribuirea indicilor Miller pentru toate reflexiile Bragg
observate.
1.3 Câteva metode uzuale de idexare

Metoda Treor. Această metodă este o metodă de căutare în spaţiul re-
ciproc şi se bazează pe atribuirea unor indici Miller la primele linii de di-
fracţie, după care se calculează parametrii celulei elementare [6]. Având
parametrii celulei elementare, se generează toate poziţiile posibile ale ma-
ximelor de difracţie şi se verifică dacă poziţiile unghiulare ale maximelor
de difracţie observate sunt incluse în cele calculate în limita unor erori de
măsură, după care se calculează factorul de încredere. Operaţia se repetă
atribuind alţi indici Miller primelor maxime de difracţie şi se ordonează
soluţiile în ordinea descrescătoare a factorilor de încredere.
Se reţin acele valori ale parametrilor de reţea care se potrivesc cel mai
bine cu valorile experimentale şi se calculează pentru acestea factorul de
încredere. Cu acest program se poate indexa orice sistem cristalografic, dar
cele mai bune rezultate se obţin pentru sistemele cu simetrie ridicată.
Metoda Dicvol. Metoda Dicvol [7] este o metodă de căutare în spaţiul
direct şi se bazează pe metoda dihotomiei care constă în variaţia lungimilor
celulei elementare şi a unghiurilor dintre axe între anumite limite şi reduce-
rea intervalelor respective, dacă în intervalul respectiv se găseşte soluţia
elementară.
Programele de calcul care fac indexarea prin metoda Dicvol încep de la
sistemul cubic, care este de simetria cea mai ridicată şi termină cu sistemul
triclinic.
Dacă difractograma experimentală are şi impurităţi, atunci această me-
todă nu poate să facă corect indexarea deoarece nu are posibilitatea să dis-
309
tingă între liniile de difracţie ale compusului şi ale impurităţilor. O metodă
asemănătoare cu Dicvol şi care se bazează tot pe procedeul dihotomiei, dar
care nu este foarte sensibilă la impurităţi se numeşte X-cel [8]. Cu această
metodă de indexare se obţine şi grupul spaţial la care aparţine compusul.
Metoda Ito. Această metodă de calcul, împreună cu programul aferent,
realizează o căutare a zonelor în spaţiul reciproc şi transformare a axelor
celulei pentru a găsi o celulă cât mai potrivită [9]. Cele mai comune versi-
uni sunt ITO13 şi ITO15.
Pentru a se indexa cu această metodă se parcurg următorii paşi: a) Gă-
sirea potenţialelor zone utilizând primele 20 unghiuri Bragg; b) Construirea
reţelelor tridimensionale prin găsirea de zone bidimensionale care au o
zonă unidimensională comună; c) Reducerea celulei găsite şi transformarea
acesteia în una din cele 14 reţele Bravais; d) Atribuirea indicilor Miller pen-
tru toate maximele observate şi calcularea figurilor de merit.
Programul Ito este folosit în special pentru indexarea sistemelor cu si-
metria joasă, în special triclinic şi monoclinic. Programul cere cel puţin 20
de reflexii Bragg şi nu funcţionează cu mai puţine linii de difracţie. Un nu-
măr de 30-35 de reflexii Bragg este recomandat.
Pe lângă aceste programe de calcul am mai elaborat şi noi un program
[10] care se bazează pe căutarea în spaţiul direct pentru parametrii reţelei
cuprinşi într-un anumit interval şi cu un anumit pas. Pentru fiecare combi-
naţie de parametrii ai celulei elementare se generează poziţiile maximelor
de difracţie. Maximelor de difracţie experimentale li se pun în corespon-
denţă cele mai apropiate maxime de difracţie calculate, se calculează eroa-
rea medie dintre poziţiile maximelor calculate şi cele experimentale şi se
trece la pasul următor.
Se ordonează soluţiile în ordinea descrescătoare a erorii medii. Pro-
gramul mai ţine cont de densitatea aproximativă a compusului şi de numă-
rul posibil de molecule pe celula elementară.
Ca o remarcă generală: cu cât poziţiile liniilor de difracţie sunt deter-
minate mai precis şi cu cât proba de analizat este mai pură, cu atât şansa de
a obţine mai repede soluţia corectă la indexare este mai mare.
În general, din programele de indexare rezultă mai multe soluţii foarte
diverse între ele. O primă observaţie este că dacă nu au fost indexate toate
liniile de difracţie, rămânând una sau două linii de difracţie neindexate,
s-ar putea ca soluţia să fie corectă, cu condiţia ca liniile de difracţie neinde-
xate să fie de mică intensitate şi, în acest caz, acestea să aparţină unor im-
purităţi, dar aceasta trebuie confirmată. O altă observaţie în alegerea soluţi-
ei corecte se referă la densitatea calculată. După indexare cunoaştem volu-
310
mul celulei elementare şi dacă presupunem un anumit grup spaţial putem
determina numărul de molecule pe celula elementară şi de aici densitatea.
Densitatea calculată trebuie să aibă o valoare rezonabilă în funcţie de ele-
mentele care se găsesc în compus. Dacă s-a determinat densitatea experi-
mentală, atunci o putem compara cu densitatea calculată şi să confirmăm
dacă indexarea poate fi corectă cu soluţia aleasă. Un alt criteriu foarte im-
portant este valoarea figurii de merit. Dacă indexarea se face cu Dicvol,
Treor sau Ito, figura de merit trebuie să fie neapărat mai mare ca 4. Dacă
indexarea este corectă, atunci putem să mergem mai departe pentru a obţi-
ne modelul structural şi să-l rafinăm, în caz contrar, modelul structural
obţinut nu va putea fi rafinat.
2. Obţinerea modelului structural

Pentru obţinerea modelului structural există două posibilităţi, şi anu-
me: metode utilizate în cazul monocristalelor şi metode de căutare în spaţi-
ul direct. Vom descrie pe scurt cele două tipuri de metode.
2.1 Metodele pentru monocristale aplicate la pulberi

În acest caz, mai întâi se extrag intensităţile de difracţie deoarece se ştie
că în cazul difracţiei pe pulberi foarte multe intensităţi de difracţie se su-
prapun. Există două tehnici de extragere a intensităţilor de difracţie, şi
anume, metoda Le Bail şi metoda Pawley.
Vom descrie pe scurt cele două metode.
2.1.1 Extragerea intensităţilor de difracţie

Metoda Le Bail de extragere a intensităţilor de difracţie este inspirată
din metoda Rietveld. Rietveld a propus un algoritm simplu de evaluare a
factorilor de structură observaţi pentru o suprapunere parţială sau totală a
maximelor de difracţie. Le Bail a extins această metodă pentru estimarea
valorilor absolute a factorilor de structură, când nu există un model struc-
tural. Le Bail a propus o metodă iterativă de determinare a intensităţilor de
difracţie observate. Intensităţile de difracţie pentru iteraţia (r+1) se exprimă
în funcţie de intensităţile de difracţie pentru iteraţia r. Rezultatele intensită-
ţilor de difracţie extrase nu depind de valoarea intensităţilor iniţiale. Ca
intensităţi de pornire, se pot considera valorile calculate ale intensităţilor de
difracţie. Deşi metoda este în general robustă, există şi cazuri când prezintă
instabilităţi, mai ales atunci când fondul de difracţie este supraestimat. Dar
cel mai important aspect care a contribuit la creşterea popularităţii metodei
311
Le Bail este că aceasta poate să fie uşor încorporată în tehnica Rietveld de
rafinare.
Metoda Pawley este o metodă pentru determinarea intensităţilor de di-

fracţie din difractograma de raze X, care nu necesită un model structural. În
timp ce metoda Le Bail este o metodă iterativă, metoda Pawley rezolvă
problema de extragere a intensităţilor de difracţie printr-o tehnică matricia-
lă. Mărimea matricei nu este o problemă deoarece matricea este
cvasidiagonală, termenii nediagonali diferiţi de zero provin de la suprapu-
nerea maximelor de difracţie vecine. Deşi procesul de rafinare este în gene-
ral stabil, maxime de difracţie foarte apropiate pot duce uneori la apariţia
de maxime de difracţie negative. Experienţa arată că aceasta are loc când
poziţiile a două maxime de difracţie sunt mai apropiate unele de altele cu
0.5 dintr-un pas de înregistrare a difractogramei. Unii autori au căutat să
elimine maximele negative prin rafinarea mărimii factorilor de structură, în
schimbul intensităţilor de difracţie.
2.1.2 Aplicarea unor procedee de calcul pe monocristale la pulberi

După extragerea intensităţilor de difracţie prin metoda Le Bail sau
Pawley, pentru obţinerea modelului structural se poate urma procedeul
care se foloseşte pentru monocristale. Dificultatea adaptării procedeului de
calcul pentru monocristale la pulberi provine din aceea că metodele de cal-
cul sunt metode statistice şi necesită un număr mare de intensităţi de di-
fracţie. În timp ce pentru monocristale se pot colecta câteva mii de intensi-
tăţi, numărul de intensităţi care se pot obţine pentru pulberi este de ordinul
a zecilor până la 3 sau 4 sute. Cu toate acestea, în unele cazuri s-au obţinut
rezultate bune. Paşii care trebuie urmaţi sunt:
(i) Corectarea intensităţilor de difracţie. Primul pas, după ce au fost
obţinute intensităţile de difracţie, este corectarea acestora de fac-
tori fizici sau geometrici care afectează intensităţile de difracţie.
Aceştia sunt: Factorul Lorentz, factorul de polarizare, factorul de
absorbţie şi factorul de extincţie. Aceste corecţii pot să fie făcute şi
în cadrul extragerii intensităţilor de difracţie.
(ii) Determinarea factorului de scală şi a factorului global de tempera-
tură. Datorită faptului că atomii oscilează în jurul poziţiilor de echi-
libru, intensităţile acestora se reduc cu un factor de temperatură.
(iii) Determinarea fazei factorilor de structură. Dacă se fac corecţiile in-
tensităţilor de difracţie, se determină factorul de scală şi de tempe-
ratură şi se obţine modulul factorilor de structură. Dar factorii de
312
structură sunt numere complexe, faza acestor numere complexe
este arbitrară pentru structuri necentrosimetrice şi are valoarea 0
sau π pentru structuri centrosimetrice, deci în acest caz factorii de
structură sunt numere reale pozitive sau negative. Determinarea
fazei factorilor de structură când se cunoaşte modulul factorilor de
structură este cea mai complexă problemă în procesul de determi-
nare a structurilor cristaline pentru monocristale. Metodele de de-
terminare a fazei factorilor de structură se numesc în cristalografie
metode directe şi se bazează pe metode statistice şi probabilităţi
condiţionate.
(iv) Sinteza Fourier şi sinteza Patterson. Cunoscând factorii de structu-
ră, putem să determinăm densitatea electronică de sarcină în celu-
la elementară, cu ajutorul relaţiei:
1
ρ ( x, y , z ) =∑ Fhkl exp( −2πi(hx + ky + lz ))
V hkl
Densitatea electronică de sarcină se exprimă direct în unităţi elec-
tronice astfel încât, dacă densitatea electronică este mai mare, exis-
tă o probabilitate mai mare să avem atomi şi ne indică aproxima-
tiv şi numărul de atomi Z pentru maximul de densitate electronică
respectivă. Pe baza densităţii electronice se poate construi un mo-
del structural aproximativ. Dacă nu s-au determinat fazele factori-
lor de structură şi avem numai modulul acestora, atunci putem
face sinteza Patterson, după relaţia:
1
P(u,v,w) = ∑ Fh , k ,l cos( 2π ( hx + ky + lz ))
2
V h , k ,l
unde u, v, w reprezintă respectiv Δ x, Δ y, Δ z. Cu ajutorul acestei
relaţii putem să determinăm distanţe dintre atomi şi, mai ales, dis-
tanţele dintre atomii grei. Cu ajutorul sintezei Patterson putem lo-
caliza poziţiile atomilor grei din celula elementară, dacă aceştia
există.
(v) Rafinare Fourier. Modelele structurale obţinute prin metodele di-
recte sau metoda Patterson sunt adesea incomplete chiar şi pentru
monocristale, iar pentru pulberi cu atât mai mult pentru că numă-
rul de intensităţi experimentale este mult mai mic. Pentru a îmbu-
nătăţi şi completa modelul se apelează la tehnici de rafinare Fouri-
er. Cele mai importante tehnici de rafinare Fourier sunt: Sinteze
Fourier succesive şi Sinteza Diferenţă.
313
2.2. Metoda de căutare în spaţiul direct
Metoda de căutare în spaţiul direct sau metoda grid search este o me-
todă de localizare a unităţilor structurale în celula elementară, astfel ca
difractograma calculată să se suprapună cât mai bine cu difractograma ex-
perimentală. Această metodă nu cere extragerea factorilor de structură din
difractogramă.
Tipul unităţilor structurale care trebuie să fie localizate în celula ele-
mentară depinde de natura compusului. Putem să avem atomi, grupe de
atomi aranjaţi într-o anumită configuraţie, molecule, fragmente din molecu-
le. Pentru compuşii anorganici avem atomi sau grupe de atomi aranjaţi sub
diverse forme, ca de exemplu, tetraedrii, octaedrii etc.
Pentru moleculele organice ca unităţi structurale putem să considerăm
întreaga moleculă ca fiind rigidă sau fragmente rigide din molecula care se
mişcă unele în raport cu altele, modificându-şi configuraţia prin modifica-
rea unghiurilor de torsiune, eventual a unghiurilor de valenţă şi a distanţe-
lor dintre atomi. Astfel, pentru fiecare compus avem un număr de grade de
libertate care trebuie să fie modificate până când difractograma calculată se
suprapune cât mai bine peste difractograma experimentală. Pentru molecu-
lele organice, în celula elementară putem avea o moleculă sau mai multe în
unitatea asimetrică, celelalte molecule fiind generate prin operaţiile de si-
metrie ale grupului spaţial care caracterizează compusul respectiv. Să pre-
supunem că avem doar o moleculă pe celula elementară. În acest caz, avem
în mod obligatoriu 3 grade de libertate de translaţie, 3 grade de libertate de
rotaţie. La aceasta se adaugă gradele de libertate interne legate de modifi-
carea configuraţiei moleculare prin modificarea unghiurilor de torsiune,
unghiurilor de legătură dintre atomi şi, mai rar, distanţe. Să presupunem că
la cele 6 grade de libertate (translaţii şi rotaţii) se adaugă doar 4 grade de
libertate interne şi să avem în total 10 grade de libertate. Dacă, de exemplu,
presupunem că pentru fiecare grad de libertate corespunde doar 10 zece
paşi de căutare, rezultă că numărul total de configuraţii care trebuie să fie
testat este de 10x10=1010, ceea ce cere un timp foarte mare de calcul. Aceas-
ta înseamnă că nu se pot testa toate configuraţiile şi de aceea se apelează la
metode probabilistice, ca de exemplu, metoda Monte Carlo inversă [11].
Există diverse tehnici Monte Carlo de căutare a configuraţiei optime,
dintre care amintim:
Răcire simulată (simulated annealing), o variantă a acesteia numită
parallel tempering şi tehnica algoritmilor genetici. În cazul metodei de răci-
re simulată, se generează configuraţii întâmplătoare în spaţiul parametrilor
de căutare, se testează potrivirea dintre difractograma calculată şi cea expe-
314
rimentală. Ca o măsură a potrivirii dintre difractograma calculată şi cea
experimentală, se consideră funcţia de cost CF. Funcţia de cost CF se poate
alege în diverse moduri. Una dintre posibilităţi este să se aleagă ca fiind
reziduul R, definit în felul următor:
obd calc
Σ i wi ( y − y )2
i i
Rwp=[ obs 2
]1/2
Σ i wi ( y )
i
Dacă funcţia de cost CF este mai mică decât cea precedentă, atunci se
reţine noua configuraţie. Dacă CF este mai mare decât cea precedentă,
atunci se reţine noua configuraţie, cu probabilitatea exp(- Δ CF/T). Probabi-
litatea relativă a celor două configuraţii de încercare respectă legea lui
Boltzman: P1/P2=exp[(CF2-CF1)/T], T fiind temperatura distribuţiei.
În timpul procesului de căutare, temperatura se scade treptat. Astfel, în
faza iniţială a procesului de căutare a configuraţiei optime, se poate uşor
trece de la un minim local la un alt minim, în scopul determinării minimu-
lui absolut, dar în faza finală, când T este foarte mic, probabilitatea de a
găsi un alt minim este de asemenea mică. Există mai multe programe de
calcul care au implementat această modalitate de determinare a minimului
global, dintre care amintim, Powder Solve [12], Fox [13,14].
Totuşi, pentru a evita probabilitatea să cădem într-un minim local, un
alt algoritm a fost dezvoltat, şi anume, Parallel Tempering (PT) [15]. În
schimbul utilizării unui singur lanţ de configuraţii cu descreşterea tempera-
turii, se aleg de la început mai multe configuraţii (un număr mic de confi-
guraţii), fiecare configuraţie porneşte cu o anumită temperatură care scade
treptat. Periodic se testează configuraţiile paralele şi se alege configuraţia
optimă prin aceeaşi schemă ca în cadrul unui singur proces. În felul acesta,
posibilitatea de a se obţine minime locale este mai mică.
În procesul de căutare a minimului global ca şi Cost Function, poate să
se introducă ca şi criteriu pentru modelul obţinut, în afară de potrivirea
dintre difractograma calculată şi cea observată, minimizarea energiei po-
tenţiale de interacţiune inter - şi intramoleculară. Pentru ca unităţile struc-
turale să nu se apropie foarte mult unele de altele, se poate introduce un
factor numit ‘anti-bump’.
Difractogramele pot fi modelate ca o sumă de două funcţii, şi anume,
funcţia care descrie fondul (background) şi o funcţie care sumează liniile de
difracţie, fiecare linie de difracţie fiind centrată corespunzător. Profilul linii-
lor de difracţie se descrie de obicei prin funcţii standard de tipul Gaussiana,
Lorentziana sau pseudos-Voigt. Orientarea preferenţială poate fi descrisă
prin funcţii de tip March-Dollase.
315
3. Rafinarea structurilor cristaline prin metoda Rietveld
După obţinerea unui model structural, este necesară rafinarea parame-
trilor de care depinde difractograma experimentală în aşa fel încât
difractograma calculată să se suprapună cât mai bine peste difractograma
experimentală [16]. Ajustarea parametrilor de care depinde difractograma
experimentală se face prin metoda celor mai mici pătrate. În cazul obţinerii
modelului structural, s-a făcut o căutare globală, potrivindu-se parametrii
de structură astfel încât difractograma calculată să concorde cât mai bine cu
difractograma observată. Dintre programele de calcul, cel mai utilizat este
GSAS [17]. În cazul metodei Rietveld de rafinare se presupune că suntem în
apropierea unui minim, de aceea este posibilă ajustarea parametrilor prin
metoda celor mai mici pătrate, deoarece nu sunt necesare variaţii mari ale
acestor parametrii.
Funcţia ce trebuie minimizată este:
∑
S y = wi ( y i − y ci ) 2
i
(1)
unde yi si yci sunt intensităţile observate şi calculate la pasul i, iar wi=1/yi

este factorul de ponderare.
yci depind de o serie de factori, şi anume: de factorii de structură şi in-
dicii Miller corespunzători factorilor de structură respectivi, factorul de
scală, factorul Lorentz–polarizare, factorul de absorbţie, funcţia de profil
pentru liniile de difracţie, fondul de difracţie în punctul respectiv etc. Cu
alte cuvinte, yci este difractograma care se calculează la pasul i pentru că
difractograma se calculează în paşi, dându-se intensitatea de difracţie la
fiecare pas. Expresia factorilor de structură este dată de relaţia:
⎛ B sin 2 θ ⎞
Fhkl = ∑ N j f j exp[2Π(hx j + ky j + lz j )]exp⎜⎜ − ⎟ (2)
j ⎝ λ2 ⎟⎠
unde: Nj - factorul de ocupare,
fj - factorul de structură pentru atomul j;
xj, yj, zj - coordonatele atomului j;
B - factorul de temperatură (care se datoreşte vibraţiilor termice).
Forma liniilor de difracţie este o convoluţie datorată probei şi efectelor
instrumentale.
Profilul liniei de difracţie, ϕ, se poate aproxima prin diverse funcţii: de
tip Gauss, Lorentz, pseudo-Voigt, etc. Dintre acestea, cea mai utilizată este
funcţia pseudo Voigt, pV, care este descrisă ca fiind o combinaţie a funcţiei
Gauss şi Lorentz:
316
pV = ηL + (1-η)G
unde: pV - funcţia pseudo-Voigt , L fiind funcţia Lorentz, G funcţia Gaus
iar η parametru de amestecare a celor două funcţii.
Forma funcţiei de profil a liniilor de difracţie depinde şi de
semilărgimea la semiînălţime a liniei de difracţie respective. Lărgimea la
semiînălţime se notează cu FWHM (full width half maximum) şi are urmă-
toarea dependenţă unghiulară, exprimată prin funcţia lui Caglioti[18]:
H 2 = U tan 2 θ + V tanθ + W (3)

unde, H este lărgimea la semiînălţime şi U, V, W sunt parametri care se pot
rafina.
PK este funcţia care descrie orientarea preferenţială. Orientarea prefe-
renţială are loc când cristalitele din probă tind să se orienteze preferenţial
după anumite direcţii. Aceasta face ca unele maxime de difracţie să fie mai
intense, iar altele mai puţin intense faţă de cazul când nu ar exista orientare
preferenţială.
Orientarea preferenţială poate fi modelată matematic cu ajutorul unor
funcţii, ca de exemplu, March-Dollase [19]:
1 2
I cor = I obs (G 2 cos2 α K + sin α K ) −3 / 2 (4)
G
unde, Icor - intensitatea corectată pentru orientare preferenţială,
Iobs - intensitatea măsurată,
αK - unghiul ascuţit dintre vectorul de împrăştiere pentru reflexia K şi
direcţia preferenţială de orientare a planului cristalitelor faţă de planul
probei,
G - coeficientul March care variază între 0 şi 1, unde 0 se referă la 100%
orientare preferenţială a cristalitelor în probă şi 1 se referă la orientare
complet întâmplătoare a cristalitelor.
Calitatea rafinării se apreciază pe baza unor indici de rezidiu, care iau
în considerare concordanţa dintre modelul calculat şi cel experimental şi
care se definesc în felul următor:
RB =
∑| I K ( obs ) − I K ( calc) |
(5)
∑I K ( obs )
RP =
∑| y − y
i ci |
(6)
∑y i
317
⎧⎪ ∑ wi ( y i − y ci ) 2 ⎫⎪
1/ 2
RWP =⎨ ⎬ (7)
⎪⎩ ∑ wi ( y i )
2
⎪⎭
Cei mai utilizaţi indici sunt RP si RWP.
Pentru o reuşită în rafinarea Rietveld trebuie adoptată o anumită stra-
tegie referitoare la ordinea în care se rafinează diferiţi parametrii de care
depinde difractograma [20].
Din literatură şi din experienţa proprie, am constatat că este necesar să
se adopte următoarea strategie. La început se rafinează factorul de scală,
factorul de temperatură şi coeficienţii polinomului care descriu fondul. În
general fondul difractogramei se descrie cu un polinom a cărui grad poate
fi între 10 şi 40. Urmează rafinarea deplasării punctului de zero pentru
difractogramă. Pentru o difractogramă oricât de perfectă, maximele de di-
fracţie calculate sunt uşor deplasate faţă de cele experimentale. În continua-
re se rafinează parametrii de reţea după care urmează parametrii care de-
scriu profilul liniilor de difracţie, factorul care descrie absorbţia razelor X şi
factorul de polarizare. Profilul liniilor de difracţie depinde de parametrii ce
caracterizează dimensiunile cristalitelor, deformaţiile de reţea, factorii care
descriu asimetria liniilor de difracţie etc. În ultimele etape se rafinează po-
ziţiile atomilor în celula elementară şi eventual factorii de ocupare pentru
atomi.
În ceea ce priveşte rafinarea poziţiilor atomilor în celula elementară, în
general trebuie impuse constrângeri, mai ales dacă avem un număr mare
de atomi pe celula elementară. Există două tipuri de constrângeri: con-
strângeri slabe sau “soft restrain”[21] şi “rigid body“[22]. Constrângerile
slabe este necesar să fie impuse asupra distanţelor dintre atomi deoarece
există distanţe standard dintre atomi, de exemplu C-C, C-O, pentru legături
simple sau duble. Totuşi, aceste distanţe pot să varieze între anumite limite.
La fel se pot impune constrângeri slabe pentru unghiurile de legătură şi
pentru unităţile structurale care sunt planare. De exemplu, pentru ciclu
benzenic se impun constrângeri slabe referitoare la planeitatea acestui ciclu.
Dacă rafinarea se face ţinând cont de constrângerile slabe, atunci la
funcţia din formulă (5), care trebuie minimizată, mai trebuie să adăugăm şi
termenii care iau în considerare constrângerile slabe. În acest caz, funcţia ce
trebuie minimizată este:
SyR= ∑ w (y
i
i oi-yci)
2+C
w ∑ w (R -R
j oj cj(x))
2 ; wi=1/ σ 2
(yoi) ; wj=1/ σ 2
(Roj) (8)
j
unde yoi şi yci sunt intensităţile observate şi calculate la pasul i; σ (yoi) este
318
deviaţia standard a intensităţii lor măsurate; Roj este valoarea aşteptată pen-
tru mărimea stereochimică respectivă care poate fi lungime de legătură,
unghiuri etc (aşa numita pseudo observabilă), iar Rcj(x) este valoarea calcula-
tă din poziţiile atomilor (x,y,z); δ (Roj) este deviaţia standard a pseu-
do-observabilei; cw este un factor de ponderare care permite să se varieze
contribuţia constrângerilor în procesul de rafinare. Cu cât cw este mai mare,
cu atât constrângerile sunt mai puternice. În general, se porneşte cu un cw
mare, de ordinul miilor, şi se tot reduce în procesul de rafinare. În cazul
programului de rafinare GSAS [17], constrângerile puternice “rigid bodies”
sunt incompatibile cu constrângerile slabe, aceasta înseamnă că atomilor
care aparţin unui corp rigid nu le pot fi aplicate constrângerile slabe în ace-
laşi timp. În cazul în care există şi grupări plane, atunci este necesară apli-
carea constrângerilor de planeitate [23], ca de exemplu, pentru ciclu benze-
nic, când în afară de constrângerile slabe se aplică şi constrângeri ca mole-
cula să fie planară.
Constrângerile puternice sau “rigid body” se aplică atunci când urmă-
rim ca o grupare de atomi să se mişte împreună sau să se modifice distanţe-
le dintre atomi dar forma ansamblului să nu se schimbe. Acest fel de con-
strângeri urmăreşte să se reducă numărul parametrilor ce trebuie rafinaţi şi
obţinerea unui model de structură realist. De exemplu, în procesul de rafi-
nare a complecşilor de incluziune, fiecare din cele şapte unităţi glicozidice
care intră în componenţa ciclodextrinei, împreună cu atomii de oxigen se-
cundari, au fost considerate ca “rigid body”, permiţând translaţia şi rotaţia
acestora. Unităţile glicozidice au fost legate între ele prin constrângeri sla-
be.
4. Exemple privind determinarea structurii cristaline

din pulberi
4.1 Determinarea structurii cristaline pentru complexul de incluzi-
une Atenolol + β ciclodextrina.
Complecşii de incluziune cu β -ciclodextrina se folosesc pentru a îm-
bunătăţi biodisponibilitatea, solubilitatea şi stabilitatea diferitelor medica-
mente în soluţii apoase.
β -ciclodextrina este compusă din 7 unităţi glicosidice, una dintre aces-
te unităţi este prezentată în figura 1. Aceasta are o formă toroidală în care
se pot încapsula diferiţi compuşi bioactivi şi se poate realiza eliberarea trep-
tată a acestora.
319
Figura 1 Unitate glicozidică din componenta β Ciclodextrina
Noi am urmărit să determinăm structura cristalină pentru Atenolol cu

β -Ciclodextrina, adică să determinăm sistemul cristalografic, grupul spaţi-
al, celula elementară şi modul în care interacţionează şi se cuplează cele
două molecule pentru a forma complexul de incluziune.
Formula structurală pentru Atenolol este prezentată în figura 2.
Figura 2 Formula structurală pentru Atenolol
După determinarea poziţiilor maximelor de difracţie, indexarea s-a fă-

cut cu ajutorul programului de calcul Ito [9]. Structura cristalină pentru β
Ciclodextrină se cunoştea. Dar la interacţiunea cu atenololul structura cris-
talină se modifică total în sensul că se schimbă grupul spaţial, celula ele-
mentară şi configuraţia moleculară. Structura cristalină pentru atenolol nu
a fost cunoscută la acel moment. De aceea, configuraţia moleculară pentru
atenolol a fost calculată cu ajutorul programului de modelare moleculară
Cerius 2.0 [20].
Configuraţia moleculară pentru β ciclodextrină a fost luată din baza
de date Cambridge Structural Database [29].
În urma indexării s-a stabilit că, complexul de incluziune cristalizează
în sistemul monoclinic având grupul spaţial C2 cu 4 molecule de
320
ciclodextrină şi 4 molecule de atenolol pe celula elementară şi următorii
parametrii de reţea: a= 18.914Å, b=24.450Å, c=15.649Å , α =900, β =110.640,
γ =900. Volumul celulei elementare este V=6772.55Å3. Densitatea calculată
este ρ =1.375g/cm3, o valoare plauzibilă pentru compuşii organici care
conţin C, O, N, H..
Obţinerea modelului structural s-a făcut cu ajutorul programului de
calcul, utilizând tehnica ”simulated anealling” şi ”paralel tempering”. În
urma modelării s-a constatat că molecula de atenolol intră în cavitatea
β -ciclodextrinei. Ca grade de libertate au fost translaţiile şi rotaţiile pentru
molecula de ciclodextrină şi molecula de atenolol, unghiurile de torsiune
pentru molecula de atenolol, unghiurile de torsiune dintre unităţile
glicizidice şi unghiurile dintre unităţile glicozidice.
În continuare, s-a procedat la rafinarea modelului structural prin me-
toda Rietveld. Pentru aceasta s-a utilizat programul de calcul GSAS.
Pentru obţinerea unui model structural realist s-a procedat la aplicarea
unor serii de restrângeri şi constrângeri. Fiecare unitate glicozidică, împre-
ună cu atomii de oxigen O4, a fost considerată ca “rigid bodies”. Pentru
unităţile glicozidice, s-a permis rotaţia şi translaţia, unele în raport cu altele,
iar oxigenii de la capătul grupărilor glicozidice au fost legaţi între ei prin
restrângeri slabe (soft restrains). De asemenea, cu ajutorul restrângerilor de
planeitate, s-a pus condiţia ca toţi cei 7 atomi de oxigen O4 să fie aproxima-
tiv în acelaşi plan. Reamintim că în cadrul unui grup de atomi care au fost
definiţi ca “rigid bodies” nu se permite nici o mişcare a atomilor din cadrul
grupului. În schimb, pentru restrângerile slabe este permisă mişcarea ato-
milor, dar între anumite limite, rigidizarea este cu atât mai mare cu cât fac-
torii de pondere pentru restrângerile slabe sunt mai mari. Astfel, restrânge-
rile slabe referitoare la planeitatea atomilor (O4)n a fost în cazul
ciclodextrinei de 0.05 Å. Au fost aplicate restrângeri de planeitate pentru
gruparea fenil din cadrul atenololului.
De asemenea, au fost aplicate restrângeri slabe pentru toate distanţele
dintre atomi şi unghiurile de legătura dintre aceştia. Restrângerile slabe nu
se pot aplica pentru atomii din cadrul unui grup aparţinand la “rigid bo-
dy”. Iniţial, factorii de pondere pentru restrângerile slabe au fost:
fd=fa=fp=5000, fd fiind factorul de pondere pentru restrângerile de distan-
ţe, fa pentru restrângerile de unghiuri, iar fp pentru restrângerile de planei-
tate. Profilul de difracţie a fost aproximat prin funcţii de tip pseudo-Void.
Pentru funcţiile de profil s-au folosit 12 parametrii. Au fost rafinaţi de ase-
menea parametrii termici, parametrii de reţea, background-ul, adică fondul
de difracţie care a fost aproximat cu un polinom, punctul de zero pentru
321
difractogramă şi, bineînţeles, parametrii de poziţie, care au fost în număr
de 288. În final, s-a obţinut un rezidiu Rp=7.8% şi Rwp=11.58%.
Configuraţia moleculară pentru complexul de incluziune văzut după
axa b şi după axa c este prezentată în figura 3. Se observă ca moleculele de
ciclodextrină şi cele de atenolol se grupează între ele prin legături de hi-
drogen, formând un fel de dimeri.
Figura 3 Configuraţia moleculară pentru complexul de incluziune atenolol- β CD,

vedere după axa b şi c.
În mod asemănător s-a determinat structura cristalină pentru comple-

xul de incluziune Acid Mefenamic- β -Ciclodextrina.
4.2. Structura cristalină pentru

N-(5-etil-[1,3,4]-tiadiazol-2-il0-toluensulfonamida
Structura cristalină pentru acest compus a fost determinată prin com-
binarea difracţiei de raze X pe pulberi cu informaţii obţinute din RMN pen-
322
tru 13C şi din modelare moleculară. Deoarece deplasarea chimică obţinută
din RMN pe solide este sensibilă chiar şi la mici modificări de împachetare
moleculară şi modificare conformaţională din spectrul RMN, se obţin in-
formaţii structurale foarte importante. Difractograma de raze X pe pulberi a
fost obţinută cu difractometrul de raze X, D8 Advance, echipat cu un mo-
nocromator de Ge (111) pentru fasciculul incident pentru înlăturarea radia-
ţiei K α 2 şi, prin urmare, s-a utilizat radiaţia Cu K α 1 9 λ =1.54056Å. S-a
lucrat varianta geometria Bragg-Brentano θ -2 θ prin reflexie. Noi vom
descrie în special aportul difracţiei de raze X la determinarea structurii cris-
taline pentru acest compus.
Indexarea compusului s-a făcut utilizând programul de calcul Dicvol
[9]. Cea mai bună soluţie corespunde sistemului ortorombic cu următorii
parametrii de reţea: a=8.5364Å, b=15.0148 Å si c=21.3846 Å şi volumul celu-
lei elementare fiind V=2740.914 Å3.
Prin examinarea difractogramei cu ajutorul programului de calcul
Checkcell [28], cel mai probabil grup spaţial a fost găsit ca fiind Pbca. În
continuare s-a făcut fitarea Le Bail a difractogramei experimentale pentru
confirmarea grupului spaţial selectat. S-a obţinut un fit cu Rp=0.05 şi
Rwp=0.072, ceea ce confirmă grupul spaţial ales din reflexiile interzise. Men-
ţionăm că, în cele mai multe cazuri, pentru un anumit grup de reflexii in-
terzise corespund mai multe grupuri spaţiale. La acest grup spaţial cores-
pund un număr de 8 poziţii generale. Deoarece nu există nici un motiv ca
moleculele să se plaseze în poziţii speciale, rezultă că numărul de molecule
pe celula elementară este 8. Considerând 8 molecule pe celula elementară,
s-a calculat densitatea ca fiind ρ =1.37g/cm3, care reprezintă o valoare re-
zonabilă. Modelul structural de pornire a fost obţinut cu ajutorul progra-
mului de calcul Molden. Determinarea structurii cristaline s-a făcut prin
metoda căutării în spaţiul direct, folosind programul de calcul Dash [30],
prin ajustarea a 10 grade de libertate, dintre care 6 corespund pentru pozi-
ţia moleculei şi orientarea acesteia, iar 4 la unghiurile de torsiune pentru
moleculă. Modelul obţinut în acest mod a fost în continuare rafinat prin
metoda Rietveld, utilizând programul de calcul GSAS [17] combinat cu
interfaţa grafică EXPGUI [31] . Un factor de temperatură global a fost rafi-
nat pentru toţi atomii. Pentru a avea un model structural realist în timpul
rafinării, s-au aplicat o serie de restrângeri slabe pentru distanţe, unghiuri
şi planeitate a grupării fenil. Factorii de pondere corespunzători restrânge-
rilor pentru distanţe fd, unghiuri fa şi planeitate fp au fost reduşi treptat în
cursul ciclurilor de rafinare de la 500 la 100. Profilul maximelor de difracţie
de pe întregul interval 2 θ = 3.5-500 au fost modelate cu funcţii de profil de
323
tipul pseudo-Voight cu 18 termeni. Fondul de difracţie a fost modelat cu un
polinom Chebyshev de ordinul întâi. În continuare, modelul a fost îmbună-
tăţit utilizând tehnici de modelare moleculară combinată cu informaţii ob-
ţinute din măsurători de deplasare chimică din spectul RMN. În final, s-au
obţinut următorii factori care caracterizează figura de merit a modelului
structural: Rp=0.079, Rwp=0.113, Rexp= 0.053, χ 2=6.71.
În figura 4 este prezentată împachetarea în celula elementară pentru
compusul studiat şi aranjarea supramoleculară sub formă de două şuviţe
formate din molecule puse cap la cap. În figura 5 este prezentată
difractograma experimentală, difractograma calculată şi diferenţa dintre
difractograma calculată şi cea experimentală. Se observă o potrivire foarte
bună între cele două difractograme, deci modelul structural este corect.
Figura 4 Împachetarea în celula elementară şi aranjarea supramoleculară
Un alt compus pentru care s-a determinat structura cristalină prin

combinarea difracţiei pe pulberi cu spectroscopie RMN şi modelare mole-
culară a fost Etoxiazolamida [27].
324
Figura. 5 Comparaţie dintre difractograma observată şi cea calculată
5. Bibliografie
1. P.-E.Werner, Autoindexing. in: Structure determination from powder diffraction
data. IUCr monographs on crystallography , W. I. F. David, K. Shankland, L.B.
McCusker, and Ch. Baerlocher, Eds., Oxford University Press, Oxford, New York
(2002)
2. J. Appl. Cryst. 25, 69 (1992).
3. A. Le Bail, Monte Carlo indexing with McMaille, Powder Diffraction, 19, 249 (2004)
4. J. Appl. Cryst. 36, 86 (2003).
5. A.A. Coelho, A. Kern, The Third Pharmaceutical Powder X-ray Symposium
(PXRD-3). (2004).
6. A. Altomare, C. Giacovazzo,A. Guagliardi, A.G.G. Moliterni, R. Rizzi, P.-E. Werner
J. Appl. Cryst. 33, 1180 (2000).
7. A. Boultif and D. Lou¨er, J. Appl. Cryst. 37, 724 (2004)
8. J. Appl. Crystallogr, 36, 356 (2003).
9. J.W. Visser, Appl. Cryst. 2, 89 (1969)
10. Gh. Mihailescu, Gh. Borodi, I. Bratu, J.M. Gavira Roumanian Reports in Physics,
51(7-10) 983 (1999)
11. R.L.McGreevy, L.Pusztai ,Mol.Simul. 1,359 (1988)
12. G.E.Engel, S.Wilke , O.Koning, K.D.Harris , F.J.Leusen, J.Appl. Cryst. 32,
1169,(1999)
13. V.Favre-Nicolin and R.Cerny J.Appl.Cryst. 35, 734, (2002)
14. V.Favre-Nicolin and R.Cerny Z.Kristallogr. 219, 847-856, (2004)
15. M.Falcioni, M.W.Deem J.Chem.Phys. 110 , 1754 (1999)
16. H.M Rietveld , J.Appl. Cryst. 2, 65, (1969)
325
17. A.C.Larson & R.B. Von Dreele General Structure Analysis System (GSAS). Report
LAUR 86-748, Los Alamos National Laboratory, NM, 87545, USA.
18. The Rietveld Method edited by R.A. Young Oxford University Press (1993)
19. W.A. Dollase, J.Appl. Cryst. 19, 267, (1986)
20. L.B. McCusker, R.B. Von Dreele, D.E. Cox, D.Louer and P.Scardi J. Appl.Cryst., 32,
36,
21. H.Nowell, J.P. Attfield and J.C.Cole, Acta Cryst.B B58 835,(2002
22. R.E. Dinnebier Powder Diffraction 14, 84,. (1999)
23. D. Mentzafos, I.M.Mavridis, G. le Bas, G. Tsoucaris, Acta. Cryst. B47, 746 (1991)
24. G. Borodi, I. Bratu, F. Dragan, R. Peschar, R. B. Helmbholdt, A. Hernanz,
Spectrochimica Acta A,70, 1041, (2008)
25. M.Pop, K. Goubitz, G. Borodi, M. Bogdan, D.J.A. De Ridder, R. Peschar, H. Shenk
Acta Cryst. B58, 1036, (2002),
26. A. Hangan, G. Borodi, X. Filip, C. Tripon, C. Morari, L. Oprean and C. Filip, Acta
Cryst. B66, 615, (2010)
27. X. Filip, G. Borodi and C. Filip, Phys. Chem. Chem. Phys. DOI, 10.1039/c1cp21878f.
28. J.Laugier,and B.Bochu CHECKCELL, Colaborative Computational Project Number
14 (CCP14). Laboratoire des Materaux et du Genie Physique de l’Ecole Superieur
de Physique de Grenoble, France.
29. T. Steiner and G. Koeller J.Am.Chem. Soc. 116,5122,(1994)
30. W.I.F. David, K.Shankland, J. Van de Streek, E.Pidcock, W.D.S. Motherwell,
J.C.Cole, J.Appl. Cryst.,39, 910, (2006).
31. B.H. Toby, J. Appl. Cryst. 34,210, (1001)
326
IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ
ŞI DE TRANSMISIE
Microscopia electronică
Cuprins
1. Generalităţi ......................................................................................................................... 327

2. Microscopia electronică de transmisie (Transmission Electron Microscopy – TEM) ......... 328
3. Microscopia electronică de baleiaj (Scannig Electron Microscopy – SEM) ........................ 338
1. Generalităţi
Microscoapele sunt instrumente utilizate pentru a facilita observarea
unor obiecte la o mărire mai mare decât cea a obiectului observat. Cel mai
comun microscop este lupa, obiect ce utilizează lentila pentru a focaliza
lumina reflectată de un obiect într-o imagine mai mare.
Microscoapele optice (figura 1) sunt instrumente mai complexe care
conţin un set de lentile care măresc imaginea. Limitările microscopiei optice
constă în rezoluţia obţinută prin această tehnică (aprox. 250 nm). Rezoluţia
este limitată de lungimea de undă a fotonilor utilizaţi ca sursă de iluminare
a specimenului, ceea ce înseamnă că două caracteristici aflate la o distanţă
mai mică de 250 nm nu vor putea fi diferenţiate.
Pentru observarea detaliilor mai mici a fost necesar crearea unui micro-
scop care să utilizeze o sursă de iluminare caracterizată printr-o lungime de
undă mult mai mică. Accelerarea electronilor permite reducerea lungimii de
undă a unui fascicul de electroni ceea ce face posibila vizualizarea detaliilor
cele mai fine. Printre alte surse se numără razele X şi neutronii.
În 1931, fizicianul Ernst Ruska şi inginerul Max Knoll au construit un
microscop electronic prototip. Doi ani mai târziu, Ruska a creat primul mi-
croscop a cărui rezoluţie era superioară unui microscop optic. Compania
Siemens a patentat invenţia celor doi germani, iar în 1939 primul microscop
electronic de transmisie a fost produs în scopuri comerciale.
327
1 – ocular
2 – revolver
3 – obiective
4 – viza macrometrică
5 – viza micrometrică
6 – platina
7 – sursă de lumină
8 - diafragma şi lentila
condensor
Figura 1. Microscopul optic
2. Microscopia electronică de transmisie (Transmission Elec-

tron Microscopy – TEM)
Prin intermediul TEM imaginea observată este proiecţia probei în gro-
simea ei, incluzând suprafaţa şi structurile
interne. Electronii pătrund prin probă,
interacţionează cu aceasta în grosimea ei,
aceştia putând fi deviaţi sau nu. Astfel
obiectele având structură internă diferită
pot fi diferenţiate deoarece proiecţiile
acestora vor fi diferite.
Ca limitare se aminteşte natura bidi-
mensională a proiecţiei rezultate, informa-
ţiile aparţinând axei z se vor pierde. Pro-
bele analizate trebuie să fie foarte subţiri
deoarece ar absorbi o mare parte a fascicu-
lului de electroni.
Organizarea unui microscop electronic
328
Principiile funcţionării unui
croscop electronic de transmite nu
diferă cu mult faţă de cele ale unui
microscop optic. În vârful coloanei
există un emiţător de electroni cu
voltaj înalt care va genera fasciculul
de electroni care va traversa coloana.
Aceşti electroni vor penetra proba şi
vor trece printr-o serie de lentile
magnetice, iar în final vor fi focalizaţi
pe ecranul situat la capătul coloanei.
Pentru a modifica mărirea şi
punctul focal al unei imagini se pot
utiliza diferite lentile. Aperturile de
pe traseul fasciculul de electroni au
rolul de a schimba contrastul şi rezo-
luţia imaginii.
În interiorul coloanei se va stabili
un vid înalt pentru a minimaliza in-
teracţiunile dintre electroni şi molecu-
lele de aer. Figura 2 - Secţiune prin coloana unui TEM
Tunul de electroni
Electronii sunt emişi de un filament supraîncălzit de un curent electric
până când suficientă energie va fi produsă (aprox. 2500K) pentru a învinge
’’the work function’’ a metalului, de obicei tungsten sau hexaborid de
lantaniu. Electronii emişi au o distribuţie Boltzman a energiei şi trebuie să
fie concentraţi pentru ca fasciculul rezultat să străbată coloana, prin probă,
lentile şi aperturi.
Tunul de electroni are mai multe componente: filamentul, circuitul de
interferenţă (biasing circuit), un vârf Wehnelt şi un anod de extracţie. Prin
conectarea filamentului de partea negativă a generatorului de energie, elec-
tronii pot fi pompaţi de către filament spre placa anodică şi coloana micro-
scopului, astfel circuitul fiind complet. Prin construirea unui cilindru
Wehnelt, care este încărcat mult mai negativ decât filamentul în sine, se
asigură convergenţa optimă a electronilor încă din momentul emisiei.
Cele mai comune microscoape sunt cele de emisie termionică si FEG
(Field Emission Guns).
329
Figura 3. Schema unui tun de electroni
Tipuri de tunuri de electroni

Tungsten: filamentul este fabricat din tungsten, iar principiul de funcţi-
onare se aseamănă cu cel al funcţionării unui bec, pe măsură ce filamentul
se încălzeşte electronii vor fi emişi.
Hexaborid de lantaniu: este tot un filament de emisie termionică, dar
are ”the work function” mai mică, de aceea este mai eficient.
FEG: filamentul nu este unul termic. Emisia de electroni este asigurată
de aplicarea unui puternic câmp electric imediat în vecinătatea vârfului
filamentului. Mărimea şi gradul de apropiere a câmpului electric cauzează
desprinderea electronilor de pe filament.
Figura 4. Tipuri de tunuri de electroni: filament de tungsten şi cristal de hexaborid de lantaniu
330
Fasciculul de electroni se caracterizează prin coerenţă.
Coerenţa temporală. Deoarece electronii emişi sunt supraîncălziţi, distri-
buţia energiei nu este sub forma unui singur peak, în schimb distribuţia este
de tip Boltzman şi diferă în funcţie de natura filamentului. În cazul unui mi-
croscop performant se doreşte ca raportul ∆E/E să fie cât mai mic, adică dis-
tribuţia energiei să fie o mică fracţiune din energia medie a electronilor.
Coerenţa spaţială. Se referă la intensitatea fasciculului. Dacă electronii
emişi sunt paraleli atunci fasciculul va fi coerent o mai multă perioadă. Fa-
za electronilor afectează coerenţa fasciculul, ideal toţi electronii emişi ar
trebui să fie în fază. Dacă electronii sunt în fază ei vor interfera constructiv.
Dacă electronii sunt defazaţi, vor interfera distructiv, iar fasciculul va pier-
de din intensitate.
Lentilele
Lentilele utilizate în microscopia electronică sunt bobine magnetice ca-
re au scopul de a focaliza şi direcţiona fasciculul de electroni. Deoarece len-
tilele sunt reglate pentru o anumită lungime de undă acestea vor concentra
electronii cu alte lungimi de undă mai puţin uniforme. Prin urmare în urma
trecerii fasciculului printr-o lentilă acesta va suferi o scindare. Această abe-
raţie cromatică se aseamănă cu scindarea luminii când o rază traversează o
prismă, lumina fiind descompusă în radiaţii cu lungimi de undă diferite. În
cazul prismei lumina este refractată sub diferite unghiuri. În cazul lentilelor
electro-magnetice acestea pot roti fasciculul de electroni dacă sunt ajustate
corespunzător. Când acest fenomen are loc imaginea se va roti pe măsură
ce vor fi introduse în coloană alte lentile. Pentru formarea imaginii se folo-
sesc 3 tipuri de lentile. Lentila obiectiv are rolul de a realiza primul pas de
mărire şi focalizare a unei imagini. Cuplată cu apertura obiectiv va genera
contrastul de amplitudine. Lentila intermediară controlează, prin poziţia şi
puterea ei, mărirea imaginii sau pattern-ul de difracţie. Ultima lentilă –
lentila proiector - focalizează şi proiectează imaginea finală pe suprafaţa
folosită pentru vizualizare.
Aperturile
Aperturile sunt găuri de-a lungul coloanei microscopului care pot limi-
ta mărimea fasciculul de electroni. Funcţia unei aperturi este determinată
de poziţia acesteia în coloana microscopului.
Prima apertură, apertura condensator, este localizată în vecinătatea tu-
nului de electroni şi este utilizată pentru concentrarea electronilor şi menţi-
nerea coerenţei fasciculului.
A doua apertură, apertura obiectiv, este localizată sub probă imediat
după lentila obiectiv. Această apertură controlează contrastul unei imagini.
331
Exteriorul microscopului
Consola utilizatorului constă dintr-un ecran pe care se vor afişa para-
metrii sub care funcţionează microscopul precum: mărirea, valoarea defo-
calizării, voltajul curentului etc.
Pe consolă se mai află butoane care controlează poziţia specimenului în
interiorul coloanei, luminozitatea fasciculului, curentul, alinierea, focaliza-
rea şi mărirea.
Microscoapele electronice de nouă generaţie au interfeţe cu computere-
le ceea ce conferă utilizatorului o mai mare flexibilitate şi control.
În cazul microscopiei electronice de transmisie proba analizată este de-
pusă pe o grilă de metal, iar aceasta într-un holder de metal (fig.5). Acest
holder de metal, prin intermediul goniometrului, va asigura introducerea
probei în vidul din coloana microscopului cu o scădere minimă a presiunii
din interiorul coloanei.
Figura 5 - Holder utilizat în microscopia electronică de transmisie
Dacă se doreşte vizualizarea unei probe sub diferite unghiuri sau reali-
zarea unei tomograme, goniometrul se poate roti pentru a schimba unghiul
probei.
Principii ale formării imaginii

În momentul în care fasciculul trece prin grosimea unui specimen au loc
mai multe fenomene. Dacă electronul nu loveşte un atom din probă acesta va
avea o traiectorie nedeviată până la ecranul care va colecta imaginea.
Dacă electronul intră în contact cu atomi din probă poate suferi o cioc-
nire elastică, nu va pierde din energie, iar legea conservării momentului va
determina unghiul la care acesta a fost deviat de la traiectorie. Acest elec-
tron va conferi o rezoluţie înaltă imaginii.
În cazul unei ciocniri inelastice electronul va ceda o cantitate variabilă
de energie specimenului, astfel când electronul va ajunge la nivelul ecranu-
lui va avea energia diminuată şi un unghi de incidenţă necunoscut. Acest
electron va cauza apariţia zgomotului în imagine.
332
Electronii pot fi deviaţi la unghiuri mai mari de 90°, astfel de electroni
nu sunt folosiţi în microscopia electronică.
Contrastul dintr-o imagine ia naştere în urma interferenţei electronilor
ce au unghiuri diferite. Electronii care vor fi deviaţi de la traiectoria iniţială
în urma interacţiunii cu atomii specimenului vor interfera constructiv sau
distructiv cu fasciculul principal de electroni. Dacă se utilizează o apertură
obiectiv mică electronii care sunt deviaţi sub un unghi mare nu vor contri-
bui la formarea imaginii, iar contrastul este îmbunătăţit. Electronii cu de-
flecţie mare conţin informaţii importante legate de rezoluţie, aceste infor-
maţii fiind pierdute.
Într-un microscop electronic de transmisie electronii trec prin probă
înainte de a impresiona ecranul şi conţin informaţii cu privire la structura
internă a acestei probe. Spre exemplu, dacă privim o sferă goală pe dinăun-
tru sau una plină, proiecţiile acestora vor diferi (figura 6). Sfera solidă va
genera un disc întunecat la interior, intensitatea diminuându-se spre mar-
ginile discului. În cazul sferei goale gradientul va fi în direcţia opusă, mar-
ginea fiind cea mai închisă. Aceste proiecţii diferă deoarece gradul de întu-
necare a unei imagini este direct proporţional cu capacitatea materialului
de a absorbi electronii.
Figura 6. Diferenţa dintre proiecţiile unei sfere solide şi a unei sfere goale în momentul vizualizării
la TEM
Microscoapele electronice pot fi utilizate pentru vizualizarea pat-

tern-urilor de difracţie a probelor. Un pattern de difracţie poate fi colectat
din probe care conţin un motiv care se repetă, de exemplu din cristale bi-
dimensionale. Pattern-ul de difracţie se formează ” in the back focal plane”
al lentilei obiectiv. Lentila intermediară determină vizualizarea imaginii
sau a pattern-ului de difracţie pe ecran.
Colectarea imaginilor se poate face în diverse moduri. Observarea di-
rectă a imaginii de către utilizator are loc la nivelul unui ecran de fosfor.
Pentru a înregistra imaginea se utilizează negative care sunt impresionate
de fasciculul de electroni sau camere CCD (Charge Coupled Device) care
traduc în format digital interacţiunile electronilor cu senzorul camerei.
333
Tehnici de preparare a probelor
Grile
În cazul microscopiei electronice de transmisie specimenele sunt depo-
zitate pe grile. Grilele sunt discuri de metal (cupru, aur, nichel, platină)
având un diametru de 3.05 mm care prezintă o reţea. Ochiurile reţelei pot
avea diferite dimensiuni şi forme (pătrat, hexagon). Pe această grilă se va
depozita un film care va conferi suport specimenului.
Figura 7. Grilă de microscopie electronică, vedere superioară şi secţiune
Filme de suport
Filmul Formvar este un film de natură polimerică (formal de polivinil),
fiind des folosit în microscopia electronică. Substanţa se găseşte sub formă
solidă şi este solubilă în solvenţi organici, cei mai utilizaţi fiind cloroformul
şi dioxanul. Pentru a obţine un film continuu de Formvar o lamă de sticlă
pentru microscopia optică este curăţată şi scufundată uniform în soluţia de
Formvar. Există două metode pentru depozitarea filmului pe grile: una
implică aşezarea grilelor pe suprafaţa filmului flotat pe apă, iar a doua de-
punerea pe grile a filmului flotat.
Filmele de carbon
Probele trebuie depuse pe un film care este foarte stabil sub acţiunea
fasciculului de electroni. Filmele de carbon sunt foarte stabile.
Principiul evaporării carbonului este unul foarte simplu. O foaie de mi-
că este proaspăt clivată, iar noile plăci sunt introduse cu partea proaspăt
clivată în interiorul unei camere în care se va stabili un vid înalt. Deasupra
platoului pe care sunt aşezate cele două foiţe de mică se află un fragment
de sfoară de carbon conectată la un circuit de mare voltaj. Feţele proaspăt
clivate ale micăi sunt perfect plate din punct de vedere atomic ceea ce îm-
bunătăţeşte proprietăţile filmului de carbon. După stabilirea vidului un
334
curent se aplică sforii de carbon până când aceasta devine incandescentă, în
acest moment carbonul se va evapora şi depozita pe mică formând un film
continuu.
Grilele sunt aşezate pe o sită de metal într-un vas plin cu apă. Plăcile de
mică sunt imersate treptat în apă ceea ce permite filmului hidrofob să se des-
prindă. Depozitarea filmului de carbon are loc prin evacuarea vasului de apă.
Carbonul este o substanţă hidrofobă, iar dacă o picătură de apă este depu-
să pe suprafaţa unui astfel de film aceasta va avea tendinţa de a-şi micşora
suprafaţa care întră în contact cu carbonul. Pentru a face filmele mai accesibile
substanţelor aflate în soluţie apoasă carbonul trebuie hidrofilizat. Aceasta se
poate realiza fie prin tratarea cu UV a grilelor sau prin glow discarching.
În cazul glow discharching grilele sunt introduse într-o cameră parţial
evacuată, iar când voltajul este aplicat între anod şi catod potenţialul elec-
tronic ionizează aerul din încăpere. Ionii negativi se vor depozita pe supra-
faţa filmului de carbon.
Microscopia electronică de transmisie utilizează un fascicul de electroni
de înaltă energie pentru a bombarda specimenul. În funcţie de cantitatea de
energie absorbită intensitatea fasciculului care va impresiona ecranul diferă
şi se va forma o imagine. În cazul probelor biologice care sunt formate din
atomi precum carbon, oxigen, azot şi hidrogen, acestea nefiind foarte den-
se, cantitatea de energie absorbită este foarte mică comparativ cu energia
fasciculului. De aceea, pentru o vizualizare mai bună, probele sunt impreg-
nate cu săruri de metale grele. După coloraţie, proba se va usca şi va putea
fi examinată la microscop.
În ultimii ani, datorită descoperirii graphene-ului şi a remarcabilelor
sale proprietăţi se investighează aplicaţia acestui film în microscopia elec-
tronică.
Coloraţia negativă
În cazul microscopiei, contrastul specimenului este prea slab pentru ca
ochiul uman să diferenţieze marginile şi detaliile probei observate. Pentru a
îmbunătăţi contrastul se folosesc diferite tehnici. În cazul microscopiei opti-
ce se aplica contrastul de fază, în cazul acestei tehnici lumina care pene-
trează proba suferă o schimbare a fazei, această nouă rază va interfera cu
fasciculul iniţial şi contrastul se creează.
Alte metode se bazează pe colorarea probelor pentru evidenţierea unor
caracteristici. Coloranţii se bazează fie pe vopsele sau pe materiale foarte
absorbante. Pentru ca o coloraţie să aibă efect trebuie să se lege de preferen-
ţial anumite părţi ale probei.
Coloraţia în cazul microscopiei electronice de transmisie se bazează pe
săruri de metale grele derivate din molibden, uraniu sau tungsten. Ionii de
335
metale grele vor interacţiona cu electronii. Coloraţia cu aceşti atomi grei se
numeşte coloraţie negativă deoarece în microscop se va observa o zona
neacoperită de colorant înconjurată de coloraţia negativă. Zona este neaco-
perită deoarece proba (proteina de exemplu) împiedică depunerea sării pe
filmul de carbon. Contrastul optim se obţine când coloraţia înconjoară
complet specimenul si zonele adiacente.
Tehnica este una simplă: proba este depusă pe grilă şi lăsată câteva zeci
de secunde urmată fiind de ‘’spălarea’’ grilei cu 3 picături de colorant. Ex-
cesul va fi îndepărtat cu ajutorul unei hârtii de filtru, iar după uscare grila
poate fi examinată.
Contrastul apare în urma interacţiunii electronilor cu specimenul. În fi-
gura 8 se observă o proteină colorată negativ, electronii ce vor interacţiona
cu atomii de metale grele vor fi puternic deviaţi, iar apertura obiectiv îi va
elimina pe cei care vor fi deviaţi la un unghi prea mare, ceea ce va determi-
na contrastul şi rezoluţia imaginii.
Figura 8. Interacţiunea dintre un specimen

(coloraţie negativă) şi fasciculul de electroni
Avantaje şi dezavantaje ale coloraţiei negative

Pro Contra
Contrast foarte mare. Colorantul În timpul colorării particulele pot fi
absoarbe electronii mult mai bine distorsionate. În timpul uscării
decât mediul înconjurător, de aceea specimenul îşi pierde învelişul
diferite regiuni ale probei pot avea hidratant. În cazul proteinelor
diferite densităţi de electroni şi pot menţinerea unei stări hidratate este
fi diferenţiate în proiecţiile obţinute. importantă pentru păstrarea
Alterarea datorită radiaţiei este configuraţiei.
irelevantă deoarece sărurile metalice Ca urmare a distribuţiei inegale a
nu sunt la fel de susceptibile la efec- coloraţiei pot să apară artefacte.
tele electronilor precum molecule Rezoluţia este limitată la 20 Å în
organice. condiţii optime. Aceasta corespunde
Pregătirea probei nu necesită apara- cu mărimea granulei sării folosite
tură şi nu ia mult timp (aprox. 4 pentru coloraţia negativă.
minute).
336
Îngheţarea probei – metoda cryo
Microscopia cryo este o tehnică prin care proba este îngheţată într-un
refrigerent pentru o mai bună păstrare şi protecţie în timpul observaţiei.
Îngheţarea se face prin dropping a
unei grile pe care proba este deja de-
pozitată, apa din jurul probei va în-
gheţa, iar proba va fi protejată. Proce-
sul este laborios deoarece plonjarea
grilei în recipientul de etan lichid tre-
buie să fie suficient de rapidă pentru a
împiedica formarea gheţii cubice, cris-
taline care va estompa detaliile speci-
menului.
Azotul lichid are o temperatură
ideală (aprox. -195˚), dar capacitatea
calorică este foarte mică, în momentul
introducerii unei grile aflate la tempe-
ratura camerei fierbe ceea ce favori-
zează formarea gheţii cristaline. De
aceea se preferă utilizarea etanului
lichid.
Pentru a vizualiza proba în
Figura 9. Schemă a instalaţiei utilizate pt. cryo-electronmicroscopie trebuie folo-
îngheţarea probei sită o doză minimă de electroni pen-
tru a evita alterarea probei datorită
radiaţiei. Doza recomandată e de 6-10 electroni/Å2.
Avantaje şi dezavantaje ale cryo-electronmicroscopiei faţă de coloraţia ne-

gativă
Avantaje Dezavantaje
Specimenul este tot timpul în Raportul semnal/zgomot este foarte
soluţie şi nu intră în contact cu mic deoarece absorbţia electronilor e
suprafeţe, prin urmare forma scăzută.
observată este cea reală în stare Înregistrarea imaginilor pentru
nativă. Nu există colorant care să tomografie e dificilă deoarece prin
distorsioneze preparatul. rotire stratul de gheaţă expus este
Proba poate să aibă o orientare prea gros.
preferenţială pe grilă în cazul Pregătirea probelor necesită mult
337
coloraţiei negative, ceea ce se evită timp, iar obţinerea gheţii vitroase
în cazul cryo. poate fi problematică.
Se foloseşte doza minimă de elec-
troni, ceea se asigură prezervarea
probei.
3. Microscopia electronică de baleiaj (Scannig Electron

Microscopy – SEM)
În cazul SEM, specimenele sunt acoperite cu un strat subţire de metal
pentru ca electronii să fie reflectaţi. Acest înveliş metalic asigură o suprafa-
ţă conductoare, astfel se evită încărcarea electrică a probei. Fasciculul de
electroni este concentrat şi utilizat pentru a scana suprafaţa obiectului ob-
servat. Imaginea se formează pe un ecran datorită electronilor care sunt
reflectaţi de învelişul metalic.
Prin intermediul microscopiei electronice de baleiaj se pot observa de-
talii de pe suprafaţa unui specimen, iar informaţiile privitoare la structura
internă lipsesc.
Microscopul electronic scanning (SEM) permite observarea şi caracteri-

zarea materialelor organice şi anorganice heterogene la o scară cuprinsă
între nanometri (nm) şi micrometri (µm). Popularitatea SEM-ului e datorată
capacităţii sale de a obţine imagini aparent tridimensionale ale suprafeţelor
unei game largi de materiale. Imaginile SEM sunt utilizate într-o mare vari-
etate media, de la jurnale ştiinţifice la reviste de popularizare şi filme. Deşi
principala lui utilizare este de a obţine imagini topografice la o mărire cu-
prinsă între de 10-10000 de ori, SEM-ul are o adaptabilitate mare.
338
La SEM, suprafaţa de examinat sau microvolumul de analizat este ira-
diată cu un fascicol îngust de electroni, care poate fi trecut în raster (linie cu
linie) deasupra suprafeţei specimenului pentru a forma mai multe imagini,
sau care poate fi static pentru a obţine analiza unei singure poziţii. Tipurile
de semnale rezultate din interacţiunea fascicolului cu probă includ elec-
troni secundari, electroni reflectaţi, raze X caracteristice şi alţi fotoni cu
energii variate. Aceste semnale se obţin din emisii de volum specifice pro-
bei şi pot fi folosite pentru a examina multe caracteristici ale probei (topo-
grafia, cristalografia, compoziţia etc.).
Semnalele de imagine de cel mai mare interes sunt electronii secundari
şi reflectaţi, pentru că aceştia variază în primul rând datorită diferenţelor
topografice. Emisia de electroni secundari, regăsiţi într-un volum foarte mic
în apropierea zonei de impact a fascicolului, aleasă la diferite valori ale
energiei razei de electroni, permite formarea de imagini la o rezoluţie apro-
piată de cea a mărimii fascicolului de electroni. Aparenţa tridimensională a
imaginii se datorează unei adâncimi mari a câmpului microscopului elec-
tronic, precum şi efectului de umbră dat de contrastul electronilor secun-
dari şi reflectaţi.
La SEM, se emit şi raze X caracteristice, ca şi rezultat al bombardamen-
tului de electroni. Analiza acestor raze emise de către probă poate scoate în
evidenţă atât caracteristici calitative cât şi informaţii cantitative de element,
din regiuni ale unui specimen având mărimea de 1µm în diametru şi 1µm
în adâncime (în condiţii normale de operare). Evoluţia SEM-ului şi capaci-
tăţile specifice ale instrumentelor comerciale moderne se vor discuta în cele
ce urmează.
Capacităţi de imagistică
Microscopul electronic scanning este unul dintre cele mai versatile in-
strumente disponibile pentru examinarea şi analizarea caracteristicilor
microstructurale ale obiectelor solide. Un motiv puternic pentru utilitatea
SEM-ului este rezoluţia mare ce poate fi obţinută când sunt examinate obi-
ecte voluminoase; rezoluţii instrumentale cu ordin de 1-5 nm (10-50 Å) se
folosesc azi ca rutină la instrumente comerciale.
O altă caracteristică importantă a SEM-ului este adâncimea câmpului,
care e cea responsabilă în parte pentru aparenţa tridimensională a imaginii
specimenului. Cu cât e mai mare această adâncime a câmpului cu atât se
furnizează mai multe informaţii despre specimen, această calitate a
SEM-ului fiind cea mai apreciată de către un utilizator. Cele mai multe
micrografii SEM se efectuează la măriri sub 8000 de ori, unde aparatul ope-
339
rează bine în limitele propriilor capacităţi de rezoluţie. În plus, SEM-ul are
capacitatea de a analiza la măriri foarte mici, proprietate foarte utilă în stu-
dii de criminalistică şi nu numai, pentru că imaginea SEM vine cu informa-
ţii adiţionale imaginii obţinute la microscopul optic.
Principalele componente ale SEM-ului sunt sistemele de lentile, tunul,
colectorul de electroni, tubii catodici fotocolectori de raze, şi părţile electro-
nice asociate. Prima lucrare recunoscută ca descriind conceptul de micro-
scop electronic scanning este cea a lui Knoll (1935). A urmat apoi von Ar-
denne (1938) care a construit microscopul electronic scanning de transmisie
(STEM) prin adăugarea unei lentile de baleiere la microscopul electronic de
transmisie (TEM). Atât aspectele teoretice cât şi cele practice ale STEM-ului
au fost explicate în detaliu de către von Ardenne, iar aparatul său includea
multe instrumente care de atunci au devenit standard.
Primul SEM utilizat să examineze specimene dense a fost descris de
Zwokyn şi col. (1942). Autorii au realizat că emisia de electroni secundari
este cea responsabilă pentru contrastul topografic. Colectorul a fost înclinat
pozitiv aproximativ cu 50 V înspre specimen şi al doilea curent acumulat în
el a produs o cădere de tensiune de-a lungul unui rezistor, astfel s-a obţinut
o rezoluţie de aproximativ 50 nm. Dar, prin comparaţie cu performanţele
obţinute atunci cu TEM-ul în continuă perfecţionare, această metodă a fost
considerată neincitantă şi dezvoltarea pe această ramură a stagnat.
În următorii câţiva ani, C. W. Oatley şi studentul său D. Mc.Mullan au
construit primul lor SEM care până în 1952 a atins rezoluţia de 50 nm.
Mc.Mullan a fost urmat de Smith (1956) care a observat că procesarea sem-
nalului ar putea îmbunătăţi micrografiile, şi a introdus amplificarea nelini-
ară a semnalului. De asemenea a îmbunătăţit sistemul de scanare prin in-
troducerea de scanare prin dublă deflecţie, şi a fost primul care a inclus un
stigmator în SEM. (Smith, 1956)
Următorul pas înainte a fost refacerea detectorului secundar de elec-
troni, de către Everhart şi Thornley (1960). Ei au adăugat un scintilator pen-
tru a converti electronii în lumină, care a fost apoi transmisă printr-o ţeavă
de lumină direct pe suprafaţa fotomultiplicatorului. Schimbarea multiplica-
torului de electroni cu mult mai eficientul fotomultiplicator a crescut canti-
tatea semnalului colectat şi a rezultat un mai bun raport semnal-zgomot.
Astfel, mecanisme de contrast mai slab ar putea fi mai bine studiate. Alte
utilizări ale SEM-ului au fost dezvoltate în această perioadă. Spre exemplu,
Oatley şi Everhart au putut observa pentru prima dată contrastul de voltaj,
mai târziu Wells (1959) a făcut primele studii ale efectelor penetrării fasci-
colului cu scopul formării imaginii la SEM, şi primul care a utilizat perechi
340
stereografice pentru a produce imagini tridimensionale la SEM. (Wells,
1960)
Pease a construit un sistem cunoscut ca SEM V, cu trei lentile magneti-
ce, care conţinea şi sistemul detector Everhart-Thornley. Acest aparat a de-
venit primul prototip comercial numit ,,Stereoscan” (Cambridge Scientific
Instruments Mark I). A. D. G. Stewart şi coechipierii de la compania Cam-
bridge Scientific Instrument au finalizat design-ul comercial şi împacheta-
rea produsului (Oatley, 1972). În anii ce au urmat mai mult de 50 000 de
unităţi SEM au fost vândute de către producători din S.U.A., Marea Brita-
nie, Olanda, Japonia, Germania şi Franţa.
De la primul aparat comercial din 1965 s-au făcut numeroase îmbună-
tăţiri, una din ele fiind dezvoltarea surselor de lumină puternică precum
catodul de hexaborid de lantan (LaB6). Cu această sursă o mai mare cantita-
te de electroni au putut fi concentraţi pe o suprafaţă mai mică,
obţinându-se astfel o rezoluţie mai bună. Sursa de emisie de electroni, utili-
zată pentru prima dată la SEM în 1942, s-a dezvoltat în aşa măsură încât
poate fi acum folosită pentru imagini de cea mai înaltă rezoluţie, la nivel de
rutină. Avantajul tunului de emisie este dimensiunea sa mică astfel încât
poate fi obţinută o imagine a unei probe de 1 nm. Această lumină puternică
permite pătrunderea a de 1000 de ori mai mulţi electroni pe cele mai mici
dintre probe, decât filamentele convenţionale de tungsten. Sursele de elec-
troni au nevoie totuşi de vid de ordinul a cel puţin 10-8 Pa pentru a opera
într-un mod de încredere, şi astfel de nevoi cer o atenţie specială tehnologi-
ei de vidare. Cu toate că au crescut costurile şi complexitatea SEM-urilor cu
emisie de curent, aceste microscoape şi-au găsit utilitatea în numeroase
domenii de cercetare şi tehnologie în care rezoluţia înaltă şi energia mică a
sursei sunt importante.
Majoritatea SEM-urilor sunt dotate cu capacitatea de a stoca imagini
digitale, deşi în aparatele mai vechi imaginile încă se mai fac prin fotografi-
erea tubului catodic de raze. Imaginile pot fi observate pe un ecran, printate
sau reţinute pe un CD sau alte unităţi de memorie. Odată stocată în format
digital imaginea poate fi procesată în multe moduri, precum prin amplifi-
care non-lineară, diferenţiere etc. Disponibilitatea unor computere puterni-
ce şi ieftine dotate cu capacitate de stocare mare şi pachete de soft capabile
de o varietate mare de procesări şi funcţii pentru imagini digitale, oferă
microscopistului o mare flexibilitate şi uşurinţă în utilizarea SEM-ului.
Alte avansări în utilizarea SEM-ului includ mecanismele de contrast
precum contrastul prin canalizarea electronilor produs prin variaţii în ori-
entarea cristalografică şi contrast magnetic produs din domenii magnetice
din materiale uniaxiale şi cubice.
341
Printre primele micrografii scanate au fost câteva materiale biologice
precum carcasa unor insecte sau fibre lemnoase, care au fost suficient de
puternice pentru a rezista procesului de vidare fără să se deformeze (Smith
şi Oatley, 1955). Mai târziu Thornley a prezentat imagini SEM ale materia-
lelor uscate prin îngheţare şi analizate la 1 keV pentru a evita încărcarea
electrostatică. Totuşi, dezvoltările în domeniul biologic au depins de avan-
sarea în prepararea specimenului. Majoritatea materialelor biologice sunt
umede, sensibile la radiaţii, termolabile, de contrast mic şi emisivitate de
electroni slabă şi sunt, aşadar, slabi conductori. S-a dat multă atenţie la sta-
bilizarea materialelor organice delicate, îndepărtării sau imobilizării fluide-
lor celulare, şi acoperirii lor cu un strat subţire de material conductor. Dez-
voltarea procesărilor la temperaturi scăzute a ajutat la reducerea pierderii
de masă şi a distrugerilor termice la specimenele sensibile (Echlin, 1992).
Una dintre cele mai importante descoperiri recente este microscopul
electronic scanning cu presiune variabilă (VPSEM). Acest tip de aparat
permite examinarea suprafeţelor a aproape oricărui tip de specimen, uscat
sau umed, pentru că mediul înconjurător specimenului nu mai este nevoie
să fie la vid înalt (Danilatos, 1991, 1993). Mediul poate fi alcătuit din vapori
de apă sau alte gaze în intervalul de 25-2500 Pa (0,2- 20 torri). Un sistem
diferenţial de pompare a vidului este folosit pentru a menţine tunul de elec-
troni la vid înalt în timp ce specimenul este sub o presiune mai mare. În
formatul său modern, VPSEM-ul poate detecta electroni secundari şi
retroîmprăştiaţi la fel de bine precum razele X. Probele biologice sunt ideale
pentru studiul la acest aparat. În plus, se pot efectua experimente în aparat
în care suprafaţa specimenului poate interacţiona cu atmosfera gazoasă.
Dimensiunea mare a adâncimii câmpului întâlnită la SEM face posibilă
observarea tridimensională a obiectelor utilizând stereoscopia. Imaginile
tridimensionale permit interpretarea corectă a caracteristicilor morfologice
şi măsurarea lor. Au apărut echipamente care permit evaluarea cantitativă
a suprafeţei şi urmărirea în timp real şi de înaltă rezoluţie a specimenului
prin intermediul SEM-ului.
Analiza structurală
Una din cele mai promiţătoare dezvoltări din domeniul SEM-ului este
abilitatea de a determina structura cristalină şi orientarea lor pe suprafaţa
specimenelor preparate. Această capacitate se foloseşte de difracţia electro-
nilor reflectaţi de pe suprafaţa specimenului (Schwartz şi col., 2000), şi este
cunoscută sub numele de difracţie electrono-reflectată (EBSD). Pentru a
colecta maximum de intensitate în modelul de difracţie, suprafaţa specime-
342
nului este dintr-o dată răsucită la un unghi de 70º faţă de orizontală. Inten-
sitatea modelului reflectat Kikuchi este relativ mică, precum şi contrastul
semnalului, de aceea e nevoie de camere ultrasensibile şi senzori fini de
captare a contrastului. Cea mai recentă descoperire în aplicaţia modelului
Kikuchi la volume de analizat este dezvoltarea sistemului de înregistrare a
modelului folosind o cameră video de înaltă sensibilitate sau mai recent o
cameră video tensio-cuplată (CCD). Aceste pattern-uri sunt mai apoi anali-
zate printr-o metodă de indexare asistată de computer. Indexarea automată
a modelelor şi cartarea orientării straturilor de cristale asistată electronic
permite identificarea fazelor de cristalizare şi arată orientarea greşită prin-
tre limitele cristalelor.
Analiza elementală
SEM-ul poate fi utilizat pentru a obţine informaţii legate de compoziţie
folosind razele X caracteristice. Dezvoltarea unui instrument de analiza
chimică localizată a probelor solide (EPMA) s-a produs deodată cu apariţia
SEM-ului.
Conceptul unui microanalizator electronic de probe a apărut în anii
1940 (Hillier, 1947), şi de abia în 1949 R. Castaing sub îndrumarea lui
A.Guinier au descris şi construit un instrument numit ,,microsondă elec-
tronica”(Castaing, 1951). În teza sa de doctorat, Castaing nu numai că a
demonstrat că o analiză chimică localizată poate fi desfăşurată pe suprafaţa
specimenului, dar a şi subliniat modul în care această informaţie poate fi
cuantificată. Recunoaşterea complexităţii transformării intensităţii razelor X
în compoziţie chimică a dus la perfecţionarea analizei cantitative de către
numeroşi investigatori pe parcursul ultimilor 50 de ani.
În timpul anilor 1950 câteva aparate EPMA au fost dezvoltate în labora-
toare din Europa şi S.U.A., iar primul aparat comercial a fost introdus de
CAMECA în Franţa în 1956. Optica electronică era formată dintr-un tun
electronic urmat de lentile convergente ce formau o sondă electronică cu un
diametru de 0,1- 1 µm pe specimen. De asemenea mai făcea parte din apa-
rat şi un microscop optic pentru găsirea corectă a punctului de analiză şi
una sau mai multe spectrometre WDS pentru analizarea intensităţii radiaţi-
ei X emise în funcţie de energie.
Cosslett şi Duncumb (1956) au construit primul microanalizor electro-
nic scanning de probe la Laboratoarele Cavendish în Cambridge. Dacă pâ-
nă atunci microprobele electronice operau cu fascicole statice de electroni,
cei doi oameni de ştiinţă treceau fascicolul brusc pe suprafaţa probei, aşa
cum se face azi în SEM-rile actuale. Deşi conceptul de analiză locală cu raze
X este în sine un stimulent pentru folosirea microanalizatorului, adăugarea
343
conceptului de scanare a fost o contribuţie foarte semnificativă. SEM-ul şi
EPMA-ul au fost considerate aparate separate pentru încă un deceniu, dar
azi EPMA-ul este considerat a fi un echipament aparţinând SEM-ului,
având şi lentile optice şi una şi mai multe unităţi WDS.
Adăugarea unui spectrometru EDS la microanalizorul electronic pentru
a măsura razele X a atras atenţia asupra nevoii utilizării lui şi în cadrul
SEM-ului (Fitzgerald şi col.,1968). Detectorii de raze X se bazau pe o formă
solidă de silicon derivat de litiu [Si (Li)]. Spectrometrele dispersive de
energie moderne sunt capabile de detectarea razelor X caracteristice ale
tuturor elementelor cu număr atomic mai mare decât 4, la curenţi tipici
utilizaţi la imagistica electronică secundară a SEM-ului. Marea majoritate a
SEM-urilor vândute azi sunt echipate cu capacităţi EDS. Sistemul EDS oferă
o modalitate rapidă de analiză a elementelor constituente în probă. În plus,
pe lângă analiza calitativă rapidă, prin spectrometrie EDS de raze X se mai
poate realiza şi o analiză cantitativă foarte fină. Într-un SEM tipic echipat cu
detectori EDS şi WDS, EDS-ul e utilizat pentru a analiza razele X caracteris-
tice elementelor majore (>10 wt%), pe când WDS-ul este utilizat pentru
detecta razele X ale elementelor minore (<10 wt%) sau chiar pentru a le
recunoaşte în probă. După ce pentru mulţi ani principalele linii de concen-
trare au fost în direcţia dezvoltării tehnologiilor existente, câteva descope-
riri recente au dat noi tendinţe în conceptele de detectori şi design. Câteva
dintre acestea cuprind microcalorimetria în raze X, detectorii din derivaţi
de silicon, şi utilizarea de spectrometre de cristale plate împreună cu optică
capilară X-ray, toate găsind o tot mai mare utilizare în cadrul SEM-ului.
Un EPMA modern are în mod normal capacităţile unui SEM, două sau
mai multe spectrometre de lungime de undă (WDS), un microscop optic
pentru observarea suprafeţei specimenului şi un fascicol de curent de elec-
troni care se stabilizează prin analiza de raze X. Proba este analizată fără a
fi afectată şi analiza cantitativă poate fi obţinută la o rezoluţie spaţială de 1
µm pe probă. Pentru probe plate şlefuite, printr-o analiză normală cu fasci-
colul de electroni se obţine o acurateţe de 1-2% (5-10% la probele biologice)
din cantitatea respectivului element prezent.
O altă însuşire importantă a SEM-ului cu EDS şi WDS este capacitatea
de cartare compoziţională folosind raze X caracteristice. Atracţia acestei
forme de acumulare a informaţiei este detaliul microcompoziţional ce poate
fi corelat cu metalografia optică şi electronică.
În anii ce au urmat de la prima apariţie a EPMA-ului, s-au făcut nume-
roase îmbunătăţiri, printre care o descoperire a fost de mare importanţă:
difracţia cristalelor din moleculele organice cu spaţieri mari interplanare
344
(Henke, 1965). Aceste cristale eliberează raze X cu lungime mare de undă
din elementele cu număr atomic mic (B, C, N, O) ce pot fi măsurate de spec-
trometre dispersive de lungime de undă. Recent au fost dezvoltaţi
difractori mari de spaţii interplanare ce utilizează depunerea fizică alterna-
tivă de straturi de vapori de elemente grele şi uşoare. Capacitatea de a de-
tecta elemente cu număr atomic mic le dă utilizatorilor de EPMA posibilita-
tea de a investiga numeroase noi probleme ale aparatului.
În ultima vreme, aparatele au fost construite să permită posibilitatea
unei analize de încredere cu fascicol de electroni si raze X de energie mică.
Avantajul energiei mici a fascicolului de electroni este că apare posibilitatea
minimizării dimensiunii sursei de raze X şi a minimizării efectului de ab-
sorbţie în procedura cantitativă. Efectele de suprafaţă pot fi mai uşor de
măsurat, deşi intervine problema contaminării cu carbon din cauza
vacumizării slabe a SEM-ului.
Microanaliza în raze X a materialelor biologice şi polimerice întâlneşte
aceiaşi problemă în examinarea probelor la SEM, în plus preparatorul tre-
buie să fie foarte atent ca elementele pentru măsurat să rămână în cadrul
punctului de analiză şi să nu se îndepărteze sau să dispară pe parcursul
preparării. Deşi prepararea specimenului biologic este mult mai exactă de-
cât procedura pentru alte ştiinţe, metodele cantitative sunt în principiu
simple. Ele se bazează pe analiza unor secţiuni subţiri, în care efectele ab-
sorbţiei şi de fluorescenţă sunt neglijabile. Totuşi materialele biologice sunt
mult prea uşor afectate de fascicolul de electroni şi astfel că în deceniile
trecute s-a depus mult efort în instrumentare precum şi în procedurile pre-
parative şi analitice cum sunt analiza la temperatură scăzută.
După ce s-a observat capacitatea de măsurare a razelor X care poate fi
extinsă şi la specimene nonmetalice, a apărut ipoteza folosirii şi altor tipuri
de fenomene de excitaţie. De exemplu, culoarea luminii vizibile
(catodluminiscenţa), produsă din interacţiunea electronilor cu specimenul a
fost asociată cu prezenţa unor impurităţi în material (Long şi Agrell, 1965).
În plus, se mai poate studia şi emisia de fotoni vizibili din recombinarea
excesului de perechi de goluri de electroni dintr-un semiconductor (Kyser
şi Wittry, 1966). Măsurarea catoluminiscenţei a devenit azi o parte impor-
tantă a SEM-ului mai ales în industria microelectronicelor.
Utilizarea tot mai intensă a computerului împreună cu SEM-ul a cres-
cut calitatea şi cantitatea de informaţii adunate prin intermediul aparatului.
S-au creat programe care pot să convertească raportul intensităţii razelor X
în compoziţii chimice, în primul rând datorită faptului că unii parametri de
corecţie sunt funcţie de concentraţie şi, prin urmare, fac aproximările succe-
345
sive necesare. Aceste programe derulează calcularea compoziţiei în câteva
secunde şi astfel operatorul se bucură de mai multă flexibilitate în obţinerea
rezultatelor. În plus programele pot acum să controleze fascicolul de elec-
troni, mişcarea specimenului, şi spectrometrele. Automatizarea e de mare
ajutor în operaţiunile repetitive, creşte numărul analizelor efectuate, şi îi
permite operatorului să se concentreze pe evaluarea analizelor.
Dezvoltarea cartării compoziţiei cantitative este un alt punct forte în le-
gătura dintre imagistică, capacitatea de analiză cantitativă a elementelor şi
utilizarea automatizată computaţională a SEM-ului. Se face câte o analiză
completă executată de calculator, la cartarea cantitativă de compoziţie, pen-
tru fiecare rază discretă din suprafaţa scanată. Valorile concentraţiilor co-
respunzătoare poziţiei razelor pe specimen sunt asamblate într-o imagine
digitală cu un procesor de imagini prin codificarea axelor concentraţiei cu
nuanţa de gri corespunzătoare. Imaginile rezultate sunt hărţi compoziţio-
nale şi au la fiecare element constitutiv (pixel) valoare numerică completă a
concentraţiei. În acest fel analistul poate să revadă analizele corespunzătoa-
re fiecărui pixel sau şir de pixeli, iar hărţile pot fi corelate cu imagini SEM
preparate prin oricare alt fel de semnal.
346
Microscopia electronică
- partea a II-a
Cuprins
1. Microscopia electronică de transmisie................................................................................. 349

2. Microscopia electronică de baleiaj ....................................................................................... 359
Din păcate, problemele preparării probelor biologice au rămas mult în

urma îmbunătăţirilor aduse performanţelor microscoapelor electronice.
Dezvoltarea unui microscop electronic de baleiaj şi transmisie (STEM) de
înaltă rezoluţie (0,2 nm) a permis vizualizarea unui singur atom de metal
greu, performanţă uşor de atins acum pentru materiale anorganice, în timp
ce detaliile probelor biologice, în general, nu sunt mai bune de 1,5 – 2,0 nm.
Depăşirea barierei de 1,5 nm pentru specimenele biologice s-ar putea
realiza prin utilizarea acestui STEM, ce oferă un contrast superior şi mai
multe tipuri de informaţii simultan sau prin utilizarea câmpului întunecat
într-un TEM convenţional, eliminându-se astfel nevoia contrastării.
O imagine electronomicroscopică este diferită de situaţia reală din or-
ganismul viu, gradul alterării probei depinzând foarte mult de tehnica de
pregătire a materialului biologic. Plaja efectelor induse de diferitele trata-
mente premergătoare analizei electronomicroscopice este foarte largă, iar
înţelegerea acestora este esenţială pentru extrapolarea detaliilor oferite de
microscop la situaţia existentă in vivo. Atâta vreme cât artefactele inevitabi-
le sunt interpretabile, acestea sunt acceptate, fiind necesară, deci, luarea în
calcul a tratamentelor la care este supusă proba până la ajungerea în faza
de examinare, răspunzătoare de acurateţea interpretării imaginilor.
Pe lângă metodele clasice de contrastare a probelor biologice, absolut
necesare pentru obţinerea unor imagini utilizabile, coloraţia negativă este
cea mai utilizată metodă pentru vizualizarea topografiei şi structurii bacte-
riilor, virusurilor, organitelor celulare izolate (inclusiv membrane) şi ma-
cromoleculelor, fiind una din cele mai uşoare şi mai rapide proceduri pen-
tru detectarea virusurilor.
Când microscopia imunoelectronică este folosită în conjuncţie cu colo-
raţia negativă, virusuri cu ultrastructuri similare pot fi diferenţiaţi cu sensi-
bilitate mare, iar marcarea antigenilor de suprafaţă se poate realiza cu uşu-
347
rinţă prin colorarea imunonegativă. Marcarea imunogold în combinaţie cu
coloraţia negativă au un potenţial considerabil în detectarea virusurilor,
antigenilor virali şi a anticorpilor. Un marker de aur coloidal este util, în
special, pentru detecţia virusurilor foarte mici, picornavirus şi parvovirus,
precum şi în cazul nivelelor scăzute de virusuri.
Coloraţia negativă a probelor deshidratate prin îngheţare ar putea evi-
denţia ultrastructura virusurilor şi a membranelor fără colapsul specimenu-
lui. O altă abordare este utilizarea coloraţiei negative în combinaţie cu vitri-
ficarea pentru realizarea unui contrast crescut, pe lângă beneficiile
crioprotecţiei. De asemenea, crioelectron - microscopia probelor colorate
negativ este o metodă importantă pentru investigarea structurii tridimensi-
onale a proteinelor cristalizate.
Criotehnicile, ce includ răcirea ultrarapidă a celulelor şi ţesuturilor,
sunt o alternativă la fixarea chimică, scopul acestora fiind de a stabiliza
ultrastructura celulei aşa cum există in vivo, deşi, şi aici există pericolul
producerii de artefacte în intervalul de temperatură dintre cea fiziologică şi
cea de imobilizare, vitrificarea nefiind uşor de realizat.
Fixarea pieselor de dimensiuni mari prin metode convenţionale prezin-
tă un gradient de calitate a fixării, astfel, straturile superficiale pot fi
suprafixate, în timp ce cele din zona profundă vor fi subfixate. În plus, arte-
factele dependente de timp, cum ar fi contractarea sau umflarea probelor şi
extracţia componentelor celulare datorate difuziei lente a fixatorilor, apar
destul de des.
Unele din acestea pot fi evitate prin fixarea cu aldehide într-un cuptor
cu microunde. Microundele sunt unde electromagnetice generate, obişnuit,
cu o frecvenţă de 2,45 GHz (1 GHz = 109 cicluri / sec) şi prezentând o lun-
gime de undă de 12,4 cm, oscilaţia dielectrică a moleculelor de apă şi o
energie a fotonului de 10-5 eV, energie prea mică pentru a afecta legăturile
covalente, dar suficientă pentru a interacţiona cu cele necovalente cum sunt
legăturile sterice (legături de H şi interacţiuni van der Waals), esenţiale
funcţiilor biologice. Undele electromagnetice sunt radiaţii neionizante ce
produc deplasări moleculare prin migrarea ionilor şi rotirea moleculelor
dipolare.
Dintre avantajele fixării cu căldura microundelor menţionăm: capilare-
le pulmonare interstiţiale nu colapsează cum se întâmplă în cazul fixării cu
formaldehidă, cromatina este mult mai distinctă în ţesuturile tumorale, iar
ca dezavantaje: deteriorarea eritrocitelor din ţesuturile nefixate, chiar la
370C, dilatarea excesivă a secţiunilor anumitor ţesuturi (limfoid).
Cea mai bună soluţie rămâne combinarea celor două metode, respectiv,
fixarea cu glutaraldehidă într-un cuptor cu microunde.
348
1. Microscopia electronică de transmisie
Principalele etape de a căror acurateţe depinde foarte mult obţinerea
unor informaţii cât mai apropiate de situaţia reală din celula vie, sunt ur-
mătoarele: recoltarea, fixarea, deshidratarea, includerea, încapsularea, mo-
delarea, secţionarea, contrastarea, examinarea şi developarea suporturilor
fotografice.
RECOLTAREA
Recoltarea fragmentelor de ţesut trebuie efectuată foarte rapid (1-2
min) după sacrificarea animalelor pentru a se împiedica instalarea unor
alterări morfo-funcţionale la nivelul ţesutului. Pentru menţinerea neschim-
bată a ultrastructurii – deci păstrarea ei identică cu cea din momentul sacri-
ficării animalului, fragmentele recoltate la rece (pe gheaţă), se trec rapid pe
glutaraldehidă 2,7-3% (primul agent fixator). Este indicată pipetarea soluţi-
ei de glutaraldehidă peste organul ce urmează a fi recoltat, înainte de pre-
levarea acestuia din organismul animal.
Din fragmentele aflate pe glutaraldehidă se taie foarte repede cuburi
mici, cu latura de maxim 1 mm. Dimensiuni mai mari nu ar permite pene-
trarea pieselor de către tetraoxidul de osmiu, principalul agent de fixare
utilizat în microscopia electronică de transmisie. Acesta nu fixează cores-
punzător la o profunzime mai mare de 0,5 mm. Se prelevează fragmente
suficiente pentru prepararea a câte 3 blocuri/probă (adică cel puţin 6 cu-
buri). Pentru decuparea cuburilor se recomandă folosirea a două lame de
ras noi, acţionate în sens contrar pentru a se evita lezarea mecanică (zdrobi-
rea/sfâşierea) ţesutului.
FIXAREA
Procesul de fixare asigură stabilizarea structurii biologice cât mai
aproape de starea nativă, cu ajutorul unor agenţi capabili să creeze legături
încrucişate între moleculele constitutive ale materialului prelucrat,
nepermiţându-se deteriorarea arhitectonicii ultrastructurale. Începând cu
această etapă, toate celelalte operaţii, până la secţionare, se vor desfăşura
sub nişă, datorită toxicităţii mari a reactivilor cu care se lucrează. Se reali-
zează o fixare chimică a pieselor, cu doi agenţi fixatori la 4ºC.
A. Prefixarea
Prefixarea se efectuează cu o soluţie de glutaraldehidă 2-6% (2,7%) în
Tampon fosfat 0,1 M. Rezultate foarte bune se obţin dacă, înainte de recol-
tare, se pipetează soluţia de glutaraldehidă pe suprafaţa organului de inte-
349
res. Există, de asemenea, posibilitatea perfuziei ţesuturilor cu fixator, res-
pectiv introducerea fixatorului în circulaţie, asigurându-se astfel o răspân-
dire rapidă a acestuia la nivelul ţesuturilor. Glutaraldehida este primul
fixator utilizat curent, deoarece este mai puţin toxic, permite o mai uşoară
manipulare a preparatului, pătrunde mai uşor şi acţionează rapid asupra
ultrastructurii preparatului.
După obţinerea cuburilor de ţesut, acestea sunt trecute în tuburi de sti-
clă şi păstrate timp de 15-30 minute în 1-1,5 ml glutaraldehidă. După 15-30
minute se schimbă glutaraldehida şi se continuă fixarea timp de încă 1-2-3
ore în funcţie de consistenţa ţesutului.
Glutaraldehida [O=CH-(CH2)3-CH=O] are proprietatea de a lega gru-
pările active de hidrogen, în special de la alcooli şi grupările amino- (din
moleculele proteice) şi imino-, formând punţi încrucişate şi punţi intermo-
leculare, conferind astfel o mare stabilitate structurilor celulare cu care vine
în contact. Prin urmare va prezerva foarte bine ultrastructura celulară şi
activitatea enzimatică a celulelor.
Glutaraldehida pură prezintă un singur vârf de absorbţie în UV, la 280
nm. Dacă este ţinută la temperatura camerei, în soluţie apar polimeri ai
glutaraldehidei, care vor avea un nou vârf de absorbţie la 235 nm. Deci
glutaraldehida 25% (sau 50%) stoc se va păstra numai la frigider, prepara-
rea soluţiei 2,7% se va face extemporaneu, iar fixarea se va face la 4ºC.
Tuburile de sticlă cu care se lucrează vor fi foarte curate (bine spălate
cu detergent şi amestec sulfocromic, urmate de spălare abundentă cu apă
distilată). Ele se acoperă cu dop (de cauciuc rezistent) – care nu se va fărâ-
miţa sub acţiunea substanţelor ce se vor folosi. Glutaraldehida se utilizează
în soluţie apoasă 2,7% preparată extemporaneu după reţeta:
- Glutaraldehidă (25%) pentru microscopie electronică 2 ml

- Tampon fosfat 0,1 M pH 7,4 10 ml
- Apă distilată 4,2 ml
Tamponul fosfat 0,1 M se prepară după reţeta:
- NaH2PO4 · H2O 1,37 g

(NaH2PO4 · 2H2O) (1,56 g)
- Na2HPO4 anhidru 7,154 g
(Na2HPO4 · 12H2O) (18,036 g)
- apă distilată Până la 500 ml
350
B. Spălarea
După prefixare, este foarte important a se înlătura prin spălare orice
urmă de glutaraldehidă, ale cărei reziduuri vor împiedica legarea osmiului.
Prin reacţia posibilă între cele două substanţe fixatoare aplicate succesiv,
poate rezulta un precipitat electron-dens care dăunează calităţii preparatu-
lui. În plus, dacă urmele de aldehide nu sunt eliminate din ţesut, la
post-fixare lipidele din membrane nu se vor fixa bine cu OsO4.
După îndepărtarea glutaraldehidei se adaugă peste piese (care nu vor
rămâne niciodată neacoperite) tampon fosfat 0,1 M, pH 7,4 în 4 băi succesive
a câte o oră (în a patra baie piesele se pot ţine peste noapte). Dacă prefixa-
rea s-a făcut la frigider, şi spălarea se va face în aceleaşi condiţii.
C. Postfixarea
Postfixarea se realizează cu tetraoxid de osmiu (OsO4) 1-4% în funcţie de
consistenţa ţesutului de studiat. Rolul acidului osmic este de a stabiliza atât
proteinele cât şi bistraturile lipidice, dar şi de a mări contrastul la nivelul
ultrastructurii ţesutului, pe care o colorează prin depunerea osmiului. Du-
pă înlăturarea tamponului fosfat, în tuburile cu piesele prefixate şi spălate
se adaugă cel de-al doilea agent fixator, şi anume, o soluţie 1% (sau 2%) de
OsO4 în Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, pentru 15 minute. Se înlătură aceas-
tă soluţie, se adaugă o soluţie proaspătă de OsO4 în care piesele vor mai sta
timp de 85 minute.
Tamponul fosfat 0,15 M se prepară după reţeta:

- NaH2PO4 · H2O (NaH2PO4 · 2H2O) 2,064 g (2,366 g)
- Na2HPO4 anhidru (Na2HPO4 · 12H2O) 10,765 g (27,139 g)
- apă distilată Până la 500 ml
OsO4 2% se prepară astfel: 1 g OsO4 se trece într-o sticlă foarte curată,

cu dop rodat, conţinând 50 ml tampon fosfat 0,15 M pH 7,4. Se închide sti-
cla şi se agită puternic până la spargerea fiolei, după care se lasă 24 ore la
4ºC pentru dizolvarea completă. Se va evita contactul soluţiei cu obiecte
metalice, iar trecerea soluţiei în alte flacoane se va face numai prin răstur-
nare. Culoarea unei soluţii proaspete de OsO4 este galben pal. Prin proce-
dura de fixare menţionată se urmăreşte stoparea proceselor metabolice din
ţesturi, prezervarea structurii fine a celulelor şi stabilizarea acestora pentru
a face posibile etapele ulterioare de preparare în scopul vizualizării în mi-
croscopul electronic de transmisie. Există cazuri când fixarea a fost prelun-
gită peste noapte pentru fiecare fixator.
351
D. Spălarea
După terminarea procesului de fixare pe cale chimică trebuie să urme-
ze imediat spălarea pentru înlăturarea totală a excesului de fixator din ţe-
sut. În cazul fixărilor succesive duble, spălarea trebuie efectuată după fieca-
re fixator folosit. Prezenţa urmelor de fixator în ţesut facilitează reacţii între
acesta şi soluţiile de solvenţi organici folosite la deshidratare, cu urmări
asupra polimerizării blocurilor la includere. După îndepărtarea
tetraoxidului de osmiu se adaugă peste piese (care nu vor rămâne niciodată
neacoperite) Tampon Fosfat 0,15 M, pH 7,4, în 4 băi succesive de câte o oră
(în a patra baie piesele se pot ţine peste noapte). Dacă fixarea s-a făcut la
frigider, şi spălarea se va face în aceleaşi condiţii.
DESHIDRATAREA
În vederea includerii pieselor (pentru a se putea efectua secţiunile
ultrafine) se utilizează răşini epoxidice: Vestopal W sau Epon 812 care sunt
substanţe organice hidrofobe. Deci, pentru o cât mai bună includere, este
necesar ca toată apa introdusă în timpul spălării în piese să fie extrasă fără
a produce modificări în structura moleculară a celulelor.
Pentru deshidratare se utilizează acetona (pentru epon se poate folosi şi
alcoolul etilic) şi în unele cazuri oxidul de propilen, dioxan sau toluol în
etapele finale, în soluţii apoase de concentraţii crescătoare:
30% timp de 15 minute;
100% (anhidră) timp de 15 minute;
La includerea în Epon 812 pot urma două băi de oxid de propilen de

câte 15 minute fiecare. Extragerea apei se face treptat şi în timpi scurţi pen-
tru ca procesul să nu fie însoţit de alterări structurale (eventuale extracţii de
proteine din ţesut). Până la concentraţia de 70% se lucrează la temperatura
de 4ºC după care tuburile vor putea fi păstrate la temperatura camerei.
Cantitatea de soluţie folosită pentru fiecare etapă de deshidratare trebuie să
fie de 2-5 ml în funcţie de numărul pieselor din fiecare flacon. Când se
ajunge la etapele finale, înlocuirea solventului trebuie făcută foarte rapid,
deoarece alcoolul sau acetona se evaporă uşor şi piesele pot suferi procese
352
de strângere, urmate de modificări nedorite. Este recomandabil ca alcoolul
sau acetona folosite în ultimele băi să fie anhidre, ceea ce se poate realiza
introducând în vase o cantitate oarecare de sulfat de sodiu anhidru.
Între soluţiile de deshidratare şi cele de includere este bine să se inter-
caleze câteva băi cu solvenţi de tranziţie. În cazul includerii cu răşini
epoxidice, cel mai bun intermediar este oxidul de propilen care acţionează
ca deshidratant şi fixator şi, fiind foarte fluid şi miscibil cu aceste răşini,
asigură o foarte bună infiltrare a ţesuturilor. În cazul cercetărilor de locali-
zare enzimatică, acest solvent trebuie evitat deoarece inhibă unele enzime.
Tot ca intermediar este recomandat xilolul sau toluolul, fiind mai volatil. În
paralel cu deshidratarea se prepară soluţie de Vestopal sau Epon pentru
includere.
INCLUDEREA
Obţinerea secţiunilor ultrafine care, prin grosimea lor redusă să permi-
tă transmisia electronilor şi deci obţinerea imaginilor în TEM este condiţio-
nată de includerea pieselor într-un mediu suficient de dur care să faciliteze
secţionarea pieselor, dar care, prin infiltrarea în ţesut, să nu altereze struc-
turile. Specimenele sunt infiltrate în toată masa lor cu materialul de inclu-
dere, care înlocuieşte substanţa în care se efectuează deshidratarea, respec-
tiv acetona (sau dacă este cazul – alcoolul etilic).
Din categoria mediilor de includere hidrofobe fac parte cele pe bază de
metacrilat, răşini poliesterice şi unele răşini epoxidice. Există şi medii de
includere hidrofile, care nu necesită deshidratarea pieselor după fixare şi
spălare. Din această categorie pot fi amintite: durcupanul, gli-
col-metacrilatul sau aquonul.
Dintre răşinile poliesterice, cel mai frecvent utilizat este Vestopalul W;
din aceeaşi clasă mai fac parte lacul poliesteric ME 6611, rigolacul, selectro-
nul etc.
Dintre răşinile epoxidice se pot enumera: Araldita, Eponul 812,
Maraglas 655 – DER 732, DER 332 – DER 732, Epon 812 –Araldită, etc.
Pentru includera în Vestopal sau Epon piesele sunt ţinute câte 1 oră în
soluţii de Vestopal (Epon)/acetonă (anhidră) în concentraţii crescătoare:
1:2; 1:1; 2:1; 3:1 şi în Vestopal (Epon) pur, fără dop, peste noapte. Toate ope-
raţiile de includere şi încapsulare se desfăşoară în nişă.
A. Vestopal W
Vestopalul W este o răşină poliesterică – un copolimer format dintr-un
poliester nesaturat şi stiren, prepolimerizaţi împreună până la starea unui
353
sirop consistent, uşor gălbui. Fiind parţial polimerizat, nu produce procese
de strângere a ţesuturilor. Vestopalul W nu este miscibil cu alcoolul, şi pen-
tru deshidratare trebuie să se folosească acetona, stirenul, dioxanul sau
chiar glicometacrilatul. Pentru includere şi încapsulare, se prepară
vestopalul astfel: se adaugă în puţin Vestopal peroxidul de benzoil (iniţia-
tor al polimerizării Vestopalului) pentru predizolvare şi se amestecă foarte
bine cu o baghetă de sticlă; se adaugă Vestopal în cantitate de 1 g/bloc, se
omogenizează din nou foarte bine şi se adaugă 8 picături de activator (la 3
probe) (octoat de cobalt) cu o pipetă la care 1 ml corespunde pentru 20 de
picături.
Atât răşinile cât şi iniţiatorul şi activatorul se pot păstra la rece. În timp
ce răşina poate fi păstrată câteva luni la rece, iniţiatorul şi activatorul, chiar
la rece, îşi pierd activitatea în decurs de o lună. De aceea, aceştia din urmă
trebuie reînnoiţi în fiecare lună, altfel blocurile vor fi moi şi de slabă calita-
te. Cel care expiră mai repede este activatorul, care îşi schimbă culoarea.
Blocurile se pot secţiona uşor cu cuţitul de sticlă. Secţiunile sunt rezistente
la fasciculul de electroni, se pot monta pe grile fără pelicule suport şi per-
mit obţinerea unei înalte rezoluţii.
Pentru 3 probe (15 blocuri) reţeta de preparare a Vestopalului este ur-
mătoarea:
- Vestopal W 15 g
- Peroxid de benzoil 150 mg
- Octoat de cobalt preparat astfel:
8 picături (0,4 ml)
1 ml α-metil stiren + 7 picături de octoat de cobalt
Peroxidul de benzoil se activează în prealabil prin recristalizarea din

cloroform. Substanţa activată se depune sub formă de cristale incolore pe
pereţii vasului respectiv, cristale care se răzuiesc şi se mărunţesc, după care
se pun în tuburi. În timpul lucrului se va avea grijă să nu se amestece direct
iniţiatorul cu activatorul, deoarece amestecul este exploziv.
B. Epon 812
Eponul 812 este o răşină epoxi-alifatică pe bază de glicerol, obţinută
prin condensarea epiclorohidrinei cu glicerol. Ca amestec de includere,
pătrunde repede în ţesuturi, duritatea blocurilor poate fi modificată după
dorinţă, se secţionează uşor cu cuţitul de sticlă, ţesuturile au un contrast
ridicat şi sunt excelent prezervate, iar secţiunile sunt foarte rezistente la
fascicolul de electroni.
354
Reţeta de preparare a Eponului este următoarea:
Soluţia A ml Soluţia B (dă duritatea) ml

Epon 812 (Epitoke 212) 66 Epon 812 100
DDSA (anhidrida 100 NMA (anhidrida me- 84
dodecenil-succinică) til-nadică)
Soluţiile A şi B pot fi păstrate timp de peste 6 luni la 4ºC în sticle bine

închise şi ferite de umezeală. Înainte de amestecarea celor două soluţii, ele
trebuie scoase de la frigider şi ţinute la temperatura camerei timp de câteva
ore pentru a evita condensarea vaporilor de apă pe ele, ceea ce ar afecta
polimerizarea, deci includerea corectă. Pentru două probe (6 blocuri), ra-
portul de combinare A:B = 5:5 la care se adaugă 150 μl DMP 30
(2,4,6-dimetil-aminometil fenol) – acceleratorul polimerizării. Se amestecă
foarte bine cu o baghetă de sticlă şi apoi se centrifughează pentru elimina-
rea bulelor de aer. Raportul 5:5 duce la obţinerea unor blocuri potrivit de
dure; dacă predomină soluţia A (7:3), blocurile vor fi mai moi, iar dacă pre-
domină soluţia B (3:7), blocurile vor fi mai dure.
ÎNCAPSULAREA
Încapsularea specimenelor se face în capsule de gelatină foarte bine us-
cate (ţinute câteva ore la etuvă la 60°C) – în fiecare capsulă se pune o pică-
tură de mediu de includere şi apoi câte două cuburi dintr-o probă pentru
fiecare bloc. Se completează cu Vestopal (Epon) circa 3/4 din volumul cap-
sulelor, pentru ca blocul să fie relativ scurt, spre a intra aproape în întregi-
me în suportul ultramicrotomului. Ulterior se face etichetarea capsulelor
(pe etichete se scrie cu creionul chimic pentru Vestopal şi cu creion obişnuit
pentru Epon – pentru a se evita ştergerea simbolurilor la contactul cu me-
diul de includere) şi completarea concomitentă a tuturor capsulelor de ge-
latină. După încapsulare se induce polimerizarea mediului de includere
prin introducerea capsulelor la etuvă la o temperatură de 60ºC timp de
24-48 de ore. Temperatura mai ridicată poate duce la polimerizarea neo-
mogenă, cu preponderenţă la periferia blocurilor, sau chiar la spargerea
acestora. În urma polimerizării se obţin blocuri dure, transparente, conţi-
nând în interior piesele – de culoare neagră.
MODELAREA BLOCURILOR
Blocurile de răşină se fasonează cu ajutorul unei lame de ras nouă, sub
o lupă binoculară cu posibilităţi de mărire de 70-100×. În vârful blocurilor,
355
la nivelul probei se execută un trunchi de piramidă care să poarte în vârf o
suprafaţă trapezoidală cu laturile de aproximativ 0,1-0,2 mm. Se modelează
câte două blocuri pentru fiecare probă, câte un bloc fiind păstrat ca rezervă.
Operaţiunea de modelare a blocurilor este necesară pentru ca în momentul
secţionării să se obţină secţiuni trapezoidale care vor forma benzi rectilinii.
SECŢIONAREA
Această operaţie este necesară pentru obţinerea secţiunilor ultrafine, cu
o grosime care să permită străbaterea lor de către fasciculul de electroni
acceleraţi la tensiuni de 50-100 kW în TEM. Cu cât secţiunile sunt mai groa-
se, cu atât tensiunea de accelerare a electronilor va trebui să fie mai mare
pentru a se putea obţine imaginea pe ecranul fluorescent al microscopului.
Pentru secţionare se pot folosi cuţite de diamant sau cele de sticlă, mult
mai accesibile. S-a demonstrat că dacă nu există sticlă specială pentru cuţite,
poate fi folosită orice sticlă albă plană, cu grosimea de 5-8 mm. Pentru tăierea
sticlei nu se folosesc cuţite de diamant, deoarece acestea pătrund prea adânc,
şi la fracturare sticlei se produc tensiuni care afectează calitatea cuţitului.
Cele mai potrivite sunt rondelele de metal din comerţ. Apăsarea pe foaia de
sticlă trebuie să fie uşoară, de aceeaşi intensitate pe toată linia de tăiere. Tăie-
rea se va face pe o folie de cauciuc. Se poate întinde înainte de tăiere o urmă
de petrol cu ajutorul unui tampon de vată, asigurându-se astfel o tăiere uşoa-
ră şi o rupere a benzilor de sticlă fără tensiuni. Din barele de sticlă se vor tăia
în prima fază pătrate, pe diagonala cărora se va face o nouă tăietură, rezul-
tând câte două cuţite de formă triunghiulară, prismatică.
Pentru realizarea cuţitelor se poate utiliza aparatul special conceput
pentru aceasta (knife maker), pentru care se foloseşte ca materie primă,
sticla pentru cuţite, sub formă de bare, lungi de 400 mm, late de 25 mm şi
groase de 5,5 mm. Înainte de confecţionarea cuţitelor, barele de sticlă se
curăţă uşor cu un tampon de vată cu acetonă anhidră după care se şterg cu
o bucată de tifon curat.
Folosirea knife-maker-ului are ca rezultat obţinerea de cuţite cu tăiş
drept; în cazul tăierii manuale, cuţitele pot avea muchia de tăiere oblică.
Din cauza tensiunii de fracturare, imediat sub tăişul cuţitului se formează o
linie curbă, aşa-zisa linie Wallner, cu ajutorul căreia se poate detecta zona
utilă a cuţitului. Aceasta începe în punctul unde linia Wallner se curbează:
zona cea mai ascuţită examinată la microscopul stereoscopic al
ultramicrotomului, la o mărire de 50-100×, apare ca o linie albă, strălucitoa-
re, în timp ce zonele învecinate prezintă dinţi de fierăstrău.
Cuţitele selecţionate pentru secţionare se păstrează ferite de praf. Înain-
te de folosire este necesară pregătirea suplimentară a cuţitelor. La marginea
356
prismei unde se află suprafaţa de secţionare se construieşte un bazin prin
lipirea unei benzi adezive în poziţie perfect orizontală. Cuţitul se instalează
în ultramicrotom raportat la limitatorul din stânga locaşului cuţitului şi la
un unghi de 3º. Se spală de cel puţin 3 ori cu alcool (10% sau acetonă 10%)
sau cu apă distilată, apoi se face oglinda. La nivelul bazinului se va ajusta
cantitatea de alcool 10% astfel încât, prin reglarea poziţiei lămpii fluores-
cente, reflexia luminii să se realizeze cât mai uniform la suprafaţa băii, pe o
suprafaţă cât mai mare posibilă (ideal este completă) a acesteia. De aseme-
nea, oglinda de apă trebuie să fie orizontală, să nu prezinte menisc, ceea ce
ar putea determina udarea blocului şi compromiterea secţionării.
Pentru secţionare blocurile se montează pe rând în dispozitivul barei
de înaintare al ultramicrotomului LKB. Blocurile se montează astfel ca baza
mare a trapezului din vârful piramidei să fie perfect paralelă cu lama cuţi-
tului, în zona cea mai ascuţită a acestuia. Pentru realizarea acestui lucru se
reglează angrenajele intermediare care ajută la fixarea suportului care poar-
tă blocul de bară de înaintare a ultramicrotomului. În poziţia blocată a barei
de înaintare, piramida realizată la nivelul probei trebuie să se afle la nivelul
gurii cuţitului (în plan vertical). Se apropie cât mai mult posibil cuţitul de
bloc prin manevrarea voxelor macrometrică, şi apoi micrometrică a
ultramicrotomului, mişcând uşor, în paralel, bara de înaintare în sus şi în
jos prin acţionarea manuală a acesteia – de la viza de pe panoul de coman-
dă. Bara de înaintare va efectua mişcări succesive în plan vertical, astfel
încât suprafaţa de secţionare a blocului cade pe faţa de tăiere a cuţitului de
sticlă sau de diamant. După fiecare mişcare de tăiere, bara înaintează cu o
distanţă reglabilă, egală cu grosimea secţiunii (500-1000 Å). În cazul
ultramicrotomului LKB avansul este controlat prin dilatarea termică a unei
tije metalice (aliaj de nichel). Pentru aceasta, temperatura camerei trebuie să
fie cât mai scăzută posibil.
Secţiunile obţinute vor pluti la suprafaţa apei distilate din baia cuţitului
(care formează oglinda), grosimea acestora fiind apreciată după culoarea
lor:
Cenuşie 100-200 Å Galben intens-maroniu 700-800 Å

Cenuşiu-argintie 300-400 Å Maro 800-850 Å
Argintie 500 Å Maro – albăstrui 900-1000 Å
Argintiu-gălbuie 600 Å Albăstrui 1000-1100 Å
Galben pai 650-700 Å Verde 1300-1500 Å
357
Pentru cercetări de rutină, secţiunile de culoare argintie sunt foarte
convenabile. Grosimea secţiunilor se va alege şi ţinând cont de caracteristi-
cile microscopului în care se va face examinarea.
Secţiunile sunt preluate pe grile electrolitice de cupru (200 mesh) aco-
perite în prealabil cu o peliculă fină de parlodion. Din fiecare bloc se vor
culege secţiuni pe cel puţin câte 2 grile. Uscarea grilelor se face cu hârtie de
filtru prin tamponarea laterală a grilelor. Grilele se păstrează în cutii Petri
cu capac pentru a fi ferite de praf (pe hârtie de filtru pe care se trec simbo-
lurile corespunzătoare specimenelor).
Grilele electrolitice sunt reţele de cupru cu cadrul de 3 mm, obţinute
prin electroliză. Numărul de ochiuri pe care le poate avea o grilă variază
între 50 şi 1000, însă în mod curent sunt folosite grile cu 100-200 de ochiuri.
Pentru obţinerea peliculei de parlodion, în mijlocul unui cristalizor cu
apă bidistilată se pipetează o picătură de parlodion. Se evaporă diluantul
rămânând o peliculă de 100 Å grosime. Pe această peliculă se aşează grilele,
cu faţa în jos. Grilele sunt apoi scoase cu ajutorul unor rondele de hârtie.
După uscarea peliculei la temperatura camerei, grilele fiind ferite de praf,
se trece la acoperirea cu carbon (un strat de circa 100 Å) a grilelor într-un
evaporator cu vid (metalizor). Stratul de carbon are rolul de a proteja peli-
cula de parlodion de acţiunea distrugătoare a fasciculului de electroni.
CONTRASTAREA
Ţesuturile biologice incluse în mase plastice, datorită fineţei lor şi a
compoziţiei chimice, au putere mică de împrăştiere a electronilor, şi ca ur-
mare, contrastul acestora este foarte scăzut. Contrastarea urmăreşte creşte-
rea capacităţii de împrăştiere diferenţiată a electronilor de către materialul
biologic secţionat. Contrastul imaginii obţinute în microscopul electronic
depinde de numărul atomic al elementelor din care este alcătuit specime-
nul: cu cât acest număr este mai mare, cu atât dispersia electronilor şi im-
plicit contrastul imaginii sunt mai mari. Deoarece moleculele din structurile
biologice sunt constituite din atomi cu număr atomic mic (C, N, O, H), pen-
tru a le evidenţia sunt contrastate cu săruri ale metalelor grele. În cazul de
faţă contrastarea se face în două etape, cu doi contrastanţi diferiţi:
A. Contrastarea cu acetat de uranil.

Soluţia de acetat de uranil se prepară după reţeta:
- Acetat de uranil 2,6 g

- Alcool etilic 50% în apă distilată 20 ml
358
Se pipetează acetatul de uranil în godeurile unei plăci de parafină (cea-
ră), după care s-au lăsat grilele cu secţiunile în jos pe picăturile de contras-
tant. Se ţin grilele pe acetat de uranil 15-20 minute după care se spală la jet
de pisetă cu apă distilată-alcool şi se iau pe hârtie de filtru spre a nu adera
la vârful pensei fine cu care se lucrează.
B. Contrastarea cu citrat de plumb.

Se pipetează citratul de plumb în godeurile plăcii de parafină (ceară),
după care se lasă grilele cu secţiunile în jos pe picăturile de contrastant. Se
ţin grilele pe citratul de plumb maxim 9 minute (timp după care apar pre-
cipitate), după care se spală la jet de apă distilată. Pentru evitarea apariţiei
precipitatelor (reprezentate de carbonatul de plumb ce apare la contactul
citratului de plumb cu CO2 atmosferic), se va evita contactul contrastantu-
lui cu aerul atmosferic. Cel mai bine este să se folosească o soluţie proaspă-
tă preparată, filtrată, iar colorarea să se facă în apropierea câtorva granule
de NaOH care să absoarbă CO2.
Soluţia de citrat de plumb se prepară după reţeta:
Citrat de plumb (GM 1053,85) 1,410 g

Se dizolvă în 30 ml apă distilată şi se agită puternic timp de 5-10 minute
NaOH 1N 8 ml
Se agită timp de 5 minute
Apă distilată Se completează până la 50 ml
Se aduce pH-ul la valoarea 12
2. Microscopia electronică de baleiaj

Microscopul electronic de baleiaj sau scanning (SEM) diferă fundamen-
tal de microscopul electronic de transmisie în privinţa modului de formare
a imaginii. În microscopul electronic de transmisie clasic imaginea se for-
mează în întregime, simultan, în timp ce la cel de baleiaj, imaginea se for-
mează punct cu punct în forma rasterului.
Electronii emişi de tunul de electroni al microscopului şi acceleraţi de o
tensiune înaltă (0,5–30 kV) sunt concentraţi, într-un sistem cu mai multe
lentile, într-un fascicul îngust al cărui diametru în locul de încrucişare are,
pe suprafaţa probei cercetate, sub 10 nm. Imaginea finală, care se compune
din numărul total al liniilor, se numeşte raster. Raza primară (incidentă) a
electronilor acceleraţi şi concentraţi ce cade pe suprafaţa probei, interacţio-
nează cu materialul, interacţiune în urma căreia apar următoarele semnale:
359
• Electroni secundari (SE)
• Electroni reflectaţi (BE)
• Electroni Auger
• Electroni absorbiţi de probă (AE)
• Electroni transmişi prin probă (TE)
• Fotoni
• Radiaţii X.
Neavând de a face cu electroni transmişi prin probă, pentru SEM di-
mensiunile preparatelor pot depăşi 3 cm grosime, limitarea fiind dată doar
de mărimea incintei probei, dar pentru probele biologice este necesară aco-
perirea acestora cu un strat foarte subţire de metal (prin evaporare în vid),
capabil de a genera electroni secundari sub impactul fasciculului incident
provenit din filamentul microscopului.
Ca şi în cazul TEM, şi aici probele trebuiesc deshidratate,
îndepărtându-se orice urmă de solvent sau a vreunei substanţe volatile din
materialul biologic, examinarea desfăşurându-se, de asemenea, în condiţii
de vacuum înalt.
Deşi rezoluţia acestui microscop nu permite observarea unor detalii de
ordinul celor din TEM, o deshidratare naturală a materialului biologic pro-
duce alterări ale suprafeţei probelor datorate tensiunii superficiale, sufici-
ent de profunde pentru a nu mai înregistra un aspect normal al acestora.
Pentru fixarea probelor biologice cu conţinut ridicat de apă se foloseşte
aceeaşi combinaţie de fixatori ca şi pentru microscopia electronică de
transmisie:
- prefixarea cu glutaraldehidă 2,7% în tampon fosfat 0,1M, pH 7,4 pen-
tru 60 – 90 minute la 4 0C;
- îndepărtarea fixatorului în exces prin trecerea probei în tampon fosfat
0,15M, pH 7,4 - trei băi consecutive a câte 60 minute fiecare, a patra peste
noapte, toate la 4 0C;
- postfixarea cu acid osmic (Os O4) 1% în tampon fosfat 0,15M, pH 7,4
timp de 75-90 minute, de asemenea la 4 0C.
Timpii de lucru ai acestor etape vor fi adaptaţi tipului de ţesut or-
ganic şi, în special, dimensiunilor probei.
DESHIDRATAREA LA PUNCT CRITIC

Deshidratarea la punct critic reprezintă o metodă de eliminare a orică-
rei substanţe volatile, generatoare de vapori (ce pot diminua nivelul vidu-
lui din microscop) dintr-o probă biologică în vederea examinării acesteia la
microscopul electronic cu baleiaj.
360
În 1952, Anderson a dezvoltat această metodă folosind CO2 lichid, dar
se pot folosi şi alte gaze lichefiate ca şi fluid de tranziţie, metodă superioa-
ră sublimării apei în vid.
În acest sens, studierea morfologiei suprafeţelor probelor biologice im-
plică prezervarea detaliilor de suprafaţă. Deshidratarea normală prin eva-
porare la temperatura camerei induce deformări ale majorităţii specimene-
lor, cauza primară a acestora fiind efectele tensiunii superficiale, proba fi-
ind supusă forţelor prezente la limita fazei lichid – vapori.
Cel mai comun mediu al probelor biologice este apa, care prezintă o
tensiune superficială la aer foarte mare, spre deosebire de acetonă, unde
aceasta este de câteva ori mai mică. Tensiunea superficială poate fi redusă
prin substituirea cu un lichid ce are o tensiune superficială mult mai mică
decât a apei, aşteptându-se deformări minore ale suprafeţei probei în tim-
pul deshidratării.
Totuşi, intervenţia aşa-numitei continuităţi de fază sugerează o metodă de
deshidratare pentru care tensiunea superficială poate fi redusă la zero, cu păs-
trarea nealterată a detaliilor de suprafaţă. Prin creşterea temperaturii gazului
lichefiat, meniscul devine plat, indicând o reducere a tensiunii superficiale.
Dacă tensiunea superficială scade foarte mult, suprafaţa lichidului de-
vine foarte instabilă şi, în final, trece în faza de gaz. Când este atins punctul
critic este posibilă trecerea de la faza de lichid la faza de gaz fără modificări
dramatice. Dacă proba biologică a fost în lichid, va parcurge această tranzi-
ţie spre un mediu gazos “uscat” fără a fi în contact cu suprafaţa, evitând
astfel posibilitatea apariţiei deformărilor datorate tensiunii superficiale.
361
Graficul indică faptul că, la atingerea punctului critic (caracterizat de
valori ale presiunii şi temperaturii foarte precise), proprietăţile stării de
lichid şi ale stării de gaz (vapori) ale aceleiaşi substanţe, devin similare şi,
în final, coincid. Acest fapt este realizat pe izoterma de 31,1 oC pentru CO2,
aceasta fiind temperatura critică căreia i se asociază o presiune critică, va-
lori la care are loc tranziţia. Dacă lichidul a fost încălzit într-o incintă închi-
să, aşa încât presiunea critică să poată fi atinsă la temperatura critică, orice
menisc vizibil va dispărea, tensiunea superficială fiind zero având, deci, o
continuitate de stare.
Deasupra acestei temperaturi gazul nu poate fi lichefiat prin aplicarea
presiunii, astfel, o substanţă poate fi clasificată drept gaz doar deasupra
temperaturii critice, sub această valoare, unde poate fi lichefiată, este mult
mai precis termenul de vapori.
Chiar dacă valorile critice ale diferitelor substanţe pot fi atinse practic,
în cazul probelor biologice la unele dintre acestea ar interveni modificări
termice suplimentare, cel mai utilizat fiind, în consecinţă, dioxidul de car-
bon.
CONSTANTE CRITICE
Substanţa Temperatura critică Presiunea critică
(oC) (atm)
HIDROGEN -234,5 20
OXIGEN -118 50
AZOT -146 33
DIOXID DE CARBON +31,1 73
MONOXID DE CARBON -141,1 36
APĂ +374 219
Deci, CO2 rămâne cel mai utilizat mediu pentru deshidratarea la punct
critic şi este numit fluid de tranziţie. Nefiind miscibil cu apa, apa din proba
biologică trebuie înlocuită cu un alt fluid miscibil cu CO2. Acest fluid in-
termediar, de regulă, schimbă apa din ţesut şi este miscibil cu CO2, deşi se
pot utiliza şi variante cu două fluide intermediare.
Înaintea acestor etape se realizează fixarea probei, tipic pentru micro-
scopia electronică, procedura glutaraldehidă – osmium.
Aşa cum s-a menţionat, stadiul intermediar implică deshidratarea pro-
bei biologice cu ajutorul lichidului intermediar:
(proba umedă) H2O > Acetonă > CO2 > DPC (proba uscată)
362
Specimenul este trecut prin diferite concentraţii crescătoare ale fluidu-
lui intermediar, culminând cu înlocuirea completă a apei din ţesut cu acest
fluid, deoarece prezintă o tensiune superficială foarte scăzută, fiind mai
puţin susceptibil deformărilor datorate evaporării fluidului de tranziţie ce-l
va înlocui.
_______________acetonă________________________
H2O > 30% > 50% > 60% > 70% > 80% > 90% > 100% > CO2 ¤
------------------- câte 10 minute fiecare ----------------------
¤ - trei schimbări
FLUIDE INTERMEDIARE / DESHIDRATANTE

Substanţa Tensiunea superficială (dyne/cm)
ETANOL 23
ACETONĂ 24
FREON (113) 19
APĂ 73
Principalele etape ale deshidratării la punct critic:

1. fixarea probei cu glutaraldehidă 2,7% şi OsO4 1% în tampon fosfat;
2. deshidratarea cu acetonă;
3. imersia probei în acetonă în incinta aparatului;
4. substituirea acetonei cu CO2 lichid sub presiune – operaţie repetată
în funcţie de dimensiunile probelor;
5. încălzirea incintei până la atingerea punctului critic;
6. eliberarea vaporilor de CO2.
ACOPERIREA CU METALE
Toate probele neconductive necesită acoperirea cu un film subţire de mate-
rial conductiv. Această acoperire este necesară pentru eliminarea sau reducerea
încărcării electrice ce se instalează rapid la suprafaţa unei probe neconductive la
baleierea acesteia de către un flux de electroni de energie înaltă.
Materialul uzual pentru acoperirea probelor este aurul. În absenţa stra-
tului de acoperire, specimenele nonconductive examinate la parametri op-
timi prezintă invariabil fenomenul încărcării electrice ce conduce la distor-
sionarea imaginii şi la distrucţii termice, având drept rezultat pierderi sem-
nificative de material din probă. În situaţii extreme, specimenul poate acu-
mula o încărcătură suficient de mare pentru a decelera fluxul primar, proba
acţionând în acest caz ca oglindă pentru electroni.
363
Când scopul analizei nu este achiziţia unui spectru de raze X, aurul este
cel mai utilizat element pentru acoperirea probelor. Acoperirea se realizea-
ză prin evaporarea metalului în vid, ce presupune legarea metalului la po-
lul pozitiv şi a probei la cel negativ, la capete aplicându-se o tensiune con-
tinuă de 1 – 3 kV, dispozitiv instalat într-o incintă ce menţine un nivel de
vacuum (10-2 Pa) suficient pentru a asigura o depunere a atomilor de aur
într-un strat uniform şi foarte subţire, de câteva sute de nanometri.
EXAMINAREA DIFERITELOR PROBE IN SEM
Probele pentru examinarea în SEM sunt montate pe suporturi conduc-

tive din cupru cu ajutorul unor discuri de carbon adezive pe ambele feţe.
Orientarea probei pe suport în aceasta fază este foarte importantă, ţinând
cont de posibilitatea limitată de înclinare a probei în microscop, aşa încât
zona de interes să fie expusă direct fasciculului de electroni ce balează pro-
ba. Astfel, montarea probelor se va realiza sub lupa binocular unde, probe
de tipul microfosilelor (foraminifere) sau segmente de aparate bucale, ante-
ne, palpi (insecte), pot fi aranjate în ordine pe un singur suport. Pulberile,
sporii sau alte probe ce nu pot fi manipulate cu pensa, vor fi presărate pe
suportul adeziv, surplusul fiind îndepărtat în momentul introducerii în vid
pentru metalizare. Probe biologice de tipul insectelor chitinoase, precum şi
cele cu un conţinut nesemnificativ de apă (frunze uscate) pot fi montate pe
suport şi metalizate fără deshidratare, în timp ce, la celelalte probe este
obligatorie uscarea la punct critic pentru prevenirea deformărilor datorate
unei deshidratări brutale în aer, abia apoi realizându-se acoperirea cu meta-
le a acestora.
Probele astfel pregătite se introduc în microscop si se examinează la di-
ferite măriri, imaginile fiind preluate în format digital sau clasic pe film.
O anexă importantă a SEM este sistemul de microanaliza elementală cu
raze X (EDX). Detectorul special al EDX identifică, pe baza radiaţiei X (spe-
cifică fiecărei specii chimice) generate din probă, compoziţia chimică a pro-
bei analizate atât calitativ cât şi cantitativ, putându-se realiza chiar hărţi cu
distribuţia fiecărui element chimic în zona luată în studiu.
364
X. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ
Microscopia de forţă atomică

Cuprins
1. Microscopia de Scanare a Probei ......................................................................................... 365

2. Microscopia de Forţă Atomică ............................................................................................ 369
3. Spectroscopia de Forţă Atomică .......................................................................................... 371
4. Aplicaţii ale Microscopiei de Forţă Atomică ....................................................................... 371
5. Nanolitografie cu Microscopul de Forţă Atomică ............................................................... 373
6. Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de Forţă Atomică ........................................ 374
7. Avantajele şi Limitele Microscopiei de Forţă Atomică ........................................................ 375
8. Bibliografie .......................................................................................................................... 376
Quantum mechanics predicts an exponential dependence of

tunneling current with a separate distance between the two
electrodes. An observation of this dependence between a W-tip
and Pt surface by G. Binnig, H. Rohrer, Ch. Gerber and E.
Weibel in 1981 was marked as the invention of STM.
1. Microscopia de Scanare a Probei

Microscopia cu scanarea probei
(Scanning Probe Microscopy - SPM) este
o microscopie mecanică ce acoperă câ-
teva tehnici de vizualizare a suprafeţei
unui eşantion (morfologia suprafeţei) cu
o rezoluţie la nivelul moleculelor sau a
grupurilor de atomi. În cazul celor mai
performante echipamente SPM disponi-
bile în prezent, se poate vizualiza
dintr-un eşantion maxim 150 X 150 um
Figura 1. Imagine SEM x1000 pentru un dacă rugozitatea în zona scanată este
cantiliver – tip.
365
mai mică de 10 um. Tehnologia SPM are la bază un concept simplu: scana-
rea unei suprafeţe cu ajutorul unui vârf (tip) foarte ascuţit (sharp, vârf cu
raza de curbură de circa 3-50 nm, Figura 1).
Acest tip este ataşat de o grindă (cantilever) flexibilă, astfel încât să
poată fi urmărit profilul suprafeţei scanate. În funcţie de mecanismul de
interacţiune dintre probă (vârf, tip) şi eşantionul scanat, se definesc tehnici-
le SPM. În prezent, cele mai multe sisteme SPM utilizează un fascicol laser
pentru a determina deflexia cantilever-ului. Acest fascicul laser se reflectă
de partea opusă tip-ului (fabricat din Si sau Si3N4) pe un fotodetector sensi-
bil la poziţie (Figura 2).
Cu ajutorul unui astfel de sistem de
detecţie este posibilă măsurarea indi-
rectă a forţei dintre tip şi suprafaţa
eşantionului studiat. Pentru a calcula
forţa de interacţie utilizăm legea lui
Hook (F = kz), unde k este constanta de
elasticitate a cantilever-ului, iar z este
distanţa pe care cantilever-ul a suferit o Figura 2. Detecţia deflexiei cu ajutorul
deflexie. Cunoaşterea acestor forţe este unui fascicul laser şi a unui fotodetector.
importantă pentru interpretarea imagi-
nilor SPM sau pentru a determina proprietăţi mecanice locale ale eşantio-
nului.
Un alt element de bază al unui SPM este scanner-ul piezoelectric. De
performanţele mecan- electrice ale scanner-ului piezoelectric depind în ceea
mai mare măsura performanţele întregului SPM. Mai mult, se poate spune
că este singurul element puternic limitativ în evoluţia viitoare a microsco-
piei mecanice. Scanner-ul SPM este realizat din material piezoelectric
(PZT) care se expandează şi contractă proporţional cu tensiunea aplicată,
respectiv cu polaritatea acesteia. De regulă, scanner-ul este construit sub
forma unui tub (Figura 3) cu elec-
trozi pentru deplasarea pe X, Y şi Z
iar cu ajutorul lui se poate poziţiona
proba (tip-ul) cu extremă precizie în
3D (3 Dimensiuni).
Scanner-ele sunt caracterizate
Figura 3. Scanner piezoelectric de forma prin sensibilitatea lor (raportul dintre
tubulara.
deplasarea pe o direcţie şi tensiunea
aplicată pe acea direcţie) adică, atât cât se extinde sau contractă un material
piezoelectric per volt. Pentru valori mari ale tensiunii, deplasarea nu este
366
liniară cu tensiunea aplicată şi această dependenţă diferă de la scanner la
scanner. Efectul final al acestei situaţii este identificat prin rezultate diferite
funcţie de direcţia de scanare. Desigur că acest efect poate fi limitat prin
aplicarea unei tensiuni neliniare pentru scanare (identificată în procesul de
calibrare a scanner-ului).
Poate cel mai neplăcut lucru legat de scanner este procesul exponenţial
de îmbătrânire ce determină o scădere a sensibilităţii în timp. Pentru a limi-
ta efectele date de procesul de îmbătrânire, fabricantul utilizează cel putin
48 de ore scanner-ul înainte de a fi livrat pentru o aplicaţie. Cu toate aces-
tea, o recalibrare frecventă a scanner-ului se impune mai ales în primul an
de utilizare.
Cele mai comune tehnici SPM sunt:
• Scanning Tunneling Microscopy (STM) este tehnica SPM de bază
care a generat întreg domeniul acoperit azi de microscopia mecani-
că. Principiul STM-ului este dat de efectul de tunelare al electronilor
între doi electrozi în prezenţa unui câmp electric. Pentru a putea
măsura efectul de tunelare distanţă dintre cei doi electrozi trebuie să
fie de aproximativ 1 nm. Această situaţie experimentală este posibi-
lă în cazul unor suprafeţe conductoare curate (practic fără rugozita-
te) precum şi în lipsa vibraţiilor ambientale.
• Atomic Force Microscopy (Microscopia de Forţă Atomică) a apărut
ca o extensie în utilizarea microscopiei mecanice (1986) pentru eşan-
tioanele nu foarte conductoare. Din această cauză, această tehnică a
cunoscut o dezvoltare rapidă (în comparaţie cu STM), fiind extrem
de utilă în multe domenii de cercetare. Practic, toate eşantioanele de
material de orice tip (inclusiv de natură biologică) pot fi investiga-
te/măsurate cu AFM. Pe lângă morfologia suprafeţei, AFM-ul a fost
dezvoltat în ultimele decenii pentru a măsura o mare varietate de
proprietăţi pe suprafaţa eşantionului cum ar fi proprietăţile electri-
ce, magnetice si mecanice. Această diversitate este bazată pe princi-
piul de funcţionare care implică existenţa unui tip (probă) în contact
sau foarte apropiat de suprafaţa eşantionului, aşa că, orice interacţi-
une dintre tip şi suprafaţa eşantionului este măsurabilă.
• Near-Field Scanning Optical Microscopy (NSOM) utilizează o sursă
de lumină de foarte mici dimensiuni ca mecanism de formare a
imaginii. Prin utilizarea unei surse cvasi-punctiforme, cu un diame-
tru mai mic decât lungimea de undă, poate fi obţinută o rezoluţie
dincolo de limita de difracţie. Proba (un tip de fibră optică plus o
apertură) trebuie să fie foarte aproape de suprafaţa eşantionului;
367
mai aproape decât lungimea de undă. Această regiune limitată de
proba şi eşantion este numită “Near-Field” de unde şi numele aces-
tei microscopii. Rezoluţia imaginii este limitată de dimensiunea
aperturii detectorului şi nu de lungimea de undă a luminii inciden-
te. Tipic, în cazul unui NSOM avem o rezoluţie laterală de circa 20
nm şi o rezoluţie verticală de 2-5 nm.
La fel ca în orice microscopie optică, mecanismele de contrast pot fi
uşor adaptate pentru studierea diferitelor proprietăţi, cum ar fi indi-
cele de refracţie, structura chimică si stress-ul local. De regulă, lu-
mina laserului, prin intermediul unei fibre optice, parcurge o aper-
tură realizată prin acoperirea ei cu metal (cum ar fi Al) şi
microfabricată la fel ca o probă AFM. Dimensiunea punctului de
lumină determină rezoluţia maximă ce poate fi obţinută.
În cazul NSOM, feedback-ul necesar în sistem, pentru a menţine o
distanţă de lucru dintre probă şi suprafaţa eşantionului, se realizea-
ză prin două metode. O prima metodă este echivalentă cu cea din
cazul AFM, adică prin intermediul unui cantilever şi a unui sistem
de detecţie al deflexiei cu fascicul laser. Un al doilea mod este un
mod rezonant (tuning fork) şi este monitorizată amplitudinea osci-
laţiei când tip-ul se mişcă deasupra suprafeţei eşantionului. Mutarea
laterală a tip-ului este denumită “shear-force” feedback.
În funcţie de modul de obţinere a imaginii, şi în acest caz, avem mai
multe moduri de operare:
• Transmisie: lumina care vine prin apertura probei este
transmisă prin eşantion; sunt necesare eşantioane transpa-
rente.
• Reflexie: lumina care vine prin apertura probei se reflectă pe
suprafaţa eşantionului. În acest caz, eşantionul poate fi opac,
dar intensitatea lumini este scăzuta si dependentă de forma
probei.
• Colectare: eşantionul este iluminat dintr-o sursă externă cu arie
mare de iluminare, iar proba colectează lumina reflectată.
• Iluminare/Colectare: Proba este responsabilă atât de ilumi-
nare, cât şi de colectarea luminii reflectate.
Detecţia semnalului se realizează prin: spectrometru, APD (Avalanche
Photo Diode), tub fotomultiplicator sau CCD (Charge Coupled Devices).
Pentru a vizualiza imaginile, sunt utilizate câteva mecanisme de contrast:
polarizare, topografie, birefringenta, indice de refracţie, fluorescenţă, de-
pendenţa de lungimea de undă şi reflectivitate.
368
2. Microscopia de Forţă Atomică
Microscopia de Forţă Atomică (AFM, 1986) a fost dezvoltată ca o solu-
ţie tehnică pentru STM, de a măsura prin microscopie mecanică eşantioane-
le neconductoare. Marele avantaj al AFM-ului este capacitatea acestuia de
a investiga practic orice tip de suprafaţă inclusiv polimeri, ceramici, materi-
ale compozite, sticle şi materiale
biologice. Versatilitatea AFM-ului a
dus în timp la o diversitate de mo-
duri de operare şi adaptări, modifi-
cări la situaţii specifice: măsurători
in lichide, în medii chimice corozive
sau medii biologice termostatate.
Potenţialul Lennard-Jones (Figu-
ra 4) este un model aproximativ
Figura 4. Potentialul Lennard-Jones versus pentru cazul izotropic (repulsie şi
modurile de operare AFM. atracţie) al forţei Van der Waals ca o
funcţie de distanţă. Relativ la natura
forţelor implicate şi interacţiunea dintre tip şi suprafaţa eşantionului defi-
nim cele mai importante moduri AFM de operare (clasice):
• Contact Mode (modul contact), tip-ul este menţinut (de obicei) la o
forţă constantă puternic de respingere, iar cantilever-ul este mutat
în sus sau în jos pe timpul scanării. Se poate, de asemenea, pentru
suprafeţe ale eşantionului cu rugozitate scăzuta să se opereze în
modul distanţă constantă. Acesta a fost de altfel primul mod de
operare AFM implementat ca o adaptare la STM. Capabilitatea de a
urmării suprafaţa eşantionului în acest mod este limitată doar de
circuitul de feedback. Tip-ul este în contact puternic cu suprafaţa
eşantionului şi în modul distanţă constantă este posibilă rezoluţia
atomică, dacă eşantionul este special preparat.
• Microscopia de Forţă Laterală (Lateral Force Microscopy - LFM) mă-
soară forţele de frecare dintre tip şi suprafaţa eşantionului. Aceste
forţe sunt măsurate indirect prin deflecţia laterală (twist) a
cantilever-ului. În acest scop, cantilever-ul este optimizat pentru
sensibilitate mare la forţele de frecare laterală; tocmai de aceea,
cantilever-ul este foarte subţire. LFM este util în vizualizarea forţe-
lor de frecare pe suprafaţa eşantionului, care sunt determinate de
neomogenităţile materialului, precum şi pentru a pune în evidenţă
muchiile de pe suprafaţa eşantionului. Modul de operare LFM este
369
un mod derivat din modul de operare Contact Mode; tipul este în
contact constant cu suprafaţa eşantionului.
• NonContact Mode este un concept ce descrie familia modurilor AC
(moduri de curent alternativ). În acest caz, cantilever-ul este oscilat
îin regim de atracţie, ceea ce înseamnă că tip-ul este apropiat de su-
prafaţa eşantionului, dar nu este în contact cu aceasta. Desigur că
forţele de interacţiune dintre tip şi suprafaţa eşantionului sunt foarte
mici, în acest caz, de ordinul pN. Detecţia se bazează pe măsurarea
diferenţelor de cuplaj cu suprafaţa eşantionului care determină
schimbarea frecvenţei de rezonanţă a cantilever-ului şi/sau a ampli-
tudinii de oscilaţie.
• Contact Intermitent (Dynamic Force, Tapping Mode) este denumi-
rea clasică, iar mai recent este denumit DFM (Dynamic Force Mo-
de). Şi în acest mod, cantilever-ul este oscilat în apropierea suprafe-
ţei eşantionului, dar părţi ale oscilaţiei sunt extinse în regimul de
respingere, în aşa fel încât, tip-ul intră intermitent în contact cu su-
prafaţa eşantionului. Avantajul acestui mod de operare este legat de
rezoluţia laterală mai ridicată fără apariţia unor forţe de dragare.
• Force Modulation este un mod AFM de operare ce se referă la utili-
zarea proprietăţilor materialului probei pentru a controla interacţi-
unea cu suprafaţa eşantionului. Tip-ul este oscilat şi pus în regim de
respingere, iar slop-ul, forţa-distanţă este măsurată determinând
astfel elasticitatea eşantionului. Aceste date pot fi culese simultan cu
topografia suprafeţei eşantionului. Prin acest mod de operare AFM
se pot determina şi compara simultan morfologia şi proprietăţile lo-
cale.
• Phase Imaging este un mod în care sunt culese informaţii despre
shift-ul de fază a cantilever-ului aflat în oscilaţie în raport cu semna-
lul de excitaţie. Acest shift de fază se corelează cu proprietăţi speci-
fice suprafeţei eşantionului (frecare, adeziune, vîscoelastice). Acest
mod de operare este un mod măsurat simultan cu modurile AC
enumerate mai sus.
Modurile de operare din Microscopia de Forţă Atomică sunt rezumate

în Tabelul 1 cu referire la forţa de interacţiune pentru fiecare mod. Tabelul 1
este departe de a fi complet (doar modurile esenţiale) şi mai mult, în fiecare
an se adăuga noi moduri de operare sau noi versiuni ale acestora.
370
Tabelul 1.
Mod de Operare Forţa de Interacţie
contact mode puternic de respingere – forţa constantă sau dis-
tanţa constantă
non-contact mode slabă de atracţie - vibrarea probei
intermittent contact mode puternică de respingere - vibrarea probei
lateral force mode forţele de frecare exercită o torsiune a cantilever-
ului folosit în scanare
magnetic force câmpul magnetic de la suprafaţa eşantionului
poate fi vizualizat
thermal scanning distribuţia conductivităţii termice pe suprafaţa
eşantionului este vizualizată.
3. Spectroscopia de Forţă Atomică

O altă aplicaţie majoră AFM este Spectroscopia de Forţă Atomică (FS,
Force Spectroscopy) şi se referă la măsurarea directă a interacţiunii dintre tip şi
suprafaţa eşantionului în funcţie de distanţa de separare. În această metodă,
tip-ul este împins în faţă şi apoi retras de la suprafaţa eşantionului, iar
deflexia cantilever-ului este monitorizată în funcţie de deplasarea scan-
ner-ului. Această metodă este utilă în măsurarea contactului la dimensiune
nano (legături atomice, forţe Van der Waals, forţe Casimir) cum ar fi forţa de
rupere a moleculelor de suprafaţa eşantionului. Limita de măsurare este în
domeniul pN, iar distanţa pe axa Z este mai bună de 0.1 nm. Spectroscopia
de Forţă Atomică poate fi implementată ca şi deflexie statică sau mai recent
în mod dinamic, situaţie în care cantilever-ul este vibrat (metoda AC).
O altă metodă modernă de investigare mediată de AFM este
nanoidentarea (nanoidentation). Aceasta tehnică inovativă este combinată
cu probe specializate şi este corelată cu intensitatea spectrală (Raman) în
timp real pentru a vizualiza legăturile chimice. AFM-ul poate aplica un
stres mecanic controlat pe suprafaţa eşantionului (raza de curbură a
tip-ului este de câţiva nm aşa că P = F/A determină presiuni ridicate,
megapascali) care produce un shift în semnalul Raman corelat cu stresul
aplicat.
4. Aplicaţii ale Microscopiei de Forţă Atomică

Datorită faptului că AFM-ul poate investiga practic orice tip de materi-
al fără o preparare specială a eşantionului, această tehnică experimentală a
devenit în timp cea mai utilizată tehnică în studierea macromoleculelor sau
371
eşantioanelor biologice (proteine, ADN, cromozomi, bacterii). De aseme-
nea, este frecvent utilizată în studierea suprafeţelor în industria electronică
(Silicon wafers, medii de stocare a datelor, circuite integrate), precum şi în
studierea unor nanostructuri (suprafaţa polimerilor, reţele de difracţie, ce-
ramici, răşini naturale).
Modul de lucru AFM trebuie ales în funcţie de caracteristicile ce prezintă
interes în investigare, precum şi de natura suprafeţei eşantionului. Modul
contact este o bună alegere pentru suprafeţele dure, de exemplu, dar nu este
o alegere potrivită pentru suprafeţele moi, deoarece poate produce o conta-
minare a tip-ului sau poate îndepărta material de pe suprafaţa eşantionului.
Dacă alegem un contact apropiat atunci AFM-ul va deveni foarte sensibil la
zgomote (vibraţii) externe, dar va deforma mai puţin sau deloc eşantioanele
moi. Murdăria şi efectele de capilaritate induse de apa de pe suprafaţa eşan-
tionului vor avea un rol dominat si, în final, vor degrada calitatea imaginii
obţinute. Modurile AC (cu vibrarea probei) sau intermitente au fost imagina-
te pentru a investiga suprafaţa unor eşantioane biologice.
Performanţele unui AFM sunt limitate de un număr de factori dintre
care amintim: capacitatea elementelor mecanice de a muta tip-ul cu preci-
zie şi de a măsura poziţia acestuia, calitatea tip-ului, liniaritatea scan-
ner-ului şi vibraţiile ambientale. Marii producători de echipamente de mi-
croscopie mecanicp au reuşit în ultimul timp să elimine o mare parte din
limitările anterioare prin îmbunătăţirea componentelor mecanice şi electro-
nice. Calibrarea automată tridimensională a uşurat mult munca operatoru-
lui, încât multe din articolele ştiinţifice de ieri au devenit azi automatizare.
Reţinem din aceste timpuri istorice câteva distorsiuni induse de forma
tip-ului care merită înţelese. La rezoluţii ridicate, imaginea obţinută este
practic convoluţia dintre forma tip-ului şi morfologia locală. În aceste situa-
ţii, este importantă cunoaşterea formei tip-ului (geometria acestuia) pentru
o interpretare corectă a imaginilor obţinute.
¾ Distorsiuni ale imaginii induse de probă. Pentru a vizualiza atomi
sau molecule este necesar ca interacţiunea să fie numai între tip şi
atomul/molecula cea mai apropiată (acest lucru se poate realiza
pentru rezoluţia atomică numai în tehnologia STM). Acest lucru nu
este posibil în cazul AFM şi este limitat atât fizic (Van der Waals),
cât şi tehnologic prin limita de ascuţire a tip-ului. Aşa că, în general,
ceea ce vedem într-o imagine AFM este mai degrabă o imagine me-
diată a morfologiei suprafeţei eşantionului.
¾ Restaurarea Imaginii (Deconvoluţia Probei). Vizualizarea cu AFM a
suprafeţelor pentru eşantioane cu relief înalt implică utilizarea unui
372
tip foarte ascuţit. În caz contrar, ceea ce vedem poate fi imaginea
tip-ului reflectată de suprafaţă. În aceste situaţii, trebuie să apelam
la metode matematice pentru a restaura imaginea (deconvoluţie).
Metoda efectivă de deconvoluţie depinde de caracteristicile suprafe-
ţei eşantionului şi de geometria tip-ului (un subiect frecvent prezent
în literatura ştiinţifică).
5. Nanolitografie cu Microscopul de Forţă Atomică

Nanolitografia se referă la fabricarea de structuri nanometrice mai mici
de 100 nm. În prezent, această tehnică de utilizare a unui AFM este utilizată
(nu foarte frecvent) în realizarea de circuite integrate (nanocircuite) sau de
sisteme nanoelectromecanice (NEMS). Nanolitografia nu se rezumă la utili-
zarea AFM, aşa că, o descriere sumară a principalelor tehnici este utilă:
• Scanning Probe Lithography (SPL) este o unealtă/tehnologie pro-
miţătoare pentru realizarea de pattering la scală nano. De exemplu,
atomi individuali pot fi manipulaţi prin utilizarea tip-ului unui
STM. Dip-Pen Nanolithography (DPN) a fost prima metodă SPL
disponibilă comercial pentru AFM.
• Atomic Force Microscopic Nanolithography (AFMN) este o meto-
dă de pattering pe o suprafaţă chimică-mecanică pentru AFM.
Patter-ul poate fi creat manual sau automat.
Trebuie menţionat că pe lângă nanolitografia de scanare a mai fost dez-
voltată în ultimul timp şi litografia vectorială. În figura 5, se pot vedea câ-
teva exemple clasice de nanolitografie.
Figura 5. Nanolitografie vectorială de la procedeu (a) la rezultat (b), litografie AFM (5 um).
373
6. Nanomanipularea cu ajutorul Microscopului de Forţă Atomică
Diverse structuri nanometrice, cum ar fi nanotuburi şi nanofire care sunt
pe suprafaţa unui eşantion, pot fi manipulate pentru a realiza circuite electri-
ce sau pentru a măsura proprietăţile lor mecanice, implicate în manipularea
lor. Trebuie menţionat că AFM-ul poate fi utilizat ca un robot 3D (manipula-
tor 3D) care are spaţiul de lucru la scală nano. După cum am menţionat, pat-
tern-ul poate fi realizat manual sau automat, sau mai recent, prin utilizarea
unei interfeţe haptic şi a unei aplicaţii de realitate îmbunătăţită.
Prin utilizarea AFM-ului ca sistem nanorobotic, nanomanipularea poa-
te deveni o operaţie relativ uşor de realizat. Un exemplu de nano-
manipulare a unor particule de aur (nano cuburi) cu diametrul de 100 nm
pe o suprafaţă de sticlă se poate vedea în figura 6.
Figura 6. Nanomanipularea unor nano cuburi de aur pe o suprafaţă de sticlă.
Un alt exemplu de nanomaipulare este prezentat în figura 7 a unor par-

ticule de latex cu diametrul de 100 nm într-o structură complicată.
Figura 7. Nanomanipularea unor particule de latex cu diametrul de 100 nm.
374
AFM-ul ca nano robot este extrem de util în nanomaipularea unor celu-
le sau molecule, în special nanomanipularea moleculelor ADN. Aceste mo-
lecule cunoscute de mai mult de o jumătate de secol au atras atenţia, în ul-
timul timp, pentru aplicaţii în nanotehnologie, cum ar fi realizarea unor
circuite electronice (motivată de studierea proprietăţilor electrice). Molecu-
la de AND are un diametru de circa 2.4 nm şi este în esenţă o structură
scurtă (3.6 nm) care se repetă.
După aproximativ 15 ani de controverse relativ la mecanismul de con-
ducţie (transfer de sarcină) este acum bine demonstrată dependenţa de dis-
tanţă (tunelarea într-un singur pas sau hopping termic mai mulţi paşi).
Ambele mecanisme (tunelarea sarcinii, hopping termal) au fost studiate şi
verificate indirect experimental. În acelaşi timp, în literatura de specialitate
ADN-ul rămâne pentru moment un subiect neelucidat, unele rezultate su-
gerează că avem un bun conductor (chiar supraconductor la temperaturi
joase), alte rezultate îl prezintă ca fiind un semiconductor, iar altele ca un
izolator. Elucidarea acestor situaţii nu se poate face decât prin experienţe de
nanomanipulare a ADN-ului; un exemplu este prezentat în figura 8.
Figura 8. Nanomanipularea ADN-ului pe o placă de polycarbonat (aria de scanare este de 5 um).
7. Avantajele şi Limitele Microscopiei de Forţă Atomică

La fel ca orice alt echipament, Microscopul de Forţă Atomică are în
aceeaşi măsură avantaje şi limite. Cunoaşterea acestor limite, respectiv a
avantajelor, este importantă în luarea unei decizii corecte înainte de a apela
la acest echipament pentru investigarea unui eşantion. Microscopia concu-
renta SPM (AFM) este SEM (Scanning Electron Microscopy) dar spre deo-
sebire de SEM unde avem o proiecţie 2D sau mai exact o imagine 2D pentru
eşantion, în cazul AFM avem un profil 3D. Mai mult, eşantionul nu necesită
un tratament special (acoperirea cu metal sau carbon) care poate compro-
375
mite, în unele situaţii, eşantionul. Un alt avantaj este posibilitatea de a in-
vestiga eşantionul în condiţii ambientale, lucru foarte important pentru
eşantioanele biologice, asigurând în principiu o rezoluţie mai bună decât
SEM, comparabilă cu rezoluţia unui TEM (Transmission Electron
Microscopy).
Marele dezavantaj al AFM faţă de SEM se referă la aria scanată, care în
cazul SEM este de ordinul milimetrilor, cu posibilitatea de scanare simulta-
nă a unor arii diferite, toate acestea la o viteză mult mai mare. Datorită fap-
tului că timpul de scanare în cazul AFM-ului este mare, drift-ul termic poa-
te induce distorsiuni pe imagine, făcând lipsită de precizie măsurarea unor
structuri. Aceste limitări sunt un subiect fierbinte în cercetarea instrumen-
tală din acest domeniu şi câteva succese au fost obţinute prin utilizarea în
paralel a mai multor cantilevere sau, mai recent, AFM cu rata de scanare
video.
Imaginile obţinute cu AFM pot fi, de asemenea, distorsionate de efectul
de hysteresis al materialului piezoelectric, precum şi de efectele de mixare
între axele X,Y,Z care necesită refacerea în software a imaginii. Din păcate,
această post-filtrare poate elimina unele caracteristici ale eşantionului.
Aceste limitări au fost eliminate în cazul microscoapelor AFM moderne
prin scannere în bucla închisă sau scanner-e ortogonale.
La fel ca şi în orice altă tehnică bazată pe realizarea de imagini este po-
sibilă apariţia de artefacte care pot fi induse de tip-ul instabil sau mediul
ambiental impropriu sau chiar de eşantionul studiat. Este, de asemenea,
bine cunoscută limitarea puternică indusă de existent pe eşantion a unor
pereţi drepţi sau şanţuri foarte adânci şi înguste a căror morfologie nu poa-
te fi pusă în evidenţă decât prin utilizarea unor tip-uri speciale şi extrem de
scumpe.
8. Bibliografie
1. Giessibl, Franz J. (2003). "Advances în atomic force microscopy". Reviews of Modern

Physics 75: 949.
2. Roiter, Y; Minko, S (Nov 2005). "AFM single molecule experiments at the so-
lid-liquid interface: în situ conformation of adsorbed flexible polyelectrolyte
chains". Journal of the American Chemical Society 127 (45): 15688–9
3. Zhong, Q (1993). "Fractured polymer/silica fiber surface studied by tapping mode
atomic force microscopy". Surface Science Letters 290: L688.
4. M. Hoffmann, Ahmet Oral, Ralph A. G, Peter (2001). "Direct measurement of inter-
atomic force gradients using an ultra-low-amplitude atomic force microscope".
Proceedings of the Royal Society a Mathematical Physical and Engineering Sciences 457:
1161.
376
5. R. V. Lapshin (1998). "Automatic lateral calibration of tunneling microscope
scanners", Review of Scientific Instruments (USA: AIP) 69 (9): 3268–3276.
6. J C Wolfe and B P Craver, "Neutral particle lithography: a simple solution to
charge-related artefacts în ion beam proximity printing", J. Phys. D: Appl. Phys. 41
(2008) 024007 (12pp)
7. R. C. Davis et al. (2003). "Chemomechanical surface patterning and
functionalization of silicon surfaces using an atomic force microscope". Appl. Phys.
Lett. 82 (5): 808–810.
8. G.Y. Li, N. Xi, M. Yu, W. K. Fung, 3-D nanomanipulation using atomic force
microscopy, Proceeding of the 2003 IEEE International Conference on Robotics and
Automation, May, 2003, Taiwan.
9. V.M. Ayres, N. Xi, F. Salam, K.Gilgenbach, H.Saglik and D. Wang, “SPM-Based
Investigation of Site Specific Biological Interactions”, Proceedings of the 2001 1st
IEEE Conference on Nanotechnology
10. V. M. Ayres, H. Hummert, B. Goolsby, F. Salam, Ning Xi “Micro/Nano Motion
Control for Biological Specimen Handling”, Proceedings of International
Symposium on Smart Structures and Microsystems, Hong Kong, October, 2000.
377
Microscopia de forţă atomică
– partea a II-a
Cuprins
1. Tehnici Experimentale - Scanning Probe Microscopy ........................................................378

2. Bibliografie ..........................................................................................................................385
3. Implementarea Noilor Tehnologii........................................................................................386
4. Bibliografie ..........................................................................................................................393
1. Tehnici Experimentale - Scanning Probe Microscopy

Introducere. O evaluare obiectivă a tehnicilor microscopice (Tabelul 1)
pune în evidenţă elemente de performanţă favorabile pentru SPM
(Scanning Probe Microscopy). Dintre acestea, în primul rând merită remar-
cată informaţia 3D reală a topologiei suprafeţei dublată de măsurarea unor
mărimi fizice pe suprafaţă, de regulă, în microscopia modernă prelevate
odată cu informaţia topografică.
Tabel 1.
Optical microscope Scanning Transmission Atomic force
electron electron microscope
microscope microscope
Mechanism Light absorption Electron Electron Forces of pro-
of contrast (diffraction, scattering absorption be-sample
formation polarization, scattering interaction
etc) or fluorescence
Range in XY 200nm – 1mm 1nm-10 mm 1Å-100μm 1Å-200 μm
Range in Z 500nm – 10 mm 10 nm-1 mm limited by 0.5Å-20 μm

ultratome
(10 nm-1 μm)
What is optical slice surface real thin slice surface
studied
Complicated optional necessary necessary optional
sample
preparation
378
Dacă ne referim la modul de preparare a probelor pentru SPM, atunci
cuvântul „optional” nu sugerează întotdeauna ceva facil. La o extremă, orice
material (de exemplu, un fir de păr) este suficient de potrivit dacă nu are o
rugozitate comparabilă cu capacitatea de deplasare a scanner-ului pe direcţia
Z (perpendicular pe eşantion). Obţinerea unor imagini unice în conţinut si
performanţă, nu de puţine ori, ne obligă să apelăm la o preparare complexă a
eşantioanelor; respectiv apelarea la instrumente SPM complexe (izolare la
vibraţii avansată, temperatură scăzută, atmosferă controlată, …). În condiţii
experimentale adecvate, SPM-urile moderne pot pune în evidenţă un singur
atom, dar în cazul unor eşantioane biologice (molecule), acest lucru nu este
posibil datorită lipsei de rigiditate a acestora. Aşa că, nu ne putem aştepta să
vedem diferite domenii în moleculele de proteină, mari schimbări de con-
formaţie (myosin) sau forme spiralate ale moleculelor DNA.
Tehnica experimentală la nivel de detecţie a interacţiunii dintre un tip
(sondă) şi eşantion se bazează pe un cantilever. Merită să reţinem că detec-
torul este mecanic şi de asemenea, să reţinem că acest detector mecanic este
capabil să pună în evidenţă atomii. Consecinţa acestei situaţii se reflectă în
performanţa finală a experimentelor în care apelăm la un SPM şi putem
spune că în mare măsură performanţa este dependentă de iscusinţa expe-
rimentatorului. Sistemul optic nu are alt rol decât de a măsura deflexia
cantileverului, respectiv amplitudinea de oscilaţie sau fază. Mărimea speci-
fică de interes într-o situaţie particulară este detectată (Figura 1.1) de un
sistem opto-electronic bazat pe reflexia unui fascicul laser pe cantilever.
Fasciculul este poziţionat în centrul unui foto-detector cu patru cadrane
(fotodiodă). Viteza de scanare depinde de caracteristicile mecanice ale
scanner-ului şi tot de calităţi-
le mecanice ale acestuia de-
pinde şi aria maximă ce poa-
te fi scanată. Rezoluţia siste-
mului este asigurată de sis-
temul de control (electronic,
Digital Anolog Converter -
DAC) cantilever şi sondă
(tip). Performanţa sistemului
de control şi achiziţie este
esenţială în performanţa fina-
lă a SPM-ului, dar nu poate
elimina limitările mecanice
Figura 1.1. Scaning Probe Microscope, subsistem pentru
(din construcţie), nici limită- detectia inneractiuni sonda (tip) si esantion.
379
rile induse de proprietăţile materialelor folosite la construcţia SPM-ului,
acestea fiind parte din limitele fizice ale unui SPM.
Informaţiile care se pot ob-
ţine pe diferite sisteme de stu-
diu cu ajutorul unui SPM, în
general, nu pot fi considerate
complementare cu alte tehnici
experimentale, după cum rezultă
din Tabelul 1. Specific şi unic în
cazul SPM este capacitatea aces-
tuia de a pune în evidenţă topo-
Figura 1.2. Latice HPOG (stanga) grafia moleculară, interacţiunile
respective latice MoTe2. moleculare, imaginea celulelor,
reconstrucţia 3D şi nanomanipularea.
SPM poate include în platforma sa tehnici optice în special în cazul
AFM, cum ar fi: AFM plus
microscopie laser confocală,
imagini SNOM, sau imagine
şi spectroscopie Raman.
Tehnologia experimentală
actuală se bazează masiv pe
conceptul de imagine, res-
pectiv imagine 3D. Această
situaţie este produsul unei
lungi evoluţii a tehnologiilor
de laborator şi asigură ma-
ximul de informaţie posibil
în acest moment. Tocmai de
aceea, performanţa unei teh-
nici experimentale sau a
unui echipament modern
este complet definită de
imaginea obţinută pentru un
eşantion dat; o imagine mai
bună este echivalentă cu mai
multă informaţie, cu o mai
Figura 1.3. DNA (sus), Proteine (Seleno
Protein, Treponema Pallidum (Tp)
antigens), Virus Ebola, Bacterii (Anabaena
Variabils, Helicobacter Pilory).
380
bună calitate, cu un mai bun raport semnal zgomot, cu o mai bună liniarita-
te în sistemul de măsură, adică toate mărimile fizice istorice se regăsesc în
final în calitatea imaginii. În acest sens, sunt prezentate în continuare, prin
imagini, exemple cu ceea ce poate „vedea” un SPM (Figura 1.3).
SPM-ul a fost primul echipament (STM) care a pus în evidenţă atomii şi
acest lucru este posibil fără echipamente complexe pe eşantioane cu rugozi-
tate scăzută (monostrat atomic). În Figura 1.2 se poate vedea la rezoluţie
atomică o latice de MoTe2, respectiv HOPG. De mare interes sunt imagini-
le ce pot fi obţinute pe eşantioane biologice, dat fiind interesul crescut pen-
tru biologie şi biotehnologii. În acest sens, SPM are un rol bine definit prin
capacitatea sa unică de a putea asigura o rezoluţie ridicată pentru eşantioa-
ne superficial pregătite (Figura 1.3). De asemenea, capacitatea de
nanomanipulare simultană a
acestor eşantioane asigură pre-
misele unui nano laborator
într-un singur echipament. Lăr-
girea platformei cu elemente
specifice microscopiei optice,
SNOM şi spectroscopiei Raman
întregeşte această tehnică mo-
dernă.
Interacţiunea dintre sondă
(tip) şi eşantion, baza funcţionă-
rii SPM-ului, este exploatată şi în
spectroscopia locală de distanţă.
Într-o măsurătoare locală, este
uşor de pus în evidenţă curba
forţă– distanţă atunci când o
legătură specifică apare. După
cum se poate vedea în Figura
1.4, două situaţii distincte pot fi
observate în interacţiunea dintre
sondă (tip) şi eşantionul studiat:
a) nu există o adeziune la
suprafaţa eşantionului;
b) între sondă şi suprafaţa Figura 1.4. Nu exista adesiune (jos), adesiune intre
sonda si suprafta esantionului.
eşantionului, într-o pozi-
ţie dată (x,y), este pusă în
evidenţă o adeziune.
381
Bazat pe observaţia anterioară, se poate imagina un sistem de recunoaş-
tere moleculară, plecând de la tăria adeziunii pentru o situaţie dată; sonda
funcţionalizată (molecula
ligant) interacţionează cu
un eşantion biologic speci-
al preparat. În Figura 1.5
este reprezentat schematic
un astfel de experiment
care printr-o tehnică speci-
fică permite discriminarea
unor receptori pe suprafa-
ţa unei celule. În general,
fiecare experiment în care
este implicat SPM – ul, din
Figura 1.5. Discriminarea unor receptori pe suprafaţa unei
celule. perspectiva utilizării aces-
tuia, are multe elemente
particulare care, în final, depind în mod esenţial de experienţa utilizatoru-
lui. Cu toate acestea, avem câteva reguli generale, cum ar fi: a) celula este
un sistem prea labil pentru a putea observa o singură proteină pe suprafaţa
ei; b) acest lucru este dificil şi în cazul unei topologii moleculare. Tehnica
sondă-ligant şi analiza unei situaţii particulare prin intermediul curbelor
locale forţă – distanţă sunt de mare folos în diferite experimente de recu-
noaştere a proteinelor.
Progresele recente privind rezoluţia spaţială a tehnologiei AFM au fă-
cut din obţinerea unor imagini topografice a unei singure proteine o opera-
ţiune de rutină. Sunt încă dificil de recunoscut proteine specifice, cum sunt
receptorii, numai pe baza acestor informaţii topografice.
Deoarece interacţiunea dintre liganzi şi receptori este foarte specifică,
tehnica funcţionalizării cu anumite biomolecule (proteine, proteoglicani,
glicani, acizi nucleici) a unui vârf AFM a deschis o cale promiţătoare pentru
recunoaşterea unor molecule particulare. S-a dovedit că receptori indepen-
denţi pot fi recunoscuţi de un vârf AFM funcţionalizat cu anticorpi, printr-o
tehnică de cartare a forţei. Toate aceste rezultate au fost obţinute prin ob-
servarea unor probe corespunzător preparate pe suprafeţe substrat şi nu în
condiţii fiziologice.
Platforma Integrată pentru Nanotehnologii combină toate tehnologiile
cunoscute în Scanning Probe Microscopy (SPM) într-un singur produs, ge-
nerând astfel un nou şi performant echipament în acest domeniu. Sistemul
NTegra produs de NT-MDT Inc. este cel mai recent echipament şi singurul
382
pe plan mondial care poate fi încadrat în conceptul de NanoLaborator.
Acest concept este sugerat şi prin numele echipamentului format din gru-
pul de litere cheie NT care sunt prescurtarea de la NanoTechnology şi un al
doilea grup de litere cheie care sunt prescurtarea de la intEGRA, care în-
seamnă perfect.
Sistemul NTegra (Figura 1.6) a fost special proiectat pentru a permite
înglobarea unor tehnici de analiză ştiinţifică
(spectroscopie si/sau prepararea probelor) pe
lângă cele specifice SPM. Toate sistemele integra-
te în platforma NTegra utilizează acelaşi suport
electronic şi acelaşi program. Rezultatul acestui
concept permite reconfigurarea sistemului pentru
orice aplicaţie particulară (Figura 1.7), doar prin
program (mouse - click). Sistemul NTegra se pre-
zintă utilizatorului ca fiind o soluţie completă
pentru cercetare, industrie şi nanotehnologie.
Programul de aplicaţie înglobează lunga ex-
perienţă NT-MDT Inc. în producerea de echipa-
mente şi programe pentru nanotehnologii, îmbi-
Figura 1.6. Sitemul
nând simplitatea utilizării cu facilităţile oferite, Ntegra- Vita.
astfel încât, chiar dacă sistemul este foarte com-
plex, acesta este uşor de înţeles şi utilizat. Programul NOVA (NT-MDT)
controlează întreaga platformă, de la achiziţia de imagine la arhivarea aces-
teia, inclusiv procesarea de imagine 3D,
măsurarea caracteristicilor probei şi genera-
rea automată de rapoarte. Aproape toate
setările sistemului sunt controlate de pro-
gramul NOVA.
În acest moment, Laboratorul de Nano-
tehnologii Fizice are în dotare un sistem
NTegra Vita care integrează două micro-
scoape optice performante, un sistem SPM
şi un controler de temperatură pentru mă-
surarea probelor biologice în aer sau lichid
(inclusiv în mediul de cultură, cu posibilita-
tea schimbării acestuia pe durata măsurăto-
rilor). Nu în ultimul rând, trebuie menţiona-
te metodele avansate de litografie disponibi-
Figura 1.7. Subsitem scanner integrat le (scratching, current); pentru litografie,
in microscopul optic.
383
programul NOVA are aplicaţii, facilităţi de generare automată de imagini
sau mai mult, pot fi preluate imagini „gray level” şi transpuse pe suprafaţa
de investigat. În proiectele noastre, utilizăm intensiv facilitatea open soft-
ware a programului NOVA care permite, prin Vbscript, realizarea unor
extensii sau automatizarea unor secvenţe de genul măsurare, procesare
imagine şi generare de rapoarte. În acest fel, programul poate fi extins pen-
tru orice aplicaţie utilizator fără a fi nevoie de cunoştinţe de programare
avansată. Metodele de bază SPM, cât şi unele performanţe ale sistemului
NTegra Vita sunt enumerate in Tabelul 2.
Tabel 2
SPM methods in air and AFM(contact, semi-contact, non-contact);
liquid LFM (Lateral Force Microscopy);
AFI(Adhesion Force Imaging); Force
Modulation; Phase Imaging; AFM
Lithography (scratching); Forces-Distance
Curves
in air only STM/MFM (Magnetic Force Microscopy);
Electrostatic Force Microscopy; Scanning
Capacitance Microscopy; Kelvin Probe
Microscopy; Spreading Resistance Imaging;
Lithography: AFM (current), STM
Sample size in air by sample Φ 40 mm, 15 mm in height and
Φ 100mm , 15 mm in height by probe
in liquid by sample up to 14x14x2.5 mm and by pro-
be up to 15x15x3 mm
Scan Range 100x100x10 μm
up to 200x200x20 μm in DualScan mode
Temperature control Range from RT to 60˚ C
(for operation in fluid Stability +/- 0.005˚ C (typically), <= +/- 0.01 ˚ C
environment )
O pagină help bine documentată cu descrierea funcţiilor de bază şi câ-

teva exemple de utilizare asigură accesul utilizatorului la semnale de bază
din sistem. Ntegra Vita are facilitaţi de excepţie pentru investigarea de pro-
be biologice cum ar fi: incinte închise/deschise stabile chimic care pot ope-
ra cu discuri Petri, controlul temperaturii pentru lichide, diverse tipuri de
încălzitoare pentru lichid şi măsurarea probelor biologice cu schimbarea
lichidului cu flux controlat pe parcursul experimentului, sau între experi-
mente.
384
2. Bibliografie
1. Drexler KE, Molecular nanomachines: physical principles and implementation
strategies, Ann Rev Biophys Biomol Struct, 23, 377-405, 1994.
2. Goodsell DS, Bionanotechnology: lessons from nature, Wiley-Liss, Inc., Hoboken, New
Jersey, 2004.
3. Rubio-Sierra FJ, Heckl WM, Stark RW, Nanomanipulation by atomic force
microscopy, Adv Eng Mater, 7, 193-196, 2005.
4. Ferreira A, Mavroidis C, Virtual reality and haptics for nanorobotics, IEEE Robot
Autom Mag, 13, 78-92, 2006.
5. Heckl WM, Molecular self-assembly and nanomanipulation - two key technologies
in nanoscience and templating, Adv Eng Mater, 6, 843-847, 2004.
6. Hench LL, Polak JM, Third-generation biomedical materials, Science, 295,
1014-1017, 2002.
7. Polak JM, Bishop AE, Stem cells and tissue engineering: past, present, and future,
Ann NY Acad Sci, 1068, 352–366, 2006.
8. Hu Q, Tan Z, Liu Y, Tao J, Cai Y, Zhang M, Pan H, Xu X, Tang R, Effect of
crystallinity of calcium phosphate nanoparticles on adhesion, proliferation, and
differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells, J Mater Chem, 17,
4690-4698, 2007.
9. Winfree E, Liu F, Wenzler LA, Seeman NC, Design and self-assembly of
two-dimensional DNA crystals, Nature, 394, 539-544, 1998.
10. Dufrene YF, Hinterdorfer P, Recent progress in AFM molecular recognition
studies, Pflugers Arch - Eur J Physiol, 456, 237-245, 2008.
11. Dammer U, Popescu O, Wagner P, Anselmetti D, Guntherodt HJ, Misevic GN,
Binding strength between cell adhesion proteoglycans measured by atomic force
microscopy, Science, 267, 1173-1175, 1995.
12. Hards A, Zhou C, Seitz M, Brauchle C, Zumbusch A, Simultaneous AFM
manipulation and fluorescence imaging of single DNA strands, Chem Phys Chem, 6,
534-540, 2005.
13. Revyakin A, Ebright RH, Strick TR, Single-molecule DNA nanomanipulation:
Improved resolution through use of shorter DNA fragments, Nat Methods, 2,
127-138, 2005.
14. Liu Z, Li Z, Wei G, Song Y, Wang L, Sun L, Manipulation, dissection, and
lithography using modified tapping mode atomic force microscope, Microsc Res
Tech, 69, 998-1004, 2006.
15. Lu J, An H, Li H, Li X, Wang Y, Li M, Zhang Y, Hu J, Nanodissection, isolation, and
PCR amplification of single DNA molecules, Surf Interface Anal, 38, 1010-1013, 2006.
16. Li B, Zhang Y, Yan SH, Lu JH, Ye M, Li MQ, Hu J, Positioning scission of single
DNA molecules with nonspecific endonuclease based on nanomanipulation, J Am
Chem Soc, 129, 6668-6669, 2007.
17. Hu J, Zhang Y, Li B, Gao HB, Hartmann U, Li MQ, Nanomanipulation of single
DNA molecules and its applications, Surf Interface Anal, 36, 124-126, 2004.
18. Crocker JC, Golden handshake, Nature, 451, 528-529, 2008.
19. Kufer SK, Puchner EM, Gumpp H, Liedl T, Gaub HE, Single-molecule
cut-and-paste surface assembly, Science, 319, 594-596, 2008.
20. Nykypanchuk D, Maye MM, van der Lelie D, Gang O, DNA-guided crystallization
of colloidal nanoparticles, Nature, 451, 549-552, 2008.
21. Peng L, Stephens BJ, Bonin K, Cubicciotti R, Guthold M, A combined atomic
force/fluorescence microscopy technique to select apatamers in a single cycle from
a small pool of random oligonucleotides, Microsc Res Tech, 70, 372-381, 2007.
385
3. Implementarea Noilor Tehnologii
Introducere. Nevoia unei interacţiuni om-maşină naturale, intuitive şi a
unui feedback senzorial multi-modal a determinat proiectarea unor maşini
care asigură utilizatorului generarea unor comenzi prin mişcarea mâinilor. În
acelaşi timp, utilizatorul primeşte informaţii despre forţe sau coliziuni ale
mâinilor sale, pentru a crea acestuia o percepţie naturală. Aceste maşini sunt
denumite interfeţe haptice, unde prin haptic înţelegem ştiinţa pipăitului. De-
oarece cercetările iniţiale au fost promiţătoare, acestea au generat o adevărata
competiţie în încercarea de a dezvolta o interfaţă haptică naturală.
O problemă majoră legată de sistemul tactil uman constă în faptul că
nu este foarte bine cunoscut, spre deosebire de alte modalităţi de interacţi-
une: percepţia vizuală, vorbirea sau sistemul motor. Studiul abilitaţilor tac-
tile umane este o încercare recentă şi multe din sistemele disponibile astăzi
nu incorporează cunoştinţe din domeniile psihofizicii, biomecanicii şi ele-
mente neurologice ale percepţiei haptice. Dezvoltarea unor interfeţe şi dis-
pozitive haptice moderne necesită studii extensive pentru a înţelege legătu-
ra dintre fenomenele perceptuale şi măsurătorile biologice, urmată de în-
corporarea acestor cunoştinţe în ingineria interfeţelor haptice. Aceste dis-
pozitive bazate pe interfaţa haptica prezintă o mare oportunitate în dezvol-
tarea unor aplicaţii generic asistative care să permită manipularea na-
no-obiectelor precum şi imersia totală în realitatea virtuală a utilizatorului.
Motivare. Când noi suntem prezenţi undeva, privim în jurul nostru,
privim către lucruri din diverse unghiuri, simţim lucruri interesante cu aju-
torul mâinilor, privim comportamentul lucrurilor care se mişcă sau se
schimbă, putem lua lucrurile pentru a le rearanja şi putem interacţiona cu
acestea pentru a vedea răspunsul lor.
Interfaţa ideală dintre om şi SPM trebuie să prezinte utilizatorului su-
prafaţa investigată ca o reprezentare 3D mărită pe care să o poată pipăi şi
care să poată fi modificată cu ajutorul unor unelte controlate de mână. Sis-
temul de control va translata mişcarea uneltei în mişcarea sondei SPM-ului
şi va translata parametrii măsuraţi ai suprafeţei sub forma unei forţe aplica-
te uneltei simultan cu informaţii vizuale şi/sau audio despre parametrii
suprafeţei. Când este utilizat un astfel de sistem, cercetătorul percepe că
poate interacţiona direct cu suprafaţa de investigat. Mişcarea naturală a
capului sau mâinilor poate fi utilizată pentru a investiga şi modifica supra-
faţa care este afişata la scala cercetătorului. Această metodă va asigura cer-
cetătorului posibilitatea de a se concentra pe investigarea suprafeţei şi pro-
prietarilor asociate şi nu asupra programării unei interfeţe.
În viitorul apropiat, noi vom avea mult de învăţat despre lumea la scală
386
nano, inclusiv despre modul cum proprietăţile mecanice, transportul de
sarcină şi dinamica acestor proprietăţi sunt afectate de structura la scală
atomică a nano-obiectelor, precum şi legat de interfaţa cu obiectele la scală
nano. Nanomanipularea dă o semnificaţie aparte acestor probleme,
oferindu-ne posibilitatea de a investiga individual nano-obiecte cu facilitaţi
de excepţie obţinute prin combinarea caracteristicilor unor proprietăţi fizice
cu informaţiile structurale. Interfaţa utilizator avansată va juca un rol cruci-
al prin modul transparent de a experimenta la scală nano, oferind cercetă-
torului posibilitatea de a fi virtual în dimensiune nano.
Sistemul de Nanomanipulare. Nanomanipulatorul este obţinut prin
integrarea unui microscop de scanare a probei împreună cu controller-ul,
un dispozitiv SPIDAR (Space Interface Devices for Artificial Reality, Figu-
ra 3.1) cu feedback de forţă împreună cu controller-ul şi o reţea de calcula-
toare PC cu facilităţi grafice avansate. Acest cluster local format din cel
puţin trei calculatoare comunică printr-o reţea IP.
Figura 3.1. Interfaţa SPIDAR.
Scopul unei interfeţe SPIDAR este de a asigura cercetătorului imersia

virtuală în lumea la scală nano. Prin combinarea unui SPM cu o interfaţă de
realitate virtuală asigurăm o afişare intuitivă a datelor produse de instru-
ment, precum şi un control natural al funcţiilor acestuia. Semnificaţia inter-
feţei de realitate virtuală a SPM-ului este aceea de a simula prezenţa cerce-
tătorului pe suprafaţa de investigat. Beneficiile unei asemenea tehnologii
sunt:
387
a) îmbunătăţirea percepţiei structurilor 3D,
b) explorarea efectivă a suprafeţei de investigat,
c) abilitatea de a observa procese dinamice aproape în timp real
d) şi posibilitatea de a modifica interactiv suprafaţa.
Microscopul de scanare a probei (SPM) este un instrument extrem de
rafinat pentru explorarea şi manipularea la scală nanometrică. Multe expe-
rimente au fost realizate prin controlul preprogramat sau în buclă deschisă
a probei SPM-ului, urmat de un feedback al parametrilor pe durata modifi-
cărilor şi utilizând pseudo-culori sau imagini ale liniilor, pe măsura ce se
colectează datele. Pe lângă datele despre topografia suprafeţei, SPM-ul poa-
te colecta multe alte date despre parametrii fizici specifici eşantionului.
Acestea includ măsurători de conductanţă şi măsurarea de curbe cu-
rent/distanţă (STM), forţe laterale şi de adeziune (AFM), transmisia laser a
diverse lungimi de undă şi polarizări (NFOM – near field optical
microscopy), proprietăţi magnetice (MFM – magnetic force microscopy),
temperatură sau alţi parametri fizici. Câţiva dintre aceşti parametri sunt repre-
zentaţi natural pe canalele vizuale ca informaţie de culoare sau înălţime, dar aceas-
tă afişare nu permite cercetătorului să vadă corelarea dintre aceste informaţii şi
topografia suprafeţei. În acest caz, este util să afişăm aceşti parametri într-un spa-
ţiu virtual, într-un mod nerealist, dar într-o manieră utilă. Pentru vizualizarea
ştiinţifică, utilitatea unei tehnici este mult mai importantă decât realismul.
Figura 3.1. Interfaţa SPIDAR.
388
Sistemul Multimodal. Au fost studiate şi dezvoltate câteva moduri de
vizualizare a unor seturi de date. A fost revăzută problema relativ simplă a
rendering-ului 3D pentru o suprafaţă, ca un exemplu a consideraţiilor im-
plicate. Într-un caz simplu, setul de date pentru o abordare prin interfaţa
SPIDAR este de fapt topografia suprafeţei (Figura 3.2). O afişare naturală a
unui set de date 3D este posibilă prin iluminarea direcţionată a suprafeţei.
Utilizând procesarea de imagine 3D, este acum posibil să creăm un
rendering în timp real al suprafeţei, pe măsură ce datele sunt achiziţionate
de SPM. Se poate asigura interacţiunea în timp real cu parametrii de vizua-
lizare cum ar fi direcţia iluminării, unghiul de vizualizare şi scalarea, prin
interfaţa haptică, a feedback-ului de forţă.
O procesare de imagine 3D utilizează un mixaj de imagini într-un
head-mounted display (HMD). Implementarea unei componente de vedere
cu raze X la programul nanomanipulatorului SPM, tehnologie bine cunos-
cută în câteva aplicaţii de avionică, introduce conceptul de realitate îmbună-
tăţită. Acest concept generează noi aplicaţii în nanomanipulare şi asigură,
pe timpul unor situaţii complexe, efectiv o vedere cu raze X utilizatorului,
prin combinarea unui rendering grafic computerizat cu elementele ascunse.
În această etapă tehnologică, acest concept este foarte elegant în simplitatea
sa şi foarte util pentru o unitate de nanomanipulare.
Figura 3.2. Interfaţa SPIDAR in timpul unei operaţii de nano-manipulare.
389
Vizualizarea 3D nu este întotdeauna cea mai bună soluţie pentru supra-
feţe cu mici denivelări; de regulă o vedere prin pseudo-culoare este superi-
oară unei vizualizări 3D prin umbre. Acest lucru este adevărat din două
considerente: pseudo-colorarea dedică întreg domeniul de intensitate
adâncimii şi sunt, de asemenea, netezite micile fluctuaţii cauzate de zgomo-
tul conţinut în imaginea suprafeţei. Pentru caracteristicile care sunt semni-
ficative numai prin diferenţa mare de înălţime faţă de suprafaţa imaginii,
imaginile pseudo-colorate au dedicat întreg domeniul de intensităţi pentru
a evidenţia aceste diferenţe. Folosirea umbrelor este echivalentă cu desena-
rea suprafeţei, utilizând numai o lumină ambientală cu intensitatea funcţie
de înălţime. Această tehnologie poate lucra bine pentru imagini lipsite de
zgomot, dar imaginile din lumea reală conţin întotdeauna zgomot. Pentru
imaginile SPM, o suprafaţă plată are un mare conţinut de zgomot şi acesta
este exprimat ca o fracţie, din caracteristicile imaginii. Acest zgomot va de-
termina o fluctuaţie a iluminării caracteristicilor cu aceeaşi magnitudine,
uneori reuşind, din păcate, să le facă neobservabile.
De asemenea, micile caracteristici de pe suprafaţă conţinute în alte mari
variaţii sunt mai bine puse în evidenţă prin utilizarea unei hărţi de culoare
şi iluminarea puternică a suprafeţei 3D (acestea ar fi imperceptibile într-o
reprezentare 2D). Abilitatea cercetătorului de a recunoaşte structuri mole-
culare specifice în prezenţa zgomotului este îmbunătăţită prin vedere ste-
reoscopică, grafica 3D bazată pe umbre cu hărţi de culoare iluminate pu-
ternic. Asigurând afişarea stereoscopică şi nu cea monoscopică, pentru
cercetător este mai uşor să perceapă adâncimea obiectelor virtuale apropia-
te. Percepţia spaţială 3D a datelor SPM cu acurateţe face posibilă pentru
cercetător utilizarea cunoştinţelor sale ştiinţifice la recunoaşterea unor
structuri şi caracteristici de interes.
Este neaşteptat să ne imaginăm că putem acum oferi posibilitatea cerce-
tătorului nu numai de a vedea nano suprafeţe cu ajutorul SPM, dar să şi acţi-
oneze asupra lor şi să le atingă. Conceptual, acest sistem este echivalent cu
un sistem tele-robotic care operează între două scale foarte diferite, spre deo-
sebire de sistemele tele-robot utilizate în chirurgie. Noi utilizăm o interfaţă
haptică cu feedback de forţă care sesizează poziţia 3D a o-ring-ului SPIDAR
(cu capabilităţi adiţionale pentru a sesiza 3DOF – grade de libertate) şi aplică
forţele de la nivel nano adecvat scalate în mâna utilizatorului. Poziţia
o-ring-ului în spaţiu poate controla diferite caracteristici afişate, cum ar fi
controlul unghiului de vizualizare a suprafeţei. De asemenea, pe perioada
modificărilor suprafeţei, un feedback de forţă asigură un control intuitiv al
probei şi permite sesizarea contururilor de pe suprafaţă. Această abilitate
390
asigură controlul precis al suprafeţei şi deschide calea unor noi experimente.
Feedback-ul de forţă este esenţial în găsirea structurilor ce urmează a fi mo-
dificate, găsirea traseului pentru modificare şi asigurarea unei atingeri fine
care să permită începerea unui ciclu experimental în secvenţa scana-
re-modificare-scanare. De asemenea, fedback-ul de forţă asigură utilizatoru-
lui posibilitatea de a localiza obiecte şi caracteristici ale suprafeţei, simţind
când proba SPM se apropie de punctul de la care sunt posibile modificările.
În final, sistemul de nanomanipulare înregistrează toate datele, inclu-
zând topografia suprafeţei şi canalele externe, cum ar fi conductanţa cu
secvenţa de timp pe care o numim fişier stream. Acest fişier poate fi redat
mai târziu pentru a revedea întregul experiment, inclusiv corelarea cu pro-
prietăţile măsurate cu o up-datare a imaginilor structurii. Utilizatorului ii
este extrem de util să revadă experimentul pentru a vedea ce decizii a luat
pe parcursul desfăşurării acestuia (analiza post-expriment).
Percepţia Multimodală şi Intermodală. O abilitate deosebită a oameni-
lor este aceea de a dezvolta capabilităţi de coordonare intermodală şi de
procesare a modelelor. De exemplu, numai dacă privim un obiect, noi pu-
tem face o predicţie despre caracteristicile lui tactile cu o acurateţe rezona-
bilă. Un sistem automat cu abilitatea de a face o predicţie despre cum sim-
ţim obiectele de tipul celor reprezentate prin valori ale pixelilor are multi-
ple aplicaţii în generarea automată a datelor haptice. Un astfel de sistem
poate fi de exemplu unul care construieşte nano-blocuri şi un dispozitiv
care asistă cercetătorul şi asigură generarea de date haptice despre na-
no-mediul apropiat.
Abilitatea de a sesiza şi percepe obiecte dincolo de zona accesibilă (Figu-
ra 3.3) este extrem de importantă în activităţile zilnice cum ar fi conducerea
maşinilor, navigaţia şi aşa mai departe. Vederea asigură fiecăruia abilitatea
de a plănui şi executa activităţi spaţiale (zonă cunoscută ca fiind kinesferă).
Mai mult, corelarea dintre văz , auz şi senzaţiile tactile determină redundanta
în reprezentarea spaţială care asigură fiecăruia dintre noi utilizarea transferu-
lui intermodal şi coordonarea mecanică pentru activităţile spaţiale.
Studiile efectuate pe persoane nevăzătoare arată că au abilitaţi eficiente
în câteva activităţi spaţiale, în special în discriminarea texturilor, în descrie-
rea acestora, descrierea formelor, discriminarea formelor, recunoaşterea obi-
ectelor şi descrierea acestora. Cu toate acestea, o limitare majoră a percepţiei
tactile este dată de dimensiunea kinesferei. În al doilea rând, persoanele ne-
văzătoare construiesc modele intercorelate între canalul auditiv şi cel haptic,
iar cercetările psihologice au arătat că aceste modele nu sunt adaptate pentru
percepţia de stimuli la distanţă, aşa cum avem în cazul văzului.
391
Figura 3.3. Interfata SPIDAR in timpul unei operatii de recunoastere haptica a unei structuri create
anterior prin nano-manipulare.
Nevoia de noi experimente şi dezvoltarea de algoritmi care pot îmbu-

nătăţi percepţia în lumea de scală nano prin stimulare în timp real vizual,
audio şi haptic este un domeniu fascinant de cercetare. Feedback-ul de forţă
capturează procese din SPM şi acest lucru este denumit în literatura „ex-
plorare haptică a nano-obiectelor”. Explorarea haptică a nano-obiectelor se
referă în esenţă la mişcarea mâinii, utilizată de cercetător pentru a percepe
un nano-obiect. Gesturile utilizate de cercetător pentru a percepe caracteris-
ticile unui nano-obiect au o structură logică şi asigură înţelegerea caracteris-
ticilor unui nano-obiect. Captura vizuală SPM poate fi ajutată prin stocarea
profilului haptic sau de atingere al unui obiect sub forma miscărilor mâinii.
Odată ce un obiect a fost capturat vizual, în faza de antrenament, utilizato-
rul urmează să categorisească perceptual forma, dimensiunea, greutatea,
textura şi materialul nano-obiectului haptic. Aceste modele computaţionale
sunt dezvoltate pe baza modelelor neuropsihologice şi cognitiv psihologice
ale analizei caracteristicilor vizual-haptice. Modelele computaţionale sunt
dezvoltate la nivelul tehnologic actual ca şi prototipuri vizual-haptice.
Aceste structuri de date care stochează atât caracteristicile vizuale cât şi pe
cele haptice ale obiectului sunt baza dezvoltării unor cartografieri automate
dintre diferite caracteristici vizuale şi haptice. Aceste prototipuri stocate
într-o bază de obiecte haptice împreună cu strategiile de explorare haptic
392
asigură baza de date pentru nano-spaţiu, fiind suportul oferit de tehnologia
actuală pentru viitoare aplicaţii în nano-robotică.
4. Bibliografie
1. Jeffrey W. Roberts, BIOCHEMISTRY: RNA Polymerase, a Scrunching Machine,
Science 17 November 2006 314: 1097-1098.
2. Guangyu Zhang, Xin Jiang, and Enge Wang, Tubular Graphite Cones, Science 18
April 2003 300: 472-474.
3. Aurélien Bancaud, Natalia Conde e Silva, Maria Barbi, Gaudeline Wagner,
Jean-François Allemand, Julien Mozziconacci, Christophe Lavelle, Vincent
Croquette, Jean-Marc Victor, Ariel Prunell, Jean-Louis Viovy, Structural plasticity of
single chromatin fibers revealed by torsional manipulation, Nature Structural & Molecu-
lar Biology 13, 444 - 450 (01 May 2006).
4. Peter Karageorgiev, Dieter Neher, Burkhard Schulz, Burkhard Stiller, Ullrich
Pietsch, Michael Giersig, Ludwig Brehmer, From anisotropic photo-fluidity towards
nanomanipulation in the optical near-field, Nature Materials 4, 699 - 703 (01 Sep 2005).
5. Andrey Revyakin, Richard H Ebright, Terence R Strick, Single-molecule DNA
nanomanipulation: Improved resolution through use of shorter DNA fragments, Nature
Methods 2, 127 - 138 (01 Feb 2005).
6. Luthi, R., Meyer, E., Haefke, H., Howald, L., Gutmannsbauer, W., and Guntherodt,
H. J., Sled-Type Motion on the Nanometer Scale: Determination of Dissipation and
Cohesive Energies of C60, Science 266 (December 23), 1979 - 1981, 1994.
7. Resch, R., Baur, C., Bugacov, A., Koel, B. E., Madhukar, A., Requicha, A. A. G., and
Will, P., Building and manipulating three-dimensional and linked two- dimensional
structures of nanoparticles using scanning force microscopy, Langmuir 14 (23), 6613-
6616, 1998.
8. Taylor II, R. M. and Superfine, R., Advanced Interfaces to Scanning Probe Microscopes,
in Handbook of Nanostructured Materials and Nanotechnology, Nalwa, H. S. Academic
Press, New York, 1999, pp. 271-308.
9. Falvo, M. R., Clary, G., Helser, A., Paulson, S., Taylorr II, R. M., Chi, V., Brooks Jr.,
F. P., Washburn, S., and Superfine, S., Nanomanipulation experiments exploring
frictional and mechanical properties of carbon nanotubes, Microsc. Microanal. 4, 504-512,
1998.
393
XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI
DE RAZE X (XPS) ŞI ULTRAVIOLETE (UPS)
Spectroscopia fotoelectronică
C.S.III. dr. Maria Teodora Radu
Cuprins
I.Concepte de bază .................................................................................................... 395
1. Analiza de suprafaţă ............................................................................................ 395
2. Spectroscopia fotoelectronică cu radiaţie UV (UPS) ............................................ 396
2.1. Caracteristici generale .................................................................................. 397
2.2. Spectrele UPS şi energia de rezoluţie ........................................................... 398
3. Spectroscopia fotoelectronică de raze X ................................................................ 400
II. Design-ul şi principiul de funcţionare al spectrometrului de electroni ............... 401
1. Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS ............................................... 402
1.1. Caracteristici generale ................................................................................... 402
1.2. Descrierea Analizorului ................................................................................ 402
1.2.1. Sistemul de lentile ............................................................................... 405
1.2.2. Analizorul Emisferic (HSA) ............................................................... 410
1.2.3. Izolarea Magnetică .............................................................................. 412
1.2.4. Mecanismul de tăiere a orbitei ............................................................ 412
1.2.5. Detector Multicanal MCD ................................................................. 414
1.2.5.1. Principiile Detecţiei .................................................................. 414
1.2.5.2. Coerenţa între şi pas ...................................................... 415
1.2.5.3. Multiplicarea Electronică ......................................................... 415
2. Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M) ................................................. 416
2.1. Principiu de funcţionare................................................................................ 416
2.2. Descrierea sursei ........................................................................................... 417
2.2.1. Generarea fotonilor de raze X ............................................................. 417
2.2.2. Monocromatorul ................................................................................. 417
2.2.3. Informaţii generale în legătură cu sursa XR 50 M ............................ 421
2.2.3.1. Modul de focalizare................................................................... 421
2.2.3.2. Răcirea cu apă ........................................................................... 422
3. Flood-Gun 15/40 .................................................................................................. 422
3.1. Informaţii generale ........................................................................................ 422
3.1.1. Componente ........................................................................................ 422
4. Bibliografie ........................................................................................................... 423
394
I. Concepte de bază
1. Analiza de suprafaţă
Spectroscopia fotoelectronică a fost stabilită ca una din cele mai impor-
tante metode de studiu a structurii electronice a moleculelor, solidelor şi
suprafeţelor [1-2]. Mai mult, are pe scară largă implicaţii practice în diferite
domenii ca de exemplu fizica şi chimia suprafeţelor sau ştiinţa materialelor,
şi a contribuit semnificativ la înţelegerea principiilor fundamentale din fizi-
ca corpului solid [1-5].
Principiul fundamental al procesului de fotoemisie este prezentat
schematic în fig.1 Această figură simplificată arată atractivitatea spectro-
scopiei de fotoemisie, pentru că proprietăţile fotoelectronilor emişi reflectă
în principal stările electronice proprii ale sistemului investigat. În principiu
se poate face distincţie între fotoemisia cu radiaţie în ultraviolet (UPS) utili-
zată în principal pentru investigaţii ale stărilor din benzile de valentă şi
spectroscopia de fotoemisie cu raze X (XPS) care permite identificarea ato-
milor la suprafaţa solidelor şi determinarea deplasărilor în energiile de le-
gătură ale core-level-urilor care sunt legate de diferite moduri de legături
chimice, la energii de legătură mai mari. Această separare se bazează în
principal pe cele două tipuri diferite de sursă de excitare cvazi-mono-
cromatică disponibile în laboratoarele de cercetare şi anume: spectrul liniei
UV a lampei de descărcare pentru energii în domeniul de aproximativ
10-50 e.V. cu gaze rare ca heliu (He I: 21.23 eV si He II: 40.82 eV) şi liniile
ceraracteristice ale unei surse de raze X care utilizează de obicei ca materia-
le pentru anod aluminiul (Al - Kα1,2: 1486.6 eV) sau magneziul (Mg -
Kα1,2:1253.6 eV). Deşi lărgimea liniei este de obicei suficient de mică pentru
multe aplicaţii, de ex. câţiva meV pentru lampa de descărcare şi aprox. 1 eV
pentru anozii sursei de raze X, folosirea unui monocromator suplimentar
poate fi un avantaj atât pentru energia de rezoluţie cât mai ales pentru su-
primarea background-ului şi a intensităţilor sateliţilor care pot să apară în
spectru.
Electronii cu energia de legătura EB pot fi excitaţi deasupra nivelului E
de către fotoni cu energia hν > EB + Φ0. Distribuţia fotoelectronilor I(Ekin)
poate fi măsurată de analizor şi reprezintă în prima aproximaţie o imagine
a densităţii stărilor electronice ocupate N(EB) în proba analizată.
În general, suprapunerea dintre rezultatele experimentele de spectro-
scopie de fotoemisie şi teorie este necesară pentru investigarea a numeroase
proprietăţi a stării solide, inclusiv dispersia benzii de valenţă magnetismul
395
Figura 1. Prezentare schematică a procesului de fotoemisie
în modelul uni-particulă.
şi suprafaţa Fermi. Investigarea experimentală a acestor proprietăţi necesită

o energie de rezoluţie de ordinul meV. În acest context, în ultimii ani s-au
efectuat îmbunătăţiri remarcabile d.p.d.v. tehnic în domeniul spectrometre-
lor de înaltă rezoluţie.
2. Spectroscopia fotoelectronică cu radiaţie UV (UPS)

Această tehnică este folosită pentru a studia nivelele de energie din
banda de valenţă şi legăturile chimice corespunzătoare. Mai mult, în cazul
chemosorbţiei metoda ne permite studierea nivelelor electronice de energie
derivate din orbitali moleculari ai sistemului substrat absorbit. Metoda a
fost dezvoltată iniţial în 1962 de David W. Turner pentru studierea mole-
culelor în faza gazoasă[6] şi ulterior dezvoltată până la nivelul actual.
În prezent, UPS joacă un rol important în obţinerea structurii benzii de
valenţă a unui număr mare de solide şi suprafeţe, furnizând informaţii
despre dispersia fononilor în solide, aproape la fel ca difracţia de neutroni.
De asemenea, trebuie menţionate câteva exemple pentru caracteristici
“many-body” ce pot fi puse în evidenţă pe scala meV în spectrele de foto-
emisie UPS a sistemelor solide: (111) stări de suprafaţă de tip Shockley pen-
tru Cu(1 1 1) [7-8], gap-ul supraconductor al unui supraconductor conven-
396
ţional (V3Si), [9] şi rezonanţă Kondo în sistemele cu fermioni grei,
(CeCu2Si2) [10-11]. Aceste exemple sunt reprezentative pentru înţelegerea
unor probleme mult mai complexe în fizica stării solide cum ar fi supra-
conductivitatea de temperatură înaltă (HTSC) şi compuşii cu fermioni grei.
2.1. Caracteristici generale

Fluxul fotonilor emişi de sursa de-a lungul axei optice poate fi deter-
minat utilizând formula
Φ = I ph * Ω ,
unde (1)
Φ- fluxul fotonilor (sec-1); Iph - densitatea fotonilor (sec-1sr-1); Ω- unghiul
solid (sr-1);
În prima aproximaţie unghiul solid rezultă din zona iluminată a probei
şi distanţa dintre capilar şi probă:
π + r2 (2)
Ω=
d2
d
R= (3)
(1 − 2d*cr )
R - raza ariei excitate din proba; d - distanţa de la capilar la probă
(aprox 40 mm); dc - diametrul capilarului (1.3 mm).
Figura 2. Schema pentru aproximaţia unghiului solid
Fluxul de fotoni poate fi calculat folosind formula:

1
Φ= , unde (4)
e* r
I- curentul fotonic pe probă; η - randamentul total de electroni
397
Din (1) si (4) rezultă:
2
⎛ d ⎞ (5)
I ph = I * ⎜⎜ dc ⎟⎟ / e *π * r 2 *η
⎝ 1 − 2*r ⎠
Pentru o arie iluminată a probei de aprox. 2.22 mm diametru şi un cu-
rent pe proba de 55 nA, densitatea fotonilor este calculată ca fiind:
Iph= 8.3 * 1015 fotoni sr-1sec-1
2.2. Spectrele UPS şi energia de rezoluţie

Sursa UV de tipul UVS 10/35 este în principal utilizată pentru studiul
densităţii de stări a electronilor de valentă. Descărcarea VUV acoperă un
interval de energie al fotonilor de la 10 la 50 eV. Lăţimea liniei de excitare,
este în general de câţiva meV de aceea monocromatizarea suplimentară nu
este necesară în cele mai multe cazuri.
Datorită caracterului cvasimonocromatic al liniilor de excitare se poate
obţine energie de rezoluţie înaltă (aprox. 0.01 eV) ceea ce permite rezolva-
rea structurilor vibraţionale moleculare.
În intervalul VUV de energii joase (<20 ev, sau< 12 eV energie a fotoni-
lor) spectrele fotoelectronilor UV excitaţi, forma şi structura lor, depind pu-
ternic de energia fotonilor excitanţi. Pentru energiile fotonilor VUV în inter-
valul 20 - 40 eV structurile electronilor de valenţă s-like sunt suprimate în
comparaţie cu orbitalii p-like. Dacă energia fotonilor este 40 eV structurile
d-like sunt generate cu o probabilitate de excitare mare. De aceea, în plus faţă
de XPS, spectrele UV ale fotoelectronilor exciţi pot fi comparate cu rezultatele
teoretice obţinute din calculul structurilor de benzi, şi folosite pentru deter-
minarea unor informaţii specifice suplimentare în analiza de suprafaţă.
Figura 3. Determinarea funcţiei de lucru, Φ, cu UPS
398
Potrivit figurii 3, funcţia de lucru, Φ, este exprimată astfel:
Φ= Evac - EF, unde (6)
Evac- nivelul de energie al vidului; EF- nivelul Fermi.
În general, pentru un electron emis de la un nivel de energie EB < EF:
Ekin= h * ν – (EB - Φ) (7)
unde, hν este energia fotonului.
Pentru un electron emis de la nivelul Fermi (figura 3B), pentru energia
de legătură şi energia cinetică avem:
EB= 0 (8)
Emax= h * ν – Φ, (9)
unde Emax este cea mai mare energie cinetică.
Un electron emis de la un nivel de energie Ex < Ef (figura 3C) are o

energie cinetică minimă (Emin= 0). Acest electron ar apărea în poziţia A în
figura 4.
Figura 4. Determinarea funcţiei de lucru, Φ, prin măsurători UPS
Diferenţa dintre energiile cinetice ale electronilor la poziţiile A şi B este

Emax - Emin adică:
Emax - Emin= h * ν – Φ (10)
Această diferenţă este egală cu distanţa de la A la B, adică lăţimea spec-
trului cu ΔE= constant în figura 4.
Prin urmare, funcţia de lucru poate fi calculată folosind formula:
Φ= h * ν – (Emax - Emin) (11)
399
3.Spectroscopia fotoelectronică de raze X
În XPS, în general suntem preocupaţi de o formă specială de fotoemi-
sie, adică de emiterea unui electron de la un nivel de bază datorită acţiunii
unui foton de raze X de energie hv. Energia fotoelectronului emis este apoi
analizată de un spectrometru de electroni şi datele sunt prezentate ca un
grafic de intensitate funcţie de energia fotoelectronilor emişi.
Energia cinetică a electronilor (EK) este experimental măsurată cantitativ
de spectrometru, dar acest lucru depinde de energia fotonilor razelor X im-
plicate şi de aceea nu este o proprietate a materialelor intrinseci. Energia de
legătură a electronilor (EB) este parametrul care identifică specificul electroni-
lor. Relaţia dintre parametrii implicaţi în XPS este:
EB = hv - EK - W,
unde hv este energia fotonilor, EK este energia cinetică a electronilor şi W
(cst) este funcţia de lucru a spectrometrului.
Cantităţile din dreapta relaţiei sunt cunoscute sau măsurabile. În prac-
tică, acest lucru va fi efectuat de către sistemul de control sau de sistemul
de date asociat cu spectrometrul. Operatorul doar selectează o scală de
energie cinetică sau de legătură, care este considerată mai adecvată.
Spectrul de fotoelectroni va reproduce structura electronică a unui
element destul de precis, deoarece toţi electronii cu o energie de legătură
mai mică decât energia fotonilor vor fi cuprinşi în spectru. Acest lucru este
ilustrat în figura următoare, unde, spectrul XPS al plumbului este suprapus
pe o reprezentare a orbitalilor electronici.
Figura 5. Spectru fotoelectronic al plumbului

care arată modul în care electronii scapă din
solid, contribuind la vârfuri discrete, sau pot
suferi pierderi de energie şi să contribuie la fun-
dal; spectrul este suprapus pe o structură elec-
tronică schematică a plumbului pentru a studia
modul în care fiecare orbital dă naştere la linii
fotoelectronice.
Aceşti electroni care sunt excitaţi şi scapă fără a pierde energie, contri-
buie la vârfurile caracteristice în spectru; cei care sunt supuşi unei împrăşti-
eri inelastice şi suferă pierderi de energie, contribuie la fondul spectrului.
Odată ce fotoelectronul a fost emis, atomul ionizat trebuie să se relaxeze.
Acest lucru poate fi realizat prin emisia unui foton de raze X, cunoscut sub
400
numele de fluorescenţă de raze X. O altă posibilitate o constituie ejecţia
unui electron Auger. Astfel, electronii Auger sunt produşi ca urmare a pro-
cesului XPS, adesea denumit X-AES (X-ray induced Auger electron
spectroscopy). X-AES, cu toate că nu se practică la scară largă, poate con-
duce la informaţii chimice valoroase despre un atom.
II. Design-ul şi principiul de funcţionare al spectrometrului

de electroni
Figura 6. Sistemul de analiză a suprafeţelor SPECS
În cel mai simplu mod, spectrometrul de electroni conţine următoarele

componente:
• Analizor de energie a electronilor de tip PHOIBOS 150
• Sursa de raze X, XR50
• Sursa de raze X cu monocromator FOCUS 500
• Sursa UV UVS 10/35
• Sursa sputter IQE 11/35 cu ioni de Ar
• Neutralizator de tip Flood Gun FG 15/40
Acestea sunt cuprinse într-o cameră de vid, care funcţionează în regim
de vid ultra-înalt (UHV). Sursa de radiaţii primare pentru spectroscopia
fotoelectronilor de raze X face uz de razele X, în general cu catodul de
aluminilu (Al Kα) sau catodul de magneziu (Mg Kα). Camera de vid si de
preparare poate fi dotată cu diferite instalaţii pentru prepararea probelor şi
facilitaţi analitice auxiliare (neutralizator de sarcină, sistem de tăiere a pro-
belor, sistem de curăţare cu ioni de Ar etc.). Un sistem computerizat este
folosit pentru achiziţia datelor şi de procesarea ulterioară.
401
1. Analizorul de energie emisferic de tip PHOIBOS
1.1. Caracteristici generale
Analizorul SPECS de energie emisferic electrostatic de tip PHOIBOS
permite înregistrarea spectrelor de energie pentru particulele negative
(electroni) şi particulele pozitive (ioni) în intervalul energiilor cinetice de la
0 eV la 3.5 keV. Lentilele de intrare sunt proiectate pentru a se potrivi cu o
gamă largă de aplicaţii.
Analizorul PHOIBOS 150, este echipat cu 9 canale detectoare. Partea elec-
tronică pentru detecţie include un discriminator, un preamplificator, un
numerator şi o interfaţă bus. Toate părţile sunt integrate într-o singură cutie
compactă din aluminiu protejată RF. Partea electronică de detecţie este alimen-
tată împreună cu unitatea analizoare de control. Analizorul de acest tip poate
detecta energii ale electronilor şi ionilor în intervalul 0-3500 eV cu o lărgime
minimă a pasului de 7 meV. Unitatea poate fi folosită şi pentru aplicaţii la ni-
vele mai mari de energie folosind un mod de operare corespunzător.
Un ansamblu de lentile de transfer în doi paşi poate fi folosit în diferite
moduri pentru rezolvarea spaţială şi unghiulară. Toate modurile lentilei
pot fi setate electronic. Un mecanism de tăiere a orbitei şi o lentilă
multi-mod fac selectabile zona de pe proba de analizat şi unghiul de recep-
ţie. De aceea, analizorul permite măsurători rezolvate spaţial cu un diame-
tru minim de 100 µm şi, de asemenea, cercetarea unor suprafeţe largi asoci-
ate diferitelor unghiuri de recepţie ale lentilelor.
Toate componentele sunt controlate de un program SPECS. Generato-
rul HSA3500 pentru analizatorul PHOIBOS este controlat în totalitate cu
ajutorul computerului, nefiind necesară intervenţia celui care o foloseşte.
Acesta are patru moduri de operare pentru diferite intervale de voltaj:
- Intervalul 3500 V. Voltajul emisferelor (între - 400 şi 400 V) vari-
ază cu voltajul de întârziere (între -3500 şi 3500 V);
- Intervalul 1500 V. Voltajul emisferelor (între -400 şi 400 V) vari-
ază cu voltajul de întârziere (între -1500 şi 1500 V);
- Intervalul 400 V. Voltajul emisferelor (între -400 şi 400 V) şi voltajul
de întârziere (între -400 şi 400 V) sunt schimbate independent;
- Intervalul 40 V. Voltajul emisferelor (intre -40 si 40 V) ţi voltajul
de întârziere (între -40 şi 40 V) sunt schimbate independent.
1.2. Descrierea Analizorului

Analizorul PHOIBOS este format dintr-un sistem de vidare şi patru com-
ponente majore interne care sunt arătate în figurile de mai jos. Toate aceste
402
componente sunt introduse într-un mediu de vid ultra-înalt (UHV), pentru a
evita ciocnirea particulelor emise de pe suprafaţa probei cu moleculele de gaz.
Figura 7. Schema de conectare a componentelor PHOIBOS
Figura 8: Principalele componente ale analizorului şi principiul voltajului
U0 – voltajul principal de întârziere,

U0 = –Ekin(kinetic energy) + Ep(pass energy) + WF(work function);
Uchannel HV/ Base – potenţialul pe anod/catod pentru canale;
403
UHV–UBase – voltajul detectorului;
UChannelBase-U0 – voltajul de conversie;
LA…LE – potenţialele pe lentile;
IH, OH – emisfera interioară/exterioară;
T1…T10 – electrozi ai lentilei de transfer multi-mod;
S1 – intrarea de tăiere a capacitorului emisferic;
S2 – planul de ieşire al capacitorului emisferic;
r0 – raza nominală a capacitorului (100 sau 150 mm);
C1…C9 - detectori mono/multi-canal de colecţie discretă (1,5 sau 9 canale);
Componentele interne sunt:
• Sistemul lentilelor de intrare, pentru recepţionarea particulelor
încărcate;
• Analizorul emisferic de 180° (HSA) cu un diametru de 150 mm
pentru măsurători spectroscopice de energie;
• Ansamblul detector pentru particule individuale;
• Mecanism de tăiere a orbitei cu o interconexiune rotaţională ex-
terioară;
• Apertură iris cu interconexiune rotaţională exterioară.
Sursa excitatoare depinde de tehnica folosită, dar de obicei se folosesc
razele X sau alte tipuri de fotoni, ioni, sau electroni. Înainte ca particulele să
treacă prin analizorul semisferic, trec mai întâi printr-un sistem de lentile
electronic care taie fasciculul de particule. Sistemul de lentile electronic şi
părţile tăiate (intrarea şi ieşirea) au efecte importante asupra împrăştierii
energiei detectate de analizor.
Sistemul de lentile de intrare include zece segmente de lentile. Pentru
obţinerea unei imagini nedegenerate, sistemul de lentile nu conţine sau nu
are interfranje. Succesiunea de lentile defineşte suprafaţa de analiză şi ac-
ceptanţa unghiulară prin imagistica particulelor emise la intrarea în anali-
zor. Particulele care trec prin lentile sunt focalizate în poarta de tăiere S1,
unde sunt întârziate în lentile pentru o analiză energetică ulterioară. În
plus, panourile de lentile definesc acceptanţa unghiulară şi suprafaţa pen-
tru o anumită mărime a tăierii de intrare.
Sistemul de lentile poate fi operat în diferite moduri pentru situaţii de
rezolvare spaţială şi unghiulară pentru a adapta analizorul la diferite cerin-
ţe. Toate modurile lentilei pot fi setate electronic.
Pentru analiza cu un spot mic este disponibilă o rezoluţie colaterală de
până la 100 µm, folosind modul de amplificare puternică si o apertură iris
corespunzătoare. În modurile de amplificare rezolvarea unghiulară este
realizată cu o apertură iris în planul de difracţie al sistemului de lentile.
404
Folosind irisul, rezoluţia unghiulară poate fi ajustată continuu menţinând
suprafaţa de recepţie a probei constantă.
Modurile de transmisie sunt optimizate pentru transmisii înalte la mă-
rimi diferite ale spotului. Rezoluţia colaterală este înrăutăţită şi suprafaţa
de recepţie nu este definită în mod normal de lentile.
În modurile unghiulare dispersive, distribuţia emisiei după unghiuri
este vizualizată în locul imaginii reale. Toată rezoluţia colaterală este pier-
dută, dar, informaţia dată de unghiurile de emisie este obţinută uşor. Aces-
te moduri sunt concepute pentru schiţarea benzilor UPS, suprafeţelor
Fermi sau experimente similare.
În capacitorul semisferic, particulele care intră în S1 sunt focalizate în
planul de ieşire al capacitorului S2. Poziţia radială a imaginii tăiate în pla-
nul S2 depinde de energia cinetică a particulelor în capacitor. Particulele de
pe traiectoria centrală au energia de trecere optimă. Ele sunt focalizate pe
poziţia centrală radială a ieşirii plane S2. Particulele cu o energie cinetică
mai mare sunt focalizate mai departe spre exterior, iar particulele cu o
energie cinetică mai mică, sunt focalizate mai în interiorul planului S2.
Aceasta permite posibilitatea folosirii detectorilor multi-canal, cu înregis-
trarea simultană a unei benzi de energie în jurul valorii de trecere optime a
energiei. Particulele care trec prin planul de ieşire al capacitorului S2 sunt
accelerate în sistemul de detectori C. Cu detectorul multi-canal, fiecare ca-
nal este conectat la un preamplificator separat, montat în afara vidului.
Preamplificatorii sunt citiţi de către detectorii multi-canal (MCD), cu inter-
faţa pentru programul de achiziţie de date SPECS.
1.2.1. Sistemul de lentile

Ansamblul de lentile de transfer în doi paşi a fost conceput pentru a
oferi randament de transmisie foarte bun şi proprietăţi optice bine definite.
Acesta poate fi folosit în diferite moduri care pot fi setate electronic, pentru
rezolvarea spaţială şi unghiulară.
Un sistem de lentile cu un mecanism variabil de tăiere a orbitei este
necesar pentru:
• a vizualiza planul probei pe intrarea plană HSA;
• a defini zona probei analizată şi unghiul solid de recepţie de
pe probă;
• a accelera/decelera particulele la energia de trecere.
Distanţa standard de lucru de 40 mm şi partea frontală de formă conică
la un unghi de 44° al lentilei furnizează accesul optim la probă pentru toate
tipurile de surse excitatoare. La nivelul lentilei particulele ce ies de pe pro-
405
ba S sunt vizualizate în intrarea de tăiere S1, proba fiind în planul focal al
sistemului de lentile, de exemplu, 40 mm în faţa primului electrod al lenti-
lei T1. În interiorul primei lentile, particulele trec printr-o imagine interme-
diară înainte să fie focalizate în intrarea de tăiere S1 a capacitorului emisfe-
ric (figura 4). La nivelul S1 particulele sunt întârziate de diferenţa de ener-
gie dintre particulele cu energia cinetică preponderentă Ekin şi energia pre-
ponderentă de trecere Epas.
Dacă S1 are diametrul D1, atunci, conform teoriei, suprafaţa vizualizată
a probei va avea dimensiunea DS egală cu:
DS = D1 / M (1)
Puterea de amplificare a planului de lentile poate fi selectată. Amplifi-
carea este schimbată electric, conectând la electrozii lentilelor voltajul op-
tim. Valorile voltajului sunt dependente de voltajul spectrometrului U0 care
este preponderant egal cu Ekin - Epas + funcţie de lucru. Ekin este negativă
pentru electroni şi pozitivă pentru ioni.
Sistemul PHOIBOS poate funcţiona într-un nivel stabilit de întârziere
(fixed retarding ratio – FRR) sau în transmisie stabilită de analiză (fixed
analyzer transmission – FAT). În modul FAT, voltajul aplicat pe emisfere
este dat de ecuaţia:
Epas = (-q)kΔV
În modul FRR, energia de trecere are valoarea:
Epas = Ekin / R,
R fiind rata de întârziere.
Mărimea reală a suprafeţei probei de analizat DS este în principiu dată
de ecuaţia (1). Cu toate acestea, datorită aberaţiei sferice a intrării lentilei,
imaginea în planul de intrare este difuză. Gradul de difuzie creşte, pentru o
amplificare dată, cu unghiul de recepţie al intrării lentilei. Aceasta înseam-
nă că zona observată în planurile focale ale intrării sistemului de lentile este
tot mai împrăştiată cu creşterea unghiului, rezultând astfel dimensiuni mai
mari ale probei decât cele date de ecuaţia (1). Din această cauză unghiul de
recepţie al lentilei este selectabil prin modurile de amplificare, ţinând abe-
raţia sferică la o valoare cunoscută şi acceptabilă.
Amplificarea înaltă, (figura 9), este în mod special potrivită pentru stu-
dii de rezolvare spaţială. Planul imaginii probei este în coincidenţă cu pla-
nul intrării analizorului. Utilizatorul poate defini zona de recepţie a anali-
zorului cu ajutorul intrării de tăiere deoarece traiectoriile electronilor emişi
406
Figura 9. Mod de transmisie înaltă
Figura 10. Mod de arie medie
de către probă sunt influenţate de către câmpurile electrice din jurul pro-
bei,T1 având un potenţial fix care este setat ca fond la schimbarea sursei de
alimentare. Datorită aberaţiilor lentilei, razele care intră în lentilă depărtate
faţă de axa ei la unghiuri mari, pot să găsească un drum spre intrarea anali-
zorului. Cu o apertură iris, aceste raze rele pot fi eliminate. Mai mult, aper-
tura iris poate fi utilizată pentru ajustarea unghiului de recepţie a analizo-
rului. Pentru analiza cu spoturi mici, o rezoluţie laterală de până la 100 µm
este disponibilă, utilizând modul de amplificare înaltă şi apertură iris.
Modurile de amplificare au fost optimizate pentru a permite unghiuri
foarte mari de recepţie pentru surse punctiforme cu transmisie puternică (mo-
duri de transmisie punctiformă). În aceste moduri, rezoluţia unghiulară este
realizată cu ajutorul aperturii iris în planul de difracţie al sistemului de lentile.
Folosind irisul, rezoluţia unghiulară poate fi încontinuu ajustată între ± 10 şi
± 90 , menţinând zona de recepţie a probei constantă. Razele apropiate de axa
407
lentilei (raze paraxiale) sunt focalizate în focarul Gaussian. Razele care intră în
lentilă la unghiuri mai mari, converg mai puternic. Discul cu cea mai mică
dezordine se află unde tubul de raze emergente are cel mai mic diametru. Fo-
calizări mici sub lentilă, implică deplasarea discului de cea mai mică dezordi-
ne, în planul imaginii. De aceea este realizat un unghi mare de recepţie, dar
rezoluţia spaţială este înrăutăţită. Asta face ca modurile de transmisie punctua-
le să fie cele mai potrivite pentru AES, ISS şi studii de sincroton.
Figura 11. Modul de amplificare înaltă
Tabelul 1: Unghiul de recepţie versus diametrul irisului pentru o sursă

punctiformă
Unghiul de recepţie Diametrul irisului
± 1º 3.5 mm
± 2º 7 mm
± 3º 10 mm
± 4º 13 mm
± 5º 15.5 mm
± 6º 17.5 mm
În noul mod de suprafaţă medie cu unghiuri rezolvate, electronii care

părăsesc proba la o anumită distanţă unghiulară sunt focalizaţi pe aceeaşi
408
zonă a intrării analizorului indiferent de poziţia lor din probă. Modurile
unghiulare permit utilizatorului să optimizeze rezoluţia unghiulară până la
± 0.050 cu mecanismul de tăiere a orbitei. Cu un sistem de detecţie 2-D se
pot obţine unghiuri de rezoluţie mare pe direcţia dispersiei, a analizorului,
fără restricţionarea unghiului de recepţie; acest mod este alegerea ideală
pentru studii de dependenţă unghiulară.
La PHOIBOS, amplificarea şi apertura unghiulară sunt selectabile. Există
mai multe combinaţii diferite disponibile. Setările lentilelor pot fi combinate cu
diferite combinaţii ale tăierii, rezultând astfel un număr de combinaţii egal cu
produsul dintre modurile de setare a lentilei şi numărul de tăieri.
Pentru o analiză cu spoturi mici, apertura iris poate fi folosită pentru
micşorarea suprafeţei de analizat. Setarea optimă a aperturii iris depinde de
mărimea tăierii şi de calitatea dorită a suprafeţei de analizat. Funcţia inten-
sitate-poziţie a analizorului este o Gaussiană, dar cu intensităţi mai mari în
regiunile de margine. Folosind apertura iris, aceste intensităţi pot fi supri-
mate. Suprafaţa de analizat a fost definită pentru a include între 90-99% din
totalitatea semnalului fotoelectric.
Figura 12. Profilul tipic intensitate-poziţie cu apertură iris
Cozile de intensitate mică formează un disc. Intensitatea sa integrată

poate atinge acelaşi ordin de magnitudine ca intensitatea peak-ului. Folo-
sind apertura iris, aceste intensităţi pot fi suprimate.
409
1.2.2. Analizorul Emisferic (HSA)
Analizorul emisferic PHOIBOS (HSA) cu o rază R0 (100mm/150mm)
măsoară energia particulelor încărcate. Particulele încărcate care intră în
HSA prin intrarea de tăiere S1, sunt deviate pe traiectorii eliptice de câmpul
electric radial între emisfera internă Rin şi emisfera externă Rout. Razele emi-
sferelor PHOIBOS sunt 1.25 R0 şi 0.75 R0. Intrarea de tăiere S1 şi planul de
ieşire S2 sunt centrate în jurul razei R0:
R in + R out
R0 = = 150 mm (2)
2
Pentru un gradient fix al câmpului electric, numai particulele cu energie
cinetică cuprinsă într-un anumit interval, pot să treacă integral prin devierea
unghiulară de la intrarea de tăiere S1 la planul de ieşire S2. Particulele cu ener-
gie cinetică mai mare se vor apropia de emisfera exterioară în timp ce particu-
lele cu energie cinetică mai mică sunt deviate spre emisfera interioară. Acele
particule care intră în HSA perpendicular pe S1 şi se mişcă prin emisfere pe o
traiectorie circular centrală, au energia de trecere preponderentă Epass:
Epass = (-q) kΔV, (3)
q – sarcina electrică a particulei;
ΔV – diferenţa de potenţial aplicată pe emisfere (Vout - Vin);
k – constanta de calibrare;
R in R out (4)
k= = 0.9375
2R0 (Rout − R in )
Aceste particule ajung pe S2, parcurgând un arc de cerc de rază R0. Dacă
HSA acceptă jumătatea unghiului α pe direcţia dispersiei, rezoluţia HSA sau
FWHM (full width at half maximum), a liniei transmise ΔEan este dată de :
ΔEan S α2 (5)
= +
Epas 2R0 4
unde S = (S1 + S2)/2. Această valoare (S) este o constantă a analizorului.
Există contribuţii în plus la lărgimea liniei observate în spectru. Pentru
liniile de fotoemisie cele mai importante contribuţii adiţionale sunt:
a) Lărgimea proprie a liniei pentru nivelul atomic ΔElevel (de exemplu
O 1s, C 1s),
b) Lărgimea naturală a liniei pentru radiaţia caracteristică folosită la
excitare ΔEphoto (de exemplu Mg Kα, Al Kα).
FWHMtotal observat este dat de convoluţia FWHM - urilor individuale,
de exemplu, pentru lărgimea Gaussiană a liniilor:
FWHMtotal =(ΔEan 2 +ΔElevel2 +ΔEphoto2 )1/2 =ΔE (6)
410
FWHMtotal este de obicei stabilit folosind o probă de argint curăţată
prin împrăştiere ionică şi înregistrarea nivelului Ag 3d5/2, după extracţia
liniară a fondului. Pentru excitarea Mg Kα, rezoluţia HSA la nivelele joase
ale energiei de trecere pentru Ag 3d5/2 este :
HMMgKa= 0.8 eV (7)
În practică, o rezoluţie de 0.9 eV este de obicei suficientă pentru măsu-
rători la rezoluţie mare. Pentru o rezoluţie mai mare a instrumentului, este
posibilă folosirea radiaţiei X monocromatice de excitare, de exemplu radia-
ţie Al Kα monocromatică în mare parte. Pentru radiaţie Al Kα monocroma-
tică şi pentru nivelul Ag 3d5/2 rezoluţia extremă este:
FWHMextreme = 0.44 eV (8)
Pentru a atinge rezoluţia extremă de 0.44 eV, FWHM-ul razelor X tre-
buie să fie foarte mic, folosind doar o mică parte din suprafaţa spotului
monocromatic de radiaţii X (datorită dispersiei energiei pe suprafaţa spotu-
lui), cu costul unei mari pierderi în intensitate. În practică, o rezoluţie de
0.65 eV este de obicei suficientă pentru studii de înaltă rezoluţie cu o excita-
re monocromatică a Al Kα. Pentru radiaţia monocromatică, FWHMtotal este
uneori determinat înregistrând nivelul Si 2p3/2 în loc la Ag 3d5/2, de unde
rezultă valori mai mici pentru FWHMextreme, datorită îngustării lărgimii
liniei proprii a nivelului Si 2p.
Intensitatea semnalului integral I al particulelor măsurate (suprafaţa
cuprinsă în interiorul peak-ului până la nivelul fondului) este proporţiona-
lă cu produsul dintre unghiul solid de recepţie ΩS, suprafaţa de recepţie a
probei AS şi rezoluţia HSA, ΔEan :
Epass Epass 2 , (9)
I:ΔEan ΩSAS =ΔEan Ω0A0 :
Ekin Ekin
unde sunt valorile de recepţie pentru HSA. Ele sunt constante ale
analizatorului. Ecuaţia rezultă din teorema lui Liouville.
Analizorul poate fi operat în două moduri diferite:
a) Gradul de întârziere fix (Fixed retarding ratio (FRR)), gradul de
întârziere R este definit ca:
Ekin (10)
R=
Epas
În acest mod toate particulele sunt decelerate cu acelaşi factor constant.
De aceea, energia de trecere este proporţională cu energia cinetică. Intensi-
tatea creşte cu creşterea energiei cinetice:
I ∼ Ekin , (11)
în timp ce rezoluţia energetică scade.
411
b) Transmisie fixă a analizorului (fixed analyzer transmission(FAT)), în
care Epass şi ΔEan din ecuaţia (5) sunt constante ajustabile. Semnalele date de
toate particulele, indiferent de energia lor cinetică, sunt măsurate cu aceeaşi
scădere a rezoluţiei şi intensităţii cu energia cinetică:
1 (12)
I∼
Ekin
Cele două moduri sunt disponibile pentru toate tipurile de măsurători.
Există unele aplicaţii în care unul dintre ele este de obicei preferabil. Modul
FRR este folosit cel mai mult în AIS, ISS şi este preferabil pentru măsurători
ale survey-ului. Modul FAT este folosit preponderent în XPS şi UPS, unde
este necesară o informaţie detaliată şi rezoluţia nu trebuie să depindă de
energie. Dacă Ekin este constantă şi acelaşi peak este măsurat pentru diferite
energii de trecere, rezultă că:
I ∼ Epass 2 (13)
1.2.3. Izolarea Magnetică

Particulele încărcate sunt influenţate de câmpul magnetic rezidual, (inclu-
siv câmpul magnetic al pământului) de aceea este esenţial să eliminăm aceste
câmpuri în volumul închis al analizatorului. Analizatorul, sistemul de lentile şi
detectorul sunt înconjurate de un strat de 1.5 mm grosime µ-metal pentru a
ecrana câmpurile magnetice la un nivel minim. Factorul de izolare pentru re-
giunea analizatorului este de aproximativ 35. Pentru o performanţă maximă a
analizatorului şi sistemului de lentile, acestea sunt construite, în întregime, din
materiale non-magnetice într-o carcasa de µ-metal.
1.2.4. Mecanismul de tăiere a orbitei

Mecanismul de tăiere a orbitei este folosit pentru a schimba manual
deschiderea intrării şi ieşirii analizorului. Mecanismul poziţionează o des-
chidere de intrare şi ieşire de o mărime adecvată în planul de intrare şi ieşi-
re al analizorului. Raza de intrare este definită de două secţiuni care sunt la
circa 6 mm depărtare. Tăierea posterioară se află în planul intrării şi defi-
neşte energia de rezoluţie a analizorului (vezi ecuatia (5)), în timp ce tăierea
anterioară serveşte la compararea împrăştierii unghiulare pentru analizor.
Pentru o rezoluţie energetică dată, o zonă de analiză tolerată şi un unghi de
recepţie, tăierea maximă posibilă poate fi selectată. Aceasta face posibilă
cea mai mare rată de numărare permisă pentru aceşti parametrii şi de aceea
rezultă un timp scurt de măsurare şi un raport bun semnal-zgomot.
Inelul de intrare poate fi poziţionat direct prin rotirea cadranului (vezi fi-
412
gura 10). Pe de altă parte, inelul de ieşire este poziţionat indirect prin interme-
diul inelului de intrare (vezi figura 11). Prin acest aranjament se pot alege pu-
terile de intrare şi ieşire independent, folosind acelaşi sistem rotaţional.
Analizorii PHOIBOS, începând cu ieşirea 5, au 8 tăieri de intrare şi 2 de
ieşire în configuraţia standard. Poziţiile tăierii de intrare sunt indicate cu
numere (1-8) pe cadranul rotaţional exterior. Poziţiile tăierilor de ieşire sunt
indicate cu litere (A-B, sau A,B sau C). Aceşti indicatori corespund celor care
apar în setările programului de control al analizatorului SpecsLab2. Când
deschiderea intrării şi ieşirii este schimbată, poziţiile trebuie introduse în
zona de editare a datelor. Aranjamentul propriu-zis în analizor apare în sec-
ţiunea de tăiere a programului de control livrat împreună cu analizorul.
Figura 13. Selecţia fantei de ieşire
413
1.2.5. Detector Multicanal MCD
Detectorul este format din următoarele părţi:
• Un aranjament de multiplicatori de electroni MCD
• O punte ceramică multi-pin, de voltaj înalt, situată în vid
• Preamplificatori MCD.
1.2.5.1. Principiile Detecţiei

Datorită simetriei sferice a HSA, există o imagine 1:1 a intrării circulare
de tăiere cu o rază de curbură R0, în planul ieşirii pentru electroni mono-
cromatici cu energia preponderentă de trecere Epass. Imaginile electronilor,
având diferite energii în HSA, sunt cercuri concentrice. Într-o primă apro-
ximaţie raza de poziţie R a electronilor cu energia cinetică Ek, este dată de:
R − R0 Ek − Epass D
= × (16)
R0 E pass R0
unde D este dispersia la HSA. Valoarea teoretică a lui D este:

D = 2R0 (17)
Valoarea experimentală determinată pentru dispersie poate fi puţin di-
ferită, în principal datorită câmpurilor de refringenţă existente pe marginea
analizorului.
Detecţia multicanal se realizează aranjând corespunzător 9 CEMs (mul-
tiplicator de electroni cu canale) ca şi colectori, cu 9 ieşiri de tăiere în cercuri
concentrice în planul de ieşire. Distanţa radială între ieşiri de tăiere vecine
ΔR, este selectată pentru a corespunde cerinţelor unei diferenţe de energie
cinetică constantă între canalele vecine ΔEk. Numărul particulelor Nn care
sosesc la fiecare colector Cneste numărat separat, iar aceste numere sunt
stocate şi procesate într-o unitate de achiziţie a datelor.
Schimbând tensiunea spectrometrului U0, traiectoria electronului este
mutată între fiecare analizor pas cu pas, şi în acest fel fiecare colector înre-
gistrează un spectru corect, cu o compensare fixă a energiei între canalele
vecine. În principiu, baleând spectrul odat peste suprafaţa detectorului, 5
sau 9 spectre paralele sunt înregistrate simultan. Energia cinetică En a parti-
culelor ce ajung la colectorul Cn, fiind ştiută din ecuaţia (16), numărul parti-
culelor din fiecare canal, aparţinând aceleiaşi energii cinetice, poate fi adă-
ugat, rezultând numărul total de particule pentru fiecare energie cinetică.
414
1.2.5.2. Coerenţa între Epass şi pas
Din ecuaţia de dispersie energetică pentru analizor, diferenţa de ener-
gie Δ între canalele vecine, la distanţa ΔR unul de celălalt, este:
ΔR
ΔEk = Epass (18)
D
sau:
D
Epass = ΔEk (19)
ΔR
unde D este dispersia pe analizor.
În special în modul FRR, unde energia de trecere se schimbă în spectru
(şi diferenţa de energie dintre canalele învecinate), un calcul al energiei
detectate a particulelor este necesar. Pentru asta, un program calculează
numărul de particule Nn în canalul Cn, la energia cinetică nominală, prin
interpolarea între numerele măsurate în canalul Cn la energiile măsurate cel
mai apropiat dedesubt şi deasupra energiei nominale.
Algoritmul este uniechivoc, deoarece nu există niciodată mai mult de-
cât o energie nominală între două poziţii ale energiei măsurate. Datorită
procesului de interpolare, nu există o restricţie a pasului energiei datorată
performanţei analizorului. Performanţa acumulatorului (DAC steps, etc)
limitează lărgimea şi distanţa posibilă a paşilor. Programul validează valo-
rile la cele mai apropiate valori.
1.2.5.3. Multiplicarea Electronică

Un multiplicator de electroni cu canale (CEM) este un dispozitiv de
achiziţie înaltă pentru detectarea particulelor energetice, cum ar fi electronii
şi ionii, sau radiaţia. CEM este format dintr-un tub mic şi curbat de sticlă.
Peretele interior este căptuşit cu un material de rezistenţă înaltă. Materialul
rezistiv devine o dinodă (o serie de electrozi incorporaţi într-un fotomulti-
plicator) continuă când un potenţial este aplicat la capetele acestui tub.
Impactul particulelor încărcate formează electroni secundari care sunt
eliberaţi din peretele CEM. Aceşti electroni sunt acceleraţi de către voltajul
înalt, conectat la CEM, şi eliberează noi electroni secundari prin impactul în
continuare de-a lungul peretelui CEM. Acest efect este repetat succesiv,
până când, în final, un “nor electronic” se formează la ieşirea din CEM.
Numărul mediu de electroni care pleacă din ansamblul CEM pe parti-
cula incidentă, se numeşte câştigul G. Pentru detectarea unei singure parti-
cule, câştigul trebuie selectat destul de înalt pentru a folosi CEMs în modul
415
saturat, de exemplu, fiecare particulă incidentă eliberează un nor electronic
la ieşirea aranjamentului CEM, a cărui sarcină este independentă de micile
schimbări în voltajul multiplicator. Operaţia de saturare este necesară pen-
tru o reflexie a zgomotului suficientă, în detectarea unei singure particule.
De obicei, câştigul minim pentru operaţia de saturare este de aproximativ
107, de exemplu, un nor electronic format din mai mult de 107 electroni pă-
răseşte CEM.
Norul electronic emis, este accelerat în electrodul conectorului CEM, şi
pulsul sarcinii purtate de norul electronic este detectat ca provenind de la
una din particulele incidente şi numărate în canalul preamplificatorului.
Unul sau un grup de CEM este folosit într-un aranjament special, ca o
componentă de multiplicare electronică pentru analizorii PHOIBOS. Toate
CEMs sunt montate într-o unitate paralelă pe o flanşă cu rol de punte. Par-
ticulele ce trec de ieşirea aperturii, sunt accelerate la o energie cinetică co-
respunzătoare în interiorul CEM.
2. Sursa de raze X pentru FOCUS 500 (XR50 M)

2.1. Principiu de funcţionare
Monocromatorul FOCUS 500 de raze X este echipat cu o versiune spe-
cială a sursei de raze X XR-50, numită XR 50 M. La fel ca şi XR 50, această
sursă este o sursă cu doi anozi, având ca materiale constituente Al şi Ag.
Fiecare anod poate fi operat în modul de focalizare sau non-focalizare.
Dacă modul de focalizare este activat de către acumulatorul XRC 1000 M,
spotul sursei de raze X pe anod este de 3.5 x 0.5 mm2 (corespunde la 3.5 x
0.2 mm2 pe probă). Datorită mărimii mici a sursei, rezoluţia maximă a mo-
nocromatorului de 0.25 eV poate fi atinsă pentru Al Kα. Puterea maximă
este restricţionată la 150 W în modul de focalizare.
În modul de non-focalizare, mărimea spotului de raze X pe anod este
de 3.5 x 4 mm2 (corespunde la 3.5 x 1 mm2 pe probă) şi sursa de raze X poa-
te fi operată la puterea maximă de 400 W ( 600 W pentru Ag Lα) la lărgimea
liniei de 0.4 eV pentru Al Kα.
Selecţia între anodul 1 şi anodul 2 accesează fie radiaţia Al Kα la 1486.74
eV, fie radiaţia Ag Lα la 2984.3 eV. Dacă anodul de argint este activat, mo-
nocromatorul este folosit în reflexia Bragg de ordinal 2, iar XR 50 M trebuie
să fie mutat cu 16 mm. Cum este menţionat mai sus, modul focaliza-
re/non-focalizare este utilizabil pe amândoi anozii.
416
Efectul de focalizare este obţinut cu ajutorul unei lentile electronice adi-
ţionale, amplasată în capul sursei, care nu există în XR-50 standard. Voltajul
de focalizare este generat de către un amplificator XRC 1000 M şi este trans-
ferat la sursa de raze X printr-un cablu de filament prin cele 4 punţi.
Modulul XR-50 M (cu alimentarea de apă şi protecţia HV scoase) poate
fi încălzit până la 250°C, permiţând o operaţie UHV. Conectorii de filtrare
rapidă permit îndepărtarea rapidă a liniilor de răcire cu apă şi HV (de înal-
tă tensiune).
2.2. Descrierea sursei

2.2.1. Generarea fotonilor de raze X
Dacă un material în stare solidă este bombardat cu electroni de înaltă
energie, are loc un proces de ionizare al nivelelor electronice. Dacă aceste
locuri vacante sunt umplute cu electroni cu o caracteristică energetică mai
înaltă, vor fi generate raze X sau electroni Auger. În afară de aceste două
procese, va fi produsă şi o radiaţie cu o frecvenţă continuă a spectrului, de
către electronii întârziaţi.
Diagrama bloc a sursei de raze X este prezentată mai jos, arătând volta-
jul şi curenţii pe sursă.
Figura 14. Diagrama bloc a principiului de funcţionare a sursei
2.2.2. Monocromatorul
Radiaţia caracteristică este generată pe anodul XR-50 M şi pleacă de la
sursă sub un unghi de 15°. Aceasta este reflectată după legea lui Bragg pe
oglinda elipsoidală din cuarţ în monocromatorul FOCUS 500 şi focalizată
pe probă.
417
A) Descrierea generală a monocromatorului:
Ansamblul cristalului este compus dintr-o oglindă din cristal de cuarţ
şi un manipulator al oglinzii. Oglinda este făcută dintr-un suport monolitic
de încălzire, cu plane de cristal monoatomice orientate precis. Manipulato-
rul oglinzii poate genera trei moduri de mişcare: translaţie (focalizare) şi
două direcţii de înclinare. Este folosit pentru poziţionarea oglinzii în vede-
rea obţinerii unui fascicul de raze X monocromatic.
Figura 15. Prezentarea schematica a monocromatorului FOCUS 500
În anodul dual sunt produse raze X Al Kα (1486,74 eV) sau Ag Lα

(2984,3 eV). Sursa de raze X XR 50 M este montată pe un manipulator după
cele trei axe. Sursa este alimentată de către un acumulator XRC 1000 M şi
de către o unitate de răcire CCX60.
Monocromatorul aduce următoarele avantaje sursei de raze X:
• Distribuţia energetică a razei X cu benzi energetice înguste îmbună-
tăţeşte selectivitatea chimică, îngustând peak-urile spectrului;
• Un background mai mic;
• Eliminarea razelor X nedorite de la sateliţi şi impurităţile anodului,
care simplifică analiza spectrală;
• Eliminarea Bremsstrahlung şi a radiaţiei termale de la sursa de raze
X, care reduce semnificativ uzajul indus asupra sursei;
• Un spot de raze X focalizat pe probă creşte sensibilitatea în XPS pe
probe mici.
418
B) Monocromatizarea prin difracţia pe cristal
Figura 16. Configuraţia monocromatorului cristalin elipsoidal
Cristalele de cuarţ individuale sunt folosite în procesul de

monocromatizare. Când razele X, de lungime de undă λ cad pe cristal sub
unghiul de incidenţă θ, are loc o interferenţă constructivă după împrăştiere
numai dacă drumurile parţiale ale undelor pe plane diferă printr-un număr
întreg de lungimi de undă. Situaţia este explicată de ecuaţia lui Bragg:
2d cosθ = n λ
În termenii energiei avem:
2dE cosθ = n 1239,8419 nm eV
Din cele două ecuaţii rezultă, luând 2d = 0,851243 nm, pentru Al Kα
unghiul de difracţie 2θ = 23,149° şi pentru Ag Lα, 2θ = 25,096°.
O sursă de raze X divergentă, va fi focalizată dacă sursa, focarul şi su-
prafaţa oglinzii, se află pe un cerc. Cercul Rowland este o condiţie geome-
trică pentru reflexie.
Există două cerinţe pentru ca difracţia de raze X să aibă loc în concor-
danţă cu legea lui Bragg:
1. Toate punctele de pe suprafaţa cristalului, unghiurile de incidenţă θ1
şi unghiurile de reflexie θ2, trebuie să fie la fel ca şi cele din planul
de reflexie.
2. Toate punctele de pe suprafaţă şi unghiul de reflexie 2θ al razei, tre-
buie să fie constante.
419
Condiţia de reflexie necesită ca sursa şi proba să se afle pe cercul
Rowland, iar planele reflectoare ale cristalului să fie concave, cu raza egală
cu diametrul cercului Rowland şi să fie tangenţiale la cercul Rowland în
punctul c (figura 15). Legea lui Bragg presupune ca unghiul de reflexie să
fie independent de punctul reflexiei. Ambele condiţii sunt îndeplinite doar
pentru reflexia simetrică din punctul c.
Sursa de raze X, XR M 50 este echipată cu o lentilă electrostatică care
focalizează electronii pe anod. Poate fi operată în două moduri diferite.
Pentru fluxuri înalte, poate fi operată în modul non-focalizare, unde se
produce o lărgire datorată diametrelor finite ale spotului sursei de raze X.
În modul de focalizare, lărgirea datorată sursei este neglijabilă.
Există numeroase ajustări date pentru montajul optic. Aliniatorul sursei
de raze X îi dă voie utilizatorului să poziţioneze anodul pe cercul Rowland.
Ansamblul cristalului poate fi înclinat în două direcţii şi mutat pe direcţia y
pentru a duce suprafaţa cristalului pe cercul Rowland.
Figura 17. Profilul Gaussian al peak-ului de

difracţie al unei raze monocromatice (Al Kα)
Curba intensitate-unghi de difracţie pentru un anumit tip de cristal este

cunoscută sub numele de “rocking curve”. Pentru monocromatorul elipso-
idal FOCUS 500 sunt folosite doar cristale cu Δθ = ±10" . Diferenţa din ecua-
ţia Bragg duce la expresia pentru rezoluţia intrinsecă a oglinzii:
Rezoluţia energetică intrinsecă la o anumită aliniere a planurilor crista-
lelor este
Δθ
ΔE=n 1456,7 eV
(cosθ)2
Pentru Al Kα, rezoluţia energetică intrinsecă a FWHM este 167 meV, iar
pentru Ag Lα este de 344 meV.
420
2.2.3. Informaţii generale în legătură cu sursa XR 50 M
2.2.3.1. Modul de focalizare
În contrast cu sursa standard XR-50, sursa XR-50 M este echipată cu o
lentilă electronică în capul sursei. Această lentilă poate focaliza electronii
care se fixează pe anod şi astfel este obţinut un spot de raze X de mărime
variabilă.
Fiecare anod poate opera în modul de focalizare sau non-focalizare.
Aceasta dă un total de patru moduri de operare pe anod:
1. Ag non-focalizat (anod 1N);
2. Al non-focalizat (anod 2N);
3. Ag focalizat (anod 1F);
4. Al focalizat (anod 2F).
Dacă modul de focalizare este activat, spotul sursei de raze X pe anod
este de 3.5 x 0.5 mm2. Datorită mărimii mici a sursei, rezoluţia maximă a
monocromatorului de 0.25 eV poate fi atinsă pentru Al Kα.
În modul non-focalizare, mărimea spotului de raze X pe anod este 3.5 x
4 mm2 şi sursa de raze X poate fi folosită la putere maximă.
Figura următoare arată lărgimea spotului pe probă în funcţie de tensi-
unea de focalizare, UL:
Figura 18. Lărgimea spotului de raze X în functie de
Puterea maximă şi tensiunea corespunzătoare UL pentru anozii de Al şi

Ag, pot fi setate în interiorul sursei XRC 1000 M.
Pentru condiţiile optime de focalizare, UL trebuie să varieze liniar cu
tensiunea pe anod. Această relaţie este setată automatic de către sursa XRC
1000 M.
421
2.2.3.2. Răcirea cu apă
Ca agent de răcire pentru XR-50 M se foloseşte apa. Disiparea maximă
de putere pe anod a sursei de raze X, poate fi obţinută doar dacă presiunea
de răcire a apei este mai mare decât 3.5 bar (de obicei 5-6 bar) şi dacă debi-
tul este de aproximativ 2.5-3.5 l/m. Temperaturi mai mici decât temperatu-
ra camerei vor duce la condensarea apei şi fenomene de descărcare în inte-
riorul conductei de apă sau al învelişului de protecţie. Temperaturile înalte
au ca şi consecinţă suprasolicitarea, de exemplu evaporarea materialului
anodului sau în cel mai rău caz, fisurarea anodului şi eliberarea apei în ca-
mera de vid.
3. Flood-Gun 15/40
3.1. Informaţii generale
Flood-Gun–ul FG 15/40 a fost conceput pentru neutralizarea generală a
sarcinilor probelor, a izolatorilor încărcaţi pozitiv, sau semiconductorilor, şi
este folosit special pentru aplicaţii XPS. Fasciculul de energie poate varia
între 0 şi 500 eV. Curentul de emisie poate varia de la 0 la 5 mA.
3.1.1. Componente:
1. Filament;
2. Lentile extractoare;
3. Anod.
Tensiunea şi curenţii necesari pentru operaţia FG-ului sunt asigurate cu
PS FG 20. Diagrama operaţională şi conexiunile electrice ale
Flood-Gun-ului sunt arătate în figura următoare:
Figura 19. Diagrama operaţională
• Energia este controlată manual;
422
• Voltajul de extracţie nu este selectabil de către utilizator;
• Curentul de emisie este independent de energie şi este controlat
manual
4. Bibliografie
1. Cardona M and Ley L (ed) 1978 Photoemission în Solids I (Topics în Applied Physics vol
26) (Berlin: Springer)
2. Hüfner S 2003 Photoelectron Spectroscopy.Principles and Applications 3rd
edn (Berlin: Springer)
3. Feuerbacher B, Fitton B and Willis R F 1978 Photoemission and the Electronic
Properties of Surfaces (Chichester: Wiley)
4. Kevan S D (ed) 1992 Angle Resolved Photoemission - Theory and Current Applications
(Studies în Surface Science and Catalysis) 74) (Amsterdam: Elsevier)
5. Schattke W and Van Hove M A (ed) 2003 Solid-State Photoemission and Related
Methods: Theory and Experiment (Weinheim: Wiley-VCH Dec.)
6. Turner, D. W.; Jobory, M. I. Al (1962). "Determination of Ionization Potentials by
Photoelectron Energy Measurement". The Journal of Chemical Physics 37:3007
7. Shockley W 1939 On the surface states associated with a periodic potential Phys.
Rev. 56 317-23
8. Davison S G and Steslicka M 1992 Basic Theory of Surface States (Oxford: Oxford
University Press)
9. Reinert F, Eltner B, Nicolay G, Forster F, Schmidt S and Hüfner S 2004 The elec-
tron-phonon selfenergy of metallic systems determined by angular resolved high -
resolution photoemission Physica B 351 229-34
10. Ashcroft N W and Mermin N D 1988 Solid State Physics (Philadelphia, PA:
Saunders College)
11. Matzdorf R, Meister G and Goldmann A 1993 Temperature-dependent photoemission
spectra from Cu(1 0 0) and Cu(1 1 1) surfaces Surf. Sci. 286 56-65
423
Studiul prin spectroscopie fotoelectronică de raze X
a suprafeţelor diferitelor tipuri de materiale
C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga
Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................424
2. Bibliografie ..........................................................................................................................436
1. Introducere
Spectroscopia XPS este o tehnică de analiză foarte utilă în domeniul
cercetării avansate în ştiinţa şi tehnologia materialelor. Această metodă
permite determinarea elementelor care contaminează o suprafaţă şi uni-
formitatea compoziţiei elementale la suprafaţă sau în adâncime (depth
profiling). De asemenea se poate folosi în analiza modificărilor care apar în
chimia suprafeţei unui material după ce acesta a fost supus unor tratamen-
te fizico-chimice.
Înregistrarea energiei cinetice şi a numărului de electroni emişi de la
suprafaţa materialului datorită acţiunii razei X de energie hν duc la obţine-
rea spectrului XPS. Fiecare element determină un număr caracteristic de
vârfuri XPS la valori caracteristice ale energiei de legătură care ne permit
identificarea directă a elementelor care există pe suprafaţa investigată. Pen-
tru a detecta numărul de electroni la fiecare valoare a energiei de legătură
(energie cinetica) cu eroare minimă, măsurătorile XPS trebuie efectuate în
condiţii de vid ultra-înalt (UHV) din cauza distanţei la care se află instru-
mentele de detecţie în instalaţiile XPS, faţă de suprafaţa iradiată cu raze X.
Este important de reţinut că XPS detectează numai acei electroni care ajung
în vidul din incinta echipamentului; mai exact cei care pleacă din material
de la o adâncime de aproximativ 10-12 nm. Toţi electronii fotoemişi de la
adâncimi mai mari în urma penetrării materialului de către radiaţia X
(aprox. 1-5 µm) sunt recapturaţi sau blocaţi în diferite stări de excitare în
interiorul materialului. Pentru majoritatea aplicaţiilor este de fapt o metodă
nedistructivă prin care se determină chimia suprafeţei oricărui material.
La baza cuantificării unui spectru XPS obţinut stă presupunerea că
numărul electronilor înregistraţi este proporţional cu numărul de atomi
într-o stare dată. Instrumentul de bază pentru măsurarea numărului de
424
electroni înregistraţi pentru o stare atomică este regiunea de cuantificare. În
marea majoritate a cazurilor primul pas în analiza probei este acela de a
înregistra spectrul pe scala energetică maximă disponibilă a spectrometru-
lui pentru a determina elementele prezente pe suprafaţă (survey analysis).
Resursele software ajută la o analiză cantitativă (concentraţia relativă a tu-
turor elementelor prezente pe suprafaţă ) cu o precizie acceptabilă după 2-3
baleiaje a scalei energetice. Trebuie menţionat că acest tip de analiză se rea-
lizează maximizând semnalul obţinut (sensibilitatea) cu preţul degradării
rezoluţiei. Spectrele de înaltă rezoluţie se înregistrează pe domenii energe-
tice restrânse (10-15 eV) micşorând fereastra energetică, prin aceasta micşo-
rând transmisia analizorului şi, în consecinţă, crescând rezoluţia energetică.
În acest caz numărul de “scan”-uri pe această plajă energetică îngustă va fi
mai mare (10–20 baleiaje) pentru că sensibilitatea scade cu creşterea rezolu-
ţiei. Cu ajutorul acestor spectre (“high resolution” spectra) se identifică
stările chimice ale elementelor detectate (deplasările chimice) din poziţia şi
forma liniilor spectrale. În aceste spectre de înaltă rezoluţie apar structură-
rile secundare care ne permit studiul complex al elementelor în înconjura-
rea lor chimică şi structurală.
În figura 1 este ilustrat un spectru survey analizat folosind un tabel de
cuantificare din baza de date a software-ului de prelucrare a datelor (Casa
XPS) pentru regiunile selectate. Obiectivele principale ale regiunii de cuan-
tificare sunt: definirea domeniului de energie în care semnalul poate fi atri-
buit tranziţiei de interes şi specificarea tipului de aproximaţie adecvat pen-
tru eliminarea semnalului de fond care nu aparţine vârfului de interes.
Aşadar, din spectrele XPS se pot obţine concentraţiile relative ale elemente-
lor pe suprafaţă ca de exemplu: x%Si, Y%C, Z%O, etc., concentraţiile relati-
ve ale stărilor de oxidare ale unui singur element ( x% Si4+, Y%Si3+, z%Si2+,
t%Si1+) sau concentraţiile relative ale stărilor chimice prezente pe suprafaţă
(x%Si4+, y%Si3+, z%O, t% C-C).
Pentru a realiza măsurători de încredere şi pentru a putea face
intercompararea rezultatelor cu alte laboratoare, calibrarea cu exactitate a
scalei energetice şi a scalei de intensitate este crucială. Mai mult, capacitatea
de calibrare a scalei de energie este dependentă de capacitatea de compensa-
re a sarcinii pozitive acumulate la suprafaţa probei în timpul măsurătorii şi
de disponibilitatea unei linii spectrale la o energie de legătură cunoscută care
să poată constitui un etalon pentru deplasarea scalei de energie. Cu excepţia
cazului când electronii emişi sunt înlocuiţi, proba se va încărca relativ la su-
portul de probă având ca efect apariţia unui câmp electric de întârziere la
suprafaţa probei care determină deplasarea spectrului spre energii cinetice
425
Figura 1 Exemplificare spectru XPS cuantificat pe o probă cu conţinut de C, O, Ca, B, Si şi Mg.
mai mici (energii de legătură mai mari). Pentru probe conductoare conectate
electric la suport echilibrul de sarcină este restabilit uşor; pentru materialele
izolatoare electronii emişi trebuie înlocuiţi de la o sursă externă - un tun de
electroni de energie joasă (flood gun) pentru a restabili o stare de echilibru
d.p.d.v. electric. Pentru ilustrarea acestui efect, figura 2 prezintă spectrul
unei probe înregistrat înainte şi după compensarea de sarcină [1]. Linia spec-
trală a carbonului, C1s, este deplasată cu 120 eV între cele doua situaţii (cu
compensare de sarcina şi fără). În absenţa compensării efective de sarcină ,
energia masurată pentru o linie fotoelectrică poate varia în funcţie de ener-
gia cinetică a electronilor. Este important de menţionat că, compensarea de
sarcină nu înseamnă neapărat neutralizarea suprafeţei probei ci mai mult
stabilizarea suprafeţei probei a. î. forma liniilor spectrale sa fie cea mai bună
concomitent cu asigurarea că distanţa dintre vârfuri între tranziţii este inde-
426
pendentă de energia la care sunt măsuraţi electronii. Obţinerea unei energii
de legătură corecte pentru o tranziţie cunoscută nu e neapărat un indicator al
unei bune neutralizări de sarcină. Un experiment în care compensarea de
sarcină este făcută corespunzător necesită de obicei deplasarea în energia de
legătură folosind pagina “ Calibration property” din programul de cuantifi-
care al spectrelor, Casa XPS, însă forma vârfurilor este bună şi poziţiile rela-
tive ale vârfurilor sunt stabile.
Straturile de oxid pe materialele metalice pot transforma un material
conductor într-o suprafaţă izolatoare care astfel necesita tratarea lor ca un
material izolator. De exemplu, metalul Al oxidează chiar şi în vid iar stratul
subţire de oxid se comportă ca un izolator.
Figura 2 Efectul compensării de sarcină în spectrul XPS, [1], pe o proba cu conţinut de C, Si şi O:

a) În absenta neutralizării (flood gun off), spectrul este deplasat cu 120eV şi distorsionat
b) În prezenţa neutralizatorului de sarcina dar cu parametrii de lucru selectaţi incorect, vârfurile
sunt largi, acumularea de sarcina este compensată insuficient
c) Suprafaţa probei neutralizată corect; vârfurile au forma foarte îngustă
Măsurătorile XPS prezentate mai jos reprezintă sinteza unor studii

complexe pe diferite tipuri de materiale, concretizate deja în lucrări ştiinţifi-
ce importante, cu scopul de a pune în evidenţă performanţele tehnice ale
echipamentului folosit. Mai mult, aceste măsurători furnizează informaţii
relevante despre limitele şi posibilităţile de îmbunătăţire ale acestei tehnici
de analiză.
Măsurătorile au fost realizate cu ajutorul unui echipament de tip
SPECS PHOIBOS 150 MCD echipat cu o sursă AlKα monocromatică
(hν=1486.6 eV). Avantajele utilizării monocromatorului sunt: reduce semni-
427
ficativ fondul de radiaţie, elimină sateliţii din spectru (vârfuri secundare
care însoţesc tranziţiile de interes) , asigură o rezoluţie energetică şi spaţială
foarte bună.
Proba care urmează a fi analizată este fixată pe un suport de molibden
cu ajutorul unei benzi dublu adezive de carbon. Măsurătorile se realizează
utilizând o sursă de raze X de putere 250 W. Presiunea în camera de analiză
este în intervalul 10-9- 10-10 mbar.
Materialele oxidice cu structură vitroasă pe bază de Bi2O3 prezintă inte-
res foarte mare atât din punct de vedere ştiinţific cât şi tehnologic deoarece
prezintă proprietăţi fizice mai bune decât alte sticle: coeficienţi de expansi-
une termică mari, temperatură de topire joasă, transmisie în ultraviolet
(UV) şi caracteristici optice. În acest studiu sunt comparate rezultatele XPS
obţinute pentru sistemul (1-x) B2O3·xBi2O3 cu x = 25 – 65 cu echipamentul
descris mai sus, cu cele obţinute şi publicate recent [2] în literatura de spe-
cialitate cu un echipament similar, pe acelaşi tip de probe. Autorii au pro-
pus descompunerea spectrelor O1s obţinute pentru acest sistem în două
componente : O1 – asociată legăturilor de tip B-O-B şi O2 atribuită legături-
lor B-O-Bi şi Bi-O-Bi. În Fig. 3a este prezentată descompunerea spectrului
O1s urmărind scenariul propus în literatură. Prin măsurarea probei B2O3
autorii au determinat poziţia vârfului O1s la o valoare a energiei de legătură
de 533.2 eV, indicată în fig.3a prin linia punctată. Se observă că, cu creşterea
lui x, spectrul O1s se deplasează spre energii de legătură mai mici, a. î. prezenţa
O1s as prep O1s as prep

x=0.875 x=0.875
Intensitate ( u. a. )
x=0.6 x=0.6
x=0.375 x=0.375
O3
O2
(a) O1
(b)
540 535 530 525 520 540 535 530 525 520
Energie de legatura (eV)
Figura 3 Deconvoluţia spectrului O1s de înaltă rezoluţie: (a) aşa cum a fost sugerată in literatură;
(b) propusă în studiul nostru
428
componentei B-O-B în spectru, nu mai poate fi clar evidenţiată. Ţinând cont
de echipamentul de înaltă rezoluţie utilizat în achiziţionarea acestor spectre
(sursa -AlKα- monocromata) în laboratorul nostru, şi de valorile energiilor
de legătură ale oxigenului în B2O3 şi Bi2O3 raportate în literatură [3], s-a reuşit
o analiză mult mai detaliată a tipurilor de legături şi a modificărilor care apar
la nivelul acestora în probe cu creşterea conţinutului de Bi. În Fig. 3b este
prezentată deconvoluţia spectrului O1s cu trei componente: O1, O2 şi O3
atribuite legăturilor de tipul B-O-B, Bi-O-B şi Bi-O-Bi. Se observă că, cu creş-
terea conţinutului de Bi, concentraţia legăturilor de tip Bi-O-Bi creşte, în timp
ce componenta atribuită legăturilor de tip B-O-B scade continuu a. î. pentru
proba cu x = 0.875, spre deosebire de [3], această componentă nu mai poate fi
pusă în evidenţă. Spectrul O1s pentru această probă constă din două compo-
nente atribuite legăturilor de tipul Bi-O-B şi Bi-O-Bi. Bi2O3 devine aşadar
formator de reţea vitroasă ceea ce determina creşterea stabilităţii chimice a
probelor. Astfel, acest studiu confirmă faptul că rezoluţia spectrelor înregis-
trate are un rol foarte important în analiza şi modul de interpretare a datelor.
O categorie de probe pe care au fost efectuate măsurători XPS în scopul
evaluării modificărilor structurale induse la suprafaţa acestor sisteme prin
aplicarea tratamentelor termice o reprezintă nanocompozitele pe bază de
Si şi Ti preparate prin combinarea metodei sol-gel cu metoda uscării prin
pulverizare. Acest tip materiale a atras o atenţie deosebită în ultimii ani [4,
5] în special pentru aplicaţii de fotocataliză, deoarece prezintă o
fotoactivitate mult crescută faţă de oxidul de titan pur. Rezultatele XPS
obţinute pentru sistemul cu raport Ti:Si 1:2, indică prezenţa oxigenului şi a
carbonului de contaminare, împreună cu Ti, Si şi Gd, după cum se poate
observa din spectrul survey prezentat în Fig. 4A.
Fotopicul O1s prezintă o formă complexă, asimetrică datorită suprapu-
nerii mai multor componente specifice oxigenului din structura sistemului
investigat (Fig. 4B).
Prin creşterea temperaturilor de tratament termic acesta se deplasează
de la 530.84 eV pentru proba netratată termic, la 532.83 eV pentru cea trata-
tă la 1400 eV.
Începând cu proba tratată termic la 700°C, vârful corespunzător oxige-
nului din reţeaua TiO2 (Ti-O-Ti) prezent în jurul valorii de 530.5 eV şi cel
corespunzător oxigenului în reţeaua SiO2 (Si-O-Si) observat la 532.8 eV sunt
bine separate (Fig. 4B), indicând o segregare a celor doua faze, cu prepon-
derenţa fazei de siliciu la suprafaţă. Analiza fotopicului Si 2p (102 eV) iden-
tifică formarea SiO2 (Fig. 4C), iar spectrul de înaltă rezoluţie corespunzător
Ti 2p pentru substratul de Ti:Si 1:2 (Fig. 4D), indică prezenţa TiO2 evidenţiat
429
O 1s (A ) (B)
Ti LMM
O KLL
C KLL
Gd 3d
Si 2p
Gd 4d
Ti 2p
C 1s
Intensitate (u.a.)
(f)
(f)
(e)
(e )
(d)
(d )
(c)
(c )
(b)
(b )
(a)
(a )
1200 900 600 300 0 545 540 535 530 525
E n e r g ie d e le g a t u r a ( e V ) Energie de legatura (eV)
Intensitate (u.a.) (C) (D)
(f) (f)
(e) (e)
(d)
(d)
(c) (c)
(b)
(b)
(a)
(a)
110 105 100 95 90 470 465 460 455 450
Energie de legatura (eV) Energie de legatura (eV)
Figura 4A: Spectrele XPS survey pentru sistemul Ti:Si 1:2 (a) netratat termic, respectiv tratat
termic la (b) 350°C, (c) 700°C, (d) 900°C, (e) 1100°C şi (f) 1400°C .Spectrele XPS de înaltă rezoluţie
corespunzătoare (B) O 1s, (C) Si 2p, (D) Ti 2p, pentru (a) proba netratată termic precum şi pentru
probele tratate termic la (b) 350°C, (c) 700°C, (d) 900°C, (e) 1100°C şi (f) 1400°C.
prin peak-ul de la 459.0 eV (Ti 2p3/2) şi 464.5 eV (Ti 2p1/2). Formarea celor
doi oxizi (SiO2 şi TiO2) este confirmată şi de forma vârfului O 1s (Fig. 4B).
După cum se poate observa din Tabelul 1, cantitatea de Ti 2p la suprafaţă
descreşte de la 12.28 % pentru proba netratată termic, la 2.89 % pentru pro-
ba tratată termic la 1100°C, în timp ce cantitatea de Si 2p creşte de la 16.87
% la 38.05 %. Acest fapt poate fi explicat printr-o migrare a titanului de la
suprafaţă spre interior şi a siliciului din interior spre suprafaţă,
reflectându-se astfel o substituţie a atomilor de Ti de către atomi cu o elec-
tronegativitate mai mare şi polarizabilitate mai mică, cum sunt atomii de Si
în reţeaua SiO2.
Cantitatea de oxigen la suprafaţa probelor descreşte odată cu creşterea
temperaturii de tratament, fapt datorat îndepărtării oxigenului specific
compuşilor organici sau grupărilor OH, dar mai ales separării celor două
faze.
430
Tabel 1. Concentraţia relativă a principalelor componente,
înainte şi după tratamentul termic, pentru sistemul Ti:Si 1:2.
Temperatura de Compoziţia elementală (% at.)
tratament termic
O 1s Ti 2p Si 2p Gd 3d
(ºC)
Netratat termic 70.688 12.281 16.875 0.156
350 64.428 11.260 24.164 0.148
700 62.684 9.367 27.76 0.18
900 62.640 7.549 29.653 0.15
1100 58.829 2.894 38.057 0.22
1400 59.331 5.498 34.798 0.37
Spectrele de înaltă rezoluţie corespunzătoare Si 2p (Fig. 4B) sunt de

asemenea deplasate spre energii de legătură mai mari, de la 101.43 eV pen-
tru proba netratată termic la 102.9 eV pentru proba tratată termic la 1400°C.
Motivul acestei deplasări este corelat cu deplasarea spectrelor O1s şi cu
migrarea atomilor de Si spre suprafaţă odată cu creşterea temperaturii de
tratament termic.
XPS ne permite de asemenea studiul biocompatibilităţii diferitelor ti-
puri de materiale. Biocompatibilitatea este dictată de modul în care protei-
nele se adsorb la suprafaţa materialului odată ce acesta intră în contact cu
mediul biologic. Pentru exemplificare sunt prezentate caracteristicile de
adsorbţie a albuminei serice bovice (BSA) şi a fibrinogenului (Fg) la supra-
faţa unui compus aluminosilicatic cu conţinut de Fe şi Y preparat prin me-
toda sol-gel (60%SiO220%Al2O310%Fe2O310%Y2O3 - procente molare). Ce-
ramicele vitroase aluminosilicatice sunt foarte stabile în organism iar prin
adăugarea oxidului de fier şi ytriu ele pot fi optimizate pentru aplicaţii si-
multane de hipertermie şi radioterapie [6].
Experimentele de adsorbţie a proteinelor s-au realizat prin imersarea
compusului aluminosilicatic în lichid biologic simulat (SBF) îmbogăţit cu
BSA, precum şi în soluţie tampon fosfatică (PBS) îmbogăţită cu Fg. BSA şi
Fg reprezintă principalele componente plasmatice şi proteinele relevante
care se adsorb la suprafaţa biomaterialelor care intră în contact cu sângele.
După procedura de imersie, probele spălate şi uscate au fost analizate cu
ajutorul spectroscopiei XPS.
Spectrul XPS survey înregistrat înainte de imersie prezintă doar
fotopicuri corespunzătoare elementelor care intră în compoziţia sistemului
(Y 3p, Fe 2p, Si 2p şi Al 2p) pentru toate probele investigate, excepţie fă-
când fotopicul de C 1s (Fig. 5 (A, B)). Prezenţa carbonului se explică prin
expunerea probei la atmosferă, dar şi datorită benzii dublu adezive de car-
bon pe care a fost imobilizată proba pentru măsurare. Pentru măsurători
ulterioare pe probe funcţionalizate cu diverse tipuri de proteine este reco-
431
mandată utilizarea benzii de In în locul celei de C. Este de remarcat faptul
că pentru suprafeţele funcţionalizate cu proteine, detecţia elementelor Y 3p,
Fe 2p, Si 2p şi Al 2p a fost mai puţin evidentă datorită stratului de proteină
format (Tabel 1, 2). Rezultate similare au fost obţinute pentru ambele prote-
ine (BSA/Fg) utilizate pentru funcţionalizare.
O 1s (A) O 1s
O KLL
(B)
C 1s
C KLL
O KLL
Fe 2p
Al 2pSi 2p
C 1s
C KLL
Si 2s
Fe 2p
N 1s
N 1s
Intensitate (u.a.)
Y 3p
Y 3p
Si 2s
Intensitate (u.a.)
Si 2p
O 2s
Al 2p
(d)
(d)
(c)
(c)
(b)
(b)
(a)
(a)
1200 1000 800 600 400 200 0
1200 800 400 0
Figura 5 Spectrele XPS survey înainte de imersie (a) şi după 5 minute (b),
2 ore (c) şi 24 ore (d) de imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi PBS/Fg (B).
În acelaşi timp, analiza spectrelor survey indică fotopicuri corespunză-

toare N 1s, datorită azotului prezent în fiecare aminoacid component al
proteinelor. Măsurătorile XPS de concentraţie de azot pot fi utilizate şi ca
metodă indirectă de determinare a cantităţii de proteină adsorbită la supra-
faţă [7]. Deoarece, concentraţia de azot a fost practic zero înainte de imersie
în soluţiile cu proteină (Tabel 2, 3), azotul poate fi utilizat ca un indicator
sigur al ataşării proteinelor. Rapoartele N:C de 0.2 respectiv 0.5, înregistrate
deja după un timp de imersie de 5 minute, denotă o ataşare rapidă a prote-
inei la suprafaţa compusului. Deconvoluţia spectrelor de N 1s (Fig. 6) de
înaltă rezoluţie scoate în evidenţă două componente, centrate la 398.2 şi 400
eV, caracteristice grupărilor C-NH2. Fotopicul N 1s înregistrat la aproxima-
tiv 400 eV este tipic pentru azotul din compuşii organici [8].
Tabel 2. Concentraţia relativă a principalelor componente, înainte şi după imersia

în soluţiile de SBF/BSA.
Compoziţia elementală (% at.)
Timpul de C N O Al Si Fe Y
imersie
0 6.92 - 53.08 2.3 36.77 0.18 0.75
5 min 28.43 5.68 37.7 2.19 25.47 0.04 0.49
2 ore 28.93 6.46 37.21 1.71 25.2 0.03 0.46
24 ore 33.21 6.67 35.16 1.54 23 - 0.42
432
Tabel 3. Concentraţia relativă a principalelor componente,
înainte şi după imersia în soluţiile de PBS/Fg.
Timpul de Compoziţia elementală (% at.)
imersie
C N O Al Si Fe Y
0 6.92 - 53.08 2.3 36.77 0.18 0.75

5 min 43.11 10.69 29.26 0.8 15.96 0.02 0.16
2 ore 51.81 11.5 23.25 0.41 13.02 0.01 -
24 ore 48.53 13.52 27.83 0.1 10.02 - -
Analizele XPS confirmă creşterea conţinutului de azot după diferite pe-

rioade de imersie. În plus, aşa cum este de aşteptat, proteina mai mare,
(Fg), produce un semnal de azot mai intens decât proteina mai mică, (BSA).
(c) (c)
Intensitate (u.a.)
410 405 400 395 390 410 405 400 395 390
(b) (b)
Intensitate (u.a.)
410 405 400 395 390 410 405 400 395 390
(a) (a)
Intensitate (u.a.)
410 405 400 395 390 410 405 400 395 390
Figura 6 Deconvoluţia spectrelor XPS de înaltă rezoluţie ale N 1s pentru BSA/Fg liofilizat (a)
după 5 minute (b), şi 24 ore (c) imersie în soluţiile de SBF/BSA (coloana stângă) şi PBS/Fg
(coloana dreapta).
433
Potrivit rezultatelor publicate anterior privind adsorbţia proteinelor, o
cantitate de 14% N, în cazul Fg-ului (Tabel 3), este un indicativ al formării
unui monostrat complet de proteină [9].
(A) (B)
Intensitate (u.a.)
Intensitate (u.a.)
(e)
(e)
(d)
(d)
(c)
(c)
(b)
(a) (b)
(a)
292 288 284 280 276 272
292 288 284 280 276 272
Figura 7 Spectrele XPS de înaltă rezoluţie ale C 1s înainte de imersie (a), ale C 1s pentru BSA/Fg liofilizat
(b) precum şi după 5 minute (c), 2 ore (d) şi 24 ore (e) imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi PBS/Fg (B).
În cazul probelor imersate în soluţiile cu proteină, semnalele de înaltă re-

zoluţie ale C 1s (Fig. 7) sunt mai largi şi prezintă o formă asimetrică, semna-
lând formarea unor noi tipuri de legături specifice carbonului în proteine [8].
După imersia în soluţiile cu proteine, fotopicul O 1s este evident lărgit
şi se deplasează spre energii de legătură mai mici, pe baza componentei
BSA-ului de la 530.3 eV, respectiv Fg-ului la 531.2 eV (Fig.8). După imersia
în soluţiile cu proteină, conţinutul semnificativ diminuat al O 1s (Tabel 2,
3) corespunde în mare parte oxigenului peptidic constituent al proteinelor,
datorită ataşării la suprafaţă a BSA/Fg-ului cu un conţinut scăzut în oxigen
faţă de compusul oxidic utilizat (Fig.8B)
Astfel spectroscopia XPS a fost utilizată cu succes în acest studiu, evi-
denţiind ataşarea proteinelor la suprafaţa materialului şi totodată
biocompatibilitatea materialului investigat [10-12].
(A) (B)
(e) (e)
Intensitate (u.a.)
(d)
Intensitate (u.a.)
(d)
(c)
(c)
(b)
(b)
(a) (a)
545 540 535 530 525 545 540 535 530 525
Figura 8 Spectrele XPS de înaltă rezoluţie ale O1s înainte de imersie (a), ale O 1s pentru BSA/Fg
liofilizat (b) precum şi după 5 minute (c), 2 ore (d) şi 24 ore (e) imersie în soluţiile de SBF/BSA (A) şi
PBS/Fg (B).
434
Biomaterialele dopate cu particule nano ( Au, Ag) prezintă un interes cres-
cut datorită caracteristicilor remarcabile ale acestora, ce deschid noi oportuni-
tăţi în medicină. Acest tip de materiale furnizează avantaje valoroase şi în dia-
gnosticarea cancerului sau imagistica biomedicală. Mai jos sunt prezentate
rezultatele XPS cu privire la nucleaţie şi procesul de creştere a nanoparticulelor
de Au în sticla bioactivă CaO-SiO2-P2O5 tratată termic la diferite temperaturi.
Spectrul Au4f este caracterizat de două componente spin-orbită, Au 4f7/2 şi
Au 4f5/2, având despicarea, ΔE = 3.67 eV. Deconvoluţia spectrului Au4f înre-
gistrat pentru probele tratate termic la 300 şi respectiv 500 °C prezintă trei
dubleţi la energiile de legătură: 82, 83.72 şi 85.95 eV, atribuiţi la trei specii de
Au diferite: Auδ-, Au0 şi Auδ+. Identificarea speciilor de Au prezente în probe
este foarte importantă deoarece studii recente au demonstrat faptul că toxicita-
tea nanoparticulelor de Au în tratamentul cancerului depinde de sarcina aces-
tora [13]. Acest studiu publicat recent, [14], are importanţă ştiinţifică mare da-
torită faptului că demonstrează foarte clar legătura care există între dimensiu-
nea nanoclasterilor care se formează în matrice şi modificările observate în
spectrul Au4f şi cel al benzii de valenţă cu creşterea temperaturii de tratament
a probei. Aceste rezultate furnizează dovezi experimentale complete pentru
corelaţia dintre dimensiunea şi structura electronică a nanoparticulelor de Au
care a fost prezisă teoretic.
Au4f ΔE 0.6
δ- Au 5d
T (°C)
0 T(°C)
500 0.3
δ+ 500
0.0
Intensitate (u. a. )
0.6
300
300 0.3
0.0
0.6
110
110 0.3
(a)
(b)
0.0
92 90 88 86 84 82 80 16 12 8 4 0
Energie de legatura (eV) Energie de legatura ( eV )
Figura 9(a) Spectrul XPS obţinut pentru Au 4f pe proba

0.3Au2O3·99.7[61.5SiO2·30.8CaO·7.7P2O5] tratată termic la 110, 300 şi 500°C; Deconvoluţia
liniilor spectrale indica prezenţa speciilor de Au Auδ+, Au0 şi Auδ- în fiecare proba;
(b) Spectrul XPS al benzii de valenţa (Au 5d) obţinut pe aceleaşi probe. Linia gri reprezintă spectrul
obţinut pentru fiecare din cele trei probe fără nanoparticule de Au.
435
2. Bibliografie
1. “Dual-Beam” Charge Neutralisation for monoXPS
2. T. Honma et al., Phys. Chem. Glasses, 43,32-40, 2002.
3. V. Dimitrov et al., J. of Solid State Chem. 163, 100-112 (2002).
4. V. Simon, O. Ponta, S. Simon, M. Neumann, J. Opt. Adv. Mat., vol. 10, No. 9, (2008)
2325
5. Oana Ponta, Structural characterization of some silicate xerogels and microspheres,
PhD Thesis, December 2010
6. Overgaard J, Gonzalez Gonzalez D, Hulshof MCCH, Arcangeli G, Dahl O, Mella
O, et al. Int J Hyperther 2009; 25:323-334.
7. A. Arvidsson, F. Currie, P. Kjellin, Y.T. Sul, V. Stenport, J Mater Sci: Mater Med;
20:1869-1879, 2009.
8. A. P. Serro, M.P. Gispert, M.C.L. Martins, P. Brogueira, R. Colaco, B. Saramago, J
Biomed Mater Res;78A:581-589, 2006.
9. R. Michel, S. Pasche S, M. Textor, D. G. Castner, Langmuir 2005; 21:12327–12332.
10. V. Simon, S. Cavalu, S. Simon, H. Mocuta, E. Vanea, M. Prinz, M. Neumann, Solid
State Ionics, 180, 764–76, 2009.
11. V. Simon, S. Cavalu, M. Prinz, E. Vanea, M. Neumann, S. Simon, European Cells &
Materials, 16, S1, 55, 2008.
12. E. Vanea, V. Simon, XPS study of protein adsorption onto nanocrystalline
aluminosilicate microparticles, Applied Surface Science, 257(2011) 2346-2352
13. L. C. Kennedy, L. R. Bickford, N. A. Lewinski, A. J. Coughlin, Y. Hu, E. S. Day, J. L.
West, R. A. Drezek, A New Era for Cancer Treatment: Gold-Nanoparticle-Mediated
Thermal Therapies. Small 7, 169-183, 2011
14. T. Radu, D. Benea, R. Ciceo-Lucacel, O. Ponta and S. Simon, J. Appl. Phys.,
doi:10.1063/1.3681307
436
XII. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ
ELECTRONICĂ DE SPIN
Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin

3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700

m agnetic field
Cuprins
1. Consideraţii teoretice .......................................................................................................... 437
1.1. Interacţiunea Zeeman ................................................................................................. 438
1.2. Hamiltonianul de Spin ............................................................................................... 441
2. Obţinerea şi analiza spectrelor RES .................................................................................... 443
3. Caracterizarea instalaţiei experimentale RES ..................................................................... 447
3.1. Principiul de funcţionare al unui spectrometrul RES................................................. 447
3.2. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400 ............................................................ 447
3.3. Exemple de spectre RES achiziţionate cu ajutorul spectrometrului portabil
ADANI PS8400 ......................................................................................................... 449
4. Bibliografie .......................................................................................................................... 451
1. Consideraţii teoretice
Rezonanţa electronică de spin este o metodă larg utilizată în descrierea
stărilor fundamentale şi caracterizarea efectelor vecinătăţii asupra nivelelor
energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metodă sensibilă la pozi-
ţiile atomilor în structură şi permite studiul simetriei locale. Metoda constă
437
în studiul tranziţiilor dintre nivelele electronice ale atomilor în prezenţa
unui câmp magnetic extern [1,2].
Astfel, spectroscopia RES este capabilă să furnizeze detalii de structură
moleculară inaccesibile altor metode analitice. Aceasta se datorează faptu-
lui că momentul magnetic de spin al electronului neîmperecheat este foarte
sensibil la câmpurile magnetice locale din interiorul probei. Aceste câmpuri
de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiţilor nuclei
care pot fi prezenţi în vecinătăţi (de exemplu, atomii interstiţiali dintr-un
cristal sau matricea unei sticle, etc.).
În cazul experimentelor de Rezonanţă Magnetică Nucleară (RMN),
frecvenţele utilizate sunt de ordinul megahertzilor (MHz) din domeniul
vizibil la cel ultraviolet. Frecvenţa de ordinul gigahertzilor (GHz), în do-
meniul microundelor, este folosită în cazul experimentelor RES.
De-a lungul anilor, spectroscopia RES a fost cu succes aplicată în di-
verse domenii ca biologie, fizică, geologie, chimie, ştiinţele medicale, ştiinţa
materialelor, antropologie, etc. Solidele, lichidele şi gazele sunt deopotrivă
accesibile spectroscopiei RES. Prin utilizarea unor tehnici specializate varia-
te (cum ar fi metoda capcanelor de spin şi a radicalilor nitroxidici, ESEEM
şi ENDOR) în conjuncţie cu RES este posibil să se obţină informaţii detalia-
te privind unele teme de interes ştiinţific. De exemplu, procesele de cineti-
că, schimbul electronic, procesele electrochimice, structura cristalină, catali-
za şi reacţiile de polimerizare au fost toate studiate cu mare succes.
Sistemele tipice care pot fi studiate prin RES sunt:
1. Radicalii liberi în stare solidă, lichidă sau gazoasă;
2. Defecte punctuale (imperfecţiuni localizate în cristale) în solide;
cel mai cunoscut din această clasă este centrul F, un electron
prins într-o vacanţă ionică negativă;
3. Biradicalii (molecule ce conţin doi electroni neîmperecheaţi, su-
ficient de depărtaţi unul de altul, astfel încât interacţiunea lor să
fie slabă);
4. Sisteme cu stare fundamentală de triplet (cu doi electroni neîm-
perecheaţi care interacţionează puternic);
5. Sisteme cu trei sau mai mulţi electroni neîmperecheaţi;
6. Ioni ai metalelor tranziţionale şi ai pământurilor rare [1, 2];
7. Sisteme cu electroni de conducţie (metale şi semiconductori).
1.1. Interacţiunea Zeeman

Metoda RES constă în studiul tranziţiilor induse între două subnivele
Zeeman vecine, sub acţiunea unui câmp de microunde cu o anumită frec-
438
venţă numită frecvenţă de rezonanţă [1]. Diferenţa de energie în spectro-
scopia RES este predominant datorată interacţiunii electronilor neîmpere-
cheaţi din probe cu câmpul magnetic produs de un magnet, efect denumit
efect Zeeman. În urma absorbţiei de energie electronii trec de pe nivelul de
energie inferior pe unul superior, orientarea spinului trecând din cea para-
lelă cu câmpul în poziţia antiparalelă cu acesta.
Astfel, se cunoaşte faptul că electronul posedă o proprietate cuantică
numită “spin”, care este privită clasic ca o rotaţie în jurul propriei axe. Ca
→
urmare a acestei rotaţii electronul posedă un moment cinetic de spin S că-
→
ruia i se asociază un moment magnetic μ S :
→ →
μ S = −g ⋅γ ⋅ S (1)
unde g este factorul Landé care pentru electronul liber are valoarea 2.0023,
iar γ este raportul giromagnetic electronic; S - este momentul cinetic de
spin. Introdus într-un câmp magnetic static B, spinul electronului poate
avea două orientări, paralelǎ sau antiparalelǎ cu câmpul magnetic. Diferen-
ţa dintre cele două direcţii ale spinului, în energie, depinde de intensitatea
câmpului magnetic aplicat. Energia interacţiunii Zeeman a unui electron
într-un câmp magnetic aplicat B este dată de relaţia:
→ →
E Zeeman = − μ s ⋅ B = g ⋅ β ⋅ B⋅ M S (2)
unde β este magnetonul Bohr, β = γ ⋅ , iar MS este numărul cuantic mag-

netic de spin care poate lua valoarea M S = ± 1 2 . Astfel, ecuaţia (2) poate
avea doar două forme pentru o orientare dată a câmpului magnetic B:
⎛ 1⎞ ⎛ 1⎞
E↑ = +⎜ ⎟ ⋅ β ⋅ g ⋅ B , E↓ = −⎜ ⎟⋅ β ⋅ g ⋅ B (3)
⎝ 2⎠ ⎝ 2⎠
Regula de selecţie pentru tranziţia unui spin electronic este
Δ M S = ± 1 . Asemenea tranziţii corespund la o schimbare în momentul
unghiular de spin de ( ± ). Un foton are momentul unghiular intrinsec
egal cu . Din această cauză dacă Δ M S = + 1 când un foton este absorbit
M I (numărul cuantic magnetic nuclear) trebuie să rămână neschimbat
pentru ca momentul unghiular total să se conserve. Astfel regulile de selec-
ţie impuse sunt Δ M S = ± 1 şi Δ M I = 0 .
439
Cu alte cuvinte, spectrul RES măsoară energia necesară tranziţiei elec-
tronului (ΔE) între cele două nivele energetice, într-un câmp magnetic exte-
rior. Această energie, de obicei se obţine de la o sursă de energie electro-
magnetică, având o frecvenţă fixă de oscilaţie ν şi deci energia (h·ν). Rezul-
tă de aici condiţia de rezonanţă:
h ⋅ν = g ⋅ β ⋅ B (4)
unde h este constanta lui Planck, ν frecvenţa de rezonanţă, iar B câmpul
magnetic aplicat. Parametrul g determină poziţia liniei de absorbţie. De
obicei linia de absorbţie nu este singulară apărând uneori un spectru de
multipleţi datorită existenţei nucleelor magnetice în specia paramagnetică.
Figura 1. Nivelele energetice şi absorbţia de rezonanţă

RES pentru interacţia Zeeman a unui electron (S = 1/2)
În (Fig. 1) sunt reprezentate schematic energiile Zeeman funcţie de

magnetizarea câmpului aplicat B, în cazul unui electron neîmperecheat
(S=1/2). De asemenea, figura ilustrează tranziţia între nivelul de energie
inferior « spin jos » şi nivelul de energie superior « spin sus » indusă prin
introducerea probei în câmpul de microunde de frecvenţă ν. Spectrul de
absorbţie măsurat la condiţia de rezonanţă este schematic reprezentat în
partea de jos a figurii.
440
1.2. Hamiltonianul de Spin
Fenomenul RES poate fi tratat teoretic prin două metode: tratarea clasi-
că cu ajutorul teoriei lui Bloch şi tratarea cuantică. Cel mai simplu forma-
lism pentru interpretarea spectrelor RES este cel al hamiltonianului de spin.
Starea unui ion paramagnetic având spinul nuclear nenul, introdus
într-o reţea cristalină şi aşezat într-un câmp magnetic static, este descrisă
printr-un hamiltonian compus din mai mulţi termeni [1], şi anume:
H=H0+HLS+HSS+HZ+HN+HQ+HD+HC (5)
unde,
H0 - reprezintă energia ionului liber care nu depinde de spin;
HLS – este interacţiunea spin – orbită;
HSS – reprezintă interacţiunea de structură fină în aproximaţia de
ordin II (sau termenul de despicare în câmp nul);
HZ – reprezintă interacţiunea electronului cu câmpul magnetic exte-
rior (termenul Zeeman);
HN – reprezintă termenul interacţiunii hiperfine;
HQ – interacţiunea electrostatică cu momentul de cuadrupol q al
nucleului;
HD – descrie proprietăţile diamagnetice;
HC – termenul câmpului cristalin şi reprezintă influenţa câmpului
electrostatic cristalin.
În esenţă hamiltonianul de spin este un operator echivalent care acţio-
nează numai asupra coordonatelor de spin conducând la aceleaşi rezultate
ca şi hamiltonianul total al sistemului. Hamiltonianul de spin conţine o
serie de coeficienţi care sunt mărimi tensoriale, deci depind de forma func-
ţiei de undă şi de câmpul cristalin. Toţi coeficienţii tensoriali din expresia
hamiltonianului de spin se exprimă prin matrici care pot fi diagonalizate.
Folosind teoria perturbaţiilor se ajunge la forma bine cunoscută a
hamiltonianului de spin:
Hs = β ⋅ ( g xx S x Bx + g yy S y By + g zz S z Bz ) + D ⋅ ⎡⎢S z2 − S (S + 1)⎤⎥ + E ⋅ (S x2 − S y2 ) (6)
1
⎣ 3 ⎦
Primul termen din acest hamiltonian este aşa numita interacţiune
Zeeman, iar ultimii doi sunt termenii ce dau structura fină. D şi E reprezintă
constantele de despicare în câmp nul, axială, respectiv rombică. Dacă sime-
tria este axială, rămân în hamiltonian numai termenul Zeeman şi termenul
în D, termenul E fiind 0.
441
Cea mai simplă formă a hamiltonianului de spin este pentru un singur
electron cu g izotrop, fără interacţiuni hiperfine corespunzător ecuaţiei (4),
şi are următoarea formă:
H = g ⋅ β ⋅ B ⋅ SZ (7)
unde direcţia câmpului magnetic este aleasă ca fiind axa z, SZ este operato-
rul de spin corespunzător proiecţiei acestuia după axa z.
Pentru un singur electron cu g anizotrop hamiltonianul de spin este mai
complicat din cauza diferiţilor operatori ai proiecţiei spinului. De exemplu,
pentru o simetrie axială hamiltonianul de spin are următoarea formă:
H = g // ⋅ β ⋅ B Z ⋅ S Z + g ⊥ ⋅ β ⋅ B X ⋅ S X (8)
unde BZ este componenta câmpului magnetic de-a lungul axei z (paralel),

BX este componenta câmpului magnetic de-a lungul direcţiei perpendicula-
re (x). Dacă câmpul magnetic este direcţionat paralel cu direcţia axelor mo-
leculare atunci situaţia este identică cu relaţia (7).
Interacţiunea dintre momentul magnetic de spin şi un moment magne-
tic nuclear se numeşte interacţiune hiperfină. Termenul HN (ecuaţia 5) re-
prezintă termenul interacţiunii hiperfine. Hamiltonianul de structură hiper-
fină produce o despicare simetrică a nivelelor energetice şi are următoarea
formă:
→ ~ →
HN = S⋅ A ⋅ I (9)
unde A este tensorul interacţiunii hiperfine. Ordinul de mărime al energiei
hiperfine este de 0 ÷ 10-2 cm-1. Acest termen reprezintă interacţiunea mo-
→ →
mentului cinetic de spin I cu momentul de spin electronic S . Tocmai
această interacţiune produce structura hiperfină a nivelelor energetice de
spin, descrisă de hamiltonianul de mai sus.
Hamiltonianul de spin care descrie starea energetică a unui centru pa-
ramagnetic electronic în interacţiune cu n nuclee cu spinul nuclear diferit
de zero va fi:
n →
→ → ~ →
H = β ⋅ B⋅ g~⋅ S + ∑ S ⋅ Ai ⋅ I i (10)
i =1
unde, în cazul unor simetrii nesferice atât g, cât şi Ai sunt mărimi tensoriale.
442
2. Obţinerea şi analiza spectrelor RES
În experimentele RES cele mai utilizate benzi de frecvenţe de micro-
unde sunt benzile X (∼ 9.5 GHz) şi Q (∼ 35 GHz). Deoarece sensibilitatea
instrumentului creşte proporţional cu pătratul frecvenţei, rezultă că se ob-
ţine o rezoluţie spectrală mult mai bună o dată cu creşterea frecvenţei de
microunde. Totuşi, există limitări tehnice legate de utilizarea benzilor de
frecvenţă ridicate: folosirea de probe de dimensiuni mici; dificultăţi de ob-
ţinere a omogenităţii câmpului (δH/H) la frecvenţe mari; creşterea absorb-
ţiei o dată cu creşterea frecvenţei, pentru probe sub formă de soluţii, ceea ce
duce la scăderea sensibilităţii.
Măsurătorile RES se pot efectua pe probe gazoase, soluţii îngheţate,
pulberi şi monocristale. Probele se introduc de obicei în tuburi şi, având în
vedere posibilităţile de absorbţie şi de a da semnal RES al sticlei obişnuite,
este indicat a se folosi cuarţul. Tuburile au diametre de câţiva milimetri şi
lungimi de ordinul centimetrilor.
Spectrul RES al unui centru paramagnetic cu spinul ½ este bine definit
dacă se cunosc tensorii g (factorul de despicare spectroscopică) şi A (con-
stanta de despicare hiperfină). Aceşti tensori dau cele mai importante in-
formaţii cu privire la structura centrului paramagnetic studiat.
Factorul g este o mărime tensorială caracterizată prin trei valori princi-
pale. În expresia factorului g, în afara unei mărimi constante intervine o
mărime care dă abaterea factorului g de la valoarea corespunzătoare elec-
tronului liber. Pentru un electron liber, valoarea factorului g este ge =
2.0023. Cu toate acestea în probele care conţin centri paramagnetici intervin
o serie de factori care abat valoarea factorului g de la valoarea amintită mai
sus. Unul din factori este datorat faptului că electronul posedă în plus un
moment unghiular orbital căruia i se asociază un moment magnetic. În felul
acesta în sisteme cu un electron neîmperecheat şi legătură π, momentul de
spin şi cel orbital se pot combina.
Astfel, abaterea factorului g de la valoarea 2,0023, notată Δg, se dato-
rează unui slab câmp perturbator indus, provocat de mişcarea orbitală.
Acest câmp perturbator se poate adăuga sau scădea la câmpul exterior,
obţinând o valoare a lui Δg pozitivă sau negativă.
În sistemele chimice, electronii neîmperecheaţi ocupă un orbital care
poate fi localizat pe un singur atom sau poate fi delocalizat pe o întreagă
moleculă sau pe un radical. Pentru radicalii liberi, g rămâne apropiat de
valoarea electronului liber.
În celelalte cazuri, trebuie luate în considerare contribuţiile la momen-
tul magnetic ale mişcării orbitale a electronului. Valoarea lui g definită prin
443
h ⋅ν
relaţia g = , cunoscută şi sub denumirea de g efectiv (gef ), poate fi
β ⋅B
diferită de 2,00 , mai rar scade mult sub această valoare, dar poate ajunge la
9,00 sau mai mult. În acest caz valoarea factorului g depinde de numerele
cuantice J, L şi S astfel:
J ⋅ ( J + 1) + S ⋅ ( S + 1) − L ⋅ ( L + 1) (11)
g =1+
2 J ⋅ ( J + 1)
unde J – numărul cuantic total; S – numărul cuantic de spin; L – numărul
cuantic orbital, iar această ecuaţie reprezintă formula lui Lande.
În experimentele RES uzuale efectuate în undă continuă se fixează
frecvenţa şi se variază inducţia câmpului magnetic aplicat. De obicei se
lucrează în banda X, fiind necesar un câmp magnetic de ∼ 3300 G, pentru
semnale cu g ~ 2.0. Astfel, factorul g este calculat din condiţia de rezonanţă,
utilizând valorile măsurate ale frecvenţei şi câmpului la rezonanţă. Valoa-
rea lui g depinde de orientarea câmpului magnetic extern în raport cu cel
electric cristalin şi este o mărime tensorială.
Pentru a determina valoarea factorului g mai uşor, se poate introduce
în cavitatea de rezonanţă pe lângă proba de studiat şi un etalon. Cel mai
uzual radical utilizat ca etalon pentru marcarea câmpului magnetic este
DPPH (difenilpicrilhidrazil), pentru care g = 2,0036. Astfel, valoarea lui g
pentru un sistem paramagnetic oarecare se calculează utilizând următoarea
relaţie:
g etalon ⋅ B etalon
g = (12)
B proba
Există posibilitatea de a combina metode în care pot fi îndeplinite mai
multe condiţii de rezonanţă pe lângă cele referitoare la spinul electronic, de
exemplu ENDOR (Electron Nuclear DOuble Resonance) şi ELDOR (Elec-
tron Electron DOuble Resonance). Acestea sunt exemple de tehnici nelinia-
re, deoarece ambele depind de saturaţie [3].
În ceea ce priveşte forma şi lărgimea semnalului RES, acestea sunt in-
fluenţate atât de caracteristicile fizico-chimice ale substanţei paramagnetice,
cât şi de condiţiile experimentale. Liniile de rezonanţă ale probelor solide
sunt considerabil distorsionate de anizotropia factorului g sau de cuplajul
dintre spinii electronici şi nucleari. Prezenţa anumitor tipuri de interacţiuni
are ca efect lărgirea sau îngustarea liniei de rezonanţă. Impurităţile para-
magnetice pot de asemenea distorsiona semnalul RES, în particular prin
alterarea timpului de relaxare spin-reţea.
444
Dintre factorii instrumentali care pot influenţa forma semnalului RES,
avem: neomogenitatea câmpului magnetic static B0, saturarea sistemului de
spini cu o putere excesivă, neliniaritatea amplificatorului sau a detectoru-
lui, diversele scheme de modulaţie utilizate pentru a creşte detecţia.
Lărgirea liniei RES poate fi omogenă sau neomogenă. În cazul lărgirii
omogene toţi spinii din probă răspund ca o unitate acţiunii cuantelor de
microunde, absorbind cuantele la o valoare bine determinată a câmpului
magnetic.
Figura.2 Forma Lorentzianǎ şi gaussianǎ a liniilor RES
Dacă numai anumite grupuri de spini sau pachete de spini din probă
pot absorbi direct cuantele de o frecvenţă particulară, atunci linia este lărgi-
tă neomogen.
Liniile lărgite omogen, apărute în urma unor fluctuaţii dinamice în sis-
temul de spini (variabile în timp), sunt simetrice şi au o formă aproximativ
Lorentziană (Fig.2). Această linie este îngustă în zona centrală şi are o des-
creştere lentă spre extreme. Cauzele care determină lărgirea neomogenă
sunt : interacţiunea dipolară între spinii de acelaşi tip, relaxarea spin – re-
ţea, interacţiunea dintre spinul electronic şi câmpul de microunde, difuzia
de spin, fluctuaţiile datorate mişcării spinilor în câmpul magnetic local.
Liniile lărgite neomogen sunt înfăşurătoarele liniilor lărgite omogen cores-
punzătoare diferitelor pachete de spini, linii care au maxime de absorbţie
uşor diferite între ele datorită distribuţiei de câmp magnetic local în probă.
Liniile lărgite neomogen, atunci când lărgirea nu este provocată de interac-
ţiunile anizotrope, se apropie de o formă Gaussiană. Cauzele lărgirii neo-
mogene sunt fluctuaţii spaţiale de câmp magnetic şi sunt datorate prezenţei
unor interacţiuni hiperfine, dipolare dintre spini cu frecvenţe Larmour di-
ferite, anizotropiei tensorilor g şi de structura fină, neomogenităţilor câm-
pului magnetic static. Pentru sistemele reale, linia de rezonanţă are în gene-
ral o formă intermediară între cele două cazuri limită.
445
În cazul radicalilor liberi generaţi prin iradiere γ în sisteme
biofarmaceutice şi de interes biomedical, structura hiperfină a spectrelor
RES (când este bine rezolvată) furnizează informaţii mai importante despre
radicali decât valoarea factorului g, deoarece majoritatea radicalilor detec-
taţi sunt radicali centraţi pe carbon sau azot, iar poziţia spectrelor este
aproximativ aceeaşi în câmpul magnetic [4]. Studiile efectuate au pus în
evidenţă la spectrele de rezonanţă ale radicalilor liberi, o serie de particula-
rităţi [1]:
I. Factorul de despicare spectroscopică g are valoarea foarte apropiată
de cea corespunzătoare electronului liber (g = 2.0023);
II. Prezenţa unei structuri hiperfine caracteristice, care permite în multe
cazuri identificarea radicalilor liberi; structura fină lipseşte pentru că
spinul este egal cu ½ ;
III. Lărgimea liniei este de obicei mică.
I. Valoarea factorului de despicare spectroscopică g apropiată de cea a
electronului liber, arată că la radicalii liberi există o interacţiune spin-orbită
foarte slabă şi electronii cu spinii neîmperecheaţi au un grad mare de loca-
lizare. Factorul g nu permite identificarea radicalilor liberi, totuşi unele
măsurători RES, foarte precise, au reuşit să pună în evidenţă dependenţa
factorului g de structură într-o serie de substanţe organice [2].
II. Prezenţa structurii hiperfine la radicalii liberi se datorează interacţi-
unii magnetice a electronului cu spin neîmperecheat cu momentul magne-
tic al nucleelor cuprinse în orbita acestui electron. Fiecare radical liber are o
structură hiperfină caracteristică, determinată de numărul de nuclee cu-
prinse în orbita electronului şi de gradul de localizare al electronului la
fiecare dintre aceste nuclee. Prin aceasta, structura hiperfină permite, în
majoritatea cazurilor, identificarea radicalului liber studiat.
Numărul liniilor de structură hiperfină, intensitatea lor şi valoarea des-
picării hiperfine depind de numărul nucleelor cuprinse în orbita electronu-
lui paramagnetic, de faptul dacă aceste nuclee sunt identice sau nu, şi de
densitatea de electroni cu spini neîmperecheaţi la fiecare dintre aceste nu-
clee. Când orbita electronului cuprinde cu egală probabilitate un număr n
de nuclee identice, caracterizate printr-un număr cuantic I, spectrul va avea
(2nI+1) linii de structură hiperfină, aşezate la intervale egale şi cu intensităţi
care sunt mai mari în centrul spectrului şi descresc spre margini. În cazul
când electronii paramagnetici înconjoară mai multe nuclee cu spini nucleari
diferiţi, descifrarea structurii hiperfine a spectrelor este destul de complica-
tă, căci apar (2I1+1)(2I2+1)…..(2In+1) linii de egală intensitate, dar situate la
intervale neegale.
446
Există două tipuri de interacţiuni hiperfine: interacţiunea hiperfină ani-
zotropă şi interacţiunea hiperfină izotropă. Interacţiunea hiperfină anizo-
tropă este interacţiunea de tip dipol magnetic între electronul cu spin ne-
împerecheat şi nucleul cu moment magnetic diferit de zero. Interacţiunea
hiperfină izotropă sau interacţiunea hiperfină de contact (interacţiunea de
contact Fermi), are loc între nucleul cu moment magnetic nenul şi electronii
cu spini neîmperecheaţi, a căror densitate la locul nucleului este diferită de
zero. Interacţiunea hiperfină izotropă este partea principală a interacţiunii
hiperfine în radicali liberi, deoarece în multe cazuri interacţiunea hiperfină
anizotropă nu se rezolvă şi are ca efect doar o lărgire a liniilor de rezonanţă
sau o anizotropie a formei şi lărgimii liniei. Structura hiperfină a spectrelor
apare în special în cazurile când electronii cu spin neîmperecheat sunt elec-
troni s sau σ. Structura fină lipseşte în cazul radicalilor liberi cu un singur
electron neîmperecheat.
III. Lărgimea liniei fiind mică permite determinări foarte precise de
concentraţie a radicalilor liberi şi separarea efectelor diferiţilor radicali pre-
zenţi în acelaşi timp în proba studiată. De asemenea lărgimea mică a liniilor
facilitează studiul structurii hiperfine, în general despicarea hiperfină fiind
mai mare decât lărgimea componentelor hiperfine.
3. Caracterizarea instalaţiei experimentale RES

3.1. Principiul de funcţionare al unui spectrometru RES
Funcţionarea spectrometrului se bazează pe înregistrarea într-un câmp
magnetic static al polarizării induse de o probă electromagnetică în câmp
de microunde datorită tranziţiilor cuantice între nivelele Zeeman ale parti-
culelor paramagnetice. Astfel, spectrometrul RES se compune dintr-un elec-
tromagnet capabil să creeze un câmp magnetic static B, un generator de
microunde, un detector, o cavitate de microunde şi un sistem computerizat
pentru înregistrarea şi observarea fenomenului de rezonanţă. Toate aceste
elemente se găsesc cuplate prin intermediul probei de studiat care se află
sub acţiunea câmpului magnetic static şi al câmpului de microunde.
3.2. Spectrometrul portabil RES ADANI PS8400

În cazul tuturor experimentelor, măsurătorile se efectuează folosind
capilare speciale de sticlă, cu lungimea de 20 cm şi diametrul interior de
1mm, în care se introduce proba. Spectrele RES se înregistrează la tempera-
tura camerei cu ajutorul spectrometrului “ADANI Portable EPR
Spectrometer PS8400”, care operează în banda X (9.1 GHz ÷ 9.6 GHz) şi
447
care este echipat cu un sistem de achiziţie al datelor, computerizat. Spec-
trometrul poate opera în următoarele condiţii : temperatura mediului cu-
prinsă între (+18°C) şi (+28°C) ; umiditatea relativă între 20% şi 80%, şi pre-
siunea atmosferică (840 GPa – 1066 GPa), (630 mmHg - 800mmHg) (Fig.3).
Parametrii spectrometrului utilizaţi la achiziţionarea spectrelor RES sunt
diferiţi, în funcţie de probele care urmează a fi studiate.
Schema bloc a spectrometrului portabil “ADANI PS8400” este redată în
(Fig. 4). Sursa de radiaţie electromagnetică şi detectorul de află într-o cavi-
tate numită “punte de microunde”. Puntea de microunde este o cutie de me-
tal care ajută la amplificarea semnalelor slabe provenite de la probe. Sursa
de microunde este reprezentată de un oscilator “GUNN”.
“ADANI PS8400”
Figura. 3 ADANI Portable EPR Spectrometer PS8400
Cavitatea de microunde este de formă rectangulară, lucrează în modul

TE102 şi are un factor de calitate Q = 5000. Factorul de calitate Q indică cât
de eficient stochează cavitatea energia de microundă. Cu creşterea factoru-
lui de calitate Q, sensibilitatea spectrometrelor creşte.
ν res
Factorul de calitate este dat de relaţia Q = , unde νres este frecvenţa
Δν
de rezonanţă, iar Δν lărgimea la semiînălţime a rezonanţei.
Modulaţia se realizează cu un semnal de frecvenţă ν = 100 kHz. Sensi-
bilitatea spectrometrului RES tip “ADANI PS8400” este 5×106 spin /Gauss,
iar rezoluţia este de 0.07 Gauss /cm.
Canalul de semnal cuprinde partea electronică necesară detectării senzi-
tive în fază. Valorile de “offset” ale câmpului magnetic şi timpul de baleiere
sunt controlate de către sistemul de achiziţionare computerizat. O baleiere
a câmpului este divizată în 4096 de paşi discreţi.
448
Figura.4 Schema bloc a spectrometrului “Portable ADANI PS8400”
La fiecare pas, o tensiune de referinţă corespunzătoare valorii de

“offset” a câmpului magnetic este trimisă către acea parte a controlerului
care reglează bobinele de baleiere. Rata de baleiere este controlată prin va-
rierea timpului de aşteptare între paşii individuali. Toate aceste componen-
te lucrează împreună pentru achiziţionarea unui spectru de rezonanţă elec-
tronică de spin (RES).
3.3. Exemple de spectre RES achiziţionate cu ajutorul spectrometru-

lui portabil ADANI PS8400
a) spectrele RES ale unor probe de hidroxiapatită cu fier
449
b) spectrele RES ale unor probe vitroase şi vitroceramice care conţin fier [5]:
g = 4.3
x (mol %)
g = 4.3 x (mol %)
70
70
60
60
Intensitate (u.a.)
50
50
Intensitate (u.a.)
40
40
g = 2.0
30 30
20 20
10
10
1000 2000 3000 4000 5000

Camp magnetic (G) 1000 2000 3000 4000 5000
Camp magnetic (G)
c) spectrele RES ale unor medicamente:
spectrul experimental
spectrul experimental
spectrul simulat
spectrul simulat
3250 3300 3350 3400 3450 3250 3300 3350 3400 3450
B(G) B(G)
d) spectrele RES ale unor radicali liberi [6]:

T im p (zile)
7
5 E (92 z)
E (ini)
1
3250 3300 3350 3400 3450

3320 3340 3360 3380 3400
B (G ) B (G)
450
4. Bibliografie
1. I.Ursu, Rezonanţa electronică de spin, Ed. Academiei R.S.România, (1965)
2. Al. Nicula, Rezonanţa magnetică, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 61-64
(1980)
3. L. David, C. Crăciun, O. Cozar, V. Chiş, Rezonanţa electronică de spin, Presa Universi-
tară Clujeană, Cluj-Napoca, (2001)
4. A-S. Crucq, Study of radicalizing mechanisms of irradiated drugs (Radiosterilization of
pharmaceuticals: radicals), Chimie Nouvelle, 12: 1356 -1359, (1994)
5. S. Simon, M. Todea, Spectroscopic study on iron doped silica-bismuthate glasses and glass
ceramics, J. Non-Cryst. Solids, 352, 28-29, (2006) 2947.
6. Dina Petrişor, G. Damian, S. Simon, Gamma-irradiated ExtraVit M nutritive
supplement studied by EPR spectroscopy , submis la Radiation Physics and Chemistry,
2007
451
Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin
– partea a II- a
3000 3100 3200 3300 3400 3500 3600 3700

m agnetic field
Cuprins
1. Introducere ..........................................................................................................................452
2. Aplicaţii ale spectroscopiei de rezonanţă electronică de spin (RES) ....................................453
3. Exemple de aplicaţii ale rezonanţei electronice de spin ........................................................454
4. Bibliografie: .........................................................................................................................465
1. Introducere
Spectroscopia de rezonanţă electronică de spin (RES) este una dintre ce-
le mai eficiente metode, non-distructive si non-invazive, folosită pentru
caracterizarea ordinii locale şi a interacţiunilor magnetice în materiale or-
ganice si anorganice. Spectrele RES înregistrate de asemenea în cazul: sis-
temelor necristaline, monocristalelor, pulberilor policristaline, soluţiilor
congelate sau în cazul soluţiilor lichide aduc contribuţii importante cercetă-
rilor din domeniul materialelor, fizicii, chimiei, biologiei, mineralogiei si
geologiei. Centrii paramagnetici, care pot fi investigaţi prin RPE sunt ionii
metalelor de tranziţie şi elemente ale pământurilor rare sau centrii asociaţi
cu sarcinile electrice sau cu defectele neutre.
Rezonanţa electronică de spin este o metodă larg utilizată în descrierea
stărilor fundamentale şi caracterizarea efectelor vecinătăţii asupra nivelelor
452
energetice ale centrilor paramagnetici. RES este o metodă sensibilă la pozi-
ţiile atomilor în structură şi permite studiul simetriei locale. Metoda constă
în studiul tranziţiilor dintre nivelele electronice ale atomilor în prezenţa
unui câmp magnetic extern [1,2].
Astfel, spectroscopia RES este capabilă să furnizeze detalii de structură
moleculară inaccesibile altor metode analitice. Aceasta se datorează faptu-
lui că momentul magnetic de spin al electronului neîmperecheat este foarte
sensibil la câmpurile magnetice locale din interiorul probei. Aceste câmpuri
de obicei provin de la momentele magnetice nucleare ale diferiţilor nuclei
care pot fi prezenţi în vecinătăţi.
2. Aplicaţii ale spectroscopiei de rezonanţă electronică de spin

(RES)
Spectroscopia RES are aplicaţii în cadrul cercetărilor din diferite dome-
nii cum sunt: fizică, biologie, chimie, studiul materialelor, medicină, mediu,
geologie, nanomateriale, nanoştiinţelor, aplicaţiile industriale etc.
Cu ajutorul rezonanţei paramagnetice electronice (RES) pot fi studiate:
a. În domeniul fizicii
• concentraţii de spin
• ioni paramagnetici ai metalelor de tranziţie, pământurilor ra-
re şi actinidelor
• defecte paramagnetice, centrii de culoare, deformări locale
• electroni de conducţie în conductori şi semiconductori
• interacţii magnetice şi cristaline
• procese de recombinare la temperaturi scăzute
b. În domeniul chimiei
• radicali liberi
• cataliza
• procese de oxidare si reducere
• stări de triplet a moleculelor
• compuşi organo-metalici şi zeoliţi
• cinetica de reacţie şi reacţii de polimerizare
c. În domeniul biologiei, medicinii şi mediului
• markeri de spin
• antioxidanţi şi agenţi de contrast
• oximetrie
• radicali liberi în ţesuturi, radicali ai oxigenului, NO în siste-
me biologice
• fotosinteza
453
• detecţie de droguri, metabolism şi toxicitate
• factori poluanţi
d. În domeniul aplicaţiilor industriale
• controlul calităţii produselor alimentare iradiate
• dozimetrie pentru procesele de iradiere
• vârste şi datări de materiale cu aplicaţii în arheologie, geologie
• detecţia radicalilor în polimeri iradiaţi şi procese de coroziune
• prospeţimea uleiurilor vegetale
• controlul calităţii sticlelor optice speciale
• procese oxidative în vopsele utilizate în industria auto
e. În domeniul caracterizării materialelor
• proprietăţi ale polimerilor
• defecte în fibre optice
• materiale laser
• conductori organici şi anorganici cu dimensionalitate redusă
• influenţa impurităţilor şi defectelor în semiconductori
• proprietăţi ale noilor materiale magnetice
• proprietăţi ale materialelor utilizate în spintronică, optoelec-
tronică
• manganiţi cu magnetorezistenţa colosală
• supraconductori oxidici cu temperatură de tranziţie ridicată
• semiconductori
f. În domeniul nanomaterialelor şi nanoştiinţelor
• efecte ale reducerii dimensionalităţii
• dinamica de spin în nanomateriale, nanocompozite
• efecte miez interior - strat superficial ale nanoparticulelor mag-
netice
• proprietăţi ale nanoparticulelor şi nanofirelor magnetice
• interacţii magnetice dipolare şi de schimb: efectele dimensiunii
• nanometrologie: dimensiune medie a nanoparticulelor metalice
şi magnetice
• caracterizare nanotuburi de carbon, fullerene şi compuşi derivaţi
• proprietăţi ale conducţiei electrice şi transportului polaronic
3. Exemple de aplicaţii ale rezonanţei electronice de spin

Spectrele RES au fost înregistrate pe pulberi la temperatura camerei cu
ajutorul unui spectrometru portabil RES “ADANI Portable EPR
Spectrometer PS8400”, care operează în banda X (9.1 GHz – 9.6 GHz) şi este
454
echipat cu un sistem de achiziţie a datelor, computerizat. Funcţionarea
spectrometrului se bazează pe înregistrarea într-un câmp magnetic static a
polarizării induse de o probă paramagnetică în câmp de microunde datori-
tă tranziţiilor cuantice între nivelele Zeeman ale centrilor paramagnetici.
Exemplul1. Fe3+
Spectrele RES înregistrate, pentru probele vitroase din sistemul
0.01Fe2O3·0.99[xSiO2·(100-x)Bi2O3], sunt reprezentate în figura 1. Sticlele şi
vitroceramicile studiate conţin ionul paramagnetic Fe3+ (3d5 6S5/2), acesta
fiind în stare S şi frecvent utilizat în investigaţiile RES ale sticlelor. Spectrul
conţine o linie principală de rezonanţă relativ largă cu gef ≅ 4.3 şi o linie
foarte slab rezolvată la gef ≅ 2.0. Linia de la gef ≅ 4.3 este specifică tuturor
sticlelor ce conţin ioni Fe3+ ca impuritate sau ca dopant în concentraţii mici
[5-8].
g = 4.3
x (mol %)
70
60
Intensitate (u.a.)
50
40
30
20
10
1000 2000 3000 4000 5000

Camp magnetic (G)
Figura. 1 Spectrele RES înregistrate pentru probele netratate termic
Caracteristicile spectrului RES pentru diferite rapoarte Bi2O3/SiO2 sunt

complet similare pentru toate probele netratate termic (Fig. 1) arătând că
vecinătatea ionilor Fe3+ nu depinde foarte mult de compoziţia matricilor
vitroase. Liniile de la gef=2.0 sunt atribuite ionilor paramagnetici izolaţi în
poziţii caracterizate de câmpuri cristaline relativ slabe, pentru care terme-
nul Zeeman este dominant , în timp ce liniile cu gef>2.0 sunt atribuite ioni-
lor paramagnetici aflaţi în poziţii caracterizate de câmp cristalin relativ pu-
ternic unde termenii de câmp cristalin sunt comparabili sau mai mari decât
termenii Zeeman [9, 12].
Dependenţa lărgimii acestor linii de la gef ≅ 4.3 de compoziţia probelor
este ilustrată în Fig. 2. Observăm că linia de rezonanţă de la gef=4.3 se în-
gustează pe măsură ce înlocuim Bi2O3 cu SiO2 (Fig. 2). Îngustarea liniei de
455
rezonanţa pentru x>20 indică o vecinătate a ionilor Fe3+ mai uniformă în
sticlele bogate în siliciu. Forma liniilor RES descrie şi dezordinea din jurul
ionilor de fier rezonanţi şi caracteristicile structurale ale matricilor vitroase
în care sunt încorporaţi aceşti ioni de fier.
Caracteristicile spectrelor RES pentru ionii Fe3+ în probele tratate termic
sunt evident modificate aşa cum se poate vedea în Fig. 3. Pentru un conţi-
nut scăzut de SiO2 (x ≤ 30) linia dominantă se găseşte la gef ≅ 2.0 în timp ce
linia mai puţin intensă se situează la gef ≅ 4.3.
230
220
210
200
ΔB (G)
190
180
170
160
10 20 30 40 50 60 70
x (mol%)
Figura. 2 Dependenţa lărgimii liniilor de rezonanţă de la gef ≅ 4.3 de compoziţia probelor
Pentru probele cu un conţinut mai ridicat de SiO2 (40 ≤ x ≤ 50) şi în ca-

zul cărora a fost identificată prin difracţia de raze X faza cristalină
Bi5.6Si0.5O9.4, semnalul de la gef ≅ 2.0 este slab evidenţiat iar linia dominantă
fiind cea de la gef ≅ 4.3. În cazul probelor cu conţinut ridicat de siliciu
(60 ≤ x ≤ 70) sunt prezente ambele linii, atât cea de la gef ≅ 2.0 cât şi cea de la
gef ≅ 4.3.
Lărgimea liniei de la gef ≅ 2.0, înregistrată pentru probele cu un conţi-
nut scăzut de SiO2, scade cu x aşa cum se observă în Fig. 4. În probele trata-
te termic, spectrele RES ale Fe3+ (Fig. 3) arată schimbările apărute în ordinea
locală în jurul ionilor de fier. Semnalul de la gef = 4.3 este înregistrat pentru
toate probele şi lărgimea liniei este de aproximativ 200 G pentru toate com-
poziţiile. Acest rezultat indică faptul că ordinea la scurtă distantă, din jurul
ionilor Fe3+ responsabili pentru acest semnal, este caracterizată de un câmp
cristalin relativ puternic şi poate fi asociat cu poziţiile fierului în reţeaua
necristalină bogată în siliciu.
456
g = 4.3 x (mol %)
70
60
50
Intensitate (u.a.)
40
g = 2.0
30
20
10
1000 2000 3000 4000 5000
Camp magnetic (G)
Figura. 3 Spectrele RES pentru probele vitroceramice
Linia cu gef = 2.0 este linie rezolvată numai pentru conţinut scăzut de
SiO2 , până la x = 30 şi este atribuit ionilor Fe3+ situaţi în poziţii cu câmp
cristalin slab cu simetrie octaedrală. Luând în considerare razele ionice pen-
tru ionii Bi3+ şi Fe3+ şi starea lor identică de valentă, este de aşteptat ca ionii
Fe3+ să ocupe poziţiile Bi3+ din faza cristalină Bi12SiO20. Remarcăm de ase-
menea că linia se îngustează cu creşterea conţinutului de SiO2 (Fig. 4) ceea
ce denotă tendinţa de ordonare structurală în jurul ionilor Fe3+ rezonanţi
dispuşi în aceste poziţii.
160
150
140
130
ΔB (G)
120
110
100
90
10 20 30
x (mol %)
Figura. 4 Dependenţa lărgimii liniei de la g ≅ 2.0 de compoziţia probelor
457
Linia de rezonanţă slab rezolvată atribuită ionilor de fier dispuşi în
câmp cristalin slab pentru probele vitroceramice cu 40 ≤ x ≤ 50 mol % arată
că doar o mică parte dintre ionii de Fe3+ sunt situaţi în poziţiile Bi3+ ale fa-
zei δ (Bi5.6Si0.5O9.4), vecinătatea lor fiind puternic distorsionată [3, 4, 10, 11].
Probabil că majoritatea ionilor Fe3+ să fie dispuşi în faza rămasă
necristalină bogată în Si [13, 14].
În probele în care se dezvoltă faza cristalină de tipul Bi2SiO5 ( x = 60, 70)
spectrele RES prezintă atât linia cu g ≅ 4.3 specifică ionilor de Fe3+ în poziţii
cu câmp cristalin intens din matrici necristaline, cât şi o linie largă la g ≅ 2.0
specifică ionilor din poziţii în câmp cristalin slab dar în vecinătate distorsi-
onată sau între care se manifestă interacţiuni dipolare [15].
Exemplul 2: Gd3+
a) Analizele de rezonanţă paramagnetică electronică au pus în evidenţă
compoziţii diferite ale ionilor de gadoliniu în probe cu conţinut mai mare
de bismut (Fig. 5). Astfel, dacă în probele cu x = 0 şi x = 0.14 spectrele RES
ale ionilor de Gd3+ sunt similare şi reflectă o vecinătate relaxată a acestora
în matricea amorfă, odată cu creşterea conţinutului de bismut, pe lângă
asemenea poziţii, gadoliniul ocupă poziţii in regiuni cvasicristaline în acord
cu modificarea difractogramelor acestor probe. După tratamentul termic la
400oC ionii de gadoliniu ocupă poziţii în interiorul fazei cristaline de tip
Bi5.6Si 0.5O9.4 (Fig. 6).
2.8
5.9 2.0 2.8 2.0

5.9
x=0
x=0
x = 0.14
x = 0.14
x = 0.33
x = 0.33
4.3
x = 0.5
x = 0.5
1000 2000 3000 4000 5000

B(G) 1000 2000 3000 4000 5000
B(G)
Figura 5 Spectrele RES ale probelor Figura 6 Spectrele RES ale probelor tratate termic
preparate prin metoda sol-gel 30 minute la 400oC
b) Gd3+, Ti3+, vacante de oxigen

Spectrele RES înregistrate în cazul microsferelor netratate termic sunt
dominate de o linie largă centrată la g ≈ 2.0 care reflectă o vecinătate relaxa-
tă în matricea amorfă, dar se observă şi linii mici la ≈ 5.9 şi2.8. Acestea indi-
că faptul că există poziţii în matricea amorfă unde ionii de Gd3+ se află în
458
câmp intermediar. Lărgimea liniei de la g ≈ 2.0 din spectrele RES, care re-
flectă în mod direct schimbările în rata de relaxare spin-reţea şi cel mai im-
portant în dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modifică în inter-
valul de temperatură investigat. Linia de la g ≈ 4.3 este atribuită fierului
(III) şi apare datorită tuburilor de sticlă în care se pune proba pentru a efec-
tua măsurătoarea RES.
Modificările structurale induse în probele titano-silicatice amorfe prin
tratamentele termice sunt bine puse în evidenţă în spectrele RES ale probe-
lor parţial şi total cristaline (Fig. 7-14). Linia largă de la g ≈ 2.0 din spectrele
probelor tratate termic la 350, 700 şi 900°C ne indică că ionii de Gd3+ sunt
preponderent dispuşi în faza reziduală necristalină, în câmp cristalin slab,
rezultat în urma relaxării structurale dar încă cu un grad mare de dezordi-
ne în jurul lor. Se observă şi spectrul în ‘‘U’’ cu linii la g ≈ 5.9, g ≈ 2.8, g ≈
2.0, specific matricelor policristaline dezordonate care conţin ioni de Gd3+
destul de omogen distribuiţi.
Spectrele RES pentru microsferele tratate termic în intervalul 350 –
1400°C sunt caracterizate printr-un semnal îngust, suprapus peste compo-
nenta spectrală, la g ∼ 2, care creşte în intensitate odată cu creşterea tempe-
raturii de tratament. În conformitate cu Kolodiazhnyi şi Petric am atribuit
aceste linii vacanţelor de oxigen la titan (VTi) cu spin electronic neîmpere-
cheat. Spectrele RES prezintă o uşoara asimetrie a liniei de rezonanţă (se
abat de la o funcţie pur Lorentziană) care poate fi explicată prin prezenţa
unei anizotropii uşoare şi/sau a unui fundal de rezonanţă relativ larg de o
foarte joasă amplitudine. Lărgimea liniei spectrelor RES, care reflectă în
mod direct schimbările în rata de relaxare spin-reţea şi cel mai important în
dinamica medie a anizotropiei factorului g, se modifică în intervalul de
temperatură investigat [16].
Prin aplicarea tratamentului termic, oxigenul difuzează din interior
spre suprafaţă şi se formează în regiunea de sub-suprafaţă vacante de oxi-
gen, în timp ce titaniul difuzează de la suprafaţă spre interior, unde se for-
mează ionii de Ti3+. În timp ce atomul de O difuzează el generează doi
atomi de titan cu configuraţie incomplete, legaţi anterior de atomul de oxi-
gen. Unul dintre aceşti atomi de Ti captează un electron şi rămâne în confi-
guraţia tetraedrală, iar celălalt atom de Ti se relaxează într-o configuraţie
planar trigonală.
459
2.8
2.0
4.3
5.9
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000 2000 3000 4000 5000 1000 2000 3000 4000 5000
B(G) B(G)
Figura 7 Spectrele RES ale microsferelor prepa- Figura 8 Spectrele RES ale microsferelor tratate
rate prin metoda sol gel. termic la 350°C, 30 minute.
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000 2000 3000 4000 5000 1000 2000 3000 4000 5000
B(G) B(G)
Figura 9 Spectrele RES ale microsferelor tratate Figura 10 Spectrele RES ale microsferelor trata-
termic la 700°C, 30 minute. te termic la 900°C, 30 minute.
(a) (b)
2.004
1.98
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
2.004
1.98
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000 2000 3000 4000 5000 3000 3200 3400 3600 3800
B(G) B(G)
Figura 11 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1100°C, 30 minute,

utilizând un baleiaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.
460
(a) (b)
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:2
Ti:Si 1:1
Ti:Si 1:1
1000 2000 3000 4000 5000 3000 3200 3400 3600 3800
B(G) B(G)
Figura 12 Spectrele RES ale microsferelor tratate termic la 1400°C, 30 minutes,

utilizand un balaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.
Spectrele RES ale probelor tratate termic la 1400°C sunt caracterizate

doar prin semnalul din jurul valorii g∼1.98, atribuit ionilor de Ti3+, neexis-
tând vacanţe de O din cauza atmosferei reducătoare. Centrii de Ti3+ sunt de
obicei detectaţi la temperaturi sub 120K [17,18], dar au mai fost detectaţi în
literatura de specialitate [19] la temperatura camerei.
(a) (b)
1400oC
o
1400 C 2.004
1100oC 1.98
o 1100oC
900 C
700oC
o
350 C
900oC
as-prep. 700oC
3000 3200 3400 3600 3800

1000 2000 3000 4000 5000
B(G)
B(G)
Figura 13 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:2 preparate prin metoda sol gel si supuse diferitelor
tratamente termice, utilizand un baleaj de (a) 4000 G si respectiv (b) 600 G.
(a) (b)
o
1400 C
o
1400 C
2.004
o 1.98
1100 C
o o
900 C 1100 C
o
700 C
o
o 900 C
350 C
o
700 C
as-prep.
1000 2000 3000 4000 5000 3000 3200 3400 3600 3800
B(G) B(G)
Figura 14 Spectrele RES ale sistemului Ti:Si 1:1 preparate prin metoda sol gel şi supuse diferitelor
tratamente termice, utilizând un baleiaj de (a) 4000 G şi respectiv (b) 600 G.
461
Din spectrele RES prezentate în Fig.13, 14 se observă faptul că trata-
mentul termic joacă un rol important în formarea de centrii paramagnetici
adiţionali, ambele sisteme având o dependenţă oarecum similară în raport
cu tratamentul termic.
În Figurile 13 si 14 sunt evidenţiate evoluţiile vacanţelor de oxigen (pen-
tru g∼2.004) si Ti3+ (pentru g∼1.98), în urma tratamentelor termice. În cazul
microsferelor preparate prin metoda sol gel, semnalul RES provine numai de
la ionii de Gd3+. În cazul microsferelor tratate termic la 350, 700, 900 si
1100°C, peak-ul de la g∼2.004 poate fi atribuit vacanţelor de oxigen, în bună
concordanţă cu literatura de specialitate şi rezultatele obţinute prin spectro-
scopie Raman unde a fost obţinut un semnal de fluorescenţă în cazul probe-
lor tratate termic până la temperatura de 900°C. Nakamura şi col. [20] au
raportat faptul că semnalul RES la g∼2.004 detectat pe plasma de TiO2 tratată
termic provine de la un electron captat la o vacanţă de oxigen. Serwicka [21]
a observat un astfel de semnal la g∼2.003 pe TiO2 redus în vid şi l-a atribuit
unui defect, cel mai probabil un electron captat la o vacanţă de oxigen. Sem-
nale similare au fost observate şi în TiO2 – anatase dopate cu C [22-24], cât si
în TiO2 dopat cu B [25]. Au mai fost raportate astfel de semnale RES de către
Li şi col. [22] la g∼2.0055 în spectrele RES în probe de titan dopat cu C, după
ce au fost folosite în teste fotocatalitice, cât şi de către Feng şi col. [26] în pro-
be de TiO2 dopat cu N, iar Serpone [27] a atribuit semnalele din intervalul
g = 2.003 – 2.005 unui electron captat la o vacanţă de oxigen.
Acest studiu este focusat în special pe efectul adiţiei oxidului de galiu
în sisteme, deoarece evoluţia defectelor: vacanţe de oxigen (g∼2.004) şi Ti3+
(g∼1.98) este similară cu cea discutată anterior. Pentru microsferele tratate
termic la 1100°C si 1400°C se observă efectul galiului în sensul prevenţiei
formării vacanţelor de oxigen. În cazul microsferelor cu conţinut de galiu se
dezvoltă după tratamentul termic la 1400°C o nouă faza, Ga2TiO5, în con-
cordanţă cu difracţiile de raze X. Spectrele RES evidenţiază integrarea ioni-
lor de Ti3+ în această fază. Vor fi prezentate doar spectrele RES ale sistemu-
lui Ti:Si 1:2, deoarece sistemul Ti:Si 1:1 nu prezintă modificări esenţiale.
Ga2O3 Ga2O3
20% 20%
10% 10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
1000 2000 3000 4000 5000

1000 2000 3000 4000 5000
B(G)
B(G)
Figura 15 Spectrele RES ale microsferelor prepa- Figura 16 Spectrele RES ale microsferelor tatate
rate prin metoda sol gel. termic la 350°C.
462
Ga2O3
Ga2O3 (a)
(b)
20%
20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
3000 3200 3400 3600 3800

1000 2000 3000 4000 5000 B(G)
B(G)
Figura 17 Spectrele RES ale microsferelor tatate termic la 700°C,

utilizand un baleaj de (a) 4000 G, (b) 600 G.
Ga2O3 (a) 20% (b)
20% 10%
10% 5%
5% 1%
1% 0%
0%
Ga2O3
3000 3200 3400 3600 3800
1000 2000 3000 4000 5000 B(G)
B(G)

Ga2O3 (a) Ga2O3 (b)
20% 20%
10%
10%
5%
5%
1%
1%
0%
0%
1000 2000 3000 4000 5000 3000 3200 3400 3600 3800
B(G) B(G)

463
Ga2O3 (a) Ga2O3 (b)
20% 20%
10%
10%
5%
5%
1% 1%
0%
0%
3000 3200 3400 3600 3800
1000 2000 3000 4000 5000
B(G) B(G)

c) Gd3+
Prin rezonanţa paramagnetică electronică a fost investigată ordinea
structurală din jurul ionilor de Gd3+ si interacţiunea magnetică dintre ei.
Prezenţa în probe a ionilor de Gd3+ ne dă informaţii cu privire la modificări-
le structurale care au loc în vecinătatea lor, în funcţie de compoziţia matricii
şi este utilă în caracterizarea locurilor în care s-ar putea distribuii alte pă-
mânturi rare neparamagnetice, introduse în aceeaşi matrice.
Spectrele RES ale probelor investigate sunt prezentate în figura 21.
Spectrele constau din linii relativ largi cu g = 2,0 fapt ce denotă că vecinăta-
tea ionilor de Gd3+ se confruntă cu câmpuri cristaline slabe, ceea ce înseam-
nă că aceştia nu sunt incluşi în reţeaua silicatică sau germanată unde au
avut o vecinătate mult mai distorsionată [28].
Această lărgire a liniei de rezonanţă este în mod normal atribuită inter-
acţiunii dipol-dipol dintre ionii de Gd3+, dar şi dezordinii locale [29-32].
Liniile largi preconizate pentru o concentraţie atât de scăzută (0,5% mol
Gd2O3), considerând că gadoliniu ar fi distribuit omogen în întregul volum
de probă, sprijină ipoteza distribuţiei sale pe suprafaţa nanoparticulelor.
În acest caz, distanţa medie dintre ionii de gadoliniu este mai mică de-
cât în cazul distribuţiei uniforme în întregul volum şi se confruntă cu inter-
acţiuni magnetice puternice.
Diferenţele observate în forma liniilor, în funcţie de compoziţia probe-
lor, arată că această distribuţie pe suprafaţa nanoparticulelor nu este uni-
formă, fiind mult mai grupată pentru probele cu raportul Si/Ge 1:2 şi 1:3,
unde efectul interacţiunii de schimb este clar evidenţiat [33].
464
Figura. 21. Spectrele RES ale probelor aparţinând sistemului 0.005Gd2O3·0.995[(1−x)SiO2·xGeO2]
4. Bibliografie:
1. I.Ursu, Rezonanţa electronică de spin, Ed. Academiei R.S.România, (1965)
2. Al. Nicula, Rezonanţa magnetică, Editura Didactică şi Pedagogică, Bucureşti, 61-64
(1980)
3. A. Witkowska, J. Rybicki, A. DiCicco, 6-thInternational Conference on Intermolecu-
lar Interactions în Matter, Gdańsk – Poland, 10-13 September 2001
4. T. Nanba, H. Tabuchi, Y. Miura, Proceedings of XX Int. Congress. Glass, Sept. 27-
Oct. 1, 2004, Tokyo, Japan, P-10-011
5. R.H. Sands, Phys. Rev., 99 (1955) 1222
6. R. Stößer, M. Notz, Glastechn. Ber. Glass Sci. Technol., 67 (1994) 156
7. S. Simon, R. Pop, V. Simon, M. Coldea, J. Non-Cryst. Solids, 331 (2003) 1
8. R. Berger, J. Kliava, E.M. Yahiaoui, J.-C. Bissey, P.K. Zinsou, P. Beziade, J.
Non-Cryst. Solids 180 (1995) 151
9. T. Castner, C.S. Newell, W.C. Holton, C.P. Schlichter, J. Chem. Phys., 32 (1960) 668d
10. Y. Wu, M.J. Forbess, S. Seraji, S.J. Limmer, T.P. Chou, C. Nguyen, G. Cao, J. Appl.
Phys, 90, 10 (2001) 5296
11. Pan, A. Ghosh, J. Chem. Phys., 112, 3 (2000) 1503
12. I. Ardelean, M. Peteanu, V. Simon, F. Ciorcas, V. Ioncu, Journal of Materials
Science Letters, Volume 20, Number 10, 2001, 947-949(3).
13. S. Simon, M. Todea, J. Non-Cryst. Solids, 352 (2006) 2947.
14. M. Todea, S. Simon, J. Optoelectronics and Advanced Materials, 9 (2007), 621-624.
15. M. Todea, V. Simon, S. Simon, J. Optoelectronics and Advanced Materials, Vol. 10,
No. 12 (2008), 3336 – 3340.
16. N. Guskos, E. A. Anagnostakis, G. Zolnierkiewicz, J. Typek, A. Biedunkiewicz, P.
Figiel, A. Guskos, K. A. Karkas, Rev. Adv. Mater. Sci. 23 (2010) 189-195.
17. O. I. Micic, Y. Zhang, K. R. Cromack, A. D. Trifunac, M. C. Thurnauer, J. Phys.
Chem. (1993), 97, 7277.
18. M. Anpo, M. Yabuta, S. Kodama, Y. Kubokawa, Bull. Chem. Soc. Japan 59 (1986) 259.
19. E. A .Konstantiniva, A. I. Kokorin, S. Sakthivel, H. Kisch, K. Lips, Chimia 12 (2007) 61.
20. I. Nakamura, N. Negishi, S. Kutsuna, T. Ihara, S. Sugihara, K. Takeuchi, J. Mol.
Catal. A: Chem. 161 (2000) 205–212.
21. E. Serwicka, Colloids Surf. 13 (1985) 287–293.
22. Y. Li, D.S. Hwang, N.H. Lee, S.J. Kim, Chem. Phys. Lett. 404 (2005) 25–29.
465
23. V. Gombac, L. D. Rogatis, A. Gasparotto, G. Vicario, T. Montini, D. Barreca, G.
Balducci, P. Fornasiero, E. Tondello, M. Graziani, Chem. Phys. 339 (2007) 111–123.
24. E. A. R. Garcia, Y. Sun, K. R. R. Gil, D. Raftery, Solid State Nucl. Mag. Reson. 35
(2009) 74–81.
25. M. Fittipaldi, V. Gombac, T. Montini, P. Fornasiero, M. Graziani, Inorg. Chim. Acta
361 (2008) 3980–3987.
26. C. Feng, Y. Wang, Z. Jin, J. Zhang, S. Zhang, Z. Wu, Z. Zhang, New J. Chem. 32
(2008) 1038–1046.
27. V. N. Kuznetsov, N. Serpone, J. Phys. Chem. C 113 (2009) 15110–15123.
28. S. Simon, J. Optoelectr. Adv. Mater. 8 (2006) 99–101.
29. J. Kliava, I.S. Edelman, A.M. Potseluyko, E.A. Petrakovskaja, R. Berger, I.
Bruckental, Y. Yeshurun, A.V. Malakhovskii, T.V. Zarubina, J. Phys.: Condens.
Matter 15 (2003) 6671–6681.
30. J. Kliava, A. Malakhovskii, I. Edelman, A. Potseluyko, E. Petrakovskaja, S.
Melnikova, T. Zarubina, G. Petrovskii, Y. Bruckental, Y. Yeshurun, Phys. Rev. B 71
(2005) 104406.
31. J. Kliava, I. Edelman, A. Potseluyko, E. Petrakovskaja, R. Berger, I. Bruckental, Y.
Yeshurun, A. Malakhovskii, T. Zarubina, J. Magn. Magn. Mater. 272–276 (2004)
1647–1649.
32. S. Simon, I. Ardelean, S. Filip, I. Bratu, I. Cosma, Solid State Commun. 116 (2000)
83–86.
33. Diana-Louisa Trandafir, R.V.F. Turcu, S. Simon, Materials Science and Engineering
B 172 (2010) 68–71
466
XIII. METODE ELECTROCHIMICE
Elaborarea, testarea şi verificarea protocoalelor de practi-

că experimentală pentru echipamente de investigare prin
metode electrochimice
Cuprins
1. Introducere .......................................................................................................................... 467

2. Voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV) ................................................................. 467
3. Voltametria ciclică (sau CV) ............................................................................................... 471
4. Voltametria ciclică fără cuplu redox activ........................................................................... 474
5. Voltametria ciclică cu un cuplu redox activ........................................................................ 474
6. Bibliografie .......................................................................................................................... 488
1. Introducere
Metodele electrochimice moderne oferă chimistului electroanalist o va-
rietate de tehnici pentru a rezolva problemele analitice. Una dintre aceste
metode este voltametria, în care curnetul este măsurat ca o funcţie de po-
tenţialul aplicat şi este utilizată la studiul cineticii reacţiei de transfer de
electroni şi proprietăţile de transport ale reacţiilor.
În principal, există două tipuri de metode voltametrice:
* voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV);
* voltametrie ciclică (CV).
2.Voltametrie cu baleiaj liniar de potenţial (LSV)

În voltametria cu baleiaj liniar de potenţial (LSV), potenţialul este bale-
iat într-un domeniu fix de potenţial cu o viteză constantă, de obicei, de la o
limită inferioară la o limită superioară a potenţialului, aşa cum se arată in
figura 1.
467
Figura 1. Forma semnalului de excitare în Figura 2. Voltamograma cu baleiaj liniar
voltametria cu baleiaj liniar de potenţial. de potenţial.
Viteza de scanare (v) se calculează din panta dreptei din figura 1. În

mod clar prin schimbarea timpului necesar pentru a baleia domeniul de
potenţial se modifică viteza de baleiaj (scanare).
Caracteristicile voltamogramei înregistrate (figura 2) depind de o serie
de factori, cum ar fi:
* viteza reacţiei de transfer de electroni;
* reactivitatea chimică a speciilor electroactive;
* viteza de baleiaj a potenţialului.
Exemplu: Rezultatul măsurătorilor de LSV este rRESezentarea grafică a

curentului obţinut versus potenţialul baleiat cu o viteză constantă. Pentru
sistemul Fe3+/Fe2+, unda aparută se datorează reacţiei 1.
(1)
Presupunem că scanarea începe din partea stângă a graficului cu-
rent/potenţial, unde iniţial nu este curent. Când potenţialul este baleiat
spre dreapta (spre valori de reducere), începe să apară un curent care, even-
tual, poate atinge şi un maxim înainte să scadă. Pentru a înţelege acest
comportament, trebuie să se ia în considerare influenţa potenţialului asu-
pra echilibrului stabilit la suprafaţa electrodului. Dacă avem în vedere re-
ducerea electrochimica a Fe3+ la Fe2+, viteza reacţiei de transfer de electroni
este mai rapidă în comparaţie cu viteza de baleiaj a potenţialului. Prin ur-
mare, la suprafaţa electrodului se stabileşte un echilibru identic cu cel pre-
zis de termodinamică. În echilibrul electrochimic, ecuaţia lui Nernst este
cea care prezice relaţia dintre concentraţie şi potenţial (diferenţă de potenţi-
al), unde E este diferenţa de potenţial aplicat şi Eo este potenţial standard
de electrod, conform ecuaţiei 2:
468
(2)
Deci, când potenţialul este baleiat de la valoarea V1 la V2, poziţia de

echilibru se modifică de la nici o conversie (la V1) la conversia completă (la
V2) a reactantului la suprafaţa electrodului. Forma exactă a voltamogramei
poate fi înţeleasă prin luarea în considerare şi a efectelor potenţialului şi
transportului în masă. Când potenţialul este baleiat de la valoarea iniţiala
V1, echilibrul la suprafaţa electrodului începe să se modifice şi, ca urmare,
apare un curent, conform ecuaţiilor 3:
(3)
Aşa cum curentul creşte cu potentialul, poziţia de echilibru se depla-

sează continuu în sensul conversiei reactantului. Peak-ul (vârful, maximul)
apare deoarece la un moment dat stratul de difuzie a crescut suficient încât
fluxul de reactant la electrod nu este suficient de rapid pentru a satisface
cerinţele impuse de ecuaţia lui Nernst. În această situaţie curentul începe să
scadă. De fapt, scăderea curentului urmează acelaşi comportament ca şi cel
estimat prin ecuaţia Cottrell.
În cazul în care se modifică viteza de baleiaj, alura voltamogramei se
modifică şi ea (Figura 3).
Figura 3. Influenţa
vitezei de baleiaj
asupra
voltamogramelor cu
baleiaj liniar de po-
tenţial.
Fiecare curbă are aceeaşi formă, dar este evident că curentul creşte cu
creşterea vitezei de baleiaj, datorită dimensiunilor stratului de difuzie şi a
469
timpului necesar pentru a înregistra voltamograma. În mod clar,
voltamograma se va obţine mai încet, cu cât viteza de baleiaj este mai mică.
Prin urmare, grosimea stratului de difuzie de la suprafaţa electrodului va fi
diferită în funcţie de viteza de baleiaj folosită. La o viteză de baleiaj mică,
stratul de difuzie va creşte mai mult în comparaţie cu cazul în care viteza
de scanare este mare. În consecinţă, fluxul de la suprafaţa electrodului este
considerabil mai mic la viteze de baleiaj mici, faţă de cele de la viteze de
baleiaj mari. Cum mărimea curentului este proporţională cu fluxul spre
electrod, valoarea curentului va fi mai mică la valori mici ale vitezei de ba-
leiaj.
Acest lucru evidenţiază un punct important atunci când se examinează
LSV (şi CV): deşi nu există o axă a timpului pe grafic, viteza de balaiaj a
potenţialului (şi, prin urmare, timpul necesar pentru a înregistra o
voltamogramă) influenţează puternic comportamentele observate. O altă
observaţie este poziţia curentului de peak: este clar că peak-ul apare la ace-
eaşi valoare de potenţial (figura 3) şi aceasta este o caracteristică a reacţiilor
de electrod, care au o cinetică rapidă de transfer de electroni. Aceste proce-
se rapide sunt adesea menţionate ca reacţii reversibile de transfer de elec-
troni.
În consecinţă, se poate formula întrebarea referitoare la ce s-ar întâmpla
în cazul în care procesele de transfer de electroni au fost "lente" (în raport
cu viteza de baleiaj a potenţialului). Pentru aceste cazuri, reacţiile sunt
menţionate ca reacţii cvasi-reversibile sau ireversibile de transfer de elec-
troni. Figura 4 arată o serie de voltamograme înregistrate la o singură vite-
ză de baleiaj pentru diferite valori ale constantei vitezei reacţiei de reducere
(kred).
Figura 4. Voltamograma cu baleiaj

liniar de potential, pentru diferite
constante ale vitezei reactiei de
reducere. Conditii experimentale:
viteza de baleiaj identica.
În aceast caz, potenţialul aplicat nu va duce la generarea concentraţiilor

la suprafaţa electrodului conform estimărilor din ecuaţia Nernst, deoarece
470
cinetica de reacţie este "lentă" şi, astfel, echilibrele nu sunt stabilite rapid (în
comparaţie cu viteza de baleiaj). În această situaţie, forma generală a
voltamogramei înregistrate este similară cu cea de mai sus, dar spre deose-
bire de reacţia reversibilă, poziţia curentului de peak/maxim se schimbă în
funcţie de constanta vitezei de reducere (şi, de asemenea, de viteza de bale-
iaj a potenţialului). Acesta are loc deoarece curentul apare mai încet decât
în cazurile reversibile.
3.Voltametria ciclică (sau CV)

Este metoda electrochimică potenţiodinamică foarte similară cu LSV.
Într-un experiment de voltametrie ciclică, potenţialul electrodului de lucru
este baleiat liniar în funcţie de timp, ca şi în cazul voltametriei liniare. Spre
deosebire de voltametria cu baleiaj linear, care se încheie atunci când se
ajunge la un potenţial stabilit (V2), în cazul CV, deşi potenţialul este baleiat
tot între două valori (V1 şi V2), când potenţialul atinge V2 sensul de baleiaj
este inversat, iar potenţialul este baleiat înapoi la V1. Această inversare se
poate produce de mai multe ori în timpul unui singur experiment.
Voltamograma ciclică obţinută este rRESezentarea grafică a curentul obţi-
nut la electrodul de lucru (i) faţă de potenţialul aplicat (E). Voltametria ci-
clică este folosită, în general, pentru a studia proprietăţile electrochimice ale
unui analit într-o soluţie.
În voltametrie ciclică, potenţialul de electrod este baleiat liniar faţă de
timp (figura 5), panta dreptei fiind cunoscută ca viteza de baleiaj (v [V/s]).
Potenţialul este măsurat între electrodul de referinţă şi electrodul de lucru,
iar curentul este măsurat între electrodul de lucru şi electrodul auxiliar.
După cum se observă în voltamograma din figura 6, în scanarea în sens
direct se obţine un curent de peak pentru orice specie care poate fi oxidată
în domeniul de potenţial baleiat. Curentul va creşte pe măsură ce potenţia-
lul atinge potenţialul de oxidare a analitului, dar apoi va scădea deoarece
concentraţia analitului se va epuiza în vecinătatea suprafeţei electrodului.
În cazul în care cuplul redox este reversibil, atunci când potenţialul aplicat
este invers, se va ajunge la potenţialul la care se va reduce produsul format
în prima reacţie de oxidare şi se va produce un curent de polaritate inversă
faţă de scanarea directă. De obicei, peak-ul de reducere va avea o formă
similară cu peak-ul de oxidare.
Ca urmare, din astfel de experimente se obţin informaţii despre poten-
ţialul redox şi despre vitezele reacţiilor electrochimice.
Dacă transferul de electroni la suprafaţă este rapid şi curentul este limi-
tat de difuzia speciilor spre suprafaţa electrodului, atunci curentul de peak
471
(vârf) va fi proporţional cu rădăcina pătrată a vitezei de scanare. Această
relaţie este descrisă de ecuaţia Cottrell.
Figura 5. Semnalul de excitare în cazul Figura 6. Voltamograma ciclică pentru un

voltametriei ciclice. rectant participând la o reacţie monoelectronică
de transfer de electroni.
O voltamogramă ciclică tipică, înregistrată pentru o reacţie reversibilă

monoelectronică, este prezentată în figura 6. Răspunsul la baleiajul în sens
direct este identic cu cel de la LSV. Când sensul de baleiaj este inversat,
poziţia echilibrului se modifică în sens invers, convertind produsul (Fe2+)
înapoi la reactant (Fe3+). Curentul apare din nou datorită speciilor din solu-
ţie care difuzează spre electrod şi are sens invers decât procesul din prima
etapă.
Reacţia de electrod şi capacitatea electrodului

Figura 7 descrie procesul care are loc în reacţii de electrod simple. În
cazul reducerii, specia (Ox) capabilă de a primi un electron de la electrod
difuzează spre suprafaţă, primeşte un electron şi difuzează de la suprafaţă.
Curentul de la suprafaţă este generat prin transferul de electroni de la elec-
trod la speciile redox. În soluţie, curentul este transportat prin migraţia
ionilor. Se pune întrebarea dacă un curent poate apărea dacă nu există nici
o specie în soluţia care poate transfera electroni la suprafaţă electrodului, la
potenţialul de interes? Răspunsul este că un curent tranzitoriu poate circula
deoarece interfaţa electrod-soluţie se va comporta ca un condensator. Când
potenţialul electrodului este variat, ionii se mişcă spre suprafaţa electrodu-
lui pentru a forma un strat dublu electric, aşa cum se arată în figura 8.
O interfaţă electrod-soluţie, în absenţa unui cuplu redox nu este un
condensator cu plăci paralele pur, ci se comportă mai degrabă ca şi cum ar
fi, iar pentru descrierea sistemelor electrochimice se preferă acest model
472
care permite să se înţeleagă comportamentul electrozilor în absenţa unui
cuplu redox.
Figura 7. Sistem electrochimic care Figura 8. Schema stratului dublu electric.

include transferul de electroni şi circuitul
echivalent corespunzător.
Astfel, pentru un condensator cu plăci paralele, sarcina condensatoru-

lui (Q) este proporţională cu căderea de tensiune în condensator (E):
Q=CE (4)
Constanta de proporţionalitate C este capacitatea mediului. Cea mai sim-
plă descriere a capacităţii electrochimice este dată de modelul Helmholtz:
C εε 0 (5)
=
A
unde: ε este constantă dielectrică a materialului de separare a plăcilor; εo
este permitivitatea spaţiului liber, ℓ este distanţa de separare între plăcile
paralele, iar A este aria de electrod.
Acest model nu descrie în mod adecvat toate interfeţele electrochimice
dacă capacitatea depinde atât de potenţial, cât şi de electrolitul suport.
Capacitatea este un factor esenţial în experimentele electrochimice pen-
tru că dă naştere la un curent în timpul de încărcare al condensatorului.
Destul de logic (şi fără imaginaţie), numim această mărime curent de încăr-
care. Pentru a calcula mărimea acestui curent, se diferenţiază ecuaţia (1) în
raport cu t şi presupune că capacitatea este o mărime constantă:
dQ dE
=C (6)
dt dt
473
Identificând dQ/dt ca o expresie a curentului şi dE/dt cu viteza de baleiaj
a potenţialului (v), se obţine:
I = C*v (7)
Prin această derivare simplă, se obţine o expresie pentru curentul de
încărcare în stare staţionară, atunci când se aplică o treaptă de potenţial.
Astfel, prin măsurarea curentului de încărcare la o anumită viteză de sca-
nare, se poate determina capacitatea sistemului. Dacă nu există nici o posi-
bilitate de transfer de electroni între soluţie şi electrod (nu există un cuplu
redox), atunci acest curent este singurul care va fi observat.
4. Voltametria ciclică fără cuplu redox activ

Dacă se consideră cazul foarte simplu al voltametriei ciclice, în care nu
este prezent nici un cuplu redox activ (experimentul prezentat în figura 9),
şi se aplică semnalul de excitare a potenţialului având forma din figura 9a,
voltamograma obţinută are forma din figura 9b. Rezultatul excitării siste-
mului este o creştere bruscă a curentului din cauza schimbării bruşte a vi-
tezei de scanare (ν). Curentul atinge o stare de echilibru, care se menţine
atât cât se menţine variaţia de potenţial. La inversarea vitezei de scanare,
curentul îşi schimbă semnul, iar când se opreşte scanarea, curentul revine
la zero.
Figura 9. Experiment de
voltametrie ciclică, în
absenţa speciei redox
active.
5. Voltametria ciclică cu un cuplu redox activ

Deşi curenţii capacitivi în voltametrie ciclică sunt o realitate, puterea
reală a acestei tehnici constă în capacitatea sa de a investiga mecanismul
reacţiei de electrod. De obicei, se vor folosi condiţii în care curentul capaci-
tiv este mic în comparaţie cu curentul de transfer de electroni (denumit
curent faradaic). Curentul faradaic depinde de doi factori: cinetica transfe-
rului de electroni şi viteza la care specia redox difuzează spre suprafaţa
electrodului.
474
Pentru cuplul redox Fe(CN)63-/4-, care participă la reacţia 8 a cărei cine-
tică de transfer de electroni este destul de rapidă, aşa că se presupune că la
suprafeţele electrodului, concentraţiile de Fe(CN)63- şi Fe(CN)64- respectă
ecuaţia lui Nernst 9:
Fe (CN)6 3- + 1 e- → Fe(CN)6 4- ; εo’ = 0.356 V vs. ENH (8)
[Fe(CN)64 − ]
E = E o' − 0.0592 log (9)
[Fe(CN)36− ]
unde: E este potenţialul aplicat şi E0’ este potenţialul formal de electrod.
Se poate observa că, deoarece potenţialul aplicat devine mai negativ,

concentraţia de Fe(CN)63- trebuie să scadă la suprafaţa electrodului, prin
reacţia de reducere la Fe(CN)64-. Chiar şi în cazul asumării comportamentu-
lui nernstian, rRESoducerea fidelă a voltamogramei cuplului Fe(CN)63-/4-
(figura 6) necesită o soluţie analitică la două ecuaţii diferenţiale. (Detalii cu
privire la simulări în voltametria ciclică pot fi găsite în Anal. Chem, 1964,
36, 706 şi Anal. Chem., 1965, 37, 1351).
Interpretări calitative. Dacă presupunem că concentraţiile de la supra-

faţa electrodului sunt reglementate prin ecuaţia lui Nernst, concentraţia de
specii oxidate la suprafaţă va scădea odată cu negativarea potenţialului.
Presupunând că viteza de transfer de electroni este foarte rapidă, curentul i
care este măsurat când potenţialul scade va fi direct proporţional cu fluxul
speciilor oxidate care difuzează spre suprafaţa electrodului, conform ecua-
ţiei 10:
i=nFAJ (10)
Fluxul este guvernat de legea lui Fick:
⎛ dC ⎞ (C * −C x = 0 ) (11)
J = −D ⎜ ⎟ ≅D
⎝ dx ⎠ x = 0 Δx
unde: D este coeficientul de difuzie a speciilor; x este distanţa de la suprafa-

ţa electrodului; (dC/dx)x=0 este gradientul de concentraţie la suprafaţa elec-
trodului, C* este concentraţia de specie oxidată în volumul soluţiei, şi Cx=0
este concentraţia sa la suprafaţa electrodului.
După cum se observă din ecuaţia 11, cu cât este mai mare gradientul de
concentraţie, cu atât este mai mare fluxul J şi, prin urmare, conform ecuaţiei
10, cu atât este mai mare curentul catodic.
475
Schimbarea gradientului de concentraţie pentru regiunea catodică din
voltamograma ciclică este prezentată în figura 10. Înainte ca un potenţial să
fie aplicat la electrod (t = 0), nu există nici un gradient de concentraţie, iar
soluţia are concentraţia uniformă din faza de volum C*. În momentul în
care se aplică un potenţial, concentraţia speciei oxidate se epuizează la su-
prafaţă. Această concentraţie mai mică la suprafaţă dă un gradient de con-
centraţie mai mare (cel puţin iniţial), astfel încât în conformitate cu legea de
difuzie a lui Fick (ec. 11), fluxul spre suprafaţă şi, prin urmare, curentul
catodic vor fi mai mari. Dacă se va continua negativarea potenţialului, con-
centraţia speciilor oxidate la suprafaţa electrodului va tinde spre zero.
În acelaşi timp, faza de volum a soluţiei care este epuizată în specia
oxidată va creşte şi gradientul de concentraţie va începe să scadă. Cu cât
scade gradientul de concentraţie, cu atât va scădea fluxul spre suprafaţa
electrodului şi curentul va începe să scadă. Toate acestea vor duce la obţi-
nerea unei curbe curent-potenţial care are forma din figura 11.
Figura 10. Profilul de concentraţie la diferite Figura 11. Alura voltamogramei ciclice pentru o
momente de timp, în cadrul experimentului reacţie electrochimică nernstiană. Parametrii electro-
de CV (numai baleiaj negativ). chimici caracteristici.
Dacă se inversează potenţialul de scanare (nu este arătat în figura 10),

încă mai există un strat epuizat de specie oxidată, dar concentraţia de su-
prafaţă începând să crească, curentul va scădea în continuare. În cele din
urmă, vom ajunge la o regiune unde curentul anodic începe să domine (fi-
gura 11). Apoi sistemul va trece prin intermediul profilelor de concentraţie
similare pentru speciile reduse. Se va obţine un curent de peak negativ şi
apoi curentul va scădea în amplitudine, cu cât epuizarea stratului de specie
redusă va creşte.
476
Caracterizarea
Aceasta a fost o descriere foarte calitativă a voltametriei ciclice. În 1964,
Nicholson şi Shain au efectuat simulări cantitative ale voltametriei care au
dus la schimbări majore în domeniul electrochimiei. Parametrii importanţi
pentru o voltamogramă ciclică sunt potenţialele de vârf (Ep ) şi curenţii de
vârf (ip), care se cuantifică conform figurii 11.
Proces redox reversibil

Utilitatea voltametriei ciclice este foarte dependentă de analitul studiat.
Analitul trebuie să fie o specie redox în domeniul de potenţial experimen-
tat. De asemenea, este foarte de dorit ca analitul să prezinte peak-uri rever-
sibile. Dacă un sistem redox rămâne în echilibru pe întreg domneiul de
potenţial scanat, procesul redox este numit reversibil (echilibru impune ca
concentraţiile de suprafaţă de Ox şi Red să fie menţinute la valorile prezise
prin ecuaţia Nernst). Un peak reversibil se obţine atunci când un analit este
redus sau este oxidat pe un sens al baleiajului de potenţial şi apoi este
reoxidat sau redus pe sensul invers al baleiajului, conform reacţiei 12:
Ox + e- → Red (12)
Toate voltamogramele reversibile arată la fel şi au forma tipică indicată
în figura 11. Simulările cantitative arată mai multe aspecte pentru un sistem
nernstian. Curentul de peak într-o voltamogramă ciclică care conţine o sin-
gură specie este descrisă de ecuaţia Randles-Sevcik (ec. 13), la 25 °C:
ip = (2.687 *105) n3/2 A D1/2 v1/2 C* (13)
unde: ip este curentul de peak (în A); n este numărul de electroni transfe-
raţi; A este aria electrodului (în cm2), D este coeficientul de difuzie (în cm2
s-1); v este viteza de baleiaj (în V/s) şi C* este concentraţia în faza de volum
a speciei (în mol/cm3).
Chiar şi cuplurile reversibile conţin suprapotenţiale de polarizare şi ast-
fel prezintă o histereză între potenţialul absolut de reducere (Epc) şi de oxi-
dare (Epa). Acest suprapotenţial reiese dintr-o combinaţie a vitezelor de
difuzie a analitului şi bariera intrinsecă de activare a transferului de elec-
troni de la electrod la analit. O descriere teoretică a suprapotenţialului de
polarizare este inclusă în ecuaţia Butler-Volmer şi ecuaţia Cottrell.
Următorii parametrii sunt folosiţi pentru a caracteriza voltamograma
ciclică a unui proces reversibil:
a. Separarea potenţialului de peak ΔEp (= Epc - Epa) = 59/n [mV], la toate
vitezele de scanare, la 25 oC. Este foarte dificil pentru a atinge o sepa-
477
rare a peak-urilor în valoare de 59/n [mV], pe majoritatea electrozi-
lor solizi. (Se consideră o valoare mulţumitoare aceea de 70 mV.
Aceasta este o funcţie de pregătire a electrozilor, precum şi de viteză
de scanare).
b. Diferenţa între potentialul de peak (Ep) şi potentialul la care curentul
este jumătate decât la Ep, (Ep/2), este de 56.5/n [mV] la 25 °C, unde: n
este numărul de electroni transferaţi.
c. Poziţia potenţialului de peak nu se modifică cu viteza de scanare.
d. Raportul curenţilor de peak este unitar (ipa/ipc = 1) la toate vitezele de
scanare. Acest raport poate fi perturbat pentru cuplurile reversibile
în prezenţa unei reacţii chimice, în experimentele de stripare sau în
prezenţa unui fenomen de nucleaţie.
e. Curenţii de peak (ip) sunt proporţionali cu rădăcina pătrată a vitezei
de scanare (v), iar conform ecuaţiei 13, funcţia ip/v1/2 este indepen-
dentă de v. Influenţa vitezei de scanare asupra curentului pentru un
transfer de electroni reversibil, ilustrat în figura 12, poate fi explicată
ca şi în cazul LSV, ca funcţie de grosimea stratului de difuzie.
f. În cazul în care valorile constantelor de difuzie pentru speciile oxidate
şi reduse sunt similare, valoarea Eo’ poate fi estimată ca media arit-
metică a valorilor potenţialelor de peak anodic şi catodic (Eo’ = (Epa +
Epc )/2).
g. Atunci când se obţin peak-uri reversibile, se pot determina informaţii
termodinamice, cum ar fi: potenţialul de semi-undă (E01/2).
Figura 12. Influenţa vitezei de baleiaj asupra Figura 13. Voltamograma pentru o reacţie
voltamogramelor ciclice ale unui cuplu redox cvasi-reversibilă pentru diferite valori ale con-
monoelectronic reversibil. stantelor vitezelor de reducere şi de oxidare.
Procese redox cvasi-reversibile

Pentru sistemele cvasi-reversibile (cu 10-1> k °> 10-5 cm/s), curentul es-
te controlat atât de transferul de încărcare, cât şi de transportul de masă.
478
Forma voltamogramei ciclice este funcţie de raportului k°/(πνnFD/RT)1/2.
Pe măsură ce acest raport creşte, procesul se apropie de cazul reversibil. De
asemenea, pentru valori mici ale acestuia, sistemul va prezenta un compor-
tament ireversibil. În general, voltamogramele unui sistem cvasi-reversibil
sunt mai extinse şi prezintă o separare mai mare, potenţial de peak în com-
paraţie cu un sistem reversibil.
Deviaţiile de la comportamentul reversibil sunt identificate prin variaţii
de la parametrii expuşi anterior (a-g). Există două cazuri de comportament
ireversibil descrise mai jos.
Sistemele nernstiane de transfer de electroni la electrod complete sunt
greu de găsit în practică şi moleculele redox-active sunt adesea destul de
lente. Comportamentul unui electrod se poate apropia de cel al un sistem
nernstian prin încetinirea vitezei de scanare. Cu cât curentul este mai mic,
viteza de transfer de electroni are o şansă mai mare de a fi mai rapidă,
comparativ cu difuzia. Cu toate acestea, dacă electrozii nu sunt curăţati
(sau sunt acoperiţi cu monostraturi), sistemele devin mai lente şi sunt apte
să prezinte control cinetic. În aceste cazuri se observă că separarea de peak
este o funcţie de viteză constantă a transferului de electroni, care scade
când cuplurile redox nu sunt în măsură să ajungă la suprafaţa electrodului.
Când se efectuează o voltamogramă ciclică pe un electrod modificat cu un
monostrat auto-asamblat, se poate demonstra rolul esenţial pe care îl joacă
curăţenia electrodului prin compararea voltamogramelor obţinute cu elec-
trodul curat şi modificat.
1) Cinetica transferului de electroni lent

Aşa cum s-a menţionat anterior, reversibilitatea impune ca cinetica de
transfer de electroni să fie suficient de rapidă pentru a menţine concentra-
ţiile de suprafaţă ale Ox şi Red, la valorile cerute de ecuaţia lui Nernst. Prin
urmare, reversibilitatea depinde de valorile relative ale constantelor de vi-
teză a transferului de electroni eterogen (ks) şi viteza de schimbare a poten-
ţialului (viteza de scanare, v). Dacă raportul ks/v este suficient de mic încât
concentraţiile nernstiene nu pot fi menţinute, atunci procesul se spune că
este cvasi-reversibil. Un proces cvasi-reversibil se caracterizează prin:
A) Separarea potenţialelor de peak are o valoare care depaşeşte 58/n
mV şi care creşte cu creşterea v (ΔEp > 58/n mV). Atâta timp cât re-
versibilitatea depinde de valoarea raportului ks/v, este posibil ca în
scopul de a schimba un proces cvasi-reversibil într-unul reversibil să
se micşoreze viteza de baleiaj v (ceea ce permite ca într-un timp mai
îndelungat concentraţiile superficiale să se ajusteze la noile valori ce-
479
rute de schimbările de potenţial). În plus, ΔEp depinde de valoarea
ks/v şi, prin urmare, ks poate fi calculată din variaţiile Ep cu v.
B) Din păcate, creşterea ΔEp cu creşterea v poate fi, de asemenea, cauzată
de rezistenţa necompensată a soluţiei (Ru). Efectul Ru poate fi minimi-
zat printr-un design experimental atent, prin compensare electronică
cu feedback pozitiv şi prin manipularea ulterioară a datelor. Cele două
efecte pot fi distinse prin varierea concentraţiei de analit (scăderea po-
tenţialului datorită rezistenţei necompensate a soluţiei şi astfel, valoa-
rea ΔEp rezultată creşte cu creşterea curentului, în timp ce valoarea ks
este independentă de concentraţia de analit).
C) Atunci când peak-urile sunt semi-reversibile, adică raportul ipa/ipc
este diferit (mai mare sau mai mic) de 1, este posibil să se determine
mai multe informaţii, în special despre procesul cinetic care urmea-
ză după cel electrochimic.
În figura 13, prima curbă prezintă cazul în care constantele de viteză
ale proceselor, atât de oxidare, cât şi de reducere sunt încă rapide, cu toate
acestea, când constantele de viteză sunt reduse, potenţialele de peak se de-
plasează spre valori mai pozitive/negative. Din nou, acest lucru poate fi
înţeles în termeni de echilibru la suprafaţă care nu este stabilit atât de ra-
pid. În aceste cazuri, separarea potenţialelor de peak nu mai este fixă, dar
variază în funcţie de viteza de scanare. În mod similar cu cazul de reversi-
bilitate, curentul de peak variază în funcţie de rădăcina pătrată a ratei de
scanare. Prin analizarea variaţiei potenţialului de peak, în funcţie de viteza
de scanare este posibil să se obţină o estimare pentru constantele vitezelor
de transfer de electroni.
2) Reacţiile chimice ale Ox şi Red

Valorile de echilibrul pentru Ox şi Red pot fi menţinute în timpul unui ex-
periment de voltametrie ciclică, dacă ambele specii Ox şi Red sunt stabile în
timpul experimentului. De exemplu, în cazul în care reducerea de la Red la Ox
este urmată de conversia lui Red la P, atunci mai mult Red trebuie generat
pentru a compensa pierderea de Red. Prin urmare, viteza de reducere creşte şi
potenţialul de peak (Epc) se deplasează spre o valoare mai pozitivă. În plus,
raportul ipa/ipc este mai mic decât unitatea (din moment ce doar o parte din
moleculele care au fost reduse prin baleiajul direct sunt disponibile pentru
reoxidation prin baleiajul invers). Valoarea curentului poate fi, de asemenea,
afectată de reacţii chimice care urmează după transferul de electroni.
Efectul unei reacţii chimice depinde de valoarea raportului k/v (unde k
este constanta de viteză a reacţiei chimice). Dacă această valoare este mare,
480
atunci reacţia chimică are un efect semnificativ, în timp ce un efect mai re-
dus apare în cazul în care acest raport este mai mic. Prin urmare, este posi-
bil să se elimine efectul reacţiei chimice (deci să se restabilească reversibili-
tatea), prin cresterea v. Valoarea lui k poate fi calculată fie prin studii de
simulare, fie prin investigarea efectului vitezei de baleiaj asupra raportului
ipa/ipc.
Deşi voltametria ciclică este foarte utilizată pe scară largă pentru carac-
terizarea speciilor redox (de exemplu: potenţiale redox şi stabilitatea diferi-
telor stări de oxidare) şi de investigare calitativă a reacţiilor chimice care
însoţesc transferul de electroni, există o serie de dezavantaje inerente în
cadrul acestui procedeu:
a. Efectele transferului eterogen de electroni lent şi reacţiile chimice nu pot
fi separate. Dacă ambele efecte sunt prezente, atunci constantele de vi-
teză pentru aceste procese nu pot fi calculate folosind metode de simu-
lare.
b. Există un curent rezidual de încărcare în timpul experimentului, expri-
mat prin vCdl (unde: Cdl este capacitatea la interfaţa electrodului de lu-
cru). Acest fapt restrânge limita de detecţie la aproximativ 10-5 M. În
plus, raportul dintre curentul de peak faradaic şi curentul de încărcare
scade cu creşterea v (în timp ip este proporţional cu v1/2), plasând o li-
mită superioară a lui v decât poate fi utilizată.
În ciuda acestor limitări, voltametria ciclică este foarte potrivită pentru
o gamă largă de aplicaţii. Într-adevăr, în unele domenii de cercetare,
voltametria ciclică este una din tehnicile standard utilizate pentru caracte-
rizare.
Procese redox ireversibile (control de transfer de sarcină)

În cazul transferului de electroni ne-reversibil, există diferenţe conside-
rabile în ceea ce priveşte parametrii voltamogramei. Când peak-urile sunt
ne-reversibile este imposibil să se determine parametrul E01/2. Acesta poate
fi însă determinat, cu toate acestea el necesită adesea existenţa de cantităţi
egale de analit, în ambele stări de oxidare. Când un peak este ne-reversibil,
voltameteria ciclică nu poate determina dacă peak-ul este la potenţialul său
termodinamic sau s-a deplasat la un potenţial mai extrem, datorită unui
suprapotenţial. Cuplul redox ar putea fi ireversibil din cauza unui proces
chimic care urmează, un exemplu comun pentru metale tranziţionale este o
schimbare în geometria sferei de coordonare. Dacă este acesta cazul, atunci
viteze mari de scanare pot arăta peak-uri reversibile. De asemenea, este
posibil ca peak-ul să fie ireversibil din cauza unui proces fizic, cel mai frec-
481
vent, o formă de precipitare. Unele speculaţii pot fi făcute în ceea ce priveş-
te peak-urile ireversibile, cu toate acestea, ele sunt în general în afara do-
meniului de aplicare al voltametriei ciclice.
Condiţii experimentale
Metoda utilizează o combinaţie de trei electrozi: electrodul de lucru, un
electrod de referinţă şi un contraelectrod (figura 14). De obicei, electrolitul
este adăugat la soluţia de testat pentru a asigura o conductivitate suficientă.
Combinaţia dintre solvent, electrolit şi electrodul de lucru specific determi-
nă intervalul de potenţial baleiat.
Figura 14. Celula electrochimică pentru experimentul de voltametrie liniară sau ciclică.
În timpul voltametriei ciclice, electrozii sunt statici şi aşezaţi în soluţii

negitate. Această metodă cu soluţie staţionară are ca şi consecinţă apariţia
caracteristicilor de peak controlate de difuzie. Această metodă permite, de
asemenea, ca o parte din analit să rămână, după reducere sau oxidare, aco-
lo unde poate afişa în continuare activitate redox. Agitarea soluţiei între
trasarea voltamogramelor este importantă pentru ca să furnizeze suprafaţei
electrodului analit proaspăt în fiecare nou experiment. Solubilitatea unui
analit se poate schimba drastic dacă se schimbă sarcina totală a acestuia.
Deoarece voltametria ciclică modifică, de obicei, sarcina analitului, este
uzual pentru analitul redus sau oxidat să precipite pe electrod. Această
stratificare a analitului poate izola suprafaţa electrodului, evidenţiind pro-
pria activitate redox în scanările ulterioare sau, cel puţin, poate modifica
482
suprafaţa electrodului. Din acestea sau alte motive, adesea este necesară
curăţarea electrozilor între scanări.
Materialele uzuale pentru electrozii de lucru sunt: cărbunele sticlos,
platina şi aurul. Aceşti electrozi sunt, în general, încastraţi într-un material
izolator inert, având doar un disc expus la unul dintre capete. Un electrod
de lucru obişnuit are o rază de un ordin de mărime de câţiva mm. Pentru
interpretarea rezultatelor de voltametrie ciclică este important ca electrodul
să posede o arie a suprafaţei controlată cu o formă definită.
Pentru a executa experimente de voltametrie ciclică la viteze de scanare
mari este insuficient un electrod de lucru obişnuit. Vitezele mari de scanare
creează peak-uri având intensităţi mari de curent, care au ca rezultat creşte-
rea rezistenţei, ceea ce duce la denaturarea formei voltamogramei. Pentru a
minimiza curentul şi rezistenţa, pot fi folosiţi ultramicroelectrozi.
Contraelectrodul cunoscut, de asemenea, sub numele de electrod auxi-
liar, poate fi orice material care conduce cu uşurinţă şi nu va reacţiona cu
volumul soluţiei. Reacţiile care apar la suprafaţa contraelectrodului sunt
lipsite de importanţă, atâta timp cât este asigurată o conducţie bună a cu-
rentului. Pentru a menţine curentul observat la contraelectrod, se vor oxida
sau reduce adesea electrolitul sau solventul.
Electrozii de referinţă uzuali sunt cei de calomel sau de Ag/AgCl sa-
turaţi cu KCl, uneori separaţi de soluţia testată prin capilare Luggin care să
împiedice infestarea electrolitului cu KCl.
Remarci
Voltametrie ciclică nu este o tehnică hidrodinamică. Într-o tehnică hidro-
dinamică, fluxul spre suprafaţa electrodului este realizat prin agitare, pompare
a soluţiei sau rotaţia electrodului, cum este în cazul electrozilor disc-rotitor şi
disc-inel-rotitor. Aceste tehnici ţintesc condiţiile de stare de echilibru, care apar
oricum indiferent dacă baleiajul se face dinspre valori pozitive sau negative,
ceea ce le limitează la voltametria cu baleiaj liniar de potenţial.
Exemplu
Se realizează o soluţie de hexacianoferat de potasiu 0.5 mM K3Fe(CN)6
prin dizolvarea cantităţii corespunzătoare de sare în 100 ml de KCl 1 M.
Utilizând voltametria ciclică să sa investigheze comportamentul cuplu-
lui redox Fe(CN)63-/4- şi să se determine parametrii electrochimici: Eo’, ΔEp,
ipa/ipc, precum şi D.
Celula electrochimică conţine 10 ml soluţie de analit şi este echipată cu
3 electrozi: electrod de lucru din grafit, contraelectrodul de platină şi elec-
trodul de referinţă Ag/AgCl/KClsat.
483
Procesele de electrod sunt:
reducere: [FeII(CN)6]3- + e- → [FeIII(CN)6]4- (13)
oxidare: [FeII(CN)6]4- → [FeIII(CN)6]3- + e- (14)
Aparatura folosită este un potenţiostat Autolab PGStat 10 (EcoChimie,
Olanda) pilotat de computer (figura 15).
Figura 15. Potenţiostat Autolab PGStat 10.
La rularea softului GPES se deschid 3 ferestre (figura 16). În fereastra «Edit

Procedure» se fixează parametrii experimentului: potenţialul de start, potenţia-
lul de întoarcere, numărul de cicluri şi viteza de baleiaj. Eventual, se fixează şi
parametrii pretratamentului (depinde de sistemul studiat). În fereastra «Ma-
nual Control» se bifează toată gama de curenţi pentru ca rRESezentarea grafică
on-line să se autoscaleze. În fereastra «Data presentation» va apărea
voltamograma on-line, după ce s-a dat comanda “Start”.
Figura 16. Softul GPES pentru pilotarea potenţiostatului.
484
Pentru sistemul studiat, se obţin voltamogramele din figura 17, la dife-
rite viteze de baleiaj. Din panta rRESezentării log I vs log v (figura 18) se
stabileşte puterea lui v şi astfel se verifică posibilitatea de a utiliza ecuaţia
Randles-Sencik pentru calculul coeficientului de difuzie.
0.00075
20 mV/s
50 mV/s anodic
0.00050 70 mV/s catodic
100 mV/s 1E-3
200 mV/s
0.00025
0.00000
log I
I/A
-0.00025
1E-4
-0.00050
-0.00075
0.0 0.2 0.4 0.6 10
E/ V vs. Ag/AgCl, KClsat log v
Figura 17. Voltamograma ciclică pe CV/NP Figura 18. Dependenţa log I vs. Log v pentru
(0.0188:1)-Nafion în 5 mM K3[Fe(CN)6] + 1 M electrodul CV/NP (0.0188:1)-Nafion în 5 mM
KCl. Condiţii experimentale: electrolit, tampon K3[Fe(CN)6] + 1 M KCl. Condiţii experimenta-
fosfat 0.1 M, pH = 6.8; 2 cicluri; potenţial de start, le: electrolit, tampon fosfat 0.1 M, pH = 6.8; 2
-0.1 V/ Ag/AgCl, KClsat. cicluri; potenţial de start, -0.1 V/ Ag/AgCl,
KClsat.
Tabelul 1. Parametrii electrochimici ai sistemului studiat în figura 17.

v (mV/s) Epa (V) Epc (V) Ipa (A) Ipc (A) Eo’ (V) ΔEp (V) ipa/ipc
50 0.303 0.253 1.023e-4 -1.255e-4 0.278 0.050 0.815
100 0.303 0.253 2.254e-4 -2.753e-4 0.278 0.050 0.818
Din datele prezentate în tabelul 1, se observă ca mărimile ΔEp şi ipa/ipc

au valori care plasează sistemul studiat în cazul sistemelor
monoelectronice, reversibile (conform Anexei 1).
Cronoamperometrie
Cronoamperometria este o tehnică electrochimică în care potenţialul
electrodului de lucru este variat după un semnal tip treaptă, curentul fara-
dic rezultat la electrod este monitorizat ca funcţie de timp. Ca şi toate teh-
nicile cu puls de potenţial, cronoamperometria generează un curent mare,
care scade exponenţial cu timpul, ca orice circuit RC. Curentul obţinut (fi-
gura 19) are două componente: un curent datorat încărcării stratului dublu
(figura 20) şi altul datorat transferului de electroni.
485
Figura 19. Cronoamperograma Figura 20. Profilul curentului stratului dublu
electric
Considerând o situaţie în care un electrod solid este cufundat într-o so-

luţie care conţine forma oxidată (Ox) a unui cuplu redox la concentraţie
iniţială cunoscută (C0), de ex.: 1 mM. Iniţial, electrodul este fixat la un po-
tenţial (Ei) mult mai pozitiv decat ale E0’ a cuplului Red/Ox, asigurându-ne
că doar Ox este prezent în soluţie. Soluţia conţine, de asemenea, un exces
de electrolit inert, şi se lucrează în acele condiţii experimentale care să asi-
gure că fluxul spre electrod să fie strict controlat de difuzie. La un moment
t0, potenţialul este modificat după un semnal de tip treaptă până la o valoa-
re semnificativ mai negativă decât E0’ pentru cuplu redox (Es), iar forma Ox
din vecinătatea electrodului este imediat transformată (după o cinetică re-
versibilă) la forma Red.
Ca urmare a transformării, concentraţia de Ox din vecinătatea electrodului
este redusă la zero faţă de concentraţia iniţială, în faza de volum de 1 mM.
Aceasta duce la formarea unui gradient de concentraţie pentru Ox, prin care
Ox din cea mai mare parte a soluţiei trebuie să difuze la suprafaţa electrodului,
unde este imediat redusă la Red. Cu cât electrodul rămâne mai mult la acest
potenţial de reducere, cu atât stratul de difuzie sărăcit în Ox, se extinde. Un
gradient similar, dar în sens opus există pentru Red, care după formarea sa
este liber să difuzeze departe de suprafaţa electrodului, în faza de volum, pe
măsură ce trece timpul. Această situaţie este prezentată în Figura 21.
Aşa cum s-a discutat anterior, curentul faradaic în condiţii controlate
de difuzie este direct legat cu gradientul de concentraţie, ∂Ci/∂x, evaluate
la x = 0. Astfel, cum panta profilului de concentrare pentru Ox scade cu
timpul în urma excitării sub formă de treaptă de potenţial, acelaşi lucru se
va observa şi în cazul curentului.
486
Figura 21. Semnalul
de excitare in
cronoamperometrie si
evolutia profilului de
concentratie la
suprafata electodului.
În exemplul de mai sus, concentraţia de Ox la suprafaţă a atins imediat

valoarea zero pentru o treaptă de potenţial mult mai negativă decât E0’ a
cuplului redox. În general, pentru un sistem reversibil (de reducere), rapor-
tul [Red] la [Ox] la suprafaţa electodului este dat de ecuaţia lui Nernst la
orice potenţial, cu raportul 100:1 ajungând la o valoare de 118 mV mai ne-
gativă decât E0’. Informaţii suplimentare cu privire la formarea de gradien-
ţilor de concentrare, pot fi găsite la
(http://www.chem.uoa.gr/applets/AppletDiffus/Appl_Diffus2.html).
Pe lângă cel mai frecvent experiment de cronoamperometrie, adică cel
cu o singură treaptă de potenţial, în care numai curentul rezultat este înre-
gistrat, există şi cele cu treaptă dublă de potenţial, în care potenţialul revi-
ne la o valoare finală (Ef) după ce este menţinut o perioadă de timp τ, la
potenţialul Es. Ecuaţia cea mai utilă în cronoamperometria este ecuaţia
Cottrell, care descrie curentul observat (electrodul planar) în orice moment,
în urma unui trepte de potenţial într-o reacţie redox reversibilă (sau la
suprapotenţial mare) în funcţie de t-1/2.
i = n F A Co Do1/2 π-1/2 t-1/2 [A] (15)
unde n = numărul de electroni implicaţi în reactie; F = constanta Faraday
2
(96,485 C/echivalent), A = aria electrodului (cm ), C0 = concentraţia speciei
3
electroactiv (mol/cm ), si D0 = constanta de difuzie pentru specia
2
electroactiv (cm /s).
Curentul datorat încărcării stratului dublu, contribuie la curentul total
observat după aplicarea unei treapte de potenţial. Prin natura lui acest cu-
rent capacitiv, ic, scade ca funcţie de 1/t si are valori semnificative numai în
perioada iniţială (de câteva ms) imediat după aplicarea semnalului treaptă.
Acesta poate fi uşor înregistrat prin efectuarea experimentului într-o celulă
care conţine doar electrolit. De obicei, această influenţă poate fi evitată nu-
mai luând în considerare datele i-t în ultimele 90% din timp.
487
Cronoamperometria cu pas dublu de potenţial este ilustrată în figura
22. În partea stângă a figurii este arătat felul cum se aplică treapta de poten-
ţial de la Ei la Es, unde este menţinut un timp τ, pentru ca apoi să revină la
Ef = Ei. În general, curentul din perioada de întoarcere este înregistrat tot
pentru un inte rval de timp τ.
Figura 22. Semnalul de excitare şi răspunsul în cronoamperometria cu treaptă dublă

.
Cum era de aşteptat din ecuaţia Cottrell, curentul observat pentru pri-
ma treaptă scade cu t-1/2. În acest exemplu, transferul de electroni este re-
versibil atât chimic, cât şi electrochimic. Curentul apărut la treapta de în-
toarcere este conceptual mai dificil de explicat decât cel de la prima treaptă.
Pentru cei interesaţi detaliile se află în Bard şi Faulkner. Un sistem simplu,
reversibil poate fi identificat prin compararea valorile curentului direct şi
invers măsurat în acelaşi interval de timp, după fiecare treaptă de potenţial.
De exemplu, valorile curentului măsurat la un moment egal cu τ/2, după
fiecare treaptă (notat ir şi if în figura 22) pentru un astfel de sistem ar duce
la o valoare egală cu 0.293 pentru raportul dintre [-ir (2τ)/if (τ).Prezenţa
unei reacţii chimice după etapa de transfer de electroni va duce la un raport
diferit de această valoare teoretică.
Cronoamperometria se pretează bine la măsurarea exactă a ariei elec-
trodului (A) prin utilizarea unui cuplu redox bine-definit (cu n, Co si Do
cunoscute]. Cu o suprafaţă de electrod cunoscută, sunt uşor de realizat mă-
surători, fie de n, fie de D0 pentru o specie electroactivă. Metoda dublei
trepte de potenţial este deseori aplicată în măsuratori de constante de vite-
ză pentru reacţii chimice (inclusiv produşi de adsorbţie) care apar în urma
primei trepte de potenţial.
6.Bibliografie
1. Bard A. J. , Faulkner L. R., Electrochemical Methods: Fundamentals and
Applications, John Wiley and Sons Publishers, New York, 2001.
2. Brett C. M. A., Brett Oliveira A. M., Electrochemistry: Principles, Methods and
Applications, Oxford University Press, USA, 1993.
488
3. Bartlett P.N. (Editor) Bioelectrochemistry: Fundamentals, Experimental Techniques
and Applications, John Wiley & Sons, Ltd, 2008.(ISBN 978-0470843642)
4. Compton R. G., Banks C. E, Understanding voltammetry, World Scientific, Singa-
pore, 2007. 371 + XII p., ISBN 981-270-625-9
5. V. Mirčeski, Š. Komorsky-Lovrić, M. Lovrić: Square-Wave Voltammetry. Theory
and Application. In: Monographs in Electrochemistry (F. Scholz, edt) Sprin-
ger-Verlag, Berlin., 2007, ISBN 978-3-540-73739-1,
6. Nicholson R. S., Shain I., Anal. Chem., 1964, 36, 706.
9. Nicholson R .S., Anal. Chem., 1965, 37, 667.
10. Nicholson R. S., Anal. Chem., 1965, 37, 1351
(https://twiki.ogt.co.uk/twiki/pub/People/ElectrochemistryPapers/TheoryandApplicationofC
yclicVoltammetryforMeasurementofElectrodeReactionKinetics.pdf)
Anexa 1.
Criterii de identificare pentru voltametria ciclică cu specia redox în soluţie
ip = (2.687 *105) n3/2 AD1/2 v1/2C* [A]; se calculează D
⎛ RT ⎞ 28.5 [mV]
E p - E1/2 = - 1.109⎜ ⎟=−
⎝ nF ⎠ n
Sisteme reversibile
⎛ RT ⎞ 28.5 [mV]
E p/2 = E1/2 + 1.09⎜ ⎟ = E1 / 2 +
⎝ nF ⎠ n
ΔEp (= Epc - Epa) = 59/n
ipa/ipc = 1
Sisteme 1/2
⎛ nF ⎞
cvasi-reversibile i p = nFAC* D1/2
Ox ⎜ RT ⎟ Ψ(E) v1/2
⎝ ⎠
⎛ RT ⎞
Ep/2 - Ep = (Λ , α )⎜ ⎟
⎝ nF ⎠
⎛ ⎞
⎜ ⎟
⎜ ko ⎟
Λ=⎜ 1/2 ⎟
⎜ ⎡D1−α Dα nF ⎤
v ⎥ ⎟⎟
⎜ ⎢ Ox Red RT
⎝⎣ ⎦ ⎠
⎛ ⎛ D ⎞α/2 ⎞
⎜ ⎜ ox ⎟ k ⎟
⎜ ⎜D ⎟ s ⎟ , se calculează ks
Ψ = ⎜ ⎝ Re d ⎠ ⎟v −1 / 2
⎜ ⎡ nF 1/2
⎤ ⎟
⎜⎜ ⎢π Dox ⎥ ⎟
⎝⎣
RT ⎦ ⎟⎠
Sisteme ireversibile, ip = (2.99 *105) n(αna)1/2 A D1/2 v1/2 C* [A], se calculeaza D
na = număr de
RT ⎛⎜ ⎞ , se calculeaza ko
⎛ D1/2 ⎞ 1/2
⎛ αn F ⎞
electroni transferaţi în E p = E o' - 0.78 + ln ⎜ Ox ⎟ + ln ⎜ a ⎟ + lnv1/2 ⎟
αn a F ⎜ ⎜ o ⎟ ⎝ RT ⎠ ⎟
etapa determinată de ⎝ ⎝ k ⎠ ⎠
viteză 47.7 [mV], se calculeaza αna
E p - E p/2 =
αn a
[Pentru identificarea notaţiilor şi detalii vezi: Nicholson, Anal. Chem. 1965, 37(11), 1351]
489
Electrochimia unei substanţe cu potenţial biologic activ.
Studiu de caz
Cuprins
1. Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de platină pentru estimarea coeficientului
de difuzie, prin experimente realizate în K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj. .....................490
2.Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă redox (pe bază de fier) în soluţie .........493
2.1. Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei in soluţie (G//Fe(III)P) pe elec-
trod de grafit.................................................................................................................494
2.2. Influenţa pHului asupra comportării sistemului G//Fe(III)P pe electrod de grafit ......495
3. Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă redox (pe bază de fier)
imobilizată în polimeri ........................................................................................................497
3.1. Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei adsorbită
(G/SWCNT–Fe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit .....................................................498
3.2. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru sistemul
G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion ........................................................................................499
3.3. Studiul integrităţii filmului de Fe(III)P pentru sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion
prin calculul ariei suprafeţei active ..............................................................................501
3.4. Influenţa pH-ului asupra comportării sistemului adsorbit (G/SWCNT–
Fe(III)P-Nafion) pe electrod de grafit ...........................................................................502
3.5. Estimarea stabilităţii sistemului G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion la funcţionare continuă .....504
4. Concluzii .............................................................................................................................505
5. Bibliografie ..........................................................................................................................506
6. Anexă ..................................................................................................................................507
1. Exemplu de utilizare a voltametriei ciclice pe electrod de

platină pentru estimarea coeficientului de difuzie, prin expe-
rimente realizate în K3[Fe(CN)6] la diferite viteze de baleiaj.
a. Se trasează voltamogramele ciclice la diferite viteze de baleiaj pe
electrodul de platină în soluţia de 5 mM K3[Fe(CN)6] care conţine 0.1
M KCl ca şi fond electrolitic pentru îmbunătăţirea conducţiei (Figura
1A). Comportamentul redox al acestei substanţe considerată stan-
dard este descris de ecuaţia 1:
-3 - -4
Fe(CN)6 + e → Fe(CN)6 (1)
şi se manifestă prin apariţia unei perechi de picuri bine conturate
(poziţionate la Ea = 0.354 V, Ec = 0.245 V, Ipa = 0,155 mA si Ipc = 0.157
mA) având parametrii electrochimici (ΔE = 0.109 V, Eo’ = 0.300 V si
Ipa/Ipc = 0.987, pentru o viteză de baleiaj de 50 mV/s.
490
(A) (B)
800 anodic
5 m V /s
catodic
1 0 m V /s
600 2 5 m V /s
5 0 m V /s
7 5 m V /s
400
1 0 0 m V /s
2 5 0 m V /s
I/A
200 5 0 0 m V /s
I / μA
7 5 0 m V /s
9 0 0 m V /s 1E-4
0
-2 0 0
10 100 1000
-4 0 0
-1
v / (mV *s )
-6 0 0
-0 .2 0 .0 0 .2 0 .4 0 .6
E / V vs. ESC
(C)
500
Figura 1. (A) Voltamograma ciclica a 5 mM
/ μA
400
K3[Fe(CN)6]+ 0.1 M KCl pe electrod de platina. (B) 300
anodic
Dependenta log I vs. log v pentru voltamogramele 200
I 100
din fig 1A. 0
(C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului de

/ μA
-1 0 0
peak I pentru voltamogramele din fig 1A.

catodic
-2 0 0
-3 0 0
I
-4 0 0
Condiţii experimentale: potenţial iniţial, –0.2 V
vs. ESC. 0 ,0 0 ,2 0 ,4
1 /2
0 ,6
1/2
0 ,8 1 ,0
v / (V /s )
b. Intensitatea curentului de peak (Ip) depinde de viteza de baleiaj (v) în

conformitate cu ecuaţia Randles-Sevcic (ecuatia 2) pentru un sistem
reversibil sub control difuziv [Bard A. J., 1980]:
Ip = 2.69*105 n3/2 A D01/2 v1/2 Co* (2)
unde: Ip = curentul de peak (A), n = numărul de electroni, A = aria
electrodului (cm2), D0 = coeficientul de difuzie (cm2/s), v = viteza de
baleiaj (V/s) ; C0* = concentraţia soluţiei în fază de volum (mol/cm3).
Astfel, cu ajutorul curenţilor de peak anodic şi catodic (Ipa, Ipc), se tra-

sează dependenta log I vs. log v (figura 1B). Ecuaţiile regresiei liniare
sunt prezentate în tabelul 1. Panta acestor regresii ne dă indicii des-
pre tipul de transfer de sarcină difuziv (specia în soluţie, panta în jur
de 0.5, dependenţa I vs. v1/2, conform ecuaţiei Randles Sevcik) sau
transfer de sarcină eterogen (specia adsorbită, panta în jur de 1).
Analiza datelor prezentate în tabelul 1 indică că specia redox studia-
tă, K3[Fe(CN)6], se află în soluţie, iar intensitatea curentului, I, respec-
491
tă dependenţa Randles-Sevcik faţă de v1/2.
Tabelul 1. Regresii liniare pentru dependenţele log I v.s log v şi respectiv,

I vs. v.
anodic log Ia = (-4.518 ± 0.011) + (0.415 ± 0.007) log v R = 0.9994, n=6
Ia /A= (2,132 e-5 ± 4.220e-6) + (5.817e-4 ± R = 0.9976, n = 6
2.008e-5)v1/2 /V/s
catodic log Ic = (-4.552 ± 0.013) + (0.438 ± 0.009) log v R =0.9992, n=6
Ic /A= (-1,648e-5 ± 3.90e-6) – (6.131e-4 ± R = 0.9982 n = 6
1.858e-5) v1/2 /V/s
c. Având stabilită dependenţă log I vs. log v se poate trasa dependenţa

I vs. v1/2 (figura 1C) şi estima panta regresiei liniare, pentru a putea
utiliza ecuaţia Randles Sevcik la calculul coeficientului de difuzie, D.
Valorile parametrilor regresiei liniare I vs. v1/2 sunt prezentate în ta-
belul 1. Atentie, pentru a putea utiliza corect rezultatele, în rRESezentarea
I vs. v1/2, valorile curentului trebuie să fie în amperi (A) şi ale vitezei de ba-
leiaj (v) în (V/s).
d. Se înlocuiesc în ecuaţia Randles Sevcik (ecuaţia 2) parametrii cunos-
cuţi. Astfel:
n = numărul de electroni este 1 în conformitate cu reacţia 1;
A = aria electrodului (cm2) este (πd2)/4, unde d= diametrul electro-
dului, adică d = 0.7 cm,
C0* = concentraţia soluţiei de K3[Fe(CN)6] în fază de volum
(mol/cm3), adică 5 mM = 5 10-6 mol/cm3.
Astfel, ecuaţia 2 devine:
Ip = 2.69*105 (1)3/2 [π (0.7)2]/4 D01/2 5 10-6 v1/2 analoaga unei ecuaţii li-
niare y = a x, unde a este panta. Prin urmare panta regresiei liniare
este:
a = 2.69*105 (1)3/2 [π (0.7)2]/4 D01/2 5 10-6 = 0.00517 102 D01/2
de unde:
D0 = a2/(0.00517 102)2
Adică: Do,a = (5.817 10-4)2/(0.00517 102)2 = 1.265 10-6 cm2/s si Do,c =
(6.131 10-4)2/(0.00517 102)2 = 1.41 10-6 cm2/s, iar Dmediu = 1.33 10-6
cm2/s.
Datele obţinute sunt în concordanţă cu cele din literatură care varia-
ză între: D = 6.5 10-6 cm2/s obţinut cu o soluţie 20 mM K3[Fe(CN)6]
[Hrapovic S., 2003] si D = 5.9 10-5 cm2/s obţinut cu o soluţie 5 mM
K3[Fe(CN)6] [Ye J.-S., 2004].
492
2.Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă
redox (pe bază de fier) în soluţie
Hemina (denumirea IUPAC: cloro[3, 7, 12, 17 – tetrametil - 8, 13 –
divinilporfirin - 2, 18 –dipropanoato (2−)]fier(III), denumirea comercială:
Panhematina) este o porfirină cu conţinut de fier (figura 2). Mai exact, este
protoporfirina IX care conţine un ion de fier
feric (Heme b) şi un ligand clorură. Este folosit
în gestionarea atacurilor de porfirie10, în special
în porfiria intermitentă acută11. Se distinge de
hematină12 care are o grupare hidroxid în loc de
clorură. Cu toate acestea, termenii sunt uneori
echivalenţi. Hematina este considerată "factorul
X" necesar pentru creşterea Haemophilus
Figura 2. Structura heminei. influenzae13.
Voltamogramele ciclice ale Fe(III)P în soluţie obţinute la diferite viteze

de baleiaj pe electrod de grafit arată o pereche de peak-uri bine definite
plasate la un potenţial formal standard (εo’)14 care se plasează între – 0.350
to - 0.500 V vs. Ag/AgCl, KClsat, în funcţie de pHul soluţiei. Peak-urile au
fost atribuite unui comportament reversibil monoelectronic al cuplului
redox Fe(III)/Fe(II) coordinat în inelul porfirinic (Figura 3A), în conformita-
te cu reacţia 3:
Fe(III)P + e- → Fe(II)P (3)
Din tabelul 2, care conţine parametrii electrochimici ai
10 Porfiria este o boală ereditară cauzată de o tulburare a sintezei hemului (fracţiunea neproteică
a hemoglobinei) şi caracterizată prin acumularea în ţesuturi a unor substanţe intermediare ale
acestei sinteze, porfirinele. Porfiriile sunt boli foarte rare.
11 Porfiria intermitentă acută se manifestă de cele mai multe ori la vârsta adultă prin dureri
abdominale acute, uneori prin crampe, printr-o slăbiciune musculară şi prin tulburări psihice.
Urinele devin roşii atunci când sunt lăsate să aştepte. Numeroase medicamente, ca barbituricele,
contraceptivele orale, sulfamidele si fenitoina, se află la originea acestor crize.
12 Hematină, hematine, (s.f.) pigment care provine din sânge şi conţine fier. – din fr. hématine
[Dicţionarul explicativ al limbii române, Academia Română, Institutul de Lingvistică „Iorgu

Iordan”, Editura Univers Enciclopedic, 1998].
13 Haemophilus influenzae sunt cocobacili Gram negativi, mici (1 - 1,5/0,3 μm), cu bacili scurţi,
drepţi, cu capete rotunjite, pleomorfic. Este non-motil, nu formează spori, facultativ anaerobe.
14 Potenţialul formal standard se calculează ca media aritmetică a potenţialelor de peak anodic şi
catodic.
493
voltamogramelor din figura 4A se observă că la viteze de baleiaj care depă-
şesc 300 mV*s-1, separarea peak-urilor (ΔEp) devine superioară valorii de
59/n mV, indicând transformarea procesului reversibil, într-unul
cvasi-reversibil.
2.1. Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei in

soluţie (G//Fe(III)P) pe electrod de grafit
Trasarea dependenţei log I vs. log v (figura 3B) a permis estimarea pante-
lor, care având valori în jur de 1 (tabelul 3), indiferent de pHul soluţiei, indică
faptul că specia studiată se adsoarbe pe electrod în timpul trasării
voltamogramelor. Ca urmare dependenţa liniară I-v (figura 3C) confirmă un
transfer de electroni heterogen, descris de o ecuaţie în care v este la puterea 1,
caracteristic speciilor adsorbite. Ca urmare, nu este posibil calculul coeficientu-
lui de difuzie D al speciei studiate din ecuaţia Randles-Sevcik (aşa cum s-a
descris în capitolul 1, pentru specia considerată standard, K3[Fe(CN)6].
(A) (B)
300
v = 10 m V*s
-1 anodic
v = 20 m V*s
-1
catodic
200 v = 100 m V*s
-1
-1
100
v = 300 m V*s
-1
v = 500 m V*s
100
-1
v = 1000 m V*s
-1
v = 1500 m V*s
I/μA
log I
10
-100
-200
1
-300
10 100 1000
-750 -500 -250 0
E / m V vs. Ag/AgC l, KC lsat log v
(C )
Figura 3. (A) Voltamogramele ciclice ale 0.5 mM
200
Fe(III)P pe electrod de grafit (sistem G//Fe(III)P).
/ μA
(B) Dependenta log I vs. log v pentru 100
voltamogramele din fig 3A.

an
(C) Influenta vitezei de baleiaj asupra curentului

I
de peak I pentru voltamogramele din fig 3A. -1 0 0

/μA
Condiţii experimentale: electrolit, TRIS 0.05

M, pH 8; potenţial initial, -0.85 V vs. -2 0 0
cat
I
Ag/AgCl, KClsat; soluţie dezaerată. -3 0 0
0 500 1000 1500

-1
v / m V *s
494
Tabelul 2. Valorile parametrilor electrochimici pentru sistemul G//Fe(III)P
investigat prin voltametrie ciclica pe electrod de grafit. Condiţii experimentale:
vezi figura 3.
v Epa Epc Ipa Ipc ΔE =Epa-Epc Eo’ Ipa/Ipc
mV/s mV vs ER mV vs ER μA μA mV vs ER
10 -420.0 -420.0 0,88 -5,86 0 420 0.15
20 -420.0 -440.0 2,51 -7,08 20.0 430 0.35
50 -420.0 -439.9 8,54 -13,29 19.9 429.95 0.64
70 -420.0 -439.9 12,34 -16,94 19.9 429.95 0.73
100 -415.1 -444.8 18,11 -23,76 29.7 429.95 0.76
200 -405.3 -454.6 35,88 -44,53 49.3 429.95 0.81
300 -405.5 -454.4 54,17 -67,86 48.9 429.95 0.80
500 -400.6 -464.3 86,10 -108,90 63.7 432.45 0.79
700 -391.7 -478.7 117,10 -146,70 87.0 435.2 0.80
1000 -370.2 -484.7 157,70 -200,50 114.5 427.45 0.79
1500 -361.0 -506.4 229,20 -286,30 145.4 433.7 0.80
Tabelul 3. Panta dependentei log Ip – log v pentru sistemul G//Fe(III)P. Condiţii

experimentale: vezi figura 3.
Panta
pH
proces anodic proces catodic
6.48 0.53091 ± 0.0217 0.91835 ± 0.0096
0.9925/11 0.9995/11
8 1.0784 ± 0.03639 0.82581 ± 0.0318
0,99492/11 0,99337/11
8.82 0.8765 ± 0.0245 1.09837± 0.0454
0.9965/11 0.9924/11
2.2. Influenţa pHului asupra comportării sistemului

G//Fe(III)P pe electrod de grafit
Reacţia generală de electrod:
ox + n e- + p H+ ↔ red (4)
este caracterizată de potenţialul Nernst descris de ecuaţia:
RT a ox a p +
0 H
E=E + ln (5)
nF a red
RT a
sau E = E 0' + ln ox (6)
nF a red
495
RT p
unde: E 0' = E 0 + p ln a H + sau E 0' = E 0 − 0.059 pH , la 25 °C (7)
nF n
Comportamentul electrochimic al heminei (Fe(III)P) în soluţie este in-
fluenţat de pHul soluţiei. Experimentele au fost efectuate în domeniul de
pH 6.5 - 10.5 în tampon 0.5 mM TRIS-HCl + 0.1 M KBr [Li M-Xl., 1997]. În
domeniul de pH studiat se observă o deplasare a voltamogramelor spre
valori de potenţial mai negative odată cu creşterea pHului soluţiei (figura
4A). Parametrii electrochimici ai voltamogramelor sunt sintetizaţi în tabelul
4. Pantele dependenţei potenţialului formal standard în funcţie de pH (fi-
gura 4B), indiferent de viteza de baleiaj, este în jur de de -47 mV*pH-1 (tabe-
lul 5). Această valoare este apropiată de valoarea teoretică de 56 mV*pH-1
(conform ecuaţiei 7) la 25 °C, indicând că 1 H+ este cuplat la transferul de
electroni ai heminei în timpul reacţiei de electrod [Yang J., 1999]. Peste pH
>8, panta dependenţei εo’ vs. pH reflectă formarea complexului
bis(hidroxo) al heminei:
(H2O)(OH)Fe(III)P ⇔ (OH)2Fe(III)P + H+ (8)
Astfel, dependenţa de pH se poate explica prin schimbările la ligandul
fierului sau prin rolul OH- în stabilizarea formei oxidate a heminei [Trevin
S., 1996a; Trevin S., 199b], conform reacţiei 9:
(OH)2Fe(III)P + H+ + e- → (H2O)(OH)Fe(II)P (9)
(A) (B)
-300
10 -1
v = 500 mV s
-1
v = 300 mV s
-350 -1
v = 50 mV s
0
I/mA
-400
/ mV
-10 pH 7.16 -450

o'
pH 7.64
ε
pH 8.0
pH 8.31
pH 8.82 -500
-20
pH 9.26
pH 9.7
-800 -600 -400 -200 0 -550

6 7 8 9 10
E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat
pH
Figura 4. (A) Influenţa pHului asupra voltamogramelor sistemului G//Fe(III)P si (B) dependenţa Eo’
vs. pH. Condiţii experimentale: electrolit, TRIS 0.05 M; viteza de baleiaj, 50 mV/s; potenţial de start,
-0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluţie dezaerată.
496
Tabelul 4. Parametrii electrochimici ai voltamogramelor ciclice ale sistemului
G//Fe(III)P la diferite viteze de baleiaj. Condiţii experimentale: vezi figura 4.
v = 500 mV/s v = 300 mV/s v = 50 mV/s
Ea Ec Eo ’ Ea Ec Eo ’ Ea Ec Eo ’
pH
(mV vs. (mV vs. (mV) (mV vs. (mV vs. (mV) (mV vs. (mV vs. (mV)
ER) ER) ER) ER) ER) ER)
9,7 -455.2 -539.7 -497,45 -465.6 -539.3 -502,45 -510 -529.9 -519.95
9,26 -435.8 -516.1 -475,95 -450.2 -505.7 -477,95 -460 -479.9 -469.95
8,82 -430.2 -497.7 -463,95 -436.6 -485.3 -460,95 -448 -453.9 -450.95
8,31 -401.7 -476.2 -438,95 - - -- -424 -421.9 -422.95
8,08 -400.6 -464.3 -432,45 -405.5 -454.4 -429,95 -420 -439.9 -429.95
7,64 -386.3 -445.6 -415,95 -385.2 -439.3 -412,25 -390 -419.9 -404.95
7,157 -353 -425 -389 -360.8 -411.1 -385,95 -368 -395.9 -381.95
6,48 -302.3 -397.6 -349,95 -292.3 -387.6 -339,95 -324 -367.9 -345.95
Tabelul 5. Regresia dependenţei Eo’- pH. Condiţii experimentale: vezi figura 4.

v / (mV/s) Eo’ vs pH R/n
50 Eo’ = -28.45 – (48.88 ± 3.79) pH 0.9824/8
300 Eo’ = -38.55 – (47.94 ± 2.21) pH 0.99475/7
500 Eo’ = -70.82 – (44.26 ± 1.82) pH 0.99493/8
3. Calculul parametrilor electrochimici pentru o substanţă

redox (pe bază de fier) imobilizată în polimeri
În figura 5A sunt prezentate voltamogramele obţinute cu electrodul
G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion înregistrate în tampon fosfat (pH 7). Aşa cum
era de aşteptat prezenţa heminei pe suprafaţa electrodului se manifestă
prin apariţia unei perechi de peak-uri bine definite, atribuite unui proces
monoelectronic cvasireversibil de transfer de electroni (ΔEFWHM = 197mV).
Ca şi în cazul heminei în soluţie acest proces implică cuplul redox
Fe(III)/Fe(II) coordinat în inelul porfirinic (ecuaţia 3) [Murray R.W., 1983].
Faptul că ΔEFWHM are o valoare mai mare decât cea teoretică (90.5/n mV)
corespunzătoare cuplurilor redox adsorbite pe suprafaţă [Laviron E., 1979;
Wang B., 2000], indică o anumită neuniformitate a cuplurilor redox adsor-
bite sau existenţa unor interacţiuni repulsive între centrii activi redox
[Honeychourch M. J., 1998].
Potenţialul formal (Eo’) are o valoare de −0.535V vs. Ag/AgCl, KClsat,
(tabelul 6) pentru v = 50 mV/s. Această valoare este cu 0.153 V deplasată
spre valori mai negative), faţă de cazul în care hemina este în soluţie (vezi
tabelul 4). Această diferenţă reflectă influenţa specifică a matricei de imobi-
lizare asupra comportamentului redox al heminei.
497
3.1. Influenţa vitezei de baleiaj asupra comportării heminei adsor-
bită (G/SWCNT–Fe(III) P-Nafion) pe electrod de grafit
Curentul de peak pentru sistemele redox adsorbite depinde de viteza
de baleiaj conform ecuaţiei:
n 2 F2
Ip = A Γ0* v (10)
4RT
unde: Ip = curentul de peak (A), n = numărul de electroni, F = constanta lui
Faraday (C/mol), R = constant universal a gazelor (J/mol K), T = tempera-
tura (K), v = viteza de baleiaj (V/s), A = aria geometrica a electrodului
(cm2), Γ0*= gradul de acoperire sau concentraţia superficială activă
(mol/cm3).
Pe un domeniu larg de viteze de baleiaj (5 – 2000 mV s−1), intensitatea

de curent atât a peak-ului anodic, cât şi celui catodic variază liniar cu viteza
de baleiaj indicând prezenţa unui cuplu redox adsorbit (figura 5B) [Murray
R. W., 1983]. Această concluzie este susţinută şi de panta dependenţelor log
I – log v, care este în jur de valoarea 1 (tabelul 7) [Bard A. J., 1980] şi o slabă
creştere a diferenţei potenţialelor de peak15 (ΔEp) cu creşterea vitezei de
baleiaj a potenţialului.
(A) (B)
50 300
200
Ipa/ μA
25
100
I / μA
0 0
-100
-1
20 mV s
-25 -1
50 mV s -200
Ipc / μA
-1
70 mV s
-1
200 mV s -300
-50 -1
400 mV s
-1
500 mV s -400
-750 -500 -250 0 250 0 500 1000 1500 2000 2500
E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat -1

v / mV*s
Figura 5. (A) Voltamogramele ciclice ale sistemului G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion si (B) Dependenta

Ip de viteza de baleiaj. Condiţii experimentale: potenţial de start, 0 V vs. Ag/AgCl, KClsat; electrolit
suport, tampon fosfat 0.1M (pH 7); soluţie dezaerată.
15Diferenţa potenţialelor de peak (ΔEp = Epa - Epc) se calculează ca diferenţa dintre potenţi-
alele de peak anodic (Epa ) si catodic (Epc).
498
Tabelul 6. Parametrii electrochimici a sistemului G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion.
Condiţii experimentale: vezi figura 5.
v Ea Ipa Ec Ipc E a - Ec Eo’ Ipa/Ipc
mV/s (mV/vs. ER) (μA) (mV/vs. ER) (μA) (mV/vs. ER) (mV/vs. ER)
5 -540 1,285 -554 -1,252 -4 -542 1.02
10 -520 2,415 -544 -2,713 -24 -532 0.89
30 -516 7,068 -552 -8,264 -36 -534 0.85
50 -518 11,57 -552 -13,71 -34 -535 0.84
70 -512 15,8 -558 -18,85 -46 -535 0.84
100 -510 22,04 -560 -26,33 -50 -535 0.84
300 -498 61,49 -580 -74,45 -82 -539 o.83
500 -490,1 93,46 -596 -112,4 -105,9 -543,05 0.83
700 -475,1 120,6 -608,2 -160,1 -133,1 -541,65 0.75
1000 -456 164,2 -620 -195 -164 -538 0.84
1500 -449,2 219 -641,2 -258,2 -192 -545,2 0.85
2000 -429,9 272,8 -660 -320,5 -230,1 -544,95 0.85
Tabelul 7. Regresie liniară pentru dependenţa log I v.s log v a sistemului

G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion (conform figurii 5B).
anodic log Ia = -0.486 + 0.901 log v R = 0.99923, n = 12
catodic log Ic = -0.467 + 0.923 log v R = 0.99815, n = 12
3.2. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru

sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion
Pentru calculul constantei eterogene de transfer de electroni se utilizea-
ză tratamentul Laviron pentru speciile adsorbite, când ΔEp < 200/n mV şi
α = 0.5 [Laviron E., 1979].
499
Tabelul 8. Dependenţa 1/m – ΔEp conform datelor din Laviron E., 1979.
ΔEp 1/m 16
18,8 0,5
27 0,75 14
34,8 1 12
48,8 1,5
61,2 2 10
72,2 2,5
8
82,4 3
1/m
91,8 3,5 6
100,6 4
130 6 4
142,4 7 2
153,8 8
164 9 0
173,4 10 0 50 100 150 200
182 11 Δ Ep
190 12
197,6 13 Figura 6. Dependenta 1/m – dEp conform datelor din Laviron E., 1979.
204,6 14
Se utilizează datele ΔEp pentru diferite viteze de baleiaj (din tabelul 6)

pentru interpolarea din figura 6 şi estimarea valorii 1/m a căror valori sunt
trecute în tabelul 9.
Tabelul 9. Estimarea constantei eterogene de transfer de electroni
ΔEp m-1 ks / s-1 ΔEp/mV m-1 ks / s-1 ΔEp/mV m-1 ks / s-1
v (V/s) G/SWCNT– G/SWCNT(UC)– G/SWCNT(KOH)–
Fe(III)P-Nafion Fe(III)P-Nafion Fe(III)P-Nafion
0,005 -4 - - -50 1,55 0,1257 -20 0,536 0,36351
0,01 -24 0,6587 0,59159 -35 1,013 0,38468 -25 0,69 0,56476
0,03 -36 1,0463 1,11731 -45 1,3651 0,85638 -20 0,536 2,18105
0,05 -34 0,9759 1,99652 -55 1,7527 1,11166 -35 1,013 1,9234
0,07 -46 1,4 1,94841 -55 1,7527 1,55633 -30 0,85 3,20914
0,1 -50 1,55 2,51408 -55 1,7527 2,22332 -40 1,185 3,28845
0,3 -82 2,982 3.92034 -80 2,8 4,17516 -40 1,185 9,86536
0,5 -105,9 4,36 4.46883 -104,7 4,28 4,55236 -54.9 1,75 11,13376
0,7 -133,1 6,256 4.36025 -124.9 5,659 4,82024 -74.2 2,599 10,49547
1 -164 9,0058 4.32701 -144.5 7,186 5,42279 -89.5 3,376 11,5427
1,5 -192 12,281 4.75957 -180.4 10,816 5,40424 -122.6 5,4952 10,63697
2 -230,1 -209 -135 6,4065 12,1652
Valoare 4.3672 ± 0.302 4,875 ±0,542 10,973± 0,817
medie n=5 n=5 n= 6
Diferenţa ΔEp < 200/n mV indică un transfer de electroni rapid. Con-

stanta de viteză a transferului de electroni ks poate fi estimată din ecuaţia:
ks = m n F V / (RT) (11)
unde: m = parametru care depinde de ΔEp (conform figurii 6).
500
Viteza de transfer de electroni rapidă este rezultatul puternicilor inter-
acţiuni dintre Fe(III)P şi micromediul format din SWCNT si Nafion [Dai Z.,
2004].
3.3. Studiul integrităţii filmului de Fe(III)P pentru sistemul

G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion prin calculul ariei suprafeţei active
În scopul de a face o evaluare a variaţiei permeabilităţii sau a integrită-
ţii matricei de înglobare a heminei, s-au trasat voltamograme ciclice ale
electrodului G/SWCNTFe(III)P-Nafion în soluţii 5mM K3[Fe(CN)6] conţi-
nând 1M KCl [Long D.D, 2001]. Aşa cum se observă din figura 7A, peak-
urile voltametrice ale cuplului [Fe(CN)6]3−/[Fe(CN)6]4− (conform ecuaţiei 1)
nu se suprapun cu cele ale cuplul Fe(III)P/Fe(II)P din hemină (conform
reacţiei 3), iar curentul de peak anodic şi catodic ascultă aceeaşi ecuaţie 2.
(A) (B)
300
40
200
20
100
0
I / μA
0
I /μA
-20 -1 -100
5 mV s
-1
10 mV s
-1
-40 30 mV s -200
-1
70 mV s
-300
-60 0.0 0.5 1.0 1.5
-400 -300 -200 -100 0 100 200
1/2 -1 1/2
v / (V*s )
E / mV vs. Ag/AgCl, KClsat
Figura 7. (A) Voltamogramele ciclice ale 5 mM K3[Fe(CN)6] + 0.1 M KCl pe electrodul

G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion si (B) Dependenşa Ip de viteza de baleiaj. Condiţii experimentale:
potenţial de start, -0.400 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluţie dezaerată.
În tabelul 10 sunt sintetizaţi parametrii electrochimici ai voltamo-

gramelor obţinute pe sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion, în scopul trasă-
rii dependenţei log I - log v şi apoi I - v1/2 (figura 7B).
501
Tabelul 10. Parametrii electrochimici ai voltamogramele ciclice ale 5 mM
K3[Fe(CN)6] + 0.1 M KCl pe electrodul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion şi ecuaţia regre-
siei I - v1/2 pentru calculul ariei suprafeţei active.
Condiţii experimentale: vezi figura 6.
v v1/2 Ipa Ipc Proces anodic catodic
(V/s) (V/s)1/2 (A) (A) Ecuatia de I = -5.8972 10-6 + I = 3.26707 10-6 -
0,005 0,07071 9,727E-6 -9,043E-6 liniarizare 1,74056 10-4 v1/2 1,5828 10-4 v1/2
0,010 0,1 1,332E-5 -1,318E-5 R 0.9995 0.9995
0,030 0,17321 2,402E-5 -2,279E-5 n 11 11
0,050 0,22361 2,798E-5 -2,926E-5 A (cm2) 0.01684 0,01532
0,070 0,26458 3,869E-5 -3,809E-5 Amediu 0,0161 cm2
0,100 0,31623 4,781E-5 -4,542E-5
0,300 0,54772 8,975E-5 -8,924E-5
0,500 0,70711 1,217E-4 -1,074E-4
0,700 0,83666 - --
1,000 1 1,661E-4 -1,571E-4
1,500 1,22474 2,072E-4 -1,899E-4
2,000 1,41421 2,405E-4 -2,19E-4
Utilizând ecuaţia Randles Sevcik (ecuaţia 2) caracteristica speciei

K3[Fe(CN)6] aflată în soluţie şi presupunând că coeficientul de difuzie al
K3[Fe(CN)6] este identic cu cel raportat în literatură (adică D = 5.9×10−5
cm2/s [Ye J.-S.., 2004] se obţine
Ip = 2.69*105 (1)3/2 A (5.9×10−5 )1/2 5 10-6 v1/2 = 0.010331 A v1/2
care se compară cu ecuaţia liniară I = panta v1/2 (sau y = ax),
de unde A = panta / 0.010331 (cm2)
Valorile obţinute pentru ramura anodică şi catodică sunt prezentate în
tabelul 10, iar valoarea medie este 0,0161 cm2, care este cam de 5 ori mai
mică decât aria geometrica a electrodului calculată cu relaţia A = (πd2)/4 =
0.07065 cm2 (unde: d = 0.3 cm).
3.4. Influenţa pH-ului asupra comportării sistemului adsorbit

(G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion) pe electrod de grafit
Influenţa pH-ului a fost studiată pe aceleaşi tipuri de electrod, doar că
nanotuburile de carbon SWCNT au suferit un tratament suplimentar înain-
tea imobilizării. Este vorba de o ultracentrifugare pentru G/SWCNT(UC) şi
un tratament cu KOH concentrat în cazul SWCNT(KOH). Voltamogramele
ciclice sunt prezentate în figura 8A, iar dependenţa Eo’- pH în figura 8B.
502
10 -0,50
ε ' / V vs. Ag/AgCl, KClsat

5
-0,55
0
I / μA
-0,60
-5
pH 6.04
pH 7.3 -0,65
-10
pH 8.57
0
G/SWCNT(UC)-Fe(III)P-Nafion
G/SWCNT(KOH)-Fe(III)P-Nafion
-15
-800 -600 -400 -200 0 -0,70
6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0
E / mV vs Ag/AgCl, KClsat pH
Figura 8. (A) Influenţa pHului asupra voltamogramelor sistemului G/SWCNT(UC)–

Fe(III)P-Nafion si (B) dependenţa Eo’ vs. pH. Condiţii experimentale: electrolit, TRIS 0.05
M; viteza de baleiaj, 50 mV/s; potenţial de start, -0.85 V vs. Ag/AgCl, KClsat; soluţie
dezaerată.
Tabelul 11. Parametrii electrochimici ai voltamogramele ciclice pe electrodul

G/SWCNT(UC)–Fe(III)P-Nafion şi G/SWCNT(KOH)–Fe(III)P-Nafion în funcţie de
pH. Condiţii experimentale: vezi figura 8.
G/SWCNT(UC)–Fe(III)P-Nafion G/SWCNT(KOH)–Fe(III)P-Nafion
pH Ea Ec Eo’ pH Ea Ec Eo’
(mV vs. ER) (mV vs. ER) (mV) (mV vs. ER) (mV vs. ER) (mV)
6.03 -510 -560 0.535 6.04 -545 -570 0.5572
6.22 -510 -560 0.535 6.3 -520 -540 0.53
6.55 -510 -560 0.535 6.6 -540 -560 0.55
6.88 -500 -540 0.52 6.9 -500 -540 0.52
7 -585 -620 0.602 7.3 -600 -620 0.61
7.44 -570 -615 0.5925 7.68 -590 -615 0.6025
7.7 -570 -615 0.5925 8.04 -600 -640 0.62
8.12 -595 -630 0.6125 8.57 -650 -690 0.67
8.45 -600 -655 0.6275
Utilizând parametrii electrochimici din tabelul 11 şi acelaşi formalism

matematic ca şi cel descris pentru speciile în soluţie de către ecuaţiile 4 - 7,
se obţine pentru dependenţa Eo’ - pH (tabelul 12) o pantă apropiată de va-
loarea teoretică (59 mV/pH), ceea ce confirmă faptul că comportamentul
heminei, chiar şi imobilizată, este dependent de pH soluţiei adiacente, con-
form ecuaţiei 9.
503
Tabelul 12. Regresia dependentei Eo’- pH. Condiţii experimentale: vezi figura 8.
Electrod Eo’ - pH R/n
G/SWCNT(UC)–Fe(III)P-Nafion E°' = -0.157 - 0.0562 pH 0.945/ 6
G/SWCNT(KOH)–Fe(III)P-Nafion E°' = -0.165 - 0.0577 pH 0.990 /5
3.5. Estimarea stabilităţii sistemului G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion la

funcţionare continuă
Stabilitatea pe termen scurt a electrozilor modificaţi poate fi evaluată în
condiţii potenţiodinamice, prin ciclarea continuă a electrodului între 0 şi
−0.95 V/ER (v = 50 mVs−1), într-un electrolit inert rRESezentat de o soluţie
de tampon fosfat (pH 7) (figura 9A). Presupunând ca evoluţia în timp a
gradului de acoperire al electrodului sau concentraţia superficial activă, Γ,
respectă o cinetică de ordinul zero, constanta vitezei de activa-
re/dezactivare se calculează ca fiind panta dependenţei Γ- timp (figura 9B).
Gradului de acoperire al electrodului sau concentraţia superficial acti-
vă, Γ, se calculează ca raportul dintre aria de sub peak şi aria geometrica,
conform relaţiei 12 [Yacynych A.M., 1978]:
A
Γ= (mol/cm2) (12)
F ∗S *v
unde: A = aria de sub peak obţinută prin integrarea peak-ului din
voltamograme (A*V); F = constanta lui Faraday (C/mol); S = aria geometri-
ca a electrodului (cm2), v = viteza de balaiej (V/s).
(A) (B)
15 c ic lu l 5
c ic lu l 5 0
80
10 c ic lu l 1 0 0
-2
/ mol*cm
5
60
N T -S D S
0 -9 -1 4
Γ = 7 .4 3 3 * 1 0 + 4 .5 9 1 * 1 0 t
I / μA
R = 0 .7 3 5 , n = 1 6
-5
40
-10
| * 10
-1 0
-1 5 20
cat
|Γ
-2 0
0
-8 0 0 -6 0 0 -4 0 0 -2 0 0 0
0 1000 2000 3000 4000
E / m V v s A g /A g C l, K C l s a t
tim e / s
Figura 9. (A) Voltamograme ciclice succesive pe electrodul G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion si (B)

dependenta Γ- timp pentru estimarea constantei de stabilitate. Condiţii experimentale: viteza de
baleiaj, 50mV s−1; potenţialul de start 0 V vs. Ag/AgCl, KClsat; electrolitul suport, 0.1M tampon
fosfat (pH 7); soluţie dezaerată.
504
Utilizând datele obţinute din voltamogramele ciclice din figura 9A,
pentru doi electrozi similari, sintetizate în tabelul 13, regresia liniară a de-
pendenţei Γc- timp conduce la obţinerea constantei vitezei de activare de ka
= 4,591 10-14 s (figura 9B), valoare care este în concordanţă cu datele din
literatură [Ciszewski A. et al., 2000].
Tabelul 13. Parametrii electrochimic ale sistemului G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion

supus ciclării succesive.
Numarul Timpul Eld 1 Eld 2
de cicluri de scanare Apc Γpa Apc Γpc Γpc, mediu
(s) (C) (mol/cm2) (C) (mol/cm2) (mol/cm2)
1 38 3,008E-6 8,82406E-9 2,1248E-6 6,23316E-9 7,52861E-9
5 190 2,879E-6 8,44563E-9 2,2292E-6 6,53942E-9 7,49253E-9
10 380 2,836E-6 8,31949E-9 2,192E-6 6,4303E-9 7,37489E-9
15 570 2,861E-6 8,39283E-9 2,1898E-6 6,42384E-9 7,40834E-9
20 760 2,8519E-6 8,36613E-9 2,1898E-6 6,42384E-9 7,39499E-9
25 950 2,8768E-6 8,43918E-9 2,2088E-6 6,47958E-9 7,45938E-9
30 1140 2,8894E-6 8,47614E-9 2,2424E-6 6,57815E-9 7,52714E-9
35 1330 2,8634E-6 8,39987E-9 2,2438E-6 6,58225E-9 7,49106E-9
40 1520 2,8719E-6 8,4248E-9 2,2553E-6 6,61599E-9 7,5204E-9
45 1710 2,874E-6 8,43096E-9 2,233E-6 6,55057E-9 7,49077E-9
50 1900 2,872E-6 8,4251E-9 2,3074E-6 6,76883E-9 7,59696E-9
60 2280 2,8826E-6 8,45619E-9 2,2823E-6 6,6952E-9 7,57569E-9
70 2660 2,8757E-6 8,43595E-9 2,2388E-6 6,56759E-9 7,50177E-9
80 3040 2,8749E-6 8,43361E-9 2,2877E-6 6,71104E-9 7,57232E-9
90 3420 2,8777E-6 8,44182E-9 2,2783E-6 6,68346E-9 7,56264E-9
100 3800 2,9044E-6 8,52014E-9 2,287E-6 6,70898E-9 7,61456E-9
4. Concluzii
a. S-au studiat prin voltametrie ciclică atât în soluţie, cât şi imobilizat
pe electrod de grafit, doi compuşi care conţin Fe(III): K3[Fe(CN)6]
(compus cu comportament standard) şi hemina (Fe(III)P, compus cu
proprietăţi biologice).
b. Studiul compusului standard în soluţie pe electrod de platină a
permis determinarea coeficientului de difuzie, D, utilizând ecuaţia
Randles Sevcik (ecuaţia 2) specifică transferului de electroni difuziv.
c. Studiul sistemului G//Fe(III)P la diferite viteze de baleiaj a stabilit
că compusul studiat (Fe(III)P) se adsoarbe pe suprafaţa electrodului
(panta logI-log v aproximativ 1).
d. Studiul efectului pH-ului asupra sistemului G//Fe(III)P a permis
stabilirea că în procesul de transfer de electroni intervin şi protonii
(ecuaţia 9, panta Eo’-pH în jur de 59 mV/pH).
505
e. Studiul influenţei vitezei de baleiaj asupra sistemului
G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion confirmă că specia studiată este adsorbi-
tă pe electrod şi transferul de sarcină se face după un proces etero-
gen. Calculul constantei eterogene de transfer de electroni pentru
sistemul G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion se face utilizând modelul
Laviron pentru ΔEp < 200/n mV şi α = 0.5.
f. Studiul integrităţii filmului de Fe(III)P pe electrodul de G/SWCNT–
Fe(III)P-Nafion s-a realizat prin ciclarea la diferite viteze de baleiaj
în soluţie de K3[Fe(CN)6], ceea ce a permis calculul ariei suprafeţei
active utilizând ecuaţia Randles-Sevcik (ecuaţia 2).
g. Studiul influenţei pH asupra Fe(III)P imobilizat
(G/SWCNT-Fe(III)P-Nafion) arată un comportament care nu este
diferit faţă de a celui în soluţie (în G//Fe(III)P).
h. Estimarea stabilităţii pe termen scurt a sistemului G/SWCNT–
Fe(III)P-Nafion la funcţionarea continuă se face utilizând şi
rRESezentarea grafică Γ- timp (modelul cineticii omogene de ordi-
nul zero), a cărei pantă rRESezintă constanta de activa-
re/dezactivare.
i. Estimarea cantitativă a eficienţei electrocatalitice a Fe(III)P asupra
eletcrocatalizei NO2- sau H2O2 pe sistemele G//Fe(III)P şi
G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion se face prin calculul unui indicator al
efectului electrocatalitic descris de relaţia 16.
5. Bibliografie
1. Bard A.J., Faulkner L.R., Electrochemical Methods, Wiley-VCH, New York, 1980, p. 522.
2. Ciszewski A., Milczarek G., Anal. Chem., 2000, 72 (14), 3202-3209.
3. Dai Z., Liu S., Ju H., Chen H., Biosensors Bioelectronics 2004, 19, 861-867.
4. Honeychourch M. J., Rechnitz G.A., Electroanalysis 1998, 10, 285-293.
5. Hrapovic S., Luong J. H. T., Anal Chem., 2003, 75(14), 3308-3315.
6. Laviron E., J. Electroanal. Chem. 1979, 101, 19-28.
7. Li M-X., Li N-Q., Gu Z-N., Zhou X-H., Sun Y-L., Wu Y-Q., Anal. Chim. Acta, 1997,
356, 225-229.
8. Long D.D, Marx K.A. Zhou T., J. Electroanal. Chem., 2001, 501, 107-113.
9. Murray RW (1983) “Chemically modified electrodes”, in “Electroanalytical
chemistry”, Bard A. J. (ed), vol. 13, Marcel Dekker, New York, p. 191.
10. Trevin S., Bedioui F., Devynck J., J. Electroanal. Chem., 1996a, 408, 261-265.
11. Trevin S., Bedioui F., Devynck J., Talanta, 1996b, 43, 303-311.
12. Wang B., Zhang J., Cheng G., Dong S., Anal. Chim. Acta, 2000, 407, 111-118.
13. Yacynych, A. M.; Kuwana, T. Anal. Chem. 1978, 50, 640-645.
14. Yang J., Hu N., Rusling J. F., J. Electroanal. Chem., 1999, 463, 53-62.
15. Ye J.-S., Wen Y., Zhang W.D., Cui H.-F., Gan L.M., Xu G.Q., Sheu F.-S., J.
Electroanal. Chem., 2004, 562, 241-246.
506
6. Anexă
Reactivi
Clorura de protoporfirina IX fier(III) (Fe(III)P),
2-amino-2-hidroximetil-1,3-propandiol(tris-(hidroximetil)amino metan)
(TRIS) şi bromura de potasiu s-au achiziţionat de la Fluka Buchs, Switzer-
land. Nanotuburile de carbon cu un singur perete (SWCNT), dodecil sulfa-
tul de sodiu (SDS) şi Nafionul s-au procurat de la Sigma (SUA), iar apa oxi-
genată (soluţie 30% w/v) de la J. T. Baker şi nitritul de sodium de la Merck.
Soluţia de electrolit este tamponul fosfat (PB) care conţine 0.1M KBr
(pH 7.5) şi a fost preparată din 0.05 M NaH2PO4, 0.05 M Na2HPO4 şi 0.1 M
KBr (Fluka Buchs, Switzerland) şi pHul ajustat cu HCl.
Soluţia 0.5 mM Fe(III)P s-a preparat prin dizolvarea sării în tampon
0.05 M TRIS-HCl + 0.1 M KBr (pH 8). Soluţiile de tampon 0.1 M KBr, 0.05 M
TRIS şi 0.05 M PB au fost preparate cu apă distilată şi păstrate la frigider
pentru a împiedica creşteri bacteriene. Ajustările de pH s-au făcut cu soluţii
de HCl şi NaOH (Carlo Erba, Italy).
Toţi reactivii au fost de puritate “analytical” şi s-au utilizat fără alte pu-
rificări.
Aparate
Măsurătorile de voltametrie ciclică s-au făcut cu o combină electrochi-
mică PGStat 10 (Autolab EcoChemie, Olanda). Celula electrochimică cu un
compartiment a fost echipată cu un electrod de lucru din grafit (2.5 mm
diameter) (Ringsdorff-Werke, Gmbh, Bonn-Bad Godesberg, Germany), un elec-
trod de referinţă Ag⎪AgCl, KClsat (Radiometer, Franţa) şi un contraelectrod
de platină. Toate experimentele au fost efectuate la temperatura camerei, în
soluţii dezaerate prin barbotare de argon.
Modul de citire a parametrilor de peak este prezentat

în figura 10.
Figura 10. Modul de citire a paramterilor de peak:

potentialul de peak (Ep) si intensitatea curentului de
peak(Ip).
507
Prepararea electrodului modificat G/SWCNT–Fe(III)P-Nafion
Electrodul de grafit (G) a fost curăţat cu hârtie abrazivă de diferite di-
mensiuni (Carbimet 240, 400, 600 şi 1000, de la Buehler Ltd, Lake Bluff, Il,
USA), apoi supus unui tratament cu ultrasunete în apă distilată şi apoi spă-
lat cu apă distilată.
O cantitate de 0.01 g nanotuburi de carbon (SWCNT) se dispersează în
50 ml de soluţie de 1% (wt) dodecil sulfat de sodiu (SDS) După omogeniza-
re şi ultrasonare, suspensia de SWCNT obţinută se ultracentrifughează al
120.000 G timp de 4 ore. Se prepară o soluţie din 500 μl de SWCNT şi o so-
luţie 5 mM Fe(III)P. Un volum de 2 μl din această soluţie se depune pe su-
prafaţa electrodului şi se aşteaptă evaporarea solventului. Operaţia este
repetată de 3 ori. În final electrodul se acoperă cu 2 μl de Nafion 5%.
508
XIV. SISTEME DE ANALIZĂ A SUPRAFEŢEI
SPECIFICE ŞI A DIMENSIUNII PARTICULELOR
Sisteme de analiză a suprafeţei specifice

şi a dimensiunii particulelor
Lect. dr. ing. Réka Barabás
Cuprins
1. Introducere; considerente teoretice ...................................................................................... 509

1.1. Suprafaţa specifică şi porozitatea ................................................................................. 509
1.2. Determinarea suprafeţei specifice prin metoda difracţiei laser ..................................... 513
2. Operarea cu Analizorul de Suprafeţe, seria Qsurf .............................................................. 513
2.1. Etape în derularea unei analize ................................................................................... 513
3. Bibliografie .......................................................................................................................... 517
1. Introducere; considerente teoretice

1.1. Suprafaţa specifică şi porozitatea
Suprafaţa specifică şi porozitatea sunt două proprietăţi fizice importante
care determină calitatea şi utilitatea multor materiale. Datorită acestui lu-
cru, este important ca ele să fie determinate şi controlate într-o manieră
strictă. Cunoştinţele legate de porozitate şi suprafaţă specifică reprezintă
elemente importante în înţelegerea modului de formare a structurii şi a
posibilelor aplicaţii ale unor materiale. Analizarea suprafeţei specifice ajută
la determinarea modului în care materialele se dizolvă sau reacţionează
între ele.
Diferenţele în zona de suprafaţă si porozitatea particulelor într-un ma-
terial pot influenţa foarte mult performanţa şi caracteristicile acestuia.
Suprafaţa specifică depinde de natura adsorbantului, de metoda de ob-
ţinere, de modul de tratare fizico-chimică şi termică (ceea ce influenţează
natura suprafeţei), de porozitatea adsorbantului, precum si de mărimea,
distribuţia şi volumul porilor. Cu cât numărul porilor, raportat la unitatea
509
de masă (sau de volum) de adsorbant este mai mare, cu atât suprafaţa spe-
cifică este mai mare. Unitatea de măsură pentru suprafaţa specifică este
m2/g.
Suprafaţa specifică are o importanţă deosebită la procesele de adsor-
bţie, cataliză eterogenă şi la reacţiile de suprafaţă.
Cea mai folosită tehnică pentru estimarea suprafeţei specifice este me-
toda BET. Mai jos sunt descrise doar câteva dintre aplicaţiile cele mai utili-
zate ale analizelor de suprafaţă şi a măsurătorilor de porozitate:
Produse farmaceutice – Analizarea suprafeţei specifice si porozitatea joacă
roluri importante în capacitatea de a purifica, procesa, amesteca şi compri-
ma un medicament. Rata de dizolvare (care reglementează rapiditatea cu
care medicamentul devine disponibil pentru organism) depinde de supra-
faţa şi de porozitatea materialului.
Produse ceramice – Analizarea suprafeţei specifice şi informaţiile legate de
porozitate sunt necesare pentru obţinerea unui produs final cu aspect, tex-
tură şi densitate dorită.
Cărbuni activi – Suprafaţa specifică şi porozitatea trebuie să fie optimizate,
în intervale înguste pentru a realiza în mod corespunzător recuperarea va-
porilor de benzină în automobile, recuperarea solvenţilor în operaţiunile de
vopsire sau controlul poluării în managementul apelor reziduale.
Negru de fum – Producătorii de cauciucuri au descoperit că suprafaţa de
carbon afectează durata de viaţă, tracţiunea si performanţa cauciucurilor.
Utilizarea prevăzută a cauciucului, sau tipul de vehicul pe care va fi plasat
acesta, determină dacă suprafaţa de carbon necesară trebuie să fie scăzută
sau ridicată.
Vopsele şi straturi de acoperire – Suprafaţa pigmentului sau a materialului de
umplere influenţează luciul, textura, culoarea, saturaţia culorii, luminozitatea
si proprietăţile de adeziune ale filmului. Porozitatea poate controla proprietăţi-
le aplicării, cum ar fi fluiditatea, timpul de uscare şi grosimea filmului.
Propelanţi – Suprafaţa specifică a propelantului utilizat în fabricarea de
muniţii afectează în mod direct rata de ardere. O rată ridicată poate fi peri-
culoasă, iar o rată scăzută de ardere poate provoca defecţiuni si lipsă de
acurateţe.
Implanturi medicale – Suprafaţa specifică şi porozitatea materialelor utilizate
în implanturile medicale influenţează aderenţa materialului pe os sau pe
ţesuturile naturale.
510
Electronice – Fabricarea condensatorilor compacţi utilizând un număr mi-
nim de materii prime costisitoare necesită dezvoltarea unui material cu
suprafaţa controlată, având o reţea de pori atent proiectată.
Aerospace – Porozitatea scuturilor termice şi materialele izolante afectează
atât greutatea cât şi funcţionarea.
Nanotuburi – Analizele de microporozitate sunt utilizate pentru a anticipa
capacitatea unui material de a stoca hidrogen.
Celule de combustibil – Electrozii celulelor de combustibil necesită porozitate
controlată pentru a produce densitate de putere optimă [1,2,3].
Metoda BET se foloseşte foarte mult în studiul materialelor pentru de-

terminarea suprafeţei solidelor prin intermediul adsorbţiei fizice ale mole-
culelor de gaz. Brunauer, Emmet si Teller au descris 5 izoterme de bază
care sunt grafice ale volumelor de gaz adsorbit în raport cu presiunea. Tra-
tarea matematică a izotermelor de adsorbţie este dificilă şi în general se
pleacă de la modele simplificate ale solidului şi ale adsorbţiei. S-a ajuns
totuşi ca, din izotermele de tipul II şi IV, să se poată calcula suprafaţa speci-
fică a solidului. În unele cazuri, pentru materiale microporoase şi la
chemisorbţie pot fi folosite şi izotermele de tipul I. Din izotermele de tipul
III şi V nu se poate determina suprafaţa totală. Brunauer, Emmett şi Teller
pleacă de la următoarele ipoteze:
• adsorbţia este localizată pe anumite centre active;
• fiecare centru activ poate adsorbi numai o moleculă;
• energia de adsorbţie a particulelor este identică pentru toate parti-
culele adsorbite şi nu depinde de prezenţa sau absenţa altor particu-
le pe centrii vecini.
La aceste ipoteze, se mai adaugă şi presupunerea că o moleculă din
primul strat adsorbit poate constitui un centru de adsorbţie pentru o mole-
culă din al doilea strat, iar acesta din urmă pentru al treilea strat etc.
Brunauer, Emmett şi Teller presupun că există un echilibru dinamic între
moleculele adsorbite şi cele din faza gazoasă. Ei mai presupun că la primul
strat de adsorbţie energia de adsorbţie este E1,iar la celelalte straturi este
mai mică şi egală cu căldura latentă de condensare a adsorbatului. Izoterma
de tip 1 este caracteristică solidelor pe care sunt formate doar monostraturi
adsorbite. Moleculele adsorbatului pot fi considerate ca fiind depozitate pe
suprafaţa într-un strat de grosime monomoleculară. Pe masură ce presiu-
nea creşte, volumul de gaz adsorbit creşte rapid până când se formează un
monostrat; creşterile ulterioare de presiune nu au ca rezultat adsorbţia unei
511
cantităţi mai mari de gaz (chiar dacă această creştere se face până la presiu-
nea vaporilor saturaţi Po).
Principiul de analiză: proba de analizat se scufundă în azot lichid, azotul

din amestecul de gaz care trece prin celulă se lichefiază şi se depune într-un
strat de grosime moleculară pe suprafaţa şi pereţii porilor probei [4].
La baza acestui model stă teoria lui Langmuir, şi anume teoria adsor-
bţiei în strat monomolecular, care poate fi extrapolată pentru adsorbţia în
mai multe straturi, având în vedere următoare ipoteze: i) moleculele de gaz
se adsorb fizic pe solid în straturi infinite; ii) nu există interacţiune între
straturile adsorbite; iii) teoria lui Langmuir poate fi aplicată pentru fiecare
strat. Ecuaţia BET poate fi exprimată [5,6,7]:
1 c −1 P 1
= ( )+ (1)
V [( P0 / P ) − 1 ] Vm c P0 Vm c
unde P şi P0 este presiunea speciei adsorbite la echilibru şi la saturaţie la
temperatura de adsorbţie, V este cantitatea de gaz adsorbită (în unităţi de
volum) şi Vmc este cantitatea de gaz adsorbită în strat monomolecular, c
este constanta BET, exprimată:
E1 − E L
c = exp( ) (2)
RT
unde, E1 este energia de adsorbţie pentru primul strat şi EL pentru stratul
doi (sau straturi mai mari) şi este egală cu energia de lichefiere.
În concluzie, măsurarea suprafeţei specifice prin metoda BET constă în
măsurarea volumului de azot adsorbit la temperatura azotului lichid.
Ecuaţia Brunauer, Emmet şi Teller (B.E.T.) pentru determinarea suprafeţei
este, în forma cea mai simplă, următoarea:
St=K(1-P/Po)xVa (3)
Unde:
St – suprafaţa totală a probei supuse analizei
K - o constantă pentru nitrogen K= 4,03
P/Po = 0,294 pentru amestec de gaz de 30% (vol.) N2 şi 70% (vol.) He
Va = Volum de gaz (N2) adsorbit
Fiecare cm3 de N2 adsorbit (apoi desorbit) de către probă este echivalent

cu o suprafaţă totală (St) de 2,84 m2 . Suprafaţa specifică se calculează împăr-
ţind St la masa probei din celula în grame [8].
512
1.2. Determinarea suprafeţei specifice prin metoda difracţiei laser
Difracţia laser permite şi ea determinarea relaţiei între distribuţia gra-
nulometrică şi suprafaţa specifică. Suprafaţa specifică creşte odată cu scă-
derea mărimii particulelor. Diferenţa între suprafaţa specifică determinată
prin metoda BET şi difracţia laser depinde de porozitatea şi rugozitatea
suprafeţei particulelor. În cazul materialelor cu particule poroase, suprafaţa
specifică determinată prin metoda BET va fi mai mare decât cea determina-
tă prin metoda difracţiei laser [9].
Avantajul metodei BET este că ne permite atât determinarea suprafeţei
specifice, cât şi determinarea distribuţiei porilor.
2. Operarea cu Analizorul de Suprafeţe, seria Qsurf

Echipamentele analitice tip Qsurf au fost dez-
voltate cu scopul de a permite utilizatorilor analize
rapide, rRESoductibile şi de calitate conform cerin-
ţelor care se impun pentru laboratoarele de control.
Analizoarele Qsurf se caracterizează printr-o
precizie ridicată în ceea ce priveşte calibrarea sem-
nalului de conductivitate termică, satisfăcând astfel
cerinţele cele mai severe în ceea ce priveşte precizia
şi acurateţea.
2.1. Etape în derularea unei analize

Pentru a măsura volumul de gaz adsorbit de către o probă, analizoarele
din seria 9600 utilizează metoda fluxului continuu dezvoltată de către
Nelsen & Eggertsen. Un amestec de 30% N2 şi He, este trecut printr-un de-
tector de conductivitate termică, TCD (de referinţă) şi apoi printr-o celulă
de sticlă conţinând proba (vezi figura 1.)
La părăsirea celulei de probe, amestecul de gaze trece printr-un al doi-
lea detector de conductivitate termică. Această pereche de detectori conţine
o punte Wheatstone. Această punte este conectată la un panou de control
cu microprocesor.
Sistemul este calibrat mai întâi prin injectarea a 1,00 m1 de nitrogen în
flux chiar în faţa detectorului de probă. Volumul injectat de N2 trece
printr-un tub către detectorul de probe la un debit de flux constant. Puntea
îşi pierde echilibrul în timpul în care acceptă acest volum de gaz de calibra-
re pentru a trece prin detectorul de probe. Semnalul rezultant este integrat
într-un integrator digital si rezultatul este stocat într-un fişier din memorie.
513
Figura 1.Diagrama bloc al sistemului de analizare Qsurf [8]
Odată ce instrumentul a fost astfel calibrat, se formează automat o baie

de N2 lichid care „inundă” proba. N2 din amestecul care curge prin probă,
care este scufundată în nitrogen lichid, devine „ca un lichid” şi este adsor-
bit de către probă. În timpul în care nitrogenul este adsorbit, amestecul de
gaz care iese din celula de probă conţine cu mult mai puţin nitrogen decât
la intrare. Adsorbţia continuă până când proba nu mai poate adsorbi nitro-
gen din flux.
Când amestecul de gaz, cu un conţinut redus de nitrogen după adsor-
bţie, ajunge la detectorul de probă, puntea devine instabilă şi rămâne aşa
până când tot gazul cu deficit de nitrogen a trecut de detectorul de probe.
Semnalul rezultat de la punte este integrat, dar valoarea nu este utilizată în
determinarea suprafeţei. Ciclul de adsorbţie este utilizat doar pentru a „în-
cărca” proba cu întreaga cantitate de nitrogen pe care o poate adsorbi din
amestecul de gaz. La finalul semnalului de adsorbţie, se face revenirea la
„linia de bază” şi baia de nitrogen lichid este coborâtă automat.
Pe măsură ce proba revine la temperatura camerei, tot nitrogenul care a
fost adsorbit este acum desorbit si este returnat fluxului de amestec de ga-
ze. Acest semnal de nitrogen „îmbogăţit” este transmis la detectorul de
probe şi semnalul rezultant integrat, iar rezultatul stocat într-un fişier în
memorie.
Analiza este completă şi este calculat echivalentul suprafeţei totale, St, a
nitrogenului adsorbit şi apoi desorbit de către probă. În scopul realizării
acestui calcul se presupune că în celulă există 1,00 g probă. La începutul
analizei este stabilită o masă brută „în lipsa” egală cu masa de tara + 1,00g.
514
Operaţiunea se face astfel încât la sfârşitul analizei să se calculeze suprafaţa
totală S t şi să poată fi afişată ca „S t=m 2/celula”. Rezultatul este afişat,
iar când operatorul confirmă apăsând ENTER, confirmarea este salvată în
fişierul numit anterior în memorie. Fişierul arată că adevărata masă brută
nu a fost încă introdusă.
Pentru a calcula suprafaţa specifică (SSA= St/masa probei), se măsoară
masa brută actuală a probei. Fişierul este refăcut în memorie şi este intro-
dusă masa brută. Suprafaţa specifică, SSA, este automat calculată şi afişată,
de această dată în m2/g.
Mărimea optimă a probei

Domeniul dinamic al instrumentului permite măsurători ale suprafeţe-
lor totale (St) în domeniul 0,50 până la 50 metri pătraţi în celulă. Pentru a de-
termina mărimea optimă a celulei, se urmăreşte procedura de mai jos:
1. În cazul în care se cunoaşte domeniul suprafeţei

a. Dacă este cunoscută suprafaţa aproximativă a probei ce urmează a
fi analizată, se alege o masă a probei care va furniza o probă cu
adevărat rRESezentativă. Metodele prin care se poate face această
determinare depind foarte mult de materialul respectiv. Aceste
metode sunt de obicei bine stabilite din fabricaţie sau în laborato-
rul care se ocupă cu analiza suprafeţelor.
b. Se încarcă celula de probă cu cantitatea minimă de probă ce va fi re-
prezentativă şi care are o suprafaţă totală (St) aflată în domeniul ana-
lizorului. Mai jos sunt prezentate două exemple pentru a estima mărimea
probei.
Exemplu: suprafaţa între 50 şi 500 m2/g

Dacă suprafaţa aşteptată este aprox. de 300 m2 /g, atunci se alege o greuta-
te de 0,075 grame în celulă, care va însemna aprox. 15 m2 in celulă. Această
valoare se află la mijlocul domeniului analizorului.
Exemplu: suprafaţa între 5 şi 50 m2/g

Dacă suprafaţa estimată este aprox. de 20 m2/g, se alege o greutate de
aprox. 0,50 g care va fi aprox. 10 m2 in celulă. Din nou, această valoare se află
la mijlocul domeniului analizorului.
B.E.T cu mai multe puncte (o metodă mai precisă):

Utilizează 3 amestecuri diferite de gaze pentru determinarea de puncte
515
multiple, (Notă: opţional este disponibil un cap de distribuţie cu puncte
multiple).
• Moleculele pot fi considerate că există sub formă de monostrat cu
un strat mai jos pe pereţii interiori ai porilor probelor, precum şi pe
suprafaţa exterioară.
• Porii nu se umplu cu molecule de N2 lichid; doar pereţii probelor
sunt acoperiţi.
• Dacă sunt plasate pe o suprafaţă plană, aceste molecule vor acoperi
o suprafaţă de 2,84m2.
Suprafaţa totală, St = 2,84 m2 în celulă {m 2/celulă}

Suprafaţa specifică a materialului SSA este = St masa şi pentru o probă de
1g este 2,84m2/g [10].
Exemple de măsurători şi domenii de aplicaţie ale metodei

Suprafaţa specifică şi volumul mediu al porilor pentru hidroxiapatită (HAP) şi
HAP dopată cu diferite cantităţi de silice şi cadmiu [11].
Volumul mediu al
Material Suprafaţă specifică medie
porilor
m2/g mL/g
ncHAP Φ>90 Φm 31.2 - 54.4 (3x∗) 0.15 - 0.16 (3x)
ncHAP Φ>45 Φm 73.7 (2x) 0.24 (2x)
ncHAP Φ>90 Φm + Cd (10-3 M) 71.5 (2x) 0.23 (1x)
cHAP Φ>90 Φm 2.5 (3x) 0.006 (1x)
ncHAP-SiO2 5% Φ>45 Φm 89.8 (3x) 0.28 (1x)
ncHAP-SiO2 10% Φ>63 Φm 120.9 (2x) 0.41 (2x)
ncHAP-SiO2 10% Φ<45 Φm 124.4 (2x) 0.46 (1x)
ncHAP-SiO2 15% Φ>45 Φm 87.8 (2x) 0.25 (1x)
Metoda BET de determinare a suprafeţei specifice prezintă un interes

deosebit şi pentru domeniul nanotehnologiei, cum ar fi determinarea su-
prafeţei specifice la:
- fibre polimerice [12]
- nanoaerosoli [13]
- nanotuburi de carbon [14]
- suprafaţa specifică ale bentonitelor
∗
numărul de repetări a măsurătorilor pentru proba respectivă
516
Figura. 2. Reprezentarea schematică a adsorbţiei azotului pe diferite specii de smectite [15]
3. Bibliografie
1. Bratu, E. A., Operaţii şi utilaje în industria chimică, Ed. Tehnică, Bucureşti, 1970
2. http://www.infim.ro/~biomat/physisorption.html
3. Q. Jiang, a, b, , and Y. Zhaoa, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76,
Issues 1-3, 215-219
4. G. Fagerlund, Determination of specific surface by the BET method, Materials and
Structures, 6, 3, 239-245, 1973, DOI: 10.1007/BF02479039
5. D. Dollimore, P. Spooner, A. Turner, The bet method of analysis of gas adsorption
data and its relevance to the calculation of surface areas, Surface Technology, 4, 2,
1976, 121-160, doi:10.1016/0376-4583(76)90024-8
6. S. Brunauer, P.H. Emmett and E. Teller, J. Am. Chem. Soc. 60 (1938), p. 309
7. J.U. Keller and R. Staudt, Gas Adsorption Equilibria. Experimental Methods and
Adsorptive Isotherms, Springer, Heidelberg, 2004.
8. www.porotec.de
9. http://www.malvern.com/LabEng/technology/laser_diffraction/gas_adsorption
_bet.htm
10. http://www.thermo.com.cn/Article.aspx?ID=189
11. Bogya Erzsebet-Sara: Studii cinetice şi de echilibru ale unor procese de reţinere pe
materiale apatitice, teză de doctorat, 2010, Cluj-Napoca, UBB
12. S. J. Eichhorn and W. W. Sampson, Journal of the Royal Society, 2010 vol. 7 no. 45,
p. 641-649
13. S. Bau, O. Witschger, F. Gensdarmes, O. Rastoix, D. Thomas, Powder Technology,
Volume 200, Issue 3, 28 June 2010, p. 190-201
14. Q. Jiang, Y. Zhao, Microporous and Mesoporous Materials, Volume 76, Issues 1-3, 1
December 2004, p. 215-219
15. S. Kaufhold, R. Dohrmann, M. Klinkenberg, S. Siegesmund, K. Ufer, Journal of
Colloid and Interface Science, Volume 349, Issue 1, 1 September 2010, p. 275-282
517
Casa Cărţii de Ştiinţă
Director: Mircea Trifu
Fondator: dr. T.A. Codreanu
Tehnoredactare computerizată: Andra Ioana Ghira, Czégely Erika
Tiparul executat la Casa Cărţii de Ştiinţă

400129 Cluj-Napoca; B-dul Eroilor nr. 6-8
Tel./fax: 0264-431920
www.casacartii.ro; e-mail: editura@casacartii.ro
518

Metode Experimentale Avansate

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Metode Experimentale Avansate

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Editori

Mihaela Aluaş Simion Simon

Metode experimentale avansate

METODE EXPERIMENTALE AVANSATE

Casa Cărţii de Ştiinţă

Editură acreditată CNCSIS (24)

© Universitatea „Babeş-Bolyai”, 2012

Descrierea CIP a Bibliotecii Naţionale a României

În calitate de director al proiectului cu titlul „Program doctoral performant

Mulţumirile mele se îndreaptă de asemenea către echipa de management a

Prof. dr. Simion Simon, coordonator ştiinţific program doctoral

Am convingerea că informaţia cuprinsă în această lucrare va sprijini gene-

Proiectul „Program doctoral performant pentru formarea resursei umane

C.S.III. dr. Mihaela ALUAŞ

Institutul de Cercetări Interdisciplinare a fost înfiinţat prin Hotărârea Sena-

I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13

II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64

III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN............................................................ 101

IV. SPECTROMETRUL IR........................................................................................... 134

V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160

VI. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ MAGNETICĂ NUCLEARĂ ......... 191

VII. MĂSURĂTORI TERMICE .................................................................................. 266

VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286

IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ ŞI DE TRANSMISIE ........... 327

X. MICROSCOPUL DE FORŢĂ ATOMICĂ ............................................................ 365

XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X ŞI

XII. SPECTROMETRUL DE REZONANŢĂ ELECTRONICĂ DE SPIN .......... 437

XIV. SISTEME DE ANALIZĂ A SUPRAFEŢEI SPECIFICE ŞI

Clonarea şi exprimarea genelor – o metodă excepţională

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a genelor în sistem

1. Prezentarea principiilor metodei de clonare şi exprimare a

Amplificarea genei de interes. O genă este considerat orice fragment

După fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dublează, iar după

De la aceste porţiuni dublu catenare formate între catena matriţă şi

5' 3' 5' 3'

5' 3' 5' 3'

5' 3' 5' 3'

3' 3' 5'

5' 3' 5' 3'

5' 3' 5' 3'

5' 3' 5' 3'

amorsă ce indică direcţia de sinteză

Figura 2. Reprezentarea schematică a primelor cicluri de PCR.

Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere inversă.

5′ G AATTC 3′ 5′ GGG CCC 3′

Capetele libere după tăierea de către enzimele de restricţie pot fi de 2

H infI (7 5) E coRI (605)

E coRV (5 8) H infI (616) B amH I (7 7 3)

H infI (32) H infI (461) E coRI (633) NcoI (7 7 7 ) H infI (942

Ligarea fragmentelor de ADN

PvuI (3737) BamHI (376)

AP r SphI (567) bla(AmR) Kpn I (6

f1 origin SalI (180)

bla (Ap) BamHI (199

ColE1 pBR322 origin

Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A – transformarea chimică cu

Electroforeza acizilor nucleici

Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei în gel de agaroză.

Electroforeza în gel de agaroză este utilizată pentru vizualizarea şi pu-

Verificarea moleculelor recombinate

Exprimarea genelor în sistem procariot

Purificarea proteinelor recombinate

Figura 11. Reprezentarea schematică a purificării de proteine recombinate prin cromatografie de