CROMOZOMII

Structurile celulare care contin ADN si cele care

intervin in realizarea functiilor sale (ribozomii si
centriolii) alcatuiesc Aparatul genetic.

Nucleul este elementul principal al aparatului
genetic.

In nucleu fiecare molecula de ADN se asociaza
cu proteine histonice, nonhistonice si mici
cantitati de ARN, formand un complex nucleo-
proteic denumit CROMATINA.

Interactiunile dintre ADN si proteine au un rol
structural in organizarea supramoleculara a
ADN si un rol functional in mecanismele care
regleaza expresia si replicarea genelor.

Cromozomii sunt elemente dinamice si
constante ale celulei cu functii genetice
esentiale.

Exceptand procariotele care au un singur
cromozom circular, la eucariote numarul
cromozomilor este caracteristic fiecarei
specii:


OM - 46
MAIMUTA - 42
CIMPANZEU - 48
BOVINE - 60
CAINE - 78
PISICA - 38
CAL - 64
SOARECE - 40
DROSOPHILA- 8

Numarul cromozomilor in celula nu respecta
gradul de evolutie biologica si complexitatea
structural functionala a speciei.

Ca urmare, numarul cromozomilor nu este un
criteriu taxonomic de stabilire a pozitiei
filogenetice, a gradului evolutiei biologice.

In lumea vie sunt specii inferioare ca evolutie
filogenetica dar cu un numar mare de
cromozomi ( exemplu crapul are 104
cromozomi pe cand omul 46 cromozomi).

ADN reprezinta cel mai important constituent
al cromozomilor eucariotici, in el gasindu-se
programul genetic al speciei respective.

Informatia genetica e codificata in
macromolecula de ADN, un polimer linear
care contine milioane de nucleotide. Un
milion de nucleotide inseamna un segment
de ADN cu o lungime de 3,4X10 la puterea 5
nm, adica 0,034cm.

In cromozomii eucariotelor, ADN-ul
reprezinta 13-16 %, ARN-ul 12-13 % iar
proteinele histonice si non histonice 68-72 %.
HISTONELE
Sunt proteine bazice cu o mare afinitate pt
ADN prezente la toate eucariotele.

Genele care codifica histonele au o structura
particulara ( fara introni ) si se afla localizate
pe cromozomii 1,6,12 . Se exprima in faza S a
ciclului celular, sincron cu replicarea ADN.

La eucariote se deosebesc 5 tipuri de
histone: H1, H2A, H2B, H3, H4. Cu exceptia
H1, celelalte tipuri (in special H3,H4) au o
structura stabila, bine conservata in evolutie.


H1 - bogata in lizina
H2A - bogata in leucina
H2B - bogata in serina
H3 - bogata in arginina si cisteina
H4 - bogata in arginina


Au rol structural in compactarea ADN-ului in nucleu,
intrand in alcatuirea nucleozomilor, particula
fundamentala din structura fibrelor de cromatina.

Au rol functional fiind implicate in reglarea expresiei
genelor (transcriptie).

Acetilarea histonelor determina activarea unor gene,
metilarea lor produce represie genica iar fosforilarea
lui H1 provoaca condensarea fibrilelor de cromatina
interfazica in cromozomi si declanseaza mitoza.

Experimental s-a demonstrat ca histonele
stabilizeaza dublul helix si inhiba sinteza ARN.





NON HISTONELE
Sunt proteine acide si neutre, heterogene si putin
abundente ( exceptie face grupul proteinelor HMG-
high mobility group).

Majoritatea au rol functional intervenind specific in
reglarea activitatii genelor ( ex. HMG participa se
pare la reglarea replicarii ADN).

Unele au rol structural formand matricea
cromozomilor.

Moleculele de ADN si histonele sufera spiralizari
succesive alcatuind un sistem ierarhizat de fibre de
cromatina.

La inceputul diviziunii, fibrele de cromatina se
spiralizeaza si se condenseaza suplimentar formand
cromozomii. La sfarsitul diviziunii, acestia se
despiralizeaza si persista in interfaza sub forma
filamentelor de cromatina.

Deci, cromatina si cromozomii sunt doua modalitati
diferite de organizare morfofunctionala a materialului
genetic in interfaza si diviziune
CROMATINA
Asocierea dintre ADN si proteine se numeste
cromatina.
Prezinta diferite grade de condensare si se prezinta
sub doua tipuri morfofunctionale distincte :
eucromatina si heterocromatina ( clasificare facuta
de E.Heitz in 1928).
Eucromatina:

este putin condensata si slab colorata
prezinta mult ADN nerepetitiv bogat in perechi de
baze G-C si proteine nonhistonice
reprezinta partea activa genetic a cromatinei
se replica precoce la inceputul fazei S
alcatuieste benzile R din cromozomi

Heterocromatina

este puternic condensata si intens colorata
prezinta ADN repetitiv bogat in A-T si histone

desi inactiva genetic indeplineste anumite functii
celulare precum : stabilizeaza centromerul si
telomerele cromozomului, intervine in desfasurarea
meiozei ( in sinapsa cromozomilor omologi ) si
probabil in diferentierea celulara

este de doua feluri : constitutiva si facultativa
(clasificare facuta de S.Brown in 1975).

Heterocromatina constitutiva

- Se gaseste constant sub forma condensata

- Nu contine gene functionale si este formata din ADN
inalt repetitiv ( ADN satelit)

- Se gaseste in regiunea centromerului, pe bratul lung
al cromozomului Y, pe bratele scurte ale
cromozomilor acrocentrici si in constrictiile
secundare

- Alcatuieste benzile C din cromozomi

Heterocromatina facultativa

- Variaza la celule / organisme diferite: in unele
celule, anumite parti sau gene din
cromozomi pot fi active, in alte celule,
aceleasi structuri pot sa nu functioneze fiind
sub forma de heterocromatina

- Aceasta heterocromatinizare poate fi limitata
la un anumit segment din cromozom sau
poate cuprinde tot cromozomul ( exemplu
tipic la sexul feminin cand unul din cei doi
cromozomi X este inactiv formand
corpusculul sexual X).

NUCLEOZOMUL

Primul nivel de organizare supramoleculara a ADN
(structura primara a cromozomului) este filamentul
cu nucleozomi cu diametrul de 11 nm.

Nucleozomul (super helixul cromatinian) este
alcatuit dintr-o secventa de ADN (de 146 pb) care se
infasoara de aproximativ doua rotatii complete ( 1 tur
si ) in jurul unui miez histonic format din 8 histone
(cate 2 molecule din H2A, H2B, H3, H4).

Nucleozomii sunt legati intre ei printr-un segment de
ADN liber ( 60 pb) formand un filament asemanator
unui sirag de margele. Aceasta structura
(mentinuta strans de histona H1 care leaga doi
nucleozomi vecini) realizeaza o impachetare a ADN-
ului de circa 10 ori.

Dimensiunile nucleozomilor depind de organism,
tesut sau de starea de activitate a genomului celular
( exemplu : cand ADN-ul se replica, nucleozomii se
deschid pentru ca informatia genetica sa devina
accesibila ).

Nucleozomul contine cantitati aproximativ egale de
ADN si histone. Masa moleculara a nucleosomului
este de cca 262 000 de daltoni, fiind alcatuita astfel :
H1 = 24000
H2A X 2 = 28000
H2B X 2 = 28000
H3 X 2 = 30000
H4 X 2 = 22000
Deci in total histonele reprezinta 132000 de daltoni si
ADN diferenta de 130000 de daltoni ( cca 200 pb).
SOLENOIDUL
Este al doilea nivel de organizare ( structura
secundara sau super-super-helixul) sau fibra de
cromatina de 30 nm.
Acesta rezulta prin spiralizarea filamentului cu
nucleozomi. Aceasta structura ( cu pasul de 6
nucleozomi) este stabilizata de histona H1 si
realizeaza o compactare de 5 ori.
In solenoid zonele spiralizate alterneaza cu zone
nespiralizate unde se pot fixa o serie de proteine
specifice. Totodata prin aceasta noua spiralizare,
diferite regiuni care pe ADN-ul liniar se aflau la
distanta, sunt apropiate favorizand interactiunile
genice.
BUCLA CROMOZOMICA

Este al treilea nivel de organizare ( structura tertiara
a cromozomului) care rezulta prin plierea fibrei de
cromatina de 30 nm in bucle laterale de lungimi
diferite ( 20-100 Kb), formandu-se fibra cu diametrul
de 300 nm.

Buclele au o dispozitie helicoidala fiind dispuse in
rozete hexametrice.

Dispunerea bucleiforma a fibrei polisolenoidice si
conservarea buclelor in cromozomii metafazici sunt
determinate de prezenta proteinelor non histonice
Sc1 si Sc2 ( scaffold)

Se considera ca fiecare bucla ar putea fi o unitate
functionala, de transcriptie si replicare.

STRUCTURA CUATERNARA

Este al patrulea nivel de organizare a cromozomilor
la eucariote

Dupa dispozitia bucleiforma a fibrei nucleoproteice
urmeaza un proces de hipercondensare a ADN-ului.

Prin spiralizarea fibrei de 300 nm, care are loc in
interfaza, ia nastere fibra de 700 nm care corespunde
diametrului unei cromatide.

Fiecare cromatida contine o singura molecula de
ADN.


Buclele anterior descrise se vor rasuci suplimentar
in metafaza. Intr-o rasucire de 360 apar aproximativ
30 de rozete hexametrice avand drept corespondent
banda G de pe cromozomii umani.

Numarul de rasuciri complete depinde de cantitatea
de ADN/cromozom ( ex. la cr 1 ar fi intre 29-33 de
asemenea rotatii).

In procesele de rasucire participa in jur de 30 de
proteine non histonice HMG, MARs ( matrix
associated regions) sau SARs ( scaffold associated
regions). Astfel molecula de ADN sufera o
compactare de 10000 ori.


NUCLEOZOMUL
CROMOZOMII B
Sunt numiti si cromozomi aditionali
complementului normal de cromozomi
(cromozomi supranumerari)
Au fost identificati la peste 1000 specii de plante
si 260 specii de animale
Indivizii care au cromozomi B nu se deosebesc
fenotipic de indivizii conspecifici lipsiti de
prezenta acestor cromozomi
Se numesc B, deoarece prezenta lor nu este
indispensabila pentru cresterea, dezvoltarea si
reproducerea normala a organismelor
Caracteristicile cromozomilor B
Morfologie diferita in comparatie cu cromozomii
A (cromozomi esentiali)
Talie foarte mica
Contin o cantitate mai mare de heterocromatina
constitutiva
Nu sunt omologi cu cromozomii A normali si nu
se cupleaza cu acestia in timpul meiozei sau
mitozei
Se mostenesc nemendelian la descendenti
Nu contin gene indispensabile dezvoltarii si
activitatii celulare
Efectul lor este cumulativ
Ca origine, provin din cromozomii A care au
suferit o serie de deletii repetate, ce au dus la
vidarea de ADN a cromozomului initial si
reducerea considerabila a talie
Datorita transmiterii nemendeliene, nr.
cromozomilor B variaza intre indivizii conspecifici
( uneori se constata ca un individ poate prezenta
mai multe populatii celulare care difera intre ele
prin numarul de cromozomi B).
Replicarea cromozomilor umani
In 1957 Taylor a demostrat ca in stadiul S
interfazic , cromozomii se replica conservativ

Replicarea cromozomilor este legata direct de
replicarea semiconservativa a ADN-ului si de
dublarea cantitatii de histone

Exista mai multe metode: Taylor ( 1957, folosiind
timidina tritiata; substanta radioactiva ); Dutrilaux
si Latt ( 1973, folosiind 5-brom-dezoxiuridina,
BrdU)
Experimentul Taylor
Se cultiva plante de Vicia Faba in mediu cald
bogat in timidina tritiata, timp de 8 ore (timp
necesar pentru o replicare)
Aceasta v-a fi incorporata in ADN-ul cromozomial
in cursul replicarii acestuia
Se scot plantele din mediul radioactiv; se
recolteaza un esantion si se cultiva inca 8 ore pe
un mediu rece lipsit de precursori radioactivi
Esantionul recoltat ( generatia nr. 1) se trateaza cu
colchicina si se face analiza autoradiografica a
cromozomilor
Dupa introducerea in mediul rece, la fiecare 8 ore
se recolteaza si se examineaza cite 1 esantion
(generatiile nr.2 si 3)

Concluzii
Primul esantion:
- toate metafazele marcate
- toti cromozomiii din placa metafazica prezinta ambele
cromatide marcate cu timidina tritiata
Al doilea esantion:
- toate metafazele marcate
- toti cromozomi marcati,prezentand o cromatida marcata si
una nemarcata
Al treilea esantion:
- 1/2 din cromozomi marcati si 1/2 nemarcati
- cromozomii marcati au o cromatida marcata si una
nemarcata
Aceste rezultate sunt posibile doar daca replicarea
cromozomilor este semiconservativa ca si replicarea
ADN-ului
Analiza cromozomilor
Metode citogenetice de rutina: folosesc culturi de limfocite
din sangele periferic ( este produsul cel mai accesibil
pentru studiu)

Metode speciale: folosesc culturi din alte tipuri celulare
(maduva osoasa, fibroblaste obtinute prin biopsii de piele,
celule fetale recoltate prin amniocenteza sau biopsie de
trofoblast). Dezavantaj: prelevare mai dificila si timp mai
lung de cultura

Metode directe (fara cultura): se aplica in anumite situatii
tesuturilor care se divid activ (maduva osoasa in leucemii,
tumori solide, vilozitati coriale). Avantaj: rezultat rapid (3-
12 ore). Dezavantaj: nr. metafazelor e variabil si calitatea
cromozomilor este mediocra
Tehnici de analiza cromozomiala
Tehnici de generatia I (1956):

- cromozomii obtinuti sunt uniform colorati

- au putine repere pentru identificarea lor

- tehnica e limitata la diagnosticul aneuploidiilor si
mozaicurilor cromozomiale, a situsurilor fragile,
a rupturilor si polimorfismului cromozomial
Tehnici de generatia II
Sunt tehnici de bandare a cromozomilor
metafazici (bandare G,Q,R,T,C,N)
Folosiind o serie de tratamente si coloratii
speciale a ADN-ului se vizualizeaza pe
cromozomi o serie de benzi alternative, intens si
slab colorate
Se evidentiaza ~ 300-400 de benzi pentru un set
haploid de cromozomi metafazici
Permit identificarea precisa a fiecarui cromozom
precum si caracterizarea majoritatii anomaliilor
cromozomiale
Tehnici de generatia III
Sunt tehnici de inalta rezolutie
Studiaza cromozomii in primele faze ale
diviziunii cind sunt mai putin condensati
Se obtin intre 650-850 de benzi
corespunzatoare prometafazei sau profazei
Fiecare banda corespunde la 20-30 de gene,
aceasta fiind limita maxima de rezolutie in
analiza citogenetica conventionala
Nu este o tehnica de rutina, se efectueaza cind
exista suspiciunea de modificari mici (ex.
Microdeletii)
Tehnici de generatia IV (1991)
Sunt tehnici de citogenetica moleculara

Folosesc sonde de ADN monocatenar,
specifice unui anumit cromozom, regiuni
cromozomice sau a unor gene cu
localizare cunoscuta

Sondele se fixeaza (hibridizeaza) prin
complementaritate in aceste situsuri tinta
Pentru a fi evidentiate dupa hibridizare, sondele
sunt marcate cu fluorocrom (vizibil la
microscopul cu lumina UV)

De aceea tehnica se numeste hibridizare
fluorescenta in situ sau FISH (Fluorescence In
Situ Hybridization)

FISH e o metoda performanta avand rezolutia
de citeva megabaze, dar este dificila si
scumpa.Se foloseste pentru suspiciunea de
translocatii criptice, deletii telomerice si unele
microdeletii/microduplicatii