INTRODUCERE

Imunologia studiaza, n primul rnd, funcia de aparare a organismului uman i animal, c are face parte din categoria funciilor de relaie i este eseniala pentru supravieuire. Sistemul imunitar este esenial pentru supravieuirea organismelor multicelulare, d atorita agresiunii permanente a agenilor infecioi (microorganisme i virusuri). Omul adult poarta pe suprafaa mucoaselor i a tegumentului, un numar uria de celule bacte riene (circa 1014), mai multe dect propriile celule, unele avnd potenialul de a inii a procese infecioase. Disfuncia severa congenitala sau dobndita a funciei imunitare este incompatibila cu viaa. Termenul de imunitate are o proveniena sociala: n Roma antica, persoanele scutite de impozite catre stat, erau considerate ?imune?. Sensul termenului s-a extins, ulterior desemnnd persoanele scutite de a suferi efectele infeciei cu ageni patogen i. Imunologia s-a nascut i s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei, bazndu-se p e cunotiinele i conceptele Patologiei i Biochimiei.

n sensul clasic, restrns al noiunii, Imunologia studiaza reactivitatea organismului animal i uman, consecutiv contactului cu agenii patogeni, mecanismele elaborarii raspunsului imun, precum i particularitaile esuturilor, celulelor i moleculelor care condiioneaza starea de imunitate. In sens clasic, noiunea de imunitate definete st area de nereceptivitate sau de rezistena a organismului faa de un agent patogen in fecios, n situaia n care sunt ndeplinite condiiile pentru apariia unei maladii infec e. Din acest motiv, Imunologia s-a dezvoltat ca un domeniu al Microbiologiei. n concepia clasica, s-a considerat ca activarea funciei imunitare are un efect excl usiv benefic, protector pentru organism. n concepia moderna, funcia imunitara se definete ca o proprietate biologica eseniala a organismului uman i animal, care consta n capacitatea de a diferenia rapid i speci fic, substanele proprii de cele straine.

Sistemul imunitar este tolerant faa de substanele proprii, deoarece ?a nvaat? sa le recunoasca n timpul vieii embrionare, dar este dotat cu proprietatea de a recunoate i de a diferenia prompt substanele straine, faa de care se activeaza i le ndeparteaz din organism. Tolerana imunitara este rezultatul unui proces de selecie a clonelor de limfocite, selecie ce are loc n perioada dezvoltarii embrionare a limfocitelor, ele fiind ce lulele efectoare ale raspunsului imun. Selecia consta n eliminarea clonelor de lim focite potenial autoreactive (potenial reactive faa de moleculele proprii) Componentele chimice proprii organismului, pe care sistemul imunitar le tolereaz a, sunt incluse n noiunea de ?self? (self, englez = propriu), iar cele straine, ca re se abat de la structura chimica programata genetic a organismului, poarta den umirea de substane nonself sau antigene. Astfel, funcia imunitara este o funcie bio logica eseniala, prin intermediul careia organismele difereniaza prompt i cu mare s ensibilitate, componentele self de substanele nonself.

Funcia imunitara are un rol determinant pentru pastrarea homeostaziei mediului in tern i a individualitaii chimice a fiecarui organism, prin faptul ca sistemul imun itar recunoate i tolereaza moleculele proprii, dar se activeaza la contactul cu su bstanele straine care se abat de la programul biochimic tolerat. Dupa ce nvaa sa tolereze self-ul, chiar din perioada dezvoltarii embrionare, funcia imunitara realizeaza un permanent ?control de calitate? a moleculelor self. Aa cum aparatul genetic asigura stabilitatea i integritatea unei specii ca sistem biologic, sistemul imunitar asigura pastrarea homeostaziei biochimice a organism ului. Funcia imunitara este mediata de molecule cu rol de receptori de pe suprafaa limfo citelor i de molecule solubile n umorile organismelor.

Obiectul de studiu al Imunologiei s-a diversificat odata cu progresul general al tiinelor biologice i n special, odata cu aprofundarea cunoaterii funciei de aparare. cepnd din anii ?60, interesul tiinific pentru Imunologie a crescut considerabil din doua motive: 1) n primul rnd s-a demonstrat ca funcia imunitara este eseniala pentru organism, in suficiena sa marind riscul infeciilor cu microorganisme patogene sau potenial patog ene, iar disfuncia imunitara severa este incompatibila cu viaa. 2) S-a demonstrat ca activarea funciei imunitare nu este totdeauna benefica pentr u organism, ci uneori, stimularea ei determina leziuni tisulare severe, chiar ir eversibile, asociate cu starile de hipersensibilitate sau iniiaza evoluia unor sta ri patologice grave, ca de exemplu, maladiile autoimune. Exemplul clasic este of erit de infecia cu Mycobacterium tuberculosis sau cu M. leprae. Leziunile tisular e, materializate n existena granuloamelor, se datoreaza chiar raspunsului imun, ca re este aa de amplu nct produce manifestarile patologice. Starile de hipersensibilitate definesc o stare de reactivitate imunitara crescut a i se caracterizeaza prin aceea ca, la primul contact cu o substana nonself, nu s e produce un raspuns imun detectabil, ci organismul dobndete o stare speciala de s ensibilizare imunitara faa de un antigen. La contactul secundar ulterior, chiar c u cantitai foarte mici ale antigenului sensibilizant, organismul raspunde cu mani festari patologice de intensitai variabile, al caror rezultat final poate fi fata l. Aa se ntmpla n starile de hipersensibilitate (alergii) la polen, la diferite medi camente (de exemplu, penicilina), la veninul insectelor sau la diferite substane alimentare. Modificarile patologice consecutive alergiilor pot fi locale sau gen eralizate. Un domeniu vast, n continua expansiune, dar relativ recent al Imunologiei l consti tuie maladiile autoimune. In esena, maladiile autoimune semnifica ntreruperea star ii de tolerana perfecta pe care sistemul imunitar o manifesta faa de componentele self. Datorita unor stari fiziologice legate de procese de mbatrnire, unor procese infecioase, datorita unor procese patologice degenerative sau ca urmare a utiliz arii substanelor medicamentoase, n organism se produc modificari chimice tisulare care sunt detectate de celulele sistemului imunitar. Consecina este declanarea unu i raspuns imun faa de componentele self modificate chimic. Astfel se iniiaza un co nflict autoimun, n cursul caruia sistemul imunitar genereaza efectorii sai ? celu le activate i molecule ? care recunosc specific moleculele self modificate. Respingerea grefelor de esuturi i organe este consecina activarii funciei imunitare. Antigenele esutului grefat, solubile sau fixate pe suprafaa celulelor din grefa, activeaza limfocitele (celulele efectoare ale raspunsului imun). Autogrefele sun t totdeauna tolerate. n condiiile unei reactivitai imunitare normale, alogrefele i x enogrefele sfresc prin a fi respinse. Cu ct diferenele genetice i implicit biochimice ntre organismul donor i cel receptor de grefa sunt mai accentuate, cu att grefa es

te respinsa mai repede.

Etapele dezvoltarii Imunologiei ca tiina

Imunologia este o tiina relativ tnara, care a aparut iniial ca un domeniu a Microbio logiei, care la nceputurile sale a studiat mecanismele reaciilor de aparare a orga nismului uman i animal faa de agresiunea infecioasa. Imunologia a fost fundamentata de descoperirile lui Pasteur i Metchnikoff i pastreaza nca legaturi de esena cu dis ciplina mama - Microbiologia, dei astazi ea este una dintre ramurile cele mai imp ortante i mai dinamice ale tiinelor biologice. Apariia Imunologiei ca tiina a fost precedata cu milenii, de observaii empirice refe ritoare la faptul ca vindecarea unor maladii infecioase era urmata de o stare de rezistena permanenta la reinfecie sau cel mult de forme uoare de mbolnavire. Cu 2-3 secole .C., n China i India s-a observat ca unele maladii foarte grave (variola, pe sta, ciuma), lasa n urma o stare de rezistena permanenta la reinfecie sau cel mult, persoanele faceau forme foarte uoare de mbolnavire. n infecia variolica, apar leziuni caracteristice mai ales pe tegumentul feei. Mai nti apar vezicule mici, pline cu lichid clar, al caror coninut se tulbura datorita i nfiltratului celular i fac crusta, iar dupa vindecare, lasa o cicatrice ce se pas treaza toata viaa (varsat de vnt). S-a trecut la infectarea artificiala a persoane lor sanatoase n scopul declanarii unei mbolnaviri uoare, care sa instaleze starea de imunitate. Practica variolizarii prin prizarea pe nas a mojaratului de cruste u scate, recoltate de la cei trecui prin boala, era nsoita de infecii grave, datorita cantitaii mari de virus inhalat. n 1418, procedeul variolizarii a fost introdus n Anglia de Mary Wortley Montagu i s -a practicat o perioada, cu toate riscurile mbolnavirii cu severitate necontrolat a. Vaccinarea antivariolica a fost introdusa de E. Jenner (1796). Ca vaccin, el a u tilizat un virus de la bovine (cowpox). Metoda s-a bazat pe observaia empirica a rezistenei n cursul marilor epidemii de variola, a mulgatorilor care fusesera infe ctai cu virusul cowpox. Acesta, produce o infecie pustulara i fiind nrudit antigenic cu virusul variolei, confera protecie antivariolica. Vaccinarea persoanelor sana toase s-a facut cu lichidul recoltat din pustulele de pe ugerul vacilor. Perioada tiinifica a Imunologiei a fost inaugurata de L. Pasteur, prin descoperire a unor vaccinuri cu o larga aplicaie practica. Denumirea de ?vaccin? a fost data de Pasteur, n amintirea produsului recoltat de Jenner din leziunile de pe ugerul vacii. Denumirea s-a pastrat pentru toate produsele folosite n practica, pentru a crea o stare de rezistena preventiva faa de eventualul contact cu agentul patogen . Pasteur a fundamentat tiinific practica producerii i utilizarii vaccinurilor. El a demonstrat ca proprietaile biologice (patogenitatea i virulena) bacteriilor i virusu rilor patogene nu sunt fixe. In anumite condiii, aceste proprietai se pot diminua prin anumite artificii de tehnica, aa nct un agent virulent care de regula determin a o infecie mortala, poate fi transformat ntr-un agent care produce o infecie uoara, fara semne clinice, dar creeaza o rezistena foarte solida. Vaccinurile atenuate n deplinesc aceste deziderate. Pasteur a atenuat virulena agenilor patogeni prin dou a metode: prin nvechirea culturilor i prin cultivarea la temperaturi ridicate. Pas teur a descoperit trei vaccinuri: al holerei gainilor, al antraxului la ovine i a

l rabiei. Agentul patogen al holerei gainilor ? Yersinia pestis ? este o bacterie foarte v irulenta. Un inocul de cteva celule este suficient pentru a produce mbolnavirea i m oartea organismelor sensibile. Cultura virulenta de Yersinia, prin meninere la te mperatura camerei (nvechire) se atenueaza i dupa inoculare la gainile normale, nu mai produce mbolnavirea. Pasarile inoculate cu cultura bacteriana atenuata, devin rezistente la reinfecia cu o cultura virulenta, spre deosebire de pasarile lotul ui martor, care se mbolnavesc i mor. Cultura bacteriana veche a creat o stare de i munitate, adica a avut rolul unui vaccin. Atenuarea virulenei prin nvechirea cultu rii este un proces necontrolat i probabil se datoreaza modificarilor biochimice s au genetice ale celulelor, sub influena produselor de catabolism acumulate n mediu l de cultura sau se datoreaza epuizarii mediului n substanele eseniale pentru creter e. Agentul patogen al infeciei carbunoase (anthrax) este Bacillus anthracis, o bacte rie sporulata. Sporul se formeaza la 37o. Cultura bacteriana crescuta la 42o, i mo difica proprietaile biologice, pierde capacitatea de sporulare (devine asporogena ). Aceste modificari se nsoesc de pierderea progresiva a virulenei. Incubarea la 42 o este o modalitate a obinerii dintr-o cultura virulenta, a unei culturi cu virul ena progresiv atenuata pentru organismul gazda(oaie, iepure, cobai, oarece). Carbunele este o boala grava a oilor, ce se transmite i la om. Pasteur a imaginat o schema de vaccinare a ovinelor, ncepnd cu un inocul bacterian virulent pentru oa rece i continund cu inocul bacterian cu virulena mai mare. A creat o stare de imuni tate a ovinelor, carora le-a conferit rezistena la bacteriile foarte virulente. Agentul infecios al rabiei nu a fost evideniat de Pasteur. Autorul a utilizat esut nervos medular sau creier de la iepurele infectat experimental, pe care l-a modi ficat prin uscare n prezena potasei caustice. A obinut un vaccin care, administrat ct mai repede dupa mucatura animalului rabid, creeaza o stare de rezistena, n absena careia infecia rabica evolueaza invariabil spre moarte. Cercetarile lui Pasteur au pus bazele Imunologiei medicale i ale obinerii i utiliza rii pe baze tiinifice a vaccinurilor. A urmat o perioada n cursul careia s-au nregis trat progrese importante n obinerea i administrarea vaccinurilor.

Bazele conceptului imunitaii humorale au fost puse de Behring i Kitasato (1890), c are au evideniat anticorpii serici, dupa imunizarea animalelor de laborator. Seru rile imune pot fi folosite n scop terapeutic pentru a stopa sau a atenua evoluia u nei boli infecioase, cu condiia ca administrarea acestor seruri sa fie foarte prec oce. In 1923, Behring a organizat producia de seruri imune, preluata de Institutu l Pasteur din Paris (nfiinat n 1894) i apoi de Institutul Babe i de Institutul Cantac zino. n 1894, Pfeiffer a descris fenomenul de bacterioliza, demonstrnd ca serul sanguin al animalelor imunizate are proprietatea de a provoca liza celulelor bacteriene. El a demonstrat ca bacterioliza necesita doua componente: serul sanguin al anim alului imunizat i o picatura de ser proaspat de cobai. Procesul este foarte speci fic: serul produce numai liza celulelor bacteriene care au specificitate faa de a nticorpii serici. J. Bordet a evideniat ca fenomenul lizei se produce i n cazul hematiilor, daca sunt puse n contact cu serul sanguin de la iepurele imunizat cu hematii, la care se a dauga ser proaspat de cobai, n care se gasete complementul (alexina). Conceptul imunitaii mediate celular a fost formulat de Metchnikoff (1891). El a e vidniat ca n organism exista o serie de celule specializate, cu capacitatea de a r ecunoate celulele straine i de a le ngloba prin procesul de fagocitoza, care sunt d igerate i eliminate din celula fagocitara. Metchnikoff a facut observaii pe crusta

ceul Daphnia magna, ale carui celule fagocitare nglobeaza i digera sporii fungici (Monospora bicuspidata). Cnd infecia cu spori este masiva, capacitatea de aparare a organismului este depaita i gazda moare. Cele doua doctrine ale fenomenului imunitar, care s-au confruntat prin reprezent anii lor, au fost unificate de Wright (1903). El a demonstrat existena n ser a unor anticorpi naturali denumii opsonine, care acioneaza n cooperare cu fagocitele. n 1930, K. Landsteiner a evideniat o structura antigenica pe suprafaa hematiilor um ane i a stabilit existena sistemului antigenic ABO, precum i a normelor ce trebuie respectate n practica transfuziei de snge. Ramon (1925) a demonstrat ca unii ageni patogeni (ca de exemplu, al difteriei, al tetanosului) produc toxine foarte puternice. Aceste toxine au un potenial foarte ridicat: cantitai foarte mici de toxine sunt suficiente pentru a provoca moartea animalelor de experiena. Tratarea preparatului de toxina cu formol 4%o i meninerea amestecului la 39o pentru o perioada de timp, este urmata de pierderea completa a proprietailor toxice. Preparatul atoxic este inofensiv i poate fi administrat n cantitai relativ mari, fara sa determine efecte patologice. Preparatul atoxic i pas treaza proprietaile imunogene i induce o stare de rezistena a organismelor imunizat e. Sub aciunea combinata a formolului i temperaturii, toxinele difterica i tetanica au fost transformate n anatoxine. Cercetarile de biochimie(1930-1950) au permis elucidarea structurii moleculare a antigenelor, a imunoglobulinelor i a haptenelor. Studiul mecanismelor celulare ale proceselor imunitare (1950-1980) este marcat d e progresele biologiei moleculare i de interferena cu Virologia, Microbiologia, Bi ologia celulara, Biofizica, Biochimia, Genetica. S-a evideniat rolul esenial al li mfocitului n fenomenele imunitare, precum i rolul plasmocitelor n sinteza i secreia a nticorpilor. Mc Farlane Burnet (1959) a elaborat teoria seleciei clonale a raspunsului imun, i ar J.F.A.P.Miller (1960) a stabilit rolul esenial al timusului n dobndirea competene i funcionale a limfocitelor T. R. Good (1960) a evideniat rolul bursei lui Fabricius n geneza sistemului imunitar la pasari. J. Dausset (1954) a demonstrat ca pe suprafaa celulelor oricarui organism se gaset e o serie de molecule (antigene), care confera fiecarui organism o individualita te antigenica unica. Datorita acestor antigene, reaciile care sunt determinate de o grefa de esut sau de organ, pot evolua n mod diferit: ntre organismele foarte nru dite, grefa prinde foarte bine, iar o grefa ntre organisme cu diferene majore de o rdin genetic, produce o reacie de respingere, care este cu att mai rapida cu ct dif erenele antigenice sunt mai mari. Antigenele suprafeei celulare care confera indiv idualitate biochimica unica fiecarui organism, se numesc antigene de histocompat ibilitate. Evaluarea diferenelor celor doi parteneri (donor i receptor) n ceea ce p rivete moleculele de histocompatibilitate, este eseniala nainte de grefarea organul ui. Dupa 1970, studiul sistemului imunitar corespunde unei abordari integratoare. Du pa opinia lui N. K. Jerne (1985), ?imunologia i-a pierdut statutul de disciplina izolata, fiind pe cale de a fi absorbita de biologia clasica?. Dupa 1980, Imunologia s-a diversificat i s-a aprofundat, dar n acelai timp este mai unificata ca oricnd, sub imperativul numitorului comun al nelegerii funciei imunita re la nivel molecular. Abordarile moleculare vor sta la baza tuturor cercetarilo r viitoare, legate de funcia imunitara.

n perspectiva, orizontul de evoluie a Imunologiei se extinde asupra nelegerii genelo r codificatoare ale moleculelor efectoare i reglatoare ale raspunsului imun i ale mecanismelor aciunii lor. Astfel vom nelege diferenierea limfocitelor, activarea lor , mecanismele sintezei, secreiei, recircularii limfocitelor i mecanismele aciunii m oleculelor efectoare. Ar urma utilizarea cunotiinelor imunologice pentru prevenire a maladiilor cu substrat imunitar (alergii, maladii autoimune), pentru prevenire a respingerii grefelor de esuturi i organe i pentru imunoterapia neoplaziilor. Va f i o perioada a rentoarcerii aplicarii Imunologiei moleculare, la nivelul ntregului organism.

Diviziunile Imunologiei

Imunologia s-a nascut ca un domeniu al Microbiologiei i s-a dezvoltat ca un domen iu al Bacteriologiei medicale, cu care a ramas n raporturi de dependena pna catre a nul 1960. Treptat nsa, prin acumularea unui volum mare de date tiinifice care au de monstrat intervenia funciei imunitare i a reaciilor imune n numeroase fenomene normal e i patologice, Imunologia a devenit o tiina de sine statatoare. Consecina fireasca a implicarii funciei imunitare ntr-o multitudine de procese normale i patologice, a fost aceea ca din domeniul Imunologiei s-au desprins ramuri care, la rndul lor, tind sa aiba o existena autonoma. Imunobiologia este cea mai cuprinzatoare dintre ramuri. Ea studiaza fenomenele i munitare ca manifestari ale unei funcii biologice eseniale ? funcia de aparare. Stu diaza substratul biologic al raspunsului imun (celulele imunitare, originea i mec anismele diferenierii lor, factorii celulari i humorali care asigura diferenierea l or), mecanismele celulare i moleculare ale biosintezei anticorpilor, explica impl antarea celulelor tumorale i geneza cancerului clinic n condiiile aciunii efectorilo r sistemului imunitar. Studiaza mecanismele imunitare ale respingerii grefelor d e esuturi i organe, mecanismele reactivitaii imunitare n filogenie i ontogenie, precu m i bazele celulare i moleculare ale starilor de hipersensibilitate i ale maladiilo r autoimune. Imunochimia este o disciplina de grania ce aparine Imunologiei i Biochimiei, care s tudiaza funcia imunitara sub aspect biochimic. Preocuparea eseniala a constat n stu diul chimiei antigenelor i anticorpilor i al mecanismului lor de interaciune n reacia antigen-anticorp. Datele referitoare la structura chimica a antigenelor i antico rpilor au pus bazele Imunochimiei, dar ulterior, domeniul i-a largit sfera de act ivitate i studiaza urmatoarele aspecte: - factorii moleculari ai raspunsului imun i n special ai imunitaii mediate celular ; - moleculele de histocompatibilitate; - markerii antigenici specifici diferitelor populaii de celule limfoide; - moleculele cu funcie de receptor de antigen, pe suprafaa celulelor limfoide; - factorii de cooperare celulara n cursul elaborarii raspunsului imun (interleuc hine); - componentele complementului etc. Termenul de Imunochimie a fost introdus de chimistul suedez Arrhenius (1907). El

i-a intitulat astfel studiul cu privire la reaciile chimice care se produc n organ ismul uman i animal, dupa imunizare. Fondatorul Imunochimiei este P. Ehrlich. El a introdus metode cantitative n studiul reaciilor antigen-anticorp i a elaborat o t eorie generala asupra recunoaterii imune (teoria catenelor laterale sau a recepto rilor). Dupa 1950, Imunochimia s-a dezvoltat spectaculos, datorita descoperirilo r din domeniul biochimiei, datorita utilizarii unor metode fizico-chimice de ana liza a macromoleculelor i prin aplicarea acestora la domeniul Imunologiei. S-a na scut un set de metode, n esena biochimice, puse n slujba analizei moleculelor impli cate n funcia imunitara. Domeniul s-a numit analiza imunochimica i utilizeaza metod e care deriva din mbinarea tehnicilor fizico-chimice cu cele imunologice. Imunoch imia este deservita de metoda imunodifuziei, imunofluorescenei, RIA, ELISA, diali za la echilibru etc. Efectul utilizarii acestor metode de investigare a fost cun oaterea mecanismelor moleculare care stau la baza raspunsului imun, ndeosebi humor al i aplicarea n laboratorul clinic, a unor noi metode de diagnostic. n clinica, studiile de Imunochimie au propus noi metode de tratament, bazate pe i nteraciunea unor molecule cu rol de vehicul pentru anticorpi, cu receptorii unor celule inta (imunotoxine). Imunogenetica studiaza determinismul genetic al raspunsului imun: mecanismele ge netice care asigura diversitatea anticorpilor i a antigenelor de histocompatibili tate. Imunohematologia s-a nascut odata cu stabilirea diferenelor antigenice ale eritro citelor umane i cu precizarea grupelor sanguine (K. Landsteiner, 1901) i s-a dezvo ltat dupa ce s-a stabilit existena unor diferene fine ntre diferite tipuri de eritr ocite i, n special, dupa descoperirea factorului Rh i a rolului sau n patologia sarc inii. Imunologia medicala umana i veterinara s-a dezvoltat n trei direcii: - direcia profilactica, orientata spre descoperirea i producerea unor noi vaccinur i, capabile sa creeze o stare de rezistena. Ea se preocupa, de asemenea, de schem ele de vaccinare, de posibilitatea asocierii diferitelor vaccinuri i de posibilit atea stimularii raspunsului imun cu ajutorul adjuvanilor; - direcia terapeutica studiaza posibilitatea obinerii serurilor imune. Ele conin an ticorpi i se administreaza organismelor care prezinta riscul mbolnavirii prin infe cii; - direcia diagnosticului studiaza posibilitatea identificarii agenilor etiologici ai diverselor maladii infecioase, cu ajutorul reactanilor imunologici (seruri imun e i antigene). Imunopatologia studiaza fenomenele imunitare n relaie cu diferite maladii. In mult e situaii patologice, raspunsul imun (activarea funciei imunitare) are efecte defa vorabile, prejudiciante asupra organismului. Raspunsul imun se instituie drept c auza, dar n special ca mecanism, pentru producerea unor manifestari patologice. A feciunile generate de activarea sistemului imunitar (imunopatii) se grupeaza n dou a categorii: - starile de hipersensibilitate(alergiile); - maladiile autoimune. Imunopatologia studiaza, de asemenea, imunodeficienele (nascute i dobndite), imunita tea de transplant i imunitatea antitumorala, raspunsul imun n maladiile infecioase virale i bacteriene, precum i n maladiile parazitare. Serologia (Imunoserologia) s-a dezvoltat ca o ramura practica, dedicata studiulu

i tehnicilor de explorare a reaciilor imune in vitro.

p 8 p p

CARACTERIZAREA GENERALA A ANTIGENELOR

GR. MIHAESCU, CAMELIA MIHAESCU

Convenional, antigenele se definesc ca substane straine, care, consecutiv introduc erii n organismul uman sau animal pe o cale parenterala (alta dect cea digestiva), declaneaza sinteza anticorpilor cu care se combina specific. Definiia este incomp leta din cteva motive. 1. Calea digestiva de administrare a antigenelor nu exclude totdeauna posibilita tea declanarii raspunsului imun. Pentru agenii infecioi care se multiplica n tractul digestiv, administrarea orala asigura o buna imunizare (de exemplu, vaccinul pol io se administreaza oral, dei calea parenterala este mai eficienta). 2. Unele substane nonself sunt n mod eronat considerate ca neantigenice, deoarece, dei in vivo stimuleaza reactivitatea imunitara i induc sinteza unei cantitai mici de anticorpi, in vitro nu produc reacii vizibile antigen-anticorp. 3. Faa de unele antigene, organismele nu declaneaza raspunsul imun, ci manifesta o stare de tolerana. 4. Unele molecule n stare nativa nu induc un raspuns imun, ci numai dupa cuplarea covalenta cu o molecula purtator. Molecula nativa i pastreaza proprietatea de a s e combina specific cu anticorpii sintetizai. Astfel de molecule se numesc haptene . J. F. Bach (1976) definete antigenele ca fiind molecule care, consecutiv introduc erii n organism pe o cale adecvata, induc un raspuns imun materializat prin proli ferarea celulelor limfoide i sinteza moleculelor de recunoatere (anticorpi i recept ori celulari), cu care se combina in vivo i in vitro. Modelul general de structura a unui antigen O molecula antigenica este alcatuita din doua componente; - componenta purtator (?carrier?), care corespunde celei mai mari pari a molecul ei:

- gruparile determinante de specificitate sau epitopi, localizate pe suprafaa com ponentei purtator i formate din secvene specifice de monomeri. Epitopii, prin secv ena proprie a monomerilor i prin configuraia spaiala specifica, confera individualit ate chimica i specificitate antigenica moleculei nonself. Gruparile determinante de specificitate sunt echivalenii moleculari i funcionali ai haptenei.

Gruparile determinante de specificitate se gasesc n numar variabil pe suprafaa pur tatorului i pot fi identice att n ceea ce privete compoziia chimica, ct i configura aiala (ca n cazul antigenelor polizaharidice cu epitopi repetitivi) sau sunt difer ite, att ca secvena a monomerilor ct i n privina configuraiei spaiale. Fig. 1. Modelul general de structura a unui antigen. Cea mai mare parte a oricar ei molecule antigenice este reprezentata de gruparea carrier, pe care sunt local izai epitopii cu diferite configuraii spaiale, stimulatori ai reactivitaii imunitare . Unii epitopi pot fi unici, iar alii sunt multipli. Uneori, epitopii stimuleaza sinteza anticorpilor cu afinitai diferite. Proprietaile definitorii ale antigenelor n studiile experimentale asupra imunogenitaii unor molecule sintetice, M. Sela (19 69) a descris doua proprietai eseniale ale antigenelor: 1. Imunogenitatea sau antigenitatea este proprietatea unui antigen complet, form at din gruparea carrier i epitopi, de a declana un raspuns imun, humoral sau celul ar, ori de cte ori patrunde n organism pe o cale adecvata. Proprietatea de imunoge nitate este asociata cu gruparea carrier a moleculei de antigen, grupare care ntr -o oarecare masura influeneaza i specificitatea anticorpilor. 2. Specificitatea definete capacitatea antigenului ntreg sau numai a epitopilor sa i de a se combina specific cu anticorpii sau cu receptorii celulari a caror sint eza a fost indusa. Proprietatea de specificitate este dependenta, n primul rnd de epitopi, dar este influenata ntr-o masura mai mare sau mai mica i de gruparea carri er. Noiunea de imunogen, uneori, este distincta de aceea de antigen. Noiunea de imunog en este mai restrictiva i semnifica proprietatea unei substane, n stare nativa, de a stimula raspunsul imun, fara sa necesite conjugarea cu o alta molecula. Noiunea de antigen este mai larga, deoarece desemneaza molecule nonself care sunt imunogene n stare nativa sau devin imunogene dupa conjugarea cu o molecula purta tor. Antigenul poate fi uneori inacapabil, n forma sa nativa, sa stimuleze raspun sul imun.

CLASIFICAREA I IMUNOGENITATEA ANTIGENELOR

Dupa originea lor, antigenele sunt exogene i endogene. Antigenele exogene sunt cele mai numeroase i pot fi mparite n trei categorii: 1) nat urale; 2) artificiale; 3) sintetice. Antigene naturale Antigenele naturale formeaza categoria cea mai cuprinzatoare. Aici sunt incluse toate macromoleculele naturale din virusuri, microorganisme, fungi, plante i anim ale. Dupa dimensiuni se disting antigene moleculare (?solubile?) i antigene corpuscula

re. Antigenele moleculare (solubile) constituie gruparea cea mai numeroasa, care inc lude toate tipurile de macromolecule: proteine, polizaharide, lipide, acizi nucl eici. Antigenele corpusculare (?insolubile?) sunt reprezentate de virusuri i de celule (procariote i eucariote). Antigenele moleculare Cele mai studiate antigene sunt proteinele i polizaharidele, la care se adauga co njugatele: glicoproteine, nucleoproteine, lipoproteine, peptidoglicani, glicolip ide. Proteinele sunt cele mai numeroase i mai importante antigene moleculare. Diversit atea lor chimica, generata de variaia secvenei de aminoacizi este uriaa. Practic, f iecare tip de molecula proteica nonself din lumea vie este un antigen pentru org anismul animal i uman, deoarece are o secvena unica de aminoacizi, care determina o structura secundara i tridimensionala proprie i implicit, existena unor epitopi p roprii ca secvena a aminoacizilor i conformaie spaiala. Imunogenitatea este o proprietate generala a proteinelor, a celor cu rol structu ral (colagenul, cheratina, elastina, fibroina viermelui de matase, proteinele ca psidei virale), a celor cu rol funcional (miozina, actina, albumina, hemoglobina, mioglobina, enzime, hormoni, imunoglobuline), a celor cu rol de depozit de amin oacizi(ovalbumina, cazeina, gliadina ? din seminele de gru). Toate proteinele i pol ipeptidele cu o greutate moleculara mai mare de 1000 D sunt imunogene, ntr-o masu ra mai mare sau mai mica. De cele mai multe ori, pentru antigenele proteice, nu se face distincia dintre ep itopii inductori ai raspunsului imun i gruparea carrier, deoarece proteinele pose da un spectru continuum de determinani antigenici, ce corespund unor secvene discr ete ale suprafeei moleculare localizate n zonele cele mai expuse contactului cu re ceptorii sistemului imunitar. Antigenitatea moleculelor globulare este determina ta adeseori, de configuraia lor spaiala, rezultata din plierea tridimensionala. Pe ntru cele mai multe proteine globulare (mioglobina, hemoglobina, lizozimul, ribo nucleaza etc.), aproape toi determinanii antigenici sunt conformaionali, adica sunt rezultatul plierii spaiale a moleculei, iar alii sunt secveniali, adica sunt repre zentai de o secvena particulara de aminoacizi. Moleculele proteice fibrilare (cher atina, colagenul, fibroina) au configuraii mai simple dect cele globulare, catenel e lor fiind aranjate sau rasucite pe o singura dimensiune. Determinanii antigenic i ai acestor proteine sunt secveniali, formai din 3-6 aminoacizi. Sistemul imunitar al unui organism recunoate un numar limitat de determinani antig enici ai unei molecule proteice. Epitopii, conformaionali sau secveniali, care sti muleaza raspunsul imun in vivo, iar in vitro induc proliferarea limfocitelor, se numesc epitopi dominani. O parte a determinanilor antigenici ai unei molecule nat ive, cel mai adesea, sunt neimunogeni (imunosilenioi), nefiind accesibili sistemul ui imunitar al organismului, dar se pot exprima ntr-un anumit set de condiii de im unizare (gazda, adjuvant etc.). Acetia sunt epitopi interni ai proteinelor globul are. Un determinant intern poate fi silenios n molecula nativa, dar devine imunost imulator dupa clivarea enzimatica a moleculei, in vivo sau in vitro. De aceea, M . Sela a recomandat utilizarea termenului de ?grupare imunodominanta?, pentru ep itopul sau epitopii care se exprima n anumite condiii(gazda, adjuvant, cale de adm inistrare) i determina specificitatea raspunsului imun. Fig.2. Epitopii dominani sunt localizai la suprafaa moleculei globulare. Epitopii s ubdominani devin accesibili dupa clivarea moleculei n etapa prelucrarii n macrofag, iar epitopii criptici sunt inaccesibili fenomenului de recunoatere imunitara.

Imunogenitatea antigenelor proteice se modifica n diferite condiii. Denaturarea moleculelor native sub aciunea agenilor chimici i a caldurii, modificar ea configuraiei moleculei sub aciunea agenilor reducatori sau hidroliza enzimatica, modifica imunogenitatea. Anticorpii specifici faa de proteina nativa precipita s lab sau de loc proteina denaturata termic sau chimic. Formaldehida i glutaraldehida sunt ageni de legare ncruciata a moleculelor proteice, constituind reele multimoleculare stabile. Aceti ageni produc denaturarea proteine lor i modifica funciile celor cu activitate biologica (toxine, enzime). Astfel, e xotoxinele tratate cu formaldehida, i pierd proprietaile toxice, dar ramn imunogene. Formaldehida i glutaraldehida se folosesc pentru conservarea antigenelor cu greu tate moleculara mica (peptide), dar sunt mai puin utilizate pentru conservarea pr oprietailor antigenice ale moleculelor mari. Agenii chimici de legare ncruciata modi fica imunogenitatea moleculelor proteice prin schimbarea conformaiei moleculei i m ascarea epitopilor sau prin modificarea chimica a aminoacizilor epitopului. Denaturarea semnifica deplierea structurii rasucite a moleculelor proteice i are loc prin modificarea pH, prin ncalzire, prin reducerea legaturilor S-S sub aciunea ureii i a beta-mercaptoetanolului sau a acidului performic. Prin denaturare, pro teina i pierde nu numai funcia biologica, dar i modifica specificitatea antigenica. D e exemplu, cele 4 puni S-S ale RN-azei, ntre resturile de cistina, sunt reduse de mercaptoetanol i transformate n 8 resturi de cisteina, cu pierderea totala a activ itaii enzimatice. Anticorpii faa de RN-aza pancreatica bovina nativa nu precipita moleculele de RN-aza denaturata prin reducerea legaturilor S-S. Invers, anticorp ii faa de RN-aza denaturata, nu precipita RN-aza nativa. Modificarea specificitaii anticorpilor sugereaza ca reducerea legaturilor S-S determina pierderea epitopi lor conformaionali. Proteinele denaturate reverseaza greu la forma nativa, chiar prin restabilirea c ondiiilor de mediu. Hidroliza enzimatica modifica configuraia spaiala a moleculelor proteice native i d iminua imunogenitatea lor, cu att mai mult cu ct fragmentele rezultate au dimensiu ni mai mici. Prin clivare enzimatica se anuleaza imunogenitatea epitopilor confo rmaionali i se releva epitopi care n molecula nativa au statutul de epitopi criptic i. O atenie speciala s-a acordat studiului imunogenitaii unor proteine ale caror prop rietai biologic-active sunt uor de evaluat: enzime, inhibitori enzimatici, hormoni proteici, toxine, imunoglobuline (n calitatea lor de antigene), proteine ale cap sidei sau ale nveliului viral. Enzimele sunt antigenice, indiferent de originea lor. Reacia moleculelor de enzim a cu anticorpii specifici a constituit o modalitate de determinare a poziiei epit opilor. Anticorpii faa de diferii epitopi ai moleculei de enzima modifica n grade f oarte diferite activitatea ei catalitica. Daca anticorpii sunt specifici faa de e pitopi localizai la nivelul situsului activ al enzimei, molecula i pierde activitat ea faa de substrat, deoarece legarea anticorpilor la situsul activ inhiba competi tiv legarea moleculelor de substrat. Gradul de inhibiie a activitaii enzimatice es te cu att mai accentuat, cu ct molecula este mai mare. Efectul inhibitor al antico rpilor nu se produce daca enzima a legat deja substratul specific. Daca gruparil e determinante de specificitate ale moleculei de enzima sunt situate n afara situ sului catalitic, activitatea enzimei este parial inhibata, datorita modificarilor conformaionale care survin dupa reacia antigen-anticorp, sau ramne intacta. Foarte rar, complexul enzima-anticorp are un efect catalitic superior, comparativ cu e nzima nativa. Hormonii sunt molecule slabimunogene, datorita uniformitaii relative a structurii

lor chimice n regnul animal. Anticorpii specifici faa de majoritatea hormonilor p roteici se obin prin asocierea lor prealabila cu adjuvantul Freund. Imunogenitate a hormonilor este ntr-o relaie directa cu gradul deosebirilor chimice existente ntr e hormonul exogen i hormonul produs de organismul receptor. Consecina este sinteza anticorpilor antihormon. Proprietaile antigenice ale insulinei sunt bine cunoscute, datorita utilizarii cl inice a hormonului. Molecula de insulina este alcatuita din doua catene polipept idice, cu un numar total de 51 de aminoacizi: 21 ai catenei A i 30 ai catenei B. Cele doua catene sunt reunite prin puni S-S. Structura moleculelor de insulina de la diferite specii este foarte asemanatoare, 47 din cei 51 de aminoacizi fiind identici. Deosebirile se gasesc n catena A pentru aminoacizii 8, 9 i 10 (la bovine Ala, Ser, Val, la om sunt Thr, Ser, Ile, iar la ovine Ala, Gly, Val). In catena B, diferena este limitata la aminoacidul C-terminal. Aceste mici diferene ale sec venei de aminoacizi nu modifica funcia hormonului. De aceea, insulina, indiferent de proveniena, este la fel de eficienta pentru tratamentul diabetului uman. Micil e diferene de secvena, n general, nu sunt sesizate de organismul receptor. Totui, du pa administrare prelungita, organismele receptoare cu reactivitate imunitara mai nalta, sintetizeaza anticorpi anti-insulina. Polizaharidele, dei au complexitate structurala relativ mare, condiionata de multi tudinea posibilitailor de legare a atomilor de carbon, sunt molecule slabimunogen e n stare nativa, comparativ cu proteinele. Antigenitatea lor este conferita de s uccesiunea unitailor componente, de configuraia spaiala a moleculei i de greutatea m oleculara. Cele cu greutai mai mici de 50 kD nu sunt imunogene. Polizaharidele su nt antigene cu epitopi secveniali repetitivi i cel puin uneori, n funcie de originea polizaharidului i de specia imunizata, sunt imunogeni. Din punctul de vedere al structurii moleculare, se disting doua tipuri de poliza haride: a) cele care au o catena centrala pe care se insera ramificaiile laterale ; b) polizaharide lipsite de o catena centrala, iar ramificaiile sunt dispuse ale atoriu, fara nici o simetrie. Rolul catenelor centrale n conferirea imunogenitaii este controversat, dar ramificaiile laterale au o importana deosebita pentru deter minarea specificitaii antigenice a polizaharidelor. Din punctul de vedere al comp oziiei chimice pot fi homo- sau heteroplizaharide, iar n ceea ce privete sarcina, p ot fi neutre sau ncarcate. Oligo- i polizaharidele pot dobndi o structura teriara (g lobulara). Uneori, configuraia spaiala a polimerului glucidic este determinanta pe ntru specificitatea sa antigenica. Schimbarile conformaionale ale polizaharidelor se produc mai uor dect ale proteinelor, pentru ca au bariere energetice scazute. Pentru polizaharide, denaturarea este practic necunoscuta, ceea ce le confera st abilitate. Daca imunogenitatea polizaharidelor native este slaba, adeseori ele s e comporta ca haptene, adica devin antigenice dupa cuplarea cu un purtator prote ic, rezultnd lectine, cu o foarte larga distribuie n lumea vie. In calitate de hapt ene, polizaharidele au proprietatea de specificitate, adica se combina cu antico rpii complementari faa de complexul glicoproteic. Din motive de ordin practic, cele mai studiate polizaharide din punct de vedere antigenic sunt cele de origine bacteriana: dextranul i polizaharidele capsulare. Dextranii sunt polimeri ramificai de glucoza, resturile glucozil fiind unite mai ales prin legaturi de tip ? 1-6, dar n funcie de specia producatoare, punctele de ramificaie ale catenelor polimere pot fi 1-2, 1-3 sau 1-4. Dextranii sunt sintetizai n special de unele bacterii lactice, din zaharoza, dupa reacia: Dextranaza N(zaharoza) --------------- (Glucoza)n + (Fructoza)n Dextranii au greutai moleculare foarte diferite (pna la 106 D), n funcie de gradul d e polimerizare. Nu sunt imunogeni i de aceea se folosesc ca nlocuitori ai plasmei.

Prin transfuzii repetate cu soluii de dextran la om i prin injectare repetata la o arece, s-au sintetizat anticorpi antidextran. Specificitatea anticorpilor antide xtran este foarte nalta. In serul animalelor imunizate cu dextrani s-au detectat doua tipuri de anticorpi: unii specifici faa de resturile de glucozil legate 1-2 i alii specifici faa de resturile de glucozil legate 1-3, ce nu dau reacii ncruciate, dei deosebirea dintre cele doua categorii de molecule de dextran consta numai n mo dul diferit de legare a resturilor de glucozil ntre ele. Polizaharidele capsulare se pot gasi fie subforma moleculelor libere (?solubile? ), fie subforma corpusculara (ataate celulelor bacteriene capsulate). Variaiile biochimice ale polizaharidelor capsulare, determinate de compoziia gluci dica a catenei, de secvena monomerilor sau de modul de legare a lor n catena, conf era tulpinilor bacteriene, specificitate antigenica de tip. La Str. pneumoniae s -au identificat peste 80 de tipuri antigenice ale polizaharidelor capsulare. In compoziia lor intra hexoze, pentoze, derivaii lor aminai, metilai etc. Specificitate a antigenica a polizaharidelor capsulare depinde att de compoziia chimica, ct i de s uccesiunea monomerilor n catena polizaharidica. Ca vaccinuri, polizaharidele indu c starea de tolerana. n stare purificata sunt molecule neimunogene, datorita uniformitaii lor structural e n lumea vie. Injectarea lor la animale nu induce sinteza anticorpilor. Acizii n ucleici nativi sunt conjugate nucleoproteice, n care acizii nucleici au rolul de haptena. Majoritatea epitopilor conjugatului sunt conformaionali. O fracie din ant icorpii anti-conjugat se combina cu acizii nucleici. Anticorpii anti-acizi nucle ici se combina cu acizii nucleici n stare pura, indiferent de proveniena. Proteine le asociate acizilor nucleici confera o noua specificitate antigenica i determina sinteza anticorpilor care se combina cu proteina putator. Experimental, anticorpii anti-acizi nucleici se obin pe una din urmatoarele cai: 1. Imunizarea cu bacteriofagi din seria T par (T2, T4, T6), supui ocului osmotic. ADN al acestor fagi se deosebete de ADN din celulele eucariote, prin prezena 5-hid roxi-metilcitozinei glicozilate, n locul citozinei. Anticorpii au specificitate f aa de bazele glicozilate, ceea ce explica lipsa reaciilor ncruciate cu ali acizi nucl eici. 2. Imunizarea cu ribosomi din celulele vegetale sau animale. Anticorpii sintetiz ai reacioneaza cu ARN de origine bacteriana, vegetala sau animala, precum i cu poli nucleotidele sintetice(poli-A, poli-C, poli-U), dar nu reacioneaza cu ADN nativ i nici cu ADN denaturat. 3. Imunizarea cu conjugate haptena-proteina, n care haptena este reprezentata de baze azotate, ribonucleozide, dezoxiribonucleozide, nucleotide, dinucleotide i tr inucleotide. Anticorpii sintetizai reacioneaza att cu haptena ct i cu ADN nativ sau d enaturat. 4. Imunizarea cu complexe formate din acizi nucleici i albumina metilata. Cele do ua molecule formeaza un complex necovalent, datorita interaciei dintre gruparile negative ale acizilor nucleici i cele pozitive ale proteinei. Anticorpii sintetiz ai reacioneaza cu complexul molecular, cu proteina, cu acidul nucleic nativ i denat urat de diferite origini. 5. Anticorpii anti-acizi nucleici se gasesc n sngele pacienilor cu lupus eritematos diseminat (LED). Anticorpii sintetizai faa de acizii nucleici cu rol de haptene n conjugatele cu pro teine nu au specificitate, deoarece precipita ADN monocatenar, ARN de diferite o rigini, poliribonucleotide i acizii nucleici dublu catenari.

Lipidele sunt molecule neimunogene n stare nativa, dar se pot cupla cu proteinele i n conjugatul format au rolul de haptene. Din punct de vedere imunologic, cele m ai importante lipide sunt fosfatidele (sfingomielina i cefalina) i glicosfingolipi dele(galactocerebrozida). O haptena lipidica cu o importana practica deosebita este cardiolipina, din cordu l mamiferelor. In sngele indivizilor infectai cu T. pallidum se gasesc anticorpi c are reacioneaza cu cardiolipina nalt purificata (reacie ncruciata), extrasa din cordu l bovin. Un alt antigen lipidic este antigenul Forssman, inductor al sintezei anticorpilo r hemaglutinani i n prezena complementului, hemolitici. Studiul imunogenitaii lipidelor a fost ngreunat de insolubilitatea lor n apa. Probl ema reactivitaii anticorpilor cu antigenele lipidice a fost depaita parial, prin ut ilizarea lipidelor auxiliare (lecitina i colesterolul) n suspensia antigenica. Dis ponibilitatea liposomilor a permis studiul imunogenitaii lipidelor asociate cu me mbranele. Haptene Haptenele(haptein, grec = a apuca) sunt substane chimice naturale sau de sinteza, cu molecula mica, a caror imunogenitate este condiionata de cuplarea cu o molecu la purtator, dar i pastreaza proprietatea de specificitate, adica reacioneaza cu an ticorpii specifici a caror sinteza a fost indusa de haptena conjugata cu o molec ula cu rol de purtator. Denumirea de ?haptena? a fost introdusa de Landsteiner pentru a caracteriza din punct de vedere funcional un extract alcoolic de rinichi de cal, neimunogen ca at are pentru iepure, dar capabil sa se combine cu anticorpii sintetizai dupa imuniz area iepurelui cu extractul alcoolic de rinichi de cal, cuplat cu o molecula pur tator. El a propus ca n categoria haptenelor sa fie cuprinsa orice substana natura la sau sintetica, cu greutate moleculara mica sau mare, care n forma nativa nu po ate sa induca un raspuns imun detectabil, dar dobndete capacitatea imunogena, dupa cuplarea sa in vivo sau in vitro, cu o molecula purtator cu greutate moleculara mare. Conjugatul este imunogen nu numai n raport cu epitopii moleculei purtator , ci i cu epitopul haptenei. Din punct de vedere funcional, haptenele s-au numit ?jumatai de antigene?, deoarec e au numai una din cele doua proprietai eseniale ale antigenelor: nu sunt imunogen e, dar i pastreaza proprietatea de specificitate. De aceea, termenul ?antigenic? n u este sinonim cu cel de ?imunogenic?. Haptena este un antigen, dar n forma sa na tiva, nu este imunogena. n general, haptenele sunt molecule mici, dei uneori, macromoleculele pot funciona c a haptene. Extractul alcoolic de rinichi de cal este o haptena complexa. Haptene le simple sunt reprezentate de polinucleotide, alcooli, formaldehida, unele medi camente etc. Utiliznd haptenele simple, prin reacii de cuplare cu o molecula purtator s-au obinu t antigene artificiale. Haptena din complexul molecular are rolul gruparii deter minante de specificitate. Studiul imunogenitaii conjugatelor haptena-molecula pur tator a permis determinarea marimii gruparilor determinante de specificitate ale antigenelor i indirect, determinarea situsului de combinare a anticorpilor. Pe a ceiai cale s-a evaluat specificitatea, afinitatea i heterogenitatea anticorpilor. Haptenele au fost folosite pentru studiile de cristalografie cu raze X a unui co mplex antigen-anticorp. Haptene autocuplante sunt molecule cu greutate moleculara mica, a caror particul aritate consta n aceea ca, dupa injectare, n organism se combina spontan cu protei

nele tisulare i formeaza conjugate haptena-proteina, in vivo. Conjugatele haptena -proteina induc sinteza anticorpilor i determina procese de hipersensibilitate sa u iniiaza maladii autoimune. Astfel se comporta derivaii dinitrofenolului substitu ii cu clor sau fluor, unii produi de degradare a penicilinei. Antigenele corpusculare Antigenele corpusculare sunt, n esena, antigene moleculare asociate virusurilor i c elulelor. Proteinele capsidale i glicoproteinele nveliului viral sau proteinele pre zentate pe suprafaa celulelor infectate cu virusuri, sunt foarte imunogene i stimu leaza raspunsul imun al gazdei. De aceea, imunitatea consecutiva infeciei virale este, de obicei, de lunga durata. Antigenele bacteriene sunt fie solubile (eliminate n mediul extracelular), fie co rpusculare (legate de celula). Din prima categorie fac parte exotoxinele i poliza haridele capsulare libere, iar din cea de a II-a, antigenul somatic O (endotoxin a bacteriilor Gram negative), antigenele polizaharidice din glicocalix, flagelin a, pilina, acizii teichoici, mureina etc. Antigenele eritrocitare sunt glicoproteine ale suprafeei eritrocitare, cu determi nism biochimic cunoscut, n sistemul A, B, 0. Glicoproteinele eritrocitare de grup sanguin se gasesc i pe suprafaa celulelor tisulare, dar i n secreiile exocrine (sali va, suc gastric etc.), la circa 75% dintre indivizi, denumii ?secretori?. Glicopr oteinele din secreii sunt hidrosolubile i studiul lor a fost mai uor dect al molecul elor eritrocitare. Gruparile glucidice ale glicoproteinelor membranei eritrocitare au rol dominant n determinarea specificitaii de grup sanguin, aa cum au evideniat studiile de digest ie enzimatica controlata. Eritrocitele tuturor grupelor sanguine au un precursor antigenic comun ? antigenul H (codificat de gena H), bine exprimat pe suprafaa a ntigenelor de grup 0 i n cantitai progresiv descrescnde pe hematiile de grup A, Bi Ab . Specificitatea antigenica de grup 0 este conferita de L-fucoza. Grupul A are o g ena ce codifica sinteza glicozil-transferazei, enzima ce adauga N-acetil-D-galac tozamina, la galactoza preterminala a moleculei H. De aceea, specificitatea anti genica a eritrocitelor de grup A este conferita de trizaharidul N-acetil-galacto zamina, galactoza i L-fucoza: N-acetil galactozamina (? 1-3) Gal ? R (R = restul catenei polizaharidice) ? 1-2 Fuc Indivizii de grup Bau o gena ce adauga D-galactoza (n loc de N-acetil galactozami na) la galactoza preterminala a moleculei H, avnd un determinant antigenic format din doua resturi terminale de D-galactoza i L-fucoza. Fig. 3. Oligozaharidele cu rol de epitopi determinani ai grupelor sanguine ABO. O ligozaharidul este ancorat n membrana eritrocitului prin intermediul sfingomielin ei, denumita ceramida. 85% din indivizii umani secreta substanele de grup sanguin n saliva. La indivizii ?secretori?, oligozaharidele sunt prezente sub forma conj ugatelor cu polipeptidele codificate de genele secretoare (dupa Roitt, 1997).

Prezena restului de fucoza (adica antigenul H) este eseniala pentru expresia epito pilor A i B. Gena H i antigenul sau lipsesc la fenotipul Bombay. De aceea, transfe razele A i B nu pot adauga glucidele specifice la restul Gal al polizaharidului i

antigenele de grup A i B nu sunt exprimate. Exprimarea antigenelor ABO pe hematii poate fi modificata prin tratamentul in vi tro cu glicozidaze: o ?-glicozidaza (extrasa din bobul de cafea verde) poate cli va restul de Gal de pe hematiile de grup B i le convertete n hematii de grup 0, ce pot ramne funcionale dupa transfuzia la subiecii de grup 0. Antigenele de histocompatibilitate (descrise de J. Dausset, 1958) sunt molecule de suprafaa ale majoritaii esuturilor. Din punct de vedere biochimic, ele sunt stri ct specifice fiecarui organism uman i animal i confera individualitate biochimica proprie fiecarui organism. Se numesc i antigene de transplantare, deoarece, dupa grefarea unui esut sau a unui organ, moleculele de histocompatibilitate se compor ta ca antigene i declaneaza raspunsul imun al organismului receptor, care determin a respingerea grefei. Antigenele individuale de histocompatibilitate se evideniaza prin reacia de respin gere a grefei. n funcie de raportul genetic dintre donor i receptor, antigenele de histocompatibilitate aparin urmatoarelor categorii: 1) autoantigenele includ antigenele proprii de histocompatibilitate, care, n cond iii normale sunt tolerate de sistemul imunitar. Sub aciunea unor factori fizici, c himici sau biologici, antigenele de histocompatibilitate se modifica devenind au toantigene, generatoare ale conflictelor autoimune; 2) izoantigenele cuprind antigenele de transplantare comune orga-nismelor identi ce din punct de vedere genetic, care aparin unei linii genetic pure (inbred). Ver ificarea puritaii genetice a unei populaii de organisme se face prin transplantul de piele. Daca grefa este acceptata, organismele respective aparin aceleiai linii inbred. Termenii ?izoantigen? i ?inbred? nu au corespondena pentru populaia umana; 3) aloantigenele (alos = altul) includ molecule care, dupa injectare declaneaza r aspunsul imun la organisme ale aceleiai specii, dar diferite genetic, de organism ul donor. Aloantigenele sunt inegal raspndite la indivizii unei specii i induc ras punsul imun la organismele care nu poseda antigenul respectiv. Aloantigenele se evideniaza dupa imunizarea unui organism, cu o suspensie celulara provenita de la organisme ale aceleiai specii, dar aparinnd unui alotip diferit; 4) heteroantigenele (xenoantigene, xenos = strain) includ molecule care se gases c n/pe celulele tuturor indivizilor unei specii i care se comporta ca antigene faa de organismele altei specii. Heteroantigenele se evideniaza prin sinteza anticorp ilor faa de antigenele celulelor provenite de la un organism al unei specii difer ite. Celulele unei specii diferite aduc n organismul receptor nu numai heteroantigene, ci i aloantigene i chiar autoantigene. De aceea injectarea unui heteroantigen est e una dintre cele mai utilizate metode pentru a induce sinteza autoanticorpilor. Antigenele de organ sunt molecule specifice care confera particularitaile biochim ice i funcionale ale celulelor unui organ. De exemplu, proteinele hepatice sau ale glandei mamare difera de proteinele esutului renal al aceluiai organism. Antigene artificiale La origine, antigenele artificiale sunt antigene naturale, modificate chimic pri n cuplarea, cel mai adesea covalenta, cu una sau mai multe molecule mici, care l e confera o noua individualitate antigenica i o noua specificitate de combinare c u anticorpii, n raport cu molecula de origine. Antigenele artificiale s-au obinut, n principal, pornind de la moleculele proteice

. Prin legarea moleculelor proteice cu diferite haptene s-au obinut trei tipuri d e antigene artificiale: a) conjugate haptena-proteina, prin reacia de diazotare, iodurare i respectiv subs tituie nucleofila; b) conjugate proteina-proteina, prin intermediul unor ageni bifunc-ionali de legar e (diizocianaii i carbodiimidele); c) proteine legate de suporturi insolubile, prin reacia de diazotare sau prin int ermediul carbodiimidelor. a) Conjugatele haptena-proteina au fost utilizate de Landsteiner, n studiile cu p rivire la mecanismele raspunsului imun. In conjugate, haptenele ndeplinesc rolul de epitopi (grupari determinate de specificitate), iar mole-culele proteice au r olul de carrier. Raspunsul imun nu este orientat strict faa de epitopii haptenici , ci i faa de determinani antigenici ai gruparii carrier. Cuplarea haptena-purtator necesita existena unei grupari reactive a haptenei, car e sa se lege covalent cu gruparile funcionale ale purtatorului, cu condiia pastrar ii integritaii funcionale a celor doi reactani. Haptenele se pot cupla cu purtatori foarte diveri, dar proteinele naturale (albumina, globulinele) furnizeaza conjug ate foarte imunogene. Landsteiner a cuplat amino-benzen-sulfonatul cu molecule proteice, prin reacia de diazotare i a obinut azoproteine:

Dupa cuplarea haptenei cu Tir, His sau Lys din structura unei proteine, rezulta un antigen artificial care induce formarea a doua categorii de anticorpi cu spec ificitai diferite, dupa cum reacioneaza cu haptena, sau cu molecula purtator. Conjugatele azoproteice au permis studiul influenei configuraiei spaiale a haptenei , asupra specificitaii antigenice. Gruparea sulfonat a fost legata n poziia orto, m eta sau para a haptenei aminobenzen. Antiserurile obinute au specificitate faa de fiecare izomer. Izomerul meta al aminobenzen-sulfonatului, cuplat cu proteina, p astreaza capacitatea de a precipita cu anticorpii specifici faa de proteina nativ a, n timp ce conjugatele cu izomerii orto- i para- dau reacie foarte slaba de preci pitare. Concluzia este ca izomerii de poziie induc modificari sterice (conformaion ale) ale haptenei.

Conjugatele haptena-proteina se pot obine prin reacia de iodurare. Proteinele pute rnic iodurate i modifica specificitatea antigenica. Ele induc sinteza anticorpilor care dau reacii ncruciate de precipitare cu proteinele iodurate heterologe. Semnif icaia este ca prin iodurare, proteinele i pierd specificitatea antigenica. Toate pr oteinele iodurate induc sinteza anticorpilor faa de o grupare iodurata, n special faa de tirozina iodurata, indiferent de specificitatea gruparii purtator. O alta reacie de obinere a conjugatului haptena-proteina este cea de substituie nuc leofila. Cele mai folosite haptene sunt 2,4-dinitrofenolul(DNP) i 2,4,6-trinitrof enolul(TNP). Mecanismul molecular al cuplarii este urmatorul: un atom de H din gruparea OH- , NH2+ sau S-SH a proteinei, este nlocuit de gruparea haptenica prin eliminarea ap ei. Proteina pierde electroni, iar nucleul benzenic i accepta. Gruparile donoare

de electroni sunt OH- , NH2+, S-SH. Gruparile DNP i TNP sunt cuplate cu proteina purtator sub forma 2,4-dinitrobenzen-sulfonatului de Na, a 2,4,6-trinitrobenzensulfonatului de Na sau subforma derivailor halogenai. Reacia dintre o proteina i 2,4-dinitrobenzen-sulfonatul de sodiu ilustreaza mecani smul atacului nucleofilic, reacie n care proteina cedeaza electroni, iar nucleul b enzenic i accepta.

b) Conjugatele proteina-proteina se obin prin intermediul agenilor bifuncionali de legare: diizocianaii i carbodiimidele. Deoarece gruparile ciano au reactivitate di ferita, reacia de cuplare se realizeaza n trepte. De exemplu, gruparea din poziia 4 a toluilen-diizocianatului este mai reactiva dect gruparea ciano din poziia 2. Ac easta permite ca una dintre proteine sa se cupleze n poziia 4, iar ulterior, ntr-o noua etapa a reaciei, cea de a II-a proteina se va cupla la gruparea ciano din po ziia 2:

Carbodiimidele, utilizate ca ageni bifuncionali pentru cuplarea proteinelor, sunt considerate anhidride simetrice ale ureii: H2N ? C ? NH2 ? HOH O ??HN = C =NH H2N ? C 4 N Uree Carbodiimida simetrica Cianamida asimetrica

Carbodiimidele pot fi substituite simetric sau asimetric cu molecule proteice: R1N = C = NR1 sau R1N = C = NR2. Agenii bifuncionali de cuplare permit obinerea conjugatelor proteice (conjugate ant icorpi-feritina, insulina-albumina), dar se folosesc i ca mediatori ai legarii di feritelor molecule proteice pe suprafaa eritrocitelor. Marcajul cu feritina este deosebit de important din punct de vedere practic, deo arece se folosete pentru evidenierea electrono-optica, la nivelul membranei, a dif eritelor molecule proteice. c) Conjugatele proteina-suport insolubil se obin prin cuplarea proteinelor cu un suport insolubil, prin reacia de diazotare, prin intermediul carbodiimidelor sau al BrCN. Ca suporturi insolubile se folosesc derivai celulozici: sephadex, sephar oza, agaroza etc. Legarea proteinei de suport, prin reacia de diazotare, se face prin intermediul tirozinei, lizinei, histidinei, triptofanului sau argininei.

Conjugatele anticorpi-suport insolubil se numesc imunosorbeni i sunt folosii cu o e ficiena deosebita pentru purificarea proteinelor dintr-un amestec, datorita speci ficitaii lor de combinare cu anticorpii corespunzatori, fixai ntr-o coloana de mate rial inert. Antigenul complementar specificitaii de legare a anticorpului fixat n coloana, se leaga necovalent de imunosorbent, dupa care poate fi eluat cu un age nt chimic. Anticorpii pot fi imobilizai pe un suport insolubil, prin tratamentul cu un agent de legare ncruciata (glutaraldehida), dar multe din situsurile reactive pt fi den aturate sau ramn ascunse. Fig. 4. Principiul funcional al imunosorbenilor utilizai n cromatografia de afinitat e. Coloana conine sefaroza, pe care sunt fixate moleculele de anticorp. Amestecul de antigene este trecut prin coloana, unde va fi reinut numai antigenul care rec unoate specific anticorpul fixat. Cel mai bun suport de imobilizare este agaroza, un polizaharid obinut prin fracion area agarului. Agaroza este rezistenta la aciunea degradativa a enzimelor bacteri ene i a agenilor chimici i poate fi regenerata. Este disponibila subforma sferelor poroase hidratate, cu diametrul de 40-300 m i conine 2-8% agaroza n soluie apoasa. In coloana de imunosorbent se pot fixa nu numai anticorpii, ci i antigenele sa u chiar celule intacte. Imunosorbenii se folosesc n activitatea de cercetare i n clinica, pentru prepararea unor produse biologice i a medicamentelor. Antigene sintetice Antigenele sintetice sunt polimeri de aminoacizi, cu secvena cunoscuta, obinui in v itro. Proprietaile imunogenice ale homopolimerilor (poli-Lys, poli-Glu, poli-Pro) i ale heteropolimerilor au fost studiate de M. Sela. Studiul imunogenitaii hetero polimerilor are avantajul ca ofera posibilitatea studiului influenei compoziiei ch imice, a greutaii moleculare i a conformaiei moleculare, uurnd studiul imunochimic al gruparilor determinante de specificitate antigenica. Catenele polipeptidice sintetice pot fi lineare sau ramificate. Cele ramificate rezulta prin ataarea polimerilor lineari, la o catena polifuncionala. Ramificarea se obine mai uor cu aminoacizi aromatici. Homopolimerii nu sunt imunogeni, cu excepia poli-L-Pro, poli-L-Glu, poli-L-Arg, p oli-L-Lys. Copolimerii formai din doi aminoacizi nu sunt totdeauna imunogeni, dar cei rezultai prin polimerizarea a trei aminoacizi diferii sunt totdeauna imunogen i. Cu ct compoziia lor este mai heterogena, imunogenitatea este mai accentuata. Pr ezena aminoacizilor aromatici confera o anumita rigiditate a epitopilor i implicit , o imunogenitate superioara. Pentru a fi imunogeni, copolimerii trebuie sa fie catabolizai de aparatul enzimat ic al celulelor care prelucreaza i prezinta antigenul. Polipeptidele formate din D-aminoacizi sunt slab imunogene, datorita incapacitaii organismului de a catabol iza polimerul. Polipeptidele sintetice s-au dovedit a fi foarte utile n studiile de imunochimie, cu privire la: - determinarea marimii gruparii determinante de specificitate i indirect, a situ sului de combinare a anticorpilor specifici; - rolul dimensiunilor moleculei asupra proprietailor de imunogenitate; - rolul configuraiei spaiale a moleculei n conferirea proprietaii de imunogenitate; - identificarea epitopilor secveniali i conformaionali.

p 8 p p

IMUNOGLOBULINELE (ANTICORPII)

Existena anticorpilor a fost demonstrata de Behring i Kitasato (1890), n serul anim alelor imunizate experimental cu toxina tetanica. Serul lor neutralizeaza toxina in vitro i o face inofensiva pentru animalele de experiena. Autorii au folosit de numirea de ?anticorp? pentru a desemna substanele protectoare ce apar n ser, cu sp ecificitate faa de un antigen corpuscular (bacterii). Heidelberger (1930) a purificat anticorpii din ser i a evideniat ca aparin fraciei p roteice. Tiselius i Kabat (1938) au demonstrat experimental ca, de cele mai multe ori, funcia de anticorp este asociata cu fracia gama a proteinelor serice i le-au dat denumirea de gamaglobuline. n 1970, prin consens ntre specialiti, OMS a stabilit ca substanele cu proprietai de a nticorp, sa fie grupate n categoria imunoglobulinelor, pornind de la faptul ca to ate substanele din acest grup au funcie imunitara i sunt cuprinse n fracia globulinic a a serului. Anticorpii nu sunt numai gamaglobuline. Exista i alte globuline cu f uncie de anticorp, dupa cum exista i gamaglobuline care nu au activitate de antico rp (de exemplu, proteinele patologice Bence-Jones). Fig.10. Mobilitatea electroforetica a imunoglobulinelor serice. IgG are cea mai heterogena sarcina electrica i migreaza n regiunile gama i beta. IgE are are mobili tate similara cu a IgD, dar nu poate fi identificat pe electroforegrama datorita nivelului seric scazut. Anticorpii sunt imunoglobuline care nui antigen i au proprietatea de a i anihila aciunea nociva. Termenul losit de Ehrlich (1891) n lucrarea se sintetizeaza n organism dupa patrunderea u se cupla specific cu antigenul inductor i de ade ?anticorp? n accepiunea sa actuala, a fost fo ?Studii experimentale asupra imunitaii?.

Anticorpii formeaza 20% din totalul proteinelor plasmatice, dar se gasesc i n lich idele extravasculare, n secreiile exocrine (saliva, lapte, lacrimi) i ca molecule r eceptor de anti-gen pe suprafaa limfo-citelor B.

Moleculele de anticorpi au cea mai mica mobilitate electroforetica. Dei sunt asem anatoare ca structura, moleculele de imunoglobuline formeaza o familie de o dive rsitate imensa, nentlnita la nici o alta proteina. Diversitatea lor uriaa este ordo nata n clase i subclase, n primul rnd pe baza compoziiei n aminoacizi. Heterogenitate compoziiei n aminoacizi se reflecta n sarcina lor electrica, foarte diferita. La e lectroforeza, celelalte proteine serice migreaza ca o banda compacta, cu o mobil itate caracteristica, deoarece moleculele lor sunt omogene n ceea ce privete sarci

na electrica, la un pH dat. Imunoglobulinele migreaza ca o banda larga, fiind he terogene, nu numai prin secvena aminoacizilor, ci i prin sarcina electrica. Structura moleculei de imunoglobulina Structura moleculei de imunoglobulina (Ig) s-a stabilit prin analiza proteinelo r omogene secretate de plasmocitoame, cu metodologii complexe: biochimice, anali tice, cristalografia prin difracie cu raze X.

Unitatea structurala de baza a moleculei de Ig este monomerul. Acesta este o uni tate tetrapeptidica, formata prin asocierea a doua lanuri grele (H, Heavy = greu) , fiecare avnd circa 450 de aminoacizi i o greutate moleculara cuprinsa ntre 50-76 kD i doua lanuri uoare (L, Light = uor), fiecare avnd circa 216 aminoacizi i o greuta e moleculara de 25 kD. Cele 4 catene polipeptidice sunt legate ntre ele prin puni S-S i se rasucesc n spirala - att unul faa de altul, dar i fiecare separat ? faa de p opria-i axa, rezultnd o configuraie tridimensionala, stabilizata prin 16-24 legatu ri S-S i prin alte interaciuni necovalente. Monomerul tetrapeptidic tridimensional are forma de T sau de Y. n funcie de secvena aminoacizilor, fiecare lan polipeptidic este alcatuit din doua r egiuni distincte: a) regiunea constanta (C ) corespunde jumataii C-terminale a celor 4 catene polip eptidice. Are o secvena relativ uniforma a aminoacizilor i asigura unitatea struct urala i funcionala a moleculei de Ig; b) regiunea variabila (V) cuprinde o secvena de circa 110 aminoacizi n jumatatea N -terminala a celor 4 catene polipeptidice. Marimea sa nu este fixa, deoarece int ervin inserii sau deleii de 3-6 aminoacizi. Regiunile variabile ale fiecarei pere chi de catene formeaza situsul de combinare al moleculei de Ig, care confera spe cificitate de legare cu antigenul. Variabilitatea maxima a secvenei de aminoacizi a catenei L se concentreaza n poziii le 24-34, 50-55, 89-97, iar a catenei H, la secvenele 30-36, 50-56, 86-91 i 95-100. Aceste secvene formeaza regiunile hipervariabile sau regiunile determinante de complementaritate (RDC), faa de configuraia spaiala a ep itopului. Aminoacizii acestor secvene intra n alcatuirea situsului de combinare al moleculei de Ig. Secvenele relativ invariante se numesc regiuni cadru (RC) i formeaza 80-85% din r egiunea variabila a moleculei de Ig. Variaia secvenei aminoacizilor la nivelul reg iunilor cadru este limitata la 5%. Secvena regiunilor cadru i a celor determinant e de complementaritate alterneaza astfel: RC1, RDC1, RC2, RDC2, RC3, RDC3, RC4, RDC4. Aproape de jumatatea catenelor H se gasete o secvena de circa 15 aminoacizi, n car e sunt grupate toate resturile de cisteina ce formeaza puni S-S intercatenare. Ac easta secvena se numete regiunea balama. Este sensibila la aciunea proteazelor fiin d clivata de papaina, pepsina etc. La IgM i IgE, regiunea balama lipsete, dar cea omologa balamalei este clivata de proteaze. Regiunea balama asigura flexibilitat ea moleculei de Ig, permind mobilitatea fragmentelor Fab, care, teoretic, pot form a unghiuri variabile, ntre 0-180o, conferind moleculei o geometrie variabila. Cel e 16-24 legaturi S-S ale monomerului tetrapeptidic sunt constante ca numar i loca lizare pentru diferitele clase de Ig. Se disting 3 categorii de puni S-S: - legaturi intercatenare H-H sau L-H, ale unui monomer. Legaturile L-L s-au des cris la IgA2 i la proteinele Bence-Jones, care sunt dimeri de lanuri L; - legaturi intracatenare, care determina structura teriara a fiecarui lan polipep tidic.

- legaturi intercatenare, ntre lanurile H ce aparin unor monomeri diferii, la IgA2 i IgM, care formeaza complexe moleculare polimerice: moleculei de Ig se formeaza prin plierea fiecareia din cele 4 catene polipeptidi ce i prin rasucirea lor n spirala. Domeniile sunt regiuni globulare ale moleculei, legate ntre ele prin secvene lineare scurte. Domeniile se pliaza ntr-o conformaie s tabila, conferita de secvena proprie de aminoacizi. Comparativ cu secvenele linear e, domeniile pliate sunt mai rezistente la proteoliza. Catena L are doua domenii: unul corespunzator regiunii variabile (VL) i altul cor espunzator regiunii constante (CL). Catena H are 4 domenii: unul corespunzator regiunii variabile (VH) i trei domenii ale regiunii constante: CH1, CH2, CH3. Fig. 11. a. Reprezentarea schematica a structurii primare a moleculei de imunogl obulina. Fig. 11. b. Localizarea diferitelor funcii ale moleculei de anticorp. Fiecare catena H a moleculelor de IgM i IgE are 5 domenii: unul n regiunea variabi la (VH) i 4 n regiunea constanta (CH1 ? CH4). Secvena de legatura ntre regiunea constanta (CH1) i cea variabila a fiecarei catene se numete zona de comutare (s = switch). Fiecare domeniu are o forma cilindrica sau globulara, cuprinde o secvena de circa 60 de aminoacizi i este stabilizat prin interaciuni necovalente de tip trans, cu domeniul omolog din lanul opus i de tip cis, cu domeniul vecin al aceleiai catene. Domeniile fiecarui lan, mpreuna cu cele omologe ale lanului opus, formeaza unitai fu ncionale denumite module. Cooperarea lor funcionala este ilustrata de faptul ca do meniile VL i VH separate, au o capacitate foarte limitata de legare a antigenului , n timp ce forma lor asociata (care constituie situsul de legare al moleculei) e ste foarte eficienta n legarea antigenului. Fig. 12. Reprezentarea schematica a domeniilor pliate i stabilizate ale moleculei de IgG. Moleculele de imunoglobuline exista sub doua forme: secretate, ca anticorpi n umo rile organismului i legate de membrana limfocitelor B, ndeplinind funcia de recepto ri de antigen. Forma legata prezinta o secvena hidrofoba la capatul C-terminal, d e circa 30 de aminoacizi, care strabate membrana i se ancoreaza n structura ei. Metodele de clivare i de denaturare chimica a moleculei de imunoglobulina au cont ribuit la nelegerea structurii i funciei sale. Clivarea s-a realizat cu enzime prote olitice (papaina, pepsina, tripsina) sau prin cianoliza cu BrCN. Fig. 13. Clivajul enzimatic al moleculei de IgG1 umane. Pepsina cliveaza catena H i elibereaza fragmentele F(ab?)2 i regiunea Fc (segmentul cristalizabil). Hidrol iza prelungita taie fragmentul Fc? n peptide scurte. Papaina cliveaza molecula n r egiunea balama (la restul 224) i elibereaza doua fragmente Fab i un fragment Fc (d upa Roitt, 1984). Papaina scindeaza mo-lecula de imunoglobulina la nivelul regiunii balama (aminoa cidul 224) i elibe-reaza doua fragmente Fab (Fragment antigen binding) i fragmentu l Fc (cristalizabil). Fiecare fragment Fab (50 kD) conine un lan L ntreg i jumatatea N-terminala a lanului H, notata cu Fd (difficult), care cuprinde domeniile VH i C H1. Frag-mentul Fab poate fi scindat transversal i rezulta frag-mentul Fv (variab

il) format din domeniile VL i VH, se-parat de domeniile CL i CH1. Fragmentul Fc (50 kD) este format din jumataile C-terminale ale celor doua catene H, unite printr-o legatura S-S i prin legaturi necovalente. Pepsina cliveaza lan-urile H sub regiunea balama i elibereaza fragmentul Fc?, mai mic dect fragmentul Fc papainic i doua fragmente Fab? legate ntre ele (Fab?)2, prin puni S-S intercatenare. BrCN scindeaza lanurile polipeptidice la nivelul secvenelor cu Met, pe care o tran sforma n homoserina. Fragmentele rezultate sunt heterogene ca marime, n funcie de f recvena metioninei. Polipeptidele rezultate prin clivare enzimatica, ct i prin cian oliza, se separa prin tehnici cromatografice. Denaturarea moleculei de imunoglobulina prin reducerea legaturilor S-S. Agenii re ducatori (mercaptoetanolul, mercaptoetanolamina, ditiotreitolul) au o grupare SH libera i reduc legaturile S-S intercatenare i intracatenare. HO ? CH2 ? CH2 ? SH (Mercaptoetanolul) Legaturile intercatenare (H-H sau H-L) sunt reduse mai uor, iar cele intracatenar e, care stabilizeaza buclele domeniilor moleculei de imunoglobulina, sunt disoci ate mai greu. Reducerea legaturilor S-S este reversibila. Dupa ndepartarea agentului denaturant , renaturarea este rapida i completa. Din acest motiv, agenii denaturani se ncorpore aza n sistemul supus denaturarii. Denaturarea se poate stabiliza prin diferite me tode chimice. Funciile moleculei de imunoglobulina n ansamblul efectorilor sistemului imunitar, moleculele de imunoglo-bulina ndeplin esc doua categorii de funcii: - funcii de specificitate - funcii grupate sub denumirea de activitai biologice efectoare Specificitatea imunoglobulinei faa de un antigen este exprimata prin capacitatea de recunoatere fina a epitopului complementar al antigenului i de combinare cu ace sta. Specificitatea moleculei de imunogobulina este conferita de situsul sau de combinare. Marea diversitate a moleculelor de anticorpi, asigura o diversitate u riaa a situsurilor de combinare, de ordinul a 108 ? 109 specificitai de legare. Specificitatea de legare este data de structura spaiala a situsului de combinare cu antigenul, conferita de resturile de aminoacizi ale regiunilor hipervariabile ale catenelor H i L. Aminoacizii care formeaza situsul de combinare al moleculei de imunoglobulina, p rin plierea regiunilor hipervariabile, delimiteaza o cavitate moleculara ce dife ra ca forma i marime. Cavitatea prezinta substructuri (proeminene i depresiuni), pe care le formeaza sec venele hipervariabile, n timp ce restul regiunilor variabile ale celor doua catene confera structura tridimensionala a cavitaii moleculare. Potrivirea spaiala dintre situsul de combinare al moleculei de anticorp i epitopul specific, din punctul de vedere al configuraiei spaiale, este perfecta. Eventuale le imperfeciuni geometrice pot fi ocupate de moleculele de apa. Potrivirea perfec ta a celor doua unitai combinante este sugerata de metafora ?cheie-broasca?.

Dupa combinarea cu antigenul, modificarile spaiale ale situsului de combinare a a nticorpului sunt minime, nedectabile. Epitopul antigenic are un rol important n p otrivirea conformaionala perfecta cu situsul de combinare a anticorpului, deoarec e corespunde unei regiuni moleculare cu factor de temperatura mai ridicata, ceea ce sugereaza o flexibilitate mai accentuata a secvenei moleculare respective. Flexibilitatea unui determinant antigenic i permite sa se adapteze mai uor ntr-un s itus de legare preexistent al moleculei de anticorp, chiar daca epitopul nu se p otrivete exact geometriei situsului de combinare a anticorpului. Datorita flexibi litaii epitopului, legarea antigenului cu anticorpul se aseamana cu ?ntlnirea a doi nori? i nu cu aceea a ?doua pietre?. Anticorpii specifici faa de secvenele peptidice mobile (calde) ale antigenului pro teic, se leaga cu afinitate mai mare de proteina nativa. Aceste rezultate sunt f oarte importante din punct de vedere practic, pentru selectarea segmentelor pept idice n vederea obinerii vaccinurilor sintetice subunitare. Dimensiunile situsului de combinare s-au dedus indirect, prin determinarea marim ii haptenei care blocheaza reacia de combinare a anticorpilor cu antigenul nativ: oligozaharidul format din 6-8 unitai monomerice ocupa complet situsul de combina re al moleculei de anticorp. Oligozaharidele mai mici inhiba parial reacia specifi ca de precipitare. Pentru anticorpii specifici faa de antigene proteice, tetrapep tidele au blocat cu maxima eficiena reacia de precipitare dintre anticorpi i antige nul nativ. Funciile biologice efectoare sunt amorsate de reacia antigen-anticorp. Numarul fun ciilor biologice efectoare este mai mic i sunt dependente de regiunile constante a le moleculei de imunoglobulina. Fiecare domeniu al regiunii constante a moleculei de imunoglobulina ndeplinete anu mite funcii: - legarea antigenului pe imunoglobulinele de suprafaa care funcioneaza ca receptor i pe limfocitele B, declaneaza proliferarea i diferenierea lor, iar legarea antigen ului cu imunoglobulinele citotrope pentru mastocite, declaneaza degranularea aces tor celule; - dupa cuplarea cu antigenul, moleculele de imunoglobulina expun fragmentul Fc, recunoscut ulterior de receptorii specifici pentru Fc de pe suprafaa monocitelor, macrofagelor, PMNN. Astfel se stimuleaza procesul de fagocitoza a celulelor non self tapetate cu imunoglobuline, denumit imunofagocitoza; - celulele K, prin intermediul receptorilor pentru Fc, interacioneaza cu celulele nonself tapetate cu IgG i realizeaza liza de contact prin fenomenul de citotoxic itate;

- interaciunea antigen-anticorp genereaza un semnal care se transmite regiunii Fc . Aceasta i modifica configuraia spaiala i expune un situs de recunoatere (pentru IgG situat ntre Glu 318 i Lys 322), de care se leaga C1q; - regiunea balama este transductoare de semnale i are un rol important n flexibili tatea moleculei de imunoglobulina, permind variaia unghiului dintre fragmentele Fab : ele trec reversibil de la forma T la Y. Geometria variabila a moleculei de imu noglobulina marete eficiena de legare a antigenului, deoarece ajusteaza poziia celo r doua situsuri de combinare ale anticorpului, n funcie de distana la care se gases c determinanii antigenici pe suprafaa unui antigen particulat (virus sau celula); - regiunea balama a moleculelor de IgG i IgD este sensibila la aciunea enzimelor p roteolitice, iar a moleculei de IgA este rezistenta.

Componenta glucidica a imunoglobulinei ndeplinete urmatoarele funcii; - realizeaza i menine o conformaie a moleculei de imunoglobulina, eseniala pentru se creie; - marete solubilitatea moleculelor de imunoglobulina; - are rol de spaiator ntre domeniile unui lan i ntre catenele moleculei; - participa la funciile citotrope ale moleculei de imunoglobulina; - are rol n legarea C1q, componenta a sistemului complement. Heterogenitatea anticorpilor

Moleculele de imunoglobuline din plasma oricarui organism sunt foarte heterogene , att datorita diversitaii epitopilor faa de care s-au sintetizat ? ceea ce induce variaii ale secvenelor hipervariabile ale moleculei, ct i datorita variaiilor secvene de aminoacizi n regiunile constante ale moleculei. Heterogenitatea anticorpilor este ordonata n clase, subclase, tipuri, alotipuri i idiotipuri, pe baza variaiei secvenei de aminoacizi. Moleculele de imunoglobuline au calitai duble: ele se comporta nu numai ca molecule de recunoatere, care recuno sc specific antigenul, dar la rndul lor sunt recunoscute ca antigene. Pentru spor irea gradului de imunogenitate, moleculele de imunoglobuline se asociaza cu adju vantul Freund i se injecteaza la animale de experiena. Variaiile de structura chimi ca a imunoglobulinelor se comporta ca determinani antigenici i induc sinteza antic orpilor anti-imunoglobulina. Variaiile de ordin chimic ale imunoglobulinelor se e videniaza prin metode imunochimice de precipitare ntre moleculele de imunoglobulin a cu rol de antigen i anticorpii anti-imunoglobulina din serul imun. Din punctul de vedere al manifestarii imunopotenei determinanilor antigenici ai im unoglobulinelor, s-au definit trei nivele de heterogenitate: izotipica, alotipic a i idiotipica. Heterogenitatea izotipica Heterogenitatea izotipica (izos = acelai) definete variantele biochimice ale imuno globulinelor, comune pentru toi indivizii unei specii. Variantele biochimice se d atoreaza variaiilor secvenei de aminoacizi n regiunea constanta a catenei H. Ele se comporta ca determinani antigenici dupa injectarea n organismul altei specii. Pen tru identificarea epitopilor izotipici ai moleculelor de imunoglobulina umana, a cestea, n asociaie cu adjuvantul Freund, se injecteaza la iepure. Fiecare individ al unei specii exprima toate variantele antigenice izotipice car acteristice speciei. Variantele antigenice izotipice ale imunoglobulinelor umane s-au identificat inii al, n regiunea constanta a catenei H. Exista 5 variante antigenice distincte ale catenelor H n regiunea constanta, nota te cu g, m, a, d, e, corespunzatoare celor 5 clase de imunoglobuline: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Serul imun faa de un determinant antigenic de clasa nu da reacii ncr uciate cu celelalte tipuri de determinani, deoarece catenele H ale diferitelor cla se de imunoglobuline prezinta diferene mari de ordin chimic ntre domeniile echival ente, care merg pna la circa 60% din totalul aminoacizilor. Determinanii antigenici ai unei clase de imunoglobuline sunt comuni tuturor indiv izilor unei specii i se evideniaza n serul imun heterolog, obinut prin imunizarea or

ganismelor altei specii. De exemplu, un antiser faa de lanul uman , obinut pe iepur e, va precipita numai anticorpii clasei IgG din orice ser uman. Ulterior, determinanii antigenici s-au identificat i n regiunile constante ale cate nelor L. Determinanii antigenici ai catenelor L determina tipurile de imunoglobul ine. Catena L are doua variante antigenice, notate cu k i l, care se gasesc la toate c ele 5 clase de imunoglobuline. Cele doua tipuri structurale de lanuri L (k i l) pr ezinta deosebiri de secvena a aminoacizilor n regiunea constanta i nu au determinani antigenici comuni. De aceea, nu dau reacii imune ncruciate. Serul imun heterolog a nti-molecule de imunoglobuline umane cu catena Lk, obinut pe iepure, precipita to ate moleculele de imunoglobuline umane care conin catena Lk, indiferent de clasa. Serul imun anti-Lk nu precipita moleculele de imunoglobuline care conin catena L l. O molecula de imunoglobulina are doua catene de tip k sau l. Formula generala a diferitelor clase de imunoglobuline este g2k2 (sau g 2 l 2), m2k2 (m2 l 2), a2k2 (a2 l 2). Catenele L de tip k i l determina tipurile moleculare de imunoglobuline. La om, r aportul Ig k/ l este 7/3, iar la oarece este 19/1, valori care probabil reflecta raportul numeric al genelor codificatoare pentru cele doua tipuri de catene. Izotipurile catenelor H nu influeneaza funcia de specificitate a moleculelor de im unoglobuline: acelai antigen poate fi legat de oricare din cele 5 clase de imunog lobuline. Pe lnga variantele antigenice menionate ? clase i tipuri ? s-au identificat diferene mai subtile ale moleculelor de IgG i IgA, n ceea ce privete proprietaile fizice, ch imice i biologice, diferene care corespund subclaselor antigenice. Aceasta nseamna ca, pe lnga determinanii antigenici de clasa, exista i alte variante antigenice ale regiunii constante ale catenei H, corespunzatoare subclaselor. Ele se noteaza c u litera clasei, urmata de o cifra: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, respectiv IgA1, IgA2 . Moleculele de imunoglobuline ale subclaselor au n comun determinanii antigenici pr oprii fiecarei subclase, aducnd un nivel superior de heterogenitate a catenelor H . Diferenele secvenei de aminoacizi ai catenei H, ntre diferite subclase sunt mici: 2 4 de aminoacizi ntre IgG1 i IgG4. Cea mai importanta deosebire consta n numarul leg aturilor S-S intercatenare. Moleculele diferitelor subclase sunt sintetizate de celule diferite. Variantele alotipice Descoperirea alotipiei (alos = altul) a pornit de la urmatorul fapt de observaie: n serul pacienilor cu artrita cronica reumatoida se gasesc molecule de tip specia l, ncadrate n categoria factorilor reumatoizi (FR). Factorii reumatoizi sunt molec ule de auto-anticorpi, adica IgM anti- IgG. Factorii reumatoizi se evideniaza in vitro, prin capacitatea lor de a determina a glutinarea eritrocitelor tapetate cu o doza subaglutinanta de anticorpi specific i antieritrocitari (IgG). Grubb (1956) a observat ca FR seric, uneori, aglutineaza hematiile tapetate cu a uto-anticorpi specifici (care se sintetizeaza n anemia hemolitica autoimuna) ale unor pacieni, iar alteori, reacia de hemaglutinare nu se produce, testul evidenieri

i FR in vitro fiind fals negativ. Concluzia reaciei de hemaglutinare pe care, une ori, FR din serul pacienilor de artrita reumatoida o produce asupra hematiilor ta petate cu o doza subaglutinanta de anticorpi specifici, a fost urmatoarea: autoa nticorpii de pe suprafaa eritrocitelor unor indivizi cu anemie hemolitica autoimu na, poseda determinani antigenici diferii, pe care FR poate sa-i recunoasca. Astfe l s-a dedus ca moleculele de imunoglobulina de la indivizi diferii, sunt diferite din punct de vedere antigenic. n consecina, imunizarea unui individ cu imunoglobu linele provenite de la alt individ al aceleiai specii, determina sinteza anticorp ilor faa de determinanii antigenici ai moleculelor imunoglobulinice ale donorului. Imunoglobulinele sunt aloantigene ineficiente daca sunt injectate ca proteine so lubile n organismul uman. De aceea, transfuziile de snge total, de plasma sau inje ctarea imunoglobulinelor solubile, de cele mai multe ori, nu induc sinteza antic orpilor anti-imunoglobuline ale donorului. Moleculele de imunoglobuline devin an tigenice dupa asocierea lor cu adjuvantul Freund. Semnificaia variantelor antigenice alotipice ale moleculelor de imunoglobuline es te analoga celei a antigenelor de grup sanguin. Fenomenul este general, adica i a lte molecule provenite de la un organism pot fi imunogene pentru alte organisme ale aceleiai specii, la care se comporta ca aloantigene. Variantele alotipice ale imunoglobulinelor se detecteaza n reacia de precipitare c u aloantiseruri obinute pe organisme ale aceleiai specii, dar cu alotip diferit de acela al organismului donor al antigenului imunoglobulinic. Variantele moleculare alotipice sunt consecina existenei genelor alele perechi (aa ), o caracteristica generala a organismelor diploide. Prin mutaii succesive, n ace lai locus, apar mai multe alele care formeaza o serie polialelica - a1, a2, a3 ?? an. Genele alele ocupa acelai locus pe cromosomii omologi, ca i gena de tip salba tic a. Fiecare individ va avea o combinaie de gene alele: aa1, aa2 ?.. aan sau a1 a2, a1a3 ?? a1an, cu variante antigenice distincte. Alotipurile imunoglobulinelor sunt rezultatul variaiilor secvenei aminoacizilor n r egiunile constante ale catenelor H i L, ceea ce le confera un grad superior de he terogenitate, consecina a alelelor codominante la acelai locus. Pentru moleculele imunoglobulinice umane s-au descris trei categorii de markeri alotipici: - factorii Gm (gama marker), numerotai de la 1 la 25, pe catena H a subclaselor de IgG. De exemplu, markerul G1m(a) pe moleculele de IgG1 are secvena Asp-Glu-Leu -Thr-Lys, iar moleculele altor indivizi au secvena Glu-Glu-Met-Thr-Lys, adica doi aminoacizi diferii. Pentru IgG3 sau descris 14 alele; - factorii A2m(1) i A2m(2), identificai pe catenele H ale subclasei IgA2; - factorii Km(Inv), pe catenele Lk, n numar de trei; - doua variante alelice pentru IgE. Foarte rar, determinanii antigenici alotipici sunt localizai n domeniile variabile ale moleculei. Ca i n alte sisteme alelice, indivizii pot fi homozigoi sau heterozigoi pentru genel e care codifica markerii. Genele se exprima codominant i se transmit n descendena d upa mecanismul mendelian. De exemplu, alotipurile b4b5 pe catenele L ale imunogl obulinelor de iepure se exprima astfel: un organism homozigot b4b4 sau b5b5 expr ima alotipul b4, respectiv b5. Dar genotipul b4b5 rezultat n descendena lor expri ma markerul b4 pe o fracie a moleculelor i markerul b5, pe restul moleculelor de i munoglobuline.

Variantele idiotipice Idiotipul (idios = individual) este reprezentat de o populaie omogena de molecule de anticorpi, sintetizate de descendenii unei clone celulare, care recunosc i se combina cu un singur determinant antigenic (epitop). Specificitatea idiotipica a unei populaii de anticorpi s-a dedus pe cale experime ntala: - antigenul (celule de S. typhi) s-a injectat la organismele A i B (iepuri), ide ntice din punct de vedere genetic. Se sintetizeaza anticorpi aglutinani anti S. typhi; - anticorpii aglutinani 1(produi de organismul A) s-au injectat la organismul C ( iepure din aceiai linie genetica). Se sintetizeaza anticorpi anti-anticorpi 1, ev ideniai n reacia de precipitare. Surprinzator, anticorpii anti-anticorpi 1 nu precipita anticorpii 2, dei anticorp ii 1 i anticorpii 2 au aceiai specificitate faa de antigenele S. typhi, iar organis mele A, B, C aparin aceluiai alotip. Concluzia este ca anticorpii 1 i anticorpii 2, dei au aceiai specificitate faa de an tigenul de S. typhi, la rndul lor, au determinani antigenici proprii. De aceea, an ticorpii anti-anticorpi 1 nu precipita anticorpii 2, sintetizai de un alt organis m. Moleculele de anticorpi cu aceiai specificitate de combinare faa de un antigen, sintetizate de organisme identice genetic, au o individualitate antigenica dist incta, denumita specificitate idiotipica. Heterogenitatea idiotipica este consecina determinanilor idiotipici, localizai n reg iunile hipervariabile ale catenelor H i L. Specificitatea idiotipica a moleculelo r de anticorpi sintetizai de o clona de celule este conferita de unicitatea secve nei de aminoacizi de la nivelul secvenelor hipervariabile ce participa la formarea situsurilor de combinare, care determina epitopi cu caracter strict individual denumii idiotopi. Unii idiotopi sunt localizai chiar n interiorul situsului de comb inare sau n imediata sa vecinatate. Dovada o constituie faptul ca legarea epitopu lui specific de situsul de combinare a anticorpului, blocheaza ntr-o masura mai m are sau mai mica, legarea anticorpilor anti-idiotipici. Fig. 14. Ilustrarea diagramatica a heterogenitaii anticorpilor. Colecia de idiotopi ai situsului de combinare a unei molecule de imunoglobuline f ormeaza idiotipul ei. Idiotipul este rezultatul configuraiei spaiale unice a regiu nilor hipervariabile ale catenelor H i L, conferita de o secvena unica a aminoaciz ilor. Repertoriul idiotipurilor este de acelai ordin de marime cu acela al specificitaii situsurilor de com-binare. Pentru situsul de combinare al moleculei de imunoglo bulina s-a pro-pus denumirea de paratop. La alcatuirea idiotipului participa ambele catene. Cele doua catene disociate nu pot sa lege anti-idiotipul sau l leaga cu o eficiena foarte scazuta.

p 8

p p

SISTEMUL IMUNITAR

Existena tuturor organismelor vii este condiionata de activitatea unor mecanisme d e rezistena i de imunitate, capabile sa protejeze individualitatea lor chimica, pr in mecanisme de recunoatere i difereniere a substanelor proprii (self) de cele strai ne (nonself). In mod normal, aceste mecanisme sunt perfect tolerante faa de molec ulele self, dar se activeaza i reacioneaza mai mult sau mai puin viguros pentru a nd eparta, a neutraliza sau a distruge substanele nonself. Mecanismele de rezistena i imunitate sunt prezente pe toata scara evolutiva a orga nismelor, ncepnd cu bacteriile i se complexeaza n evoluie. Celulele bacteriene poseda mecanisme de protecie a individualitaii genetice, repre zentate de: - fenomenele de restricie mediate de prezena unor sisteme enzimatice specifice (e nzime de restricie), care recunosc moleculele straine de ADN, le cliveaza la nive lul unor situsuri specifice, rezultnd fragmente mai mici, sensibile la aciunea exo - i endonucleazelor; - fenomenele de reparaie genetica dependente de activitatea unor sisteme enzimat ice care recunosc modificarile ADN induse de mutaii sau de lipsa de fidelitate a mecanismelor de replicare, transcriere i traducere genetica, corectndu-le fie comp let (sistemele error free) sau minimaliznd erorile n cazul sistemelor reparatorii predispuse la erori (error prone systems). La plantele superioare, mijloacele de aparare specifica, aparent sunt absente, d ar exista o gama larga de modalitai de aparare nespecifica: - continuitatea i integritatea esuturilor epidermice, acoperite sau impregnate cu substane impermeabile pentru virusuri i microorganisme; - rezistena fiziologica conferita de coninutul nalt de zaharuri reducatoare, preze na taninurilor, a diferiilor acizi organici, a pseudoanticorpilor cu activitate he maglutinanta n sucurile vegetale. La protozoare, procesele de recunoatere asigura selecia hranei, identificarea part enerilor pentru conjugare la parameci, iar la cele parazite, procesele de recuno atere mediaza interaciunea cu gazda. MECANISME DE APARARE LA NEVERTEBRATE

Dei nu au sistem limfoid, nevertebratele recunosc i raspund la substanele nonself, la fel de eficient ca i vertebratele. La ele funcioneaza o diversitate de mecanism e, unele fiind inductibile. Raspunsul este de scurta durata i nu are specificitat e faa de agentul infecios patogen. Raspunsul imun al nevertebratelor se aseamana c alitativ cu cel nascut al vertebratelor mediat de celulele fagocitare i de molecul

ele neimunoglobulinice. La nevertebrate, apararea organismului este asigurata de bariere fizico-chimice complexe: secreia mucoasa care acopera corpul celenteratelor, anelidelor, molutelo r i protocordatelor, omoara potenialii patogeni. Exoscheletul dur al celenteratelo r, molutelor, artropodelor, echinodermelor i protocordatelor, formeaza o bariera p rotectoare eficace faa de agenii infecioi. Majoritatea nevertebratelor superioare au sistem circulator cu celule albe, denumite hemocite sau celomocite, n funcie de n atura cavitaii corpului. Lipsesc hematiile. n mediul intern al nevertebratelor se gasesc fagocite, factori antimicrobieni con stitutivi i inductibili cu efect neutralizant i litic, factori de coagulare a macr omoleculelor straine. Toate nevertebratele, chiar cele care nu au cavitai ale cor pului (spongieri, anemone, viermi lai), au fagocite, uneori de mai multe tipuri. Ca i la vertebrate, fagocitele sunt efectorii raspunsului inflamator, sintetizeaz a enzime lizosomale i poseda mecanisme citocide dependente de superoxid. Reaciile de aparare (repararea tisulara, fagocitoza, reacia de ncapsulare)sunt medi ate de fagocite i de celulele hemostatice. Ingestia microorganismelor invadatoare este rezultatul aciunii fagocitelor, iar un numar mare de microorganisme i de met azoare parazite este ncapsulat de celulele hemostatice i de tip fagocitar. Endopar azitul care patrunde n organismul nevertebratelor este fagocitat, sau daca are di mensiuni prea mari, este ncapsulat. Incapsularea este rezultatul unei fagocitoze fruste. Adeseori, endoparazitul ncapsulat, este omort sub aciunea intermediarilor t oxici ai unei cascade enzimatice. La nevertebrate lipsesc limfocitele i moleculele de imunoglobuline, dar acestea s unt compensate de o varietate de factori umorali de aparare: aglutinine, lizozim , bactericidine, enzime lizosomale, factori de imobilizare. La insecte s-au dete ctat peste 15 tipuri de proteine antibacteriene inductibile n cteva ore dupa injec tarea unui antigen. Nevertebratele nu au proteinele cascadei complementare, dar viermii, insectele, crustaceii conin sistemul profenoloxidazei. Componentele acestui sistem sunt acti vate de o serie de enzime. La capatul cascadei de activare se formeaza enzima ac tiva fenoloxidaza, cu rol esenial n ndepartarea substanelor nonself. Fig.26. Un mecanism posibil de activare a profenoloxidazei la fenoloxidaza, la a rtropode. Activarea este stimulata de leziunile tisulare, de infecia cu microorga nisme, de schimbari ale concentraiei ionilor de Ca2+ i ale valorii pH, care pot du ce la coagularea plasmei i generarea factorilor care mediaza evenimentele ulteri oare ale imunitaii (dupa Roitt, 1997). Fagocitoza este foarte activa i este stimulata de aglutininele i bactericidinele c u rol de opsonine. Din punct de vedere funcional, aglutininele i bactericidinele s unt similare anticorpilor. Acestea sunt lectine, cu rolul de a lega componenta g lucidica a glicoproteinelor de pe suprafaa celulelor nonself, rezultatul fiind ag lutinarea. Lectinele sunt molecule care au aparut timpuriu n evoluie i sunt ubicvitare: se gas esc la bacterii, plante, nevertebrate i vertebrate. Ele tapeteaza microorganismel e invadatoare i au rolul de a le imobiliza, dar au i rol opsonizant, uurnd fagocitoz a. In funcie de specificitatea lor de legare cu glucidele, lectinele sunt foarte diferite. n corpul gras al insectelor superioare s-au caracterizat circa 100 de peptide ant imicrobiene, a caror sinteza rapida este indusa de infecie. Din punct de vedere s tructural sunt de doua tipuri: - peptide ciclice, care conin puni S-S (de exemplu, drosmycina), active faa de bac teriile Gram pozitive i faa de fungi;

- peptide lineare (cecropine bogate n Gly i Pro), active faa de bacteriile Gram ne gative. Componentele celulare i humorale cu funcii protectoare mediaza reacii de aparare ne specifice (nascute), fara raspuns accelerat la stimularea antigenica secundara. ORGANIZAREA SISTEMULUI IMUNITAR LA VERTEBRATE

La vertebrate, apararea este asigurata de mecanisme complicate celulare i humoral e, de rezistena i imunitate. Funcia eseniala a sistemelor de aparare este protecia fa de agenii patogeni invadatori. Interaciunea permanenta cu microorganismele are un rol hotartor n dobndirea complexitaii structurale i funcionale a sistemului imunitar Dovada o constituie faptul ca la animalele germ-free (axenice), numarul limfoci telor B i titrul anticorpilor serici naturali sunt de 5-10 ori mai mici dect la or ganismele convenionale. Evoluia a generat tipuri celulare specializate, tot mai ef iciente funcional, care neutralizeaza, sechestreaza, omoara sau ndeparteaza agenii infecioi. La vertebrate, reaciile de aparare sunt rezultatul aciunii unor factori humorali n especifici (complement, substane bactericide) i specifici (anticorpi) i a unor popu laii de celule specializate, cu aciune nespecifica (fagocite) sau specifica (limfo cite). Din punct de vedere structural, n concepia moderna, sistemul imunitar al organisme lor superioare este considerat ca un organ difuz sui-generis, alcatuit dintr-un numar foarte mare de molecule i celule, reunite ntr-o reea de interaciuni complexe, a carei funcie este asigurarea integritaii i individualitaii structurale a organismu lui. n concepia restrictiva a lui N.K. Jerne, sistemul imunitar este reprezentat n exclu sivitate de limfocite, iar ntr-o accepiune mai larga, pe lnga limfocite, n alcatuire a sistemului imunitar intra o serie de celule accesorii cu rol esenial n declanarea raspunsului imun: macrofagele i o serie de celule nrudite(celulele Lagerhans din tegument, celulele dendritice i cele interdigitate). Se apreciaza ca numarul limfocitelor, la adultul normal, este de 1012, iar al mo leculelor de imunoglobuline, de ordinul a 1020. Impreuna, aceste componente form eaza organul difuz, cu greutatea de circa 910 g (1-2% din greutatea corpului), a carui existena este adeseori ignorata, datorita caracterului sau difuz, n tot org anismul. Celulele i moleculele sistemului imunitar sunt prezente n toate esuturile, dar n unele organe (splina, ganglioni limfatici, placi Peyer, amigdale, timus), componentele celulare au o densitate maxima. Sistemul imunitar este unul din cele mai complexe ale organismului. Complexitate a lui deriva din structura de reea complicata de comunicaii intercelulare, din ubi cvitatea sa n organism i din efectele multiple pe care le determina un numar mic d e categorii celulare. Sistemul imunitar este considerat un adevarat ?creier mobi l?. Din punct de vedere structural i funcional, sistemul de aparare al organismelor su perioare prezinta numeroase dualitai: - existena unui compartiment al rezistenei nespecifice i neadaptative (nascuta) i a unui compartiment cu aciune specifica i adaptativa (sistemul im unitar);

- prezena a doua populaii nclinate de limfocite (T i B), care mediaza imunitatea ce lulara i respectiv humorala; - activitatea limfocitelor este modulata fie stimulator, fie inhibitor, sub aciu nea unor celule i a unor factori humorali; - existena organelor limfoide centrale (primare) i periferice (secundare); - existena unui raspuns imun primar i a unui raspuns imun secundar; - dualitatea structurala (doua perechi de catene polipeptidice) i funcionala (biv alena) a moleculei de anticorp; - comportamentul dublu al moleculei de anticorp: molecula de anticorp recunoate epitopul specific i la rndul ei este recunoscuta de molecule cu rol receptor. Numarul celulelor sistemului imunitar (cu un ordin de marime superior neuronilor ) i al moleculelor sale nu reflecta fidel potenialul de aparare a organismului, de oarece n cursul raspunsului imun are loc proliferarea i amplificarea numerica a li mfocitelor, precum i a potenialului de biosinteza. La aceasta se adauga o rata nalt a de renoire i refacere a rezervelor sale celulare. La om se produc zilnic un miliard de limfocite ce trec n circulaie. Circulnd i recir culnd prin reeaua vaselor sanguine i limfatice, celulele i moleculele sistemului imu nitar asigura supravegherea organismului, recunoaterea moleculelor i a celulelor n onself, pentru a le elimina. Limfocitele Sistemul imunitar este reprezentat de esuturi derivate din mezoderm, a caror prin cipala componenta celulara este limfocitul. De aici deriva denumirea de sistem l imfoid. In ultimul timp se folosete denumirea de ?limfon?, care semnifica totalit atea organelor limfoide ? primare i secundare, precum i celulele componente cu fun cia de a recunoate antigenul. Limfocitele sunt celule care n cursul elaborarii raspunsului imun, recunosc speci fic antigenul i de aceea se mai numesc imunocite. De aici deriva denumirea de sis tem imunocitar, echivalenta celei de sistem limfoid. Toate celulele acestui sist em poarta pe suprafaa lor, molecule cu rol receptor, capabile sa recunoasca speci fic determinanii antigenici straini. Sistemul imunitar funcioneaza pe baza interaciunii dintre semnal (antigen) i recept orul specific limfocitar preformat. n concepia moderna, limfocitul este celula centrala a sistemului imunitar. Ea nu e ste celula ?cap de serie? ? aa cum o considerau vechii histologi, ci prezinta o e xtraordinara capacitate de reactivitate i difereniere. Numarul limfocitelor. Copiii au un numar mai mare de limfocite i de aceea vrsta trebuie considerata ca u n parametru fiziologic de variaie, n evaluarea numerica a acestor celule. Ele repr ezinta 25-33% din totalul leucocitelor, adica circa 2100 celule/mm3 de snge. Valo ri mai mici de 1500 limfocite/mm3 semnifica starea de limfocitopenie i cel mai ad esea semnifica un deficit numeric al limfocitelor T. Pna n anii ?50, limfocitele erau distinse numai dupa dimensiuni: mari, mijlocii i m ici. Cele mai multe limfocite circulante au dimensiuni mici: 7-10 m diametru. La microscopul optic, pe frotiul colorat May Grunwald ? Giemsa, limfocitele se dist

ing de celelalte dupa dimensiuni, sunt agranulare i au cel mai mare raport nucleo citoplasmatic. Limfocitele mari au un raport nucleocitoplasmatic mai mic i n citop lasma se gasesc granulaii azurofile. Se numesc limfocite granulare mari (LGL). In vitro, limfocitele sunt neaderente i nu fagociteaza. Astazi, Imunologia are la baza conceptul unei heterogenitai funcionale nelimitate a limfocitelor, care deriva din diversitatea specificitaii receptorilor suprafeei lor. Populaia de limfocite care are receptori identici de antigen i recunoate un singur epitop (sau civa nrudii) formeaza o clona. Toate celulele unei clone sunt descendent e ale unei singure celule-mama. In consecina, n organism sunt tot attea clone de li mfocite, cte tipuri de determinani antigenici exista (teoretic) n natura. Corespond ena complementaritaii spaiale dintre receptorii limfocitari de antigene i epitopii a ntigenici asigura posibilitatea elaborarii unui raspuns imun specific, dupa cont actul limfocitelor cu oricare dintre epitopi. Caracterizarea funcionala a limfocitelor este rezultatul cercetarilor ntreprinse d upa anul 1960. n raport cu organul limfoid primar n care se produce diferenierea i m aturarea, Roitt i col. (1966) au mparit limfocitele n doua categorii distincte; - limfocite T, care se difereniaza i se matureaza n timus; - limfocite B, care se difereniaza i se matureaza n bursa lui Fabricius la pasari i n echivalenii ei funcionali, la mamifere. n funcie de capacitatea lor de a interaciona cu antigenul specific, limfocitele sun t: - incompetente (imature), cele care nu recunosc antigenul; - competente (mature), cele care recunosc antigenul specific. Starea de competena este condiionata de prezena receptorilor prin intermediul caror a antigenele sunt recunoscute. Pe suprafaa unei celule pot fi pna la 100 000 de mo lecule receptoare identice, care ateapta ntlnirea cu substanele nonself corespunzato are. Dupa ce limfocitul i-a dobndit competena n unul din organele limfoide primare, poate sa ramna n repaus, daca organismul nu a recepionat mesajul antigenic corespunzator . Aceste limfocite sunt neangajate (neinformate sau naive). Cele care au venit n contact cu antigenul specific sunt limfocite angajate (informate). Ele constitui e substratul material al memoriei imunologice i ori de cte ori se vor rentlni cu ant igenul, vor produce un raspuns imun rapid i amplu. Dupa durata vieii, limfocitele sunt: - cu viaa scurta (efectoare ale raspunsului imun); - cu viaa lunga (de memorie). Ele recircula n organism perioade ndelungate (de ord inul anilor). La om, limfocitele de memorie ar supravieui circa 10 ani, fara sa s e divida. n raport cu funcia pe care o ndeplinesc, se disting urmatoarele categorii de limfoc ite: - efectoare, cele care direct sau indirect, prin molecule efectoare, neutralize aza antigenul; - reglatoare, cele care ralizeaza echilibrul optim al raspunsului imun.

Limfocitele B Limfocitele B reprezinta 5-15% din totalul limfocitelor circulante i constituie o diviziune funcionala majora a populaiei limfocitare. Impreuna cu descendenii lor d ifereniai (limfoblastul, plasmocitul), limfocitele B sintetizeaza anticorpi, efect orii raspunsului imun mediat humoral (RIMH). Limfocitul B imunocompetent (matur, neangajat) sintetizeaza cantitai mici de mole cule ale unui izotip de imunoglobuline, care ramn legate de membrana limfocitului , avnd rol de receptori de antigen, adevarate ?antene? de detectare a antigenului specific. Sub aspectul specificitaii de legare a antigenului, fiecare organism poseda milio ane de clone de limfocite B, adica mici populaii celulare identice, descendente d in aceiai celula mama, care recunosc i leaga acelai antigen i produc anticorpi cu ac eiai configuraie spaiala a situsului de combinare. Dupa activare, toi descendenii limfocitului B sintetizeaza imunoglobuline i le secr eta ca anticorpi, cu aceiai specificitate de legare pe care a avut-o receptorul. Receptorul de antigen al limfocitelor B. Majoritatea limfocitelor B umane din sng ele periferic exprima doua izotipuri de imunoglobuline pe suprafaa lor: IgM i IgD sau numai IgD. Situsurile de legare ale celor doua izotipuri sunt identice. Numa i 10% dintre limfocitele B au pe suprafaa lor, ca receptor de antigen, molecule d e IgG, IgA sau IgE. Cele care au ca receptor molecule de IgA, sunt localizate n es utul limfoid asociat mucoaselor. Moleculele receptoare de imunoglobulina sunt inclavate cu capatul C-terminal n membrana. Intre IgM legat de membrana (IgMm), cu funcia de receptor d e antigen i IgM seric (IgMs), sunt doua deosebiri majore: - IgMm conine o secvena C-terminala hidrofoba, prin care se ancoreaza n membrana li mfocitelor mature neangajate, care nu au venit n contact cu antigenul; - IgMm este monomer, iar IgM seric este pentamer. Secvena C-terminala a IgMm cuprinde 25 de aminoacizi hidrofobi ce formeaza domeni ul transmembranar, urmat de o secvena cationica Lys-Val-Lys. Ca la toate proteine le ancorate n membrana, acest domeniu formeaza un ?-helix, cu o lungime suficient a pentru a strabate membrana. Fiind hidrofoba, secvena de aminoacizi are interaciu ni strnse cu lipidele membranei. Secvena cationica se extinde n citoplasma, marind gradul de stabilitate a moleculei n membrana celulara. Dupa stimularea antigenica, sinteza se comuta la IgM seric. Trecerea de la IgMm la IgMs este rezultatul unor diferene ale modului de prelucrare a ARN premesager. Copia de ARN premesager pentru sinteza catenei (H) are doua situsuri poteniale de clivare i ataare a resturilor de poli-A, ce marcheaza capatul ARNm. Dupa stimular ea antigenica, din ARN premesager sunt clivate secvenele codificatoare ale domeni ului C-terminal hidrofob i se sintetizeaza molecule de IgM fara secvena C-terminal a de aminoacizi hidrofobi. Comutarea IgMm --- IgMs nu modifica lanul L al moleculei. Cele doua forme ale IgM au domenii identice VH i VL, adica au aceiai specificitate de legare a antigenulu i (au acelai idiotip). Limfocitul B are receptori membranari pentru substanele mitogene, pentru compleme nt (C3b), pentru regiunea Fc a imunoglobulinelor, pentru insulina etc. Receptoru l pentru C3b funcioneaza i ca receptor pentru virusul Epstein-Barr. Limfocitele B neactivate au receptori de mica afinitate pentru IL-2, dar dupa stimularea antig

enica, ele exprima rapid, receptori pentru IL-2 de nalta afinitate. Limfocitele B raspund la efectul stimulator al IL-2, prin proliferare rapida i secreia IgM. Pe suprafaa limfocitelor B se gasesc la densitate nalta, moleculele CMH II. Limfocitele T Limfocitele T reprezinta pna la 80% din totalul limfocitelor circulante. Valorile normale n snge, pentru limfocitele T sunt cuprinse ntre 1620-4320/mm3, ntre una i 18 luni de viaa i ntre 590-3090/mm3, dupa 18 luni. Proporia limfocitelor T se poate determina prin metoda rozetelor cu hematii de be rbec sau prin metoda imunofluorescenei cu anticorpi monoclonali faa de receptorul de antigen. Limfocitele T mature exprima markerul* CD4** sau CD8. Aceste molecule aparin sup rafamiliei imunoglobulinelor. Celulele CD4 au de obicei funcie helper, iar cele c e exprima markerul CD8 sunt citotoxice. Limfocitele T ndeplinesc funcii complexe, att efectoare ale raspunsului imun mediat celular ct i reglatoare, prin intermediul unor factori humorali pe care-i secreta , denumii limfochine. Limfocitele T realizeaza urmatoarele funcii: ? lizeaza celulele care exprima molecule nonself pe suprafaa lor; ? regleaza raspunsul imun; ? mediaza reaciile de hipersensibilitate ntrziata. Aceste funcii sunt rezultatul heterogenitaii funcionale i se datoreaza activarii u nor subpopulaii distincte de limfocite T: - limfocite Tc (Tcl, citotoxice sau citolitice) exprima pe suprafaa lor markerul T8 (CD8); - limfocite Th (helper) au pe suprafaa markerul CD4. Acestea sunt cele mai numer oase, reprezentnd 60-65% din numarul total de limfocite T ale organismului uman; - limfocite Ts (supresoare), purtatoare ale markerului CD4; - limfocite TD sau TDH (delayed hypersensitivity) exprima markerul CD8. Funciile limfocitelor Th se realizeaza prin intermediul limfochinelor secretate. In funcie de limfochinele pe care le sintetizeaza, limfocitele Th se clasifica n d oua subseturi:Th-1 i Th-2. Celulele Th-1 (Th-c) secreta IFN gama, IL-2 i TNF beta (citochine de tip 1, stimu latoare ale imunitaii mediate celular). Citochinele de tip 1 produc urmatoarele e fecte: stimuleaza reacia de citotoxicitate i inflamatorie asociata cu reaciile de h ipersensibilitate ntrziata. In esena, limfocitele Th-1 au rol n edificarea unui rasp uns imun mediar celular (RIMC). Celulele Th-2 (Th-b) secreta citochine de tip 2: IL-4, IL-5, IL-6 i IL-10 (dar nu secreta Il-2) i stimuleaza activitatea limfocitelor B de memorie. Citochinele ti p 2 (IL-4, IL-5) stimuleaza raspunsul imun humoral faa de paraziii extracelulari ( stimuleaza diferenierea limfocitelor B spre plasmocit) i instalarea starilor alerg ice prin capacitatea lor de a induce sinteza IgE i de a stimula mastocitele. In e sena, limfocitele Th-2 sunt implicate n edificarea raspunsului imun mediat humoral (RIMH). Prin toate aceste efecte, limfocitele Th sunt amplificatoare ale raspun sului imun

Limfocitele CD8 (T citototoxice) reprezinta 25-35% dintre limfocitele T circulan te. Funcia lor consta n efectul litic prin contact celular direct asupra celulelor infectate cu virusuri, malignizate sau alogenice. Limfocitele TD sunt mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate ntrziata (delaye d) de tip tuberculinic. Ele secreta limfochine cu efecte locale asupra macrofage lor i limfocitelor din focarul inflamator. Limfocitele Ts sunt inhibitoare ale amplitudinii raspunsului imun, dupa epuizare a antigenului. Ele au rolul de a diminua intensitatea RIMC i RIMH, meninnd n limite fiziologice intensitatea reaciilor imunitare. Se pare ca i exercita rolul supresor asupra raspunsului imun, prin inhibarea activitaii limfocitelor Th, dar au i efect supresor direct asupra limfocitelor T i B efectoare. Limfocitele Ts au rol impor tant n inducerea starii de tolerana faa de antigenele exogene, ca i faa de moleculele self. Deficienele funcionale ale limfocitelor Ts creeaza predispoziii pentru malad iile autoimune. Distincia funcionala ntre limfocitele TCD4 i TCD8 nu este totdeauna neta. Unele clon e de limfocite TCD4 au proprietai citotoxice, iar unele clone TCD8, dupa contactu l cu antigenul, prolifereaza i secreta limfochine, ca i limfocitele TCD4. Receptorul de antigen al limfocitelor T (RCT) Dei moleculele de anticorpi au fost printre primele a caror structura chimica s-a identificat, caracterizarea biochimica a receptorului de antigen al celulelor T s-a facut foarte greu, deoarece nu a existat un echivalent celular T al tumoril or de mielom. Molecula cu rol de receptor de antigen a limfocitelor T s-a identi ficat recent, dupa ce a fost posibila cultivarea liniilor de hibridom de celule T. Moleculele receptoare de antigen ale limfocitelor T au o larga variaie biochimica, corespunzatoare specificitaii de legare a spectrului foarte la rg de antigene. Ca i n cazul anticorpilor, pentru receptorul de antigen al celulelor T, se folosete termenul de ?idiotip? (Ti), pentru a desemna o molecula a RCT cu un set unic de epitopi asociai, derivai din configuraia sa spaiala unica, complementara pentru leg area specifica a unui epitop antigenic. Pentru izolarea i identificarea receptorului Ti s-au utilizat anticorpi monoclona li (AMC) anti- Ti, care precipita specific moleculele Ti dintr-un amestec comple x de proteine membranare. Examinarea peptidelor n imunoprecipitatele diferitelor clone de celule T, prin metoda electroforezei n SDS-poliacrilamida, a evideniat ca RCT este un heterodimer i consta dintr-o glicoproteina de 80-90 kD, care n condiii reducatoare se disociaza n doua peptide de 40 i respectiv 43 kD. Molecula ntreaga consta dintr-o pereche de lanuri peptidice, similare ca dimensiuni, legate prin p uni S-S.

Lanul ?

Lanul Fig. 27. Structura receptorului de antigen al limfocitului T. Molecula este un h

eterodimer format din lanurile ? i , care se extind prin membrana celulara i au scur te poriuni citoplasmatice. Complexul T3 este alcatuit din 4 subunitai proteice (?, ?i 2 ?), localizate i dublul strat lipidic i n citoplasma.

Cele doua peptide sunt distincte i s-au notat ? i . Lanul ? are 248 aminoacizi, cu p unctul izoelectric la pH = 5,0-5,5. Lanul are 282 aminoacizi, iar punctul izoelec tric este la pH 6,5-7,0. Fiecare catena are 4 domenii: unul variabil (V ?, respectiv V ), unul constant (C ?, respectiv C ), unul transmembranar i unul intracitoplasmatic. Astfel alcatuit a, molecula RCT face parte din suprafamilia moleculelor imunoglobulinice. Prin d imensiuni se aseamana cu lanul L al imuno-globulinelor: domeniul variabil al fiec arui lan are 110 aminoacizi, dar pentru ca se ancoreaza n membrana, se aseamana cu lanul H. Domeniile variabile (? i ) sunt extrem de variabile (ca i regiunile variabile ale c elor doua catene ale imunoglobulinelor) i participa la formarea situsului de comb inare al RCT. Situsul de combinare al RCT este alcatuit din regiunile hipervariabile sau regiu nile determinante de complementaritate ?RDC (3 ale catenei ? i 4 ale catenei ) i es te aplatizat, adaptat funciei sale de a lega suprafaa aplatizata a moleculelor CMH . La om, RCT heterodimer este asociat cu molecula T3, o grupare de trei peptide as ociate necovalent. Funcia probabila a lui T3 este aceea de transductor al semnalu lui de activare, de la Ti la citoplasma, constituind, prin modificari conformaion ale, un canal de trecere a ionilor de Ca2+ prin membrana, dupa ce receptorul a l egat epitopul specific. S-au identificat doua tipuri de RCT: Fig.28.a. Subseturi majore de celule T Fig. 28.b. Subseturi funcionale de celule T CD4+ Subseturi de limfocite T, n funcie de tipul de RCT (RCT-2, RCT-2). Limfocitele RCT -1 au un repertoriu restrns de interaciune cu antigenul, dar nu manifesta fenomenu l restriciei CMH. Limfocitele RCT-2 exprima CD4 sau CD8, care determina recunoater ea antigenului asociat cu moleculele CMH II sau CMH I. Limfocitele TCR-2+ CD4+ s unt divizate pe baza limfochinelor pe care le secreta, n subseturi de celule Th1( stimulatoare ale IMC) i Th2 (stimulatoare ale IMH) (dupa Roitt, 1997). - RCT-2 este heterodimerul format din polipeptidele ? i , legate prin puni S-S, pre zent pe suprafaa a circa 90% dintre limfocitele T; - RCT-1 este asemanator structural cu RCT-2, dar consta din polipeptidele ? i ?, cu o alta specificitate antigenica, identificata prin intermediul anticorpilor m onoclonali. Se gasete pe suprafaa a 0,5-15% dintre limfocitele T circulante umane, dar este mai frecvent pe limfocitele intraepiteliale ale mucoasei intestinale. Limfocitele T ?/? exprima markerul CD3 i recunosc antigenul printr-un mecanism as emanator cu acela al limfocitelor T ?/, adica recunosc epitopii asociai cu molecul ele CMH I i II, dar frecvent par sa interacioneze cu molecule CMH neclasice, iar s pecificitatea interaciunii lor cu epitopii antigenici este limitata. Aceste limfo cite pot sa recunoasca antigene neconvenionale, ca de exemplu, proteinele de oc te rmic i antigenele nepeptidice (glucidice).

n general, limfocitele cu RCT-1 ( ?/?) sunt negative pentru markerul CD4 i pentru CD8, dei unele exprima nivele scazute ale unuia dintre markeri. Unele studii sugereaza ca aceste celule contribuie la raspunsul iniial al gazdei, la diferii ageni infecioi: virusuri, bacterii(n special micobacterii), parazii, dar la raspunsul anti-tumoral. Ele par sa constituie ?prima linie de aparare?. Ipote za este n acord cu localizarea lor anatomica, la poarta de intrare n organism, n esu turile nelimfoide (tegument, intestin), dar i n situsurile inflamatorii. Limfocite le T ?/? se aglomereaza n focarele inflamatoare cronice(membrana sinoviala, leziu nile asociate cu lupusul eritematos diseminat). La rumegatoare, 30-80% din totalul limfocitelor T circulante au receptor ?/?, va lorile maxime nregistrndu-se la organismele nou-nascute. La alte specii, numarul a cestor limfocite T este mic. Abundena lor numerica la rumegatoare este corelata, probabil, cu bacteriemia masiva care nsoete procesul digestiv. n esena, markerii RCT i CD3 sunt definitorii pentru limfocitele T. Limfocitele T au un marker distinctiv pe suprafaa lor, faa de limfocitele B: Thy 1 (CD90). Acest marker poate fi exprimat i pe alte tipuri celulare i lipsete la o mi ca proporie a limfocitelor T. Celulele NK Celulele NK (natural killer) reprezinta circa 15% din totalul limfocitelor sangu ine. Ele deriva din maduva osoasa i au origine comuna (acelai progenitor), ca i cel ulele T. In vitro, sunt neaderente i nefagocitare, ceea ce le aseamana cu limfoci tele. Din punct de vedere morfologic, celulele NK sunt mari, granulare (LGL, lar ge granular lymphocytes), avnd citoplasma mai bogata dect celelalte limfocite, cu granulaii azurofile. Celulele NK nu au nici unul din receptorii de antigen caracteristici limfocitelo r T sau B i de aceea au fost denumite celule ?nule?. Celulele NK au pe suprafaa lor unii markeri caracteristici limfocitelor: au recep tor pentru Fc ? de mica afinitate, formeaza rozete E, au receptor de mica afinit ate pentru IL-2, produc IL-2 i IFN ?. Au i receptori caracteristici seriei mieloid e. n dezvoltarea lor, celulele NK nu sunt dependente de timus.

Celulele NK au viaa scurta i reprezinta o linie importanta, primordiala n evoluie, c u rol esenial n mecanismele de aparare nascuta a organismului: sunt active n resping erea grefelor i a celulelor modificate sub raport antigenic. Funcia celulelor NK e ste de a recunoate i de a liza anumite celule tumorale i celule infectate cu virusu ri. Celulele NK au lizat celulele liniilor B limfoblastoide transformate de EBV, deficiente n molecule CMH I, dar nu au mai lizat aceste inte dupa transfecia cu ge nele HLA-B sau HLA-C. Mecanismul recunoaterii celulelor purtatoare de molecule no nself nu este cunoscut. Se admite ca celulele NK recunosc moleculele CMH i se act iveaza cnd receptorii lor nu ntlnesc moleculele CMH pe suprafaa celulelor inta sau cn moleculele CMH au o densitate mai mica dect cea normala. Efectul interaciunii est e liza celulei inta. Aciunea definitorie a celulelor NK este citotoxicitatea. Ele lizeaza fara restrici e CMH, celulele tumorale sau pe cele infectate cu virusuri. Activitatea celulelor NK este foarte nalta la oarecele nud (fara timus) sau la oare cii timectomizai neonatal. Dupa activare, celulele NK elibereaza IFN ?. Cel mai studiat receptor membranar al celulelor NK este receptorul de mica afini

tate pentru Fc al IgG (CD16). O subpopulaie distincta a celulelor NK o reprezinta celulele K (killer). Ele sunt tot LGL, dar spre deosebire de celulele NK, exprima receptorul de mare afinitat e pentru Fc ?. Aciunea lor principala este citotoxicitatea mediata de anticorpi ( ADCC), faa de celulele modificate antigenic. In vitro, limfocitele T din snge, sub aciunea stimulatoare a unor citochine (IL-2, IFN ?) difereniaza o subpopulaie, care au fost denumite LAK (lymphokine activated killers). In vitro, prin adaugarea IL-2 i a antigenului tumoral, devin citotoxic e faa de celulele tumorale omologe.

* Markerii de suprafaa ai limfocitelor T umane s-au identificat cu dificultate, d atorita naturii outbred a populaiei. S-au notat cu literele TCD, urmate de o cifr a, n ordinea descoperirii: TCD1, TCD2 etc. Anticorpii monoclonali au constituit i nstrumentul esenial de lucru. Cel mai cunoscut este markerul TCD4, deoarece funcio neaza ca receptor pentru HIV. Este un glicopeptid cu o regiune extracelulara for mata din 4 domenii, un domeniu transmembranar i unul citoplasmatic, iar CD8 este dimeric i prezinta un domediu asemanator cu domeniul variabil al moleculei de imu noglobulina. ** CD (cluster designation) se refera la grupele (cluster) de anticorpi monoclon ali utilizai pentru identificarea subpopulaiilor de limfocite. Fiecare grupa de AM C are specificitate faa de un anumit marker celular.

p 8 p p

ANTIGENELE COMPLEXULUI MAJOR DE HISTOCOMPATIBILITATE (C M H)

Existena antigenelor de histocompatibilitate a fost dedusa din faptul ca alogrefe le tegumentare sau de organe, nu sunt viabile n organismul receptor. Dupa 7-10 zi le, esutul transplantat se inflameaza i curnd dupa aceea, grefa este respinsa. Respingerea grefei este de natura imunitara: sistemul imunitar al receptorului d e grefa recunoate ca nonself, anumite molecule ale celulelor grefei i se activeaza . Moleculele de suprafaa ale celulelor grefate, recunoscute ca nonself, sunt denu mite antigene de histocompatibilitate. Ele confera individualitate biochimica fi ecarui individ. Antigenele de histocompatibilitate se definesc ca molecule ale suprafeei celulare i care, datorita diferenelor biochimice individuale sunt recunoscute de sistemul imunitar al unui organism cu un alotip diferit (cu o alta combinaie de gene alele

la situsul codificator). Diversitatea biochimica la nivel individual a acestor molecule, sta la baza unic itaii biochimice a fiecarui individ uman i este determinata de o diversitate genet ica corespunzatoare. Deoarece se comporta ca antigene majore n organismul receptor de grefa, antigenel e CMH se numesc i antigene de transplantare. n funcie de capacitatea lor de a stimula raspunsul imun de respingere a grefei, an tigenele CMH sunt tari i slabe. Antigenele CMH tari reprezinta principala bariera n calea transplantului de esutur i i organe. La oarece, moleculele CMH tari aparin sistemului H-2. Grefele de esuturi i organe ntre organisme care difera prin antigenele complexului H-2 ale suprafeei celulare sunt invariabil respinse n 10-14 zile. Antigenele tari aparin claselor I i II. Antigenele slabe (uoare) sunt codificate de sistemul minor de histo-compatibilita te i determina respingerea lenta a grefei de piele, n circa 200 de zile. La om, corespondentul sistemului molecular antigenic H-2 de la oarece este comple xul antigenic al sistemului HLA (Human Leucocyte Antigen). Denumirea semnifica f aptul ca moleculele sistemului au fost detectate iniial (J. Dausset, 1958), pe suprafaa leucocitelor. Antigenele complexelor H-2 i HLA au o varietate antigenica individuala i de aceea natura lor chimica se poate studia numai n populaii genetic pure (inbred) de oarece , obinute prin mperecheri multiple ntre indivizii aceleiai descendene. Structura moleculara a antigenelor CMH clasa I Antigenele codificate de genele CMH clasa I sunt glicoproteine de membrana, a ca ror regiune C-terminala se gasete n citoplasma, iar cea N-terminala este expusa ex tracelular. O molecula CMH clasa I este alcatuita dintr-un lan H (Heavy) polipeptidic glicozi lat (45 kD), n asociaie strnsa, necovalenta, cu -2 microglobulina (12 kD), un polipe ptid care se gasete i n ser. Catena H este alcatuita din 339 aminoacizi, distribuii n urmatoarele 5 domenii: - trei domenii extracelulare, n regiunea N-terminala, notate cu ?-l, ?-2, ?-3, fi ecare cu cte 90 de aminoacizi. Sub aciunea papainei, pot fi clivate de restul mole culei. Domeniile ?-2 i ?-3 prezinta legaturi S-S intracatenare i formeaza bucle de 63 i respectiv 86 aminoacizi; Fig.52. Reprezentare schematica a structurii moleculelor CMH clasa I, ancorate n membrana citoplasmatica. Catena codificata de gena CMH prezinta 3 domenii globul are (?-1, ?-2, ?-3). Domeniul ?-3 este asociat cu un peptid ? -2 microglobulina, un mic peptid globular de 12 kD cu o structura teriara asemanatoare unui domeniu al Ig, stabilizat printr-o punte S-S. - domeniul transmembranar conine 25 resturi de aminoacizi hidrofobi, care travers eaza membrana. Imediat deasupra acestui domeniu se gasesc 5 aminoacizi bazici (A rg, Leu), tipici pentru proteinele legate de membrana, cu rolul de a ancora lanul polipeptidic n membrana; - domeniul hidrofil cito-plasmatic (30 de aminoacizi la om, 40 la oarece), conine n special serina, unele resturi fiind fosforilate, este implicat n transmiterea semnalului de la domeniile extrac

elulare, la mediatorii citoplasmatici. Acest domeniu conine resturi de cisteina c u rol n legarea prin intermediul punilor S-S, de alte catene H sau de proteine cit oplasmatice. Componenta glucidica este alcatuita din doua grupari, fiecare fiind formata din 12-15 resturi de zaharuri, ataate de domeniile ?-1 i ?-2. Sunt oligozaharide care conin manoza, de care se leaga catene laterale de glucozamina i acid sialic. Catena H are o regiune variabila n jumatatea N-terminala, cu doua subzone hiperva riabile, care difera prin mai mult de 60% din aminoacizi, de la un organism la a ltul, localizate n domeniile ?-1 i ?-2. Studiile prin difracie cu raze X ale domeni ilor extracelulare, cristalizate dupa clivarea cu papaina arata ca domeniile ?-1 i ?-2 sunt foarte asemanatoare ca secvena de amino-acizi i prin pliere formeaza mpr euna o cavitate moleculara, presupusa a fi situsul de legare stabila a epitopulu i antigenic. Cavitatea, susinuta de secvene -pliate ale acelorai domenii ?-1 i ?-2, e ste ocupata de o molecula lineara, care este un peptid ce cristalizeaza concomit ent cu catena H. Situsul cavitar, dupa ce leaga antigenul, formeaza un complex r ecunoscut de limfocitele TCD8. Restul catenei H corespunde regiunii constante. Fig.53.a. Reprezentarea schematica n ?ochi de pasare? a suprafeei superioare a mol eculei CMH clasa I umane, bazata pe structura obinuta n cristalografie cu raze x. Secvenele -pliate care formeaza baza cavitaii sunt marcate prin sagei groase, orient ate n direcia amino-carboxil. Secvenele ?-helicale sunt reprezentate prin liniile g roase spiralate. Suprafeele interne ale celor doua helice i faa superioara a secvene lor -pliate formeaza o cavitate. Cele doua sfere negre reprezinta o legatura S-S ntracatenara. b. Vedere laterala a aceleiai molecule, care arata anatomia cavitaii i plierea dome niilor ?-3 i -2 m (4 catene -pliate antiparalele pe o faa i 3 pe cealalta) (dupa Roit t, 1997) -2 microglobulina (-2 m) (o globulina mica, ce migreaza la electroforeza n regiunea -2) a fost descoperita n 1968, n urina pacienilor cu disfuncie renala provocata de i ntoxicaia cronica cu cadmiu. Este sintetizata de majoritatea celulelor din organi sm. Conine circa 100 aminoacizi, cu uoare variaii numerice. Nu prezinta variabilita te detectabila pe cale chimica sau imunologica i nu este glicozilata. Ca i domeniul ?-3 al catenei H, -2 m prezinta omologie a secvenei de aminoacizi cu domeniile constante ale moleculei de Ig. Secvena de aminoacizi a -2 m formeaza un singur domeniu stabilizat printr-o punte S-S, ntre doua resturi de cisteina. -2 m se asociaza necovalent cu lanul H al moleculei CMH clasa I, prin interaciunea cu domeniul ?-3, dar studiile recente de cristalografie cu raze X, sugereaza un contact extins cu toate cele trei domenii. Moleculele de -2 m legate, se afla n ec hilibru cantitativ cu cele din plasma. Asocierea celor doua catene se face dupa terminarea sintezei lor i este o condiie obligatorie pentru transportul moleculelor CMH I de la reticulul endoplasmic la membrana citoplasmatica i pentru ancorarea lor n membrana. Celulele liniei Daudi ( derivata din limfomul Burkitt), dei sintetizeaza catena H, nu exprima molecule CM H I, deoarece nu sintetizeaza -2 m. Moleculele CMH I au un turnover constant. Cele vechi se elibereaza i trec n circul aie sau sunt endocitate i se sintetizeaza altele noi. Stabilitatea lor este condiio nata de rata disocierii peptidului i -2 m. Catenele H libere se denatureaza i sunt degradate. Moleculele CMH clasa I sunt adevarate ?certificate de identitate? biochimica i ge netica, pentru fiecare organism, datorita polimorfismului lor biochimic foarte a ccentuat. Ele vegheaza la pastrarea homeostaziei biochimice a organismului i devi n inta sistemului imunitar n urmatoarele situaii:

dupa grefarea esuturilor i organelor care poarta molecule incompatibile; dupa ce se asociaza cu antigenele virale, tumorale sau cu cele induse de agenii c himici; dupa modificarea biochimica printr-un proces mutaional. Structura moleculara a antigenelor CMH clasa II Antigenele CMH clasa II-a sunt glicoproteine heterodimere de membrana, formate d in doua catene diferite, notate cu ? i . Prin solubilizare cu detergent, aceste molecule se elibereaza ntregi. Lanul ? are 30-34 kD, iar lanul are 26-29 kD. Fiecare catena este formata din 4 domenii: - doua extracelulare, alcatuite din circa 90 de aminoacizi fiecare, notate cu ?1, ?-2, respectiv -1, -2; un domeniu transmembranar (circa 30 de aminoacizi); un domeniu citoplasmatic (10-15 aminoacizi). Fig. 54. Reprezentarea schematica a moleculelor CMH clasa II-a. Molecula este fo rmata din 2 catene diferite (? i ), legate necovalent, a caror extremitate C-termi nala se insera n citoplasma. Cele doua catene au cte doua domenii globulare, asema natoare cu domeniile Ig. Cu excepia domeniului ?-1, toate celelalte sunt stabiliz ate printr-o punte S-S intracatenara. Cele doua catene sunt glicozilate (dupa Ro itt, 1997). Domeniile ?-1 i -1 au o variabilitate accentuata a secvenei de aminoacizi. Ele se a sociaza pentru a forma o structura ce delimiteaza o cavitate n care este legat pe ptidul antigenic. Domeniile ?-2 i -2 pre-zinta omologie a secvenei de aminoacizi, cu domeniile mole-c ulei de Ig. Domeniile ?-2, -1 i -2 sunt stabilizate prin legaturi S-S, iar domeniile ?-1, ?-2 i 2 sunt gli-cozilate. Gruparea glucidica conine manoza, galactoza, fucoza, glu-coz amina. Diferenele greutaii mo-leculare a celor doua catene se dato-reaza nivelului diferit de glicozilare. Determinismul genetic al moleculelor CMH Moleculele CMH sunt codificate de genele complexului major de histocompatibilita te. Calificativul ?complex? este justificat de numarul mare de gene componente, iar cel de ?major? semnifica importana deosebita a moleculelor codificate de aces te gene, n realizarea unor funcii imunitare importante: -elaborarea raspunsului imun -respingerea grefelor de esuturi i organe. n raport cu tipul de proteine pe care le codifica, genele CMH aparin clasei I i cla sei a II-a. La oarece, genele CMH codificatoare ale moleculelor complexului antigenic H-2 sun t localizate pe cromosomul 17, ntr-un fragment de 2000-4000 kb perechi, suficient

de mare pentru a codifica circa 200 de proteine de dimensiuni medii. In acest c omplex se gasesc 3 tipuri de gene descoperite independent: -primul grup de gene (descoperit n anii ?40) codifica antigenele ?tari? de transp lantare, care induc respingerea rapida a grefelor de tegument i de organe, ntre in divizi neidentici genetic (aparin unor alotipuri diferite). Acestea sunt genele C MH clasa I, care codifica moleculele CMH clasa I; -al II-lea grup, denumite genele raspunsului imun (IR) codifica sinteza unor mol ecule care condiioneaza intensitatea raspunsului imun al organismului, slab sau p uternic, faa de un antigen. Genele IR codifica proteinele clasei a II-a de molecu le CMH, denumite i molecule Ia (I associated); -al III-lea set de gene ale complexului CMH codifica sinteza unor componente ale complementului. La oarece, moleculele CMH I sunt codificate de gene situate la extremitaile comple xului genic H-2, notate K i D. Gena K are circa 55 de variante alelice. Fiecare v arianta codifica proteine distincte. Fig. 55. Reprezentare diagramatica a localizarii subregiunilor genice CMH la oare ce i om i poziia genelor majore n aceste subregiuni. La om, locusurile genice clasa II-a sunt localizate ntre centromer i locusurile clasei I, ca i la alte specii de m amifere. Complexul H-2 la oarece (pe cromosomul 17). Regiunea cromosomal K I S D Clasa I II III I Locusuri genice K A, E C4, C2, Bf, TNF D, L La om, moleculele CMH clasa I sunt codificate de genele HLA, iar moleculele CMH II, de regiunea cromosomala D, localizate pe cromosomul 6. Moleculele CMH I sunt codificate de trei gene: HLA-A, HLA-B, HLA-C. S-au descris genele HLA-E, -F, -G, -H i -J, dar acestea sunt considerate gene neclasice pentr

u ca produsele lor de sinteza se deosebesc structural i funcional de ale genelor H LA-A, -B i ?C. Moleculele CMH II sunt codificate de regiunea cromosomala HLA-D, ce aparine genel or clasei a II-a. Genele clasei a III-a codifica sinteza acelorai proteine plasmatice (C4, C2, Bf). Complexul HLA (pe cromosomul 6). Regiunea cromosomal D C4, C2, Bf B C A E, F, G, H, J Clasa II III I Gene neclasice Locusuri genice DP, DQ, DR C4, C2, Bf B C A E, F, G, H, J Genele HLA clasa I i II au cel mai nalt grad de polimorfism genetic dintre toi dete rminanii genici cunoscui ai organismului uman: HLA-A are 83 de alele HLA-B, 185 de alele HLA-C, 42 de alele. Numarul alelelor este n continua cretere pe masura ce se identifica noi variante. Polimorfismul genic este consecina existenei a cel puin doua alele pentru un locus. Pe fiecare din cei doi cromosomi pereche, un individ prezinta 3 gene CMH diferi te (HLA-A, HLA-B, HLA-C). Celulele umane prezinta 6 variante diferite de gene cl asa I, cte trei de la fiecare parinte. Genele CMH I sunt codominante, astfel ca p e suprafaa fiecarei celule se exprima produsele de sinteza ale ambelor alele pare ntale. Se sintetizeaza astfel 6 variante biochimice de molecule CMH I. ntr-o populaie umana, moleculele CMH I i CMH II sunt foarte diferite din punct de v edere biochimic, ca o expresie a polimorfismului genic al indivizilor umani. Antigenele HLA-A, B i C sunt antigenele majore recunoscute de sistemul imunitar a l gazdei, n reacia de respingere a grefei. Cantitativ, moleculele HLA-C sunt infer

ioare faa de HLA-A i HLA-B. Toate sunt capabile sa prezinte antigenul. Moleculele CMH neclasice (E, F, G) nu prezinta antigenul. Polimorfismul biochimic al moleculelor CMH I este limitat la domeniile ? 1 i ? 2, la nivelul secvenelor ce formeaza cavitatea moleculara. Genele CMH II sunt localizate n regiunea HLA-D. Regiunea genica HLA-D controleaza raspunsul limfocitelor n amestec. Specificitaile alelice ale genelor CMH II au fo st definite prin tipizare limfocitara i aparin locusurilor Dw i HLA-DP sau prin tip izare serologica i aparin locusurilor HLA-DP, DQ, DR. Regiunea D este divizata n trei subregiuni funcionale majore, care codifica molecu lele DR, DQ i DP. In subregiunile DQ i DP se gasete o pereche de gene funcionale DQA 1 i DQB1, respectiv DPA1 i DPB1, care codifica cele doua catene (? i ) ale moleculei CMH II. Subregiunea DR este mai complexa. Ea conine o singura gena pentru sinteza catenei ?, DRA1 i una sau doua gene pentru sinteza catenei (DRB1, DRB3, DRB4 sau DRB5). Nr. alelelor DRA1 2 DRB1 184 DRB3 11 DRB4 8 DRB5 12 DQA1 18 DQB1 31 DPA1 10 DPB1 77 Ca i genele codificatoare ale moleculelor CMH I, genele codificatoare ale molecul elor CMH II sunt codominante. Se sintetizeaza astfel 8 variante biochimice de mo lecule CMH II (deoarece sunt doua gene codificatoare ale genei pentru mlecula HL A-DR). Combinarea aleatorie a numarului mare de alele explica polimorfismul extensiv al moleculelor CMH ntr-o populaie umana. Numarul combinaiilor genice posibile ntre ace ste alele este evaluat la circa 1090, un numar cu mult mai mare dect al indivizil or umani care coexista la un moment dat. In contextul existenei unui numar mare d e gene alele codificatoare, posibilitatea ca doi indivizi nenrudii sa aiba protein e identice ale moleculelor CMH clasele I i II este mica. Nu exista doi indivizi i dentici pentru toate cele 6 variante de molecule CMH I i pentru cele 8 variante d e molecule CMH II. Moleculele CMH I i II au rolul de a lega peptidele antigenice. O varianta molecul ara poate sa lege un numar limitat de peptide antigenice(de ordinul milioanelor) , dar probabilitatea unei potriviri spaiale crete mult prin existena a 6 variante d e molecule CMH I i a 8 variante de molecule CMH II. Peptidul antigenic este legat deosebit de stabil n situsul cavitar al moleculelor CMH I i II.

Evaluarea diferenelor antigenice ale moleculelor CMH Fiecare organism are o specificitate antigenica proprie conferita de moleculele CMH clasa I. Diferenele antigenice dintre indivizii alotipici ai unei specii, dep endente de moleculele CMH I se evalueaza serologic. Serul imun specific anti-mol ecule CMH se obine prin injectarea unei suspensii de leucocite, la un organism al aceleiai specii, diferit din punct de vedere genetic, adica un organism cu o alt a combinaie de gene alele codificatoare ale moleculelor CMH I. Organismul recepto r sintetizeaza anticorpi faa de antigenele HLA ale leucocitelor donorului, care s e deosebesc de propriile sale molecule. Specificitatea antigenica a unui organism poate sa conste n prezena antigenice pe sau n celulele sale, care nu exista pe sau n celulele e sau se datoreaza unor diferene structurale fine ale moleculelor de bilitate, prezente la toate organismele speciei, n variante genetice unei molecule altor organism histocompati distincte.

Anticorpii anti-HLA se gasesc n serul femeilor multipare i se sintetizeaza ca rezu ltat al stimularilor antigenice HLA de origine paterna, exprimate pe celulele fa tului, dar absente pe suprafaa celulelor organismului matern. Leucocitele fatului care strabat bariera placentara trec n circulaia materna i induc sinteza IgG, cu p ersistena ndelungata n circulaie. O alta sursa de ser imun anti-HLA o constituie pacienii politransfuzai. Astfel ei se imunizeaza faa de antigenele HLA alotipice de pe suprafaa leucocitelor donorilo r de snge. Antiserurile HLA se pot obine prin imunizarea voluntarilor. Diferenele antigenice dintre doi indivizi, determinate de moleculele CMH clasa II -a se evalueaza prin capacitatea lor de a iniia reacia limfocitara mixta (RLM). Li mfocitele de la doi indivizi ce poarta alele diferite la locusul HLA-D sunt co-c ultivate in vitro. Condiia reactivitaii limfocitare este diferena unei singure alel e la locusul ce codifica aceste molecule. Indivizii care au molecule CMH I identice nu reacioneaza serologic, dar daca celu lele lor difera prin moleculele CMH II, codificate de alele diferite ale locusul ui HLA-D produc un raspuns intens n RLM. ntr-un amestec de celule limfoide homozigote aa i bb se activeaza ambele populaii d e limfocite, deoarece limfocitele aa reacioneaza faa de antigenul b, iar limfocite le bb se activeaza faa de antigenul a. Intr-un amestec de limfocite homozigote aa , cu populaia de limfocite heterozigote ab, raspund numai limfocitele aa. Raspuns ul bidirecional apare i n amestecul limfocitelor ac i ab. De obicei se evalueaza capacitatea limfocitelor receptorului de grefa de a se ac tiva faa de antigenele donorului i pentru a induce un raspuns unidirecional, populai a de limfocite a donorului este tratata cu mitomicina C (un inhibitor al sinteze i ADN) sau este iradiata. Tratamentul nu modifica imunogenitatea celulelor. Funci a stimulatoare a celulelor limfoide este restrnsa la celulele specializate prezen tatoare de antigen, radiorezistente i care nu se divid in vitro. Raspunsul celule lor n RLM este orientat exclusiv faa de moleculele CMH I i II. Moleculele CMH II co nstituie un stimul primar esenial pentru RLM. Moleculele CMH clasa I i II au rol esenial n elaborarea raspunsului imun, iar din p unct de vedere antigenic, determina respingerea alogrefelor (grefe ntre indivizi ai aceleiai specii, dar aparinnd unor alotipuri diferite). Distribuia tisulara a moleculelor CMH I i II i semnificaia lor evolutiva

Moleculele CMH I se gasesc pe suprafaa majoritaii esuturilor, pe celulele endoteli ale ale capilarelor, iar leucocitele exprima cea mai nalta densitate a moleculelo r CMH I: 1% din moleculele de suprafaa ale membranei leucocitare sunt molecule HL A. Moleculele CMH I au o densitate mai mica pe suprafaa celulelor hepatice, din plamn , rinichi i sunt foarte diluate pe suprafaa celulelor musculare i a celor mai multe glande endocrine (cu excepia suprarenalelor). Moleculele CMH II sunt exprimate predominant, pe suprafaa limfocitelor B i pe celu lele specializate pentru prelucrarea i prezentarea antigenelor: celulele seriei m onocit-macrofag, celulele endoteliale ale capilarelor sanguine i limfatice, celul ele Kupffer, celulele dendritice, eozinofile, microglia SNC. Moleculele CMH lipsesc pe eritrocite, pe celulele endoteliului corneean, pe comp onenta exocrina a pancreasului, pe celulele acinare ale glandelor parotide, pe n euronii SNC, pe celulele endoteliale ale capilarelor SNC, pe esutul placentar. n condiii normale, o forma solubila de molecule HLA se gasete n plasma. Nivelul ei c rete marcat n timpul infeciei virale, probabil datorita creterii ratei sintezei mole culelor HLA, stimulata de interferon i de alte citochine. Intensitatea exprimarii noleculelor CMH II este variabila, fiind controlata de d iferii factori: interferonul ? i IL-2, sintetizai de limfocitele T, amplifica nivel ul de exprimare a moleculelor CMH II, iar PGE2, glucocorticoizii, ?-fetoproteina , LPS din bacteriile Gram negative, diminua densitatea acestor molecule, avnd as tfel rol imunosupresor. Limfocitele B i celulele tumorale secreta molecule CMH II. Privita n perspectiva evoluiei, existena moleculelor CMH nu semnifica respingerea g refelor de esuturi i organe, deoarece acestea nu se realizeaza n mod natural, ci au fost introduse n practica medicala a ultimelor decenii. In sens evolutiv, existe na moleculelor CMH ar putea fi atribuita necesitaii organismelor de a semnaliza ra pid, celulele care prezinta molecule antigenice pe suprafaa lor: celulele infecta te cu virusuri sau cele transformate malign. In acest context, moleculele CMH au o semnificaie deosebita: pentru supravieuirea organismului, liza celulelor purtat oare de molecule nonself trebuie sa fie rapida, nainte ca virusul sa se multiplic e i respectiv, nainte ca celula maligna sa se divida i sa formeze o microtumora. Pentru ca intervenia limfocitelor Tc sa fie eficienta, este necesar ca moleculele CMH sa fie prezente pe oricare celula ce poate fi infectata de un virus sau poa te sa fie transformata malign. Pe de alta parte, moleculele CMH, al caror rol es enial este acela de a prezenta epitopii nonself, trebuie sa permita aciunea eficie nta i rapida a limfocitelor Tc. Moleculele CMH ndeplinesc i funcii neimune. Moleculele CMH I sunt componente ale re ceptorilor de hormoni. De exemplu, linia celulara stabilizata Daudi nu exprima m oleculele CMH I i nu are nici receptor pentru insulina, deoarece nu sintetizeaza 2-microglobulina.

p 8

p p

RASPUNSUL IMUN

Organismul, ca sistem funcional este echilibrat atta timp ct informaia antigenica pe care o primete, este identica cu cea proprie. Faa de moleculele straine, care se abat de la modelul informaional propriu, sistemul imunitar raspunde prin activare a mecanismelor de recunoatere pentru a ndeparta moleculele nonself. Ansamblul fenomenelor complexe n cascada, declanate de interaciunea specifica a sis temului imunitar cu antigenul, n cursul carora celulele imunocompetente se active aza, prolifereaza i se difereniaza n celule efectoare i celule de memorie, constitui e raspunsul imun. Funcionalitatea sistemului imunitar se suprapune parial, modelului general al arcu lui reflex, deoarece presupune existena unui flux informaional care corespunde unu i excitant specific (Ag) faa de un receptor (limfocitele), o cale aferenta (celul ele care nglobeaza i prelucreaza Ag), un organ central (celulele limfoide dintr-un organ limfoid secundar) i efectorii raspunsului imun (anticorpi, celule efectoar e). Asemanarile dintre sistemul imunitar i sistemul nervos se extind i asupra altor pa rticularitai: - sistemul imunitar este dotat, ca i sistemul nervos, cu ?inteligena? (capacitatea de a recepiona un numar mare de stimuli (adica de a recunoate un numar mare de de terminani antigenici diferii) i de a prelucra informaie chimica. Sistemul nervos pre lucreaza informaie senzoriala, iar sistemul imunitar recunoate i prelucreaza inform aie moleculara. ?Inteligena? sistemului imunitar se manifesta discontinuu, n funcie de agresiunile antigenice asupra organismului; - ?educaia? sistemului imunitar (adica stocarea informaiei antigenice primita prin stimulari repetate), ca i n cazul sistemului nervos, ncepe dupa natere; - ambele sisteme ?nvaa? prin experiena, pentru ca ambele sunt dotate cu memorie, ca re poate fi consolidata prin repetarea stimulului. Memoria ambelor sisteme este n scrisa n modificari moleculare persistente ale reelei, dar nu poate fi transmisa l a descendeni; - ambele sisteme sunt organizate dupa modelul unei complexe reele celulare i molec ulare. ntre cele doua sisteme exista i deosebiri: sistemul nervos recepioneaza stimuli de orice natura, care acioneaza la nivelul ntregului organism, iar sistemul imunitar recunoate i reacioneaza numai la stimuli de natura moleculara, care tind sa perturb e echilibrul chimic al organismului. PARTICULARITAILE GENERALE ALE RASPUNSULUI IMUN

Elaborarea raspunsului imun faa de o substana nonself este un proces fiziologic ca

re se caracterizeaza printr-o mare eficiena i suplee i are urmatoarele particularitai generale: - funcia imuna are caracter adaptativ, care decurge din orientarea specifica a re aciilor sale faa de o substana nonself. Caracterul adaptativ al raspunsului imun im plica mobilizarea unor celule preprogramate care ateapta sa fie activate de un an umit antigen, corespunzator specificitaii lor; - caracterul foarte economic al funciei imunitare deriva din specificitatea aciuni i sale. In timpul raspunsului imun se selecioneaza i se activeaza numai clonele de limfocite care au recunoscut specific epitopii antigenului, toate celelalte clo ne ramnnd disponibile pentru alte interaciuni; - eficiena funciei imune deriva din caracterul foarte economic al mijloacelor celu lare i moleculare pe care le mobilizeaza i din capacitatea de a amplifica efectori i sai, pe doua cai; a) proliferarea masiva (circa 8 generaii celulare) a celulelor selecionate sub aciu nea stimulatoare a substanei nonself. Dupa activare se produc modificari funcional e calitative ale acestor celule, de difereniere proliferativa i maturare, rezultat ul fiind generarea celulelor efectoare cu mare capacitate de aciune i a celulelor de memorie; b) celulele efectoare produc cantitai mari de molecule de recunoatere, sub forma r eceptorilor specifici faa de substana nonself; - caracterul de reea a celulelor activate n raspunsul imun, conectate prin mediato ri moleculari (interleuchine) i care condiioneaza eficiena raspunsului imun; - celulele sistemului imunitar coopereaza stimulator cu numeroase alte categorii de celule, capabile la rndul lor sa confere rezistena organismului. Cooperarea ar e loc, inclusiv cu factorii nespecifici (nascui) ai rezistenei (fagocitele, protein ele sistemului complement, molecule bactericide sau bacteriolitice din plasma); - raspunsul imun adaptativ necesita o perioada de timp pentru activarea i prolife rarea limfocitelor care au recunoscut antigenul, n timp ce reaciile neadaptative s unt prompte; - raspunsul imun adaptativ asigura protecia organismului i a descendenilor sai, pri n transferul placentar al anticorpilor i prin secreia lactata; - raspunsul imun adaptativ are o proprietate fundamentala unica - memoria imuna - consecina a experienei antigenice individuale, netransmisibila la descendeni. Raspunsul imun este rezultatul cooperarii unui numar restrns de tipuri celulare i moleculare. In funcie de predominana componentei celulare sau moleculare n compartimentul efect or al raspunsului imun, se disting doua tipuri de reactivitate imunitara. 1. Raspunsul imun mediat humoral (RIMH), care se caracterizeaza n esena, prin sint eza anticorpilor ca molecule efectoare. Efectele RIMH sunt urmatoarele: - neutralizarea toxinelor i a infeciozitaii particulelor virale - opsonizarea antigenelor celulare(bacterii, celule eucariote) - legarea antigenelor moleculare n complexe Ag-Ac i eliminarea lor. Imunitatea mediata humoral este transferabila de la un organism la altul prin in

termediul serului. RIMH este protector faa de infeciile bacteriene (n special pioge ne), faa de reinfeciile virale i faa de antigenele moleculare pe care le neutralizea za. 2. Raspunsul imun mediat celular (RIMC) se caracterizeaza prin aceea ca, dupa pa trunderea antigenului, de regula celular, sistemul imunitar mobilizeaza celule s pecializate, care ataca antigenul inta. Atacul se realizeaza fie prin contact cel ular direct ntre limfocitele T efectoare i celula inta, fie prin mediatori molecula ri. Raspunsul imun mediat celular este declanat de antigene care se exprima pe supraf aa celulelor: - antigene virale exprimate pe suprafaa celulelor infectate, n special dupa infecia virala primara; - antigene fungice; - antigene exprimate pe suprafaa celulelor infectate de bacteriile cu localizare intracelulara obligata (Rickettsia, Coxiella, Chlamydia) sau facultativ intracel ulara (M. tuberculosis, M. bovis, M. leprae, Brucella sp., Listeria monocytogene s, Francisella tularensis), n special n macrofage; - antigenele tumorale; - antigenele celulare din grefele de esuturi i organe alogenice. Existena celor doua compartimente ale raspunsului imun este argumentata de rezult atele experimentale, dar i de observaiile clinice, adevarate ?experiene ale naturii ?, asupra unor indivizi cu afeciuni determinate de incapacitatea RIMH sau RIMC. Sindromul Di George se caracterizeaza prin aplazia congenitala a timusului i para tiroidelor. Bolnavilor le lipsete reactivitatea faa de antigenele care mobilizeaza IMC i de aceea sunt sensibili la infeciile virale, fungice i la cele produse de ba cterii cu localizare intracelulara. Sinteza i titrul Ig serice sunt normale.

Hipo- i agamaglobulinemia congenitala de tip Bruton este o afeciune congenitala de terminata de gena tirozin-kinazei, situata pe cromosomul X, care afecteaza difer enierea celulelor limfoide B i produce imunodeficiena X lincata (Xid). Celulele B n snge sunt rare, dei numarul limfocitelor pre-B n maduva osoasa nu este semnificativ redus, ceea ce sugereaza o moarte celulara crescuta la tranziia pre-B-B. Deficie na clinica consta n incapacitatea de a sintetiza anticorpi i din aceasta cauza, cop iii, dupa 3-6 luni de viaa, fac infecii repetate i recurente cu bacterii Gram pozit ive i prezinta manifestari ale maladiilor autoimune. Reactivitatea IMC ramne nemod ificata, pentru ca organismul i pastreaza rezistena faa de infeciile virale i faa de cteriile Gram negative. Separarea celor doua compartimente ale raspunsului imu n, humoral i celular, este artificiala, deoarece ntre ele este o condiionare recipr oca i profunda: anticorpii au funcie opsonizanta, favoriznd astfel IMC, iar pe de a lta parte, IMC este mediata de numeroi factori solubili. Cele doua compartimente interacioneaza sinergic pentru producerea unui raspuns imun eficient. Totui, separ area este meninuta deoarece reflecta diferenele fundamentale ale mecanismelor de a ciune ale celor doua populaii de limfocite: limfocitele B pentru RIMH i limfocitele T pentru RIMC. Nici un antigen nu induce un raspuns imun pur, humoral sau celular. Totdeauna ra spunsul imun este mixt, cu predominana unuia sau a celuilalt dintre compartimente . ETAPELE RASPUNSULUI IMUN

Raspunsul imun este rezultatul succesiunii urmatoarelor etape: - patrunderea antigenului n organism i nglobarea lui de catre celulele accesorii; - prelucrarea antigenului i prezentarea epitopilor pe suprafaa celulelor accesorii ; - recunoaterea specifica a componentelor nonself i activarea celulelor efectoare; - producerea efectorilor raspunsului imun. Patrunderea antigenului n organism se realizeaza pe diferite cai: - pe cale cutanata - pe calea circulaiei sanguine - pe calea mucoaselor(respiratorie, gastro-intestinala i urogenitala). Epiteliul tegumentar i mucoasele reprezinta o suprafaa foarte mare, expusa la o ma re diversitate de substane antigenice. Tegumentul este o bariera mecanica faa de c ele mai multe antigene, iar mucoasele sunt protejate, n primul rnd, de IgA din sec reii. Epiteliul tegumentar i epiteliile mucoaselor au rol n fenomenul ?excluderii a ntigenice?. Schimbul liber ntre mediul extern i cel intern are loc numai n situaii p atologice. Elaborarea raspunsului imun este, n esena, rezultatul cooperarii a doua categorii de celule: celulele accesorii ale raspunsului imun i celulele limfoide. Antigenul este recunoscut de celule specializate funcional i nglobat, cel mai adese a prin aciunea unor mecanisme nespecifice, de celulele accesorii, cu rolul de a p relucra i de a prezenta antigenul. Celulele prezentatoare de antigen (CPA) Celulele accesorii au rol esenial n elaborarea raspunsului imun, datorita capacitai i lor de a ngloba substanele straine, de a le prelucra i de a le prezenta limfocite lor, de a fagocita celulele opsonizate i de a sintetiza substane imunomodulatoare. Prezentarea antigenului este treapta obligatorie care precede recunoaterea antig enelor proteice de catre celulele T. Orice celula care poarta pe suprafaa ei molecule CMH poate sa participe la elabor area raspunsului imun. Celulele prezentatoare de antigen au urmatoarele propriet ai: preiau antigenele, le internalizeaza i le prelucreaza; exprima moleculele CMH I i II; exprima moleculele de aderena care favorizeaza interaciunea cu limfocitele; produc molecule stimulatoare ale creterii i diferenierii limfocitelor T; elibereaz a citochine. Cele mai importante celule accesorii pentru elaborarea raspunsului imun sunt mac rofagele. In vivo, macrofagul participa decisiv la procesul de imunogeneza. Indi ferent de calea de patrundere n organism, antigenele sunt captate de celule acces orii, cel mai adesea, de macrofag. Cea mai mare parte a antigenelor circulante sunt eliminate nainte de a declana ras punsul imun, n primul rnd de celulele Kupffer, localizate pe faa luminala a capilar elor sinusoide din ficat. La nivelul ficatului se elimina circa 90% din totalul

antigenelor circulante (bacteriile care strabat bariera mucoasei digestive, endo toxinele absorbite la nivelul colonului, antigenele de origine alimentara). Alte celule specializate, cu rol major n prezentarea antigenului sunt celulele de ndritice i limfocitele B. Celulele dendritice fac parte dintr-o familie care cuprinde urmatoarele tipuri d e celule: - celulele Langerhans, localizate n epiderm, dar i n mucoase(orala, nazala, esofagi ana, bronica, n mucoasa traheii) - celulele cu voal, din limfa aferenta - celulele dendritice, din epiderm, din epiteliile mucoaselor, din organele limf oide i din snge - celulele interdigitate, din aria paracorticala a ganglionilor limfatici. Originea acestor celule nu este certa, dar se admite urmatoarea filiaie: monocitu l sanguin, celula Langerhans din epiderm, celula cu voal din limfa aferenta gang lionului limfatic, celula dendritica din derm, din organele limfoide i din snge. Celulele dendritice s-au izolat din organele limfoide i din snge, pe baza capacitai i lor de a adera de suport (ceea ce permite eliminarea limfocitelor din amestec) i de a-i pierde aderena dupa 24 de ore de cultivare. Rolul lor n prezentarea antige nului este argumentat de faptul ca stimuleaza intens reacia limfocitara mixta. Celulele dendritice au rol foarte important pentru iniierea raspunsului imun. Sun t larg distribuite n esuturile limfoide i nelimfoide la toate speciile de mamifere studiate. Precursorii celulelor dendritice i ai macrofagelor sunt localizai n maduv a osoasa, iar monocitul este un stadiu comun, nainte de diferenierea pe cele doua linii. Monocitul trece n snge, de unde se disemineaza n esuturile nelimfoide (epider m, epiteliul tractului respirator, gastrointestinal, urogenital) i se difereniaza n celula dendritica. n tegument, celulele dendritice i celulele Langerhans formeaza o reea ramificata n tot epidermul. Ele au capacitai optime de captare i prelucrare a antigenelor, care patrund pe cale tegumentara. Dupa maturare, favorizata de ci tochinele produse local, migreaza din esuturile nelimfoide, n esuturile limfoide se cundare. Migrarea din epitelii are loc pe cale limfatica, pna n ganglionii limfati ci regionali, iar cele din spaiile interstiiale migreaza pe cale sanguina n splina . In timus, celulele dendritice prezinta complexele CMH-peptide, timocitelor car e i dobndesc competena imunitara, pentru inducerea toleranei imune. Celulele acestei familii nu au receptori pentru Fc i nici pentru C3, dar exprima la un nivel ridicat, moleculele CMH I i II. Celulele Langerhans reprezinta 2-8% din totalul celulelor epidermice i formeaza o reea printre cheratinocitele straturilor profunde. Ele reprezinta celulele dend ritice imature i exprima nivele mai mari de molecule CMH II. Sunt capabile sa pre ia antigenul exogen prin intermediul moleculelor de suprafaa, fiind celule prezen tatoare de antigen foarte eficiente. Celulele Langerhans pot sa prezinte antigen ul local, n epiderm, sau pot sa se mobilizeze, sa paraseasca stratul bazal i sa m igreze pe cale limfatica, pna n ganglionii regionali. In timpul migrarii, celulele au prelungiri membranare i se numesc celule cu voal. In ganglionul limfatic, ele se distribuie n aria paracorticala(cortexul profund) i devin celule dendritice i c elule interdigitate (o varianta morfologica cu prelungiri mai scurte), avnd rol e senial n prezentarea antigenelor i activarea limfocitelor T. Celulele Langerhans, c elulele cu voal i celulele interdigitate sunt stadii diferite ale liniei celulelo r dendritice.

Celulele acestei familii nu au proprietai fagocitare. Totui, li se atribuie un rol important n procesul prelucrarii antigenelor. Antigenele ramn legate la nivelul m embranei celulare i sunt prelucrate prin intermediul ectoproteazelor pe care le s ecreta. Iradierea tegumentului cu raze UV duce la dispariia celulelor Langerhans. Limfocitul B este celula efectoare a RIMH, dar are i rolul de captare i prezentare a antigenului specific. Eficiena sa n captarea antigenului este maxima, deoarece receptorul imunoglobulinic leaga specific epitopii corespunzatori chiar la conce ntraii foarte mici, de 1000 de ori mai mici dect cele necesare prezentarii sale de catre macrofag sau de catre celula dendritica. Limfocitul B recunoate i prezinta numai antigenele moleculare mici (peptide). Prob abil ca proteinele mari nu le sunt accesibile. Exista dovezi ca antigenul peptid ic legat la suprafaa limfocitului B, prin intermediul receptorului imunoglobulini c specific, este endocitat, prelucrat n compartimentul acid i prezentat n asociaie c u moleculele CMH II, pentru a fi recunoscut de limfocitele T. Limfocitele B expr ima nivele relativ nalte ale moleculelor CMH II. Rolul lor de captare i eventual, prelucrare a antigenului este semnificativ la contactul secundar cu antigenul. Cele mai importante celule, cu funcia de captare i prelucrare a antigenului sunt m acrofagele i celulele dendritice. Prima treapta a interaciunii antigenului exogen cu CPA (macrofag, celula dendriti ca) este legarea nespecifica, necovalenta, cu structuri nedeterminate ale supraf eei celulare. Antigenele din complexele imune sunt recunoscute de CPA prin interm ediul receptorilor pentru Fc i C3. Dupa ce a patruns n organism, antigenul este repede nglobat i depozitat n interiorul macrofagului. Scoaterea antigenului din circulaie are o semnificaie funcionala deo sebita, deoarece constituie un depozit din care este eliberat treptat i stimuleaz a imunogeneza. Antigenul liber n organism poate sa induca una din cele doua stari defavorabile pentru reactivitatea imunitara: - poate fi eliminat prea rapid din organism, nainte de stimularea raspunsului imu n; - dozele prea mari de antigen liber sunt defavorabile reactivitaii imunitare, pri n blocarea raspunsului limfocitelor. Starea caracterizata prin incapacitatea de raspuns imun a organismului se numete paralizie imunologica. Este o stare de blocare completa a reactivitaii imunitare prin ?inundaie antigenica?. Antigenele moleculare sau particulate cu o buna imunogenitate sunt reinute parial n macrofag sub o forma rezistenta la degradare, pentru perioade mai lungi de timp . Macrofagele modifica imunogenitatea antigenelor: dupa legarea de macrofag, cele slab imunogene devin mai imunogene, iar cele cu imunogenitate ridicata, dupa leg area de macrofag i pierd parial aceasta calitate. Prelucrarea antigenelor Prelucrarea antigenelor exogene este o etapa obligatorie deoarece limfocitele T (Th i Tc) nu recunosc i nu preiau direct informaia antigenica nativa. Limfocitele T recunosc numai informaia antigenica prezentata pe suprafaa CPA. Celulele accesori i ale raspunsului imun prelucreaza antigenele moleculare mari i pe cele particula te. Din punct de vedere biochimic, prelucrarea semnifica deplierea, clivarea pro

teinelor i generarea peptidelor, ca rezultat al unei proteolize pariale. Prelucrar ea antigenului exogen de catre celulele prezentatoare, parcurge urmatoarele etap e: internalizarea antigenului n veziculele membranare acide; proteoliza pariala; c uplarea cu moleculele CMH; transportul la nivelul membranei plasmatice. Gradul prelucrarii antigenului este dependent de natura sa. Intervalul de preluc rare este de 45-60 minute. Durata s-a determinat prin inactivarea metabolica a m acrofagelor cu paraformaldehida, la diferite intervale de timp dupa contactul cu antigenul. Experienele cu antigen marcat au evideniat ca n CPA, materialul imunogen are doua d estinaii: o parte este expusa pe suprafaa celulei i este recunoscuta de celulele T, iar o alta parte este sechestrata n celula, de unde este eliminata activ n mediul extracelular i este preluata de alte CPA. Principalul mecanism degradativ care are loc n CPA este proteoliza lizosomala. Co ncluzia a fost dedusa experimental: amoniacul i cloroquina (substane lizosomotrope ) se acumuleaza n lizosomi i blocheaza activitatea enzimelor prin creterea pH lizos omal. Macrofagele astfel tratate sunt incapabile sa prezinte antigenele proteice sau bacteriene. Cloroquina blocheaza numai etapa prelucrarii antigenului, dar n u i recunoaterea sa de catre limfocitele T, deoarece administrarea ei dupa o ora d e la contactul macrofagelor cu antigenul, a ramas fara efect. Cloroquina a bloca t prezentarea antigenului de catre celulele dendritice, dei ele nu sunt fagocitar e in vitro i au un echipament lizosomal puin dezvoltat. S-a dedus ca ele prelucrea za antigenul la suprafaa, prin intermediul ectoproteazelor membranare, dei nu exis ta dovezi directe n acest sens. Prezentarea antigenelor i asocierea cu moleculele CMH I nu este sensibila la aciun ea substanelor lizosomotrope alcalinizante. Proteinazele cisteinice (funcioneaza prin intermediari covaleni enzima-substrat) s unt importante pentru prelucrarea antigenelor proteice, aa cum s-a demonstrat cu antigene sintetice. Proteoliza rapida i extensiva este cauza slabei imunogenitai a unor antigene (sau chiar a absenei imunogenitaii). Unele antigene sintetice (copolimerul L-acid gluta mic-L-alanina) sunt mult mai imunogene dupa inhibarea aciunii proteinazelor ciste inice. Mecanismele moleculare ale prelucrarii antigenelor sunt puin cunoscute. In macrof age se produce o digestie selectiva a antigenului, n urma careia o parte din epit opi se pastreaza, dar cea mai mare parte a antigenului este complet degradata. Complexitatea antigenului condiioneaza numarul de peptide cu rol de epitopi, care deriva prin procesul de prelucrare i care pot fi legate de moleculele CMH. Daca antigenul este o bacterie, numarul de epitopi este nedeterminat i specificitatea lor antigenica este variabila, n funcie de complexitatea aparatului enzimatic hidr olitic al celulei care prelucreaza antigenul. Nu toate antigenele necesita proteoliza (fragmentarea) prealabila recunoaterii de catre celulele T. Uneori este suficienta numai denaturarea (deplierea) proteine lor pentru ca antigenul sa fie prezentat de CPA, chiar tratate cu cloroquina. Forma sub care limfocitele T recunosc antigenele, depinde att de natura CPA, dar n special de natura antigenului. Majoritatea proteinelor sunt rapid endocitate i prelucrate, dar unele sunt legate de membrana celulei i prezentate n stare nativa, fara o prelucrare prealabila. An tigenele peptidice mici (insulina, angiotensina) pot fi recunoscute n forma nativ a, de unele subpopulaii de limfocite T, n timp ce altele recunosc formele prelucra

te ale acelorai antigene. Dimensiunea i configuraia spaiala a moleculei de antigen sunt hotartoare n ceea ce pr ivete gradul prelucrarii sale, nainte de a fi prezentat. De regula, moleculele mar i necesita prelucrarea prealabila, iar cele mici sunt prezentate n forma nativa. Forma chimica a antigenului, dupa prelucrare, nu este cunoscuta cu certitudine. Foarte probabil, este un polipeptid de dimensiuni mici (9-20 aminoacizi). Dupa ali autori, prelucrarea nu este necesara pentru ca antigenul sa fie prezenta t limfocitelor T, dar totdeauna este necesara conversia sa la o forma care sa-i permita interaciunea cu moleculele CMH II ale CPA i cu receptorii limfocitelor T. Dovada este adusa de faptul ca liposomii cu molecule CMH II inserate n stratul li pidic, la care s-au ataat o varietate de antigene proteice native, stimuleaza clo nele de limfocite T in vitro, n absena completa a CPA. Epitopii antigenelor peptidice exogene sunt expui la suprafaa CPA, n asociaie cu mol eculele CMH clasa II, iar epitopii antigenelor de origine endogena sunt prezentai n asociaie cu moleculele CMH clasa I. Rolul moleculelor CMH n prezentarea antigenelor Raspunsul imun este rezultatul interaciunilor complexe ntre celulele care prezinta antigenele i limfocitele T i B. Prezentarea antigenelor este o etapa obligatorie a elaborarii raspunsului imun, ce deriva din faptul ca limfocitele nu interacioneaza direct cu antigenele n stare nativa, ci numai dupa ce acestea au fost prelucrate i prezentate pe suprafaa unei celule. Moleculele CMH ndeplinesc funcia de prezentare a antigenelor i au un rol esenial n de clanarea raspunsului imun. Pentru a deveni disponibili interaciunii cu receptorii de antigen ai limfocitelor , epitopii sunt asociai intracelular, cu moleculele CMH I sau II i sunt transportai la suprafaa CPA ca fragmente peptidice sau ca proteine intacte, n funcie de natura i de marimea antigenului. Fig. 56. Prelucrarea i prezentarea antigenului exogen, n asociaie cu moleculele CMH II. Moleculele CMH II, cu catena invarianta, sunt asamblate n reticulul endoplas mic (RE) i transportate prin reeaua Golgi, de unde sunt orientate spre vezicula en dosomala, care conine proteina degradata parial, derivata din antigenul exogen. De gradarea catenei invariante, face posibila asocierea peptidului antigenic cu mol ecula dimerica (DM). Complexul este transportat la suprafaa celulei i este recunos cut de limfocitele Th. Moleculele CMH I i II au capacitatea funcionala de a lega i de a expune pe suprafaa celulei, un numar neli-mitat de peptide diferite. Complexul format de mo-leculel e CMH I sau II i epitopul peptidic este recu-noscut de limfocitele T. Nu se cunoate modalitatea interaciunii dintre moleculele CMH i epitopii antigenici. Ar putea fi o interaciune ferma sau moleculele CMH au numai rolul de suport pent ru epitopii antigenici. Se accepta ideia unei ierarhii a epitopilor cu privire la ordinea legarii compet itive de moleculele CMH, dato-rita sensibilitaii diferen-iate la proteaze. Rezulta peptide cu afinitate diferita faa de situsul de legare a moleculelor CMH. Astfel , exista epitopi dominani, care se asociaza cu mare probabilitate de molecu-lele CMH, epitopi subdominani, cu mai puine anse de asociere cu moleculele CMH i epitopi criptici, care se asociaza rareori n complexe cu moleculele CMH i care nu devin ac

cesibili limfocitelor T potenial reactive. Antigenele exogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH II Moleculele CMH II leaga peptide derivate din proteinele exogene endocitate de ce lule: proteine solubile, proteine ale capsidei virale, proteine bacteriene sau p roteine ale protozoarelor endocitate de celula. In vitro, s-a demonstrat ca mole culele CMH II purificate, leaga suficient de stabil o molecula peptidica, pentru a fi izolate mpreuna prin gel-filtrare. Antigenele exogene sunt nglobate i prelucrate n fagolizosomii celulelor prezentatoa re de antigen (CPA). Moleculele CMH II se sintetizeaza n reticulul endoplasmic gr anular i sunt modificate post-traducere, n cisternele Golgi. Cele doua catene ale moleculei sunt reunite prin catena invarianta. Asocierea este meninuta pna cnd mole culele CMH II ajung n sistemul endocitar al celulei. In drumul lor spre suprafaa c elulei, moleculele CMH II ajung prin fuziunea veziculei transportoare, n comparti mentul fagolizosomului ce conine antigenul parial degradat. La acest nivel este el iminata catena invarianta ce reunete catenele ? i i care ocupa situsul de legare a antigenului. Moleculele CMH II se asociaza cu peptidul antigenic de 13-25 aminoa cizi. Complexul format este expus la nivelul membranei, unde este recunoscut de limfocitele TCD4. Situsul de legare al moleculei CMH II este o cavitate formata prin -plierea domeniilor ?-1 i -1, delimitata de secvenele ?-helicale ale domeniilor ?-1 i -1. Complexul format este recunoscut de limfocitele TCD4. Fig. 57. Reprezentarea schematica a asocierii moleculelor CMH II cu peptidul ant igenic (dupa Cresswell, 1994). Moleculele CMH II au funcia fundamentala de a stimula elaborarea raspunsului imun specific faa de antigenele exogene, prin intermediul limfocitelor TCD4. Limfocit ele TCD4 secreta IL-2, IL-4, IL-5, IFN ?, cu efect stimulator faa de limfocitele Tc i B. Asocierea unui peptid nonself cu moleculele CMH II semnifica ?cererea de ajutor? pentru eliminarea antigenului, materializat n activarea limfocitelor TCD4 i secrei a de limfochine stimulatoare ale raspunsului imun. Moleculele CMH II au rol esenial pentru stimularea raspunsului imun, dar i pentru reglarea intensitaii sale. Interaciunea moleculelor CMH II cu epitopii antigenici nu este specifica. Deoarece moleculele CMH sunt polimorfe, exista diferene, uneori importante, ntre o rganismele outbred ale unei specii de a raspunde la un antigen. Astfel se explic a diferenele individuale de sensibilitate faa de un agent infecios. Un raspuns imun mai amplu, este generat de un organism care expune mai muli epitopi antigenici d iferii, asociai cu diferitele variante de molecule CMH II, comparativ cu un organi sm care expune mai puine fragmente antigenice asociate cu 1 sau 2 tipuri de molec ule CMH II. Antigenele endogene sunt prezentate n asociaie cu moleculele CMH I Rolul moleculelor CMH n procesul recunoaterii antigenelor care se sintetizeaza n in teriorul celulei (proteine endogene), a fost demonstrat de Zinckernagel i Doherty (1974), pentru antigenele virale, n experiene de genul urmator: - oarecii liniei inbred D au fost inoculai cu virusul coriomeningitei limfocitare (cu specificitate antigenica A), pentru a stimula proliferarea limfocitelor Tc f aa de celulele infectate cu acest virus;

- culturile de fibroblaste de la embrionii liniei D se infecteaza cu varianta an tigenica A i respectiv B, iar fibroblastele liniei K se infecteaza cu varianta an tigenica A; - limfocitele Tc ale organismelor liniei D, stimulate cu virusul A, recunosc i li zeaza, in vitro, fibroblastele liniei D, infectate cu varianta antigenica A, dar nu recunosc i nu lizeaza fibroblatele liniei D infectate cu varianta antigenica B i nici fibroblastele liniei K, infectate cu varianta antigenica A. Concluzia a fost ca nucleoproteinele citosolice virale, sintetizate n celula, pot deveni inta celulelor Tc, dupa ce sunt expuse ca un peptid prelucrat, n asociaie c u moleculele CMH I ale celulei infectate. Pe baza acestei concluzii s-a stabilit principiul general ca proteinele intracelulare (care nu sunt destinate membrane i citoplasmatice), pot sa-i semnaleze prezena n raport cu celulele T, prin expunere a asociata cu moleculele CMH I. Rezultatele au fost extrapolate i pentru categori a larga a antigenelor exogene. Fig. 58. Aciunea limfocitelor Tc este restrictiva n raport cu moleculele CMH I, de oarece celula Tc recunoate att antigenul specific, ct i molecula CMH I. Amanunte n te xt. Recunoaterea asociata a antigenelor cu moleculele CMH I sau II are doua semnificai i majore: - celulele sistemului imunitar interacioneaza cu proteinele proprii, numai daca a cestea sunt asociate cu un determinant antigenic nonself, de origine virala, tum orala sau indus de ageni chimici; - recunoaterea antigenului este condiionata de existena fenomenului de histocompati bilitate, adica celulele care prezinta antigenul i cele care l recunosc (limfocite le Tc i Th) trebuie sa poarte molecule CMH identice, adica celulele care interacio neaza trebuie sa aparina aceluiai organism sau unor organisme genetic identice(ale aceleiai linii inbred). Acesta este fenomenul de restricie (limitare) a interaciun ilor celulare prin moleculele CMH. Moleculele CMH I au rolul de a lega i de a prezenta proteine self, peptide deriva te din catabolismul proteinelor citosolice, antigene bacteriene sau ale paraziilo r intracelulari, antigene virale sintetizate n celula prin traducerea unui ARNm v iral, antigene tumorale sau antigene a caror sinteza a fost indusa de ageni chimi ci. Dupa asocierea cu epitopi antigenici, moleculele CMH I devin inta atacului li mfocitelor TCD8. Limfocitele Tc sunt implicate, n primul rnd, n recunoaterea i eliminarea celulelor in fectate cu virusuri sau a celor transformate malign. Ambele tipuri de antigene s unt sintetizate n celula i sunt considerate ca avnd origine endogena. Evenimentele celulare al caror rezultat este prezentarea peptidelor, se succed n urmatoarele trepte: - catabolismul antigenului proteic (n citoplasma) - transportul peptidului din citosol, n cisternele reticulului endoplasmic - asamblarea complexului format din peptid i molecule CMH I - transportul complexului la suprafaa celulei. Antigenele endogene se asociaza cu moleculele CMH I, chiar n cisternele reticulul ui endoplasmic granular. La acest nivel, moleculele CMH II sunt inaccesibile aso cierii cu epitopii antigenici, deoarece catenele ? i sunt reunite prin catena inv

arianta. Prezentarea antigenelor endogene, asociate cu moleculele CMH I nu este sensibila la aciunea agenilor lizosomotropi alcalinizani (amoniac, cloroquina), dar este sen sibila la derivaii peptidici(di- sau tripeptide aldehidice) care inhiba proteasom ul. Proteasomul este un complex proteic multicatalitic, compus din mai multe sub unitai inelare suprapuse, asamblate ntr-o structura cilindrica, n care se produce p roteoliza moleculelor proteice citosolice conjugate cu ubicvitina. Proteasomul e ste o structura care controleaza turn-overul proteinelor citosolice, inclusiv al factorilor de transcriere i al ciclinelor. Ubicvitina este un polipeptid mic, ca re este asociat pe cale enzimatica dependenta de ATP, de lizina proteinelor cito solice. Legarea ubicvitinei produce deplierea proteinei inta i asigura recunoaterea de catre elementele complexului proteasomic citosolic. Proteinele celulare modi ficate dupa cuplarea cu ubiquitina, devin sensibile la proteoliza. Proteoliza ar e loc n mediul apos al structurii cilindrice i este independenta de ATP. Astfel su nt protejai constituienii celulari de degradarea necontrolata. Peptidele rezultate n proteasom sunt foarte rapid degradate n citoplasma. De aceea s-a presupus ca el e se asociaza cu proteinele chaperone, cu rol protector i de orientare a peptidel or n lumenul reticulului endoplasmic. Fig. 59. Prelucrarea i prezentarea antigenului endogen, de catre moleculele CMH I . Proteinele citosolice sunt degradate de complexul proteosomic, n peptide care s unt transportate n reticulul endoplasmic (RE). La acest nivel, -2 m induce diso-ci erea catenei H de proteina chaperone (calnexina). Se asambleaza molecula CMH I i se asociaza cu peptidul antigenic. Complexul peptid-CMH I se elibereaza din asoc ierea cu transportorul TAP, traverseaza cisternele Golgi i se exprima pe suprafaa celulei, gata sa fie recunoscut de RCT. Celulele deficiente n TAP1/2 nu elibereaz a peptidele pentru a se asocia cu moleculele clasa I i nu pot exercita efectul c itotoxic asupra intei (dupa Roitt, 1997). Fig. 60. Formarea complexului CMH I-peptid n cisternele RE. Peptidele rezultate din pre-lucrarea antigenelor endogene sunt transportate n ret iculul endo-plasmic, de o categorie de proteine transportoare, denumite TAP (pro -teine transportoare asociate cu prezentarea antigenului) care folo-sesc energia rezultata din hidroliza ATP, pentru a transporta prin membrane diferite protein e, ioni, antibiotice. Molecula TAP este un heterodimer, format din doua subunit ai (TAP1 i TAP2). Fiecare subunitate are o regiune hidrofoba N-terminala transmemb ranara i un domeniu C-terminal ce leaga ATP. Moleculele TAP au capacitatea de a t ransloca peptidele prin membrana RE. Catenele moleculei CMH I se sintetizeaza separat pe cisternele RE i odata cu trad ucerea sunt transportate n RE. Catena H, -2 m i peptidul se asambleaza ntr-un comple x, chiar n cisternele RE sau n compartimentul pregolgian. n cisternele Golgi, caten a H este glicozilata, iar complexul CMH I-peptid este ancorat n membrana i expus l a suprafaa celulei. Moleculele CMH I leaga peptide mici, de 8-10 aminoacizi. Spec ificitatea de legare este larga. Molecule CMH I identice leaga peptide diferite. Liniile celulare care nu sintetizeaza -2 m, nu exprima molecule CMH I pe suprafaa lor. Acesta este un exemplu al funciei de ?control de calitate? pe care l are RE. Moleculele CMH pliate incorect nu sunt transportate la nivelul membranei, ci ramn n cisternele RE i sunt degradate. Absena -2 m determina plierea greita i degradarea atenei mari. Controlul de calitate este mediat de un set de proteine chaperone, care se asociaza reversibil cu proteinele pliate incorect i astfel permit ?corect area? greelii de pliere. La nivel membranar, complexul molecular este recunoscut de limfocitele Tc i rezul tatul interaciunii este liza celulei inta. Moleculele CMH I nu disting ntre peptidele self i nonself. Peptidele asociate cu m oleculele CMH I au fost izolate, fracionate prin HPLC (high-performance liquid ch

romatography) i secveniate. Fiecare celula expune pe suprafa cele mai multe fiind proteine citosolice autologe.

a, sute de peptide,

Asocierea moleculei CMH I cu un peptid nonself pe suprafaa celulei, semnifica ne cesitatea distrugerii celulei inta. Dovada n favoarea acestei ipoteze este adusa d e faptul ca, in vivo, situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de pept ide self, adica fragmente ale proteinelor proprii, pe care celulele le capteaza din spaiul interstiial sau le produc n proteasom i le prezinta ca i pe cele nonself. Dupa disocierea peptidului, molecula CMH I ?goala? expusa la suprafaa celulei, es te instabila. Faptul ca situsul de legare al moleculelor CMH I este ocupat de peptide self, es te n acord cu teoria supravegherii imune, conform careia, celulele killer i limfoc itele Tc controleaza permanent suprafaa celulelor organismului, pentru a detecta eventuala apariie a antigenelor tumorale sau virale. Celulele care exprima pe sup rafaa lor molecule nonself, sunt eliminate prompt. Deoarece celulele prelucreaza i prezinta continuu molecule proprii, celulele sist emului imunitar sunt stimulate permanent. Limfocitele controleaza calitatea mole culelor CMH I i detecteaza celulele ce prezinta molecule alterate sau molecule no nself. Indivizii umani deficieni ai moleculelor CMH I, nu par a avea o incidena crescuta a infeciilor virale severe, ceea ce sugereaza existena i a altor mecanisme de recun oatere a moleculelor nonself, neasociate cu moleculele CMH I. Fig. 61. Reprezentarea schematica a moleculelor CD4 i CD8. Modelul recunoaterii antigenuluide catre limfocitele T Recunoaterea antigenului de catre limfocitele T este mediata n primul rnd, de recep torul de antigen (RCT). Secvenele hipervariabile ale lanurilor ? i formeaza regiuni le determinante de comple-mentaritate (RDC 1 i RDC 2). Buclele RDC 1 i RDC 2 ale r egiunilor variabile (V) ? i ale RCT, interacioneaza cu regiunea ? helicala a molec ulei CMH, iar cele doua secvene RDC 3, interacioneaza cu peptidul antigenic. Interaciunea limfocitului cu celula prezentatoare de antigen este mediata i de alt e molecule. Limfocitele Tc prezinta pe suprafaa lor, markerul CD8 i recunosc antigenele asocia te cu moleculele CMH I, iar limfocitele Th prezinta markerul CD4 i recunosc antig enele asociate cu moleculele CMH II. Moleculele CD4 i CD8 sunt proteine membranar e, monomorfe, participante la recunoaterea complexelor CMH-peptide, de pe suprafaa celulelor inta. Domeniile lor extracelulare, prin secvena aminoacizilor, se aseam ana cu domeniile imunoglobulinelor. Molecula CD4 este monomerica i este pliata n 4 domenii extracelulare, omologe cu a le moleculei de Ig, stabilizate prin puni S-S. CD8 este o proteina dimerica, iar conformaia sa spaiala prezinta un domeniu aseman ator domeniului variabil al moleculei de imunoglobulina. n procesul recunoaterii antigenului, molecula CD8 se asociaza cu domeniul constant ?-3, al moleculei CMH clasa I, iar molecula CD4 se asociaza cu domeniile consta nte ?-2 sau -2 ale moleculei CMH clasa II-a. Moleculele CD8 i CD4 sunt importante nu numai pentru orientarea limfocitelor spre intele adecvate, dar au i rol n transducerea semnalului, deoarece cozile lor citos

olice leaga o tirozin-kinaza, cu rol esenial n transmiterea semnalului activator a l limfocitului T. Receptorul de antigen al limfocitelor T recunoate fragmentele peptidice complexat e cu moleculele CMH I sau II. Pentru fiecare organism, diversitatea moleculelor CMH este limitata, dar ele leaga o larga varietate de peptide scurte (8-9 aminoa cizi, pentru moleculele CMH I i circa 14 aminoacizi, pentru moleculele CMH II). D ei nu este o legare pe baza specificitaii, interaciunea peptidului antigenic cu mol eculele CMH este caracterizata de o afinitate nalta, deoarece se stabilete cu grup arile NH2 i COOH de la extremitatea peptidului, restul secvenei de aminoacizi ramnnd disponibili pentru interaciunea cu RCT. Fig. 62. Diagrama domeniilor extracelulare ale moleculelor CMH clasa I (sus) i cl asa II (jos). Situsurile de legare ale celor doua clase de molecule au configurai i tridimensionale asemanatoare i sunt ocupate de peptidul rezident self sau nonse lf (dupa Roitt, 1993). Deoarece moleculele CMH I i II leaga peptide scurte, epitopii celulelor T sunt al catuii din secvene peptidice lineare, adica configuraia epitopilor nu este dependen ta de conformaia proteinei native. Deoarece epitopii recunoscui de limfocitele T s unt peptide scurte, rezulta ca prelucrarea proteolitica a antigenelor este o eta pa obligatorie, care precede interaciunea lor cu limfocitele T. Prezentarea antigenelor asociate cu moleculele CD1 Antigenele nepeptidice sunt prezentate celulelor T, prin alte mecanisme. Molecul ele CD1 se aseamana structural cu moleculele CMH I. Ele prezinta antigenele n aso ciaie cu domeniile hidrofobe, care formeaza cavitai, capabile sa lege antigenele l ipidice i glico-peptidice. n aceasta asociaie, antigenele sunt recunoscute de limfo citele T. Se cunosc 4 izo-forme distincte de molecule CD1 (CD1a, -b, -c, -d), co dificate de 5 gene situate pe cromosomul 1. Prezentarea antigenelor lipidice n as ociaie cu moleculele CD1 este sensibila la agenii de acidificare a endosomului (cl oroquina, concana-micina A). Probabil, asocierea antigenelor lipidice cu cu CD1 se produce n compartimentul endo-somal acid. Moleculele CD1 sunt impor-tante pentru reaciile de aparare anti-infecioasa, pentru ca ele prezinta antigenele de micobacterii (acidul micolic, lipoarabinomananul) , celulelor T. Calea CD1 de prezentare a antigenelor se aseamana enelor peptidice n asociaie cu moleculele CMH I ct de vedere structural, cu moleculele CMH I, dar n endosomul lipidic. Prezentarea antigenelor n siderata ca o cale distincta. Activarea limfocitelor T Fig. 63. Moleculele CMH regleaza raspunsul imun. a. O celula T citotoxica (CD8) recunoate peptidul n asociaie cu o molecula CMH clasa I, pe suprafaa unei celule in fectate cu un virus. b. O celula T helper (CD4) recunoate peptidul antigenic asociat cu o molecula CMH clasa II, pe suprafaa unei celule prezentatoare de antigen (CPA). Epitopii antig enici sunt recunoscui de RCT, dar la procesul recunoaterii participa i moleculele C D8 i respectiv CD4. CD8 recunoate domeniul ?-3 al moleculei CMH I, iar CD4 se lea ga de domeniile ?-2--2 ale moleculei CMH II. cu caile de prezentare a antig i II. CD1 este asemanatoare din pun asocierea cu antigenul are loc asociaie cu moleculele CD1 este con

Cel puin trei molecule distincte sau complexe moleculare, fizic independente, ale membranei au rol n transducerea eficienta a semnalului activator al celulei T, f iecare fiind asociata cu o activitate enzimatica relevanta: - RCT1 ?- i complexul CD3 (?-?-?). Partea invarianta a RCT este asociata cu tirozi n-chinaza p59fyn; - coreceptorii CD4 sau CD8, asociai cu tirozin-chinaza p56lck; - CD45, cu activitate fosfatazica tirozin-specifica. Limfocitele T mature cu RCT ?- sunt CD4 sau CD8. Celulele TCD4 recunosc fragmente le peptidice legate de moleculele CMH II, iar celulele TCD8 recunosc fragmentele peptidice legate de moleculele CMH I. Aceasta specificitate a condus la sugesti a ca molecula CD4 poate sa lege molecula CMH II, iar molecula CD8 leaga molecula CMH I, ambele avnd rol de coreceptori de antigen. Fig. 64. a. Suprafamilia genelor care codifica imunoglobulinele i diferite alte m olecule cu rol n recunoaterea intercelulara. Toate aceste molecule au o structura asemanatoare. Familia moleculelor multigenice, cu rol n recunoaterea antigenului c uprinde imunoglobulinele, RCT, moleculele CMH I i II. b. Familia moleculelor monogenice cuprinde molecula Thy (exprimata pe celulele T i pe neuroni), receptorii de poli-Ig (transporta IgA prin epiteliul mucoaselor), N-CAM (o molecula de aderena a neuronilor), CD4, CD8, precum i alte proteine (o p roteina plasmatica umana, o proteina neurocitoplasmatica) (dupa Roitt, 1997). Coreceptorii CD4 i CD8 sunt glicoproteine trans-membranare. Fiecare este aso-ciat a cu o molecula de tirozin-kinaza specifica celulei T, p56lck. In procesul activ arii celulei T de catre antigen, coreceptorul trebuie sa se lege de aceiai molecu la CMH ca i RCT, pentru transducerea optima a semnalului. Inter-aciunea faciliteaz a transmi-terea semnalului activator cu o eficiena de pna la 300 de ori mai mare. CD4 i CD8 sunt mem-bre ale suprafamiliei imuno-globulinelor. Dei ambele au rol de coreceptori i se asociaza cu aceiai tirozin-kinaza (p56lck), nu au omologie struct urala. Studiile de cristalografie cu raze X au aratat ca domeniul extern al moleculei C D4 formeaza o protruzie pe faa laterala a moleculei, implicata n legarea moleculei CMH II. Molecula CD8 este formata din doua catene diferite (? i ) i are un singur domeniu de omologie cu molecula de Ig, la capatul amino. Acesta este urmat de o secvena c u configuraie nedefinita i cuprinde resturile de cisteina care permit legarea mole culelor n dimeri funcionali. Molecula CD8 are rol de coreceptor, participnd la recu noaterea antigenului, prin asocierea cu domeniul ?-3 al moleculei CMH I. Fig. 65. Diferite aranjamente ale RCT i ale co-receptorilor sai sunt determinate de izoformele lui CD45 exprimate pe celula T. Pe celulele neangajate, CD4, CD45 i RCT migreaza independent pe suprafaa celulei. Pe celulele T de memorie, cele tre i molecule sunt asociate. Pe celulele Th2 clonate, o izoforma de CD45 cu gr. mol mica, se leaga de CD4, dar acest complex nu se asociaza cu RCT. Activarea optim a a celulei are loc n cazul n care cele trei molecule sunt asociate strns pe supraf aa limfocitului (dupa Janeway, 1997). Coreceptorii se asociaza fizic cu RCT n timpul activarii celulei T. Molecula CD45 este o fosfataza transmembranara tirozin-specifica. Este un antige n leucocitar, prezent pe toate celulele de origine hematopoietica, alcatuit dint r-un domeniu extern variabil i un domeniu citoplasmatic constant ce consta din do

ua subdomenii cu activitate fosfatazica tirozin-specifica. CD45 prezinta mai multe izoforme, care variaza cu tipul celular. Varia-bilitatea rezulta din clivarea alternativa a ARNm. Celulele T i schimba izoforma de CD45 n t impul activarii i dupa activare. Pe limfocitele T neangajate, izoformele de CD45 sunt toate cu greutate moleculara mare, iar celulele T activate sau de memorie e xprima o varianta a CD45 cu greutate moleculara mica. Izoformele distincte se asociaza n mod diferit cu celelalte componente ale comple xului la celulele neangajate i la cele de memorie, modificnd eficiena transmiterii semnalului de activare. Limfocitele TCD4 recunosc com-plexul molecular CMH II-epitop, expus la suprafaa c elulei prezentatoare de antigen (CPA) i se activeaza. Limfocitul activat secreta IL-2, o interleuchina eseniala pentru expansiunea clonala a limfocitelor TCD4 i am plificarea raspunsului imun. Amplificarea raspunsului imun parcurge mai multe et ape: Fig. 66. Mecanismul activarii celulei T. - dupa legarea limfocitului TCD4 de CPA, ultima produce IL-1; - stimuleaza limfocitul TCD4 sa produca IL-2. IL-2 acioneaza stimulator asupra ce lulelor care o produc (bucla autocrina) i asupra limfocitelor nvecinate, care au a ceiai specificitate a receptorului de antigen (aciune paracrina), efectul fiind ex primarea intensa a receptorilor pentru IL-2 pe suprafaa limfocitelor stimulate; - limfocitele TCD4 activate de IL-2 prolifereaza i genereaza o populaie de celule imunoreactive, Th1 i Th2, care la rndul lor, prin intermediul interleuchinelor pe care le secreta, au efecte activatoare asupra compartimentului imunitaii celulare sau stimuleaza activarea i proliferarea limfocitelor B specifice, n funcie de natu ra antigenului. Fig. 67. Amplificarea raspunsului imun. Pentru ca epitopii sa fie recunoscui, moleculele CMH trebuie sa expuna simultan p e suprafaa celulei, un numar mare de peptide nonself, pentru un interval suficien t, astfel nct sa permita limfocitelor T sa controleze calitatea moleculelor CMH al e fiecarei celule. Timpul de generaie al unei celule T, dupa stimularea antigenica poate fi de 4,5 o re, adica ntr-o saptamna, dintr-o singura celula T pot sa rezulte 1012 celule, cee a ce ar nsemna dublarea numarului de limfocite T n organism. O proteina de dimensi uni medii, cu 2-10 epitopi, poate fi recunoscuta de 10-1000 celule neangajate, n funcie de capacitatea moleculelor CMH de a prezenta epitopii peptidici. Consecuti v unei infecii virale, numarul celulelor CD8 cu specificitate faa de antigenele vi rale, la oarece poate sa creasca de 10 ori. Durata de viaa a limfocitelor T este greu de evaluat, dar moartea lor prin apopto za este declanata de IL-2 i de antigen. Dupa stimularea ciclului celular sub aciune a antigenului, limfocitele T devin foarte sensibile la apoptoza. Proliferarea ce lulelor T este stimulata dupa ce IL-2 se fixeaza pe receptorul specific. Dupa un ul sau cteva cicluri, limfocitele T n faza G1 sau S, devin foarte sensibile la apo ptoza. Aa se explica moartea hibridoamelor T ca raspuns la legarea ncruciata a RCT. Apoptoza celulelor T este declanata n doua situaii: sub aciunea stimulatoare a antig enului i n absena limfochinelor. Raspunsul celulelor T la antigen se desfaoara n doua faze, cu evenimente molecular e distincte: faza de activare i cea de proliferare. Faza de activare consta n inducerea genelor pentru sinteza IL-2 i a receptorului d

e mare afinitate pentru IL-2. In aceasta faza, apoptoza este practic absenta. Fa za de proliferare a limfocitelor T este iniiata de fixarea IL-2 pe receptorul sau . Dupa ce celulele T au parcurs unul sau cteva cicluri celulare i intra n faza G1 s au S, devin foarte sensibile la apoptoza. Factorul esenial al apoptozei este IL-2 . Conceptul controlului feed-back al intensitaii raspunsului imun prin fenomenul ap optozei (reglarea propriocida) s-a nascut din nevoia de a explica acest nou rol al IL-2, care contrasteaza cu proprietaile sale proliferative. Teoria afirma ca I L-2 confera celulelor T, sensibilitate la apoptoza. Gradul stimularii antigenice determina inducerea apoptozei. Dupa ncetarea stimularii antigenice, sinteza IL-2 i a receptorului sau scade. In absena IL-2, cu rol trofic pentru limfocitele T, s e iniiaza apoptoza pasiva. Invers, daca celulele T intrate n ciclul diviziunii sun t intens stimulate de antigen, se produce apoptoza activa (indusa de antigen). Apoptoza pasiva diminua expansiunea populaiei celulelor T, i o adapteaza la intens itatea unui raspuns fiziologic. Apoptoza activa este indusa numai de activarea R CT. Ca rezultat al acestor doua forme de apoptoza, raspunsul feed-back elimina c elulele T daca antigenul i IL-2 sunt n exces sau n deficit. O parte a celulelor T poate sa scape morii apoptotice pasive sau active i sa devin a limfocite T de memorie, cu viaa lunga. 1 Structura RCT a fost prezentata ntr-un capitol anterior.

p 8 p p

SURSE DE GAMAGLOBULINE OMOGENE

Moleculele de anticorpi ale unui ser imun sunt foarte heterogene din punctul de vedere al specificitaii lor de combinare cu epitopii antigenici inductori, deoare ce, att antigenele moleculare, dar n special cele corpusculare (virusuri, celule), prezinta o mare diversitate de epitopi. Chiar i antigenele moleculare cele mai s imple sunt mozaicuri de epitopi. Specificitatea de combinare a moleculelor de an ticorpi corespunde epitopilor faa de care s-au sintetizat. Diversitatea uriaa a specificitaii de combinare a anticorpilor (evaluata la 108-10 9) genereaza o heterogenitate biochimica de acelai nivel, materializata n variaia s ecvenei de aminoacizi, ceea ce a constituit un obstacol major n calea studiului lo r prin metode analitice, dei anticorpii se gasesc totdeauna n snge, cu excepia cazur ilor patologice de agamaglobulinemie. Analiza biochimica a imunoglobulinelor a fost condiionata de existena unei surse o mogene de molecule de anticorpi, cu o secvena identica a aminoacizilor. Condiia id

entitaii secvenei de aminoacizi este ndeplinita de anticorpii care au aceiai specifi citate de legare, nu faa de un antigen, ci faa de un singur epitop. Proteine de mielom Sursa naturala de molecule de imunoglobulina, omogene, identice din punct de ved ere biochimic (monoclonale), este mielomul multiplu (plasmocitomul), o afeciune t umorala maligna, iniiata n maduva osoasa i rezultata prin proliferarea unui plasmab last. Plasmocitomul produce molecule de imunoglobuline identice din punct de vedere bi ochimic i al sarcinii electrice, denumite proteine de mielom, deoarece toate celu lele tumorii sunt descendente ale unei singure celule producatoare de anticorpi. Moleculele secretate de o tumora de mielom se numesc proteine M (Mielom) sau pa raproteine i pot sa reprezinte pna la 95% din totalul gamaglobulinelor plasmatice. Tumorile de mielom apar spontan cu o frecvena mica la om, cine, cal, obolan, oarece sau se induc experimental la oarecii liniilor inbred NZB i BALB/c. Tumora este tra nsplantabila n serie. Uneori, proteinele M au aceiai secvena de aminoacizi ca i imunoglobulinele normale, dar adeseori, sinteza catenelor patologice este incompleta: lipsesc diferite se cvene de aminoacizi, de diferite lungimi. Rareori, proteinele de mielom i pastreaza chiar proprietatea de a lega specific de terminani antigenici cunoscui: de exemplu, 5% din proteinele M ale unei linii inbr ed de oarece, leaga determinani antigenici ai suprafeei celulelor bacteriene enteri ce, ceea ce sugereaza ca tumora i are originea n descendenii limfocitelor B, care pr olifereaza ca raspuns la stimularea specifica cu antigene ale microbiotei enteri ce. Tumorile de mielom, de cele mai multe ori, secreta molecule incomplete sau fragm ente de molecule imunoglobulinice. n celulele tumorilor de mielom, rata sintezei catenelor H i L este dezechilibrata. De exemplu, mielomul Bence-Jones, sintetizeaza catenele L n mare exces. Proteine le Bence-Jones sunt dimeri de lanuri L (k sau ?). Una din cele doua catene L are rolul catenei H i participa la formarea situsului de legare. Molecula patologica are activitate de anticorp faa de unele componente tisulare sau faa de antigene mi ci. Mielomul lanurilor grele sintetizeaza numai catenele H ale izotipurilor ???? sau , iar mielomul macroglobulinemiei Waldenstrom sintetizeaza molecule de IgM. Major itatea mieloamelor produc proteine Bence-Jones. n laboratorul clinic, diagnosticul de mielom se pune dupa detectarea n ser, prin e lectroforeza, a unei cantitai mari de molecule ale unui izotip de imunoglobulina (circa 50 mg/ml). Proteinele de mielom precipita la 50-60o, la pH 4-6, se redizolva prin ncalzire l a 80-90o i reprecipita prin racire. La pacienii cu mielom, n special la cei cu macroglobulinemie Waldenstrom, vscozitat ea sngelui crete mult, datorita cantitaii excesive de proteine produse de mielom. E liminarea proteinelor patologice se face prin procedeul plasmaferezei. Plasmafer eza este tehnica de recoltare a unor volume mari de snge, urmata de reintroducere a n organism, a celulelor sanguine suspendate ntr-un nlocuitor de plasma.

Surse artificiale de anticorpi monoclonali. Tehnologia hibridomului Metoda clasica de obinere a anticorpilor necesari studiilor clinice i de diagnosti c, consta n stimularea repetata, prin injectarea antigenului ntr-un organism cu re activitate imunitara optima. Cnd titrul anticorpilor specifici este maxim, animal ul este sngerat i se obine serul imun (antiserul), care este folosit n stare nativa sau este utilizat pentru purificarea anticorpilor. Metoda are cteva dezavantaje: - cantitatea i calitatea anticorpilor faa de un antigen variaza de la un organism la altul i chiar ntre sngerarile succesive ale aceluiai animal; - serul imun este un amestec foarte heterogen de molecule de anticorpi, chiar i n cazul n care imunizarea se face cu un antigen cu grad nalt de puritate; - orict de simplu ca structura moleculara, un antigen are mai muli epitopi care st imuleaza mai multe clone de limfocite, ce produc anticorpi cu specificitai i afini tai diferite; - antigenele nalt purificate conin impuritai antigenice care induc sinteza anticorp ilor specifici n cantitai disproporionat de mari; - chiar dupa purificare ? proces costisitor ? antiserurile conin anticorpi cu afi nitai diferite i cu reactivitate ncruciata. Din aceste cauze, toate serurile imune sunt amestecuri de anticorpi policlonali, n cantitai variabile de la un organism la altul. Obinerea unor cantitai mari de ant icorpi cu specificitate de legare faa de un epitop unic, prin metoda clasica este imposibila. Tehnologia moderna de obinere a anticorpilor omogeni, denumita hibridoma (hibrid + mieloma) a fost propusa de Khler i Milstein (1975), se bazeaza pe urmatoarele pr incipii metodologice i teoretice: 1) Antigenul purificat se injecteaza animalelor de experiena. 2) La momentul adecvat, din splina sau din ganglionii limfatici, se separa limfo citele. Fiecare limfocit i plasmocitele derivate sintetizeaza molecule omogene de anticorpi, cu specificitate unica de combinare pentru un singur epitop, denumii anticorpi monoclonali (AMC). 3) Limfocitele B traiesc puin n afara organismului, iar plasmocitele care sintetiz eaza cea mai mare cantitate de anticorpi, nu supravieuiesc in vitro i de aceea cul tivarea sau clonarea lor nu este posibila. 4) Celulele de mielom sunt nemuritoare, datorita capacitaii lor de a se menine un timp nelimitat n cultura. Fuziunea lor cu limfocitele B in vitro, le confera celo r din urma proprietatea de ?nemurire?, rezultnd o celula hibrida(hibridom), care sintetizeaza i secreta anticorpi monoclonali (AMC). AMC sunt considerai ca variant a in vitro a proteinelor de mielom, pentru ca n ambele cazuri, o clona de limfoci te prolifereaza i secreta anticorpi cu o anumita specificitate 5) Hibridomul producator de anticorpi motenete caracteristici att de la limfocit ? adica secreta anticorpi cu specificitate faa de un antigen, ct i de la celula de mi elom, adica este nemuritor. 6) Celulele hibridoma pot fi clonate individual i fiecare clona produce anticorpi specifici faa de un singur determinant antigenic. Ele pot fi meninute indefinit p

rin pasaje in vivo sau prin cultivare in vitro. Fig.91. Biotehnologia hibridomului de producere a anticorpilor monoclonali se ba zeaza pe fuziunea limfocitului, cu celula tumorala de mielom de oarece. Antigenel e membranare specifice ale celor doua celule, se distribuie n mozaic pe suprafaa c elulei fuzionate heterocarion. Etapele obinerii hibridomului Metodologia obinerii unei linii celulare hibride, nemuritoare, producatoare de AM C, parcurge mai multe etape. 1. Obinerea celulelor de mielom. Baza tehnologiei hibridomului a fost obinerea une i linii celulare mutante de mielom, care nu secreta anticorpi i este deficienta p entru hipoxantin-guanozin-fosfo-ribozil-transferaza (HGPRT). Mielomul (plasmocitomul) este rezultatul diviziunilor necontrolate ale unui sing ur plasmablast sau ale unui precursor al sau din linia limfocitara B. Proliferar ea necontrolata este nsoita de sinteza unor cantitai mari de molecule omogene de im unoglobulina, cu proprietai biochimice uniforme. Moleculele sintetizate de tumori le de mielom se deosebesc de imunoglobulinele normale, prin aceea ca nu prezinta specificitate de legare cu antigenul. Tumorile de mielom apar spontan la multe mamifere, iar la om, 1% din tumori sunt mieloame. Tumorile de mielom se induc experimental la mai multe linii de oarece (BALB/c i NZB), dupa injectarea intraperitoneala a uleiurilor minerale, sau dupa implantarea materialelor plastice, care produc o reacie inflamatorie cronica. Tum orile apar dupa 120-130 de zile i se pot menine prin pasaje seriate la oareci din a ceiai linie inbred sau prin cultivare in vitro i produc cantitai suficiente de imun oglobuline pentru analiza biochimica. Nu s-au obinut mieloame care sa sintetizeze anticorpi cu specificitate de legare faa de un antigen. Hibridoamele se obin din linii speciale de mielom, care au doua particularitai mut aionale: - nu sintetizeaza propria molecula de imunoglobulina, astfel ca celula hibrida v a produce exclusiv molecule de imunoglobulina caracteristice limfocitului B norm al; - sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, necesara sintezei acizilor nucle ici. - Pentru hibridare sunt disponibile linii celulare de mielom de oarece, de obolan, de om, dar cea mai folosita este linia P3-X63-Ag8, izolata de la linia BALB/c, cu urmatoarele caracteristici: ? este HGPRT-; - este tumorigena pentru oarece; - are o frecvena relativ nalta (1/105-106) de fuziune cu limfocitele de oarece; - nu sintetizeaza imunoglobulina proprie i nu represeaza genele pentru sinteza im unoglobulinei n hibridom; - are o eficiena nalta de clonare in vitro. Deoarece sunt deficiente pentru sinteza enzimei HGPRT, celulele sale nu detoxifi ca efectul aminopterinei, care se adauga n mediul de cretere. Aminopterina, un ant agonist al reductazei acidului folic, blocheaza calea sintezei ADN prin inhibiia

sintezei purinelor (A, G) i a timidinei. In mediul cu aminopterina, celulele cu H GPRT- nu supravieuiesc. 2. Imunizarea. Obinerea unei populaii mari de limfocite B, prin fenomenul expansiu nii clonale, angajate n sinteza anticorpilor specifici faa de un anumit epitop, se realizeaza prin imunizare. Antigenul stimuleaza mai multe clone de limfocite. F iecare clona de limfocite activate, sintetizeaza anticorpi specifici faa de unul din epitopii antigenului. Procedura de imunizare (cantitatea de antigen, tipul d e adjuvant, calea de administrare) este selectata empiric.

Cea mai buna sursa de limfocite ramne splina de oarece i de obolan, dar n special oar cele BALB/c, pentru ca mielomul are aceiai origine i prin hibridare se evita incom patibilitatea CMH. Hibridoamele de obolan, obinute prin fuziunea limfocitelor sple nice cu celule de mielom, sunt mai stabile i anticorpii pe care i sintetizeaza fix eaza complementul. Cantitatea de antigen necesara pentru imunizare depinde de imunogenitatea acestu ia. Antigenele celulare bacteriene sau ale celulei eucariote sunt foarte imunoge ne. Antigenele solubile (polipeptide, glucide, hormoni) sunt slab antigenice. Im unogenitatea lor crete dupa cuplarea cu hemocianina de Limulus (KLH) sau cu album ina. Cea mai buna imunizare se obine prin injectare intravenoasa sau intraperiton eala repetata, timp de cteva saptamni sau luni, a antigenului slab imunogen. Splina se recolteaza nainte de atingerea titrului maxim al anticorpilor serici. B lastele fuzioneaza mai uor dect celulele n repaus. O alternativa a imunizarii este stimularea limfocitelor in vitro, prin incubarea n prezena antigenului. 3. Fuziunea se realizeaza n scopul ?imortalizarii? celulelor producatoare de anti corpi i este esena biotehnologiei hibridomului. Scopul ?imortalizarii?este pastrar ea capacitaii limfocitelor individuale de a secreta un singur tip de AMC, prin cr eterea nelimitata n timp, fara senescena, in vivo sau in vitro, ca o consecina a tra nsformarii, indusa cu celule de mielom. Limfocitele sau imortalizat pe trei cai: - prin fuziune cu celule tumorale de mielom - prin infecie cu un virus transformant ADN - prin transfecie cu ADN transformant din celulele maligne sau cu ADN al unui onc odnavirus. Cea mai utilizata metoda de ?imortalizare? este aceea a fuziunii cu o celula de mielom. Fuziunea limfocitelor viabile din splina, obinute prin dezagregare mecani ca, cu celulele de mielom HGPRT- se realizeaza prin amestecul lor n proporie de 25 celule splenice/o celula de mielom. Procesul fuziunii este stimulat pe mai multe cai, dar cel mai adesea se folosete PEG cu gr. mol. de 4000 D. Amestecul de celule se menine 3 minute n 0,20-0,50 ml P EG 40%, la 370, pH 7,5-8,0. Frecvena fuziunii crete sub aciunea impulsurilor electr ice scurte, de mare intensitate. Numarul i varietatea hibridoamelor obinute este mare, ceea ce impune selecia celor producatoare de anticorpi cu specificitatea dorita. 4. Selecia celulelor de hibridom. Amestecul de fuziune conine celule splenice i cel ule de mielom nefuzionate, celule splenice fuzionate ntre ele, celule de mielom f uzionate ntre ele i celule hibridom, rezultate prin fuziunea splenocitelor cu celu

le de mielom. Selecia are ca scop, separarea celulelor de hibridom i eliminarea din amestec, a c elorlalte tipuri celulare, nefuzionate sau fuzionate neutilizabile. In acest sco p, amestecul de celule se cultiva pe mediul selectiv HAT (hipoxantina-aminopteri na-timidina), n care splenocitele nefuzionate i fuzionaii splenocit x splenocit mor n 1-2 saptamni, copleite fiind numeric de celulele de hibridom, care se divid la f iecare 17-24 de ore. Mediul selectiv HAT permite supravieuirea numai a fuzionailor mielom x splenocit i este inhibitor pentru celulele de mielom, ca i pentru fuzionaii mielom x mielom. A ciunea sa selectiva se bazeaza pe urmatoarele condiii experimentale: a) Aminopterina din mediul HAT blocheaza sinteza purinelor (A, G) pe calea inozi n-monofosfatului i astfel blocheaza sinteza acizilor nucleici. In acest mediu, ce lulele HGPRT- devin dependente de surse externe de purine (A, G) i de timidina. Hipoxantina din mediul HAT poate fi convertita la inozin-mo nofosfat, de catre enzima HGPRT i se formeaza adenozin-monofosfat i guanozin-monof osfat. Timidina poate fi fosforilata la timidin-monofosfat i timidin-trifosfat, d e catre enzima TK. Ambele enzime (HGPRT i TK) se gasesc n splenocitele normale. b) Celulele de mielom sunt HGPRT- i pe mediul selectiv HAT nu supravieuiesc nici c elulele ca atare, nici fuzionaii mielom-mielom. Pe acest mediu supravieuiesc i se d ivid indefinit, celulele de hibridom, deoarece sunt HGPRT+ (codificata de genomu l splenocitelor) i sunt ?nemuritoare?, calitate conferita de celulele de mielom.

5. Clonarea. Clona este o populaie de celule identice, genetic stabile, derivate din diviziunea unei singure celule. Clonarea se face prin diseminarea suspensiei celulare diluate, pe medii nutritive agarizate. Fiecare celula de hibridom, pri n diviziuni succesive, produce o colonie, adica o clona celulara. Operaia de clon are se repeta pentru a garanta o descendena omogena. Dintre sutele de hibridoame clonate, este necesara selectarea celor cu capacitate de sinteza a anticorpilor specifici faa de antigenul cu care s-a facut imunizarea. Fig.92. Ilustrarea schematica a etapelor producerii anticorpilor monoclonali (AM C). Animalele, de obicei oareci, sunt imunizate cu un antigen (de exemplu, un mic roorganism care conine 4 antigene de suprafaa - a, b, c, d). Fiecare antigen conine un numar de epitopi, de exemplu molecula b conine epitopii b, b?, b?. Serul anim alelor imunizate este policlonal i conine anticorpi A, B, B?, B?, C, D. Prima trea pta n producerea AMC este obinerea suspensiilor de celule B i celule de mielom. In etapa urmatoare, cele doua populaii de celule (m i s) sunt puse n amestec, n prezena PEG, ca agent de fuziune. Suspensia se repartizeaza n godeurile unei placi pentru cultivarea celulelor, la o diluie adecvata astfel nct, fiecare godeu sa nu conina m ai mult dect o celula hibrida. Celulele se cultiva n mediu HAT pentru a inhiba cret erea celulelor de mieloma nefuzionate. Celulele splenice nefuzionate nu se divid i mor dupa cteva zile. In procesul de selecie mor i fuzionaii s - s i m - m. Supravi iesc i prolifereaza fuzionaii am, bm, b?m, dm i xm. Clonarea se repeta. Hibridoamel e se cultiva i se determina specificitatea anticorpilor sintetizai. Cele care sint etizeaza anticorpi cu specificitatea necesara se propaga n recipiente mai mari n c are se obin 1-10 l/ml. Celulele pot fi injectate n cavitatea peritoneala de oarece, unde se multiplica sub forma ascitei i produc 1 mg/ml anticorpi specifici. Hibridoamele producatoare de anticorpi cu specificitatea dorita, se cultiva in v itro, n culturi cu perfuzie continua cu mediu proaspat sau n bioreactoare cu capac itate mare. Cea mai simpla tehnica este a cultivarii in vivo i consta n inocularea intraperito neala a circa 2 x 106 celule hibridoma, la organisme ale aceleai linii genetice ( pentru evitarea fenomenului de incompatibilitate CMH). Hibridomul se dezvolta in traabdominal i lichidul de ascita care o nsoete, conine anticorpi n proporie de 50% totalul proteinelor sale.

Randamentul producerii AMC in vivo este de 100-1000 de ori mai mare dect in vitro . Anticorpii din lichidul ascitic se purifica prin fracionare cu sulfat de amoniu sau prin metoda cromatografiei cu schimb de ioni. Avantajele biotehnologiei hibridomului Producerea AMC prin tehnologia hibridomului are un avantaj net faa de metoda conv enionala a obinerii serului imun, deoarece se pot obine anticorpi specifici produi d e cte un hibridom, pentru fiecare epitop al unui antigen natural. Clonarea indivi duala a fiecarui hibridom, creeaza condiii ca fiecare clona celulara sa secrete a nticorpi cu specificitate unica faa de un singur epitop al unui antigen. Celulele de hibridom prolifereaza rapid, ceea ce scurteaza timpul necesar obineri i AMC. Hibridoamele produc cantitai foarte mari de anticorpi, ce depaesc de cteva ori conc entraia anticorpilor din serul animalelor imunizate. Clonele de hibridom se menin indefinit prin cultivare in vitro sau in vivo. Hibridomul ofera posibilitatea obinerii AMC marcai, prin adaugarea precursorilor m arcai radioactiv (marcare interna). Anticorpii marcai in situ (n timpul sintezei) o fera un avantaj net n raport cu anticorpii marcai dupa purificare (marcare externa ). Marcarea externa cu I125 implica purificarea imunoglobulinelor din antiserul convenional, dar presupune modificarea chimica i denaturarea pariala, cu pierderea proporionala a specificitaii de legare. Pentru marcarea interna se folosesc elemente radioactive cu perioada de njumataire mai lunga dect a I125 : C14, S35, H3. Marcajul radioactiv intern este net superi or celui cu peroxidaza i feritina, utilizat n tehnicile convenionale. Tehnologia hibridomului este un model experimental care poate fi extins i la alte categorii de celule care sintetizeaza substane utile (interferon, insulina). Obin erea unor hibrizi dintre celula de mielom de oarece i un limfocit normal, de la ac eiai specie, n scopul producerii AMC, a introdus un concept nou n biologia molecula ra - conceptul imortalizarii funciilor specifice difereniate. Aplicaii practice ale AMC AMC reprezinta un reactiv imunochimic bine definit i de aceea, rezultatele obinute prin utilizarea lor sunt reproductibile. AMC se folosesc ca reactivi de mare specificitate n cercetare, n diagnosticul clin ic, n farmacologie pentru profilaxia i terapia unor infecii la om i animale, n tehnic ile de biochimie analitica pentru purificarea unor molecule. n domeniul cercetarii imunocitochimice*, AMC sunt reactivi cu nalta specificitate, utilizai pentru identificarea unor proteine care se gasesc n cantitai foarte mici. De exemplu, AMC marcai cu fluoresceina permit evidenierea moleculelor membranare, inaccesibile investigaiei cu metodele clasice. AMC au fost markeri eficieni pentr u identificarea diferitelor subpopulaii de limfocite T i B, a antigenelor membrana re ale celulelor seriei mieloide i monocitare. Sistemul CD (cluster differentiati on) este definit n ntregime pe baza utilizarii AMC i cuprinde acum peste 200 de mar keri de suprafaa. AMC cu specificitate CD se folosesc pentru a detecta apariia sau absena populaiilor celulare n timpul stimularii antigenice.

Fig. 93 Structura fluoresceinei. Datorita specificitaii lor de legare, AMC se folosesc pentru a evidenia diferenele antigenice minore ntre diferite variante moleculare. Astfel sau identificat variai ile compoziiei n aminoacizi ale spiculelor glicoproteice, consecutive driftului an tigenic la virusul influenza A. AMC se folosesc pentru identificarea moleculelor neurotransmiatoare, a receptoril or sinaptici i a enzimelor de biosinteza. S-au obinut AMC faa de receptorul de acet ilcolina, dar dificultaile sunt mari pentru ca neurotransmiatorii sunt antigene sl abe. n diagnosticul serologic, serurile imune obinute prin metoda clasica au avut adese ori inconvenientul major al lipsei reproductibilitaii rezultatelor. AMC se folose sc ca reactivi de mare specificitate pentru diagnosticul rabiei pe seciunile de es ut nervos al animalelor infectate, Anticorpul este marcat cu o molecula generatoare de semnal (de exemplu, un fluor ocrom, o enzima producatoare de culoare prin aciunea sa asupra substratului speci fic, ori o particula metalica). Sensibilitatea metodei, adica puterea semnalului poate fi marita prin creterea raportului dintre molecula indicator (anticorpul m arcat) i antigen. Imunocitochimia necesita producerea anticorpilor specifici i tra tamentul adecvat al esuturilor, adica fixarea i histoprepararea pentru a favoriza interaciunea optima ntre reactiv i molecula inta a hepatitelor virale B, C, D, a inf eciei cu HIV (prin determinarea prezenei antigenelor n ser) i a unor infecii bacterie ne. Pentru diagnostic se folosesc anticorpi marcai cu fluoresceina sau metodele E LISA sau RIA. AMC se folosesc pentru diagnosticul neoplaziilor, pe baza evidenierii antigenelor specific-tumorale. n acest scop se utilizeaza AMC marcai cu izotopi radioactivi, cu specificitate faa de CEA, AFP etc. AMC se folosesc pentru detectarea hormonilor polipeptidici: TSH, FSH, HCG. Hormo nii sunt molecule cu un numar mic de epitopi. Subunitaile ? ale diferiilor hormoni sunt foarte asemanatoare, dar difera n special prin catenele . Exista AMC specifi ci pentru ambele subunitai i AMC care recunosc epitopii conformaionali ai moleculei native. AMC se folosesc n farmacologie. In scop profilactic se fac imunizari pasive faa de infeciile bacteriene care nu beneficiaza de preparate vaccinale i sunt rezistente la antibiotice: Pseudomonas, Clostridium. n scop terapeutic, AMC se folosesc pentru tratamentul rabiei, pentru neutralizare a endotoxinelor (LPS) produse de infeciile cu bacterii Gram negative, consecutive arsurilor. Septicemiile sunt cauzate de o larga varietate de bacterii Gram nega tive, toate avnd n comun lipidul A n structura chimica a LPS. Pentru tratamentul ma joritaii infeciilor bacteriene se utilizeaza antibiotice, la un pre de cost inferio r n raport cu AMC. AMC se folosesc n controlul fertilitaii: AMC anti-HCG i anti-zona pelucida sunt fol osii pentru imunizarea pasiva a femeilor fertile. Sperana utilizarii AMC n tratamentul tumorilor s-a naruit. Una din cauze este ca m ajoritatea tumorilor umane i au originea n celulele epiteliale ale colonului, snului , plamnului i prostatei, iar oncogenele activate codifica proteine intracelulare, inaccesibile terapiei cu AMC. Frecvena acestor tumori nu crete la persoanele imuno supresate, ceea ce este un argument n favoarea codificarii antigenelor intracelul are, inaccesibile sistemului imunitar. Chimioterapia ofera mult mai multe anse de succes, la un pre de cost inferior.

n sistemul hematopoietic i imunitar, AMC se folosesc pentru a distruge toate popul aiile celulare, cu excepia celulelor stem, cu scopul eliminarii celulelor maligniz ate i a precursorilor ei care poarta oncogena activata. AMC se folosesc pentru neutralizarea nivelelor toxice ale unor medicamente (digo xina). AMC se folosesc ca ageni imunosupresori. Receptorilor de grefa li se administreaz a AMC specifici faa de complexul antigenic membranar CD3, n cazurile n care imunosu presia chimica (cu ciclosporina) nu reuete. n maladiile autoimune, AMC se administreaza pentru a realiza o imunosupresie paria la, care sa permita apararea faa de infeciile cu ageni oportuniti. AMC se folosesc pentru producerea imunotoxinelor (conjugate AMC-medicamente). Me dicamentele utilizate sunt ageni citotoxici, care, prin intermediul situsului de legare a AMC, sunt destinate sa se lege specific de celulele inta(de exemplu, cel ulele maligne). In acest scop sunt necesari AMC cu o afinitate nalta a specificit aii de legare faa de antigene specific tumorale. AMC se cupleaza cu toxine (difter ica, ricina, abrina), cu medicamente citostatice sau cu radionuclizi. AMC se folosesc n tehnicile de biochimie analitica, n scopul purificarii proteinel or, sub forma coloanelor de afinitate imunoabsorbante. AMC sunt imobilizai pe sup orturi n coloane solide (imunosorbeni), prin care este trecut amestecul de protein e. In coloana sunt reinute specific, moleculele care se leaga cu AMC. Astfel se p urifica proteine care se gasesc n amestec, n concentraii foarte mici (IFN). *Imunocitochimia este o tehnica de laborator care permite identificarea vizuala a moleculelor inta n esuturi i celule, prin interaciunea specifica a anticorpilor mar cai, cu antigenul.

p 8 p p

MECANISME DE APARARE ANTIINFECIOASA Sistemul imunitar a evoluat i s-a complexat structural i funcional, n condiiile presi unii selective permanente pe care o exercita agenii infecioi, ce tind sa invadeze, sa colonizeze i sa se multiplice n esuturi. Structura sistemului imunitar este o re flectare directa a interaciunilor sale cu diversitatea agenilor infecioi care-l stim uleaza. Cele doua fore opozante s-au modelat reciproc, ntr-un conflict constant. G azdele care nu neutralizeaza agentul infecios sunt sortite morii, iar cele care su pravieuiesc sunt mai bine adaptate sa reziste infeciilor ulterioare. Problema heterogenitaii antigenice a virusurilor i bacteriilor patogene este impor tanta nu numai din punct de vedere teoretic, ci este eseniala pentru aspectul pra ctic al vaccinarii, deoarece exista riscul stimularii raspunsului imun fara efic

iena protectoare. Consecina stimularii unui raspuns imun ineficient poate fi agrav area maladiei infecioase sau chiar activarea mecanismelor patogenitaii autoimune. Evaluarea imunogenitaii moleculelor structurilor suprafeei virusurilor i bacteriilo r este dificila, deoarece o molecula n soluie poate avea o alta configuraie a epito pilor dect n ansamblul structural nativ. Diferena deriva din raporturile sale spaial e cu moleculele vecine, pe suprafaa agentului infecios. Din aceasta cauza, raspuns ul imun al organismului, la stimularea cu un agent patogen, ramne un domeniu de s tudiu practic nelimitat. O alta complicaie este consecina faptului ca specificitat ea antigenica a unor molecule este, uneori, variabila de la o tulpina la alta, a tt la virusuri ct i la bacterii. Raspunsul imun trebuie sa contracareze nu numai di versitatea antigenelor la care este expus, ci trebuie sa gaseasca soluia de raspu ns, pentru variaia biochimica a unei structuri, la diferite tulpini de microorgan isme. RASPUNSUL IMUN SPECIFIC ANTIINFECIOS Raspunsul imun antibacterian i antiviral are att o componenta humorala ct i una celu lara. Prevalena unuia sau altuia dintre cele doua compartimente este diferita n fu ncie de natura agentului infecios. De cele mai multe ori, predomina raspunsul imun mediat humoral, iar n cazuri mai rare (de exemplu, infecia cu M. tuberculosis sau cu M. leprae) este preponderent raspunsul imun mediat celular.

Raspunsul imun faa de diferite antigene ale agenilor patogeni are grade variate de protecie antiinfecioasa, n funcie de natura agentului, de gradul sau de virulena i d natura raspunsului imun pe care-l iniiaza. Uneori, raspunsul imun antiinfecios es te puin benefic pentru gazda sau este chiar detrimental, din diferite cauze: - raspunsul imun este orientat faa de componente moleculare neeseniale ale agentul ui infecios. Stimularea antigenica activeaza un raspuns imun ineficient. Anticorp ii nu au efect neutralizant al infeciozitaii, pentru ca structurile de care se lea ga specific nu constituie situsuri critice ale agentului patogen (de exemplu, an ticorpii antiflagelari, care in vitro determina aglutinarea, in vivo au o eficie na mai scazuta, limitata la imobilizarea celulelor bacteriene); - raspunsul imun poate produce leziuni mai puternice i mai extinse dect nsui agentul infecios. Infecia propriu-zisa produce leziuni minime, dar activarea imunitaii med iate celular amplifica leziunile tisulare i grabete evoluia procesului infecios (de exemplu, leziunile consecutive infeciei cu virusul corio-meningitei limfocitare l a oarece i liza hepatocitelor infectate cu virusul hepatiei B umane). Componentele structurale antigenice ale unui agent infecios, care stimuleaza un r aspuns imun protector se numesc situsuri critice sau structuri imunodominante. Un raspuns imun eficient (protector) trebuie sa aiba ca rezultat final, lezarea structurii peretelui bacterian, fungic sau a nveliului viral, prin aciunea combinat a a anticorpilor i a proteinelor complementului. Structura antigenica a celulei bacteriene Multe molecule bacteriene moduleaza activitatea sistemului imunitar, avnd ori un efect stimulator (adjuvant), ori diminua reactivitatea imunitara. Ele modifica r aspunsul celulelor imunitare competente, prin mecanisme de semnalizare. De aceea se numesc molecule imunomodulatoare. Efectele lor realizeaza un echilibru compl ex ntre mecanismele de recunoatere i neutralizare a antigenelor i virulena bacteriana . Imunomodulatorii pot avea efecte asupra limfocitelor T, B i asupra macrofagelor , similare cu cele produse de citochine.

Imunomodulatorii cu activitate mitogenica, induc activarea policlonala a limfoci telor T i B, care se deosebete de activarea specifica. Rezultatul este sinteza ant icorpilor cu specificitai multiple, dintre care, o fracie sunt specifici faa de age ntul infecios. Dei fara specificitate, sinteza rapida a anticorpilor poate fi sufi cienta pentru stoparea infeciei. Moleculele imunomodulatoare modifica nu numai reactivitatea imunitara, ci i mobil itatea celulelor, n special a fagocitelor (de exemplu, pot inhiba migrarea macrof agelor din focarul inflamator). Daca moleculele imunomodulatoare persista n esutur i, stimuleaza cronic sistemul imunitar, cu efecte patologice autoimune, cea mai cunoscuta fiind artrita de adjuvant. Multe molecule imunomodulatoare de origine bacteriana au efecte mai generale, ca re se extind asupra altor sisteme: ele produc febra, influeneaza sistemul de coag ulare sanguina, concentraia ionilor, a Fe etc. Moleculele bacteriene cu rol imunomodulator sunt localizate pe suprafaa celulei. Ele sunt polimeri ai nveliului, dar i molecule excretate, cu efect toxic. Pe de alt a parte, eficiena raspunsului imun antibacterian, depinde de raportul dintre reac tivitatea sistemului imunitar i mecanismele de autoprotecie ale bacteriei, menite sa devieze raspunsul imun.

Din punct de vedere antigenic, bacteriile interacioneaza cu gazda prin modalitai d iverse. La o extremitate sunt cele lipsite de atributul invazivitaii, care produc cantitai mici de toxine, iar la cealalta, sunt bacteriile care cresc cu o rata na lta n esuturi sau n snge i produc septicemii. Unele bacterii prezinta determinani ant genici asemanatori ca structura chimica, moleculelor self ale organismului gazda . Raspunsul imun specific va fi absent ori nesemnificativ, sau efectorii imunita ri dau reacii ncruciate cu moleculele self. Alteori, suprafaa bacteriana poseda dete rminani antigenici de natura proteica sau polizaharidica, inductori ai raspunsulu i imun. Cele mai semnificative structuri bacteriene din punct de vedere antigenic sunt c ele parietale: peptidoglicanul din peretele Gram pozitiv i Gram negativ, peptidog licolipidele din peretele complex al micobacteriilor i structurile parietale ale spirochetelor. Toate tipurile structurale de perete conin mureina (peptidoglican) , dar se deosebesc prin alte numeroase componente chimice cu semnificaie antigeni ca. Unitatea minima a peptidoglicanului care pastreaza activitatea imunostimulatoare este N-acetil-muramil-L-alanina-D-izoglutamina (muramil dipeptid- MDP). Att comp onenta glucidica ct i aminoacizii MDP au funcie imunomodulatoare. A II-a clasa de polimeri imunomodulatori sunt acizii teichoici i lipoteichoici ai bacteriilor Gram pozitive. Proteinele de suprafaa asociate peretelui celular au, uneori, semnificaie antigeni ca. Cea mai cunoscuta este proteina M de la Str. pyogenes (grup A), care confera specificitate de tip. S-au identificat peste 80 de variante antigenice, cu rol de factor de virulena. Componentele antigenice eseniale ale membranei externe a bacteriilor Gram negativ e sunt lipopolizaharidele (LPS), a caror specificitate este conferita de poliza haridul O, o structura imunodominanta care cuprinde pna la 40 de unitai glucidice. Numeroasele variaii structurale ale catenei glucidice determina existena unui num ar corespunzator de variante antigenice bacteriene. LPS este componentul princip al al bacteriilor Gram negative, activator al raspunsului imun nascut, prin compo nentul sau lipidic. Termenii ?LPS? i ?endotoxina? sunt frecvent utilizai cu acelai sens. LPS trebuie sa desemneze moleculele purificate, iar termenul de ?endotoxin a? semnifica LPS i proteinele asociate din membrana externa, eliberate din supraf

aa celulei. LPS sunt molecule amfifile, ceea ce condiioneaza interaciunea lor cu celulele orga nismului. Ele au o regiune hidrofoba, capabila sa stabileasca legaturi cu lipide le membranare i o parte hidrofila, care poate ramne n faza apoasa. O prima modalita te de interaciune este cea directa, dintre molecula amfifila i suprafaa celulei. Mo lecula LPS poate fi inserata n membrana celulei, prin jumatatea hidrofoba sau se leaga de receptorii membranari prin jumatatea hidrofila. A II-a modalitate de interaciune a moleculei LPS cu celulele este indirecta, medi ata de proteina care leaga (binding) LPS (LBP). Molecula de LPS este recunoscuta i legata de o glicoproteina plasmatica de 60 kD, din categoria proteinelor de fa za acuta. Este sintetizata de hepatocite i are un situs de legare pentru lipidul A. Polizaharidele capsulare ale unor bacterii patogene Gram pozitive i negative, lib ere n supernatant sau legate de perete, sunt foarte imunogene daca conin lipide sa u proteine terminale. Variaia lor biochimica deriva nu numai din schimbarea ordin ii unitailor glucidice componente, ci, n primul rnd, din posibilitatea legarii mono zaharidelor de oricare din cei 6 atomi ai hexozei adiacente. Diferenele de secvena a monozaharidelor genereaza determinani antigenici care nu reacioneaza ncruciat cu anticorpii specifici faa de un alt determinant cu aceiai compoziie. Toxinele de natura proteica sunt imunogene i stimuleaza raspunsul imun cu efect p rotector. Peretele celular al micobacteriilor este foarte rezistent la aciunea factorilor l itici. In alcatuirea sa intra glicolipide, formate din resturi de acid micolic, legai covalent de resturile de arabino-galactan (lipoarabinogalactan) i arabinoman an (lipoarabinomanan). Complexul glicolipidic se leaga de peptidoglican, prin pu ni fosfat. Membrana externa a spirochetelor este bogata n lipide i lipopeptide, stimulatoare ale raspunsului imun i ale reaciilor de hipersensibilitate. Bacteriile toxigene, lipsite de invazivitate (C. diphteriae, C. tetani, clostrid iile enterice) stimuleaza raspunsul imun humoral antitoxic. Bacteriile invazive determina infecii regionale sau generalizate (sistemice). Maj oritatea se multiplica n spaiile extracelulare, unele au localizare facultativ int racelulara, iar altele sunt obligat intracelulare. Bacterii cu localizare extracelulara Bacterii facultativ intracelulare, Bacteri i obligat intracelulare Streptococcus sp Mycobacterium tuberculosis Rickettsia Staphylococcus sp M. leprae Chlamydia Neisseria sp Brucella sp. Escherichia coli Listeria monocytogenes Klebsiella sp. Yersinia sp. Proteus sp. Salmonella typhi Pseudomonas sp. S. paratyphi Bacteroides fragilis Treponema pallidum Haemophilus influenzae Actinomyces sp.

Bacteriile cu localizare extracelulara induc un raspuns imun mediat humoral. Act ivarea limfocitelor B este rezultatul cooperarilor celulare macrofag-limfocit Blimfocit Th. In focarul de inflamaie, bacteriile cu localizare extracelulara dete

rmina formarea abcesului, n care predomina polimorfonuclearele Bacteriile cu localizare intracelulara induc, preponderent, un raspuns imun medi at celular. Persistena lor n celulele fagocitare are ca rezultat final, formarea g ranulomului. Cele mai tipice pentru natura lor imunitara sunt granuloamele care se formeaza n infeciile cu M. tuberculosis i cu M. leprae. Mecanisme prin care microorganismele evita apararea gazdei Infeciozitatea microorganismelor patogene este dependenta de capacitatea lor de a coloniza esuturile gazdei i de a contracara mecanismele de aparare ale gazdei. Ca pacitatea de variaie rapida a moleculelor de suprafaa este o trasatura evolutiva c omuna n tot spectrul patogenilor. Se cunosc exemple de bacterii patogene care au elaborat mecanisme ce permit variaia antigenica rapida i eficienta. Moleculele de suprafaa prezinta regiuni bine conservate, ancorate n membrana, dar nu sunt niciod ata expuse contactului cu sistemul imunitar al gazdei. Rata nalta de mutaie produc e un numar mare de variante antigenice. Astfel, n patogeneza gonoreii i meningitei , cauzate de Neisseria sp, rolul fimbriilor este esenial pentru ataarea de celulel e epiteliale. Moleculele de fimbrilina evideniaza secvene constante, semivariabile i hipervariabile. Regiunile hipervariabile determina antigenitatea acestor struc turi i tropismul faa de celulele epiteliale ale tractului urogenital uman. N. meni ngitidis este capsulata i numai fimbriile proemina dincolo de limitele stratului polizaharidic. De aceea, pierderea fimbriilor inhiba proprietatea de aderena. Polizaharidul capsular este repelent pentru fagocite, deoarece celulele fagocita re nu au receptori pentru polizaharidele capsulare. Uneori, acestea sunt asemana toare oligozaharidelor din moleculele glicoproteice proprii organismului, ceea c e explica slaba lor imunogenitate. Tulpinile variante, necapsulate sunt mai puin virulente, dar au avantajul ca nu sunt recunoscute de anticorpii specifici faa de antigenele capsulare. Absena capsulei, la Haemophilus influenzae, confera celule i o capacitate sporita de a se ataa i de a invada celulele epiteliale ale gazdei. La Str. pyogenes s-au identificat peste 80 de serotipuri diferite, ce rezulta di n mutaiile punctiforme ale genei ce codifica proteina M, componenta a peretelui c elular. LPS protejeaza fizic celula bacteriana de aciunea complementului i a fagocitelor, constituind un strat protector, iar diversitatea glucidelor din oligozaharidul t erminal, confera o variaie antigenica extrem de larga. La. S. typhimurium s-au id entificat peste 2000 de variante antigenice, cu tot attea specificitai serologice. La spirocheta Borrelia hermsii (agentul febrei recurente, caracterizata prin cri ze febrile, separate de intervale asimptomatice), episoadele febrile semnifica a pariia i multiplicarea unei noi variante antigenice. Antigenul variant este o pro teina abundenta a membranei externe (VMP = variable major protein). Unul dintre cele mai bine studiate exemple de variaie antigenica i rolul ei n infeci e, este al tripanosomelor africane care produc boala somnului. T. brucei produce o parazitemie, care crete i descrete, deoarece genereaza subpopul aii care sunt variante antigenice ale unei glicoproteine specifice (VSG ? variant -specific glycoprotein) a suprafeei celulei. Undele de parazitemie constituie tra satura principala a infeciei cronice, care persista pna cnd individul tratat se vin deca, ori netratat, moare. In stadiile terminale, agentul patogen invadeaza alte esuturi i capacitatea de aparare este depaita. n cursul infeciei, numarul mare de parazii, da natere la o subpopulaie care poarta o VSG modificata biochimic i antigenic, ce scapa controlului imediat al raspunsului

imun. Ulterior, aceasta varianta noua este recunoscuta de sistemul imunitar, da r generarea rapida a noilor VSG mpiedica eliminarea infeciei. Capacitatea parazitu lui de a se comuta la diferite VSG duce la epuizarea forelor de aparare ale gazde i n fazele terminale ale bolii. Infecia cu Plasmodium falciparum este persistenta, recurenta i se caracterizeaza p rintr-un tablou foarte variabil al manifestarilor clinice. Imunitatea specifica se dezvolta lent i numai dupa infecii ample i repetate, se consolideaza un raspuns imun protector faa de infecia severa, dar este o imunitate incompleta i incapabila sa sterilizeze organismul. In ariile geografice cu o rata nalta de transmitere a parazitului, apar complicaii severe, cu mortalitate crescuta, la copiii sub 5 ani . Copiii care depaesc 5 ani, au imunitate adecvata pentru a controla infecia. Star ea de protecie persista tot restul vieii, n condiiile inocularii continue a sporozoii lor de la narii infectai. Raspunsul imun faa de antigenele parazitului este mediat de anticorpi (IgG). La pacienii cu SIDA (care exacerbeaza dramatic evoluia tuberculo zei sau infeciile oportuniste), malaria nu are o evoluie mai severa, ceea se nseam na ca sinteza IgG este independenta de celulele T. Eritrocitele infectate sunt i ngerate de macrofage, independent de IFN. Diversitatea antigenica a tulpinilor de Plasmodium este argumentata de miniepide miile de malarie severa, care apar n zonele endemice mari. Tulpinile mai virulent e au proprietai antigenice i de citoaderena modificate. Diferenele proprietailor de a derena produc manifestari severe, inclusiv malarie cerebrala, iar modificarile de antigenitate permit parazitului sa persiste i sa produca infecii repetate. Moleculele de suprafaa ale eritrocitelor infectate cu P. falciparum prezinta vari aie antigenica, ceea ce condiioneaza citoaderena. Aderena eritrocitelor infectate, d e esutul cerebral, renal sau hepatic, este cauza malariei severe. Generarea conti nua a diferitelor populaii variante antigenice de parazii, cu diferite specificitai de aderena, este cauza infeciilor persistente caracterizate prin unde de parazite mie i manifestari clinice specifice malariei. Diversitatea fenotipica corespunzatoare variaiei antigenice este o strategie foar te eficienta pentru adaptarea la presiunea selectiva pe care o exercita efectori i raspunsului imun i la diversitatea de particularitai structurale i funcionale ale e suturilor gazdei. Mecanismele de variaie sunt deosebit de importante pentru succe sul diseminarii unei infecii n populaia gazda. RASPUNSUL IMUN N INFECIILE VIRALE

Infeciile virale constituie, nca, o cauza majora a morbiditaii i mortalitaii, dei vac inarea a redus incidena infeciilor severe (polio, oreion, rujeola, rubeola) i a era dicat variola. Cunoaterea mecanismelor raspunsului imun antiviral este importanta pentru evaluarea problemelor clinice de fond (de exemplu, dinamica raspunsului imun) i pentru cautarea unor noi metode de obinere a vaccinurilor. Interaciunea virusurilor cu organismele, este modulata de sistemele de aparare nas cute i dobndite. Pentru a se perpetua ntr-o populaie, virusul trebuie sa fie virulen t, dar suficient de flexibil n modularea virulenei, pentru a se pastra n populaia se nsibila. In perspectiva evolutiva, interaciunea virusului cu organismul sensibil trebuie sa confere superioritate virusului. Daca este prea virulent i nu poate fi controlat de imunitatea gazdei, rezultatul poate fi moartea i n final dispariia ga zdei. Daca este lipsit de virulena, virusul va fi eliminat prea rapid de sistemul imunitar al gazdei i poate sa dispara prin incapacitatea de a se perpetua. Adeseori, virulena virala este diminuata prin mutaie i n acelai timp se selecteaza ga zde mai bine adaptate imunitar, rezultnd un echilibru fluctuant, n care coexista a tt gazda ct i virusul.

Proteinele virale, componente ale capsidei i peplosului, sunt imunogene i induc un raspuns imun intens n organismul infectat. Raspunsul imun antiviral este orienta t att faa de antigenele exprimate pe suprafaa virionilor, ct i faa de antigenele prez ntate pe suprafaa celulei infectate. Antigenele expuse pe suprafaa celulei infectate, difera n funcie de natura virusulu i (nud sau acoperit) i de mecanismul maturarii virionilor. Celulele infectate cu virusuri nude (adeno-, reo-, enterovirusuri) expun pe suprafaa lor proteine viral e asociate cu moleculele CMH I, iar cele infectate cu virusuri nvelite, n special cu virusuri care se matureaza prin nmugurire la nivelul membranei, expun glicopro teinele peplosului, inserate n arii limitate ale membranei. In ambele cazuri, cel ula infectata devine inta mecanismelor de recunoatere imunitara. Antigenele expuse pe suprafaa virionului sau a celulei infectate, stimulatoare al e raspunsului imun, se numesc antigene protectoare. Antigenele intrinseci ale vi rionului, au rol protector nesemnificativ, deoarece nu vin n contact cu sistemul imunitar, dect n cazul n care se sintetizeaza n exces i se elimina din celula infecta ta. Antigenele virale libere sau asociate virionului, stimuleaza raspunsul imun humo ral, iar cele prezentate pe suprafaa celulelor infectate, stimuleaza raspunsul im un celular. Activarea unuia sau altuia dintre compartimentele imunitaii, depinde de mai muli f actori: de tipul de infecie (primara sau secundara), de rezultatul interaciunii vi rus-celula (liza sau infecie persistenta) etc. Virusurile care produc infecii acute, determina o competiie ntre replicarea virala i efectorii raspunsului imun. Rezultatul este nsanatoirea sau moartea gazdei. Pentru virusurile care produc infecii cronice, scara de timp este mai lunga. Viri onii sau antigenele virale din snge sau din alte fluide, determina formarea compl exelor Ag-Ac, cu manifestari patologice secundare. Alteori, anticorpii antiviral i i celulele T activate, pot produce leziuni ale celulelor infectate. Majoritatea manifestarilor clinice care nsoesc infeciile virale cronice, sunt consecina raspuns ului imun al gazdei, stimulat de antigenele virale. Raspunsul imun primar Mecanismele de aparare nespecifica (interferonul, aciunea celulelor NK, raspunsul mucociliar) pot influena rezultatul infeciei. Dupa infecia virala primara sau dupa administrarea vaccinului inactivat, se stimu leaza raspunsul imun mediat celular(citotoxic) i humoral. Raspunsul humoral, cu s inteza anticorpilor, are o dinamica lenta. In stadiul acut al infeciei, titrul an ticorpilor specifici este abia detectabil, dar atinge valoarea maxima la 2-4 sap tamni i persista saptamni sau luni, n funcie de gazda, virus etc. Pentru virusul febr ei galbene i cel rujeolic, nivelul detectabil al anticorpilor persista tot restul vieii. Dupa infecia primara sau dupa vaccinarea cu preparatul viral atenuat sau inactiva t, se sintetizeaza anticorpi din clasele IgM, IgA i IgG. Sinteza anticorpilor est e indusa de marea majoritate a virusurilor, dar rolul protector al imunoglobulin elor este variabil de la un virus la altul, n funcie de sediul multiplicarii, care la rndul sau condiioneaza manifestarile patologice ale infeciei. n funcie de mecanismul patogenezei, se disting trei tipuri de virusuri:

- virusurile care infecteaza mucoasele tractului respirator i digestiv i ramn la po arta de intrare: rinovirusuri, influenza, parainfluenza, virusul respirator sinc iial, enterovirusuri; - virusuri care infecteaza i se multiplica la nivelul mucoaselor, iar ulterior se disemineaza pe cale sanguina, limfatica sau axonala, pentru a infecta viscerele sau sistemul nervos central: virusul poliomielitei, rujeolic, al oreionului, he rpes simplex, pox, virusul hepatitei A; - virusuri inoculate direct n snge, prin mucatura, nepatura, prin traume, iar de aici se raspndesc la organele inta: HIV, virusul hepatitei B, virusul rabic, virusuril e encefalitogene(alfa- i flavivirusuri). Rolul anticorpilor n imunitatea antivirala Cei mai importani anticorpi cu rol protector antiviral sunt cei care au specifici tate de combinare faa de epitopii critici ai suprafeei virionilor. Legarea anticor pilor cu virionul se face dupa modelul complementaritaii spaiale ntre epitopii anti genelor suprafeei virale i situsul de combinare al anticorpilor. Efectul principal al interaciunii anticorpilor cu particulele virale, n faza fluida, este neutraliz area, adica pierderea infeciozitaii virionilor. Pentru producerea efectului neutra lizant, este necesara legarea mai multor molecule de anticorpi, care trebuie sa recunoasca o structura eseniala a virionului, denumita situs critic. De exemplu, fagii din seria T-par au un singur situs critic i infeciozitatea lor este anulata de legarea anticorpilor specifici la nivelul fibrelor cozii. Virionul gripal are situsuri critice multiple: anticorpii anti-HA sunt neutralizani, cei specifici a nti-NA au efect neutralizant minim, iar anticorpii anti-proteina M sunt total in eficieni. La adenovirusuri, situsurile critice sunt capsomerele hexonice i fibra pentonica. Anticorpii specifici faa de aceste structuri sunt neutralizani, iar anticorpii an ti-penton nu diminua infeciozitatea. Pentru HIV, situsul critic este zona prin ca re virionul se ataeaza de moleculele CD4 ale limfocitului Th. Anticorpii specific i faa de situsul de legare al virusului Epstein-Barr de receptorul pentru C3b al limfocitului B, au efect neutralizant. Moleculele de anticorpi legate pe suprafaa virionului nvelit formeaza complexe, ca re, in vivo sau in vitro, iniiaza fixarea complementului. Rezultatul final este l iza virionilor nvelii. Un alt efect al interaciunii anticorpilor cu virionii, in vitro, este agregarea. Fenomenul este dependent de un prag limita a densitaii virionilor/unitate de volu m. Agregarea virionilor este nsoita de diminuarea infeciozitaii, deoarece chiar n caz ul unui mare exces al moleculelor de anticorpi, unele particule virale din inter iorul agregatului, ramn n afara contactului cu anticorpii neutralizani i i pastreaza nfeciozitatea, denumita infeciozitate reziduala sau persistenta. Agregarea virala fiind dependenta de un prag al densitaii virionilor, este un fenomen care se mani festa numai in vitro. In vivo nu se realizeaza niciodata o densitate limita a vi rionilor care sa produca acest efect. Anticorpii antivirali ce se sintetizeaza n cursul raspunsului imun primar, au en ergie mica (afinitate) de legare cu situsurile antigenice ale virionilor i se dis ociaza uor, lasnd o infeciozitate reziduala. Alteori, moleculele de anticorpi nu ac opera situsurile critice ale virionilor, care condiioneaza iniierea procesului inf ecios. Efectul protector al anticorpilor circulani este demonstrat pentru infeciile cu fa

za viremica, avnd o contribuie eseniala la ncheierea procesului infecios. Anticorpii reduc ncarcatura de virus i diminua infeciozitatea virala, consecina fiin d scaderea numarului de celule infectate, uurnd astfel sarcina celulelor Tc de a e limina celulele infectate. n cursul infeciei secundare, anticorpii se sintetizeaza rapid, la titru nalt. Anticorpii se folosesc pentru profilaxia i terapia infeciilor virale. Imunizarea p asiva cu ser imun, diminua riscul infeciei virale i se folosete n tratamentul infecii lor stabilizate. Protecia mucoaselor. La nivelul mucoaselor, imunitatea antivirala este dependenta , n primul rnd de IgA. Sinteza locala de anticorpi (n special IgA) dupa stimularea virala este relativ independenta de raspunsul imun sistemic. Anticorpii sintetiz ai la nivelul mucoaselor au efect protector, n absena anticorpilor sistemici. Antic orpii din secreiile mucoaselor ndeplinesc doua funcii majore faa de agenii patogeni v irali: excluderea imuna i neutralizarea infeciozitaii virale. Excluderea imuna este un mecanism protector foarte important la nivelul mucoasei respiratorii i pare a fi dependent nu numai de imunoglobuline, ci i de stratul de mucus care acopera epiteliul. Absena activitaii ciliare este asociata cu infecii s evere ale tractului superior, sugernd importana barierei mucoase. sIgA neutralizea za infeciozitatea virionilor, iar secreia mucoasa este n primul rnd o bariera mecani ca ce blocheaza adsorbia virionilor pe membrana celulelor epiteliale. IgA din secreii are rol esenial n rezistena la reinfecia cu virusurile care se multip lica exclusiv n celulele epiteliale ale mucoaselor digestive i respiratorii. Vacci narea orala cu virus polio inactivat are ca scop stimularea imunitaii mucoasei. D aca au titru crescut, anticorpii serici (IgM) difuzeaza n mucoase. Nu se tie n ce m asura anticorpii din secreii sau din snge protejeaza epiteliul tractului respirato r inferior. Fig. 94. Mecanismele protectoare ale mucoasei tractului respirator, faa de infecia virala. Dupa inoculare, particulele virale sunt neutralizate (1) de anticorpi, care ajung la suprafaa mucoasei prin transport transepitelial (IgA polimeric), pr in difuzie (IgG) sau prin administrare artificiala (picatura spray, aerosol). Al t mecanism este ?excluderea imuna? (2) i se produce cnd particulele virale sunt le gate de anticorpi, incluse n mucus i ndepartate prin activitate mucociliara. Antico rpii pot difuza prin mucus pentru a neutraliza virusul progen i particulele care trec prin stratul de mucus. Neutralizarea virala poate sa se produca intracelula r (3), n timpul transportului intracelular al IgA polimeric. La suprafaa bazolater ala a celulelor epiteliale infectate, IgG se poate fixa specific de proteinele m embranare codificate de virus i mediaza liza celulei (4) dupa fixarea complementu lui sau prin fenomenul ADCC. Celulele infectate de virus pot fi lizate sub aciun ea limfocitelor Tc specifice. Liza celulelor epiteliale uureaza trecerea efectori lor imunitari n ambele direcii (dupa Weltzin, 1999). n tractul respirator inferior, n secreia mucoasa, se gasesc concentraii mari de IgA i IgG. Anticorpii ajung n secreii, n mare parte, prin difuzia printre celule sau pri n ruperi ale epiteliului. Dei vaccinurile gripale se administreaza parenteral, este clar ca anticorpii din secreii (sIgA) au rol major n protecia antiinfecioasa. sIgA confera o mai buna prote cie ncruciata faa de variante antigenice rezultate prin drift antigenic, comparativ cu IgG circulant. Pentru antigenele virale expuse pe suprafaa celulelor infectate, studiile in vitr o au evideniat ca anticorpii antivirali i complementul se leaga specific i pot sa p roduca citoliza.

Complementul poate acoperi complexul Ag-Ac, blocnd eventualii receptori disponibi li. Complexele sunt fagocitate de celule care au receptori pentru C3. Complementul poate liza virionii nvelii. Retravirusurile sunt lizate de complement , chiar n absena anticorpilor. Complementul pare sa aiba rol n faza timpurie a infe ciei, cnd titrul anticorpilor este foarte scazut i au afinitate mica. Proteinele complementului sunt importante ca mecanism efector humoral faa de infe ciile bacteriene, dar rezistena celor cu deficit al complementului, faa de infeciile virale este normala. Imunizarea pasiva a mucoasei respiratorii poate fi folosita n scop profilactic sa u terapuetic. Are avantajul ca efectul protector este imediat, iar efectele cola terale sunt rare. Anticorpii sunt mai eficieni faa de infeciile virale, cnd se admin istreaza profilactic. Anticorpii administrai prin imunizare pasiva, n secreiile tra ctului respirator, pot sa previna, sa diminueze sau sa vindece infecile virale. I munizarile s-au facut n special cu IgG pentru ca este mai uor de obinut. IgA are av antajul de a fi polimeric i teoretic, are activitate aglutinanta superioara faa de IgG i pentru ca nu fixeaza complementul, probabil nu stimuleaza reaciile inflamat orii. Are o perioada de activitate mai lunga, deoarece componenta secretoare (CS ) l protejeaza de aciunea proteazelor. n concluzie, imunitatea mediata humoral reprezinta modalitatea tactica, de neutra lizare a virusurilor n faza extracelulara. Anticorpii se sintetizeaza n raspunsul imun primar i secundar antiviral, dar activ itatea lor protectoare este neeseniala pentru controlul multor infecii primare sau secundare. Copiii cu agamaglobulinemie nascuta de tip Bruton, nu au sensibilitat e crescuta faa de infeciile virale, cu excepia meningitei enterovirale, produsa de echovirusurile 9 sau 11. Anticorpii sunt activi faa de antigenele virale din umor ile organismului, dar nu penetreaza n celulele infectate. Imunitatea antivirala mediata celular n ciclul infecios al multor virusuri, antigenele sunt expuse trziu pe suprafaa celul ei. In aceste cazuri, rolul protector al anticorpilor este secundar. Imunitatea mediata celular (IMC) constituie mecanismul major al apararii specifi ce antivirale. Dupa infecia primara sau dupa administrarea vaccinului viral atenu at, se activeaza raspunsul celulelor Tc, care are activitate maxima la 7-10 zile i scade la 2-3 saptamni dupa infecie. Pentru controlul infeciei virale, celulele Tc sunt eseniale. La pacienii cu sindrom Di George (cu aplazie timica congenitala), la pacienii SIDA, la cei leucemici sa u la cei supui terapiei imunosupresoare prelungite, frecvena i severitatea infeciilo r virale cresc semnificativ. Rolul IMC n protecia antivirala este elocvent n cazul infeciei cu virusul rujeolic. La copiii normali, infecia produce erupia tegumentara caracteristica i ulterior vi rusul este eliminat. La copiii cu deficiena a celulelor T, boala este adeseori fa tala. Manifestarile eruptive sunt mediate de celulele T i la copiii imunosupresai nu se produc. Apariia erupiei este indicatorul evoluiei favorabile. La copiii agama globulinemici, erupia se produce i evoluia infeciei este nealterata de absena anticor pilor. Se instaleaza imunitatea de memorie. IMC precede sinteza anticorpilor n toate infeciile virale, dar n special n cazul in feciilor citolitice n care virusul se multiplica rapid. IMC are rol important n apa

rarea faa de infeciile virale primare, deoarece se activeaza ntr-un timp scurt i ras punde nevoilor de aparare rapida faa de infeciile virale, nainte de edificarea rasp unsului imun mediat humoral. In focarul inflamator indus de infecia virala se acu muleaza celule efectoare ale IMC, care ating valoarea maxima la doua zile de la n ceputul replicarii virale. IMC se activeaza dupa ce virusul a patruns n celula i a ceasta expune pe suprafaa ei, antigene virale. Efectul sau este liza celulelor in fectate i are rolul de a limita diseminarea virusului n mediul extracelular. Liza celulelelor infectate cu virusuri citocide este protectoare numai daca se produc e rapid, nainte de asamblarea virionilor progeni. Liza tardiva are efect opus, de oarece favorizeaza diseminarea virusului. Pentru virusurile care produc infecii p ersistente, citoliza timpurie sau tardiva are efect protector. Fig. 95. Controlul infeciilor virale citocide i necitocide de catre celulele Tc. L iza celulei infectate poate sa se produca n faza de eclipsa, nainte de asamblarea virionilor maturi sau n faza de mijloc, cnd numai o parte a virionilor s-a asambla t. In ambele cazuri, liza este protectoare faa de infecia cu virusuri citocide i ne citocide. In contrast, liza relativ trzie n timpul ciclului de replicare virala es te protectoare numai faa de virusurile necitocide. Daca celulele Tc nu produc liz a, celulele infectate pot sa supravieuiasca i sa elibereze virioni infecioi perioade lungi de timp. In cazul infeciei citocide, liza tardiva nu diminua diseminarea v irusului, deoarece asamblarea s-a ncheiat i virionii vor fi eliberai prin citoliza produsa de efectorii imunitar (dupa Kagi, 1996). IMC constituie modalitatea strategica de protecie antivirala, al carei efect este liza celulei nainte de ncheierea ciclului de replicare virala. Efectorii imunitaii mediate celular detecteaza celulele a caror suprafaa este modi ficata din punct de vedere antigenic (celule infectate cu virus, celule transfor mate malign, celule mbatrnite sau celule nonself). Orice proteina structurala a virionului sau existenta numai n celula infectata (p roteina nestructurala) poate fi prelucrata de celulele infectate sau de celulel e accesorii ale raspunsului imun. Moleculele nonself prelucrate sunt asociate cu moleculele CMH I (sau CMH II) i sunt expuse pe suprafaa celulei. Complexele molec ulare devin inte pentru aciunea limfocitelor Tc. Celula infectata este lizata sub aciunea factorilor litici eliberai de limfocitul Tc. Celulele Tc recunosc orice proteina virala, structurala sau nestructurala, asociata cu moleculele CMH. Limfocitele Tc activate sunt specifice faa de virusul infectant. De exemplu, limf ocitele Tc sensibilizate faa de virusul variolei, lizeaza numai celulele infectat e cu acest virus. Nu lizeaza celulele normale i nici celule alogenice infectate cu virusul variolei. Zinckernagel i Doherty (1974) au demonstrat experimental specificitatea aciunii li mfocitelor faa de antigenele virale, dar i fenomenul de limitare (restricie) a inte raciunilor celulei efectoare cu celula inta, de identitatea moleculelor CMH. Celul ele care prezinta antigenul i cele care l recunosc trebuie sa fie histocompatibile , adica sa poarte pe suprafaa lor, molecule CMH I i II identice. n infecia secundara, raspunsul celulelor Tc este rapid, mediat de celulele Tc de m emorie. Celulele de memorie pot sa persiste n absena antigenului specific, probabi l datorita stimularii sporadice nespecifice, de citochinele eliberate local n tim pul reaciilor faa de antigenele nenrudite. Celulele NK nu au specificitate faa de antigen i nu produc memorie imunitara. Celu lele NK se activeaza rapid i la 2-3 zile dupa infecie ating activitatea maxima, du pa care diminua rapid. Deficienele pentru celulele NK sunt rare, dar sunt nsoite de infecii severe cu virusul varicela zoster, cu virusul citomegalic, herpes simple x virus 1.

Mecanismul interaciunii celulei NK cu celula infectata nu se cunoate. Celulele NK lizeaza celulele care au pierdut moleculele CMH i astfel au devenit anormale. Act ivitatea celulelor NK este stimulata de interferon. Celulele infectate cu virusuri pot fi lizate prin fenomenul ADCC (antibody depen dent cell citoxicity), prin aciunea limfocitelor Tc sau NK. Ele lizeaza celulele tapetate cu anticorpi. Fagocitele mononucleare (monocitul sanguin, macrofagul tisular, celula dendritic a) au rol important pentru eliminarea virusului dintr-un proces infecios. Fagocit ele mononucleare fagociteaza virionii inoculai prin nepatura. Macrofagele au i activ itate ADCC. Mecanisme prin care celulele infectate evita efectorii raspunsului imun n mediul extern, virusurile sunt instabile, datorita sensibilitaii la factorii de mediu. De aceea, pentru a se perpetua ntr-o populaie de organisme sensibile, virus ul trebuie sa ramna ct mai mult n gazda infectata, ori sa se transmita ct mai eficie nt de la o gazda la alta. Pe de alta parte, efectorii raspunsului imun humoral i celular nu sunt totdeauna eficieni n recunoaterea i eliminarea celulelor infectate c u virus, iar virusul eliberat din celula, trebuie sa evite contactul cu efectori i raspunsului imun. n majoritatea infeciilor persistente, virusurile infecteaza celulele sistemului im unitar: virusul hepatitei B, papovavirus, herpes, virusul Epstein-Barr, virusul citomegalic, rubela, rujeola, oreion, influenza, parainfluenza, HTLV I, II, HIV, diminund potenialul reactiv al imunitaii. O celula infectata care expune pe suprafaa ei un numar mic de situsuri antigenice poate sa scape lizei, deoarece situsurile antigenice distanate nu permit legarea celor doua situsuri de combinare ale moleculei de anticorp, necesara activarii complementului. Celulele infectate persistent exprima o cantitate limitata de an tigene virale pe suprafaa lor, comparativ cu celulele n care ciclul de replicare v irala este litic. Acesta pare a fi mecanismul de supravieuire a celulelor infecta te cu virusul coriomeningitei limfocitare (LCM), cu virusul rujeolei sau cu viru sul hepatitei B. Antigenele virusului hepatitei B se sintetizeaza n mare exces i se elimina din hep atocite, sub forma unor particule fara genom. Se considera ca excesul cantitativ de antigene virale determina fenomenul de tolerana imunitara. Celulele infectate persistent manifesta fenomenul de fluctuaie cantitativa a anti genului viral, expus pe suprafaa lor. Celulele infectate cu virusul rujeolic trec succesiv prin cicluri de dispariie i reapariie a antigenelor virale, asociate memb ranei citoplasmatice, n timp ce moleculele normale ale celulei nu au variaii canti tative semnificative. Fenomenul se numete modulaie antigenica. Anticorpii necitolitici pot masca antigenele virale expuse la suprafaa celulei, d evenind astfel inaccesibile celulelor efectoare litice (limfocite Tc, NK). Uneori, virusurile infecteaza celule care nu exprima molecule CMH I. Neuronii ex prima puin sau de loc moleculele CMH I i reprezinta un situs preferenial al persist enei virale. Herpesvirusurile infecteaza latent neuronii, iar virusul rujeolic, v irusul LCM i alfavirusurile pot infecta aceste celule. Adenovirusurile codifica o proteina de 19 kD, care se asociaza cu moleculele CMH I i blocheaza transportul lor spre suprafaa celulei i astfel celula infectata care nu exprima molecule CMH I nu este recunoscuta de limfocitele T. Virusul influenza evita efectul neutralizant al anticorpilor specifici, prin rat

a nalta de mutaie a ARN-polimerazei, genernd noi variante biochimice ale hemaglutin inei (HA) i ntr-o masura limitata, ale neuraminidazei (NA). Noile variante antigen ice ale HA i NA trebuie sa-i pastreze funcia, adica virionul trebuie sa fie infecios , dar scapa detectarii de anticorpii preexisteni. Fenomenul variaiei antigenice li mitate se numete drift antigenic. Shiftul antigenic corespunde unei noi variante genetice a virusului influenza i e ste rezultatul unei reasortari a genomului, care are loc cel mai probabil la pas ari, unde se produce co-infecia cu un virus uman (ce infecteaza rareori pasarile) i cu o linie de virus aviar. Virusurile contracareaza aciunea citochinelor. Virusurile sunt att inductori ai si ntezei interferonilor (IFN), ct i inta principala a aciunii lor. Un virus care induc e sinteza IFN i este foarte sensibil la aciunea sa inhibitorie nu se poate propaga . Evoluia a favorizat virusurile care contracareaza efectele inhibitorii ale IFN asupra ciclului de replicare virala. Virusurile cu virulena nalta, inhiba sinteza ARN celular i sinteza proteinelor (efect de ntrerupere), ceea ce interfera cu capa citatea celulei de a produce IFN i de a raspunde la aciunea lui. Multe virusuri sunt rezistente la aciunea IFN. Unele dezoxiribovirusuri codifica proteine ce inhiba caile majore de transducere a semnalelor induse de IFN. De ex emplu, proteina E1 a adenovirusurilor inhiba semnalul indus de IFN ??? sau ?. Pox virusurile codifica sinteza unor receptori solubili pentru citochine (pentru TNF i IL-1), denumii virochine. TIPURILE DE IMUNITATE DOBNDITA (ADAPTATIVA) Homeostazia organismului uman i animal este asigurata de sisteme complexe de apar are, ale caror particularitai funcionale au fost definite n primul rnd, n raport cu m odul de aciune faa de agenii infecioi. Organismele dispun de doua categorii de mecani sme de aparare: - mecanisme de aparare specifica, reprezentate de sistemul imunitar; - mecanisme de aparare nespecifica sau nascuta, adica cele care asigura rezistena sau imunitatea naturala. Prin imunitate ?naturala? sau nascuta se nelege rezistena unui organism faa de un age nt infecios sau faa de un parazit, n absena unui raspuns imun evident. Cele doua sisteme de aparare, specifica i nespecifica, se condiioneaza reciproc. N u se poate evalua gradul n care mecanismele de rezistena naturala sunt influenate d upa expunerea la contactul cu agenii infecioi, dar raspunsul imun detectabil sau ch iar subliminal produce modificari ale starii de activitate a sistemului fagocita r mononuclear i a celulelor killer. Mecanismele de aparare antiinfecioasa sunt att specifice (adaptative, dobndite) ct i nespecifice (nascute). Imunitatea dobndita are un caracter specific i se definete ca o stare de rezistena a ntiinfecioasa, cu caracter individual, condiionata de contactul anterior al organi smului, ntr-un proces infecios natural, cu agentul infecios virulent, cu toxinele s ale native sau cu agentul atenuat i anatoxinele sale administrate ca vaccin. Imun itatea dobndita, denumita i inductibila, este relativa, n sensul ca, dei n general es te foarte solida, poate fi nvinsa prin agresiunea exercitata de o cantitate mare de ageni infecioi sau de infecia cu o tulpina deosebit de virulenta.

n funcie de originea i modul de instalare, imunitatea dobndita este de doua tipuri: dobndita pe cale naturala i pe cale artificiala. In ambele cazuri, imunitatea poat e fi dobndita att activ, prin raspunsul imun la stimulul antigenic, ct i pasiv, prin transferul de anticorpi exogeni. Imunitatea dobndita natural activ se instaleaza dupa trecerea organismului printr -o stare de infecie aparenta (decelabila clinic) sau inaparenta. Durata starii de imunitate este variabila. Trecerea prin unele infecii asigura o protecie specific a pentru tot restul vieii (rujeola, variola, varicela, oreionul). Alte infecii (di fteria, scarlatina, tusea convulsiva etc.) confera o protecie mai puin solida, ast fel nct la o noua expunere(dupa civa ani), organismul poate face din nou boala ntr-o forma mai uoara dect prima mbolnavire. Imunitatea dobndita natural pasiv este rezultatul transferului transplacentar i pr in secreia lactata, al anticorpilor de la mama la fat. Aceasta forma de imunitate este variabila din punct de vedere cantitativ i calitativ, n funcie de complexitat ea structurala a barierei placentare i diversitatea antigenelor la care a fost ex pus organismul matern. Trecerea imunoglobulinelor prin filtrul placentar depinde de structura placentei, adica de numarul de straturi celulare ce se interpun ntr e circulaia materna i cea fetala. Tranzitul anticorpilor este restrictiv la specii le de bovine, cabaline, porcine, canine, care au placenta de tip epiteliocorial, cu 4 straturi tisulare: endoteliul capilar matern, epiteliul corionic, esutul co njunctiv fetal, endoteliul capilar fetal. Nou-nascutul este protejat de imunoglo bulinele din colostru. In primele 24 de ore, aparatul gastrointestinal este imat ur din punct de vedere funcional i digestia proteica nu are loc. Imunoglobulinele din colostru ramn intacte i sunt transportate n mediul intern prin celulele epiteli ului intestinal. Transferul placentar al imunoglobulinelor este foarte intens la speciile cu placenta hemocoriala (om, maimue, rozatoare), la care stratul endote liului capilar matern lipsete i sngele matern scalda esutul placentar fetal. Nou-nas cutul uman primete anticorpi materni i dupa natere, prin colostrul bogat n imunoglob uline, provenite din circulaia materna. Imunitatea dobndita natural i pasiv asigura noului nascut o stare de nereceptivita te faa de agenii infecioi pentru care organismul matern este imun. Aceasta imunitate scade treptat dupa natere, pe masura catabolismului anticorpilor de origine mate rna, astfel nct, dupa o perioada de 3-6 luni copilul devine sensibil faa de agenii i nfecioi. Imunitatea transplacentara explica raritatea maladiilor infecioase la copi i, n primele luni de viaa. Imunitatea dobndita artificial activ Imunitatea dobndita artificial activ este consecutiva administrarii vaccinurilor. Denumirea de vaccin vine vine de la cuvntul latin vaca i semnifica originea primu lui preparat pe care E. Jenner (1798) l-a utilizat pentru controlul variolei.

p 8 p p

REACII IMUNITARE IN VIVO

De cele mai multe ori, n special n procesele infecioase, reaciile imunitare au o fi nalitate benefica, avnd un rol determinant n eliminarea agenilor patogeni. Uneori, dupa contactul cu antigenele (n special moleculare), activarea funciei imunitare a re rol prejudiciant, defavorabil asupra organismului, deoarece raspunsul imun se instituie drept cauza i mecanism pentru producerea diferitelor maladii (alergii, boli autoimune). Reaciile Ag-Ac in vivo, cu consecine defavorabile pentru organism, fac obiectul de studiu al unui domeniu bine conturat, denumit Imunopatologie. Activarea neadecvata a funciei imunitare determina doua categorii de manifestari clinice: a) starile de hipersensibilitate b) maladiile autoimune Diminuarea activitaii sistemului imunitar, genereaza o categorie speciala de mani festari clinice, cunoscute sub denumirea generica de imunodeficiene. Ele pot fi na scute (primare) sau dobndite (secundare). Imunopatologia studiaza reactivitatea funciei imunitare n starile neoplazice, reac tivitatea consecutiva transplantului de esuturi i organe, n maladiile infecioase vir ale, bacteriene, fungice i n maladiile parazitare. 1. STARILE (REACIILE) DE HIPERSENSIBILITATE Starile de hipersensibilitate sunt reacii teriare, consecutive reaciilor Ag-Ac in v ivo. Ele sunt o consecina a faptului ca procesul de imunizare dupa contactul prim ar cu antigenul i generarea efectorilor imunitari (anticorpi i limfocite efectoare ) nu confera totdeauna o stare favorabila, de rezistena a organismului. Contactul primar cu antigenul creeaza, uneori, o stare de sensibilizare faa de antigenul r espectiv. Sensibilizarea este o stare fiziologica daunatoare organismului i se ma nifesta, n special dupa contactul organismului cu antigene proteice (din ou, din ser), cu antigenele din polen i mai rar dupa contactul cu antigenele corpusculare (hematii de berbec). La contactul secundar cu antigenul sensibilizant, organism ul raspunde prin starile patologice de hipersensibilitate. Starile de hipersensibilitate sunt consecina unui raspuns de intensitate prea mar e sau a unui raspuns imun neadecvat, care sta la originea leziunilor tisulare. E chivalentul termenului de hipersensibilitate, folosit n mod curent, este cel de a lergie (allos, ergon = alta energie). Termenul de alergie a fost introdus de von Pirquet (1906) i semnifica o reacie imu nitara care se exprima cu energie diferita de cea normala, dupa expunerea secund ara la un antigen. Ambele denumiri se refera la o reactivitate imunitara de inte nsitate anormal crescuta, faa de un antigen. In sens tiinific, noiunea de alergie in clude toate manifestarile care decurg din reactivitatea imunitara, cu o alta ene rgie dect cea fiziologica: reaciile hiperergice, hipoergice i anergice. n mod curent, alergia se definete ca o stare de hipersensibilitate, ce rezulta din expunerea la un alergen i se distinge prin supraproducia componentelor imunitare. Clasificarea starilor de hipersensibilitate

Starile de hipersensibilitate au fost clasificate n raport cu promptitudinea cu c are se manifesta:

- reaciile de hipersensibilitate imediata au o dinamica rapida. Se declaneaza n ctev a secunde sau minute de la contactul secundar cu alergenul i diminua rapid, n cteva ore, fara semne vizibile, cu excepia celor foarte grave. esutul suport al reaciei este diferit de la o specie la alta. Aproape totdeauna va rezulta distrugerea ce lulei inta. Reaciile imediate se desfaoara n esuturi vascularizate i, de obicei, se m nifesta local, dar pot produce i efecte sistemice. Hipersensibilitatea imediata e ste cea mai raspndita dezordine imunitara la om. Este cea mai frecventa maladie c ronica, ce afecteaza circa 25% din populaie n arile dezvoltate, cu severitate varia bila, de la o simpla iritare, pna la periclitarea vieii; - reaciile de hipersensibilitate subacuta sunt acelea care ncep sa se manifeste du pa 1-3 ore de la contactul secundar cu antigenul i nceteaza dupa 10-15 ore. Sunt m ediate de IgG sau IgM; - reaciile de hipersensibilitate ntrziata se evideniaza la 1-2 zile dupa contactul s ecundar cu alergenul. Persista un interval de cteva zile, pna la cteva saptamni. Ace ste reacii sunt mediate de limfocitele T i de macrofage. Nu sunt dependente de fac tori humorali circulani i de aceea se pot produce i ntr-un esut nevascularizat. Singu ra condiie este ca esutul sa fie situat n apropiere de sistemul vascular, pentru ca limfocitele i macrofagele sa poata migra spre locul unde a fost injectat antigen ul. Reaciile de hipersensibilitate imediata i ntrziata se deosebesc prin urmatoarele tra saturi: - mecanismul inducerii (humoral sau celular) - dinamica desfaurarii n timp - particularitaile manifestarilor patologice - posibilitatea combaterii. Gell i Coombs au definit 4 tipuri de reacii de hipersensibilitate: - reacii de tip I: reaciile de anafilaxie (anafilaxia generalizata, reaciile de ana filaxie locala, denumite i stari atopice1 : astmul bronic alergic, febra de fn, urt icaria, reacia Arthus, maladia serului). - reacii de tip II: reacii de citotoxicitate mediate de anticorpi - reacii de tip III: reaciile de hipersensibilitate induse de complexele imune - reacii de tip IV: reaciile de hipersensibilitate ntrziata, mediate de limfocitele T(reacia la tuberculina, brucelina, lepromina etc; dermatitele de contact, reacia de respingere a grefei). Reaciile de tip I, II i III sunt mediate de anticorpi, iar cele de tip IV sunt med iate de celule. Dovezi pentru natura imunitara a reaciilor de hipersensibiltate: - reaciile de hipersensibilitate necesita stimularea prealabila (sensibilizarea) organismului uman sau animal cu antigenul inductor (alergenul); - ntre momentul contactului cu doza sensibilizanta i momentul administrarii dozei

declanatoare este necesara o perioada de timp (5-10 zile), pentru sinteza efector ilor reaciei (anticorpi) sau pentru expansiunea clonelor de limfocite. Dupa acest interval, organismul devine sensibil la declanarea starii de hipersensibilitate, numai la contactul cu acelai alergen care a creat starea de sensibilizare sau cu un antigen nrudit, care da reacie serologica ncruciata cu alergenul inductor. Intre antigenul sensibilizant, cel declanator i starea de hipersensibilitate este o rel aie specifica; - organismele sensibilizate prezinta un raspuns imun de tip humoral sau celular. Starea de hipersensibilitate este mediata de efectorii raspunsului imun; - reaciile de hipersensibilitate imediata se transfera prin ser de la un organism hipersensibil la unul sanatos. Pentru ca reacia de hipersensibilitate sa se mani feste, serul trebuie sa se injecteze ntr-un esut vascularizat. Reaciile de hipersen sibilitate ntrziata se transfera prin intermediul limfocitelor viabile. Reaciile de hipersensibilitate imediata de tip I

Reaciile de hipersensibilitate de tip I, denumite i reacii anafilactice au cea mai mare frecvena i se manifesta foarte diferit, att n ceea ce privete intensitatea, ct organului inta al reactivitaii. Fig. 115. Reprezentare schematica a particularitailor de evoluie a celor patru tip uri de reacii de hipersensibilitate. Declanatorii Antigenele care induc manifestarile reaciilor anafilactice se numesc alergene. El e se gasesc n polenul unor plante, n praful de casa, n veninul insectelor sau n prod use alimentare. Alergenele sunt un set de antigene, stimulatoare ale sintezei de IgE. Natura lor chimica este foarte heterogena. Un studiu german recent, releva ca organismul uman vine n contact cu circa 14000 de substane chimice: unele sunt substane alimentare, altele sunt ingerate odata cu alimentele, fiind adaugate n pr ocesul industrial al prelucrarii. O categorie larga o formeaza substanele poluant e. Din punct de vedere chimic, alergenele sunt glicoproteine i polizaharide de or igine vegetala sau animala sau molecule mici, cu rol de haptene. Haptenele sunt molecule organice sau anorganice, cu greutate mica, insuficienta pentru a fi antigene, dar devin alergene dupa cuplarea lor cu macromoleculele ti sulare. De cele mai multe ori, haptenele alergice sunt substane de uz farmaceutic , de 500-1000 D. Dupa legarea covalenta ireversibila cu proteinele serice, rezul ta un conjugat haptena-proteina, cu specificitate antigenica modificata i adeseor i alergic. Toate medicamentele n stare nativa, dar i derivaii lor de degradare paria la pot sa se comporte ca haptene i sa devina alergene. Intensitatea reaciilor de hipersensibilitate este dependenta de calea de patrunde re n organism, de doza, de frecvena expunerii i de caracteristicile moleculare ale alergenului. Cel mai adesea, alergenele se clasifica n funcie de calea de patrunde re n organism. In raport cu calea de patrundere a alergenelor, se disting: - alergene inhalate - alergene ingerate - alergene inoculate Alergenele inhalate sunt glicoproteine din polen, din fungi, din praful animalel or de casa. Greutatea moleculara nu depaete 50 kD, deoarece moleculele mai mari nu strabat membranele mucoase ale tractului respirator. Un alergen inhalat poate d

etermina simptome respiratorii: rinita, astm. Crizele se produc numai n prezena al ergenului. Unele alergene sunt sezoniere (polen), altele sunt perene (praful de casa). Polenul este, din punct de vedere cantitativ, cea mai importanta sursa de alerge ne. Plantele din familiile Gramineae, Compozitae, Betulaceae, Fagaceae produc po len alergic. Toate polenurile alergice provin de la plante polenizate de vnt (ane mofile). Ele produc cantitai mult mai mari de polen dect plantele entomofile i n per ioada nfloririi l elibereaza n atmosfera. Alergenele din polen sunt glicoproteine nr udite chimic i dau reacii ncruciate. Serul imun de iepure, faa de un alergen din pole n precipita o diversitate de alergene polenice. Sporii fungilor se gasesc n aer, n cantitate de circa 5 ori mai mare dect granulele de polen, dar produc mai puine stari alergice. In regiunile temperate, numarul s porilor fungici este maxim n timpul verii i scade n sezonul rece. Alergiile sunt pr oduse de sporii a peste 80 de genuri de fungi: Alternaria, Penicillium, Aspergil lus. Singura substana alergica de origine fungica, izolata n stare pura, este peni cilina. Cantitaile de alergene care patrund pe cale respiratorie, sunt foarte mici: sub 1 g/an. Reaciile alergice la alergenele fungice apar la 30 de minute de la expunere, iar cele toxice, la 6-8 ore dupa ingestie. Reaciile toxice nu au substrat imunologic. Micotoxinele au greutate moleculara mica (sub 1 kD) i pot fi eliminate din extra ctele de alergene fungice, prin dializa. Cele mai multe particule inhalate (mai mari de 10 m), ca de exemplu, polenul i spo rii mari sunt depozitate n nazofaringe i sunt asociate cu manifestari locale, naza le i/sau oculare, denumite generic ?febra de fn?. Particulele mai mici de 10 m (dar n special cele mai mici de 5 m) sunt antrenate cu curentul de aer inspirat, n cail e inferioare, unde reaciile alergice tind sa se manifeste sub forma de astm. Spor ii fungici difera ca dimensiuni i determina reacii alergice ale tractului respirat or superior i inferior. Alergenele ingerate se gasesc n compoziia unor alimente: n ou, ciocolata, capuni, ci ree, uleiul de ficat de pete, n seminele de Glycine max (soia), n faina unor cereale (gru, orz), n seminele de Arachys hypogea (alun de pamnt) etc. La copii, laptele de vaca i soia sunt cauzele majore ale reaciilor alergice, urmate de cereale, oua i pet e. Vrsta manifestarilor este variabila: dupa primele zile de viaa(faa de laptele de vaca), pna la doi ani. La 90% din cazuri, intolerana dispare dupa trei ani. Cele mai comune manifestari sunt voma, diareea, colicile abdominale, ce apar ntr-un in terval variabil, de la cteva minute, pna la 1-2 ore dupa ingestie. Alergia la lapt ele de vaca i la pete este mai frecventa la populaiile care consuma cantitai mari al e acestor produse. Alergenele alimentare traverseaza lumenul intestinal, la nivelul mucoaselor dige stive. Bariera mucoasei gastrointestinale este expusa la un grup heterogen de an tigene. Experienele cu molecule marcate cu peroxidaza de hrean sau cu feritina, a u evideniat ca unele antigene intacte i fragmente de antigene particulate din tubu l digestiv, dobndesc accesul la esuturile limfoide ale gazdei, n special la persoan ele cu deficit al sintezei de IgA. Antigenele ce ajung n contact cu structurile l imfoide ale mucoaselor, stimuleaza raspunsul imun al gazdei. Penetrarea antigenelor la nivelul tractului digestiv se face pe doua cai: - prin endocitoza de catre celulele intestinale absorbante, la polul luminal. Se formeaza fagosomi, n interiorul carora se produce digestia materialului endocita t, dar cantitai mici ramn nedigerate i sunt exocitate n spaiul extracelular, la polul bazal. Starile de hipo- sau aclorhidrie favorizeaza tranzitul proteinelor prin

mucoasa intestinala. - patrunderea antigenelor alimentare la nivelul celulelor epiteliale M, ce acope ra placile Peyer, foarte numeroase n regiunea distala a intestinului subire. Acest e celule funcioneaza ca adevarate ?sonde de antigen?, adica au capacitatea de a ng loba antigenele derivate n special din microorganisme i ntr-o masura mai mica, anti gene de origine alimentara. Celulele M reprezinta un sistem de avertizare timpurie pentru sistemul imunitar al organismului. Ele sunt acoperite de un strat subire de mucus, au microvili scu ri, dar au capacitatea de a endocita antigene luminale, prin mecanismul pinocitoz ei. Celulele M sunt difereniate, conin lizosomi i nu degradeaza antigenele pe care le pinociteaza, dar le transfera macrofagelor din foliculii subiaceni. Dei au evoluat ca o modalitate strategica protectoare faa de antigenele luminale, totui celulele M reprezinta poarta de intrare pentru microorganismele patogene, c are la acest nivel i dobndesc accesul la esuturile subiacente mucoasei. Studiile electrono-optice cu molecule marcate cu peroxidaza de hrean, au aratat ca acestea sunt transportate din lumenul intestinal i ajung n spaiul subiacent celu lelor M, unde se gasesc limfocite i macrofage. Se stimuleaza astfel raspunsul imu n local. Structurile limfoide asociate mucoaselor constituie prima bariera de pr otecie faa de antigenele tractului digestiv. Uneori, cantitaile relativ mari de ant igene de origine bacteriana i alimentara, nu sunt anihilate local, de structurile limfoide ale mucoaselor i trec n mediul intern, ajungnd la cea de a II-a bariera m ajora de protecie faa de antigene, care este ficatul. Circa 30% din numarul total de celule ale ficatului au capacitatea de a fagocita i epureaza sngele adus de ven a porta din teritoriul digestiv. Antigenele inoculate sunt proteine din veninul de insecte, n special Hymenoptere (albina, viespe), care conine 7-10 antigene. Alergenele din venin sunt diferite f orme ale fosfolipazei A. Veninul de albina conine fosfataza acida, hialuronidaza, dopamina i norepinefrina i un peptid care produce degranularea mastocitelor. Serurile imune obinute pe diferite specii de animale (heteroantiseruri), dupa inj ectare la om, adeseori activeaza raspunsul imun al organismului receptor. Muli di abetici tratai cu insulina de origine animala sau cu insulina sintetizata n celule reprogramate prin metodele ingineriei genice, sintetizeaza anticorpi anti-insul ina. Agenii farmacologici, administrai n scop terapeutic sau diagnostic, pot cauza o var ietate de dezordini imunitare, deoarece acioneaza ca haptene care se cupleaza cu diferite proteine tisulare, conferindu-le imunogenitate. Legarea covalenta a unu i medicament ori a unui metabolit reactiv derivat prin metabolizarea lui, de o m acromolecula, creeaza un conjugat haptena-macromolecula, inductoare a raspunsulu i imun specific. Legarea covalenta a celor doua molecule se numete haptenare. Se descriu doua tipuri de haptenare: - haptenarea directa a celulelor (a moleculelor membranare) i a moleculelor extra celulare, sub aciunea compuilor chimici cu reactivitate nativa (intrinseca). De ex emplu, penicilinele de semisinteza (benzil-penicilina, cefalosporinele), dar i al te medicamente se cupleaza cu diferite proteine serice, formnd conjugate cu funcie de alergene. Circa 10% din moleculele de penicilina injectata, se leaga covalen t prin gruparea ?NH2, de proteine plasmatice sau membranare. Celula poate lega m ii de haptene -lactamice, n cteva minute dupa tratament. - haptenarea indirecta a moleculelor membranare sau libere, cu derivaii rezultai d in catabolizarea pariala a unor molecule, care n stare nativa sunt puin reactive sa u areactive.

Metabolizarea are loc n hepatocite, cheratinocite (i n alte celule) i poate crea int ermediari reactivi ce formeaza legaturi covalente cu molecule carrier. Uneori, catabolismul medicamentelor este concomitent cu sinteza proteica. Se pro duce haptenarea moleculelor n cursul sintezei (haptenare interna) i pot fi expuse ca antigene pe suprafaa celulei.

a = inel -lactamic b = inel tiazolidinic Dupa fisiunea inelului -lactamic rezulta gruparea peniciloil, principalul inducto r al reaciilor anafilactice la om. Metaboliii reactivi pot fi secretai n spaiul extracelular i se leaga cu proteine extr acelulare. Unii indivizi sunt predispui la reaciile alergice faa de diverse medicamente, n spec ial antiinfecioase. Daca un individ manifesta fenomene alergice faa de un compus a ntimicrobian, riscul alergiei faa de o alta clasa de compui farmacologici crete de 9 ori. Circa 10% dintre aduli sunt alergici faa de o clasa de compui i intra n catego ria celor cu risc crescut faa de ali compui farmacologici. Reaciile de hipersensibilitate imediata de tip 1, induse de medicamente, se manif esta variat: anafilaxie, urticarie, angioedem. Unele substane pot produce mai mult de un tip de reacie, la un organism sensibil. De exemplu, penicilina poate cauza o reacie anafilactica de tip I, o anemie hemol itica datorata reaciei citotoxice de tip II, dezordini funcionale de tip III cu co mplexe imune sau o reacie de hipersensibilitate ntrziata. Reaciile de hipersensibilitate apar, de cele mai multe ori, n esuturile bogate n mas tocite: tegument, mucoase, mucoasa linguala, plamn, tractul gastrointestinal. Daca reacia de hipersensibilitate imediata este localizata n mucoasa nazala i n conj unctiva oculara, simptomele includ rinoree, lacrimare, stranut, congestie nazala , creterea numarului eozinofilelor n snge. Titrul IgE seric poate sa creasca sau sa ramna scazut. Daca reacia de hipersensibilitate imediata este localizata n bronhii, manifestarea clinica este astmul alergic, caracterizat prin scurtarea i ngreunarea respiraiei. Mediatorii reaciei de hipersensibilitate imediata de tip I Reaciile de hipersensibilitate imediata de tip 1 se datoreaza sintezei unor izoti puri de anticorpi cu proprietai particulare. Din punct de vedere funcional, anticorpii sunt convenionali i citofili. Anticorpii convenionali (Ig A, IgG, IgM) din ser se detecteaza in vitro, prin rea cia de aglutinare, precipitare sau de fixare a complementului. In vivo, anticorpi i convenionali se combina cu antigenul i l neutralizeaza. Reaciile de hipersensibili tate de tip 1 se datoreaza sintezei anticorpilor citofili, cu proprietai funcional e particulare.

Anticorpii citofili au proprietatea de a se fixa pe suprafaa unor celule care au receptori pentru regiunea Fc i n primul rnd pe mastocite, dar i pe bazofile, eozinof ile, macrofage. Nu produc reacii secundare de aglutinare, precipitare sau de fixa re a complementului. Anticorpii citofili declanatori ai reaciilor de hipersensibilitate imediata se num esc reagine, deoarece produc modificari ale reactivitaii tisulare: maresc permeab ilitatea vasculara prin intermediul histaminei, eliberata din mastocite. La om, reaginele majore sunt IgE i IgG4. IgE este termolabil (se inactiveaza la 56o, tim p de 30 de minute), iar IgG4 este termostabil. Ambele izotipuri se sintetizeaza dupa imunizari naturale. IgE nu traverseaza bariera placentara. Timpul de njumatai re este de doua zile. Sinteza lor se face dupa mecanismul clasic: dupa ce alergenul vine n contact cu m ucoasele (respiratorie sau digestiva), penetreaza pelicula de mucus i celulele ep iteliale, este fagocitat de macrofage, prelucrat i prezentat n asociaie cu molecule le CMH II, limfocitelor Th. Limfocitele Th sintetizeaza IL-2 care produce expans iunea clonala a limfocitelor B. Sub aciunea stimulatoare a IL-2, limfocitele B se transforma n plasmocite ce sintetizeaza IgE. La persoanele normale, sinteza IgE este supresata de limfocitele Ts, iar concent raia de IgE seric variaza ntre 17-450 ng/ml, adica 0,002% din totalul cantitaii de imunoglobuline serice. La indivizii atopici (cu predispoziie genetica pentru mani festarea reaciilor alergice), dupa contactul cu o doza mica de alergen, aproape t otdeauna se sintetizeaza IgE, iar titrul seric crete de 1000 de ori. Nivelul seri c crescut al IgE este o modalitate de diagnostic al starilor alergice, dar nivel ul normal al IgE nu exclude starea alergica. IgE se sintetizeaza local, n structurile limfoide, la poarta de intrare a antigen ului, n plasmocitele din corionul mucoasei. Excesul de IgE trece n circulaie i se le aga pe receptorii pentru Fc ? de mare afinitate ai bazofilelor, neutrofilelor, a i celulelor endoteliului vascular, ai celulelor epiteliale alveolare pulmonare. Sngele transporta IgE la masocitele tisulare din tot organismul. IgE fixat pe cel ule reprezinta o proporie importanta din IgE total. Dei IgE liber (din ser) are timpul de njumataire de doua zile, IgE fixat pe suprafaa celulelor este foarte stabil. Mastocitele ramn sensibilizate luni de zile, dator ita afinitaii foarte nalte a receptorilor lor pentru Fc al IgE. n stare legata, IgE este protejat de atacul proteazelor. Celulele mediatoare ale reaciilor de hipersensibilitate imediata sunt n primul rnd mastocitele i bazofilele. Bazofilele sunt celule circulante, dar pot patrunde n focarul inflamator. Mastoci tele sunt celule mononucleate i au doua localizari principale: - n esutul conjunctiv, n special n jurul vaselor sanguine din ficat, rinichi, splina ; - n mucoasele digestive i cea respiratorie. n creierul uman sunt doua surse de histamina: mastocitele i neuronii histamiergici . Mastocitele se gasesc n zonele cele mai vascularizate (eminena mediana, glanda p ineala, meninge) i controleaza circulaia sngelui i permeabilitatea vaselor SNC. Neur onii histaminergici sunt limitai exclusiv la nivelul nucleului tuberomamilar din hipotalamusul posterior. Colateralele axonale se proiecteaza n toate zonele corte xului. Astfel, sistemul histaminergic central controleaza activitatea ntregului c reier.

Localizarea strategica a mastocitelor se coreleaza cu alterarile patologice care se produc la nivel vascular gastrointestinal, bronic, cutanat, cerebral, ocular. n citoplasma bazofilelor i mastocitelor, la microscopul electronic se observa gran ule electrono-dense, ce reprezinta pna la 40% din volumul celular. Ele conin media tori preformai, cei mai importani fiind aminele biogene (histamina i serotonina). Mastocitele conin histamina (amina tisulara), detectata iniial n tegument. In vivo, histamina se sintetizeaza prin decarboxilarea histidinei, reacie catalizata de h istidin-decarboxilaza (o enzima citoplasmatica) i este depozitata n granule. O cel ula umana conine 2-3 pg de histamina. Histamina este larg distribuita n esuturile organismului uman. La om, neuronii his taminergici ai SNC reprezinta o sursa nemastocitara de histamina. Histamina acion eaza asupra unei varietai largi de tipuri celulare: celule musculare netede, neur oni, celule endocrine, exocrine, celule sanguine, celulele sistemului imunitar. Efectele variate se produc prin receptori distinci: H1, H2, H3. Serotonina (5-hidroxi-triptamina) se formeaza prin decarboxilarea moleculei de t riptofan hidroxilat. Mastocitele umane nu conin serotonina. Serotonina s-a izolat iniial din ser (tonina din ser), deoarece are efect vasoconstrictor. Produce ede m i are rol important n reaciile anafilactice.

Histidina Histamina Serotonina (5-hidroxi-triptamina) Mecanismul celular i molecular al reaciilor de hipersensibilitate imediata de tip I Reaciile de hipersensibilitate imediata de tip 1 se desfaoara n mai multe stadii. Faza I a este legarea anticorpilor citofili (IgE, care s-a sintetizat dupa conta ctul primar cu antigenul), de receptorii pentru Fc ? ai mastocitelor locale. Ali factori activatori ai mastocitelor sunt: - alergenul specific sau unul nrudit cu cel inductor al sintezei IgE; - diferite lectine - anticorpi anti-IgE, anticorpi anti-idiotipici, anticorpi anti-receptor Fc ?; Fig. 116. Activarea masto-citelor este mediata de legarea ncruciata a recep-torulu i Fc ?. Aceasta poate fi realizata de legarea antigenului de IgE fixat pe recept orii pentru Fc ?, de anticorpii bivaleni care recunosc determinanii izo-tipici ai regiunii Fc a IgE, de anticorpii anti-idiotipici ai regiunii Fab ai IgE, de anti corpii anti-receptor care se fixeaza direct pe recep-torul pentru Fc ?, de dimer ii bivaleni de IgE obinui cu ageni chimici de polime-rizare sau de lectinele care se leaga de resturile glu-cidice ale IgE. Antigenele i anticorpii monovaleni nu acti veaza mastocitele, deoa-rece nu realizeaza legarea ncruciata a receptorilor (dupa Roitt, 1993). - neuropeptide endogene, fapt care explica alergia determinata de stimularea sis temului nervos - anafilatoxinele C3a i C5a - peptidele bacteriene ce conin formil-metionina

- ageni fizici (de exemplu, temperatura scazuta) - diferite medicamente. n faza a II-a se produce activarea mastocitelor i degranularea lor. Alergenul declanator trebuie sa fie multivalent pentru a lega ncruciat doua molecul e de IgE fixate pe celula efectoare. Dupa legarea ncruciata a receptorilor pentru Fc ?, membrana granulelor fuzioneaza cu membrana citoplasmatica i elibereaza conin utul. Fig. 117. Ali stimuli activatori ai mastocitelor. Anafilatoxinele C3a, C5a sau su bstanele medica-mentoase (ionoforii de Ca2+, codeina, morfina, ACTH sintetic) act iveaza mastocitele pe o cale directa. Toate aceste substane induc patrun-derea Ca 2+ n mastocit, declanatoare a fenome-nelor biochimice care duc la degranularea i e liberarea mediatorilor. Eliberarea mediatorilor preformai - histamina - triptaza - activeaza C3 - heparina

Moleculele de IgE pot fi legate ncruciat de lectine (PHA, Con A), prin asocierea l or cu resturile glucidice ale regiunii Fc. Astfel se explica urticaria produsa d e capuni i ciree, care conin cantitai mari de lectine. Stimulul activator al mastocitelor este transmis prin receptorii pentru IgE. A ctivarea se datoreaza legarii ncruciate a doua situsuri Fab, printr-o molecula de alergen. Mastocitele au i receptori pentru Fc ?, care leaga IgG cu afinitate mult mai mica. Degranularea mastocitelor este precedata de influxul masiv de Ca2+. G ranulele pline cu mediatori preformai, migreaza la periferia celulei, fuzioneaza cu membrana externa i elibereaza coninutul: histamina, proteaze neutre(triptaza, c himaza, carboxipeptidaza), proteoglicani (heparina, condroitin-sulfatul). Fig. 118. Inducerea i mecanismele efectoare ale hipersensibilitaii de tip I. Prelu crarea antigenului se face la nivelul mucoaselor. Reexpunerea la alergen declanea za degranularea mastocitelor i producerea mediatorilor ce determina simptome aler gice (dupa Mirakian, 1998). Triptaza (prezenta n mastocite, dar absenta n bazofile) produce constricia muchilor netezi ai bronhiilor, iar chimaza stimuleaza secreia mucoasei bronice. Proteoglicanii din granulele mastocitelor au rol n mpachetarea mediatorilor prefor mai n granule. Heparina este proteoglicanul predominant n mastocitele pulmonare umane. Mastocitu l este singura sursa endogena de heparina la om i la rozatoare. Heparina are efec t anticoagulant. Mastocitele conin SOD i peroxidaza. Degranularea activeaza o lipaza care mobilizeaza acidul arachidonic din membrana mastocitului. Prin metabolizarea acestuia se sintetizeaza mediatori noi ai reaci ei de hipersensibilitate imediata. Astfel, din acidul arachidonic, pe calea lipo oxigenazei se sintetizeaza leucotriene, iar pe calea ciclooxigenazei se formeaza

prostaglandine i tromboxan. Efectele mediatorilor mastocitari Manifestarile reaciilor alergice, inclusiv alergia respiratorie, pot sa se produc a n doua faze: ? faza timpurie, care se desfaoara n cteva minute, datorita eliberarii mediatorilor preformai; ? faza tardiva se produce la 3-4 ore dupa expunerea la alergen, datorita infiltr atului celular, ca raspuns la mediatorii fazei timpurii. n prima etapa, aciunea histaminei consta n contracia muchilor netezi ai tractului res pirator i digestiv. Histamina produce constricia celulelor endoteliale i crete perme abilitatea vaselor mici. Acelai efect l are serotonina. Prin constricia celulelor e ndoteliale i creterea permeabilitaii capilare, se produce edemul tisular. n etapa a II-a, histamina produce dilatarea vaselor periferice i rezultatul este s caderea brutala a tensiunii arteriale. ocul hipotensiv este una din manifestarile dramatice ale anafilaxiei generalizate. Ali mediatori ai fazei a II-a sunt chininele. Ele se formeaza din chininogenul pl asmatic i sunt polipeptide mici: ? metionilchinina (Met-Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) ? bradichinina(Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg) ? calidina (lisil-bradichinina): Lys-Arg-(Pro)2-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg. Chininogenul este alcatuit din 11 aminoacizi i (acid sialic)n, la una sau la ambe le extremitai. Este o ?-globulina (2 mg/ml ser). Chininele au efect vasodilatator i maresc permeabilitatea capilara, producnd edem. n faza a III-a se sintetizeaza ali mediatori, care ntrein n timp diferitele efecte in iiate de mediatorii eliberai din mastocite, prin efectul chimiotactic faa de celule le sanguine: ECF (eozinofil-chemotactic factor) determina afluxul de eozinofile NCF (neutrofil-chemotactic factor) PAF (factorul activator al plachetelor). Leucotrienele (LC4, LD4, LB4, LE4) determina contracia de durata a muchilor netezi , edem al mucoaselor i stimularea secreiei lor. Exemple de reacii de hipersensibilitate de tip I Prima reacie de hipersensibilitate imediata a fost descrisa de Prausnitz i Kustner . Reaciile de hipersensibilitate imediata pot sa se produca la orice organism al un ei specii i se numesc reacii anafilactice sau se manifesta numai la anumii indivizi predispui genetic i se numesc atopii (stari atopice).

Reaciile anafilactice (ana = opus; phylaxis = protecie) se caracterizeaza printr-o dinamica exploziva a manifestarilor, n decurs de 3-4 minute. Clinic, termenul de anafilaxie semnifica sindromul care rezulta din eliberarea unor mediatori prefo rmai i generai de novo n mastocite, care determina o stare opusa celei de protecie. M anifestarile clinice ale reaciilor de hipersensibilitate sunt dependente de calea de patrundere a alergenului i de cantitatea de histamina eliberata. Reaciile cuta nate medii, cu eritem, urticarie, prurit, dureri de cap, sunt asociate cu un niv el scazut al histaminei plasmatice (sub 1 ng/ml).

Daca alergenul este injectat intravenos, raspunsul este sistemic, adica are loc o anafilaxie generalizata, care poate duce la oc vascular hipotensiv i asfixie sec undara prin constricie bronica i laringiana. Daca sfritul nu este letal, recuperarea funcionala se poate face ntr-o ora. ocul vascular se datoreaza ieirii plasmei n spaiu extravascular, rezultnd scaderea volumului sanguin. Scaderea debitului cardiac d uce la hipoxie i acidifierea mediului intern, antrennd i insuficiena respiratorie. Daca alergenul este injectat n piele, reacia este limitata la locul injeciei i se nu mete anafilaxie cutanata, nsoita de eritem (urticarie), angioedem, edem laringian, bronhoconstricie, hipotensiune, aritmie cardiaca. Anafilaxia generalizata (sistemica) este forma cea mai grava a hipersensibilitaii imediate. Mult timp s-a considerat ca anafilaxia generalizata este o manifestar e patologica, indusa numai n condiii experimentale la animalele de laborator. In r ealitate, att la om ct i la animale se produc ambele tipuri de reacii anafilactice, att generalizate, ct i locale. Prima reacie de anafilaxie generalizata a fost descrisa la cine. n 1902, Richt i Port ier studiau biologia meduzelor i toxicitatea extractelor apoase i glicerinate din celenterate, asupra mamiferelor. Administrate n doze mari, extractele produc moar tea imediata a cinelui, datorita ocului toxic, dar dozele mici sunt suportate. O i njecie secundara la cteva saptamni mai trziu, produce o reacie anafilactica generaliz ata, cu paralizia muchilor respiratori i ocul fatal. Instalarea starii de oc este ac celerata de injectarea intravenoasa a dozei secundare. La autopsie se observa ed emul mucoasei intestinale, a esutului pulmonar, congestia ficatului. La cobai, anafilaxia se induce prin injectarea intravenoasa a unei doze mici (1m g) de albumina serica bovina. La 8 zile dupa injectarea dozei sensibilizante, an imalul devine sensibil la ocul anafilactic i are sensibilitate maxima la 21 de zil e. Doza declanatoare a ocului este mai mare. Raspunsul anafilactic este prompt i ma nifestarile ncep n primele zeci de secunde: piloerecie dorsala, agitaie motorie, str anut, tuse zgomotoasa, cianozarea mucoaselor, pierderea reflexelor de miciune i de fecaie, blocaj respirator, convulsie, moarte. Tabloul acestor modificari patologi ce se succede n cteva minute. Muchii netezi bronici ai cobaiului sunt foarte sensibi li la histamina i bronhoconstricia fatala este caracteristica anafilaxiei la aceas ta specie. Reaciile anafilactice generalizate la om se manifesta n primul rnd faa de alimente i se exteriorizeaza prin urticarie generalizata. Urticaria afecteaza 15-23% din po pulaie Suportul manifestarilor patologice care nsoesc aceste reacii, este tegumentul . Anafilaxia generalizata la om, este declanata i de ali factori: penicilina, aloseru ri, heteroseruri, veninul insectelor (albina, viespe) i se manifesta prin urticar ie generalizata, spasmul muchilor bronici, edem laringian, dispnee severa, cianoza , oc hipotensiv. Intensitatea manifestarilor este dependenta de gradul de sensibi litate. Sensibilitatea alergica a pacienilor variaza n limita a circa 1/1000. Raspunsul sistemic cu reacii tegumentare generalizate, tulburari gastrointestinal e, tahicardie, aritmie cardiaca, hipotensiune medie, este asociat cu creterea con centraiei plasmatice a histaminei peste nivelul de baza. Reacia ampla care pericli

teaza viaa, cu hipotensiune severa, fibrilaie ventriculara, spasmul muchilor bronici , stop cardiac i respirator, este asociata cu nivelul crescut al histaminei, de 1 2 ng/ml. La om, histamina are efect vasodilatator asupra vaselor periferice, cu scaderea presiunii vasculare. Hipersensibilitatea imediata la penicilina produce circa 500 decese/an/glob. Rea cia este declanata de penicilina nativa sau de derivaii rezultai din degradarea ei ( acidul peniciloic, acidul penicilenic). Anticorpii anti-penicilina aparin izotipurilor IgE i IgG4 i se gasesc chiar n serul persoanelor netratate cu penicilina. Probabil ca sinteza lor a fost indusa de penicilina din carne. Originea penicilinei este n masa miceliana d e la fabricile de antibiotice, care se adauga n hrana animalelor, ca stimulator a l creterii. Alergenele inhalate produc manifestari locale, la poarta de intrare. Reacii atopice. Termenul de atopie definete starile de hipersensibilitate imediata cu substrat ereditar, limitate la om. Starile atopice se manifesta la 10-20% di n populaie, sub forme variate. Reaciile atopice au un tablou clinic mai simplu i se produc atunci cnd reacia alerge nului cu anticorpii specifici are loc pe suprafaa unei mucoase sau n epiteliul teg umentar. Rinita alergica sau febra de fn este forma cea mai simpla a atopiei i se manifesta prin secreie abundenta a glandelor epiteliului nazal, iar astmul bronic, prin con tracia muchilor cailor respiratorii. Cele doua forme extreme de manifestari alergi ce sunt determinate de alergenele inhalate, care se gasesc n polen, n praful de ca sa(ce conine alergene de acarieni), n parul animalelor. Foarte raspndite sunt alerg iile la polenul de Ambrozia, o planta care raspndete o cantitate mare de polen (10 0 kg/planta/an). Grauncioarele de polen vin n contact cu mucoasa nazala i respirat orie, cu conjunctiva oculara i determina o stare de sensibilizare a aparatului re spirator. Reexpunerea la polen n sezonul urmator, declaneaza reacia alergica, cu ur matoarele manifestari: eritemul conjunctivei oculare, edemul mucoasei nazale i se creia apoasa abundenta, stranut. Intensitatea simptomelor depinde de nivelul cantitativ al expunerii la polen, da r i de reactivitatea organismului. Exista situaii grave, inexplicabile, cu crize a mple, dupa o expunere minimala. Daca rinita are caracter sezonier sau este dependenta de condiiile de mediu, apro ape sigur are caracter alergic. Rinita alergica perena se datoreaza contactului cu praful de casa i de animale.

Mecanismul rinitei alergice este diferit de al altor manifestari alergice. In pr imul rnd, exista diferene funcionale ntre mastocitele mucoaselor i ale esutului conju ctiv. Mastocitele mucoasei nazale(denumite MCT) conin histamina i triptaza, iar du pa stimularea alergenica, se degranuleaza, dar concentraia plasmatica a histamine i nu se modifica. Mediatorii mastocitari produc o hiperemie a mucoasei nazale, e dem i transudarea lichida. Inflamaia nazala se datoreaza transudarii, n care albumi na este un marker mult mai stabil dect mediatorii din categoria citochinelor. Fig. 119. Mecanismul rinitei alergice (dupa Frankland, 1998). n al II-lea rnd, manifestarile rinitei sunt dependente de particularitaile unice al e vascularizaiei nazale, conferite de esutul venos erectil. Variaiile volumului san guin din esutul venos erectil regleaza rezistena tractului nazal la coloana de aer . Umplerea cu snge a acestui esut produce congestia mucoasei. Curgerea sngelui este controlata de fibrele nervoase vegetative. Inervaia simpatica este vasoconstrict oare i diminua fluxul sanguin, iar tonusul simpatic are activitate ciclica. De ac

eea, mucoasa nazala are o perioada de repaus la fiecare 2-4 ore, iar caile nazal e se pot obtura alternativ. Faza primara a rinitei (stranut, rinoree, obstrucie nazala) este dependenta de hi stamina din mastocite, de leucotriene i prostaglandine, iar faza tardiva (obstruci e nazala ampla prin hiperreactivitate i anosmie) este dependenta de bazofile.

Astmul alergic, o varianta complexa a reaciilor atopice, este o maladie cronica i nflamatorie a plamnului, cu o prevalena crescnda a morbiditaii i mortalitaii n ultim doua decenii. Dei s-a considerat ca este o boala a muchilor netezi ai cailor resp iratorii, n ultima decada s-a acceptat ca astmul este, n primul rnd, o boala inflam atorie. Structural, caile aeriene ale astmaticilor se caracterizeaza prin inflam aie cronica, cu infiltrarea intensa a mucoasei bronice, cu limfocite, eozinofile i mastocite, cu descuamarea epiteliului, hiperplazia celulelor mucoase, ngroarea sub mucoasei. Aceste modificari se asociaza cu manifestarile clinice, care includ ob strucia cailor aeriene i hiperreactivitatea cailor aeriene. Astmul bronic alergic are determinism multifactorial, atopia (predispoziia genetic a de a sintetiza IgE ca raspuns la aeroalergenele comune) fiind cel mai comun fa ctor predispozant. Dupa expuneri repetate la doze mici de alergene, indivizii at opici sintetizeaza IgE. Expunerea secundara la alergene iniiaza raspunsul imun hu moral. Evenimentele reaciei alergice, consecutive expunerii la alergen, se desfaoa ra n doua faze: faza timpurie, de ordinul minutelor, consta n raspunsul bronhospas tic i faza tardiva, de ordinul orelor, ce consta n raspunsul inflamator. Raspunsul rapid se caracterizeaza prin edemul mucoasei, creterea tonusului muchilo r netezi i ngustarea cailor respiratorii, asociata cu degranularea mastocitelor. M anifestarile astmatice imediate sunt dependente de eliberarea histaminei din mas tocite. Pacienii cu astm alergic au o concentraie de IgE de 6 ori mai mare dect ast maticii nealergici, ceea ce confirma relaia dintre concentraia IgE i starea patolog ica. Unii astmatici alergici dezvolta raspunsul de faza tardiva, la 3-6 ore dupa stim ularea cu alergenul, care, n absena terapiei, poate sa persiste cteva zile. Raspuns ul tardiv, este asociat cu migrarea eozinofilelor, dar i a neutrofilelor i limfoci telor din snge, n parenchimul pulmonar. Limfocitele TCD4 au rol esenial n patogeneza astmului. In plamnul astmatic, alergenul este nglobat, prelucrat i prezentat de ma crofagul alveolar, de celulele epiteliale ale mucoasei i de celulele dendritice. Limfocitele Th-2 secreta IL-4, 5, 6, 9, 10, 13, stimulatoare ale sintezei de IgE . Alergiile la alimente formeaza o categorie de stari atopice foarte comune la cop ii i se manifesta faa de alergene din lapte, oua, ulei de pete, ciocolata, capuni, c iree, portocale. Manifestarile reaciilor alergice la alimente pot fi locale sau ge neralizate. Reaciile alergice locale se caracterizeaza prin erupii urticariene (pustule eritem atoase) la nivelul mucoasei bucale, nsoite uneori de tulburari digestive (colici a bdominale, diaree). La vrsta adulta, subiecii vor manifesta reacii alergice respira torii. Nu toate urticariile tegumentare sunt determinate de reacii alergice. Urticaria n eimuna de contact poate fi declanata de ageni chimici (salicilai, sulfii, acidul ben zoic, acidul sorbic, acidul nicotinic i esterii sai din alimente, din guma de mes tecat, din ampoane, din parfum, din unguente) sau de ageni fizici (traumatisme, fr igul). Acetia stimuleaza eliberarea factorilor chimici inductori ai urticariei. M ecanismele ei nu se cunosc, dar efectele se manifesta asupra endoteliului vascul ar. Simptomele sunt arsura, usturimea, pruritul, edemul i eritemul. Urticaria este acuta sau cronica. Cea cronica se manifesta prin apariia zilnica s

au aproape zilnica a leziunilor tegumentare, pentru un interval de cel puin 6 sap tamni, cauzata de stimuli fizici. n toate cazurile de urticarie, imuna sau neimuna, pe tegument apar leziuni eritem atoase (macule) i edematoase, nsoite de prurit. Urticaria implica dermul superficia l. Leziunea cutanata eruptiva este datorata creterii permeabilitaii capilarelor i dila tarii venulelor. Plasma parasete patul vascular i determina formarea pustulei tegu mentare pruriginoase, nconjurata de o zona de culoare roie intensa. Lichidul vezic ulelor eruptive este infiltrat cu limfocite i PMNN. Erupia tegumentara dispare la 24-48 ore, fara urme n cazul reaciilor acute sau persista mai multe zile la cele c ronice. n manifestarile cu angioedem, edemul se extinde subcutan sau submucos i leziunil e pustulare sunt mai mari i pot sa dureze 72 de ore. Se manifesta la nivelul buze lor, limbii, pleoapelor, dar poate fi afectata orice zona corporala. Pseudoalergii. Simptomele clinice ale alergiilor (urticarie, rinita, astm, ocul a nafilactic) apar adeseori din cauze nealergice. Numarul lor depaete pe acela al al ergiilor. Iata principalele cauze: - histamina se gasete n cantitai mari n unele alimente i activeaza mediatorii specifi ci ai reaciilor alergice; - histidina din alimente este precursorul histaminei; - tiramina de origine alimentara determina dureri de cap pulsatile i hipertensiun e; - feniletilamina produce migrena; - benzoatul de origine alimentara i din acidul benzoic produce astm i rinita; - bisulfitul de sodiu, bioxidul de sulf i metabisulfiii (conservani) produc simptom e ale tractului gastrointestinal, distrug vitaminele B, produc dureri de cap, as tm; - glutamatul monosodic (agent de aromatizare) produce astm; - coloranii alimentari (n special culoarea galbena) produc astm i alte reacii alergi ce; - aspirina induce astm, urticarie, angioedem (Girard, 1998). Testarea starilor atopice Pentru prevenirea accidentelor provocate de reaciile de hipersensibilitate imedia ta, n clinica, nainte de administrarea unor medicamente, se testeaza eventualele m anifestari de hipersensibilitate. O problema eseniala pentru diagnosticul i tratamentul alergiilor, este gradul nalt de variabilitate biochimica a alergenelor, de la un lot la altul. Preparatele de alergene sunt foarte heterogene, iar cantitatea de alergen specific, din cele m ai multe extracte comerciale, variaza de la cteva procente pna la 50% din proteina totala. Extractele sunt amestecuri complexe, cu cantitai variabile de alergene m ajore, alergene minore i proteine irelevante. Extractele fungice conin proteine, g lucide, enzime proteolitice, enzime glicolitice, n cantitai variabile. De aceea, e fortul major s-a orientat n direcia clonarii alergenelor de importana clinica major

a. Majoritatea alergenelor s-a clonat i unele sunt disponibile la un nivel modera t sau chiar nalt de puritate. Disponibilitatea preparatelor antigenice omogene, c u puritate i activitate biologica definite, va avea un impact major asupra diagno sticului i probabil, asupra terapiei dezordinilor alergice. Multe alergene, n special cele de natura proteica, se prezinta ntr-o multitudine d e izoforme naturale. Ele sunt rezultatul variaiei alelice a numeroaselor proteine vegetale i fungice, foarte asemanatoare ca secvena a aminoacizilor, dar au propri etai distincte de combinare cu anticorpii sau de activare a clonelor de limfocite T specifice. Existena numeroaselor izoforme ale aceleiai molecule de alergen, este probabil, as ociata cu grade diferite de recunoatere a epitopilor sai, de catre limfocitelor T i B i, ca o consecina, cu grade diferite de sensibilitate. Ca dovada, anticorpii d e la diferii pacieni alergici, leaga numai unele izoforme ale alergenului. Preparatele de alergene pentru diagnostic sunt heterogene i deriva din surse natu rale care conin majoritatea sau toate izoformele de alergen. Inlocuirea acestor a lergene cu cele clonate, pentru diagnostic, va rezolva unele probleme, dar va cr ea altele. Unii cercetatori apreciaza ca majoritatea indivizilor raspund la un n umar limitat de epitopi ai oricarui alergen. De aceea se considera ca un numar m ic de alergene (circa 40) ar putea sa fie suficiente pentru a identifica majorit atea indivizilor alergici. Testele cutanate constau n injectarea subcutana a alergenelor la diferite diluii. La organismul alergic, reacia de hipersensibilitate se manifesta n cteva minute, pr in apariia la locul injectarii, a unei reacii inflamatorii pruriginoase, nconjurata de o zona mai extinsa de eritem. Reacia de hipersensibilitate la proteinele sali vei de nar are acelai aspect. Alergenul injectat (sau inoculat) se leaga specific de IgE fixat pe mastocitele din piele. Mastocitele elibereaza histamina n cteva minu te, cauznd edemul localizat, eritem (vasodilataie) i prurit. Leziunile locale ale r eaciei de hipersensibilitate imediata se reproduc prin injectarea unei cantitai mi ci de histamina. Determinarea cantitativa a IgE seric al pacientului, ramne cel mai bun criteriu d e diagnostic. IgE se dozeaza prin metoda RIA: - alergenul (de exemplu, penicilina) se fixeaza pe suportul inert (dextran); - proba de ser de cercetat se pune n contact cu alergenul fixat pe suport. IgE di n ser se fixeaza pe alergenul imobilizat; - se adauga ser imun de iepure, care conine IgG marcat radioactiv, anti-IgE uman; - se masoara indirect cantitatea de IgE fixata pe suport, prin masurarea cantitai i de IgG radioactiv legat specific. Combaterea starilor de hipersensibilitate imediata de tip I se face prin evitare a alergenelor, prin terapie medicamentoasa i prin imunoterapie. Masurile de evitare a alergenelor sunt ideale pentru prevenirea reaciilor: evitar ea alimentelor, medicamentelor, controlul prafului de casa, evitarea contactului cu animalele al caror praf este alergic, combaterea mucegaiului din ncaperile lo cuite.

Medicamentele antihistaminice au efect antagonic faa de histamina, deoarece intra n competiie cu receptorii pentru histamina ai celulelor inta. Astfel, se poate blo ca creterea permeabilitaii vasculare, vasodilataia, contracia muchilor bronhiilor i a mucoasei gastrointestinale. Rinita alergica necesita terapie antihistaminica lo cala. Cromoglicatul de sodiu protejeaza pacienii astmatici. Teofilina(o metilxant

ina) relaxeaza muchii netezi bronici. Imunoterapia sau hiposensibilizarea consta n administrarea planificata a alergenu lui la un pacient pentru a diminua sinteza IgE. Rinita alergica, astmul bronic i a nafilaxia la veninul de insecte pot raspunde la aceasta terapie. Alergenul este injectat saptamnal, n doze gradat crescnde. Dupa o cretere iniiala a IgE circulant, s e produce declinul. Locul IgE este luat de IgG care fixeaza alergenul i-l mpiedica sa stimuleze mastocitele, blocnd reacia alergica. 1 Atopia definete o stare de hipersensibilitate imediata locala, ce se manifesta la persoane cu predispoziie ereditara.

p 8 p p

Imunodeficienele

Organismele imunodeficitare reprezinta, din punct de vedere clinic, adevarate ?e xperiene ale naturii?, care, alaturi de studiile experimentale, au contribuit dec isiv la fundamentarea concepiei actuale cu privire la organizarea i funcionarea sis temului imunitar. Analiza cazurilor clinice ale indivizilor imunodeficieni, a evi deniat faptul ca cele doua compartimente celulare ale sistemului limfoid sunt sem iautonome, deoarece ntre ele exista multiple interdependene funcionale. Maladiile cu substrat imunitar (imunodeficienele) sunt heterogene, att n expresia l or imunologica-clinica, ct i n privina mecanismelor celulare i moleculare implicate. Imunodeficienele pot fi nascute (primare) sau dobndite (secundare) i se datoreaza ma i multor cauze: - pot fi rezultatul unor defecte genetice intrinsece ale celulelor limfoide, car e se manifesta prin erori ale diferitelor trepte de maturare, care se succed de la celula stem pluripotenta, pna la celula T matura i respectiv, pna la plasmocit. Deficiena poate fi datorata lipsei unor enzime eseniale pentru metabolismul celule i (de exemplu, metabolismul purinelor). Consecina este absena limfocitelor din org anele limfoide i din circulaie; - alteori se produc deleii ale genelor care codifica unele izotipuri de lan greu ( H). Astfel, apar deficienele selective ale claselor de imunoglobuline; - imunodeficienele se pot datora slabei dezvoltarii a mediului necesar diferenieri i i maturarii celulelor limfoide (timus, GALT); - imunodeficienele pot fi rezultatul perturbarii mecanismelor reglatoare ale celu lelor Th i Ts, care controleaza raspunsul imun mediat celular i humoral; - imunodeficienele pot surveni ca rezultat al catabolizarii imunoglobulinelor cu

o rata excesiva, sau chiar datorita pierderii imunoglobulinelor din snge i din sec reii, dei celulele limfoide i imunoglobulinele sunt normale sub aspect numeric i res pectiv, cantitativ; Circa 50% din imunodeficiene se datoreaza sintezei deficitare a anticorpilor, 10% sunt imunodeficiene celulare, 20% sunt imunodeficiene combinate, 18% sunt deficie ne ale fagocitelor i 2% sunt deficiene ale proteinelor complementului. Imunodeficienele nnascute Imunodeficienele nnascute (primare) au fost descoperite de O. Bruton (1952), odata cu descrierea agamaglobulinemiei i hipogamaglobulinemiei infantile sex-lincata. Maladia afecteaza baieii i se transmite prin cromosomul X. Pacienii ramn asimptomati ci n primele luni de viaa, deoarece n aceasta perioada imunoglobulinele materne asi gura protecia antiinfecioasa. Dupa vrsta de 5-6 luni, pacienii devin foarte sensibil i la infeciile tegumentare cu bacterii piogene i la infecii ale tractului respirato r cu streptococi, meningococi, H. influenzae. Pacienii sunt lipsii de reactivitate a imunitara mediata humoral. In esuturile limfoide lipsesc plasmocitele, iar foli culii limfoizi nu se formeaza nici dupa stimularea antigenica repetata. La elect roforeza, serul pacienilor nu releva fracia gamaglobulinica. IgG are concentraia de 1/10 (1 mg/ml faa de 10 mg/ml), iar IgM are concentraia de 1/100 din valorile nor male. Lipsete IgA, dar lipsesc i hemaglutininele ? i . n mod normal limfocitele B rep rezinta 5-18% din totalul limfocitelor circulante, dar la aceti pacieni, proporia l or este foarte mica (mai puin de 0,1%). Absena limfocitelor B mature se datoreaza defectelor de maturare, determinate de tirozin-kinaza nefuncionala, codificata de gena mutanta. Pacienii au reactivitate normala a imunitaii mediate celular: testul hipersensibil itaii ntrziate la tuberculina este pozitiv, resping alogregele, limiteaza infeciile virale, cu excepia hepatitei B (care evolueaza rapid spre ciroza) i a celor cu ent erovirusuri. Limfocitele T au valori numerice normale. Vaccinurile virale atenua te sunt bine suportate i nu produc infecii clinice. Disgamaglobulinemiile selective se caracterizeaza prin incapacitatea sintezei un ui anumit izotip imunoglobulinic. Se cunosc deficiene selective ale IgM, IgA sau ale IgM i IgA, IgA i IgG, IgM i IgG.

Deficienele IgA se asociaza cu o frecvena crescuta a infeciilor tractului digestiv i respirator, iar deficienele sintezei IgG i IgM se nsoesc cu creterea sensibilitaii f de infeciile tegumentare cu bacterii piogene: Streptococcus, Staphylococcus. Agama-, hipogama- i disgamaglobulinemiile selective se amelioreaza net, prin admi nistrarea intravenoasa a gamaglobulinelor. Sindromul Di George este consecina hipoplaziei sau ageneziei timice. In cursul vi eii embrionare se produce o perturbare a dezvoltarii structurilor derivate din pe rechile a 3-a i a 4-a de pungi faringiene. Agenezia timica este nsoita de absena par atiroidelor i de aceea, pacienii, iniial, prezinta alte simptome: hipocalcemie, mal formaii cardiace. Timusul este foarte redus ca dimensiuni sau chiar lipsete la 1/3 dintre pacieni. Adeseori, timusul exista sub forma glandelor ectopice. Imunitat ea mediata humoral este normala, reflectata n valorile normale ale concentaiei imu noglobulinelor.

Daca supravieuiesc, la civa ani, pacienii manifesta sensibilitate nalta faa de infec e virale, faa de bacteriile intracelulare sau faa de infecia fungica cu Pneumocysti s carinii. Imunodeficiena severa combinata (scid) se caracterizeaza prin deficitul ambelor c ompartimente ale imunitaii, att celular, ct i cel humoral. Deficiena se datoreaza abs

enei celulelor stem de origine a limfocitelor. Lipsesc limfocitele T, B i granuloc itele, datorita hipoplaziei generalizate a esutului reticular hematopoetic. Organ ele limfoide secundare sunt hipoplazice, iar timusul este absent. Lipsesc imunog lobulinele serice. Pentru restabilirea funciei imunitare se impune transplantul maduvei osoase.

Imunodeficienele dobndite

Imunodeficienele dobndite (secundare) cuprind diverse maladii, datorate unor cauze patologice care interfera direct sau indirect cu funcia imunitara. Imunodeficienele dobndite pot fi cauzate de hipercatabolismul imunoglobulinelor. C oncentraiile serice ale imunoglobulinelor reflecta raportul dintre rata sintezei i rata catabolismului acestor molecule. Creterea ratei catabolismului poate sa con duca la o deficiena selectiva a unei clase de imunoglobuline, ce se manifesta pri n hipoproteinemie. Imunodeficienele dobndite se pot datora pierderii excesive a imunoglobulinelor, la nivelul tractului urinar sau gastrointestnal. Pierderea urinara este consecina d efectelor renale glomerulare, a unor disfuncii tubulare sau unor defecte combinat e. Deficienele glomerulare sunt asociate cu pierderea proprietailor de sita ale endot eliului capilarelor glomerulare. Moleculele imunoglobulinice mici (IgG) trec n ur ina cu o rata superioara faa de moleculele mari (IgM). Totui, IgG3 i IgG4 ramn norma le, ceea ce sugereaza ca, n afara greutaii moleculare, sunt importani i ali factori c are condiioneaza funcia filtrului renal. Nivelul seric al IgG scade, proporional cu gradul perturbarii funciei de sita a endoteliului glomerular, iar IgM ramne norma l. A II-a cale majora a pierderii majore a imunoglobulinelor este tractul gastroint estinal, la nivelul vaselor limfatice. Cele mai multe situaii patologice la acest nivel nu induc hipogamaglobulinemie, cu excepia limfangiectaziei intestinale. Ac easta se caracterizeaza prin dilatarea excesiva a canalelor limfatice i este nsoita de pierderea masiva de proteine i chiar a limfocitelor. Dilatarea vaselor limfat ice este cauzata de obstrucia limfatica, datorita unei infecii (de exemplu, tuberc uloza), unei malignitai (limfom) sau datorita creterii presiunii hidrostatice n ins uficiena cardiaca severa congestiva. Rata sintezei imunoglobulinelor este normala sau crescuta, dar turnover-ul este rapid, datorita pierderii excesive a protein elor la nivel intestinal. Imunodeficiene datorate micronutrienilor. Deficiena fierului creeaza condiii predisp ozante pentru candidoza mucocutanata cronica. Deficiena zincului supreseaza funcia celulelor T i predispune la infecii oportuniste. Seleniul este important pentru f uncia celulelor T. Deficiena pariala la copii, predispune la infecii. Imunodeficiene induse de medicamente. Cele mai multe medicamente citotoxice i imun osupresoare, utilizate n tratamentul malignitailor, al inflamaiilor i n imunosupresia pacienilor cu transplant de organe, deprima funcia imunitara celulara i humorala, iar neutropenia predispune la infecii cu bacterii Gram negative i la infecii fungic e. Compuii steroidici utilizai n tratamentul maladiei reumatismale, ciclofosfamida i azatioprina, folosite n tratamentul neoplaziilor, dupa administrare prelungita, deprima imunitatea mediata celular, dar i nivelul seric al imunoglobulinelor. Unele imunodeficiene sunt consecutive altor procese patologice, care interfera cu

efectorii sistemului imunitar: deficiena renala sau hepatica are ca efect acumul area substanelor toxice n organism, cu efect supresor asupra reactivitaii imunitare . Dezechilibrul endocrin, cu producerea n exces a cortizonului suprarenalian (n mala dia Cushing) este asociat cu imunodeficiena. Cortizonul lizeaza limfocitele T i B circulante i diminua monocitele periferice. Starile neoplazice, n special cele care afecteaza sistemul imunocitar, monocitar sau granulocitar induc un deficit al funciei imunitare. In maladia Hodgkin ? neop lazia liniei monocitare a ganglionilor limfatici ? se instaleaza deficiena imunit aii mediate celular, dar imunitatea humorala este normala. In alte malignitai, efe ctele neoplaziei asupra sistemului imunitar, nu s-au putut disocia de efectele p rovocate de caexie. Mielomul multiplu (tumora plasmocitara localizata n maduva osoasa) este nsoit de sc aderea cantitativa severa a tuturor claselor de imunoglobuline normale i de aici, deficiene ample ale imunitaii humorale, dar imunitatea celulara ramne normala.

Imunodeficiena consecutiva infeciei cu HIV

Imunodeficiena consecutiva infeciei cu virusul HIV este, n esena, expresia incapacit aii organismului uman de a neutraliza virionii, n timpul fazei acute a infeciei. Du pa contactul primar cu antigenele HIV, organismul se apara prin mecanisme imunit are specifice. Se sintetizeaza anticorpi specifici, la un titru crescut. Testul ELISA pentru diagnosticul infeciei cu HIV se bazeaza pe detectarea anticorpilor a nti-HIV. Titrul maxim al anticorpilor se coreleaza n timp, cu nivelul viremiei. Imunitatea mediata celular anti-HIV se detecteaza foarte timpuriu dupa infecie i e ste dominata de numarul mare de limfocite TCD8, al caror numar crete de 10-20 de ori faa de valorile normale (200-600/?l). Ele manifesta activitate citotoxica spe cifica anti-HIV i lizeaza limfocitele infectate, care expun pe suprafaa lor, prote inele env (SU i TM). Limfocitele TCD8 diminua viremia primara, att prin efect citotoxic direct asupra celulelor n care virusul se replica, ct i prin efect represor asupra replicarii vir ale, mediat de citochine. Celulele NK lizeaza celulele infectate prin mecanismul ADCC. Raspunsul imun primar, humoral i celular represeaza replicarea virala dupa infecie . Dei foarte energic, raspunsul imun primar nu elimina complet virusul i nici celu lele infectate. Organismul nu se sterilizeaza deoarece anticorpii specifici anti -HIV, produi n timpul infeciei primare, nu au activitate neutralizanta optima. Anti corpii raspunsului imun primar, n esena, nu au efect protector, deoarece raspunsul imun este neadecvat, fie cantitativ, fie calitativ. O proporie importanta a viri onilor nu este neutralizata, pastrndu-i infeciozitatea. Ramn de asemenea, multe celu le infectate cu virus, n special n ganglionii limfatici, att limfocite ct i celule fo liculare dendritice. Anticorpii neutralizani se detecteaza mai trziu, dupa trecerea de la faza acuta a infeciei, la faza cronica. Probabil ca anticorpii neutralizani sunt specifici faa d e epitopii care nu sunt expui pe virionii asamblai n cursul infeciei primare sau ant icorpii raspunsului imun secundar sufera fenomenul maturarii de afinitate i se le aga mai eficient de epitopi. Pe masura ce infecia progreseaza, anticorpii neutralizani sunt nlocuii cu anticorpi

stimulatori (enhancing) ai infeciei. Anticorpii stimulatori favorizeaza infecia ce lulelor, prin intermediul receptorului pentu C3 sau pentru Fc. Ineficiena anticor pilor este explicata prin aceea ca una din glicoproteinele de nveli al virionilor este foarte glicozilata (circa 24 de situsuri de glicozilare), pe o secvena de 48 1 aminoacizi. Gruparile glucidice mascheaza epitopii antigenici i mpiedica neutral izarea virusului. Imunodeficiena grava este consecina directa a scaderii dramatice a numarului de li mfocite TCD4 circulante, de la circa 1000 la 100/?l. Daca n stadiul preclinic, pr oporia limfocitelor producatoare de virus este de 1/40, n stadiile avansate, propo ria este 1/10. Cauza principala a scaderii numarului de limfocite TCD4 este liza consecutiva in feciei cu HIV. Proteinele virale sintetizate n celula au efect toxic. Legarea HIV de membrana i penetrarea n celula, este asociata cu creterea volumului celular. Cel ula pierde controlul influxului ionilor i al apei. Aceste modificari s-au reprodu s in vitro cu glicoproteina 120 de HIV. Efectul toxic al glicoproteinelor virale este reversat de antagonitii canalelor de Ca2+, utilizai n clinica pentru a atenua anomaliile neurologice consecutive infeciei cu HIV. La pacienii infectai cu HIV, o proporie semnificativa de limfocite, dupa stimularea cu antigenele virale, n loc sa se activeze i sa se divida, se sinucid prin apopto za, adica prin activarea programului genetic al morii.

O alta cauza a imunodeficienei o constituie anergia limfocitelor. Cele doua glico proteine (120 i 41)rezulta prin clivajul enzimatic al proteinei precursoare 160. Clivajul proteinei 160 este esenial pentru infeciozitatea virala. Glicoproteina 12 0 asociata necovalent cu gp 41pe suprafaa nveliului viral, este uor eliberata de pe suprafaa celulei i a nveliului. Glicoproteina 120 sintetizata n exces, se gasete libe a(?solubila?) n snge i se leaga de receptorul CD4, producnd perturbari ale reactivit aii imunitare, prin blocarea reactivitaii limfocitelor. Afinitatea interaciunii gp 120 cu CD4 este conferita de resturile sale glucidice. Starea de anergie poate f i reversata sub aciunea stimulatoare a IL-2. Complexele imune gp 120-anti gp 120 s-au identificat pe suprafaa limfocitelor, la pacienii infectai cu HIV. HIV-1 infecteaza limfocitele TCD4, dar i monocitele, macrofagele, celulele dendri tice, celulele Langerhans, celulele trofoblastice placentare, neuronii. Scaderea ampla a numarului de limfocite TCD4, detectabila n testul transformarii blastice cu mitogene, anuleaza funcia lor reglatoare asupra funciei imunitare. Lim focitele viabile asigura persistena infeciei. Diminuarea sintezei IL-2 ncetinete pro liferarea i diferenierea limfocitelor Tc. In absena celulelor Tc activate, multipli carea virala este necontrolata. Consecutiv scaderii sintezei IL-2, diminua activ itatea macrofagelor i a celulelor NK. La organismele infectate cu HIV, numarul limfocitelor B este normal, iar concent raia imunoglobulinelor este de circa 10 ori mai mare dect la persoanele sanatoase. Explicaia creterii titrului anticorpilor este ca, n absena limfocitelor TCD4, celul ele Ts nu-i ndeplinesc rolul fiziologic de a supresa activarea limfocitelor B, dif erenierea lor i sinteza Ig. Limfocitele B se activeaza nespecific, policlonal. Se sintetizeaza anticorpi la un titru crescut, dar nu au specificitate anti-HIV i nu sunt protectori nici faa de ali ageni patogeni sau potenial patogeni. Data fiind specificitatea interaciunii gp 120 cu receptorul limfocitar CD4, s-a nc ercat utilizarea CD4 solubil ca agent imunoterapeutic. Tulpinile virale de labor ator au fost neutralizate eficient de preparatele CD4, dar izolatele primare de HIV-1 sunt relativ rezistente. Absena neutralizarii infeciozitaii s-a atribuit meca nismelor complexe de intrare a virusului n celula. CD4 solubil stimuleaza elibera rea gp 120 din nveliul viral, ceea ce determina creterea infeciozitaii.

Grupurile cu risc major de mbolnavire sunt cele ale homosexualilor i ale consumato rilor de droguri. Virusul se transmite i pe cale heterosexuala, mai ales la femei , care transmit infecia fatului.

p 8 p p IMUNOLOGIE TUMORALA

Dupa malignizare, membrana citoplasmatica este cea mai modificata structura celu lara. Semnalele reglatoare de control al creterii i multiplicarii, care acioneaza n primul rnd prin intermediul receptorilor membranari, nu-i mai gasesc inta structura la. Incapacitatea celulelor de a recepiona semnalele reglatoare ale creterii i divi ziunii sau de a raspunde adecvat acestor semnale, este cauza principala a compor tamentului invaziv al celulelor maligne. Pierderea inhibiiei de contact este refl ectarea modificarilor suprafeei celulare. Adeseori, malignizarea este nsoita de sinteza unor molecule noi, localizate n orica re din compartimentele celulei i care se comporta ca antigene tumorale. Orice structura chimica a celulei maligne, absenta n sau pe celulele normale ale e sutului de origine a tumorii, susceptibila de a induce o reacie imunitara la gazd a primara sau dupa injectare la o noua gazda, poate fi considerata ca antigen tu moral.

ANTIGENE TUMORALE Se disting urmatoarele categorii de antigene tumorale: 1. Antigenele tumorale de difereniere, denumite i antigene oncofetale, deoarece se gasesc att pe suprafaa celulelor unor tumori, dar sunt prezente i n timpul unei faz e de difereniere embrionara. Ele lipsesc pe suprafaa celulelor organismului adult sau se gasesc n cantitai foarte mici, nedectabile. a) Antigenul carcinoembrionar (CEA) s-a izolat din sngele unui pacient cu cancer de colon (1965). Este o glicoproteina de 180-200 kD, localizata pe membrana celu lelor normale ale tractului digestiv la fat, dar se gasete n cantitai foarte mici l a subiecii normali aduli. La fat, CEA este sintetizat n celulele mucoasei gastro-intestinale i este concentr at n glicocalix, pe suprafaa luminala a acestor celule. In celulele embrionare nor male, CEA pare a avea rol n aderena celulara, dar probabil favorizeaza metastazare a celor maligne. CEA este un grup foarte heterogen de molecule, cu o cantitate foarte variabila d

e glucide. Raportul proteine/glucide variaza ntre 1/1 i 1/5. Componenta glucidica este reprezentata, n primul rnd, de acidul sialic. Imunogenitatea moleculei este c onferita de componenta proteica.

La adult, CEA se gasete n cantitai mici pe mucoasa colonului, n plamn, n esutul mama dar reapare n cantitai mari pe celulele maligne ale tractului digestiv uman (intes tin subire, pancreas, ficat, stomac, colon, rect). CEA se gasete nu numai asociat suprafeei celulelor maligne, dar trece i n sngele a 60-80% dintre pacienii cu cancer de colon. Nu se cunoate mecanismul prin care CEA ajunge n snge. Din sngele pacienilor neoplazici, CEA sintetizat de celulele maligne, este epurat la nivelul ficatului. De aceea, cele mai mari concentraii de CEA apar la neoplazi cii cu insuficiena hepatica (metastaze hepatice, ciroze). CEA este un antigen nespecific, deoarece poate sa apara, n concentraii mici (10 ng /ml), n sngele unor pacieni cu maladii nemaligne: la cei cu ciroza alcoolica a fica tului sau cu insuficiena renala, astfel ca sperana detectarii cancerului prin depi starea CEA n snge, s-a naruit.

Leziunile de orice natura ale mucoasei tractului gastrointestinal sunt nsoite de c reterea sintezei i secreiei CEA, care trece i n snge: n maladia inflamatorie a intes ului, n colita ulcerativa, polipi ai tractului digestiv, tumori ale tractului gas trointestinal. Unele tumori secreta CEA, mai ales dupa o metastazare hepatica (adenocarcinomul colonului, tumorile de pancreas, ficat, plamn). Nivelul CEA foarte crescut, reflecta o evoluie rapida a tumorii. b) Alfafetoproteina (AFP) este o glicoproteina majora a fatului timpuriu, o glob ulina normala (69 kD)a sngelui fetal uman i a celorlalte mamifere, descoperita n 19 56. Coninutul glucidic este de 3,5%. Din punct de vedere structural, AFP este ase manatoare albuminei. Genele codificatoare ale celor doua proteine au organizare similara. AFP se detecteaza n plasma la embrionul de 4 saptamni i crete rapid n primu l trimestru de sarcina. Nivelul maxim (2-3 mg/ml) se gasete la fatul de 14 saptamni i scade la valorile caracteristice ad ultului, la vrsta de 6-10 luni. AFP se gasete nu numai n plasma, ci i n fluidele feta le: lichidul amniotic, lichidul cerebrospinal, urina. Cantitai mici de AFP (500 n g/ml) strabat placenta i se gasesc n serul femeilor gravide.

n timpul vieii fetale, AFP se sintetizeaza n ficat, n celulele gastrointestinale. La adultul normal, concentraia sa este nedetectabila prin metodele imunochimice obin uite, dar crete n neoplaziile de carcinom hepatic. Circa 70% din cancerele hepatic e primare sunt nsoite de creterea nivelului seric al AFP. AFP crete i n alte neoplazi : testiculare, ovariene. Nu toate hepatoamele i tumorile testiculare produc AFP, dar cele care sintetizeaza aceasta glicoproteina, o produc n cantitai foarte mari. Creterea concentraiei AFP n snge nu este totdeauna asociata cu malignitatea: AFP cret e n starile patologice de hepatita virala, hepatita cronica, ciroza, fapt ce refl ecta regenerarea celulara. AFP crete n maladiile inflamatorii ale intestinului: boala Crohn, colita ulcerativ a. AFP este un marker util pentru depistarea cancerului hepatic la populaiile cu ris c nalt (chinezi, japonezi, eschimoi din Alaska), dar este inutila pentru celelalte populaii, datorita creterii nivelului sau n afeciuni nemaligne. n lichidul amniotic, nivelul crescut al AFP este asociat cu defecte ale tubului n eural (spina bifida).

2. Antigenele de transplantare a tumorilor (TATA = tumor associated transplantat ion antigen). a) Antigenele specifice de organ se exprima la un nivel nalt pe celulele tumorale , n timp ce exprimarea lor pe celulele normale este foarte scazuta sau este limit ata la un anumit stadiu al dezvoltarii esutului.

Antigenul specific prostatei (PSA) este fosfataza acida prostatica, o glicoprot eina cu activitate proteolitica asupra gelului seminal, pe care-l hidrolizeaza. PSA se gasete n esutul prostatic normal, n adenomul benign i n carcinomul malign. Est produs de celulele acinare ale prostatei. n ser, PSA este legat cu ? 1-antichimi otripsina, ceea ce influeneaza valorile furnizate de determinarea sa cantitativa. PSA crete mult n cancerul prostatic, cel mai comun cancer la vrsta de peste 75 se a ni, dar crete i n hipertrofia prostatica benigna. Concentraia sa se coreleaza cu vol umul prostatei, cu stadiul cancerului prostatic, cu raspunsul la terapie. Glicoproteinele mucinoase sunt antigene de suprafaa celulara, cu greutate molecul ara mare. Sunt formate dintr-o axa polipeptidica, de care se ataeaza numeroase catene oligo zaharidice. Glucidele reprezinta 60-80% din greutatea lor moleculara. Sinteza gl icoproteinelor mucinoase este consecina pierderii controlului metabolismului celu lei neoplazice. Uneori, celula maligna pierde capacitatea de sinteza a unor glic oproteine de suprafaa, ca de exemplu antigenul de grup sanguin A i sintetizeaza mo lecule absente n celulele normale. Glicoproteinele mucinoase se exprima pe suprafaa celulelor epiteliale i se detecte aza n ser, saliva, ori sunt adsorbite pe eritrocite. Ele s-au identificat odata c u disponibilitatea anticorpilor monoclonali: CA 15-3, CA 125, asociate cu cancer ele ovariene, CA 19-9, identificat ntr-o tumora colorectala (CA = cancer associat ed). Modificarea cantitativa a glucidelor membranare poate modifica dramatic mal ignitatea, influennd potenialul de metastazare. Markerii tumorali imunoglobulinici se identifica prin electroforeza serului sau a urinii. Aparin izotipurilor IgG, A, M, E sau sunt catene k sau ? libere. Aproxi mativ, 1% din aduli au proteine serice M (monoclonale), iar din acestea 25% au se mnificaie nedeterminata. 50% din totalul proteinelor serice M sunt datorate mielo mului multiplu. Determinarea proteinelor M n snge sau urina este utila pentru moni torizarea raspunsului la terapie. b) Antigenele specifice fiecarei tumori sunt antigene individuale (TSTA = tumor specific transplantation antigen), proprii fiecarei tumori. Sunt exprimate numai n celulele tumorale i nu sunt niciodata detectabile n esuturile normale. Sunt carac teristice tumorilor induse chimic (L. Gross, 1953). Chiar tumorile multiple indu se de acelai agent chimic (metilcolantren), n acelai esut (tegument) al unui organis m, sunt diferite n ceea ce privete specificitatea antigenelor de transplantare. Ac easta semnifica faptul ca informaia genetica declanatoare a malignizarii, rezida n gene diferite, care sufera mutaie sub aciunea agentului chimic. Fig. 131. Tumorile tegumentare induse de un agent chimic (de exemplu, metilcolan trenul) poseda antigene tumorale strict individuale. Toate celulele unei tumori induse de metilcolantren sunt identice din punct de v edere antigenic, fapt demonstrat experimental: oarecele imunizat cu mojarat de ce lule tumorale, respinge ulterior o grefa de celule vii ale aceleiai tumori. Datorita unicitaii lor antigenice, fiecare tumora indusa chimic, stimuleaza imuni tatea faa de antigenele proprii, iar reaciile ncruciate sunt absente totdeauna.

Antigenele tumorale specifice de transplantare sunt complexe glicoproteice sinte tizate n celula i inserate n membrana citoplasmatica. Celulele maligne pot sa prezinte simultan, att antigene tumorale comune, ct i antig ene specifice. Tumorile care apar n mod natural sunt slab sau deloc antigenice. Nu se tie daca antigenele tumorale sunt prezente de la nceput pe toate celulele tu morale sau daca celula devine maligna, fara sa dobndeasca markerii distinctivi de malignitate. Antigenele tumorilor induse de ageni chimici pot fi stabile i se tra nsmit de la o generaie celulara la alta, dar majoritatea tumorilor induse de ageni chimici, trebuie considerate heterogene din punct de vedere antigenic, datorita instabilitaii genetice. Antigenele suprafeei celulelor maligne sunt supuse modificarilor cantitative i cal itative. La om, 90% din tumori sunt induse de ageni chimici. 3. Antigenele de origine virala sunt comune i se gasesc la toate tumorile induse de acelai virus, chiar la specii diferite. Antigenele tumorilor induse de oncodnavirusuri sunt codificate de programul timp uriu al informaiei genetice virale. De exemplu, virusurile polioma i SV40 induc tu mori la animalele de experiena, iar virusul papiloma este implicat n geneza tumori lor de cervix uterin uman. Virusurile oncogene ADN induc sinteza antigenelor tumorale cu localizare nuclear a i membranara. Sunt proteine nestructurale, care se disting de antigenele capsid ei virale. In celulele transformate cu oncodnavirusuri, nu se detecteaza antigen e capsidale, deoarece programul tardiv al genomului viral nu este transcris i vir usul progen nu este asamblat.

SV40 codifica sinteza a doua proteine virale (antigene tumorale), de 94 i respect iv 17 kD, iar virusul polioma codifica sinteza a trei antigene, de 100, 55 i resp ectiv de 22 kD. Antigenul T de 100 kD are o localizare aproape exclusiv nucleara i se sintetizeaza att n celulele infectate productiv, ct i n cele transformate. Anti enul de 55 kD este o proteina fosforilata ce se asociaza cu oncoproteina Src, o chinaza tirozin-specifica, codificata de protooncogena c-src. Interaciunea cu ant igenul viral produce o stimulare de circa 50 de ori a activitaii chinazice a onco proteinei celulare Src. Antigenele T sunt comune i pentru alte virusuri ale grupului. Toate tumorile indu se de un virus, au antigene comune, chiar la specii diferite. Imunizarea organis mului receptor de grefa de esut tumoral cu celule tumorale iradiate sau cu mojara t de celule tumorale de acelai tip este protectoare faa de dezvoltarea tumorii tra nsplantate. Antigenele T, codificate de oncodnavirusuri nu se gasesc n structura virionului ( proteine nestructurale). De aceea, virionii inactivai nu imunizeaza i nu protejeaz a organismul faa de suspensia de celule tumorale omologe (transformate de acelai v irus). Antigenele tumorale codificate de oncornavirusuri sunt comune pentru toate tumor ile induse de un virus, indiferent de specificitatea antigenica a celulei. Major itatea sunt antigene proteice virale structurale, adica se regasesc n structura v irionului, ceea ce le deosebete net de antigenele codificate de oncodnavirusuri. Antigenele tumorilor induse de oncornavirusuri sunt codificate de gena env i au s

pecificitate de grup. Multiplicarea oncornavirusurilor nu interfera cu capacitat ea celulelor de a crete i de a se divide. Deoarece antigenele tumorale sunt protei ne structurale ale virionilor, imunizarea organismului cu o suspensie virala ina ctivata, confera protecie faa de celulele transformate de virusul omolog. Spre deosebire de antigenele induse chimic, care pot fi tari sau slabe, antigene le codificate de virusurile oncogene sunt foarte imunogene. La om, circa 10% din totalul tumorilor sunt cauzate de virusuri: - carcinomul hepatocelular (indus de virusul hepatitei B) - cancerul de col uterin (indus de papilomavirusuri ? HPV16, HPV18) - limfomul Burkitt i carcinomul nazofaringian (induse de virusul Epstein-Barr) - leucemia celulelor T mature (indusa de HTLV-1). 4. Antigenele tumorale codificate de protooncogene. Mutaiile punctiforme ale onco genelor ? genele ce regleaza creterea normala i diferenierea - i mutaiile genelor sup resoare ale oncogenelor, ca de exemplu, p53 i Rb, produc substituii ale unui singu r aminoacid n catena polipeptidica codificata, care le transforma n antigene tumor ale, codificate de genom. Ele au localizare nucleara, citoplasmatica sau membran ara. S-au descris peste 10 antioncogene (supresoare ale oncogenelor) i circa 100 de oncogene (de exemplu, genele ras), ale caror mutaii punctiforme determina sint eza unor molecule cu substituii punctiforme de aminoacizi, unice sau multiple i ca re se deosebesc de moleculele normale. Antioncogena p53 codifica o proteina nucl eara, reglatoare a diviziunii celulare. In celulele maligne, p53 se sintetizeaza n exces. Dupa localizare, antigenele tumorale sunt: - antigene expuse la suprafaa celulei. Sunt cele mai importante, deoarece sunt ac cesibile efectorilor raspunsului imun (TSTA, TATA); - antigene intracelulare, localizate n nucleu sau n citoplasma. Ambele categorii de antigene, se pot elibera fie din celulele vii, fie dupa necr oza i se gasesc n circulaie, la distana de tumora. Eliberarea lor poate stimula rasp unsul imun sau are un efect de blocare a reactivitaii imunitare, prin fenomenul d e inundare antigenica. Anticorpii antitumorali se obin prin injectarea celulelor tumorale viabile, ori a mojaratului tumoral, la organismele altei linii genetice sau altei specii, care poarta alte molecule CMH. Celulele vor fi respinse ca o grefa alogenica. Antise rul conine anticorpi anti-antigene tumorale, dar i anticorpi anti-antigene CMH. De aceea, serul imun trebuie absorbit cu antigene tisulare normale. Astfel s-a evi deniat CEA la pacienii cu tumori de colon i AFP la cei cu hepatoame. Antigenul evid eniat de anticorpi n serul absorbit poate fi un antigen tumoral sau un antigen nor mal, exprimat abundent pe celulele tumorale. Fig. 132. Modificari ale suprafeei celulei, asociate cu transformarea maligna (du pa Roitt, 1997). Procesul dezvoltarii tumorii are loc n cteva trepte: - transformarea celulei normale n celula maligna - creterea exponeniala a celulei maligne i constituirea tumorii primare - angiogeneza

- invazia esutului nconjurator - intravazarea i eliberarea celulelor tumorale individuale, n vasele sanguine i lim fatice, unde trebuie sa supravieuiasca - oprirea celulelor tumorale n diferite localizari (ficat, plamn etc.) - extravazarea celulelor tumorale i invazia acestor esuturi - creterea tumorii la noile situsuri de metastazare i angiogeneza. Fiecare etapa a dezvoltarii tumorii este influenata de factori imunologici i neimu nologici. De exemplu, integrinele condiioneaza interaciunile dintre celule. Cu ct a derena celulelor maligne este mai bine exprimata, cu att tendina ei de metastazare este mai limitata. Celulele maligne elibereaza unele componente membranare, ca d e exemplu, fibronectina. Pierderea fibronectinei pare sa determine scaderea ader enei majoritaii tipurilor de celule maligne i precede metastazarea. Componentele gl icocalixului sunt eliberate sub aciunea proteazelor, pe care le secreta celulele tumorale. Proteazele (din categoria metaloproteazelor) modifica consistena substa nei fundamentale a esutului conjunctiv, degradeaza colagenul i proteoglicanii, uurnd metastazarea i invazia. RASPUNSUL IMUN ANTITUMORAL Creterea anormala este prevenita prin diferite mecanisme de control: mecanisme de reparare a ADN, aciunea genelor supresoare ale oncogenelor (antioncogene) sau pr in apoptoza celulelor care au suferit leziuni ireversibile. Daca aceste mecanism e nu mai sunt operative, celula continua sa prolifereze. Celula maligna se afla n tr-o interaciune dinamica cu micromediul, ce determina supravieuirea sau moartea e i. Imunogenitatea tumorilor pentru gazda i stimularea timpurie a raspunsului imun an titumoral a condus la formularea conceptului imunosupravegherii, n acord cu care, organismele elimina celulele potenial canceroase care apar n cursul vieii individu ale. Conform acestui concept, cancerul clinic este consecina scaparii celulelor m aligne, de aciunea mecanismelor protectoare. De aceea, factorii care interfera cu reactivitatea imunitara, predispun la malignitate. In concepia actuala, maligniz area este rezultatul activarii oncogenelor sau pierderii funciei genelor supresoa re ale oncogenelor (antioncogene). Teoria supravegherii imune afirma ca sistemul imunitar, monitorizeaza constant o rganismul, pentru apariia celulelor tumorale i ca majoritatea acestor celule abera nte suntdetectate i lizate de sistemul imunitar, nainte de a produce tumori clinic e. Aa se ntmpla cu celulele tumorale intens imunogene. Majoritatea (sau toate) celu lele tumorale care apar spontan, sunt imunogene i raspunsul imun inhiba creterea t umorii. Argumentele n favoarea sau contra acestei teorii sunt greu de obinut. Ele sunt ext rapolate din observaii asupra tumorilor clinice. Dispariia spontana a tumorilor i recuperarea completa a pacienilor cu cancer disemi nat, este rara, dar exista i este explicata prin insuficiena vascularizaiei, prin p rocese de difereniere a celulelor tumorale, prin mecanisme psihosomatice. O expli caie imunologica, este ca raportul dintre creterea tumorii i raspunsul imun antitum oral este n favoarea raspunsului imun. Exista dovezi care sugereaza ca organismul uman raspunde la prezena tumorilor, prin mecanisme imunitare:

- regresia spontana, n special a meloanoamelor maligne, a carcinoamelor renale, a neuroblastomului i retinoblastomului, semnalata n peste 100 de cazuri publicate; - unele tumori evolueaza latent, o lunga perioada, adica cresc foarte ncet sau su nt complet inactive i apoi brusc metastazeaza. Latena se poate explica prin echili brul dintre tumora i sistemul imunitar; - frecvent tumorile sunt infiltrate cu celule mononucleare: limfocite, monocite, puine plasmocite. Celulele T i macrofagele sunt prezente abundent n tumorile umane , sugernd un raspuns imun antitumoral. Celulele T activate faa de tumora autologa, s-au izolat din cteva tipuri de tumori(melanom malign, carcinom renal, cervical) . Ele recunosc peptide asociate cu moleculele CMH I, care sunt represate n celule le normale sau peptide derivate din proteinele mutante; - carcinoamele asociate cu reacie inflamatorie evolueaza mai lent dect cele care n u manifesta un raspuns inflamator; - tumorile sunt mai frecvente la organismele foarte tinere (datorita imaturitaii sistemului imunitar) i la cele vrstnice (datorita senescenei sistemului imunitar); - anumite categorii de tumori (cancerele de piele cu papiloma virus, limfoamele pozitive pentru antigenele EBV) au o incidena crescuta la pacienii cu transplant, supui imunosupresiei. Imunosupresia prelungita (20 de ani), este asociata cu crete rea incidenei tumorilor de origine virala, n timp ce incidena celorlalte categorii de tumori, crete foarte puin. Dovezile clinice sugereaza ca raspunsul imun este or ientat predominant faa de infecia cu virusuri oncogene i neoncogene, iar rata aparii ei altor tumori este relativ nemodificata. Aceasta arata, indirect, ca supravegh erea antitumorala este relativ ineficienta. Datele experimentale sprijina ideia ca supravegherea imuna este orientata, n primul rnd, faa de virusuri oncogene ADN i nu faa de oncorna- sau faa de tumorile induse de agenii chimici carcinogeni.; - celulele metastatice sunt comune la pacienii cu cancer, dar frecvena implantarii lor i creterea tumorilor secundare este mica. Efectorii raspunsului imun antitumoral Daca sunt prezente, multe antigene tumorale stimuleaza raspunsul imun la animale le de experiena i pot induce o stare de rezistena antitumorala faa de celulele trans plantate. Raspunsul imun antitumoral are o eficiena foarte variabila, n funcie de n atura antigenelor. Astfel, antigenele induse de virusurile oncogene sau ale tumo rilor induse de radiaiile UV, sunt foarte imunogene i stimuleaza raspunsul imun pr otector, iar antigenele de transplantare ale tumorilor induse chimic sunt slabe. Tumorile care apar spontan la animale i la om sunt puin antigenice i induc un rasp uns imun de mica intensitate. Antigenele asociate celulelor tumorale sunt recunoscute ca nonself, de sistemul imunitar al gazdei, dar tumorile secreta antigene solubile, care tind sa produca fenomenul de inundare antigenica i paralizie imunitara. Raspunsul imun antitumoral este humoral i celular. Anticorpii specifici, de cele mai multe ori, nu au eficiena antitumorala. Cel mai adesea, celulele tumorale sup ravieuiesc aciunii factorilor humorali i se multiplica. Ineficiena aciunii lor s-a de monstrat n experiene cu celule maligne nchise n camere poroase, permeabile numai pen tru molecule, amplasate n cavitatea abdominala a unor organisme imunizate cu moja rat de esut tumoral. Anticorpii sunt efectori eficieni faa de celulele maligne de o rigine limfoida (leucemii, limfoame). Dupa activarea complementului, se produce liza celulei inta. Efectorii imunitaii antitumorale sunt celulele. Rolul lor s-a demonstrat cu acelai gen de experimente, cu celule maligne plasate n camere poroase, care permit trec erea celulelor efectoare ale raspunsului imun. Rezultatul aciunii celulelor imuni

tare este liza celulei inta. Fig. 133. Antigenul tumoral poate fi prezentat celulelor T, pe diferite cai: dir ect, n absena co-stimulilor necesari, rezultatul fiind anergia; direct de celula t umorala care exprima molecule co-stimulatoare, rezultnd activarea celulelor Tc; d irect de celulele tumorale i indirect via CPA, producnd activarea limfocitelor Tc i Th (dupa Roitt, 1997). Imunitatea celulara antitumorala este mediata de celule capabile sa lizeze celul ele inta, prin interaciune specifica sau de celule care nu necesita procese de rec unoatere specifica. Rolul celulelor NK Celulele NK sunt cei mai importani efectori ai imunitaii antitumorale. Aciunea lor nu este limitata de identitatea moleculelor CMH i i exercita efectul prin contact d irect. Celulele NK nu necesita prezentarea antigenului de catre celulele accesor ii. Mecanismul molecular al interaciunii lor cu celula inta nu este cunoscut. Activitatea celulelor NK se modifica cu vrsta: are nivel scazut la natere, atinge maximum la pubertate i scade gradat cu vrsta. Activitatea lor faa de celulele malig ne, in vitro, este invers proporionala cu nivelul moleculelor CMH I, exprimate pe suprafaa celulelor maligne. Exprimarea moleculelor CMH I poate duce chiar la sca parea celulelor tumorale de a fi recunoscute de celulele NK, in vivo. Se presupu ne ca celulele NK controleaza celulele pentru nivelul expresiei CMH I. Celulele care au pierdut total sau parial moleculele CMH I, par a fi recunoscute ca inte i l izate. Deoarece aciunea celulelor NK nu este restrictiva n raport cu moleculele CM H, ele sunt active faa de celulele tumorale singenice, alogenice i chiar xenogenic e. Importana funcionala a celulelor NK pentru protecia antitumorala este argumentata d e faptul ca liniile de oareci congenital atimici sau cei timectomizai neonatal au un numar mare de celule NK Celulele K interacioneaza cu celula inta prin intermediul receptorilor pentru Fc ? . Celula tumorala tapetata cu IgG este astfel uor recunoscuta de celulele K. Ele se activeaza i lizeaza celula inta prin fenomenul ADCC. Activitatea celulelor NK i K din snge, testata in vitro, scade odata cu progresia tumorii. La contactul cu celula maligna, direct sau mediat de anticorpi, celula efectoare elibereaza factori citotoxici solubili: perforina, proteaze, TNF-?, li mfotoxina (TNF-). Mecanismul eliberarii factorilor litici este acelai, descris pen tru limfocitulTc. Celulele NK, activate in vitro de IFN-? i de IL-2, se numesc LAK (celule killer a ctivate de limfochine). Activarea celulelor NK i K nu produce memorie imuna. Nu exista diferene ntre raspun sul imun primar i secundar. Citotoxicitatea mediata de macrofage Macrofagul neactivat (de la indivizi normali) exprima un nivel minim de citotoxi citate antitumorala. Macrofagul activat distinge celulele tumorale de celulele normale i poate sa omoa re selectiv, celulele tumorale. Activitatea sa citotoxica este independenta de m oleculele CMH, dar este dependenta de factori genetici.Macrofagul se activeaza n urmatoarele situaii: - dupa ce leaga prin receptorul pentru Fc, moleculele de imunoglobulina fixate p

e determinanii antigenici ai celulei maligne sau complexele Ig?Ag tumoral solubil ; - sub aciunea factorilor eliberai de celulele T sensibilizate (IFN ?) - sub aciunea endotoxinelor bacteriene - sub aciunea antigenelor de Mycobacterium, Listeria, Toxoplasma sau dupa infecia cu aceste microorganisme intracelulare. Activarea consta n amplificarea ratei metabolice i macrofagul devine killer potenia l al celulelor tumorale. Macrofagul activat nu interacioneaza cu antigenele tumor ale specifice, dar ca i celulele NK, pare sa distinga ntre celulele maligne i cele normale, prin mecanisme moleculare necunoscute. Macrofagele activate secreta diferite molecule antitumorale: - enzime hidrolitice care degradeaza esutul conjunctiv - IFN-?, activator al celulelor NK - TNF-? (caectina) cu efect stimulator asupra altor celule care elibereaza IL - H2O2 i produi de oxidare a glucozei, cu efect toxic direct asupra celulei inta, p rin perturbari membranare - oxidul nitric (NO), toxic pentru celulele maligne. NO se formeaza prin combina rea oxigenului cu azotul derivat din dezaminarea enzimatica oxidativa a L-argini nei. Reacia este catalizata de nitric-oxid-sintaza. NO mediaza citotoxicitatea ma crofagului, dependenta de L-arginina. Una din cauzele primare ale patologiei maligne este metastazarea, adica eliberar ea celulelor din situsul tumorii primare, pentru a iniia la distana, creterea unei noi tumori. Celulele metastazate au aceleai antigene de suprafaa, ca i tumora prima ra. Principalele situsuri de metastazare sunt ganglionii limfatici, plamnul, fica tul. n studiile experimentale, macrofagele activate s-au dovedit a fi foarte eficiente n reducerea incidenei metastazelor unor tumori. Imunitatea mediata de celulele T Imunitatea antitumorala mediata de celulele T, ca mecanism, este analoga raspuns ului imun faa de alte antigene T-dependente (de exemplu, antigenele CMH). Experie nele in vitro au evideniat ca antigenele tumorale stimuleaza proliferarea tuturor subpopulaiilor de limfocite T (Th, Ts, Tc). Funciile efectoare ale limfocitelor T sunt stimulate de limfochine i monochine (IL-1 i TNF-??), sintetizate i secretate d e macrofagele care prezinta antigenele tumorale solubile. IL-1 stimuleaza proliferarea celulelor B, T i NK. IL-1 produce i raspunsul febril n reacia inflamatorie, iar TNF-? determina necroza celulelor tumorale. Limfocitele TCD4 (i NK) secreta IL-2, cu efect stimulator asupra celulelor care o secreta. IFN ? este secretat de celulele TCD4 (i NK) i activeaza macrofagele i celulele NK. Interferonul are efect antitumoral direct, dar este i imunomodulator. Limfocitele Tc au rol important n liza celulelor tumorale, daca acestea exprima m olecule CMH I. Interaciunea limfocitului Tc cu celula maligna este specifica. Lim

fotoxina produsa de limfocitul Tc are efect litic direct asupra celulelor tumora le. Celula tumorala expune pe suprafaa ei, antigene asociate cu moleculele CMH I, dar elimina i molecule solubile, care sunt preluate de CPA i prezentate limfocitelor Th. Acestea secreta IL-2, activatoare pentru toate tipurile de celule cu funcie i munitara, specifica sau nespecifica. n concluzie, reacia imuna faa de celulele tumorale are doua trepte. In prima etapa sunt activate celulele efectoare nespecifice (macrofage, eozinofile, neutrofile, celule NK) i se produce o reacie inflamatorie locala. Reacia nespecifica uureaza re acia imuna specifica, prin diminuarea ratei de cretere a tumorii i creterea nivelulu i de prezentare a antigenelor tumorale de catre celulele maligne, prin modularea exprimarii moleculelor CMH. In faza a II-a, celulele Tc asigura protecia imuna f aa de creterea tumorii. Celulele efectoare ale imunitaii mediate celular, specifica i nespecifica, sunt ef iciente n detectarea i liza celulelor tumorale izolate i transplantate. Deoarece de tecteaza celulele tumorale izolate, ele sunt eficiente n prevenirea metastazelor, dar sunt ineficiente faa de celulele care constituie o microtumora. Mecanisme de scapare a celulelor tumorale Antigenele tumorale se gasesc pe suprafaa celulelor tumorale. Ele sunt antigene T STA, mai concentrate sau mai diluate. Antigenele CMH normale nu dispar, dar dimi nua cantitativ. Creterea tumorilor, n condiiile activarii raspunsului imun, nu este explicata satis facator. S-au propus mai multe mecanisme prin care celulele tumorale evita recun oaterea de catre efectorii raspunsului imun. Cnd sistemul imunitar este alertat, es utul tumoral este prea dezvoltat i nu mai poate fi nlaturat. De cele mai multe ori, tumora nu este imunogena. Lipsa imunogenitaii nu se datore aza absenei antigenelor tumorale, ci faptului ca celulele tumorale nu sunt eficie nte n prezentarea antigenului. Cel mai surprinzator i cel mai studiat mecanism de evitare a raspunsului imun est e modularea antigenica. Fenomenul modularii antigenice definete capacitatea tumor ii de a masca sau de pierde antigenele, n prezena efectorilor imunitari. De exempl u, celulele leucemice transplantate la oarecele imunizat cu mojaratul celulelor l eucemice care conin antigenul TL, au pierdut antigenul TL, dar antigenul reapare dupa transplantul celulelor leucemice la oarecii care nu au anticorpi serici anti -TL. Imunoselecia. Antigenele exprimate pe suprafaa celulelor tumorale activeaza raspun sul imun mediat celular, iar antigenele solubile stimuleaza sinteza anticorpilor . Unele celule tumorale, ca rezultat al instabilitaii genetice, pierd antigenele iniiale i astfel evita efectorii raspunsului imun specific. Ele devin dominante n m asa tumorii. Noile variante antigenice induc raspunsul imun specific, dar fenome nul schimbarii specificitaii antigenice se repeta. Raspunsul imun nu induce schim barea specificitaii antigenice a suprafeei celulei maligne, ci selecteaza celulele care au suferit modificarea antigenica i astfel au devenit rezistente la aciunea efectorilor imunitari. Diminuarea reactivitaii imunitare pe cale naturala sau artificiala este nsoita de c reterea incidenei neoplaziilor. Imunosupresia naturala este mediata de limfocitele Ts. Antigenele tumorale par sa activeze mai uor celulele Ts dect limfocitele Th. Limfocitele Ts sunt mai numeroase la pacienii neoplazici i pot sa represeze raspun sul imun pna la ineficiena totala.

Celulele tumorale secreta citochine cu aciune imunosupresoare, prin efectul lor i nhibitor asupra interleuchinelor. Celulele maligne produc IL-10, detectata n lich idul peritoneal i n serul pacientelor cu cancer ovarian sau cu alte neoplasme intr aperitoneale. IL-10 inhiba exprimarea moleculelor CMH II pe suprafaa monocitelor i macrofagelor i diminua reactivitatea imunitara prin efectele sale multiple asupr a limfocitelor, monocitelor, celulelor NK i celulelor dendritice. Reactivitatea imunitara poate sa diminue datorita mascarii antigenelor tumorale. De exemplu, sialomucina, abundenta pe suprafaa celulelor unor tumori, mascheaza antigenele tumorale i le face inaccesibile recunoaterii imunitare i efectorilor imu nitari. Sialomucina poate fi ndepartata, in vitro, prin tratamentul celulelor cu neuraminidaza de Vibrio cholerae i celulele i dobdesc sensibilitatea la aciunea litic a a efectorilor imunitari. Diminuarea reactivitaii imunitare se poate datora inundarii organismului cu antig enele tumorii. Fiind o celula foarte activa din punct de vedere metabolic, compo nentele membranei sale au un turn-over ridicat. Antigenele eliberate se complexe aza cu anticorpii specifici sau cu receptorii specifici ai limfocitelor, facndu-i ineficieni n recunoaterea celulelor maligne. Efectul imunosupresor al antigenelor tumorale este proporional cu dimensiunile tumorii i dependent de existena metastaze lor. Efectul de inundare cu antigenele tumorii este argumentat de experienele de trans plant tumoral. Numarul celulelor transplantate este determinant pentru dezvoltar ea tumorii. Grefarea unui numar mic de celule (prin injectarea suspensiei) este urmata de respingere, iar grefarea unui numar mare de celule este urmata totdeau na de creterea tumorii. Dupa ce organismul a respins un numar mic de celule malig ne transplantate, se va apara faa de un numar progresiv crescnd de celule de acelai tip. Imunitatea de transplantare faa de antigenele tumorale poate fi depaita de u n numar de 100-10 000 mai mare de celule tumorale, dect numarul de celule necesar grefei tumorii la animalele neimunizate. Efectul imunosupresor al tumorii. Pacienii purtatori de tumori mari nu raspund la antigenele tumorale, iar limfocitele lor in vitro, au o slaba activitate citoto xica faa de celulele tumorale autologe. Antigenele tumorale exercita un efect imunosupresor n gradient. La un situs ndepar tat de tumora, efectul imunosupresor diminua i inoculul mic de celule tumorale es te respins. Dupa ce tumora a dobndit dimensiuni importante, efectul imunosupresor este sistemic. Antigenele tumorale circulante se asociaza cu celulele efectoare ale sistemului imunitar, chiar n sngele circulant, producnd paralizia raspunsului imun. Creterea tumorii poate fi stimulata prin fenomenul de enhancement imunitar. Fenom enul de enhancement, descoperit experimental, se definete ca un proces de intensi ficare a creterii tumorii, n prezena anticorpilor specifici. Tumorile au fost trans plantate la organisme imunizate cu mojarat celular al aceleiai tumori, pentru sin teza anticorpilor specifici. Anticorpii nu numai ca nu resping celulele grefate, ci determina un efect invers, de stimulare a creterii tumorii, comparativ cu cret erea sa la animalele neimunizate. Anticorpii cu efect de enhancement sunt IgG, l a titru mic. Fenomenul de enhancement se explica astfel: - anticorpii ar putea induce un efect imunosupresor, deoarece prin feed-back inh iba sinteza anticorpilor potenial citolitici; - anticorpii de enhancement sunt citofili, adica se leaga specific pe suprafaa ce lulelor tumorale, formndu-se complexe Ag-Ac, care blocheaza fizic ataarea efectori lor humorali sau celulari.

Evoluia tumorii este condiionata, ntr-o oarecare masura, de tipul anticorpilor care se sintetizeaza. Tolerana imunitara este un mecanism eficient de scapare a celulelor tumorale de a ciunea efectorilor sistemului imunitar. Tolerana se datoreaza lipsei de reactivita te a limfocitelor Tc i B, care la contactul cu antigenele tumorale nu se sensibil izeaza i nu genereaza raspunsul imun, dei faa de alte antigene, reactivitatea imuni tara este normala. Tolerana survine datorita stimularii repetate cu cantitai mici de antigene, dar un rol esenial n inducerea toleranei imunitare pare sa revina rapo rtului dintre limfocitele Th i Ts. Diferite produse tumorale, altele dect antigenele, pot sa interfere cu funcia imun itara i sa favorizeze instalarea toleranei imunitare. De exemplu, prostaglandinele diminua nivelul exprimarii moleculelor CMH II pe suprafaa celulelor prezentatoar e de antigen i pot de asemenea sa suprime activitatea celulelor NK. Factorii genetici, neidentificai, influeneaza evoluia tumorii. Unele neoplazii sunt asociate cu incapacitatea limfocitelor T de a activa raspunsul imun, probabil d atorita incapacitaii lor de a recunoate antigenul. n concluzie, micile acumulari de celule tumorale, stimuleaza raspunsul imun. Dar, chiar tumorile imunogene continua sa creasca la gazdele imunocompetente, datori ta eficienei scazute a raspunsului imun antitumoral in vivo. Tumorile evita aciune a distructiva a efectorilor imunitari sau blocheaza chiar raspunsul imun. Abordari terapeutice ale neoplaziilor Terapia neoplaziilor este abordata pe urmatoarele cai: chirurgicala, radioterapi a, chimioterapia i imunoterapia. Oricare ar fi modalitatea de tratament, este nec esara reducerea prealabila a masei tumorale prin rejecie chirurgicala. Terapia chirurgicala are ca scop reducerea dimensiunilor tumorilor solide, n stad iile timpurii ale neoplasmelor de sn, colon, plamn, prostata - cele 4 malignitai ma jore la om, ce reprezinta peste 50% din totalul tumorilor solide. Radioterapia poate fi primara sau secundara. Cea primara se practica n cancerele capului, gtului i n maladia Hodgkin (neoplazie a ganglionilor limfatici, din diferi te regiuni ale corpului). Radioterapia este mai eficienta pentru esuturile moi, n arii adiacente maxilarelor i cailor nazale. Iradierea totala se practica nainte de transplantul maduvei osoase i este foarte eficienta pentru anumite leucemii acut e, refractare la chimioterapie i pentru tratamentul unor tumori solide (cancer de sn), care au revenit dupa civa ani de remisiune. Chimioterapia consta n tratamentul cu medicamente citotoxice, majoritatea fiind p roduse de sinteza chimica. Scopul chimioterapiei este de a omor selectiv celulele maligne, deoarece au o rata superioara de cretere i diviziune. Cele mai sensibile la chimioterapie sunt leucemiile. Efectul medicamentelor citotoxice este depend ent de doza. Dozele prea mici nu produc efect, iar cele mari au efecte toxice as upra organismului, n special asupra maduvei osoase i asupra celulelor cu o rata ma re de diviziune. Doza se calculeaza la aria de suprafaa corporala, preferabila ra portarii la greutate. Majoritatea agenilor citotoxici se administreaza intravenos , calea orala fiind adecvata pentru ciclofosfamida (i pentru tamoxifen). Agenii chimioterapeutici, n funcie de mecanismul aciunii lor, aparin mai multor clase . Agenii alchilani induc formarea legaturilor transversale stabile ntre cele doua cat ene ale AND (prin legarea de N7 a guaninei) i inhiba replicarea moleculei de ADN. Interaciunea poate sa se produca cu una sau cu ambele catene ADN. Alchilarea gua

ninei induce mperecherea anormala cu timina sau depurinarea prin excizia resturil or de guanina. Consecina este ruperea catenei de ADN. Daca legatura transversala se face ntre resturile de guanina ale celor doua catene, excizia reparatorie poat e sa rupa molecula de ADN i sa rezulte o mutaie letala pentru celula. Agenii alchil ani reacioneaza chimic cu gruparile sulfhidril, amino, hidroxil i fosfat. Aciunea lo r nu are specificitate de faza a ciclului celular, dar celulele sunt mai sensibi le n faza G1 i S. Efectul se manifesta prin blocarea ciclului celular dupa faza G2 .

Mecanismul rezistenei dobndite la agenii alchilani poate sa conste ntr-o retenie scaz ta a agentului n celula, n creterea sintezei compuilor sulfhidril cu greutate mica i creterea capacitaii de reparare a leziunilor ADN. Dei au mecanisme asemanatoare de aciune, diferenele structurii moleculare reduc gradul rezistenei ncruciate ntre comp i subclaselor majore. Efectele secundare sunt gastrointestinale (greaa, voma) i he matologice (mielosupresie). Ciclofosfamida este cel mai folosit agent alchilant, n tratamentul malignitailor h ematologice i a tumorilor solide. Este convertita la forma activa n ficat Compuii platinei (cisplatin, carboplatin) nu sunt ageni alchilani, dar acioneaza pri ntr-un mecanism similar, adica se leaga de N7 al guaninei i realizeaza legarea ncr uciata a catenelor de ADN. Se leaga i cu alte molecule: adenina, citozina, ARN, pr oteine. Antimetaboliii (citarabina, fluorouracil, metotrexat, mercaptopurina, hidroxiuree a) sunt analogi ai bazelor azotate i inhiba sinteza ADN, ARN sau sinteza proteine lor. Sunt ageni cu specificitate de faza a ciclului celular. Antagonitii pirimidinelor. Citarabina (Ara-C) este un compus cu specificitate de faza S. Este metabolizata n celula la forma activa, ara-CTP, inhibitor al ADN-pol imerazei i al sintezei ADN. Ara-C este ncorporata n ADN i blocheaza alungirea catene i, ca i legarea fragmentelor n molecula de ADN nou sintetizata. Antagonitii purinelor. 6-mercaptopurina i 6-tioguanina sunt convertite la forma nu cleotidica de hipoxantin-guanin fosforibozil transferaza (HGPRT). Metaboliii lor inhiba unele enzime ale caii purinice. Unii metabolii ai 6-tioguaninei sunt ncorporai n ADN i n ARN. Fludarabina este analog al adeninei. Derivatul sau, fludarabin-trifosfat, acionea za prin inhibiia ADN-polimerazei i ribonucleotid-reductazei i prin ncorporarea n ADN Antagonitii acidului folic (metotrexat, aminopterina) sunt analogi structurali ai acidului folic. Alcaloizii din plante (vincristina i vinblastina, izolai din Vinca rosea), produc agregarea tubulinei i dezorganizarea microtubulilor celulari. Vinblastina este to xica pentru maduva hematopoetica, iar vincristina are efecte toxice majore asupr a terminaiilor nervoase periferice, producnd neuropatii senzoriale (parestezie, ad ica lipsa senzaiei de durere) i motorii, n degete. Pentru un numar mare de categorii de tumori, chimioterapia determina o citoreduc ere importanta. Dar, la cteva luni sau la civa ani, creterea tumorala este reluata i continua chiar n condiiile reinstituirii tratamentului. Creterea reflecta dobndirea rezistenei specifice la medicamentele administrate. n general, dezvoltarea rezistenei la un medicament este considerata ca rezultat al unei rate nalte a mutaiilor celulelor maligne, consecina fiind apariia unor subpopu laii heterogene, din care unele sunt rezistente la diferite medicamente. Cea mai importanta mutanta este cea cu rezistena medicamentoasa multipla, mediata de glic oproteina P, o glicoproteina membranara, care funcioneaza ca o pompa de eflux, de

pendenta de energie. Pompa elimina activ din celula, o varietate de ageni citotox ici: alcaloizii din plante, antibioticele (dactinomicina, doxorubicina, daunorub icina) i unii ageni sintetici (melphalan). Celulele maligne mutante, care exprima gena codificatoare a glicoproteinei P, sunt rezistente la o larga varietate de m edicamente anticanceroase. Imunoterapia ncearca sa distruga celulele maligne, prin manipulari de stimulare a reactivitaii a sistemului imunitar. Injectarea citochinelor sau stimularea in vitro, cu IL-2, a limfocitelor autolog e, obinute din sngele pacientului, are efecte stimulatoare asupra raspunsului imun . Rareori s-a produs remisiunea completa a neuroblastomului, a carcinomului rena l sau a melanomului malign, ceea ce evideniaza ca raspunsul imun faa de aceste neo plazii poate fi stimulat. Fig. 134. Modelul unei celule maligne care exprima glico-proteina P, o proteina transmembranara care funcio-neaza ca o pompa de efluaturale sau artifi-ciale), du pa care sunt pompate la exteriorul celulei. Funcia glico-proteinei P poate fi inh ibata cx. Ea are situsuri acceptoare la care se leaga diferite medicamente anticanceroase (nompetitiv de ageni chimio-sensibilizatori ca verapamil. Cea mai obinuita forma de terapie imuna a neoplaziilor este utilizarea anticorpil or monoclonali (AMC) cu specificitate tumorala, cuplai cu toxine (toxina difteric a, toxina de ricin) sau cuplai cu ageni chimici (I131, medicamente citotoxice), ce suprima proliferarea celulara. In ansamblu, terapia cu AMC nu a reuit. Cele mai frecvente tumori (de colon, de sn, de plamn, de prostata) poarta antigene proteice intracelulare, inaccesibile AMC. Strategiile chimioterapeutice au progresat mul t i ofera mai multe anse de reuita, la un pre de cost inferior. n tratamentul limfoamelor celulelor B se folosesc AMC anti-idiotipici faa de imuno globulina membranara a limfomului. Stimularea nespecifica a esutului limfoid este o metoda terapeutica introdusa de G. Math. El a administrat BCG pentru terapia leucemiilor limfoblastice la copii. Remisiunile se prelungesc ca durata. Celulele de Corynebacterium parvum au efect e antitumorale, n asociere cu chimioterapia, iar celule de C. parvum i BCG injecta te direct n masa tumorii, inhiba creterea tumorii. Antigenele bacteriene stimuleaz a imunitatea mediata celular. Celulele limfoide sunt atrase n numar mare la locul injectarii i aciunea lor este orientata asupra celulelor tumorale. Macrofagele se activeaza la contactul cu antigenele bacteriene i dobndesc proprietai citotoxice f aa de celulele tumorale, evideniate in vitro. Interferonul ? (produs de leucocite) se utilizeaza n tratamentul unor leucemii i n tratamentul limfoamelor, dar este toxic, ceea ce impune limitarea dozei. Majorit atea pacienilor, dupa administrarea interferonului, fac un ?sindrom al starii gri pale?: febra, senzaie de frig, dureri de cap, dureri musculare. Aceste simptome d iminua pe parcursul terapiei i sunt controlate, parial, cu diferii ageni farmacologi ci. Imunoprofilaxia cu vaccinuri, pentru anumite virusuri, a avut succes la animale. Boala lui Marek, produsa de un herpesvirus, este o maladie limfoproliferativa l a puii de gaina. Incidena leucemiei felinelor a scazut, ca rezultat al unui progr am de vaccinare. Nu exista vaccinuri protectoare faa de neoplaziile umane.

p 8

p p

IMUNITATEA N TRANSPLANTUL DE ESUTURI I ORGANE

Chirurgia transplantului a depait dificultaile de ordin tehnic. Reuita transplantul ui depinde exclusiv de reactivitatea imunitara, care declaneaza un raspuns de res pingere. Ideia nlocuirii unui organ lezat, cu unul sanatos, a preocupat medicina din timpu ri foarte ndepartate. n mitologia greaca se vorbea de organisme himere, pastrate i astazi n reprezentarile sculpturale sub forma montrilor fabuloi, a caror origine su gereaza o tripla heterogrefa: leu-capra-coada de dragon sau leu-capra-arpe. Combi naia este interpretata ca o materializare pe plan abstract, a ideii de a asocia o rganisme foarte diferite. Sirenele (jumatate femeie-jumatate pete) i minotaurii (j umatate om, jumatate taur) exprimau ideia de asociere a acestor organisme foarte diferite. Perioada tiinifica a transplantului ncepe cu Alexis Carrel (medic american, care a lucrat n Frana, autorul lucrarii ?Omul ? fiina necunoscuta?), cel care a pus bazele cultivarii celulelor i esuturilor. In 1902, Carrel a facut grefe de rinichi la an imale. In 1906, a grefat plamni la pisica i a facut primul transplant de inima la cine, legnd inima de vasele regiunii cervicale. Animalul a trait 21 de ore. K. Landsteiner, unul din promotorii perioadei tiinifice, a descris grupele sanguin e i condiiile de compatibilitate majora ntre donor i receptor. In 1944, Medawar a co nchis ca respingerea grefelor de esuturi i organe are cauze imunitare, iar curnd du pa aceea, Billingham, Brent i Medawar au descris fenomenul de tolerana imunitara.

G. Math (hematolog francez) a creat himerele biologice. El a pornit de la ideia c a fenomenele de respingere a grefelor de esuturi i organe sunt datorate stimularii activitaii sistemului imunitar. In lucrarile sale experimentale, a recurs la met oda paralizarii reactivitaii imunitare. In acest scop, puii nou-nascui de obolan au fost supui iradierii totale, cu doza de 800 de razi. Rezultatul iradierii este d esfiinarea barierelor imunitare, adica anihilarea reactivitaii imunitare faa de gre fa. La animalele iradiate a inoculat cteva milioane de celule din maduva osoasa d e oarece. Autorul a creat astfel, himera biologica oarece-obolan (obolan cu elemente figurate sanguine de oarece). Himera este sensibila la infecia cu virusul leucemi ei oarecelui i face leucemia, n timp ce obolanii convenionali sunt rezisteni la infec cu acest virus. Himera biologica este orice organism dotat n mod artificial cu componente celular e, cu esuturi sau organe, care provin de la alte organisme. Ulterior, tehnicile d e inginerie genetica au creat molecule de ADN himere i chiar microorganisme himer e, ce poarta informaie genetica provenita de la doua specii diferite. n 1967, Christian Barnard a realizat primul transplant de cord la om. Denumirea de grefa, folosita curent pentru esutul implantat n organismul strain, v ine de cuvntul grecesc grafion, care desemneaza un instrument de scriere prin gra vura. Denumirea a fost ulterior folosita cu nelesul de altoi la plante. Denumirea de transplant a fost folosita de Paracelsus i nseamna a transfera, a muta.

Noiunea de transplant are un sens mai larg. Ea include fecundarea ovulului de cat re spermatozoid, ca transplant natural. Fatul este o alogrefa naturala, ce poart a informaia genetica de origine paterna, dar este protejat prin mecanisme cu aciun e placentara, de fenomenele de respingere. Terminologie.Terminologia moderna referitoare la grefa are trei origini: chirurg icala, imunologica i genetica. Uniformizarea ei a fost ceruta de OMS. Relaia genetica i antigenica ntre organismul donor i receptor Tipul de grefa (Denumire noua) Denumire veche Tipul de esut Identitate Autogrefa Grefa autologa (autohtona, autogena) esut autogenic Individul este att donor ct i receptor Identitate Singrefa (Homogrefa singenica) Izogrefa (Grefa izogena Grefa izologa) esut singenic (congenic) Organisme identice ale unei linii inbred. Pentru om, gemeni univitelini. Diferite Alogrefa (Homogrefa alogenica) Grefa homologa esut alogenic Allos = altul Organisme ale aceleiai specii dar cu variante alelice diferite. Foarte diferite Xenogrefa Heterogrefa (Grefa heterologa) esut xenogenic Xenos = strain Indivzii aparin unor specii diferite (cine - iepure). Autogrefele se practica cu o frecvena mare: n cazuri de arsuri, intervenii chirurgi cale estetice. Pielea dintr-o regiune a corpului este implantata ntr-o zona compr omisa. Alte denumiri se refera la particularitaile esutului transplantat: -> grefele homovitale se fac pentru asigurarea viabilitaii esutului transplantat -> grefele homostatice sunt acelea n care esutul grefat are rolul numai de suport structural, pe care se poate dezvolta esutul gazdei, pentru restabilirea arhitect urii iniiale. Astfel de grefe sunt lipsite de orice urma de esut antigenic, se pra ctica pentru a nlocui un fragment de vas sau de os.

Observaii

n raport cu locul de unde esutul a fost luat i locul unde se reimplanteaza, se dist ing grefe ortotopice (esutul grefat este aezat la receptor n aceiai poziie) i grefe h terotopice (esutul grefat este implantat n alt situs anatomic al organismului rece ptor). Dupa 1956, primul succes al grefei de rinichi ntre gemeni univitelini, transplant ul de organe a devenit o practica curenta. Interesul pentru transplant s-a depla

sat de la actul chirurgical, la aspectele imunologice. Argumente ale rolului reactivitaii imunitare n respingerea grefei Respingerea grefei este rezultatul activarii mecanismelor imunitare, datorita di ferenelor antigenice ntre moleculele CMH I i II ale donorului i receptorului. In fav oarea acestei afirmaii argumenteaza mai multe fapte de observaie: -> autogrefele i singrefele sunt acceptate totdeauna, daca sunt respectate condiii le de asepsie; -> grefa ntre indivizi diferii este respinsa cu att mai brutal, cu ct diferenele anti genice(biochimice) dintre moleculele CMH ale donorului i receptorului sunt mai ma ri;

D R A ---------------- A ----- O Grefa prinde. B ---------------- A ---- 0 Grefa este respinsa, pentru ca organismele difera p rin moleculele CMH. B --------------- AxB ---- O Grefa este acceptata. Capacitatea de a accepta o gr efa depinde de existena la organismul receptor, a tuturor genelor de histocompati bilitate ale donorului. Daca receptorul are un antigen suplimentar, grefa este a cceptata. AxB ----------- B ------ 0 Daca donorul poseda un antigen suplimentar faa de re ceptor, grefa este respinsa. -> din punct de vedere histologic, esutul grefat respins este infiltrat cu celule efectoare ale raspunsului imun: limfocite, macrofage, plasmocite; -> animalele timetomizate au o capacitate scazuta de respingere a grefelor de esu turi i organe, care se restabilete dupa grefarea timusului; -> debutul fenomenelor de respingere este foarte mult ntrziat, daca organismului r eceptor de grefa i se administreaza ser antilimfocitar (SAL); -> fenomenele de respingere sunt mai intense la copii, datorita abundenei esutului limfoid, dar sunt mult atenuate la batrni. Argumente indirecte n favoarea respingerii imunitare: -> organele grefate rapid dupa recoltare sunt suportate mult mai bine dect cele c are au fost pastrate o perioada mai lunga de timp n afara organismului. esutul tra nsplantat dupa o perioada de pastrare, conine mai multe celule lezate i lizate, di n care se elibereaza molecule nonself, care amplifica raspunsul imun;

-> conservarea n condiii optime marete gradul de tolerana faa de esutul grefat, iar p strarea neadecvata are efecte defavorabile; -> organele i esuturile sanatoase sunt tolerate mai bine dect cele care prezinta o stare de uzura biologica.

EVOLUIA RESPINGERII GREFEI DE PIELE

n raport cu dinamica desfaurarii, se disting trei modalitai de respingere a grefei de piele. Respingerea acuta sau hiperacuta este foarte rar ntlnita i se datoreaza incompatibi litaii totale ntre donor i receptor, care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul BO. In organismul receptor de grefa, exista anticorpi circulani preformai (aglutin inele ? i ?) faa de antigenele esutului transplantat. Lor li se adauga efectele ime diate produse de macrofagele i neutrofilele activate, de anafilatoxinele eliberat e din fixarea complementului. Vasele din organul grefat se obtureaza prin formar ea trombilor de coagulare. Grefa nu se vascularizeaza, ramne alba i n cteva ore este respinsa. Respingerea dupa dinamica raspunsului imun primar survine n cazul n care, ntre dono r i receptor este o incompatibilitate relativa. Grefa se vascularizeaza, dobndete o culoare normala (roza), dar dupa 10-12 zile, culoarea se nchide, devine purpurie , apar fenomene de respingere i grefa este eliminata. Respingerea dupa dinamica raspunsului imun secundar este de tip accelerat i are l oc la organismele la care grefa s-a repetat dupa o alta grefa cu esut de la acelai organism donor sau de la un organism al aceleiai linii inbred. Raspunsul este ac celerat, n sensul ca fenomenele de infiltraie cu macrofage, neutrofile i limfocite T sensibilizate, se produc foarte repede i n 3-4 zile, grefa este respinsa. Respingerea grefei de rinichi

Respingerea hiperacuta se produce foarte repede dupa ce s-au stabilit conexiunil e vasculare cu organul grefat i se datoreaza incompatibilitaii totale ntre donor i r eceptor, care nu aparin aceluiai grup sanguin n sistemul ABO. In primele ore dupa s tabilirea conexiunilor vasculare se produce ncetinirea fluxului sanguin, urmata d e o staza circulatorie n organul grefat. Rinichiul se ncarca cu o cantitate mare d e snge i dobndete culoarea roie, fenomen denumit hepatizare. Oprirea circulaiei sangu ne iniiaza procesul de coagulare la nivelul capilarelor sanguine. Cauzele respingerii hiperacute. In sngele organismului receptor se gasesc anticor pi preformai (aglutinine), specifici faa de antigenele din organul grefat. Antigen ele de grup sanguin n sistemul ABO se gasesc nu numai pe eritrocite, ci i pe celul ele endoteliale ale capilarelor sanguine. Aglutininele ? i ? ale receptorului de grefa ajung n rinichiul grefat imediat dupa realizarea anastomozelor vasculare. S e formeaza complexe antigen-anticorp care iniiaza fixarea complementului. Endotel iul capilar sufera mici leziuni, suficiente pentru a determina apariia suprafeelor rugoase, de care adera PMNN. La acest nivel, celulele endoteliale exprima selec tinele, prin intermediul carora leucocitele adera de endoteliu i parasesc circulai a. La nivelul suprafeei rugoase se acumuleaza trombocitele, care se agrega trepta t i mpreuna cu factorii plasmatici, formeaza trombi care obtureaza lumenul capilar . n 48 de ore, arteriolele i capilarele se trombozeaza. Respingerea hiperacuta este o reacie de activare endoteliala i grefa este respinsa ca o xenogrefa. Pentru a elimina anticorpii naturali, se practica plasmafereza sngelui receptorului i absorbia anticorpilor pe coloana. Complementul este eliminat prin administrarea veninului de cobra. Respingerea acuta se produce n doua variante dinamice: -> respingerea acuta precoce, n 10-14 zile de la transplantare -> respingerea acuta tardiva, n circa 4 luni.

Dupa grefarea esutului, o parte a antigenelor tisulare se elibereaza din rinichi i trec n circulaie, ajungnd n ganglionii limfatici regionali. Antigenele declanatoare ale respingerii grefei Moleculele CMH ale esutului grefat stimuleaza un raspuns imun intens al organismu lui receptor, a carui finalitate este respingerea grefei. Moleculele CMH I se ga sesc pe toate celulele nucleate, dar au un nivel variabil de exprimare. Molecule le CMH II au o distribuie limitata: pe macrofage, pe limfocitele B, pe unele celu le epiteliale i endoteliale, pe celulele dendritice. Nivelul de exprimare a molec ulelor CMH I i II este modulat de citochine (IFN ? i TNF ?). Polimorfismul extensi v al moleculelor CMH limiteaza posibilitatea transplantului numai ntre parteneri compatibili CMH. Chiar n aceste condiii, grefa poate fi respinsa, datorita diferene lor ntre antigenele minore ale donorului i receptorului. Antigenele din grefa au urmatoarele origini: -> antigenele libere (antigene ?solubile?) provin din liza eritrocitelor i din me mbrana bazala; -> antigenele CMH exprimate pe celulele dendritice existente n esutul grefat; -> antigene CMH asociate membranelor rezultate din liza celulelor organului, n pe rioada de conservare. Antigenele CMH ale donorului pot fi recunoscute pe suprafaa celulelor prezentatoa re (prezentare directa) sau ca fragmente prelucrate i asociate cu moleculele CMH ale receptorului (prezentare indirecta). Antigenele eliberate din grefa, ajung n ganglionii regionali ai gazdei i activeaza limfocitele T i B. Cele mai importante antigene aduse de organul grefat, cu rol esenial n declanarea conflictului imun, sunt moleculele CMH I i II. Un rol deosebit se atribuie celulelor dendritice din esutul grefat. Ele exprima molecule CMH II l a densitate foarte nalta, care determina stimularea iniiala a limfocitelor gazdei. Moleculele CMH I i II libere se comporta ca antigene tari, intens imunogene i nu n ecesita prezentarea n asociaie cu moleculele CMH proprii organismului, pentru a st imula limfocitele T, dar sunt mult mai imunogene daca sunt prezentate de alte ce lule, n special de celulele dendritice i de celulele endoteliale. Raspunsul imun faa de esutul grefat este mediat n primul rnd de limfocitele T. Ca do vada, oarecii atimici (nuzi) nu resping grefele alogenice de piele i tolereaza chi ar grefe xenogenice. La examenul histologic al unei grefe de piele, n cursul respingerii, se observa i nfiltratul cu mononucleare, multe fiind limfocite. Acumularea lor n esutul grefat precede respingerea, care survine n cteva zile. In organul grefat, raportul dintre limfocitele TCD4 i TCD8 este 1/3, adica predomina net limfocitele Tc, iar n mod n ormal, acest raport este 2/1. Limfocitele T stimulate de antigenele CMH sintetizeaza interferon ?, activator a l macofagelor din focarul conflictului. Macrofagele devin citotoxice faa de esutul grefat, ca i limfocitele Tc. Macrofagele secreta IL-1, care produce febra ce nsoete reacia de respingere a grefei . Limfocitele patrunse n esutul grefat sunt pasagere. Ele parasesc grefa, trec n li mfa i ajung n ganglioni, unde ncepe proliferarea, elibereaza citochine, care active aza limfocitele ganglionare. Acestea devin limfocite efectoare.

Celulele NK nu necesita activarea prealabila pentru a liza diferite celule tumor ale. Ele sunt implicate n respingerea alogrefelor de organe. Capacitatea de a respinge grefa poate fi uor transferata prin intermediul limfoci telor de la organismul imunizat prin contactul anterior cu antigenele grefei. Su rprinzator, n esutul grefat nu migreaza limfocitele transferate, ci migreaza limfo citele organismului gazda, activate de IL secretate de limfocitele transferate. Rolul anticorpilor. Ca raspuns faa de antigenele esutului grefat, se sintetizeaza anticorpi specifici faa de antigenele de transplantare. Anticorpii au rol secunda r n reacia de respingere a grefelor de esuturi i organe. Anticorpii au rol foarte im portant n respingerea grefei, n situaiile n care, anticorpii anti-CMH preexista la u n titru crescut n momentul transplantarii. Sinteza lor este indusa de sarcinile m ultiple, de transfuzii repetate sau de o grefa anterioara. Grefa este respinsa i mediat. Anticorpii au rol important n respingerea grefelor cu incompatibilitate grava ntre donor i receptor, deoarece fixeaza complementul i produc fenomenul de citoliza. D aca nu fixeaza complementul, anticorpii au rol de opsonine, adica sensibilizeaza celulele grefate faa de aciunea macrofagelor i neutrofilelor. Anticorpii sintetizai n esutul grefat, determina eliberarea mediatorilor reaciei de hipersensibilitate i mediata (de exemplu, histamina), care produc modificari circulatorii n vasele gre fei. Anticorpii faa de antigenele eritrocitare sunt singurii efectori imunitari eficie ni n transfuzia incompatibila. Efectul lor consta n aglutinarea i liza eritrocitelor . Dupa grefarea unui organ sanatos ntr-un organism uzat, din punct de vedere funcion al, organul grefat se aliniaza repede la starea generala de uzura a gazdei. Transplantarea maduvei osoase se realizeaza pentru tratamentul pacienilor cu mala dii imunodeficitare, anemie aplazica severa, leucemie, limfom, iar mai recent, p entru dezordinile hematopoetice cu substrat genetic. La pacienii imunodeficitari, transplantul maduvei osoase este destinat sa furnize ze celule stem pentru a restabili sistemul imunitar al receptorului, fara sa nloc uiasca n mod necesar compartimentul mieloid. Datorita starii nefuncionale a sistem ului imunitar, transplantul maduvei osoase poate fi facut fara tratamentul imuno supresor al gazdei.

Maduva este recoltata prin aspiraie din crestele iliace anterioare i posterioare, de la donorul anesteziat. Amestecul de maduva osoasa i snge este plasat n mediu de cultivare cu heparina, ntr-o punga hematologica i se administreaza fara ntrziere org anismului receptor, prin infuzie intravenoasa, n cantitatea de 2 x 108 - 6 x 108 celule medulare/kg. Infuzia se face la 1-24 ore dupa ultima iradiere totala a co rpului sau la 36 de ore dupa ultima doza de ciclofosfamida. Celulele stem circul a n snge, nsamneaza cavitatea medulara i ncep sa se divida. n 2-4 saptamni, crete celulara a maduvei i n acelai timp crete numarul celulelor sanguine periferice. La d onor, maduva se reface repede. Prevenirea respingerii grefelor de organe este posibila printr-o mperechere ct mai adecvata a donorului i receptorului din punctul de vedere al asemanarii molecule lor CMH i, ulterior, prin instituirea tratamentului imunosupresor. Dar, spre deos ebire de alte celule, cele din maduva osoasa sunt foarte antigenice (au o mare d ensitate a moleculelor CMH I) i din aceasta cauza, receptorul trebuie sa fie supu s unui tratament radio-chimioterapeutic intens, pna la limita suportabilitaii, pen tru ca transplantul de maduva sa aiba succes. Chiar astfel, la pacienii leucemici , respingerea maduvei osoase poate sa aiba loc, n cazul unei mperecheri antigenice neadecvate.

Transplantul de maduva osoasa ridica o problema speciala: celulele transplantate fiind imunocompetente, pot sa iniieze reacia ?grefa contra gazda?, faa de antigene le receptorului. Reacia este iniiata faa de antigenele tegumentare, ale ficatului i intestinului i este letala la 10-15% dintre receptorii de maduva osoasa cu molecu le HLA identice i la 40% dintre receptorii cu molecule HLA neidentice. Teste de histocompatibilitate n transplantul de esuturi i organe, eseniala este asemanarea ct mai accentuata a mole culelor CMH ale donorului i receptorului. Pentru testul gradului de asemanare, se analizeaza comportamentul limfocitelor celor doi parteneri, n amestec (reacia de amestec limfocitar, RAL). Testul evideniaza diferenele antigenice dintre donor i re ceptor, n ceea ce privete moleculele CMH II. Pentru reuita grefei, este obligatorie identitatea acestor molecule. Perechea donor-receptor care produce cel mai uor r aspuns n RAL, ofera cea mai buna ansa de acceptare a grefei. Cel mai adesea se folosesc limfocitele din snge. Celulele trebuie sa fie viabile i n mediu se adauga ser de viel (1-10%) i 2-mercaptoetanol. Limfocitele donorului se cultiva n amestec cu limfocitele receptorului, n prezena timidinei H3. Se masoara nivelul radioactivitaii limfocitelor, consecutiv ncorporarii timidinei H3 pentru s inteza ADN. RAL reflecta raspunsul proliferativ al celulelor T, cu puine sau fara celule B. Transformarea blastica nu se produce n RAL a gemenilor monozigoi. Intrun amestec celular a x b + a x c, raspunsul este bidirecional. Cea mai ampla reaci e are loc ntre limfocitele care se deosebesc prin moleculele CMH. Cel mai puterni c stimul n RAL l reprezinta aloantigenele CMH II, cu un polimorfism foarte nalt, ia r aloantigenele clasa I au un rol stimulator limitat. Moleculele CMH II se gases c pe limfocitele B, pe macrofage, pe celulele dendritice, iar pe limfocitele T, numai dupa activare. Se pare ca raspunsul n RAL nu este orientat faa de epitopii C MH propriu-zii, ci faa de o larga varietate de peptide self legate de moleculele C MH, rezultate probabil prin degradarea diferitelor proteine celulare. Dat fiind polimorfismul deosebit al moleculelor CMH, probabil ca marea majoritate a limfoc itelor T din amestec manifesta aloreactivitate faa de cel puin unul din aloantigen ele CMH ale speciei. Pentru raspunsul unidirecional, una din cele doua populaii celulare (de obicei a d onorului) se inactiveaza prin tratament cu mitomicina C (pentru inhibiia sintezei ADN) sau se supun iradierii. Tratamentul inactiveaza celulele T, dar nu interfera cu imunogenitatea lor. In R AL se activeaza numai limfocitele receptorului de grefa, ca raspuns la aloantige nele donorului. n cazul grefei unui organ imunocompetent la o gazda imunodeficitara, n RAL se inac tiveaza limfocitele receptorului, pentru a evalua reactivitatea limfocitelor don orului, care ar putea iniia o reacie grefa contra gazda. Compatibilitatea donor-receptor pentru antigenele CMH I se testeaza cu seruri im une anti- CMH I. Se analizeaza reacia limfocitelor celor doi parteneri, faa de un numar ct mai mare de seruri anti CMH I. In laboratorul de profil exista seturi de seruri anti-CMH I, recoltate de la persoane care au o bogata experiena antigenic a HLA: -> persoane care suferit transfuzii sanguine multiple i astfel s-au imunizat faa d e antigenele HLA; -> femei multipare, care au avut sarcini multiple cu parteneri diferii. Serurile anti-CMH se pun n contact cu limfocitele donorului i cu ale receptorului de grefa. Anticorpii anti-CMH se fixeaza pe suprafaa limfocitelor i astfel este in

iiata transformarea blastica. Se determina un coeficient de reactivitate (coefici ent de transformare blastica), pe baza numarului de limfocite transformate. Daca limfocitele donorului i receptorului se comporta asemanator faa de un numar m are de seruri, concluzia este ca cele doua populaii de limfocite sunt asemanatoar e. Daca titrul anticorpilor anti-CMH n ser este crescut, se poate produce nu numai a ctivarea limfocitelor, ci chiar aglutinarea imuna sau, dupa fixarea complementul ui, citoliza. Xenotransplantarea Termenul semnifica transplantul de esuturi i organe ntre organismele unor specii di ferite. Interesul clinic pentru xenotransplantare a fost determinat de lipsa org anelor umane. Succesul alotransplantului a creat un necesar care depaete disponibi lul. In 1963, transplantul de rinichi de cimpanzeu la om, a prelungit supravieuir ea cu 9 luni i moartea a survenit dupa complicaiile provocate de imunosupresie. In 1984, inima de babuin a fost transplantata la om. A urmat transplantul de ficat de maimua, transplantul de celule neurale de embrion de porc, la un pacient cu b oala Parkinson, transplantul de maduva osoasa de la babuin, la un pacient cu SID A. Barierele xenotransplantarii sunt multiple: unele organe de la alte specii nu fu ncioneaza adecvat n noul mediu. Rinichiul de cimpanzeu este funcional n organismul u man. Persoanele transplantate cu rinichi de porc devin anemice, probabil pentru ca eritropoetina nu este activa, iar cele cu ficat de babuin au nivele mai mici de colesterol (echivalente cu cele de babuin) i nivele foarte scazute de acid uri c (pentru ca ficatul de babuin nu produce acid uric). Grefarea celulelor sanguin e stem xenogenice este limitata de absena factorului de cretere specific celulelor stem transplantate. Xenogrefele pot fi neconcordante (de la porc) sau concordante (de la cimpanzeu, babuin). La perechile neconcordante, titrul anticorpilor preformai este detectabi l i xenogrefele sunt respinse hiperacut (n cteva minute), prin reacia de activare a endoteliului. Pentru respingerea hiperacuta a grefelor neconcordante, un alt fac tor critic (alaturi de anticorpii preformai) al producerii leziunilor endoteliale este complementul i proteinele sale reglatoare. In combinaia porc-om, anticorpii preformai se leaga la nivelul determinanilor antigenici de galactoza ? (1,3)-galac toza ai endoteliului grefei, deoarece omul a pierdut gena pentru enzima alfa-gal actozil-transferaza i nu poseda acest epitop. Activarea complementului se face pe calea clasica, iar n absena anticorpilor preformai, pe calea alterna. In esena, res pingerea hiperacuta se datoreaza reaciei endoteliale la activarea complementului, mediata de anticorpii preformai (IgG anti-?-gal). Incompatibilitatea combinaiei porc-om se datoreaza faptului ca porcul exprima un nou antigen de grup sanguin, ?-gal(gal-? 1,3-gal) (la om, specificitatea antigen ica a grupului 0 este conferita de L-fucoza, a grupuluiA, de N-acetil-galactozam ina, galactoza i L-fucoza, iar a grupului B, de D-galactoza i L-fucoza). ?-gal nu este singurul determinant recunoscut de anticorpii naturali umani. Alte heteroan tigene pot deveni importante, dupa transplantul organului. Anticorpii xenoreacti vi, specifici faa de epitopii ? 1,3-gal i complementul sunt factorii majori ai res pingerii hiperacute. inta respingerii hiperacute este endoteliul vascular. Activarea endoteliului prod uce cele mai evidente manifestari ale respingerii hiperacute: tromboza intravasc ulara, hemoragia extravasculara i edemul. n asocierile concordante, titrul anticorpilor preformai nu este detectabil i respin erea este acuta, datorita aceluiai fenomen de activare a endoteliului vascular.

Respingerea ntrziata (acuta) a xenogrefelor concordante se face n 2-3 zile (mult ma i repede dect a alogrefelor). Din punct de vedere histologic, respingerea acuta r eleva mai puina hemoragie, dar cu tromboza intravasculara semnificativa, ca i n rea cia hiperacuta, deoarece inta este endoteliul vascular. Respingerea acuta a xenogr efei se datoreaza anticorpilor a caror sinteza este indusa de antigenele xenogre fei. Se sintetizeaza preponderent IgG anti-?-gal, al caror titru crete rapid. Progresul n xenotransplantare s-a facut n sensul prevenirii respingerii hiperacute : imunosupresia receptorului de grefa i ingineria genica a donorului pentru a eli mina marile diferene antigenice dintre xenogrefe i alogrefe. La oarece s-a reuit eli minarea genei galactozil-transferazei prin recombinare homologa, dar tehnologia nu este adecvata pentru alte specii. Eliminarea antigenului ?-gal, expune un nou determinant glucidic, faa de care omul are un nivel scazut de anticorpi preformai . Imunosupresia Variantele alelice multiple codificatoare ale moleculelor CMH fac cu totul impro babila posibilitatea ca doua organisme sa fie identice pentru moleculele CMH, cu excepia gemenilor monozigoi. Natura determinismului genetic al moleculelor CMH nu este favorabila transplantului de esuturi i organe. Amplitudinea procesului de re spingere a grefei este parial dependenta de gradul de incompatibilitate al antige nelor CMH, dintre donor i receptor. Scopul imunosupresiei selective este de a menine funcionalitatea mecanismelor de a parare a organismului, faa de infeciile virale, bacteriene, fungice i faa de parazii, de a pastra capacitatea SFM de a fagocita celulele mbatrnite i de a proteja mecani smele de imunosupraveghere care elimina celulele maligne. Pe de alta parte, se u rmarete inducerea starii de tolerana faa de antigenele organului grefat (rinichi, f icat, inima). n cazul maladiilor autoimune, dezideratul imunosupesiei este inhibii a selectiva a reactivitaii imunitare autoagresive faa de antigenele retinei (n uvei ta)sau faa de antigenele colonului (n boala Crohn). Un medicament imunosupresor trebuie sa ntruneasca urmatoarele criterii: -> sa inhibe activarea raspunsului imun i sa fie eficient faa de procesele imunita re n curs de desfaurare; -> sa aiba aciune selectiva, adica sa produca deleia clonala sau sa inactiveze num ai anumite subpopulaii de celule imunocompetente; -> sa aiba un index terapeutic bun, adica un raport favorabil ntre doza terapeuti ca i cea toxica. Pentru supravieuirea grefei, transfuziile de snge cu specificitatea antigenica a d onorului sau transfuziile nespecifice, ca i testele de histocompatibilitate sunt importante numai daca se asociaza cu imunosupresia, cu scopul diminuarii reactiv itaii imunitare. Terapia imunosupresoare este foarte complexa, pentru ca nici un agent chimic nu are aciune strict selectiva asupra esutului limfoid. Imunosupresia se realizeaza prin: -> iradierea x -> terapia imunosupresoare -> metode imunologice. Terapia imunosupresoare. Medicamentele imunosupresoare inhiba nespecific reactiv itatea imunitara i se administreaza att dupa grefa tisulara, ct i pacienilor cu malad

ii reumatice, caracterizate prin reactivitate imunitara excesiva. Imunosupresia s-a realizat cu o varietate de ageni terapeutici: hormoni corticost eroizi, medicamente citotoxice. Cele mai multe metode convenionale de imunosupres ie i realizeaza efectul n mod neselectiv. Medicamentele citotoxice au fost iniial folosite n tratamentul neoplaziilor, dar r eprezinta o modalitate importanta de imunosupresie pentru tratamentul maladiilor autoimune. Chimioterapia administrata pacienilor neoplazici produce, uneori, o imunosupresie profunda. Medicamentele citotoxice sunt imunosupresoare deoarece distrug celule le imunocompetente sau blocheaza proliferarea lor. Agenii citotoxici folosii pentru imunosupresie(dar i n tratamentul neoplaziilor) sun t: -> ageni alchilani -> antimetabolii: analogi ai purinelor (6-mercaptopurina i azatioprina); analogi p irimidinici (citozin-arabinozida); -> antagonitii acidului folic (methotrexatul). Ciclofosfamida este compusul prototip al agenilor alchilani. Aciunea sa este nespec ifica, asupra tuturor subpopulaiilor de limfocite i a celulelor nelimfoide care in tra n faza S. Agenii din categoriile menionate, au aciune nespecifica, adica aciunea lor nu este l imitata la celulele imunocompetente. Ei produc leziuni asupra tuturor celulelor aflate n mitoza, inclusiv asupra celulelor hematopoetice. Respingerea grefei poat e fi blocata, dar aciunea neselectiva a acestor ageni produce efecte secundare tox ice prea severe i rezultatele au fost considerate ca nesatisfacatoare. Ciclosporina este un peptid ciclic lipofil, izolat din culturi de microorganisme i acioneaza specific asupra limfocitelor, inhibnd transcrierea genica pe o cale de pendenta de Ca, adica blocheaza progresia ciclului celular de la G0 la G1. Este un agent imunosupresor mai selectiv, deoarece acioneaza asupra celulelor Th, fara efecte notabile asupra altor subpopulaii de limfocite T, asupra limfocitelor B, granulocitelor sau macrofagelor. Efectul major pare a fi inhibiia sintezei IL-2. Imunosupresia cu ciclosporina este o modalitate imunofarmacologica, datorita aciu nii sale selective faa de celulele imunocompetente.

n ultimii ani s-au identificat civa compui chimici naturali, izolai ca i ciclosporina din culturi de microorganisme: tacrolimus, sirolimus (rapamycin), mizoribine i s pergualin. Tacrolimus este o lactona macrociclica lipofila, cu mecanism de aciune asemanator cu al ciclosporinei. Sirolimus este un macrolid care inhiba proliferarea celule lor T, prin blocarea trecerii de la faza G1 la faza S. Imunosupresorul ideal va media inducerea toleranei, n special n transplant, adica v a permite sistemului imunitar sa adopte ca self, moleculele CMH specifice esutulu i grefat. Radiaia ionizanta x i gama produce ionizarea atomilor i genereaza radicali liberi, n special radicalul OH., foarte reactiv, principalul agent ce mediaza moartea cel ulelor iradiate. Efectele radiaiilor ionizante sunt dependente de doza. Celulele stem i celulele imature sunt foarte sensibile. Limfocitele T sunt mai rezistente dect limfocitele B, iar monocitele i macrofagele sunt relativ rezistente.

Corticosteroizii sunt cele mai folosite medicamente, cu efect inhibitor asupra r aspunsului imun, dar i al proceselor inflamatorii. S-a propus mecanismul limfoliz ei, dar la om acest efect nu se produce. Timp de 4-6 ore dupa administrare, cort icosteroizii reduc numarul de leucocite circulante (limfocite, monocite, eozinof ile), dar crete semnificativ numarul neutrofilelor. Valorile leucocitelor revin l a normal n 24 de ore. Limfocitele T, precum i monocitele parasesc circulaia i migrea za n maduva osoasa, iar limfocitele B sunt relativ rezistente la corticosteroizi. Eozinopenia, dupa injectarea corticosteroizilor, explica efectele benefice ale acestor hormoni la persoanele alergice. Serul antilimfocitar (SAL) i globulina antitimocitara se obin prin injectarea limf ocitelor, respectiv a timocitelor, la o specie xenogena. Se folosesc celulele du ctului toracic sau timocitele pentru imunizarea iepurelui sau calului. Din serul heterolog se separa fracia imunoglobulinica, ce se administreaza intravenos pent ru depairea unei stari critice dupa grefare. Anticorpii policlonali din SAL au fost nlocuii cu AMC specifici faa de antigene cel ulare de suprafaa: AMC anti-receptor de IL-2 i anti CD4. Deoarece citochinele sunt molecule foarte importante n reacia imunitara, s-a ncerca t neutralizarea lor cu receptori solubili. Deleia specifica a populaiilor de limfocite este posibila cu preparatele denumite imunotoxine. Acestea sunt complexe ce constau din doua componente: un anticorp m onoclonal care asigura recunoaterea specifica a intei celulare i o componenta toxi ca (ricina, toxina difterica).

p 8 p p

Interaciunile sistemului imunitar cu sistemul neuroendocrin

Sistemele imunitar, nervos i endocrin sunt interconectate structural (anatomic) i funcional, ceea ce a condus la conturarea unor noi domenii interdisciplinare, ca neuroimunoendocrinologia, neuroimuno-modularea i psihoneuroimunologia. Sistemele enumerate au n comun capacitatea de raspuns la un numar de stimuli comuni (hormon i steroizi, citochine, neuropeptide), care furnizeaza baza moleculara a integrar ii bidirecionale. Starea psihica influeneaza reactivitatea imunitara i intensitatea raspunsului inflamator a organismului. Exista dovezi certe ca anomaliile neuroe ndocrine au rol important n inducerea disfunciilor imunitare, materializate, n prim ul rnd, n manifestarile autoimune. Pe de alta parte, vrsta, genul i ali factori genet ici regleaza interaciunile imuno-neuroendocrine. Cele mai pregnante interaciuni neuroendocrinoimunitare se produc n starea de stres s. Stressul este definit ca o condiie dinamica n cursul careia homeostazia normala

(starea de echilibru a mediului intern) este perturbata sau periclitata. Starea de dezechilibru este indusa de factori de stress, fizici sau psihologici. Facto rii de stress, fizici sau mentali, declaneaza un raspuns complex adaptativ, denum it raspunsul de stress sau de alarma, menit sa contracareze efectele factorului de stress. Intensitatea raspunsului adaptativ este dependenta de vrsta, gen, star ea hormonala i de ali factori genetici. Fig. 135. Interaciuni neuro-endocrino-imunitare. Stressul presupune n primul rnd, modificarea unor componente mentale i comportament ale. Crete brusc activitatea sistemului nervos central ce controleaza starea de v eghe, alerta, starea psihica, atenia, concentrarea ateniei i este inhibata activita tea vegetativa care controleaza hranirea i reproducerea. In raspunsul la stress s e produc modificari fizice ale sistemului circulator, care redirecioneaza nutrieni i spre organele activate. O reactivitate prea mare sau prea mica la stress poate produce sau poate contribui indirect la manifestari patologice. Raspunsul la factorii de stress este mediat de factorul (hormonul) de eliberare a corticotropinei (CRH), de axa hipotalamo-hipofizo-corticosu-prarenala i de sist emul nervos simpatic. CRH este produs n primul rnd n hipotalamus, dar i n alte arii a le creierului i n sistemul nervos periferic i are urmatoarele funcii: - controleaza starea de veghe, starea psihica i integreaza sistemele de raspuns l a stress; - activeaza axa hipofizo-corticosuprarenala, stimulnd secreia ACTH i a corticostero izilor; - activeaza sistemul nervos simpatic, cu stimularea epinefrinei i norepinefrinei. CRH este activatorul starii de alarma, manifestata prin creterea glicemiei, a rit mului cardiac, a tensiunii arteriale, dar inhiba funcia imunitara i raspunsul infl amator. Efectul activator al CRH asupra sistemului nervos simpatic este mediat d e locus ceruleus, care i proiecteaza axonii n trunchiul cerebral i n hipotalamus, cee a ce contribuie direct la eliberarea mediatorilor simpatici (epinefrina i norepin efrina) n arii foarte largi ale SNC. Activarea sistemului nervos simpatic stimule aza eliberarea CRH din neuronii nucleilor paraventriculari sub aciunea impulsuril or cu originea n locus ceruleus. Sistemul de raspuns la stress funcioneaza ca o bucla feedback pozitiva, bidirecion ala. Activarea unui component al sistemului, activeaza pe celalalt. Serotonina i acetilcolina activeaza raspunsul la factorii de stress, iar MSH (hormonul stimul ator al melanocitelor) i acidul gama aminobutiric sunt inhibitori. Corticosteroizii sunt componentele majore ale sistemului de raspuns la stress i i nhiba cele doua componente majore ale raspunsului (secreia CRH i sistemul nervos v egetativ), dar i reactivitatea imunitara i raspunsul inflamator. Raspunsul activator la stress influeneaza axa hipotalamo-hipofizara cu componente le ei: hipotalamus-hipofiza-tiroida (HHT) i respectiv, hipotalamo-hipofizo-gonada la (HHG). Chiar daca stressul acut stimuleaza secreia hipofizara a hormonului de cretere, st ressul cronic, prin intermediul CRH, stimuleaza secreia hipofizara a somatostatin ei (inhibitor al creterii). Somatostatina, a carei secreie este stimulata de CRH, inhiba secreia de TSH, iar glucocorticoizii inhiba conversia tiroxinei, relativ i nactiva, la triiodotiroxina. Aceste raspunsuri sunt adaptative i se coreleaza cu necesitatea limitarii pierderii energiei. Activarea raspunsului la stress inhiba axa HHG, la mai multe nivele. CRH inhiba sinteza factorului eliberator al hormonului luteinizant din nucleul arcuat hipot

alamic, fie direct, fie prin intermediul corticosteroizilor. Corticosteroizii in hiba secreia hormonului luteinizant (LH) hipofizar i concomitent, producia hormonil or gonadali: estrogeni, progesterona, testosteronul. Hormonii tiroidieni i sexosteroizi influeneaza activitatea axei hipotalamo-hipofiz o-corticosuprarenale (HHC). Hipotiroidismul inhiba axa HHC. La organismele de se x feminin (oarece, obolan, om), axa HHC este mai activa dect la masculi, adica stre ssul induce un raspuns mai amplu, masurabil prin nivelul mai nalt al corticostero izilor. Ovarectomia diminua eliberarea corticosteroizilor, iar orhiectomia marete rata sintezei corticosteroizilor la stress. Raspunsul integrat neuro-imuno-endocrin este mediat nu numai de hormoni, ci i de interleuchine, cele mai cunoscute fiind IL-1 i IL-6. IL-1 activeaza axa hipotalamo-hipofizo-corticosuprarenala, stimulnd eliberarea AC TH hipofizar, iar sinteza ei este inhibata de glucocorticoizi. Endotoxinele stim uleaza producerea IL-1 n hipofiza i astfel secreia ACTH este reglata local, n hipofi za. IL-1 este sintetizata local, n arii discrete ale SNC (hipotalamus, hipocamp). Ace ste arii regleaza raspunsul la stress. Rolul corticosteroizilor n reglarea funciei imunitare Asemanarea dintre hormoni i imunoglobuline rezulta din similitudinea structurala i funcionala a celor doua categorii de molecule: ambele conin o regiune de legare l a un receptor celular i o secvena cu rolul de a transmite semnale specifice la un sistem efector. Exista dovezi ca moleculele CMH I, implicate n prezentarea antigenelor, au rol de receptor pentru insulina.

Corticosteroizii regleaza toate componentele raspunsului imunitar i inflamator, c hiar i creterea i diferenierea timocitelor. Nivelul corticosteroizilor crete ntr-un i terval de ordinul minutelor, dupa expunerea la factorul de stress. Rolul lor est e de a limita extensia raspunsului i a procesului inflamator. Amplitudinea lor pr ea mare poate sa produca leziuni, inclusiv maladii autoimune. Administrarea corticosteroizilor, la rozatoare, produce moartea apoptotica a lim focitelor timice. Limfocitele T mature (periferice) umane sunt rezistente la cor ticosteroizi, dar cele timice sunt sensibile. Creterea nivelului plasmatic al cor ticosteroizilor, produsa de stress, induce apoptoza timocitelor. Corticosteroizii par a fi implicai n selecia timocitelor cu specificitate faa de ant igenele nonself. Concepia dominanta presupune ca timocitele sunt selectate pentru apoptoza sau supravieuire, n funcie de capacitatea lor de a se asocia cu moleculel e CMH. Timocitele cu receptori (RCT) de mare afinitate pentru moleculele CMH, su nt potenial generatoare ale maladiilor autoimune i sufera moartea apoptotica. Cele cu receptori de mica afinitate pentru moleculele CMH mor de asemenea prin apopt oza, sub aciunea corticosteroizilor. Supravieuiesc numai timocitele cu receptori d e aviditate medie pentru moleculele CMH. Selecia limfocitelor n timus este control ata de hormonii sintetizai local. Astfel, timusul exprima activitai neuroendocrine multiple, inclusiv sinteza CRH i ACTH. CRH stimuleaza secreia ACTH, iar ACTH indu ce producerea corticosteroizilor n celulele corticosuprarenalelor. Sinteza neurop eptidelor (CRH) n timus este deosebit de interesanta, avnd n vedere rezultatele car e susin ca celulele timice epiteliale conin enzime steroidogene i sintetizeaza cort icosteroizi, n special n perioada fetala i neonatala. Astfel, timusul poate sa sint etizeze toi hormonii produi prin activarea axei HHC. Corticosteroizii regleaza dezvoltarea subpopulaiilor Th1 i Th2 de limfocite, inhibn

d sinteza citochinelor Th1 (IL-2, IFN ?). Rolul sexosteroizilor Hormonii steroizi sexuali influeneaza maturarea i diferenierea timocitelor. Timusul sufera modificari profunde n timpul sarcinii, dupa gonadectomie sau dupa adminis trarea exogena a hormonilor sexuali. Dupa gonadectomie, masa timusului crete, iar administrarea hormonilor sexuali (estrogen, testosteron) are efecte inverse.

Factorul hipotalamic de eliberare a hormonului luteinizant (RFLH), regleaza att f uncia de reproducere, ct i funcia imunitara. Acest hormon se sintetizeaza nu numai n creier, ci i n gonade, n glandele mamare, n placenta, splina i timus, avnd rol integr tor al funciei neuro-endocrine reproducatoare i al funciei imunitare. In timus, lim focitele T sintetizeaza RFLH i au receptori specifici pentru acest hormon. Îmbatrnirea sistemului imunitar, la om, ncepe dupa 30 de ani i se caracterize aza prin creterea produciei de autoanticorpi i diminuarea capacitaii de a produce an ticorpi faa de antigenele nonself. Diminua sinteza IL-2, dar crete rata sintezei I L-4, IL-5 i IL-6. Aceste schimbari sugereaza o cretere numerica a subpopulaiei de l imfocite Th2, n raport cu subpopulaia Th1. Diminua funcia citotoxica. Crete nivelul plasmatic al IL-6, cu rol reglator al sintezei anticorpilor, dar i cu rol n progre sia maladiilor autoimune sau a altor procese patologice, ca osteoporoza. Un rol important n procesul de mbatrnire se atribuie dehidroepiandrosteronului (DHE A), secretat de corticosuprarenale, sub controlul ACTH. Este un intermediar al b iosintezei altor hormoni (testosteronul i estradiolul). DHEA circula n forma inact iva, de sulfat. Hormonul se activeaza numai n esuturile care au DHEA-sulfataza, cu distribuie difereniala n organele limfoide. Nivelul plasmatic al sulfatazei scade odata cu mbatrnirea sistemului imunitar i scade brusc n diferite boli cronice, inclu siv maladiile autoimune. Administrarea DHEA la rozatoare i om, restabilete funcia i munitara la organismele vrstnice i are efect antagonic corticosteroizilor, care pr oduc atrofia timica. Fig. 136. Organele i celulele influenate de hor-monii steroizi sexuali. Aceti hormo ni pot aciona n timpul dezvoltarii celulelor imunitare, dar i direct asupra celulel or mature efectoare. Hormonul de cretere, prolactina i hormonul tiroidian stimuleaza maturarea i difereni erea timocitelor. Hipofizectomia sau hiposecreia acestor hormoni hipofizari duce la imunodeficiena i hipoplazia timusului. Hormonul de cretere stimuleaza intens pro liferarea celulelor precursoare ale timocitelor n maduva osoasa. Prolactina stimu leaza diferenierea celulelor T cu specificitate de antigen n organele limfoide per iferice. Hormonul tiroidian stimuleaza creterea timusului i a splinei. oarecii hipo tiroidieni au timus i splina hipoplazica, numar redus de celule TCD8. Interaciunile neuro-imuno-endocrine sunt bidirecionale. esuturile i celulele sistemu lui imunitar sintetizeaza un spectru larg de hormoni neuro-endocrini. Foarte imp ortanta este sinteza CRH, un reglator esenial al raspunsului la stress, n timus, s plina, hipofiza anterioara, corticosuprarenale, ovar, testicul, intestin, inima, plamn. In timus i splina, CRH este sintetizat de celulele T, unde exercita efecte reglatoare autocrine sau paracrine. CRH este de asemenea sintetizat local n foca rele inflamatorii acute sau cronice, inclusiv n lichidul sinovial al pacienilor cu artrita reumatoida. Factori neuroendocrini favorizani ai maladiilor autoimune umane Diferenele funcionale cu privire la intensitatea raspunsului axelor hipotalamo-hi pofizo-corticosuprarenaliene (HHC) i hipotalamo-hipofizo-gonadale (HHG) sunt impo rtante pentru nelegerea manifestarilor autoimune. Maladiile autoimune sunt mult ma i frecvente la femei dect la barbai. De exemplu, raportul pe sexe al tiroiditei au toimune este de 19/1, al lupusului de 9/1, iar al artritei reumatoide, de 3-4/1.

Mai mult, maladiile autoimune tind sa se dezvolte, sa aiba intensitate maxima o ri sa diminue, n perioadele de schimbare a activitaii axei HHG (pubertate, menstru aie, sarcina, perioada postpartum, menopauza sau n timpul unui stress psihologic d e amploare). Toate aceste perioade sunt asociate cu modificari ale secreiei facto rului hipotalamic de eliberare a LH, a LH hipofizar, a hormonilor sexuali i a alt or hormoni. Frecvena fenomenelor autoimune crete cu vrsta, corelata cu schimbarile neuroendocrine. Artrita reumatoida este asociata cu o insuficiena a sintezei corticosteroizilor. Nivelul corticosteroizilor plasmatici tinde sa se coreleze cu severitatea inflam aiei, dar pacienii cu afeciune de intensitate medie au nivele inferioare ale cortic osteroizilor comparativ cu indivizii normali. Nivelul testosteronului la pacienii cu artrita reumatoida, n special la barbai, tinde sa aiba valori scazute, iar niv elul estrogenului este nemodificat. Terapia cu testosteron amelioreaza maladia. Estrogenii nu par sa produca o exacerbare a artritei reumatoide, iar contracepti vele orale ncetinesc evoluia maladiei. Odata cu scaderea brusca a nivelului estrog enilor (perioada postpartum, intervalul care precede menstruaia, menopauza), artr ita reumatoida se intensifica. In acelai timp diminua secreia de corticosteroizi, deoarece estrogenii influeneaza axa HHC. Nivelul prolactinei la pacienii cu artrit a reumatoida este variabil(crescut, normal sau scazut). Artrita reumatoida se re mite frecvent n timpul sarcinii i se reactiveaza sau se declaneaza n perioada postpa rtum, ndeosebi la femeile care alapteaza. Alaptarea este nsoita cu creterea marcata a secreiei de prolactina i cu supresia funciei axei HHC. Lupusul sistemic eritematos are o dominana neta la femei, ceea ce denota rolul ho rmonilor sexuali n declanarea i evoluia acestei maladii. În plasma pacienilor sa relevat un dezechilibru ntre nivelul androgenilor i estrogenilor. Dezechilibrul poate fi primar sau secundar, datorat unei enzime care convertete androgenii la e strogeni. Barbaii cu lupus sunt prevalent hipoandrogenici. Nivelul scazut al andr ogenilor favorizeaza imunitatea mediata humoral, iar estrogenii favorizeaza auto imunitatea, prin stimularea producerii de prolactina, care are efect activator a supra funciei imunitare. Pacienii cu lupus se caracterizeaza prin hiperprolactinem ie. In timpul sarcinii, maladia se intensifica. Tiroidita autoimuna se declaneaza frecvent n perioada postpartum, caracterizata pr in hipocortisolemie. Perioada sarcinii se caracterizeaza prin supresia imunitaii mediate celular i menin erea sau chiar creterea imunitaii humorale. Setul de citochine sintetizate de celu lele Th1 diminua (IL-2 i IFN ?), ceea ce elimina riscul avortului imunitar. Dimin uarea sintezei IFN ? este eseniala pentru pastrarea sarcinii, deoarece cantitaile mari favorizeaza avortul. Nivelul plasmatic al corticosteroizilor, estrogenilor i progesteronei crete. Starea hormonala complexa n timpul sarcinii pare sa condiione ze remisia maladiilor autoimune dependente de imunitatea celulara, ca de exemplu artrita reumatoida i agravarea maladiilor dependente de procese ale imunitaii hum orale, ca de exemplu, glomerulonefrita n lupusul eritematos. Postpartum, starea hormonala se modifica brusc. Corticosteroizii, estrogenii i pr ogesterona scad la nivele subnormale, iar imunitatea mediata celular se restabil ete, ceea ce permite declanarea sau activarea unor maladii autoimune, aa cum este a rtrita reumatoida, datorita creterii secreiei de prolactina. Perioadele de sarcina i postpartum se caracterizeaza prin modificari ample ale st arii hormonale i sunt asociate frecvent cu declanarea sau activarea unor maladii a utoimune, ceea ce ilustreaza rolul mecanismelor endocrine n reglarea funciei imuni tare.

<