ANALIZA ENZIMATICA A

ALIMENTELOR
CURS 10
ZAHAROZA/D-GLUCOZA/D-FRUCTOZA
 ANALIZA ENZIMATICA

 Este o metoda de analiza folosita pentru

masurarea unor componente ca:
 zaharuri,

 acizi,

 alcooli

 si a altor metaboliti din alimente

 si bauturi.

 enzimele sunt proteine care catalizează

conversia unei molecule în alta.
REACTIILE ENZIMATICE

Advantaje
- Rapide si sigure
- specifice

Metode
- cinetice
- discontinue

Influentate de
- pH
- temperatura
- taria ionica
 Analizoare spectrale automate

Promo-Pronto Alpha Prime

Vitros
SUCROZA
 Sucroza (zaharoza) - zahar de masa sau
de zahăr alb.
 Este un dizaharid format dintr-o moleculă
de glucoză și fructoză prezentand in
pozitiile alpha, beta-1,2-legătură
glicozidică.
 găsit în tulpinile de trestie de zahăr și
rădăcinile de sfeclă de zahăr.
Formula moleculara: C12H22O11

Masa molara: 342.30 g/mol

Densitate: 1.587 g/cm3

Punct de topire: 186°C

CAS nr.: 57-50-1

 GLUCOZA
 Glucoza (zahărul din sânge, dextroză, zahăr de
porumb)
 este o monozaharidă, care are doi enantiomeri:

 D-glucoza și L-glucoza.

 Numai D-glucoză apare în mod natural.

 L-glucoză, care este disponibil numai în formă

sintetică, abia are semnificație practica.

Formula moleculara: C6H12O6

Masa molara: 180.16 g/mol

Densitate: 1.54 g/cm3

Punct de topire: 146-150°C

CAS nr.: 50-99-7

 FRUCTOZA
 Fructoza apare in mod natural,
 în special în fructe și miere.

 Dulceața relativ mare face fructoza unul

dintre cei mai dulci carbohidrații ce apar în
mod natural.

Formula moleculara: C6H12O6

Masa molara: 180.16 g/mol

Densitate: 1.694g/cm3

Punct de topire: 103°C

CAS nr.: 57-48-7

 ANALIZA ENZIMATICA

ZAHAROZA

D-GLUCOZA

D-FRUCTOZA
 NAD(P)H

NADH (Nicotinamida adenin dinucleotida)

NADPH (Nicotinamida adenin dinucleotid fosfat)

NADH este o coenzima

NAD+ este forma oxidată
NADH este forma redusă

NADP+ / NADPH - o grupare fosfat suplimentar in

poziția 2 'a inelului de riboza

NAD+ / NADH
STRUCTURI

NADH este o coenzima

NAD+ este forma oxidată în timp NADH
este forma redusă

NADH NADPH
 Testele enzimatice sunt extrem de utilizate ca instrument analitic
în vederea analizei produselor alimentare precum sucurile de
fructe, vin sau bere, produse lactate, ouă şi carne.

 Au la bază enzime de înaltă calitate, care permit măsurarea precisa

şi specifică a fiecărei componente, chiar şi din matrici complexe.

 Rezultatele sunt măsurate cu un spectrofotometru şi este posibilă

şi automatizarea.
 Principiu
 Calitatea rezultatelor obţinute prin determinări enzimatice sunt
bazate pe specificitatea enzimelor, exactitatea reacţiilor
catalizate de enzime şi recunoaşterea coeficienţilor de exticţie
ale substanţelor care absorb lumina.

 Metoda UV
 Toate metodele enzimatice la care ne referim ca metode UV se
bazează pe măsurarea creşterii sau descreşterii în absorbarea
coenzimei NADH sau NADPH la 340 nm.

 Observatii
 Un surplus de glucoză şi/sau o proporţie prea mare de sucroză
indică o îndulcire artificială.
 PREGĂTIREA PROBELOR

 Se folosesc probe limpezi, practic neutre.

 Se folosesc direct sau după diluare.

 Se foloseşte un volum de până la 2,000 ml.

Cantitate de zaharoză + Diluarea cu Factor de

D-glucoză+D-fructoză apă diluţie
estimată/l

340 nm 334 nm 365 nm

<0,8 g <1,5 g - 1
0,8 – 8,0 g 1,5 – 15 g 1+9 10
8,0 – 80 g 15 – 150 g 1+99 100
>80 g >150 g 1+999 1000
 PREGĂTIREA PROBELOR

 Soluţiile tulburi se filtrează.

 Probele care conţin CO2 sunt degazate (ex. prin
filtrare).
 Se ajustează pH-ul probelor acide pH 8 prin
adăugarea de NaOH sau KOH. (D-glucoză şi
D-fructoză).
 La probele acide şi colorate se aduce pH-ul la 8 –
după care se incubează 15 minute. (pt. D-glucozăşi
D-fructoză)
 PREGĂTIREA PROBELOR

 Probele foarte colorate care se folosesc nediluate

se tratează cu polivinilpolipirolidonă sau
poliamidă.
 Se sfarmă sau se omogenizează probele solide sau
semisolide.
 Se extrag cu apă şi se filtrează;

 Agenţii de colorare şi cei care provoacă

turbiditatea sunt îndepărtaţi prin tratare cu
reactiv Carrez.
 Deproteinizarea probelor care conţin proteine se
face cu reactiv Carrez.
 PREGĂTIREA PROBELOR

 Probele cu conţinut ridicat de grăsimi se extrag

cu apă fierbinte
 Temperatura de extracţie trebuie să fie peste
temperatura de topire a grăsimii.
 Se răceşte extractul pentru a permite separarea
grăsimii.
 Se pune vasul de extracţie într-un vas cu gheaţă
timp de 15 minute după care se filtrează.
 Soluţia se lipezeşte cu reactiv Carrez după
etracţia cu apă fierbinte.
 LIMPEZIRE CU SOLUTIA CARREZ

 Se pipetează lichidul într-un balon cotat care

conţine 60 ml apă bidistilată
 sau se cântăresc suficientă probă într-un balon
cotat de 100 ml
 şi se adaugă 60 ml apă bidistilată.

 Se adaugă cu grijă 5 ml soluţie Carrez I şi 5 ml

soluţie Carrez II
 Soluţia Carrez I contine hexacianoferat de
potasiu (II) (ferocianidă),
85 mM  3,60 g K4Fe(CN)6 x 3 H2O / 100 ml.
 Soluţia Carrez II contine sulfat de zinc,

250 mM  7,20 g ZnSO4 x H2O / 100 ml.

 LIMPEZIRE CU SOLUTIA CARREZ

 Se ajustează la pH 7,5 – 8,5 cu NaOH

 se amestecă după fiecare adăugare.

 Se umple balonul cotat până la semn (100 ml).

 Probele care conţin proteine nu trebuiesc

deproteinizate cu acid percloric sau cu acid
tricloacetic în prezenţa zaharozei sau a maltozei
deoarece aceste dihazaharide sunt hidolizate
complet cu eliberarea D-glucozei.
 Se recomandă limpezirea Carrez.
 DETERMINAREA ZAHAROZEI, D-GLUCOZEI,
D-FRUCTOZEI DIN SUCURI DE FRUCTE
 Se filtrează probele tulburi (alternativ se
limpezeşte cu reactiv Carrez)
 se diluează pentru a atinge o concentraţie de 0,1
– 1,5 g/l.
 Proba diluată poate fi folosită pentru analiza
probei dacă este colorată.
 Numai probele forte puternic colorate sunt
folosite nediluate datorită conţinutului scăzut de
zaharoză+D-glucoză+D-fructoză.
 În acst caz se face după cum urmează:

 Se amestecă 10 ml suc cu aproximativ 0,1 g

poliamidă, se agită 1 minut şi se filtrează. Se
foloseşte soluţia limpede, uşor colorată.
DETERMINAREA ZAHAROZEI, D-GLUCOZEI,
D-FRUCTOZEI DIN BERE
 Pentru îndepărtarea acdilui carbonic se agită 5
– 10 ml bere timp de 5 minute cu o baghetă de
ticlă sau se foloseste un agitator mecanic.
 Se filtrează.

 Se foloseşte filtratul pentru analiză.

Determinarea zaharozei, D-glucozei, D-

fructozei din lape condensat îndulcit
Se cântăreşte 1 g într-un balon de 100 ml
şi se adaugă 60 ml apă
şi se incubează 15 minute la 70 °C;
se agită din când în când.
 LAPE CONDENSAT ÎNDULCIT

 Pentru limpezire, se adaugă 5 ml soluţie Carrez

I, 5 ml soluţie Carrz II, 10 ml NaOH (0,1 M).
 Se amestecă dupăp fiecare adăugare.

 Se aduce la temperatura camerei, se aduce la

semn cu apă, se amestecă şi se filtrează.
 Se foloseşte amestecul limpede, posibil puţin
tulbure care rezultă.
 Se diluează confrom tabelului de diluţie dacă este
necesar.
 DETERMINAREA ZAHAROZEI, D-GLUCOZEI,
D-FRUCTOZEI DIN GEM ŞI ÎNGHEŢATĂ

 Se omogenizează 10 g probă într-un mixer.

 Se cântăresc 0,5 g omogenat într-un balon de 100
ml, se amestecă şi se agită.
 Se completează la semn cu apă şi se filtrează.

 Se aruncă primii 5 ml de filtrat.

 Se foloseşte filtratul limpede, posibil uşor

opalescent care rezultă.
 Se diluează dacă este necesar.
DETERMINAREA ZAHAROZEI, D-GLUCOZEI,
D-FRUCTOZEI DIN CARTOFI
 Se omogenizează 50 g cartofi curăţaţi cu 50 ml
apă într-un omogenizato timp de 3 minute.
 Se transferă conţinutul într-un vas de 250 ml.

 Se umple până la 150 ml cu apă.

 Se adaugă succesiv 5 ml soluţie Carrez I, 5 ml

soluţie Carrz II, 10 ml NaOH (0,1 M).
 Se amestecă după fiecare adăugare.

 Se transferă într-un balon de 250 ml,

 Se clăteşte cu apă.

 Se adaugă 0,3 ml n-octanol şi se agită până când

dispare spuma.
 Se aduce la semn cu apă şi se amestecă şi se
filtrează.
DETERMINAREA ZAHAROZEI, D-GLUCOZEI ŞI A D-FRUCTOZEI
DIN MIERE
 Se omogenizează bine mierea cu o spatulă.
 Se iau 10 g miere vâscoasă sau cristalină, se încălzeşte 15 minute
la 60 °C.
 Se amestecă din când în când. Se lasă să se răcească.

 Se cîntăreşte 1 g din proba lichidă într-un balon de 100 ml

 (se dizolvă prima dată cu o cantitate mică de apă şi apoi se aduce

la semn).
 a. Determinarea D-glucozei şi a D-fructozei

 Se dilează 1% soluţia de miere 1:10 (1+9)

 b. Determinarea zaharozei
 Cantitatea estimată de zaharoză din miere este între 5 şi 10 %,
se diluează soluţia de 1% 1:3 (1+2)
 SOLUTII NECESARE
1. tampon citrat, pH 4,6;
β-fructozidază 720 U.
2. amestec pudră format din: tampon trietanolamină, pH 7,6;
NADP, 110 mg; ATP 260 mg; sulfat de magneziu.
3. suspensie formată din hexokinază 320 U;
glucozo-6-fosfat-dehidrogenaza, 160 U.
4. Soluţie de control pentru analizarea zaharozei.
5. Soluţie pentru controlul analizei D-glucozei.

 Stabilitatea reactivilor
1. Conţinutul solutiilor 1, 2 şi 3 este stabil la 2 - 8°C.
2. Soluţiile 1 şi 2 sunt stabile 4 săptămâni la 2- 8 °C sau 2 luni la –15, -25 °C.
3. Se aduc soluţiile1 şi 2 la 20 – 25 ̊C înainte de utilizare.
 MOD DE LUCRU
PIPETARE BLANK PROBA ZAHAROZA
PROBA ZAHAROZA
SOLUTIE 1 0,200 0,200
PROBA - 0,100
Se amestecă, se incubează 15 minute la 20 – 25 °C timp de 5 minute la 37 °C Înainte de
pipetare soluţia trebuie încălzită la la 37 °C.
SOLUTIE 2 1,000 1,000
APA 1,800 1,700
BIDISTILATA
Se amestecă, se citesc absrobanţele după aprox. 3 minute A1. Se începe reacţia prin
adăugarea de:
SUSPENSIA 3 1,000 1,000
1,800 1,700
Se amestecă, se aşteaptă până la terminarea reacţiei (10 – 15 minute), se citesc
absorbanţele A2.
Dacă reacţia nu s-a terminat în 15 minute, se continuă citirea sbrobanţelor din două în 2
minute până când se onservă o creştere constantă.
 PIPETARE BLANK PROBA
PROBA D-GL/D-FR PROBA D-GL/D-FR
SOLUTIE 1 - -
PROBA - 0,100
Se amestecă, se incubează 15 minute la 20 – 25 °C timp de 5 minute la 37 °C Înainte
de pipetare soluţia trebuie încălzită la la 37 °C.
SOLUTIE 2 1,000 1,000
APA 2,000 1,900
BIDISTILATA
Se amestecă, se citesc absrobanţele după aprox. 3 minute A1. Se începe reacţia prin
adăugarea de:
SUSPENSIE 3 1,000 1,000
2,000 1,900
Se amestecă, se aşteaptă până la terminarea reacţiei (10 – 15 minute), se citesc
absorbanţele A2.
Dacă reacţia nu s-a terminat în 15 minute, se continuă citirea sbrobanţelor din două în
2 minute până când se onservă o creştere constantă.
SUSPENSIE 4 0.020 0,020

Se amestecă, se citesc absrobanţele soluţiilor după 10 – 15 minute (A3).

 CALCUL
 Se calculează diferenţele de absorbanţe, (A2 – A1) atât pentru
pentru blank cât şi pentru probă.
 Se scade diferenţa obţinută pentru blank din diferenţa obţinută
pentru prob corespunzătoare şi se obţine ΔA.
 ΔA=(A2 – A1)probă - (A2 – A1)blank

 ΔAD-glucoză totală – ΔAD-glucoză= ΔAzaharoză

 ΔAD-glucoză totală (din proba de zaharoză)
 ΔAD-glucoză (din proba D-glucoză)

 Se determină diferenţa de absrobanţă, (A3 – A2) atât pentru blank

cât şi pentru probă (probă D-glucoză/probă D-fructoză).
 Se scade diferenţa de absorbanţă pentru blank din diferenţa de
absorbanţă pentru probă. Se obţine ΔAD-fructoză
 BLANK PROBA 1 PROBA 2
A1 ? ? ?
A2 ? ? ?
A3 ? ? ?
A2-A1 ? ? ?
ΔA NU ? ?
(A2-A1)proba-(A2-A1)blank
A3-A2 ? ? ?
ΔA fructoza NU ? ?
(A3-A2)proba-(A3-A2)blank

 Concentratia: c = V * MW / ε * d * v *1000 * ΔA [g/l],

 V = volumul final [ml]
 v = volumul probei [ml]
 MW = masa moleculară a susbtanţei care trebuie analizată [g/mol]
 d = calea optică [cm]
 ε = coeficient de exctincţie al NADH la 340 nm= 6.3[l x mmol -1x cm-1]

Pentru zaharoză: c=10,34/ ε * ΔAzaharoză [g zaharoză/l soluţie probă]

Pentru D-glucoză: c=5,441/ ε * ΔAD-glucoză [g D-gluoză/l soluţie probă]
Pentru D-fructoză: c=5,477/ ε * ΔAED-fructoză [g D-fructoză/l soluţie probă]
 AMIDONUL- METODA UV

 Principiu
 Amidonul este hidrolizat la pH 6 de către enzima
amiloglucozidază (AGS).

(1).Amidon+(n-1) H2O AGS N D-glucoză

D-glucoza formată este determinată cu hexokinaza (HK)

şi glucozo-6-fosfat dehidrogenaza (G-6-P-DH) la pH 7,6.
D-glucoza este fosforilată la D-glucozo-6-fosfat (G-6-P) de către
ATP în prezenţa HK cu formarea simultană de ADP.
 AMIDON
(2). D-glucoza + ATP HK G-6-P + ADP

(3). G-6-P + NADP+ G6PDH D-gluconat -6-fosfat + NADPH

+ H+

În prezenţa G6P-DH D-glucozo-6-fosfat este oxidat de NADP la D-gluconat

-6-fosfat cu formrea NADPH.

Cantitatea de NADPH formată este stoechiometrică cu cantitatea de D-

glucoză. Variaţia de NADPH este măsurată fotometric orin intermediul
absorbanşei sale la 340, 334sau 365 nm.
 PREGATIREA PROBELOR
 Solubilizarea cu dimetilsulfoxid (DMSO) şi
HCl
 Se omogenizează proba

 se trece printr-o sită cu diametrul de 0. 2mm.

 Se cântăresc 100 mg probă într-un pahar

Erlenmeyer,
 se adaugă 20 ml DMSO şi 5 ml HCl (8 M).

 Dacă avem de a face cu probe grase, se

recomandă adăugarea DMSO prima dată.
 Probele cu conşinut scăzut de grăsime se tratează
cu HCl prima dată.
 Se închide balonul şi se incubează 30 minute (în
 PREGATIREA PROBELOR
 Ex. dacă sunt prezente bucăţi de pâine) la 60 ºC
într-o baie de apă.
 Se răceşte repede la 20 - 25 º

 se adaugă 50 ml apă, se ajustează pH-ul la 4 – 5

cu NaOH (5M) agitând puternic.
 Se tranferă conţinutul într-un balon de 100 ml, se
clăteşte cu apă, se aduce la semn cu apă distilata
 se filtrează.

 Se poate utiliza si decantarea solutiei.

 Nu este recomandt centrifugarea datorită

precipitării amidonului astefl obţinându-se
valori foarte mici.
 Se folosesc 0,100 ml nediluaţi pentru analiză.
 HIDROLIZA ALCALINĂ ŞI ENZIMATICĂ A
AMIDONULUI

 amidonul este suma α glucanilor care sunt insolubili

în etanol (40 % v/v)
 şi care sunt hidrolizaţi la D-glucoză de către
amiloglicozidaze.
 Produşii hidrolizei amidoului sunt:

 maltodextrine,
 D-glucoză,
 şi dextrine care sunt solubile în etanol.
 Dextrinele sunt hidrlizate de amiloglicozidază la D-
glucoză.
 REACTIVI
 Etanol
 Soluţie NaOH 0,5 M

 Amiloglicozidază (AGS), soluţie

 Tampon acetat, pH 4,6

 Mod de lucru:

 Se cantăresc 100 mg probă într-un tub de centrifugă,

 se adaugă 50 ml etanol (40% v/v)

 şi se agită 20 minute la 20 – 25 ºC.

 Se lasă agitatorul magnetic încă 5 minute.

 Se ia supernatantul cu ajutorul unei pipette Pasteur şi

se foloseşte o pompă de vid cu apă pentru a determina
hidroliza amidonului solubil în apă şi a glucozei libere.
 Se spală reziduul de cel puţin două ori cu 25 ml etanol.
Se combină supernatanturile.
 Se adaugă 50 ml NaOH (0,5 M) la reziduu
 şi se agită timp de 30 minute la 60 ºC într-o baie de
apă.
 Se ajusteaza pH-ul la 4,6 – 4,8cu acidului acetic glacial
(min 96%).
 Se adaugă 1 ml AGS şi se agită încă 30 minute.

 Se răceşte la 20 – 25 ºC,, se transferă soluţia

 într-un balon de 100 ml,

 se clăteşte cu apă,

 se adduce la semn, se amestecă

 şi se filtrează dacă este necesar.

DETERMINAREA PRODUŞILOR DE HIDROLIZĂ
PARŢIALĂ A AMODIONULUI
 1. Dextrinele în bere
 Solubilizarea cu DMSO nu este necesară. Proba
poate fi folosită direct la analiză.

 Se foloseşte un volum de 0,100 până la 1,000 dacă

este necesar.

 Concentraţia de dextrină se calculează după

scăderea posibilelor canittăţi de D-glucoză liberă
prezente.
 ΔAdextrină= (A2-A1)probă-(A2-A1) blank probă

 ΔAD-glucoză-libră= (A2-A1)probă-(A2-A1) blank

reactiv
 SOLUŢII CARE CONŢIN PRODUŞI
HIDRILIZAŢI PARŢIAL AI AMIDONULUI

 Se diluează proba conform tabelului de diluţie

 a.î. să se obţină on concentraţie de oligogligozide de

0,4 g/l la 340 nm şi Hg 334 nm (0,7 g/l la 365 nm)
pentru

 probă şi blank de probă. În cazul D-glucozei librere

aceste concentraţii trebuie să se obţină pentru probă
şi blankul de reactiv.