Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
Studiul enzimelor sub toate aspectele prezinta o importanta deosebita din punct de
vedere fundamental, contribuind la intelegerea mecanismelor moleculare ce stau la baza
transformarilor moleculare din celula vie si la dezvoltarea altor stiinte moderne si domenii
interdisciplinare cum ar fi biologia moleculara, genetica si ingineria genetica, microbiologia,
fiziologia animalelor, plantelor si microorganismelor, biotehnologia si altele.
Inca din antichitate omul cunostea diferite procese de transformare, realizate de catre
organismele vii, in special microorganisme (obtinerea vinului, otetului, painii), mult timp insa,
mecanismele moleculare ce stau la baza acestor procese, locul si rolul enzimelor in
desfasurarea lor au ramas necunoscute. Chiar si astazi, multe mecanisme de actiune ale
enzimelor, precum si unele procese biochimice raman inca neelucidate.
Dintre enzimele cunoscute pana in prezent, aproximativ 30% sunt transferaze. Reactiile
catalizate de transferaze sunt reactii biomoleculare in care un substrat joaca rolul de donor iar
celalalt rolul de acceptor al gruparii transferate. Din aceasta cauza denumirea sistemica a
acestor enzime este de tipul donor:acceptor transferaza.
ARN-polimeraza este o enzimă din clasa transferazelor care produce acidul ribonucleic şi are
functia de catalizator al procesului de transcripţie al ADN-ului în ARN.
1
Capitolul I
Denumiri alternative:
ARN-polimeraza ADN-dependenta.
ARN polimeraza I.
ARN-polimeraza II.
ARN-polimeraza III.
In afara de acestea mai exista si ARN polimeraza ARN dependenta. ARN-polimeraza face parte
din clasa transferazelor, subclasa fosfotransferaze,subsubclasa nucleotidiltransferazelor, ceea
ce inseamna ca sunt enzime care catalizeaza transferul gruparii PO4 nucleozid de la un substrat
donor la un substrat acceptor.
2
Capitolul II
Determinarea activitatii catalitice a unei enzime poate fi evidentiata fie prin evaluarea
volumului de substrat fie prin evaluarea produsului de reactive format. Pentru marea
majoritate a enzimelor viteza de reactive este o functie liniara de timp doar pentru primele
minute de reactive. Din aceasta cauza determinarea activitatii enzimelor se face prin efectuarea
transformarii respective in conditii optime de reactii intr-un interval de timp in care aceasta
dependent este liniara. Dupa scurgerea acestui interval de timp se stopeaza reactia enzimatica
printr-o modalitate sau alta dupa care se determina fie concentratia substratului (substratelor)
fie a produsului (produsilor) de reactive prin metode fizico-chimice specific. Crearea conditiilor
optime de reactive inseamna crearea unor conditii de pH temperature, presiune osmotic,
raport masic enzima / substrat etc. care sa fie cat ma apropiate de conditiile naturale, adica de
conditiile pe care enzima le gaseste in vivo. In functie de proprietatile fizico-chimice, ale
substratelor sau produsilor de reactie metodele de determinare a activitatii enzimelor se impart
in mai multe grupe:
- Metode spectrofotometrice;
- Metode fluorimetrice;
- Metode titrimetrice;
- Metode calorimetrice;
- Metode polarimetrice.[1]
Determinarea activitatii ARN polimerazei a facut obiectul unei inventii patentate in SUA sub
numarul 5,635,350, de inventatorii: Josef Eberle, Munich, Rudolph Seibl, Penzberg, Cristoph
Kessler, Dorfen, Berg, toti din Germania. Inventia se refera la metode de determinare a
3
activitatii enzimatice a polimerazei si implemetarea metodei mentionate in detectarea HIV, de
determinare a efectului inhibitor a substantelor asupra activitatii polimerazei, de determinare a
anticorpilor pentru polimeraza si a secventelor promoter. Redam mai jos metoda de detectare
a HIV care contine si metoda de determinare a activitatii enzimatice.
2-3 ml de supernatant fara celule de colonie de HIV virusi, sau solutie de virusi izolati.
Centrifugare la 20.000 de rotatii pe minut, timp de 2 ore,care conduce la obtinerea de virusi
granulati.
Virusii granulati sunt dizolvati in 40 micrograme de tampon de liza care e format din :
1,4 ditioeritrit (DTT, Merck, Darmstadt), 2,5 mM, EDTA 0.75 mM, KCl 80 mM, HCl 50 mM, pH
8.0, 22 grade Celsius.
DTT 10 mM,KCl 290 mM, MgCl2 30 mM, dTTP 8,3 micrograme, Biotin-16-dUTP 125 nM, DIG-11-
dUTP 2,5 micromoli, acid poliadenilic* acid pentadecatimidilic (PoliA)*(dT)15, pH 8.00, 22 grade
Celsius.
e) spalare:
g) decantare 60 min,
4
II.2 Detectarea activitatii ARN polimerazei ADN dependenta si secventelor specifice promoteri
pentru ARN polimeraza asupra ADN-ului
3 fragmente AND care contin promoteri pentru fiecare ARN polimeraza, T7-ARN polimeraza sau
T3-ARN polimeraza care sunt in reactive de transcriptie sunt incubate cu ribonucleotide.
Mixtura contine si Dig UTP si Bio UTP si, ori SP6 RNA polimeraza, ori T7 RNA polimeraza. In
ambele cazuri in care promoterii si polimerazele corespund, nucleotidele incorporate in lantul
ARN sunt complementare cu ADN-ul.
Activitatea ARN polimrazei poate fi detectata prin detectarea de digoxigenin nucleotide care
sunt covanlent legate de biotin-nucleotide cu ajutorul antidigoxigenin-anticorpilor.
5
Reactiilor de transcriptie li s-au adaugat 10 mmoli/l Tris HCl, 1 mmol EDTA, la pH 8.0.
Portiuni de 20 microlitri de de dilutie din reactiile de transcriptie sunt pipetate pe fundul
placilor puturilor streptavidin-filmate si 180 microlitri de 0,05 % (vol/vol) sol Tween 20. Totul se
acopera cu capacele pentru a se efectua reactia de legare. Se agita. Reactiile in care
componentele nu s-au legat sunt inlaturate in 6 pasi de spalare cu 300 microlitri de 0,9% solutie
NaCl.
1200 ml ABTS solutie de substrat sunt incubati la 37 grade Celsius timp de 5-60 min si
coloratia este masurata cu fotometrul la 405 nm.
Capitolul III
Atat ARN cat si ADN polimeraza isi pot adauga nucleotide la lantul initial marindu-si
lungimea. Dar exista o mare diferenta intre cele doua, ARN polimeraza poate intia un nou lant
in timp ce ADN polimeraza nu il poate initia.
6
In timpul replicarii, o oligonucleotida (primer) trebuie sa fie sintetizata de o enzima
diferita. Nucletotidele utilizate pentru a extinde un lant ARN sunt ribonucleotzidele trifosfat
(NTPs). Doua grupuri de fosfat sunt eliberate ca pirofosfat (PPi) in timpul reactiei. Alungirea
lantului se face in directia 5’-3’.
7
Prezentarea elongatiei lantului: liniile verticale reprezinta pentozele iar cele orizontale
legaturile difosfodiesterice
Initierea transcrierii
Promotorii sunt secvente specific continute in AND si care sunt recunoscute de ARN
polimeraza. Dimensiunile secventei promoter sunt variabile. Enzima “miez” singura nu poate
recunoaste regiunile promotor, subunitatea sigma fiind esentiala in acest sens. Pe parcursul
legarii ARN polimerazei de ADN evenimentele se succed in umatoarea ordine:
8
Primul NTP ce urmeaza a fi incorporate in structura ARN se leaga de situsul de initiere al ARN
polimerazei si formeaza punti de hidrogen cu baza complementara de pe ADN din cadrul
complexului ADN deschis promotor. Acest situs leaga numai NTP purinice (majoritatea
transcriptelor ARN incep cu baza A). Al doilea NTP ce urmeaza a fi incorporat in structura ARN
se leaga in situsul de elongare al polimerazei. Alegerea celui de al doilea NTP ce va intra in
structura ARN se face pe baza capacitatii sale de a forma leghatuiri de hydrogen cu baza
complementara din structura ADN a complexului ADN deschis. ARN polimeraza catalizeaza
formarea primei legaturi fosfat diesterice intre nucleotidul +1 aflat in situsul de initiere si
nucleotidul +2 aflat in situsul de elongare. ARN polimeraza initiaza sinteza catenelor
poliribonucleotidice fara a avea nevoie de primeri. Dupa formarea primelor legatuiri fosfat
diesterice subunitatea sigma disociaza din complexul ARN polimeraza – ADN – ARN si se
asociaza unei alte ARN polimeraze “miez”, reluand un nou ciclu in procesul de transcriere.
9
10
[2]
III.2 Raspandire
RdRP viral a fost descoperit la începutul anilor 1960 datorita unor studii privind
meningovirusul si virusul poliomielitei, atunci când s-a observat că aceste virusuri nu au fost
sensibile la actinomicin D, un medicament care inhibă sinteza AND-ului celular. Lipsa de
sinsibilitate a acestor virusi a sugerat că există un virus specific, o enzima care ar putea copia
ARN-ul pornind de la un şablon ARN, şi nu de la un sablon ADN.
11
Cel mai celebru exemplu de RdRP este virusul poliomielitei. Virusul este format din ARN,
care intră în celule prin endocitoză receptor-mediată. De acolo, ARN-ul este capabil să
acţioneze ca un şablon pentru sinteza ARN complementar, imediat. Componentele
complementare sunt apoi, ele insele, capabile să acţioneze ca un şablon pentru producerea de
genomi virali noi, care sunt în continuare ambalati şi eliberati din celula, gata de a infecta alte
celule gazdă. [3]
III.3 Utilizari:
ARN polimeraza poate fi folosita pentru tratarea unor boli imunologice si ca o sonda enzimatica
a structurii nucleosomale sau mai poate fi folosita la analiza expresiei genelor.
12
IV CONCLUZII
2.Cel mai nou domeniu stiintific, care prezinta totodata si cele mai largi perspective
pentru viitorul imediat sic el indepartat, il reprezinta biotehnologia. In ultimul timp, tot mai
multi oameni de stiinta impartasesc idea ca asa cum secolul XX a apartinut electronicii, in
acelasi mod secolul XXI va apartine biotehnologiei. In ceea ce priveste importanta enzimologiei
pentru cercetarea si productia biotehnologica, actualmente se disting doua posibilitati de
valorificare a cunostintelor in acest domeniu:
13
CUPRINS:
Introducere……………………………………………………………………………pag 2
Capitolul I……………………………………………………………………………..pag 3
Capitolul II……………………………………………………………………………..pag 4
Capitolul III……………………………………………………………………………pag 7
III.2 Raspandire…………………………………………………………………pag 12
III.3 Utilizari………………………………………………………………………pag 13
IV CONCLUZII………………………………………………………………….…..pag 14
14
BIBLIOGRAFIE
Internet:
http://www.freepatentsonline.com/5635350.pdf
http://en.wikipedia.org/wiki/RNA-dependent_RNA_polymerase
http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch4B1.htm
http://en.wikipedia.org/wiki/RNA_polymerase_I
Referinte:
3.Rusu L,Enzimologie industriala, Editura Alma Mater , Bacau 2007, pag 151-176
15