Abstract

fundal
Vitele Angus hrănite cu iarbă și cele hrănite cu cereale diferă în ceea ce privește regimurile
alimentare. Cu toate acestea, mecanismele complexe ale diferitelor calități ale cărnii de vită și ale
altor fenotipuri induse de diferențele de dietă sunt încă neclare. Dieta afectează funcția
mitocondrială și comportamentul dinamic ca răspuns la modificările cererii și ofertei de
energie. În acest studiu, am examinat numărul de copii ADNmt, expresia genelor legate de
mitocondrii și biomarkerii metabolici la bovinele Angus hrănite cu iarbă și hrănite cu cereale.

Rezultate
Am descoperit că grupul hrănit cu iarbă a avut un număr mai mare de copii ADNmt decât grupul
hrănit cu cereale. Dintre diferitele țesuturi, numărul de copii ADNmt a fost cel mai mare în ficat
decât în mușchi, rumen și splină. Pe baza transcriptomului celor patru țesuturi, a fost descoperită
o expresie mai scăzută a genelor codificate cu mtDNA în grupul hrănit cu iarbă, comparativ cu
grupul hrănit cu cereale. Cu toate acestea, pentru genele nucleare legate de mitocondrii, cele mai
multe dintre ele au fost semnificativ reglate în jos în mușchiul grupului hrănit cu iarbă și
suprareglate în celelalte trei țesuturi. În care, COX6A2 , POLG2 , PPIF , DCN și NDUFA12, care
implică sinteza ATP, replicarea mitocondrială, transcripția și întreținerea, ar putea contribui la
modificările numărului de copii ale ADNmt și ale expresiei genelor. Între timp, 40 și 23 de
biomarkeri metabolici au fost identificați în sângele și mușchiul grupului hrănit cu cereale,
comparativ cu un grup hrănit cu iarbă. Analiza integrată a metaboliților modificați și a expresiei
genelor a dezvăluit că nivelul ridicat de expresie al MDH1 în grupul alimentat cu cereale ar putea
contribui la oxidarea mitocondrială a NADH și la metabolismul spermidinei pentru adaptarea
numărului de copii ale ADNmt de ștergere.

Concluzii
În general, studiul poate oferi o perspectivă mai profundă asupra modulațiilor adaptative și de
reglementare ale funcției mitocondriale ca răspuns la diferite sisteme de hrănire la bovinele
Angus.

fundal
Recent, producția de carne de vită hrănită cu iarbă este în plină expansiune în Statele Unite, ceea
ce este considerat mai benefic pentru sănătatea umană [ 1 ]. Principala diferență dintre bovinele
de carne hrănite cu iarbă și cele hrănite cu cereale este atribuită regimurilor de dietă. După cum
știm, mitocondriile joacă un rol esențial în răspunsul celular la factorii de stres din mediu, cum ar
fi aerul, apa, temperatura și alimentele [ 2 ]. Mitocondriile sunt organite dinamice care sunt
prezente în celulele aproape eucariote și joacă un rol crucial în mai multe căi celulare, producând
cea mai mare parte a ATP celular folosind fosforilarea oxidativă (OXPHOS). Diferitele țesuturi
au caracteristici mitocondriale specializate datorită diferențelor dintre profilurile lor metabolice
și cerințele energetice [ 3 , 4 , 5 ], 6 ]. Diferența nu se limitează numai la funcția OXPHOS [ 6 ]
și compozițiile proteinelor mitocondriale [ 7 ], ci și la expresiile genelor, menținerea ADN-ului
mitocondrial și replicările [ 8 , 9 ].
Mitocondriile conțin genomul lor (mtDNA), care codifică un total de 13 proteine, împreună cu
22 de ARNt și două ARNr, necesare pentru traducerea ARNm-urilor subunității respiratorii în
matricea mitocondrială. Alterările mtDNA înseamnă inactivarea mutațiilor genetice sau
epuizarea numerelor de copii mtDNA [ 10 ]. Copiile mtDNA servesc ca șablon inițial pentru
replicarea și întreținerea mtDNA, permițând celulelor să dobândească un număr adecvat de copii
mtDNA pe măsură ce se diferențiază în tipuri de celule mature [ 11 , 12 , 13 ]. Replicarea
mitocondriilor, întreținerea, precum și expresia genelor sunt controlate de factori codificați
nuclear, cum ar fi factorul respirator nuclear 1 și 2 ( NRF-1 , NRF-2).), factorul de transcripție
mitocondrial A ( TFAM ) și receptorul-gama activat de peroxizomi activat-1a ( PGC-1a )
[ 14 , 15 ]. Genomul mitocondrial și nuclear se coordonează și co-evoluează în eucariote pentru a
se adapta la schimbările de mediu. Variația genomului mitocondrial este capabilă să afecteze
expresia genelor pe genomul nuclear [ 16 ]. Cu toate acestea, modul în care regimul alimentar
influențează dinamica mitocondriilor, asociată în continuare cu calitatea cărnii de vită, nu știe
încă.

Furnizarea de macronutrienți dietetici către mitocondrii este influențată de variațiile genetice

care afectează activitățile sistemului de transport de electroni, semnalizarea organelelor
retrograde către genomul nuclear și semnalizarea anterogradă către mitocondrie [ 17 , 18 ]. În
obezitatea indusă de dietă, funcția mitocondrială afectată și conținutul scăzut de mitocondrie au
fost găsite în ficat și mușchii scheletici [ 19 , 20 ]. Suplimentarea alimentară cu plasminogen a
crescut numărul de copii mitocondriale și a îmbunătățit funcția mitocondrială la șoareci
[ 19 , 20 , 21 ]]. O reducere a numărului de copii ADNmt și a expresiei genelor implicate în
biogeneza mitocondrială în ficatul șobolanilor hrăniți cu o dietă bogată în fructoză [ 22 ]. La
hrănirea muștelor cu o dietă bogată în carbohidrați, expresia genelor legate de mitocondrii și
ADNmt au fost modificate [ 23 ]. Analiza ARN-seq a arătat că genele asociate cu funcția
mitocondrială au fost exprimate diferențial între junincile hrănite cu conținut scăzut de proteine
pentru diete cu energie ridicată sau scăzută [ 24 ].

Între timp, dieta prin interacțiunile haplotipului ADN mitocondrial stimulează flexibilitatea
metabolică și fitnessul organismului [ 23 ]. Profilul metabolomic oferă un strat suplimentar de
cunoștințe pentru reprezentarea completă a fenotipului animalului, dezvăluind contribuțiile
combinate ale expresiei genelor, activității enzimatice și contextul de mediu [ 23 , 25 ]. Ceea ce
mănâncă o vacă poate avea un efect semnificativ asupra compoziției metabolice și nutritive a
cărnii de vită prin modularea metabolismului și a cheltuielilor energetice [ 1 ]. Carnea de vită
hrănită cu iarbă poate conține mai puține grăsimi totale decât carnea de vită hrănită cu cereale,
dar mult mai mulți acizi grași omega-3 și acid linoleic conjugat [ 26 , 27 , 28 ]]. În studiile
noastre anterioare, s-au observat modificări ale divergentelor în acizii grași liberi, nivelurile de
lipide și modelele de expresie a genelor între bovinele Angus hrănite cu iarbă și hrănite cu
cereale [ 29 , 30 , 31 ]]. Cu toate acestea, lipsesc informații despre posibilul mecanism privind
funcția mitocondrială și metabolismul dintre cei hrăniți cu iarbă și cei hrăniți cu cereale. Aici,
propunem utilizarea măsurătorilor trio ale numărului de copii mtDNA, ARNm transcris din
mtDNA și ARNm transcris din ADN-ul nuclear legat de mitocondrii, pentru a explora rolurile
mitocondriale care au răspuns la diferite diete la bovinele Angus. În paralel, am combinat aceste
date cu metabolomica pentru a evalua corelația dintre genele legate de mitocondrii și nivelurile
de metaboliți. Aceste descoperiri oferă, în plus, perspective asupra modelelor de coordonare
transcripțională dintre genomul mitocondrial și cel nuclear.
Metode
Animale și declarație de etică
Vitele Angus hrănite cu iarbă și hrănite cu cereale au fost crescute la ferma Wye Angus, care a
fost închisă de mai bine de 70 de ani, au o genetică similară. Grupul hrănit cu cereale a primit o
dietă convențională compusă din porumb decojit, porumb siloz, soia și oligominerale. Viii hrăniți
cu iarbă consumau de obicei lucernă pășunată. Dieta alcătuiește, iar regimentele de hrănire
pentru bovinele hrănite cu iarbă și cu cereale sunt descrise în Fișierul suplimentar 1: Tabelul
S1. Țesuturile mușchilor longissimus dorsi, ficatul, splina și rumenul au fost colectate de la
bovici hrăniți cu iarbă și, respectiv, hrăniți cu cereale, când au atins greutatea pieței. Animalele
hrănite cu cereale au atins greutatea pieței în jurul vârstei de 14 luni, în timp ce vicii hrăniți cu
iarbă au avut nevoie de aproximativ 200 de zile suplimentare pentru a ajunge la o valoare
similară a greutății. Probele au fost prelevate imediat după eutanasie, congelate în azot lichid și
păstrate la -80 ° C până când sunt utilizate pentru extragerea ARN și ADN-ului. Recoltarea
sângelui pentru ambele grupuri a fost efectuată înainte de sacrificare. Analiza profilului
metabolomic a fost efectuată în probe de sânge și mușchi de la opt indivizi din grupul hrănit cu
iarbă și, respectiv, grupul hrănit cu cereale. Apoi, cele patru țesuturi de la doi indivizi selectați
aleatoriu din fiecare grup au fost utilizate pentru secvențierea profundă.

Toate experimentele pe animale au fost efectuate conform ghidurilor NIH pentru adăpostirea și
îngrijirea animalelor de laborator și urmând reglementările Universității din Maryland din
College Park (UMCP). Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC)
UMCP a revizuit și a aprobat protocoalele (numărul de permis R-08-62).

Analiza numărului de copii mtDNA

A fost preparat ADN-ul și analiza numărului de copii mtDNA a fost efectuată conform raportului
anterior [ 32 , 33 ]. Pe scurt, ADN-ul total a fost extras din țesuturile mușchilor longissimus
dorsi, ficat, splină și rumen folosind kit-ul Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega,
Madison, WI, SUA), respectiv. Concentrația de ADN a fost detectată utilizând spectrofotometrul
Nanodrop-2000 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, DE) și ajustată la 50
ng/μL. Primerii au fost proiectați pentru patru gene mitocondriale: ND2 (NADH dehidrogenază
subunitatea 2), ND5 (NADH dehidrogenază subunitatea 5), CYTB (citocrom
B), 12sRNA și COX3 (citocrom oxidază subunitatea III). ACTB _Gena (actina B) a fost utilizată
ca genă de control nuclear. Pentru analiza numărului de copii mtDNA, a fost efectuată
amplificarea cantitativă PCR în timp real (qPCR) a ADN-ului genomic pe un termociclor C1000
Touch (BioRad, Hercules, CA, SUA). Reacțiile pentru fiecare genă au fost efectuate cu 50 ng
ADN genomic în triplicat într-un volum final de 10 μL utilizând 300 nmol/L de primeri specifici
și amestecul 2 × SYBR Green PCR (Biorad, Hercules, CA, SUA). Programul PCR a fost de 95
°C timp de 5 minute, 40 de cicluri de 95 °C timp de 15 s, 60 °C timp de 30 s și 72 °C timp de 30
s, cu o analiză a curbei de topire (65 °C–95 °C ) în ultimul ciclu pentru a evalua specificitatea de
amplificare. Pentru fiecare cursă, a fost generată o curbă standard din diluții în serie de 10 ori
(10   până la 10  ). Numerele relative de copii ale ADNmt au fost calculate în urma ecuației
-1 -8

[ 34 ]: numărul de copii ale ADNmt = 2  1 + (Ct 

 , unde Ct reprezintă pragul mediu al
n_gene 
-Ct 
mt_gene 
)

ciclului. Datele privind numărul de copii ADNmt din cele patru țesuturi au fost analizate separat.
Secvențierea și analiza ARN-ului
Extracția ARN, sinteza ADNc, pregătirea bibliotecii, secvențierea transcriptomului și datele
brute au fost efectuate din protocoalele noastre raportate [ 29 , 30 , 31 ]. Am folosit FastQC
v.0.11.2 ( https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ ) pentru a verifica
calitatea datelor secvenței și Trim Galore v 0.4.0 ( https://www.bioinformatics.
babraham.ac.uk/projects/trim_galore/ ) pentru a curăța datele. Datele curățate au fost aliniate la
genomul de referință descărcat de la Ensembl (Bos_taurus.ARS-UCD 1.2) folosind Hisat2
( https://ccb.jhu.edu/software/hisat2/ ) [ 35 ]. Genele exprimate diferențial au fost calculate
utilizând Cuffdiff ( cole-trapnell-lab.github.io/cufflinks/cuffdiff). O genă a fost considerată a fi
exprimată diferențial atunci când modificările de ori ≥2 și FDR  < 0,15. Analiza de îmbogățire a
Ontologiei genelor (GO) și analiza căii Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes (KEGG) au
fost implementate cu instrumente STRING ( http://string-db.org/ ) și KOBAS 3.0
( http://kobas.cbi.pku). edu.cn/ ).

Profilul metabolomic
Analiza profilului metabolomic a fost efectuată de Platforma Metabolon, așa cum a fost descris
anterior [ 29]. Sângelui întreg și țesuturilor musculare li sa atribuit un identificator unic de către
Sistemul de management al informațiilor din laboratorul Metabolon (LIMS). Probele au fost
preparate folosind sistemul automat MicroLab STAR de la Hamilton Company. Un standard de
recuperare a fost adăugat înainte de primul pas în procesul de extracție în scopuri de control al
calității (QC). Pregătirea probei a fost efectuată utilizând un proces de extracție cu metanol apos
pentru a îndepărta fracția de proteină, permițând în același timp recuperarea maximă a
moleculelor mici. Extractul rezultat a fost împărțit în patru fracții: una pentru analiză prin
cromatografie lichidă/spectroscopie de masă (LC/MS) (mod pozitiv), una pentru LC/MS (mod
negativ), una pentru cromatografie în gaz/spectroscopie de masă (GC/MS) , și unul pentru
backup. Probele au fost plasate pentru scurt timp pe un TurboVap (Zymark) pentru a îndepărta
solventul organic. Fiecare probă a fost apoi congelată și uscată sub vid. Probele au fost apoi
pregătite pentru instrumentul corespunzător. Progresul LC/MS, GC/MS, QA/QC, extragerea
datelor și identificarea compusului au fost descrise în detaliu în publicația anterioară a
laboratorului nostru. Pachetul MUVR din R a fost folosit pentru a găsi biomarkerii metabolici
[36 ].

Îmbogățirea metabolomică și caracterizarea căilor

Analiza căii a fost efectuată de MetaboAnalyst 4.0 [ 37 ]. Bazele de date comune ale căilor din
MetaboAnalyst 4.0 au fost utilizate pentru a explora căile de impact metabolic. Calea cu o
valoare P mai mică de 0,05, precum și o valoare de impact mai mare de 0,1, a fost definită ca o
cale de impact semnificativă. Gradul de centralitate a fost selectat pentru importanța nodului și
calculul valorii impactului căii în analiza topologică. Distribuția hipergeometrică în analiza
suprareprezentării a fost aplicată pentru a evalua semnificația fiecărei căi pe baza suprapunerii
acesteia cu listele de căi din bazele de date comune. Semnificația statistică a fost definită la
articulația P  < 0,05.

Rezultate
Variația numărului de copii MtDNA în diferite țesuturi
Numărul de copii ADN-mt, testat cu seturi de primeri independente, a arătat diferența între
grupurile hrănite cu iarbă și cele hrănite cu cereale. În general, boii hrăniți cu iarbă au avut un
număr mai mare de copii ADNmt decât boii hrăniți cu cereale. Dintre țesuturi, numărul de copii
ADNmt a fost mai mare în ficat decât în celelalte trei țesuturi, indiferent de cele hrănite cu iarbă
și cele hrănite cu cereale. Următorul a fost muşchi. În ceea ce privește setul de primere
ND2/ACTB , dieta a afectat semnificativ numărul de copii. În ficat și mușchi, numărul de copii
ADNmt a arătat diferențe semnificative între hrăniți cu iarbă și hrăniți cu cereale ( P  <
0,05). Dar a existat o influență redusă asupra numărului de copii în rumen și splină. Numărul de
copiere în ceea ce privește CYTB/ACTB , COX3/ACTB sau 12SRNA/ACTB a arătat un rezultat
similar (Fig.1 ).

Fig. 1

Variația numărului de copii ADNmt în diferite țesuturi între hrănite cu iarbă și hrănite
cu cereale
Imagine la dimensiune completă

Expresia genelor codificate de ADN-ul mitocondriilor

Pentru a identifica dacă expresia genei mitocondriale a fost modificată la bovinele hrănite cu
iarbă și cu cereale, cele 13 gene codificate cu ADNmt au fost examinate folosind datele de
secvențiere a ARN (Fig. 2 ). În mușchi, șapte dintre cele 13
gene, ND1 , ND2 , ND3 , ND4 , ND5 , COX2 și CYTB , au fost semnificativ supra-reglate în
grupul hrănit cu cereale, comparativ cu grupul hrănit cu iarbă. În
ficat, ND1 , ND2 , ND5 , COX2 și CYTB au avut niveluri de expresie mai scăzute în grupul hrănit
cu iarbă. În splină, doar o genă codificată de mtDNA, ND3, s-a arătat semnificativ mai scăzut la
grupul hrănit cu iarbă. În rumen, nu a existat nicio genă codificată de mtDNA care a fost
exprimată semnificativ între cele două diete. Interesant, în cele patru țesuturi, nicio genă
codificată cu mtDNA exprimată diferențial nu a fost demonstrată o reglare în sus la bovinele
Angus hrănite cu iarbă.

Fig. 2

Harta termică care arată expresia relativă a genelor codificate mtDNA în cele patru
țesuturi ale bovinelor Angus hrănite cu iarbă și hrănite cu cereale. Valoarea medie a
fragmentelor pe kilobază de transcriere per milion (FPKM) a celor două replici a fost
utilizată ca expresie a genei, iar harta termică a fost reprezentată grafic pe baza
log   (FPKM+ 1). Legenda culorii reprezintă nivelul corespunzător, cu roșu indicând
2

nivelul ridicat de expresie, iar albastrul indicând nivelul scăzut de exprimare

Imagine la dimensiune completă
Gene nucleare legate de mitocondrii exprimate diferențial
Genele legate de mitocondriile umane au fost descărcate din baza de date a proteinelor
mitocondriale umane MitoProteome [ 38 ]. Numele genelor au fost comparate direct cu cele la
bovine folosind instrumentul de extragere a datelor BioMart
( http://useast.ensembl.org/biomart/martview ). Între timp, genele raportate a fi implicate în
funcția mitocondrială au fost generate prin căutarea „mitocondriale de vite” în baza de date
NCBI Gene (Centrul Național pentru Informații Biotehnologice, Biblioteca Națională de
Medicină din SUA, Gene, http://www.ncbi.nlm). nih.gov/gene ). În cele din urmă, au fost
potrivite 1283 de gene, inclusiv 13 gene de proteine codificate ADNmt, precum și 1270 de gene
nucleare legate de mitocondrii (Fișier suplimentar 1 : Tabelul S2).

Nivelurile de expresie a 1270 de gene nucleare legate de mitocondrie au fost, de asemenea,

investigate pe baza datelor de secvențiere a ARN și au fost efectuate analize ale genelor
exprimate diferențial (DEG) între cele două diete în țesuturi diferite. Numerele genelor nucleare
legate de mitocondrii exprimate diferențial au fost prezentate în Fig.  3 și Fișierul suplimentar 1 :
Tabelul S3-S7. În comparație cu grupul hrănit cu cereale, majoritatea DEG-urilor au fost reglate
în jos în mușchiul grupului hrănit cu iarbă, dar mai multe DEG au fost reglate în sus în celelalte
trei țesuturi (Fig. 3 a). În mușchi, 15 gene nucleare legate de mitocondrii au fost exprimate
diferențial într-o manieră dependentă de dietă. CKMT2 (creatin kinază, mitocondrială
2), UBB(ubiquitin B) și MDH1 (malat dehidrogenază 1) au fost reglate în sus în grupul hrănit cu
iarbă, în timp ce alte nouă gene au avut modelul de expresie opus. În ficat, efectul schimbării
dietei a arătat că 27 de gene nucleare legate de mitocondrii au fost exprimate diferențial, toate
fiind reglate în sus în grupul hrănit cu iarbă. Dintre cele nouă DEG observate în splină, șapte
gene au fost reglate în sus, iar două gene, LYRM7 (motivul LYR care conține 7)
și CYP11A1 (citocromul P450, familia 11, subfamilia A, polipeptida 1), au fost reglate în jos în
iarbă. grup alimentat. În rumen, 15 gene nucleare legate de mitocondrii au fost exprimate
diferențial (modificări de ori ≥2, FDR < 0,15), dintre care 11 gene au fost reglate în sus, iar patru
gene au fost reglate în jos la cele hrănite cu iarbă în comparație cu cele hrănite cu cereale. Nu au
existat DEG în comun între cele patru țesuturi ale celor două diete diferite. UBB a fost de obicei
exprimată diferențial în mușchi și ficat. Deși au existat două DEG, DHCR24 (24-
dehidrocolesterol reductază) și SHMT1 (serină hidroximetiltransferaza 1), exprimate în mod
obișnuit în ficat și rumen (Fig. 3 b).

Fig. 3
Gene nucleare legate de mitocondrii exprimate diferențial. un număr de DEG reglate în
sus sau în jos în cele patru țesuturi. Genele reglate în sus și în jos au fost afișate în roșu
și, respectiv, verde. b Diagrama Venn care arată numărul de DEG exprimat în mod
obișnuit în cele patru țesuturi
Imagine la dimensiune completă

Analiza funcțiilor bioinformatice

Pentru a defini în continuare funcția biologică potențială a genelor mitocondriale exprimate
diferențial, inclusiv genele proteice codificate ADNmt, precum și genele nucleare legate de
mitocondrie, au fost efectuate analiza GO și analiza căii KEGG. Termenii GO îmbogățiți ai
proceselor biologice, funcțiilor moleculare și componentelor celulare au fost afișați în
Tabelul  1 și Fișierul suplimentar 1 : Tabelul S8 ( FDR  < 0,05). Pentru analiza căii KEGG,
majoritatea căilor exprimate diferențial ( P  < 0,05) au fost asociate cu căile metabolice în cele
patru țesuturi (fișier suplimentar 2: Fig. S1). În mușchi, căile metabolice au inclus metabolismul
carbonului, metabolismul glioxilatului și dicarboxilatului și metabolismul butanoatului. În ficat,
metabolismul a fost implicat în metabolismul piruvatului, metabolismul aminoacizilor,
metabolismul glioxilatului și dicarboxilat, metabolismul carbonului și metabolismul
glicerolipidului. Între timp, calea de semnalizare FoxO a fost, de asemenea, exprimată
diferențial, ceea ce a fost asociat cu dezvoltarea.

Tabelul 1 Top cinci termeni de ontologie genică în cele patru țesuturi

Tabel de dimensiuni complete

Predicția potențialilor biomarkeri metabolici și a căilor metabolice de impact

semnificativ
Datele LC/MS și GC/MS au detectat 326 și 353 de compuși în sânge și mușchi [ 29 ] (fișier
suplimentar 3 ). Apoi, compușii au fost analizați folosind pachetul MUVR în R pentru a găsi
biomarkeri tematici. Au fost identificați 40 și 23 de biomarkeri metabolici în sânge și mușchi ai
grupului hrănit cu cereale, comparativ cu un grup hrănit cu iarbă, respectiv (Fig.  4 ). Metaboliții
implicați au aparținut aminoacizilor, carbohidraților, cofactorilor și vitaminelor, lipidelor,
nucleotidelor, peptidelor și xenobioticelor. Pentru cei 40 de biomarkeri metabolici din sânge, 14
metaboliți au avut o abundență relativă mai mare în sânge a grupului hrănit cu cereale decât a
grupului hrănit cu iarbă ( P < 0,01). Alți 26 de metaboliți au scăzut semnificativ în grupul hrănit
cu cereale. În mușchi, 14 biomarkeri metabolici au fost măriți într-un grup hrănit cu cereale,
comparativ cu grupul hrănit cu iarbă, iar ceilalți nouă au fost scăzuți ( P  < 0,01). Printre acești
metaboliți, patru lipide (1-eicosapentaenoil glicerofosfoetanolamină, 2-eicosapentaenoil
glicerofosfoetanolamină, 1-linolenoil glicerofosfocolină (18:3n-3) și 3-dehidrocarnitină), un
aminoacid (N-metilprolină) și un aminoacid (N-metilprolină) ) au fost propuși ca biomarkeri
metabolici convenționali pentru cele două țesuturi, care au avut aceeași tendință de abundență
între cele două grupuri de dietă diferite.

Fig. 4
Biomarkeri metabolici potențiali și căi metabolice în sânge și mușchi ai grupului hrănit
cu cereale în comparație cu grupul hrănit cu iarbă. B, Sânge; M, Muschi; Evidențierea
culorii indică cei șase metaboliți comuni din cele două țesuturi
Imagine la dimensiune completă

Analiza căii de impact a relevat că opt căi au fost căi de impact semnificative bazate pe cei 23 de
biomarkeri metabolici în mușchi (Fig. 5 a): metabolismul glicerofosfolipidelor ( P  = 0,0018,
valoarea impactului = 0,6), metabolismul argininei și prolinei ( P  = 0,0021, valoarea
impactului). = 0,2162), metabolismul acidului alfa-linolenic ( P  = 0,0036, valoarea impactului =
0,25), metabolismul purinelor ( P  = 0,0102, valoarea impactului = 0,1077), metabolismul
glutationului ( P  = 0,0164, valoarea impactului = 0,2222), metabolismul acidului linoleic ( P  =
0,0359, valoarea impactului = 0,25), metabolismul D-glutaminei și D-glutamatului ( P  = 0,0359,
valoarea impactului = 0,5), metabolismul azotului ( P = 0,0429, valoarea impactului = 0,2). Între
timp, au existat patru căi de impact semnificative bazate pe cei 40 de biomarkeri metabolici din
sânge (Fig. 5 b): biosinteza neomicinei, kanamicinei și gentamicinei ( P  = 0,0171, valoarea
impactului = 1), metabolismul glicinei, serinei și treoninei ( P  = 0,0328, valoarea impactului =
0,1515), metabolismul glicerofosfolipidelor ( P  = 0,0364, valoarea impactului = 0,4857),
metabolismul acidului linoleic ( P  = 0,0423, valoarea impactului = 0,25).

Fig. 5

Vederea impactului căii a biomarkerilor metabolici identificați în țesutul muscular și

sanguin din grupul hrănit cu iarbă și, respectiv, cu cereale. o vedere a impactului căii
biomarkerilor metabolici identificați în mușchi. b vizualizarea impactului căii
biomarkerilor metabolici identificați în sânge. Axele X și Y reprezintă valoarea
impactului căii și respectiv valoarea îmbogățirii căii; dimensiuni mai mari și culori mai
închise reprezintă valori mai mari de îmbogățire a căii și de impact
Imagine la dimensiune completă

Analiza integrată a metaboliților și a genelor mitocondriale

Analiza suprareprezentării și analiza topologiei căii au fost efectuate între biomarkerii metabolici
diferiți ai dietei și genele mitocondriale exprimate diferențial în mușchiul grupurilor hrănite cu
iarbă și cu cereale (analiza I). Nutrienții digerați în rumen sunt absorbiți de peretele epitelial al
rumenului și apoi sunt transportați la mamar la ficat pentru glicogeneză, urmat de transportul
către alte țesuturi prin fluxul sanguin [ 39 , 40 ].]. Prin urmare, am integrat împreună genele
nucleare legate de mitocondrii exprimate diferențial în ficat și rumen pentru a stabili biomarkerii
metabolici din sânge și am făcut analiza supra-reprezentării și analiza topologiei căii (analiza
II). Analiza topologică utilizează structura unei căi date pentru a evalua importanța relativă a
genelor/metaboliților pe baza locațiilor lor relative. În analiza I, au fost identificate 27 de căi, iar
20 dintre ele au fost afișate în Fig. 6a . În analiza II, au fost identificate 46 de căi, dintre care
primele 20 au fost prezentate în Fig. 6b. Șase și nouă căi au fost semnificativ îmbogățite în
analiza I și analiza II, receptiv. Acestea includ arginina și prolina, glioxilat și dicarboxilat, acid
alfa-linolenic, butanoat, glicerofosfolipide și metabolismul beta-alaninei. Alte metabolisme
includ, de asemenea, piruvat, glicină, serină și treonină, degradarea lizinei, glioxilat și
dicarboxilat și triptofan. Rețelele de interacțiune genă-metabolit au fost, de asemenea, prezentate
în Fig .

Fig. 6
Analiza integrată a căii metabolice din metaboliți combinați și gene mitocondriale
exprimate diferențial în ( a ) mușchi sau ( b ) sânge. Caseta roșie reprezintă căile
semnificativ îmbogățite
Imagine la dimensiune completă

Discuţie
Variația numărului de copii MtDNA
Conform analizei nutriționale a dietei cu iarbă și a dietei cu cereale, conținutul de carbohidrați
fără fibre și amidon a fost mult mai mare în dieta cu cereale, oferind mai mulți nutrienți total
digerabili și, de asemenea, energie disponibilă. Dimpotrivă, proteinele, lignina, materia fibrelor
și cenușa au fost mai abundente în dieta cu iarbă decât cereale (Fișier suplimentar 1 : Tabelul
S1). S-a raportat că atunci când muștele au fost hrănite cu o dietă bogată în proteine, numărul de
copii ADNmt a crescut în comparație cu dieta bogată în carbohidrați [ 23 ]. În rezultatele noastre,
vicii hrăniți cu iarbă au avut un număr mai mare de copii ADNmt decât boii hrăniți cu cereale,
ceea ce ar putea fi faptul că administrarea de insulină și aminoacizi îmbunătățește biogeneza
mitocondrială și producția de ATP [ 41 ].]. Între timp, numărul de copii ADNmt a fost mai mare
în ficat decât în mușchi, rumen și splină, indiferent de grupul hrănit cu iarbă sau cu
cereale. Conform setului de primeri ND2/ACTB, numărul de copii ADNmt a fost de 3,96 ori mai
mare în ficatul grupului hrănit cu iarbă decât grupul hrănit cu cereale și a fost de 2,46 ori mai
mare în mușchi, ceea ce s-ar putea datora diferitelor mecanism de replicare și menținere a
mtDNA în diferite țesuturi [ 9 , 42 ]. Celulele hepatice și renale își replic ADNmt folosind
mecanismul asincron, mușchiul scheletic și grăsimea brună cu activitate OXPHOS ridicată
utilizează un mod de replicare cuplată cu catenele, combinat cu niveluri crescute de recombinare
[ 9 ].

Expresia genelor legate de mitocondrii

Prin profilarea ARN-seq, 13 gene codificate mtDNA au fost dependente de dietă și ar putea fi
reglementate diferit la nivelul transcripției. În ceea ce privește expresia diferențială, majoritatea
genelor care codifică subunități ale complexului I ( ND1 , ND2 , ND3 , ND4 , ND5 ),
complexului III ( CYTB ) și complexului IV ( COX2 ) au fost reglate în jos în grupul hrănit cu
iarbă, sugerând că dieta bogată în proteine ar putea avea un efect advers asupra genelor
codificate de mtDNA [ 10]. Complexele mitocondriale I, III și IV sunt considerate nucleul de
conservare a energiei al lanțului de transport de electroni, deoarece pompează protoni prin
membrana interioară mitocondrială, care este responsabilă pentru producția de ATP și care
afectează în mod direct funcția mitocondrială [ 43 , 44 ].]. Studiile viitoare ar trebui să analizeze
nivelurile de ATP din diferitele țesuturi ale grupului hrănit cu iarbă și al grupului hrănit cu
cereale. Cu toate acestea, nivelurile mai mari de expresie ale genelor codificate cu ADNmt au
fost împreună cu un număr mai mic de copii ADNmt, ceea ce implică faptul că compensarea
pentru genele codificate cu ADNmt exprimate diferențial rezultate din dieta diferită ar putea fi
prin mecanisme transcripționale, mai degrabă decât prin modificări ale ploidiei ADNmt. Mai
mulți factori, inclusiv, dar fără a se limita la numărul de copii mtDNA, determină în cele din
urmă abundența la starea de echilibru a mtRNA-urilor și a proteinelor derivate într-o celulă
[ 32 , 33 , 45 ], majoritatea fiind factori codificați nuclear [ 16 , 46 ].

Pentru a vedea dacă genomul nuclear legat de mitocondrii experimentează modificări analoge în
expresia genelor din cauza diferitelor diete, am examinat expresia genelor nucleare legate de
mitocondrii în diferite țesuturi ale grupului hrănit cu iarbă și cu cereale. În mușchi, o inspecție a
genelor exprimate diferențial a arătat dovezi pentru reglarea în creștere a transportului de
electroni cuplat la sinteza ATP ( COX6A2 ) la bovicii hrăniți cu cereale. Proteina COX6A2 este o
subunitate a complexului IV al lanțului respirator, a cărui expresie este limitată la mușchii striați
[ 47 , 48 ]. COX6A2 are un rol important în termogeneza și metabolismul energetic al întregului
corp și poate o nouă țintă potențială pentru terapia împotriva obezității induse de dieta bogată în
grăsimi sau a rezistenței la insulină.49 , 50 ]. În ficat, toate genele exprimate diferențial au fost
reglate în sus în grupul hrănit cu iarbă. Conform analizei termenului GO, gena POLG2 a fost
implicată în lanțul de transport al electronilor din respirație. POLG2 codifică subunitățile
accesorii ale ADN polimerazei gamma, care este singura polimerază replicativă ADN implicată
în mitocondriile umane și este crucială pentru replicarea și repararea mtDNA
[ 51 , 52 ]. POLG2 ar putea îmbunătăți interacțiunile cu șablonul ADN și crește atât activitatea
catalitică. Mutațiile din POLG2 au un efect dominant-negativ și duc la deleții multiple de
mtDNA [ 53]. Nivelul mai ridicat de POLG2 ar putea contribui la o cantitate mai mare de copii
de ADNmt în ficatul boiecilor hrăniți cu iarbă în comparație cu cei hrăniți cu cereale. În
rumen, PPIF a fost reglat în sus, iar DCN a fost reglat în jos în grupul hrănit cu iarbă în
comparație cu grupul hrănit cu cereale. Aceste două gene au fost implicate în termenul GO de
„reglare pozitivă a organizării mitocondriilor”. PPIF este cunoscut anterior ca cypD, care este o
proteină mitocondrială însoțitoare importantă și binecunoscută pentru reglarea funcției
mitocondriale și cuplarea lanțului de transport de electroni și a sintezei ATP prin controlul
porului de tranziție a permeabilității mitocondriale [ 54 , 55 ].

Supraexprimarea cypD în mitocondriile celulelor HEK293 a crescut activitatea respiratorie, în

special activitatea complexului III. Acest lucru a condus la asamblarea în creștere a
supercomplexelor care conțin complecșii I, III și IV. În același timp, cypD se leagă de complexul
III și supercomplexele care conțin complexul III și încorporarea mai rapidă a complexului III în
aceste supercomplexe [ 56 ]. DCN este implicat în multiple funcții celulare, cum ar fi
proliferarea, migrarea și invazia și acționează ca o moleculă structurală, precum și un ligand
pentru receptori [ 57 , 58 ]. S-a raportat că DCN a atenuat puternic complexele respiratorii
mitocondriale și mtDNA [ 59 ]. În splină,NDUFA12 a fost implicat în termenul GO de „proces
de oxidare-reducere”, care a fost reglat în sus în grupul hrănit cu iarbă în comparație cu grupul
hrănit cu cereale. NDUFA12 a fost necesar pentru formarea brațului extramembranar al
complexului mitocondrial I [ 60 ] și a avut funcția de stabilitate a complexului I [ 61 ]. Pe baza
acestor rezultate, a sugerat că diferiți factori nucleari legați de mitocondrii, implicați în sinteza
ATP, replicarea mitocondrială, transcripția și întreținerea, ar putea contribui la variația copiei
ADNmt și la modificarea expresiei ADNmt în diferite țesuturi hrănite cu iarbă și cereale. vii
hrăniți.

Căi metabolice cheie după analiză unică și integrată

Conform studiului anterior, s-au găsit modificări ale metabolismului glucozei și divergențe ale
acizilor grași liberi între butii Angus hrăniți cu iarbă și hrăniți cu cereale [ 29 ].]. În studiul de
față, au fost identificați 40 și 23 de biomarkeri metabolici în sângele și mușchiul grupului hrănit
cu cereale, comparativ cu un grup hrănit cu iarbă. Pe baza analizei unei singure căi metabolice,
calea cel mai semnificativ afectată în mușchiul grupului hrănit cu iarbă și al grupului hrănit cu
cereale a fost metabolismul glicerofosfolipidelor, care a fost, de asemenea, semnificativ diferit în
sângele celor două grupe diferite de dietă. Modificările în abundența lipidelor pot indica, de
asemenea, metabolismul alterat al membranei. Fosfoetanolamina, glicerofosfocolina și
glicerofosfoetanolamina au fost crescute în mușchii hrăniți cu cereale și pot sugera o rotație
crescută a membranei, ceea ce poate sprijini creșterea îmbunătățită a țesuturilor [ 62 ].]. În sânge,
calea cel mai semnificativ afectată a fost biosinteza neomicinei, kanamicinei și gentamicinei,
care a fost, de asemenea, punctul de vârf la nivelul combinat (îmbogățire și semnificație
biologică). Metabolitul implicat a fost NADH, care a fost important pentru ciclul TCA. În
contrast, NADH a fost crescut în sânge, dar a scăzut crescut în mușchiul bovinelor hrănite cu
iarbă în comparație cu bovinele hrănite cu cereale și poate evidenția reglarea diferențială a
energiei de către mușchi față de alte țesuturi ca răspuns la aceste diete. Gena înrudită MDH1a
fost reglat în jos în mușchiul grupului hrănit cu cereale în comparație cu cel hrănit cu iarbă, în
timp ce a fost reglat în sus în ficat și rumen. MDH1 este o enzimă dependentă de NAD(H) și o
parte a navetei malat-aspartat (MAS). Sinteza malatului citosolic a fost prin MDH1. MDH1
generează NAD+ la reducerea oxalacetatului la malat. MAS este important pentru homeostazia
redox NAD(H) intracelulară, deoarece se transferă, reducând echivalenții prin membrana
mitocondrială [ 63 ].

Între timp, cea mai critică cale a fost metabolismul argininei și prolinei pe baza analizei integrate
în mușchi. Trei metaboliți (spermidină, L -glutamat, 4-guanidinobutanoat) și o genă ( CKMT2 )
au fost implicați în această cale. CKMT2 este o creatin kinază mitocondrială responsabilă de
transferul fosfatului de înaltă energie din mitocondrie în compartimentul citosol și, în același
timp, de returnarea ADP la sistemul respirator mitocondrial, stimulând astfel fosforilarea
oxidativă, care a fost asociată negativ cu spermidină, L - glutamat și 4-guanidinobutanoat în
rezultatele noastre. Spermidină, L-glutamatul și 4-guanidinobutanoatul au fost niveluri crescute
în mușchii finisați cu cereale și pot reflecta o sinteză mai mare și disponibilitate pentru creșterea
țesuturilor. Spermidina prezintă efecte pleiotrope care includ proprietăți antiinflamatorii, funcții
antioxidante, îmbunătățirea funcției metabolice mitocondriale și respirație [ 64 ]. ATP, ca
polianion, este capabil să suprime efectul policationic al spermidinei [ 65 ]. Cu toate acestea,
relația dintre CKMT2 și spermidină trebuia studiată în continuare. Între timp, spermidina este un
compus poliaminic, iar nivelul mai ridicat în mușchiul finisat cu granule ar putea apărea datorită
menținerii oxidării NADH mitocondriale care a răspuns la un număr mai mic de copii mtDNA
[ 66 ].

Concluzii
În rezumat, aceste date sugerează că dietele cu iarbă și cereale la bovine ar cauza diferențe în
numărul de copii ADNmt, expresia ADNmt și expresia ARNm a genelor nucleare selectate
implicate în funcția mitocondrială. Între timp, modificările expresiei genelor legate de
mitocondrii ar putea contribui la variațiile nivelului metaboliților. Cu toate acestea, sunt necesare
cercetări suplimentare pentru a înțelege mai bine relațiile dintre funcția mitocondriilor,
mecanismele metabolice și moleculare și calitatea cărnii de vită.