DISPOZITIVE BIOMEDICALE bazate pe optică electromagnetică

6.4. Interferometrie și biosenzori

Se consideră două surse de lumină punctiforme S și S , care emit radiații de aceeși
frecvență. În punctul P, elongațiile E și E vor fi descrise de ecuațiile:
E = E ∙ sin ωt + φ și E = E ∙ sin ωt + φ

Fig. 6.4.1
Pentru simplitate vom considera că cele două unde au aceeași amplitudine, adică E =
E = E . Atunci elongația rezultantă E în punctul P, prin suprapunerea lor:
E = E + E = E sin ωt + φ + sin ωt + φ
φ −φ φ +φ
E = 2E cos sin ωt +
2 2
Unda rezultantă este deci tot o undă sinusoidală, având aceeași frecvență ca și cele două
unde din care se compune, iar amplitudinea:
φ −φ φ +φ
A = 2E cos și faza φ =
2 2
Iar intensitatea câmpului electric rezultant: E = A sin(ωt + φ)
Atunci când diferența de fază ∆φ = φ − φ este constantă în timp, spunem că cele două unde,
respectiv cele două surse sunt coerente. În acest caz amplitudinea undei rezultante A este constantă
în timp, ceea ce înseamnă că iluminarea în punctul P va fi aceeași în decursul timpului, iar valoarea
acesteia depinde de valoarea diferenței de fază, ∆φ.
Dispozitivul lui Young are o importanță deosebită, deoarece cu ajutorul lui s-a realizat
prima experiență de interferență, prin care s-a demonstrat valabilitatea principiului Huygens în
optică și prin aceasta valabilitatea teoriei ondulatorii a luminii.
 Acest dispozitiv constă dintr-o sursă de lumină S (un filament drept subțire incandescent,
prevăzut cu un filtru optic care lasă să treacă numai radiații de o anumită lungime de undă), un
paravan opac PO în care sunt practicate două fante dreptunghiulare F și F , paralele atât între ele,
cât și cu filamentul incandescent, aflate la distanța 2l între ele. Un ecran este plasat la distanța D
de panoul cu cele două fante.
Punctele de pe frontul de undă situate în dreptul fantelor, conform principilui Huygens,
emit noi fronturi de unde. Astfel, cele două fante devin două surse de lumină coerentă, deoarece
undele emise de ele provin de pe aceeași suprafață de undă.
Schematic, dispozitivul este reprezentat în Fig.6.4.2.

Fig. 6.4.2
Vom nota cu r și r distanțele dintre surse și un punct oarecare P de pe ecran. Notăm cu
x = OP, distanța dintre axa MO de simetrie a sistemului și punctul considerat, P. Presupunem că
π
sursele secundare S și S oscilează după legea, E` = E sin t. Ecuațiile celor două unde, în
punctul P vor fi:
π π
E = E sin t − , și E = E sin t− ,
π π
Iar suprapunerea lor: E = E + E = 2E sin t− + sin t− .
Transformând suma din paranteză într-un produs obținem:
2π r − r 2π r +r
E = 2E cos ∙ sin t− .
T 2c T 2c
Amplitudinea undei rezultante este:
2π(r − r ) π(r − r )
A = 2E cos = 2E cos .
2cT λ
Intensitatea luminoasă în punctul P va fi:
π(r − r )
I = A = 4E cos .
λ
π( )
Intensitatea luminoasă I va fi maximă în punctul P, în cazul în care cos = 1, adică
λ
λ
atunci când diferența de drum r − r = 2k unde k este un număr întreg (0, ±1, ±2, … ) și
λ
minimă dacă r − r = (2k + 1) .
 Diferența r − r este o diferență de drum geometric, reprezentând diferența dintre
distanțele parcurse de lumină, pe cele două drumuri, în vid până în punctul P.
Dacă într-un mediu transparent având indicele de refracție n, lumina străbate o distanță r,
produsul n ∙ r se numește drum optic și se notează (r) = nr.
Deci, dacă în dispozitivul lui Young spațiul dintre fante și ecran ar fi un mediu transparent
de indice de refracție n, atunci diferența de drum optic ar fi n(r − r ). În acest caz, condiția de
maxim sau minim va fi:
λ λ
n(r − r ) = 2k respectiv n(r − r ) = (2k + 1) .
2 2
Prin urmare, ca rezultat al interferenței staționare a undelor coerente provenite din S și S ,
se vor forma pe ecranul E o serie de benzi numite și franje rectilinii, luminoase și întunecoase
(maxime și minime), perpendiculare pe planul desenului deci paralele între ele.
Interfranja. Determinarea lungimii de undă. Din geometria figurii cu interferometrul Young se
obțin următoarele relații, în triunghiurile dreptunghice corespunzătoare cu ipotenuzele r1 și r2 (câte
o catetă D, și câte o catetă de-a lungul ecranului):
r = D + (x − 𝑙/2) și r = D + (x + 𝑙/2) .
Făcând diferența lor obținem:
x𝑙
r − r = (r − r )(r + r ) = x𝑙 ⇒ r − r = .
r +r
Ținând cont că în experiențele de interferență distanța x = OP ≪ D, putem face
aproximația r + r ≅ 2D. Notând cu x valoarea lui x în punctul în care intensitatea este maximă,
adică în care este satisfăcută condiția r − r = kλ, relația de mai sus devine:
x 𝑙 kDλ
= kλ , de unde x =
D 𝑙
Pentru un ordin de interferență imediat superior k + 1, relația anterioară se va scrie:
(k + 1)Dλ
x = .
𝑙
Distanța dintre două maxime (sau două minime) consecutive se numește interfranjă, se
λ
notează cu i și se obține făcând diferența: i = x −x = .
În cazul experienței lui Young, interfranja este deci o constantă (nu depinde de x), ceea ce
înseamnă că franjele sunt echidistante pe ecranul E.
Relația lui i poate servi la determinarea lungimii de undă. Astfel, măsurând distanța dintre
sursele coerente 𝑙, distanța D și interfranja i, lungimea de undă se va calcula: λ = .
Interferența localizată. Lame subțiri.
Un fascicul de lumină poate fi divizat cu una sau mai multe suprafețe reflectătoare, de pe
care o parte din lumină se reflectă, iar altă parte se transmite.
În natură putem observa adeseori fenomene de interferență, folosind drept izvor de lumină,
lumina zilei. Un asemenea tip de interferență are loc la iluminarea unei pelicule transparente,
subțiri, când descompunerea undei de lumină necesară pentru realizarea fasciculelor coerente se
obține prin reflexia luminii pe fața superioară și pe cea inferioară a peliculei. Dacă lumina folosită
este lumină albă, pelicula subțire apare colorată.
Acest fenomen, cunoscut sub numele de culorile lamelor subțiri, se observă ușor pe:
peliculele baloanelor de săpun, petele de ulei sau de petrol care apar pe suprafața apei de pe străzi,
etc. Vom studia două forme de lame subțiri transparente.
 Lama cu suprafețe plan paralele Fie d grosimea lamei și n indicele de refracție. Diferența
de drum optic dintre cele două raze (2 și 3) care interferă va fi: δ = (L ) − (L ) = n(AB + BC) −
λ
AD − .

Fig. 6.4.3
λ λ
În expresia de mai sus a drumului optic (L ) = AD − , apare datorită pierderii unei
semiunde ca și în cazul reflexiei undelor mecanice pe un mediu mai dens. Exprimând segmentele
AB = BC și AD în funcție de unghiul de incidență i, de unghiul de refracție r, și de grosimea lamei
d obținem:
d d λ
δ=r + − AC sin i − .
cos r cos r 2
Deoarece AC = 2d tg r = 2d , n= , relația de mai sus devine:
λ
δ = 2nd cos r + .
2
În cazul incidenței normale (i = 0) și din legea refracției n sin r = sin i, reiese că și
unghiul de refracție r = 0, adică cos r = 1. În acest caz, relația anterioară devine:
λ
δ = 2nd + .
Pana optică. Dacă cele două suprafețe plane ce delimitează lama subțire fac un unghi mic între
ele, pelicula din mediul respectiv formează o pană.

Fig. 6.4.4
Fie n indicele de refracție al mediului din care este formată pana, α unghiul penei, SA raza
incidentă și razele coerente AC și BD prin reflexii și refracții pe suprafețele de separare dintre pană
și aer. Punctul de localizare a franjei ce corespunde razei incidente SA va fi în M, la intersecția
prelungirilor razelor AC și BD. Toate punctele de localizare a franjelor provenite de la raze
incidente paralele cu SA se vor afla într-un plan P ce trece prin vârful penei O și punctul M.
 Dacă fasciculul incident este perpendicular pe fața superioară a penei, ținând cont că
unghiul α este foarte mic (de ordinul minutului), planul de localizare a franjelor se va afla în
interiorul penei, practic pe suprafața penei. Din acest motiv se spune că franjele sunt localizate pe
pană. Starea de interferență într-un punct dat de pe pană este determinată de grosimea ei în acel
punct (franje de egală grosime). Franjele formate vor corespunde deci diferenței de drum optic
determinată de diferitele grosimi ale penei. Ele sunt franje drepte, paralele între ele și cu muchia
λ
penei și echidistante. Condiția de maxim sau de minim este determinată de relația δ = 2nd + .

Fig. 6.4.5
La incidență normală, interfranja i se calculează astfel: fie d o grosime oarecare a penei
pentru care avem un maxim de ordin k (fig. 6.). Astfel, din relația anterioară obținem:
λ
pentru maximul de ordin k: 2nd + = kλ,
λ
și pentru maximul de ordin k + 1: 2nd + = (k + 1)λ,
λ
Rezultă distanța dintre două maxime consecutive: d −d = = αi
λ
Interfranja este dată de relația: i = α
Interferența pe lame subțiri se obține cu surse de lumină nepunctiforme, întinse. Deși razele
paralele provin din puncte diferite ale sursei, interferența are loc din cauza grosimii foarte mici a
peliculei subțiri.
Cu ajutorul a două lame de sticlă se poate forma și o pană de aer. Față de cele studiate
anterior, deosebirea constă în faptul că pierderea de semiundă are loc la reflexia pe suprafața
inferioară a penei.

Fig. 6.4.6
Interferența produsă de lame subțiri are foarte multe aplicații în tehnică. Astfel, o peliculă
subțire plan-paralelă (transparentă) poate servi fie ca strat antireflex, fie ca strat reflectător. Dacă
undele reflectate pe cele două fețe ale peliculei sunt în antifază la ieșirea din lamă atunci prin
interferență ele se distrug. Dimpotrivă, dacă grosimea peliculei și indicele de refracție al acesteia
sunt astfel alese încât cele două unde reflectate să se adune (sunt în fază) la interferență, unda
rezultată se va întări. Cu ajutorul mai multor straturi subțiri depuse pe o suprafață de sticlă de
exemplu, se poate obține o oglindă care reflectă aproape în întregime fluxul luminos incident (peste
99%). Acestea sunt folosite în toate aparatele optice.
Pana de aer este folosită pentru verificarea calității suprafețelor. În acest scop se formează
o pană de aer cu o suprafață etalon (suprafața apei liniștite sau a mercurului de exemplu) și
suprafața supusă controlului. Aceasta din urmă prezentând abateri de la planeitate (asperități,
defecte) franjele de egală grosime nu vor fi drepte și paralele ci niște linii ondulate în funcție de
grosimea penei.

Aplicații în biologie și medicină. BIOSENZORI

Atunci când moleculele dintr-o soluție se acumulează pe o suprafață plană din material
dielectric, acestea vor forma un strat subțire. Spunem că se formează o lamă subțire cu fețe plan
paralele (vezi teoria de mai sus). Dacă acest substrat este iluminat cu o undă optică, aceasta se va
reflecta într-un mod diferit față de cazul în care aceste molecule nu sunt acolo. Acest lucru se va
observa în figura de interferență.
Se poate prepara suprafața dielectrică să fie funcționalizată astfel încât de ea să se lege doar
anumite molecule dorite din soluție, prin legături chimice specifice, iar celelalte să nu aibă
posibilitatea de a se atașa de suprafață. Iar prin monitorizarea figurii de interferență se poate
determina concentrația substanței care se monitorizează. Acesta este principiul de bază al
funcționării biosenzorilor cu afinitate de captură a suprafeței care poate da o modificare a
semnalului optic. Primul obiectiv al proiectării unor astfel de senzori este să se realizeze
specificitatea legării moleculelor de suprafață la cea mai bună sensibilitate. Un alt parametru
important este responsivitatea sau răspunsul.
Prin specificitate mare se înțelege raportul cel mai mare dintre moleculele specifice și
nespecifice atașate de suprafață.
Prin sensibilitate mare se înțelege cea mai mică concentrație de molecule specifice care
poate fi detectată de către senzorul respectiv.
Prin responsivitate înaltă sau răspuns bun se înțelege capacitatea senzorului de a percepe
cea mai mică schimbare.
De exemplu, dacă grosimea stratului de molecule de proteine este de aproximativ 1nm,
atunci diferența de fază introdusă de acest strat este în jurul valorilor de 10 - 20 miliradiani. De
aceea, este important ca zgomotele optice să fie îndepărtate sau măcar minimalizate. Pentru
obținerea unei responsivități bune, cele mai bune metode sunt cele interferometrice.
Acești biosenzori interferometrici includ: 1) biosenzori colorimetrici bazați pe schimbarea
culorii, 2) biosenzori elipsometrici bazați pe schimbarea stării de polarizare, 3) imagini de
interferometrie moleculară, 4) BioCD-urile.
6.5. Principii pentru determinarea compoziției chimice cu spectrofotometrul
Un spectrofotometru este un instrument care măsoară intensitatea luminoasă absorbită de
către o probă la fiecare lungime de undă. Beckman și colegii săi de la National Technologies
Laboratory au construit primul aparat în 1940. Cu ajutorul său se poate determina concentrația
unei anumite soluții pentru care se cunoaște compoziția chimică. Dacă în soluție se află și
componente necunoscute, se pot identifica acestea pe baza spectrului lor de absorbție și folosind o
bază de date care conține o bibliotecă cu spectrele celor mai cunoscute substanțe.
Componentele principale ale unui spectrofotometru sunt: ►o sursă de lumină, ►un
monocromator, ►recipient pentru probă, ►detector, ►sistem de afișaj.
Sursa de lumină trebuie să fie cu spectru continuu, deoarece spectrofotometrul trebuie să
aibă toate lungimile de undă pentru a le trimite pe soluția care se studiază, deoarece fiecare
aplicație necesită propriile lungimi de undă.
Monocromatorul descompune radiația incidentă în componentele ei folosind o prismă sau
o rețea de difracție, adică fie fenomenul de dispersie, fie pe cel de difracție. Tot monocromatorul
este prevăzut cu o fantă pentru a selecta câte o bandă îngustă de lungimi de undă pe care să le
trimită pe probă succesiv.
Recipientul pentru probă trebuie să fie dintr-un material transparent pentru toate lungimile
de undă pentru care este fabricat spectrofotometrul. Există spectrofotometre doar pentru vizibil,
dar există și pentru UV-Vis. Ca să cuprindă și IR trebuie să cuprindă componente suplimentare
(sfere integratoare).
Fotodetectorii se bazează de obicei pe efectul fotoelectric, astfel încât se poate măsura
curentul electric care este proporțional cu intensitatea luminoasă. Între fotodetector și sistemul de
afișaj este nevoie să se introducă amplificatoare, potențiometre și alte elemente de circuit electric.

Fig. 6.5.1
Pentru un spectrofotometru cu prismă, principiul de funcționare se bazează pe dispersia și
refracția radiației incidente pe o prismă. La suprafața de separare dintre prismă (cu indicele de
refracție n) și aer, pe fața de intrare și pe cea de ieșire, se va scrie legea refracției:
sin 𝑖 = 𝑛 sin 𝑟
𝑛 sin 𝑟 = sin 𝑖′
Spectrofotometrele comerciale folosesc o sursă cu lumină albă, astfel, pentru toate
lungimile de undă, unghiul de incidență va fi același. Ținând cont de faptul că, pentru fiecare
lungime de undă, sticla din care este realizată prisma are valori diferirte ale indicelui de refracție,
rezultă din legea refracției că pentru fiecare lungime de undă va fi o altă valoare a unghiului de
refracție:
sin 𝑖 = 𝑛 ∙ sin 𝑟
sin 𝑖 = 𝑛 ∙ sin 𝑟
 sin 𝑖 = 𝑛 ∙ sin 𝑟
sin 𝑖 = 𝑛 ∙ sin 𝑟
sin 𝑖 = 𝑛 ∙ sin 𝑟
După cum se observă, fiecare culoare va fi deviată cu alt unghi și de aceea spunem că
lumina albă incidentă este descompusă în componentele ei spectrale. Cu ajutorul unei fante se
selectează o anumită lungime de undă care se va trimite pe probă, iar după probă se află detectorul.
Știind intensitatea undei incidente (din construcția aparatului) și măsurând-o pe cea a radiației
emergente din probă, se poate determina concentrația probei pentru diferite lungimi de undă.
Există și cazuri în care ne interesează ce anume substanțe sunt în probă. Atunci se caută
acele lungimi de undă care vor fi total absorbite de probă și folosind biblioteci spectrale se
identifică elementul chimic.
Pentru a etalona corect spectrofotometrul, constructorul are nevoie să cunoască foarte
precis unghiul la care va fi refractată o anumită lungime de undă și de aceea trebuie să știe valorile
indicilor de refracție ai materialului de sticlă din care este făcută prisma. Pentru aceasta se urmează
procedura: ►se iluminează prisma cu lumină monocromatică (de exemplu un laser cu lungimea
de undă cunoscută), ►se măsoară deviația fasciculului la ieșirea din prismă (figura de mai jos)
𝛿 = 𝑖 + 𝑖′ − (𝑟 + 𝑟′) = 𝑖 + 𝑖′ − 𝐴 (A unghi congruent cu DMI' pentru că au laturile respectiv
perpendiculare, acesta fiind exterior triunghiului MII'), ►se caută condiția de deviație minimă la
mersul simetric prin prismă când cele două unghiuri de incidență și de refracție sunt egale și atunci
𝛿 = 2i -A, ►din prima lege a refracției pe fața de intrare rezultă 𝑛 = =

Fig. 6.5.2
Constructorul trebuie să se asigure că pe fața a doua a prismei nu se produce reflexia totală.
Trebuie ca 𝑟′ ≤ 𝑙, unde l este unghiul limită. Știind 𝐴 = 𝑟 + 𝑟′ rezultă sin 𝑟 ≥ sin (𝐴 − 𝑙) și din
legea refracției pe fața de intrare, rezultă ≥ sin(𝐴 − 𝑙). Unghiul maxim de incidență este
π/2, de aceea putem scrie ≥ sin (𝐴 − 𝑙). Din reflexia totală știm = sin 𝑙. Atunci trebuie
respectată condiția: sin 𝑙 ≥ sin (𝐴 − 𝑙) sau A ≤ 2𝑙.

Pentru un spectrofotometru cu rețea de difracție, principiul de funcționare se bazează pe

fenomenul de difracție al undei policromatice incidente pe o rețea de difracție (succesiune de
porțiuni opace și transparente paralele și echidistante). Rețeaua se caracterizează prin numărul de
trăsături pe unitatea de lungime 𝑛 = și o distanță între două porțiuni opace succesive:
l= = , care se numește constanta rețelei.
Diferența de drum optic între două raze care trec prin două porțiuni transparente succesive
va fi 𝛿 = 𝑙 (sin 𝑖 − sin 𝛼) unde i este unghiul de incidență pe rețea și 𝛼 este unghiul la care este
plasat observatorul. Ambele unghiuri sunt măsurate față de normala la rețea.
De la fiecare fantă se va propaga câte o undă și toate se vor suprapune, adică va exista și
fenomenul de interferență. Dacă numărul total de fante este N, atunci vor interfera între ele N
fascicule. Prin interferența a două unde provenite de la două fante aflate la distanța l, într-un punct
se va obține un
maxim dacă 𝛿 = 𝑘𝜆
minim dacă 𝛿 = (2𝑘 + 1)
Ținând cont de prezența tuturor fasciculelor, vom obține maxime în toate direcțiile pentru
care 𝑙 (sin 𝑖 ± sin 𝛼) = 𝑘𝜆 .
Dacă fasciculul incident cade perpendicular pe rețea după ce a trecut printr-o lentilă cu
distanța focală f, atunci unghiul de incidență este zero și avem relația simplă: 𝑙 sin 𝛼 = 𝑘𝜆.
Aplicațiile spectrofotometriei sunt multiple, de la cele mai generale până la cele specifice
unor domenii diferite: ●determinarea concentrației unei soluții, ●identificarea claselor de compuși
aflați în stare pură sau în preparate, ●monitorizarea oxigenului conținut în ape, ●detectarea
impurităților, ●clarificarea structurii compușilor organici, ●caracterizarea proteinelor, ●analiza
gazului expirat, ●monitorizarea apelor uzate, etc.
Aparatele de spectrofotometrie comerciale, se calibrează de către producător, dar sunt
necesare și calibrări în laborator, astfel încât intensitatea luminoasă emisă de lampă să aibă o
valoare cunoscută la diferite valori ale lungimilor de undă. Aceasta reprezintă valoarea Io incidentă
pe probele analizate. În calea acestei radiații de intensitate cunoscută, se așază cuva de grosime
cunoscută d, în care se află o anumită substanță de o anumită concentrație. Se măsoară intensitatea
fasciculului luminos la ieșirea din această cuvă I, la diferite valori ale lungimii de undă, selectată
de monocromator. Pentru a calcula concentrația c, a probei lichide din cuvă, se va folosi legea
Beer-Lambert:
𝐼 = 𝐼 𝑒𝑥𝑝 (−𝜀 ∙ 𝑐 ∙ 𝑑)
unde 𝜀 este coeficientul de extincție al soluției lichide respective. Aparatele moderne sunt însoțite
de computere care calculează direct concentrația prin informațiile pe care le primesc de la
detectori.
În unele situații este nevoie de calibrare (măsurarea radiației incidente) înainte de fiecare
probă. Aparatul respectiv se bazează și pe o bibliotecă cu valori ale coeficienților de extincție
pentru majoritatea substanțelor utilizate în laboratoarele de analize.
Practic, deoarece nu se cunosc cu mare exactitate coeficienții de extincție pentru fiecare
substanță, se adoptă o metodă bazată pe etalonarea aparatului folosind substanțe cu concentrații
cunoscute. Această operație de etalonare se reface de mai multe ori în timpul de utilizare al unui
aparat, câteofată și de câteva ori pe zi, folosind substanțe standard furnizate de producatorul
aparatului.
Mai jos este un exemplu de etalonare a unui spectrofotometru folosind cuve cu concentrații
cunoscute. În acest exemplu producătorul a folosit 6 cuve cu analit de concentratii cunoscute și a
realizat un grafic al absorbției la o anumită lungime de undă în funcție de concentrația exprimată
în g/L. Absorbanța se calculează ca diferență între intensitatea citită de detector fără probă în aparat
și cea citită de același detector, în aceleași condiții dar în prezența probei.
Pentru a determina concentrația unei substanțe necunoscute, se va urma procedura în doi
pași: 1/ se determină experimental intensitatea luminoasă transmisă de aceasta și, 2/ folosind curba
de etalonare, se va citi pe aceasta (sau va calcula un computer) concentrația de analit din substanța
care se investighează.

Fig. 6.5.3