2/3/2010

ELEMENTELE DE STRUCTUR ALE CELULEI BACTERIENE

-

ULTRASTRUCTURA BACTERIILOR. ELEMENTELE PERMANENTE I NEPERMANENTE DE STRUCTUR

Elementele constante (permanente, obligatorii) Peretele celular Membrana citoplasmatic Citoplasma Nucleoidul Ribosomii Mezosomii Elementele inconstante (nepermanente, neobligatorii) Capsula Sporul Flagelii Pilii/fimbriile Plasmidele Incluziunile celulare

PERETELE CELULAR (PC)

Reprezint un nveli rigid ce nconjoar protoplastul bacterian. Lipsete la micoplasme. Se disting 2 mari grupe de bacterii n funcie de structura PC: 1. Bacterii gram-negative (G-) 2. Bacterii gram-pozitive (G+) (1884, savantul danez Christian GRAM). Elementul comun al ambelor grupe peptidoglicanul (PG).

2/3/2010

PEPTIDOGLICANUL (PG)
PG structur particular rigid a PC bacterian. Structura PG: Heteropolimer macromolecular reticulat, constituit dintr-un component glicanic i unul peptidic. Partea glicanic (polizaharidic) este constituit din catene liniare paralele n care alterneaz N-acetyl-glucozamina cu acidul N-acetyl-muramic. Partea peptidic este reprezentat de uniti tetrapeptidice (izomeri L i D de AA), fixate de acidul muramic, care pot fi legate intre ele direct (formand o structur bidimensional, la bacterii G-) sau prin puni interpeptidice (structur tridimensional, la bacterii G+).

Acidul diaminopimelic, izomerii D ai AA i acidul muramic se ntlnesc doar la celulele procariote. Fragmente solubile de murein pot stimula secreia excesiv a citokinelor de ctre macrofage, prin legarea de receptorii toll-like sau CD14, inducnd astfel simptome de oc septic PG reprezint inta de atac a unor substane: 1. Lizozimul, care taie legturile dintre N-AGA i acidul NAM (catena glicanic) 2. Unele antibiotice (beta-lactamine, glicopeptide, fosfomicina), care perturb procesul de transpeptidare.

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-POZITIVE

Uniform, cu pori mici Grosimea 20-80 nm (pn la 300 nm) - Componentul major (40-80%) reprezint PG (structur reticulat tridimensional) - Componente minore: 1. Acizii teichoici (polimeri de glicerol sau ribitol fosfat), fixai de N-AGA. Traverseaz PG i creaz sarcin electric negativ la suprafaa bacteriei, asigur transferul de ioni i fixarea unor proteine, funcie antigenic. Pot activa complementul pe cale alternativ i stimula secreia citokinelor de ctre macrofage.
-

2. Acizii lipoteichoici: se fixeaz de

MCP i depesc stratul de PG. Funcii: identic cu acizii teichoici, intervin n adeziunea la celule i au un efect toxic slab. 3. Proteine asociate peretelui celular: proteina A, coagulaza legat (clumping factor) i proteina fixatoare de fibronectin la Staphylococcus aureus, proteina M la Streptococcus pyogenes (rol n adeziune la substrate, protecie de fagocitoz) 4. La unele bacterii G+ (de exemplu: Mycobacterium, Nocardia) peretele conine o cantitate important de lipide sau ceruri, la altele (ex.: streptococi) peretele conine multe glucide.

2/3/2010

PERETELE CELULAR AL BACTERIILOR GRAM-NEGATIVE

1.

2.

Grosimea 10-12 nm Neomogen, format din straturi distincte: PG, stratul intern, constituie 1-10% din masa uscat a peretelui celular. Acizii teichoici lipsesc. Nu exista puni interpeptidice (structur bidimensional). Membrana extern (ME) dublu strat lipidic cu proteine nserate (proteine majore 70%, minore 30%).

Unele proteine majore - porine, unindu-se n triplete, particip la formarea porilor, altele (nonporine) au funcie de receptor pentru bacteriofagi i pili sau asigur adeziunea la receptorii celulelor-gazde. Proteinele minore sunt enzime implicate in captarea unor substane i transportul specific transmembranar. ME este permeabil pentru ioni i mici molecule hidrofile i impermeabil pentru molecule hidrofobe sau amfipatice

3. Lipoproteinele asigur legtura dintre ME i PG 4. Lipopolizaharidul (LPZ) stratul extern al peretelui gram-negativ. Este format din: Lipidul A (endotoxin), glicolipid ancorat n ME. Stimuleaz formarea i secreia citokinelor. Determin efectul toxic al bacteriilor G- manifestat n urma lizei celulare. Polizaharide complexe, fixate pe lipidul A. Particip n procese de penetrare i transport a unor substane, confer specificitate de gen (antigenul R) La exterior, subuniti oligozaharidice liniare sau ramificate. Creaz sarcin negativ la suprafaa bacteriei (mpiedic fagocitoza, accesul moleculelor toxice), confer specificitate de specie sau tip (antigenul O)

2/3/2010

Spaiul periplasmic este regiunea dintre ME i MCP. Conine PG i proteine-enzime implicate n transport, digestia nutrienilor, protecia contra substanelor toxice (ex.: beta-lactamazele, care distrug antibioticele beta-lactamice). La bacteriile G+ aceste enzime sunt secretate n mediul extern. Evidenierea peretelui celular: microscopia electronic, metode speciale de colorare, plasmoliz (n mediu hipertonic), plasmoptiz (n mediu hipotonic).

2/3/2010

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.

9.

FUNCIILE PERETELUI CELULAR Confer forma bacteriilor Barier osmotic i mecanic Barier de permeabilitate selectiv Funcie antigenic (Ag O i R) Particip la procesele de cretere i diviziune celular Funcie de receptor Responsabil de aderena specific la substrate Componente ale peretelui celular (lipidul A, acizii lipoteichoici, fragmente de PG) contribuie la producerea citokinelor i activarea complementului pe cale alternativ cu manifestarea ocului septic (endotoxinic) Reprezint inta de atac a unor enzime i antibiotice

Determinarea tipului peretelui celular

COLORAIA GRAM (condiionat de structura i compoziia chimic a peretelui celular) 1. Colorarea frotiului fixat cu violet de genian (citoplasma bacteriilor se coloreaz n violet) 2. Splarea cu ap apoi tratarea cu soluie Lugol (I 2 +KI) fixeaz colorantul n celule prin formarea complexului insolubil violet-iodin 3. Decolorarea cu alcool 95%. Bacteriile G+ pstreaz colorantul, cele G- se decoloreaz. 4. Recolorarea bacteriilor G- cu fucsin apoas Rezultat: bacteriile G+ apar colorate n violet, bacteriile G- n rou.

Mecanismul: Peretele G- este subire, conine multe lipide (20%), care sunt dizolvate de alcool, porii au diametrul mare, pH citoplasmei este slab acid (se decoloreaz cu alcool); Peretele G+ este gros, nu conine lipide sau foarte puine, alcoolul deshidrateaz peretele i reduce diametrul porilor, pH acid (colorantul nu este splat din citoplasm) Utilizarea practic a coloraiei Gram: 1. Diagnostic 2. Orientare n tratament (sensibilitate diferit la antibiotice)

Acidorezistena bacteriilor Unele bacterii G+ (Mycobacterium, Nocardia) conin n componena peretelui multe lipide, acizi grai i ceruri (70% din greutatea peretelui). Aceasta le confer rezisten marcant n mediul extern i sensibilitate distinct la antibiotice. Coloraia Ziehl-Neelsen permite diferenierea acestor bacterii dup proprietatea lor de acidoalcoolo-rezisten

2/3/2010

METODA DE COLORARE ZIEHL-NEELSEN Principiul: bacteriile acido-rezistente colorate cu fucsin fenicat nclzit nu pot fi decolorate de acizi sau alcool. 1. Frotiul se coloreaz cu fucsin fenicat, nclzind lama pn la apariia vaporilor (2 - 3 ori) 2. Se cltete cu ap, apoi se trateaz cu soluie de acid sulfuric de 5% 3. Dup splare frotiul se recoloreaz cu albastru de metilen Rezultatul: bacteriile acido-rezistente rmn colorate n rou, cele acido-nerezistente se decoloreaz, apoi se recoloreaz n albastru

Sub influena unor substane (lizozim, antibiotice) PG poate fi deteriorat, iar bacteria explodeaz din cauza presiunii osmotice ridicate (5-20 atm). n mediu echilibrat osmotic pot fi obinute forme particulare: Protoplastul - reprezint o structur sferic totalmente lipsit de perete celular. El este obinut din bacterii G+ Sferoplastul - structur sferic sau neregulat parial lipsit de perete celular. Este o bacterie G- lipsit de peptidoglican i nconjurat de ME i MCP Bacteriile care prezint un deficit n PG sunt numite forme L (descoperite la institutul Lister). Ele se pot forma sub influena antibioticelor betalactamice. Sunt instabile fa de variaii osmotice i rezistente la betalactamine. Pot fi reversibile sau ireversibile

MEMBRANA CITOPLASMATIC (MCP)

Prezint o structur membranar clasic: dublu strat fosfolipidic n care sunt nserate proteine i glicoproteine. Lipsesc sterolii. La bacteriile gram-pozitive MCP formeaz invaginaii, mezosomi (septali, laterali), n care se conin enzime, citocromi i proteine ale sistemului transportor de electroni.

2/3/2010

Proteinele MCP: 1. PFP (Proteine Fixatoare de Penicilin), enzime ce catalizeaz legturile dintre catenele peptidice din PG reacia de transpeptidare (sunt inactivate de penicilin i antibiotice beta-lactamice) 2. Componente ale sistemului de transport (permeaze) 3. Proteine ale sistemelor de secreie (I V). Reprezint cilindre proteice ce traverseaz nveliurile celulei bacteriene. Asigur transportul proteinelor din interiorul celulei bacteriene spre exterior 4. Proteine receptori 5. Enzime ale lanului respirator

1. 2.

Funciile membranei citoplasmatice

Barier osmotic i de permeabilitate selectiv Asigur transportul activ prin intermediul permeazelor Excreia enzimelor hidrolitice, toxinelor, etc Sediul metabolismului energetic (mezosomi) Intervine n diviziunea celular (mezosomi) Implicare n sinteza PG i a fosfolipidelor Implicare n chemotaxie prin receptori specifici Asigur transmiterea informaiei din mediul nconjurtor spre interiorul celulei bacteriene

3. 4. 5. 6. 7. 8.

1. 2.

Evidenierea MCP Microscopia electronic Fenomene de plasmoliz (n mediu hipertonic retracia citoplasmei) sau plasmoptiz (n mediu hipotonic liza celulei, desprinderea MCP de peretele celular)

CITOPLASMA Necompartimentat - Lipsesc organitele celulare - Format din ap (80%), conine nucleoidul, ribosomi (apr. 20 000 per celul), incluziuni, plasmide, ioni, enzime, deeuri, etc. - Consistena dens (stare de gel) asigur permanena mediului intern - pH acid Funcii: sediul tuturor proceselor metabolice Evidenierea: prin orice metod de colorare
-

NUCLEOIDUL BACTERIAN Constituit din ADN bicatenar circular, uneori liniar, plasat liber n citoplasm. ADN este repliat n bucle i stabilizat prin ARN i proteine. Fiecare bucl este hiperspiralizat sub aciunea ADN-girazei i topoizomerazei IV (se ntlnesc doar la bacterii). Pe ADN sunt fixate enzime de sintez (ADN - , ARN polimeraze) Funcii: dirijaz activitatea celulei (procesele de sintez, creterea, multiplicarea, diferenierea celulei, replicarea proprie, etc) Evidenierea: - Microscopia electronic - Metode speciale de colorare (Feulgen) Feulgen: HCl.aldehida.react. Shiff.culoare rosie
-

2/3/2010

PLASMIDELE Elemente genetice (ADN) extracromozomiale, capabile de replicare autonom. Confer bacteriei caractere suplimentare. Se transmit celulelor-fiice la diviziunea bacteriei. Plasmidele conjugative F se transmit prin conjugare. Episom - plasmida integrat n cromosom Tipuri de plasmide: 1. F factor de fertilitate, conjugative (sinteza pililor F) 2. R rezisten la antibiotice 3. Ent producerea enterotoxinei 4. Hly producerea hemolizinei 5. Col producerea de bacteriocine Utilizarea practic: n tehnologii de ADN-recombinant
-

SPORUL BACTERIAN Reprezint o difereniere celular care asigur supravieuirea bacteriei n condiii nefavorabile ale mediului extern. Bacterii sporogene Bacillus, Clostridium. Aceste mi/o se prezint sau sub form vegetativ, metabolic activ, sau sub form inert metabolic sporul. Procesul de formare a sporului este numit sporogenez, sporulare. Este declanat n special de carene nutritive sau condiii nefavorabile ale mediului extern.
-

Stadiile sporogenezei (durata 36-72 ore) Stadiul I se formeaz filamentul axial, compus din ADN Stadiul II divizarea asimetric a citoplasmei printr-un sept, formarea presporului, care conine un filament de ADN. MCP nglobeaz presporul. Stadiul III nglobarea complet a presporului, care este limitat de 2 membrane Stadiul IV formarea cortexului de PG ntre cele 2 membrane Stadiile V-VI formarea tunicii proteice la exterior i maturarea sporului. Uneori se formeaz un nveli extern suplimentar - exosporiu Stadiul VII sporul matur este eliberat iar celula-mam se dezintegreaz

2/3/2010

Proprietile sporului Inactiv metabolic - Coninut sczut de ap liber - Coninut mare (pn la 10%) n dipicolinat de calciu - Rezistent la temperaturi i pH extreme, desicare, radiaii, ageni chimici i fizici n condiii favorabile sporul germineaz, dezvoltnduse forma vegetativ. Forma sporului (sferic, oval) i poziia n celul (central, subterminal, terminal) sunt caractere utile n identificarea bacteriilor. Evidenierea sporilor: colorarea dup AUJESZKY (sporul se coloreaz n rou, iar citoplasma n albastru)
-

2/3/2010

CAPSULA
- nveliul extern al unor bacterii. Reprezint polimeri organici sintetizai n mediul natural de via al bacteriilor (exemplu: n macroorganism). Se disting: - Capsula adevrat (peste 0,2m), vizibil la microscopul optic - Microcapsula, detectat la microscopul electronic - Capsula flexibil (slime, glicocalix), o reea lax de fibre polizaharidice, care difuzeaz n mediu. Nu se evideniaz microscopic. Asigur formarea biofilmelor bacteriene ansamblu structurat de celule bacteriene nglobate ntro matrice de polimeri de origine bacterian, care poate adera la suprafee inerte (ex.: cateter, stimulator cardiac, endoproteze, sonde de intubare, etc) sau esuturi vii.

Compoziia chimic a capsulei: ap i substane organice (polizaharide, mucopolizaharide, peptide) Bacillus anthracis acid glutamic Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae polizaharide Streptococcus pyogenes acid hialuronic

Funciile capsulei: Impiedic desicarea bacteriei Barier de permeabilitate pentru substane toxice (antibiotice, ioni metalici) Barier protectoare faa de factori antiinfecioi (complement, fagocite), bacteriofagi, protozoare Rezerv nutritiv Asigur aderarea bacteriei la substrate esuturi sau suporturi inerte (placa dentar, biofilm pe catetere, proteze, instrumente, etc) Specificitate antigenic de specie sau tip (Ag K)

Evidenierea capsulei Coloraia Burri-Hins (metod negativ) - Pe lam se amestec suspensia bacterian cu tu de China, se etaleaz, se usuc Frotiul se fixeaz cu alcool - Se coloreaz frotiul cu fucsin apoas Rezultatul: capsula apare ca un halou incolor pe fondul negru. Citoplasma bacteriilor se coloreaz n rou. Coloraia Romanovski Giemsa (capsula se coloreaz n roz) coloraie pozitiv a capsulei

10

2/3/2010

GRANULAIILE DE VOLUTIN Reprezint polimeri anorganici de polimetafosfat. Servesc n calitate de rezerv de fosfai i pot interveni n metabolismul energetic. Interesul medical: la agentul difteriei, Corynebacterium diphtheriae, granulele de volutin se localizeaz la extremitile celulei, iar la corynebacterii nepatogene sunt repartizate neuniform n citoplasm. La tratarea cu unii colorani bazici granulele de volutin se coloreaz n alt culoare, de ex. n rouviolet la colorarea cu albastru de metilen fenomenul metacromaziei. Evidenierea: metoda Loeffler, metoda Neisser

11

2/3/2010

FLAGELII structuri filamentoase proteice, ntlnite la bacterii, bacili, spirili i spirochete. Funcii: intervin n mobilitatea bacterian, reprezint Ag H al bacteriilor. Structura flagelului: - Filamentul, structur helicoidal constituit din fibrile proteice (flagelin) rsucite - Crligul de articulaie - Corpul bazal, constituit dintr-un ax rigid i mai multe inele ce servesc la fixarea flagelului (la MCP i PC). Mobilitatea bacteriei este asigurat de rotaia flagelului (30 70 micrometri/s).

Tipurile de bacterii dup dispoziia flagelilor Bacterii monotriche Bacterii lofotriche (un mnunchi de flageli la o extremitate) Bacterii amfitriche (cte un flagel sau un mnunchi de flageli la fiecare extremitate) Bacterii peritriche (flageli pe toat suprafaa celulei) La spirochete flagelii se plaseaz n spaiul periplasmic flageli interni, periplasmatici.

12

2/3/2010

Evidenierea flagelilor I - metode directe - Microscopia electronic

Coloraia special Loeffler (mordansarea cu tanin, sruri

de aluminiu, Fe, apoi colorarea cu fucsin sau albastru de metilen)

II metode indirecte (studierea mobilitii bacteriilor) - Studierea preparatelor native pictur suspendat sau ntre lam i lamel (microscopia cu contrast de faz sau pe fond negru) - nsmnarea culturii bacteriene n medii semisolide (se observ turbiditate) - Creterea culturii n vl pe suprafaa mediului solid

13

2/3/2010

Pilii comuni (fimbriile) elemente proteice fine, rigide, scurte repartizate pe suprafaa celulei bacteriene G - n special. Sunt formate din subuniti proteice identice (pilina), implantate n ME. Numrul fimbriilor per celul: 1 sute Funcii: asigur adeziunea bacteriilor la suprafee inerte, la celule sau alte bacterii, reprezint antigenul F

Pilii conjugativi structuri capiliforme de natur proteic, prezeni n numr de 1-10 per celul (numai la bacteriile ce gzduiesc plasmide conjugative F). Funcii: transferul de ADN prin conjugare, receptori pentru unii bacteriofagi Evidenierea pililor: microscopia electronic

14