Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
ro
www.referat.ro
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL-VETERINARE
PROIECT DE DIPLOMĂ
Absolvent :
Marinescu
Georgiana
BUCUREŞTI
2010
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRONOMICE ŞI
MEDICINĂ VETERINARĂ – BUCUREŞTI
FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII
SPECIALIZAREA BIOTEHNOLOGII MEDICAL
VETERINARE
BUCUREŞTI
2010
Cuprins
REZUMAT………………………………………………………………………………
…………..3
INTRODUCERE................................................................................................................7
PARTEA I.........................................................................................................................11
STUDII DOCUMENTARE.............................................................................................11
Capitolul 1. Enzime hidrolitice de uz furajer şi microorganisme producătoare.......11
α-amilaza........................................................................................................................11
Celulazele.......................................................................................................................13
1.3. Hemicelulazele....................................................................................................14
1.4. Microorganisme producătoare de enzime hidrolitice de uz furajer....................16
Capitolul 2. Utilizarea deşeurilor şi/sau subproduselor agricole în medii de
biosinteză a enzimelor hidrolitice de uz zootehnic........................................................20
Capitolul 3.........................................................................................................................24
CERCETĂRI EXPERIMENTALE...............................................................................27
Capitolul 4. Materiale şi metode.....................................................................................27
4.1 Tulpini de lucru........................................................................................................27
4.2. Obţinerea culturilor de intreţinere...........................................................................27
.................................................................................................27
4.3. Cultivarea în laborator şi testarea activităţii hidrolitice ....................................28
4.4. Determinarea activităţilor enzimatice.................................................................30
4.5. Testarea produsului enzimatic în hrana animalelor de fermă.............................39
Capitolul 5. Rezultate şi discuţii.....................................................................................42
5.1. Compoziţia mediilor pentru cultura de întreţinere .................................................42
5.2 Analiza comparativă a biosintezei enzimelor hidrolitice cu tulpini Aspergillus niger
şi Trichoderma viride pe diferite medii.........................................................................42
5.3. Temperatura optimă de cultivare............................................................................45
5.3 Alegerea pH-ului optim de cultivare........................................................................47
5.4. Testarea complexului enzimatic ca aditiv furajer.................................................51
CONCLUZII.......................................................54
BIBLIOGRAFIE .............................................................................................................56
REZUMAT
INTRODUCERE
α-amilaza
Începand din anul 1970, au fost iniţiate studii privind obţinerea de proteaze acide
cu mucegaiuri din genul Aspergillus (A. niger, A. oryzae) prin cultivare în sistem submers
sau SSF. Preparatele enzimatice obţinute sunt complexe, conţin pe lângă proteaze şi
amilaze (α-amilaza şi glucoamilaza), celulaze, xilanaze, pectinaze. În cazul culturilor
submerse, comparativ cu procedeul de cultivare în sistem SSF, randamentele de obţinere
a preparatului enzimatic sunt mai scăzute [10].
Alături de tulpina microbiană şi compozţtia mediului de cultură, printre factorii
importanţi care influenţează procesul de biosinteză a enzimelor hidrolitice se numără
aeraţia, temperatura şi pH-ul mediului de biosinteză, precum şi gradul de agitare [15].
P.V. Gawande şi M.Y. Kamat au studiat influenţa temperaturii de cultivare asupra
obţinerii de xilanază (E.C. 3.2.1.8) prin fermentaţie în stare solidă pe diferite substraturi
lignocelulozice, cu 2 tulpini de Aspergillus sp. (A.terreus si A. niger 44), cunoscute ca
producătoare de xilanază. Tărâţele de grâu s-au remarcat ca cel mai bun substrat
lignocelulozic utilizat pentru producţia de xilanază. Mediul optim pentru Aspergillus
niger a fost: tărâţe de grâu în proporţie 1:5 cu soluţie minerală Mandels şi Strenberg
(conţinând 0,1% extract de drojdie), concentraţia inocului fiind de 2x107-2x108 spori /5 g
substrat. După terminarea procesului fermentative, s-a constatat că maximul producţiei de
xilanază, pentru ambele tulpini de Aspergillus, a fost atins la temperatura de 35°C.
Anterior zaharificării, preparatele xilanazice au îndepărtat fracţia hemicelulozică din toate
deşeurile lignocelulozice testate, dovedintu-şi astfel potenţialul commercial. Aspergillus
sp. a produs xilanază cu un nivel scăzut al activităţii celulozolitice, facilitând un sistem de
purificare al enzimelor relativ simplu.
Luiza Jecu [16] a constatat că fungul Aspergillus niger 38 poate fi cultivat prin
fermentaţie în strat solid, pentru obţinerea celulazelor folosind ca sursă de carbon deşeuri
agricole uşor de procurat cum ar fi tărâţele de grâu şi paiele de grâu în diferite proporţii.
Mediul de cultură (g/l) a avut urmatoarea compoziţie: 10 (NH 4)2SO4;; 3 KH2PO4;; 0,5
MgSO4x7H2O; si 0.5 CaCl2xH2O. Tărâţele de grâu şi paiele de grâu s-au folosit în
proporţii diferite (de la 9:1 la 1:9). Cu o umiditate de 74% a substratului conţinând paie
de grâu/tărâţe de grâu în proporţie de 9/1, s-a obţinut o activitate endonucleazică de 14.80
UI/ml (unităţi internaţionale/ml), optimă, la un pH de 4.5-5.5. Raportul o parte paie de
grâu şi nouă pări tărâţe de grau a prezentat cea mai bună activitate.
Temperatura mediului în care are loc procesul de biosinteză a enzimelor
hidrolitice este un factor extrem de important pentru activitatea microorganismelor.
Variaţiile de temperatură au efect asupra randamentului de transformare a substratului în
produsul finit, asupra cerinţelor nutritive ale microorganismului şi compoziţiei biomasei
obţinute şi, nu în ultimul rând, asupra vitezei de creştere microbiană. Temperatura este un
factor care acţionează în mod direct asupra microorganismului viu. Temperaturile ridicate
pot dăuna microorganismelor prin denaturarea enzimelor, a proteinelor transportatoare,
sau a altor tipuri de proteine[17].
Valoarea pH-ului este, alături de temperatură, un parametru important în
procesele de biosinteză. Fiecare specie are definit un anumit interval de pH în care poate
creşte, precum şi un pH optim de dezvoltare. Influenţa valorii pH-ului asupra dezvoltarii
culturilor microbiene poate fi urmarită în două direcţii principale si anume : asupra
vitezei de creştere a microorganismelor şi asupra randamentului de conversie a
substratului la produsul polienzimatic. În general, microorganismele au un domeniu
optim de pH pentru dezvoltare, în care viteza specifică de creştere atinge valoarea
maximă. În cazul fungilor, pH-ul optim de dezvoltare este cuprins între 4,5-6,5. Fungii
prezintă avantajul de a creşte convenabil în medii de cultură acide, în care cele mai multe
specii de bacterii nu se dezvoltă. Formarea produsului dorit în urma procesului poate să
fie legată de desfaşurarea bioprocesului într-un domeniu foarte strict de pH. În timpul
dezvoltării unei culturi microbiene apar deviaţii ale pH-ului de la valoarea considerată
optimă, care pot avea urmări nedorite asupra procesului de biosinteză. Aceste modificări
se pot datora fie consumării unui nutrient, fie producerii unui acid organic de către
microorganism. Pentru corectarea pH-ului la valoarea prescrisă se folosesc diverse
substanţe chimice (acizi sau baze)[18].
PARTEA A II A
CERCETĂRI EXPERIMENTALE
După preparare, mediile de cultură sterilizate şi răcite la 35ºC, s-au însă mânţat cu
o cultură de inocul sub formă de suspensie de spori obţinută din cultura de întreţinere.
Raportul de însamanţare este de 0,5 ml suspensie pentru 50 ml mediu. Cultivarea s-a
efectuat 72 ore la baloane agitate(220 rpm) cu 50 ml mediu de cultura/balon. Incubarea
s-a făcut la termostat la 28-30ºC.
Pentru urmărirea bioprocesului, la intervale de 24 ore s-au determinat următorii
parametri:
- pH-ul mediului de cultura;
- activitatea enzimatică a mediului ;
- dezvoltarea macroscopică si microscopică a tulpinii de la care s-a pornit.
Pentru dozarea activiăţii α -amilazei produsă de fungi s-a aplicat metoda descrisă
de Hostettler şi colaboratorii [20] metodă care se bazează pe hidroliza enzimatică a
amidonului la pH=6,9 si la temperatura de 30ºC. Hidrolizatul format în special din
maltoză reactionează, datorită grupărilor reducătoare semiacetalice, cu acidul 3,5-
dinitrosalicilic, cu formare de acid nitroaminosalicilic de culoare roşie-portocalie, cu
maximum de adsorbţie la 546nm.
Concentraţia de acid diaminosalicilic format, măsurată colorimetric, este
proporţională cu activitatea enzimatică.
Conform acestei metode o unitate amilazică corespunde unui mmol de maltoză
eliberat de 1g preparat enzimatic într-un minut la 30ºC.
Reactivi necesari :
1. Soluţie tampon fosfat 0,2M,Ph=6,9 ;
7,16g Na2HPO4 x 12 H2O + 2,72g KH2PO4 + 0,58g NaCl se dizolvă şi se aduc la 1 litru
soluţie cu apă distilată. Valoarea de pH se verifică cu pH-metrul.
2. Soluţie amidon 1% in solutie tampon(1) ;
3. Reactiv acid dinitrosalicilic (DNS).
10g acid dinitrosalicilic se dizolvă la cald în aproximativ 300ml apă distilată. Se adaugă
400ml soluţie NaOH 1N şi 300g tartrat de sodiu şi potasiu. Se aduce la semn într-un
balon cotat de 1 litru.
4. Soluţie etalon de maltoză ;
0,2g maltoză monohidrat (0,19g maltoză anhidră) se dizolvă în apă îtr-un balon cotat de
100ml.
5. Soluţie probă de determinat.
Proba se dizolvă cu CaCl2, astfel încât să conţină 0,5-1,5 unităţi DNS.
Mod de lucru
Construirea curbei de etalonare
Din soluţia etalon de maltoză(4) se pipetează în 6 eprubete după cum urmează :
În fiecare eprubetă se adaugă 2ml DNS, apoi se tine în baie de apă la fierbere 5
minute.
Se răcesc şi se diluează pana la 12 ml cu apă distilată.
Se citeşte densitatea optică la 546nm dupa 20 de minute.
Datele oţinute se trec într-un grafic pentru construirea curbei de etalonare. Pe
abcisă se trec valorile reprezentând densitatea optică citită la spectrofotometru
corespunzătoare concentraţiei de maltoză înscrisă pe ordonată.
Dozarea activităţii enzimatice
Paralel cu proba de analizat se face o probă martor pentru a determina
concentraţia de maltoză existentă în probă, înainte de începerea reacţiei enzimatice.
Modul de lucru este prezentat schematic în tabelul 2.
Calculul rezultatelor
Activitatea enzimatică se calculează şi se exprimă după formula :
unde :
- m = µmoli de maltoză, determinaţi din curba de etalonare ca fiind diferenţa dintre
µmoli de maltoză din probă şi µmoli de maltoză din martor ;
- D = factorul de diluţie al probei luate în lucru ;
- V = volumul (ml) de soluţie probă luată în lucru ;
- 10 = timpul de incubare (minute).
Principiul metodei
Determinarea activităţii celulozolitice se efectuează dupa metoda descrisă de
Petterson şi Porath [21].
Metoda se bazează pe dozarea glucidelor reducătoare eliberate de enzimă în urma
acţiunii asupra substratului respectiv carboximetil celuloza (CMC).
Reactivi şi soluţii:
1. Soluţie tampon Na2HPO4- acid citric 0,1N, pH=6,4 ;
2. Soluţie CMC 1%. 1g carboximetil celuloza se dizolvă în 100ml tampon(1) ;
3. Preparat enzimatic cu activitate celulazică ;
4. Reactiv DNS (20g acid 3,5 dinitrosalicilic, 4g fenol proaspat distilat, 1g sulfit de
sodiu, 400g tartrat de sodiu şi potasiu). Se dizolvă în 1 litru NaOH 2%, soluţia se
aduce la 2 litri cu apă distilată.
5. Solţtie glucoză 0,1% preaparată proaspăt în apă distilată.
Amestecul de reacţie, ce constă din 2ml soluţie de substrat (2), 0,2 ml preparat
enzimatic (3), este incubat 10 minute la temperatura de 50ºC, după care reacţia
enzimatică este stopată cu 3 ml rectiv DNS. Probele sunt incubate apoi 15 minute pe o
baie de apă la fierbiere, răcite şi colorimetrate la 640 nm faţă de apa distilată.
Fiecare probă este însoţită de un martor, în care dozăm glucidele reducătoare
preexistente în amestecul de reacţie prin introducerea reactivului DNS înaintea
preparatului enzimatic cu activitatea celulozolitică. Martorii sunt şi ei colorimetraţi la 640
nm faţă de apa distilată.
Calculul rezultatelor
Valorile densităţii optice măsurate la spectrofotometru pentru probe şi martori se
transformă cu ajutorul curbei etalon în mg glucoză.
(micromoli Tyr proba- micromoli Tyr martor) x 3,5/10 x 0,5 x 0,5 = micromoli Tyr/ml/min
unde:
3,5- volum total amestec ;
1/10- factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică ;
0,5- volumul de lichid cu activitate proteolitică luată în lucru ;
0,5- volumul de lichid filtrat luat în lucru ;
O unitate de activitate proteazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în
condiţiile de reacţie indicate eliberează 1µmol tirozină pe minut.
unde
1/30- factorul de transformare pentru un minut de reacţie enzimatică ;
O unitate de activitate xilanazică este definită ca fiind cantitatea de enzimă care în
condiţiile de reacţie indicate eliberează 1nmol xiloza/ml/minut la 40ºC.
A fost utilizată o receptură de nutreţ combinat unică pentru cele trei loturi,
variabila constituind-o cantitatea de enzima inclusă în premixul vitamino-mineral într-o
pondere diferită la cele două loturi experimentale (E1-2 kg /to de NC; E2- 5 kg/ to de
NC) (tabelul 8). Ca ingrediente cerealiere s-a utilizat grâul (acesta fiind caracterizat
printr-un conţinut ridicat xilani şi arabinoxilani), ponderea de includere fiind de 30% şi
porumbul, în vederea unei mai bune echilibrări energetice a reţetei.
Ingrediente % LOT
M E1 E2
Porumb 28,31 28,21 27,81
Grâu 30,00 30,00 30,00
Şrot soia 8,00 8,00 8,00
Full fat soia 10,00 10,00 10,00
Lapte praf 15,00 15,00 15,00
Făină peşte 4,00 4,00 4,00
Lizină 0,49 0,49 0,49
Metionină 0,20 0,20 0,20
Premix colină 0,10 0,10 0,10
Fosfat monocalcic 1,70 1,70 1,70
Carbonat de calciu 1,10 1,10 1,10
Sare 0,10 0,10 0,10
Premix vitamino-mineral P1 1,00 1,00 1,00
Enzimă - 0,20 0,50
Indici calitativi
Proteină brută (%) 21,62 21,62 21,62
Energie metabolizabilă
Kcal 3320 3320 3320
Mj/kg NC 13,89 13,89 13,89
Lizină (%) 1,50 1,50 1,50
Metionină + cistină (%) 0,90 0,90 0,90
Calciu (%) 1,10 1,10 1,10
Fosfor (%) 0,90 0,90 0,90
Capitolul 5. Rezultate şi discuţii
În urma testării celor doua medii menţionate în capitolul 4 s-a constatat că mediul
cu extract de malţ oferă cele mai bune condiţii pentru obţinerea culturilor de întreţinere
pentru toate tulpinile testate. Astfel, pe pe suprafata acestui mediu, la temperatura optimă
de dezvoltare (28ºC), după 7 zile, se formează un miceliu bogat, alb pufos şi un miceliu
aerian purtător de conidiofori coloraţi în negru intens. Miceliul este uniform, sporulat pe
toată suprafata. Tulpina de Trichoderma viride nu s-a dezvoltat pe mediul Czapek-Dox
simplu [25].
Me
diul
pH A.E A.E A.E pH A.E A.E A.E pH A.E A.E A.E
celulozolitică amilolitică proteolitică celulozolitică amilolitică proteolitică celulozolitic amilolitică proteolitică
(C1-Cx) UDNS/ml UP/ml (C1-Cx) UDNS/ml UP/ml ă UDNS/ml UP/ml
U/ml U/ml (C1-Cx)
U/ml
1 6,4 0,01 6 0,20 6,0 0,07 7,2 0,50 6,0 0,02 8,1 0,19
2 5,0 0,03 7 0,26 6,0 0,40 8,4 0,32 5,5 0,18 9,3 0,14
3 5,5 0,02 11 0,95 5,5 0,80 12,3 1,44 5,5 0,10 6,4 0,16
4 5,8 0,01 5 0,11 5,5 0,20 5,8 0,21 5,0 0,07 6,9 0,84
1 6,4 0,01 2 0,93 6,0 0,02 13,6 1,2 5,5 0,04 16 0,67
2 6,0 0,10 3,6 0,09 6,0 0,14 28 0,22 5,7 0,02 26 0,11
3 5,5 0,30 3,4 0,5 5,5 0,52 16 0,74 5,5 0,15 36 0,12
4 6,4 0,90 1,4 0,1 5,5 1,18 13 1,4 5,0 0,1 40 0,30
Trichoderma viride CMGB-405
1 6,0 0,187 8 0,28 6,0 0,2 40,4 0,28 5,7 0,15 31,6 0,08
2 6,0 0,095 9,5 0,49 6,0 0,2 46,4 0,49 5,5 0,12 25,7 0,25
3 6,0 0,0375 3,2 0,44 5,5 0,15 18,8 0,39 5,5 0,057 13,0 0,12
4 6,0 0,025 4,5 0,14 5,5 0,75 34,5 0,44 5,5 0,15 9,8 0,17
Tabelul nr. 14 Determinarea activităţii xilanazice
Activitatea
Activitate a amilolitică(UDNS/ml)
enzimatică (U/ml) 140 Activitatea proteolitică(U/g)
124,08
120 104,88
Activitatea
100 82,8 celulozolitică(UDNS/g)
80
60
40
20 2,82
2,27 2,03 1,69 1,43 1,84
0
28°C 32°C 37°C
Temperatura
După 48 ore, s-a constatat că pH-ul mediului de cultură în cazul primei variante a
rămas constant 5-5,5, pe când pentru celelalte variante (2 şi 3) pH-ul mediilor de cultură a
scazut de la 6.5-7.5 la 5-5.5. Ulterior, mediile de cultură au fost condiţionate integral,
înainte de sporulare, prin adsorbţie pe CaCO3. .
Activitatea
160 amilolitică(UDNS/ml
Activitatea 141.6 Activitatea proteolitică(U/g)
enzimatică (U/ml) 140
Activitatea
120 108 celulozolitică(UDNS/g)
100
76.8
80
60
40
20 1.95
2.91 2.15 1.66
1.29 1.15
0
5.5 6.5 7.5
pH
Tabelul 18. Variaţia activităţii xilanazice în funcţie de pH-ul mediului de cultură după 48
ore şi după condiţionare
Activitatea
xinalazică
(U/ml)
1800
1600 1366.33 1595.36
1400
1200
1000
800
600
400 167.4
200
0
5.5 6.5 7.5
Valoare pH
Greutatea medie iniţială a animalelor supuse testării a fost de 8 kg. După 18 zile
de la începutul experimentului s-a efectuat cântărirea individuală finală iar rezultatele
obţinute au fost prelucrate statistic (tabelul 18, figura 8). Performanţele au fost
îmbunătăţite în cazul loturilor la care a fost inclusă enzima în structura reţetei de nutreţ
combinat dar nu s-au semnalat diferenţe semnificative în ceea ce priveşte greutatea
corporală şi sporul mediu zilnic (P>0.05). O posibilă explicaţie a îmbunătăţirii
performanţelor la purcei prin adăugarea de enzimă ar fi efectul asupra unor factori ca:
timpul de tranzit intestinal al hranei, producţiile endogene, schimbările în polizaharurile
fără amidon, degradarea sau schimbarea fibrei[26].
Tabelul 20. Performanţe bioproductive
LOT
Specificaţie
M E1 E2
Greutate corporala iniţiala (kg) 8,75 8,71 8,96
Greutate corporala finală (kg)* 12,75 a ± 1,94 12,83 a ± 1,90 13,23 a ± 2,86
Spor mediu zilnic (kg) 0,222a ± 0,09 0,229a ± 0,08 0,237a ± 0,12
Consum mediu zilnic de NC (kg) 0,439 0,446 0,450
Consum specific -kg NC /Kg spor 1,98 1,95 1,90
- % faţă de martor 100,00 98,48 95,96
*aceeaşi literă diferenţe nesemnificative între loturi (P>0.05)
14
12
10
12.83
13.23
8
12.75
8.71
8.75
8.96
6
4
2
0
G. initiala G. finala
M E1 E2
În ceea ce priveşte sporul mediu zilnic (tabelul 20, figura 11), se constată de
asemenea, o uşoară îmbunătăţire în cazul loturilor experimentale (0,237 kg la lotul E1,
respectiv, 0,229 kg la lotul E2, faţă de 0,222 kg la lotul martor), fără ca diferenţele să fie
semnificative. Se apreciază că enzima ameliorează efectul antinutritiv şi eficientizează
producţia [26].
0.24
0.23
0.237
M
E1
0.229
E2
0.22
0.21 0.222
smz
Consumul mediu zilnic de nutreţ combinat a fost asemănător la cele trei loturi
(tabelul 20, figura 12). S-a constatat o reducere a consumului specific în cazul loturilor
cu adaos de preparat enzimatic (1,95 kg NC/kg spor la lotul E1 respectiv, 1,90 kg NC/kg
spor în cazul lotului E2 comparativ cu 1,98 kg NC/kg spor la lotul M).
2.1
1.8
1.5
1.2 M
E1
0.9
E2
0.6
0.3
0
c.m.z NC Consum specific
M 0.439 1.98
E1 0.446 1.95
E2 0.450 1.90
Figura 12 . Consumul mediu zilnic (kg) şi consumul specific (kg NC/Kg spor)
CONCLUZII