Studiul Unor Interactiuni Aliment-Medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament
UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR. T. POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE
STUDIUL UNOR INTERACIUNI ALIMENT - MEDICAMENT

Rezumatul tezei de doctorat
CONDUCTOR TIINIFIC, PROF. DR. RODICA CUCIUREANU DOCTORAND, FARMACIST CAMELIA DIACONU HARAPU
IAI, 2011
Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai Facultatea de Farmacie Doamnei / Domnului............................................................... V facem cunoscut faptul c n ziua de 14 iulie 2011 la ora 11.00 n sala S.M.N. din cadrul universitii de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai, va avea loc susinerea public a tezei de doctorat intitulat Studiul unor interaciuni aliment - medicament elaborat de d-na farmacist Camelia Diaconu Harapu, conductor tiinific prof. Dr. Rodica Cuciureanu, n vederea conferirii titlului tiinific de doctor n Domeniul fundamental tiine Medicale, domeniul Farmacie. V invitm s participai la aceast manifestare. Comisia de doctorat are urmtoarea componen: PREEDINTE: Decan Prof.Univ.Dr. Monica Hncianu Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai, Facultatea de Farmacie CONDUCTOR TIINIFIC: Prof.Univ.Dr. Rodica Cuciureanu Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai, Facultatea de Farmacie REFERENTI OFICIALI: Prof.Univ. Dr. Anca Miron Universitatea de Medicin i Farmacie Gr. T. Popa Iai, Facultatea de Farmacie Conf. Univ. Dr. Lorena Filip Universitatea de Medicin i Farmacie Iuliu Haieganu Cluj Napoca, Facultatea de Farmacie Conf. Univ. Dr. Ana Corina Ioni Universitatea de Medicin i Farmacie Carol Davila Bucureti, Facultatea de Farmacie
CUPRINS
Capitolul I I.1. Introducere I.2. Motivaia alegerii temei I.3. Obiectivele tezei de doctorat PARTEA GENERAL. STADIUL ACTUAL AL CUNOATERII Capitolul II II.1. Interaciuni aliment medicament. Aspecte generale II.2. Interaciuni aliment-medicament. Domenii de interes II.3. Influena medicaiei asupra status-ului nutritiv al organismului II.4. Interactiuni suc de grapefruit medicamente II.4.1. Istoric II.4.2. Suc de grapefruit: compozitie chimic II.4.2.1. Arborele de grapefruit II.4.2.2. Componente bioactive din sucul de grapefruit II. 4.3. Metabolizarea medicamentelor, interaciuni medicamentoase, interaciuni aliment medicament II.4.3.1. Citocrom P450 (CYP), enzime, interaciuni medicamentoase i interaciuni aliment - medicament II.4.3.2. Transportori de medicamente sau/i de xenobiotice II.4.4. Mecanisme de inhibiie a enzimelor citocromului P450 II.4.5. Efectele sucului de grapefruit asupra metabolismului medicamentelor II.4.5.1. Ingrediente active din sucul de grapefruit flavonoide i furanocumarine II.5. Antinflamatoare nesteroidiene (Diclofenac). Aspecte generale PARTEA PERSONAL Capitolul III Studiul interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de grapefruit III.1. Introducere. Aspecte generale privind farmacocinetica diclofenacului i Pg. 1 1 5 8 9 9 9 12 16 17 17 21 21 24 28 28 32 36 41 42 47 50 50 50 50
Studiul unor interaciuni aliment - medicament III.2. Validarea metodei HPLC de determinare a diclofenacului III.2.1. Protocol de validare III.2.1.1. Sinopsis III.2.1.2. Materiale i metoda analitic prezentare III.2.2. Determinarea concentratiei de diclofenac III.2.3. Procedura de validare III.2.3.1. Specificitatea III.2.3.2. Curba de calibrare (Liniaritate) III.2.3.3. Precizia si acuratetea III.2.3.4. Limita de cuantificare inferioar III.2.3.5. Validarea dilutiei probelor III.2.3.6. Regasirea III.2.3.7. Probele de control III.2.4. Raport de validare III.2.4.1. Sinopsis III.2.4.2. Specificitatea III.2.4.3. Liniaritatea III.2.4.4. Limita inferioar de cuantificare III.2.4.5. Precizia i acurateea III.2.4.6. Regsirea III.2.4.7. Validarea diluiei III.3. Studiul interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de grapefruit III.3.1. Stabilirea modelului experimental III.3.2. Aplicarea modelului experimental. Etapa clinic III.3.3. Etapa analitic. Rezultate III.3.4. Etapa farmacocinetic III.3.5. Discuii. Mecanismul interaciunii III.3.6. Concluzii Capitolul IV Flavonoidele componente bioactive din sucuri de fructe IV.1. Introducere IV.2. Rspndire IV.3. Structur IV.4. Clasificare IV.4.1. Calcone IV.4.2. Flavanone IV.4.3. Flavanonoli IV.4.4. Flavone IV.4.5. Flavonoli IV.4.6. Catehine IV.4.7. Terpenil-flavonoide ii 54 54 55 55 59 59 59 60 60 60 60 61 61 61 61 61 62 64 64 64 64 65 65 65 66 67 75 83 85 85 85 85 86 87 87 87 88 88 89 90 90
Studiul unor interaciuni aliment - medicament IV.4.8. Izoflavonoide IV.4.9. Aurone IV.4.10. Antociani IV.5. Naringina flavonoid din fructele citrice IV.5.1. Aspecte generale IV.5.2. Mecanism de ac iune IV.6. Determinarea flavonoidelor totale din sucuri de fructe IV.7. Determinarea HPLC a naringinei i naringeninei din sucuri de fructe IV.7.1. Metoda de analiz IV.7.1.1. Standarde IV.7.1.2.Condiiile de lucru HPLC IV.7.1.3.Condiiile de lucru MS IV.7.2. Analiza naringeninei IV.7.3. Analiza HPLC a naringinei IV.7.3.1. Determinarea naringinei din probe de sucuri IV.7.3.1.1. Rezultate IV.7.3.1.2. Discuii IV. 8. Concluzii Capitolul V Furanocumarinele - substane bioactive din sucul de grapefruit V.1. Introducere V.2. Furanocumarinele implicaii n producerea interaciunilor suc de grapefruit-medicamente V.2.1. Cumarine i derivai V.2.2. Structura chimic i clasificare V.2.3. Furanocumarinele componente bioactive din sucul de grapefruit V.2.3.1. Biosinteza bergamotinei V.2.3.2. Rolul furanocumarinelor din sucul de grapefruit n producerea interaciunilor farmacocinetice cu unele medicamente V.3. Determinarea bergamotinei din sucuri de fructe V.3.1. Material i metode V.3.1.1. Extracia bergamotinei V.3.1.2. Separarea bergamotinei prin cromatografie pe coloan (CC) V.3.1.3. Identificarea bergamotinei prin cromatografie pe strat sub ire (CSS) V.3.1.4. Analiza HPLC a bergamotinei V.3.1.5.Curba de calibrare a bergamotinei iii 91 92 93 94 94 95 98 104 104 104 105 105 106 111 126 144 147 148 150 150 150 151 151 152 158 160 162
163 163 164 165 165 165 166
Studiul unor interaciuni aliment - medicament V.3.2. Rezultate i discuii V.4. Concluzii Capitolul VI Studiul comparativ al influenei unor sucuri de fructe asupra farmacocineticii diclofenacului, la obolan VI. 1. Introducere 175 195 196 196 196 197 197 198 203 208 209 209 211 211 212
VI. 2. Obiective VI. 3. Protocol experimental VI. 4. Etapa analitic. Rezultate VI. 5. Discutii VI. 6. Concluzii
Capitolul VII Concluzii generale Elemente de originalitate Perspective de cercetare Bibliografie
iv
Capitolul I I. 1. INTRODUCERE Medicamentele administrate pe cale oral au acelai parcurs n sistemul digestiv ca i alimentele/sucurile naturale. n producerea interaciunilor medicament - aliment, intervin proprietaile fizico-chimice ale moleculelor de medicament, calitatea i compoziia alimentaiei, ordinea n care sunt ingerate medicamentele i alimentele, intervalele de timp ntre acestea, s.a.m.d. astfel c, se impune din ce n ce mai imperios, pe perioada administrrii unui medicament, un control strict al dietei n vederea eficientizrii terapeutice a tratamentului dar i pentru a asigura nevoile energetice i nutritive ale alimentaiei. Medicii adepi ai terapiilor complementare, susin faptul c sucurile proaspete s-au dovedit a fi o arm impotriva bolilor, studiile artnd c sucurile naturale pot s grabeasc procesul de vindecare al unor boli cnd sunt folosite impreun cu alte metode naturale precum homeopatia, plantele medicinale, terapiile nutriionale, prin mrirea capacitaii naturale de vindecare a organismului i ntrirea sistemului imunitar. Medicii alopai, adepi ai terapiei medicamentoase, nu exclud terapia cu sucuri naturale, asociat celei medicamentoase, numai c inaintea nceperii unei astfel de cure, este recomandat un consult medical, pentru c nu toi pacienii pot beneficia de astfel de asocieri. De exemplu, o afeciune nedepistat (diabet sau hipoglicemie) poate, far un tratament medical adecvat, s se nrautaeasc din cauza curei cu sucuri naturale; mai mult de att, tot ce ingeram poate s interacioneze cu altceva, astfel c natural, nu inseamn i sigur, santos i benefic pentru organism n toate cazurile. Referitor la sucurile naturale, corect preparate i administrate, singura problem, spun nutriionitii, este legat de faptul c acestea nu pot s furnizeze cele 20 25g de fibre zilnic de care au nevoie adulii; totodat, acetia ne recomand, pentru beneficiu maxim, sucurile preparate n gospodrie i consumate imediat dupa preparare i nu cele din supermarketuri (chiar dac sunt declarate 100% naturale), care nu seamn nici nutriional i nici estetic cu cele preparate n momentul utilizrii, pentru c pasteurizarea (practicata pentru a mri durata de valabilitate) distruge vitaminele i enzimele din sucuri. Si tot pentru beneficiu maxim, este recomandat s folosim fructe i legume proaspete, crescute n tar (mai proaspete dect cele importate), fr pesticide (la care nu se tiu nca toate efectele pe termen lung) i aditivi de cretere i maturizare. Preocuparea cercettorilor privind studiul "comorilor" din regnul vegetal este o adevrat megatendina a cercetrii noului mileniu; de cnd industria farmaceutic a nteles deschiderea consumatorilor ctre aceast categorie de produse alimentare, unele cu utilizri fitoterapeutice, cercetarea fitochimic a devenit chiar o mod.
1
In topul celor mai sntoase fructe, grapefruitul este campion, un adevrat soare n constelaia remediilor naturale, o vedet a stilului de viat sntos, atribuindu-i-se proprietai curative remarcabile, fapt pentru care se bucura de atenia binemeritat a cercettorilor (Mencinicopschi, 2009). Consumul pe scara larg al grepfruitului nu poate fi atribuit numai gustului sau valorii sale nutritive. De fapt, entuziasmul consumului su, se datoreaz macar n parte cercetrilor medicale care au sugerat c sucul de grepfruit reduce formarea plcilor aterosclerotice i inhib proliferarea celulelor canceroase la nivel mamar, ca i tumorigeneza mamar; ulterior, s-a demonstrat c sucul de grepfruit conine antioxidani, substane cu aciune antinitrozaminica, antiseptic, detoxifiant, cardiotonic, sedativ i hipocolesterolemiant. n lumina acestor aciuni, grepfruitul a fost indicat mult timp pentru tratamentul anorexiei, diferitelor infecii, hipertrofiei benigne de prostat, cancerelor (de sn, colon, prostat, piele, plmn), diabetului, disuriei, hipercolesterolemiei, insomniei, micozelor etc. Date din literatura de specialitate semnaleaz o scadere semnificativ a nivelului colesterolului la persoanele care consum un grapefruit/zi, fapt pentru care grapefruit-ul a intrat pe lista mondial a alimentelor care reduc incidena bolilor de inima. n 1991 s-au semnalat primele informaii privind interaciunea medicamentoas ntre sucul de grapefruit i unele medicamente blocante ale canalelor de calciu: felodipina (Plendil) i nifedipina (Adalat). Acest fenomen a fost descoperit din ntmplare, n urma unui studiu al interaciunii etanolmedicament n care sucul de grapefruit a fost utilizat ca vehicul pentru alcoolul folosit n studiu (cu scopul de a masca gustul alcoolului). Observaia a fost surprinztoare i pentru cercettorii n cauz (coordonator studiu dr. David Bailey, cercettor n cadrul Health Sciences Center de la Londra) aa c, au ntmpinat greuti atunci cnd au dorit s publice studiul ntr-o revist de medicin, observaiile i concluziile fiind considerate o glum. Ulterior, au fost realizate studii experimentale pe animale de laborator i numeroase studii clinice care demonstreaz existena interaciunilor sucului de grapefruit cu medicamente din diferite clase terapeutice: antagoniti ai canalului de Ca, modulatori ai SNC (Hukkinen et al., 1995; Kupferschmidt et al., 1995; Ozdemir et al., 1998) inhibitori HMG-CoA reductaza, imunosupresoare, inhibitori ai 5-fosfodiesterazei, antihistaminice, prokinetice, antiaritmice etc. (Dahan et al., 2004). I.2. MOTIVAIA ALEGERII TEMEI Interaciunile medicamentoase reprezint o surs major de accidente sau de eecuri terapeutice, mai ales n situaii de polimedicaie. Mecanismele farmacocinetice care pot induce interaciuni medicamentoase sunt mai dificil de prevzut de ctre clinicieni dect interaciunile farmacodinamice care pot fi
2
anticipate pe baza aciunii farmacologice a medicamentelor administrate. Pe parcursul diferitelor faze ale cineticii medicamentelor, metabolismul i, n particular, biotransformarile catalizate de citocromii P450 pot conduce la interaciuni semnificative care se manifest la nivelul absorbiei intestinale sau al excreiei renale. Majoritatea medicamentelor administrate pe ale oral se absorb, n principal, n intestinul subire. Alimentele, prezente simultan n tubul digestiv, pot influena eficacitatea principiilor active medicamentoase prin diminuarea sau, din contr, intensificarea efectelor terapeutice. Interaciunile privesc, adesea, absorbia medicamentelor de-a lungul tubului digestiv, dar anumii nutrieni modific metabolismul i eliminarea medicamentelor. Alimentele pot influena att viteza de absorbie ct i biodisponibilitatea unui medicament. Dintre interaciunile farmacocinetice, mai importante sunt cele care afecteaz cantitatea de principiu activ absorbia; acestea sunt clinic semnificative mai ales, pentru medicamentele cu indice terapeutic ngust. In aceste cazuri, modificarea vitezei de absorbie influeneaza eficacitatea medicamentului. Influena alimentelor asupra eficacitaii i toleranei medicamentelor este dificil de prevzut pe baza consideratilor teoretice sau experimentelor in vitro. Majoritatea datelor disponibile se bazeaza pe studii farmacocinetice pe voluntari sntoi, la care medicamentele au fost administrate cu sau far alimente; de obicei, se determin Cmax, tmax i aria de sub curba (ASC). Influena alimentelor statistic semnificativ este frecvent demonstrat, dar efectele clinice semnificative sunt rare. Impactul acestor interaciuni asupra eficacitaii medicamentelor ar fi mai corect documentat prin studii asupra pacienilor reprezentativi pentru populaia inta de tratat (Dahan et al., 2004). Mecanismul posibil al interaciunii poate fi inhibarea P-glicoproteinei i creterea biodisponibilitii orale prin reducerea efluxului intestinal i/sau hepatic. Cercetri in vitro au demonstrat inhibarea de ctre sucul de grapefruit a polipeptidelor transportoare de anioni anorganici (OATP); absorbia intestinal pare s scad pe msura ce biodisponibilitatea oral a fost redus. Mai multe componente ale sucului de grapefruit sunt considerate rspunztoare de interaciunea cu medicamentele; unele dintre datele n literatur sunt controversate i de aceea, este prematur de a trage concluzii. Flavonoidele (naringina, quercetina, kaemferolul) au fost primele investigate. Studii in vitro (Bailey et al., 1993) au demonstrat c naringenina, metabolit al naringinei ar fi un potenial inhibitor al CYP 450 (Miniscalco et al., 1992). Furanocumarinele, un alt grup de compui din sucul de grapefruit au demonstrat aciune de inhibare specific a CYP3A4. Wang (Wang et al., 2001) a semnalat capacitatea furanocumarinelor de a inhiba P-glicoproteinele. Bergamotina este furanocumarina majoritar n sucul de grapefruit; metabolitul sau, dihidroxibergamotina, precum i alte patru componente cu
3
structuri asemntoare sunt potenial inhibitoare ale P-glicoproteinei, cnd sunt prezente simultan n aliment (Edwards et al., 1996; Ohnishi et al., 2000; Mohri et al., 2001). Unele cercetri au fost efectuate folosind suc de grapefruit de concentraie obinuit, in timp ce alte studii au folosit sucuri de grapefruit de concentraie dubl (sucuri reconstituite cu jumtate din cantitatea de ap recomandat). O alt diferena ntre metodele utilizate este reprezentat de cantitatea de SG ingerat (un pahar sau mai multe pahare de suc de grapefruit). In ciuda rezultatelor care au demonstrat o intensitate mai marea efectelor dupa administrri repetate de suc de grapefruit, se pare c n cele mai multe cazuri, ingestia unui singur pahar de suc de grapefruit de concentraie obinuit este suficient pentru a produce efectul maxim. In acest sens, dup 14 zile de consum de suc de grapefruit, nu a mai avut loc nici o modificare n farmacocinetica felodipinei, comparativ cu efectele dupa primul pahar de suc de grapefruit (Bailey et al., 1993). Efectul sucului de grapefruit dureaza pan la 3 zile. Totui, se pare c un interval de 24 de ore ntre ingestia de SG i administrarea medicamentului poate preveni o interaciune relevant d.p.d.v. clinic. Interesul pentru studierea interaciunii medicamentelor cu sucul de grapefruit este confirmat de numrul foarte mare de publicaii care semnaleaz aspecte particulare privind acest tip de interaciuni. Au fost realizate studii experimentale pe animale de laborator i numeroase studii clinice care demonstreaz existena interaciunilor cu medicamente din diferite clase terapeutice: antagoniti ai canalului de Ca, modulatori ai SNC (Hukkinen et al., 1995; Kupferschmidt et al., 1995; Ozdemir et al., 1998) inhibitori HMG-CoA reductaza, imunosupresoare, inhibitori ai 5-fosfodiesterazei, antihistaminice, prokinetice, antiaritmice etc. (Dahan et al., 2004). Numeroase studii se refer la descifrarea mecanismului prin care componentele sucului de grapefruit intervin n modificarea biodisponibilitii principiilor active medicamentoase. Antiinflamatoarele nesteroidiene reprezint una dintre cele mai utilizate clase de medicamente. Mecanismul principal de aciune al acestor principii active este inhibarea ciclooxigenazei i a sintezei de prostaglandine i de ali eicosanoizi ciclooxigenazici. Utilizarea tot mai extins a inhibitorilor selectivi de Cox-2 (prima generaie: Celecoxib, Rofecoxib) i a doua generaie: Valdecoxib, Parecoxib, Etoricoxib) necesit, ntre altele, evidenierea interaciunilor de tip farmacocinetic i farmacodinamic ale acestei grupe de medicamente (Paulson, 2001). Pentru medicamentul selectat pentru studiu, diclofenac, datele privind interaciunile farmacocinetice cu alimentele, n general, i cu sucul de grapefruit, n special, sunt relativ puine. Mahgoub (2002) a studiat influenta sucului de grapefruit asupra diclofenacului administrat ca antiinflamator, pe model inflamator, indus de carageenan; pentru toate concentraiile de
4
diclofenac administrate per os (1 mg, 2,5mg i respectiv 10mg/kg corp), reducerea volumului edemului a fost prezent i mrit (n proporie de 19 47% ), comparativ cu aceleai doze de diclofenac, administrate fr suc de grapefruit. Diclofenacul este un antiinflamator nesteroidal cu aciune antiinflamtoare, analgezic i antipiretic foarte utilizat n Romnia i, de aceea consideram oportuna evaluarea farmacocineticii interaciunilor dintre diclofenac i sucul de grapefruit. Abordarea n mod tiinific a posibilittilor profilactice i terapeutice, n urma unor studii clinice i experimentale, confer alternativa realizrii unui management corect al administrrii simultane a sucului de grapefruit i a diclofenacului, acest antiinflamator nesteroidian mult utilizat n ara noastr pentru tratamentul bolilor reumatismale, precum i posibilitatea monitorizrii riguroase a manifestrilor generale. Datele din literatura de specialitate privind interaciunile poteniale ale medicamentelor, foarte frecvent utilizate n practica medical, cu alimentele i, n special cu sucul de grapefruit, sunt total insuficente i de aceea consideram oportuna evaluarea farmacocineticii interaciunii diclofenac-suc de grapefruit, prin experimente pe animale de laborator i prin studii clinice. Identificarea i dozarea substanelor bioactive considerate responsabile de interaciune (flavonoide, furanocumarine) poate contribui la elucidarea mecanismului de aciune i modularea intensitii interaciunii. Rezultatele cercetarilor pot contribui la optimizarea administrrii medicamentelor, n sensul adaptrii dozelor, n funcie de influena sucului de grapefruit asupra biodisponibilitaii medicamentului administrat simultan. Considerm de asemenea c este oportun, studierea unitar a acestor interaciuni i prin faptul c att medicul, care prescrie medicamentul, ct i farmacistul care l elibereaz pacientului, trebuie s cunoasc n detaliu aspectele privind modificarea biodisponibilitaii medicamentelor n scopul obinerii maximului de eficiena terapeutic i reducerea efectelor secundare i adverse. Originalitatea cercetrii este consecutiv originalitii domeniului; n cercetarea biomedical o perioad de timp de 15 20 de ani (de la prima semnalare a interaciunilor medicamentelor cu sucul de grapefruit) nu este suficient pentru abordarea tuturor aspectelor generale sau particulare aprute; n plus, sunt introduse n terapeutia noi medicamente (inhibitorii selectivi de ciclooxigenaza etc) pentru care studiile de farmacocinetic trebuie diversificate. Astzi, studiile de farmacocinetic beneficiaz din plin de progresele spectaculoase din domeniul chimiei analitice (metode HPLC/MS/MS, GS/MS) care fac posibil determinarea concentraiilor serice ale principiilor active cu mare, mare precizie. Cuprinderea i rezolvarea complet a interaciunilor i incompatibilitilor care pot s apar, este o sarcin nerezolvat, fiind ns necesare cunostine ct mai
5
temeinice privind rezultatele asocierilor medicamentoase, a interaciunilor i efectelor acestora asupra raspunsului terapeutic. Publicaiile de specialitate semnaleaz din ce n ce mai des, importana cunoaterii faptului c anumite alimente ar trebui evitate n timpul unui tratament medicamentos pentru a optimiza eficacitatea terapeutic a medicamentelor. Hotrarea nr. 21/22.05.2006 referitoare la aprobarea Ghidului pentru elaborarea raportului de evaluare privind documentaia clinic, adoptat de Consiliul tiinific al A.N.M. n capitolul II.1.3. precizeaz: se includ date referitoare la interaciuni medicament-aliment. Cert este faptul c nu se poate renuna la medicamente atunci cnd sunt necesare i nici la alimente pe perioada tratamentului medicamentos. Singura regul care poate fi aplicat rmne informarea corect i complet asupra medicamentului care urmeaz a fi utilizat i daca nu dispunem ntotdeauna de datele necesare, ca profesioniti n domeniul medicamentului, este corect s respectm i s indicm pstrarea unui interval de 2-3 ore ntre administrarea medicamentelor si a alimentelor, ca masura minima de siguranta. Lucrarea de fata a fost intocmita pe baza unui studiu minuios al literaturii de specialitate care a permis iniierea i dezvoltarea cercetrilor incluse n obiectivele tezei de doctorat. Am dorit i sper ca aceast lucrare s se inscrie cu titlul unei mici i modeste contribuii la efortul general ntreprins pentru a se asigura o folosire raional a arsenalului terapeutic actual i pentru a se evita accidentele produse de o medicaie activ, ntr-un context alimentar inadecvat. I.3. OBIECTIVELE TEZEI DE DOCTORAT n contextul actual generat de importana descifrrii mecanismelor interaciunii aliment medicament, n general, i a interaciunilor farmacocinetice manifestate la consumul de suc de grapefruit simultan cu administrarea unor medicamente, n particular, prezent tez de doctorat i propune ca obiective: Validarea unei metode HPLC de dozare a diclofenacului din plasma de obolan; Studiul experimental al interaciunii farmacocinetice suc de grapefruit diclofenac, la animale de laborator; Evidenierea i determinarea cantitativ a unor componente bioactive din sucul de grapefruit (flavonoide, furanocumarine), responsabile de producerea interaciunii; Studiu preliminar privint interaciunea diclofenacului cu alte sucuri de fructe; Formularea mecanismului interaciunii dintre sucul de grapefruit i diclofenac pe baza parametrilor farmacocinetici determinai experimental.
6
Capitolul II II.1. INTERACIUNI ALIMENT MEDICAMENT. ASPECTE GENERALE Terapia medicamentoasa constituie baza tratamentului majoritii mbolnvirilor i const n intervenia medicului, care prin competena sa instituie o conduit terapeutic adecvat, care incepe cu anamneza i se finalizeaz, n cele mai multe cazuri, cu nmanarea reetei ctre pacient. Cel puin teoretic, trebuie admis, ca orice medicament reprezint o substan toxic, n msura n care acesta reclam un efort metabolic necesar procesului de transformare, de adaptare a sa la organism, de nsuire a efectului terapeutic. Medicul practician i farmacistul trebuie sa cunoasc din ce n ce mai multe notiuni privind asocierea medicamentelor (al caror numr este n permanent crestere) i a posibilelor interaciuni i incompatibiliti. Studiile asupra efectelor reciproce care pot fi exercitate de ctre medicamente i alimente asupra diferitelor funcii ale organismului pot fi considerate recente. n prezent se recunoate necesitatea de a stabili o metodologie de studiu a eventualelor interaciuni medicament-aliment, studii efectuate att pe animale de laborator, ct i studii clinice, dei se tie c aceast metodologie nu este uor de stabilit i nici de urmat n toate cazurile. De aceast problem s-a preocupat ndelung Roe et al., (1981) care i-a publicat studiile n primul numr al revistei Drug Nutrient Interaction nc din anul 1981. Acest autor semnaleaz faptul c pentru a putea cunoate i interpreta posibilele influene ale alimentaiei asupra activitii farmacologice a medicamentelor, este necesar s inem cont de: Factori dietetici care pot influena biodisponibilitatea medicamentelor; Efectele dietei asupra metabolismului microbian al xenobioticelor; Relaiile care pot exista ntre alimente i mutagenitate, teratogenitate i carcinogenez; Existena unor nutrimente cu proprieti terapeutice (alimente medicamente); Interaciunile alcoolului cu medicamentele i, de asemenea, interaciunile acestuia cu alimentele; Influena pe care o poate exercita medicamentul asupra digestiei alimentelor, asupra greutii corporale, asupra necesarului nutritiv i asupra creterii organismului; Posibilele efecte adverse sau benefice ale medicamentelor asupra absorbiei, transportului, metabolizrii, utilizri celulare i excreiei nutrimentelor; Eventuala prezen a substanelntinutritive n alimente;
7

Efectele malnutriiei asupra absorbiei, transportului, metabolizrii i toleranei medicamentelor; Factorii care determin malnutriia indus de alcool i/sau de medicamente.
II.2. INTERACIUNI ALIMENT-MEDICAMENT. DOMENII DE INTERES Interaciunile aliment medicament sunt definite ca o interaciune rezultat dintr-o relatie fizic, chimic, fiziologic, fiziopatologic ntre un medicament i un nutrient, o asociere de nutrieni, produsele alimentare, n general sau cu starea de nutriie a organismului, global. O interaciune este considerat a fi semnificativ clinic n cazul n care altereaz un rspuns farmacoterapeutic sau compromite statusul nutriional al organismului (Boullata, 2010). Consecinele clinice ale interaciunii se refer la perturbarea distribuiei medicamentelor sau nutrienilor. Farmacocinetica (disposition) include absorbia, distribuia i eliminarea unui medicament sau unei substane nutritive i implic transportorii fiziologici i enzime metabolizante. Efectul pe termen lung al interaciunilor aliment-medicament se refer la aciunea fiziologic a unui medicament sau substane nutritive la nivel celular sau chiar subcelular. Interaciunile medicament-nutrient pot influena sntatea organismului, n special la categoriile de populaiei vulnerabile (Kordas et al., 2007). Mai muli factori pot influena riscul de dezvoltare a unei IAM cu semnificaie clinic. Printre acetia amintim pacienii cu patologie cronic care folosesc mai multe medicamente simultan, n special din categoria celor cu indice terapeutic ngust (Salazar et al., 2007). Prevalena consumului de medicamente la vrstnici este recunoscut i are drept consecine frecvena crescut a efectelor secundare mai severe, precum i riscul dezvoltrii interaciunilor aliment - medicament. La acestea se adaug caracteristicile genetice ale organismului, precum i polimorfismul transportorilor, enzimelor, receptorilor, afectarea funciei unor organe, statusul nutritional perturbat la persoanele vrstnice. Perturbarea statusului nutriional se refer la dezechilibre metabolice provocate de aport alimentar inadecvat sau de instalarea unor alterri ale metabolismului unor principii nutritive. Interaciunile medicament-nutrient pot fi evaluate ca perturbri n farmacocinetica i, mai rar n aciunea farmacodinamic a medicamentului. Medicamentele i substanele nutritive pot influena parcursul semnalului de transducie cu impact asupra enzimelor care metabolizeaz medicamentele i asupra transportorilor prin expresia genelor receptor-mediate (Rushmore, 2002; Gillies, 2007). In plus, este cunoscut faptul c unele medicamente servesc ca substrat, inductori sau inhibitori ai transportorilor, ai enzimelor din diferite esuturi,
8
cu dezvoltarea unor interaciuni directe sau indirecte cu nutrienii; aceste interaciuni trebuie cunoscute sau prevzute pentru a le diminua impactul asupra organimului n care se produc. Interaciunile farmacocinetice pot implica enzime i transportori care particip la absorbia, distribuia sau eliminarea medicamentului. Interaciunile farmacocinetice sunt cel mai bine definite ca schimbri ai parametrilor medicamentelor sau nutrienilor (biodisponibilitatea, volumul de distribuie, clearance-ul). Interaciunile farmacodinamice implic efectul clinic al unui medicament, respectiv cel fiziologic al unui nutrient. Interaciunile farmacodinamice sunt cel mai pregnant caracterizate prin evaluarea cantitativ i calitativ a aciunii medicamentelor i a statusului nutriional al organismului. II.3. INFLUENA MEDICAIEI ASUPRA STATUS-ULUI NUTRITIV AL ORGANISMULUI Influena medicaiei asupra status-ului nutritiv al organismului privind nutrieni specifici poate fi, de asemenea, multifactorial (Boullata, 2005). Medicamentele pot influena absorbia nutrienilor, distribuia, metabolismului i excreia acestora. Semnificaia schimbrilor n starea substanelor nutritive, ca urmare a utilizrii medicamentelor este apreciat prin evidenierea unor markeri individuali. n plus, orice manifestare clinice poate fi mai mult specific unui anumit pacient dect specific administrrii unui medicament. Dezvoltarea unui sindrom clasic consecutiv unui deficit de nutrieni nu poate fi considerat rezultat al unei interaciuni de tip aliment medicament. Conceptul c unele efecte adverse ale medicamentelor sunt direct legate de influena lor asupra statusului nutriional al organismului nu este nou. Carenele nutriionale asociate consumului de medicamente pot fi considerat o subclas de efecte adverse legate de doz, de durata administrrii medicamentului sau chiar fenomene de idiosincrazie. II.4.INTERACIUNI SUC DE GRAPEFRUIT MEDICAMENTE II.4.1. Istoric Un studiu experimental privind posibile interaciuni ntre ingestia de alcool i felodipina a evideniat interaciunea sucului de grapefruit cu blocanii canalelor de calciu, sucul de grapefruit fiind folosit pentru mascarea gustului neplcut al alcoolului. Ingestia simultana de doze netoxice de etanol i de felodipina au condus la concentraii crescute de felodipina. i alte studii privind farmacocinetica felodipinei administrat simultan cu sucul de grapefruit au condus la aceleai rezultate (Bailey et al., 1989). Dei un accident, descoperirea ca sucul de grapefruit poate crete disponibilitatea unor medicamente administrate pe cale oral (i deci i o sporire a efectelor lor farmacodinamice), a trezit un interes deosebit; aceste observaii surprinztore au condus la continuarea cercetrilor, cercetri care au confirmat ca sucul de grapefruit poate creste dramatic biodisponibilitatea felodipinei i c poate
9
influena parametrii farmacocinetici i farmacodinamici i pentru alte medicamente (Bailey, 1991). Au urmat numeroase publicaii privind interaciunea sucului de grapefruit cu diferite medicamente, cu accent pe aspecte diferite: mecanismul interactiunii, componentele sucului de grapefruit responsabile de interactiune, relevanta clinica, etc., publicaii care semnaleaz aspecte particulare privind acest tip de interactiuni si care confirma interesul pentru studirea interaciunii medicamentelor cu sucul de grapefruit. Au fost realizate studii experimentale pe animale de laborator i numeroase studii clinice care demonstreaz existena interaciunilor cu medicamente din diferite clase terapeutice: antagoniti ai canalului de Ca, modulatori ai SNC (Hukkinen et al., 1995; Kupferschmidt et al., 1995; Ozdemir et al., 1998) inhibitori HMG-CoA reductaza, imunosupresoare, inhibitori ai 5fosfodiesterazei, antihistaminice, prokinetice, antiaritmice etc. (Dahan et al., 2004). O alt diferen ntre metodele utilizate este reprezentat de cantitatea de suc de grapefruit ingerat (un pahar sau mai multe pahare de suc de grapefruit). Unele cercetri au fost efectuate folosind suc de grapefruit de concentraie obinuit, n timp ce alte studii au folosit sucuri de grapefruit de concentraie dubl (sucuri reconstituite cu jumtate din cantitatea de ap recomandat). II.4.2. Suc de grapefruit: compozitie chimic II.4.2.1. Arborele de grapefruit Arborele care produce grapefruitul - Citrus paradisi - este un arbore din familia Rutaceae, genul Citrus. Arborii de grapefruit au fost semnalai pentru prima dat n Barbados, n jurul anului 1750; fructele erau cunoscute sub numele de fructul oprit. Doar dup civa ani s-au observat crescnd n Jamaica, dar termenul de grapefruit nu a fost folosit pn n 1814. Numele dat reflect felul n care sunt aranjate fructele n copac atrnnd n mnunchiuri precum strugurii (engl. grapes = struguri). Termenul "grapefruit" dateaz din 1665 i provine din Pompelmoes,, Pompel, pais et limoes, citron. "Pomelo" este un cuvnt preluat din limba englez (unde apare scris pummelo), el nsui provenit din limba latin tiinific din pomum melo nsemnnd pomme melon, adic "mr pepene galben" latin. n limba francez cuvntul a fost introdus n anul 1912, specia botanic n-a fost recunoscut ca o specie distinct pn n secolul al XIX-lea. Grapefruitul veritabil are origine oriental. Grapefruitul se deosebete de pomelo prin dimensiunea sa mare (diametrul de 13 cm i chiar mai mult), de unde denumirea n limba latin: Citrus maxima sau C. Grandis; forma de par nu este ntotdeauna prezent (Carrington et al., 2003).
10
II.4.2.2. Componente bioactive din sucul de grapefruit Mai multe studii epidemiologice arat o relaie invers ntre consumul de fructe i legume i a incidenei bolilor cronice, cum ar fi bolile cardiovasculare i unele maladii neoplazice. (Cerda et al., 1994). Aceast relaie de proporionalitate invers a fost confirmat de multe studii n care consumul de citrice afost legat de prevenirea anumitor tipuri de cancer (inclusiv cancere ale cavitii bucale, faringelui, esofagului, stomacului) (So et al., 1996; Guthrie, 1998). Mai multe componente bioactive cum ar fi flavonoide, limonoide, vitamina C si carotenoide, ar putea juca un rol important n aceste efecte. II.4.3.1. Citocrom P450 (CYP), enzime, interaciuni medicamentoase i interaciuni aliment medicament Metabolismul medicamentelor are loc n principal n ficat, dei alte organe cum ar rinichii, plmnii i tractul gastro-intestinal pot contribui la reacii de biotransformare (Krishna et al., 1994). Administrate pe cale oral, medicamentele trebuie s traverseze peretele intestinal, sistemul hepatic portal i ficatul nainte de a ajunge n circulaia sistemic. n cazul n care un medicament este supus biotransformrii extinse n ficat, numai o fraciune din doz va ajunge n circulaia sistemic i, n cele din urm, n site-ul su de aciune. Acest fenomen este cunoscut ca proces de metabolizare la nivelul primului pasaj hepatic. Termenul "extraction ratio" definete fraciunea de medicament ndeprtat din snge n timpul unui singur tranzit prin ficat. Corespunztor, medicamentele care sunt supuse unei ample metabolizri la nivelul primului pasaj au extraction ratio ridicat. Metabolizarea la primul pasaj poate reduce n mod semnificativ biodisponibilitatea unor medicamente, chiar dac absorbia este complet. Ca i la nivelul ficatului, medicamente administrate oral pot fi supuse metabolismului la nivelul peretelui intestinal nainte de a ajunge n circulaia sistemic. Pentru unele medicamente (mai ales substraturi ale CYP3A4) metabolizarea presistemic n intestin poate fi un factor determinant pentru biodisponibilitatea lor (Paine et al., 1996; Thummel et al., 1996). II.4.3.2. Transportori de medicamente sau /i de xenobiotice Medicamentele i xenobioticele pot produce o inhibare reversibil sau ireversibil a enzimelor CYP i, astfel, pot preveni biotransformarea substraturilor. n inhibarea reversibila, compuii lipofili se leag covalent de site-ul activ al enzimei. Acest lucru previne legarea altor molecule ale substratului pe regiunile active hidrofobe ale apoproteinei CYP sau activarea hemului CYP de ctre oxigen. Ambele aciuni rezult din inhibarea tranzitorie, dei uneori este potenat activitatea enzimei (Murray, 1999). Inhibitorii competitivi sunt de multe ori, dar nu neaprat substraturi pentru enzima pe care o inhib. Inhibitorii tipic competitivi ai
11
enzimelor CYP includ antifungice cu structur imidazolic ketoconazol i itraconazol i, respectiv inhibitori de proteaz, ritonavir (Back et al., 1991; Eagling et al., 1997). Inhibarea ireversibil a enzimelor CYP, mecanism numit "inhibare sinucidere" mecanism based inhibition se poate manifesta ca inactivare autocatalitic i complexare metabolit intermediat. Inactivarea autocatalitic sau inhibarea de sinucidere are loc atunci cnd un metabolit reactiv al medicamentului, format n etapele anterioare catalizate de o enzima CYP, se leag de aceast enzim i modific structura sa, ducnd la pierderea ireversibila a funciei. II.4.4. Mecanisme de inhibiie a enzimelor citocromului P450 Inhibarea enzimelor metabolice, n special cele ale sistemului P450, reprezint o preocupare permanent pentru industria farmaceutic pentru dou motive; pe de o parte, inhibarea enzimei poate determina interaciuni medicamentoase atunci cnd dou sau mai multe medicamente sunt administrate simultan, iar pe de alt parte, unele izoenzime specifice ale citocromului P450 pot fi considerate ca inte terapeutice. Un exemplu este CYP19 (aromataz) (Koymans, 1995), care catalizeaz aromatizarea androgenilor n estrogeni a cror inhibiie este util n tratamentul cancerului de sn (Brueggemeier, 2001). Inhibiia aromatazei este un tratament utilizat pe scar din ce n ce mai larg n terapie; exist multe studii clinice cu privire la utilizarea unor compui care au ca mecanism de aciune inhibarea aromatazei (Brueggemeier, 2005; Carlini, 2005; Ziegler, 2005). Inhibarea unor izoforme ale citocromilor P450 ca inte terapeutice nu sunt nc metode terapeutice aplicate n practica clinic. II.4.5. Efectele sucului de grapefruit asupra metabolismului medicamentelor n anii '90, Bailey et al. (1991) au raportat pentru prima dat interaciunea sucului de grapefruit-medicamente observate ntre sucul de grepfrut i felodipin, un blocant dihidropiridinic al canalelor de calciu (Bailey et al., 1991). ntr-un studiu clinic cu pacienii hipertensivi, la care s-au administrat 250 ml suc de grapefruit dublu concentrat s-a observat triplarea ariei de sub curb pentru felodipin, comparativ cu lotul control (Bailey et al., 1991). n paralel, a crescut concentraia plasmatic maxim (Cmax) a felodipinei; timpul de njumtire a rmas neschimbat. ASC pentru a dehidrofelodipin, metabolitul principal al felodipinei, a fost, de asemenea crescut de sucul de grapefruit. Cu toate acestea, raportul ASC dehidrofelodipine/felodipin a fost mai mic la administrarea sucului de grepfrut dect la lotul control. Felodipina este, de obicei complet absorbit din tractul gastro-intestinal (Edgar et al., 1985). Cu toate acestea, datorit metabolizrii sale presistemice, biodisponibilitatea absolut este de aproximativ 15%, cu considerabile variaii interindividuale. Oxidarea
12
felodipinei la dehidrofelodipin i a acesteia, mai departe ntr-un metabolit secundar sunt catalizate de CYP3A4, care este exprimat abundent att n zona apical a enterocitelor din intestinului subire ct i n hepatocite. Astfel, rezultatele obinute de Bailey et al (1991) indic faptul c sucul de grapefruit inhib att mecanismul principal de metabolizare a felodipinei ct i ulterior calea de metabolizare a dehidrofelodipine. n plus, s-a nregistrat o corelaie ntre concentraiile plasmatice ale felodipinei i efectele farmacodinamice ale acesteia: scderea tensiunii arteriale, intensificarea activitii cardiace precum i creterea frecvenei reaciilor adverse (vasodilataie) (Bailey et al., 1991). Deoarece sucul de grapefruit nu a modificat farmacocinetica felodipin administrate intravenos, s-a emis ipoteza c interaciunea acesteia cu sucul de grapefruit se datoreaz inhibrii metabolismului presistemic al medicamentului (Lundahl et al., 1997). Mecanismul de aciune probabil n producerea interaciunii sucului de grapefruit cu diferite medicamente este inhibarea metabolismului mediat de CYP3A4 la nivelul primului pasaj, n peretele intestinal. Cercetrile realizate de Lown et al., (1997) a ofer sprijin n favoarea acestei ipoteze. n acest studiu, realizat in vivo, consumul de suc de grapefruit timp de 5 zile a determinat o reducere de 62% a proteinelor CYP3A4 din enterocitele de la nivelul intestinal. De asemenea, a avut loc o cretere de 3 ori a ASC pentru felodipin i de 5 ori a Cmax, respectiv. n schimb, nu a avut loc modificarea nivelului CYP3A4 mRNA la nivel intestinal sau hepatic, a activitii CYP3A4, a glicoproteinei P la nivel intestinal sau a CYP3A5 la nivelul colonului. Mai mult, nivelui intestinal al CYP2D6 i CYP1A1 a rmas neschimbat. Aceste observaii au dus la concluzia c scderea expresiei CYP3A4 n peretele intestinal n urma consumului de suc de grapefruit nu se bazeaz numai pe inhibarea competitiv. Deoarece nivelul CYP3A4-ARNm n intestinul subtire nu s-a modificat, se sugereaz c sucul de grepfrut a redus, probabil, coninutul de proteine CYP3A4 prin mecanism posttranscriptional, eventual prin degradarea accelerat a CYP3A4 prin mecanismul inhibiie-sinucidere. Astfel, restaurarea activitii CYP3A4 ar necesita sinteza de novo a enzimelor (Lown et al., 1997). Rezultatele sunt n concordan cu studiile realizate de Lundahl et al. (1995), care a artat c efectul unei doze unice de suc de grapefruit asupra farmacocineticii felodipinei este prezent chiar i atunci cnd sucul a fost consumat cu 24 de ore nainte de administrarea medicamentului. Dei sucul de grapefruit nu a afectat concentraia de P-gp in intestinul subire, funcia acestei proteine transportoare se poate modifica n alt mod. Componentele grapefruitului inhib funcia P-gp n celulele CaCO-2 in vitro; n plus, inhibarea P-gp poate fi responsabil pentru efectul sucului de grapefruit asupra farmacocineticii ciclosporinei in vivo (Takanaga et al., 1998;. Edwards et al., 1999).
13
II.4.5.1. Ingrediente active din sucul de grapefruit flavonoide i furanocumarine Sucul de grapefruit (Citrus paradisi) conine numeroase componente flavonoidice structural diferite; multe dintre acestea se gsesc n alte plante (unele cunoscute i utilizate ca plante medicinale) i fructe. Flavonoidul cel mai des ntlnit n sucul de grapefruit este naringina, considerat responsabil de gustul amar al unor pri ale fructului; concentraiile de naringin variaz pe o palet foarte larg de valori n intervalul 100-800 mg/L, pentru produsele preparate n gospodrie i consumate imediat i 200 mg/L - 500 mg/L n preparate comerciale de suc de grapefruit (Ameer et al., 1996; Hagen et al., 1965; Kupferschmidt et al., 1995). Alte flavonoide prezente n fructul de grapefruit i implicit n suc, mai ales sub form de glicozide includ narirutin, hesperidina, quercetin, kaempferol, i apigenina (Guengerich et al., 1990). Naringina i agliconul su naringenina sunt cunoscute ca inhibitori competitivi ai CYP3A4, mediatori ai metabolizrii medicamentelor n microzomii hepatici umani (Guengerich et al., 1990; Miniscalco et al., 1992.). Pe baza acestei proprieti a naringinei i pe existena sa n suc ca reprezentant cantitativ a flavonoidelor s-a formulat mecanismul prin care se produce interaciunea farmacocinetic dintre sucul de grapefruit i medicamente. Mai mult dect att, naringina este absent din sucul de portocale, pentru care, la un moment dat s-a demonstrat c nu afecteaz farmacocinetica felodipinei sau a ciclosporinei (Bailey et al., 1991; Yee et al., 1995). Naringenina, agliconul naringinei este eliberat din glicozid prin scindarea enzimatic a componentei glucidice, eventual n intestinul subire; ulterior aceasta este supus conjugrii cu acidul glucuronic (Fuhr et al.,1995). In vitro, naringenina este confirmat ca inhibitor al metabolismului medicamentelor mai activ dect naringina. n studiile in vivo, naringenina nu a fost evideniat n plasm; compusul excretat pe cale renal are concentraii reduse, comparativ cu doza de naringin administrat, n timp ce glucuronoconjugatul naringeninei a avut concentraii mai mari n plasm i n urin. Aceste variaii ale distribuiei i eliminrii naringeninei au sugerat c efectul inhibitor al acestor flavonoizi prezeni n sucul de grapefruit se manifest la nivelul intestinului subire. Cu toate acestea, naringina administrat sub form de soluie apoas sau sub form de capsule, n concentraiile n care este prezent n sucul de grapefruit nu a afectat farmacocinetica dihidropiridinei in vivo (Bailey et al., 1993). Cvercetina este un alt compus flavonoidic al sucului de grapefruit (Fig II.10) care acioneaza ca un inhibitor potent al CYP3A4 in vitro. Nefiind un compus specific pentru sucul de grapefruit rolul lui n producerea interaciunilor farmacocinetice aliment - medicament nu a fost aprofundat. Mai mult, in vivo quercetina nu a afectat farmacocinetica nifedipinei (Rashid et al., 1993).
14
Aprofundarea cercetrilor n scopul descifrrii mecanismului interaciunilor farmacocinetice aliment-medicament, a componentelor responsabile i a intensitii acestui fenomen care ar putea avea semnificaii clinice severe a condus la orientarea ateniei spre un alt grup de componente ale fructelor citrice, i n special a fructelor de grapefruit. Astfel, Edwards et al., (1996) au demonstrat c 6', 7'-dihidroxi-bergamotina, furanocoumarina major n sucul de grepfrut (extractibil n clorur de metilen) poate inhib formarea de 6-hidroxi-testosteron mediat de CYP3A4 n microzomii hepatici de obolan. Studii ulterioare au confirmat c 6',7'-dihidroxi-bergamotina determin o scdere dependent de doz a activitii catalitice a CYP3A4 uman i a imunoreactivitii acestei enzime (Schmiedlin-Ren et al., 1997). II.5.ANTINFLAMATOARE NESTEROIDIENE DICLOFENAC. ASPECTE GENERALE Antinflamatoarele nesteroidiene (AINS) reprezint una din cele mai utilizate clase de medicamente care nsumeaz proprietai analgezice, antipiretice i antiinflamatorii, cu caracter simptomatic. Prototipul este acidul acetilsalicilic care prezint toate aceste efecte de intensitate moderat. Ele sunt folosite n diferite boli inflamatorii, mai ales n afectiunile reumatice i sunt denumite astfel pentru a fi deosebite de antiinflamatoarele steroidiene reprezentate de glucocorticoizi. Diclofenacul se absoarbe repede i complet din tubul digestiv (100% dup administrare oral), dar disponibilitatea sistemic este de aprox. 50%, restul fiind metabolizat la primul pasaj hepatic. Concentraiile plasmatice maxime sunt atinse n curs de 2 ore dupa administrarea oral; concentraiile plasmatice utile: 1-3 ug/ml. Dozele repetate nu conduc la acumularea de diclofenac n plasm. Farmacocinetica diclofenacului a fost studiat dup administrarea i.v. rapid i dup o doz oral unic la voluntari sntoi. 50% din doza oral absorbit nu ajunge n circulaia sistemic, ceea ce reflect un efect de prim pasaj. Se leag de proteinele plasmatice n proporie de 99,7% (n special de albumin). Timpul de njumtaire plasmatica este de 1-2 ore, dar medicamentul se menine mai mult n lichidul sinovial dect n plasm (pn la 11 ore). Nu este detectabil n laptele matern. Metabolizat n proporie mare n ficat, prin glucuronoconjugare i hidroxilare (fenil hidroxilarea diclofenacului este catalizat de CYP P450 3A4 si 2C9). Metaboliii se elimin 2/3 prin urin i 1/3 prin bil. Un metabolit principal la om este compusul 4-hidroxi-diclofenac. Aproximativ 90% din doza oral este excretat n primele 96 de ore dup administrare (Dictionar Vidal, http://www.vidal.fr/). Diclofenacul (n toate formele), este contraindicat la pacienii cu hipersensibilitate cunoscut la diclofenac i produse care conin diclofenac. Diclofenac nu trebuie administrat la pacienii care au prezentat astm bronic,
15
urticarie, sau reactii de tip alergic dup ce au luat aspirin sau alte AINS (reacii severe, rareori fatale). Simptomele de supradozare includ pierderea cunotinei, cresterea presiunii intracraniene si pneumonie de aspiraie; DL 50: 390mg/kg (pe cale oral, la oareci). Datele din literatura de specialitate privind interaciunile poteniale medicament - aliment, n general i medicamente suc de grapefruit n special, sunt total insuficente i de aceea considerm oportuna evaluarea farmacocineticii interaciunii diclofenac - suc de grapefruit, prin experimente pe animale de laborator i prin studii clinice. Rezultatele cercetrilor pot contribui la optimizarea administrrii medicamentelor, n sensul adaptrii dozelor, n funcie de influena sucului de grapefruit asupra biodisponibilitaii medicamentului administrat simultan. Interesul tiinific pentru studierea interaciunilor dintre sucul de grapefruit i medicamente cu administrare oral din numeroase clase terapeutice este confirmat de numrul foarte mare de publicaii care rapoteaz rezultatele cercetrii farmacocineticii acestor interaciuni prin experimente pe animale de laborator sau prin studii clinice pe subieci sntoi. Pentru medicamentul selectat pentru studiu (Diclofenac), datele prind interaciunile farmacocinetice cu alimentele, n general, i cu sucul de grapefruit, n special, sunt relativ puine (Mahgoub, 2002). Capitolul III STUDIUL INTERACIUNII FARMACOCINETICE DINTRE DICLOFENAC I SUCUL DE GRAPEFRUIT Obiective Validarea metodei HPLC de determinare a diclofenacului din plasma de obolan. Studiul experimental al interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de grapefrut. III.2.4. Raport de validare Parametri de performant ai metodei analitice care s-au evaluat: specificitate, liniaritate, limita inferioar de cuantificare, precizie i acuratee, regsirea, validarea diluiei probelor biologice Rezultatele validrii i concluzii III.2.4.2. Specificitatea: Nu au fost observate interferene la timpul de retenie al diclofenacului (1.9 minute). (Fig. III.7). In fig.III.8 este prezentat cromatograma unei probe cu diclofenac la limita de cuantificare (48.7 ng/ml plasma).
16

Intens . 5000
4000
3000
2000
1000
0 0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Time [min]
Fig.III.7. Blank de plasma pentru testarea specificitatii

Intens . x104
1.5
1.0
0.5
0.0 0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
Time [min]
Fig.III.8. Cromatograma unei probe cu diclofenac, la limita de cuantificare III.2.4.3. Liniaritatea Curbele de calibrare au fost liniare cu precizie i acuratee corespunztoare- n intervalul de concentraii 48.7-3120 ng/ml. (Tabel III.7). Coeficienii de corelare au fost mai mari dect 0.995. Concentraiile recalculate pe baza curbei ce calibrare demonstreaz c rezidualii nu au o anume tendin raportat la concentraie. O curb de calibrare a analitului n matrice este prezentat n figura III.9.
Fig.III.9. Curba de calibrare a diclofenacului

17
III.2.4.4. Limita inferioar de cuantificare Limita inferioar de cuantificare (cel mai sczut nivel la care acurateea i precizia nu depesc +/-20%) a fost de 48.75 ng/ml diclofenac. Precizia i acurateea pentru determinri n aceeai zi au fost de 7.0% i 12.9%. Precizia i acurateea pentru determinri n zile diferite au fost de 18.9% i 4.1% (Tabelele III. 8; III.9). Tabel III.8
Acuratetea, precizia si regasirea pentru determinari in aceeasi zi Concentratia Concentratia Acuratetea masurata ng/ml ( Precizia % nominala ng/ml % D.S.) 48.75 55.03 3.85 7.0 12.9 146.25 154.67 12.01 7.8 5.8 292.50 288.26 12.79 4.4 -1.4 585.00 608.63 29.71 4.9 4.0
Regasirea % ( D.S.) 90.1 106.0 90.7 101.1 8.2 9.0 4.1 5.0
Tabel III.9
Acuratetea, precizia si randamentul pentru determinari in zile diferite Concentratia Acuratetea Concentratia masurata ng/ml ( Regasirea % ( D.S.) Precizia % % nominala ng/ml D.S.) 48.75 46.75 8.82 18.9 -4.1 83.4 9.4 146.25 155.79 4.20 2.7 6.5 103.1 11.8 292.50 302.03 13.44 4.4 3.3 99.9 6.6 585.00 621.46 14.96 2.4 6.2 100.9 6.3
III.2.4.5. Precizia i acurateea Precizia i acurateea pentru cele trei niveluri testate au fost mai mici dect +/- 15%, att pentrru determinrile n aceeai zi ct i pentru cele din zile diferite (Tabelele 2 si 3). III.2.4.6. Regsirea Regsirea medie a analitului variaz ntre 83% si 106% pentru limita de cuantificare i cele trei niveluri de concentraii de control testate. III.2.4.7. Validarea diluiei Diluiile analitului n matricea biologic se poat face cu un coeficient de variaie sub 8.47% i o acuratee sub 6.3% , pentru determinri n aceeai serie sau serii diferite.
18
III.3. STUDIUL INTERACIUNII FARMACOCINETICE DINTRE DICLOFENAC I SUCUL DE GRAPEFRUI III.3.2. Aplicarea modelului experimental. Etapa clinic Determinarea concentraiei principiului activ n plasma sngelui de obolan a relevat diferene total nesemnificative ntre cele trei moduri de administrare a diclofenacului i a sucului de grapefruit. n continuare, studiul farmacocinetic Diclofenac suc de grapefruit a fost realizat pe dou loturi a cte 30 de obolani. Lotul I, a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de grapefruit, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit rou), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Deoarece, n etapa preliminar a studiului s-a stabilit c dup 12 ore de la administrare, diclofenacul nu mai este prezent n plasm, recoltarea sngelui (din plexul orbital) s-a realizat la intervale de 30, 60, 90, 120 minute, 3h, 4h, 6h, 8h, 10 h i 12 ore de la administrarea medicamentului. Pentru fiecare interval de timp s-au recoltat probe de snge de la 5 animale. Sngele a fost centrifugat imediat dup recoltare, iar plasma a fost pstrat la congelator (- 36 grade C) pna la analiza HPLC/MS, prin metoda de dozare validat anterior. Lotul II a primit cte 2 ml ap i, dup 30 de minute 10 mg diclofenac/kg. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. III.3.3. Etapa analitica. Rezultate Pentru dozarea diclofenacului din plasma de sobolan s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de masa (HPLC-MS), metoda standardului extern. Metoda a fost validat conform protocoalelor n vigoare pentru stabilirea condiiilor de aplicare a metodelor HPLC. III.3.4. Etapa farmacocinetic Profilurile plasmatice suprapuse ale diclofenacului, n funcie de perioada de administrare (cu sau fr sucul de grapefruit), sunt prezentate n Fig. III:10 (grafic cartezian) respectiv Fig III.11 (grafic logaritmic), n=5.
19

3500 diclofenac singur 3000 Concentratia diclofenac (ng/ml) diclofenac + suc de grapefruit 2500 2000 1500 1000 500 0 0 2 4 6 8 Timp (ore) 10 12 14
Fig. III.10. Profiluri plasmatice ale diclofenacului administrat singur, respectiv mpreun cu sucul de grapefruit, grafic cartezian, n=5 Discuii. Mecanismul interaciunii Prin analiza vizual a profilurilor plasmatice, dup cum era de ateptat, se observa concentraii de diclofenac mai mari n cazul co-administrrii de suc de grapefruit. Totui, se observ o mare variabilitate n cadrul probelor prelevate la aceiai timpi dar de la obolani diferii (Figurile III.12-III.16); valorile parametrilor farmacocinetici (arie de sub curb, T max, C max scot n eviden tendina de cretere a concentraiilor plasmatice ale diclofenacului administrat simultan cu sucul de grapefruit. Acest lucru se poate explica att prin farmacocinetica diclofenacului, caracterizat de variabilitate inter-individuala mare, dar i de specificul experimentului clinic administrare/ sacrificare animal la un anumit interval de timp, ceea ce induce un plus de variabilitate. Pornind de la concentraiile plasmatice ale diclofenacului, s-a realizat analiza farmacocinetic non-compartimental. Principalii parametri farmacocinetici determinai au fost: concentraia maxima plasmatic (Cmax), timpul de atingere al acesteia (Tmax), aria de sub curba concentraiilor plasmatice n funcie de timp (ASC). timpul de njmtaire (t) timpul mediu de reziden n organism (TMR). Primii doi parametri dau indicaii asupra vitezei de absorbie, iar ASC despre marimea absorbiei. De asemenea, au fost calculai i parametri farmacocinetici precum timpul de injmatire (t) i timpul mediu de rezidena n organism (TMR).
20
Analiza farmacocinetic s-a realizat cu ajutorul unui program de calculator special conceput pentru acest lucru programul Kinetica (TermoLabSystems, SUA). Rezultatele calculelor farmacocinetice sunt prezentate detaliat n Anexa I: Detalierea calculelor farmacocinetice i statistice pentru diclofenac. Parametrii farmacocinetici ai diclofenacului sunt prezentai n Tabelul III.11, pentru toti subiecii inclui n studiu. Tabel III.11 Principalii parametri farmacocinetici ai diclofenacului administrat singur sau in combinaie cu sucul de grapefruit. Diclofenac Diclofenac + suc de Parametrul singur grapefruit Cmax (ng/ml) 1384.56 2262.59 Tmax (ore) 3 2 ASClast (ng/ml*ora) 7101.78 9233.88 ASCtot (ng/ml*ora) %ASCextra t1/2 timp mediu de rezidenta (ore) 7652.13 7.19 2.33 4.35 9527.67 3.08 2.35 3.91
Analizand rezultatele analizei farmacocinetice efectuate, se poate observa c: Diclofenacul are concentraii plasmatice la obolan considerabil mai mari n cazul co-administrrii de suc de grapefruit dect administrat singur. Deoarece doza administrate (raportat la kg masa corporal) a fost acceai, aceast observaie dovedete existena interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de grapefruit. Dintre parametrii farmacocinetici calculate ai diclofenacului, Cmax creste de la 1384.5 ng/ml (diclofenac administrat singur) la 2262.6 ng/ml (diclofenac+suc de grapefruit). Aceste valori corespund la o biodisponibilitate relativ de 163.4%, sau altfel spus concentraiile diclofenacului coadministrat cu suc de grapefruit cresc cu 63.4% fa de normal, din cauza interaciunii farmacocinetice. Deoarece creterea Cmax poate fi corelat att cu creterea cantitaii substanei absorbite, ct i cu viteaza de absorbie, utiliznd doar valorile Cmax nu se poate preciza mecanismul/locul de interaciune farmacocinetic. Un alt parametru farmacocinetic care se modific este aria de sub curba, ce crete de la 7652.1 ng/ml*ora la 9527.7 ng/ml*ora. Aria de sub curba este un
21
parametru ce se coreleaz cu cantitatea de substan ce ajunge n circulaia sistemic. Biodisponibilitatea relativ a diclofenacului administrat cu sucul de grapefruit fa de diclofenacul singur este egal cu 124.5%. Cu alte cuvinte, n cazul administrrii cu suc de grapefruit, n circulaia sistemic va ajunge cu 24.5% mai mult diclofenac dect dac acesta este administrat singur. Cresterea ariei de sub curb n cazul coadministrrii diclofenacului cu sucul de grapefruit constituie i n acest caz o dovad a interaciunii farmacocinetice. Exist parametri farmacocinetici ai diclofenacului a cror variaie nu este marcant ntre cele dou tratamente. Este vorba de timpul de injumtire, cu valori similare, timpul mediu de reziden i Tmax. Dei diferena ntre Tmax este de la 3 ore (diclofenac singur) la 2 ore (diclofenac + suc de grapefruit), diferena nu e relevant datorit valorilor discrete ale parametrului Tmax (ntre 2 si 3 ore nu poate lua alt valoare deoarece nu au existat prelavari). In astfel de situaii, diferenele observate nu se considera semnificative. Faptul c timpii de njumtii ai diclofenacului sunt similari indiferent de modul de administrare (singur sau cu suc de grapefruit), dovedete faptul c nu exist o interaciune la nivelul eliminrii substanei; deci sucul de grapefruit nu infleneaz capacitatea organismului de a elimina aceasta substan. Din moment ce funcia de eliminare a diclofenacului nu este afectat de sucul de grapefruit, dar totui parametrii Cmax si ASC dovedesc existenta interaciunii, aceasta se poate explica doar prin creterea biodisponibilitii datorit scderii efectului primului pasaj intestinal sau hepatic, fie prin inhibiia directa a izoenzimei CYP2A4 (ce exist n proporie de 40% n intestin), fie prin inhibiia glicoproteinei P, cu rol de pompa ce scoate substana medicamentoas din celula intestinal, impiedicnd sau diminund absorbia acesteia. Rezultatele acestui studiu experimental sunt n deplin concordan cu cele publicate de Mahgoub (2002). Asocierea sucului de grapefruit cu diclofenacul (doze de diclofenac de 1,0; 2,5; 5,0 mg/kg corp administrate la obolan concomitent cu sucul de grapefruit), reduce volumul edemului labei indus cu carageenan n proporie de 19 47%, datorit creterii biodisponibilitii medicamentului. De asemenea, rezultatele noaste confirm implicarea sucului de grapefruit n modularea activitii enzimatice a complexului CYP, izoforma CYP3A4. Mecanismul prin care pare a fi inactivat enzima CYP3A4 este descris de mai muli autori. Astfel, Masubuchi et al., (2001) a demonstrat c incubarea diclofenacului cu microzomi hepatici umani n prezena NADPH a condus la scderea activitii 6-hidroxilare a testosteronului. Aceast reducere a activitii i a timpului de reacie, evaluat prin urmrirea cineticii dependent de concentraie, presupune metabolizare oxidativ, rezistena la 22
reducerea glutationului, sugernd c diclofenacul provoac o inactivare de tip inhibiie-sinucidere a CYP3A4. Mecanismul de inactivare de tip inhibiie sinucidere a citocromului P450 poate deveni o problem clinic grav, pentru c este posibil acumularea nedorit a medicamentului i producerea interaciunilor medicamentoase. n cercetarea mecanismului de producere a interaciunilor studierea inhibiieisinucidere este valoroas pentru identificarea unor izoenzime P450 responsabile de reactivitatea unor monooxigenaze specifice i a mai marii lor selectiviti dect a inhibitorilor competitivi. Proprietatea acestor compui de a se lega covalent specific de anumii aminoacizi ai P450 specific permite identificarea site-ul activ al enzimei P450 (Halpert, 1995; Kent et al., 2001). Aceiai autori (Masubuchi et al., 2001) au semnalat c diclofenacul, medicament antiinflamator nesteroidian este un inactivator puternic prin mecanism inhibiie-sinucidere a CYP2C11, izoenzim P450 predominant n ficatul de obolan de sex masculin; CYP2C11 este enzima responsabil de metabolizarea major a diclofenacului prin 4-hidroxilare i 5-hidroxilarea (Fig. III.1), n microzomii hepatici de obolan (Masubuchi et al., 2001). Anterior, ali autori au demonstrat c alte dou izoenzime P450 distincte, CYP2C9 i CYP3A4 sunt implicate metaboliuzarea diclofenacului, prin hidroxilare n microzomii hepatici umani (Leemann et al., 1993; Shen et al., 1999; Tang et al., 1999b). Deoarece CYP2C9 nu a fost inactivat n timpul metabolizrii diclofenacului (Masubuchi et al., 2001), autorii au sugerat c inactivarea CYP2C11 a fost independent de 4 - hidroxilare, presupunnd c, dimpotriv 5-hidroxilarea este implicat n inactivarea CYP2C11. Astfel, la om, este posibil ca CYP3A4, izoenzim major responsabil de 5-hidroxilarea diclofenacului s fie susceptibil de inactivare n timpul metabolizrii diclofenacului. Un alt metabolit al 5-hidroxidiclofenacului, benzoquinon imina este chimic reactiv i se poate lega covalent de proteinele celulare (Shen et al., 1999; Tang et al., 1999; Yan et al., 2005). III.3.6. Concluzii Finalizarea cercetrilor proprii privind producerea interaciunii farmacocinetice la administrarea diclofenacului simultan cu sucul de grapefruit a condus la concluzii care confirm aceast ipotez. Rezultatele obinute, n concordan cu datele existente n literatura de specialitate, sugereaz inhibiia tip sinucidere ca mecanim probabil i posibil al producerii interaciunii. Aceste concluzii sunt susinute de parametrii farmacocinetici ai diclofenacul administrat concomitent cu sucul de grapefruit, comparativ cu ai medicamentului ca atare. Parcurgerea etapelor de lucru conform protocolului de validare a metodei HPLC de determinare a diclofenacului a condus la stabilirea condiiilor cromatografice HPLC care confirm validitatea determinrii: Instrument : HPLC Agilent Technologies 1100 Series
23

Coloana : Zorbax SB-C18 100x3.0 mm, 3.5 m Faza mobila: 52% acetonitril, 48% solutie acid acetic 0.2% (V Debit: 1 ml/min Volum injectare: 5 microL Temperatura coloanei: 40 C Detectia: MS/MS/MS Diclofenac: ESI+, EIC(215+248+250) din (278+280) din (296+298), Timp de retentie: 1.9 minute Timp de analiza / proba: 2.4 minute Metoda validat a fost aplicat cu rezultate satisfctoare n etapa farmacocinetic a studiului. Stabilirea modelului experimental i aplicarea acestuia la studiul interaciunii sucului de grapefruit cu diclofenacul, administrat n doz unic (10 mg/kgc), la obolan a confirmat ipoteza producerii interaciunii farmacocinetice la asocierea alimentului cu medicamentul luat n studiu. Biodisponibilitatea relativ a diclofenacului administrat cu sucul de grapefruit fa de diclofenacul singur este egal cu 124.5%. Cu alte cuvinte, n cazul administrrii cu suc de grapefruit, n circulaia sistemic va ajunge cu 24.5% mai mult diclofenac dect dac acesta este administrat singur. Faptul c timpii de injumatarite ai diclofenacului sunt similari indiferent de modul de administrare (singur sau cu suc de grapefruit), dovedete faptul c nu exist o interaciune la nivelul eliminrii substanei; deci sucul de grapefruit nu infleneaz capacitatea organismului de a elimina aceasta substan. Din moment ce funcia de eliminare a diclofenacului nu este afectat de sucul de grapefruit, dar totui parametrii Cmax si ASC dovedesc existena interaciunii, aceasta se poate explica doar prin creterea biodisponibilitaii datorit scderii efectului primului pasaj intestinal sau hepatic, fie prin inhibiia direct a izoenzimei CYP2A4 (ce exist n proporie de 40% n intestin), fie prin inhibiia glicoproteinei P, cu rol de pompa ce scoate substana medicamentoas din celula intestinal, impiedicnd sau diminund absorbia acesteia. Compararea rezultatelor proprii cu cele ale altor autori permite adugarea unui nou argument care pledeaz pentru concluzia final: diclofenacul este recunoscut ca un inhibitor al CYP3A4 prin mecanism inhibiie sinucidere; 5-hidroxi-diclofenacul nu reprezint molecula responsabil de inactivarea enzimei, dar formarea acestui prim metabolit este esenial pentru inhibarea enzimei metabolizante. Aceast concluzie deschide o nou perspectiv asupra consecinelor clinice ale asocierii diclofenacului cu consumul de suc de grapefruit, care prin unele dintre componentele sale inhib izoenzima CYP3A4, probabil prin mecanism inhibiie-sinucidere.
24
Capitolul IV FLAVONOIDELE COMPONENTE BIOACTIVE DIN SUCURI DE FRUCTE Obiective Determinarea flavonoidelor totale din sucuri de fructe. Standardizarea metodelor HPLC de determinare a naringinei i naringeninei din sucurile de fructe. IV.6. DETERMINAREA FLAVONOIDELOR TOTALE DIN SUCURI DE FRUCTE Cercetrile experimentale prezentate n acest capitol au ca obiectiv studiul comparativ al coninutului total n flavonoide, respectiv n naringin pentru diferite sucuri de fructe: citrice (grapefruit alb, roz i rou, portocale, mandarine), mere, pere - preparate industrial sau n laborator. Material i metode Probe de analizat Probele supuse analizei (tabel I) au fost sucuri de grapefruit (alb, roz i rou), de portocale, de mandarine, de pere i de mere - preparate industrial (din comer) sau n laborator, utiliznd storctorul de fructe. Sucurile de citrice preparate n momentul utilizrii (n laborator) s-au realizat n trei variante: suc din pulpa fructului (I), din pulpa fructului i albena (II) i din fructul integral (III). Sucurile preparate industrial au fost achiziionate din reeaua comercial a oraului Iai. Studiu cromatografic Identificarea flavonoidelor din sucurile de fructe s-a realizat prin cromatografie pe strat subire pe suport de silicagel, n sistem ascendent (metoda standardului extern). Ca substane de referin s-au utilizat rutozidul i naringina. Determinarea cantitativ a flavonoidelor Determinarea coninutul total n flavonoide exprimat n naringin s-a realizat prin tehnica prezentat n Farmacopeea Romn, Ediia a X-a, monografia Cynarae folium (Farmacopeea Romn, 1993). Calculul coninutului n flavonoide al probelor de suc, exprimat n mg naringin/100 mL s-a realizat cu ajutorul curbei de calibrare trasate n prealabil, pentru domeniul de concentraii 0-50g. Separarea flavonoidelor din probele de sucuri de fructe n vederea determinrii spectrofotometrice s-a realizat prin tratare cu metanol anhidru (1:1, v/v) i centrifugare timp de 15
25
minute la 3000 RTM. Cot parte din lichidul supernatant a fost prelucrat n modul indicat la trasarea curbei de etalonare. IV.7. DETERMINAREA HPLC A NARINGINEI I NARINGENINEI DIN SUCURI DE FRUCTE IV.7.1. Metoda de analiz Pentru analiza naringinei si naringeninei din extracte de fructe s-a folosit cromatografia de lichide de nalta performanta cuplata cu spectrometria de masa (LC/MS). IV.7.1.1. Standarde Au fost utilizate standarde de naringina (producator Extrasynthese, Genay, Franta) si naringenina (producator Extrasynthese). IV.7.1.2.Conditiile de lucru HPLC Coloana analitica : Kinetex C18, 50 mm x 2.1 mm i.d., 2.6m Filtru online 0.5 m Faza mobila: - Analiza naringenina: amestec acetonitril: solutie acetat de amoniu 2 mM (V/V), elutie 30 /70 - Analiza naringina: amestec acetonitril: solutie acetat de amoniu 2 mM (V/V), elutie 25 /75 Debitul: 0.3 ml/min, temperatura: 40 C Detectia: - Naringenina si naringina: ESI-MS, ionizare negativa Volumul de injectare: 2 l IV.7.1.3.Conditiile de lucru MS Sursa de ioni: ESI (electrospray) Mod ionizare: negativ Nebulizator: azot, presiune 40 psi Gaz de uscare: azot, debit 10 L/min, temperatura 350C Potential capilara: + 3000 V Mod analiza: Naringin - MS (m/z 579.1) si Naringenina - MS/MS (m/z 271> m/z 151.7) IV.7.2. Analiza naringeninei Spectrul de masa al unei solutii standard de naringenina este prezentat in Fig. IV. 33- IV.35. Se observa ionul pseudo-molecular cu m/z 271, obtinut in urma ionizarii prin deprotonare a naringeninei (M=272). Dupa izolare si
26
fragmentare, ionul pesudo-molecular al naringeninei se scindeaza in ionii cu m/z 151.7 si 177.7, primul dintre acestia fiind ales mai departe pentru cuantificare.
Intens. x10 5 0.8 0.6 0.4 0.2 00 5 114.0 169.8 213.6 227.8 255.7 297.2 -MS, 0.3-0.3min, 100%=82919 271.3
Fig. IV. 33. Spectrele de masa ale naringeninei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: spectru full-scan;
0.0 x10 5 1.5 1.0 0.5 0.0 4 -MS2(271.1), 0.4-0.4min, 100%=128262 271.1
Fig. IV. 34. Spectrele de masa ale naringeninei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: izolare;
0.0 x10 4 5 4 3 2 1 0 100 120.0 120 140 160 177.6 180 200 220 240 260 280 m/z 151.7 -MS2(271.1), 0.6min, 100%=46824 271.1
Fig. IV. 35. Spectrele de masa ale naringeninei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: fragmentare Cromatograma unei solutii standard de naringenina, obtinuta in conditiile descrise mai sus este prezentata in Fig. IV. 36.
27

Intens. x10 4 8
0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 T i me [mi n]
Fig. IV. 36. Cromatograma unei solutii standard cu naringenina (timp de retentie analit: 1.65 minute) Curba de calibrare pentru naringenina (Tabel IV. 4; Fig. IV.37 a fost realizat in intervalul 50-2500 ng/ml.
Fig. IV. 37. Curba de calibrare pentru determinarea naringeninei IV.7.3. Analiza HPLC a naringinei Spectrul de masa al unei solutii standard de naringina este prezentat in Fig. IV. 39 - Fig. IV. 41. Se observa ionul pseudo-molecular cu m/z 579, obtinut in urma ionizarii prin deprotonare a naringinei (M=580). Dupa izolare si fragmentare, ionul pesudo-molecular al naringinei se scindeaza in ionii cu m/z 271.1 si 458.9. Desi in cazul analizei pe baza unui ion din spectrul MS al unei substante (in cazul de fata m/z 458.9), sensibilitatea si specificitatea analizei este mult crescuta, in 28
cazul de fata, deoarece randamentul de fragmentare m/z 579 > m/z 459 este mic, analiza s-a realizat prin monitorizarea ionului pseudomolecular m/z 579, fara fragmentare ulterioara. Ionul cu m/z 271 din spectrul MS/MS al naringinei corespunde naringeninei care se obtine in urma ruperii legaturii chimice dintre aglicon si zaharid.
Intens. x10 4 4 3 2 1 0 4 153.7 271.2 325.1 471.3 633.4 -MS, 0.1-0.2min, 100%=40267 579.1
Fig. IV. 39. Spectrele de masa ale naringinei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: spectru full-scan;
0 x10 4 6 4 2 0 MS2(579 1) 0 5 0 6 i 100% 6414 -MS2(579.1), 0.3-0.4min, 100%=59855 579.1
Fig. IV. 40. Spectrele de masa ale naringinei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: izolare
0 8000 6000 4000 2000 0 100 193.4 200 235.2 271.1 579.0 313.0 300 396.9 400 500 600 m/z -MS2(579.1), 0.5-0.6min, 100%=6414 458.9
Fig. IV. 41. Spectrele de masa ale naringinei, obtinute prin ionizare electrospray, mod negativ: fragmentare Cromatograma unei solutii standard de naringina, obtinuta in conditiile descrise mai sus este prezentata in Fig. IV. 42.
29

Intens. x10 5
1.5
1.0
0.5
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Time [min] EIC 578.8-579.8 -MS2(579.1)
Fig. IV. 42. Cromatograma unei solutii standard cu naringina (timp de retentie analit: 1.25 minute) Curba de calibrare pentru naringina (Fig. IV. 43; Tabel IV. 5) a fost realizata in intervalul 63-6300 ng/ml. Pentru constructia curbelor de calibrare s-a utilizat modelul quadratic (y=ax2+bx+c).
Fig. IV. 43. Curba de calibrare pentru naringin

30
Probele de analizat au fost diluate 1/100 cu apa distilata, au fost centrifugate (3 minute la 12000 rpm) iar 2 l din supernatant s-au injectat in sistemul cromatografic. Cromatogramele probelor analizate sunt prezentate in Fig. IV. 51 Fig. IV. 52.
Intens. x10 5
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Time [min]
Fig. IV. 51. Cromatograma naringinei, Proba 1 Timp retentie: 1.25 minute. Concentratia de naringina gasita (dupa aplicarea factorului de dilutie) a fost de 225.3 g/ml
Intens. x10 5
1.5
1.0
0.5
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Time [min]
Fig. IV. 53. Cromatograma naringinei, prob de suc de mere In aceast prob nu s-a identificat prezena naringinei. 31
Observaie In cromatogramele naringinei, la timpul de retentie de 1.05 minute se observa existenta unui alt semnal. Deoarece analiza se face prin spectrometrie de masa, prezenta acestui semnal de la 1.05 minute denota existenta unui compus cu aceeasi masa moleculara cu a naringinei (compus izobar). Pentru a elucida daca acest compus este la randul sau un derivat de naringenina, a fost realizat spectrul de masa tip MS3 al su, comparativ cu cel al naringinei. Cromatograma tip Auto MS3 pentru compusul necunoscut (timp retentie 1.05 minute) si pentru naringina (timp retentie 1.25 min) este prezentata in Fig. IV. 54.
Intens. x10 7
1.5
1.0
0.5
0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Time [min]
Fig. IV. 54. Cromatograma tip Auto MS3 pentru compusul necunoscut (RT 1.05 min) si naringina (1.25 min). Spectrele de masa tip MS3 atat pentru compusul necunoscut, cat si pentru naringina sunt prezentate comparativ in Fig. IV. 55 - Fig. IV. 57, respectiv n Fig. IV. 58 - Fig. IV.60. Se observa ca, spre deosebire de naringina care s-a scindat in doi ioni principali (cu m/z 271 si 459), compusul necunoscut se scindeaza doar in ionul cu m/z 271, care este in fapt naringenina, agliconul constitutiv deprotonat. Mai mult, prin realizarea spectrului MS3 al ionului cu m/z 271 din compusul necunoscut se observa ionii caracteristici naringeninei (m/z 151.6 si 177.6), ioni care au fost observati prin analiza spectral directa a acestei substante (Fig. IV. 33).
32
n concluzie, substanta necunoscuta contine ca aglicon naringenina, dar partea glucidica e diferita de cea din naringina. Datorita componentei sale (aglicon de naringenina), dupa hidroliza intestinala, si acest compus poate fi responsabil de inhibitia enzimatica observata la adminsitrarea sucului de grapefruit.
Intens. x10 7 0.8 0.6 0.4 0.2 615.3 00 6 -MS, 1.1min, 100%=7333777 579.6
Fig. IV. 55. Spectrele de masa tip MS3-1 pentru compusul necunoscut, timp retentie 1.05 minute
0.0 x10 6 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 5 S ( ) % 271.2 -MS2(579.6), 1.1min, 100%=709261
0.0 x10 5 1.5 1.0 0.5 108.0 0.0 100 177.6 200 271.1 300 400 500 600 m/z 151.6 -MS3(579.6->271.3), 1.1min, 100%=144991
33

Intens. x10 7 1.0 0.5 615.5 0.0 10 5 693.2 -MS, 1.2min, 100%=12400246 579.9
MS2(579 7) 1 3 i 100% 515695
Fig. IV. 58. Spectrele de masa tip MS3-1 pentru naringina, timp retentie 1.25 minute
0.0 x10 5 6 4 2 235.7 0 4 313.1 357.0 S ( ) % 271.4 -MS2(579.7), 1.3min, 100%=515695 459.1
Fig. IV. 59. Spectrele de masa tip MS-3-2 pentru naringina, timp retentie 1.25 minute
0 x10 4 4 3 2 1 0 100 200 300 400 500 600 m/z 271.1 423.2 151.6 356.9 235.2 -MS3(579.7->459.2), 1.3min, 100%=39464
Fig. IV. 60. Spectrele de masa tip MS3-3 pentru naringina, timp retentie 1.25 minute IV.7.3.1. Determinarea naringinei din probe de sucuri Probele supuse analizei au fost sucuri de grapefruit (alb, roz i rou), de portocale, de mandarine, de pere i de mere - preparate industrial (din comer) sau n laborator, utiliznd storctorul de fructe. Sucurile de citrice preparate n momentul utilizrii (n laborator) s-au realizat n trei variante: suc din pulpa
34
fructului (I), din pulpa fructului i albena (II) i din fructul integral (III). Sucurile preparate industrial au fost achiziionate din reeaua comercial a oraului Iai. Pentru analiza HPLC, probele de suc preparate anterior sau procurate din reeaua comercial au fost diluate 1/100 cu apa distilata, au fost centrifugate (3 minute la 12000 rpm), iar 2 l din supernatant s-au injectat in sistemul cromatografic. In nici una din probele analizate nu a fost identificata naringenina. Acest lucru este explicabil prin faptul ca naringenina (agliconul aflat in structura naringinei) nu se gaseste liber ca atare n produsul alimentar, ci apare in organism doar dupa hidroliza enzimatica a naringinei in timpul absorbtiei. IV.7.3.1.1. Rezultate Concentratiile de naringina determinate in probele analizate sunt prezentate in figurile IV. 77 IV. 79.
Fig. IV. 77. Concentraiile naringinei n probele de suc de grapefruit preparate n laborator
35
Fig. IV. 78. Concentraiile naringinei n probele de suc de citrice (pomelo, mandarine, portocale)
Fig. IV. 79. Concentraiile naringinei n probele de suc de grapefruit preparate industrial
36
Fig. IV. 80. Concentraiile naringinei n probele de sucuri de fructe preparate industrial IV.7.3.1. 2. Discuii Din analiza concentraiilor naringinei n sucurile de grapefruit preparate n laborator se constat valori mai crescute la sucul preparat din grapefruit rou-fructul integral (292,24 mg/100 mL i valori mai sczute, dar apropiate la sucul preparat din grapefruitul alb, respectiv roz. Aceleai constatri sunt valabile pentru sucurile preparate din pulpa fructului. Pentru acest produs, concentraiile de naringin variaz de la 225,32 mg/100 mL la grapefruitul rou, la 186,06 mg/100 mL pentru sucul din grapefruit alb. Sucurile de portocale au concentraii de naringin mult mai sczute: 67,41 mg/100 mL la sucul preparat din pulpa fructului, 86,37 mg/100 mL pentru sucul preparat din fructul integral i 94,12 mg/100mL pentru sucul preparat din pulpa i albena. n sucul de mandarine s-au determinat concentraii de naringin cuprine ntre 81,65 mg/100 mL i 116,23 mg/100 mL. Pentru pomelo concentraiile de naringin sunt semnificativ mai crescute; astfel, sucul de pomelo preparat din pulpa fructului conine 2024 mg naringin/100 mL, sucul obinut din pulpa i albena are 1496,58 mg/100 mL, n timp ce produsul obinut din fructul integral are 1424, 21 mg/100 mL. n ceea ce privete coninutul n naringin a buturilor rcoritoare preparate industrial pe baz de suc de grapefruit, variabilitatea concentraiilor este cu mult mai mare, n funcie de proporia de suc utilizat la preparare. La unele sortimente (proba 13) n-a fost evideniat prezena naringinei, pe cnd la altele (proba 9) valorile coninutului de naringin au urcat la 420,96 mg/100 mL.
37
Rezultate obinute de noi sunt n concordan cu unele date din literatura de specialitate. Astfel, Ross et al. (2000) au raportat concentraii de flavonoide totale care variaz ntre 19,44 i 84,28 mg/100 mL pentru 9 probe de suc de grapefruit preparat industrial. Naringina, flavonoidul major determinat n aceleai sucuri are concentraii cuprinse ntre 14,56 i 63,80 mg/ 100 mL. Ribeiro et al. (2008) au determinat naringina prin HPLC cu detecie PAD (photodiode array detector); coninutul mediu n naringin variaz ntre 36,6 mg/100 mL i 134,7 mg/100 mL suc. Autorii au remarcat absena naringeninei din probele analizate; rezultatele sunt n concordan cu cele obinute de noi. IV. 8. CONCLUZII Flavonoidele reprezint o clas important de componente bioactive din fructe, n general i din fructele citrice, n special. Flavonoidele prezente n partea comestibil a fructului de grapefruit sunt considerate parial responsabile de interaciunile cu diferite principii active medicamentoase. Pn n prezent au fost identificate: naringina, poncerina, narirutin, neohesperidina, hesperidina, didymina, narirutin-4-glucozida, naringin-4-glucozida, naringin-6-malonat, eriocitrina, neoeriocitrina, rhoifolin, isorhoifolin, diosmina. Speciile de grapefruit difer ntre ele n ceea ce privete coninutul n flavonoide. Principalele flavonoide prezente sunt: naringina, hesperidina, neohesperidina, neoeriocitrina. Determinarea HPLC a coninutului n naringin s-a realizat dup standardizarea condiiilor de lucru: Conditii de lucru HPLC Coloana analitica : Kinetex C18, 50 mm x 2.1 mm i.d., 2.6 m Filtru online: 0.5 m Faza mobila: - Analiza naringenina: amestec acetonitril: solutie acetat de amoniu 2 mM (V/V), elutie 30 /70 - Analiza naringina: amestec acetonitril: solutie acetat de amoniu 2 mM (V/V), elutie 25 /75 Debitul: 0.3 ml/min, temperatura: 40 C Detectia: - Naringenina si naringina: ESI-MS, ionizare negativa Volumul de injectare: 2 l Condiii de lucru MS Sursa de ioni: ESI (electrospray) Mod ionizare: negativ Nebulizator: azot, presiune 40 psi Gaz de uscare: azot, debit 10 L/min, temperatura 350C Potential capilara: + 3000 V
38
Mod analiza: Naringin - MS (m/z 579.1) si Naringenina - MS/MS (m/z 271> m/z 151.7) Cercetrile experimentale prezentate n acest capitol au urmrit determinarea coninutului n flavonoide totale, tiut fiind faptul c aciunea benefic asupra organismului este datorat, n general fitocomplexului i nu unui anumit component izolat n stare pur din acesta. Valorile obinute la determinarea flavonoidelor totale din cele 25 de probe de sucuri (preparate n laborator sau achiziionate din reeaua comercial), cuprinse ntre 18,32 i 102,54 mg/100mL, evideniaz o mare variabilitate n funcie de natura produsului i de metoda de preparare a sucului. Determinarea coninutului n flavonoide totale n sucuri de fructe (citrice, mere, pere) preparate industrial sau n laborator a evideniat valori diferite att n funcie de natura fructului ct i dup modul de preparare al sucului. Sucul preparat din fructul integral este mai bogat n flavonoide, respectiv n naringin, comparativ cu sucul preparat din pulpa fructului. Sucurile preparate industrial, din fruct integral prezint valori ale coninutului n flavonoide apropiate de cele preparate n laborator. Diferenele constatate ntre concentraiile n componentele bioactive ale sucurilor de fructe explica intensitatea diferit a interaciunilor farmacocinetice care se manifest la administrarea simultan cu medicamente din clase terapeutice diferite. Capitolul V FURANOCUMARINELE - SUBSTANE BIOACTIVE DIN SUCUL DE GRAPEFRUIT V.3. DETERMINAREA BERGAMOTINEI DIN SUCURI DE FRUCTE Obiectivele cercetrii Dup ce au fost prezentate rezultatele cercetrilor proprii care au confirmat producerea interaciunii farmacocinetice dintre diclofenac i sucul de grapefruit a fost necesar iniierea cercetrilor privind evidenierea componentelor bioactive din suc, responsabile de producerea interaciunii - flavonoidele totale i naringina - reprezentantul major al acestei clase de compui. Datele din literatura de specialitate demonstreaz rolul predominant al furanocumarinelor n producerea interaciunii sucului de grapefruit cu diferite medicamente. Determinarea cantitativ a furanocumarinelor din probe de sucuri de diferite proveniene ar putea explica variaiile mari ale intensitii interaciunilor produse, in funcie de coninutul de furanocumarine al sucului administrat. n acest capitol prezentm rezultatele unui studiu prin care s-a
39
realizat separarea, identificarea i determinarea cantitativ a bergamotinei din sucuri de fructe (grapefruit, portocale, mandarine, mere, pere). V.3.1. Material i metode Probe de analizat Fructele din care s-au preparat sucurile (grapefruit, portocale, mandarine, pere, mere) au fost achizitionate din reteaua comerciala a orasului Iai. Sucurile au fost preparate n laborator din fructul integral, respectiv din pulpa fructului, cu ajutorul storcatorului de fructe. n timpul depozitrii sucurile de fructe separ dou frac iuni: un supernatant i precipitatul corespunztor. n literatura de specialitate este semnalat concentraia diferit a bergamotinei n cele dou fraciuni (Girennavar et al., 2006). Determinarea concentraiilor bergamotinei s-a realizat prin metoda HPLC dezvoltat de no pentru fiecare dintre cele dou fraciuni obinute din sucul integral de grapefruit rou, alb, respectiv roz. Separarea celor dou fraciuni s-a realizat prin centrifugarea sucului la 10.000 rpm, timp de 20 de minute. Pentru analiza HPLC a sucului integral, acesta a fost diluat (1:1) cu metanol, meninut 30 de minute la temperatura camerei i centrifugat la 3000 rpm timp de 15 minute. Lichidul supernatant se injecteaza n sistemul cromatografic. Reactivi Silicagel pentru cromatografia pe coloana, 230-400 mesh (Chemical Company Inc). Solveni de puritate analitic (Fluka) pentru extractia i eluarea bergamotinei. Solveni pentru analiza HPLC (Cromasolv Company). Standard bergamottin, Sigma Aldrich, lot BCBC-0571. V.3.1.1. Extracia bergamotinei 1200 mL suc de grapefruit rou diluat cu 1200 mL ap distilat se extrag de trei ori succesiv cu acetat de etil (1:1). Fazele organice reunite se evapora la sec (evaporator Buchi); se obine reziduul brut (1,3 g). V.3.1.2. Separarea bergamotinei prin cromatografie pe coloan (CC) Reziduul (1,3 g) s-a amestecat cu 1,3 silicagel i s-a adus ntr-o coloan cromatografic 250/3 cm coninnd silicagel pentru CC umectat cu hexan. Eluarea componentelor extractului brut s-a realizat succesiv cu fraciuni a 50 mL de: hexan; hexan-acetat de etil (90:10); (85:15); (80:20); (70:30); (60:40); (40:60); (20:80); (10:90) i (0:100). Cele 10 fraciuni colectate au fost evaporate la sec i supuse analizei TLC, respectiv HPLC.
40
V.3.1.3. Identificarea bergamotinei prin cromatografie pe strat subire (CSS) Pentru analiza TLC s-au utilizat placile Fertigplaten Kieselgel g Merck, 20/20cm. Reziduul fiecarei fractiuni, dizolvat in 0,5 mL metanol a fost spotat (0,5L) pe linia de start a placii cromatografice alaturi de bergamotina (standard extern); sistem de solventi hexan acetat de etil (4:1). Bergamotina a fost vizualizat sub forma unor spoturi albastru nchis, dup pulverizarea pe plac a soluiei de acid sulfuric 10% i meninerea la 110C timp de 10 minute. V.3.1.4. Analiza HPLC a bergamotinei Determinarea cantitativ a bergamotinei din sucurile de fructe ca atare, respectiv dup separarea prin cromatografie pe coloan (Tabel I) s-a realizat prin cromatografia de lichide de nalta performanta cuplat cu spectrometria de mas (LC/MS), adaptat dup metoda utilizat de Girennavar et al (2008). Aparatur Sistem HPLC Agilent Technologies 1100 series Module: - Spectrometru de masa Agilent Ion Trap 1100 SL; - Termostat G1316A; - Autosampler G1329A; - Pompa binara G1312A; - Degazor G1379A. Condiiile de lucru HPLC: - Coloana analitica: Zorbaz SB-C18 100 mm x 3.0 mm i.d., 3.5 m (Agilent, SUA); - Filtru on-line 0.2 microni (Agilent) ; - Faza mobila: amestec solutie acid acetic 0.1% (V/V) si metanol in raport 15/85 (v/v) ; - Debit: 1 ml/min, temperatura: 40 C; - Detecie: MS/MS fragmentare ion cu m/z 339, corespunztor moleculei bergamotinei protonate, apoi monitorizare ion cu m/z 203 din spectrul MS/MS al analitului; - Volum de injectare: 5 l; - Timp de retentie: 1.75 minute - Timp total de analiza: 2.2 minute; Conditiile de lucru MS: - Sursa de ioni: APCI (atmosferic pressure chemical ionisation); - Mod ionizare: pozitiv; - Nebulizator: azot, presiune 60 psi; - Gaz de uscare: azot, debit 7 L/min, temperatura 350 C; - Temperatur: 400C; heater
41
- Potential capilara: 3000 V; - Mod analiza: monitorizare tranzitie m/z 339 > 203. Cromatograma i spectrul MS al bergamotinei sunt prezentate n fig. V. 41 i V. 42
Fig. V. 41. Cromatograma MS a bergamotinei
Fig.V.42. Spectrul MS al bergamotinei

42
V.3.1.5.Curba de calibrare a bergamotinei Curba de calibrare a bergamotinei, detec ie MS/MS (Fig. V. 43 - V. 44, Tabelul V.2) s-a realizat in intervalul de concentratii 26.4-2641 ng/ml.
Fig.V.43. Curba de calibrare a bergamotinei (detectie MS/MS) Determinarea bergamotinei din probele de sucuri de fructe Determinarea cantitativ a bergamotinei din sucurile de fructe ca atare, respectiv dup separarea prin cromatografie pe coloan (TabelV. 1) s-a realizat prin cromatografia de lichide de nalta performanta cuplata cu spectrometria de masa (LC/MS). V.3.2. Rezultate i discuii Rezultatele obinute la determinarea cantitativ a a bergamotinei din sucurile de fructe ca atare, respectiv dup separarea prin cromatografie pe coloan sunt prezentate n figurile V.56 - V.61. Continutul n bergamotina, exprimat n mg/ 100 mL suc s-a calculat cu ajutorul curbei de calibrare (Fig. V.43) i este prezentat n figurile V. 62 V.65.
43
Fig. V.62. Coninutul n bergamotin pentru probele de suc de grapefruit.
Fig. V.63. Coninutul n bergamotin al sucurilor de grapefruit separate n fraciuni
44
Fig. V.64. Coninutul n bergamotin al sucurilor de citrice
Fig. V.65. Coninutul n bergamotin al sucurilor de grapefruit separate n fraciuni, comparativ cu sucul nefracionat
45
Fig.V. 66. Concentraiile bergamotinei n sucurile de citrice analizate Coninutul n bergamotin pentru sucurile obinute din fructul integral de grapefruit (probele 1,4,7) variaz ntre 2,49 mg/100 mL pentru proba 1 i 0,97 pentru proba 7 (fig. 4). Valorile obinute sunt mai mici pentru sucurile preparate din pulpa fructelor de grapefruit (probele 2, 5, 8, figura 5). Concentraiile bergamotinei din fraciunile separate prin cromatografia pe coloan sunt destul apropiate de cele obinute pentru sucul preparat din fructul integral corespunztor; aceasta sugereaz faptul c separarea componentelor sucului prin cromatografie pe coloan decurge cu randamente satisfctoare. Rezultatele sunt n concordan cu concentraiile determinate de ali autori; astfel, Uno et al. (2006) au raportat valori medii de 1,7 mg bergamotin/250 ml suc (0,68 mg/100 mL), Uno et al (2006) Paine et al. (2006) 0,33 12,37 mg/100 mL., de Castro (2006) concentraii de 0,67 9,53 mg /100ml, iar Girennavar et al. (2008) concentraii medii cuprinse ntre 0,038 i 0,128 mg/100ml. Rezultatele obinute la determinarea bergamotinei din cele dou fraciuni obinute prin centrifufarea sucului integral sunt consemnate n fig. V. 63. Aceste rezultate sunt n deplin concordan cu valorile obinute de Guo et al. (2006). Autorii respectivi au continuat cercetrile i au evaluat capacitea de inhibare a izoenzimei CYP3A4 de ctre fiecare dintre cele dou fraciuni separate prin centrifugare, activitate corelat cu coninutul n componente furanocumarinice.
46
De remarcat faptul c toi autorii au semnalat o mare variabilitate a coninutului sucurilor de grapefruit n bergamotin, explicat prin existena a numeroase varieti de fruct i metodele diferite de preparare a sucului (De Castro et al., 2006). n sucurile de mere, pere, afine i portocale sweet n-a fost identificat prezena bergamotinei. V.4. CONCLUZII Datele publicate n literatura de specialitate n urma realizrii a numeroase studii clinice n care diferite medicamente au fost asociate cu sucul de grapefruit au scos n eviden o mare variabilitate n intensitatea interaciunilor provocate. Aceast variabilitate poate fi pus pe seama compoziiei chimice a sucurilor, izomorfismului enzimelor implicate n metabolizarea medicamentelor, particularitilor genomului uman etc. Coninutul n furanocumarine al sucurilor de citrice este foarte diferit n funcie de specie, varietate, condiiile specifice de cultur, dar mai ales modalitilor foarte diverse de preparare a sucului. n paralel cu studiile privind inhibarea CYP3A4 de ctre sucurile de grapefruit au fost realizate teste similare pentru sucuri preparate din alte fructe n a cror compoziie sunt prezente furanocumarinele. Aceste studii simultane au confirmat rolul componentelor furanocumarinice n producerea interaciunilor aliment-medicament. Sucul de sweetie, spre exemplu, a manifestat aciune inhibant asupra CYP3A4 chiar mai intens dect grapefruitul. Aceast aciune este concordant cu coninutul n furanocumarine, care pentru unele sortimente de suc de sweetie este de 2-3 ori mai crescut dect cel din grapefruit. n alte situaii, furanocumarinele n-au putut fi evideniate n sucul de sweetie. Taxonomic, varietile de citrice obinute prin incruciri ntre grapefruit, pomelo sau portocale au condus la obinerea unor fructe cu coninut variabil, i nu ntotdeauna cunoscut de furanocumarine. De altfel, i pentru alte produse vegetale coninnd ca i componente bioactive furanocumarinele este cunoscut i recunoscut capacitatea de a produce interaciuni de tipul celor aprute la consumul sucului de grapefruit simultan cu administrarea unor medicamente. Aceste date sunt n concordan cu rezultatele cercetrilor noastre care au pus n eviden valori foarte difetite ale coninutului n bergamotin al sucului, pentru acelai fruct n funcie de modul de preparare, dar i pentru fructe diferite sweetie, portocale, mandarine, pomelo). Pentru nceput s-au standardizat metodele HPLC/MS de determinare a bergamotinei; performana metodei a permis aplicarea acesteia i la probele cu un coninut sczut de bergamotin.
47
Determinarea HPLC a bergamotinei din probe de sucuri de fructe (citrice, mere, pere, afine) a condus la rezultate concordante cu cele publicate n literatura de specialitate. Coninutul n bergamotin pentru sucurile preparate din pulpa fructelor de grapefruit este mai sczut dect pentru cele obinute din fructul integral de grapefruit. Concentraiile bergamotinei din fraciunile separate prin cromatografia pe coloan sunt destul apropiate de cele obinute pentru sucul preparat din fructul integral corespunztor; aceasta sugereaz faptul c separarea componentelor sucului prin cromatografie pe coloan decurge cu randamente satisfctoare. Remarcm o mare variabilitate a coninutului sucurilor de grapefruit n bergamotin, explicat prin existena a numeroase varieti de fruct i metodele diferite de preparare a sucului; aceas variabilitate a coninutului n componente bioactive este corelat cu rezultatele obinute la studiul interaciunii farmacocinetice a diclofenacului cu diferite sucuri de fructe. Capitolul VI STUDIUL COMPARATIV AL INFLUENEI UNOR SUCURI DE FRUCTE ASUPRA FARMACOCINETICII DICLOFENACULUI, LA OBOLAN Protocol experimental Pentru fiecare suc de fructe s-a aplicat modelul experimental stabilit anterior. S-a lucrat cu cte dou loturi de obolani Wistar, care au primit: Lotul I- cte 2 ml ap i, dup 30 de minute 10 mg diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltarea sngelui (din plexul orbital) s-a realizat la intervale de 30, 60, 90, 120 minute, 3h, 4h, 6h, 8h, 10 h i 12 ore de la administrarea medicamentului. Pentru fiecare interval de timp sau recoltat probe de snge de la 5 animale. Sngele a fost centrifugat imediat dup recoltare, iar plasma a fost pstrat la congelator (-36C) pna la analiza HPLC/MS, prin metoda de dozare validat anterior. Lotul II (grepfrut rou) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de grapefruit rou, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit rou), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul III (grepfrut alb) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de grapefruit alb, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (grapefruit alb), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp.
48
Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul IV (pomelo) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de pomelo, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (pomelo), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul V (portocale) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de portocale, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (portocale Grecia), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul VI (mandarine) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de mandarine, proaspt preparat prin presarea manual a fructelor (mandarine Grecia), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul VII (afine) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de afine, proaspt preparat n storctorul electric a fructelor (afine proaspete), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Lotul VIII (mere) - a primit (gavaj gastric) cte 2 ml suc de mere, proaspt preparat n storctorul electric a fructelor (mere Golden auriu), i dup 30 de minute, diclofenac (soluie apoas) n concentraie de 10 mg /kg corp. Recoltrile au fost realizate la aceleai intervale i prelucrate n aceleai condiii cu cele de la lotul I. Etapa analitica. Rezultate Pentru dozarea diclofenacului din plasma de sobolan s-a folosit cromatografia de lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de masa (HPLC/MS), metoda standardului extern. Metoda a fost validat conform protocoalelor n vigoare pentru stabilirea condiiilor de aplicare a metodelor HPLC. Rezultatele studiului analitic. Utiliznd metoda HPLC-MS dezvoltat i validat, au fost determinate concentraiile plasmatice ale diclofenacului din probele clinice. Acestea sunt redate n Tabelul VI.1
49
Tabel IV.1 Concentraiile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu suc de fructe
Interval de recoltare (ore)/Tratament Diclofenac singur Diclofenac + suc de grapefruit rosu Diclofenac + suc de grapefruit alb Diclofenac + suc de pomelo Diclofenac + suc de portocale Diclofenac + suc de mandarine Diclofenac + suc de afine Diclofenac + suc de mere Concentraia diclofenacului (ng/mL) 0,5 1 1,5 2 3 4 6 484 8 10 12
662,6 1018,4 1154,3 1336,9 1384,6 1020,3 797 1393
277,3 179,7 137,7 259 133,4 99,5
1728,5 2262,6 1776,5 1153,7 571,5
612,4 1002,5 1685,3 2213,5 1812,4 1020,4 518,6 268,3 182,5 114,5 338,4 1412,3 1995,3 2245,4 1818,2 1153,4 800,2 574,5 212,4 202,5 583,4 1213,5 1218,4 1525,3 1498,2 1095,4 373,2 214,8 105,2 0,0
608,2 1218,4 1305,5 1812,2 1602,8 1105,3 395,2 312,4 205,8 162,3 525,3 989,4 1814,2 2490,5 2204,3 1412,7 437,9 373,8 218,6 182,5 582 292,5 137,4 63,2
814,3 1340,1 1802,5 2080,4 1892,1 1157,4
Etapa farmacocinetic Profilurile plasmatice suprapuse ale diclofenacului, n funcie de perioada de recoltaree (cu sau fr sucul de fructe), sunt prezentate n Fig. VI.1 VI. 7 (grafice carteziene), n=5.
Fig. VI.1. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de grapefruit rou
50
Fig. VI. 2. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de grapefruit alb
Fig. VI.3.Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de pomelo
51
Fig. VI.4. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de portocale
Fig. VI. 5. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de mandarine
52
Fig. VI. 6. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de afine
Fig. VI.7. Profilurile plasmatice ale diclofenacului administrat singur sau asociat cu sucul de mere Pe baza concentraiilor plasmatice al diclofenacului administrat singur sau n asociere cu sucurile de fructe s-au calculat parametrii farmacocinetici (C max, Tmax, aria de sub curb), Tabel VI. 2.
53
Tabel VI. 2 Parametrii farmacocinetici ai diclofenacului

Diclofenac/diclofenac i suc de fructe Diclofenac singur Diclofenac + suc de grapefruit rosu Diclofenac + suc de grapefruit alb Diclofenac + suc de pomelo Diclofenac + suc de portocale Diclofenac + suc de mandarine Diclofenac + suc de afine Diclofenac + suc de mere Cmax (ng/ml) 1384.56 2262.59 2213,51 2245,43 1525,37 1812,29 2490,53 2080,41 Parametrul Tmax ASC last ASC tot (ore) (ng/ml*ora) (ng/ml*ora) 3 2 2 2 2 2 2 2 7101.78 9233.88 9033,58 9163,85 6225,21 7396,16 10164,13 8490,39 7652.13 9527.67 9320,50 9455,41 6423,27 7631,48 10487,52 8760,52
Discuii Din analiza datelor farmacocinetice pentru diclofenac, obinute pe baza acestui studiu experimental s-a constatat: Cmax creste de la 1384.5 ng/ml (diclofenac administrat singur) la valori cuprinse ntre 1525,37 ng/mL pentru diclofenacul asociat cu sucul de portocale i 2490,53 ng/mL pentru sucul de afine. Valoarea concentraiei plasmatice maxime pentru sucul de grapefruit alb (2213,51) este destul de apropiat de cea obinut pentru asocierea diclofenacului cu sucul de grape fruit rou (2262.6 ng/ml). Cele mai mici valori ale C max s-au obinut pentru sucul de portocale. Aceste valori corespund la o biodisponibilitate relativ de 163.4% pentru sucul de grapefruit rou, de 159,86 % pentru grapefruitul alb, de 110,16% pentru sucul de portocale; cea mai mare valoare pentru biodisponibilitatea relativ s-a obinut pentru sucul de afine, de 179,86. Aceasta nseamn o cretere a concentraiilor diclofenacului coadministrat cu sucurile de fructe cu 63.4%, 59,86%, 10,16% i respectiv 79,86% fa de aceleai concentraii de diclofenac administrat singur. Aria de sub curb, parametru ce se coreleaz cu cantitatea de substan ce ajunge n circulaia sistemic crete de la 7652,1 ng/ml*or la 9527,7 ng/ml*or pentru sucul de grapefruit rou, la 9320,50 ng/ml*or pentru sucul de grapefruit alb, la 6423,27 ng/ml*or pentru sucul de portocale i la 10487,52 ng/ml*or pentru sucul de afine. Cresterea ariei de sub curb n cazul coadministrrii diclofenacului cu sucrile de fructe constituie o dovad a producerii interaciunii farmacocinetice.
54
Tmax pentru diclofenacul administrat singur este de 3 ore i a sczut la 2 ore pentru toate loturile la care diclofenacul a fost asociat cu sucurile de fructe; aceast diferena nu este relevant datorit valorilor discrete ale parametrului Tmax (ntre 2 si 3 ore nu poate lua alt valoare deoarece nu au existat prelavari). In astfel de situaii, diferenele observate nu se considera semnificative. Rezultatele obinute de noi, n concordan cu cele publicate de Ushijima et al. (2009 care a studiat efectul ingestiei sucului de afine asupra farmacocineticii diclofenacului la subieci umani. Deoarece informaiile cu privire la influena sucului de afine asupra farmacocineticii substraturile CYP2C9 este limitat, este prematur a ajunge la o concluzie definitiv cu privire la efectul sucului de afine asupra farmacocineticii medicamentelor care sunt metabolizate extensiv de CYP2C9. Pentru a clarifica influena ingestiei repetate a sucului de afine asupra farmacocineticii diclofenacului, s-a realizat studiul clinic la subieci sntoi umani. Ingestia timp de cinci zile a sucului de afine nu a influenat semnificativ concentraia plasmatic a diclofenacului (Fig. VI. 8) Capitolul VII CONCLUZII GENERALE Interaciunile medicamentoase reprezint o surs major de accidente sau de eecuri terapeutice, mai ales n situaii de polimedicaie. Mecanismele farmacocinetice care pot induce interaciuni medicamentoase sunt mai dificil de prevzut de ctre clinicieni dect interaciunile farmacodinamice care pot fi anticipate pe baza aciunii farmacologice a medicamentelor administrate. Pe parcursul diferitelor faze ale cineticii medicamentelor, metabolismul i, n particular, biotransformarile catalizate de citocromii P450 pot conduce la interaciuni semnificative care se manifest la nivelul absorbiei intestinale sau al excreiei renale. Majoritatea medicamentelor administrate pe ale oral se absorb, n principal, n intestinul subire. Alimentele, prezente simultan n tubul digestiv, pot influena eficacitatea principiilor active medicamentoase prin diminuarea sau, din contr, intensificarea efectelor terapeutice. Interaciunile privesc, adesea, absorbia medicamentelor de-a lungul tubului digestiv, dar anumii nutrieni modific metabolismul i eliminarea medicamentelor. Alimentele pot influena att viteza de absorbie ct i biodisponibilitatea unui medicament. Cercetrile experimentale prezentate n partea personal a lucrrii de doctorat au urmrit aprofundarea cunotinelor privind producerea unei interaciuni farmacocinetice ntre diclofenac i sucul de grapefruit. Finalizarea cercetrilor proprii privind producerea interaciunii farmacocinetice la
55
administrarea diclofenacului simultan cu sucul de grapefruit a condus la concluzii care confirm aceast ipotez. Rezultatele obinute, n concordan cu datele existente n literatura de specialitate, sugereaz inhibiia tip sinucidere ca mecanism probabil i posibil al producerii interaciunii. Aceste concluzii sunt susinute de parametrii farmacocinetici ai diclofenacul administrat concomitent cu sucul de grapefruit, comparativ cu ai medicamentului administrat ca atare. Calcularea parametrilor farmacocinetici s-a realizat pe baza determinrii HPLC a concentraiilor plasmatice ale diclofenacului. Pentru aceasta: - am validat metoda HPLC /MS de determinare a diclofenacului; - am standardizat i am aplicat modelul experimental de studiu al interaciunii farmacocinetice diclofenac suc de grapefruit; - am trasat profilurile plasmatice ale diclofenacului n vederea calculrii parametrilor farmacocinetici; - am confirmat producerea interaciunii farmacocinetice pe baza creterii semnificative a biodisponibilitii relative a diclofenacului asociat cu sucul de grapefruit rou. Compararea rezultatelor proprii cu cele ale altor autori permite adugarea unui nou argument care pledeaz pentru concluzia final: diclofenacul este recunoscut ca un inhibitor al CYP3A4 prin mecanism inhibiie sinucidere; 5-hidroxi-diclofenacul nu reprezint molecula responsabil de inactivarea enzimei, dar formarea acestui prim metabolit este esenial pentru inhibarea enzimei metabolizante. Aceast concluzie deschide o nou perspectiv asupra consecinelor clinice ale asocierii diclofenacului cu consumul de suc de grapefruit, care prin unele dintre componentele sale inhib izoenzima CYP3A4, probabil prin mecanism inhibiie-sinucidere. Componentele bioactive din sucul de grepfrut, considerate responsabile de producerea interaciunii sunt flavonoidele i furanocumarinele. tiut fiind faptul c aciunea benefic asupra organismului este datorat, n general fitocomplexului i nu unui anumit component izolat n stare pur din acesta. Am determinat coninutul n flavonoide totale. Valorile obinute la determinarea flavonoidelor totale din cele 25 de probe de sucuri (preparate n laborator sau achiziionate din reeaua comercial), cuprinse ntre 18,32 i 102,54 mg/100mL, evideniaz o mare variabilitate n funcie de natura produsului i de metoda de preparare a sucului. n paralel am determinat coninutul n naringin, flavonoidul majoritar al sucurilor din care am determinat coninutul total n flavonoide. Pentru aceasta am stabilit condiiile HPLC/MS de determinare a naringinei i am aplicat metoda la analiza probelor de sucuri. Rezultatele obinute sunt 56
concordante cu cele publicate n literatura de specialitate; am confirmat, i de aceast dat variaii mari ale valorilor naringinei, n funcie de sursa probei de analizat. Coninutul n naringin nu se coreleaz cu intensitatea interaciunii farmacocinetice; de fapt naringina este considerat prea puin responsabil de proodu cerea interaciunii. Capacitatea bergamotinei de a inactiva izoforme ale complexului enzimatic CYP450 i implicit rolul acestei furanocumarine n producerea interaciunii sucului de grapefruit cu medicamentele metabolizate de cele dou izoenzime este firul rou al carcetrilor actuale prvint frecvena i relevana clinic a interaciunilor dintre medicamente i sucuri de fructe. n plus, unii autori au studiat posibilitatea mbogirii unor sucuri de fructe n bergamotin pentru a confirma rolul bergamotinei n mecanismul de producerii interaciunii. Cercetrile proprii n domeniul furanocumarinelor au urmrit determinarea, printr-o metod performant a bergamotinei, furanocumarina majoritar din sucul de grapefrut. Pentru aceasta: - am standardizat metoda HPLC /MS de determinare a bergamotinei; - am aplicat metoda la determinarea bergamotinei din 25 de probe de sucuri de fructe; - ca i n cazul naringinei, rezultatele, concordante cu cele din literatura de specialitate, relev o mare variabilitate a coninutului n bergamotin. Concluziile mai multor autori care studiaz rolul sucurilor vegetale n modularea farmacocineticii medicamentelor par a confirma evidenierea unor aspecte mai puin elucidate i care ar necesita regndirea importanei acestor interaciuni. De aceea, am iniiat un studiu experimental n care am urmrit influena unor sucuri de fructe (grepfrut rou, grepfrut alb, pomelo, portocale, mandarine, afine, mere) asupra concentraiior plasmatice ale diclofenacului; acelai model experimental, stabilit n prima parte a cercetrilor a fost aplicat i n acest studiu. Ariile de sub curb, calculate pe baza concentraiilor plasmatice ale diclofenacului au evideniat variaii semnificative ale valorilor biodisponibilitii relative a diclofenacului. Ca o concluzie final sucurile de citrice n general i sucul de grepfrut n special, prin componente bioactive specifice intervin n biotransformarea medicamentelor la nivelul organismului uman i pot modula biodisponibilitatea, implicit eficacitatea terapeutic a acestora. Medicul i farmacistul au datoria de a cunoate aceste interaciuni i de a informa corect pacientul n privina riscurilor consecutive consumului de suc de citrice simultan cu aministrarea de medicamente.
57
BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Ameer B, Weintraub RA, Johnson JV, Yost RA, Rouseff RL. Flavanone absorption after naringin, hesperidin, and citrus administration. Clin Pharmacol Ther 1996; 60:34-40; Back DJ, Tjia JF. Comparative effects of the antimycotic drugs ketoconazole, fluconazole, itraconazole and terbinafine on the metabolism of cyclosporin by human liver microsomes. Br J Clin Pharmacol 1991; 32:624-634; Bailey DG, Arnold JM, Munoz C, Spence JD: Grapefruit juice-felodipine interaction: mechanism, predictability and effect of naringin. Clin Pharmacol Ther 1993; 53:637-642; Bailey DG, Arnold JM, Strong HA, Munoz C, Spence JD: Effect of grapefruit juice and naringin on nisoldipine pharmacokinetics. Clin Pharmacol ther 1993; 54:589-559; Bailey DG, Arnold JMO, Munoz C, Spence JD. Grapefruit juice-felodipine interaction: mechanism, predictability, and effect of naringin. Clin Pharmacol Ther 1993; 53:637-642; Bailey DG, Spence JD, Edgar B, Bayliff CD, Arnold JMO. Ethanol enhances the hemodynamic effects of felodipine. Clin Investig Med 1989; 12:357362; Bailey DG, Spence JD, Munoz C, Arnold JMO. Interaction of citrus juices with felodipine and nifedipine. Lancet 1991; 337:268269; Boullata JI. Influence of medication on nutritional status. In: Bendich A, Deckelbaum RJ, eds. Preventive nutrition, 3rd edition. Totowa, NJ: Humana Press, Inc., 2005: 833868; Brueggemeier RW Aromatase, aromatase inhibitors, and breast cancer. American Journal of Therapeutics 2001; 8:333-344; Brueggemeier RW, Hackett JC and Diaz-Cruz ES: Aromatase Inhibitors in the Treatment of Breast Cancer. Endocrine Reviews 2005; 26:331-345; Carlini P, Bria E, Giannarelli D, Ferretti G, Felici A, Papaldo Pet al., New aromatase inhibitors as second-line endocrine therapy in postmenopausal patients with metastatic breast carcinoma. Cancer 2005; 104:1335-1342; Carrington S, Frazer HC, Grapefruit. A~Z of Barbados Heritage. Macmillan Caribbean. 2003; 9091; Cerda JJ, Normann SJ, Sullivan MP: Inhibition of atherosclerosis by dietary pectin in microswine with sustained hypercholesterolemia. Circulation 1994, 89:1247-1253; Dahan A, Altman H: Food-drug interaction: grapefruit juice augments drug bioavailability mechanism, extent and relevance. Eur J Clin Nutr 2004; 58:19; Eagling VA, Back DJ, Barry MG. Differential inhibition of cytochrome P450 isoforms by the protease inhibitors, ritonavir, saquinavir and indinavir. Br J Clin Pharmacol 1997; 44:190-194; 58
Studiul unor interaciuni aliment - medicament 16. Edgar B, Regardh CG, Johnsson G, Johansson L, Lundborg P, Lfberg I et al., Felodipine kinetics in healthy man. Clin Pharmacol Ther 1985; 38:205-211; 17. Edwards DJ, Bellevue FH, Woster PM. Identification of 6,7dihydroxybergamottin, a cytochrome P450 inhibitor, in grapefruit juice. Drug Metab Dispos 1996; 24:1287-1290; 18. Edwards DJ, Bernier SM: Naringin and naringenin are not primary CYP 3A inhibitors in grapefruit juice. Life Sci 1996; 59:1025-1030; 19. Edwards DJ, Fitzsimmons ME, Schuetz EG: 6'7' dihydroxybergamottin in grapefruit juice and sivelle orange juice: effects on cyclsporin disposition, enetrocyte CYP3A4 and P-glycoprotein. Clin Pharmacol Ther 1999; 65:237244; 20. Fuhr U, Kummert AL. The fate of naringin in humans: a key to grapefruit juice-drug interactions? Clin Pharmacol Ther 1995; 58:365-373; 21. Fuhr U, Maier A, Keller A, Steinijans VW, Sauter R, Staib AH. Lacking effect of grapefruit juice on theophylline pharmacokinetics. Inter J Clin Pharmacol Ther 1995; 33:311314; 22. Gillies PJ, Krul ES. Using genetic variation to optimize nutritional preemption. J Nutr 2007; 137:270S274S; 23. Girennavar B, Jayaprakasha GK, Jifon JL, Patil S, Variation of bioactive furocoumarins and flavonoids in different varieties of grapefruits and pummelo, Eur Food Res Technol 2008; 226: 1269 1275; 24. Guthrie N, Carroll KK. Inhibition of mammary cancer by citrus flavonoids. Adv Exp Med Biol 1998; 439:227-236; 25. Hagen RE, Dunlap WJ, Mizelle JW, Wender SH, Lime BJ, Albach RF, Griffiths FP. A chromatographicfluorometric method for determination of naringenin rutinoside, and related flavanone blycosides in grapefruit juice and in juice sacs. Anal Biochem 1965; 12:472-482; 26. Halpert JR, Structural basis of selective cytochrome P450 inhibition. Annu Rev Pharmacol Toxicol 1995; 35:2953; 27. Hukkinen SK, Varhe A, Olkkola KT, Neuvonen PJ. Plasma concentrations of triazolam are increased by concomitant ingestion of grapefruit juice. Clin Pharmacol Ther 1995; 58:127-131; 28. Kent UM, Juschyshyn MI, and Hollenberg PF, Mechanism-based inactivators as probes of cytochrome P450 structure and function. Curr Drug Metab 2001; 2:215243; 29. Kordas K, Lonnerdal B, Stoltzfus RJ. Interactions between nutrition and environmental exposures: effects on health outcomes in women and children. J Nutr 2007; 137:27942797; 30. Koymans L, Moereels H and Vanden Bossche H A molecular model for the interaction between vorozole and other non-steroidal inhibitors and human cytochrome P450 19 (P450 aromatase), Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 1995; 53:191-197; 59
Studiul unor interaciuni aliment - medicament 31. Kupferschmidt HH, Ha HR, Ziegler WH, Meier PJ, Krahenbuhl S: Interaction between grapefruit juice and midazolam in humans. Clin Pharmacol Ther 1995; 58:20-28; 32. Leemann T, Transon C, and Dayer P, Cytochrome P450TB (CYP2C): a major monooxygenase catalyzing diclofenac 4_-hydroxylation in human liver. Life Sci 1993; 52:2934; 33. Lown K, Bailey DG, Fontana RJ. Grapefruit juice increases felodipine oral availability in humans by decreasing intestinal CYP3A protein expression. J Clin Invest 1997; 99: 2545-2553; 34. Lundahl J, Regardh CG, Edgar B, Johnsson G. Effects of grapefruit juice ingestion pharmaco-kinetics and haemodynamics of intravenously and orally administered felodipine in healthy men. Eur J Clin Pharmacol 1997; 52:139 145; 35. Lundahl J, Regardh CG, Edgar B, Johnsson G. Relationship between time of intake of grapefruit juice and its effect on pharmacokinetics and pharmacodynamics of felodipine in healthy subjects. Eur J Clin Pharmacol 1995; 49:6167; 36. Masubuchi Y, Ose A, and Horie T, Mechanism-based inactivation of CYP2C11 by diclofenac. Drug Metab Dispos 2001; 29:11901195; 37. Miniscalco A, Lundahl J, Regrdh CG, Edgar B, Eriksson UG. Inhibition of dihydropyridine metabolism in rat and human liver microsomes by flavonoids found in grapefruit juice. J Pharmacol Exp Ther 1992; 261:1195-1199; 38. Murray M. Mechanisms and significance of inhibitory drug interactions involving cytochrome P450 enzymes (Review). Int J Mol Med 1999; 3:227238; 39. Paine MF, Shen DD, Kunze KL, Perkins JD, Marsh CL, McVicar JP et al., Firstpass metabolism of midazolam by the human intestine. Clin Pharmacol Ther 1996; 60:14-24; 40. Paine MF, Widmer WW, Hart HL. A furanocoumarin-free grapefruit juice establishes furanocoumarins as the mediators of the grapefruit juicefelodipine interaction. Am J Clin Nutr 2006; 83:10971105; 41. Rashid J, McKinstry C, Renwick AG, Dirnhuber M, Waller DG, George CF et al., Quercetin, an in vitro inhibitor of CYP3A, does not contribute to the interaction between nifedipine and grapefruit juice. Br J Clin Pharmacol 1993; 36:460-463; 42. Ren S, Yang JS, Kalhorn TF, Slattery JT. Oxidation of cyclophosphamide to 4-hydroxy-cyclophosphamide and deschoroethylcyclophosphamide in human liver microsomes. Cancer Res 1997; 57:429435; 43. Ribeiro AI, Ribeiro MHL, Naringin and naringenin determination and control in grapefruit juice by a validated HPLC method, Food Control 2008; 19 (4), 432-438; 44. Roe AD, Liss AR Drug-Nutrient Interactions. Inc., New York, 1981 60
Studiul unor interaciuni aliment - medicament 45. Ross SA, Ziska DS, Zhao K, ElSohly MA: Variance of common flavonoids by brand of grapefruit juice. Fitoterapia 2000; 71:154-161; 46. Rushmore TH, Kong A-NT. Pharmacogenomics, regulation and signaling pathways of phase I and II drug metabolizing enzymes. Curr Drug Metab 2002; 3:481490; 47. Salazar JA, Poon I, Nair M. Clinical consequences of polypharmacy in elderly: expect the unexpected, think the unthinkable. Expert Opin Drug Saf 2007; 6:695704; 48. Schmiedlin-Ren P, Edwards DJ, Fitzsimmons ME, He K, Lown KS, Woster PM et al. Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit juice constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins. Drug Metab Dispos 1997; 25:1228-1233; 49. Shen S, Marchick MR, Davis MR, Doss GA, and Pohl LR, Metabolic activation of diclofenac by human cytochrome P450 3A4: role of 5hydroxydiclofenac. Chem Res Toxicol 1999; 12:214222; 50. So FV, Guthrie N, Chambers AF, Moussa M, Carroll KK. Inhibition of human breast cancer cell proliferation and delay of mammary tumorigenesis by flavonoids and citrus juices. Nutr Cancer 1996; 26(2):167-181; 51. Tang W, Stearns RA, Kwei GY, Iliff SA, Miller RR, Egan MA, et al., Interaction of diclofenac and quinidine in monkeys: stimulation of diclofenac metabolism. J Pharmacol Exp Ther 1999a; 291:10681074; 52. Tang W, Stearns RA, Wang RW, Chiu SH, and Baillie TA Roles of human hepatic cytochrome P450s 2C9 and 3A4 in the metabolic activation of diclofenac. Chem Res Toxicol 1999b; 12:192199; 53. Uno T, Ohkubo T, Sugawara, Effects of grapefruit juice on the stereoselective disposition of nicardipine in humans: evidence for dominant presystemic elimination at the gut site. Eur J Clin Pharmacol. 2000; 56(9-10): 643-649; 54. Ushijima K, Koshimizu T, Fujimura A. The inhibitory effect of cranberry juice on phenytoin metabolism by human liver microsomes. Jpn J Clin Pharmacol Ther. 2009; 40:59-64; 55. Yan Z, Li J, Huebert N, Caldwell GW, Du Y, Zhong H, et al., Detection of a novel reactive metabolite of diclofenac: evidence for cyp2c9-mediated bioactivation via arene oxides, Drug Metabolism & Disposition 2005; 33(6): 706-713; 56. Yee GC, Stanley DL, Pessa LJ, Dalla Costa T, Beltz SE, Ruiz J et al. Effect of grapefruit juice on blood cyclosporin concentration. Lancet 1995; 345:955956;
61
LISTA ARTICOLE PUBLICATE

1. Camelia Harapu Diaconu, Magdalena Cuciureanu, L. Vlase, Rodica Cuciureanu, Food- Drug Interactions: Grapefruit Juice, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat, Iai, 2011; 115(1): 245-249. 2. Camelia Diaconu Harapu, Anca Miron, Magdalena Cuciureanu, Rodica Cuciureanu, Flavonoidele - Componente Bioactive din sucuri de fructe, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, 2010,114(4): 1209-1214. 3. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Cuciureanu Magdalena, Cuciureanu Rodica, Interaciuni farmacocinetice suc de grapefruit - medicamente antiinflamatoare nesteroidiene (diclofenac si celecoxib), Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, 2009; 113(2), supl.(4); CDrom. 4. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Muntean Dana, Cuciureanu Magdalena, Nechifor Mihai, Cuciureanu Rodica, Determination of diclofenac in rat plasma by HPLC/MS and its application to pharmacokinetic studies, European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics; 2009; 34; indexare Medline; CDrom. 5. Harapu Camelia, Vartolomei Anca, Cuciureanu Rodica, Sucul de grapefruit - Studiu comparativ al coninutului in compui bioactivi, Reuniunea Naionala de Istoria Farmaciei, Volumul de rezumate, 2009 (ISBN 978973-8932-44-9), Editura Tehnoplast Company SRL, (acreditare CNCSIS 1152/23.06.2004). 6. Harapu Camelia, Vlase Laurian, Cuciureanu Magdalena, Muntean Dana, Cuciureanu Rodica, Interaction between grapefruit juice and diclofenac; a pharmacokinetic study, AL IX-lea Simpozion de biofarmacie si farmacorinetica, 2010, Acta Medica Marisiensis, 56, supl. (2);(ISSN 20683324).
62

Studiul Unor Interactiuni Aliment-Medicament

Încărcat de

Informații document

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Studiul Unor Interactiuni Aliment-Medicament

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

UNIVERSITATEA DE MEDICIN I FARMACIE GR. T. POPA IAI FACULTATEA DE FARMACIE

STUDIUL UNOR INTERACIUNI ALIMENT - MEDICAMENT

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

163 163 164 165 165 165 166

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig.III.7. Blank de plasma pentru testarea specificitatii

Fig.III.9. Curba de calibrare a diclofenacului

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

0 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 T i me [mi n]

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig. IV. 43. Curba de calibrare pentru naringin

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Time [min]

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

MS2(579 7) 1 3 i 100% 515695

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig. V. 41. Cromatograma MS a bergamotinei

Fig.V.42. Spectrul MS al bergamotinei

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig. V.62. Coninutul n bergamotin pentru probele de suc de grapefruit.

Fig. V.63. Coninutul n bergamotin al sucurilor de grapefruit separate n fraciuni

Studiul unor interaciuni aliment - medicament

Fig. V.64. Coninutul n bergamotin al sucurilor de citrice