 PRINCIPALELE APLICAŢII ALE BIOTEHNOLOGIEI MODERNE

BIOTEHNOLOGIILE VEGETALE

 CERINŢE ASUPRA TEMEI:

1. să definiţi termenii de micropropagare “in vitro”, aclimatizare, dediferenţiei, regenerare,
diferenţiere, organogenză;
2. să cunoaşteţi condiţiile de vitrocultură, implicit a modificărilor morfofiziologice şi biochimice
suferite de vitrocuplantule;
3. să descrieţi metode de realizare a procesului de micropropagare.

 Definiţii

 SCHAEFFER (1990) definea micropropagarea ca fiind o înmulţire clonală „in vitro” a plantelor,
pornind de la diferite explante, în general, cu o proliferare accelerată de lăstari.

 După ZAID şi colaboratorii (1999), micropropagarea reprezintă multiplicarea miniaturizată „in

vitro” a plantelor şi regenerarea materialului vegetal într-un mediu aseptic, controlat, pe medii de
cultură care conţin substanţe de creştere specifice.

 În domeniul vitroculturilor vegetale, termenul de aclimatizare are o semnificaţie aparte, şi anume:

adaptarea plantulelor generate „in vitro” (vitroplantulelor) la condiţiile mediului septic de
viaţă (CONOVER şi POOLE, 1984; CACHIŢĂ, 1987) sau „procesul de creştere a plantelor
cultivate „in vitro”, în condiţiile mediului extern de viaţă” (ZAID, 1999).

Evoluţia culturilor de celule şi ţesuturi

 Ideea de clonare a plantelor a luat naştere încă începând cu anul 1838, când SCHLEIDEN şi, în
anul următor, SCHWANN (1839) au formulat ipoteza totipotenţialităţii celulare, potrivit căreia la
baza structurii organismelor fiecare celulă posedă toate informaţiile genetice de care aceasta are
nevoie pentru formarea unui nou organism

 -1902 - HABERLANDT - celulele plantelor cultivate „in vitro”, pe medii artificiale adecvate
asigurării vieţii acestora, pot regenera o plantă normală.

 - după descoperirea citochininelor de către SKOOG şi colab., SKOOG şi MILLER, în anul 1957,
au observat că formarea de lăstari sau de rădăciniţe este controlată de balanţa hormonală
auxină/citochinină;

 - embriogeneza somatică “in vitro” a fost descrisă, pentru prima dată, de către STEWARD şi
colab., în anul 1958 şi de către REINERT, în acelaşi an;

 - un prim pas în micropropagarea industrială a plantelor superioare l-a constituit elaborarea

tehnicilor de micropropagare “in vitro” la Cymbidium (MOREL, 1960).

 - cultura de protoplaşti, fuziunea şi dezvoltarea hibrizilor somatici au fost descrise între anii
1960-1970, de către COCKING (1960),
  - 1962, MURASHIGE şi SKOOG au descoperit un mediu de cultură, cu o mare concentraţie de
săruri minerale, care s-a dovedit a fi optim pentru creşterea “in vitro” a multor tipuri de
cormofitoinoculi.

 - cultura de antere (androgeneza) şi producerea de plante haploide a fost realizată de către GUHA
şi MAHESHWARI, între anii 1964-1966 şi de către BOURGIN şi NITSCH, în anul 1967;

 - din anul 1966 şi până în prezent se delimitează perioada modernă a culturilor de ţesuturi şi
celule vegetale, perioadă caracterizată prin larga extindere a utilizării acestor explante ca modele
experimentale în cercetările fundamentale întreprinse în diferite domenii ale biologiei vegetale;
pe de altă parte, au luat fiinţă o multitudine de subramuri de biotehnologie vegetală, şi anume:
citofitotehnologiile, ce au ca obiect creşterea şi valorificarea culturilor celulare, libere sau
imobilizate; în anii 1980, tehnologia AND-ului recombinat şi producerea de plante transgenice au
fost realizate de către SCHELL (1987) şi de către SCHELL şi VASIL (1989);

 Procesele morfofiziologice la nivelul explantelor sau a inoculilor cultivaţi “in vitro”

1. Regenerarea – capacitatea unor celule vii sau a oricărei părţi din acestea de a-şi reface oricare
parte distrusă, fiind o formă de autoconservare

În general, la angiosperme, regenerarea la nivelul inoculilor cultivaţi “in vitro”are loc pe trei căi
principale:

 depresarea meristemelor caulinare existente în explante;

 organizarea “de novo” de meristeme;

 formarea de embrioni somatici.

Regenerarea se finalizează prin:

 formarea de calus, iniţial neorganizat, acesta - la rândul lui - poate genera - în manieră
independentă - rădăcini, muguraşi sau embrioni somatici;

 formarea de muguraşi, fapt care poate conduce la generarea de tulpiniţe ce, ulterior – în porţiunea
lor bazală – pot să diferenţieze rădăcini, constituindu-se astfel, în final, la nivelul explantului, o
plantulă;

 formare de rădăcini, care, arareori, pot da naştere la muguraşi;

 formarea de embrioni somatici, care prezintă o structură morfoanatomică identică cu cea a

embrionilor zigotici, ei deţinând atât rădăciniţă, cât şi tulpiniţă şi muguraş.

 Tipuri de regenerare “in vitro” la plante

2. Dediferenţierea
Celulele explantelor inoculate pe medii aseptice, pentru ca să îşi reorganizeze un mod de viaţă, trebuie să
sufere un proces de conversie, respectiv din celule definitivate structural şi funcţional, acestea să treacă la
starea de celule meristematice, apte de multiplicare, proces numit dediferenţiere.

1. Prima fază de dediferenţiere:

 a - amorsarea proceselor de dediferenţiere;

 b - producerea dediferenţierii celulelor, până la dobândirea caracteristicilor citologice specifice

unui ţesut meristematic de tip secundar, cu celule aplatizate, asemănătoare, ca aspect şi structură,
cu cambiul;

3. A doua fază de dediferenţiere:

 a - dediferenţierea în continuare a celulelor până la stadiul de celule cu caracter de meristem

primar; generarea, din meristemele neoformate, de promeristeme sau de meristemoizi (centre
organogene), ori de embrioni somatici, iar din aceştia, regenerarea de plante;

 b - generarea - prin proliferarea celulelor dediferenţiate - a unui calus neorganizat, omogen

structurat. La nivelul acestui ţesut calusal se pot, apoi, forma meristemoizi sau centri embriogeni.

3. Diferenţierea - procesul opus dediferenţierii şi constă dintr-o serie de transformări structurale, pe care
le suferă celulele nediferenţiate sau dediferenţiate (meristemele), trecând printr-o specializare morfologică
(ultrastructurală) şi fiziologică, dobândind caracteristici noi, proprii celulelor adulte.

 citodiferenţierea “in vitro” presupune formarea elementelor lemnoase, a xilemului;

 histodiferenţierea se petrece pe măsura constituirii organelor.

 Răspunsul celulelor foliare dediferenţiate, la îndepărtarea peretelui celular (cu ajutorul

celulazelor) prin dediferenţierea însoţită de distrugerea nucleoluluişi condensarea clusterelor
genelor ARN – ului ribozomal. În acest stadiu, semnalele aditionale pot determina distrugerea
celulelor. Aplicarea de auxine şi citochinine conduce la reasamblarea nucleolilor şi
decondensarea genelor ARN-ului ribozomal, în consecinţă conduce la reintrarea în ciclul celular
şi proliferarea (Zhao et al., 2001; Williams et al., 2003; Avivi et al., 2004).

4. Morfogeneza

- morfogeneza reprezintă procesul de dezvoltare a formei şi a structurii organelor, în urma diferenţierii

histologice a celulelor;

- în cadrul morfogenezei, prin embriogeneză se subînţelege procesul de formare a embrionului, iar

organogeneza este procesul de individualizare a organelor.

rizogeneza (formarea de rădăcini), ca de altfel toate fenomenele de organogeneză, este

declanşată de interrelaţia dintre “efectori” şi locul de acţiune al acestora, respectivă “receptorii”, adică,
“terenul” morfogenetic propice pentru ca “efectorii“ să acţioneze. Prin “efectori” se înţelege ceva mai
mult decât fitohormonii, eventual acizi nucleici, sinteza proteică etc.
 caulogeneza - formarea de muguraşi, respectiv generarea de centri vegetativi. Inducerea
caulogenezei este stimulată de prezenţa în mediul de cultură a citochininelor, adeseori, în condiţiile
asocierii acestora, cu auxinele.

Neoformarea de muguraşi la nivelul calusului se află sub controlul interacţiunii celor două categorii de
fitohormoni.

Procesul de embriogeneză somatică la Melia azedarach (Cinvestav, 1998)

 (a) Embriogeneză somatică indirectă din calus.

(b) Diferite stadii ale embrionului somatic.
(c) Germinarea embrionului somatic.
(d) Conversia embrionului somatic.
(e) Întreaga plantulă.
(f) Acclimatizarea exvitroplantulelor.

(Electronic Journal of Biotechnology, 2006 by Universidad Católica de Valparaíso – Chile)

 Bibliografie

1. CACHIŢĂ, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetală vol. I Baze teoretice şi practice. Ed.
Mira Design, Sibiu.

2. ROŞU, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaţii în ameliorare, Editura Ametist –
92, Bucureşti.

 BIOTEHNOLOGIE

Curs 6

Embriogeneza somatică

 Embriogeneza somatică - Definiții, caracterizare

 Embrionul reprezintă o entitate distinctă, care funcţionează ca un stadiu intermediar al tranziţiei

de la ciclul biologic gametofitic la cel sporofitic.

 Embriogeneza somatică la plante este un proces morfogenetic complex prin care o singură celulă
somatică se poate divide şi transforma în condiţii speciale într-o structură bipolară care se va
dezvolta generând în final planta întreagă, printr-un proces asemănător embriogenezei zigotice.

 Tipuri de embrioni vegetali

 1. -embrioni zigotici – generaţi din zigot (diploizi), format prin fertilizarea ovulului,
  2. - embrioni nezigotici – formaţi „in vivo” (diploizi sau haploizi) sau „in vitro”, din alte celule
decât zigotul,

- embrioni somatici – formaţi din celulele sporofitului ex. embrionii adventivi (i-au naştere din din alţi
embrioni, organe sau celule ale sacului embrionar, ale nucelei sau ale integumentelor ovulului)

- embrioni partenogenetici – formaţi din ovule nefertilizate,

- embrioni androgenetici – formaţi din gametofitul masculin,

- embrioni ginogenetici – formaţi din gametofitul feminin

 Fazele procesului de embriogeneză somatică “in vitro”

 formarea maselor celulare embriogene şi a ţesutului proembrionic

 stadiile morfologice caracteristice:

- globular,

- cordiform,

- torpedo,

- cotiledonar.

- embrion matur

 Tipuri de embriogeneză somatică

 Directă - de la celule diferenţiate, de la plantule şi chiar de la embrioni zigotici

 Indirectă – prin iniţierea prealabilă a calusului

 Utilizarea embrionilor somatici în producţie.

Seminţe artificiale.

 La morcov, ţelină, palmierul de ulei, cafea, curmal, arbore de cacao

 Semănarea se poate face prin antrenarea embrionilor aflaţi în suspensie prin conducte şi plonjarea
lor pe brazdă, prin încapsularea în alginat de sodiu sau în polimeri biodegradabili

Embriogeneza somatică la Melia azedarach

(CINVESTAV, 1998).

 (a) Embriogeneya somatică indirectă din calus.

(b)Diferite stadii ale embrionilor somatici.
(c) Germinarea embrionilor somatici.
(d) Conversia embrionilor somatici.
 (e) Întreaga plantulă.
(f) Aclimatizarea plantulelor.

Electronic Journal of Biotechnology by Universidad Católica de Valparaíso – Chile)

Micropropagerea in vitro prin embriogeneză somaticăla Oroxylum indicum

 A. Embriogenză in vitro la culturile de calus

 B. Plantule regenerate prin embriogeneză somatică

 C. Înrădăcinarea in vitro

 D. Plante mature

 Sistemul de regenerare in vitro, rapid și foarte eficient (organogeneză și embriogeneză somatică)

din lăstari apicali
(A) Prima zi de la izolarea lăstarilor apicali, cu primordii foliare LP = primordii foliare; SM =
meristeme.
(B) După prima săptămană la nivelul explantelor se pot observa porțiuni de meristeme și
extinderea frunyulițelor primordiale.
(C) După trei săptămani în masa meristematică se disting numeroși lăstari și frunzulițe inițiale.
(D) Lăstari individuai producand 2-8 straturi de tesut translucid.
(E) Fiecare strat de țesut a generat mai mulți embrioni somatici.
(F) Diferențierea minibutașilor din meristeme.
(G) Germinația embrionilor somatici putandu-se observa apexul lăstarilor (SA), înconjurat de
frnzulițele preliminare (PL).
(H) Diferențierea embrionilor somatici in plantule.
(I) Plantule cu rădăcinițe formate.
(J) Aclimatizatizarea plantulelor.
(K) Plante regenrate în seră.

 Embriogeneza somatică la porumb pornind de la embrioni zigotici imaturi, inoculaţi pe mediu cu

adaos de 1 mg/L 2,4-D, 25 mM Prolină, 100 mg/L Cazeină hifdrolizată, 10 mg/L nitrat de argint

 Bibliografie

1. CACHIŢĂ, C.D., SAND, C., 2001, Biotehnologie vegetală vol. I Baze teoretice şi practice. Ed.
Mira Design, Sibiu.

2. ROŞU, A., 1999, Elemente de biotehnologii vegetale. Aplicaţii în ameliorare, Editura Ametist
– 92, Bucureşti.
Embrion imatur

Cultura de calus friabil

Plantulă regenerată pe mediu cu adaos de 1 mg/l ANA

Transferarea “ex vitro” în amestec de turbă cu sol 1:1
Embriogeneza somatică la Melia azedarach

(CINVESTAV, 1998).

 (a) Embriogeneya somatică indirectă din calus.

(b)Diferite stadii ale embrionilor somatici.
(c) Germinarea embrionilor somatici.
(d) Conversia embrionilor somatici.
(e) Întreaga plantulă.
(f) Aclimatizarea plantulelor.

Electronic Journal of Biotechnology by Universidad Católica de Valparaíso – Chile)

Micropropagerea in vitro prin embriogeneză somaticăla Oroxylum indicum

 A. Embriogenză in vitro la culturile de calus

 B. Plantule regenerate prin embriogeneză somatică

 C. Înrădăcinarea in vitro

 D. Plante mature
Sistemul de regenerare in vitro, rapid și foarte eficient (organogeneză și embriogeneză somatică) din
lăstari apicali

(A) Prima zi de la izolarea lăstarilor apicali, cu primordii foliare LP = primordii foliare; SM = meristeme.
(B) După prima săptămană la nivelul explantelor se pot observa porțiuni de meristeme și extinderea
frunyulițelor primordiale.
(C) După trei săptămani în masa meristematică se disting numeroși lăstari și frunzulițe inițiale.
(D) Lăstari individuai producand 2-8 straturi de tesut translucid.
(E) Fiecare strat de țesut a generat mai mulți embrioni somatici.
(F) Diferențierea minibutașilor din meristeme.
(G) Germinația embrionilor somatici putandu-se observa apexul lăstarilor (SA), înconjurat de frnzulițele
preliminare (PL).
(H) Diferențierea embrionilor somatici in plantule.
(I) Plantule cu rădăcinițe formate.
(J) Aclimatizatizarea plantulelor.
(K) Plante regenrate în seră.

Embriogeneza somatică primară în mediu solid (1) sau în suspensii celulare (2) la Coffea arabica
Caracteristici histologice ale embriogenezei somatice
secundare în suspensiile de celule.
a – b: Structuri papulare pe epiderma embrionilor torpedo.
c: embrionii secundari a unor celule.
d: embrioni seundari globulari.
Calibrarea barelor: 200 µm pentru a, 100 µm pentru b,c și
d.

 Etapele şi condiţiile de vitrocultură şi efectul lor asupra plantulelor regenerate “in vitro”

 1. înfiinţarea unei culturi, respectiv obţinerea unei culturi “in vitro” cu capacitate regenerativă;

 2. incubarea şi creşterea dirijată a cormofitoinoculilor; ceea ce presupune nu numai amorsarea

proceselor regenerative, ci şi a celor de morfogeneză;

 3. subcultivarea (repicarea sau transferarea - pasarea - culturilor);

 4. conservarea culturilor;

 5. transferarea ”ex vitro” a vitroplantelor şi aclimatizarea acestora la regimul de viaţă septic.

 Iniţierea culturii “in vitro”

 Selecţia inoculului.

 Alegerea mediului de cultură.

 Selecţia recipientelor de vitrocultură.

 Prelevarea şi asepsizarea materialului vegetal.

 Inocularea materialului vegetal.

 Incubarea vitroculturilor.

 Creşterea vitroculturilor.
  Pregătirea şi prelucrarea vitroculturii pentru viitoarea cultură.

 Conservarea vitroculturilor.

 Asepsia şi asepsizarea

 Dispozitive de sterilizare

 Mediul de vitrocultura

 Caracteristicile generale ale procesului de micropropagare

 De ce sunt vitroplantulele verzi şi totuşi nu se hrănesc fotoautotrof?

Prezenţa în mediul de vitrocultură a zaharozei

(cu excepţia culturilor fotoautotrofe)

molecule de amidon

blocarea cloroplastelor

 CAUZELE APARIŢIEI UNEI EVAPOTRANSPIRAŢII EXCESIVE LA NIVELUL

EXVITROPLANTULELOR

1. Stomatele au osteolele în permanenţă deschise (sisteme de închidere – deschidere nefuncţional);

2. Amfistomatia şi densitateas ridicată a stomatelor la nivelul limburilor foliare (la Cymbidium

vitroplantulele pot fi amfistomatice, cu toate că, în condiţii naturale de viaţă frunzele prezinţă
hipostomatie).

3. Lipsa cuticulei pe suprafaţă frunzelor;

 Cercul vicios al reglării condiţiilor de mediu „ex vitro” în perioada de aclimatizare

1. Umiditatea relativă a atmosferei din recipientele de aclimatizare trebuie menţinută ridicată,

pentru a reduce mortalitatea exvitroplantulelor

2. O metodă de creştere a umidităţii în jurul plantulelor, constă în menţinerea exvitroplantulelor sub

ceaţa artificială, care realizează o hidratare a atmosferei dar şi o umbrire a acestora,.

3. Fotosinteza este, însă, inhibată în condiţii de umbrire prea puternică

4. Inhibarea fotosintezei (fotoautotrofismului) poate descreşte organogeneza, respectiv rizogeneza

şi caulogeneza

5. Absorbţia apei şi a sărurilor minerale este diminuată de insuficienta dezvoltare a aparatului

radicular secundar

6. Absorbţia diminuată de apă, pe fondul unei transpiraţii excesive la nivelul frunzelor, poate
conduce, în final, la moartea exvitroplantulelor
Sau

În momentul transferării „ex vitro” a vitroplantulelor, o parte dintre frunzuliţe pot

fi îndepărtate, pentru a reduce astfel excesul de transpiraţie, dar, fotosinteza este inhibată de o suprafaţă
foliară mică.

 INCINTE DE ACLIMATIZARE “EX VITRO”

 TIPURI DE SUBSTRATURI DE EXVITROCULTURĂ

 Bibliografie

1. CACHIŢĂ, C.D., DELIU, C., RAKOSY – TICAN, L., ARDELEAN, A., 2004, Tratat de
biotehnologie vegetală, Vol 1, Editura Dacia, Cluj – Napoca.

2. ECONOMOU, A.S., READ, P.E., 2003, Proceedings of the First International Symposium on
Acclimatization and Establishment of Micropropagated Plants, Acta Horticulturae, 616.

Caracteristici histologice ale embriogenezei somatice

Fig. 1.
A. Arborele de Royal poinciana.
B. B. Detaliu de floare de Royal poinciana.
secundare în suspensiile de celule.
a – b: Structuri papulare pe epiderma embrionilor torpe
c: embrionii secundari a unor celule.
d: embrioni seundari globulari.
Calibrarea barelor: 200 µm pentru a, 100 µm pentru b,c
d.

Fig. 2. Etapele sterilizării:

A. Păstăi imature după presterilizare în alcool 96%.

 B – C. Localizarea semințelor imature în păstaie.

D. Secțiuni de păstaie după sterilizarea în hipoclorit de sodiu, cu adaos de Twen și clătite cu apă
aflate în interiorul hotei cu flux laminar de aer steril (Meiers, A., 2004, Journal of Undergraduate
Research Volume 5, Issue 6).

Tipuri de explante utilizate in experiment: A. Embrion zigotic imatur Bar = 1 mm. B. Sămânţă
imatură. Localizarea embrionului zigotic imatur în sămânţă. Bar = 10 mm. C. Sămânţă imatură
tăiată în jumătate Bar = 10

Formarea calusului embriogen (CE). A. Formarea CE în embrionii zigotici imaturi. Bar = 2 mm. B.
Embrioni imaturi localizaţi în sămânţă, cu calus la capăt. Bar = 9 mm. C. Calus produs la
suprafaţa semiontelor înjumătăţite Bar = 13 mm.
 Ultrastructura cloroplastelor din celulele mezofilului foliar al frunzuliţelor plantulelor de garoafe: A –
“in vitro” (6000 X) şi B – la 24 h după transferarea “ex vitro” (12000 X) (ca – canalicule; s – stromă; g –
grane; cl – cloroplast; am – amidon; pc – perete celular; sp – spaţiu intercelular; M – mitocondrie; c –
citoplasmă; V – vacuolă) (Cachiţă şi Crăciun, 1991)

1. Stomatele au osteolele în permanenţă deschise (sisteme de închidere – deschidere nefuncţional);

2. Amfistomatia şi densitateas ridicată a stomatelor la nivelul limburilor foliare (la Cymbidium

vitroplantulele pot fi amfistomatice, cu toate că, în condiţii naturale de viaţă frunzele prezinţă
hipostomatie).

3. Lipsa cuticulei pe suprafaţă frunzelor;

Formaţiuni epidermale la frunzele de violetele africane (Saintpaulia ionantha): I. - cultivate “in
vitro”: A . Celule epidermale de pe faţa superioară; B. – Aparat stomatic din epiderma inferioară şi
II. – cultivate în seră (c.epi.sup. – celulele epidermei superioare; c.epi.inf. – celulele epidermei
inferioare; st. – stomată; ost. – osteolă; c.a. – celule anexe) (Petruş – Vancea şi colab., 2007)
Aspecte ale stomatelor frunzelor de garoafe: Aspecte ale stomatelor şi a cerii epicuticulare
la frunzele de Lycium chilense: A – “in vitro”, B –“ex vitro”,
evidenţiate la microscopul electronic cu baleaj

(1350 X) (Maseda şi colab., 2004)

a – “ex vitro”, b – “in vitro”,

evidenţiate la microscopul electronic cu baleaj (Taji şi Ariel, 1994)

Aspecte ale procesului de aclimatizare al exvitroplantulelor de cartof la Centrul de Agricultură din
Canada
Exvitroplantule de violete africane (Saintpaulia ionantha), la 30 de zile de la transferarea lor „ex vitro”,
plantate fiind pe variate tipuri de substraturi: V0 – „Top soil”, V1 – amestec de zeolit cu perlită, în raport
de 1:2, V2 – amestec de zeolit cu „Top soil”, în raport de 1:1, V3 – amestec de zeolit cu nisip de râu, în
raport de 1:2.
Aspecte ale exvitroplantulelor de violete africane (Saintpaulia ionantha), aflate la 30 de zile de la
transferarea „ex vitro” a acestora şi plantarea lor pe variate substraturi de exvitrocultură: V0 – perlită; V1
– vată minerală; V2 – „Top soil”.

Aspecte ale exvitroplantulelor de crizanteme (Chrysanthemum morifolium Ramat var. Lamet), aflate la 30
de zile de la transferarea „ex vitro” a acestora şi plantarea lor pe substrat constând din rumeguş de plop
sau rumeguş de fag.
Cultură hidroponică de căpşuni